ES2983409T3

ES2983409T3 - Agonista de Glp-1/glucagón para su uso en el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica

Info

Publication number: ES2983409T3
Application number: ES17710231T
Authority: ES
Inventors: Maria Bednarek; Lutz Jermutus; Philip Ambery; Marcella Petrone
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2024-10-23
Anticipated expiration: 2037-03-10
Also published as: AU2017229530A1; CA3015922A1; JP7237590B2; EP3426284B1; IL261528B1; US20200354426A1; AR107890A1; WO2017153575A1; CN108697769A; US20190185537A1; IL261528B2; EA201891946A1; EP3426284A1; AU2020202381A1; KR20180120739A; JP2019510014A; US20220041681A1; NZ746784A; IL261528A; JP7237590B6

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y tratar la obesidad y la diabetes en pacientes que comprenden la administración de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agonista de Glp-1/glucagón para su uso en el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica

ANTECEDENTES

La obesidad es un problema sanitario importante y creciente en todo el mundo. Se asocia a muchas enfermedades potencialmente mortales, tales como enfermedades cardiovasculares, enfermedades renales, hipertensión, derrames cerebrales, infertilidad, disfunción respiratoria y diabetes de tipo 2.

El glucagón y el péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) derivan del preproglucagón, un polipéptido precursor de 158 aminoácidos que se procesa en diferentes tejidos para formar una serie de diferentes péptidos derivados del proglucagón, incluyendo el glucagón, el péptido-1 similar al glucagón (GLP-1), el péptido-2 similar al glucagón (GLP-2) y la oxintomodulina (OXM), que están implicados en una amplia diversidad de funciones fisiológicas, incluyendo la homeostasis de la glucosa, la secreción de insulina, el vaciado gástrico y el crecimiento intestinal, así como la regulación de la ingesta de alimentos. El glucagón es un péptido de 29 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 33 a 61 del proglucagón (53 a 81 del preproglucagón), mientras que el GLP-1 se produce como un péptido de 37 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 72 a 108 del proglucagón (92 a 128 del preproglucagón). La amida de GLP-1(7-36) o el ácido GLP-1(7-37) son formas biológicamente activas del GLP-1, que demuestran una actividad esencialmente equivalente en el receptor de GLP-1.

El glucagón es producido por el páncreas e interactúa con el receptor del glucagón ("glucR"). El glucagón actúa en el hígado para aumentar la glucosa en sangre a través de la gluconeogénesis y la glucogenólisis. Cuando la glucosa en sangre comienza a descender, el glucagón envía una señal al hígado para que descomponga el glucógeno y libere glucosa, lo que hace que los niveles de glucosa en sangre aumenten a un nivel normal.

El GLP-1 tiene actividades biológicas diferentes en comparación con el glucagón. Es secretado por las células L del intestino y se une al receptor de GLP-1. Sus actividades incluyen la estimulación de la síntesis y la secreción de insulina, la inhibición de la secreción de glucagón y la inhibición de la ingesta de alimentos.

Tanto el glucagón como el GLP-1, actuando como agonistas en sus respectivos receptores, han demostrado ser eficaces para la pérdida de peso. Algunos análogos de GLP-1 se comercializan o están en fase de desarrollo para el tratamiento de la obesidad,por ejemplo,Liraglutida (VICTOZA® de Novo Nordisk) y Exenatida (Byetta® de Eli Lilly/Amylin). Los péptidos agonistas de glucagón/GLP-1 también se han divulgado en el documento WO 2014/091316.

Aunque se dispone de algunas terapias para el control de la glucemia, ninguna consigue actualmente una pérdida de peso sustancial, lo que sigue siendo una importante necesidad no cubierta para los pacientes. El cincuenta por ciento de los pacientes pasan de la monoterapia oral para el control de la glucosa (normalmente con metformina) al inicio de la insulina en un plazo de 10 años, y a menudo toman múltiples terapias orales combinadas antes de iniciar la insulina. El uso de insulina agrava el aumento de peso, que puede llegar a ser de 6 kg en el primer año tras iniciar el tratamiento con insulina. Este aumento de peso puede conducir a una mayor resistencia a la insulina, que se asocia a hipertensión, dislipidemia y un mayor riesgo de eventos cardiovasculares adversos mayores. Con respecto a la reducción de la resistencia a la insulina, la pérdida de peso significativa (> 5 %) es la intervención óptima para reducir la resistencia a la insulina, aunque en la actualidad sólo puede conseguirse de forma fiable mediante intervenciones intensivas en la dieta y el estilo de vida y/o cirugía bariátrica. Sigue existiendo la necesidad de métodos de administración de péptidos agonistas de GLP-1/Glucagón a seres humanos utilizando regímenes de dosificación que sean terapéuticamente eficaces en el tratamiento de la diabetes y la obesidad, pero que eviten los efectos adversos.

BREVE COMPENDIO

Se proporciona en el presente documento un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 para su uso en un método de tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en el que se administran 50-600 |jg del péptido por dosis a un sujeto humano que lo necesite.

El péptido puede administrarse diariamente.

El péptido puede administrarse una vez al día. El péptido puede administrarse durante al menos una semana, durante al menos tres semanas o durante al menos cuatro semanas. El péptido se administra por inyección, opcionalmente la administración es subcutánea. La progresión de la enfermedad puede detenerse o invertirse. Pueden administrarse de 100 a 600 jg del péptido por dosis.

En un caso, la administración comprende la administración de una dosis inicial durante 3 a 10 días y una segunda dosis más alta a partir de entonces.

En un caso, la dosis inicial se administra durante 3 a 7 días. En un caso, la dosis inicial es de 100 |jg del péptido. En un caso, la segunda dosis se administra durante al menos cuatro días. En un caso, la dosis inicial se administra durante cuatro días consecutivos y la segunda dosis se administra durante al menos cuatro días consecutivos. En un caso, la segunda dosis es de 150-200 jg del péptido. En un caso, la segunda dosis es de 150 jg del péptido o de 200 jg del péptido.

En un caso, la administración comprende además la administración de una tercera dosis después de la segunda dosis, en la que la tercera dosis es superior a la segunda dosis. En un caso, la dosis inicial se administra durante 3 a 10 días y la segunda dosis se administra durante 3 a 10 días. En un caso, la dosis inicial se administra durante 3 a 7 días y la segunda dosis se administra durante 3 a 7 días. En un caso, la dosis inicial se administra durante cuatro días consecutivos, la segunda dosis se administra durante cuatro días consecutivos y la tercera dosis se administra durante al menos cuatro días consecutivos. En un caso, la dosis inicial se administra durante cuatro días consecutivos, la segunda dosis se administra durante siete días consecutivos y la tercera dosis se administra durante al menos cuatro días consecutivos. En un caso, la tercera dosis es de 200-400 jg del péptido. En un caso, la tercera dosis es de 200 jg del péptido, 300 jg del péptido o 400 jg del péptido.

En un caso, se administra una dosis inicial de 100 jg durante cuatro días, una segunda dosis de 150 jg durante cuatro días y, posteriormente, una tercera dosis de 200 jg al día. En un caso, se administra una dosis inicial de 100 jg durante cinco días, una segunda dosis de 150 jg durante cinco días, una tercera dosis de 200 jg durante cinco días y, posteriormente, una cuarta dosis de 300 jg diaria. En un caso, se administra una dosis inicial de 100 jg durante cinco días, una segunda dosis de 200 jg durante cinco días y, posteriormente, una tercera dosis de 300 jg al día.

En un caso, se administran 50 jg del péptido. En un caso, se administran 100 jg del péptido. En un caso, se administran 150 jg del péptido. En un caso, se administran 200 jg del péptido. En un caso, se administran 250 jg del péptido. En un caso, se administran 300 jg del péptido. En un caso, se administran 400 jg del péptido. En un caso, el péptido se administra diariamente. En un caso, el péptido se administra una vez al día.

En un caso, el péptido se administra durante al menos una semana, durante al menos dos semanas, durante al menos tres semanas o durante al menos cuatro semanas.

En un caso, el péptido se administra mediante inyección. En un caso, la administración es subcutánea.

En un caso, la administración da lugar a una reducción de al menos el 20 % en el área de glucosa bajo la curva de concentración-tiempo tras una prueba de comidas mixtas.

En un caso, se reduce la glucosa. En un caso, la glucosa es glucosa plasmática en ayunas. En un caso, la glucosa es la glucosa postprandial de una prueba de comidas mixtas.

En un caso, la administración produce una pérdida de peso de al menos 1.0 kg, al menos 1.3 kg, o de 1.3 a 2.0 kg aproximadamente. En un caso, el peso del sujeto se reduce en al menos 3.5 kg o al menos 5 kg. En un caso, el peso del sujeto se reduce al menos un 2 %, al menos un 4 %, al menos un 5 % o al menos un 10 %. En un caso, el peso del sujeto se reduce entre un 2 % y un 20 %, entre un 2 % y un 25 %, o entre un 2 % y un 30 %.

En un caso, se trata de grasa hepática. En un caso, la grasa hepática del sujeto se reduce al menos en un 20 %. En un caso, la grasa hepática del sujeto se reduce entre un 20 % y un 40 %. En un caso, la administración produce una reducción de un tercio de la grasa hepática. En un caso, se reduce el volumen hepático del sujeto.

En un caso, la administración reduce los niveles de hemoglobina A1c (HbAlc). En un caso, el nivel de HbAlc en el sujeto se reduce al menos un 0.6 %. En un caso, el nivel de HbAlc en el sujeto se reduce al menos un 0.9 %. En un caso, el nivel de HbAlc en el sujeto se reduce entre un 0.5 % y un 1.5 %, entre un 0.5 % y un 2 %, o entre un 0.5 % y un 3 %. En un caso, el nivel de HbAlc en el sujeto se reduce a 6.3 % o menos.

En un caso, la administración reduce los niveles de fructosamina.

En un caso, se reduce el apetito del sujeto.

En un caso, aumenta el gasto energético del sujeto.

En un caso, se detiene la progresión de la enfermedad. En un caso, se invierte la progresión de la enfermedad. En un caso, el péptido se fabrica sintéticamente mediante síntesis en fase sólida. En un caso, la síntesis en fase sólida utiliza la química del cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo.

En un caso, el péptido comprende una fracción de palmitoilo en el grupo N(épsilon) de un residuo de lisina. En un caso, el grupo palmitoilo está unido a la lisina mediante un enlazador. En un caso, el enlazador es gamma glutamato. En un caso, el péptido comprende una fracción de estearoil o esterato en el grupo N(épsilon) de un residuo de lisina. En un caso, el residuo de lisina es X<10>.

En un caso, el péptido se une a un receptor de glucagón humano con una EC50 en el ensayo 1 de cAMP de menos de 10.000 pM, menos de 5.000 pM, menos de 2.500 pM, menos de 1.000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM.

En un caso, el péptido se une a un receptor GLP-1 humano con una EC50 en el ensayo de AMPc 1 de menos de 10.000 pM, menos de 5.000 pM, menos de 2.500 pM, menos de 1.000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM.

En un caso, el péptido es un agonista tanto de la actividad del GLP-1 como del glucagón.

En un caso, el péptido se une tanto a un receptor de glucagón como a un receptor de GLP-1, en el que el péptido presenta una actividad al menos 2 veces, 5 veces o 10 veces mayor en relación con el ligando natural en el receptor de GLP-1 que en el receptor de glucagón.

En un caso, el péptido comprende además una fracción heteróloga. En un caso, la fracción heteróloga es una proteína, un péptido, un dominio proteico, un enlazador, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG), biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA), una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un andamio no FnIII, una etiqueta epitópica, un polímero polipéptido recombinante, una citoquina, un lípido, o una combinación de dos o más de las fracciones mencionadas.

En un caso, el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) de 27 a 40 kg/m2. En un caso, el sujeto tiene un IMC de 30-39.9 kg/m2. En un caso, el sujeto tiene un IMC de al menos 40 kg/m2.

En un caso, el sujeto tiene sobrepeso. En un caso, el sujeto es obeso. En un caso, el sujeto tiene (i) sobrepeso y (ii) hipertensión, diabetes mellitus de tipo 2, dislipidemia, antecedentes de enfermedad cardiovascular o una combinación de los mismos. En un caso, el sujeto (i) tiene sobrepeso y (ii) padece disglucemia, hipertensión, dislipidemia, apnea obstructiva del sueño o una combinación de las mismas.

En un caso, el sujeto recibe tratamiento con insulina. En un caso, se reduce la cantidad de insulina administrada. En un caso, se interrumpe el tratamiento con insulina.

En un caso, el sujeto recibe insulina, metformina, sulfonilurea, un inhibidor del cotransportador sodio-glucosa-2 (sglt-2), un inhibidor de la Dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV), glutazona, un inhibidor de la alfa glucosidasa, o una combinación de los mismos.

En un caso, la semivida del péptido es de unas 10 a unas 12 horas.

En un caso, la administración es un complemento de la dieta y el ejercicio.

En un caso, el péptido comprende SEQ ID NO: 19, y el péptido se administra a una dosis inicial de 100 |jg durante cuatro días, a una segunda dosis de 150 ug durante cuatro días, y posteriormente a una dosis de 200 jg diarios.

En un caso, el péptido comprende SEQ ID NO: 19, y el péptido se administra a una dosis inicial de 100 jg durante cinco días, a una segunda dosis de 200 ug durante cinco días, y posteriormente a una dosis de 300 jg diarios.

En un caso, el péptido comprende SEQ ID NO: 19, y el péptido se administra a una dosis inicial de 100 jg durante cinco días, a una segunda dosis de 150 ug durante cinco días, a una segunda dosis de 200 ug durante cinco días, y posteriormente a una dosis de 300 jg diarios.

En un caso, el sujeto padece diabetes mellitus de tipo 2. En un caso, el sujeto es obeso. En un caso, el sujeto tiene (i) sobrepeso y (ii) hipertensión, diabetes mellitus de tipo 2, dislipidemia, antecedentes de enfermedad cardiovascular o una combinación de los mismos. En un caso, el sujeto (i) tiene sobrepeso y (ii) padece disglucemia, hipertensión, dislipidemia, apnea obstructiva del sueño o una combinación de las mismas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

La FIG. 1 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO tras la administración del péptido G730 glucagón/GLP-1 co-agonista a tres dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo, y el tratamiento con Liraglutida. El peso corporal de partida en los diferentes grupos fue el vehículo: 47.4±3.7 g, G730 10 nmol/kg: 44.5±2.2 g, G730 20 nmol/kg: 45.9±3.6 g y G73050 nmol/kg: 46.1±2.4 g, respectivamente.

La FIG. 2 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO tras la administración del péptido G797 glucagón/GLP-1 co-agonista a tres dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo, y el tratamiento con Liraglutida. El peso corporal de partida en los diferentes grupos fue el vehículo: 47.4±3.7 g, G797 5 nmol/kg: 47.5±1.2 g, G797 20 nmol/kg: 47.4±2.2 g y G79750 nmol/kg: 47.2±1.8 g, respectivamente.

La FIG. 3 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO tras la administración del péptido G812 co-agonista glucagón/GLP-1 a una dosis de 20 nmol/kg, en comparación con el tratamiento con vehículo, y el tratamiento con Liraglutida. El peso corporal de partida en los diferentes grupos fue el vehículo: 47.4±3.7 g y G81220 nmol/kg: 49.2±3.4 g, respectivamente. La FIG. 4 es un gráfico que compara el cambio en los resultados de peso corporal para los tres péptidos glucagón/GLP-1 co-agonistas presentados en las FIG. 1,2 y 3.

La FIG. 5 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO tras la administración del péptido G796 co-agonista glucagón/GLP-1 a dos dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo, y el tratamiento con Liraglutida.

La FIG. 6 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO tras la administración del péptido G865 co-agonista glucagón/GLP-1 a dos dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo, y el tratamiento con Liraglutida.

La FIG. 7 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO tras la administración del péptido G933 co-agonista glucagón/GLP-1 a dos dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo, y el tratamiento con Liraglutida.

La FIG. 8 es un gráfico que compara el cambio en los resultados de peso corporal para los tres péptidos glucagón/GLP-1 co-agonistas presentados en las FIG. 5, 6 y 7.

