ES2983287T3 - Método de preparación para células envolventes olfativas - Google Patents
Método de preparación para células envolventes olfativas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2983287T3 ES2983287T3 ES16838484T ES16838484T ES2983287T3 ES 2983287 T3 ES2983287 T3 ES 2983287T3 ES 16838484 T ES16838484 T ES 16838484T ES 16838484 T ES16838484 T ES 16838484T ES 2983287 T3 ES2983287 T3 ES 2983287T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- olfactory
- olfactory ensheathing
- ensheathing cells
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 129
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 29
- 210000001706 olfactory mucosa Anatomy 0.000 claims description 26
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 20
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000001944 turbinate Anatomy 0.000 claims description 14
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 12
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 12
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 12
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 8
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 claims description 8
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 3
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 abstract 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 6
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 3
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 210000002718 aborted fetus Anatomy 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001180 ethmoid sinus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000196 olfactory nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000002475 olfactory pathway Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Se proporciona un método de preparación de células olfativas envolventes. El método comprende las etapas de preparación de un medio de cultivo celular, toma de muestras de tejido y pretratamiento, digestión enzimática, cultivo celular, conservación congelada y cultivo de diferenciación. Las células olfativas envolventes preparadas pueden mantener la capacidad de multiplicación durante un largo tiempo y las células olfativas envolventes siguen activas durante el paso a la 11.ª generación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método de preparación para células envolventes olfativas
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la tecnología de cultivo celular y se refiere a un método de preparación para células envolventes olfativas que comprende el aislamiento, los pases, la crioconservación y la diferenciación de las células envolventes olfativas, y a la formulación de los reactivos necesarios.
Antecedentes de la técnica
Las células envolventes olfativas (OEC, por sus siglas en inglés), originadas en el epitelio olfativo, están dispersas en los bulbos olfativos y la mucosa olfativa, véase Guo, Xinet al.: "Comparison of Growth of Human Olfactory Epithelium Ensheathing Cells in Different Culture Conditions", Zhejiang Clinical Medical Journal,vol. 16, n.° 9, 30 de septiembre de 2014 (30-09-2014), página 1366. Las neuronas olfativas primitivas, junto con una gran cantidad de células placoda, migran desde los axones eferentes de la mucosa olfativa hacia las vesículas telencefálicas, y las células envolventes olfativas guían los axones neuronales olfativos para llegar a las vesículas telencefálicas. Estas células forman bulbos olfativos tempranos que después se evierten, y las células migradas cubren sus superficies para formar una capa delgada y después penetran en la glía limitante, dando como resultado la creación de la capa nerviosa olfativa y la capa glomerular, que se convierten en una nueva glía limitante que cubre las superficies de los bulbos olfativos. Las células envolventes olfativas en un adulto aún pueden migrar a través de la barrera de la glía limitante entre los nervios periféricos y los nervios centrales. En los bulbos olfativos, las células envolventes olfativas son las únicas células gliales que entran en contacto y rodean los axones neuronales olfativos. A lo largo de toda la vía del sistema nervioso central, las células envolventes olfativas rodean los axones neuronales olfativos para evitar su contacto con las células de otros sistemas nerviosos centrales. Las OEC puede secretar factores neurotróficos y sustancias para estimular el crecimiento de los axones, que puede promover la regeneración axonal y facilitar la mielinización. Como un tipo de células gliales especiales que tienen funciones similares a las de las células de Schwann y los