ES2983611T3 - Compuestos de heteroarilo bicíclico 6-6 condensado y su uso como inhibidores de lats - Google Patents

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Xueshi Hao
Timothy Hoffman
Qihui Jin
Arnaud Lacoste
Cameron Lee
Jun Liu
Yahu Liu
Juergen Klaus Maibaum
Tingting Mo
Jianfeng Pan
Xin Qu
Jan Tchorz
Yun Feng Xie
Shanshan Yan
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos heteroarílicos bicíclicos fusionados 6-6 de fórmula A2 o A1 y su uso como inhibidores de LATS, o una sal, estereoisómero o composición farmacéutica de los mismos; en donde las variables son como se definen en el presente documento (A1 y A2). La presente invención se refiere además a un método de inhibición de LATS en una población celular utilizando un compuesto de fórmula A1, o una sal, estereoisómero o composición farmacéutica del mismo. La presente invención proporciona además un método para fabricar compuestos de la invención y sus usos terapéuticos. La invención proporciona además métodos para su preparación, para su uso médico, para su uso en el tratamiento y manejo de enfermedades o trastornos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de heteroarilo bicíclico 6-6 condensado y su uso como inhibidores de lats
Campo de la invención
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado por vía electrónica en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 23 de abril de 2018, se denomina PAT057699-WO-PCT_SL.txt y tiene un tamaño de 35.778 bytes.
INTRODUCCIÓN
La presente divulgación se refiere a inhibidores de LATS (cinasa supresora tumoral grande). La presente divulgación se refiere además a compuestos de heteroarilo bicíclico 6-6 condensado y a composiciones que comprenden dichos compuestos. Los compuestos de la invención son como se definen en las reivindicaciones.
La presente divulgación también se refiere al usoex vivode dichos compuestos para producir material celular para terapia/trasplante celular. La presente divulgación se refiere además a métodos para generar una población expandida de células, tal como una población expandida de células oculares, por ejemplo, que comprende células madre del limbo (LSC, por sus siglas en inglés) o células endoteliales corneales (CEC), que implican el uso de un inhibidor de LATS, así como a la población de células tales como células oculares que comprenden, por ejemplo, células madre del limbo (LSC) o células endoteliales corneales (CEC), y a preparaciones, a usos y a métodos de terapia que comprenden dichas células.
La presente divulgación también se refiere a compuestos de heteroarilo bicíclico 6-6 condensado, a composiciones que comprenden dichos compuestos y a su uso para promover la cicatrización de heridas, particularmente para el tratamiento de quemaduras, úlceras cutáneas agudas y crónicas, incluyendo úlceras vasculares, diabéticas y por presión, tales como úlceras venosas de las piernas, úlceras del pie diabético y úlceras por presión.
La presente divulgación se refiere adicionalmente a compuestos de heteroarilo bicíclico 6-6 condensado, a composiciones que comprenden dichos compuestos y a su uso en la regeneración y el recrecimiento del hígado, así como en la prevención de daños y en el mantenimiento o mejora de la función de órganosex vivo,con o sin dispositivos de perfusión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La regeneración y/o curación de órganos es una cuestión crucial para tratar muchos problemas de salud graves.
Por ejemplo, en el ojo, se sabe que la ceguera corneal es la tercera causa de ceguera en todo el mundo. Aproximadamente la mitad de todos los trasplantes de córnea en todo el mundo se realizan para el tratamiento de la disfunción endotelial corneal.
La córnea es un tejido transparente que comprende diferentes capas: epitelio corneal, membrana de Bowman, estroma, membrana de Descemet y endotelio. El endotelio corneal también comprende una monocapa de células endoteliales corneales humanas y ayuda a mantener la transparencia corneal a través de sus funciones de barrera y bomba iónica. Desempeña una función crucial en el mantenimiento del equilibrio de fluidos, nutrientes y sales entre el estroma corneal y el humor acuoso. Para mantener la transparencia, se debe mantener la densidad de las células endoteliales; sin embargo, la densidad de las células endoteliales puede disminuir significativamente como resultado de un traumatismo, una enfermedad o distrofias endoteliales. La densidad de las células también disminuye con el envejecimiento. El endotelio corneal humano tiene una propensión limitada a proliferarin vivo.Si la densidad de las células disminuye demasiado, la función de barrera puede verse comprometida. La pérdida de la función de barrera endotelial produce edema corneal y pérdida de agudeza visual. La afección clínica de la queratopatía ampollosa puede ser una complicación resultante.
Actualmente, el único tratamiento para la ceguera provocada por disfunción endotelial corneal es el trasplante de córnea. Aunque el trasplante de córnea es una de las formas más comunes de trasplante de órganos, la disponibilidad de córneas de donantes necesarias es extremadamente limitada. Una encuesta global de 2012-2013 cuantificó la considerable escasez de tejido de injerto de córnea, encontrando que sólo hay una córnea disponible por cada 70 necesarias (Gainat el.,(2016)Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Oftalmol.134:167-173).
Por lo tanto, son muy necesarios nuevos enfoques terapéuticos para suministrar células endoteliales corneales para el tratamiento de la disfunción endotelial corneal.
También es necesario mantener el epitelio corneal en el ojo. El epitelio corneal está compuesto por una capa de células basales y múltiples capas de un epitelio escamoso, estratificado y no queratinizado. Es esencial para mantener la transparencia y la superficie refractiva regular de la córnea. Actúa como una capa protectora transparente y renovable sobre el estroma corneal y se repone mediante una población de células madre ubicada en el limbo. En la deficiencia de células madre del limbo, una afección en la que las células madre del limbo están enfermas o ausentes, una disminución en el número de células madre del limbo sanas da como resultado una capacidad disminuida de renovación del epitelio corneal.
La deficiencia de células madre del limbo puede surgir como resultado de lesiones por quemaduras químicas o térmicas, radiación ultravioleta y ionizante, o incluso como resultado del uso de lentes de contacto; trastornos genéticos tales como la aniridia y trastornos inmunitarios tales como el síndrome de Stevens Johnson y el penfigoide cicatricial ocular. La pérdida de células madre del limbo puede ser parcial o total; y puede ser unilateral o bilateral. Los síntomas de la deficiencia de células madre del limbo incluyen dolor, fotofobia, defectos epiteliales corneales dolorosos que no cicatrizan, neovascularización corneal, reemplazo del epitelio corneal por epitelio conjuntival, pérdida de la transparencia corneal y disminución de la visión que en última instancia puede conducir a la ceguera.
En 2015 se concedió una autorización de comercialización condicional en la Unión Europea (con el nombre Holoclar®) a un producto para su uso en el tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo, lo que lo convierte en el primer Medicamento de terapia avanzada (ATMP, por sus siglas en inglés) que contiene células madre en Europa. Holoclar es una preparación expandidaex vivode células epiteliales corneales humanas autólogas que contienen células madre. Se toma una biopsia de tejido del limbo sano del paciente, se expandeex vivoy se congela hasta la cirugía. Para la administración al paciente, las células descongeladas se cultivan en una membrana que comprende fibrina y después se implantan quirúrgicamente en el ojo del paciente. La terapia está destinada a su uso en adultos con deficiencia de células madre del limbo de moderada a grave debido a quemaduras oculares físicas o químicas. (Rama P, Matuska S, Paganoni G, Spinelli A, De Luca M, Pellegrini G. (2010)Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med.
363:147-155). Sin embargo, el método tiene las limitaciones de que es sólo para uso autólogo y debe haber suficiente limbo superviviente en un ojo para permitir que se extraiga del paciente un mínimo de 1-2 milímetros cuadrados de tejido no dañado. También existe el riesgo de que para cada paciente específico el cultivo de sus células no tenga éxito y el paciente no pueda recibir este tratamiento. Además, también se usan células alimentadoras de origen murino para preparar la preparación celular Holoclar, lo que introduce posibles problemas de seguridad, debido al riesgo de transmisión de enfermedades y la potencial inmunogenicidad de la preparación para su uso en seres humanos. Por otra parte, la preparación celular Holoclar sólo contiene aproximadamente un 5 % de células madre del limbo, identificadas mediante tinción con p63alfa.
Por lo tanto, son muy necesarios enfoques terapéuticos nuevos para suministrar células madre del limbo para el tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo.
La regeneración funcional del hígado durante la homeostasis y en afecciones patológicas es fundamental para mantener los procesos fisiológicos esenciales. A pesar del marcado potencial del hígado para regenerarse, este proceso puede verse alterado después de una lesión hepática grave, aguda o crónica. El daño hepático y la regeneración del hígado alterada con frecuencia provocan una morbilidad y mortalidad graves y, por lo tanto, requieren un trasplante de hígado para salvar la vida. Desafortunadamente, la necesidad de trasplantes de hígado actualmente eclipsa con creces el suministro de órganos de donantes disponibles. Como resultado, muchos pacientes siguen muriendo mientras esperan un trasplante que les salve la vida. El uso de trasplantes de hígado dividido de donantes fallecidos o trasplantes parciales de hígado de donantes vivos está limitado por restricciones de tamaño del injerto. El trasplante de un hígado parcial que tiene una relación de peso injerto-receptor (GRWR, por sus siglas en inglés) inadecuada aumenta la incidencia de disfunción y fracaso del injerto. Las terapias que aumentan el recrecimiento del hígado pueden permitir el trasplante de hígados parciales que, de otro modo, se considerarían inadecuados para el trasplante basándose en su tamaño. Como alternativa, la regeneración de hígados mediante la inhibición de la muerte de las células hepáticas, la mejora de la función hepática y la reparación de la arquitectura hepática aberrante podría normalizar la función hepática, evitando la necesidad de un trasplante (Forbes SJ y Newsome PN (2016)Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology,13(8):473-485; Dutkowski P, Linecker M, DeOliveira ML, Müllhaupt B, Clavien PA (2015)Challenges to Liver Transplantation and Strategies to Improve Outcomes. Gastroenterology,148(2):307-323).
Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad urgente de terapias más eficaces para promover el recrecimiento del hígado.
Las úlceras cutáneas crónicas, incluyendo las úlceras vasculares, diabéticas y por presión, constituyen un problema de salud pública importante. El aumento de la demanda de tratamiento de heridas se refleja en la asociación de las heridas con las comorbilidades, el aumento de la mortalidad y la calidad de vida del paciente (Demidova-Rice TN, Hamblin MR y Herman IM (2012)Acute and impaired wound healing: pathophysiology and current methods for drug delivery, part 1: normal and chronic wounds: biology causes, and approaches to care. Advances in skin & wound care25(7):304-314; Demidova-Rice TN, Hamblin MR, & Herman IM (2012)Acute and impaired wound healing: pathophysiology and current methods for drug delivery, part 2: role of growth factors in normal and pathological wound healing: therapeutic potential and methods of delivery. Advances in skin & wound care25(8):349-370). El coste de la atención sanitaria de los pacientes con heridas crónicas ronda los 25.000 millones de dólares al año sólo en los EE. UU. La FDA no ha aprobado nuevas entidades químicas desde la aprobación de Regranex (PDGF) en 1997, que tiene una eficacia limitada (Eaglstein WH, Kirsner RS y Robson MC (2012)Food and Drug Administration (FDA) drug approval end points for chronic cutaneous ulcer studies. Wound repair and regeneration: oficial publication of the Wound Healing Society [and] the European TissueRepair Society20(6):793-796). Intrínsecamente, los factores de crecimiento no son estables en el entorno proteolítico del lecho de la herida. La terapia con factor de crecimiento también podría verse afectada por la baja expresión de sus receptores correspondientes en las heridas, como se demuestra en las muestras de pacientes clínicos (Demidova-Rice TN, Hamblin MR y Herman IM (2012)Acute and impaired wound healing: pathophysiology and current methods for drug delivery, part 2: role of growth factors in normal and pathological wound healing: therapeutic potential and methods of delivery. Advances in skin & wound care25(8):349-370).
Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad urgente de terapias más eficaces para promover la cicatrización de heridas en pacientes con heridas crónicas.
Por lo tanto, son muy necesarios enfoques terapéuticos nuevos para promover la proliferación celular para afecciones que afectan a una gama de órganos en todo el cuerpo, tales como los ojos, el hígado y la piel.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un compuesto, en donde el compuesto es de Fórmula II:
o una sal o estereoisómero del mismo,
en donde
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona del grupo que consiste en:
en donde representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula; y
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, ciano, alquilo Ci-6, haloalquilo Ci-6, -NH2, alquilamino Ci-6, di-(alquil Ci-6)amino, cicloalquilo C3-6y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo de alcoxi Ci-6;
R1 es hidrógeno o alquilo Ci-6;
Ri se selecciona del grupo que consiste en:
(a) alquilo Ci-8 que está sin sustituir o sustituido con i a 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en:
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno de alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1.6;
(xi) cicloalquilo C3.6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquilamino C1.6;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O, y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6 y R0;
(d) cicloalquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en M, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La información técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención en sí en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
No se debe interpretar que cualesquier referencias secundarias a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y los métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal constituyan una reivindicación de protección para dichos métodos como tales, sino que deben considerarse una referencia a productos, en particular, sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos métodos. La descripción puede abarcar materia objeto que se extiende más allá del alcance de las reivindicaciones. Sin embargo, únicamente las reivindicaciones adjuntas definen el alcance de la invención y de la protección y no se extenderán más allá de su alcance.
La presente divulgación se refiere a compuestos, a sales de los mismos y a composiciones de los mismos, en donde los compuestos son inhibidores de LATS (cinasa supresora tumoral grande). Estos compuestos se usan en terapias para las afecciones y fines detallados anteriormente. En el presente documento se describen diversos aspectos de la invención. La presente divulgación se refiere a un compuesto de Fórmula A2 o una subfórmula de la misma, o a una sal o estereoisómero del mismo,
en donde X1, el anillo A, R1, R2, R3 y R5 son como se definen en la descripción detallada a continuación. En la invención, el compuesto de Fórmula A2 tiene X1 = CH.
Un compuesto de Fórmula A2 puede ser de acuerdo con la Fórmula I o la Fórmula II, o subfórmulas de las mismas, o una sal de las mismas:
en donde el anillo A, R1, R2, R3 y R5 son como se definen en la descripción detallada a continuación.
Los compuestos de la invención son compuestos de acuerdo con la Fórmula II, o una sal o estereoisómero de los mismos. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la definición de la Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o subfórmulas del mismo y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una combinación, en particular una combinación farmacéutica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de acuerdo con la definición de la Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticamente activos.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a compuestos y composiciones que pueden usarse en una terapia.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de inhibición de LATS en una célula o población celular usando un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo, o un estereoisómero del mismo:
en donde X1, X2, el anillo A, R1, R2, R3 y R5 son como se definen en la descripción detallada a continuación. Preferentemente, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable. En la invención, el compuesto de Fórmula A1 tiene X1 = CH y X2 = N. En un ejemplo específico del método de inhibición de LATS en una población celular divulgada en el presente documento, el compuesto, o una sal del mismo, se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina. En otro ejemplo específico del método de inhibición de LATS en una población celular divulgada en el presente documento, el compuesto, o una sal del mismo, se selecciona de N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de inhibición de LATS en una población de células oculares usando un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo, o un estereoisómero del mismo. En otro aspecto más, en el presente documento se divulga un método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células madre del limbo usando un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo, o un estereoisómero del mismo. En un aspecto adicional más, en el presente documento se divulga un método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células endoteliales corneales usando un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo, o un estereoisómero del mismo.
También preferentemente, el método de inhibición de LATS en una población celular se realizaex vivo.En otro ejemplo preferido más, dicho compuesto está presente en una concentración de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente de 1 a 20 micromolar, en particular preferentemente de aproximadamente 3 a 10 micromolar. En un ejemplo preferido del método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células madre del limbo, el compuesto está presente durante 12 a 16 días, en particular preferentemente el compuesto está presente durante 14 días. En otro ejemplo del método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células endoteliales corneales, el compuesto está presente durante una a dos semanas y posteriormente las células se cultivan durante un período en medio de crecimiento sin suplementación con dicho compuesto, preferentemente en donde el período es de una a dos semanas. En un ejemplo del método de inhibición de LATS en una población celular, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 o LATS2, o LATS1 y LATS2. En un ejemplo más preferido, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2. En otro ejemplo preferido del método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células madre del limbo, dicho método comprende además modificar genéticamente dichas células madre del limbo. En otro ejemplo preferido del método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células endoteliales corneales, dicho método comprende además modificar genéticamente dichas células endoteliales corneales. Preferentemente, dicha modificación genética comprende introducir en dicha célula un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En otro ejemplo preferido más del método de inhibición de LATS en una población celular, el método comprende la etapa adicional después de la generación de una población expandida de células de aclarar esas células para retirar sustancialmente el compuesto. En un aspecto, una población celular expandida que comprende células madre del limbo puede obtenerse mediante el método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células madre del limbo divulgado en el presente documento. En otro aspecto, una población celular expandida que comprende células madre del limbo puede obtenerse mediante el método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células madre del limbo divulgado en el presente documento. En un aspecto, una población de células endoteliales corneales es obtenible mediante el método de inhibición de LATS en una población celular que comprende células endoteliales corneales divulgado en el presente documento. En otro aspecto
una población de células endoteliales corneales puede obtenerse mediante el método de inhibición de LATS. En otro aspecto más
una preparación de suministro de células oculares puede comprender una población celular obtenible u obtenida mediante el método de inhibición de LATS divulgado en el presente documento y una composición adecuada para el suministro ocular que es un agente localizador. En un ejemplo específico, el agente localizador es GelMa (que es gelatina modificada con metacrilamida y también se conoce como metacrilato de gelatina). En otro ejemplo específico, el agente localizador es fibrina o pegamento de fibrina. Preferentemente, la preparación de suministro de células de células madre del limbo tiene más del 20 % de células madre del limbo. También preferentemente, la preparación de suministro de células de células madre del limbo tiene más del 20 % de células positivas para p63alfa. En determinados aspectos preferidos, la población celular obtenible u obtenida mediante el método de inhibición de LATS divulgado en el presente documento o la preparación de suministro de células divulgada en el presente documento tiene sólo niveles traza del compuesto de acuerdo con la invención. Preferentemente, en la preparación de suministro de células de células endoteliales corneales, las células endoteliales corneales están presentes en la preparación de suministro de células a una densidad superior a 500 células por mm2 (área). En determinados aspectos preferidos, la población celular obtenible u obtenida mediante el método de inhibición de LATS divulgado en el presente documento o la preparación de suministro de células divulgada en el presente documento tiene sólo niveles traza del compuesto de acuerdo con la invención.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de cultivo de células que comprende cultivar una población de células en presencia de un inhibidor de LATS. Las células pueden ser una población celular como se describe y/o como se proporciona en el presente documento. Preferentemente, las células son células oculares o células hepáticas. En un ejemplo preferido, las células son células oculares. En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un método de cultivo de células que comprende cultivar una población de células que comprenden células madre del limbo en presencia de un inhibidor de LATS. En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de cultivo de células que comprende cultivar una población de células que comprenden células endoteliales corneales en presencia de un inhibidor de LATS. En un ejemplo preferido, en el presente documento se divulga un método de cultivo de células que comprende cultivar una población celular que comprende células madre del limbo, en donde el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo. En otro ejemplo preferido, en el presente documento se divulga
un método de cultivo de células que comprende cultivar una población que comprende células endoteliales corneales, en donde el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo. Preferentemente, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo preferido, dicho compuesto está presente en una concentración de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente de 1 a 20 micromolar, en particular preferentemente de aproximadamente 3 a 10 micromolar. En un ejemplo preferido del método de cultivo de células que comprende cultivar una población celular que comprende células madre del limbo, el compuesto está presente durante 12 a 16 días, en particular preferentemente el compuesto está presente durante 14 días. En otro ejemplo preferido del método de cultivo de células que comprende cultivar una población celular que comprende células endoteliales corneales, el compuesto está presente durante una a dos semanas y posteriormente las células se cultivan durante un período en medio de crecimiento sin suplementación con dicho compuesto, preferentemente en donde el período es de una a dos semanas. En un ejemplo, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 o LATS2, o LATS1 y LATS2. En un ejemplo más preferido, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2. En un ejemplo, dicho método comprende además modificar células genéticamente. Preferentemente, dicha modificación genética comprende introducir en dicha célula un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. Preferentemente, las células son células oculares. En un ejemplo, dicho método comprende además modificar genéticamente células madre del limbo. En otro ejemplo preferido, dicho método comprende además modificar genéticamente células endoteliales corneales. En otro ejemplo preferido más, el método de cultivo de células comprende la etapa adicional después de la generación de una población expandida de células de aclarar esas células para retirar sustancialmente el compuesto de acuerdo con la invención. En un aspecto, en el presente documento se divulga una población celular expandida obtenible mediante el método de cultivo de células como se divulga en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población celular expandida obtenida mediante el método de cultivo de células como se divulga en el presente documento. Preferentemente, las células son células oculares. En un aspecto, en el presente documento se divulga una población celular expandida que comprende células madre del limbo obtenibles mediante el método de cultivo de células que comprenden células madre del limbo como se divulga en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población celular expandida que comprende células madre del limbo obtenidas mediante el método de cultivo de células que comprenden células madre del limbo como se divulga en el presente documento. En un aspecto, en el presente documento se divulga una población de células endoteliales corneales obtenibles mediante el método de cultivo de células que comprenden células endoteliales corneales como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población de células endoteliales corneales obtenidas mediante el método de cultivo de células que comprenden células endoteliales corneales como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una preparación de suministro de células oculares, que comprende una población celular obtenible u obtenida mediante el método de cultivo de células como se divulga en el presente documento y una composición adecuada para el suministro ocular que es un agente localizador. En un ejemplo específico, el agente localizador es GelMa. En otro ejemplo específico, el agente localizador es fibrina o pegamento de fibrina. Preferentemente, la preparación de suministro de células de células madre del limbo tiene más del 20 % de células madre del limbo. También preferentemente, la preparación de suministro de células de células madre del limbo tiene más del 20 % de células positivas para p63alfa. Preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes en la preparación de suministro de células de células endoteliales corneales, a una densidad superior a 500 células por mm2 (área). En determinados aspectos preferidos, la población celular obtenible u obtenida mediante el método de cultivo de células como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento tiene sólo niveles traza del compuesto de acuerdo con la invención.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de expansión de poblaciones celulares que comprende la etapa de a) cultivar una población de siembra de células en presencia de un inhibidor de LATS para generar una población expandida de células. En un ejemplo preferido, el método de expansión de poblaciones celulares se realizaexvivo.Preferentemente, las células son células oculares o células hepáticas. En un ejemplo preferido, las células son células oculares. En otro aspecto más, en el presente documento se divulga
un método de expansión de poblaciones celulares que comprende la etapa de a) cultivar una población de siembra de células que comprenden células madre del limbo en presencia de un inhibidor de LATS para generar una población expandida de células que comprenden células madre del limbo. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un método de expansión de poblaciones celulares que comprende la etapa de a) cultivar una población de siembra de células que comprenden células madre del limbo en presencia de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo para generar una población expandida de células que comprenden células madre del limbo. Dicho compuesto puede seleccionarse de la Fórmula A2 o subfórmulas de la misma o una sal de la misma. En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de expansión de poblaciones celulares que comprende la etapa de a) cultivar una población de siembra de células que comprenden células endoteliales corneales en presencia de un inhibidor de LATS para generar una población expandida de células que comprenden células endoteliales corneales. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo,
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un método de expansión de poblaciones celulares que comprende la etapa de a) cultivar una población de siembra de células que comprenden células endoteliales corneales en presencia de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para generar una población expandida de células que comprenden células endoteliales corneales. Preferentemente, dicho compuesto se selecciona de la Fórmula A2 o subfórmulas de la misma. También preferentemente, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicho compuesto se selecciona del grupo de compuestos que consiste en N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propoxi)propan-2-ol; 2,4-dimetil-4-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)pentan-2-ol; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclobutil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-isopropil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; 2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propan-1-ol; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilciclopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propoxi)etan-1-ol; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; y 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
También preferentemente, dicho compuesto o una sal del mismo se selecciona de N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina y (S)-N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En un ejemplo preferido del método de expansión de poblaciones celulares, dicho compuesto está presente en una concentración de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente de 1 a 20 micromolar, en particular preferentemente de aproximadamente 3 a 10 micromolar. En un ejemplo preferido del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo en la etapa a), el compuesto está presente durante 12 a 16 días, en particular preferentemente el compuesto está presente durante 14 días. En otro ejemplo preferido del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células endoteliales corneales en la etapa a) el compuesto está presente durante una o dos semanas y posteriormente se realiza la etapa b) en donde las células se cultivan durante un período en medio de crecimiento sin suplementación con dicho compuesto, preferentemente en donde el período es de una a dos semanas. En un ejemplo específico del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión superior a 30 veces de la cantidad sembrada de células. En otro ejemplo específico del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 y subfórmulas de la misma producen una expansión de 100 a 2200 veces, preferentemente de 600 a 2200 veces, de la cantidad sembrada de células. En un ejemplo del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo, el método produce una población celular con más del 20 % de células madre del limbo. En otro ejemplo del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo, el método produce una población celular con más del 50 % de células madre del limbo. En otro aspecto, el método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo produce una población celular en la que más del 20 % expresa p63alfa. En otro aspecto más, el método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo produce una población celular en la que más del 50 % expresa p63alfa. En un ejemplo específico del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células endoteliales corneales, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión superior a 10 veces de la cantidad sembrada de células. En otro ejemplo específico del método de expansión de poblaciones celulares en relación con células endoteliales corneales, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 y subfórmulas de la misma producen una expansión de 15 a 600 veces, preferentemente de 20 a 550 veces, de la cantidad sembrada de células. En un ejemplo, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 o LATS2, o LATS1 y LATS2. En un ejemplo más preferido, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2. En otro ejemplo preferido, dicho método de expansión de poblaciones celulares comprende además el uso de un sistema de edición génica. Preferentemente, dicho método comprende el uso de un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. También preferentemente, las células son células oculares o células hepáticas. En un ejemplo preferido, las células son células oculares. En otro ejemplo preferido, dicho método de expansión de poblaciones celulares comprende además modificar genéticamente células madre del limbo, preferentemente en donde dicha modificación genética comprende introducir en dicha célula un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En otro ejemplo preferido, dicho método comprende además modificar genéticamente células endoteliales corneales, preferentemente en donde dicha modificación genética comprende introducir en dicha célula un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En otro ejemplo preferido más, el método de expansión de poblaciones celulares comprende además la etapa c) aclarar la población expandida de células para retirar sustancialmente el compuesto de acuerdo con la invención.
En un aspecto, en el presente documento se divulga un kit que comprende un inhibidor de LATS, medio de crecimiento e instrucciones para la expansión de poblaciones celulares. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población celular obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
En otro aspecto más, en el presente documento se divulga una población celular obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población de células oculares obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población de células oculares obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento. En un aspecto, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células madre del limbo obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células madre del limbo obtenidas mediante el método de expansión de poblaciones celulares en relación con células madre del limbo como se divulga en el presente documento. En un aspecto, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células endoteliales corneales obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares en relación con células endoteliales corneales como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células endoteliales corneales obtenidas mediante el método de expansión de poblaciones celulares en relación con células endoteliales corneales como se divulga en el presente documento. En otro aspecto más, en el presente documento se divulga una preparación de suministro de células oculares, que comprende una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento
y una composición adecuada para el suministro ocular que es un agente localizador. En un ejemplo específico, el agente localizador es GelMa. En otro ejemplo específico, el agente localizador es fibrina o pegamento de fibrina. Preferentemente, la preparación de suministro de células de células madre del limbo tiene más del 20 % de células madre del limbo. También preferentemente, la preparación de suministro de células de células madre del limbo tiene más del 20 % de células positivas para p63alfa. Preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes en la preparación de suministro de células de células endoteliales corneales, a una densidad superior a 500 células por mm2 (área). En determinados aspectos preferidos, la población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares o la preparación de suministro de células tiene sólo niveles traza del compuesto de acuerdo con la invención.
En algunos aspectos del método de expansión de poblaciones celulares, el método comprende además el uso de un sistema de edición génica. Preferentemente, el sistema de edición génica se usa para modificar células genéticamente. La modificación genética puede comprender
reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. También preferentemente, el sistema de edición génica se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. Preferentemente, dicho sistema de edición génica se selecciona del grupo que consiste en un sistema de edición génica CRISPR, un sistema de edición génica TALEN, un sistema de edición génica de nucleasa con dedos de cinc, un sistema de edición génica de meganucleasa, la recombinación homóloga impulsada por vectores de AAV y tecnologías de edición genómica basada en vectores lentivíricos.
En un aspecto, en el presente documento se divulga una población celular aislada, en donde más del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de las células son células madre del limbo. Preferentemente, más del 20 % son células madre del limbo. Más preferentemente, más del 50 % son células madre del limbo. En otro ejemplo preferido, más del 70%son células madre del limbo. En particular preferentemente, más del 90%son células madre del limbo. En un ejemplo, las células se han editado génicamente.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga una población celular aislada, en donde más del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de las células son células que expresan p63alfa. Preferentemente, más del 20 % son positivas para p63alfa. Más preferentemente, más del 50 % son positivas para p63alfa. En otro ejemplo preferido, más del 70 % son positivas para p63alfa. En particular preferentemente, más del 90 % son positivos para p63alfa. En un ejemplo, las células se han editado génicamente.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células madre del limbo o la población celular como se divulga en el presente documento, en donde una o más de dichas células comprenden una inserción o supresión no natural de uno o más restos de ácido nucleico de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto, en donde la inserción y/o supresión da como resultado una expresión o función reducida o eliminada de dicho gen. En una realización preferida, dicho gen se selecciona del grupo que consiste en B2M, HLA-A, HLA-B y HLA-C. En un ejemplo específico, las células tienen niveles modificados genéticamente de expresión de B2M.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células endoteliales corneales o la población celular como se divulga en el presente documento, en donde una o más de dichas células comprenden una inserción o supresión no natural de uno o más restos de ácido nucleico de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto, en donde la inserción y/o supresión da como resultado una expresión o función reducida o eliminada de dicho gen. En un ejemplo preferido, dicho gen se selecciona del grupo que consiste en B2M, HLA-A, HLA-B y HLA-C. En un ejemplo específico, las células tienen niveles modificados genéticamente de expresión de B2M.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga una población celular que comprende células madre del limbo o células endoteliales corneales que se han editado génicamente. En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga
una población celular que comprende células madre del limbo que se han editado génicamente. Preferentemente, la edición génica se realizó mediante CRISPR. Preferentemente, también se editó el gen B2M.
En un aspecto, en el presente documento se divulga un agente promotor del crecimiento de células que comprende un inhibidor de LATS. En el presente documento también se divulga un agente promotor del crecimiento de células oculares que comprende un inhibidor de LATS. En un aspecto, en el presente documento se divulga un agente promotor del crecimiento de células madre del limbo que comprende un inhibidor de LATS. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma o una sal del mismo. En otro aspecto, en el presente documento se divulga un agente promotor del crecimiento de células madre del limbo que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo. En un aspecto, en el presente documento se divulga un agente promotor del crecimiento de células endoteliales corneales que comprende un inhibidor de LATS. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo. En otro aspecto, en el presente documento se divulga un agente promotor del crecimiento de células endoteliales corneales que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo.
En un aspecto, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero del mismo, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición comprende además una solución de conservación o crioconservación. En la invención, la composición farmacéutica comprende un compuesto de Fórmula II o una sal o estereoisómero del mismo.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS y un medio de crecimiento. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma. En un aspecto, en el presente documento se divulga un medio de proliferación celular que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma
y un medio de crecimiento. En un ejemplo, el medio de proliferación celular comprende adicionalmente células como se proporcionan en el presente documento. Preferentemente, el medio de proliferación celular comprende adicionalmente células oculares. En otro ejemplo, el medio de proliferación celular comprende adicionalmente células madre del limbo. Preferentemente, las células madre del limbo están en suspensión. En otro ejemplo más, el medio de proliferación celular comprende células endoteliales corneales. Preferentemente, las células endoteliales corneales están en suspensión.
En un aspecto, en el presente documento se divulga una preparación celular que comprende un inhibidor de LATS y células de una población celular como se describe y/o se proporciona en el presente documento. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una preparación celular que comprende un inhibidor de LATS y células oculares. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una preparación celular que comprende un inhibidor de LATS y células madre del limbo. En otro aspecto más, en el presente documento se divulga una preparación celular que comprende un inhibidor de LATS y células endoteliales corneales. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una preparación celular que comprende un compuesto de Fórmula A1
y células madre del limbo. En un aspecto alternativo, en el presente documento se divulga una preparación celular que comprende un compuesto de Fórmula A1 y células endoteliales corneales. Preferentemente, la preparación celular comprende además un medio de crecimiento. En particular preferentemente, la preparación celular comprende además una solución de conservación o crioconservación.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga una preparación de suministro de células oculares, que comprende una preparación celular como se divulga en el presente documento y una composición adecuada para el suministro ocular que es un agente localizador. En un ejemplo específico, el agente localizador es GelMa. En otro ejemplo específico, el agente localizador es fibrina o pegamento de fibrina. En otro aspecto, en el presente documento se divulga una preparación de suministro de células oculares, que comprende una preparación celular como se divulga en el presente documento y una composición adecuada para el suministro ocular que es un agente localizador. En un ejemplo específico, el agente localizador es GelMa. En otro ejemplo específico, el agente localizador es fibrina o pegamento de fibrina. En determinados aspectos preferidos, la preparación celular tiene sólo niveles traza del compuesto de acuerdo con la invención. En otro ejemplo específico más, más del 20 % de las células en la preparación de suministro de células son células madre del limbo. En un ejemplo específico adicional, más del 20 % de las células en la preparación de suministro de células son células que expresan p63alfa.
En otro aspecto más, en el presente documento se divulga una preparación de suministro de células oculares, que comprende una preparación celular como se divulga en el presente documento y una composición adecuada para el suministro ocular que es un agente localizador. En un ejemplo específico, el agente localizador es GelMa. Preferentemente, las células endoteliales corneales están en suspensión. En un ejemplo alternativo, las células endoteliales corneales están presentes en la preparación de suministro de células a una densidad superior a 500 células por mm2 (área). En particular preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes a una densidad de 1000 a 3500 células/mm2 (área), más preferentemente de 2000 a aproximadamente 3000 células/mm2 (área). En determinados aspectos preferidos, la preparación celular tiene sólo niveles traza del compuesto de acuerdo con la invención.