La FIG. 9 muestra diagramas de flujo del estudio de dosis única ascendente de G933 planificado y real. La FIG. 10 muestra la disposición de los sujetos del estudio de dosis única ascendente de G933.

La FIG. 11 muestra la mediana de los niveles de glucosa de los sujetos del estudio de dosis única ascendente de G933.

La FIG. 12 muestra los niveles medios de insulina de los sujetos del estudio de dosis única ascendente de G933.

La FIG. 13 muestra un diagrama de flujo de las cohortes 1-4 del estudio de dosis múltiples ascendentes de G933. MEDI0382 se refiere a un péptido lineal de 30 aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO:19. La FIG. 14 muestra los niveles medios de glucosa en la prueba de comidas mixtas en sujetos tratados con placebo o 100 |jg de G933 el Día 7 (Cohorte 1), con placebo o 150 |jg de G933 el Día 11 (Cohorte 2), y con placebo o 200 jg de G933 el Día 15 (Cohorte 3).

La FIG. 15 muestra el cambio en los niveles basales de glucosa en ayunas en sujetos tratados con placebo o G933 el Día 7 (Cohorte 1), con placebo o G933 el Día 9 (Cohorte 3), y con placebo o G933 el Día 15 (Cohorte 3).

La FIG. 16 muestra el cambio de peso con respecto al peso inicial a lo largo del estudio en las cohortes 1 y 3 y en los días 7 y 15 en las cohortes 1 y 3, respectivamente.

La FIG. 17 muestra la concentración plasmática de MEDI0382 tras la repetición de la dosis.

La FIG. 18 muestra una mejora en el control de la glucosa medida por los niveles de glucosa en pacientes tratados con G933. Las líneas discontinuas representan los niveles de glucosa observados al inicio (Día 1), y las líneas continuas representan los niveles de glucosa observados el día 41.

La FIG. 19 muestra una mejora en el control de la glucosa medida por la HbAlc en pacientes tratados con G933.

La FIG. 20 muestra una disminución del peso absoluto en los pacientes tratados con G933. (G933 se denomina "MEDI" o "0382" en esta figura; "Plac" se refiere a placebo).

La FIG. 21 muestra una disminución del porcentaje de peso en pacientes tratados con G933. ("MEDI" se refiere a "MEDI0382" en esta figura).

La FIG. 22 muestra una evaluación de la reducción de la grasa hepática en pacientes tratados con G933. Se proporcionan imágenes representativas de sujetos individuales.

La FIG. 23 muestra las náuseas y los vómitos que se produjeron en los pacientes tratados con G933. La FIG. 24 muestra un diagrama de flujo de las cohortes 5 y 6 del estudio de dosis múltiples ascendentes de G933.

La FIG. 25 muestra una mejora en el control de la glucosa medida por los niveles de glucosa en los pacientes de la Cohorte 5 tratados con G933 en comparación con placebo. Las líneas discontinuas representan los niveles de glucosa observados al inicio (Día 1), y las líneas continuas representan los niveles de glucosa observados el día 17. (G933 se denomina "MEDI" en esta figura).

La FIG. 26 muestra una mejora en el control de la glucosa medida por los niveles de glucosa en los pacientes de la Cohorte 6 tratados con G933 en comparación con placebo. Las líneas discontinuas representan los niveles de glucosa observados al inicio (Día 1), y las líneas continuas representan los niveles de glucosa observados el día 17. (G933 se denomina "MEDI" en esta figura).

La FIG. 27 muestra el cambio porcentual del AUC de glucosa basal en todas las cohortes.

La FIG. 28 muestra una mejora en los niveles de glucosa en ayunas en las Cohortes 5 y 6. (G933 se denomina "MEDI" en esta figura).

La FIG. 29 muestra el cambio de peso desde la línea de base en las Cohortes 5 y 6. (G933 se denomina "MEDI" en esta figura).

La FIG. 30 muestra la pérdida de peso y el cambio en la glucosa en todas las cohortes.

La FIG. 31 muestra la concentración plasmática de G933 en la Cohorte 5 los días 16 y 22 y en la Cohorte 6 los días 11 y 17.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

A lo largo de esta divulgación, el término "un" o "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un polinucleótido" representa uno o más polinucleótidos. Por ello, las expresiones "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.

Además, cuando en el presente documento se usa "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B "(solo). Igualmente, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Se entiende que siempre que en el presente documento se describan aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en". Un péptido "que comprende" una secuencia particular de aminoácidos se refiere a un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos, en el que el péptido puede o no contener aminoácidos adicionales u otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Un péptido "consistente en" una secuencia particular de aminoácidos se refiere a un péptido que contiene sólo la secuencia de aminoácidos y no aminoácidos adicionales u otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Un péptido "que comprende" una secuencia de aminoácidos "consistente en" una secuencia de aminoácidos concreta se refiere a un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos y ningún aminoácido adicional; sin embargo, el péptido puede comprender otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una fracción de acilo o una fracción de palmitoilo).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que se refiere la presente divulgación. Por ejemplo, elConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3.a ed., 1999, Academic Press; y elOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, que se pueden obtener haciendo referencia a la memoria descriptiva como un conjunto. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" singular así como "polipéptidos" plurales y comprende cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos. Por tanto, como se usa en el presente documento, un "péptido", un "fragmento peptídico", una "proteína", una "cadena de aminoácidos", una "secuencia de aminoácidos" o cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen genéricamente en la definición de "polipéptido", aunque cada uno de estos términos puede tener un significado más específico. El término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término incluye además polipéptidos que han sufrido modificaciones postraduccionales o de síntesis posterior, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos que no se producen de forma natural.

Más concretamente, el término "péptido" tal y como se utiliza en el presente documento engloba péptidos de longitud completa y fragmentos, variantes o derivados de los mismos, por ejemplo, un péptido agonista del GLP-1/glucagón(porejemplo,de 29, 30 o 31 aminoácidos de longitud). Un "péptido" como el divulgado en el presente documento,por ejemplo,un péptido agonista del GLP-1/glucagón, puede formar parte de un polipéptido de fusión que comprenda componentes adicionales tales como,por ejemplo,un dominio Fc o un dominio albúmina, para aumentar su semivida. Como se describe en el presente documento, un péptido también puede derivatizarse de varias maneras diferentes.

El término "aislado" se refiere a un estado en el que los péptidos o los ácidos nucleicos se encuentran generalmente de acuerdo con la presente divulgación. Los péptidos aislados y los ácidos nucleicos aislados estarán libres o sustancialmente libres de material con el que estén asociados de forma natural, tal como otros péptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentren en su entorno natural, o el entorno en el que se preparen (por ejemplo, cultivo celular) cuando dicha preparación se realice mediante tecnología de ADN recombinante practicadain vitrooin vivo.Los péptidos y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y seguir estando aislados a efectos prácticos; por ejemplo, los péptidos se mezclarán normalmente con gelatina u otros portadores si se utilizan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilicen en diagnóstico o terapia.

Un péptido "recombinante" se refiere a un péptido producido mediante tecnología de ADN recombinante. Los péptidos producidos recombinantemente y expresados en células huésped se consideran aislados a efectos de la presente divulgación, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que hayan sido separados, fraccionados o parcial o sustancialmente purificados mediante cualquier técnica adecuada.

Los términos "fragmento", "análogo", "derivado" o "variante" cuando se refieren a un péptido agonista del GLP-1/glucagón incluyen cualquier péptido que conserve al menos cierta actividad deseable,por ejemplo,la unión a los receptores de glucagón y/o g LP-1. Los fragmentos de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento incluyen fragmentos proteolíticos, fragmentos de deleción que presentan propiedades deseables durante la expresión, purificación y/o administración a un sujeto.

El término "variante", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que difiere del péptido citado debido a sustituciones, supresiones, inserciones y/o modificaciones de aminoácidos. Se pueden producir variantes usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes también pueden, o alternativamente, contener otras modificaciones - por ejemplo, un péptido puede ser conjugado o acoplado,por ejemplo,fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga u otra fracción, por ejemplo, para aumentar la semivida, la solubilidad o la estabilidad. Los ejemplos de restos que han de conjugarse o acoplarse a un péptido proporcionado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, albúmina, una región Fc de inmunoglobulina, polietilenglicol (PEG) y similares. El péptido también puede conjugarse o producirse acoplado a un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del péptido(por ejemplo,6-His), o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido.

La expresión "identidad de secuencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polinucleótidos o entre dos o más secuencias de polipéptidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por la misma base de ácido nucleico o aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia de comparación, se dice que las secuencias son "idénticas" en esa posición. El porcentaje de "identidad de secuencia" se calcula determinando el número de posiciones en donde se produce la base de ácido nucleico o aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones "idénticas". El número de posiciones "idénticas" se divide entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de "identidad de secuencia". El porcentaje de "identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación. Para alinear de manera óptima las secuencias para comparación, la parte de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones denominadas huecos mientras la secuencia de referencia se mantiene constante. Una alineación óptima es aquella que, incluso con espacios, produce el mayor número posible de posiciones "idénticas" entre las secuencias de referencia y de comparación. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias puede determinarse utilizando la versión del programa "Secuencias BLAST 2" que estaba disponible en el National Center for Biotechnology Information a partir del 1 de septiembre, 2004, programa que incorpora los programas BLASTN (para comparación de secuencias de nucleótidos) ) y BLASTP (para comparación de secuencias de polipéptidos), cuyos programas se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Cuando se utilizan "Secuencias BLAST 2", los parámetros que eran parámetros predeterminados a partir del 1 de septiembre, 2004, se pueden usar para el tamaño de palabra (3), penalización por hueco abierto (11), penalización por hueco de extensión (1), disminución de hueco (50), valor esperado (10) y cualquier otro parámetro requerido, incluyendo, entre otras, la opción de matriz.

Los términos "composición" o "composición farmacéutica" se refieren a composiciones que contienen un péptido agonista del GLP-1/glucagón, junto con,por ejemplo,portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables para su administración a un sujeto que necesita tratamiento.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para el contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva u otras complicaciones proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable.

Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de un péptido agonista de GLP-1/glucagón proporcionado en el presente documento, cuya administración a un sujeto, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento,por ejemplo,de la obesidad. Una cantidad es eficaz, por ejemplo, cuando su administración da como resultado una o más de la pérdida o el mantenimiento del peso(porejemplo,la prevención del aumento de peso), la pérdida de grasa corporal, la prevención o la modulación de la hipoglucemia, la prevención o la modulación de la hiperglucemia, la promoción de la síntesis de insulina o la reducción de la ingesta de alimentos. Esta cantidad puede ser una dosis fija para todos los sujetos que se están tratando, o puede variar dependiendo del peso, la salud y la condición física del sujeto que ha de tratarse, el grado de pérdida de peso o el mantenimiento del peso deseado, la formulación del péptido, una evaluación profesional de la situación médica y otros factores relevantes.

El término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, que necesite tratamiento con un péptido agonista de GLP-1/glucagón proporcionado en el presente documento. Los sujetos mamíferos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, osos, vacas, simios, monos, orangutanes y chimpancés, etc. En una realización, el sujeto es un ser humano.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "sujeto que lo necesita" se refiere a un individuo al que se desea tratar,por ejemplo,un sujeto obeso o propenso a la obesidad al que se desea facilitar la pérdida de peso o de grasa corporal, el mantenimiento del peso o de la grasa corporal, o evitar o minimizar el aumento de peso durante un periodo de tiempo determinado.

Términos tales como "tratar" o "tratamiento" se refieren a medidas terapéuticas que curan y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado. Términos tales como "prevenir" se refieren a medidas profilácticas o preventivas que evitan y/o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico concreto. Así pues, entre las personas que necesitan tratamiento se encuentran las que ya padecen la enfermedad o afección. Las personas que necesitan prevención son las propensas a padecer la enfermedad o afección y aquellas en las que se quiere prevenir la enfermedad o afección. Por ejemplo, la frase "tratar a un paciente" que padece una enfermedad o afección causada o caracterizada por un exceso de peso corporal se refiere a reducir la gravedad de la enfermedad o afección hasta el punto de que el sujeto deje de sufrir molestias y/o alteraciones funcionales debido a ella. La frase "prevenir" una enfermedad o afección causada o caracterizada por un exceso de peso corporal se refiere a reducir el potencial de la enfermedad o afección y/o reducir la aparición de la enfermedad o afección (por ejemplo, una reducción relativa de la aparición en comparación con pacientes no tratados).

Términos tales como "disminución de la gravedad" se refieren a medidas terapéuticas que ralentizan o atenúan los síntomas de una afección o trastorno patológico diagnosticado. Por ejemplo, la frase "disminuir la gravedad" de una enfermedad o afección causada o caracterizada por un exceso de peso corporal se refiere a reducir la gravedad de la enfermedad o afección (por ejemplo, una reducción de peso en comparación con pacientes no tratados o un aumento del control de la glucosa).

Como se usa en el presente documento, un "péptido agonista de GLP-1/glucagón" es un péptido quimérico que presenta una actividad en el receptor del glucagón de al menos aproximadamente el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más con respecto al glucagón nativo y también presenta actividad en el receptor de GLP-1 de aproximadamente al menos aproximadamente el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más con respecto al GLP-1 nativo, en las condiciones del ensayo 1.

Como se usa en el presente documento, la expresión "glucagón nativo" se refiere al glucagón natural,por ejemplo,el glucagón humano, que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1. El término "GLP-1 nativo" se refiere a GLP-1 de origen natural,por ejemplo,GLP-1 humano, y es un término genérico que abarca,por ejemplo,GLP-1(7-36) amida (SEQ ID NO: 2), ácido de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 3), o una mezcla de estos dos compuestos. Como se usa en el presente documento, una referencia general a "glucagón" o "GLP-1" en ausencia de cualquier otra designación pretende significar glucagón humano nativo o GLP-1 humano nativo, respectivamente. A menos que se indique lo contrario, "glucagón" se refiere a glucagón humano y "GLP-1" se refiere a GLP-1 humano.

Péptidos agonistas de GLP-1/glucagón

En el presente documento se proporcionan péptidos que se unen tanto a un receptor de glucagón como a un receptor de GLP-1. En el documento WO 2014/091316 se proporcionan péptidos ejemplares. En ciertas realizaciones, el péptido es MEDI0382, es decir, un péptido lineal de 30 aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 19 que contiene un enlazador gamma glutamato y derivatización de grupo palmitoilo en el residuo 10. En ciertas realizaciones, los péptidos proporcionados en el presente documento son coagonistas de la actividad del glucagón y del GLP-1. Dichos péptidos se denominan en el presente documento péptidos agonistas de GLP-1/glucagón. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se proporcionan en el presente documento poseen actividades de GLP-1 y glucagón con relaciones favorables para promover la pérdida de peso, prevenir el aumento de peso o mantener un peso corporal deseable y poseen una solubilidad, una formulabilidad y una estabilidad optimizadas. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón según se proporcionan en el presente documento son activos en los receptores humanos de GLP1 y glucagón, en cierta realización la actividad relativa comparada con el ligando natural en el receptor de GLP-1 es al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 5 veces, 8 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o 25 veces mayor que en el receptor de glucagón.

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados tienen potencias deseables en los receptores de glucagón y GLP-1, y tienen potencias relativas deseables para promover la pérdida de peso. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados exhiben potenciasin vitroen el receptor de GLP-1 como se muestra por una EC50 en el ensayo de AMPc 1 (véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5.000 pM, menos de 2.500 pM, menos de 1.000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón según se divulgan exhiben potenciasin vitroen el receptor de GLP-1 según se muestra por EC50 en el ensayo de AMPc en 4.4 % de albúmina sérica humana (ensayo 2, véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados exhiben potenciasin vitroen el receptor de glucagón como se muestra por una EC50 en el ensayo de AMPc 1 (véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón según se divulgan exhiben potenciasin vitroen el receptor de glucagón según se muestra por una EC50 en el ensayo de AMPc en 4.4 % de albúmina de suero humano (ensayo 2, véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados tienen relaciones relativas de potencia GLP1-R/glucR, en comparación con los ligandos nativos, en el intervalo de aproximadamente 0.01 a 0.50, por ejemplo, de aproximadamente 0.02 a 0.30, por ejemplo, aproximadamente 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11. 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, o 0.30 cuando se utiliza el ensayo 2.