oligodendrocitos, las OEC tienen efectos nutritivos, protegiendo, regulando o estimulando los nervios, promoviendo la mielinización y la regeneración de axones, inhibiendo la hiperplasia glial y la formación de cicatrices, y otros efectos reparadores sobre el sistema nervioso. Estas propiedades de las células envolventes olfativas proporcionan un buen entorno interno para el restablecimiento y la reconstrucción funcional y estructural de los nervios dañados o degenerativos. Las propiedades de las células envolventes olfativas las convierten en la opción óptima para el neurorrestablecimiento. Los artículos publicados con respecto al trasplante de las células envolventes olfativas también han demostrado poderosamente que las células envolventes olfativas son las mejores células para el neurorrestablecimiento. Sin embargo, el método de preparación existente para células envolventes olfativas comprende: tomar tejidos del bulbo olfativo en el cerebro de fetos abortados de 3-5 meses, cultivarlos directamente con una determinada cantidad de suero animal y después usar una determinada cantidad de citarabina, métodos físicos o agentes químicos para inhibir o reducir fibroblastos con el fin de conseguir el fin de purificar células envolventes olfativas. El uso de una solución de crioconservación para células envolventes olfativas que se fabrican mezclando suero animal en una alta concentración con DMSO da como resultado muchas desventajas:
1. factores éticos: el uso de los tejidos del bulbo olfativo que derivan de fetos abortados puede estar limitado por motivos éticos;
2. menor pureza celular: (1) la citarabina y los reactivos químicos, que son citostáticos de amplio espectro, inhiben las células envolventes olfativas inhibiendo al mismo tiempo el crecimiento de fibroblastos, y sus cantidades son difíciles de determinar; (2) los métodos físicos dan como resultado la pérdida de un gran número de células envolventes olfativas cuando se eliminan los fibroblastos; (3) los fibroblastos crecen más rápido y más fácilmente cuando se usa un medio de cultivo que contiene suero;
3. imposibilidad de cultivo de pases continuos: (1) la citarabina y los reactivos químicos, como citostáticos de amplio espectro, afectan a los números de pases de las células envolventes olfativas; (2) cuando se usa suero como medio básico, las células envolventes olfativas son fáciles de diferenciar de forma no direccional y los fibroblastos crecen rápidamente y es difícil mantener las características biológicas después de múltiples pases;
4. existencia de riesgos potenciales: las muestras de suero y tejido alógeno son susceptibles a infecciones víricas y bacterianas y propensas a provocar rechazos, alergias u otros peligros desconocidos.
Jiang, Xiaoronget al.: "Isolation, Culture and Purification of Olfactory Ensheathing Cells from Human Fetal Olfactory Mucosa", Proceedings of the 5 th Annual Conference of International Association of Neurorestoratology, the 9 th Annual Conference of Global College of Neuroprotection and Neuroregeneration & the 4 th International Spinal Cord Injury Treatments and Trials Symp,31 de diciembre de 2012 (31-12-2012) describe un método para obtener células envolventes olfativas de la mucosa olfativa fetal humana mediante cultivo celular para la adhesión selectiva en presencia de neurotrofina-3 (NT3) y suero de baja concentración.
A partir de CN105062956A se conoce un protocolo de cultivo para células envolventes olfativas.
El cultivo de las células envolventes olfativas de la mucosa olfativa en un medio de cultivo para células envolventes que se incuban a 37 °C y CO2 al 5% sedesvela en Anne Mayeuret al.: "Potential o f Olfactory Ensheathing Cells from Different Sources for Spinal Cord Repair', Plos One,vol. 8, n.° 4, 24 de abril de 2013 (24-04-2013), página e62860, XP055526934.
E. Auet al.: "SPARC from Olfactory Ensheathing Cells Stimulates Schwann Cells to Promote Neurite Outgrowth and Enhances Spinal Cord Repair', The Journal of Neuroscience,vol. 27, n.° 27, 4 de julio de 2007 (04-07-2007), páginas 7208-7221, XP055527352, desvela la generación de medios acondicionados a partir de células envolventes olfativas.
Contenido de la invención
Para resolver los problemas mencionados anteriormente existentes en la técnica anterior, el objeto de la presente invención es proporcionar un método de preparación que pueda obtener un gran número de células envolventes olfativas activas de forma rápida y conveniente, proporcionando de este modo una fuente suficiente de células envolventes olfativas para el tratamiento de neurorrestablecimiento clínico.
