ES2983252T3 - Tratamiento de las infecciones polibacterianas - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y tratar infecciones polibacterianas que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo producido por al menos una de las bacterias en la infección polibacteriana. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus se puede administrar a un paciente con una infección polibacteriana que comprende Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa para inhibir el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de las infecciones polibacterianas

CAMPO

La tecnología se refiere al uso de anticuerpos antibacterianos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos para el tratamiento y la prevención de infecciones, incluidas las infecciones polibacterianas.

ANTECEDENTES

Las infecciones oportunistas son infecciones que son más frecuentes y/o más graves como consecuencia de un entorno especialmente propicio, tal como un sistema inmunitario debilitado. Se presentan con frecuencia en pacientes hospitalizados y/o inmunodeprimidos. A menudo, las infecciones oportunistas son polimicrobianas, es decir, implican a múltiples agentes infecciosos. Dos bacterias oportunistas importantes sonStaphylococcus aureusyPseudomonas aeruginosa.

Staphylococcus aureus (S. aureus)es una bacteria Gram-positiva, facultativamente aeróbica, que forma cocos agrupados y que suele colonizar la nariz y la piel de los seres humanos sanos. Aproximadamente el 20-30 % de la población es colonizada por S.aureusen un momento dado. Las barreras mucosa y epidérmica (piel) protegen normalmente contra las infecciones por S.aureus,pero las infecciones oportunistas por S.aureuspueden llegar a ser graves y causar diversas enfermedades o afecciones, entre las que se incluyen, a título de ejemplo no limitativo, bacteriemia, celulitis, infecciones de los párpados, intoxicación alimentaria, infecciones articulares, infecciones cutáneas, síndrome de la piel escaldada, síndrome de shock tóxico, neumonía, osteomielitis, endocarditis, meningitis y formación de abscesos.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)es una bacteria Gram negativa causante de infecciones agudas y crónicas. Paeruginosaes una causa frecuente de infecciones hospitalarias en el mundo occidental. Es un agente causante frecuente de bacteriemia en víctimas de quemaduras e individuos inmunocomprometidos. También es la causa más común de neumonía nosocomial por Gram negativos, especialmente en pacientes con ventilación mecánica, y es el patógeno más prevalente en los pulmones de individuos con fibrosis quística.

Las infecciones por bacterias como S.aureusyP. aeruginosase asocian a una mayor morbilidad y mortalidad, y es frecuente que S.aureusy Paeruginosase aíslen del mismo paciente. En vista de ello, así como del hecho de que la multirresistencia está aumentando, se necesitan estrategias novedosas para prevenir y tratar las infecciones bacterianas, incluidas las polibacterianas.

BREVE COMPENDIO

La invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias VH y VL de los SEQ ID NOs: 45 y 46 para su uso en el tratamiento o prevención de una infección polibacteriana en un paciente, en el que la infección polibacteriana comprende S.aureusy al menos otra bacteria Gram negativa, cuyo crecimiento está potenciado por la toxina alfa de S.aureus.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia o para diagnóstico.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un antígeno de S.aureus,y el antígeno de S.aureuses la toxina alfa. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la toxina alfa de S.aureusse une al mismo epítopo de toxina alfa que un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL de los SEQ ID NOs:45 y . El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la toxina alfa de S.aureuses un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende (a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58; (c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:59; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la toxina alfa de S.aureuscomprende la VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de SEQ ID NOs:57, 58, 59, 1,2 y 56. La VH y la VL del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a S.aureusalfa comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs:45 y 46.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la toxina alfa de S.aureusse une al mismo epítopo de toxina alfa que un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL de SEQ ID NOs:45 y 46. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la toxina alfa de S.aureuscomprende las secuencias VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de SEQ ID NOs:57, 58, 59, 1, 2 y 56, respectivamente. La VH y la VL del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la toxina alfa de S.aureuscomprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs:45 y 46. En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureuscomprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69.

En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno de S.aureusse administra durante dos o más ciclos de prevención o tratamiento.

En ciertos aspectos, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden la administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno de S.aureusy la administración de un segundo agente antibacteriano.

La infección polibacteriana puede ser una infección ocular, una infección pulmonar, una infección por quemadura, una infección por herida, una infección por herida quirúrgica, una infección cutánea, una infección de tejidos blandos, una infección sanguínea, una infección ósea o una combinación de dos o más de dichas infecciones.

El paciente puede padecer neumonía aguda, quemaduras, infección corneal, fibrosis quística, neumonía asociada a ventilación mecánica, infección cutánea, infección de heridas o una combinación de ambas.

El paciente puede ser hospitalizado.

La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno de S.aureus)puede dar lugar a los resultados mostrados en las Figuras 8-10 y descritos en los Ejemplos 3-4.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

LaFigura 1muestra la supervivencia de ratones inoculados con la cepa 6077 dePseudomonas aeruginosa(A)o la cepa SF8300 deStaphylococcus aureus(B).

LaFigura 2Amuestra la supervivencia de ratones inoculados con Paeruginosa("PA 6077"), S.aureus("SA SF8300) ("Infección combinada"). LaFigura 2Bmuestra las unidades formadoras de colonias (CFU) de Paeruginosa("PA CFU") y S. aureus ("SA CFU") de los pulmones de ratones inoculados con Paeruginosay/o S.aureus.

LaFigura 3muestra las CFU de Paeruginosa("recuentos PA") y S.aureus("recuentos SA") medidas en ratones inoculados con Paeruginosa("PA"), S.aureus("SA"), o ambos (SA+PA).