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón según se divulgan exhiben potenciasin vitroen el péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (péptido inhibidor gástrico) (GIPR) según se muestra por una EC50 en el ensayo de AMPc 1 (véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón divulgados exhiben potenciasin vitroen el GIPR, como lo muestra la EC50 en el ensayo de AMPc en 4.4% de albúmina de suero humano (ensayo 2, véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM, o menos de 2 pM.

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento poseen uno o más criterios de solubilidad aceptable, facilidad de formulación, estabilidad plasmática y propiedades farmacocinéticas mejoradas. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados son solubles en tampones estándar en un amplio intervalo de pH.

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón son solubles en soluciones tampón comunes a una concentración de hasta 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, o más, en sistemas tampón y una gama de fuerzas iónicas,por ejemplode 0.25 a 150 mM, incluyendo, entre otros, tampón fosfato, tampón Tris, tampón glutamato, tampón acetato, tampón succinato o tampón histidina. Los tampones de ejemplo incluyen el tampón de glutamato pH 4.5 100 mM, el tampón de acetato pH 5100 mM, el tampón de succinato pH 5100 mM, el tampón de fosfato pH 6100 mM, el tampón de fosfato pH 6.5 100 mM, el tampón de fosfato pH 7.0 100 mM, el tampón de histidina pH 7.0 100 mM, el tampón de fosfato pH 7.5 100 mM y el tampón de Tris pH 8.0 100 mM. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados son solubles en tampones estándar a 0.8 mg/ml en un intervalo de pH, por ejemplo, de pH 4.0 a pH 8.0, por ejemplo, a pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, o 8.5. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados son solubles en tampones estándar de pH 4.5 a 8.0, 5.0 a 8.0, 5.5 a 8.0, 6.0 a 8.0, 6.5 a 8.0, 7.0 a 8.0, 4.5 a 8.5, 5.5 a 8.5, 5.5 a 8.5, 6.0 a 8.5, 6.5 a 8.5, o 7.0 a 8.5.

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados son formulables en formulaciones farmacéuticas estándar. Las formulaciones de ejemplo incluyen, pero sin limitación: Tris 0.1 M pH 7.5, Manitol 150 mM, formulación final pH= 7.2; Tris 0.05 M, Arginina 50 mM/Prolina, formulación final pH= 8.0; o tampón fosfato de sodio (pH8)/ propilenglicol al 1.85 % P/V, formulación final pH= 7.0. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón divulgados son solubles en estas u otras formulaciones a una concentración de hasta 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, o más.

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón divulgados son aceptablemente estables frente a las proteasas en suero o plasma. Los productos de degradación comunes del glucagón o del GLP-1 incluyen los productos 1 (ácido) y los productos de escisión de DPP IV. Los productos con masa 1 pueden surgir de la desamidación en los grupos amida de la glutamina o en el extremo C. Los productos de escisión surgen de la acción de la proteasa DPP IV en plasma. En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón divulgados permanecen estables en plasma a niveles de hasta el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%o 100 % después de 24 horas en plasma a 37 °C.

Además del péptido agonista del GLP-1/glucagón reivindicado, los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención son G730 (SEQ ID NO: 16), G797 (SEQ ID NO: 17), G849 (SEQ ID NO: 18), G865 (SEQ ID NO: 20), G796 (SEQ ID NO: 21), G812 (SEQ ID NO: 22) y G380 (SEQ ID NO: 23). Todos los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón se enumeran en la Tabla 1:

Tabla 1: Secuencias de péptidos de GLP-1/Glucagón

Según se define en las reivindicaciones anexas, el péptido aislado para uso de la invención es G933 (SEQ ID NO: 19).

Los péptidos G797 y G933 tienen ambos un residuo glutamato en la posición 12 y mantienen una actividad robusta en los receptores tanto de glucagón como de GLP-1, como se muestra en el Ejemplo 2. El residuo correspondiente es lisina en la exendina-4 y el glucagón y es serina en el GLP-1. Aunque se cree que este residuo no entra en contacto con el receptor, los cambios de carga de positiva a negativa pueden modificar el entorno adyacente. Además, G797, G849 y G933 tienen un residuo glutamato en la posición 27. El residuo 27 es Lisina en la exendina 4 y es un residuo hidrófobo sin carga en el GLP1 (valina) y en el glucagón (metionina). La lisina de la exenatida realiza interacciones electrostáticas con el receptor GLP1 en los residuos Glu127 y Glu24 (C.R.Underwood et al JBiol Chem 285723-730 (2010); S.Runge et al JBiol Chem 283 11340-11347 (2008)). Aunque cabría esperar una pérdida de potencia del GLP1R cuando la carga en la posición 27 cambia a negativa, el cambio es compatible con la actividad del GLP1R en G797, G849 y G933.

MEDI0382 es un péptido sintético agonista dual de los receptores del péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) y del glucagón. MEDI0382 es G933 (SEQ ID NO: 19), que contiene un enlazador gamma glutamato y derivatización de grupo palmitoilo en el residuo 10.

MEDI0382 se sintetiza químicamente. La elongación de la cadena peptídica en una resina se realiza con la ayuda de un sintetizador de péptidos en fase sólida utilizando los protocolos suministrados por el fabricante para el acoplamiento de Fmoc-aminoácidos. Los residuos 20 y 24 de glutamina se sustituyen por aminoácidos que no son susceptibles de desamidación, y el residuo 17 de arginina se sustituye por glutamato para reducir la susceptibilidad a la proteólisis.

La secuencia para MEDI0382 se muestra a continuación:

L-histidil-L-seril-L-glutaminilglicílico-L-treonil-L-fenilalanil-L-treonil-L-seril-L-alfa-aspartilo-(N6-[N-(1 -oxohexadecil)-L-gamma-glutamilo])L-lisil-L-seril-L-alfa-glutamilo-L-tirosil-L- leucil-L-alfa-aspartil-L-seril-L-alfa-glutamil-L-arginil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-L-aspartil-L-fenilalanil-L-valil-L-alanil-L-triptofil-L-leucil-L-alfa-glutamil-L-alanilglicilglicina

Métodos de fabricación de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón

La presente divulgación proporciona un método de fabricación de un péptido agonista de GLP-1/glucagón, que queda fuera del objeto de las reivindicaciones. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden fabricarse mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento se sintetizan químicamente por métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, por síntesis en fase sólida como la descrita por Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). La síntesis de péptidos en fase sólida puede realizarse, por ejemplo, utilizando sintetizadores automatizados, utilizando reactivos estándar,por ejemplo,como se explica en el Ejemplo 1.

Como alternativa, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden producirse de forma recombinante usando una combinación conveniente de vector/célula hospedadora como sería bien conocido por el experto habitual en la materia. Existe una diversidad de métodos para producir de forma recombinante péptidos agonistas de GLP-1/glucagón. Generalmente, una secuencia polinucleotídica que codifica el péptido agonista del GLP-1/glucagón se inserta en un vehículo de expresión apropiado,por ejemplo,un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. El ácido nucleico que codifica el péptido agonista de GLP-1/glucagón se inserta en el vector en el marco de lectura adecuado. El vector de expresión se transfecta entonces en una célula hospedadora adecuada que expresará el péptido agonista de GLP-1/glucagón. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células de bacterias, levaduras o mamíferos. Para expresar los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón descritos en el presente documento puede utilizarse una diversidad de sistemas de vectores de expresión de huéspedes disponibles en el mercado.

Modificaciones, conjugados, fusiones y derivaciones

En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento se estabilizan mediante modificaciones de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal está amidado. En ciertas realizaciones, el aminoácido C-terminal es glicina amidada,por ejemplo,G730, G797, G849, G865, G796, G812 y G380. En ciertas realizaciones,por ejemplo,G933, la glicina C-terminal es el ácido no modificado. En ciertas realizaciones, se proporcionan péptidos agonistas de GLP-1/glucagón en los que uno o más residuos de aminoácidos están acilados. Por ejemplo, en ciertas realizaciones los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento contienen uno o más residuos de lisina, en los que una fracción de palmitoilo está acoplada al grupo N(épsilon). En ciertas realizaciones se incorpora un enlazador entre la lisina y el grupo palmitoilo. Este enlazador puede ser un grupo ácido gamma glutámico, o un enlazador alternativo tal como, pero sin limitación, beta alanina y ácido aminohexanoico. Pueden usarse diferentes métodos de acilación, tales como la adición de grupos colesterol o miristoílo. En ciertas realizaciones, la fracción de palmitoilo se añade en la posición 13(por ejemplo,G730). En ciertas realizaciones, la fracción de palmitoilo se añade en la posición 10(porejemplo,<g>797, G849, G933, G865, G796 y G812). En ciertas realizaciones, la fracción de palmitoilo se añade en la posición 17(por ejemplo,G380).

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento,por ejemplo,G730, G797, G849 y G933 pueden palmitoilarse para prolongar su semivida por asociación con la albúmina sérica, reduciendo así su propensión a la eliminación renal, como se describe en el Ejemplo 1.

Alternativa o adicionalmente, un péptido agonista del GLP-1/glucagón como el divulgado en el presente documento puede asociarse con una fracción heteróloga,por ejemplo,para prolongar la semivida. El resto heterólogo puede ser una proteína, un péptido, un dominio proteico, un enlazador, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG), biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA), una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un armazón no FnIII, un marcador epitópico, un polímero polipéptido recombinante, una citocina y una combinación de dos o más de dichos restos.

Por ejemplo, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón pueden fusionarse con un polipéptido heterólogo. Los péptidos pueden fusionarse con proteínas, ya sea a través de la fusión y la expresión de genes recombinantes o mediante conjugación química. Las proteínas que son adecuadas como compañeros para la fusión incluyen, sin limitación, la albúmina sérica humana, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que incluyen la fusión a la porción Fc de los anticuerpos. El GLP-1 se ha fusionado a estas proteínas conservando su potencia (L. Baggio et al,Diabetes532492-2500 (2004); P Barrington et alDiabetes, Obesity and Metabolism13426-433 (2011); P Paulik et alAmerican Diabetes Association2012, Póster 1946). También se han descrito secuencias de péptidos recombinantes extendidas para proporcionar al péptido una masa molecular elevada (V.Schellenberger et alNature Biotechnol27 1186-1190 (2009);PASylation(documento EP2173890)). En ciertas realizaciones, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón se incorporan como la parte N-terminal de una proteína de fusión, con el compañero de fusión, por ejemplo, la albúmina o la porción Fc, en el extremo C-terminal. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se describen en el presente documento también pueden fusionarse a péptidos o dominios proteicos, tales como los "Albudabs" que tienen afinidad por la albúmina sérica humana (M.S. Dennis et alJ Biol Chem277 35035-35043 (2002); A. Walker et alProtein Eng Design Selection23271-278 (2010)). Los métodos para fusionar péptidos agonistas de GLP-1/glucagón, como se desvelan en el presente documento, con un polipéptido heterólogo,por ejemplo,albúmina o una región Fc, son bien conocidos por los expertos habituales en la materia.

Otros restos heterólogos pueden conjugarse a péptidos agonistas de GLP-1/glucagón para estabilizar o aumentar adicionalmente su semivida. Para la fusión química, ciertas realizaciones presentan el mantenimiento de un N-terminal libre, pero pueden realizarse puntos alternativos para la derivatización. Un método alternativo adicional es derivatizar el péptido con un resto químico grande, tal como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular. Un "péptido agonista de GLP-1/glucagón pegilado" tiene una cadena de PEG unida covalentemente al mismo. La derivatización de los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón,por ejemplo,la pegilación, puede realizarse en la lisina que está palmitoilada, o alternativamente en un residuo tal como la cisteína, que se sustituye o incorpora por extensión para permitir la derivatización. Los formatos de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón anteriores pueden caracterizarsein vitroy/oin vivopara determinar su potencia relativa y el equilibrio entre la activación de los receptores de GLP-1 y glucagón.

El término general "cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG", se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en cadena ramificada o recta, representados por la fórmula general H(OCH<2>CH<2>)nOH, donde n es un número entero de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más. Las cadenas de PEG incluyen polímeros de etilenglicol con un peso molecular total promedio seleccionado del intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton. El peso molecular medio de una cadena de PEG se refiere a un número,por ejemplo,PEG-5.000 se refiere a una cadena de polietilenglicol con un peso molecular medio total de 5.000 aproximadamente.

La PEGilación puede realizarse mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo,Focus on Growth Factors,3: 4-10, 1992 y las solicitudes de patente europeas EP 0154316 y EP 0401 384. La PEGilación puede realizarse usando una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo).

Los métodos para preparar un péptido agonista de GLP-1/glucagón PEGilado generalmente incluyen las etapas de (a) hacer reaccionar un péptido agonista de GLP-1/glucagón o con polietilenglicol (tal como un derivado reactivo de éster o aldehído de PEG) en condiciones en las que la molécula se une a uno o más grupos PEG y (b) obtener el producto o productos de reacción.

Composiciones farmacéuticas

Además, se proporcionan composiciones,por ejemplo,composiciones farmacéuticas, que contienen una cantidad eficaz de un péptido agonista del GLP-1/glucagón, tal como se proporciona en el presente documento, formuladas para el tratamiento de enfermedades metabólicas, por ejemplo, la obesidad.

Las composiciones de la divulgación pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos. Se describen métodos de preparación adecuados, por ejemplo, enRemington's Pharmaceutical Sciences,19a edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). La composición puede estar en una diversidad de formas que incluyen, pero sin limitación, una solución acuosa, una emulsión, un gel, una suspensión, una forma liofilizada o cualquier otra forma conocida en la técnica. Además, la composición puede contener aditivos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, diluyentes, aglutinantes, estabilizadores y conservantes. Una vez formuladas, las composiciones pueden administrarse directamente al sujeto.

Los portadores que pueden utilizarse con las composiciones son bien conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitación,por ejemplo,tiroglobulina, albúminas como la albúmina sérica humana, toxoide tetánico y poliaminoácidos como poli L-lisina, poli L-ácido glutámico, influenza, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y tal. Pueden utilizarse diversos portadores acuosos,por ejemplo,agua, agua tamponada, solución salina al 0.8 %, glicina al 0.3 %, ácido hialurónico y similares. Las composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtración. Una composición resultante puede envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.

Métodos de tratamiento

La presente divulgación proporciona un método para tratar la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento 50-600 |jg o 100-600 |jg (por ejemplo, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, o 600 jg ) de un péptido agonista de GLP-1/glucagón como se divulga en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382). Los 50-600 jg o 100-600 jg del péptido agonista del GLP-1/glucagón divulgados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse en dosis únicas o divididas. Además, los 50-600 jg o 100-600 jg del péptido agonista de GLP-1/glucagón divulgado en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse en dosis crecientes (por ejemplo, un ajuste de dosis tal como una dosis inicial de 100 jg , una segunda dosis de 150 o 200 jg , y opcionalmente una tercera dosis de 200, 300 o 400 jg , por ejemplo, en el que la dosis inicial y/o la segunda dosis se administran durante 3-10 días o 3-7 días). En algunos casos, la administración es un complemento de la dieta y el ejercicio. La administración también puede reducir el peso corporal o tratar la obesidad. En ciertos casos, el sujeto tiene un IMC de 27 a 40 kg/m2. En ciertos casos, el sujeto tiene un IMC de 30 a 39.9 kg/m2. En ciertos casos, el sujeto tiene un IMC de al menos 40. En algunos casos, el sujeto tiene sobrepeso. En algunos casos, el sujeto es obeso.

Como se proporciona en el presente documento, pueden administrarse 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 o 600 jg ) de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) para prevenir el aumento de peso, prevenir el aumento de grasa (por ejemplo, grasa hepática), promover la pérdida de peso, promover la pérdida de grasa (por ejemplo, grasa hepática), reducir el exceso de peso corporal, reducir la grasa (por ejemplo, grasa hepática) o tratar la obesidad(por ejemplo,mediante el control del apetito, la alimentación, la ingesta de alimentos, la ingesta de calorías y/o el gasto energético), incluida la obesidad mórbida. El aumento del gasto energético puede deberse, por ejemplo, a una mayor oxidación de ácidos grasos y/o glucosa en el hígado.