Preferentemente, el medio de crecimiento en los métodos o preparación celular de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS), medio sin suero endotelial humano (SF) con suero humano, medio X-VIVO15 y DMEM/F12 que opcionalmente se suplementa con cloruro de calcio; preferentemente medio X-VIVO15.
Preferentemente, la solución de conservación o crioconservación de acuerdo con la invención comprende una solución que es Optisol o PBS (solución salina tamponada con fosfato) y la solución de crioconservación comprende adicionalmente glicerol, sulfóxido de dimetilo, propilenglicol o acetamida.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un kit que comprende una composición adecuada para el suministro ocular y un inhibidor de LATS. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma. En otro aspecto, en el presente documento se divulga un kit que comprende una composición adecuada para el suministro ocular y un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma. Preferentemente, el kit tiene instrucciones de uso. En un ejemplo, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador o colirios tópicos. Preferentemente, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador. En un ejemplo específico, el kit comprende además células madre del limbo. En otro ejemplo específico del kit, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador que es GelMa. En un ejemplo específico alternativo del kit, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador que es fibrina o pegamento de fibrina. En otro ejemplo específico más, más del 20 % de las células del kit son células madre del limbo. En un ejemplo específico adicional, más del 20 % de las células del kit son células que expresan p63alfa. En un ejemplo específico alternativo, el kit comprende células endoteliales corneales. En otra realización específica, el ejemplo adecuado para el suministro ocular de células endoteliales corneales es un agente localizador que es GelMa. En otro ejemplo específico más, las células endoteliales corneales están presentes en una monocapa. Preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes a una densidad superior a 500 células por mm2 (área). En particular preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes a una densidad de 1000 a 3500 células/mm2 (área), más preferentemente de 2000 a aproximadamente 3000 células/mm2 (área).
En ejemplos preferidos, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador que es una biomatriz. Preferentemente, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador seleccionado del grupo que consiste en fibrina, colágeno, gelatina, celulosa, membrana amniótica, pegamento de fibrina, diacrilato de polietileno (glicol) (PEGDA), GeIMA, agentes localizadores que comprenden un polímero, polímero reticulado, o hidrogel que comprende uno o más de ácido hialurónico, polietilenglicol, polipropilenglicol, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, poloxámero, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, polivinilpirrolidona, poli(lactida-co-glicolida), alginato, gelatina, colágeno, fibrinógeno, celulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropil-guar, goma gellan, goma guar, goma xantana y carboximetilcelulosa, así como derivados de los mismos, copolímeros de los mismos y combinaciones de los mismos. En ejemplos preferidos
la composición adecuada para el suministro ocular es un agente de localización que es GelMa, fibrina o pegamento de fibrina. En ejemplos específicos, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador que es GelMa. En otros ejemplos específicos, la composición adecuada para el suministro ocular es un agente localizador que es fibrina o pegamento de fibrina. Preferentemente, el agente localizador es pegamento de fibrina. Se conocen en la técnica pegamentos de fibrina, incluyendo, por ejemplo, el sellador de fibrina TISSEEL VH (Baxter AG, Viena, Austria) (Pandaet al.,2009,Indian J Ophthalmol.Septiembre-octubre; 57(5): 371-379). En un ejemplo, se usa pegamento de fibrina para el suministro de células madre del limbo. En otro ejemplo, se usa GelMa para el suministro de células endoteliales corneales.
En ejemplos más preferidos en donde las células madre del limbo están presentes en combinación con el agente localizador, más del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de las células son células madre del limbo. Preferentemente, más del 20 % son células madre del limbo. Más preferentemente, más del 50 % son células madre del limbo. En otro ejemplo preferido, más del 70 % son células madre del limbo. En particular preferentemente, más del 90 % son células madre del limbo.
En ejemplos preferidos adicionales en donde las células están presentes en combinación con el agente localizador, más del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de las células son células que expresan p63alfa. Preferentemente, más del 20 % son células positivas para p63alfa. Más preferentemente, más del 50 % son células positivas para p63alfa. En otro ejemplo preferido, más del 70 % son células positivas para p63alfa. En particular preferentemente, más del 90 % son células positivas para p63alfa.
En ejemplos más preferidos, las células endoteliales corneales están presentes en combinación con el agente localizador. Preferentemente, las células endoteliales corneales están en una monocapa. Más preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes a una densidad superior a 500 células por mm2 (área). En particular preferentemente, las células endoteliales corneales están presentes a una densidad de 1000 a 3500 células/mm2 (área), más en particular preferentemente de 2000 a aproximadamente 3000 células/mm2 (área).
En ejemplos particulares adicionales, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 o LATS2, o LATS1 y LATS2. En un ejemplo más particularmente preferido
el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2.
En ejemplos preferidos, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en 2-metil-1-(2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propoxi)propan-2-ol; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (S)-N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1 -trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2,4-dimetil-4-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)pentan-2-ol; N-isopropil-N-metil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclobutil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-isopropil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; 2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propan-1-ol; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilciclopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; 2-(2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propoxi)etan-1-ol; y (R)-N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
También preferentemente, dicho compuesto o una sal del mismo se selecciona de N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina y (S)-N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina. Preferentemente, dicho compuesto o una sal del mismo, es N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina.
En ejemplos particularmente preferidos, el compuesto de acuerdo con la invención está presente en una concentración de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente de 1 a 20 micromolar, en particular preferentemente de aproximadamente 3 a 10 micromolar.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células a un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la población de células obtenibles u obtenidas mediante el método de expansión de poblaciones celulares o el método de cultivo de células o el método de inhibición de LATS como se divulga en el presente documento
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células oculares en el ojo de un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la población de células obtenibles u obtenidas mediante el método de expansión de poblaciones celulares o el método de cultivo de células o el método de inhibición de LATS como se divulga en el presente documento, en donde las células son células oculares. Preferentemente, las células oculares son células madre del limbo o células endoteliales corneales.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células oculares en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células que comprende células madre del limbo en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la población de células que comprenden células madre del limbo obtenibles u obtenidas mediante el método de expansión de poblaciones celulares o el método de cultivo de células o el método de inhibición de LATS como se divulga en el presente documento. En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células que comprenden células madre del limbo en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población celular que comprende células madre del limbo en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método expandir una población celular que comprende células madre del limbo cultivando dicha población con medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención, preferentemente aclarar la población celular expandida para retirar sustancialmente el inhibidor de LATS y administrar dichas células en la córnea de dicho sujeto. Preferentemente, dicha población celular se combina con una biomatriz antes de dicha administración. En un ejemplo específico, dicha población celular se combina con una biomatriz que es GelMA antes de dicha administración. En otro ejemplo específico, dicha población celular se combina con pegamento de fibrina antes de dicha administración. En una realización, dicha población celular se combina con un portador que es una lente de contacto. En un ejemplo específico, la población celular que comprende células madre del limbo se combina con una biomatriz que es GelMA y el GelMA se polimeriza sobre un portador que es una lente de contacto. En otro ejemplo específico, la población celular que comprende células madre del limbo se combina con pegamento de fibrina y una lente de contacto.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la población de células endoteliales corneales obtenibles u obtenidas mediante el método de expansión de poblaciones celulares o el método de cultivo de células o el método de inhibición de LATS como se divulga en el presente documento.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método administrar la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células que comprenden células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto, comprendiendo dicho método expandir una población de células que comprenden células endoteliales corneales cultivando dicha población con medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención, aclarar la población expandida de células para retirar sustancialmente el inhibidor de LATS y administrar dichas células en la córnea de dicho sujeto. Preferentemente, dichas células se combinan con una biomatriz antes de dicha administración. En un ejemplo específico, dichas células se combinan con una biomatriz que es GelMA antes de dicha administración. En un ejemplo más específico, dichas células endoteliales corneales se combinan con una biomatriz que está bioimpresa sobre la superficie ocular. En particular preferentemente, dichas células endoteliales corneales se combinan con una biomatriz que es GelMA y se bioimprimen sobre la superficie ocular polimerizando el GelMA mediante una reacción desencadenada por luz.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células al ojo de un sujeto, que comprende combinar las células con una biomatriz para formar una mezcla de células/biomatriz, inyectar la mezcla en el ojo del sujeto o aplicar la mezcla sobre la superficie del ojo del sujeto, y bioimprimir las células en o sobre el ojo guiando y fijando las células, tal como sobre la córnea, usando una fuente de luz, tal como una fuente de luz ultravioleta A o blanca. En determinados ejemplos, la fuente de luz produce luz de una longitud de onda de al menos 350 nm. En determinados ejemplos, la fuente de luz produce luz en el intervalo de 350 nm a 420 nm. Por ejemplo, puede usarse una fuente de luz<l>E<d>para producir una luz que tenga una longitud de onda de 365 nm o 405 nm, o cualquier otra longitud de onda superior a 350 nm, o puede usarse una lámpara de mercurio con un filtro de paso de banda para producir una luz que tenga una longitud de onda de 350 nm a 700 nm, por ejemplo, una longitud de onda de 365 nm o 405 nm. En otro ejemplo, la fuente de luz produce luz blanca visible que tiene una longitud de onda, por ejemplo, en el intervalo de 400 nm a 700 nm. En determinados ejemplos, las células son células oculares, tales como células corneales, por ejemplo, células endoteliales corneales.
En el presente documento también se divulga un método de trasplante de una población de células endoteliales corneales al ojo de un sujeto, que comprende cultivar una población de células endoteliales corneales en un medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS, combinar las células endoteliales corneales con una biomatriz para formar una mezcla de células/biomatriz, inyectar la mezcla en el ojo del sujeto y bioimprimir las células en el ojo guiando y fijando las células sobre la córnea usando una fuente de luz, tal como una fuente de luz UVA o LED o visible.
En el presente documento también se divulga una profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular usando un inhibidor de LATS. Preferentemente, el inhibidor de LATS es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma. En el presente documento también se divulga un método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular usando un compuesto de acuerdo con la Fórmula A2 o subfórmulas de la misma. En ejemplos específicos preferidos, el método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular comprende además el método de inhibición de LATS en una población celular o el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento, en donde dichas células son células oculares. Preferentemente, el método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento. , en donde dichas células son células oculares. En otro ejemplo preferido, el método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento, en donde dichas células son células oculares. En otro ejemplo preferido más, el método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular el método comprende las etapas del método de trasplante de una población de células que comprenden células oculares al ojo de un sujeto como se divulga en el presente documento. Preferentemente, las células oculares son células madre del limbo o células endoteliales corneales. En otro ejemplo preferido más, el método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular el método comprende las etapas del método de trasplante de una población de células que comprenden células madre del limbo en la córnea de un sujeto como se divulga en el presente documento. En un ejemplo preferido alternativo, el método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular el método comprende las etapas del método de trasplante de una población de células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto como se divulga en el presente documento.
En un ejemplo específico del método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular como se divulga en el presente documento, la población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento se administra simultánea o secuencialmente con un agente o agentes seleccionados del grupo que consiste en dexametasona, ciclosporina, tobramicina y cefazolina.
En el presente documento también se divulga un modulador de YAP (proteína asociada a yes) para su uso en un método de trasplante de una población de células a un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento. Preferentemente, dicho modulador de yA p es un inhibidor de LATS. Preferentemente, las células son células oculares.
En el presente documento también se divulga un modulador de YAP (proteína asociada a yes) para su uso en un método de trasplante de una población de células que comprenden células madre del limbo en la córnea de un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento. Preferentemente, dicho modulador de YAp es un inhibidor de LATS.
En el presente documento también se divulga un modulador de YAP para su uso en un método de tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento.
Preferentemente, dicho modulador de YAP es un inhibidor de LATS.
En el presente documento también se divulga un modulador de YAP (proteína asociada a yes) para su uso en un método de trasplante de una población de células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento. Preferentemente, dicho modulador de YAP es un inhibidor de LATS.
En el presente documento también se divulga un modulador de YAP para su uso en un método de tratamiento de la disfunción endotelial corneal, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento.
Preferentemente, dicho modulador de YAP es un inhibidor de LATS.
En el presente documento también se divulga un tratamiento de una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población celular, en donde la población ha crecido en presencia de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En un ejemplo adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferentemente, las células son células oculares.
En el presente documento también se divulga un compuesto de acuerdo con la Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en una terapia o como medicamento. Preferentemente, el compuesto es para su uso en una enfermedad o trastorno ocular.
En el presente documento también se divulga un inhibidor de LATS para su uso en una enfermedad o trastorno ocular, preferentemente en donde el inhibidor de LATS es un compuesto. Preferentemente, el compuesto es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo
en la fabricación de un medicamento. En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno ocular.
En ejemplos específicos preferidos del compuesto para el uso de acuerdo con la invención o un inhibidor de LATS para el uso como se divulga en el presente documento o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento, el uso comprende además el método de inhibición de LATS en una población celular o el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
En ejemplos específicos preferidos adicionales del compuesto para el uso de acuerdo con la invención o un inhibidor de LATS para el uso como se divulga en el presente documento o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento, el uso comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento. En más ejemplos preferidos adicionales del compuesto para el uso de acuerdo con la invención o un inhibidor de LATS para el uso como se divulga en el presente documento o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento, el uso comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento. En un ejemplo preferido del compuesto para el uso como se divulga en el presente documento o un inhibidor de LATS para el uso como se divulga en el presente documento o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento, el uso comprende las etapas del método de trasplante de una población de células que comprenden células oculares en la córnea de un sujeto como se divulga en el presente documento. En ejemplos aún más preferidos del compuesto para el uso como se divulga en el presente documento o un inhibidor de LATS para el uso como se divulga en el presente documento o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento, el uso comprende las etapas del método de trasplante de una población de células que comprenden células madre del limbo en la córnea de un sujeto como se divulga en el presente documento. En ejemplos aún más preferidos del compuesto para el uso como se divulga en el presente documento o un inhibidor de LAT<s>para el uso como se divulga en el presente documento
o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento,
el uso comprende las etapas del método de trasplante de una población de células que comprenden células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto como se divulga en el presente documento.
En ejemplos específicos del compuesto para el uso como se divulga en el presente documento o un inhibidor de LATS para el uso como se divulga en el presente documento o el uso del compuesto en la fabricación de un medicamento como se divulga en el presente documento, la población celular obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento o la preparación de suministro de células como se divulga en el presente documento se administra simultánea o secuencialmente con un agente o agentes seleccionados del grupo que consiste en dexametasona, ciclosporina, tobramicina y cefazolina.
En ejemplos preferidos, la enfermedad o trastorno ocular se asocia a una deficiencia de células madre del limbo. En ejemplos más preferidos, la enfermedad o trastorno ocular es una deficiencia de células madre del limbo. Más preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular es una deficiencia de células madre del limbo que surge debido a una lesión o trastorno seleccionado del grupo que consiste en quemaduras químicas, quemaduras térmicas, lesiones por radiación, aniridia, esclerocórnea, neoplasia endocrina múltiple, síndrome de Stevens Johnson, penfigoide cicatricial ocular, enfermedades vasculares del colágeno; trastornos inflamatorios crónicos no autoinmunitarios que surgen del uso de lentes de contacto, enfermedad del ojo seco, rosácea, estafilococos marginales, queratitis (incluyendo queratitis bacteriana, fúngica y vírica), pterigión o neoplasia, deficiencia de células madre del limbo que surge después de múltiples cirugías oculares, escisión de pterigión o neoplasia o crioterapia; y deficiencia de células madre del limbo que surge como resultado de la toxicidad por medicamentos de un medicamento seleccionado del grupo que consiste en conservantes (timerosal, benzalconio), anestésicos tópicos, pilocarpina, betabloqueantes, mitomicina, 5-fluorouracilo, nitrato de plata y medicamentos orales que provocan el síndrome de Stevens Johnson. En particular preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular es una deficiencia de células madre del limbo que surge debido a una lesión o trastorno seleccionado del grupo que consiste en quemaduras químicas, aniridia, síndrome de Stevens Johnson y uso de lentes de contacto.
En ejemplos preferidos, la enfermedad o trastorno ocular se asocia a una disminución de la densidad de células endoteliales corneales. En ejemplos más preferidos, la enfermedad o trastorno ocular es una disfunción endotelial corneal. Más preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular es una disfunción endotelial corneal que se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, queratopatía ampollosa (incluyendo queratopatía ampollosa pseudofáquica y queratopatía ampollosa afáquica), fracaso del trasplante de córnea, distrofia corneal polimorfa posterior, distrofia endotelial hereditaria congénita, distrofia corneal endotelial ligada al cromosoma X, aniridia y endotelitis corneal. En una realización específica, la enfermedad o trastorno ocular se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, queratopatía ampollosa (incluyendo queratopatía ampollosa pseudofáquica y queratopatía ampollosa afáquica) y fracaso del trasplante de córnea.
En el presente documento también se divulgan métodos para promover la cicatrización de heridas, particularmente para tratar o mejorar los síntomas de quemaduras, úlceras cutáneas agudas y crónicas, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un inhibidor de LATS.
Dentro de determinados otros aspectos, en el presente documento se divulga un método para promover la cicatrización de heridas que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable, o un estereoisómero del mismo.
En el presente documento también se divulgan compuestos y composiciones que pueden usarse para promover la cicatrización de heridas. En otro aspecto, en el presente documento se divulgan compuestos y composiciones que pueden usarse para la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas, particularmente para tratar o mejorar los síntomas de quemaduras, úlceras cutáneas agudas y úlceras cutáneas crónicas, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, y opcionalmente con un segundo agente terapéutico que es otro compuesto de la invención u otro tipo de agente terapéutico.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas oculares que comprende administrar a un ojo de un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención. En un ejemplo, la herida ocular es una herida corneal. En otros ejemplos, la herida ocular es una lesión o herida quirúrgica.
En el presente documento también se divulgan compuestos y composiciones que pueden usarse en la regeneración y el recrecimiento del hígado. Dentro de determinados otros aspectos, en el presente documento se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo. En otro aspecto, en el presente documento se divulgan compuestos y composiciones que pueden usarse para la fabricación de un medicamento para la regeneración y el recrecimiento del hígado.
En el presente documento también se divulga un método para la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención y opcionalmente con un segundo agente terapéutico que es otro compuesto de la invención u otro tipo de agente terapéutico.
En el presente documento también se divulga un método de generación de material celular para terapia celular y/o trasplante que comprende el usoex vivode un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo. El material celular puede comprender células oculares, hepáticas o cutáneas.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende el usoex vivode un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo.
En el presente documento también se divulga un métodoex vivopara la expansión de la población de células hepáticas, que comprende el uso de un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1:Los inhibidores de LATS (compuesto del ej. 49 y ej. 133) inducen la desfosforilación de YAP en LSC una hora después del tratamiento, como se muestra mediante transferencia Western.
Figura 2:El inmunomarcaje de p63-alfa en cultivos de células madre del limbo indica que la población de LSC puede expandirse cuando se mantiene en un medio que comprende los inhibidores de LATS (compuesto del ej.
49 y ej. 133).Figura 2A: En presencia de medio de crecimiento y DMSO, sólo unas pocas células aisladas se adhieren a la placa de cultivo y sobreviven hasta 6 días. La mayoría de las células expresaron el marcador nuclear humano, pero pocas expresaron p63alfa.Figuras 2By2C:Por el contrario, en presencia de inhibidores de LATS: el compuesto del ejemplo n.° 49 y ejemplo n.° 133, las células formaron colonias y expresaron p63alfa. Este resultado indicó que los inhibidores de LAT<s>promueven la expansión de la población de células con el fenotipo positivo para p63alfa.Figura 2D: El pase de células y cultivarlas en presencia del inhibidor de LATS compuesto del ejemplo n.° 49 durante dos semanas permitió la expansión de poblaciones celulares y la formación de cultivos confluentes que expresaban p63alfa.
Figura 3:La inactivación de LATS1 y LATS2 mediante ARNip activa la proliferación de LSC en cultivo, como se muestra mediante el porcentaje de células positivas para EdU.
Figura 4:El inmunomarcaje de los marcadores de LSC DeltaN-p63 alfa/beta/gamma, ABCG2 y C/EBP delta indica que las LSC mantenidas en un medio de cultivo que contiene inhibidores de LATS (compuesto del ej. 49 y ej. 133) expresan marcadores típicos de LSC. Los resultados indican que las células cultivadas en DMSO normalmente no expresan marcadores tales como DeltaN-p63 alfa/beta/gamma, ABCG2 y C/EBP delta, normalmente expresados por las LSC. Por el contrario, las células cultivadas en presencia de inhibidores de LATS expresan marcadores tales como DeltaN-p63 alfa/beta/gamma, ABCG2 y C/EBP delta, normalmente expresados por las LSC.
Figura 5:El inmunomarcaje del marcador de LSC indiferenciado p63alfa y del marcador de células del epitelio corneal queratina 12 muestra que las poblaciones de LSC expandidas usando un medio de cultivo que comprende los inhibidores de LAT<s>(Figura 5A: compuesto del ej. 49,Figura 5B:compuesto del ej. 47, Fig5C:compuesto del ej. 12,Figura 5D:compuesto del ej. 261) pueden diferenciarse en células del epitelio corneal cuando se transfieren a condiciones que permiten la diferenciación. Se muestran vistas en las que se produce la transición de la identidad celular positiva para p63alfa a la identidad de queratina-12.
Figura 6: Las LSC se marcaron usando una proteína fluorescente para confirmar que las LSC adheridas a una lente de contacto usando polimerización de GelMA pueden suministrarse a la superficie del ojo de conejoex vivo.Las flechas muestran el sitio de unión de las LSC.
Figura 7:Fig 7A:Ojo trasplantado, tinción con queratina-12;Fig. 7B:Ojo trasplantado, tinción con queratina-19;Fig. 7C:ojo de control no trasplantado, tinción con queratina-12;Fig. 7D:Ojo de control no trasplantado, tinción con queratina-19. Estas figuras muestran que en un modelo de conejo con deficiencia de células madre del limbo, una población de LSC expandida en un medio que comprendía el compuesto del ejemplo n.° 12, combinada con GelMA y suministrada a través de una lente de contactoin vivoa la superficie corneal del conejo, condujo a la regeneración de un epitelio corneal positivo para queratina-12 (Fig.7A) y evitó la conjuntivalización por células conjuntivales positivas para queratina-19 en el ojo trasplantado.Fig. 7B:La flecha señala la ausencia de tinción con queratina 19. Por el contrario, los ojos de conejo no trasplantados mostraron ausencia de restauración del epitelio corneal positivo para queratina-12.Fig. 7C:La flecha señala la ausencia de tinción con queratina-12. En cambio, se observaron signos de conjuntivalización, como se muestra mediante la presencia de tinción de queratina-19.Fig. 7D:La flecha apunta a áreas de tinción positiva con queratina-19.
Figura 8: Fig. 8A:Ojo de conejo trasplantado con LSC humanas;Fig. 8B:Ojo de conejo de control, no trasplantado con LSC humanas. Estas figuras muestran que las células que restauraron el epitelio corneal de ojos trasplantados eran humanas (Fig. 8A), como se demuestra mediante la presencia de proteína mitocondrial humana (la flecha muestra que el marcador mitocondrial humano está presente). Por el contrario, la superficie ocular de los ojos no trasplantados no presentó tinción de proteínas mitocondriales humanas (Fig. 8B: el marcador mitocondrial humano está ausente).
Figura 9:Las imágenes microscópicas de LSC suministradas a través de TISSEEL a una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno muestran la repoblación de las células para cubrir la superficie de cultivo en 2 semanas.
Figura 10:Se suministraron LSC marcadas con CellTracker Verde CMFDA a córnea humanaex vivoy se cubrieron con lentes de contacto protectoras.
Figura 11:Se bioimprimieron células HEK-293 marcadas con colorante de color rojo y verde en un patrón Yin-Yang sobre la parte superior de una córnea de conejoex vivo(que se muestra como un patrón de color gris oscuro y claro).
Figura 12:Reducción del rechazo inmunitario mediante la supresión mediada por CRISPR/Cas9 del gen de beta-2-microglobulina (B2M) en LSC: Los análisis por FACS muestran que la supresión de B2M mediada por CRISPR y la posterior eliminación de HLA A, B y C se produjeron en el 21 por ciento de las LSC.
Figura 13:La población de LSC negativas para B2M/negativas para HLA A,B,C se expandió usando el compuesto del ejemplo n.° 48a para producir una preparación celular donde el 97 por ciento de las células no expresan HLA A, B, C.
Figura 14:Los inhibidores de LATS (compuestos de ej. 133 y ej. 49) inducen la translocación de YAP al núcleo en las Células endoteliales corneales (CEC).
Figura 15:Los inhibidores de LATS (compuesto del ej. 133 y ej. 49) inducen la desfosforilación de YAP en CEC una hora después del tratamiento. Como se muestra en la Fig. 15a mediante transferencia Western; la Fig. 15b: gráfico que muestra niveles de YAP fosforilada normalizados a beta-actina; y la Fig.15c: gráfico que muestra los niveles de YAP fosforilada normalizados a YAP total.
Figura 16:CEC cultivadas en presencia o ausencia de inhibidores de LATS. Se usó un sistema Incucyte (Essen Biosciences) para medir la confluencia de CEC mediante análisis cuantitativo de células vivas en tiempo real a lo largo del tiempo. Los compuestos del ej. 49 (cuadrados de color negro) y ej. 133 (cuadrados de color gris claro) indujeron una fuerte proliferación de CEC; mientras que la proliferación de CEC fue mínima en el vehículo (DMSO, cuadrados de color gris oscuro).
Figura 17:La inactivación de LATS1 y LATS2 mediante ARNip activa la proliferación de células endoteliales corneales en cultivo, como se muestra mediante el porcentaje de células positivas para EdU.
Figura 18:El inmunomarcaje con Zonula Occludens-1 (ZO-1) indica que las CEC proliferaron en presencia del inhibidor de LATS, compuesto del ej. 49, (Fig. 18b) forman uniones estrechas, una estructura endotelial y conservan un tamaño celular y una morfología normales característicos de las CEC funcionales. Las CEC que proliferaron en presencia del vehículo solo (DMSO) muestran signos de polimegatismo característico de las CEC disfuncionales (Fig. 18a).
Figura 19:El análisis por RT-PCR cuantitativa indica que una población de células endoteliales corneales expandida con el inhibidor de LATS, compuesto del ej. 49, expresa genes normalmente expresados por células endoteliales cornealesin vivo,incluyendo Colágeno 8a2, AQP1, SLc4A11. Las células no expresan marcadores de otros epitelios presentes en el ojo, incluyendo RPE65 (un marcador del epitelio pigmentado retiniano) y CD31 (un marcador del epitelio vascular).
Figura 20:El análisis inmunohistoquímico indica que una población de células endoteliales corneales expandida con el inhibidor de LATS, compuesto del ej.49, expresan genes normalmente expresados por células endoteliales cornealesin vivo,incluyendo Na/K ATPasa (Fig. 20a) y Colágeno 8a2 (Fig. 20b).
Figura 21:Análisis por FACS de la población de células de endotelio corneal expandida en presencia del inhibidor de LATS, compuesto del ej. 47, y CEC cultivadas en ausencia de un inhibidor de LATS. La población celular expandida en presencia del inhibidor de LATS expresa niveles bajos de CD73 (Fig. 21a, línea de color gris), c D44 (Fig. 21b, línea de color gris), CD166 (Fig. 21c, línea de color gris) y CD105 (Fig. 21d, línea de color gris); mientras que la población celular cultivada sin el inhibidor de LATS expresa niveles altos de CD44, CD73, CD105 y CD166 (líneas de color negro).
Figura 22:Método de depresión de burbujas que representa el método 1 como se describe con más detalle en la "sección de bioimpresión", en el que se aplica una biomatriz a un ojo para suministrar una preparación celular de acuerdo con la invención.Fig. 22a.Inyectar bolo de biomatriz;Fig. 22bInyectar burbujas debajo de la biomatriz para extenderlas sobre la córnea;Fig. 22cCurar la biomatriz con una fuente de luz ultravioleta o azul;
Fig. 22dRetirar la burbuja y reemplazarla con una solución salina equilibrada.
Figura 23:Método sustractivo que usa láser de femtosegundos (FS), que representa el método 2 como se describe con más detalle en la "sección de bioimpresión", en el que se aplica una biomatriz a un ojo para suministrar una preparación celular de acuerdo con la invención.Fig. 23aRetirar el endotelio disfuncional con FS;Fig.23bInyectar biomatriz en la cámara anterior;Fig.23cCure la biomatriz con una fuente de luz UV o azul;
Fig. 23dSeparar la biomatriz no deseada con FS;Fig. 23eRetirar la biomatriz desprendida con unas pinzas.
Figura 24:Método de máscara de colorante, que representa el método 3 como se describe con más detalle en la "sección de bioimpresión", en el que se aplica una biomatriz a un ojo para suministrar una preparación celular de acuerdo con la invención.Fig.24aTeñir el endotelio con un colorante (por ejemplo, Azul de Tipano);Fig.24bPelar el endotelio disfuncional;Fig. 24cInyectar biomatriz teñida;Fig.24dCurar la biomatriz con una fuente de luz UV o azul;Fig.24eLavar abundantemente la biomatriz no curada.
Figura 25:Método de dispensación en seco, que representa el método 4 como se describe con más detalle en la "sección de bioimpresión", en el que se aplica una biomatriz a un ojo para suministrar una preparación celular de acuerdo con la invención.Fig. 25aDrenar la cámara anterior;Fig. 25bDispensar biomatriz en la córnea posterior con una cánula de punta suave/cepillo;Fig. 25cCurar la biomatriz con una fuente de luz UV o azul;
Fig. 25dVolver a llenar el ojo con una solución salina equilibrada.
Figura 26Esquema que muestra el dispositivo de bioimpresión como se describe adicionalmente en el Ejemplo C11.
Figura 27Resultados que muestran que pueden bioimprimirse células en el lado posterior de la córnea mediante el uso de un dispositivo portátil que proyecta luz UVA de 365 nm a través de la córnea. Después de aclarar el material no polimerizado y no adherido, se retuvo un patrón circular de células marcadas con proteínas fluorescentes en el lado posterior de la córnea.
Figura 28Las CEC bioimpresas en el lado posterior de la córnea pueden reconstruir un endotelio corneal en un modelo de conejo de distrofia del endotelio corneal. Los resultados indicaron que, en conejos experimentales, la estructura del endotelio corneal puede detectarse mediante inmunohistoquímica de ZO-1 (Fig. 28A). En el ojo derecho de un conejo en el que se extirpó quirúrgicamente el endotelio corneal y no se bioimprimieron CEC, la tinción con ZO-1 está ausente, lo que indica una ausencia de endotelio corneal de estructura normal (Fig. 28B). En el ojo derecho de un conejo en el que se extirpó quirúrgicamente el endotelio corneal y se bioimprimieron CEC, la tinción con ZO-1 está presente, lo que indica que se ha reconstruido una estructura de endotelio corneal (Fig. 28C). La Fig. 28D y la Fig. 28E muestran que la inmunotinción con antígeno nuclear humano está ausente en ojos que no recibieron ninguna CEC humana. Por el contrario, las células positivas para el antígeno nuclear humano cubren el campo de imagen en los ojos en los que se bioimprimieron CEC humanas (Fig. 28F), lo que indica que la estructura del endotelio corneal marcada con ZO-1 que se muestra en la Fig. 28C está compuesta por las CEC humanas bioimpresas en el lado posterior de la córnea de conejo.
Figura 29:Se bioimprimieron células HEK-293 marcadas con proteína fluorescente roja en construcciones de diferentes letras en el lado posterior de córnea humanaex vivo.
Figura 30:El mapa vectorial muestra el diseño del vector AAV2 utilizado para expresar el sistema CRISPR en LSC y CEC. (La Figura 30 divulga la SEQ ID NO: 28).
Figura 31:El análisis por FACS de la expresión mediada por AAV del sistema CRISPR permitió la supresión de B2M y la posterior eliminación de HLA A, B y C en LSC.
Figura 32:El análisis por FACS de la expresión mediada por AAV del sistema CRISPR permitió la supresión de B2M y la posterior eliminación de HLA A, B y C en CEC.
Figura 33A:La Fig. 33A es una transferencia Western de pYAP en lisado de células HaCaT humanas que no se trataron o se trataron con 40 pM de cada uno de ARNip contra MST1/2 o LATS1/2; se usó actina como control.
Figura 33B:La Fig. 33B es una transferencia Western de pYAP en lisado de células HaCaT humanas que no se trataron o se trataron con 9 pM del Ejemplo 133; se usó actina como control.
Figura 33C:La Fig. 33C es un gráfico de la actividad inhibidora relativa contra LATS1 frente a la concentración del Ejemplo 133 que varía de ~10'4 a 1 pm. La CI50 calculada del Ejemplo 133 contra LATS1 fue de 1,3 nM.
Figura 34:es un gráfico de barras de niveles de expresión relativos deCyr61/Gapdhfrente a la concentración del Ejemplo 133 a 0, 0,2 y 2 mg/ml.
Figura 35A:La Fig. 35A muestra micrografías de piel de ratón tratada por vía tópica con vehículo o Ejemplo 133.
Figura 35B:La Fig. 35B es un diagrama de dispersión que compara el porcentaje de células Ki67+ en piel de ratón tratada con vehículo o el Ejemplo 133.
DESCRIPCIÓN DETALLADA ADICIONAL
LATS
LATS es el nombre abreviado de la cinasa supresora tumoral grande. LATS como se usa en el presente documento se refiere a LATS1 y/o LATS2. LATS1, como se usa en el presente documento, se refiere a la cinasa 1 supresora tumoral grande y LATS2 se refiere a la cinasa 2 supresora tumoral grande. Tanto LATS1 como LATS2 tienen actividad serina/treonina proteína cinasa. A LATS1 y LATS2 se les han asignado los identificadores del Comité de Nomenclatura Génica de la Organización del Genoma Humano (HUGO, por sus siglas en inglés): ID del HGNC 6514 e ID del HGNC 6515, respectivamente. En ocasiones también se hace referencia a LATS1 en la técnica como WARTS o wts, y en ocasiones se hace referencia a LATS2 en la técnica como KPM. Las secuencias de LATS representativas incluyen, pero sin limitación, las secuencias de proteínas disponibles en la base de datos de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica con los números de acceso NP_004681.1 (LATS1) y NP_001257448.1 (LATS1) y NP_055387.2 (LATS 2), como se muestra a continuación.