LaFigura 4muestra las UFC por ml de homogeneizado pulmonar en ratones inoculados. Se inocularon ratones con S.aureusde tipo salvaje ("SA SF8300 WT") solo (círculos) o en combinación con Paeruginosa("PA 6077") (triángulos), donde se midieron los niveles de S.aureusa las 4, 8, 24 y 48 horas tras la inoculación. También se inocularon ratones con Paeruginosa("PA 6077") sola (cuadrados) o en combinación con S.aureusde tipo salvaje ("SA SF8300 WT"), donde se midieron los niveles de Paeruginosa("PA") a las 4, 8, 24 y 48 horas tras la inoculación.

LaFigura 5muestra la supervivencia de ratones inoculados con S.aureusde tipo salvaje ("SA SF8300 WT" ), S.aureusque contiene una deleción en el gen que codifica para la toxina alfa ("SA SF8300 Ahla"),P. aeruginosa("PA 6077"), o una combinación de los mismos.

LaFigura 6Amuestra la supervivencia de los ratones que recibieron toxina alfa de S.aureus("AT"), Paeruginosa("PA 6077"),P. aeruginosaen combinación con toxina alfa, o Paeruginosaen combinación con toxina alfa y un anticuerpo anti-toxina alfa (LC10). LaFigura 6Btambién muestra la supervivencia de los ratones que recibieron toxina alfa de S.aureus("AT"), y Paeruginosa("PA 6077"), y también muestra la supervivencia de los ratones que recibieron S.aureusde tipo salvaje ("SA SF8300 WT"), S.aureusde tipo salvaje ("SA SF8300 WT") en combinación con Paeruginosa("PA 6077"), o Paeruginosa("PA 6077") con un sedimento celular obtenido a partir de S.aureusmuerto por calor ("Células SA HK") o sobrenadante obtenido a partir de S.aureusmuerto por calor ("SA HK SUP").

LaFigura 7muestra el nivel deP. aeruginosaen ratones tratados con Paeruginosa("PA 6077") sola o en combinación con S.aureusde tipo salvaje ("SA SF8300 WT), S.aureusque contiene una deleción en el gen que codifica para la toxina alfa ("SA SF8300 Ahla"), toxina alfa (AT), o tanto toxina alfa como el anticuerpo anti-toxina alfa LC10.

LaFigura 8muestra la supervivencia de los ratones que recibieron un anticuerpo de control ("R347"), un anticuerpo contra la toxina alfa de S.aureus("LC10"), un anticuerpo contra Paeruginosa("3902"), o una combinación de un anticuerpo contra la toxina alfa de S.aureus("LC10") y un anticuerpo contra Paeruginosa("3902"), y que luego fueron inoculados con S.aureus("SA") y Paeruginosa("PA").

LaFigura 9muestra la supervivencia de los ratones que recibieron una combinación de 15 mg/kg de anticuerpo contra la toxina alfa de S.aureus("LC10") y 1 mg/kg de anticuerpo contra Paeruginosa("3902") o 15 mg/kg de anticuerpo de control ("R347") 48 horas antes, 24 horas antes o 1 hora después de la inoculación con S.aureus("SA") y Paeruginosa("PA").

LaFigura 10muestra los niveles de S.aureus("SA CFU") y P aeruginosa ("PA CFU") en ratones que recibieron 15 mg/kg de anticuerpo contra la toxina alfa de S.aureus("LC10"), 1 mg/kg de anticuerpo contraP. aeruginosa("3902") o 15 mg/kg de anticuerpo de control ("R347").

LaFigura 11(A)muestra que LC10 reduce las CFU pulmonares y la diseminación. A) Grupos de ratones fueron inyectados con LC10 (□), o el control isotipo IgG (°) y desafiados intranasalmente 24 h después con 1e5 CFU deP.aeruginosay 5e7 CFUS.aureus,o Paeruginosa AT. Se extrajeron pulmones y bazos en los momentos indicados para la determinación de CFU.Figura 11(B)Carga bacteriana de S.aureusen los bazos de los ratones mono (Sa) o coinfectados (Sa Pa (Sa)) en los puntos temporales indicados tras la exposición intranasal descrita anteriormente.Figura 11(C)Número de Paeruginosarecuperados de órganos distales a las 24 y 48 h en monoinfección, coinfección y coinfección combinada con profilaxis utilizando LC10.

LaFigura 12muestra que la a-Toxina también potencia la virulencia deKlebsiella pneumoniaeyAcinetobacter baumanniien el modelo de infección pulmonar. A) Grupos de ratones fueron infectados por vía intranasal conK. pneumoniae5e1 (■),K. pneumoniae5e1 S.aureus(5e7) (A),K. pneumoniae5e1 AT (•), S.aureus(A). Se controló la supervivencia durante 7 días B) Se inyectó LC10 (A) o IgG isotipo (A) a los animales y se les administró por vía intranasal 24 h después, como se ha descrito anteriormente,K. pneumoniae+ S.aureus,oK. pneumoniae+ AT LC10 (°) o IgG isotipo (•). Recuperación de CFU de los pulmones (C) y el bazo (D) 24 h después de la exposición. E) Se infectaron intranasalmente grupos de ratones conA. baumannii(8e5) (■),A. baumannii8e5 S.aureus(5e7) (A),A. baumannii8e5 AT (•), S.aureus(A). Se inyectó a los animales LC10 (A) o IgG isotipo (A) y se les administró por vía intranasal 24 h despuésA. baumannii+ S.aureusoA. baumannii+ AT LC10 (°) o IgG isotipo (•). Recuperación de CFU de los pulmones (F) y el bazo (G) 24 h después de la exposición.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Cabe señalar que el término "una" o "un" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo" se entiende que representa uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo. Por ello, las expresiones "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv), mutantes Fv de cadena simple (scFv), anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno, siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), con base en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada a los que se refiere como alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las distintas clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas como toxinas, radioisótopos, etc.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos que participan en el reconocimiento y la unión altamente específicos a un único determinante antigénico o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.