En ciertos casos, la administración de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) produce una pérdida de peso de al menos 1 kg. En ciertos casos, la administración de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) produce una pérdida de peso de al menos 1,3 kg. En ciertos casos, la administración de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento produce una pérdida de peso de al menos 1.5 kg. En ciertos casos, la administración de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) produce una pérdida de peso de 1 a 3 kg tras cuatro semanas de administración repetida una vez al día. En ciertos casos, la administración de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) produce una pérdida de peso de 1.3 a 2 kg tras cuatro semanas de administración repetida una vez al día.

La vía de administración de los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral utilizado en el presente documento incluye,por ejemplo,la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Otro ejemplo de una forma de administración es una solución inyectable, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse como dosis única o como dosis múltiples. En ciertas realizaciones, se administran 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 o 600 |jg) de un péptido agonista del GLP-1/glucagón mediante inyección subcutánea.

Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis única en embolada, una infusión o una dosis en embolada de carga seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos específicos, fijos o variables,por ejemplo,una vez al día o "según necesidad". Los regímenes de dosificación también pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada(por ejemplo,una respuesta terapéutica o profiláctica).

En ciertos casos, pueden administrarse 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 o 600 jg ) de los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) una vez al día. En ciertos casos, pueden administrarse 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 o 600 jg ) de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) una vez al día mediante inyección (por ejemplo, administración subcutánea). En ciertos casos, 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 o 600 jg ) de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse una vez al día mediante inyección (por ejemplo, administración subcutánea) durante un periodo de al menos una semana, durante un periodo de al menos dos semanas, durante un periodo de al menos tres semanas, o durante un período de al menos cuatro semanas. En ciertos casos, pueden administrarse 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 o 600 jg ) de los péptidos agonistas del GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) en dosis únicas o divididas. En ciertos casos, 50-600 jg o 100-600 jg (por ejemplo, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, o 600 jg ) de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse en dosis crecientes (por ejemplo, un ajuste de dosis tal como una dosis inicial de 100 jg , una segunda dosis de 150 o 200 jg , y opcionalmente una tercera dosis de 200, 300 o 400 jg , por ejemplo, en el que la dosis inicial y/o la segunda dosis se administran durante 3-10 días o 3-7 días). En ciertos casos, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse como una dosis inicial de 100 jg durante cuatro días, una segunda dosis de 150 jg durante cuatro días, y una tercera dosis de 200 jg administrada posteriormente a diario. En ciertos casos, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse como una dosis inicial de 100 jg durante cinco días, una segunda dosis de 150 jg durante cinco días, una tercera dosis de 200 jg durante cinco días, y una cuarta dosis de 300 jg administrada posteriormente a diario. En ciertos casos, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) pueden administrarse como una dosis inicial de 100 jg durante cinco días, una segunda dosis de 200 jg durante cinco días y una tercera dosis de 300 jg administrada posteriormente a diario.

En ciertos casos, la semivida de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) es de unas 7 a 13 horas. En ciertos casos, la semivida de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) es de unas 9 a 13 horas. En ciertos casos, la semivida de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) es de unas 7 a 12 horas. En ciertos casos, la semivida de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) es de unas 10 a 12 horas. En ciertos casos, la semivida de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento (por ejemplo, MEDI0382) es de unas 8 a 11 horas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Síntesis, modificaciones y caracterización de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón

Lista de abreviaturas:

Boc:

terc-butiloxicarbonilo

terc-Bu;

terc-butilo

DCM:

diclorometano

DIC:

diisopropilcarbodiimida

Fmoc:

9-fluorenilmetoxicarbonilo

HOBt:

1-hidroxibenzotriazol

HPLC:

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento

Mtt:

4-metiltritilo

NMP:

N-metilpirrolidona

Pbf:

2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo

TFA:

ácido trifluoroacético

TIS:

triisopropilsilano

Trt:

trifenilmetilo, tritilo

Se sintetizaron péptidos agonistas de GLP-1/glucagón de la siguiente manera. La elongación de las cadenas peptídicas en NovaSyn TGR o en resina Fmoc-Wang precargada (NovaBiochem) se realizó con un sintetizador de péptidos en fase sólida PRELUDE™ (Protein Technologies, Tucson, AZ, EE.UU.). Se aplicaron los protocolos suministrados por el fabricante para el acoplamiento de los ésteres hidroxibenzotriazólicos de aminoácidos en N-metilpirolidona (NMP). El grupo fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) se usó para la protección semipermanente de los grupos alfa-amino de los aminoácidos, mientras que las cadenas laterales se protegieron con ferc-butilo (ferc-Bu) para la serina, la treonina, el ácido aspártico, el ácido glutámico y la tirosina y con 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf) para la arginina y con tritilo (Trt) para la histidina. El grupo amino N-terminal de la histidina en posición 1 se protegió con el grupo ferc-butiloxicarbonilo (Boc). La Lys(Mtt) se incorporó a la cadena peptídica cuando se requería una modificación química posterior de la cadena lateral.

Una vez completada la elongación de la cadena peptídica, se retiró el grupo Mtt lavando la resina peptídica con DCM que contenía TFA al 2 % y TIS al 5 % (10 * 7 ml, cada 0.5 min). El acoplamiento de un resto lipídico a la cadena lateral de Lys se realizó en el sintetizador de péptidos PRELUDE™ usando DIC como reactivo de acoplamiento en presencia de HOBt.

Los péptidos se escindieron de la resina usando una mezcla de TFA:TIS:agua (95:2,5:2.5). Después de 2 h a temperatura ambiente, la resina peptidílica se filtró, se lavó con TFA y los filtrados combinados se evaporaron a sequedadal vacío.El residuo se trituró con éter y el precipitado formado se filtró, se lavó con éter y se secó. Los péptidos en bruto se disolvieron en ácido acético al 5 % en agua y se analizaron mediante cromatografía de líquidos de alta presión en fase inversa en una columna Polaris 3 C8-A acoplada al sistema Varian 920-LC. Para el análisis se usó un sistema de gradiente convencional del 10 al 90 % de tampón B en el transcurso de 15 min. El tampón A era TFA al 0.1 % en agua y el tampón B era TFA al 0.1 % en acetonitrilo. Los perfiles de HPLC se registraron a 210 nm. Se realizaron separaciones preparativas en el sistema Varian ProStar con una columna semipreparativa C18 RP XBridge Waters. Para la separación se usó el sistema de disolventes descrito anteriormente de agua y acetonitrilo, en un gradiente del 30 al 70 % de tampón B en el transcurso de 30 min. Los productos cromatográficamente homogéneos (pureza > 97 %) se analizaron mediante espectrometría de masas por electronebulización (MassLynx, Waters).

Ejemplo 2: Estudios in vitro

Producción de AMPc mediada por receptores de glucagón y de GLP-1

Actividad biológica de los péptidos en el ensayo de actividad AMPc basado en células (ensayo 1):

Se comprobó la actividad biológica de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón sintetizados por el método del Ejemplo 1,por ejemplo,la estimulación de una o más respuestas de receptores celulares. Se generaron estirpes celulares estables que expresaban el receptor de GLP-1 (GLP-1R), el receptor de glucagón (GCGR) o el receptor del péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (polipéptido inhibidor gástrico) (GIPR) humanos, de ratón, de rata o de perro en células HEK293s o CHO mediante métodos convencionales. La activación peptídica de estos diversos receptores da como resultado la producción corriente abajo del segundo mensajero AMPc, que puede medirse en un ensayo de actividad funcional.

Los ensayos de AMPc se realizaron usando "medio de ensayo":

Medio de ensayo: FBS al 10 % en DMEM (Gibco n.° 41966), que contenía

0.5mM IBMX (Sigma # I7018).

Se usaron placas de 384 pocillos de baja unión a proteínas (Greiner n.° 781280) para realizar once diluciones en serie de 1 en 5 de las muestras de ensayo que se hicieron en medio de ensayo. Todas las diluciones de muestras se hicieron por duplicado.

Un crio-vial congelado de células que expresaban el receptor de interés se descongeló rápidamente en un baño de agua, se transfirió al medio de ensayo precalentado y se centrifugó a 240xg durante 5 minutos. Las células se volvieron a suspender en medios de ensayo a una concentración optimizada(por ejemplo,células hGCGR a 1*105 células /ml, células hGLP-1R y hGIPR a 0.5*105 células /ml).

A partir de la placa de dilución, se estampó una réplica de 5 |jl en una placa negra poco profunda de 384 pocillos con fondo en U (Coming # 3676). A esto se añadieron 5 j l de suspensión celular y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Se midieron los niveles de AMPc usando un kit de AMPc dinámico 2 HTRF disponible en el mercado (Cisbio, n.° de Cat 62AM4PEJ), siguiendo el protocolo de dos etapas según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se prepararon criptato anti-AMPc (fluoróforo donante) y AMPc-d2 (fluoróforo aceptor) por separado diluyendo cada uno 1/20 en tampón de conjugado y lisis proporcionado en el kit. Se añadieron 5 j l de criptato anti-AMPc a todos los pocillos de la placa de ensayo y 5 j l de AMPc-d2 a todos los pocillos excepto a los de unión no específica (NSB, por sus siglas en inglés), a los que se les añadió tampón de conjugado y lisis. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora y después se leyeron en un Envision (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 320 nm y longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm.

Las secuencias de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón sintetizados y sus valores de CE50 determinados en ensayos de AMPc, realizados en "medio de ensayo", se muestran en la Tabla 2. Todos los péptidos de la Tabla 2 se sintetizaron con una amida C-terminal. Se sintetizaron péptidos agonistas de GLP-1/glucagón adicionales con un ácido C-terminal y los valores de CE50 determinados en los ensayos de AMPc, realizados en "medio de ensayo", se muestran en la Tabla 3. La CE50 para péptidos agonistas de GLP-1/glucagón adicionales, realizada en "medio de ensayo", se muestra en la Tabla 4. Todos los péptidos de la Tabla 4 tienen una amida C-terminal, a menos que se indiquen como "ácido", en cuyo caso tienen un ácido C-terminal.

Tabla 2: Actividad del AMPc de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón con amida C-terminal (ensayo 1)

Tabla 3: Actividad del AMPc de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón con ácido C-terminal (ensayo 1)

Tabla 4: Actividad AMPc de péptidos agonistas GLP-1/glucagón adicionales (ensayo 1)

Ensayos de producción de AMPc mediada por receptores de glucagón y GLP-1 en presencia de concentraciones plasmáticas de albúmina sérica_(ensayo 2).Las determinaciones de la potencia agonista para péptidos que inducen la producción de AMPc se midieron en células CHO que expresaban receptores de glucagón humanos, de rata o de ratón (abreviados como GlucR o GCGR) o receptores de GLP-1 en presencia de albúmina sérica humana, de rata o de ratón al 4.4, 3.2 y 3.2 % respectivamente, de la siguiente manera.

Se cultivaron células CHO con expresión recombinante estable del GlucR o el receptor de GLP-1 humanos, de ratón o de rata en DMEM, FBS al 10 % y geneticina (100 |jg/ml). Las reservas de células crioconservadas se prepararon en 1x medio de congelación celular-DMSO sin suero (Sigma Aldrich) a 2*10<7>/vial y se almacenaron a -80 °C. Las células se descongelaron rápidamente a 37 °C y se diluyeron en tampón de ensayo (DMEM) con albúmina sérica al 4.4, 3.2 y 3.2 % para albúmina sérica humana, de rata y de ratón, respectivamente. Los péptidos se diluyeron en serie en DMSO y después se diluyeron 100 veces en DMEM que contenía albúmina sérica, a la concentración final indicada. Después, los péptidos diluidos se transfirieron a placas de ensayo de microtitulación de 384 pocillos de color negro poco profundos. Las células se añadieron a las placas de ensayo y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la incubación, se detuvo el ensayo y se midieron los niveles de cAMP utilizando el kit de ensayo de cAMP HTRF<®>dynamic d2 disponible en CisBio Bioassays, según las directrices del fabricante. Las placas se leyeron en lectores de placas de fluorescencia Perkin Elmer ENVISION<®>. La albúmina sérica humana y de rata se adquirió en Sigma Aldrich y la albúmina sérica de ratón en Equitech Bio Ltd.

Los datos se transformaron en % de Delta F como se describe en las directrices del fabricante y se analizaron mediante un ajuste logístico de 4 parámetros para determinar los valores de CE<50>. Los valores de CE<50>del ensayo 2 para péptidos seleccionados se muestran en la Tabla 5. Los valores de CE50 del ensayo 2 determinados dependen tanto de la potencia intrínseca de los péptidos sometidos a ensayo en los receptores de GLP1 y de glucagón en las estirpes celulares recombinantes como de la afinidad del péptido por la albúmina sérica, que determina la cantidad de péptido libre. La asociación con la albúmina sérica aumenta el valor de CE50 obtenido. La fracción de péptido libre a concentraciones plasmáticas de albúmina y la CE50 a HSA al 0 % pueden calcularse basándose en la variación en la generación de AMPc con la concentración de HSA. Por ejemplo, G730 y G933 proporcionaron valores del 0.85 % y el 0.29 % para el péptido libre a HSA al 4.4 % y de 7 pM y 6 pM para la CE50 en el GLP1R a HSA al 0 %, respectivamente. G797 y G849 proporcionan valores del 0.82 % y el 0.48 % para el péptido libre a HSA al 4.4 % y de 7 pM y 2 pM para la CE50 en el GLP1R a HSA al 0 %, respectivamente. Para comparar el equilibrio de las actividades en el GLP1R y el GlucR entre diferentes péptidos y en diferentes condiciones, éstos pueden correlacionarse usando el cálculo a continuación, en el que las CE50 se relacionan con las de los ligandos naturales.

Tabla 5: Potencias CE50 de los péptidos agonistas del GLP-1/Glucagón en presencia de concentraciones plasmáticas de albúmina sérica (ensayo 2)

Ensayos de estabilidad de péptidos en plasma.La estabilidad en el plasma de los péptidos G730, G797, G849 y G933 se determinó de la siguiente manera.

Se prepararon soluciones madre de los péptidos de aproximadamente 200 |jmol/l pesando el péptido sólido en un tubo Eppendorf de Baja Unión y disolviéndolo en DMSO. Se añadieron 10 j l de soluciones madre a 990 j l de plasma en un tubo Eppendorf de Baja Unión, dando como resultado concentraciones iniciales de los péptidos en plasma de aproximadamente 2 jmol/l. El plasma en blanco congelado de ser humano, rata y ratón se había descongelado y calentado a una temperatura de 37 °C antes de añadir la solución madre. Las muestras de plasma enriquecidas se mezclaron suavemente y se dejaron equilibrar durante aproximadamente 5 minutos antes de comenzar el experimento. Las muestras de plasma se incubaron durante 48 horas en una incubadora GalaxyR de CO<2>a 37 °C. Se tomaron muestras (30 j l) a las 0, 1, 2, 6.5, 17, 24 y 48 horas. Las muestras se almacenaron a -70 °C hasta su análisis.

Las muestras de plasma se analizaron de la siguiente manera. Las muestras de plasma de 30 j l precipitaron con 180 ml de etanol frío en una placa de 96 pocillos de baja unión (Eppendorf Protein LoBind). Tras mezclar y centrifugar, se transfirieron 100 j l del sobrenadante a una nueva placa y se inyectó 1 j l en una columna analítica.

El análisis se realizó usando un sistema jLC (LC Exigent jLC ) acoplado a un espectrómetro de masas de resolución media-alta (Perkin Elmer PenTOF) con ionización por electronebulización positiva. La columna analítica era una columna C18 Agilent Poroshell (hecha a medida) de 5 cm y 1 mm con un tamaño de partícula de 2.7 jm . Flujo: 0.1 ml/min usando un gradiente de fase inversa lento. Las fases móviles utilizadas fueron acetonitrilo y agua que contenían ácido fórmico al 0.1 %.