LATS1: NP_004681.1 (Serina/treonina-proteína cinasa LATS1 isoforma 1, homo sapiens)(SEQ ID NO: 1:)
1 mkrsekpegy rqmrpktfpa snytvssrqm Iqeireslrn Iskpsdaaka ehnmskmste
61 dprqvrnppk fgthhkalqe irnsllpfan etnssrstse vnpqmlqdlq aagfdedmvi
121 qalqktnnrs ieaaiefisk msyqdprreq maaaaarpin asmkpgnvqq svnrkqswkg
181 skeslvpqrh gpplgesvay hsespnsqtd vgrplsgsgi safvqahpsn gqrvnppppp
241 qvrsvtpppp prgqtppprg ttppppswep nsqtkrysgn meyvisrisp vppgawqegy
301 pppplntspm nppnqgqrgi ssvpvgrqpi imqssskfnf psgrpgmqng tgqtdfmihq
361 nvvpagtvnr qppppyplta angqspsalq tggsaapssy tngsipqsmm vpnrnshnme
421 lynisvpglq tnwpqsssap aqsspssghe iptwqpnipv rsnsfnnplg nrashsansq
481 psattvtait papiqqpvks mrvlkpelqt alapthpswi pqpiqtvqps pfpegtasnv
541 tvmppvaeap nyqgppppyp khllhqnpsv ppyesiskps kedqpslpke deseksyenv
601 dsgdkekkqi ttspitvrkn kkdeerresr iqsyspqafk ffmeqhvenv Ikshqqrlhr
661 kkqlenemmr vglsqdaqdq mrkmlcqkes nyirlkrakm dksmfvkikt Igigafgevc
721 larkvdtkal yatktlrkkd vllrnqvahv kaerdilaea dnewvvrlyy sfqdkdnlyf
781 vmdyipggdm msllirmgif peslarfyia eltcavesvh kmgfihrdik pdnilidrdg
841 hikltdfglc tgfrwthdsk yyqsgdhprq dsmdfsnewg dpsscrcgdr Ikplerraar
901 qhqrclahsl vgtpnyiape vllrtgytql cdwwsvgvil femlvgqppf laqtpletqm
961 kvinwqtslh ippqaklspe asdliiklcr gpedrlgkng adeikahpff ktidfssdlr
1021 qqsasyipki thptdtsnfd pvdpdklwsd dneeenvndt Ingwykngkh pehafyeftf
1081 rrffddngyp ynypkpieye yinsqgseqq sdeddqntgs eiknrdlvyv
LATS1: serina/treonina-proteína cinasa LATS1 isoforma 2 [Homo sapiens]
Secuencia de referencia del NCBI: NP_001257448.1 (SEQ ID NO: 2:)
1 mkrsekpegy rqmrpktfpa snytvssrqm Iqeireslrn Iskpsdaaka ehnmskmste
61 dprqvrnppk fgthhkalqe irnsllpfan etnssrstse vnpqmlqdlq aagfdedmvi
121 qalqktnnrs ieaaiefisk msyqdprreq maaaaarpin asmkpgnvqq svnrkqswkg
181 skeslvpqrh gpplgesvay hsespnsqtd vgrplsgsgi safvqahpsn gqrvnppppp
241 qvrsvtpppp prgqtppprg ttppppswep nsqtkrysgn meyvisrisp vppgawqegy
301 pppplntspm nppnqgqrgi ssvpvgrqpi imqssskfnf psgrpgmqng tgqtdfmihq
361 nvvpagtvnr qppppyplta angqspsalq tggsaapssy tngsipqsmm vpnrnshnme
421 lynisvpglq tnwpqsssap aqsspssghe iptwqpnipv rsnsfnnplg nrashsansq
481 psattvtait papiqqpvks mrvlkpelqt alapthpswi pqpiqtvqps pfpegtasnv
541 tvmppvaeap nyqgppppyp khllhqnpsv ppyesiskps kedqpslpke deseksyenv
601 dsgdkekkqi ttspitvrkn kkdeerresr iqsyspqafk ffmeqhvenv Ikshqqrlhr
661 kkqlenemmr vkpfkmsifi Inhlfawclf
LATS2:NP_055387.2 serina/treonina-proteína cinasa LATS2 [Homo sapiens]. ((SEQ ID NO: 3:)
1 mrpktfpatt ysgnsrqrlq eireglkqps kssvqglpag pnsdtsldak vlgskdatrq
61 qqqmratpkf gpyqkalrei rysllpfane sgtsaaaevn rqmlqelvna gcdqemagra
121 Ikqtgsrsie aaleyiskmg yldprneqiv rvikqtspgk glmptpvtrr psfegtgdsf
181 asyhqlsgtp yegpsfgadg ptaleemprp yvdylfpgvg phgpghqhqh ppkgygasve
241 aagahfplqg ahygrphllv pgeplgygvq rspsfqsktp petggyaslp tkgqggppga
301 glafpppaag lyvphphhkq agpaahqlhv Igsrsqvfas dsppqslltp srnslnvdly
361 elgstsvqqw paatlarrds Iqkpgleapp rahvafrpdc pvpsrtnsfn shqprpgppg
421 kaepslpapn tvtavtaahi Ihpvksvrvl rpepqtavgp shpawvpapa papapapapa
481 aegldakeeh alalggagaf pldveyggpd rrcppppypk hlllrskseq ydldslcagm
541 eqslragpne peggdksrks akgdkggkdk kqiqtspvpv rknsrdeekr esriksyspy
601 afkffmeqhv enviktyqqk vnrrlqleqe makaglceae qeqmrkilyq kesnynrlkr
661 akmdksmfvk iktlgigafg evclackvdt halyamktlr kkdvlnrnqv ahvkaerdil
721 aeadnewvvk lyysfqdkds lyfvmdyipg gdmmsllirm evfpehlarf yiaeltlaie
781 svhkmgfihr dikpdnilid Idghikltdf glctgfrwth nskyyqkgsh vrqdsmepsd
841 Iwddvsncrc gdrlktleqr arkqhqrcla hslvgtpnyi apevllrkgy tqlcdwwsvg
901 vilfemlvgq ppflaptpte tqlkvinwen tlhipaqvkl speardlitk Iccsadhrlg
961 rngaddlkah pffsaidfss dirkqpapyv ptishpmdts nfdpvdeesp wndasegstk
1021 awdtltspnn khpehafyef tfrrffddng ypfrcpkpsg aeasqaessd lessdlvdqt
1081 egcqpvyv
Se cree que LATS regula negativamente la actividad de YAP1. "YAP1" se refiere a la proteína 1 asociada a yes, también conocida como YAP o YAP65, que es una proteína que actúa como regulador transcripcional de genes implicados en la proliferación celular. Las cinasas LATS son de serina/treonina proteína cinasas que se ha demostrado que fosforilan directamente YAP, lo que da como resultado su retención citoplásmica e inactivación. Sin fosforilación por LATS, YAP se transloca al núcleo, formando un complejo con una proteína de unión a ADN, TEAD, y da como resultado la expresión génica corriente abajo. (Barry ER y Camargo FD (2013)The Hippo superhighway: signaling crossroads converging on the Hippo/Yap pathway in stem cells and development. Current opinion in cell biology25(2):247-253.; Mo JS, Park HW y Guan k L (2014)The Hippo signaling pathway in stem cell biology and cancer. EMBO reports15(6):642-656; Pan D (2010)The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental cell19(4):491-505.)
La vía Hippo/YAP está implicada en numerosos tipos de células y tejidos de sistemas de mamíferos, incluyendo diversos tipos de cáncer. En particular, la vía Hippo está evidentemente implicada en el intestino, el estómago y el esófago, el páncreas, las glándulas salivales, la piel, la glándula mamaria, los ovarios, la próstata, el cerebro y el sistema nervioso, los huesos, los condrocitos, las células adiposas, los miocitos, los linfocitos T, los linfocitos B, las células mieloides, el riñón y el pulmón. Véase Nishioet al.,2017,Genes to Cells22:6-31.
Inhibición de LATS1 y LATS2
Los compuestos de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, en forma libre o en forma de sal, son inhibidores potentes de LATS1 y/o LATS2.
Los compuestos de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, en forma libre o en forma de sal, son potentes inhibidores de LATS1 y LATS2.
La eficacia de inhibición de los compuestos contra LATS1 se sometió a ensayo mediante el Ensayo HTRF bioquímico de LATS1 como se describe en el Ejemplo A1 a continuación. La eficacia de inhibición de los compuestos de la invención contra LATS1 (CI5o de LATS1 en micromolar) en este ensayo se publican en la Tabla 1A. Cabe señalar que los compuestos con CI50 superiores a 1 micromolar se consideran inactivos en este ensayo.
La eficacia de inhibición de compuestos seleccionados contra LATS2 se sometió a ensayo mediante el Ensayo Caliper bioquímico de LATS2 como se describe en el Ejemplo A3 a continuación. La eficacia de inhibición de los compuestos de la invención contra LATS2 (CI50 de LATS2 en micromolar) en este ensayo también se publican en la Tabla 1A. Cabe señalar que los compuestos con CI50 superiores a 1 micromolar se consideran inactivos en este ensayo.
Inhibidores de LATS
En el presente documento se divulga un compuesto de Fórmula A2:
o una sal, o estereoisómero del mismo, en donde
X1 es CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula; y
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C i-6, haloalquilo C i-6, -NH2, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R3 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1.6;
(xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, a condición de que cuando X1 es CH, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetera-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0;
con la condición de que:
(1) cuando X1 es N, el anillo A es 4-primidinilo o 3-fluoro-4-primidinilo, R1 es H o metilo, R3 es H o Cl y R5 es H;
entonces R2 no es alquilo C2-4 que está sustituido con un sustituyente seleccionado de -NH2, alquilamino C1-6 o t-butil-carbamoil-amino y que está sustituido además opcionalmente con fenilo sin sustituir; y
(2) cuando X1 es N, el anillo A es indazol-5-ilo, R1, R3 y R5 son H; entonces R2 no es alquilo C4 que está sustituido con -NH2.
En los compuestos de la presente invención, X1 es CH.
A menos que se especifique otra cosa, la expresión "compuestos de la presente invención" se refiere a compuestos de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma en donde X1 es CH, o sales de los mismos, así como todos los estereoisómeros (incluyendo diastereoisómeros y enantiómeros), rotámeros, tautómeros y compuestos marcados isotópicamente (incluyendo sustituciones de deuterio), así como restos formados inherentemente.
En el presente documento se describen diversas realizaciones de la invención. Se reconocerá que las características especificadas en cada realización pueden combinarse con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invención. Cuando una realización se describe como que está "de acuerdo con" una realización anterior, la realización anterior incluye subrealizaciones de la misma,
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos que se seleccionan de N, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo de átomo de nitrógeno sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula; y
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2 y cicloalquilo C3-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona
de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de ciano, halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, NH2 y cicloalquilo C3-6;
o de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con alquilo C i-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona
de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y -NH2;
o es
que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona
de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de ciano, halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, NH2 y cicloalquilo C3-6;
o de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R1 se selecciona de hidrógeno, metilo y etilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R1 es metilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R1 es hidrógeno.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) ciano;
(ii) alquinilo C2;
(iii) haloalquilo C1-6;
(iv) -OR6, en donde R3 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(vi) -C(O)R8, en donde R8 es R0;
(vii) -S(O)2alquilo C1-6;
(viii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6 y R°;
(ix) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O y que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6; y (x) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y (c) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembro del anillo, un heteroátomo seleccionado de N y O y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) ciano;
(ii) alquinilo C2;
(iii) haloalquilo C1-6;
(iv) -OR6, en donde R3 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(vi) -C(O)R8, en donde R8 es R0;
(vii) -S(O)2alquilo C1-6;
(viii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6 y R°;
(ix) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O y que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6; y (x) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
y en donde el átomo de C del alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes (i) a (x) que es el punto de unión de R2 al resto de la molécula no es un grupo -CH2-;
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y (c) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembro del anillo, un heteroátomo seleccionado de N y O y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) ciano;
(ii) alquinilo C2;
(iii) haloalquilo C1-6;
(iv) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo o -C(O)H;
(v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)-alcoxi C1-6 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)OH; y
(vi) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; y
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo o -C(O)-alcoxi C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, I
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) haloalquilo C1-6;
(ii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; y
(iii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; y
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6 y -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con haloalquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -O-alquil C1-6-OH.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de haloalquilo C1-6, alquilamino C1-6, R0y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
en donde R2 es cicloalquilo C3-6 sin sustituir.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
en donde R2 es cicloalquilo C3-6 que está sustituido con alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de isopropilo, s-butilo, t-butilo, 2-metil-but-2-ilo, 2,4,4-trimetilpentan-2-ilo,
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de n-propilo, isopropilo, t-butilo,
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 se selecciona de n-propilo, isopropilo y /-butilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 es n-propilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, R2 es isopropilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, i R2 es t-butilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, X1 es CH; y
R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
X1 es CH; y
R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros que puede incluir, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, alquilo C1-4 y haloalquilo C1-4.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
x1 es CH; y
R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 6 miembros que puede incluir, como miembro del anillo, un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
x1 es CH; y
R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 6 miembros seleccionado de piperidinilo, piperazinilo y morfolinilo, en donde el piperidinilo, piperazinilo o morfolinilo está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo y alquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R3 se selecciona de hidrógeno, cloro y metilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R3 es hidrógeno.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R3 es cloro.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R3 es metilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R5 se selecciona de hidrógeno y cloro.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
R5 es hidrógeno.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
en donde el compuesto es de Fórmula A3:
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de halógeno, alquilo Ci-6, haloalquilo C1-6 y -NH2;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6 sin sustituir; y
R2 es
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 sustituyente seleccionado de
(i) haloalquilo C1-4 y
(ii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; o
(b) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6.
En los compuestos de la invención, X1 es CH.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A3 o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A3 o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula A3 o una sal del mismo,
R2 es n-propilo o terc-butilo que está sin sustituir o sustituido con trifluorometilo.
Un compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, puede seleccionarse de: N-(2-ciclopropMpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N,N-dietil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-etil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(4-metoxi-2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-butil-N-metil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-etil-N-metil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)etan-1-ol; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; N-etil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-cidohexNpropan-2-N)-2-(piridin-4-N)pindo[3,4-d]piniriidin-4-amina; N-(3-metiloxetan-3-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metNddopentN)-2-(piridin-4-il)pindo[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butan-2-ol; N-butN-2-(pindin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metN-4-femlbutan-2-N)-2-(piridin-4-N)pindo[3,4-d]piniriidin-4-aiTiina; N-cidopropil-2-(pindin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(4-metanosulfonil-2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propano-1,3-diol; 3-{[2-(pindin-4-N)pindo[3,4-d]pinmidin-4-il]amino}butan-2-ol; ácido 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)acético; (1R,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopentan-1-ol; 4,4,4-trifluoro-3-([2-(piridin-4-N)pindo[3,4-d]piniTiidin-4-il]amino}butan-1-ol; N-(l-metanosulfonil-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; ácido (2S)-3,3,3-trifluoro-2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propanoico; ácido 2-[(2-metil-2-([2-(piridin-4-N)pindo[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propil)amino]acético; ácido (2R)-3,3,3-tnfluoro-2-metN-2-([2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]piriiTiidin-4-il]amino}propanoico; 2-metil-2-([2-(piridin-4-N)pindo[3,4-d]piriiTiidin-4-N]aiTiino}propanoato de metilo; (1S,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopentan-1-oi; ácido 2-metil-2-([2-(pindin-4-N)pirido[3,4-d]piniTiidin-4-il]amino}propanoico; 2-(2-{[2-(piridin-4-il)pindo[3,4-d]piriiTiidin-4-N]aiTiino}etoxi)etan-1-ol; 2-(hidroximetN)-2-([2-(pindin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propano-1,3-diol; ácido 3-metN-3-(3-metN-3-([2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]piniTiidin-4-il]amino}butanamido)butanoico; 2-(piridin-4-N)-N-(1,1,1-trifluoro-3-fenilpropan-2-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-{[4-(dimetilamino)oxan-4-N]metN}-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; ácido 3-metN-3-{[2-(pindin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butanoico; N-(2-metanosulfoniletN)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-[2-(adamantan-1-N)propan-2-il]-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-N-[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]propanamida; ácido 4,4,4-trifluoro-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butanoico; N-[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]propano-2-sulfonamida; 2-(piridin-4-N)-N-[3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-N)propil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[1,1,1-trifluoropropan-2-N]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-2-(piridin-4-N)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metN-2-(piridin-4-N)-N-[(2R)-1,1,1-tnfluoropropan-2-N]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}pentan-2-ol; 4,4,4-tnfluoro-2,3-dimetN-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butan-2-ol; (l-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}cidopentil)metanol; N-(3-metoxicidobutil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (1R,2R)-1-N,2-N-dimetN-1-N-[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]cidohexano-1,2-diamina; (1s,3s)-3-{[2-(pindin-4-N)pirido[3,4-d]pinmidin-4-il]amino}cidobutano-1-carboxilato de metilo; 1-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}cidobutano-1-carboxilato de etilo; ácido 1-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}cidobutano-1-carboxílico; ácido (1s,3s)-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}cidobutano-1- carboxílico; 2-(pindin-4-N)-N-(1,1,1-tnfluoro-2-metNpropan-2-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metNcidobutN)-2-(pindin-4-il)pindo[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-metil-3-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butan-1-ol; 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)cidobutN]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilbutan-2-N)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(piridin-4-N)-N-[1-(trifluorometN)cidopropil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-cidopentN-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]piriiriidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}propan-1-ol; 3,3,3-trifluoro-2-metil-2-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propan-1-ol; N-(butan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilbut-3-in-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (1r,3s)-3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}cidobutan-1-ol; 2,3-dimetil-3-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butan-2-ol; 2-(piridin-4-il)-N-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(pentan-3-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-[2-metil-1-(morfolin-4-N)propan-2-N]-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-[1-(terc-butoxi)-2-metNpropan-2-N]-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4,4,4-trifluoro-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butan-1-ol; N-pentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butan-1-ol; N-[1-(1H-indol-3-il)-2-metilpropan-2-N]-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-[1-(4-fluorofeml)-2-irietNpropan-2-N]-2-(pindin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-fenilpropan-2-N)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-[2-(4-fluorofenil)propan-2-N]-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; ácido 3,3,3-trifluoro-2-metil-2-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}propanoico; 2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}etan-1-ol; N-metil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 1-({[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}metN)cidopentan-1-ol; N,N-dimetil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilfenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(4-metilfenN)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(4-metoxifenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-fenil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(3-metilfenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; ácido 6-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}hexanoico; N-(3-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; ácido 4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butanoico; N-(1-feniletN)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilcidopropN)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metN-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propil)carbamato de terc-butilo; (1-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}cidobutil)metanol; 2-(1-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}cidopropil)acetato de metilo; N-(2-metNpropN)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-metN-3-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butanonitrilo; N-(6-aminohexil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(4-aminobutil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}propanonitrilo; N-[2-metiM-(2-metNpipendin-1-N)propan-2-N]-2-(pindin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; dimetil(3-metN-3-[[2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-N]amino}butN)amina; N-(1-amino-2-metilpropan-2-N)-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-cidopentN-2-[3-(trifluoroirietN)-1H-pirazol-4-N]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4-[4-(terc-butilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il]piridin-2-amina; 2-[1-(bencenosulfoml)-2-irietiMH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-N]-N-terc-butilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-{2-metN-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-[3-(trifluorometN)-1H-pirazol-4-N]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-(3-cloropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butN-2-(3-metilpiridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3doropiridin-4-il)-N-(2-metilbutan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2,4-dimetil-4-({2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-il}amino)pentan-2-ol; N-etil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-1-[2-metil-2-({2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-il}amino)propoxi]propan-2-ol; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-etil-2-(3-metilpindin-4-il)-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-doropiridin-4-il)-N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4-{[2-(3-doropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}-2,4-dimetilpentan-2-ol; 2-(3-doropindin-4-il)-N-ddopentilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 1-(2-{[2-(3-doropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}-2-metilpropoxi)-2-metilpropan-2-ol; N-metil-2-(3-metilpiridin-4-il)-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-doropindin-4-il)-N-(4-metanosulfonil-2-metilbutan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-[3-(trifluorometil)piridin-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-[2-doro-5-(trifluorometil)piridin-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-doropiridin-4-il)-N-[3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-il)propil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilddopropil)pmdo[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-fluoropindin-4-il)-N-metil-N-[(2R)-1,1,1-tnfluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4-{4-[(1-metilciclopropil)amino]pirido[3,4-d]pirimidin-2-il}piridin-2-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2,4-dimetil-4-{[2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol; 4-{4-[(1-metilciclopropil)amino]pirido[3,4-d]pirimidin-2-il}piridina-3-carbonitrilo; 2-{2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}-N-propilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1H-indazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)-N-(1,1,1-tnfluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-( 1,1,1 -trifluoro-2-metilpropan-2-il)-2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4-{4-[(4-hidroxi-2,4-dimetilpentan-2-il)amino]pirido[3,4-d]pirimidin-2-il}piridina-3-carbonitrilo; 2-(3,5-difluoropiridin-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2,3-difluoropiridin-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(1,3-tiazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-[2-(trifluorometil)piridin-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4-{4-[(1-metilciclopropil)amino]pirido[3,4-d]pirimidin-2-il}piridina-2-carbonitrilo; N-(1-metilciclopropil)-2-(1,2-oxazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(dimetil-1,2-oxazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilddopropil)-2-{1H-pirrolo[2,3-b]pindin-4-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-{1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-{1H-pirrolo[3,2-b]piridin-1-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-metilpiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclobutil)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilddopropil)-2-(pirimidin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 4-{[2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}-2,4-dimetilpentan-2-ol; N-propil-2-{7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-propilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-ciclopropil-1H-pirazol-4-il)-N-propilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-metilpiridin-4-il)-N-propilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-{1-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}-N-propilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2,4-dimetil-4-{[2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-[(1R)-1-feniletil]-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(5-metil-1H-pirazol-4-il)-N-[(1R)-1-feniletil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-[(1R)-1-feniletil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-metil-1H-pirazol-5-ií)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-etil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(piridazin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(1,3-oxazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-pirazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1H-imidazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-metil-1H-imidazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-{1H-pirrolo[3,2-b]piridin-1-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-1,2,3-triazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-metil-1,2-oxazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(2H-1,2,3,4-tetrazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1H-pirazol-4-il)-N-[1-(piridin-4-il)etil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (1-{[2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclobutil)metanol; 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclobutil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (1-{[2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclobutil)metanol; 2-(1H-pirazol-4-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclopropil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclopropil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-[1-(piridin-4-il)etil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (1-{[2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclobutil)metanol; (1-{[2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopropil)metanol; 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-[1-(piridin-4-il)etil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-etil-1H-pirazol-4-il)-N-(2-metilpropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(1-amino-2-metilpropan-2-il)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 8-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 8-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-{[4-(terc-butilamino)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-5-il]amino}etoxi)etan-1-ol; N-(4-metoxi-2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[2-metil-1-(propan-2-iloxi)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[(2S)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[(2R)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butan-1-ol; N-terc-butil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2,2-dimetil-1-[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]piperidin-4-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1 ,7-naftiridin-4-il]amino}butil)amina; N,N-dietil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; N-propil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-{1H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il}-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(piridazin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(2-aminopiridin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina; N,N-dietil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; (3-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-3-metilbutil)dimetilamina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-(propan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(piperidin-1 -il)-1,7-naftiridina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(morfolin-4-il)-1,7-naftiridina; N-terc-butil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-(2-metilbutan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-2-metilpropan-1-ol; 1-[2-(3-doropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]-2,2-dimetilpiperidin-4-ol; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-[2-metiM-(morfolin-4-il)propan-2-il]-1,7-naftiridin-4-amina; 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 4-(piperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 4-(2-metilpiperidin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 2-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ddobutil)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-metil-N 1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,2-diamina; N-(oxetan-3-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 4-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 2,2-dimetil-4-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)morfolina; N-(1-metilddobutil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2,2-dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,3-diamina; N2,N2,2-trimetil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,2-diamina; 4-(2-metilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 2-metil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,3-diamina; (R)-2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)-1,7-naftiridina; N-(terc-butil)-N-metil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-(1-metilddobutil)-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N ^N^-trim etil-N 3-(2-(pirimidin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina; N1,N1,3-trimetil-N3-(2-(3-metiMH-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina; (2-metil-1-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propan-2-il)carbamato de ferc-butilo; (2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)etil)carbamato de ferc-butilo; 2-metil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina; N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)etano-1,2-diamina; N,N,2-trimetil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propanamida; N1,3-dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina; (2,2-dimetil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propil)carbamato de fercbutilo; 2,2-dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina; 3-metil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)butanamida; (R)-2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; 2,3-dimetil-N2-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-2,3-diamina; (S)-2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; 2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propanoato de etilo; N1,N1,2,2-tetrametil-N3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina; 4-(4-(terc-butilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)-1,2,5-oxadiazol-3-amina; N2,N2,2-trimethyl-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina; 2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propanamida; (S)-1,1,1-trifluoro-2-metil-3-((2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)amino)propan-2-ol; N-terc-butil-2-(3-doropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-doropiridin-4-il)-N,N-dietiM,7-naftiridin-4-amina; N-((1R,2S)-2-metilcidopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (S)-N-(sec-butil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-((1S,2R)-2-metilcidopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (R)-N-(secbutil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-((1S,2S)-2-metilddopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-((1R,2R)-2-metilcidopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; (3-metil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)butil)carbamato de ferc-butilo; N1,N1,N3,2,2-pentametil-N3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina; N1,N1-dietil-3-metil-N3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina; N3-(2-(2-fluoropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1„3-trimetilbutano-1,3-diamina; N3-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina; N1,N1,3-trimetil-N3-(2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina; N3-(2-(2-aminopiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina; y 3-metil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina.
Un compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, puede seleccionarse de: N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)cidobutil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)cidopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilddopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propan-1-ol; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-cidopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilcidopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)etan-1-ol; N-(1-metilcidopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; (1S,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}cidopentan-1-ol; N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)cidopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2R)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
Un compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo, puede seleccionarse de: N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
Un compuesto de Fórmula A2, o una sal del mismo,
es N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina.
La invención proporciona un compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil Ci_6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo Ci_a;
(xi) cicloalquilo C3-a monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-a, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-a y di-(alquil C ^am ino ;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-a;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-a y R°;
(d) cicloalquilo C3-a que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-a, R0, alquilamino C1-a, di-(alquil C ^am ino , -C(O)R0 y alquilo C1-a que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-a, R0, alquilamino C1-a, di-(alquil C ^am ino , -C(O)R0 y alquilo C1-a que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; o
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a a miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a a miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-a, haloalquilo C1-a y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-a; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el heteroalquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0
En algunas realizaciones del compuesto de fórmula II o una sal del mismo,
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o a miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos que se seleccionan de N, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo de átomo de nitrógeno sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de a miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C i-6, haloalquilo C i-6, -NH2 y cicloalquilo C3-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona
de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de ciano, halógeno, alquilo C i-6, haloalquilo C i-6, NH2 y cicloalquilo C3-6;
o de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona
de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y -NH2;
o es
que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A se selecciona de
el anillo A se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, el anillo A se selecciona
de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de ciano, halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, NH2 y cicloalquilo C3-6;
o de
cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 se selecciona de hidrógeno, metilo y etilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 es metilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 es hidrógeno.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) ciano;
(ii) alquinilo C2;
(iii) haloalquilo C1-6;
(iv) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(vi) -C(O)R8, en donde R8 es R0;
(vii) -S(O)2alquilo C1-6;
(viii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6 y R°;
(ix) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O y que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6; y (x) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y (c) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembro del anillo, un heteroátomo seleccionado de N y O y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) ciano;
(ii) alquinilo C2;
(iii) haloalquilo C1-6;
(iv) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(vi) -C(O)R8, en donde R8 es R0;
(vii) -S(O)2alquilo C1.6;
(viii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1.6 y R°;
(ix) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O y que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6; y (x) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
en donde el átomo de C del alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes (i) a (x) que es el punto de unión de R2 al resto de la molécula no es un grupo -CH2-;
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y (c) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembro del anillo, un heteroátomo seleccionado de N y O y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) ciano;
(ii) alquinilo C2;
(iii) haloalquilo C1-6;
(iv) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo o -C(O)H;
(v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)-alcoxi C1-6 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)OH; y
(vi) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con un hidroxilo; y
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C i-6, R0, alquilamino C i-6 y alquilo C i-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo o -C(O)-alcoxi C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de (i) haloalquilo C1-6;
(ii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; y
(iii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; y
(b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6 y -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con haloalquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -O-alquil C1-6-OH.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, de acuerdo con uno cualquiera de R2 es cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de haloalquilo C1-6, alquilamino C1-6, R0y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es cicloalquilo C3-6 sin sustituir.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es cicloalquilo C3-6 que está sustituido con alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de n-propilo, isopropilo, s-butilo, t-butilo, 2-metil-but-2-ilo, 2,4,4-trimetilpentan-2-ilo,
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de n-propilo, isopropilo, t-butilo,
1 En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es
1. 1 En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 se selecciona de n-propilo, isopropilo y t-butilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es n-propilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es isopropilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R2 es t-butilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros que puede incluir, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, alquilo C1-4 y haloalquilo C1-4.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 6 miembros que puede incluir, como miembro del anillo, un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 6 miembros seleccionado de piperidinilo, piperazinilo y morfolinilo, en donde el piperidinilo, piperazinilo o morfolinilo está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo y alquilo C1-6.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R3 se selecciona de hidrógeno, cloro y metilo.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R3 es hidrógeno.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R5 se selecciona de hidrógeno y cloro.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
R5 es hidrógeno.
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
el compuesto es de Fórmula VI:
cada uno sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y -NH2;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6 sin sustituir; y
R2 es
(a) alquilo C i-8 que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado de
(i) di-alquilamino C1-6;
(ii) haloalquilo C1-6;
(iii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R°; o (b) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el nitrógeno al que están unidos para formar un heterocicloalquilo de 6 miembros, que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituidos seleccionados de alquilo C1-6 e hidroxilo. En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula IV o una sal del mismo,
A es
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula IV o una sal del mismo,
R2 se selecciona de etilo,
En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula IV o una sal del mismo,
R2 es terc-butilo.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo, se
selecciona de: N-(4-metoxi-2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[2-metil-1-(propan-2-iloxi)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[(2S)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[(2R)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butan-1-ol; N-tercbutil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2,2-dimetil-1-[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]piperidin-4-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butil)amina; N,N-dietil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; N-propil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-{1H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il}-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(piridazin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(2-aminopiridin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina; N,N-dietil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; (3-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-3-metilbutil)dimetilamina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-(propan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(piperidin-1-il)-1,7-naftiridina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(morfolin-4-il)-1,7-naftiridina; N-terc-butil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-(2-metilbutan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-2-metilpropan-1-ol; 1-[2-(3-cloropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]-2,2-dimetilpiperidin-4-ol; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-[2-metil-1-(morfolin-4-il)propan-2-il]1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-M)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)cidobutil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-terc-butil-2-(3-cloropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y 2-(3-doropiridin-4-il)-N,N-dietil-1,7-naftiridin-4-amina.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula II, o una sal del mismo,
es N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
para su uso en enfermedades o trastornos oculares, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C i-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1-6;
(xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
El compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo, para su uso en enfermedades o trastornos oculares, puede ser un compuesto de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
Los compuestos de la invención son de Formula II como se divulga en el presente documento.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo, para su uso en enfermedades o trastornos oculares, en donde el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1 -il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo, para su uso en enfermedades o trastornos oculares, en donde el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
En un método de generación de una población expandida de células madre del limbo, preferentementeex vivo,en donde X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula; en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C i-6, haloalquilo C i-6, -NH2, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, cicloalquilo C3-6y fenilsulfonilo; R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1-6;
(xi) cicloalquilo C3.6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
en un método de generación de una población expandida de células endoteliales corneales, preferentementeex vivo,en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C i -6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo Ci-6;
(xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos del uso de un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo,
el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos del uso de un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo,
el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; y 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina.
En algunos ejemplos del uso de un compuesto de Fórmula Al, o una sal del mismo,
el compuesto se selecciona de: N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1 -trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclobutil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propan-1-ol; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilciclopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)etan-1-ol; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; (1S,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopentan-1 -ol; N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2R)-1,1,1 -trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos del uso de un compuesto de Fórmula Al, o una sal del mismo,
el compuesto se selecciona de: N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos del uso de un compuesto de Fórmula Al, o una sal del mismo,
el compuesto es N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina.
En algunos ejemplos del uso de un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo,
el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población celular, en donde la población celular se ha cultivado en presencia de un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1.6;
(xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C i-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En el presente documento también se divulga el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población de células madre del limbo, en donde dicha población se ha cultivado en presencia de un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi Ci-a;
R1 es hidrógeno o alquilo Ci-a;
R2 se selecciona de
(a) alquilo Ci-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-a;
(vii) -ORa, en donde Ra se selecciona de hidrógeno, alquilo Ci-a que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo Ci-a y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo Ci-a que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil Ci-a-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo Ci-a;
(xi) cicloalquilo C3-a monocíclico o cicloalquilo C7-i0 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Cia, hidroxi-alquilo Ci-a, haloalquilo Ci-a, R0, -NH2, alquilamino Ci-a y di-(alquil Ci-a)amino;
(xii) heterocicloalquilo de a miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo Ci-a, alquilamino Ci-a y di-(alquil Ci-a)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o a miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o i0 miembros que comprende, como miembro del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo Ci-a;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci-a y R°;
(d) cicloalquilo C3-a que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-a, R0, alquilamino Ci-a, di-(alquil Ci-a)amino, -C(O)R0 y alquilo Cia que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-a, R0, alquilamino Ci-a, di-(alquil Ci-a)amino, -C(O)R0 y alquilo Cia que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a a miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos a0
adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-s de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En el presente documento también se divulga el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población de células endoteliales corneales, en donde la población se ha cultivado en presencia de un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1.6;
(xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1.6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R°;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0
En algunos ejemplos de un tratamiento de este tipo de una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un tratamiento de este tipo de una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina. En algunos ejemplos de un tratamiento de este tipo de una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto se selecciona de: N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclobutil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propan-1-ol; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilciclopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)etan-1-ol; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; (1S,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopentan-1 -ol; N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2R)-1,1,1 -trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos de un tratamiento de este tipo de una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto se selecciona de: N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos de un tratamiento de este tipo de una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto es N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina.