El término "anticuerpo monodonal" abarca tanto los anticuerpos monoclonales intactos y de longitud completa como los fragmentos de anticuerpos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), los mutantes monocatenarios (scFv), las proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a dichos anticuerpos fabricados de cualquier manera, incluyendo, pero sin limitación, por hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante y animales transgénicos.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo derivado de una inmunoglobulina no humana(por ejemplo,murina), que ha sido diseñado para contener secuencias mínimas no humanas(por ejemplo,murinas). Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de la región determinante complementaria (CDR) se sustituyen por residuos de la CDR de una especie no humana(por ejemplo,ratón, rata, conejo o hámster) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos de la región marco Fv (FW) de una inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos correspondientes de un anticuerpo de una especie no humana que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.

El anticuerpo humanizado puede modificarse aún más mediante la sustitución de residuos adicionales, ya sea en la región marco Fv y/o dentro de los residuos no humanos sustituidos, para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos o tres, dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región o dominio (Fc) constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Algunos ejemplos de métodos utilizados para generar anticuerpos humanizados se describen en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.225.539 o 5.639.641.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de cadena ligera del anticuerpo o la región variable de cadena pesada del anticuerpo, ya sea solo o en combinación. Las regiones variables de cadena pesada y ligera consisten en cuatro regiones marco (FW) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FW y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque con base en la variabilidad de secuencias entre especies(es decir,Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) un enfoque con base en estudios cristalográficos de antígeno-anticuerpo complejos (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol.

273:927-948)). Además, en la técnica se utilizan a veces combinaciones de estas dos estrategias para determinar las CDR.

El sistema de numeración de Kabat se utiliza generalmente cuando se refiere a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada)(por ejemplo,Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

La numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat, se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de la cadena pesada o los dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más correspondientes a un acortamiento o inserción en una FW o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un único aminoácido insertado (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados(por ejemplo,residuos 82a, 82b y 82c,etc.según Kabat) después del residuo 82 de FW de cadena pesada.

Tabla 1

La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar". Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El final del bucle de CDR-H1 de Chothia cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat sitúa las inserciones en H35A y H35B; si no están presentes ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizadas por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.

Tal como se utiliza en el presente documento, la región Fc incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. Así, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, y a los tres últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, así como a la bisagra flexible N-terminal a estos dominios. Para IgA e IgM Fc puede incluir la cadena J. Para la IgG, el Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define generalmente para comprender los restos C226 o P230 en su extremo carboxilo, en donde la numeración es según el índice de EU establecido en Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Fc puede referirse a esta región de forma aislada, o esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fc. Se han observado polimorfismos en varias posiciones de Fc diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358 numeradas por el índice de UE y, por tanto, pueden existir ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias de la técnica anterior.

La expresión "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano realizado mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos, y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido humano de cadena pesada y/o ligera como, por ejemplo, un anticuerpo que comprenda polipéptidos murinos de cadena ligera y de cadena pesada humana.

La expresión "anticuerpos quiméricos" se refiere a los anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina procede de dos o más especies. Normalmente, la región variable de las cadenas ligeras y pesadas corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos(por ejemplo,ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra (normalmente humana) para evitar provocar una respuesta inmunitaria en esa especie.

La "afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula(por ejemplo,un anticuerpo) y su pareja de unión(por ejemplo,un antígeno). A menos que se indique lo contrario, en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión(por ejemplo,anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañera Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (K<d>). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad se unen generalmente al antígeno de forma lenta y tienden a disociarse con facilidad, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen generalmente al antígeno de forma más rápida y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. En la técnica se conocen diversos métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede utilizarse para los fines de la presente divulgación.

El término "anticuerpo biespecífico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de una única molécula de anticuerpo. Se apreciará que otras moléculas además de la estructura canónica del anticuerpo pueden construirse con dos especificidades de unión. Se apreciará además que la unión al antígeno por anticuerpos biespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos también pueden construirse por medios recombinantes.

Por "se une específicamente" se entiende generalmente que un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. De conformidad con esta definición, se dice que un anticuerpo se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión al antígeno con más facilidad de la que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se utiliza en el presente documento para calificar la afinidad relativa por la que un determinado anticuerpo se une a un determinado epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo "A" tiene una especificidad mayor para un epítopo dado que el anticuerpo "B", o puede decirse que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad mayor que la que tiene para el epítopo relacionado "D".

Por "se une preferentemente" se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Así, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo determinado se uniría con mayor probabilidad a ese epítopo que a otro epítopo relacionado, aunque dicho anticuerpo pueda presentar una reacción cruzada con el epítopo relacionado.

Se dice que un anticuerpo "inhibe competitivamente" la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a ese epítopo hasta el punto de bloquear, en cierta medida, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competencia. Puede decirse que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 % o al menos un 50 %.

El término mutaciones "YTE" se refiere a una combinación de las tres mutaciones, M252Y, S254T y T256E, en el que la numeración es de conformidad con el índice UE según se establece en Kabat, introducidas en la cadena pesada de una IgG. Véase la patente Estadounidense n° 7.658.921.

Términos tales como "tratar" o "tratamiento" o "a tratar" o "aliviar" o "a aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, ralentizan, atenúan los síntomas y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado, por ejemplo, una infección. Así pues, entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen las que ya han sido diagnosticadas o se sospecha que padecen el trastorno. Un sujeto puede ser "tratado" con éxito de una infección microbiana de conformidad con los métodos de la presente divulgación si el paciente muestra uno o más de los siguientes: una reducción de los síntomas de la infección microbiana, una reducción de la cantidad o una ausencia completa del microbio en el paciente (por ejemplo, según se evalúa utilizando una muestra obtenida del paciente), una reducción en la cantidad o ausencia completa de un indicador del microbio (por ejemplo, toxina alfa de S.aureus)en el paciente, y/o una reducción en la gravedad y/o frecuencia de un síntoma o síntomas de la infección.