Los datos resultantes se evaluaron manualmente para los siguientes productos de degradación: 1 producto (ácido) y el producto de escisión de DPP IV. Los productos con masa 1 pueden surgir de la desamidación en los grupos amida de la glutamina o en el extremo C. Los productos de escisión surgen de la acción de la proteasa DPP IV en plasma. Tanto la degradación de los péptidos como la formación de productos peptídicos se publicaron en porcentaje de la concentración de péptido inicial. Se integraron los picos y se calculó el % de péptido restante: (área del pico/área del pico 0H)*100. Los datos para el punto temporal de 24 h se muestran en la Tabla 6. Los niveles de desamidación y escisión de DPP IV fueron bajos para g 797 y G933.

Tabla 6: Estabilidad del péptido en plasma

SolubilidadLa solubilidad del péptido se evaluó en una diversidad de especies de tampón dentro de un intervalo de pH de 4.5 a 8.0, de la siguiente manera. Las formas de polvo seco de los péptidos agonistas de GLP-1/Glucagón se reconstituyeron en diversos tampones a temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 280 nm usando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 y la concentración de péptidos se calculó usando la siguiente ecuación: c=(A<28>o*Mw)/e

donde: c- concentración £- coeficiente de extinción Mw- peso molecular

A<280>- Absorbancia a 280 nm

s = (1 x Trp = 5560) (1 x Tyr = 1200)

Los Resultados se muestran en la Tabla 7. Cada uno de los péptidos era soluble a 0.8 mg/ml en un intervalo de pH (6.5 a 8.5). G730 era soluble en un intervalo de pH de 4.5 a 8.0, G797 era soluble en un intervalo de pH de 6. a 8.0, y G933 era soluble en un intervalo de pH de 6 a 8.0. La solubilidad de G933 se sometió a ensayo en varios sistemas tampón diferentes, que también se muestran en la Tabla 7. G933 era soluble a 1mg/ml en al menos los siguientes sistemas tampón: histidina (pH 6 y 7; fuerza iónica :0.25 a 100 mM), fosfato sódico (pH 6-7,5; fuerza iónica :0.25 a 100 mM), y tris/hidroximetil aminometano (pH 7-9; fuerza iónica :0.25 a 100 mM).

TABLA 7: Perfil de solubilidad del péptido (Fuerza iónica de todos los tampones: 100 mM)

Formulaciones.Se evaluó la solubilidad del péptido en tres formulaciones isotónicas diferentes:

1. Formulación por defecto (DF, por sus siglas en inglés)= Tris 0.1 M pH 7.5, Manitol 150 mM. Formulación final pH= 7.2

2. Formulación de respaldo 1 (BF1, por sus siglas en inglés)= Tris 0.05 M, Arginina 50 mM/Prolina.

Formulación final pH= 8.0

3. Formulación de respaldo 2 (BF2, por sus siglas en i nglés)= Tampón de fosfato de sodio (pH8)/ propilenglicol al 1.85%P/V. Formulación final pH= 7.0

La solubilidad se midió como se ha detallado anteriormente y los resultados se muestran en la Tabla 8. G730, G797 y G933 eran solubles al menos a 5mg/ml en el DF, la solubilidad máxima de G849 en DF era de 3.7 mg/ml, G797 era soluble al menos a 10mg/ml en BF1, y G933 era soluble al menos a 10mg/ml en BF2.

Tabla 8: Solubilidad del péptido en la formulación

La estabilidad de la DF se evaluó midiendo la pureza por cromatografía de líquidos de fase inversa (RP UPLC), en un mes. Las condiciones de almacenamiento fueron 5 °C, 25 °C, 40 °C y -80 °C. Los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10.

Tabla 9 Pureza de la formulación del péptido después de 1 mes en condiciones de estabilidad

Tabla 10: Pérdida de pureza de la formulación del péptido (% en comparación con T0) después de 1 mes en condiciones de estabilidad

Todos los péptidos mostraron propiedades aceptables en cuanto a solubilidad, formulabilidad y estabilidad

Ejemplo 3: Estudios in vivo

G730, G797 y G812 (estudio A).Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón seleccionados desvelados en el presente documento se sometieron a ensayo en un modelo en ratón de obesidad inducida por dieta (DIO, por sus siglas en inglés), de la siguiente manera. Las hembras C57/Bl6JHsdOla (obtenidas en Harlan Laboratories, Reino Unido) empezaron a recibir una dieta rica en grasas a base de D12492 (Research Diets, NJ, EE.UU.) y un dulce de chocolate, bola delicada (Delicata Bakverk, Suecia) a las 9-11 semanas de edad, y se mantuvieron con la dieta durante 16 semanas antes de su llegada al animalario, durante un periodo de aclimatación de tres semanas y durante el tratamiento farmacológico, el contenido calórico de los dos componentes de la dieta se muestra en la tabla 11. Los ratones se dividieron en 9 grupos (n=5-6) y el tratamiento se inició a las 29 semanas de vida. Los grupos de tratamiento y las dosis se muestran en la Tabla 12.

Tabla 11: Contenido de la dieta DIO

Tabla 12: Grupos de tratamiento para el Estudio A

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G730, G797 y G812, así como la Liraglutida, se formularon en el vehículo, Tris 100 mM/manitol 150 mM, pH 7.4. Los tratamientos se administraron por vía subcutánea dos veces al día durante 14 días, mientras los animales se mantenían con una dieta rica en grasas. El peso corporal de los animales se controló a diario durante todo el período de dosificación. El día 14, se obtuvieron muestras de sangre para la medición de la glucosa y la insulina en plasma de ratones conscientes después de un período de ayuno de 4 horas. Después, los ratones se anestesiaron con isoflourano y se recogió sangre terminal del lecho capilar detrás del ojo. Se midieron los siguientes parámetros: mediciones de química sanguínea de triglicéridos, colesterol total, ácidos grasos no esterificados (NEFA), beta-hidroxibutirato y factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Tablas 14 y 15 a continuación).

El efecto del tratamiento con liraglutida y los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G730, G797 y G812 sobre el peso corporal, en comparación con la liraglutida y el vehículo, se muestra en las FIG. 1-4. Los animales tratados con G730 o G797 mostraron una pérdida de peso continua y dependiente de la dosis durante el período de dosificación de 14 días. A 50 nmol/kg, los animales tratados con G730 y G797 experimentaron un cambio de peso de aproximadamente el 24 % el día 14 en comparación con los animales tratados con vehículo.

Los ratones tratados con G730 o G797 mostraron una reducción de los niveles de glucosa dependiente de la dosis en el día 14 (Tabla 13). También se observó una reducción de los niveles de insulina con estos dos tratamientos, especialmente con las dosis más altas (Tabla 13). El índice de sensibilidad a la insulina Evaluación en Modelo Homeostático (HOMA, por sus siglas en inglés) mejoró significativamente a 20 nmol/kg de G730 y 20 y 50 nmol/kg de G797. HOMA es un método de modelización que usa la suma de los niveles plasmáticos de insulina y glucosa para evaluar la función de las células p y la resistencia a la insulina (Tabla 14). El colesterol plasmático total se redujo con liraglutida, G730 y G797 en todas las dosis, con cambios menos pronunciados en los niveles de ácidos grasos no esterificados (AGNE) en plasma y en los triglicéridos (TG) plasmáticos y hepáticos. El betahidroxibutirato (BeHy) tenía tendencia a aumentar sus niveles, en consonancia con la pérdida de peso corporal. El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) aumentó en general con el tratamiento con el péptido agonista dual de GLP-1/glucagón.

Tabla 13: Efecto del tratamiento con el péptido agonista del GLP-1/glucagón sobre la glucosa, la insulina y el HOMA.

Tabla 14: Efecto del tratamiento con el péptido agonista del GLP-1/glucagón en mediciones adicionales de la química sanguínea.

G865, G933 y G796 (estudio B).Se sometió a ensayo un conjunto adicional de péptidos de GLP-1/glucagón en un modelo de obesidad inducida por dieta usando el mismo protocolo anterior, pero con los grupos de tratamiento y las dosis que se muestran en la Tabla 15:

Tabla 15: Grupos de tratamiento para el Estudio B

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G865, G933 y G796, así como la liraglutida, se formularon en el vehículo, Tris 100 mM/manitol 150 mM, pH 7.4. Los tratamientos se administraron por vía subcutánea dos veces al día durante 14 días, mientras los animales se mantenían con una dieta rica en grasas. El peso corporal de los animales se controló a diario durante todo el período de dosificación. El día 14, se obtuvieron muestras de sangre para la medición de la glucosa y la insulina en plasma de ratones conscientes después de un período de ayuno de 4 horas. Después, los ratones se anestesiaron con isoflourano y se recogió sangre terminal del lecho capilar detrás del ojo. Se midieron los siguientes parámetros: mediciones de química sanguínea de triglicéridos, colesterol total, ácidos grasos no esterificados (NEFA), beta-hidroxibutirato y factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Tabla 16 y Tabla 17 a continuación).

El efecto del tratamiento con liraglutida y los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G933, G865, G796 sobre el peso corporal, en comparación con la liraglutida y el vehículo, se muestra en las FIG. 5-8. Los animales tratados con G933, G865 o G796 mostraron una pérdida de peso continua y dependiente de la dosis durante el período de dosificación de 14 días.

Los niveles de glucosa, los niveles de insulina y la HOMA el día 14 después del tratamiento se muestran en la Tabla 16. Los niveles totales de colesterol en plasma, los niveles de ácidos grasos no esterificados (NEFA) en plasma, los niveles de triglicéridos (TG) en plasma y hepáticos, los niveles de beta-hidroxibutirato (BeHy) y los niveles del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (Fg f 21) el día 14 después del tratamiento se muestran en la Tabla 17.

Tabla 16: Efecto del tratamiento con el péptido agonista del GLP-1/glucagón sobre la glucosa, la insulina y el HOMA.

Tabla 17: Efecto del tratamiento con el péptido agonista del GLP-1/glucagón en mediciones adicionales de la química sanguínea.

Resultados evaluados mediante una distribución de dos colas, prueba t de varianza

desigual de dos muestras; * indica p<0.05 en comparación con el vehículo.

Ejemplo 4: Estudio de dosis única ascendente

(A) SUJETOS

Un total de 362 sujetos dieron su consentimiento para participar en el estudio en Alemania. Se examinó a los sujetos según los siguientes criterios de inclusión y exclusión.

Criterios de inclusión:

• Voluntarios sanos, de edades comprendidas entre los 18 y los 45 años en el m om ento del cribado;

• Índice de masa corporal > 22 y < 30 kg/m2 y peso corporal > 70 kg; y

• Acceso venoso apto para canulaciones múltiples.

Criterios de exclusión:

• Cualquier condición que pudiera in te rfe rir con la evaluación del G933 o la in terpretac ión de la seguridad del sujeto o los resultados del estudio. Entre los ejemplos específicos se incluían (a) antecedentes de pancreatitis aguda o crónica, o de amilasa o lipasa pancreáticas superiores al límite superior de la normalidad (ULN) en el momento del cribado, (b) antecedentes de gastroparesia que requiriera tratamiento, (c) antecedentes de cirugía que afectara al tracto gastrointestinal superior que pudiera afectar a la interpretación de los datos de seguridad y tolerabilidad, (d) antecedentes de colelitiasis con episodios de colecistitis aguda no tratada mediante colecistectomía, o enfermedad biliar conocida, (e) antecedentes o antecedentes familiares de neoplasia endocrina múltiple tipo 2 (MEN-2), calcitonina sérica sugestiva de hiperplasia tiroidea de células C (nivel de calcitonina > 50 ng/l), o carcinoma medular de tiroides en el momento del cribado, (f) antecedentes de alteraciones clínicamente significativas del ritmo cardiaco, por ejemplo g., fibrilación/flutter auricular permanente o paroxística, taquicardia supraventricular paroxística, taquicardia ventricular paroxística, presencia de un dispositivo marcapasos implantable o cardioversor/desfibrilador, (g) antecedentes de insuficiencia cardiaca tratada o sintomática, y (h) antecedentes de infarto de miocardio o accidente cerebrovascular previos (por ejemplo, ictus);

• Antecedentes o presencia de enferm edad gastrointes&nal, renal o hepá&ca (a excepción del síndrom e de G ilbert) o cualquier o tra afección que se sepa que in te rfie re en la absorción, d istribución , m etabo lism o o excreción de los fármacos;

• Antecedentes de cáncer, a excepción del cáncer de piel no melanoma;

• Cualquier enferm edad clín icam ente im portan te , proced im ien to m éd ico /qu irúrg ico o traum a&sm o en las 4 semanas anteriores a la dosis del Día 1;

• Serología posi&va del an3geno de superficie de la hepa&&s B o de an&cuerpos contra el virus de la hepa&&s C en el m om ento del cribado;

• Prueba positiva del virus de la ¡nm unodeficiencia humana (VIH) en el cribado o uso de m edicación an tírre trov ira l según de te rm ine la h istoria clínica o el in form e verbal del sujeto;

• Potasio o calcio séricos fuera del in terva lo normal en el cribado;

• Creatínina sérica, aspartato am inotransferasa (AST), alanina am inotransferasa (ALT) o b ilirrub ina to ta l superiores al ULN en el m om ento del cribado;

• Cualquier o tra anomalía clín icam ente im portan te en los resultados de química clínica, hem atología o análisis de orina, a ju ic io del investigador, tam bién debe dar lugar a la exclusión del estudio;

• Uso de cualquiera de los siguientes m edicam entos: (a) uso simultáneo o previo de un agonista del receptor de GLP-1, (b) uso actual o previo de corticosteroides sistémicos en los últimos 28 días anteriores a la selección, o (c) uso de cualquier medicamento o preparado a base de plantas autorizado para el control del peso corporal o del apetito está prohibido desde 1 semana antes del Día -1 hasta el Día 7;

• Signos vitales anorm ales tras 10 m inutos de reposo supino, defin idos como cualquiera de los siguientes: (a) Presión arterial sistólica < 90 mmHg o > 140 mmHg, (b) Presión arterial diastólica < 50 mmHg o > 90 mmHg, o (c) Frecuencia cardiaca < 50 o > 90 latidos por minuto;

• Cualquier anomalía clín icam ente im portan te en el ritm o , la conducción (por e jemplo, síndrome de W olff-Parkinson-W hite, síndrome del seno enferm o) o la m orfo logía del ECG de 12 derivaciones en reposo, o cualquier anomalía en el ECG que, en opin ión del investigador, pueda in te rfe rir con la in terpre tac ión de los cambios en el in tervalo QT corregido por la frecuencia cardíaca (QTc), incluida la m orfo logía anorm al de la onda T o la h ipe rtro fia ventricu la r izquierda;

• QTc prolongado según la fó rm u la de Fridericia (QTcF) > 450 m ilisegundos, o QTcF acortado < 340 m ilisegundos con base en ECG de 12 derivaciones, o antecedentes fam iliares de síndrome de QT largo;

• Acortam iento del in tervalo PR (PQ) a < 120 m ilisegundos o prolongación > 200 m ilisegundos (b loqueo auricu loventricu la r de prim er grado) ;

• Bloqueo intermitente de segundo grado (el bloqueo de Wenckebach durante el sueño no es exclusivo) o de tercer grado, o disociación auriculoventricular;

• Intervalo QRS fuera del intervalo de 50-110 milisegundos;

• Historial conocido o sospechoso de abuso de drogas en los últimos 3 años;

• Antecedentes de abuso de alcohol o ingesta excesiva de alcohol en los últimos 3 años;

• Fumador actual (> 0 cigarrillos al día); los sujetos también quedan excluidos si dan positivo en la prueba de cotinina en el cribado;

• Cribado positivo de drogas de abuso en el cribado o ingreso en la unidad de estudio, o prueba de alcoholemia positiva en el ingreso en la unidad de estudio antes de la administración del producto en investigación. Los sujetos que utilicen benzodiacepinas para tratar la ansiedad crónica o los trastornos del sueño podrán participar en el estudio;

• Antecedentes de alergia/hipersensibilidad grave o alergia/hipersensibilidad clínicamente importante en curso;

• Donación de sangre total o glóbulos rojos, o cualquier pérdida de sangre > 500 ml en los 2 meses anteriores al cribado; •

• Recepción de otra nueva entidad química (definida como un compuesto cuya comercialización no ha sido aprobada), o participación en cualquier otro estudio clínico que incluya tratamiento farmacológico en un plazo de al menos 30 días o 5 semividas de la administración del producto en investigación en este estudio (lo que sea más largo). El periodo de exclusión comenzará 30 días o 5 semividas del medicamento en investigación después de la última dosis, o después de la última visita, lo que sea más largo. No se excluyen los sujetos consentidos y cribados, pero no aleatorizados en este estudio o en un estudio anterior.