Las soluciones técnicas utilizadas para realizar los objetos anteriores son las siguientes:
Un método de preparación para células envolventes olfativas, que comprende las siguientes etapas:
(1) cultivar células envolventes olfativas individuales derivadas de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio en un medio de cultivo para células envolventes olfativas en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, y permitir que las células crezcan de forma adherente, el medio de cultivo para células envolventes olfativas es DMEM/DF12 (Gibco) como medio de cultivo básico, complementado con factores neurotróficos que comprenden EGF 20 60 ng/ml, FGF 20-80 ng/ml, 1-2 ml de N2 (100*), 2-3 ml de B27 (50*) y T3 (Sigma) 0,1 |jg/ml en concentraciones finales;
(2) recoger y filtrar un sobrenadante de cultivo obtenido en la etapa (1) cuando las células crecen de forma adherente a aproximadamente el 90 % para obtener un sobrenadante de cultivo celular filtrado, mezclar el sobrenadante de cultivo celular filtrado con el medio de cultivo para células envolventes olfativas en una relación de 1:3 para formular un medio de cultivo para hacer pases, mezclar las células obtenidas filtrando el sobrenadante de cultivo obtenido en la etapa (1) con el medio de cultivo para hacer pases, cultivarlas en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, y permitirles crecer de forma adherente.
Preferentemente, las células envolventes olfativas son células envolventes olfativas derivadas de mucosa olfativa humana.
Preferentemente, el medio de cultivo para células envolventes olfativas derivadas de mucosa olfativa humana es DMEM/DF 12 (Gibco), complementado con factores neurotróficos que comprenden EGF (Pepro Tech) 20 ng/ml, (Pepro Tech)FGF 20 ng/ml, (Gibco) N2 al 1 %, B27 (Gibco) al 2 % y T3 (Sigma).
Preferentemente, el método de preparación para células envolventes olfativas individuales comprende la siguiente etapa:
digerir bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio con una enzima para obtener células individuales.
Más preferentemente, el método de preparación para células envolventes olfativas individuales comprende la siguiente etapa:
digerir bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio con Colagenasa I y una proteasa neutra para obtener células individuales.
Preferentemente, la proteasa neutra es Dispasa II para tejidos.
Más preferentemente, el método de preparación para células envolventes olfativas individuales comprende la siguiente etapa:
digerir bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio en un tamaño de 1 mm3 con Colagenasa I y una proteasa neutra en baño de agua a 37 °C con vibración, para obtener células individuales, en donde la relación en volumen de la colagenasa y la proteasa neutra y los bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio es de 2:1.
Preferentemente, la Colagenasa I se usa a una concentración del 0,1 % y la proteasa neutra se usa a una concentración del 0,2 %.
Además, preferentemente, los bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio se lavan antes de la digestión para eliminar la sangre residual de la superficie; aún más preferentemente, la sangre residual en la superficie se elimina mediante una solución de penicilina y suero fisiológico en una relación de 1:1; incluso más preferentemente, la mucosa olfativa limpia se corta en bloques de tejido de un tamaño de 1 mm3 con unas tijeras esterilizadas en una placa de cultivo.
Preferentemente, la densidad de inoculación del cultivo en la etapa (1) es de 1 * 104 células/ml.
Preferentemente, la densidad de inoculación del cultivo en la etapa (2) es de 1*104 células/ml.
Preferentemente, el método de preparación comprende además las etapas de pases o crioconservación de las células envolventes olfativas.
Preferentemente, el método de preparación comprende además una etapa de crioconservación de las células envolventes olfativas; preferentemente, la crioconservación es la crioconservación a una temperatura ultrabaja; preferentemente, la crioconservación de las células envolventes olfativas a temperatura ultrabaja comprende las siguientes etapas: filtrar el sobrenadante de cultivo cuando las células en la etapa (2) crecen de manera adherente al 90 %, y preparar un medio de crioconservación para células envolventes olfativas a partir del sobrenadante de cultivo para la crioconservación. Más preferentemente, el medio de crioconservación para las células envolventes olfativas consiste en el suero autólogo, el sobrenadante de cultivo, DMEM/F12 y DMSO. Además, preferentemente, el medio de crioconservación para las células envolventes olfativas consiste en el suero autólogo, el sobrenadante de cultivo, DMEM/F12 y DMSO en una relación en volumen de 5:2:2:1.