En algunos ejemplos de un método para promover la proliferación celular
el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal del mismo,
en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
(i) halógeno;
(ii) ciano;
(iii) oxo;
(iv) alquenilo C2;
(v) alquinilo C2;
(vi) haloalquilo C1-6;
(vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
(viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
(ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C-,.6-C(O)R0;
(x) -S(O)2alquilo C1-6;
(xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
(xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
(xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
(xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C i-6, R0, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C i-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular, el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; y 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula Al, o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto se selecciona de: N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1 -trifluoropropan-2-M)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclobutil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1 -(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propan-1-ol; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(2-metilciclopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)etan-1-ol; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; (1S,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopentan-1 -ol; N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina; 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2R)-1,1,1 -trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula Al, o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto se selecciona de: N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula Al, o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular
el compuesto es N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A1 o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para una enfermedad o trastorno ocular el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para su uso para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil Ci-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-6;
-OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1.6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
-S(O)2alquilo C1.6;
cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquil C1-6)amino; heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C ^am ino , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C i-6, R0, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C i-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetera-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado
el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado
el compuesto se selecciona de:
2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol;
dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butil)amina;
N-(1-amino-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-(terc-butil)-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina;
N1,N1,3-tr¡met¡l-W3-(2-(3-met¡l-1H-p¡razol-4-¡l)p¡r¡do[3,4-cf]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)butano-1,3-d¡am¡na;
N1,N1,3-tr¡met¡l-W3-(2-(3-met¡l-1H-p¡razol-4-¡l)p¡r¡do[3,4-cf]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)butano-1,3-d¡am¡na;
2.2- dimetil-^1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
2.3- d¡met¡l-N2-(2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡do[3,4-cf]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)butano-2,3-d¡am¡na;
N1,N1,2,2-tetramet¡l-N3-(2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡do[3,4-cf]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)propano-1,3-d¡am¡na;
4-(4-(terc-but¡lam¡no)p¡r¡do[3,4-cf]p¡r¡m¡d¡n-2-¡l)-1,2,5-oxad¡azol-3-am¡na; y N2,N2,2-trimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina.
En algunos ejemplos de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado
el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para promover la regeneración del hígado y el recrecimiento del hígado, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, d¡-(alqu¡l C1-6)am¡no, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-6;
-OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
-S(O)2alquilo C1-6;
cicloalquilo C3.6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino; heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C ^am ino , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetera-alquilo C3-s de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de dicho uso de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado
el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de dicho uso de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado
el compuesto se selecciona de:
2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol;
dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butil)amina;
N-(1-amino-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-(terc-butil)-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina;
N1,N1,3-trimetil-W3-(2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina;
N1,N1,3-trimetil-W3-(2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina;
2.2- dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
2.3- dimetil-N2-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-2,3-diamina;
N1,N1,2,2-tetrametil-W3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
4-(4-(terc-butilamino)pirido[3,4-cf]pirimidin-2-il)-1,2,5-oxadiazol-3-amina; y
N2,W2,2-trimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina.
En algunos ejemplos de dicho uso de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado
el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo Ci-a;
-OR6, en donde Ra se selecciona de hidrógeno, alquilo Ci-a que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo Ci-a y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo Ci-a que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil Ci-a-C(O)R0;
-S(O)2alquilo Ci-a;
cicloalquilo C3-a monocíclico o cicloalquilo C7-i0 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Cia, hidroxi-alquilo Ci-a, haloalquilo Ci-a, R0, -NH2, alquilamino Ci-a y di-(alquil Ci-a)amino; heterocicloalquilo de a miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo Ci-a, alquilamino Ci-a y di-(alquil Ci-a)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o a miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o i0 miembros que comprende, como miembro del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo Ci-a;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci-a y R°;
(d) cicloalquilo C3-a que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-a, R0, alquilamino Ci-a, di-(alquil Ci-a)amino, -C(O)R0 y alquilo Cia que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-a, R0, alquilamino Ci-a, di-(alquil Ci-a)amino, -C(O)R0 y alquilo Cia que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, Ri y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a a miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a a miembros formado por Ri y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con i a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci-a, haloalquilo Ci-a y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo Ci-a; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de i a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0
En algunos ejemplos de un método de este tipo para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un método de este tipo para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado el compuesto se selecciona de:
2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol;
dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butil)amina;
N-(1-amino-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-(terc-butil)-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina;
N1,N1,3-trimetil-W3-(2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina;
N1,N1,3-trimetil-W3-(2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina;
2.2- dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
2.3- dimetil-N2-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-2,3-diamina;
N1,N1,2,2-tetrametil-W3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
4-(4-(terc-butilamino)pirido[3,4-cf]pirimidin-2-il)-1,2,5-oxadiazol-3-amina; y
W2,W2,2-trimetil-N1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina.
En algunos ejemplos de un método de este tipo para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la fabricación de un medicamento para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado,
en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-6;
-OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
-S(O)2alquilo C1-6;
cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7.10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino; heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-5;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de dicho uso de un compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de dicho uso de un compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, el compuesto se selecciona de:
2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol;
dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butil)amina;
N-(1-amino-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
8-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-(terc-butil)-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina;
2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina;
W1,W1,3-tr¡met¡l-W3-(2-(3-met¡MH-p¡razol-4-¡l)p¡r¡do[3,4-d]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)butano-1,3-d¡amina;
N1,W1,3-trimetil-W3-(2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina;
2.2- dimetil-W1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
2.3- dimetil-W2-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-2,3-diamina;
W1,W1,2,2-tetrametil-W3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina;
4-(4-(terc-butilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)-1,2,5-oxadiazol-3-amina; y W2,W2,2-trimetil-W1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina.
En algunos ejemplos de dicho uso de un compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento también se divulga un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica para su uso como medicamento.
En el presente documento también se divulga una composición farmacéutica para su uso para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado solo, u opcionalmente en combinación con otro compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o al menos otro tipo de agente terapéutico.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas<l>A<t>S; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización preferida, el agente es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga un método para expandir una población de células hepáticasex vivoque comprende poner en contacto las células hepáticas con un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente. En un ejemplo preferido, el método comprende además la edición génica de dichas células hepáticas. Preferentemente, dicha edición génica se dirige a un gen implicado en la respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto.
En el presente documento también se divulga un método para expandir una población de células hepáticas progenitorasex vivoque comprende poner en contacto las células hepáticas progenitoras con un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente. En un ejemplo preferido, el método comprende además la edición génica de dichas células hepáticas progenitoras. Preferentemente, dicha edición génica se dirige a un gen implicado en la respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto.
En el presente documento también se divulga una población de células hepáticas obtenidas poniendo en contacto células hepáticas con un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente. En un ejemplo preferido, las células hepáticas obtenidas poniendo en contacto células hepáticas con un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente se han editado génicamente. Preferentemente, dicha edición génica se dirige a un gen implicado en la respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto.
En el presente documento también se divulga una población de células hepáticas progenitoras obtenidas poniendo en contacto células hepáticas progenitoras con un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente. En un ejemplo preferido, las células hepáticas progenitoras obtenidas poniendo en contacto células hepáticas progenitoras con un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente se han editado génicamente. Preferentemente, dicha edición génica se dirige a un gen implicado en la respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para su uso para promover la cicatrización de heridas, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-6;
-OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
-S(O)2alquilo C1-6;
cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-i0 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino; heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6y di-(alquil C1-6)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-5;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de dicho compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso para promover la cicatrización de heridas, el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un compuesto de este tipo de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso para promover la cicatrización de heridas, el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1 -(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1 -il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina.
En algunos ejemplos de dicho compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso para promover la cicatrización de heridas de acuerdo con la realización 215, en donde el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para promover la cicatrización de heridas, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C i-6, haloalquilo C i-6, -NH2, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-6;
-OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
-S(O)2alquilo C1-6;
cicloalquilo C3.6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino; heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C ^am ino , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil e x a m in o , -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para promover la cicatrización de heridas, el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para promover la cicatrización de heridas, el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1 -(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; y 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para promover la cicatrización de heridas, el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi Ci-a;
R1 es hidrógeno o alquilo Ci-a;
R2 se selecciona de
(a) alquilo Ci-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-a;
-ORa, en donde Ra se selecciona de hidrógeno, alquilo Ci-a que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo Ci-a y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo Ci-a que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil Ci-a-C(O)R0;
-S(O)2alquilo Ci-a;
cicloalquilo C3-a monocíclico o cicloalquilo C7-i0 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Cia, hidroxi-alquilo Ci-a, haloalquilo Ci-a, R0, -NH2, alquilamino Ci-a y di-(alquil Ci-a)amino; heterocicloalquilo de a miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo Ci-a, alquilamino Ci-a y di-(alquil Ci-a)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o a miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o i0 miembros que comprende, como miembro del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo Ci-a;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci-a y R°;
(d) cicloalquilo C3-a que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-a, R0, alquilamino Ci-a, di-(alquil Ci-a)amino, -C(O)R0 y alquilo Cia que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con i a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-a, R0, alquilamino Ci-a, di-(alquil Ci-a)amino, -C(O)R0 y alquilo Cia que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a a miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de i a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a a miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetera-alquilo C3-s de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de un método de este tipo para promover la cicatrización de heridas,
el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un método de este tipo para promover la cicatrización de heridas
el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(1 -metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina; N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; y N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina. En algunos ejemplos de un método de este tipo para promover la cicatrización de heridas
el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas, en donde
X1 y X2 son cada uno independientemente CH o N;
el Anillo A es
(a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o
(b) un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona de
en donde "*" representa el punto de urnon del anillo A al resto de la molécula;
en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -NH2, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo;
R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6;
R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;
R2 se selecciona de
(a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de
halógeno;
ciano;
oxo;
alquenilo C2;
alquinilo C2;
haloalquilo C1-6;
-OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
-NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1.6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0;
-C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0;
-S(O)2alquilo C1.6;
cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, R0, -NH2, alquilamino C1.6 y di-(alquil C1-6)amino; heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino;
fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno;
heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y
heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O;
(b) -S(O)2alquilo C1-6;
(c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C i-6 y R°;
(d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C i-6, R0, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C i-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y
(e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo Ci-6, R0, alquilamino Ci-6, di-(alquil Ci-6)amino, -C(O)R0 y alquilo Ci-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0;
o R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y R0;
R3 se selecciona de hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y
R5 se selecciona de hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A i o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas
el compuesto es de la fórmula seleccionada de las Fórmulas I a IV:
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A i o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas
el compuesto se selecciona de 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina; N-(i-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina; y 2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirimidina.
En algunos ejemplos de un uso de este tipo de un compuesto de Fórmula A i o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas
el compuesto es un compuesto de Fórmula A2 o Fórmula II como se describió anteriormente.
En el presente documento también se divulga una composición que comprende al menos uno de los compuestos de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En el presente documento también se divulga una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica para su uso como medicamento.
En el presente documento también se divulga una composición farmacéutica para su uso para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado solo, u opcionalmente en combinación con otro compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o al menos otro tipo de agente terapéutico.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis.
En el presente documento también se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga una composición farmacéutica para su uso para promover la cicatrización de heridas, que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas solo, u opcionalmente en combinación con otro compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o al menos otro tipo de agente terapéutico.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas que comprende tratar o mejorar la sintomatología de quemaduras, úlceras cutáneas agudas y crónicas, en donde las úlceras cutáneas incluyen, pero sin limitación, úlceras vasculares, úlceras diabéticas y úlceras por presión.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población celular, en donde la población ha crecido en presencia de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo.
En el presente documento también se divulga un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población de células madre del limbo, en donde la población ha crecido en presencia de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo.
En el presente documento también se divulga un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una población de células endoteliales corneales, en donde la población ha crecido en presencia de un agente capaz de inhibir la actividad de las cinasas LATS1 y LATS2; induciendo de este modo la translocación de YAP e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación celular. En una realización adicional, el agente es un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En el presente documento también se divulga un método para promover la cicatrización de heridas oculares que comprende administrar a un ojo de un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención. En una realización, la herida ocular es una herida corneal. En otras realizaciones, la herida ocular es una lesión o herida quirúrgica.
DEFINICIONES
Los términos y las expresiones generales utilizadas anteriormente en el presente documento y en lo sucesivo en el presente documento tienen preferentemente, dentro del contexto de la presente invención, los siguientes significados, a menos que se indique otra cosa, donde términos y expresiones más generales dondequiera que se usen pueden, independientemente entre sí, reemplazarse por definiciones más específicas o permanecer, definiendo de este modo realizaciones más detalladas de la invención.
Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en el presente documento tiene por objeto únicamente ilustrar mejor la invención y no supone ninguna limitación del alcance de la invención por lo demás reivindicada.
Se debe interpretar que los términos "un", "una", "el", "la" y términos similares utilizados en el contexto de la presente invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) cubren tanto el singular como el plural a menos que se indique otra cosa en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.
Como se usa en el presente documento, la expresión "alquilo C W se refiere a un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificado que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene ninguna insaturación, que tiene de uno a ocho átomos de carbono y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo. La expresión "alcoxi C-m " se debe interpretar en consecuencia. Como se usa en el presente documento, la expresión "n-alquilo" se refiere a un radical alquilo de cadena lineal (no ramificado) como se define en el presente documento. Los ejemplos de alquilo C1-8 incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, W-propilo, 1 -metiletilo (/so-propilo), W-butilo, W-pentilo, 1,1 -dimetiletilo (í-butilo), -C(CHa)2CH2CH(CHa)2 y -C(CH3)2CH3.
Como se usa en el presente documento, la expresión "alquenilo C2-6" se refiere a un grupo radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificado que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un doble enlace, que tiene de dos a seis átomos de carbono, que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo. La expresión "alquenilo C2-4" debe interpretarse en consecuencia. Los ejemplos de alquenilo C2-6 incluyen, pero sin limitación, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo, pent-1-enilo, pent-4-enilo y penta-1,4-dienilo.
El término "alquileno" se refiere a un grupo alquilo divalente. Por ejemplo, la expresión "alquileno C1-6" o "alquileno C1 a C6" se refiere a un grupo alifático divalente, lineal o ramificado, que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos de alquileno incluyen, pero sin limitación, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), n-propileno (-CH2CH2CH2-), isopropileno (-CH(CH3)CH2-), n-butileno, sec-butileno, isobutileno, terc-butileno, n-pentileno, isopentileno, neopentileno y n-hexileno.
Como se usa en el presente documento, la expresión "alquinilo (C2-6)" se refiere a un grupo radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificado que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace, que tiene de dos a seis átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo. La expresión "alquinilo C2-4" debe interpretarse en consecuencia. Los ejemplos de alquinilo C2-6 incluyen, pero sin limitación, etinilo, prop-1-inilo, but-1-inilo, pent-1-inilo, pent-4-inilo y penta-1,4-diínilo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "alcoxi C1-6" se refiere a un radical de fórmula -ORa, donde Ra es un radical alquilo C1-6 como se definió en general anteriormente. "alcoxi C1-6" o "alcoxi C1 a C6" pretende incluir grupos alcoxi Ci, C2, C3, C4, C5 y C6 (es decir, de 1 a 6 carbonos en la cadena de alquilo). Los ejemplos de alcoxi C1-6 incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, pentoxi y hexoxi.
Como se usa en la presente, la expresión "alquilamino Ci-e' se refiere a un radical de fórmula -NH-Ra, donde Ra es un radical alquilo C1-4 como se ha definido anteriormente.
Como se usa en la presente, la expresión "di-(alquil C ^am ino " se refiere a un radical de fórmula -N(Ra)-Ra, donde cada Ra es un radical alquilo C1-4, que puede ser igual o diferente, como se ha definido anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término "ciano" significa el radical *-CeN.
El término "cicloalquilo" se refiere a un anillo carbocíclico no aromático que es un anillo totalmente hidrogenado, incluyendo los sistemas de anillo mono, bi o policíclicos. "Cicloalquilo C3-10" o "cicloalquilo C3 a C10" pretende incluir grupos cicloalquilo C3, C4, C5, Ce, C7, C8, Cg y C10 que tienen de 3 a 10 miembros del anillo de carbono). Los grupos cicloalquilo de ejemplo incluyen, pero sin limitación ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y norbornilo.
"Anillo condensado", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de anillos múltiples en donde los anillos que comprenden el conjunto de anillos están unidos de manera que los átomos del anillo que son comunes a dos anillos están directamente unidos entre sí. Los conjuntos de anillos condensados pueden estar saturados, parcialmente saturados, pueden ser aromáticos, carbocíclicos, heterocíclicos y similares. Los ejemplos no exclusivos de anillos condensados comunes incluyen decalina, naftaleno, antraceno, fenantreno, indol, benzofurano, purina, quinolina y similares.
"Halógeno" se refiere a bromo, cloro, fluoro o yodo; preferentemente fluoro, cloro o bromo.
Como se usa en el presente documento, se pretende que el término "haloalquilo" incluya grupos alquilo saturados de cadena lineal y ramificada como se definió anteriormente que tienen el número especificado de átomos de carbono, sustituidos con uno o más halógenos. Por ejemplo, "haloalquilo C1-6" o "haloalquilo C1 a Ce" pretende incluir cadena de alquilo C1 , C2, C3, C4, C5 y Ce. Los ejemplos de haloalquilo incluyen, pero sin limitación, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, pentacloroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 1,3-dibromopropan-2-ilo, 3-bromo-2-fluoropropilo y 1,4,4-trifluorobutan-2-ilo, heptafluoropropilo y heptacloropropilo.
"Heteroalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un alquilo, como se define en el presente documento, donde uno o más de los átomos de carbono dentro de la cadena de alquilo se reemplazan por heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S. En heteroalquilo Cx-y o heteroalquilo de miembros x a y, como se usa en el presente documento, x-y describe el número de átomos de la cadena (carbono y heteroátomos) en el heteroalquilo. Por ejemplo, heteroalquilo C3-8se refiere a una cadena de alquilo con 3 a 8 átomos de la cadena. Además, heteroalquilo como se define en el presente documento, el átomo que une el radical al resto de la molécula debe ser un carbono. Los ejemplos representativos de heteroalquilo de 3 a 8 miembros incluyen, pero sin limitación, -(CH2P C H 3, -(CH2)2OCH(CH3)2, -(c H2)2-O-(CH2)2-OH y -(CH2)2-(O-(CH2)2)2-OH.
El término "heteroarilo" se refiere a restos aromáticos que contienen al menos un heteroátomo (por ejemplo, oxígeno, azufre, nitrógeno o combinaciones de los mismos) dentro de un sistema de anillo aromático de 5 a 10 miembros. Los Ejemplos de heteroarilo incluyen, pero sin limitación, pirrolilo, piridilo, pirazolilo, indolilo, indazolilo, tienilo, furanilo, benzofuranilo, oxazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, triazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, tiazolilo, purinilo, bencimidazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinoxalinilo, benzopiranilo, benzotiofenilo, benzoimidazolilo, benzoxazolilo y 1H-benzo[d][1,2,3]triazolilo. El resto heteroaromático puede consistir en un sistema de anillo único o condensado. Un anillo de heteroarilo único típico es un anillo de 5 a 6 miembros que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S y un sistema de anillo de heteroarilo condensado típico es un sistema de anillo de 9 a 10 miembros que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S. El sistema de anillo de heteroarilo condensado puede consistir en dos anillos de heteroarilo condensados entre sí o un heteroarilo condensado con un arilo (por ejemplo, fenilo).
Como se usa en el presente documento, el término "heteroátomos" se refiere a átomos de nitrógeno (N), oxígeno (O) o azufre (S). A menos que se indique otra cosa, se supone que cualquier heteroátomo con valencias insatisfechas tiene suficientes átomos de hidrógeno para satisfacer las valencias, y cuando el heteroátomo es azufre, puede estar sin oxidar (S) u oxidado a S(O) o S(O)2.
El término "hidroxilo" o "hidroxi", como se usa en el presente documento, se refiere al radical -OH.
"Heterocicloalquilo" significa cicloalquilo, como se define en la presente solicitud, a condición de que uno o más de los carbonos de anillo indicados estén reemplazados por un resto seleccionado de -O-, -N=, -NH-, -S-, -S(O )- y -S(O)2-. Los ejemplos de heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros incluyen, pero sin limitación, oxiranilo, aziridinilo, azetidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, 1,1 -dióxido de tetrahidrotienilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, pirrolidinilo, pirrolidinil-2-ona, morfolinilo, piperazinilo, piperidinilo, pirazolidinilo, hexahidropirimidinilo, 1,4-dioxa-8-azaespiro[4.5]dec-8-ilo, tiomorfolinilo, sulfanomorfolinilo, sulfonomorfolinilo y octahidropirrolo[3,2-b]pirrolilo.
El término "oxo", como se usa en el presente documento, se refiere al radical divalente =O.
Como se menciona en el presente documento, el término "sustituido" significa que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un grupo que no es hidrógeno, con la condición de que se mantengan las valencias normales y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. Cuando un sustituyente es oxo (es decir, =O), entonces se reemplazan 2 hidrógenos en el átomo. En los casos en donde hay átomos de nitrógeno (por ejemplo, aminas) presentes en los compuestos de la presente invención, estos pueden convertirse en N-óxidos mediante tratamiento con un agente oxidante (por ejemplo, mCPBA y/o peróxidos de hidrógeno) para proporcionar otros compuestos de la invención.
Como se usa en el presente documento, la expresión "nitrógeno sin sustituir" se refiere a un átomo del anillo de nitrógeno que no tiene capacidad de sustitución debido a su enlace a sus átomos de anillo adyacentes mediante un doble enlace y un enlace sencillo (-N=). Por ejemplo, el nitrógeno en la posiciónparadel 4-piridilo
es un nitrógeno "sin sustituir", y el nitrógeno en la posición 4, en referencia al átomo del anillo de C de unión, del 1H-pirazol-4-ilo,
es un nitrógeno "sin sustituir".
Como un experto en la técnica será capaz de entender, por ejemplo, un grupo cetona (-CH-C(=O)-) en una molécula puede tautomerizar en su forma enol (-C=C(OH)-). Por lo tanto, se pretende que la presente invención cubra todos los posibles tautómeros incluso cuando una estructura represente solo uno de ellos.
Como se usa en el presente documento,
" y "
x -V
" son símbolos que indican el punto de unión de X a otra parte de la molécula.
Cuando cualquier variable aparezca más de una vez en cualquier constituyente o fórmula para un compuesto, su definición en cada aparición es independiente de su definición en cada una de las otras apariciones. Por lo tanto, por ejemplo, si se muestra que un grupo está sustituido con 0-3 grupos R, entonces dicho grupo puede estar sin sustituir o sustituido con hasta tres grupos R, y en cada aparición R se selecciona independientemente de la definición de R.
A menos que se especifique otra cosa, la expresión "compuesto de la presente invención" o "compuestos de la presente invención" se refiere a compuestos de Formula II y subfórmulas de la misma, como se definen en las reivindicaciones, así como a isómeros, tales como estereoisómeros (incluyendo diastereoisómeros, enantiómeros y racematos), isómeros geométricos, isómeros conformacionales (incluyendo rotámeros y atropisómeros), tautómeros, compuestos marcados isotópicamente (incluyendo sustituciones de deuterio) y restos formados inherentemente (por ejemplo, polimorfos, solvatos y/o hidratos). Cuando hay presente un resto que es capaz de formar una sal, entonces se incluyen también las sales, en particular sales farmacéuticamente aceptables.
Los expertos en la técnica reconocerán que los compuestos de la presente invención pueden contener centros quirales y como tales pueden existir en diferentes formas isoméricas.
Los "enantiómeros" son un par de estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una mezcla 1:1 de un par de enantiómeros es una mezcla "racémica". El término se usa para designar una mezcla racémica cuando sea adecuado. Cuando se designa la estereoquímica de los compuestos de la presente invención, un único estereoisómero con una configuración relativa y absoluta de los dos centros quirales conocida se designa usando el sistema RS convencional (por ejemplo, (1S,2S)); un único estereoisómero con configuración relativa conocida pero configuración absoluta desconocida se designa con estrellas (por ejemplo, (1R*,2R*)); y un racemato con dos letras (por ejemplo, (1RS,2RS) como una mezcla racémica de (1R,2R) y (lS,2S); (1RS,2SR) como una mezcla racémica de (1R,2<s>) y (1S,2R)). Los "diastereoisómeros" son estereoisómeros que tienen al menos dos átomos asimétricos, pero que no son imágenes especulares entre sí. La estereoquímica absoluta se especifica de acuerdo con el sistema R-S de Cahn-Ingold-Prelog. Cuando un compuesto es un enantiómero puro, la estereoquímica en cada uno de los carbonos quirales se puede especificar ya sea como R o S. Los compuestos resueltos, cuya configuración absoluta es desconocida, pueden designarse (+) o (-) dependiendo de la dirección (dextrógira o levógira) en la que desvían el plano de luz polarizada a la longitud de onda de la línea D del sodio. Como alternativa, los compuestos resueltos pueden estar definidos por los tiempos de retención respectivos para los correspondientes enantiómeros/diastereoisómeros a través de HPLC quiral.
Algunos de los compuestos descritos en la presente contienen uno o más centros o ejes asimétricos y, por lo tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de su estereoquímica absoluta, como (R) o (S).
Los isómeros geométricos pueden ocurrir cuando un compuesto contiene un doble enlace o alguna otra característica que da a la molécula una cierta cantidad de rigidez estructural. Si el compuesto contiene un doble enlace, el sustituyente puede tener la configuración E o Z. Si el compuesto contiene un cicloalquilo disustituido, el sustituyente cicloalquilo puede tener una configuracióncisotrans.
Los isómeros conformacionales (o confórmeros) son isómeros que pueden diferir por rotaciones alrededor de uno o más enlaces. Los rotámeros con confórmeros que difieren en la rotación alrededor de únicamente un enlace sencillo.
El término "atropisómero" se refiere a un isómero estructural basado en la quiralidad axial o plana resultante de la rotación restringida en la molécula.
A menos que se especifique otra cosa, se pretende que la presente invención incluya todos estos posibles isómeros, incluidas mezclas racémicas, formas ópticamente puras y mezclas intermedias. Los isómeros con actividad óptica (R) y (S) pueden prepararse usando sintones quirales o reactivos quirales, o pueden resolverse usando técnicas convencionales (por ejemplo, separar en columnas de cromatografía quiral de SFC o HPLC, tales como CHIRALPAK® y CHIRALCEL® que se pueden adquirir de DAICEL Corp. usando el disolvente o mezcla de disolventes adecuados para conseguir una buena separación).
Los compuestos de la presente se pueden aislar en formas racémicas o con actividad óptica. Las formas con actividad óptica se pueden preparar mediante la resolución de formas racémicas o mediante síntesis a partir de materiales de partida con actividad óptica. Todos los procedimientos utilizados para preparar los compuestos de la presente invención y los compuestos intermedios preparados en ella se considera que son parte de la presente invención. Cuando se preparan productos enantioméricos o diastereoméricos, estos se pueden separar mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía o cristalización fraccionada.
Como se usa en el presente documento, el término "LATS" es el nombre abreviado de la proteína cinasa supresora tumoral grande. LATS como se usa en el presente documento se refiere a LATS1 y/o LATS2. LATS1, como se usa en el presente documento, se refiere a la cinasa 1 supresora tumoral grande y LATS2 se refiere a la cinasa 2 supresora tumoral grande. Tanto LATS1 como LATS2 tienen actividad serina/treonina proteína cinasa.
Como se usa en el presente documento, el término "YAP1" se refiere a la proteína 1 asociada a yes, también conocida como YAP o YAP65, que es una proteína que actúa como regulador transcripcional de genes implicados en la proliferación celular.
Como se usa en el presente documento, el término "MST1/2" se refiere a las cinasas 1 y 2 similares 20 estéril de mamíferos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para la administración tópica, parenteral o inyectable.
La expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la presente invención se refiere a una cantidad del compuesto de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto, por ejemplo, la reducción o inhibición de una actividad enzimática o proteica, o mejora los síntomas, alivia afecciones, retrasa o ralentiza la progresión de la enfermedad o previene una enfermedad, etc. En una realización no limitante, la expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invención que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para (1) aliviar, inhibir, prevenir y/o mejorar al menos parcialmente una afección, o un trastorno o una enfermedad (i) mediados por la actividad de LATS o (ii) caracterizados por la actividad (normal o anómala) de LATS; o (2) reducir o inhibir la actividad de LATS; o (3) reducir o inhibir la expresión de LATS. En otra realización no limitante, la expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invención que, cuando se administra a una célula, o un tejido o un material biológico no celular, o un medio, es eficaz para reducir o inhibir al menos parcialmente la actividad de LATS; o reducir o inhibir al menos parcialmente la expresión de LATS.
El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, gatos, caballos, vacas, pollos, perros, ratones, ratas, cabras, conejos y cerdos. Preferentemente, el sujeto es humano. Excepto cuando se indique otra cosa, los términos "paciente" o "sujeto" se usan en el presente documento indistintamente.
La expresión "CI<50>", como se usa en el presente documento, se refiere a la concentración molar de un inhibidor que produce el 50 % del efecto de inhibición.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar", "que trata" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere a aliviar o mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, ralentizar o detener el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de esta); o aliviar o mejorar al menos un parámetro físico o biomarcador asociado a la enfermedad o trastorno, incluidos los que pueden no ser perceptibles para el paciente.
Como se usa en el presente documento, el término "prevenir", "que previene" o "prevención" de cualquier enfermedad o trastorno se refieren al tratamiento profiláctico de la enfermedad o trastorno; o a retrasar el inicio o la progresión de la enfermedad o trastorno.
Como se usa en el presente documento, un sujeto "necesita" un tratamiento si dicho sujeto se beneficiaría desde un punto de vista biológico, médico o en su calidad de vida de dicho tratamiento.
Dependiendo de las condiciones del proceso, los compuestos de la presente invención se obtienen en forma libre (neutra) o salina. Tanto la forma libre como la forma salina y, en particular, las "sales farmacéuticamente aceptables" de estos compuestos, están dentro del alcance de la invención.
Como se usan en el presente documento, los términos "sal" o "sales" se refieren a una sal de adición de ácido o de adición de base de un compuesto de la invención. Las "sales" incluyen en particular las "sales farmacéuticamente aceptables". La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de los compuestos de la invención y que normalmente no son indeseables desde un punto de vista biológico o de otro tipo. En muchos casos, los compuestos de la presente invención son capaces de formar sales de adición de ácido y/o base en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos.
Se pueden formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos.
Los ácidos inorgánicos a partir de los cuales se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares.
Los ácidos orgánicos a partir de los cuales se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido sulfosalicílico y similares.
Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se pueden formar con bases inorgánicas y orgánicas.
Las bases inorgánicas de las que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, sales de amonio y metales de las columnas I a XII de la Tabla Periódica. En determinadas realizaciones, las sales se obtienen de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, cinc y cobre; sales particularmente adecuadas incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
Las bases orgánicas a partir de las cuales pueden obtenerse sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas, resinas de intercambio iónico básicas y similares. Algunas aminas orgánicas incluyen isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.
En otro aspecto, los compuestos de Fórmula A2 pueden proporcionarse en forma de acetato, ascorbato, adipato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canforsulfonato, caprato, cloruro/clorhidrato, clorteofilonato, citrato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/dihidrogenofosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato trifenatato, trifluoroacetato o xinafoato.
Cualquier fórmula proporcionada en el presente documento también pretende representar formas no marcadas, así como formas marcadas isotópicamente de los compuestos. Los compuestos marcados isotópicamente tienen estructuras representadas por las fórmulas proporcionadas en el presente documento, excepto por que uno o más átomos se reemplazan por un átomo que tiene una masa atómica o un número másico seleccionados. Los isótopos que se pueden incorporar en compuestos de la invención incluyen, por ejemplo, isótopos de hidrógeno.
Además, la incorporación de determinados isótopos, particularmente deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar determinadas ventajas terapéuticas como resultado de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semividainvivoaumentada o requisitos de dosificación reducidos o una mejora en el índice terapéutico o la tolerabilidad. Se entiende que el deuterio en este contexto se considera un sustituyente de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma.
La concentración de deuterio puede ser definida por el factor de enriquecimiento isotópico. La expresión "factor de enriquecimiento isotópico", como se usa en el presente documento, se refiere a la relación entre la abundancia isotópica y la abundancia natural de un isótopo específico. Si se indica que un sustituyente en un compuesto de esta invención es deuterio, dicho compuesto tiene un factor de enriquecimiento isotópico para cada uno de los átomos de deuterio designados de al menos 3500 (52,5 % de incorporación de deuterio en cada átomo de deuterio designado), al menos 4000 (60 % de incorporación de deuterio), al menos 4500 (67,5 % de incorporación de deuterio), al menos 5000 (75 % de incorporación de deuterio), al menos 5500 (82,5 % de incorporación de deuterio), al menos 6000 (90 % de incorporación de deuterio), al menos 6333,3 (95 % de incorporación de deuterio), al menos 6466,7 (97 % de incorporación de deuterio), al menos 6600 (99 % de incorporación de deuterio) o al menos 6633,3 (99,5 % de incorporación de deuterio). Debe entenderse que la expresión "factor de enriquecimiento isotópico" se puede aplicar a cualquier isótopo de la misma manera que se describe para el deuterio.
Otros ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro tales como 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, respectivamente. En consecuencia, debe entenderse que la invención incluye compuestos que incorporan uno o más de cualquiera de los isótopos mencionados anteriormente, incluyendo, por ejemplo, isótopos radiactivos, tales como 3H y 14C, o aquellos en los que están presentes isótopos no radiactivos, tales como 2H y 13C. Dichos compuestos marcados isotópicamente son útiles en estudios metabólicos (con 14C), estudios de la cinética de la reacción (con, por ejemplo, 2H o 3H), técnicas de detección o de obtención de imágenes, tales como la tomografía por emisión de positrones (PET) o la tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT), que incluyen ensayos de distribución tisular de fármacos o sustratos, o en el tratamiento radiactivo de pacientes. En particular, un compuesto marcado o 18F puede ser particularmente deseable para estudios de PET o SPECT. Los compuestos de Fórmula A2 marcados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica o mediante procesos análogos a los descritos en los Ejemplos y Preparaciones adjuntos usando reactivos marcados isotópicamente adecuados en lugar del reactivo sin marcar empleado anteriormente.