• Enfermedad psiquiátrica tal que los sujetos hayan sido internados en una institución por orden oficial o judicial.

Tras el cribado, se determinó que 313 sujetos no cumplían los criterios de inclusión/exclusión. Los 48 sujetos restantes fueron aleatorizados y recibieron G933. En la tabla siguiente se muestran los datos demográficos de los 48 pacientes tratados.

Tabla 18 Demografía, población tratada

Tabla 18 Demografía, Doblación tratada

(B) DISENO DEL ESTUDIO

Se realizó un estudio de fase 1, aleatorizado, ciego y de dosis única ascendente. En la FIG. 9 se presenta un diagrama de flujo del estudio propuesto. Se planificaron ocho sujetos por cohorte. Dentro de cada cohorte, los sujetos fueron aleatorizados 3:1 a G933 (MEDI0382) o placebo.

Con base en modelos PK/PD realizados utilizando datos de la literatura clínica sobre GPL-1 y moduladores del glucagón, se predijo que la dosis clínicamente eficaz de G933 se encontraba en el intervalo de 300 a 2000 |jg/día. Así, se seleccionaron incrementos de dosis de 5, 10, 30, 100, 300, 600, 1200 y 2000 jg de G933. Se evaluaron los datos de seguridad de cada cohorte antes de autorizar el aumento de la dosis. Para aumentar aún más la seguridad, los aumentos de los pliegues fueron mayores en el extremo inferior del intervalo de dosis propuesto y se redujeron de forma escalonada, de modo que el último aumento de la dosis fuera inferior a 2 veces. La dosis máxima propuesta en este estudio fue de 2000 jg . El margen de seguridad a la dosis máxima propuesta para humanos de 2000 jg , con base en los datos del AUC en monos, era de 0.8.

Los sujetos recibieron 1 dosis de G933 durante el estudio. Para todos los sujetos, se realizó una visita de cribado en los 28 días previos a la aleatorización (Día -29 a Día -2). Los sujetos fueron ingresados en la unidad la tarde anterior a recibir el producto en investigación (Día - 1) para poder repetir la evaluación de los criterios de elegibilidad, realizar una monitorización de telemetría cardiaca durante un periodo de 4 horas y estandarizar el nivel de actividad física antes de la administración de la dosis a la mañana siguiente. El día 1, tras una noche de ayuno de un mínimo de 8 horas, se obtuvieron las evaluaciones basales de seguridad y muestras de sangre, y se administró al sujeto una dosis única subcutánea (SC) de G933 o de placebo. Los sujetos permanecieron en el centro del estudio para evaluaciones cronometradas y monitorización de seguridad (incluida la monitorización cardiaca mediante telemetría continua y electrocardiogramas digitales [ECG] intermitentes) durante el Día 1 y el Día 2, y permanecieron alojados hasta el alta. Los sujetos fueron dados de alta de la unidad en la mañana del día 3 después de que se realizaran las evaluaciones de seguridad y se recogieran muestras de sangre. Los sujetos volvieron a la unidad para visitas ambulatorias los días 4, 7 y 28.

Tras el cribado, la duración del estudio para cada sujeto fue de aproximadamente 29 días, lo que incluía un periodo de evaluación hospitalaria y un periodo de seguimiento ambulatorio.

Para las evaluaciones farmacodinámicas, el día 1 se extrajeron muestras de sangre para medir los niveles de glucosa e insulina antes de cada comida (desayuno, almuerzo y cena) y 1 y 2 horas (± 15 minutos) después del inicio de cada comida. Se registró el inicio de cada comida en el Día 1 y cada comida debía consumirse en 30 minutos.

Para las evaluaciones inmunológicas, se tomaron muestras de anticuerpos antifármaco (ADA) el Día 1, aproximadamente 1 semana después de la dosis y aproximadamente 1 mes después de la dosis. \

Para las evaluaciones farmacocinéticas (PK), los tiempos de muestreo fueron antes de la dosis, y 1,2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24, 36, 48 y 72 horas después de la dosis (± 15 minutos para las primeras 2 horas y ± 30 minutos para los puntos de tiempo restantes hasta 48 horas después de la dosis). El día 1, también se tomaron muestras de PK antes de cada comida (desayuno, almuerzo y cena), 1 y 2 horas (± 15 minutos) después del inicio de cada comida.

(C) RESULTADOS

La dosis se aumentó de 5 a 300 |jg según lo previsto en el protocolo; sin embargo, 300 |jg no se toleraron, como lo demostraron los vómitos importantes, y la dosis se redujo a 150 jg para la cohorte final. En la FIG. 9 se presenta un diagrama de flujo del estudio real, y en la FIG. 10 se muestra la disposición de los sujetos.

No se pudieron derivar parámetros PK para 5 jg de G933, ya que sólo 3 sujetos mostraron al menos un nivel cuantificable en plasma. Las concentraciones plasmáticas de G933 fueron medibles desde las 2-4,5 horas hasta las 16-24 horas en todos los sujetos de los grupos de 5 y 10 jg de G933. Las concentraciones plasmáticas de G933 fueron medibles hasta las 48 horas en todos los sujetos de los grupos de 100 y 300 jg de G933. Ningún sujeto presentó concentraciones plasmáticas cuantificables de G933 a las 72 horas posdosis.

Los perfiles de concentración-tiempo medios para todas las dosis de G933 mostraron un descenso monoexponencial aparente tras el pico, con una caída moderadamente rápida de la concentración entre el pico y las 48 horas tras la dosificación.

Las estimaciones de los parámetros de PK de G933 en plasma en dosis única se enumeraron por sujeto y tratamiento y se resumen por tratamiento en la Tabla 19.

Tabla 19 Compendio de la mediana de la Estimación de Parámetros Farmacocinéticos de la Dosis Única de G933 (Media Geométrica [Cl 95 %])

G933 se absorbió con una mediana del tiempo hasta la concentración máxima (tmáx) de 7.0-9.0 horas tras la administración única de G933 a dosis comprendidas entre 5 y 150 |jg, y con una mediana de tmáx de 4.5 horas a la dosis más alta de 300 jg .

La semivida de eliminación terminal aparente (ti</2>) de G933 se determinó utilizando al menos 3 puntos de datos basados en la inspección visual durante el periodo de muestreo de 72 horas. La T<1/2>no fue evaluable en los sujetos del grupo de dosis 5 jg debido a concentraciones plasmáticas demasiado bajas. En el grupo de las otras dosis, cuando el %AUCex fue superior al 20 %, tampoco se comunicó el t<1/2>y, en consecuencia, el AUC<0>-~. La media geométrica del valor t i</2>fue de unas 10-12 horas.

La variabilidad intersujeto para la concentración plasmática máxima (Cmax) y el AUC<0>-~, expresada por el coeficiente de variación (CV), fue moderada (3-37 %) para ambos parámetros.

Ningún sujeto dio positivo en ADA en la línea de base ni después de la línea de base.

La presión arterial, el pulso, la ingesta de alimentos y los acontecimientos adversos se controlaron a lo largo del estudio y se resumen en la Tabla 20.

Todos los acontecimientos adversos emergentes del tratamiento fueron de Grado 1 (leves) o Grado 2 (moderados). Se resumen en la Tabla 21.

TABLA 20

Dosi Pico Cambi Median Cambio Media Cambi Número Ingesta Median Median Media s de o en la a de la máximo na de o en la de diaria a del a del na del (Hg) puls media BP de la la BP media sujetos total de pico de pico de pico o na del diastóli median sistóli na de con alimento glucosa glucos de medi pulso ca a de la ca la BP vómitos s (mmol/l) a glucos o máxim máxima BP máxim sistóli (episodi compara tras el (mmol/ a (bpm o tras (mm diastóli a (mm ca os de da con desayu l) (mmol/ ) (a) la Hg) ca tras Hg) máxim vómitos) placebo no (d) despué l) dosis la dosis a tras s de despu (bpm) m la comer( és de (b) g) dosis e) cenar (mm (f) Hg)

15081 15,7 15 7,5 5,1 5,1 5,2

300102 35,5 19 26 4,7 5,1 4,9

BP = presión arterial

(a) La mediana del pulso máximo se define como la mediana del pulso máximo desde antes de la dosis hasta el día 28.

(b) La mediana del cambio máximo del pulso tras la dosis se define como la mediana del cambio máximo del pulso desde antes de la dosis hasta el día 28.

(c) Ingesta diaria total de alimentos en el desayuno, la comida y la cena

(d) Mediana de los niveles de glucosa recogidos aproximadamente 1 hora después del desayuno, correspondiente a 3.5 horas después de la dosis.

(e) Mediana de los niveles de glucosa recogidos aproximadamente 1 hora después de la comida, correspondiente a 7 horas después de la dosis.

(f) Mediana de los niveles de glucosa recogidos aproximadamente 1 hora después de la cena, lo que corresponde a 13.5 horas después de la dosis.

Tabla 21 Efectos adversos emergentes del tratamiento por clase de órgano del sistema y término preferente - Población tratada

En general, G933 fue bien tolerado, con vómitos y aumento de la frecuencia del pulso y la presión arterial observados en las dosis más altas. Los criterios de valoración exploratorios preespecificados sugieren una reducción de la ingesta diaria total de alimentos en los sujetos tratados con GP933 a todas las dosis en comparación con placebo.

Las mediciones individuales de glucosa e insulina en sangre alrededor de las comidas y los niveles plasmáticos medios de glucosa e insulina por dosis se muestran en las FIG. 11 y 12, respectivamente, en el intervalo de tiempo de 2.5 a 14 horas tras la dosis. Se observó un efecto reductor de la glucosa en los niveles plasmáticos de glucosa de los sujetos tratados con G933 a todas las dosis. Este efecto fue más visible alrededor de la hora de la primera comida. Del mismo modo, los niveles plasmáticos de insulina mostraron una respuesta a la dosis, especialmente a dosis de 100 |jg o superiores, en correspondencia con la hora de la primera comida.

Los TEAEs más frecuentes (incidencia > 10 % de los sujetos) fueron vómitos, náuseas, mareos y cefalea. Sólo se produjeron TEAEs de vómitos con las dosis más altas de G933 (100, 150 y 300 jg). Hubo un total de 40 episodios de vómitos en los 10 sujetos que los experimentaron. Treinta episodios correspondieron a 5 sujetos con la dosis de 300 jg , 9 episodios a 4 sujetos con la dosis de 150 jg y 1 episodio a 1 sujeto con la dosis de 100 jg .

En 2 de 6 sujetos (33.3 %) del grupo de 150 jg de G933 y en 5 de 6 sujetos (83.3 %) del grupo de 300 jg de G933 se registraron vómitos significativos, definidos como 3 o más episodios de vómitos en un solo día o en 2 días consecutivos a pesar de haber ajustado la dieta. Debido a los vómitos significativos observados con la dosis de 300 jg , la dosis de G933 se redujo a 150 jg para la cohorte final.

A dosis de hasta 150 jg , la tolerabilidad de G933 fue aceptable con respecto a las náuseas, los vómitos, la taquicardia y la presión arterial. Con una dosis de 300 jg de G933, se observaron niveles inaceptables de vómitos, así como un aumento significativo de la presión arterial sistólica y de la frecuencia del pulso. Se han observado aumentos significativos del pulso en todo el intervalo de agonistas del GLP-1 comercializados tras una dosis única, sobre todo en voluntarios sanos, así como náuseas y vómitos. Dado que los efectos gastrointestinales de G933 (vómitos) se observaron a una dosis única de 150 jg sin efectos cardiovasculares, existe una ventana en la que G933 puede administrarse con seguridad a sujetos con diabetes mellitus tipo 2 a una dosis que se espera mejore el control glucémico e impulse la reducción de peso, sin un impacto negativo en el perfil de riesgo cardiovascular. G933 cumplió los criterios de seguridad y tolerabilidad en este estudio de dosis única en voluntarios sanos.

Ejemplo 5: Estudio de dosis múltiples ascendentes parte I

(A) SUJETOS

Aproximadamente 75 sujetos con sobrepeso u obesidad con diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) relativamente bien controlada se inscriben para participar en el estudio. Los sujetos inscritos cumplen los siguientes criterios de inclusión y exclusión.

Criterios de inclusión:

• Varón o mujer de 18 a 65 años en el momento del cribado;

• Índice de masa corporal de 27 a 40 kg/m2 (inclusive);

• Diagnóstico de T2DM y control glucémico gestionado con metformina en monoterapia en el que no se haya producido ningún cambio significativo de dosis (aumento o disminución > 500 mg/día) en los 3 meses anteriores al cribado: (a) El valor de hemoglobina A1C (hemoglobina glucosilada; HbA1c) de cribado debe estar dentro del intervalo diana de 6.5 % a 8.5 %, u opcionalmente de 7.0 % a 8.5 %; (b) los sujetos a los que se les prescriba un inhibidor de la dipeptidil peptidasa-4 (DPPIV) además de metformina en monoterapia pueden ser elegibles para entrar en el estudio tras un periodo de lavado de 4 semanas del inhibidor DPPIV antes del cribado; (c) los sujetos a los que se les haya prescrito menos del 50 % de la dosis autorizada de sulfonilurea, además de metformina en monoterapia, podrán participar en el estudio tras un periodo de lavado de 4 semanas de sulfonilurea; y (d) los sujetos a los que se les haya prescrito un inhibidor del cotransportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2), además de metformina en monoterapia, podrán participar en el estudio tras un periodo de lavado de 4 semanas de inhibidor de SGLT2;

• Acceso venoso apto para canulaciones múltiples;

• Los sujetos de la cohorte 4 deben estar tomando una dosis diaria > 10 mg de una estatina durante un periodo de al menos 4 semanas antes del cribado; y

• Los sujetos de la cohorte 4 deben estar dispuestos y ser capaces de autoadministrarse inyecciones subcutáneas (SC) diarias tras una autoinyección inicial de placebo durante el periodo de cribado.