Preferentemente, el método de preparación comprende además una etapa de cultivo de diferenciación de las células envolventes olfativas; preferentemente, la etapa de cultivo de diferenciación de las células envolventes olfativas comprende añadir un medio de cultivo para la diferenciación de las células gliales a las células envolventes olfativas para el cultivo de diferenciación. Más preferentemente, el medio de cultivo para la diferenciación de las células gliales consiste en un medio de cultivo para células envolventes olfativas y el suero autólogo en una relación en volumen de 87:13.
En un ejemplo específico, el método de preparación puede consistir en las siguientes etapas:
Etapa 1. formular un medio de cultivo para células envolventes olfativas con factores neurotróficos;
Etapa 2. recogida de tejidos: sujetar una cantidad adecuada de los tejidos de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio con anestesia local;
Etapa 3. pretratamiento de bloques de tejido: lavar la sangre residual en las superficies de los bloques de tejido sujetados y procesar los bloques de tejido en bloques de un tamaño de 1 mm3;
Etapa 4. digestión con una combinación de dos enzimas: recoger los bloques de tejido picados con tijeras, añadir 2 volúmenes de Colagenasa I y una proteasa neutra y digerir en baño de agua a 37 °C con vibración;
Etapa 5. cultivo primario: recoger células individuales obtenidas mediante la digestión y colocarlas en un tubo de centrífuga, mezclar bien con un medio de cultivo para células envolventes olfativas, después inocular en un matraz de cultivo celular y cultivar en una incubadora a 37 °C y CO2 al 5 %;
Etapa 6. cultivo por pases: recoger y filtrar el sobrenadante de cultivo de la célula de la que se han de hacer pases cuando las células crecen de forma adherente a aproximadamente el 90 %, y mezclarlo con un medio de cultivo para células envolventes olfativas en una relación de 1:3, para formular un medio de cultivo para el presente pase. Etapa 7. crioconservación a una temperatura ultrabaja: recoger y filtrar el sobrenadante de las células que se han de crioconservar cuando las células crecen de forma adherente a aproximadamente el 90 %, para formular un medio de crioconservación específico para células envolventes olfativas (que comprende el suero autólogo, el sobrenadante de cultivo celular, DMEM/F12 y DMSO); y crioconservar de acuerdo con los procedimientos habituales;
Etapa 8. cultivo de diferenciación: añadir un medio de cultivo formulado para la diferenciación de células gliales (un medio de cultivo para células envolventes olfativas: el suero autólogo = 87: 13) y cultivo de diferenciación de acuerdo con los procedimientos habituales.
El método de preparación de la presente invención implica la recogida de tejidos, la digestión mediante una combinación de dos enzimas, el cultivo por pases, la crioconservación a una temperatura ultrabaja, el cultivo de diferenciación y la formulación de los reactivos requeridos. Las ventajas de la presente invención son que el método proporcionado para extraer y cultivar células envolventes olfativas puede obtener rápidamente una gran cantidad de células envolventes olfativas y mantener la capacidad proliferativa de las células envolventes olfativas durante un largo tiempo, y las células obtenidas después del 11.° pase todavía tienen las actividades de las células envolventes olfativas, como se muestra en las figuras. La Fig. 1 muestra que las células adherentes tienen forma de huso, con protuberancias alargadas bipolares, protuberancias alargadas tripolares o polígono, observadas con un microscopio invertido ordinario, aumento: 10*/0,25. La Fig. 2 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de las células envolventes olfativas bajo un microscopio confocal, en donde (A) muestra fluorescencia verde, tinción inmunocitoquímica para S100; (B) muestra fluorescencia roja, tinción inmunocitoquímica para p75 (L-NGFR); (C) muestra fluorescencia azul, estando los núcleos marcados mediante Hoechst; y (D) es un gráfico con fluorescencia de espectro completo; aumento: 20*/0,5. Las células cultivadas expresan S100 y P75 (L-NGFR) en niveles elevados, que son los marcadores positivos de las células envolventes olfativas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados del examen microscópico de las células envolventes olfativas, aumento: 10*/0,25.
La Figura 2 muestra las identificaciones por microscopía confocal de las células envolventes olfativas mediante tinción inmunohistoquímica, aumento: 20*/0,5.