Un átomo asimétrico (por ejemplo, carbono o similares) de los compuestos de la presente invención puede estar presente en compuestos racémicos o enantioméricamente enriquecidos, por ejemplo, la configuración (R), (S) o (R,S). En determinadas realizaciones, cada átomo asimétrico tiene al menos un 50 % de exceso enantiomérico, al menos un 60 % de exceso enantiomérico, al menos un 70 % de exceso enantiomérico, al menos un 80 % de exceso enantiomérico, al menos un 90 % de exceso enantiomérico, al menos un 95 % de exceso enantiomérico, o al menos un 99 % de exceso enantiomérico en la configuración(R)o (S). Los sustituyentes en átomos con dobles enlaces insaturados pueden estar presentes, si es posible, en formacis(Z) otrans(E).
En consecuencia, como se usa en el presente documento, un compuesto de la presente invención puede estar en forma de uno de los posibles estereoisómeros, rotámeros, atropisómeros, tautómeros o mezclas de los mismos, por ejemplo, como racematos, isómeros ópticos (enantiómeros), diastereómeros, estereoisómeros geométricos(cisotrans)sustancialmente puros o mezclas de los mismos.
Cualquier mezcla resultante de estereoisómeros se puede separar en función de las diferencias fisicoquímicas de los componentes en isómeros, diastereómeros y racematos puros o sustancialmente puros, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccionada.
Cualquier racemato resultante de los compuestos o intermedios puede resolverse en los enantiómeros mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante la separación de las sales diastereoméricas de los mismos, obtenidas con un ácido o una base con actividad óptica, y liberando el compuesto ácido o básico con actividad óptica. En particular, puede emplearse, por lo tanto, un resto básico para resolver los compuestos de la presente invención en sus enantiómeros, por ejemplo, por cristalización fraccionada de una sal formada con un ácido con actividad óptica, por ejemplo, ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido diacetiltartárico, ácido di-0,0'-p-toluoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico o ácido canfor-10-sulfónico. Los productos racémicos también pueden resolverse mediante cromatografía quiral, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) usando un adsorbente quiral.
El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (por ejemplo, un polipéptido de la invención), que no comprende adiciones o supresiones, para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base del ácido nucleico o el residuo aminoacídico idéntico aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Los términos "idénticos" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas secuencias. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia a lo largo de una región especificada o, cuando no se especifica, a lo largo de toda la secuencia de una secuencia de referencia), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o región designada, que se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante una alineación manual e inspección visual. La invención proporciona polipéptidos o polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente, ejemplificados en el presente documento.
El término "aislado" significa alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido o una célula presentes de forma natural en un animal vivo no están "aislados", pero el mismo ácido nucleico o péptido o célula separado parcial o totalmente de los materiales con los que coexiste en su estado natural está "aislado".
La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y a polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxi-inosina (Batzeret al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsukaet al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); y Rossoliniet al., Mol. Cell. Probes8:91-98 (1994)).
Una "población celular" o "población de células", como se usa en el presente documento, comprende células que proliferan en presencia de un inhibidor de LATS1 y/o LATS2in vivooex vivo.En dichas células, la señalización Hippo generalmente suprime el crecimiento celular, pero proliferará cuando la vía se interrumpa por la inhibición de LATS. En determinadas realizaciones, una población celular útil en un método, preparación, medio, agente o kit de la invención comprende células de tejidos descritos anteriormente o células descritas o proporcionadas en el presente documento. Dichas células incluyen, pero sin limitación, células oculares (por ejemplo, células madre del limbo, células endoteliales corneales), células epiteliales (por ejemplo, cutáneas), células madre neuronales, células madre mesenquimáticas, células madre basales de los pulmones, células madre embrionarias, células madre de adultos, células madre pluripotentes inducidas y células hepáticas progenitoras.
Farmacología y utilidad
En el presente documento se divulgan inhibidores de cinasas LATS de molécula pequeña para todas las indicaciones en las que la proliferación celular sería favorablein vivoy/oex vivo.
Las terapias celularesex vivogeneralmente implican la expansión de una población celular aislada de un paciente o donante sano para ser trasplantada a un paciente para establecer un injerto transitorio o estable de las células expandidas. Pueden usarse terapias celularesex vivopara suministrar un gen o una molécula bioterapéutica a un paciente, en donde la transferencia o la expresión génicas de la molécula bioterapéutica se logra en las células aisladas. Los ejemplos no limitantes de terapias celularesex vivoincluyen, pero sin limitación, trasplante de células madre (por ejemplo, trasplante de células madre hematopoyéticas, trasplante autólogo de células madre o trasplante de células madre de sangre del cordón umbilical), regeneración de tejidos, inmunoterapia celular y terapia génica. Véase, por ejemplo, Naldini, 2011,Nature Reviews Geneticsvolumen 12, páginas 301-315.
En un aspecto específico, en el presente documento se divulgan inhibidores de LATS de molécula pequeña, que son capaces de activar la vía YAP para promover la proliferación de células cutáneas y, por lo tanto, son útiles para promover la cicatrización de heridas.
Ejemplos adicionales de los usos de los compuestos de la presente invención son, entre otros,
1) en el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después del trasplante de injertos marginales (órganos que se consideran inadecuados y, por lo tanto, frecuentemente descartados por razones que incluyen, pero sin limitación, contenido graso excesivo, tamaño pequeño para el tamaño corporal y edad avanzada del donante);
2) respaldar un recrecimiento potenciado de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa, por ejemplo, en el contexto de tumores primarios y metastásicos del hígado, lesión hepática traumática y resección de otras lesiones del hígado que ocupan espacio, tales como malformaciones vasculares y abscesos hepáticos;
3) promover el crecimiento de células hepáticas (por ejemplo, células progenitoras hepáticas (HPC)) en cultivo (expansiónex vivo)y posible trasplante posterior;
4) regenerar hígados de pacientes con insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, lesión hepática inducida por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva;
5) respaldar el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis; o
6) prevenir daños y mantener o mejorar la función de los órganosex vivo,con o sin dispositivos de perfusión. La vía YAP/Hippo regula el crecimiento y la regeneración de tejidos en la piel y otros tejidos. La cascada de cinasas Hippo (MST), siendo LATS las cinasas terminales, regula negativamente la actividad de YAP Las cinasas LATS son de serina/treonina proteína cinasas que se ha demostrado que fosforilan directamente YAP, lo que da como resultado su retención citoplásmica e inactivación. Sin fosforilación por LATS, YAP se transloca al núcleo, formando un complejo con TEAD e impulsando la expresión génica corriente abajo para la proliferación y la supervivencia celulares.
La actividad de un compuesto de acuerdo con la presente invención puede evaluarse mediante los siguientes métodosin vitroein vivo.
Inhibición de LATS1 y LATS2
Los compuestos de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, son inhibidores potentes de LATS1 y LATS2.
La eficacia de inhibición de los compuestos contra LATS1 se analizó mediante el Ensayo bioquímico HTRF de LATS1 como se describe en la Sección A de Ejemplos. La eficacia de inhibición de los compuestos de la invención contra LATS1 (CI50 de LATS1 en j M) se publican en la Tabla 1A.
La CI 50 de LATS1 de los compuestos varió de >10 j M a menos de 1 nM, y la mayoría de los compuestos tuvieron una CI 50 por debajo de 1 j M. Cabe señalar que los compuestos con IC50 superiores a 1 j M se consideran inactivos en este ensayo.
La eficacia de inhibición de los compuestos seleccionados contra LATS2 se analizó mediante el Ensayo bioquímico Caliper de LATS2 como se describe en la Sección A de Ejemplos. La eficacia de inhibición de los compuestos de la invención contra LATS2 (CI50 de LATS2 en j M) también se publican en la Tabla 1A.
Supresión de pYAP (células HaCaT)
Mediante la inhibición de las cinasas LATS1 y LATS2, los compuestos de Fórmula A1 suprimen la fosforilación de YAP. La capacidad de los compuestos para reducir la fosforilación de YAP en células HaCaT humanas (una estirpe celular de queratinocitos) se midió mediante el ensayo HTRF de pYAP como se describe en los ejemplos. Los resultados del ensayo se publican en la Tabla 1C. Los datos demostraron que el tratamiento con compuestos de Fórmula A1 redujo la fosforilación de YAP
La capacidad de los compuestos de Fórmula A1 para reducir la fosforilación de YAP puede demostrarse de manera similar en células JHH-5 (Fujiseet al., Hepatogastroenterology.Octubre de 1990; 37(5):457-60.
Translocación nuclear de YAP (células HaCaT)
Sin fosforilación por LATS, YAP se transloca al núcleo. El efecto de los compuestos de Fórmula A1, o subfórmulas de la misma, sobre la translocación de YAP en células HaCaT humanas se evaluó mediante el ensayo de translocación nuclear de YAP como se describe en la Sección A de Ejemplos. Los valores de CE50 resultantes se publican en la Tabla 1C. La CE50 de translocación nuclear varió entre >20 j M y 0,3 j M, y compuestos seleccionados que tienen valores de CE50 de aproximadamente 1 j M o menos. Los datos respaldan que el tratamiento con compuestos seleccionados de Fórmula A1 activa la translocación de YAP desde el citoplasma al núcleo.
El efecto de los compuestos de Fórmula A1, o subfórmulas de la misma, sobre la translocación de YAP puede demostrarse de manera similar en células JHH-5 (Fujiseet al., Hepatogastroenterology.Octubre de 1990; 37(5):457-60.
Identificación de dianas
Los compuestos de Fórmula A1, o subfórmulas de la misma, se dirigen selectivamente a las cinasas LATS1/2 frente a MST1/2. Para identificar la diana de los aciertos del cribado del ensayo de translocación de YAP, se realizó el Ensayo de identificación de dianas como se describe en la Sección A de Ejemplos. Los resultados del ensayo se describen en las Figuras 33A a 33C.
La Figura 33A muestra los análisis por transferencia Western para pYAP (Ser127) en lisados de células HaCaT humanas, tratadas con vehículo o transfectadas con 40 pM de ARNip contra MST1/2 o LATS1/2. El ARNip contra LATS1/2 eliminó la señal de pYAP, mientras que el ARNip contra MST1/2 tuvo un impacto mínimo. Es coherente con el consenso en el campo de que LATS es responsable de la fosforilación de YAP.
La Figura 33B muestra el análisis por transferencia Western de lisados celulares de células HaCaT humanas que no se trataron o se trataron con 9 j M) del Ejemplo 133 durante 1 hora en presencia de ácido okadaico 0,5 j M. pYAP se inhibió drásticamente. El resultado es similar al estudio de ARNip contra LATS y MSTS (Figura 33A), lo que sugiere que el Ejemplo 133 se dirige a las cinasas LATS.
La Figura 33C muestra la inhibición de la actividad de LATS1 (con respecto al control de DMSO) en respuesta a la concentración del Ejemplo 133 que varía de aproximadamente 10-4 a 1 j M. Los datos muestran que el Ejemplo 133 inhibió fuertemente LATS1 en este ensayo con una CI50 de 1,3 nM. El resultado confirmó además que los compuestos de la invención son inhibidores potentes de las cinasas LATS.
Farmacodinamia (PD, por sus siglas en inglés)in vivode ratón: uso en la cicatrización de heridas
Los compuestos de la invención también activan la vía YAPin vivo.Se realizó un estudio de la expresión del gen diana de la vía YAP en un modelo de ratónin vivocomo se describe en el Ensayo de PDin vivoen la Sección A de Ejemplos. Se trataron por vía tópica dos heridas por escisión de espesor total en el dorso de un ratón anestesiado con vehículo, o 0,2 y 2 mg/ml del Ejemplo 133. Después de dos dosis diarias, las muestras de piel de alrededor del borde de la herida se recogieron y se realizaron análisis por Taqman usando sondas deCyr61yGapdh.Los niveles de expresión de ARNm para los genes diana se normalizaron a los niveles de ARNm de Gapdh y se representaron gráficamente frente a la concentración del Ejemplo 133 en la Figura 34. Los datos muestran que el Ejemplo 133 reguló positivamente de forma significativa el gen diana Cyr61 de YAP en comparación con el vehículo, y de una manera dependiente de la dosis. El resultado es coherente con la biología de LATS conocida para la activación de la vía YAP.
Proliferación de células cutáneasin vivo
Además, los compuestos de la invención aumentan la proliferación de células cutáneasin vivocuando se aplica por vía tópica. El estudio se realizó como se describe el "Ensayo de histología y tinción con Ki67in vivo"en la Sección A de Ejemplos. Se aplicaron el Ejemplo 133 o el vehículo a la piel dorsal intacta del ratón. Después de tres días de dosificación dos veces al día, las muestras de piel se recogieron y se sometieron a tinción inmunohistológica para Ki67. Las secciones se evaluaron visualmente para determinar la proliferación celular y la abundancia de células positivas para Ki67. Los resultados del estudio se documentan en las Figuras 35A y 35B.
La Figura 35A muestra micrografías representativas de la piel de ratón teñida con Ki67 tratada con vehículo o con Ejemplo 133. La piel de ratón tratada mediante el Ejemplo 133 muestra un aumento significativo de la proliferación de células basales y el espesor epidérmico en comparación con el vehículo. La Figura 35B compara la abundancia de células positivas para Ki67 en piel de ratón tratada y sin tratar. Los datos muestran una abundancia un 10 % superior de células positivas para Ki67 en la piel tratada mediante el Ejemplo 133, lo que es indicativo de una inducción estadísticamente significativa de células positivas para Ki67. En consecuencia, el Ejemplo 133 aumentó significativamente la proliferación de células cutáneas en ratonesin vivo.
En resumen, a partir de HTS fenotípico basado en imágenes de alto contenido, se ha demostrado que los compuestos de la invención son inhibidores potentes de LATS, lo que se confirmó mediante ensayos de LATS tanto celulares como bioquímicos. Además, mediante el uso de ARNip para inactivar tanto LATS1 como LATS2, también se ha validado LATS como regulador negativo de la vía YAP.
Además, se ha demostrado,in vitro,que el Ejemplo 133 activó la vía YAP y promovió la proliferación celular en queratinocitos humanos (HaCaT). Los inhibidores de LATS indujeron la expresión del gen diana YAP en modelos PD de ratón herido. El tratamiento tópico del Ejemplo 133 en ratones indujo la expresión del gen diana YAP y aumentó el crecimiento de células cutáneas de la capa basal como se evidencia mediante la tinción con Ki67. En consecuencia, el Ejemplo 133 es útil para promover la regeneración cutánea.
Por lo tanto, los compuestos de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, pueden ser útiles como terapia para una enfermedad o afección que puede beneficiarse de la proliferación de células como se describe en el presente documento. Por ejemplo, cuando la regeneración de tejidos y órganos lesionados o enfermos beneficiaría a un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, la piel, el hígado y la córnea. Adicionalmente, los compuestos de Fórmula A2, o subfórmulas de la misma, también pueden usarse como productos químicos de investigación, por ejemplo, como compuestos de herramientas.
Por lo tanto, como aspecto adicional, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, en una terapia.
En una realización, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1, o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para tratar y mejorar la sintomatología de quemaduras, úlceras cutáneas agudas y úlceras cutáneas crónicas. En un ejemplo, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras vasculares, diabéticas y por presión. En un ejemplo adicional, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras venosas de las piernas, úlceras del pie diabético y llagas por presión.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de una enfermedad o afección, que se trata mediante la inhibición de cinasas LATS, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula A2, o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo.
En un ejemplo, la enfermedad o afección se selecciona de quemaduras, úlcera cutánea aguda o úlcera cutánea crónica. En un ejemplo adicional, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras vasculares, diabéticas y por presión. En un ejemplo adicional, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras venosas de las piernas, úlceras del pie diabético y llagas por presión.
Por lo tanto, como aspecto adicional, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A2, o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para la fabricación de un medicamento.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas, o para el tratamiento de una enfermedad que puede tratarse mediante la inhibición de las cinasas LATS. En otro ejemplo, la enfermedad son quemaduras, úlceras cutáneas agudas o crónicas. En otro ejemplo, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras diabéticas, úlceras por presión y úlceras vasculares. En otro ejemplo, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras venosas de las piernas, úlceras del pie diabético y llagas por presión.
Por lo tanto, como aspecto adicional, en el presente documento se divulga un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para su uso como medicamento.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para su uso como medicamento para promover la cicatrización de heridas, o para el tratamiento de una enfermedad que puede tratarse mediante la inhibición de las cinasas LATS. En otro ejemplo, la enfermedad son quemaduras, úlceras cutáneas agudas o úlceras cutáneas crónicas. En otro ejemplo, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras diabéticas, úlceras por presión y úlceras vasculares. En otro ejemplo, la úlcera cutánea crónica se selecciona de úlceras venosas de las piernas, úlceras del pie diabético y llagas por presión.
Tratamientoin vivode ratones: uso en hígado
La capacidad de los compuestos de Fórmula A1 para inducir la regeneración y el recrecimiento del hígado se midió tratando ratones con los compuestos como se describe en el Ensayoin vivocomo se describe en la sección Ensayo biológico más adelante. Los resultados del ensayo se publican en la Tabla 1C. Los resultados muestran que los compuestos probados reducen los niveles de pYAP en hígados de ratones en comparación con ratones tratados con control de vehículo, lo que indica la inhibición de cinasas LATSin vivoen el hígado 2 horas después de la dosificación. El aumento de la expresión de ARNm de los genes diana de YAP Cyr61 y Ctgf indica la activación de la señalización de YAP 2 horas después de la dosificación. La tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación Ki67 indica además un aumento de la proliferación de células hepáticas 24 horas después de la dosificación.
Por lo tanto, como aspecto adicional, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, en una terapia.
En un aspecto, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de una enfermedad, que se trata mediante la inhibición de cinasas LATS, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula A1, o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo.
En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un método para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo.
Por lo tanto, como aspecto adicional, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para la fabricación de un medicamento.
En un aspecto adicional, el medicamento es para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis
Por lo tanto, como aspecto adicional, en el presente documento se divulga un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un estereoisómero del mismo, para su uso como medicamento. En un aspecto adicional, el medicamento es para promover la regeneración y el recrecimiento del hígado, particularmente para el tratamiento del recrecimiento insuficiente del hígado después de trasplante de injertos marginales; para respaldar un mayor crecimiento de la masa hepática remanente después de una hepatectomía extensa; para la regeneración del hígado de pacientes después de insuficiencia hepática aguda por hepatitis vírica, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis autoinmunitaria, hepatopatía isquémica y congestiva; y para el tratamiento de pacientes con lesión hepática crónica y fibrosis hepática subyacente, por esteatohepatitis no alcohólica, esteatohepatitis alcohólica, hepatitis vírica B y C crónica, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Wilson y fibrosis hepática inducida por fármacos para potenciar la capacidad regenerativa y acelerar la resolución de la fibrosis.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo, o un estereoisómero del mismo, para promover el crecimiento de células hepáticas en cultivo fuera del donante (expansiónex vivo)o para la inducción de regeneración hepáticaex vivo.
En otro aspecto, en el presente documento se divulga el método para promover el crecimiento de células hepáticas en cultivo fuera del donante (expansiónex vivo)o para la inducción de la regeneración del hígadoex vivousando un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, o una sal del mismo, o un estereoisómero del mismo.
Composición farmacéutica y administración
En otro aspecto, en realizaciones de la invención relacionadas con el usoin vivo,la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, la composición comprende al menos dos portadores farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en el presente documento. En realizaciones de la invención relacionadas con usos tópicos de los compuestos de la invención, la composición farmacéutica se formula de una manera que es adecuada para la administración tópica tal como soluciones acuosas, suspensiones, pomadas, cremas, geles o formulaciones pulverizables, por ejemplo, para el suministro mediante aerosol o similar, que comprende el principio activo junto con uno o más de solubilizantes, estabilizadores, agentes potenciadores de la tonicidad, tampones y conservantes que son conocidos por los expertos en la técnica.
En realizaciones de la invención relacionadas con el usoin vivo,el compuesto de la presente invención normalmente se formula en formas farmacéuticas para proporcionar una dosificación fácilmente controlable del fármaco y para proporcionar al paciente un producto elegante y fácilmente manipulable. La pauta posológica para los compuestos de la presente invención variará, por supuesto, dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, edad, sexo, salud, estado médico y peso del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento simultáneo; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado. En realizaciones de la invención relacionadas con el usoin vivo,los compuestos de la invención pueden administrarse en una única dosis diaria, o la dosificación diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día.
En realizaciones de la invención relacionadas con el usoin vivo,la composición o combinación farmacéutica de la presente invención puede estar en una dosis unitaria de aproximadamente 1-1000 mg de uno o más principios activos para un sujeto de aproximadamente 50-70 kg. La dosificación terapéuticamente eficaz de un compuesto, la composición farmacéutica o combinaciones del mismo dependen de la especie del sujeto, el peso corporal, la edad y el estado individual, el trastorno o enfermedad o la gravedad de los mismos que se están tratando. Un médico, profesional sanitario o veterinario experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad eficaz de cada uno de los principios activos necesaria para prevenir, tratar o inhibir la progresión del trastorno o la enfermedad.
Los compuestos de la presente invención pueden aplicarse por vía tópica en forma de soluciones acuosas, suspensiones, pomadas, cremas, lociones, geles o formulaciones pulverizables, por ejemplo, para el suministro mediante aerosol o similares. La dosificación puede variar entre concentraciones de aproximadamente 10'3 molar y 10'9 molar. Una cantidad terapéuticamente eficazin vivopuede variar, dependiendo de la vía de administración, entre aproximadamente 1 100 mg/kg.
En determinados casos, puede resultar ventajoso administrar el compuesto de la presente invención en combinación con al menos un agente farmacéutico (o terapéutico) adicional, tal como un analgésico, y combinaciones de los mismos. En particular, las composiciones se formularán juntas como una combinación terapéutica o se administrarán por separado.
En determinados casos, puede resultar ventajoso administrar el compuesto de la presente invención en combinación con al menos un agente farmacéutico (o terapéutico) adicional, tal como un inmunosupresor, por ejemplo, corticoesteroides, ciclosporina, tacrolimus y combinaciones de inmunosupresores. En particular, las composiciones se formularán juntas como una combinación terapéutica o se administrarán por separado.
El compuesto de la presente invención puede administrarse simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos diferentes o antes o después de estos. El compuesto de la presente invención puede administrarse por separado, mediante una vía de administración idéntica o diferente, o de forma conjunta en la misma composición farmacéutica que los demás agentes. Un agente terapéutico es, por ejemplo, un compuesto químico, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo o ácido nucleico, que es terapéuticamente activo o potencia la actividad terapéutica cuando se administra a un paciente junto con un compuesto de la invención.
En el presente documento se divulga un producto que comprende un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma, y al menos otro agente terapéutico en forma de una preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en una terapia. En un ejemplo, la terapia es el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por LATS1/2. Los productos proporcionados como un preparado combinado incluyen una composición que comprende el compuesto de Fórmula A1 y el otro u otros agentes terapéuticos juntos en la misma composición farmacéutica, o el compuesto de Fórmula A1 y el otro u otros agentes terapéuticos en forma separada, por ejemplo, en forma de un kit.
En el presente documento se divulga una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma y otro u otros agentes terapéuticos. Opcionalmente, la composición farmacéutica puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable, como se ha descrito anteriormente.
En el presente documento se divulga y se relaciona con el usoin vivo,un kit que comprende dos o más composiciones farmacéuticas separadas, al menos una de las cuales contiene un compuesto de Fórmula A2 o subfórmulas de la misma. En un ejemplo, el kit comprende medios para conservar por separado dichas composiciones, tal como un recipiente, un frasco dividido, tubo dividido o un paquete de aluminio dividido. Un ejemplo de un kit de este tipo es un paquete de aluminio, como el que se usa normalmente para suministrar gel o pomada, y similares.
El kit relacionado con el usoin vivopuede usarse para administrar diferentes formas farmacéuticas de los agentes activos, por ejemplo, orales y tópicas, para administrar las composiciones separadas en diferentes intervalos de dosificación o para valorar las composiciones separadas entre sí. Para facilitar el cumplimiento, el kit normalmente comprende instrucciones para su administración.
En las terapias de combinación, el compuesto de la invención y el otro agente terapéutico pueden ser fabricados y/o formulados por el mismo o diferentes fabricantes. Por otro lado, para el usoin vivo,el compuesto de la invención y el otro agente terapéutico pueden combinarse para su uso en una terapia de combinación: (i) antes de la liberación del producto de combinación a los médicos (por ejemplo, en el caso de un kit que comprende el compuesto de la invención y el otro agente terapéutico); (ii) por el propio médico (o bajo la guía del médico) poco antes de la administración; (iii) en el propio paciente, por ejemplo, durante la administración secuencial del compuesto de la invención y el otro agente terapéutico.
En consecuencia, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma para tratar una enfermedad o afección mediada por la inhibición de LAT<s>, en donde el medicamento se prepara para la administración con otro agente terapéutico. También se divulga
el uso de otro agente terapéutico para tratar una enfermedad o afección mediada por la inhibición de LATS, en donde el medicamento se administra con un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección mediada por la inhibición de LATS, en donde el compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se prepara para la administración con otro agente terapéutico. En el presente documento también se divulga otro agente terapéutico para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección mediada por la inhibición de LATS, en donde el otro agente terapéutico se prepara para la administración con un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma.
En el presente documento también se divulga un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección mediada por la inhibición de LATS, en donde el compuesto se administra con otro agente terapéutico. En el presente documento también se divulga otro agente terapéutico para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección mediada por la inhibición de LATS, en donde el otro agente terapéutico se administra con un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma.
En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma para tratar una enfermedad o afección mediada por LATS1/2, en donde el paciente se ha tratado anteriormente (por ejemplo, en 24 horas) con otro agente terapéutico. En el presente documento también se divulga
el uso de otro agente terapéutico para tratar una enfermedad o afección mediada por LATS, en donde el paciente se ha tratado anteriormente (por ejemplo, en 24 horas) con un compuesto de Fórmula A1 o subfórmulas de la misma.
PREPARACIÓN DE COMPUESTOS
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse de varias maneras conocidas por el experto en la técnica de la síntesis orgánica tras la lectura de los métodos, esquemas de reacción y ejemplos proporcionados en el presente documento. Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse usando los métodos que se describen a continuación, junto con métodos de síntesis conocidos en la técnica de la química orgánica sintética, o mediante variaciones de los mismos como apreciarán los expertos en la técnica. Los métodos preferidos incluyen, pero sin limitación, los que se describen a continuación. Las reacciones se realizan en un disolvente o mezcla de disolvente adecuados para los reactivos y materiales empleados y adecuados para las transformaciones que se están realizando. Los expertos en la técnica de la síntesis orgánica entenderán que la funcionalidad presente en la molécula debería ser coherente con las transformaciones propuestas. Esto en ocasiones requerirá un criterio para modificar el orden de las etapas de síntesis o para seleccionar un esquema de proceso particular sobre otro con el fin de obtener un compuesto deseado de la invención.
Los materiales de partida están generalmente disponibles de fuentes comerciales tales como Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.) o se preparan fácilmente usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, preparados mediante métodos generalmente descritos en Louis F. Fieser y Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v. 1-19, Wiley, Nueva York (1967-1999 ed.), Larock, R.C.,Comprehensive Organic Transformations,2.a ed., Wiley-VCH Weinheim, Alemania (1999) oBeilsteins Handbuch der organischen Chemie,4.a ed. Springer-Verlag, Berlín, incluyendo los suplementos (también disponibles a través de la base de datos en línea de Beilstein).
A efectos ilustrativos, los esquemas de reacción que se representan a continuación proporcionan vías posibles para sintetizar los compuestos de la presente invención, así como intermedios clave. Para consultar una descripción más detallada de las etapas de reacción individuales, véase la sección de Ejemplos a continuación. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden usarse otras vías de síntesis para sintetizar los compuestos de la invención. Aunque los materiales de partida y reactivos específicos se representan en los esquemas y se analizan a continuación, se pueden sustituir por otros materiales de partida y reactivos para proporcionar diversos derivados y/o condiciones de reacción. Además, muchos de los compuestos preparados mediante los métodos que se describen a continuación pueden modificarse adicionalmente a la luz de esta divulgación usando química convencional muy conocida por los expertos en la técnica.
Para preparar los compuestos de la presente invención, puede que sea necesario proteger la funcionalidad remota de los intermedios. La necesidad de una protección de este tipo variará dependiendo de la naturaleza de la funcionalidad remota y las condiciones de los métodos de preparación. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente si se necesita una protección de este tipo. Para una descripción general de los grupos protectores y su uso, véase Greene, T.W.et al.,Protecting Groups in Organic Synthesis,4a Ed., Wiley (2007). Los grupos protectores incorporados en la preparación de los compuestos de la presente invención, tales como el grupo protector tritilo, se pueden mostrar como un regioisómero, pero también pueden existir como una mezcla de regioisómeros.
Abreviaturas
Las abreviaturas, como se usan en el presente documento, se definen de la siguiente manera: "1x" para una vez, "2x" para dos veces, "3x" para tres veces, "°C" para grados centígrados, "ac" para acuoso, "Col" para columna, "eq" para equivalente o equivalentes, "g" para gramo o gramos, "mg" para miligramo o miligramos, "nm" para la nanómetro o nanómetros, "l" para litro o litros, "mL" o "ml" para mililitro o mililitros, "ul", "uL", " jl" o "|jL" para microlitro o microlitros, "N" para normal, "uM" o "jM " para micromolar, "nM" para nanomolar, "mol" para mol o moles, "mmol" para milimol o milimoles, "min" para minuto o minutos, "h" para hora u horas, "TA" para temperatura ambiente, "DN" para durante la noche, "atm" para atmósfera, "psi" para libras por pulgada al cuadrado, "conc." para concentrado, "ac" para acuoso, "sat" para saturado, "PM" para peso molecular, "mo" o "ponda" para microondas, "pf' para punto de fusión, "p" para peso, "MS" o "Espec Mas" para espectrometría de masas, "ESI" para espectroscopia de masas con ionización por electronebulización, "HR" para alta resolución, "HRMS" para espectrometría de masas de alta resolución, "LCMS" para cromatografía liquidaespectrometría de masas, "HPLC" cromatografía líquida de alta resolución, "RP HPLC" para HPLC en fase inversa, "TLC" o "tlc" para cromatografía en capa fina, "RMN" para espectroscopía por resonancia magnética nuclear, "nOe" para espectroscopía con efecto Overhauser nuclear, "1H" para protón, "8 " para delta, "s" para singulete, "d" para doblete, "t" para triplete, "c" para cuadruplete, "m" para multiplete, "a" para ancho, "Hz" para hercio, "ee" para "exceso enantiomérico" y "a", "p", "R", "r", "S", "s", "E" y "Z" son denominaciones esteroquímicas con las que está familiarizado el experto en la técnica.
Las siguientes abreviaturas utilizadas en el presente documento a continuación tienen los significados correspondientes: CA
Control activo
AIBN
azobisisobutironitrilo
ATP
trifosfato de adenosina
Bn
bencilo
Boc
terc-butoxicarbonilo
Boc2O
dicarbonato de di-terc-butilo
BSA
albúmina sérica bovina
Bu
butilo
Cs2CO3
carbonato de cesio anhidro
CHCl3
cloroformo
DAST
trifluoruro de dietilaminoazufre
DBU
2,3,4,6,7,8,9,10-octahidropirimido[1,2-a]azepina
DCM
diclorometano
DMAP
4-dimetilaminopiridina
DMEM
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
DMF
dimetilformamida
DMSO
dimetilsulfóxido
DPPA
azida de difenilfosforilo
DTT
ditioltreitol
EA
acetato de etilo
EDTA
ácido etilendiaminotetraacético
Equiv.
equivalencia
Et
etilo
Et2O
dietil éter
EtOH
etanol
EtOAc
acetato de etilo
FBS
suero bovino fetal
HATU
Hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio HCl
ácido clorhídrico
HEPES
ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico
HPMC
(hidroxipropil)metil celulosa
HTRF
fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo
i-Bu
isobutilo
i-Pr
isopropilo
KOAc
acetato de potasio
LÍAIH4
hidruro de litio y aluminio
Me
metilo
mCPBA
ácido 3-cloroperoxibenzoico
MeCN
acetonitrilo
MnO2
dióxido de manganeso
N2
nitrógeno
NaBH4
borohidruro de sodio
NaHCOa
bicarbonato de sodio
Na2SO4
sulfato de sodio
NBS
W-Bromosuccinimida
CN
Control neutro
PBS
solución salina tamponada con fosfato
PFA
paraformaldehído
Ph
fenilo
PPha
trifenilfosfina
PhaP=O
óxido de trifenilfosfina
pYAP
fosfo-YAP
Rf
factor de retención
TA
temperatura ambiente (°C)
Ser
serina
f-Bu o Bu‘
ferc-butilo
T3P®
Anhídrido de ácido propano fosfónico
TEA
trietilamina
TFA
ácido trifluoroacético
THF
tetrahidrofurano
UVA
Ultravioleta A
YAP
Proteína asociada a yes (ID del gen del NCBI: 10413; símbolo oficial: (YAP1)
I. Vías de síntesis generales
Pueden prepararse compuestos de Fórmulas I a VI como se ilustra en los Esquemas Generales I a III y con mayor detalle en los Esquemas 1 a 6 a continuación. A continuación también se divulga una descripción detallada de la síntesis de los intermedios y compuestos ejemplificados.
Esquema general I para la preparación de los compuestos de Fórmula I o II
Fórmula l/ll
El dicloruro bicíclicoGS1bpodría estar disponible en el mercado cuando X = C o podría prepararse a partir de ácido aminoisonicotínico/amidaGS1aa través de ciclación y cloración. El dicloruro deGS1bpodría aminarse y acoplarse con los agentes adecuados para formarGS1c,que se funcionalizó adicionalmente para producir la Fórmula I o la Fórmula II a través de cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, aminación, acoplamiento, etc.
Esquema general II para la preparación de los compuestos de Formula III
M, L = haluro, alquilo, -CN, etc.
amnacon
funcionalizacion adicional
Esquema general III para la preparación de los compuestos de Formula IV
M, L = haluro, alquilo, -CN, etc
aminacion
funciona izacion adiciona
Esquema 1.
Pueden presentarse compuestos de Fórmula V como se ilustra en el Esquema 1 a continuación. La etapa C podría incluir aminación y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, etc.
Como alternativa, pueden prepararse compuestos de Fórmula V como se ilustra en el Esquema 2. La etapa C podría incluir aminación y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, etc. La funcionalización adicional del intermedio2dde monocloruro mediante, pero sin limitación, acoplamiento mediado por metales, aminación, alquilación, etc. y las etapas necesarias de protección y desprotección, conduce a compuestos de Fórmula V.