Criterios de exclusión:

• Cualquier condición que pudiera interferir con las evaluaciones del producto en investigación o la interpretación de la seguridad del sujeto o los resultados del estudio. Algunos ejemplos concretos son: (a) antecedentes de pancreatitis aguda o crónica, o de amilasa o lipasa pancreáticas superiores al doble del límite superior de la normalidad (ULN) del intervalo de referencia del laboratorio en el momento del cribado, (b) antecedentes de gastroparesia que requiera tratamiento, (c) antecedentes de cirugía que afecte al tracto gastrointestinal superior que pueda afectar a la interpretación de los datos de seguridad y tolerabilidad (d) antecedentes de colelitiasis que haya dado lugar a episodios de colecistitis aguda no tratada mediante colecistectomía, o enfermedad biliar conocida, y (e) calcitonina sérica sugestiva de hiperplasia de células C tiroideas (nivel de calcitonina > 50 ng/l), carcinoma medular de tiroides, o antecedentes o antecedentes familiares de neoplasia endocrina múltiple en el momento del cribado; • Antecedentes o presencia de enfermedad gastrointestinal, renal o hepática (a excepción del síndrome de Gilbert), o cualquier otra afección que se sepa que interfiere en la absorción, distribución, metabolismo o excreción de los fármacos;

• Antecedentes de cáncer (opcionalmente en los últimos 10 años), a excepción del cáncer de piel no melanoma;

• Antecedentes o presencia de úlceras de pie diabético;

• Cualquier enfermedad clínicamente importante (aparte de la T2DM en sujetos con diabetes conocida), procedimiento médico/quirúrgico o traumatismo en las 4 semanas previas a la dosis del Día 1;

• Síntomas de insulinopenia o mal control de la glucemia (por ejemplo, sed importante, nicturia, poliuria, polidipsia o pérdida de peso);

• Glucemia en ayunas > 200 mg/dl (11.11 mmol/l);

• Serología positiva del antigeno de superficie de la hepatitis B o de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C en el m om ento del cribado;

• Prueba del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) positiva en el cribado o sujeto tomando medicación antirretroviral según determine la historia clínica o el informe verbal del sujeto;

• Aspartato transaminasa (AST) > 2.5 * ULN en el cribado;

• Transaminasa alanina (ALT) > 2.5 * ULN en el momento del cribado;

• Bilirrubina total > 2 * ULN en el momento del cribado;

• Hemoglobina por debajo del límite inferior del intervalo normal en el momento del cribado;

• Neutrófilos < 1.5 * 109/L en el cribado;

• Nivel de hormona estimulante del tiroides (TSH) por encima del intervalo normal en el momento del cribado;

Función renal alterada definida como tasa de filtración glomerular (GFR) < 60 ml/minuto/1.73m2 (GFR estimada según Modification in Renal Disease);

Macroalbuminuria persistente (definida como documentada en > 2 ocasiones previas por el médico habitual del sujeto) (> 300 mg/l);

Complicaciones diabéticas tardías significativas (macroangiopatía con síntomas de cardiopatía congestiva o enfermedad arterial periférica, microangiopatía con síntomas de neuropatía, gastroparesia, retinopatía, nefropatía);

Defecto de conducción cardiaca (por ejemplo, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome del seno enfermo) durante el periodo de cribado.

Signos vitales anormales, tras 10 minutos de reposo supino, definidos como cualquiera de los siguientes: (a) Si < 60 años, BP sistólica < 90 mm Hg o >l40 mm Hg; si > 60 años, BP sistólica < 90 mm Hg o > 150 mm Hg, (b) BP diastólica < 50 mm Hg o > 90 mm Hg, o (c) HR < 45 o > 85 latidos por minuto;

Cualquier anomalía clínicamente importante en el ritmo, la conducción o la morfología del ECG en reposo y cualquier anomalía en el ECG de 12 derivaciones que pueda interferir en la interpretación de los cambios del intervalo QTc, incluida la morfología anormal de la onda ST-T o la hipertrofia ventricular izquierda; QTcF prolongado > 450 mseg (para ambos sexos) o QTcF acortado < 340 mseg, o antecedentes familiares de síndrome de QT largo;

Acortamiento del intervalo PR (PQ) < 120 mseg (PR < 120 mseg pero > 110 mseg es aceptable si no hay evidencia de preexcitación ventricular);

Prolongación del intervalo PR (PQ) (> 240 mseg), bloqueo AV intermitente de segundo o tercer grado, o disociación AV;

Duración del QRS > 120 ms, incluido el bloqueo de rama persistente o intermitente

Desfibrilador cardíaco implantable o marcapasos permanente, y taquiarritmias ventriculares y/o auriculares sintomáticas;

Angina de pecho inestable o angina de pecho estable clasificada por encima de la clase II de la Sociedad Cardiovascular Canadiense o un infarto de miocardio o ictus;

Antecedentes de hospitalización por insuficiencia cardiaca o diagnóstico de insuficiencia cardiaca; Historial conocido o sospechoso de abuso de drogas en los últimos 3 años;

Antecedentes de abuso de alcohol o ingesta excesiva de alcohol en los últimos 3 años;

Cribado positivo de drogas de abuso en el cribado o ingreso en la unidad de estudio, o cribado positivo de alcohol en el ingreso en la unidad antes de la administración del producto en investigación. Los pacientes que utilicen benzodiacepinas para tratar la ansiedad crónica o trastornos del sueño podrán participar en el estudio;

Antecedentes de alergia/hipersensibilidad grave o alergia/hipersensibilidad clínicamente importante en curso;

Donación de sangre total o glóbulos rojos, o cualquier pérdida de sangre > 500 ml durante los 2 meses anteriores al cribado;

Ha recibido otra nueva entidad química (definida como un compuesto cuya comercialización no ha sido aprobada), o ha participado en cualquier otro estudio clínico que incluyera tratamiento farmacológico en un plazo de al menos 30 días o 5 semividas antes de la primera administración del producto en investigación en este estudio (lo que sea más largo). El periodo de exclusión comenzará 30 días o 5 semividas del medicamento en investigación después de la última dosis, o después de la última visita, lo que sea más largo. No se excluyen los sujetos consentidos y examinados, pero no asignados al azar a este estudio o a un estudio previo de Fase 1; •

Participación simultánea en otro estudio de cualquier tipo;

• Uso de cualquiera de los siguientes m edicam entos: (a) uso simultáneo o previo de un agonista del GLP-1 (b) uso de corticosteroides sistémicos en los 28 días anteriores a la selección; (c) uso de compuestos conocidos por prolongar el intervalo QTc, o (d) uso de cualquier preparado de hierbas o medicamento autorizado para el control del peso corporal o el apetito en la semana anterior al Día 1;

• Antecedentes de acidosis láctica o cetoacidosis.

(B) DISEÑO DEL ESTUDIO

Se realiza un estudio de fase 1/2, aleatorizado, doble ciego, de dosis múltiples ascendentes, en dos partes (A y B). En la FIG. 13 se presenta un diagrama de flujo del estudio. La Parte A establece un régimen de ajuste de dosis para G933 (MEDI0382) y una dosis efectiva máxima tras el ajuste, en sujetos con T2DM que siguen en tratamiento con metformina, durante un periodo de aproximadamente 12 días que se utilizará a continuación durante un periodo de dosificación prolongado (Parte B) para establecer la eficacia de G933 sobre el peso y el control glucémico.

La Parte A consta de 3 cohortes. La cohorte 1 consiste en una dosis estable (por ejemplo, 100 |jg) del producto en investigación administrada diariamente durante 7 días (9 sujetos; 6 G933, 3 placebo). La cohorte 2 consiste en una dosis inicial (por ejemplo, 100 jg ) del medicamento en investigación durante 4 días y un paso de ajuste (dosis de ajuste 1; por ejemplo, 150 jg ) durante 7 días (9 sujetos; 6 G933, 3 placebo), y la cohorte 3 consiste en una dosis inicial (por ejemplo, 100 jg ) del medicamento en investigación durante 4 días, una fase de ajuste (dosis de ajuste 1; por ejemplo, 150 jg ) durante 4 días y una segunda fase de ajuste (dosis de ajuste 2; por ejemplo, 200 jg ) durante 7 días (9 sujetos; 6 G933, 3 placebo).

La Parte B consta de 1 cohorte. A los sujetos de esta cohorte (Cohorte 4) se les administra una dosis inicial (por ejemplo, 100 jg ) del medicamento en investigación durante 4 días, una fase de ajuste (dosis de ajuste 1; por ejemplo, 150 jg ) durante 4 días, una segunda fase de ajuste (dosis de ajuste 2; por ejemplo, 200 jg ) durante 4 días y, a continuación, la dosis de ajuste 2 (por ejemplo, 200 jg ) durante 28 días en su domicilio (48 sujetos; 24 G933, 24 placebo).

La dosis inicial es de 100 jg . Las dosis de titulación 1 y 2 no superan los 300 jg . La duración del estudio para cada sujeto varía según la cohorte y consiste en un periodo de evaluación de dosis múltiples ascendentes (MAD) o de titulación ascendente en régimen de hospitalización (que comienza el día -2 y finaliza después del día 8 para la cohorte 1, el día 12 para la cohorte 2, el día 16 para la cohorte 3 y el día 13 para la cohorte 4) y un periodo de seguimiento en régimen ambulatorio. Además, sólo para la Cohorte 4, se incluye un periodo de 28 días de autoadministración domiciliaria del medicamento en investigación (con visitas semanales al centro) después de la segunda etapa de realimentación hospitalaria y antes de la visita de fin de estudio.

Los sujetos ingresan dos noches antes de recibir el producto en investigación para permitir la repetición de la evaluación de los criterios de elegibilidad y la prueba de comidas mixtas (MMT) de línea de base y para normalizar el nivel de actividad física antes de la administración de la dosis a la mañana siguiente. El día 1, tras una noche de ayuno de un mínimo de 8 horas, se extraen muestras de sangre de referencia para pruebas de laboratorio de seguridad, eficacia, farmacocinética (PK), farmacodinámica (PD) y anticuerpos antifármaco (ADA). Además, se registran ECG de 12 derivaciones y se administra al sujeto una dosis única SC de G933 o de placebo.

El sujeto permanece en el centro para observación y pruebas de seguridad que incluyen ECG, telemetría, monitorización de constantes vitales y evaluaciones del lugar de inyección para detectar posibles reacciones a lo largo del día y durante el periodo de tratamiento. Además, para la Cohorte 4, se realiza una monitorización ambulatoria de la presión arterial (ABPM) durante 24 horas.

Los procedimientos de prueba de comidas mixtas (MMT) se realizan el Día -1 y el último día del nivel de dosis más alto alcanzado para todas las cohortes. Los puntos temporales adicionales incluyen el primer día de la dosis de titulación 1 (Cohorte 2), el primer día de la dosis de titulación 2 (Cohorte 3), el día del alta del periodo de hospitalización de titulación ascendente (el quinto día de la dosis de titulación 2; Cohorte 4) y las visitas semanales al centro durante el periodo de 28 días de autoadministración en casa (Cohorte 4). Para el MMT, el sujeto consume una comida estandarizada (Ensure Plus®) en 5 minutos, y se obtienen muestras de sangre seriadas cronometradas para medir la glucosa y los parámetros relacionados con el metabolismo de la glucosa justo antes y hasta 240 minutos después del consumo de la comida estandarizada. Durante el periodo de hospitalización, se recogen muestras de glucosa mediante punción en el dedo 15 minutos antes y 2 horas después del desayuno, las comidas del mediodía y de la noche, y antes de acostarse.

Los sujetos de la cohorte 4 vuelven a ingresar para pasar una noche en el hospital al final del periodo de autoadministración en casa para recoger los criterios de valoración finales.

El peso corporal se mide en múltiples puntos temporales, incluyendo (pero sin limitarse a) antes de la primera dosis, durante el periodo de dosificación en hospitalización (y durante el periodo ambulatorio para la Cohorte 4), al alta de la unidad y en la visita de seguimiento de 7 a 14 días.

Las muestras farmacocinéticas para G933 se obtienen antes y después de la dosis y en varios puntos temporales por cohorte hasta 48 horas después de la última dosis de G933. Las muestras para la concentración de metformina se obtienen antes de la dosificación de G933. Las muestras de anticuerpos antifármaco se obtienen antes de la dosis y en varios momentos hasta 28 días después de la dosis final.

Los sujetos son dados de alta de la unidad al día siguiente de la administración de la última dosis del estudio. Se realiza una visita de seguimiento para las evaluaciones finales de seguridad aproximadamente 28 días después de la última dosis del medicamento en investigación.

(C) EVALUACIONES DE EFICACIA

Para la evaluación del impacto sobre el control de la glucosa y el peso tras dosis múltiples de G933 en comparación con placebo, se comparan el cambio porcentual en el AUC de la glucosa MMT (hasta 240 minutos post-MMT) y el cambio en el peso desde la línea de base (Día -1) hasta el final del tratamiento en la Cohorte 4 entre los grupos de G933 y placebo utilizando un análisis de covarianza ajustando por la medición de la línea de base y el grupo de tratamiento. Las mediciones que faltan al final del tratamiento se sustituyen por la última medición disponible. La comparación se realiza con un nivel de significación bilateral de 0.1. Una disminución del peso (por ejemplo, entre 1.3 y 2.0 kg a lo largo de 4 semanas de dosificación repetida una vez al día) en el grupo de tratamiento con G933 en comparación con el grupo placebo demuestra que G933, por ejemplo, a una dosis de 100-300 |jg, es eficaz para reducir el peso.

El cambio desde la línea de base (Día -2) en la hemoglobina A1c (hemoglobina glicosilada, HbA1c) y la fructosamina, y el cambio porcentual desde la línea de base (Día -1) en el AUC de la glucosa de 24 horas post-MMT, se analizan en la Cohorte 4 de forma similar a la evaluación del peso. Los análisis AUC de glucosa de 24 horas incluyen medidas de glucosa del panel de metabolismo de la glucosa pre/post-MMT, así como niveles de glucosa en química sérica y muestras de glucosa en DP, cuando esos resultados son de puntos temporales únicos. Un aumento del control de la glucosa (por ejemplo, una reducción de al menos el 20 % del área de la glucosa bajo la curva de concentración-tiempo (AUC) tras una prueba de comidas mixtas (MMT) y/o medida por la hemoglobina A1c y la fructosamina) en el grupo de tratamiento con G933 en comparación con el grupo placebo demuestra que G933, por ejemplo, a una dosis de 100-300 jg , es eficaz para mejorar el control de la glucosa.

(D) RESULTADOS

(i) PARTE A: Cohortes 1-3

G933 se administró con éxito en dosis de hasta 200 jg una vez al día (QD) durante un máximo de 15 días.

Se observaron reducciones significativas de la glucosa a niveles normales con G933 tanto en la glucosa plasmática en ayunas como en la glucosa posprandial de una prueba de comidas mixtas. En la prueba de comidas mixtas, el área bajo la curva (AUC) de la glucosa se redujo en >40 % en las cohortes 1-3. (Figura 14.) En la Figura 15 se muestra el cambio en las líneas de base de los niveles de glucosa en ayunas en la cohorte 1 (en el día 7) y en la cohorte 3 (en los días 9 y 15).

Se observó una tendencia dependiente de la dosis hacia una pérdida de peso sustancial de hasta 2 kg. Los resultados se muestran en la Figura 16 y demuestran que G933 redujo sustancialmente el peso corporal en pacientes con sobrepeso/obesidad y diabetes de tipo 2. En la Cohorte 3, se observó un diferencial de más de 2 kg.

G933 fue bien tolerado hasta 200 jg con ajuste de dosis. La farmacocinética tras la repetición de la dosis se muestra en la Figura 17. El PK era lineal y predecible. La semivida era de aproximadamente 11 horas. La acumulación fue mínima o nula tras múltiples dosis diarias, y el estado estacionario se alcanzó entre el Día 4 y el Día 7. Las concentraciones plasmáticas máximas en el intervalo de dosis probado fueron de 4.21 ng/ml y 18.90 ng/ml. La exposición media diaria osciló entre 2.89 ng/ml y 12.45 ng/ml.

Sólo una muestra se confirmó positiva para el anticuerpo anti-G933, después de la línea de base.

Los efectos adversos fueron manejables y acordes con los esperados de los monogonistas del GLP-1.

La gran mayoría de las náuseas y vómitos notificados se produjeron al inicio del tratamiento, es decir, en el nivel de dosis de 100 |jg. Se produjeron vómitos en el 26 % (n=5) de los pacientes que recibieron G933 y en ninguno de los que recibieron placebo. En la cohorte 1 no se notificaron casos de vómitos. En la Cohorte 2, se notificaron tres episodios de vómitos en dos pacientes activos. Ambos casos se produjeron el día 1 de la dosis de 100 jg y se resolvieron sin intervención. En la Cohorte 3, se notificaron trece episodios de vómitos en tres pacientes activos. Dos sujetos vomitaron el Día 1, y estos casos se resolvieron sin intervención. Un sujeto vomitó seis veces entre el Día 1 y el Día 5. Se administró suero salino intravenoso el día 3 y se retiró al sujeto el día 5.

Se notificaron acontecimientos adversos cardíacos en cuatro (44.4 %) de los pacientes tratados con placebo y en siete (36.8 %) de los tratados con G933. Su frecuencia no pareció aumentar con la dosis en las cohortes activas. Se observó un aumento de aproximadamente 10 bpm en la frecuencia del pulso en cada cohorte tras el tratamiento con G933. No se observaron cambios significativos en la presión arterial sistólica o diastólica, pero sí una tendencia a la disminución de la presión arterial en todas las cohortes que recibieron G933 o placebo.