Mejores modos para realizar la invención
1. Formulación de un medio de cultivo para células envolventes olfativas
Se formuló un medio de cultivo para células envolventes olfativas con DMEM/DF12 (Gibco) como medio de cultivo básico, que se complementó con los factores de cultivo que comprenden EGF 20-60 ng/ml, FGF 20-80 ng/ml, 1-2 ml de N2 (100*), 2-3 ml de B27 (50*) y T3 (Sigma) 0,1 pg/ml en concentraciones finales, después se filtró y se esterilizó en una mesa limpia y se almacenó a 4 °C para su uso posterior.
2. Recogida de tejidos
Dos días antes de la adquisición de bloques de tejido, la cavidad nasal se limpió y se confirmó que no estaba infectada. Antes de la adquisición, se realizaron dos operaciones de anestesia local por vía intranasal insertando una lámina de hilo de algodón humedecida con una solución salina fisiológica que contenía tetracaína al 1,2 %-1,5 % en la cavidad nasal con unas pinzas en forma de pistola, cada una de ellas realizada durante 5-10 min; los tejidos de la mucosa olfativa cerca del 1/3 superior y externo de los cornetes superior y medio se tomaron con pinzas para el seno etmoidal y los tejidos obtenidos se colocaron en una placa de vidrio; y después la placa de vidrio se colocó en una hielera, que se devolvió a una sala de cultivo inmediatamente.
3. Pretratamiento de tejidos
Después de devolverlos al laboratorio, los bloques de tejido se lavaron con una solución salina fisiológica que contenía penicilina 100 U/ml para eliminar la sangre residual en la superficie de los bloques de tejido mucoso y se cortaron en bloques de un tamaño de 1 mm3 con unas tijeras oftalmológicas esterilizadas en una placa de vidrio.
4. Digestión mediante una combinación de dos enzimas
Los bloques de tejido picados con tijeras se recogieron, a los que se les añadieron 2 volúmenes de Colagenasa I y una proteasa neutra, y se digirieron en baño de agua a 37 °C con vibración durante 15 min, y después se pipetearon repetidamente con una pipeta que tenía un codo grueso, y se dejaron reposar de forma natural durante 1 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga y la digestión finalizó. La operación anterior se repitió 3 veces de manera que los tejidos pudieran digerirse en una suspensión de células individuales. Todas las suspensiones celulares después de la terminación de la digestión se recogieron juntas y se centrifugaron a 1200 r/4 min, se lavaron con DMEM/F12 y se centrifugaron a 1200 r/4 min durante un total de 3 veces.
5. Cultivo primario
Se añadió un medio de cultivo para células envolventes olfativas para preparar una suspensión de células individuales, que se inoculó en un matraz de cultivo de plástico con una abertura diagonal tratado con poli-L-lisina a una densidad de 1 * 104 células/ml, después se cultivó en una incubadora de temperatura y humedad constantes a 37 °C y CO2 al 5 %.
6. Cultivo por pases
El sobrenadante de cultivo se recogió cuando las células crecieron a aproximadamente el 90 % de confluencia, se filtró con un filtro de 0,22 pm y se mezcló con un medio de cultivo para células envolventes olfativas en una relación de 1:3 para formular el medio de cultivo para el presente pase; las células se recogieron, a las que se les añadió una cantidad adecuada de medio de cultivo para pases para preparar una suspensión celular, después de teñir con azul tripano, las células viables se contaron bajo un microscopio y después se hicieron pases nuevamente, siendo la densidad de las células de las que se hicieron pases 1 * 104 células/cm3.
7. Crioconservación a una temperatura ultrabaja
El sobrenadante de cultivo se recogió cuando las células crecieron a aproximadamente el 90 % de confluencia, se filtró con un filtro de 0,22 pm para formular un medio de crioconservación específico para células envolventes olfativas (una relación en volumen del suero autólogo: el sobrenadante del cultivo celular: DMEM/F12: DMSO = 5:2:2:1); las células para la crioconservación se recogieron de forma habitual, a lo que se le añadió un crioprotector, y la densidad final de las células se ajustó a 5 * 106 células/ml ~ 5 * 107 células/ml. Las células se almacenaron a 4 °C durante 60 minutos y a -20 °C durante 70 minutos, y se crioconservaron a una temperatura ultrabaja de -80 °C durante la noche antes de colocarlas en un tanque de nitrógeno líquido.