Esquema 3.
Pueden prepararse compuestos de Fórmula I, donde R5 es hidrógeno, como se ilustra en el Esquema 3. La etapa C podría incluir aminación y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, etc. La funcionalización adicional del intermedio3dde monocloruro mediante, pero sin limitación, acoplamiento mediado por metales, aminación, alquilación, etc. y las etapas necesarias de protección y desprotección, conduce a compuestos de Fórmula (I) donde R5 es hidrógeno.
Esquema 3
Funcionalizacion adicional
donde R5 es H
Esquema 4.
Pueden prepararse compuestos de Fórmula I, donde R3 y R5 son los dos hidrógeno, como se ilustra en el Esquema 4. La etapa C podría incluir aminación y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, etc. conduciendo a compuestos de Fórmula I donde R3 y R5 son los dos hidrógeno.
Esquema 5.
Pueden prepararse compuestos de Fórmula I, donde R3 es hidrógeno, como se ilustra en el Esquema 5. La etapa D podría incluir aminación y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, etc. La funcionalización adicional del intermedio5dde monocloruro mediante, pero sin limitación, acoplamiento mediado por metales, aminación, alquilación, etc. y las etapas necesarias de protección y desprotección, conduce a compuestos de Fórmula I donde R3 es hidrógeno,
Esquema 6.
Pueden prepararse compuestos de Fórmula VI a partir de dicloruro6a'disponible en el mercado (2,4-dicloro-1,7-naftiridina, Aquila Pharmatech) como se ilustra en el Esquema 6. La etapa A podría incluir acoplamiento mediado por metales y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, ciclación, reducción, hidrólisis, alquilación, etc. La etapa B podría incluir aminación y cualquier funcionalización necesaria, tal como, pero sin limitación, etapas de protección y desprotección, reducción, hidrólisis, alquilación, etc.
Preparación de los ejemplos ejemplificados
Los siguientes Ejemplos se han preparado, aislado y caracterizado usando los métodos divulgados en el presente documento. Los siguientes ejemplos demuestran un alcance parcial de la invención y no tienen por objeto limitar el alcance de la invención.
A menos que se especifique otra cosa, los materiales de partida pueden adquirirse generalmente de proveedores que no excluyen los comerciales tales como TCI Fine Chemicals (Japón), Shanghai Chemhere Co., Ltd.(Shanghai, China), Aurora Fine Chemicals LLC (San Diego, CA), FCH Group (Ucrania), Aldrich Chemicals Co. (Milwaukee, Wis.), Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, N.H.), Acros Organics (Fairlawn, N.J.), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Cornualles, Inglaterra), Tyger Scientific (Princeton, N.J.), AstraZeneca Pharmaceuticals (Londres, Inglaterra), Chembridge Corporation (EE.UU.), Matrix Scientific (EE.UU.), Conier Chem & Pharm Co., Ltd (China), Enamine Ltd (Ucrania), Combi-Blocks, Inc. (San Diego, EE.UU.), Oakwood Products, Inc. (EE.UU.), Apollo Scientific Ltd. (Reino Unido), Allichem LLC. (EE. UU.) y Ukrorgsyntez Ltd (Letonia).
Métodos de LCMS empleados en la caracterización de los Ejemplos 1-290
El análisis por LC/MS analítica se realiza en sistemas Agilent usando el software ChemStation. Los sistemas consisten en:
• Bomba binaria Agilent G1312
• Muestreador automático de placas de pocillos Agilent G1367
• Compartimento termostatizado para la columna Agilent G1316
• Detector de haz de diodos Agilent G1315
• Espectrómetro de masas Agilent 6140/6150
• Detector evaporativo de dispersión de luz SOFTA
Las condiciones habituales del método son las siguientes:
• Caudal: 0,9 ml/min
• Columna: columna de 1,8 micrómetros 2,1 x 50 mm Waters Acquity HSS T3 C18
• Fase móvil A: Agua TFA al 0,05%
• Fase móvil B: Acetonitrilo TFA al 0,035 %
• Tiempo de ejecución: 2,25 minutos
• El sistema ejecuta un gradiente de un 10 % de B a un 90 % de B en 1,35 minutos. Al gradiente le sigue un lavado de 0,6 minutos con un 100% de B. La duración restante del método devuelve el sistema a las condiciones iniciales.
• El intervalo de Barrido típico de un espectrómetro de masas es de 100 a 1000 uma.
Métodos de LCMS empleados en la caracterización de los Ejemplos 291-335
LC-MS (método 1):
Sistema: Waters Acquity UPLC con detector Waters SQ.
Columna: Acquity HSS T3 1,8 pm 2,1 x 50 mm.
Flujo: 1,0 ml/min. Temperatura de la columna: 60 °C.
Gradiente: del 5 al 98 % de B en 1,4 min, A = agua ácido fórmico al 0,05 % acetato de amonio 3,75 mM, B = acetonitrilo ácido fórmico al 0,04 %.
LC-MS (método 2):
Sistema: Waters Acquity Clase H UPLC con detector Waters SQ.
Columna: BEH C18 1,7 pm 2,1x50 mm
Flujo: 3,0 ml/min. Temperatura de la columna: 30 °C.
Gradiente: de 2 a 100 % de B en 2,7 min, A = acetato de amonio 2 mM/agua ácido fórmico al 0,1 %, B = acetonitrilo ácido fórmico al 0,1 %.
RMN empleada en la caracterización de los Ejemplos 1-290
Los espectros de protones se registran en un AVANCE II de 400 MHz de Bruker con una criosonda QNP de 5 mm o un AVANCE III de 500 MHz de Bruker con una sonda QNP de 5 mm, a menos que se indique otra cosa. Los desplazamientos químicos se publican en ppm con respecto al sulfóxido de dimetilo (8 2,50), cloroformo (8 7,26), metanol (8 3,34) o diclorometano (8 5,32). Se disuelve una pequeña cantidad de la muestra seca (2-5 mg) en un disolvente deuterado adecuado (1 ml).
RMN empleada en la caracterización de los Ejemplos 291-335
Los espectros de protones se registran en un espectrómetro de RMN Bruker Avance 400 (400 MHz) equipado con una sonda criogénica o en un espectrómetro de RMN Bruker Avance 600 (600 MHz) equipado con una sonda criogénica. Los desplazamientos químicos (valores 8) se presentan en ppm en campo descendente con respecto al tetrametilsilano, el patrón de desdoblamiento en los espectros se designa como singlete (s), doblete (d), triplete (t), cuadruplete (c), quintuplete (p), multiplete, señales no resueltas o más solapadas (m), señal ancha (a). Los disolventes se proporcionan entre paréntesis.
Reactivos y materiales
Los disolventes y reactivos se adquirieron de proveedores y se usaron sin ninguna purificación adicional. Los cartuchos de resina de intercambio iónico básica PoraPakTM Rxn CX 20 cc (2 g) se adquirieron en Waters. Los cartuchos separadores de fases (Separador de fases Isolute) se adquirieron en Biotage. El absorbente aislado (Isolute HM-N) se adquirió en Biotage.
Métodos de ISCO empleados en la purificación de los ejemplos
La cromatografía ultrarrápida ISCO se realiza en el sistema Teledyne COMBIFLASH® con una columna RediSep® de sílice rellenada previamente.
Métodos de HPLC preparativa empleados en la purificación de los ejemplos
El análisis por HPLC preparativa se realiza en sistemas Waters Autoprep usando el software MassLynx y FractionLynx. Los sistemas consisten en:
• Automuestreador/Colector de fracciones Waters 2767
• Bomba binaria Waters 2525
• Bomba de relleno Waters 515
• Detector UV de longitud de onda dual Waters 2487
• Espectrómetro de masas Waters ZQ
Las condiciones habituales del método son las siguientes:
• Caudal: 100ml/min
• Columna: columna Waters Atlantis T3 C18 19x50 mm de 10 micrómetros
• Volumen de inyección: 0-1000 microlitros
• Fase móvil A: Agua TFA al 0,05%
• Fase móvil B: Acetonitrilo TFA al 0,035 %
• Tiempo de ejecución: 4,25 minutos
El sistema ejecuta un gradiente del x % de B al y % de B según sea adecuado para los ejemplos en 3 minutos después de una retención de 0,25 minutos en las condiciones iniciales. Al gradiente le sigue un lavado de 0,5 minutos con un 100 % de B. La duración restante del método devuelve el sistema a las condiciones iniciales.
La recogida de fracciones se activa mediante la detección masiva a través del software FractionLynx.
Métodos de HPLC preparativa quiral empleados en la purificación de los ejemplos
El cribado quiral de SFC se realiza en un sistema Thar Instruments Prep Investigator acoplado a un espectrómetro de masas Waters ZQ. El sistema Thar Prep Investigator consiste en:
• Muestreador automático Leap HTC PAL
• Módulo de suministro de fluidos Thar (de 0 a 10 ml/min)
• Horno para la columna de 10 posiciones Thar SFC
• PDA Waters 2996
• Detector quiral Jasco CD-2095
• Regulador de contrapresión automatizado Thar.
Todos los componentes Thar forman parte de la línea SuperPure Discovery Series.
El sistema fluye a razón de 2 ml/min (4 ml/min para la columna WhelkO-1) y se mantiene a 30 °C. La contrapresión del sistema se fija a 12,5 MPa (125 bar). Cada muestra se analiza a través de una batería de seis columnas de 3 micrómetros:
• ChiralPak AD 4,6x50 mm de 3 micrómetros
• ChiralCel OD 4,6x50 mm de 3 micrómetros
• ChiralCel OJ 4,6x50 mm de 3 micrómetros
• Whelk O-1 4,6x250 mm de 3 micrómetros
• ChiralPak AS 4,6x50 mm de 3 micrómetros
• Lux-Cellulose-24,6x50 mm de 3 micrómetros
El sistema ejecuta un gradiente del 5 % de cosolvente al 50 % de cosolvente en 5 minutos seguido de una retención de 0,5 minutos al 50 % de cosolvente, un cambio de nuevo sl 5 % de cosolvente y una retención de 0,25 minutos en las condiciones iniciales. Entre cada gradiente hay un método de equilibrio de 4 minutos con un flujo del 5 % de cosolvente a través de la siguiente columna que se va a someter a cribado. Los disolventes típicos para el cribado son MeOH, MeOH NH320 mM, MeOH DEA al 0,5 %, IPA, e IPA NH320 mM.
Una vez que se detecta la separación usando uno de los métodos de gradiente, se desarrollará un método isocrático y, si es necesario, se aumentará a escala para la purificación en el sistema Thar Prep80.
Síntesis de intermedios
Intermedio 1c (Esquema 1): 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina
Etapa A:En un vial de microondas de 20 ml se añadieron 3-aminoisonicotinamida (1a, 2 g, 14,58 mmol), isonicotinaldehído (1,521 ml, 16,04 mmol), bisulfito de sodio (1,821 g, 17,50 mmol) e hidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico (0,277 g, 1,458 mmol) en DMA (Volumen: 5 ml) para proporcionar una suspensión de color naranja. La reacción se agitó bien y se calentó en microondas a 160 °C durante 12 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se filtró. El sólido se lavó con agua, MeOH y éter para proporcionar 2,03 g de un sólido de color blanquecino como el producto1b(59 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,88 - 8,78 (m, 2H), 8,73 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,16 - 8,08 (m, 2H), 8,03 (dd, J = 5,2, 0,9 Hz, 1H).
Etapa B:En un reactor de microondas de 5 ml se añadieron 2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol (1b, 500 mg, 2,230 mmol) y dicloruro de fenilfosfónico (1564 microlitros, 11,15 mmol) para proporcionar una suspensión de color pardo. La mezcla de reacción se agitó a 170 °C durante 30 minutos cuando la Lc m S indicó una conversión completa. La mezcla de reacción se inactivó con hielo/agua y se neutralizó con Na2CO3 saturado, después se extrajo con DCM x 3 y proporcionó el producto1c(74 %). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,65 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,96 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,87 (s, 2H), 8,47 - 8,30 (m, 2H), 8,18 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 243,1.
Intermedio 2c (Esquema 2): 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina
Etapa A:Una mezcla de urea (40,00 g, 666,00 mmol) y ácido 3-aminoisonicotínico (2a, 18,40 g, 133,20 mmol) se calentó a 210 °C durante 1 hora (NOTA: no se usó disolvente). Se añadió NaOH (2 N, 320 ml) y la mezcla se agitó a 90 °C durante 1 h. El sólido se recogió mediante filtración y se lavó con agua. El producto en bruto obtenido de este modo se suspendió en HOAc (400 ml) y se agitó a 100 °C durante 1 h. La mezcla se enfrió a TA, se filtró y el sólido se lavó con una gran cantidad de agua y después se secó al vacío para proporcionar pirido[3,4-d]pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (2b, 17,00 g, rendimiento del 78 %) sin purificación adicional. LCMS (m/z [M+H]+): 164,0.
Etapa B:A una mezcla de pirido[3,4-d]pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (2b, 20,00 g, 122,60 mmol) y POCl3 (328,03 g, 2,14 mol) en tolueno (200 ml) se le añadió gota a gota DI<e>A (31,69 g, 245,20 mmol) y esta mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante la noche (18 h) para proporcionar una suspensión.
El disolvente y POCh se retiraron al vacío, se diluyeron con DCM (50 ml), se neutralizaron con DIEA a pH=7 a -20 °C y se concentraron nuevamente, el residuo se purificó en columna (EA al 20-50 %/PE) para proporcionar el producto (2c, 20,00 g, 99,99 mmol, rendimiento del 82 %) en forma de un sólido de color amarillo. 1H R<m>N (400 MHz, C<l>O<r>OFO<r>M<o>-d)59,52 (s, 1 H), 8,92 (d, J=5,6 Hz, 1 H), 8,04 (d, J=5,6 Hz, 1 H). LCMS (m/z [M+H]+): 200,0.
Intermedio 3c (Esquema 3): 4,8-dicloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina
Etapa A:En un reactor de microondas de 20 ml se añadieron 3-aminoisonicotinamida (3a, 650 mg, 3,79 mmol) e isonicotinaldehído (487 mg, 4,55 mmol), bisulfito de sodio (788 mg, 7,58 mmol) en<d>M<a>(Volumen: 10 ml) para proporcionar una suspensión de color amarillo. La mezcla de reacción se agitó en un microondas a 160 °C durante 10 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua, se filtró y se lavó con MeOH y éter. El sólido se recogió para proporcionar el producto3b(8-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol, 300 mg, 29 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,86 - 8,80 (m, 2H), 8,45 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 8,18 -8,12 (m, 2H), 8,00 (d, J = 5,1 Hz, 1H).
Etapa B:En un reactor de microondas de 20 ml se mezclaron (8-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol (3b, 300 mg, 1 ,160 mmol) y dicloruro fenilfosfónico (1 ml, 7,13 mmol) para proporcionar una suspensión de color amarillo. La mezcla de reacción se agitó en un microondas a 170 °C durante 60 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se filtró. El sólido se lavó con agua, MeOH y éter para proporcionar el producto del título3c(78 %). 1H r Mn (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,05 - 8,96 (m, 2H), 8,52 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 8,46 - 8,38 (m, 2H), 8,05 (d, J = 5,1 Hz, 1H). (RMN A la muestra se le añadió 1 gota de TfA, por lo demás, se observaron 2 conjuntos de picos). Lc Ms (m/z [M+H]+): 277,0.
Intermedio 4c (Esquema 4, intermedio 4c, en donde X es F y A es 4-piridinilo): 4-cloro-6-fluoro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina
Etapa A:Una solución de isonicotinonitrilo (800 mg, 7,69 mmol) en MeOH (30 ml) se trató con metóxido de sodio (0,474 ml, 5,4 M, 2,56 mmol) a t.a. durante 1 hora. Después se añadió ácido 5-amino-2-fluoroisonicotínico (1,0 g, 6,41 mmol) y la mezcla resultante se sometió a reflujo durante 24 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, el producto sólido se recogió mediante filtración. Se lavó conEtOAc, después se secó al vacío para proporcionar 6-fluoro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol (4b, 756 mg, 48,7 %). 1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 58,89 (s, 1H), 8,81 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 8,14 - 8,06 (m, 2H), 7,74 (d, J = 2,3 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 243,10.
Etapa B:A una mezcla de 6-fluoro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol (4b, 750 mg, 3,1 mmol) en DCE (40 ml) se le añadieron cloruro de tionilo (1,81 ml, 24,8 mmol) y DMF (0,1 ml). Después, la mezcla se agitó durante 3 horas a 85 °C. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se secó al vacío durante la noche. El producto en bruto (950 mg) se usó para la siguiente etapa de reacción sin tratamiento ni purificación adicionales. LCMS (m/z [M+H]+): 261,10.
Intermedio 5d (Esquema 5): 4,5-dicloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina
EtapaA:A una mezcla de ácido 3-bromo-5-fluoroisonicotínico (5a, 1,87 g, 8,5 mmol) y HATU (4,85 g, 12,75 mmol) en DMF (30 ml) se le añadió DIEA (4,5 ml), la mezcla se agitó a t.a. durante 20 minutos, después se añadió isonicotinimidamida (1,236 g, 10,2 mmol). La agitación continuó durante otras 15 horas a t.a. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Después, la mezcla en bruto de jarabe de color pardo claro se disolvió en DCM y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (eluyendo con MeOH al 0-10 %/disolvente A, el disolvente A es una mezcla de 4 litros de DCM y 8 ml de solución de amoníaco 7 N en MeOH), se agruparon fracciones 66-80 y se concentraron para proporcionar el producto deseado 3-bromo-5-fluoro-N-(imino(piridin-4-il)metil)isonicotinamida5b(566 mg, 20,6%). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,27 (s, 1H), 10,09 (s, 1H), 8,79 - 8,73 (m, 2H), 8,71 (s, 2H), 7,95 - 7,89 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 323,0.
Etapa B:Una mezcla de 3-bromo-5-fluoro-N-(imino(piridin-4-il)metil)isonicotinamida (5b, 600 mg, 1,857 mmol), DIEA (0,33 ml, 1,857 mmol), carbonato de potasio (257 mg, 1,857 mmol) y DBU (0,28 ml, 1,857 mmol) en DMA (8 ml) en un recipiente de reacción de microondas de 20 ml se calentó a 150 °C durante 45 minutos (irradiación de microondas). La mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml), se extrajo con EtOAc (3 x 60 ml), el producto deseado permaneció en la fase acuosa. Después, la fase acuosa se purificó mediante ISCO de fase inversa (CH3CN al 10-50 %/agua) para proporcionar el producto deseado 5-bromo-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol5c(520 mg, pureza del 80%, 74 %). LCMS (m/z [M+H]+): 303,0.
Etapa C:Se disolvió 5-bromo-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol (5c, 150 mg, 0,495 mmol) en CH3CN anhidro (2 ml) seguido de la adición de POCl3 (759 mg, 4,95 mmol). Después, la mezcla de reacción se calentó a 100 °C durante 16 horas. La LCMS mostró que la reacción estaba completa. La reacción se enfrió a ta y el disolvente se evaporó. El residuo se diluyó con agua helada (40 ml) y después se extrajo con EtOAc (3 x 40 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron a sequedad para proporcionar el producto deseado 4,5-dicloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina5d(86 %). El producto se usó directamente para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,05 (s, 1H), 8,87 (s, 2H), 8,68 (s, 1H), 8,16 (d,J= 4,9 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 277,0.
Intermedio 6b (Esquema 6, intermedio 6b', en donde A es 4-piridinilo): 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina
Etapa A:En un reactor de microondas de 20 ml se añadieron PaladioTetraquis (58,1 mg, 0,050 mmol), carbonato de potasio (1,256 ml, 2,51 mmol) y 2,4-dicloro-1,7-naftiridina (6a, 200 mg, 1,005 mmol) y ácido piridin-4-ilborónico (130 mg, 1,055 mmol) en acetonitrilo (2 ml) para proporcionar una suspensión de color naranja. La mezcla de reacción se agitó a 120 °C durante 60 min bajo microondas. La mezcla en bruto se diluyó con DCM, H2O, se separó y se extrajo con DCM x3. Se combinaron las fases orgánicas y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/D<c>M para proporcionar el producto (62 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,58 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,85 - 8,78 (m, 4H), 8,32 - 8,29 (m, 2H), 8,11 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 242,1.
Síntesis de los compuestos de Fórmula A1
Ejemplo 1: N-(2-ciclopropilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Compuesto 1) (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio1c) usando laetapa Ccomo en elEsquema 1.
Etapa C:En un vial de 20 ml se agitó 4-doro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (30 mg, 0,12 mmol) en DMF (0,7 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió TEA (19 pl, 0,14 mmol) y la mezcla se agitó durante 5 minutos y después se añadió KF (7 mg, 0,12 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió 2-ciclopropilpropan-2-amina (0,013 ml, 0,12 mmol) y se desgasificó, después se agitó a 80 °C durante dos horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DCM para proporcionar el producto N-(2-ciclopropilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (50 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80(d, J = 6,1 Hz, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,29(m, 2H), 7,74(s, 1H), 1,94(m, 1H), 1,52(s, 6H), 0,49(m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 306,2.
Ejemplos 2-110: (Ejemplos de referencia)
LosEjemplos 2-110que se describen a continuación se sintetizaron de acuerdo con el protocolo descrito para elEjemplo 1usando 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio1c) y diversas aminas respectivamente, excepto que se indique otra cosa.
Ejemplo 2: N-(2-ciclopropilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,58(d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,31 (m, 2H), 7,89(dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 3,90(c, J = 7,0 Hz, 4H), 1,40(t, J = 7,0 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,1.
Ejemplo 3: N-etil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,22(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,58(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 7,88(dd, J = 5,8, 0,8 Hz, 1H), 4,95-4,90(m, 1H), 3,81 (c, J = 6,9 Hz, 2H), 1,40(s, 3H), 1,38(s, 3H), 1,35(m, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
Ejemplo 4: 2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400MHz, CDCl3) 59,45(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,83(m, 2H), 8,78(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,70-8,60(m, 2H), 7,63(s, 1H), 5,98-5,92(m, 1H), 5,80-5,75(m, 1H), 1,81 (d, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 320,1.
Ejemplo 5: N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,55(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,31 (m, 2H), 8,03(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 5,15-5,10(m, 1H), 3,34(s, 3H), 1,35(d, J = 6,6 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Ejemplo 6: N-(propan-2-il)-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,76(m, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,50(d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,32(m, 2H), 8,28(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 4,74-4,67(d, J = 6,7 Hz, 1H), 1,36(d, J = 6,6 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 266,1.
Ejemplo 7: N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,64(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,40(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,29(m, 2H), 7,74(s, 1H), 3,85(s, 2H), 3,28(s, 3H), 1,60(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 310,2.
Ejemplo 8: N-(4-metoxi-2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,65(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 8,28(m, 1H), 7,85(s, 1H), 3,48(t, J = 6,7 Hz, 2H), 3,20(s, 3H), 2,35(t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,64(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 324,2.
Ejemplo 9: N-butil-N-metil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,77(m, 2H), 8,55(d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,31 (m, 2H), 8,08(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 3,92(m, 2H), 3,54(s, 3H), 1,82-1,75(m, 2H), 1,48-1,36(m, 2H), 0,98(t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
Ejemplo 10: N-etil-N-metil-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,55(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,31(m, 2H), 8,05(dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 3,94(c, J = 7,1 Hz, 2H), 3,50(s, 3H), 1,39(t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 266,1.
Ejemplo 11: 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)etan-1-ol (Ejemplo de referencia)
Etapa 1:En un vial de 40 ml a 0 °C se añadió 2-amino-2-metilpropan-1-ol (1,5 g, 16,8 mmol) en 8 ml de DCM seco. Se añadió DIEA (3,2 ml, 18,5 mmol) y después carbonocloridato de bencilo (2,37 ml, 16,8 mmol) en porciones. La mezcla de reacción se agitó durante dos horas calentando lentamente a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando EtOAc al 0-50 %/hexano para proporcionar el producto (1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (90%). LCMS (m/z [M+H]+): 224,3.
Etapa 2:En un vial de 20 ml se añadió (1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (0,63 g, 2,8 mmol) en 5 ml de THF seco. Se añadió hidróxido de potasio (0,16 g, 2,8 mmol) en 0,5 ml de H2O, después 2-bromoacetato de terc-butilo (0,62 ml, 4,2 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (90 mg, 0,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 30 °C. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (iSc O) usando EtOAc al 0-40 %/hexano para proporcionar el producto 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-metilpropoxi)acetato de terc-butilo (35 %). LCMS (m/z [M+H]+): 338,4.
Etapa 3:En un vial de 20 ml a 0 °C se añadió 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-metilpropoxi)acetato de terc-butilo (0,14 g, 0,17 mmol) en 1 ml de DMF seca. Se añadió borohidruro de litio (0,45 ml, 0,91 mmol) en porciones y la mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente y después se inactivó con agua. Se usó DCM para la extracción y el disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (iScO) usando EtOAc al 0-70 %/hexano para proporcionar el producto (1-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (35 %). LCMS (m/z [M+H]+): 268,3.
Etapa 4:En un vial sellado con septo de 20 ml se añadió (1-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (0,03 g, 0,11 mmol) en 1,2 ml de EtOH. El vial se purgó vigorosamente con N2 a temperatura ambiente. Se añadió cuidadosamente una pequeña cucharada de Pd/C (30 %, cantidad cat.) y la reacción se mantuvo en atmósfera de N2. Después se usó un globo de H2 para lavar abundantemente el recipiente de reacción y después se agitó a presión de H2 durante cuatro horas. El H2 se retiró de la reacción y después el recipiente se purgó con N2. Después, el material se filtró a través de Na2SO4 y celite y el disolvente se evaporaron bajo flujo de aire. No fue necesaria ninguna purificación adicional del residuo. 2-(2-amino-2-metilpropoxi)etanol (95 %). 1H r Mn (500 MHz, Cloroformo-d) 83,76 - 3,73 (m, 2H), 3,62 - 3,59 (m, 2H), 3,26 (s, 2H), 1,27 (s, 2H), 1,20 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 1,11 (s, 6H).LCMS (m/z [M+H]+): 134,2.
Etapa 5:En un vial de microondas de 20 ml se añadieron 3-aminoisonicotinamida (1a, 2 g, 14,58 mmol), isonicotinaldehído (1,521 ml, 16,04 mmol), bisulfito de sodio (1,821 g, 17,50 mmol) e hidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico (0,277 g, 1,458 mmol) en DMA (Volumen: 5 ml) para proporcionar una suspensión de color naranja. La reacción se agitó bien y se calentó en microondas a 160 °C durante 12 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se filtró. El sólido se lavó con agua, MeOH y éter para proporcionar 2,03 g de un sólido de color blanquecino como el producto1b(59 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,88 - 8,78 (m, 2H), 8,73 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,16 - 8,08 (m, 2H), 8,03 (dd, J = 5,2, 0,9 Hz, 1H).
Etapa 6:En un reactor de microondas de 5 ml se añadieron 2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol (1b, 500 mg, 2,230 mmol) y dicloruro de fenilfosfónico (1564 microlitros, 11,15 mmol) para proporcionar una suspensión de color pardo. La mezcla de reacción se agitó a 170 °C durante 30 min cuando la Lc Ms indicó una conversión completa. La mezcla de reacción se inactivó con hielo/agua y se neutralizó con Na2CO3 saturado, después se extrajo con DCM x 3 y proporcionó el producto1c(74 %). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,65 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,96 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,87 (s, 2H), 8,47 -8,30 (m, 2H), 8,18 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 243,1.
Etapa 7:En un vial de 20 ml se agitó 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) (150 mg, 0,618 mmol) en DMSO (1,5 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió DlEA (324 microlitros, 1,85 mmol) y se agitó durante 5 minutos y después se añadió KF (36 mg, 0,618 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió 2-(2-amino-2-metilpropoxi)etanol (99 mg, 0,74 mmol) y se desgasificó, después se agitó a 60 °C durante 30 min. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (25 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,35(m, 1H), 8,29(m, 2H), 7,76(s, 1H), 4,64-4,59(m, 1H), 3,90(s, 2H), 3,50-3,44(m, 4H), 1,61 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 340,2
Ejemplo 12: 2-metiM -(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol (Ejemplo de referencia)
KF. uíEA
Etapa 7
Etapa 1:En un vial de 40 ml a 0 °C se añadió 2-amino-2-metilpropan-1-ol (1,5 g, 16,8 mmol) en 8 ml de DCM seco. Se añadió DIEA (3,2 ml, 18,5 mmol) y después carbonocloridato de bencilo (2,37 ml, 16,8 mmol) en porciones. La mezcla de reacción se agitó durante dos horas calentando lentamente a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando EtOAc al 0-50 %/hexano para proporcionar el producto (1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (90 %). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 87,41 -7,29 (m, 5H), 5,06 (s, 2H), 4,97 -4,83 (m, 1H), 4,70 (s, 1H), 3,62 (s, 2H), 1,34 -1,19 (m, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 224,3.
Etapa 2:En un vial de 20 ml se añadió (1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (0,63 g, 2,8 mmol) en 5 ml de THF seco. Se añadió hidróxido de potasio (0,16 g, 2,8 mmol) en 0,5 ml de H2O, después 2-bromoacetato de terc-butilo (0,62 ml, 4,2 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (90 mg, 0,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 30 °C. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (iSCO) usando EtOAc al 0-40 %/hexano para proporcionar el producto 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-metilpropoxi)acetato de terc-butilo (35 %). 1H r Mn (500 MHz, Cloroformo-d) 87,39 - 7,28 (m, 5H), 5,52 (s, 1H), 5,06 (s, 2H), 3,96 (s, 2H), 3,45 (s, 2H), 1,48 (s, 9H), 1,36 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 338,4.
Etapa 3:Se agitó 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-metilpropoxi)acetato de terc-butilo (700 mg, 4,15 mmol) en DCM (5 ml) en un baño de hielo durante 10 minutos. Se añadió bromuro de metilmagnesio (30 ml, 42 mmol) lentamente en porciones y después se agitó mientras se calentaba a temperatura ambiente durante dos horas. Después, la reacción se interrumpió con agua y se extrajo tres veces con DCM. Las capas orgánicas se combinaron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando EtOAc al 0-50 %/hexano para proporcionar el producto (1-(2-hidroxi-2 metilpropoxi)-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (55 %). LCMS [M+H] = 296,4.
Etapa 4:En un vial sellado con septo de 20 ml se añadió (1-(2-hidroxi-2-metilpropoxi)-2-metilpropan-2-il)carbamato de bencilo (0,03 g, 0,11 mmol) en 1,2 ml de EtOH. El vial se purgó vigorosamente con N2 a temperatura ambiente. Se añadió cuidadosamente una pequeña cucharada de Pd/C (30 %, cantidad cat.) y la reacción se mantuvo en atmósfera de N2. Después se usó un globo de H2 para lavar abundantemente el recipiente de reacción y después se agitó a presión de H2 durante cuatro horas. El H2 se retiró de la reacción y después el recipiente se purgó con N2. Después, el material se filtró a través de Na2SO4 y celite y el disolvente se evaporaron bajo flujo de aire. No fue necesaria ninguna purificación adicional del residuo para proporcionar (1-(2-amino-2-metilpropoxi)-2-metilpropan-2-ol) (95 %). 1H RMN (500 MHz, Cloroformo-d) 8 3,32 (s, 2H), 3,26 (s, 2H), 1,22 (s, 6H), 1,12 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 162,2.
Etapa 5:En un vial de microondas de 20 ml se añadieron 3-aminoisonicotinamida(1a,2 g, 14,58 mmol), isonicotinaldehído (1,521 ml, 16,04 mmol), bisulfito de sodio (1,821 g, 17,50 mmol) e hidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico (0,277 g, 1,458 mmol) en DMA (Volumen: 5 ml) para proporcionar una suspensión de color naranja. La reacción se agitó bien y se calentó en microondas a 160 °C durante 12 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se filtró. El sólido se lavó con agua, MeOH y éter para proporcionar 2,03 g de un sólido de color blanquecino como el producto1b(59 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,88 - 8,78 (m, 2H), 8,73 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,16 - 8,08 (m, 2H), 8,03 (dd, J = 5,2, 0,9 Hz, 1H).
Etapa 6:En un reactor de microondas de 5 ml se añadieron 2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ol(1b,500 mg, 2,230 mmol) y dicloruro de fenilfosfónico (1564 microlitros, 11,15 mmol) para proporcionar una suspensión de color pardo. La mezcla de reacción se agitó a 170 °C durante 30 min cuando la L<c>M<s>indicó una conversión completa. La mezcla de reacción se inactivó con hielo/agua y se neutralizó con Na2CO3 saturado, después se extrajo con DCM x 3 y proporcionó el producto1c(74 %). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,65 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,96 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,87 (s, 2H), 8,47 -8,30 (m, 2H), 8,18 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 243,1.
Etapa 7:En un vial de 20 ml se agitó 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio1c)(25 mg, 0,10 mmol) en DMSO (0,7 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió DIEA (43 ul, 0,25 mmol) y se agitó durante 5 minutos y después se añadió KF (6 mg, 0,10 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió 2(1-(2-amino-2-metilpropoxi)-2-metilpropan-2-ol) (0,013 ml, 0,12 mmol) y se desgasificó, después se agitó a 60 °C durante 30 min. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (50 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,37 (dd, 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,30 (m, 2H), 7,80 (s, 1H), 4,40 (s, 1H), 3,90 (s, 2H), 3,17 (s, 2H), 1,61 (s, 6H), 0,99 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 368,2.
Ejemplo 13: N-etil-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,84(m, 1H), 8,76(m, 2H), 8,65(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,34(m, 2H), 8,18(dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 3,77-3,69(qd, J = 7,2, 5,4 Hz, 2H), 1,31 (t, J = 7,2 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 252,1.Ejemplo 14: N-propil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,82(t, J = 5,5 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,64(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,33(m, 2H), 8,19(dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 3,70-3,62(td, J = 7,0, 5,7 Hz, 2H), 1,80-1,70(m, 2H), 1,00(t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 266,1.
Ejemplo 15: N-(2-ciclohexilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,16(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,62(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,28(m, 2H), 7,62(s, 1H), 1,76-1,70(m, 4H), 1,62-1,59(m, 1H), 1,52(s, 6H), 1,18-1,04(c, J = 11,8, 10,9 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 348,2.