Se notificaron acontecimientos adversos gastrointestinales (GI) en cuatro (44.4 %) de los pacientes tratados con placebo y en trece (68.4 %) de los tratados con G933. Los acontecimientos adversos GI afectaron a 3, 4 y 6 pacientes en las Cohortes 1, 2 y 3, respectivamente. El acontecimiento adverso GI más prevalente fueron las náuseas, que se notificaron en 6 (31.6 %) de los pacientes tratados con G933.

Se notificó disminución del apetito en seis (85.7 %) de los pacientes tratados con G933 en la Cohorte 3.

Se notificó un acontecimiento adverso grave (SAE): neumonía por micoplasma.

En Compendio, G933 fue bien tolerado, produjo reducciones significativas de la glucosa posprandial y mostró una pérdida de peso clínicamente significativa dependiente de la dosis.

(ii) PARTE B: Cohorte 4

G933 redujo eficazmente la glucemia y la pérdida de peso durante un periodo de dosificación de 41 días. En la Figura 18 se muestra la reducción media del área bajo la curva (AUC) de la glucosa desde la línea de base (día 1) hasta el día 41. Durante este tiempo, G933 produjo una reducción del 38.5 % (90 % C.I. -47.1, -29.0), mientras que el placebo sólo produjo una reducción del 16.1 % (C.I. del 90 %. - 24.9, -8.0) (p-valor: 0,001). G933 también mejoró el control de la glucosa medido por la HbA1c. (Véase la Figura 19.) Tras 41 días de tratamiento, la HbAlc se redujo en un 0.92 %, de una media de línea de base del 7.2 % a una media del 6.3 % el día 42. En comparación, el placebo sólo redujo la HbAlc en un 0.58 %, de una media de línea de base del 7.3 % a una media del 6.7 %.

Los efectos de G933 sobre el peso se muestran en las Figuras 20 y 21. La figura 20 muestra que tras 41 días de tratamiento con G933, los pacientes perdieron unos 3.83 kg, mientras que los pacientes que recibieron placebo sólo perdieron unos 1.71 kg (una diferencia de 2.12 kg entre G933 y placebo; p<0.001). Además, el 44 % de los pacientes tratados con G933 perdieron al menos 5 kg, mientras que sólo el 8 % de los pacientes que recibieron placebo perdieron al menos 5 kg. La Figura 21 muestra que tras 41 días de tratamiento con G933, los pacientes perdieron alrededor del 4.18 % de su peso, mientras que los pacientes que recibieron placebo sólo perdieron alrededor del 1.71 % de su peso (una diferencia del 2.47 % entre G933 y placebo; p<0.001). Además, el 84 % de los pacientes tratados con G933 perdieron al menos el 2 % de su peso, mientras que sólo el 42 % de los pacientes que recibieron placebo perdieron al menos el 2 % de su peso.

El tratamiento con G933 también produjo una disminución de la grasa hepática. (Véase la Figura 22). La reducción relativa media del porcentaje de grasa hepática desde la línea de base (CI del 95 %) con G933 frente a placebo fue del 20.5 % (7.2, 33.9) (p=0.004). También se observó una reducción significativa del volumen hepático en los pacientes tratados con G933 en comparación con placebo (0.14 L (-0.24, -0.03), p=0.01).

En general, los efectos adversos fueron equilibrados en los pacientes tratados con G933 y con placebo. Los efectos adversos se resumen en la tabla siguiente. No se produjo ninguna muerte.

Un total de 17 pacientes declararon náuseas: 4 recibieron placebo (15.4 %) y 13 fueron tratados con G933(52.0%). Un total de 8 pacientes vomitaron: 0 recibieron placebo y 8 fueron tratados con G933 (32.0 %). Las náuseas y los vómitos fueron más frecuentes durante las primeras dosis. (Véase la Figura 23.)

No se observaron cambios adversos en los parámetros cardiacos y hemodinámicos. No se observó ningún aumento de la presión arterial sistólica o diastólica. Se observó un aumento de 12.8 pulsaciones por minuto (bpm) en la frecuencia cardiaca en el día 13, pero ésta había descendido a 6.9 bpm en el día 41.

En general, G933 fue eficaz tanto en la reducción de la glucemia como en la pérdida de peso durante el periodo de 41 días. El metabolismo de la glucosa basado en la prueba de la comida mixta se normalizó y se acompañó de una reducción significativa de la HbA1c. Sorprendentemente, se observó una estimación puntual de la reducción de peso superior a la que cabría esperar para el tratamiento con liraglutida (3 mg).

G933 se toleró bien hasta 41 días con dosis ascendentes de 100 |jg a 200 |jg, confirmándose la estabilización en una semana de tratamiento con 200 jg y una acumulación mínima tras múltiples dosis. Las concentraciones plasmáticas máximas observadas a niveles de dosis de 200 jg oscilaron entre 1.98 ng/ml y 34.30 ng/ml.

Ejemplo 6: Estudio de dosis múltiples ascendentes parte II

(A) SUJETOS

Aproximadamente 32 sujetos con sobrepeso u obesidad con diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) relativamente bien controlada se inscriben para participar en el estudio. Los sujetos inscritos cumplen los criterios de inclusión y exclusión descritos en el Ejemplo 5 con las siguientes excepciones:

Criterios de inclusión:

• Los sujetos de las cohortes 5 y 6 deben estar dispuestos y ser capaces de autoadm in istrarse inyecciones subcutáneas (SC) diarias tras una autoinyección inicial de placebo (o solución salina norm al) durante el periodo de cribado.

Criterios de exclusión:

• Los signos vita les anormales, tras 10 m inutos de reposo supino, se definen como cualquiera de los siguientes: (a) Si BP sistólica < 90 mm Hg o > 140 mm Hg; (b) BP diastólica < 50 mm Hg o > 90 mm Hg; o (c) HR <45 o > 85 lpm; •

• Angina de pecho inestable o angina de pecho estable clasificada superior a la clase II de la Sociedad Cardiovascular Canadiense o cualqu ier antecedente médico previo de in farto de m iocard io o ictus, o antecedentes de accidente isquém ico trans ito rio en los 12 meses anteriores.

(B) DISEÑO DEL ESTUDIO

Se realiza un estudio aleatorizado, doble ciego, de dosis múltiples ascendentes. En la FIG. 24 se presenta un diagrama de flujo del estudio. Este estudio consta de 2 cohortes: cohorte 5 y cohorte 6. La cohorte 5 consta de 16 sujetos (12 activos, 4 placebo) que inician la dosificación de G933 (MEDI0382) a 100 jg durante 5 días, seguidos de 150 jg durante 5 días, 200 jg durante 5 días y 300 jg durante 7 días. La cohorte 6 consta de otros 16 sujetos (12 activos, 4 placebo) que comienzan a tomar G933 a 100 jg durante 5 días, seguidos de 200 jg durante 5 días y 300 jg durante 7 días. Las cohortes 5 y 6 tienen aproximadamente 32 sujetos en total y se ejecutan en paralelo.

El estudio consiste en un periodo de evaluación de seguimiento hospitalario que comienza el día 3 para las cohortes 5 y 6 y un periodo de seguimiento ambulatorio. Los primeros 4 días y el último día de dosificación a 300 |jg son de hospitalización.

Los sujetos son admitidos en la clínica como se describe en el Ejemplo 5 para las Cohortes 1-4. Sin embargo, tienen un periodo inicial de hospitalización que finaliza el día 3, seguido de la autoadministración de G933 en casa con una visita clínica en cada paso de aumento de dosis hasta el inicio de la dosis de 300 jg . Los sujetos tienen un segundo periodo de hospitalización para el inicio de la dosis de 300 jg que finaliza al cuarto día con esa dosis seguida de la autoadministración en casa.

Los procedimientos de prueba de comidas mixtas (MMT) se realizan el día -1 y el último día del nivel más alto de alcanzado. Los puntos temporales adicionales incluyen antes de comenzar la dosis de 300 jg (Día 16 para la Cohorte 5 y Día 11 para la Cohorte 6), y al final de la dosificación (Día 22 para la Cohorte 5 y Día 17 para la Cohorte 6). Los MMT se realizan como se describe en el Ejemplo 5.

El peso corporal se mide en múltiples puntos temporales, incluyendo (pero sin limitarse a) antes de la primera dosis, durante el periodo de dosificación en hospitalización y durante el periodo ambulatorio, al alta de la unidad, en la visita de seguimiento de 7 a 14 días y en la visita de fin de estudio a los 28 días.

(C) RESULTADOS

G933 redujo eficazmente la glucosa en las cohortes 5 y 6. Los niveles de AUC de glucosa observados en las Cohortes 5 y 6 se muestran en las Figuras 25 y 26 respectivamente. En la cohorte 5, el tratamiento con G933 produjo una reducción del AUC de la glucosa del 41.7 % (90 % C.I. -49.9, - 33.5), mientras que el tratamiento con placebo sólo produjo una reducción de la glucosa del 8.0 % (90 % C.I. -19.6, 3.6) (p<0.001). En la cohorte 6, el tratamiento con G933 produjo una reducción del AUC de la glucosa del 35.8 % (90 % C.I. -43.3, -28.3), mientras que el tratamiento con placebo sólo produjo una reducción de la glucosa del -6.9 % (90 % C.I. -20.2, 6.3) (p= 0.002). El efecto sobre el AUC de la glucosa fue comparable al de cohortes anteriores, es decir, se normalizó en torno a una reducción del 40 %. En la Figura 27 se muestra el cambio porcentual del AUC de glucosa con respecto a la línea de base en todas las cohortes. G933 también redujo eficazmente los niveles de glucosa en ayunas en las cohortes 5 y 6, como se muestra en la Figura 28.

G933 también fue eficaz para reducir el peso. Como se muestra en la Figura 29, tras 22 días de tratamiento, los pacientes tratados con<g>933 en la Cohorte 5 perdieron alrededor de 3.09 kg, mientras que los pacientes tratados con placebo sólo perdieron alrededor de 0.98 kg (una diferencia de 2.11 kg). Del mismo modo, tras 17 días de tratamiento, los pacientes tratados con G933 en la Cohorte 6 perdieron alrededor de 2.23 kg, mientras que los pacientes tratados con placebo sólo perdieron alrededor de 0.35 kg ( una diferencia de 1.88 kg). Las cohortes 5 (2.11 kg) y 6 (1.88 kg) mostraron una pérdida de peso tras 22 y 17 días comparable a la observada durante los 41 días de dosificación en la cohorte 4.

Los cambios en el peso y los niveles de glucosa se representan juntos en la Figura 30 y se resumen en la Tabla 22 a continuación.

Tabla 22

Cohorte Peso Glucos Glucosa en ayunas (mg/dl)

N= activo

1100 ug -1,1 -27,3 -28,00 2 150 ug -0,5 -8,9 -17,90

3 200 ug -2,4 -31,6 -43,20

4 200 ug -2,11 -22,5 -32,62

5 300 ug -2,11 -33,7 -24,40

Cohorte Peso (kg) Glucos Glucosa en ayunas (mg/dl)

N= activo

6 300 ug n=12 -1,88 -28,9 -36,94

G933 fue bien tolerado en las cohortes 5 y 6, y el perfil de acontecimientos adversos estuvo en línea con el de otros análogos de GLP-1 comercializados, tal como liraglutida. No se observaron muertes ni acontecimientos adversos graves en ninguna de las cohortes.

Ambos esquemas de titulación demostraron que G933 hasta una dosis de 300 |jg era bien tolerado con respecto a las náuseas y los vómitos. En la cohorte 5, un total de 4 pacientes notificaron 8 episodios de náuseas: 1 paciente (20 %) que recibió placebo y 3 pacientes (27.3 %) que recibieron G933. Un total de 3 pacientes notificaron 8 episodios de vómitos: ningún paciente que recibió placebo (0 %) y 3 pacientes que recibieron G933 (27.3 %). En la Cohorte 6, un total de 5 pacientes notificaron 6 episodios de náuseas: ningún paciente que recibió placebo (0 %) y 5 pacientes que recibieron G933 (41.7 %). Un paciente vomitó dos veces: ningún paciente que recibió placebo (0 %) y 1 paciente que recibió G933 (8.3 %). Se observaron tasas más bajas de náuseas (8/24 = 33 %) y vómitos (4/24 = 16 %) cuando los sujetos estaban ambulatorios 48 horas después de la primera dosis.

La medición ambulatoria de la presión arterial no mostró un aumento desde la línea de base de la presión arterial sistólica/presión arterial diastólica (SBP/DBP) en los pacientes tratados con G933, y una posible tendencia a la reducción. En la cohorte 5, la frecuencia cardíaca aumentó aproximadamente 7.6 latidos por minuto (BPM) con respecto a la línea de base tras 22 días de administración de G933, en línea con lo observado anteriormente y otros análogos de GLP-1 y en la cohorte 4. En la Cohorte 6, la frecuencia cardiaca aumentó aproximadamente 5.9 BPM con respecto a la línea de base tras la administración de G933 durante 17 días.

En la Figura 31 se presentan las concentraciones plasmáticas de G933 después de 7 días a la dosis más alta de 300 jg obtenida con ambos esquemas de valoración. Los perfiles se solaparon especialmente una vez alcanzado el estado estacionario, lo que sugiere que la exposición a este nivel de dosis es independiente del esquema de titulación adoptado. La concentración plasmática máxima observada con una dosis de 300 jg osciló entre 7.9 ng/ml y 30.9 ng/ml.

Compendio de los resultados del estudio de dosis múltiples ascendentes (partes I y II)

En general, en el intervalo de dosis de 100-300 jg , G933 mostró una PK lineal con una semivida de aproximadamente 8-11 horas, una acumulación mínima tras la repetición diaria de la dosis y un estado estable alcanzado entre el día 4 y el día 7 en los cuatro niveles de dosis probados. Los resultados confirmaron los del estudio de dosis única (Ejemplo 4). Las concentraciones plasmáticas alcanzadas al cabo de 7 días con la dosis máxima de 300 jg fueron independientes del esquema de titulación adoptado. La variabilidad entre sujetos en la Cmáx fue aproximadamente del 20-30 % en las cohortes más pequeñas, y del 40-50 % en la Cohorte 4 más grande. Las concentraciones plasmáticas máximas en el intervalo de dosis probado y con el esquema de titulación adoptado, oscilaron entre 1.98 ng/ml y 34.3 ng/ml, con una concentración plasmática media diaria que osciló entre 0.87ng/ml y 16.3ng/ml.

El perfil de seguridad y tolerabilidad fue comparable al de otros miméticos del GLP-1 y, de forma significativa, G933 produjo tanto pérdida de peso como control de la glucosa.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, el alcance de la divulgación no está necesariamente limitado por las realizaciones específicas descritas, que pretenden ser ilustraciones únicas de aspectos individuales de la divulgación. De hecho, varias modificaciones de la divulgación, además de las mostradas y descritas en el presente documento, pero que entran dentro del ámbito de las reivindicaciones, resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y los dibujos que la acompañan.

La información técnica expuesta en el presente documento puede, en algún aspecto, ir más allá del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información se ha indicado claramente que no forma parte de la invención.

Las referencias incidentales a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y a métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para dicho método tal como tal, sino como reivindicaciones de producto, en particular sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos métodos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 para su uso en un método de tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en el que se administran 50-600 |jg del péptido por dosis a un sujeto humano que lo necesite.

2. El péptido para uso de conformidad con la reivindicación 1, en el que el péptido se administra diariamente.

3. El péptido para uso de conformidad con la reivindicación 2, en el que el péptido se administra una vez al día.

4. El péptido para uso de la reivindicación 3, en el que el péptido se administra durante al menos una semana, durante al menos dos semanas, durante al menos tres semanas o durante al menos cuatro semanas.

5. El péptido para uso de conformidad con la reivindicación 4, en el que el péptido se administra por inyección.

6. El péptido para uso de conformidad con la reivindicación 5, en el que la administración es subcutánea.

7. El péptido para uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que se detiene la progresión de la enfermedad.

8. El péptido para uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que se invierte la progresión de la enfermedad.

9. El péptido para uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que se administran 100 600 jg del péptido por dosis.