8. Cultivo de diferenciación
Se formuló un medio de diferenciación para células gliales (una relación en volumen de un medio de cultivo para células envolventes olfativas: el suero autólogo = 87: 13) y se conservó a 4 °C para su uso posterior; se añadió el medio de diferenciación formulado para células gliales y se realizó un cultivo de diferenciación de acuerdo con los procedimientos habituales.
Específicamente, la presente invención se ha descrito anteriormente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los ejemplos anteriores.
Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o a métodos de diagnósticoin vivoen los ejemplos anteriores han de interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos.
Claims (22)
1. Un método de preparación para células envolventes olfativas, que comprende las siguientes etapas:
(1) cultivar células envolventes olfativas individuales derivadas de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio en un medio de cultivo para células envolventes olfativas en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 % y permitir que las células crezcan de forma adherente, el medio de cultivo para células envolventes olfativas es DMEM/DF12 (Gibco) como medio de cultivo básico, complementado con factores neurotróficos que comprenden EGF 20 60 ng/ml, FGF 20-80 ng/ml, 1-2 ml de N2 (1o0*), 2-3 ml de B27 (50*) y T3 (Sigma) 0,1 |jg/ml en concentraciones finales;
(2) recoger y filtrar un sobrenadante de cultivo obtenido en la etapa (1) cuando las células crecen de forma adherente a aproximadamente el 90 % para obtener un sobrenadante de cultivo celular filtrado, mezclar el sobrenadante de cultivo celular filtrado con el medio de cultivo para células envolventes olfativas en una relación de 1:3 para formular un medio de cultivo para hacer pases, mezclar las células obtenidas filtrando el sobrenadante de cultivo obtenido de la etapa (1) con el medio de cultivo para hacer pases, cultivarlas en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, y permitir a las células crecer de forma adherente.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células envolventes olfativas son las células envolventes olfativas derivadas de mucosa olfativa humana.
3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el medio de cultivo para células envolventes olfativas derivadas de mucosa olfativa humana consiste en DMEM/DF 12 (Gibco) y los siguientes factores neurotróficos: EGF (Pepro Tech) 20 ng/ml, FGF (Pepro Tech) 20 ng/ml, N2 (Gibco) al 1 %, B27 (Gibco) al 2 % y T3 (Sigma).
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el método de preparación para células envolventes olfativas individuales comprende la siguiente etapa:
digerir bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio con una enzima para obtener células individuales.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el método de preparación para células envolventes olfativas individuales comprende la siguiente etapa:
digerir bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio con Colagenasa I y una proteasa neutra para obtener células individuales.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la proteasa neutra es Dispasa II para tejidos.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el método de preparación para células envolventes olfativas individuales comprende la siguiente etapa:
digerir bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio en un tamaño de 1 mm3 con Colagenasa I y una proteasa neutra en baño de agua a 37 °C con vibración para obtener células individuales, en donde la relación en volumen de Colagenasa I y una proteasa neutra con respecto a los bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio es de 2:1.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la Colagenasa I se usa a una concentración del 0,1 % y la proteasa neutra se usa a una concentración del 0,2 %.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde los bloques de tejido de la mucosa olfativa de los cornetes superior y medio se lavan antes de la digestión para eliminar la sangre residual de la superficie.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la sangre residual en la superficie se elimina mediante una solución de penicilina y solución salina fisiológica en una relación de 1:1.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la mucosa olfativa limpia se corta en bloques de tejido con un tamaño de 1 mm3 en una placa de cultivo con unas tijeras esterilizadas.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la densidad de inoculación del cultivo en la etapa (1) es de 1*104 células/ml.
13. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-11, en donde la densidad de inoculación del cultivo en la etapa (2) es de 1*104 células/ml.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el método de preparación comprende además una etapa de pases o crioconservación de las células envolventes olfativas.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el método de preparación comprende además una etapa de crioconservación de las células envolventes olfativas.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la crioconservación es crioconservación a una temperatura ultrabaja.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la crioconservación de las células envolventes olfativas a una temperatura ultrabaja comprende las siguientes etapas: filtrar el sobrenadante de cultivo cuando las células en la etapa (2) crecen de forma adherente al 90 % para preparar un medio de crioconservación para la crioconservación de las células envolventes olfativas.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el medio de crioconservación para las células envolventes olfativas consiste en el suero autólogo, el sobrenadante de cultivo, DMEM/F12 y DMSO.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el medio de crioconservación para las células envolventes olfativas consiste en el suero autólogo, el sobrenadante de cultivo, DMEM/F12 y DMSO en una relación en volumen de 5:2:2:1.
20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el método de preparación comprende además una etapa de cultivo de diferenciación de las células envolventes olfativas.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la etapa de cultivo de diferenciación de las células envolventes olfativas comprende añadir un medio de cultivo para la diferenciación de células gliales a las células envolventes olfativas y cultivar para la diferenciación.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el medio de cultivo para la diferenciación de células gliales consiste en un medio de cultivo para células envolventes olfativas y el suero autólogo en una relación en volumen de 87:13.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510516055.2A CN105062956B (zh) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 人嗅粘膜嗅鞘细胞分离、传代、冻存、分化技术 |
| PCT/CN2016/094529 WO2017032224A1 (zh) | 2015-08-21 | 2016-08-11 | 一种嗅鞘细胞的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2983287T3 true ES2983287T3 (es) | 2024-10-22 |
Family
ID=54492476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16838484T Active ES2983287T3 (es) | 2015-08-21 | 2016-08-11 | Método de preparación para células envolventes olfativas |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10829734B2 (es) |
| EP (1) | EP3339427B1 (es) |
| JP (1) | JP6812435B2 (es) |
| CN (1) | CN105062956B (es) |
| ES (1) | ES2983287T3 (es) |
| PL (1) | PL3339427T3 (es) |
| WO (1) | WO2017032224A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105062956B (zh) * | 2015-08-21 | 2018-02-09 | 北京市虹天济神经科学研究院 | 人嗅粘膜嗅鞘细胞分离、传代、冻存、分化技术 |
| CN105349491B (zh) * | 2015-12-15 | 2019-09-24 | 北京市虹天济神经科学研究院 | 来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术 |
| CN108441475B (zh) * | 2018-03-21 | 2020-09-29 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种培养中鼻甲来源嗅鞘细胞的方法 |
| CN112239747A (zh) * | 2019-11-15 | 2021-01-19 | 北京市虹天济神经科学研究院 | 一种嗅前体细胞的制备方法 |
| CN115261324B (zh) * | 2022-07-13 | 2024-05-17 | 华中农业大学 | 鱼类嗅觉神经元的培养方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPQ369599A0 (en) * | 1999-10-27 | 1999-11-18 | Griffith University | A method of preparing olfactory cells for transplantation |
| GB0218316D0 (en) | 2002-08-07 | 2002-09-11 | Medical Res Council | Improvements relating to therapy |
| AR046076A1 (es) * | 2003-07-18 | 2005-11-23 | Otsuka Pharma Co Ltd | Procedimiento para obtener una poblacion homogenea de celulas precursoras de oligodendrocitos y poblacion obtenida |