Las medidas profilácticas o preventivas se refieren a aquellas que evitan y/o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico diana, por ejemplo, una infección. Así pues, entre las personas que necesitan medidas profilácticas o preventivas se encuentran las propensas a padecer el trastorno y aquellas en las que se desea prevenirlo.

El término "formulación farmacéutica" "composición farmacéutica" se refiere a un preparado cuya forma permite que la actividad biológica del principio activo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. La formulación puede ser estéril.

Una "cantidad eficaz" de un anticuerpo o inmunoconjugado, tal como se divulga en el presente documento, es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria, en relación con el fin indicado.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Anticuerpos anti-Staphylococcus y fragmentos de unión a antígeno de los mismos

En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con los métodos proporcionados en el presente documento se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus(por ejemplo, polipéptido y/o carbohidrato).

En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, polipéptido y/o carbohidrato). S.aureusexpresa varios factores de virulencia, como polisacáridos capsulares y toxinas proteicas. Un factor de virulencia a menudo asociado con la infección por S.aureusque es el principal agente citotóxico es la toxina alfa (también conocida como alfahemolisina o Hla), una exoproteína hemolítica y formadora de poros producida por la mayoría de las cepas patógenas de S.aureus.La toxina forma poros heptaméricos en las membranas de células susceptibles tales como glóbulos blancos, plaquetas, eritrocitos, monocitos de sangre periférica, macrófagos, queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales. La formación de poros de toxina alfa suele provocar disfunción o lisis celular. Por consiguiente, en ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a la toxina alfa deStaphylococcus aureus.En ciertos aspectos, la toxina alfa de S.aureuscomprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70.

Tabla 2: Secuencia del anticuerpo anti-toxina alfa SEQ ID Nos

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureusse une al mismo epítopo de toxina alfa que un anticuerpo que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) de; SEQ ID NOs:45 y 46; El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureusse une al mismo epítopo de toxina alfa que un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL de SEQ ID NOs:45 y 46.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureusinhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL de las SEQ ID NOs:45 y 46 a la toxina alfa de S.aureus.El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureusinhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL de las SEQ ID NOs:45 y 46 a la toxina alfa de S.aureus.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureuses un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende (a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56.

Las VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs:57, 58, 59, 1, 2 y 56. Los VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 corresponden a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs:57, 58, 59, 1, 2 y 56.

La VH y la VL comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs:45 y 46. VH y VL corresponden a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs:45 y 46.

En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureuscomprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69 (es decir, MEDI4893).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureuspuede unirse a un fragmento de la toxina alfa de S.aureusde la SEQ ID NO:70 que comprende (a) los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO:70; (b) los aminoácidos 173-201 de la SEQ ID NO:70; (c) los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO:70 y los aminoácidos 173-201 de la SEQ ID NO:70; o (d) los aminoácidos 248-277 de la SEQ ID NO:70. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureuspuede unirse a un fragmento de la toxina alfa de S.aureusde la SEQ ID NO:70 que consiste en (a) los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO:70; (b) los aminoácidos 173-201 de la SEQ ID NO:70; (c) los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO:70 y los aminoácidos 173-201 de la SEQ ID NO:70; o (d) los aminoácidos 248-277 de la SEQ ID NO:70.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina alfa de S.aureuspuede (a) tener una constante de afinidad (K<d>) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos; (b) se une a monómeros de toxina alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %; (d) reduce la actividad citolítica de toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % (por ejemplo, (e) reduce la infiltración celular y la liberación de citocinas proinflamatorias; o (f) una combinación de los mismos.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe en el presente documento, puede unirse específicamente a un epítopo de S.aureus(por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 * 10'2 M, 10'2 M, 5 * 10'3 M, 10'3 M, 5 * 10'4 M, 10'4 M, 5 * 10'5 M, 10-5 M, 5 * 10-6 M, 10-6 M, 5 * 10-7 M, 10'7 M, 5 * 10'8 M, 10'8 M, 5 * 10'9 M, 10'9 M, 5 * 10'10 M, 10'10 M, 5 * 10'11 M, 10-11 M, 5 * 10-12 M, 10-12 M, 5 * 10'13 M, 10'13 M, 5 * 10'14 M, 10'14 M, 5 * 10'15 M, o 10'15 M.

Un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento de unión a antígeno puede alterar las propiedades biológicas de la toxina alfa, de las células que expresan toxina alfa o de otras células bacterianas. Un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento de unión a antígeno puede neutralizar la actividad biológica de la toxina alfa uniéndose al polipéptido e inhibiendo la unión de los monómeros de toxina alfa en un poro transmembrana (por ejemplo, heptámero de toxina alfa). Los ensayos de neutralización pueden realizarse mediante métodos conocidos en la técnica utilizando, en algunas circunstancias, reactivos disponibles comercialmente. La neutralización de la toxina alfa a menudo se mide con un IC50 de 1*1°-6 M o menos, 1*1°-7 M M o menos, 1*1°-8 M o menos, 1*1°-9 M o menos, 1x1°-1° M o menos y 1x1°'11 M o menos. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede neutralizar la capacidad de la toxina alfa para oligomerizarse y formar un poro transmembrana. El término "concentración inhibitoria 5° %" (abreviado como "IC50") representa la concentración de un inhibidor (por ejemplo, un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento proporcionado en el presente documento) que se requiere para inhibir en un 5° % una actividad dada de la molécula diana del inhibidor (por ejemplo, la oligomerización de la toxina alfa para formar un complejo heptámero de poro transmembrana). Un valor IC50 más bajo corresponde generalmente a un inhibidor más potente.

Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede inhibir una o más actividades biológicas de la toxina alfa. El término "inhibición", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa de la actividad biológica, incluido el bloqueo total de la actividad. Por ejemplo, "inhibición" puede referirse a una disminución de aproximadamente el 1° %, 2° %, 3° %, 4° %, 5° %, 6° %, 7° %, 8° %, 9° % o 1°° % de la actividad biológica. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede inhibir una o más actividades biológicas de la toxina alfa en al menos un 1° %, 2° %, 3° %, 4° %, 5° %, 6° %, 7° %, 8° %, 9° % o 1°° %.

Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede eliminar la toxina alfa secretada por el S.aureuspatógeno. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede lograr al menos un 2° %, al menos un 3° %, al menos un 4° %, al menos un 5° %, al menos un 6° %, al menos un 7° %, al menos un 8° %, al menos un 9° %, al menos un 95 % o aproximadamente un 1°° % de depleción de la toxina alfa secretada por S.aureus.

Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede inhibir la actividad de la toxina alfa estimulada in vitro (por ejemplo, unión al receptor, oligomerización) y/o la proliferación de células que expresan o secretan toxina alfa. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a veces inhibe in vitro la actividad de la toxina alfa, la patogenicidad de S.aureusen al menos un 1° %, al menos un 2° %, al menos un 3° %, al menos un 4° %, al menos un 5° % o al menos un 75 %. Los métodos para medir la proliferación celular, la patogenicidad y la actividad de la hemolisina alfa son conocidos en la técnica.

Un anticuerpo anti-toxina alfa o fragmento de unión a antígeno puede inhibir la expresión de uno o más genes inducibles que responden directa o indirectamente al entorno creado por la infección por S.aureusy/o la expresión y función de la toxina alfa. Un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento de unión a antígeno puede inhibir la expresión de uno o más genes inducibles que responden directa o indirectamente al entorno creado por la infección por S.aureusy/o la expresión y función de la toxina alfa en al menos un 2° %, en al menos un 3° %, en al menos un 4° %, en al menos un 5° %, en al menos un 6° %, en al menos un 7° %, en al menos un 8° %, en al menos un 9° %, en al menos un 1°° %, en al menos un 12° %, en al menos un 14° %, en al menos un 16° %, en al menos un 18° %, o en al menos un 2 °° %.

Composiciones farmacéuticas

En ciertas realizaciones, un anticuerpoanti-Staphylococcuso fragmento de unión a antígeno proporcionado en el presente documento puede formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable como composiciones farmacéuticas (terapéuticas), y puede administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración pueden variar en función de los resultados deseados. Tal como se utilizan en el presente documento, las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpoanti-Staphylococcuso un fragmento de unión a antígeno se refieren a formulaciones de la tecnología. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más materiales no tóxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos. Estos preparados contienen habitualmente sales, agentes tamponadores, conservantes, soportes compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Tales preparados farmacéuticamente aceptables también contienen habitualmente cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que son adecuadas para su administración a un ser humano. El término "vehículo" designa un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden mezclarse con los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígenos de la presente tecnología, y entre sí, de tal manera que no se produzca ninguna interacción que afecte sustancialmente a la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones terapéuticas de la presente tecnología pueden formularse para una dosificación particular. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformizar la dosificación. La forma de dosificación unitaria, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas, adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

Las composiciones terapéuticas de la presente tecnología pueden formularse para vías de administración particulares, tales como la administración oral, nasal, pulmonar, tópica (incluidas la bucal y la sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquier método conocido en el arte de la farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una única forma de dosificación variará en función del sujeto tratado y del modo de administración concreto. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una única forma de dosificación será generalmente aquella cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico.

Métodos de tratamiento y prevención

La invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias VH y VL de los SEQ ID NOs: 45 y 46 para su uso en el tratamiento o prevención de una infección polibacteriana en un paciente, en el que la infección polibacteriana comprende S.aureusy al menos otra bacteria Gram negativa, cuyo crecimiento está potenciado por la toxina alfa de S.aureus.La administración del anticuerpoanti-S.aureuso fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa toxina o fragmento de unión a antígeno del mismo) puede inhibir el crecimiento de al menos otra bacteria. La administración del anticuerpoanti-Saureuso fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa toxina o fragmento de unión a antígeno del mismo) puede aumentar la supervivencia. La administración del anticuerpoanti-Saureuso fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa toxina o fragmento de unión a antígeno del mismo) puede disminuir la mortalidad.

El número de unidades formadoras de colonias (CFU) en una muestra obtenida de un paciente con una infección polibacteriana puede proporcionar una indicación de la gravedad de la infección. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 50 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 75 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 80 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 85 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 90 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 95 %. La administración de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo que sea específico de un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 96 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 97 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 98 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede disminuir las CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente en al menos un 99 %. La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno deStaphylococcus aureus(por ejemplo, toxina alfa) puede eliminar CFU dePseudomonas(por ejemplo, Paeruginosa)en una muestra obtenida de un paciente.

La infección polibacteriana puede ser una infección ocular, una infección pulmonar, una infección por quemadura, una infección por herida, una infección por herida quirúrgica, una infección cutánea, una infección de tejidos blandos, una infección sanguínea, una infección ósea o una combinación de dos o más de dichas infecciones.

El paciente puede padecer neumonía aguda, quemaduras, infección corneal, fibrosis quística, neumonía asociada a ventilación mecánica, infección cutánea, infección de heridas o una combinación de ambas.