Ejemplo 16: N-(3-met¡loxetan-3-¡l)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡do[3,4-d1p¡r¡m¡d¡n-4-am¡na (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 0,9 Hz, 1H), 9,14(s, 1H), 8,76(m, 2H), 8,68(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,25(m, 2H), 8,16(dd, J = 5,6 Hz, 1H), 4,90(d, J = 6,3 Hz, 2H), 4,64(d, J = 6,5 Hz, 2H), 1,82(s, 3H)). LCMS (m/z [M+H]+): 294,1.
Ejemplo 17: N-(2-metilciclopentil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,19(d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,66(m, 1H), 8,33(m, 2H), 8,32(m, 1H), 7,91(m, 1H), 4,45-4,42(m, 1H), 2,20-2,14(m, 1H), 1,98-1,82(m, 2H), 1,80-1,72(m, 2H), 1,70-1,62(m, 1H), 1,50-1,42(m, 1H), 0,91 (d, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 306,2.
Ejemplo 17b: N-((1R.2S)-2-met¡lc¡clopent¡l)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡dof3.4-d1p¡r¡m¡d¡n-4-amina (17a) y N-((1S,2R)-2 -met¡lc¡clopent¡l)-2-(p¡r¡d¡n-4-il)p¡r¡dor3.4-dlp¡r¡m¡d¡n-4-am¡na (17b) (Ejemplo de referenc¡a)
A una solución de 4-cloro-2-(piridin-4-M)pirido[3,4-d]pirimidina (130 mg, 0,536 mmol) en DMF (10 ml) se le añadieron TEA (0,23 ml, 1,61 mmol) y KF (32,7 mg, 0,56 mmol). La mezcla se agitó durante 5 minutos antes de que se añadiese clorhidrato de c/s-2-metilciclopentanamina (72,7 mg, 0,536 mmol). Después, la mezcla resultante se agitó durante 2 horas a 50 °C. Después, la mezcla en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para proporcionar 109 mg de producto. Se sometieron 100 mg de este material a separación quiral para proporcionar dos isómeros cis, 35 mg de isómero del pico 1 (TR = 1,46 min), 46 mg de isómero del pico 2 (TR =1,95 min). Las asignaciones de centros quirales son condiciones de separación quiral provisionales: disolvente A CO2 (80%), disolvente B MeOH+NH4Cl al 0,1 % (20%), caudal 2 ml/min, columna 21 x 250 mm AD-H, tiempo de ejecución de inyecciones apiladas de 6 minutos, tiempo de elución de 10 minutos.
Isómero del pico 1 (T<r>=1,46 min): 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,19 (s, 1H), 8,77 (d, J = 5,8 Hz, 2H), 8,66 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 8,36 - 8,29 (m, 3H), 4,86 (p, J = 7,5 Hz, 1H), 2,09 (dtd, J = 11,7, 8,1,3,4 Hz, 1H), 1,89 (dddq, J = 29,7, 12,7, 8,4, 3,8 Hz, 3H), 1,66 - 1,53 (m, 1H), 1,51 - 1,41 (m, 1H), 0,83 (d, J = 7,1 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 306,2.
Isómero del pico 2 (Tr =1,95 min): 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,19 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,80 - 8,74 (m, 2H), 8,66 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 8,36 - 8,29 (m, 3H), 4,86 (p, J = 7,6 Hz, 1H), 2,09 (dp, J = 12,4, 4,6, 4,2 Hz, 1H), 1,98 - 1,79 (m, 3H), 1,66 - 1,54 (m, 1H), 1,50 -1,41 (m, 1H), 0,83 (d, J = 7,1 Hz, 3H). ). LCMS (m/z [M+H]+): 306,2.
Ejemplo 18: 3-metil-3-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il]ammo}butan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,17(d, J = 5,4 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,63(m, 1H), 8,33(m, 1H), 8,28(dd, J = 5,4, 0,8 Hz, 2H), 7,58(s, 1H), 5,00(d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,30-4,26(m, 1H), 1,29(s, 3H), 1,27(s, 3H), 1,05(d, J = 6,7 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 310,2.
Ejemplo 19: N-butil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,82(m, 1H), 8,78(m, 2H), 8,65(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,34(m, 2H), 8,20(dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 3,75-3,68(td, 7,2, 5,6 Hz, 2H), 1,78-1,69(m, 2H), 1,50-1,40(m, 2H), 0,98(t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Ejemplo 20: N-(2-metil-4-fenilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,63(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 7,79(s, 1H), 7,13-7,04(m, 5H), 2,61-2,56(dd, J = 10,7, 6,0 Hz, 2H), 2,48-2,43(m, 2H), 1,65(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 370,2.
Ejemplo 21: N-ciclopropil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,83(m, 1H), 8,78(m, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40(m, 2H), 8,18(dd, J = 5,6 1,0 Hz, 1H), 3,30-3,22(m, 1H), 0,98-0,94(m, 2H), 0,80-0,76(m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 264,1.
Ejemplo 22: N-(4-metanosulfoml-2-metilbutan-2-il)-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,65(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 7,76(s, 1H), 3,15-3,10(m, 2H), 2,90(s, 3H), 2,65-2,60(m, 2H), 1,61(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 372,1.
Ejemplo 23: 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propano-1,3-diol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,63(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,32(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,29(m, 2H), 7,38(s, 1H), 4,81 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,97-3,94(dd, J = 10,8, 6,0 Hz, 2H), 3,90-3,82(dd, J = 10,9, 6,2 Hz, 2H), 1,52(s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 312,1.
Ejemplo 24: 3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino)butan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,77(m, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,38(m, 1H), 8,32(m, 2H), 8,30(s, 1H), 4,80(d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,76-4,72(m, 1H), 3,93-3,88(m, 1H), 1,31(d, J = 6,7 Hz, 3H), 1,19(d, J = 6,3 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 296,2.
Ejemplo 25: ácido 2-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propoxi)acético (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de 2-(2-amino-2-metilpropoxi)acetato de terc-butilo y 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina como se describe en laEtapa C, Ejemplo 1,seguido de la desprotección del éster terc-butílico.
Desprotección:se agitó 2-(2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propoxi)il)amino)propoxi)acetato de terc-butilo (25 mg, 0,061 mmol) en una mezcla al 40 % de TFA en DCM a temperatura ambiente durante dos horas. No se observó material de partida mediante TLC o LCMS. La reacción se diluyó con DCM y se concentró usando N2 y calor suave, después se repitió tres veces y se puso a alto vacío durante la noche. Los intermedios en estas condiciones normalmente se usaron sin purificación adicional. Los compuestos del título en estas condiciones también se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, 0,8 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,63(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,33(ddd, J = 10,8, 5,1, 1,2 Hz, 2H), 8,30(m, 1H), 8,19(s, 1H), 4,14(s, 2H), 3,80(s, 2H), 3,16(s, 1H), 1,62(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 354,2.
Ejemplo 26: (1R,2S)-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclopentan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 1H), 8,65(m, 1H), 8,40(m, 1H), 8,37(m, 1H), 8,32(m, 2H), 4,72(d, J = 3,7 Hz, 1H), 4,60-4,52(ddd, J = 15,9, 9,2, 4,4 Hz, 1H), 4,44-4,40(m, 1H), 2,04-1,98(m, 3H), 1,90-1,82(m, 1H), 1,74-1,56(m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,1.
Ejemplo 27: 4,4,4-trifluoro-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,30(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,85(m, 1H), 8,80(m, 2H), 8,74(m, 1H), 8,39(d, J = 4,3 Hz, 1H), 8,33(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 2H), 5,76-5,70(m, 1H), 4,77-4,70(m, 1H), 3,61-3,55(m, 2H), 2,11-2,08(m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 350,1.
Ejemplo 28: N-(1 -metanosulfonil-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,67(dd, J = 5,9, 4,7 Hz, 1H), 8,40(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 8,08(s, 1H), 4,13(s, 2H), 2,90(s, 3H), 1,80(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 358,1.
Ejemplo 29: ácido (2S)-3,3,3-trifluoro-2-metil-2-([2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propanoico (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,23(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,76(m, 1H), 8,70(m, 1H), 8,30(dd, J = 5,6, 0,8 Hz, 2H), 7,81 (s, 1H), 2,02(s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 364,1.
Ejemplo 30: ácido 2-[(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propil)amino]acético (Ejemplo de referencia)
B r- X
<E> ccion
El compuesto del título se preparó usando 2-((2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propil)amino)acetato de terc-butilo como se describe en el esquema anterior. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,25(m, 1H), 8,82(m, 2H), 8,70(m, 1H), 8,40(m, 1H), 8,35(m, 2H), 7,84(d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,89-3,80(d, J = 6,2 Hz, 1H), 3,60-3,56(d, J = 11,0 Hz, 4H), 1,70(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 353,2.
Etapa 1:Se agitó 2-metil-N2-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,2-diamina (20 mg, 0,068 mmol) en DCM/DMF a temperatura ambiente. Se añadieron 21 microlitros de TEA (21 microlitros, 0,149 mmol) y se agitaron durante tres minutos, después se añadió 2-bromoacetato de terc-butilo (11 microlitros, 0,071 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP y se agitaron a temperatura ambiente durante cuatro horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (iScO) usando MeOH al 0 -10%/D<c>M para proporcionar el producto 2-((2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propil)amino)acetato de terc-butilo (35 %). LCMS (m/z [M+H]+): 409,5.
Ejemplo 31: ácido (2R)-3,3,3-trifluoro-2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propanoico (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,23(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,77(m, 1H), 8,70(m, 1H), 8,30(m, 2H), 7,83(s, 1H), 2,02(s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 364,1.
Ejemplo 32: 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propanoato de metilo (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,24(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,85(s, 1H), 8,79(m, 2H), 8,70(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,39(dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 8,25(m, 2H), 3,51 (s, 3H), 1,69(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 324,1.
Ejemplo 33: (1S,2S)-2-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il]ammo}ciclopentan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,65(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,51 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,38(m, 1H), 8,36(m, 1H), 8,31 (dd, J = 5,6, 0,9, Hz, 1H), 4,92(d, J = 4,6 Hz, 1H), 4,60-4,54(d, J = 7,0 Hz, 1H), 4,26-4,20(m, 1H), 2,32-2,22(ddt, J = 13,2, 8,2, 4,3 Hz, 1H), 2,00-1,92(m, 1H), 1,85-1,72(m, 2H), 1,70-1,56(m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,1.
Ejemplo 34: ácido 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}propanoico (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de la desprotección de 2-metil-2-((2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propanoato de metilo como se describe en la Etapa A, Ejemplo 25.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,61 (s, 1H), 9,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,86-8,80(s, 1H), 8,75(m, 2H), 8,67(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 8,28(m, 1H), 1,66(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 310,1.
Ejemplo 35: 2-(2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}etoxi)etan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,89(t, J = 5,5 Hz, 1H), 8,76(m, 2H), 8,65(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,32(m, 2H), 8,20(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 4,60-4,57(m, 1H), 3,89(c, J = 5,7 Hz, 2H), 3,78(t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,51-3,48(d, J = 2,9 Hz, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 312,1.
Ejemplo 36: 2-(hidroximetil)-2-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il]ammo}propano-1,3-diol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,65(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,30(ddd, J = 19,4, 5,1, 1,3 Hz, 1H), 8,26(m, 2H), 7,19(s, 1H), 4,72(t, J = 6,0 Hz, 3H), 4,00(d, J = 6,0 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 328,1.
Ejemplo 37: ácido 3-metil-3-(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}butanamido)butanoico (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80(dt, J = 4,5, 1,1 Hz, 2H), 8,64(m, 1H), 8,33(m, 2H), 8,30(m, 1H), 7,90(s, 1H), 1,72(s, 6H), 1,70(s, 2H), 1,30(s, 2H), 1,00(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 423,2.
Ejemplo 38: 2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-3-fenilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,99(d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,75(m, 2H), 8,71 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,33(m, 1H), 8,30(m, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,11 (m, 2H), 7,02(m, 1H), 5,95-5,86(t, J = 8,2 Hz, 1H), 3,38-3,34(m, 1H), 3,24-3,17(ddt, J = 13,8, 11,7, 0,7 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 396,1.
Ejemplo 39: N-{[4-(dimetilamino)oxan-4-il]metil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(s, 1H), 8,78(m, 2H), 8,67(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,52(s, 1H), 8,33(m, 2H), 8,28(m, 1H), 3,62(t, J = 10,6 Hz, 2H), 3,53(d, J = 10,7 Hz, 2H), 3,27(d, J = 5,3 Hz, 2H), 2,41(s, 6H), 1,80(d, J = 14,1 Hz, 2H), 1,63(t, J = 11,5 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 365,2.
Ejemplo 40: ácido 3-metil-3-([2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il]ammo)butanoico (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 12,02(s, 1H), 9,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,66(m, 1H), 8,40(m, 1H), 8,30(m, 2H), 7,99(m, 1H), 3,12-3,08(c, J = 7,3 Hz, 2H), 1,70(s, 6H. LCMS (m/z [M+H]+): 324,1.
Ejemplo 41: N-(2-metanosulfoniletil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,23(s, 1H), 9,10(t, J - 5,6 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,69(d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,39(m, 2H), 8,14(d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,13-4,09(c, J = 6,4 Hz, 2H), 3,62(t, J = 6,7 Hz, 2H), 3,09(s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 330,1. Ejemplo 42: N-[2-(adamantan-1-il)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,16(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(m, 2H), 8,63(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,45(m, 1H), 8,25(m, 2H), 7,06(s, 1H), 1,99-1,96(d, J = 7,5 Hz, 3H), 1,80-1,76(m, 6H), 1,67-1,64(m, 6H), 1,64-1,60(m, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 400,2.
Ejemplo 43: 2-metil-N-[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]propanamida (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 511,08(s, 1H), 9,49(m, 1H), 8,84(m, 2H), 8,80(m, 1H), 8,40(m, 2H), 8,25(dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 1H), 3,29-3,18(m, 1H), 1,26(d, J = 6,8 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,1.
Ejemplo 44: ácido 4,4,4-trifluoro-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]am ino}butanoico (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,29(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,71 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 8,34(m, 2H), 8,23(d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,84-5,79(m, 1H), 3,65-3,55(d, J = 4,8 Hz, 1H), 2,45-2,41 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 2,32-2,26(m, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 364,1.
Ejemplo 45: N-[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]propano-2-sulfonamida (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,38(s, 1H), 8,88(m, 2H), 8,76(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40-8,30(m, 3H), 4,20-4,10(c, J = 7,1 Hz, 1H), 1,40(d, J = 6,9 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 330,1.
Ejemplo 46: 2-(piridin-4-il)-N-[3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-il)propil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(m, 1H), 9,18(s, 1H), 8,75(m, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,30(m, 2H), 8,21 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 3,81-3,75(td, J = 6,9, 5,3 Hz, 2H), 2,95(t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,18-2,10(m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 334,2. Ejemplo 47: N-metil-2-(piridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
Etapa 1: Una mezcla de urea (40,00 g, 666,00 mmol) y ácido 3-aminoisonicotínico (2a, 18,40 g, 133,20 mmol) se calentó a 210 °C durante 1 hora (NOTA: no se usó disolvente). Se añadió NaOH (2 N, 320 ml) y la mezcla se agitó a 90 °C durante 1 h. El sólido se recogió mediante filtración y se lavó con agua. El producto en bruto obtenido de este modo se suspendió en HOAc (400 ml) y se agitó a 100 °C durante 1 h. La mezcla se enfrió a TA, se filtró y el sólido se lavó con una gran cantidad de agua y después se secó al vacío para proporcionar pirido[3,4-d]pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (2b, 17,00 g, rendimiento del 78 %) sin purificación adicional. LCm S (m/z [M+H]+): 164,0.
Etapa 2: A una mezcla de pirido[3,4-d]pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (2b, 20,00 g, 122,60 mmol) y POCh (328,03 g, 2,14 mol) en tolueno (200 ml) se le añadió gota a gota DIEA (31,69 g, 245,20 mmol) y esta mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante la noche (18 h) para proporcionar una suspensión.
El disolvente y POCh se retiraron al vacío, se diluyeron con DCM (50 ml), se neutralizaron con DIEA a pH=7 a -20 °C y se concentraron nuevamente, el residuo se purificó en columna (20-50 % EA/PE) para proporcionar 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (2c, 20,00 g, 99,99 mmol, rendimiento del 82 %) en forma de un sólido de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 69,52 (s, 1 H), 8,92 (d, J=5,6 Hz, 1 H), 8,04 (d, J=5,6 Hz, 1 H). LCMS (m/z [M+H]+): 200,0.
Etapa 3: En un vial de 20 ml se agitó 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (600 mg, 3,0 mmol) en DMSO (0,7 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió DIEA (1 ml, 6 mmol) y se agitó durante 5 minutos y después se añadió KF (174 mg, 3 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió 1,1,1-trifluoro-N-metilpropan-2-amina racémica (419 mg, 3,3 mmol) y la mezcla se desgasificó, después se agitó a 60 °C durante 4 horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DcM para proporcionar 2-cloro-N-metil-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (680 mg, 74 %). 1H RMN (500 MHz, Acetona-d6) 69,09 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,22 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 5,93 (dddd, J = 15,3, 8,3, 7,0, 1,2 Hz, 1H), 3,61 (c, J = 1,0 Hz, 3H), 1,63 (d, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 291,7.
Etapa 4: En un reactor de microondas de 20 ml se añadieron PaladioTetraquis (99 mg, 0,086 mmol), carbonato de potasio (2,15 ml, 4,3 mmol) y 2 cloro-N-metil-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (500 mg, 1,72 mmol) y ácido piridin-4-ilborónico (233 mg, 1,89 mmol) en acetonitrilo (8 ml) para proporcionar una suspensión de color amarillo. La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 30 min en microondas. La mezcla en bruto se diluyó con DCM, H2O, se separó y se extrajo con DCM x3. Se combinaron las fases orgánicas y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0 10 %/DCM para proporcionar el Ejemplo 47, el producto racémico, después seguido de HPLC quiral (columna OJ-H de 21x250 mm con CO2 al 85 % como fase A y MeOH al 15 % como fase B, caudal 2 ml/min, 30 °C, tiempo de elución 3,5 min) para separar los enantiómeros para proporcionar los Ejemplos 4ba y 48b.
Ejemplo 48a: N-metil-2-(piridin-4-il)-N-[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,33 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,86 - 8,75 (m, 2H), 8,63 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,38 - 8,30 (m, 2H), 8,20 (dd, J = 6,0, 0,9 Hz, 1H), 6,11 (qt, J = 8,5, 7,4 Hz, 1H), 3,50 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,61 (d, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 334,1. Quiral HPLC TR = 1,73 min. La estereoquímica absoluta se confirmó mediante la estructura cristalina de rayos X.
Ejemplo 48b: N-metil-2-(piridm-4-il)-N-[(2R)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,33 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,86 - 8,75 (m, 2H), 8,63 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,38 - 8,30 (m, 2H), 8,20 (dd, J = 6,0, 0,9 Hz, 1H), 6,11 (qt, J = 8,5, 7,4 Hz, 1H), 3,50 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,61 (d, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 334,1. Quiral HPLC TR = 1,25 min. La estereoquímica absoluta se confirmó mediante la estructura cristalina de rayos X.
Ejemplo 49: 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}pentan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,57 (s, 1H), 9,15 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,82 - 8,72 (m, 2H), 8,56 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,44 - 8,37 (m, 2H), 7,69 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 2,08 (s, 2H), 1,87 (s, 6H), 1,48 (d, J = 0,8 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 338,2.
Ejemplo 50: 4,4,4-trifluoro-2,3-dimetil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}butan-2-ol (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de clorhidrato de 2-amino-3,3,3-trifluoro-2-metilpropanoato de metilo y 4-cloro-2-(piridin-4-M)pirido[3,4-d]pirimidina como se describe en la Etapa C, Ejemplo 1, seguido de la reacción de Grignard con bromuro de metilmagnesio.
Reacción de Grignard: se agitó 3,3,3-trifluoro-2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propanoato de metilo (7 mg, 0,019 mmol) con bromuro de metilmagnesio (1,4 M en hexanos, 0,133 ml) en DCM a 0 °C durante 1 hora. No se observó material de partida mediante TLC o LCMS. La reacción se interrumpió mediante MeOH y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0 10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (66 %). 1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,28 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,77 - 8,71 (m, 2H), 8,67 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,44 - 8,38 (m, 2H), 7,85 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 2,09 (d, J = 1,4 Hz, 3H), 1,55 (t, J = 2,2 Hz, 3H), 1,37 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 378,2.
Ejemplo 51: (1-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il]ammo}ciclopentil)metanol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Cloroformo-d) 59,35 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,82 - 8,75 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,30 - 8,24 (m, 2H), 7,49 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 3,99 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 2,19 (td, J = 7,3, 6,7, 2,5 Hz, 4H), 1,94 - 1,78 (m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 322,2.
Ejemplo 52: N-(3-metoxiciclobutil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,19 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,87 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 8,80 - 8,72 (m, 2H), 8,66 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,37 - 8,32 (m, 2H), 8,25 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 4,53 - 4,42 (m, 1H), 3,84 - 3,74 (m, 1H), 3,20 (s, 3H), 2,89 -2,79 (m, 2H), 2,11 (tdd, J = 9,0, 7,5, 2,8 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,1.
Ejemplo 53: (1R,2R)-1-N,2-N-dimetil-1-N-[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]ciclohexano-1,2- diamina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,23 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,73 - 8,68 (m, 2H), 8,53 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,46 - 8,41 (m, 2H), 8,22 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 3,47 (s, 3H), 2,91 (dd, J = 13,0, 9,0 Hz, 1H), 2,39 (s, 3H), 2,30 (dtt, J = 12,6, 5,1,2,5 Hz, 1H), 2,04 (dp, J = 12,4, 3,1 Hz, 1H), 1,90 (dddd, J = 23,1, 13,0, 5,6, 3,0 Hz, 2H), 1,84 - 1,74 (m, 1H), 1,58 (qt, J = 12,7, 3,5 Hz, 1H), 1,42 (qt, J = 13,2, 3,3 Hz, 1H), 1,33 - 1,23 (m, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 349,2.
Ejemplo 54: (1s,3s)-3-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il]ammo}ciclobutano-1-carboxilato de metilo (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,20 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,95 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 8,82 - 8,72 (m, 2H), 8,67 (d, J = 5,5 H), 8,25 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 4,95 (h, J = 7,3 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,27 -3,21 (m, 1H), 2,72 2,5 Hz, 2H), 2,62 - 2,51 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 336,1.
idin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]am ino}ciclobutano-1-carboxilato de etilo (Ejemplo de
oformo-d) 59,27 (dd, J = 12,0, 4,4 Hz, 1H), 8,83 - 8,74 (m, 2H), 8,54 - 8,40 (m, 1H), 8,40 - 8,31 1H), 4,32 - 4,16 (m, 2H), 3,03 - 2,85 (m, 2H), 2,49 (dddd, J = 11,8, 9,4, 7,1, 2,3 Hz, 2H), 2,31 -= 9,6, 7,5, 7,0, 1,8 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 350,2.
1-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]am ino}ciclobutano-1-carboxílico (Ejemplo de
El compuesto del título se preparó mediante hidrólisis del éster etílico del Ejemplo 55.
Hidrólisis: una suspensión del ejemplo 55 (27 mg, 0,077 mmol) e hidróxido de litio (0,077 ml, 0,077 mmol) en MeOH (2 ml) se agitó a 90 °C durante 3 h hasta que la LCMS indicó que no quedaba material de partida. La mezcla de reacción se neutralizó con 2 ml de HCl 1 M. La capa acuosa se extrajo de nuevo con DCM x5. La capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó y se concentró. El residuo se lavó con DCM/éter para proporcionar el compuesto del título (92 %).
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 12,49 (s, 1H), 9,35 (s, 1H), 9,23 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80 - 8,72 (m, 2H), 8,70 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,34 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 8,32 - 8,21 (m, 2H), 2,82 (ddd, J = 13,3, 8,8, 4,9 Hz, 2H), 2,49 - 2,43 (m, 2H), 2,12 - 1,96 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 322,1.
Ejemplo 57: ácido (1s,3s)-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}ciclobutano-1-carboxílico (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó mediante hidrólisis del éster etílico del Ejemplo 54 usando el procedimiento como se describe en el Ejemplo 56. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,26 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 9,21 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 9,02 - 8,93 (m, 2H), 8,73 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,66 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 8,38 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 4,92 (c, J = 7,4 Hz, 1H), 3,19 -3,11 (m, 1H), 2,76 - 2,68 (m, 2H), 2,56 (ddd, J = 12,9, 6,5, 2,7 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 322,1.
Ejemplo 58: 2-(piridm-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,27 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,84 - 8,77 (m, 2H), 8,72 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,51 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,30 - 8,24 (m, 2H), 7,98 (s, 1H), 1,91 (s, 6H).LCMS (m/z [M+H]+): 334,1.
Ejemplo 59: N-terc-butil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,82 - 8,77 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,34 - 8,29 (m, 2H), 7,88 (s, 1H), 1,66 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Ejemplo 60: N-(1-metilciclobutil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,17 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,77 (dd, J = 6,3, 1,9 Hz, 2H), 8,63 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,33 -8,29 (m, 2H), 8,27 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 2,70 - 2,64 (m, 1H), 2,58 - 2,53 (m, 1H), 2,35 - 2,26 (m, 2H), 2,04 - 1,81 (m, 2H), 1,71 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 292,2.
Ejemplo 61: 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}butan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,19 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,83 - 8,77 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,34 - 8,29 (m, 2H), 8,17 (s, 1H), 8,12 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 3,68 - 3,61 (m, 2H), 2,19 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 1,66 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 310,2.
Ejemplo 62: 2-(piridm-4-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclobutil]pirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,26 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,81 - 8,76 (m, 2H), 8,71 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 8,30 - 8,25 (m, 2H), 2,91 - 2,76 (m, 4H), 2,11 - 1,96 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 346,1.
Ejemplo 63: N-(2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,19 - 9,12 (m, 1H), 8,72 (ddt, J = 6,3, 4,7, 1,6 Hz, 2H), 8,57 (dd, J = 5,8, 2,6 Hz, 1H), 8,43 (tt, J = 7,3, 3,4 Hz, 2H), 8,24 - 8,17 (m, 1H), 2,23 (qd, J = 6,7, 6,0, 2,6 Hz, 2H), 1,66 (s, 6H), 0,94 (td, J = 7,4, 1,6 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
Ejemplo 64: 2-(piridin-4-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclopropil]pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,40 (s, 1H), 9,29 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,83 - 8,78 (m, 2H), 8,71 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40 - 8,35 (m, 2H), 8,27 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 1,65 - 1,55 (m, 2H), 1,41 - 1,37 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 332,1.
Ejemplo 65: N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
En un vial de 20 ml se agitó 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) (200 mg, 0,82 mmol) en DCM (5 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió DIEA (324 microlitros, 1,85 mmol) y se agitó durante 5 minutos y después se añadió KF (48 mg, 0,82 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió ciclopentanamina (84 mg, 0,99 mmol) y se desgasificó, después se agitó a 25 °C durante 16 horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH®(ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (51 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 9,20(s, 1H), 8,78(d, 2H), 8,55(d, 1H), 8,31 (d, 2H), 8,03(d, 1H), 5,15-5,10(m, 1H), 3,34(s, 3H), 1,35(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 292,2.
Ejemplo 66: 2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}propan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,82 - 8,77 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,38 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,30 (dt, J = 4,5, 1,7 Hz, 2H), 7,62 (s, 1H), 4,95 - 4,89 (m, 1H), 3,86 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 1,57 (s, 5H). LCMS (m/z [M+H]+): 296,1.
Ejemplo 67: 3,3,3-trifluoro-2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}propan-1 -ol (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de clorhidrato de 2-amino-3,3,3-trifluoro-2-metilpropanoato de metilo y 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina como se describe en la Etapa C, Ejemplo 1, seguido de la reducción del éster metílico a alcohol con hidruro de litio y aluminio.
Reducción: se agitó 3,3,3-trifluoro-2-metil-2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)propanoato de metilo (12 mg, 0,032 mmol) con hidruro de litio y aluminio (4,8 mg, 0,127 mmol) en T<h>F a 0 °C durante 25 horas. No se observó material de partida mediante TLC o LCMS. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH, se lavó con H2O y salmuera, después se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBlFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (17 %).
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 58,37 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 7,86 - 7,81 (m, 2H), 7,74 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,54 - 7,49 (m, 2H), 7,32 (dt, J = 5,7, 1,3 Hz, 1H), 3,77 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,19 - 3,12 (m, 1H), 1,02 (d, J = 1,2 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 350,1.
Ejemplo 68: N-(butan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80 - 8,74 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,43 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,36 - 8,27 (m, 3H), 4,56 (hept, J = 6,4 Hz, 1H), 1,83 - 1,63 (m, 2H), 1,33 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Ejemplo 68a: (S)-N-(sec-butil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (68a) y (R)-N-(sec-butil)-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (68b) (Ejemplo de referencia)
El compuesto N-(butan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (26,7 mg) (Ejemplo 68) se sometió a separación quiral para proporcionar dos enantiómeros, isómero del pico 1 (TR =1,44 min) (11,7 mg) y 11,6 mg de isómero del pico 2 (Tr =1,94 min). Las asignaciones de centros quirales son provisionales. Condiciones de separación quiral: disolvente A Co 2(85 %), disolvente B MeOH (15 %), caudal 2 ml/min, temperatura 30 °C, columna 21 x 250 mm AD-H, tiempo de ejecución 3,5 minutos de inyecciones apiladas, tiempo de elución de 7 minutos.
Isómero del pico 1 (T<r>= 1,44 min): 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,77 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,43 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,36 - 8,31 (m, 2H), 8,29 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,56 (p, J = 7,2 Hz, 1H), 1,85 - 1,62 (m, 2H), 1,33 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Isómero del pico 2 (T<r>=1,94 min): 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,80 -8,72 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,43 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,35 - 8,31 (m, 2H), 8,30 (dd, J = 5,6, 0,8 Hz, 1H), 4,57 (hept, J = 6,7 Hz, 1H), 1,82 - 1,63 (m, 2H), 1,33 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Ejemplo 69: N-(2-metilbut-3-in-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,25 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,77 - 8,71 (m, 2H), 8,64 - 8,58 (m, 3H), 8,23 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 2,81 (s, 1H), 1,93 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 290,1.
Ejemplo 70: (1r,3s)-3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}ciclobutan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 9,21 (s, 1H), 8,78(d, 2H), 8,55(d, 1H), 8,31 (d, 2H), 8,05(d, 1H), 3,94(c, 2H), 3,50(s, 3H), 1,39(t, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,1.
Ejemplo 71: 2,3-dimetil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}butan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,20 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,82 - 8,77 (m, 2H), 8,67 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,28 - 8,23 (m, 2H), 8,07 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 1,64 (s, 6H), 1,27 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 324,2.
Ejemplo 72: 2-(piridm-4-il)-N-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,19 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,78 - 8,72 (m, 2H), 8,58 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,50 - 8,45 (m, 2H), 8,22 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 2,33 (d, J = 1,2 Hz, 2H), 1,77 (s, 6H), 1,01 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 336,2.
Ejemplo 73: N-(pentan-3-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79 - 8,74 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,37 - 8,30 (m, 4H), 4,47 (dtd, J = 13,2, 8,2, 5,1 Hz, 1H), 1,83 - 1,63 (m, 4H), 0,95 (t, J = 7,4 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
Ejemplo 74: (N-[2-metil-1-(morfolin-4-il)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,83 - 8,77 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,35 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 8,32 - 8,28 (m, 2H), 7,79 (s, 1H), 3,55 - 3,49 (m, 4H), 2,99 (s, 2H), 2,51 - 2,45 (m, 4H), 1,62 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 365,2.
Ejemplo 75: N-[1 -(terc-butoxi)-2-metilpropan-2-il]-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,82 - 8,77 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,38 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,33 - 8,28 (m, 2H), 7,66 (s, 1H), 3,84 (s, 2H), 1,60 (s, 6H), 1,05 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 352,2.
Ejemplo 76: 4,4,4-trifluoro-2-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il]ammo}butan-1-ol (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,23 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,81 - 8,76 (m, 2H), 8,70 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 8,2 2H), 8,22 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 5,19 (dd, J = 6,3, 5,4 Hz, 1H), 4,98 (tq, J = 9,6, 5,9 Hz, 1H), , 1H), 3,61 (dt, J = 11,0, 6,3 Hz, 1H), 2,87 -2,71 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 350,1.
(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,83 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 8,79 -8,73 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,5 Hz, 8,18 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 3,70 (td, J = 7,2, 5,6 Hz, 2H), 1,81 - 1,68 (m, 2H), 1,47 - 1,30 (m, LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
in-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]am ino}butan-1-ol (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,19 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80 - 8,74 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,40 - 8,30 (m, H), 4,54 (td, J = 8,4, 4,9 Hz, 1H), 3,72 -3,56 (m, 2H), 1,84 (ddd, J = 14,0, 7,4, 5,1 Hz, 1H), 1,68 z, 1H), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 296,1.
H-indol-3-il)-2-metilpropan-2-il]-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 510,78 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 9,21 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,86 - 8,78 (m, 2H), 8,60 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,42 - 8,36 (m, 2H), 8,30 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,47 - 7,40 (m, 1H), 7,29 (dt, J = 8,2, 0,9 Hz, 1H), 7,00 (ddd, J = 8,1,7,0, 1,1 Hz, 1H), 6,91 - 6,82 (m, 2H), 3,59 (s, 2H), 1,66 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 395,2.
Ejemplo 80: N-[1-(4-fluorofeml)-2-metilpropan-2-il]-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,23 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80 -8,75 (m, 2H), 8,58 -8,51 (m, 3H), 8,13 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,11 -7,04 (m, 2H), 6,95 -6,87 (m, 2H), 3,56 (s, 2H), 1,69 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 374,2.
Ejemplo 81: N-(2-fenilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,16 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,69 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,61 -8,56 (m, 2H), 8,53 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 7,80 - 7,75 (m, 2H), 7,55 - 7,48 (m, 2H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 7,20 - 7,12 (m, 1H), 1,89 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 342,2.
Ejemplo 82: N-(2-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,33 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,71 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,68 - 8,64 (m, 2H), 8,32 (ddd, J = 9,5, 5,1, 1,3 Hz, 3H), 7,81 (td, J = 8,0, 2,0 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 7,38 -7,31 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 318,1. Ejemplo 83: N-[2-(4-fluorofenil)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,18 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,59 -8,53 (m, 2H), 8,36 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,97 - 7,92 (m, 2H), 7,61 -7,53 (m, 2H), 7,11 -7,02 (m, 2H), 1,96 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 360,2.