| WO2005046598A2 (en) | 2003-11-07 | 2005-05-26 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Culturing and differentiating neural precursor cells |
| JP4844042B2 (ja) | 2005-08-18 | 2011-12-21 | ソニー株式会社 | 平面型表示装置 |
| PL212052B1 (pl) * | 2005-12-14 | 2012-08-31 | Akademia Medyczna Im Piastow Śląskich We Wrocławiu | Sposób pozyskiwania glejowych komórek węchowych i ich zastosowania |
| JP2007222045A (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Yamaguchi Univ | 中枢神経障害性疾患の回復誘発細胞 |
| CN101591641A (zh) * | 2008-05-30 | 2009-12-02 | 北京市虹天济神经科学研究院 | 嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法 |
| CN105062956B (zh) * | 2015-08-21 | 2018-02-09 | 北京市虹天济神经科学研究院 | 人嗅粘膜嗅鞘细胞分离、传代、冻存、分化技术 |
-
2015
- 2015-08-21 CN CN201510516055.2A patent/CN105062956B/zh active Active
-
2016
- 2016-08-11 EP EP16838484.0A patent/EP3339427B1/en active Active
- 2016-08-11 WO PCT/CN2016/094529 patent/WO2017032224A1/zh not_active Ceased
- 2016-08-11 JP JP2018528369A patent/JP6812435B2/ja active Active
- 2016-08-11 US US15/754,171 patent/US10829734B2/en active Active
- 2016-08-11 PL PL16838484.0T patent/PL3339427T3/pl unknown
- 2016-08-11 ES ES16838484T patent/ES2983287T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018526025A (ja) | 2018-09-13 |
| WO2017032224A1 (zh) | 2017-03-02 |
| PL3339427T3 (pl) | 2024-08-26 |
| CN105062956A (zh) | 2015-11-18 |
| EP3339427B1 (en) | 2024-04-17 |
| US20180245040A1 (en) | 2018-08-30 |
| EP3339427A1 (en) | 2018-06-27 |
| CN105062956B (zh) | 2018-02-09 |
| US10829734B2 (en) | 2020-11-10 |
| JP6812435B2 (ja) | 2021-01-13 |
| EP3339427A4 (en) | 2019-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2983287T3 (es) | Método de preparación para células envolventes olfativas | |
| JP2010538681A (ja) | 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法 | |
| ES2701799T3 (es) | Procedimiento para aislamiento y purificación de células madre epiteliales de la piel | |
| Lee et al. | A pre-clinical assessment model of rat autogeneic bone marrow stromal cell transplantation into the central nervous system | |
| PT103843A (pt) | Método de isolamento de células precursoras a partir do cordão umbilical humano | |
| ES2550456T3 (es) | Uso de una composición que contiene células madre mesenquimatosas derivadas de sangre de cordón umbilical humano para inducir diferenciación y proliferación de células precursoras neurales o células madre neurales a células neurales | |
| CN104031881B (zh) | 一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| Yang et al. | Platelet poor plasma gel combined with amnion improves the therapeutic effects of human umbilical cord‑derived mesenchymal stem cells on wound healing in rats | |
| CN104622709B (zh) | 人干细胞因子皮肤修复液及其制备方法 | |
| Eça et al. | Comparative study of technique to obtain stem cells from bone marrow collection between the iliac crest and the femoral epiphysis in rabbits | |
| CN108126246A (zh) | 基于复合干细胞的人工皮肤构建方法 | |
| Costa et al. | Labeling of adipose-derived stem cells with quantum dots provides stable and long-term fluorescent signal for ex vivo cell tracking | |
| WO2019237771A1 (zh) | 一种治疗脑部疾病的干细胞制剂海绵贴片复合体、其制备方法及应用 | |
| CN103013910A (zh) | 人退变椎间盘软骨终板干细胞、制备方法及其应用 | |
| CN106377799A (zh) | 一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法 | |
| CN102552323B (zh) | 加速皮肤修复与再生的药物及其制备方法和应用 | |
| BR112020004517A2 (pt) | células tronco derivadas de porco neonato e processo para sua preparação | |
| CN105087466B (zh) | 诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法 | |
| CN105349491B (zh) | 来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术 | |
| CN111484971A (zh) | 血源性女性自体生殖干细胞的制备方法和试剂盒及应用 | |
| CN106995796A (zh) | 基于细胞因子的细胞处理方法、试剂盒及冻干粉 | |
| CN112569227B (zh) | 一种具有神经保护功能的3d立体移植材料体系及其应用 | |
| RU2631642C1 (ru) | Способ лечения нерубцовой алопеции | |
| CN108542915A (zh) | 一种促进伤口愈合的药物及其制备方法 | |
| CN116920069B (zh) | 一种中药提取液及其在促进脐带干细胞分泌vegf中的应用 |