Los métodos de preparación y administración de anticuerpos antibacterianos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo,anti-Staphylococcus,anti-S.aureus,anti-toxina alfa, anti-Pseudomonas, anti-Paeruginosa,anti-Psl, anti-PcrV, o anticuerpos anti-Psl y PcrV, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) son bien conocidos o pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica. La vía de administración de los anticuerpos antibacterianos o de sus fragmentos de unión a antígenos puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral utilizado en el presente documento incluye, por ejemplo, la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea. Una forma adecuada de administración sería una solución inyectable, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Sin embargo, en otros métodos compatibles con lo expuesto en el presente documento, los anticuerpos antibacterianos o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden administrarse directamente en el lugar de la población celular adversa, por ejemplo, la infección, aumentando así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico. Por ejemplo, los anticuerpos antibacterianos o el fragmento de unión a antígeno de los mismos pueden administrarse directamente en tejido ocular, lesiones por quemaduras o tejido pulmonar.

Los anticuerpos antibacterianos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-Staphylococcus, anti-S.aureus,anti-toxina alfa, anti-Pseudomonas, anti-Paeruginosa,anti-Psl, anti-PcrV, o anticuerpos anti-Psl y PcrV, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamientoin vivode infecciones polibacterianas (por ejemplo, infecciones que comprenden bacteriasStaphylococcusy/oPseudomonas).A este respecto, se apreciará que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos están formulados para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo.

Los anticuerpos antibacterianos o sus fragmentos de unión a antígenos (por ejemplo, la toxina antialfa o sus fragmentos de unión a antígenos) pueden utilizarse en combinación con otros agentes antibacterianos tales como antibióticos. Entre los antibióticos se incluyen, por ejemplo, los betalactámicos (tal como la cefalexina), las sulfamidas (como el cotrimoxazol/trimetoprima-sulfametoxazol), las tetraciclinas (como la doxiciclina y la minociclina), clindamicina, vancomicina, linezolid, daptomicina, teicoplanina, quinupristina/dalfopristina (sinercid), tigeciclina, ciprofloxacino, meropenem, tobramicina y aztreonam. En ciertas realizaciones, el antibiótico es ciprofloxacino.

Ejemplos

Ejemplo 1: Staphylococcus aureus potencia la infección por Pseudomonas aeruginosa

Se inoculó a ratones la cepa 6077 dePseudomonas aeruginosao la cepa SF8300 deStaphylococcus aureusy se evaluó su supervivencia. Se anestesió brevemente a ratones (n=10) con isoflurano/O<2>al 3 % y se depositaron 50 |jl de bacterias (a distintas concentraciones) en la punta de las fosas nasales. La mortalidad se controló durante siete días. Como se muestra en la Figura 1A, todos los ratones tratados con 7.5e4 unidades formadoras de colonias (CFU) deP. aeruginosasobrevivieron durante el periodo de siete días, pero ningún ratón tratado con 8.00e5 CFU sobrevivió. Además, todos los ratones tratados con 1.25e8 CFU de S.aureussobrevivieron durante el periodo de siete días, pero ningún ratón tratado con 2.25e8 o 3.25e8 CFU de S.aureussobrevivió (Figura 1B).

Para investigar la cinética de la coinfección, se inoculó en ratones una mezcla de Paeruginosay S.aureusa una concentración final de 5.5e7 CFU por ratón de S.aureusy 1.1e5 CFU por ratón de Paeruginosa.La mortalidad se controló durante siete días. Como se muestra en la Figura 1, estas dosis estaban muy por debajo de las dosis letales cuando se administraban individualmente. Por lo tanto, la mayoría de los ratones tratados con Paeruginosao S.aureussobrevivieron (Figura 2A). Sin embargo, ninguno de los ratones tratados con la combinación sobrevivió (Figura 2A).

También se examinó la colonización de Paeruginosay S.aureusen los ratones. En estos experimentos, los ratones fueron inoculados con una combinación de Paeruginosay S.aureuscomo se ha descrito anteriormente, y cinco ratones/grupo fueron eutanasiados en distintos momentos. Se les extrajeron los pulmones y, tras homogeneizarlos en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se sembraron alícuotas en agar manitolsal para cuantificar S.aureuso en agar de aislamiento de pseudomonoas para cuantificar Paeruginosa.Los niveles deP aeruginosafueron significativamente mayores en los ratones inoculados tanto con Paeruginosacomo con S.aureusque en los inoculados sólo con Paeruginosa(Figura 2B). Además, los niveles deP. aeruginosafueron significativamente superiores en los ratones inoculados con Paeruginosay S.aureusque en los inoculados sólo conP aeruginosatanto a las 24 horas como a las 36 horas tras la inoculación (Figura 3). En un experimento adicional, también se examinó la colonización en ratones inoculados con 6.1e7 CFU de S.aureusy/o 1.3e5 CFU de Paeruginosa.En estos experimentos, los niveles de S.aureusfueron significativamente mayores en los ratones inoculados tanto conP. aeruginosacomo con S.aureusque en los inoculados sólo con S.aureus48 horas después de la inoculación (Figura 4).

Estos datos demuestran que S.aureuspotencia el crecimiento de Paeruginosa.Además, estos datos también demuestran que la combinación de S.aureusyP. aeruginosaen dosis de exposición normalmente subletales aumenta la letalidad en un modelo de infección pulmonar. A continuación se muestra un compendio de la valoración de las dosis de exposición de Paeruginosay S.aureusen un modelo de coinfección pulmonar en el que la exposición intranasal se realizó con la cepa Paeruginosa:6077 (exoU) : LD100 = ~1e6 y la cepa S.aureus:SF8300 (cMRSA) : LD100 = ~2e8.

Ejemplo 2: La toxina alfa de S. aureus potencia la infección por P. aeruginosa

Para determinar si la toxina alfa de S.aureusera necesaria para que S.aureuspotenciara el crecimiento de Paeruginosa,se realizaron experimentos con una cepa de S.aureusque contenía una deleción en el gen que codifica la toxina alfa (también conocida como alfa-hemolisina(hla)).En estos experimentos, los ratones fueron inoculados con S.aureusde tipo salvaje (WT) o mutante (Ahla) solo (infección única) o en combinación con Paeruginosa(infección mixta). A continuación, se midieron los niveles de S.aureusyP. aeruginosaa las 24 y 36 horas de la inoculación. Los niveles de S.aureusfueron inferiores en los ratones que recibieron inoculaciones con S.aureuscarente de toxina alfa(Ahla)que con S.aureusde tipo salvaje. Además, los niveles de Paeruginosafueron inferiores en los ratones que recibieron inoculaciones con S.aureuscarente de toxina alfa(Ahla)que con S.aureusde tipo salvaje.

También se evaluó el efecto de la toxina alfa de S.aureusen la supervivencia de los ratones. Se inocularon ratones con 1e8 CFU de S.aureusde tipo salvaje, 1e8 CFU de S.aureussin toxina alfa, 1e5 CFU de Paeruginosao una combinación de las mismas. Como se muestra en la Figura 5, ninguno de los ratones que recibieron tanto S.aureusde tipo salvaje comoP. aeruginosasobrevivió. Por otro lado, todos los ratones que recibieron Paeruginosao S.aureussin toxina alfa sobrevivieron (Figura 5). Cabe destacar que sobrevivió un mayor número de ratones que recibieron S.aureuscarente de toxina alfa en combinación con Paeruginosaque los ratones que recibieron S.aureusde tipo salvaje en combinación con Paeruginosa(Figura 5).

Para determinar si la toxina alfa de S.aureuses suficiente para potenciar el crecimiento de Paeruginosa,se inocularon ratones con 1e5 CFU de Paeruginosa,0.1 |jg de toxina alfa o una combinación de ambos. Los ratones inoculados sólo conP. aeruginosao toxina alfa sobrevivieron, pero muchos ratones inoculados con la combinación no lo hicieron (Figura 6A). Así, la toxina alfa nativa aumenta la mortalidad cuando se combina con Paeruginosa.La administración de un anticuerpo anti-alfa toxina, LC10, 24 horas antes de la inoculación fue suficiente para revertir este efecto. Los ratones que recibieron la combinación de Paeruginosay toxina alfa después de recibir LC10 sobrevivieron (Figura 6A).

Otros experimentos demostraron que los S.aureusmuertos por calor no eran capaces de potenciar el crecimiento de Paeruginosa.Los ratones inoculados con 1e5 CFU de Paeruginosaen combinación con el sedimento celular o el sobrenadante obtenido de S.aureusmuerto por calor sobrevivieron (Figura 6B).

El análisis de los niveles deP. aeruginosaen los ratones tratados reveló resultados similares. En particular, los ratones inoculados con 1e5 CFU de Paeruginosasola mostraron niveles bajos de crecimiento de Paeruginosa(Figura 7). Sin embargo, la coinoculación con 1e8 CFU de S.aureus,1e8 CFU de S.aureussin toxina alfa o 0.1 mg de toxina alfa aumentó el número deP. aeruginosa(Figura 7). La administración de 15 mg/kg de LC10 junto con 0.1 mg de toxina alfa evitó el aumento de Paeruginosa(Figura 7).

Estos datos indican que la toxina alfa de S.aureuses importante para la capacidad de S.aureusde potenciar el crecimiento de Paeruginosay es suficiente para potenciar el crecimiento de Paeruginosa.Además, un anticuerpo anti-toxina alfa de S.aureussuprime el crecimiento de Paeruginosamedicado con toxina alfa.

Ejemplo 3: La combinación de anticuerpos anti-toxina alfa y anti-P. aeruginosa favorece la supervivencia en un modelo de infección polimicrobiana por S. aureus y P. aeruginosa

Para determinar si los anticuerpos podían aumentar la supervivencia de los ratones coinoculados con Paeruginosay S.aureus,se administró a los ratones 15 mg/kg de LC10 (un anticuerpo contra la toxina alfa de S.aureus)en combinación con 1 mg/kg de MEDI3902 (un anticuerpo biespecífico que se une a Psl y PcrV de Paeruginosa),o 15 mg/kg de anticuerpo de control del isotipo (R347). Los anticuerpos se administraron 24 horas antes de la inoculación con 1e5 CFU de Paeruginosay/o 1e8 CFU de S.aureus.Los ratones inoculados únicamente con S.aureusoP. aeruginosasobrevivieron (Figura 8). Sin embargo, los ratones inoculados tanto con S.aureuscomo con Paeruginosano sobrevivieron cuando recibieron el anticuerpo de control (Figura 8). La administración de los anticuerpos LC10 y MEDI3902 fue capaz de rescatar a los ratones que recibieron tanto S.aureuscomo Paeruginosa(Figura 8).

Se realizaron experimentos similares en los que se variaron las cantidades de S.aureusy Paeruginosaen las inoculaciones. Las inoculaciones contenían 5e7 CFU de S.aureusy 1.1e5 CFU de Paeruginosa.La combinación de los anticuerpos LC10 y MEDI3902 aumentó drásticamente la supervivencia de los ratones durante siete días en comparación con el anticuerpo de control (R347).

Para evaluar la importancia del momento de administración de los anticuerpos protectores anti-S.aureusy anti-Paeruginosa,se administró a los ratones 15 mg/kg de LC10 y 1 mg/kg de MEDI3902 o 15 mg/kg de R347 en tres momentos diferentes: 48 horas antes de la inoculación, 24 horas antes de la inoculación o 1 hora después de la inoculación. Todos los ratones fueron inoculados con 5e7 - 1e8 CFU de S.aureusy 5e4 CFU de Paeruginosa.La administración en cualquiera de los tres momentos probados fue suficiente para aumentar la supervivencia de los ratones durante siete días en comparación con la administración del anticuerpo de control (Figura 9).

Estos datos demuestran que la combinación de anticuerpos anti-S.aureusy anti-Paeruginosapreviene las infecciones por colonias mixtas de S.aureusy Paeruginosa.

Ejemplo 4: El anticuerpo contra la toxina alfa es suficiente para inhibir el crecimiento de P. aeruginosa en un modelo de coinfección de S. aureus y P. aeruginosa

Para examinar los efectos de los anticuerpos individuales sobre el crecimiento de colonias mixtas de S.aureusyP. aeruginosa,se administró a los ratones (i) una combinación de 15 mg/kg de LC10 y 1 mg/kg de MEDI3902, (ii) 15 mg/kg de LC10, (iii) 1 mg/kg de MEDI3902, o (iv) 15 mg/kg de anticuerpo de control (R347). Los anticuerpos se administraron 24 horas antes de inocular a los ratones 5e7 CFU de S.aureusy 1e5 CFU de Paeruginosa.Los pulmones se recolectaron 24 horas después de la infección y los homogeneizados se colocaron en agar selectivo para evaluar el crecimiento de S.aureusy Paeruginosa.Sorprendentemente, la administración del anticuerpo contra la toxina alfa de S. aureus redujo el crecimiento tanto de S.aureuscomo de Paeruginosa,y la administración del anticuerpo contra Paeruginosaredujo el crecimiento tanto de S.aureuscomo de Paeruginosa(Figura 10).

Estos datos demuestran que los anticuerpos contra la toxina alfa de S.aureuspueden inhibir el crecimiento de Paeruginosaen una colonia mixta que contiene tanto S.aureuscomo Paeruginosa.Además, los anticuerpos anti-P. aeruginosa reducen las CFU de S.aureusen un modelo de coinfección S.aureus/P. aeruginosa.

Ejemplo 5: La proliferación y diseminación sistémica de P. aeruginosa se correlaciona con la pérdida dependiente de la AT de la integridad de la barrera de las vías respiratorias

La unión de AT a su receptor, ADAM10, en la superficie de la célula epitelial provoca una fuga vascular debido a la reorganización de las proteínas de unión y a la lisis celular (Bubeck Nat Med ADAM10 gp unión). Se observó necrosis epitelial en secciones pulmonares de ratones infectados con S.aureuso tratados con AT. Además, se observó un aumento de la hemoglobina de las vías respiratorias en los ratones infectados con S.aureuso AT, lo que indica la presencia de glóbulos rojos. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que la AT puede promover la diseminación de Gram-negativos mediante la perturbación de la barrera epitelial. En la infección mixta con S.aureuso AT purificada, el bazo contenía un número significativamente mayor de Paeruginosaen comparación con los animales infectados sólo con Paeruginosa(Figura 11A). No hubo diferencias en la carga bacteriana de S.aureusen los bazos de los ratones de los grupos mono o coinfectados (Figura 11B). La profilaxis con LC10 disminuyó significativamente el número de Paeruginosarecuperados de los órganos distales a las 24 y 48 h (Figura 11C). Estos datos demuestran que la AT promueve la diseminación sistémica de Paeruginosadurante una infección mixta.

Ejemplo 6: S. aureus AT potencia la infección con diversas bacterias Gram negativas

Para determinar si el efecto de la AT es específico de Paeruginosao podría observarse durante la coinfección por SA con otros organismos Gram negativos, se realizaron coinfecciones por SA conK. pneumoniaeoA. baumannii.Dosis subletales de exposición IN de 5e1 CFU/ratónK. pneumoniaeo 1e6 CFU/ratónA. baumannii(1/20 y 1/10 LD100 respectivamente) con 5e7 CFU/ratón S.aureusprodujeron una letalidad del 90-100 % y un aumento de la carga bacteriana Gram-negativa en el pulmón y los tejidos distales en comparación con las monoinfecciones Gramnegativas (Figuras 12B,C,E,F). De forma similar a los resultados obtenidos con Pa, la profilaxis con LC10 y la coinfección conúhlaevitaron la letalidad y redujeron la carga bacteriana Gram-negativa, lo que sugiere que AT también desempeña un papel clave en la potenciación de las coinfecciones con estos patógenos. De acuerdo con esta hipótesis, la administración conjunta de una dosis subletal de AT junto con Kp o Ab fue suficiente para potenciar el crecimiento del patógeno Gram negativo e inducir una infección letal. Estos datos demuestran que la expresión de AT de S.aureuspotencia la infección respiratoria con un intervalo de patógenos bacterianos oportunistas Gramnegativos.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias VH y VL de las SEQ ID NOs: 45 y 46 para su uso en el tratamiento o prevención de una infección polibacteriana en un paciente, en el que la infección polibacteriana comprende S.aureusy al menos otra bacteria Gram negativa, cuyo crecimiento está potenciado por la toxina alfa de S.aureus.

2. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con la reivindicación 1, en el que al menos otra bacteria esPseudomonas aeruginosa(Paeruginosa), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae)oAcinetobacter baumannii (A. baumannii).

3. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra durante dos o más ciclos de prevención o tratamiento.

4. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 3, que comprende además la administración de un segundo agente antibacteriano.

5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con la reivindicación 4, en el que el segundo agente antibacteriano es un antibiótico.

6. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con la reivindicación 5, en el que el antibiótico es ciprofloxacino.

7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.