Ejemplo 84: ácido 3,3,3-trifluoro-2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]am ino}propanoico (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,38 (s, 1H), 9,24 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,81 - 8,75 (m, 2H), 8,71 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,34 - 8,29 (m, 2H), 7,84 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 7,07 (s, 1H), 2,03 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 364,1.
Ejemplo 85: 2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}etan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,88 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 8,82 - 8,73 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,38 - 8,31 (m, 2H), 8,21 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 4,90 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 3,76 (ttd, J = 7,9, 5,5, 2,5 Hz, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 268,1.
Ejemplo 86: N-metil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,88 (c, J = 4,4 Hz, 1H), 8,80 - 8,73 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,40 -8,33 (m, 2H), 8,12 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 3,18 (d, J = 4,5 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 238,1.
Ejemplo 87: 1-({[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}metil)ciclopentan-1-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,81 -8,74 (m, 2H), 8,67 (dd, J = 11,8, 5,8 Hz, 2H), 8,37 -8,33 (m, 2H), 8,30 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 4,70 (s, 1H), 3,89 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 1,78 - 1,50 (m, 8H). LCMS (m/z [M+H]+): 322,2.
Ejemplo 88: N,N-dimetil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,22 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80 - 8,73 (m, 2H), 8,57 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,38 - 8,31 (m, 2H), 8,15 (dd, J = 5,8, 0,8 Hz, 1H), 3,53 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 252,1.
Ejemplo 89: N-(2-metilfeml)-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 510,22 (s, 1H), 9,29 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,76 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,72 - 8,67 (m, 2H), 8,42 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 8,09 - 8,04 (m, 2H), 7,50 (dd, J = 7,7, 1,5 Hz, 1H), 7,43 (dd, J = 7,1, 1,8 Hz, 1H), 7,40 - 7,29 (m, 2H), 2,27 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 314,1..
Ejemplo 90: N-(4-metilfenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 510,25 (s, 1H), 9,29 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,81 - 8,73 (m, 3H), 8,49 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 8,30 - 8,25 (m, 2H), 7,87 - 7,80 (m, 2H), 7,36 - 7,30 (m, 2H), 2,38 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 314,1.
Ejemplo 91: N-(4-metoxifenil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 510,24 (s, 1H), 9,27 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,80 -8,72 (m, 3H), 8,46 (dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 1H), 8,29 - 8,23 (m, 2H), 7,88 - 7,79 (m, 2H), 7,14 - 7,05 (m, 2H), 3,83 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 330,1.
Ejemplo 92: N-fenil-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 510,31 (s, 1H), 9,30 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,82 - 8,74 (m, 3H), 8,51 (dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 1H), 8,31 - 8,24 (m, 2H), 8,00 - 7,92 (m, 2H), 7,58 - 7,48 (m, 2H), 7,26 (tt, J = 7,3, 1,2 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 300,1. Ejemplo 93: N-(3-metilfeml)-2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 510,34 (s, 1H), 9,31 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,81 - 8,75 (m, 3H), 8,47 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,31 - 8,24 (m, 2H), 7,99 - 7,92 (m, 2H), 7,41 - 7,33 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 318,1.
Ejemplo 97: ácido 4-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butanoico (Ejemplo de referencia)
6) 510,43 (s, 1H), 9,16 (s, 1H), 8,79 - 8,72 (m, 2H), 8,62 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,39 -8,32 (m,
, 1H), 3,67 (c, J = 6,0 Hz, 2H), 2,33 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,94 (p, J = 6,6 Hz, 2H). LCMS (m/z
-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
d, J = 6,8 Hz, 3H), 5,73 (m, 1H), 7,22 (m, 1H), 7,47 (m, 2H), 7,55 (m, 2H), 8,26 (d, J = 5 Hz, 8,69 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,74 (d, J = 5 Hz, 1H), 9,08 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 9,19 (s, 1H). LCMS
propil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
d4) 59,19 (s, 1H), 8,73 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 8,55 (m, 3H), 8,01 (dd, J = 5,7, 0,7 Hz, 1H), 1,64 , 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 278,1.
il-2-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}propil)carbamato de terc-butilo
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (s, 1H), 8,87 (s, 2H), 8,67 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,49 (d, J = 4,6 Hz, 2H), 8,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,33 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 3,54 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 1,57 (s, 6H), 1,36 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 395,2.
Ejemplo 101: (1-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclobutil)metanol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,16 (s, 1H), 8,78 - 8,72 (m, 2H), 8,68 (s, 1H), 8,62 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,36 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,31 - 8,20 (m, 2H), 4,94 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 3,96 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 2,41 (dt, J = 12,5, 7,2 Hz, 4H), 1,89 (p, J = 8,0 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,1.
Ejemplo 102: 2-(1-{[2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il]ammo}ciclopropil)acetato de metilo (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 9,25(s, 1H), 9,05(t, 1H), 8,90(d, 2H), 8,70(d, 1H), 8,60(d, 2H), 8,24(d, 1H), 3,90(m, 2H), 3,79(t, 2H), 3,59(m, 2H), 3,55-3,49(m, 4H), 3,45(m, 2H), 3,41 (m, 2H), 2,40(t, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 336,1.
Ejemplo 103: N-(2-metilpropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1HNMR (400 MHz, CDCh) d 9,35 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 8,64 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 7,52 (dd, J = 5,6, 0,8 Hz, 1H), 6,00 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 3,66 (dd, J = 6,8, 6,0 Hz, 2H), 2,09 (nonete, J = 6,8 Hz, 1H), 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,1.
Ejemplo 104: 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}butanonitrilo (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Acetona-d6) 59,23 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,82 - 8,75 (m, 2H), 8,63 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,42 - 8,33 (m, 2H), 8,17 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 3,64 (s, 2H), 1,83 (s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 305,1.
Ejemplo 105: N-(6-aminohexil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,08 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,65 - 8,58 (m, 2H), 8,50 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,37 - 8,29 (m, 2H), 7,94 (dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 1H), 3,18 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,00 -2,92 (m, 2H), 2,66 (s, 1H), 2,44 (dq, J = 12,3, 5,9, 5,1 Hz, 1H), 1,86 (s, 1H), 1,69 - 1,43 (m, 10H), 1,38 - 1,25 (m, 2H), 0,97 (d, J = 6,4 Hz, 3H). LCMS (M/Z [M+H]+): 377,2.Ejemplo 109: dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}butil)amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 2c) como en el Esquema 2 usando la Etapa C para el Ejemplo 1 y la Etapa A para el Intermedio 6b. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,10(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,60(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,36(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 8,09(dd, J = 5,3, 0,8 Hz, 1H), 7,77(s, 1H), 7,50(dd, J = 1,5, 0,8 Hz, 1H), 7,42(dd, J = 5,3, 1,5 Hz, 1H), 6,10(s, 2H), 1,60(s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 349,1.
Ejemplos 112-197: (Ejemplos de referencia)
Estos compuestos se sintetizaron de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente usando 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y diversas aminas y compañeros de acoplamiento respectivamente, excepto que se indique otra cosa.
Ejemplo 112: 4-[4-(terc-butilamino)pirido[3,4-d]pirim idin-2-il]piridin-2-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó mediante desprotección del grupo tosilo del Ejemplo 113.
Desprotección: Se agitó N-(terc-butil)-2-(2-metil-1-(fenilsulfonil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (32 mg, 0,068 mmol) en 1 ml de t-butanol a temperatura ambiente. Después se añadió hidróxido de sodio (270 microlitros (5 M), 1,35 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante dos horas, momento en el que se consumió todo el material de partida. El material se concentró hasta obtener un aceite de color blanquecino y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-20 %/D<c>M para proporcionar el producto del título N-terc-butil-2-{2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (55 %).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 12,01(s, 1H), 9,05(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,97(dd, J = 8,0, 1,7 Hz, 1H), 8,45(d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,25(ddd, J = 23,7, 5,2, 1,3 Hz, 1H), 8,19(m, 1H), 7,42(s, 1H), 7,15(dd, J = 7,9, 4,7 Hz, 1H), 2,96(s, 3H), 1,63(s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 333,2.
Ejemplo 115: N-terc-butil-2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,95(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,54(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,46(s, 1H), 8,30(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,62(s, 1H), 1,58(s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 337,1.
Ejemplo 116: N-terc-butil-2-(3-cloropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,12(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(d, J = 0,5 Hz, 1H), 8,68(m, 2H), 8,41 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,92(s, 1H), 7,77(dd, J = 4,9, 0,6 Hz, 1H), 1,55(s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 314,1.
Ejemplo 117: N-terc-butil-2-(3-metilpiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,11(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,63(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,55(m, 2H), 8,39(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,79(m, 1H), 7,76(m, 1H), 2,59(s, 3H), 1,58(s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
Ejemplo 118: 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(2-metilbutan-2-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,12(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,78(d, J = 0,6 Hz, 1H), 8,68(dd, J = 5,3, 2,2 Hz, 1H), 8,66(m, 2H), 8,41(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,74(m, 1H), 2,00(c, J = 7,3 Hz, 2H), 1,49(s, 6H), 0,80(t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 328,1.
Ejemplo 119: 2,4-dimetil-4-({2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-il}amino)pentan-2-ol (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 2c) similar a como se describe en el Ejemplo 111 excepto por el uso de acoplamiento Stille como segunda etapa.
Acoplamiento de Stille: Se agitó 2-cloro-N-etil-N-isopropilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (30 mg, 0,12 mmol) en DMF seca (1 ml) a temperatura ambiente. Se añadió 3-fluoro-4-(tributilestanil)piridina (50,8 mg, 0,13 mmol), después aducto de PdCl2(dppf).CH2Cl2 (9,8 mg, 0,012 mmol) y Cul (2,3 mg, 0,012 mmol). La reacción se agitó durante 1 hora a 130 °C. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,72(d, J = 2,9 Hz, 1H), 8,61 (m, 1H), 8,59(m, 1H), 8,08(dd, J = 6,7, 4,9 Hz, 1H), 7,90(m, 1H), 4,92-4,88(m, 1H), 3,79(c, J = 7,0 Hz, 2H), 1,37(m, 6H), 1,32(dd, J = 23,7, 6,8 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 312,2.
Ejemplo__________121: 2-metil-1-[2-metil-2-({2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirim idm-4-il}amino)propoxi]propan-2-ol (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 111 y la amina como se describe en el Ejemplo 12.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 13,80(s, 1H), 8,99(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,55(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,44(s, 1H), 8,25(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,53(s, 1H), 4,35(s, 1H), 3,82(s, 2H), 3,17(s, 2H), 1,54(s, 6H), 1,00(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 425,2.
Ejemplo 122: 2-(3-fluoropiridm-4-il)-N-metil-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 120.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,74(d, J = 2,9 Hz, 1H), 8,60(m, 2H), 8,11(m, 1H), 8,09(m, 1H), 5,11-5,06(d, J = 6,6 Hz, 1H), 3,37(s, 3H), 1,34(d, J = 6,7 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 298,1.
Ejemplo 123: N-etil-2-(3-metilpiridin-4-il)-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,59(m, 1H), 8,56(m, 1H), 8,54(m, 1H), 7,89(m, 1H), 7,85(m, 1H), 4,95-4,90(d, J = 6,6 Hz, 1H), 3,79(c, J = 7,0 Hz, 2H), 2,60(s, 3H), 1,36(d, J = 6,6 Hz, 6H), 1,30(t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,2.
Ejemplo 124: 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,12(s, 1H), 8,79(s, 1H), 8,69(dd, J = 5,2, 1,8 Hz, 2H), 8,40(dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 1H), 7,78(s, 1H), 7,75(m, 1H), 3,73(s, 2H), 3,22(s, 3H), 1,50(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 344,1.
Ejemplo 125: 4-{[2-(3-cloropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino)-2,4-dimetilpentan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,45(s, 1H), 9,13(d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,79(s, 1H), 8,68(dd, J = 5,3, 3,4 z, 1H), 8,66(m, 1H), 7,83(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,77(dd, J = 4,9, 0,6 Hz, 1H), 5,57(s, 1H), 1,96(s, 2H), 1,65(s, 6H), 1,29(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 372,2.
Ejemplo 126: 2-(3-cloropiridm-4-il)-N-ciclopentilpirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,14(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,78(d, J = 0,6 Hz, 1H), 8,69(dd, J = 9,4, 5,2 Hz, 1H), 8,67(d, J = 6,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J - 6,8 Hz, 1H), 8,32(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,81(m, 1H), 4,61-4,57(m, 1H), 2,10-2,01(m, 2H), 1,80-1,54(m, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 326,1.
Ejemplo 127: 1-(2-{[2-(3-cloropiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}-2-metilpropoxi)-2-metilpropan-2-ol (Ejemplo de referencia )
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 111 y la amina como se describe en el Ejemplo 12.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,13(m, 1H), 8,80(d, J = 0,6 Hz, 1H), 8,69(m, 2H), 8,40(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,83(dd, J = 4,9, 0,6 Hz, 1H), 7,76(dd, J = 4,9, 0,6 Hz, 1H), 4,38(s, 1H), 3,80(s, 2H), 3,16(s, 2H), 1,51(s, 6H), 1,00(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 402,2.
Ejemplo 128: N-metil-2-(3-metilpiridin-4-il)-N-(propan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,58(m, 2H), 8,53(m, 1H), 8,03(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,87(d, J = 5,0 Hz, 1H), 5,09-5,00(m, 1H), 3,29(s, 3H), 2,60(s, 3H), 1,31 (d, J = 6,7 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,2.
Ejemplo 129: 2-(3-cloropiridin-4-il)-N-(4-metanosulfonil-2-metilbutan-2-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,15(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(d, J = 0,6 Hz, 1H), 8,69(dd, J = 21,3, 5,3 Hz, 1H), 8,65(m, 1H), 8,40(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,80(m, 1H), 7,78(m, 1H), 3,12-3,08(m, 2H), 2,87(s, 3H), 2,49-2,46(m, 2H), 1,53(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 406,1.
Ejemplo 130: N-terc-butil-2-[3-(trifluorometil)piridm-4-il]pirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de referencia)
SO-d6) 58,92(m, 1H), 8,89(m, 1H), 8,08(d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,76(d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,70(m, 1H), = 5,0, 0,8 Hz, 1H), 1,49(s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 348,1.
c-butil-2-[2-cloro-5-(trifluorometil)piridin-4-il]pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de
SO-d6) 59,08(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,87(s, 1H), 8,61(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,22(dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 382,1.
opiridin-4-il)-N-[3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-il)propil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,30(s, 1H), 9,15(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,77(s, 1H), 8,70(dd, J = 18,4, 5,2 Hz, 1H), 8,65(m, 1H), 8,25(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 3,70-3,65(td, J = 6,8, 5,1 Hz, 2H), 2,90(t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,12-2,07(m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 368,1.
Ejemplo 133: 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,01 (s, 1H), 8,41 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,91 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 2,83 (s, 3H), 1,60 (s, 3H), 1,05 - 0,94 (m, 2H), 0,91 - 0,82 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 281,1.
Ejemplo 134: 2-(3-fluorop¡r¡d¡n-4-¡l)-N-n.1.1-tr¡fluoro-2-met¡lpropan-2-¡l)p¡r¡dor3.4-dlp¡r¡m¡d¡n-4-am¡na (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 120.
1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 59,24 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,77 - 8,73 (m, 2H), 8,62 (dd, J = 4,9, 0,8 Hz, 1H), 8,52 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 8,04 (dd, J = 6,7, 4,9 Hz, 1H), 7,99 (s, 1H), 1,86 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 352,1.
Ejemplo 135: 2-(3-met¡l-1H-p¡razol-4-¡l)-N-(1,1,1-tr¡fluoro-2-met¡lpropan-2-¡l)p¡r¡do[3,4-d]p¡r¡m¡d¡n-4-am¡na (Ejemplo de referenc¡a)
1H RMN (600 MHz, Metanol-d4) 59,06 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,16 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 2,74 (d, J = 34,7 Hz, 3H), 1,92 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 337,1.
Ejemplo 136: 2-(3-fluorop¡r¡d¡n-4-¡l)-N-met¡l-N-[(2S)-1,1,1-tr¡fluoropropan-2-¡l]p¡r¡do[3,4-d]p¡r¡m¡d¡n-4-am¡na (Ejemplo de referenc¡a)
Etapa 1: Una mezcla de urea (40,00 g, 666,00 mmol) y ácido 3-aminoisonicotínico (2a, 18,40 g, 133,20 mmol) se calentó a 210 °C durante 1 hora (NOTA: no se usó disolvente). Se añadió NaOH (2 N, 320 ml) y la mezcla se agitó a 90 °C durante 1 h. El sólido se recogió mediante filtración y se lavó con agua. El producto en bruto obtenido de este modo se suspendió en HOAc (400 ml) y se agitó a 100 °C durante 1 h. La mezcla se enfrió a TA, se filtró y el sólido se lavó con una gran cantidad de agua y después se secó al vacío para proporcionar pirido[3,4-d]pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (2b, 17,00 g, rendimiento del 78 %) sin purificación adicional. LCm S (m/z [M+H]+): 164,0.
Etapa 2: A una mezcla de pirido[3,4-d]pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (2b, 20,00 g, 122,60 mmol) y POCh (328,03 g, 2,14 mol) en tolueno (200 ml) se le añadió gota a gota DIEA (31,69 g, 245,20 mmol) y esta mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante la noche (18 h) para proporcionar una suspensión.
El disolvente y POCh se retiraron al vacío, se diluyeron con DCM (50 ml), se neutralizaron con DIEA a pH=7 a -20 °C y se concentraron nuevamente, el residuo se purificó en columna (20-50 % EA/PE) para proporcionar 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (2c, 20,00 g, 99,99 mmol, rendimiento del 82 %) en forma de un sólido de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 69,52 (s, 1 H), 8,92 (d, J=5,6 Hz, 1 H), 8,04 (d, J=5,6 Hz, 1 H). LCMS (m/z [M+H]+): 200,0.
Etapa 3: En un vial de 20 ml se agitó 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (600 mg, 3,0 mmol) en DMSO (0,7 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió DIEA (1 ml, 6 mmol) y se agitó durante 5 minutos y después se añadió KF (174 mg, 3 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió 1,1,1-trifluoro-N-metilpropan-2-amina racémica (419 mg, 3,3 mmol) y la mezcla se desgasificó, después se agitó a 60 °C durante 4 horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DcM para proporcionar 2-cloro-N-metil-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (680 mg, 74 %). 1H RMN (500 MHz, Acetona-d6) 69,09 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,22 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 5,93 (dddd, J = 15,3, 8,3, 7,0, 1,2 Hz, 1H), 3,61 (c, J = 1,0 Hz, 3H), 1,63 (d, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 291,7.
Etapa 4 :: En un vial de 20 ml se agitó 2-cloro-N-metil-N-(1,1,1-trifluoropropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (100 mg, 0,34 mmol) en DMF seca (1 ml) a temperatura ambiente. Se añadió 3-fluoro-4-(tributilestanil)piridina (133 mg, 0,34 mmol) y después aducto de PdCh(dppf).CH2Ch (28,1 mg, 0,034 mmol) y Cul (6,55 mg, 0,034 mmol). La reacción se agitó durante 0,5 horas a 130 °C. La mezcla en bruto se diluyó con DCM, H2O, se separó y se extrajo con DCM x3. Se combinaron las fases orgánicas y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el producto racémico, después seguido de HPLC quiral (columna OJ-H de 21x250 mm con CO2 al 85 % como fase A y MeOH al 15 % como fase B, caudal 2 ml/min, 30 °C, tiempo de elución 2,75 min) para separar los enantiómeros para proporcionar los Ejemplos 136 y 137.
Ejemplos 136: 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 69,30 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,75 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,66 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,62 (dd, J = 4,9, 0,8 Hz, 1H), 8,24 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 6,12 - 5,98 (m, 1H), 3,51 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,57 (d,J = 7,0 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 352,1. Quiral HPLC Tr = 0,88 min..
Ejemplo 137: 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-[(2R)-1,1,1-trifluoropropan-2-il]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
-d6) 59,30 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,75 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,66 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,62 (dd, J =
24 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 6,12 -5,98 (m, 1H), 3,51 (d, J = 1,1 Hz, 3H), CMS (m/z [M+H]+): 352,1. Quiral HPLC TR = 0,70 min.
tilciclopropil)ammo]pirido[3,4-d]pirim idm-2-il)piridm-2-amma (Ejemplo de referencia)
na-d6) 59,15 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,17 - 8,09 (m, 2H), 7,98 (dd, J = 5,6, (m, 2H), 1,61 (s, 3H), 1,00 - 0,94 (m, 2H), 0,91 - 0,84 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 293,1.
iridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de
ol-d4) 59,20 (s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,68 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 8,33 (dd, J , J = 4,9 Hz, 1H), 1,88 (d, J = 1,0 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 368,1.
til-4-{[2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}pentan-2-ol (Ejemplo de
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,14 (s, 1H), 8,80 (s, 1H), 8,37 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 7,50 - 7,38 (m, 1H), 2,81 (s, 3H), 1,99 (s, 2H), 1,81 (s, 6H), 1,49 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 341,2.
Ejemplo 141: 4-{4-[(1-metilciclopropil)amino]pirido[3,4-d]pirimidin-2-il}piridin-3-carbonitrilo (Ejemplo de referencia)
na-d6) 59,23 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 9,09 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,99 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,65 (d, J =
, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,07 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 1,62 (s, 3H), 1,04 - 0,97 (m, 2H), 0,90 - 0,81 ]+): 303,1.
etil-1H-pirrolo[2,3-b]piridm-3-il}-N-propilpirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de
preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 114.
O-d6) 512,02 (s, 1H), 9,06 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,98 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz, 1H), 8,50 (t, J = 5,5 Hz, H), 8,19 (dd, J = 4,7, 1,7 Hz, 1H), 8,06 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 7,16 (dd, J = 7,9, 4,7 Hz, 1H), H), 2,96 (s, 3H), 1,90 - 1,69 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 319,2. zol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,12 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 9,00 (dd, J = 1,5, 0,8 Hz, 1H), 8,85 (s, 1H), 8,61 (dd, J = 8,9, 5,5 Hz, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,11 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 1,62 (s, 3H), (m/z [M+H]+): 317,1.
-dimetil-1H-pirazol-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,06 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,50 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,17 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 2,58 (s, 6H), 1,91 (d, J = 1,1 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 3511.
Ejemplo 145: N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-2-[3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il]pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (600 MHz, Metanol-d4) 59,06 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,38 - 8,36 (m, 1H), 8,20 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 1,90 (d, J = 1,1 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 391,1.
Ejemplo 146: 4-{4-[(4-hidroxi-2,4-dimetilpentan-2-il)ammo]pirido[3,4-d]pirim idm-2-il}piridm-3-carbomtrilo (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,55 (s, 1H), 9,38 (s, 1H), 9,07 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,95 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,27 (dd, J = 5,2, 0,8 Hz, 1H), 7,86 - 7,80 (m, 1H), 2,02 (s, 2H), 1,84 (s, 6H), 1,53 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 363,2.
Ejemplo 147: 2-(3,5-difluoropiridin-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 120.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,16 (s, 1H), 9,14 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,71 (s, 2H), 8,68 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,19 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 1,45 (s, 3H), 0,87 - 0,77 (m, 2H), 0,75 - 0,64 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 314,1.
Ejemplo 148: 2-(2,3-difluoropiridin-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 120.
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,36 (s, 1H), 8,90 (dd, J = 5,0, 0,9 Hz, 1H), 8,85 (dd, J = 1,6, 0,9 Hz, 1H), 8,69 (dd, J = 5,1, 1,6 Hz, 1H), 8,66 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,64 - 7,52 (m, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,04 - 0,94 (m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 314,1.
Ejemplo 149: N-(1-metilciclopropil)-2-(1,3-tiazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,22 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 9,08 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,69 - 8,62 (m, 1H), 8,56 d, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 1,55 (s, 3H), 0,92 - 0,86 (m, 2H), 0,86 - 0,76 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+):
etilciclopropil)-2-[2-(trifluorometil)piridin-4-il]pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de
formo-d) 59,41 (s, 1H), 8,97 - 8,89 (m, 1H), 8,88 (dd, J = 1,5, 0,8 Hz, 1H), 8,70 - 8,66 (m, 1H), - 7,77 (m, 1H), 6,95 - 6,80 (m, 1H), 1,65 (s, 3H), 1,07 - 1,01 (m, 2H), 1,01 - 0,92 (m, 2H). LCMS
(1-metilciclopropil)am ino]pirido[3,4-d]pirim idin-2-il}pirid in-2-carbonitrilo (Ejemplo de
formo-d) 59,36 (s, 1H), 8,90 (dd, J = 5,0, 0,9 Hz, 1H), 8,85 (dd, J = 1,6, 0,9 Hz, 1H), 8,69 (dd, J d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,64 - 7,52 (m, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,04 - 0,94 (m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+):
ciclopropil)-2-(1,2-oxazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,25 (s, 1H), 8,83 (s, 1H), 8,54 (dd, J = 6,0, 0,7 Hz, 1H), 7,94 - 7,88 (s a, 1H), 7,32 -7,27 (s a, 1H), 6,61 (dd, J = 6,0, 0,7 Hz, 1H), 0,91 (s, 3H), 0,85 - 0,73 (m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 268,1.
Ejemplo 153: 2-(dimetil-1,2-oxazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,05 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,89 (s, 1H), 8,54 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,10 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz,
, 3H), 1,51 (s, 3H), 0,96 - 0,84 (m, 2H), 0,83 - 0,71 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 296,1. etilciclopropil)-2-{1H-pirrolo[2,3-b]piridm-4-il}pirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de
O-d6) 511,77 (s, 1H), 9,23 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,92 (s, 1H), 8,59 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 8,16 (dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 7,69 (dd, J = 3,4, 2,0 Hz, 1H), 7,61 (t, J = 2,9 Hz, 1H), (m, 2H), 0,92 - 0,87 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 317,1.
-{1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
O-d6) 512,18 (s, 1H), 9,07 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,96 (dd, J = 7,9, 1,6 Hz, 1H), 8,51 (dd, J = 16,1, (m, 2H), 8,09 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 7,25 (dd, J = 7,9, 4,6 Hz, 1H), 3,67 (dt, J = 7,7, 5,9 Hz, 2H), 1,03 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 305,1.
-{1H-pirrolo[3,2-b]piridin-1-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,19 (ddd, J = 8,4, 1,5, 0,8 Hz, 1H), 9,13 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 9,02 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,48 (dd, J = 4,6, 1,5 Hz, 1H), 8,16 (dd, J = 5,5, 0,9 Hz, 1H), 7,35 (dd, J = 8,4, 4,6 Hz, 1H), 6,88 (dd, J = 3,8, 0,8 Hz, 1H), 3,71 - 3,63 (m, 2H), 1,85 - 1,74 (m, 2H), 1,04 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 305,1.
Ejemplo 157: 2-(3-metilpiridin-4-il)-N-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,22 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,73 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 5,8 Hz, 2H), 8,52 (dd, J = 5,8, 1,0 Hz, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,75 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 2,59 (s, 3H), 1,85 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 348,1.
Ejemplo 158: N-(1-metilciclobutil)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 13,11 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,47 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,38 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,14 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 2,48 - 2,41 (m, 2H), 2,25 (td, J = 9,0, 4,3 Hz, 2H), 1,99 - 1,81 (m, 2H), 1,67 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 281,1.
Ejemplo 159: N-(1-metilciclopropil)-2-(pirim idin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 120
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,15 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,17 - 8,09 (m, 2H), 7,98 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 7,81 - 7,70 (m, 2H), 1,61 (s, 3H), 1,00 - 0,94 (m, 2H), 0,91 - 0,84 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 279,1. Ejemplo 160: 4-{[2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}-2,4-dimetilpentan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 12,43 (s, 1H), 9,15 (s, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,46 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 7,69 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 5,61 (s, 1H), 2,61 (s, 3H), 2,55 (s, 3H), 1,95 (s, 2H), 1,70 (s, 6H), 1,32 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 355,2.Ejemplo 161: 4 N-propil-2-{7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il}pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)O-d6) 5 12,59 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 9,87 (s, 1H), 9,12 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,86 (s, 1H), 8,60 (t, J =
5,5 Hz, 1H), 8,36 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,11 (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 3,72 - 3,64 (m, 2H), 1,85 -7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 306,1.
piridm-4-il)-N-propilpirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de referencia)
O-d6) 59,15 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,89 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 8,78 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 8,68 (dd, J = (dd, J = 5,6, 0,9 Hz, 1H), 7,82 (dd, J = 4,9, 0,6 Hz, 1H), 3,60 - 3,52 (m, 2H), 1,76 - 1,65 (m, 2H), CMS (m/z [M+H]+): 300,1.
propil-1H-pirazol-4-il)-N-propilpirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
O-d6) 512,47 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,54 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 8,48 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,06 (dd, J dt, J = 7,8, 5,9 Hz, 2H), 3,24 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 3,17 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 1,77 - 1,63 (m, 2H), 0,93 H]+): 295,2.
lpiridin-4-il)-N-propilpirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,14 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,79 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,58 -8,52 (m, 2H), 8,20 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 7,85 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,62 - 3,54 (m, 2H), 2,60 (s, 3H), 1,77 - 1,66 (m, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 280,2.
Ejemplo 165: 2-{1-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il}-N-propilpirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 59,06 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,97 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz, 1H), 8,48 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 8,44 (s, 1H), 8,36 (dd, J = 4,7, 1,7 Hz, 1H), 8,09 (dd, J = 5,7, 1,0 Hz, 1H), 7,29 (dd, J = 7,9, 4,6 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,72 - 3,64 (m, 2H), 1,85 - 1,73 (m, 2H), 1,04 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 319,2.
Ejemplo 166: 2,4-dimetil-4-{[2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}pentan-2-ol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (DMSO-d6) d 1,29 (s, 6H), 1,72 (s, 6H), 1,98 (s, 2H), 5,5 (s, 1H, NH), 7,69 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,09 (s, 1H) 8,30 (s, 1H), 8,48 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,99 (s, 1H), 9,13 (s, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 327,2.
Ejemplo 167: N-[(1R)-1-feniletil]-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (MeOH-d4) d 1,70 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 5,63 (m, 1H), 7,21 (m, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,49 (m, 2H), 8,17 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,20-8,23 (2H), 8,48 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 9,00 (s, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 317,2.
Ejemplo 168: 2-(5-metil-1H-pirazol-4-il)-N-[(1R)-1-feniletil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (MeOH-d4) d1,70 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 2,54 (s, 3H), 5,65 (m, 1H), 7,20 (m, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,44(m, 2H), 8,14 8,18 (2H), 8,46 (s, 1H), 9,00 (s, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 331,2.
Ejemplo 169: N-metil-2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (DMSO-d6) d 0,95 (s, 4H), 1,70 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 4,35 (s, 3H), 7,04 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,56 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 9,16 (s, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 295,2.
Ejemplo 170: 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-[(1R)-1-femletil]pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (MeOH-d4) d 1,60 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 4,02 (s, 3H), 5,46 (m, 1H), 6,86 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,10 (m, 1H), 7,22 (m, 2H), 7,33 (m, 2H), 8,11 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,44 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,96 (s, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 331,2.
Ejemplo 171: N-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (DMSO-d6) d 0,92 (s, 4H), 1,68 (s, 3H), 3,37(s, 3H), 8,10 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 8,45 (m, 1H), 9,05 (s, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 281,1.
Ejemplo 172: 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 58,99 (s, 1H), 8,43 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,87 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,42 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 0,98 - 0,93 (m, 2H), 0,85 - 0,80 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 281,1.
Ejemplo 173: 2-(1-etil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,10 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 7,98 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,07 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 1,59 (s, 3H), 1,49 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,04 - 0,95 (m, 2H), 0,93 - 0,76 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 295,2.
Ejemplo 174: N-(1-metilciclopropil)-2-(piridazm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 510,19 (dd, J = 2,1, 1,3 Hz, 1H), 9,39 (dd, J = 5,3, 1,2 Hz, 1H), 9,20 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,70 (dd, J = 5,3, 2,2 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,01 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,04 - 0,98 (m, 2H), 0,97 - 0,91 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 279,1.
Ejemplo 175: N-(1-metilciclopropil)-2-(1,3-oxazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,12 (s, 1H), 8,53 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,99 - 7,95 (m, 1H), 7,95 (s, 1H), 1,60 (s, 3H), 0,96 (m, 2H), 0,88 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 268,1.
Ejemplo 176: N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-pirazol-5-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,09 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,44 (s, 1H), 7,94 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,11 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 1,60 (s, 3H), 0,94 (m, 2H), 0,90 - 0,84 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 267,1.
Ejemplo 177: 2-(1H-imidazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,06 (s, 1H), 8,44 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,98 - 7,90 (m, 2H), 1,60 (s, 3H), 0,95 (m, 2H), 0,92 - 0,84 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 267,1.
Ejemplo 178: 2-(1-metil-1H-imidazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,03 (s, 1H), 8,41 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,90 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 0,8 Hz, 2H), 4,25 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 0,99 - 0,94 (m, 2H), 0,85 - 0,79 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 281,1.
Ejemplo 179: N-(1 -metilciclopropil)-2-{1H-pirrolo[3,2-b]piridm-1-il}pirido[3,4-d]pirim idm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,69 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 9,39 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,88 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 8,72 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 8,18 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,10 - 7,02 (m, 1H), 1,59 (s, 3H), 0,99 (m, 2H), 0,98 - 0,95 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 317,1.
Ejemplo 180: N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-1,2,3-triazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19 (s, 1H), 8,64 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,16 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 1,55 (s, 3H), 0,90 (m, 2H), 0,87 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 268,1.
Ejemplo 181: 2-(3-metil-1,2-oxazol-5-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,41 (s, 1H), 8,63 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 6,98 (s, 1H), 2,44 (s, 3H), 1,60 (s, 3H), 0,99 - 0,93 (m, 2H), 0,93 - 0,85 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 282,1.
Ejemplo 182: N-(1 -metilciclopropil)-2-(2H-1,2,3,4-tetrazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (s, 2H), 8,69 (s, 1H), 8,21 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 1,57 (s, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,85 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 269,1.
Ejemplo 183: 2-(1H-pirazol-4-il)-N-[1-(piridm-4-il)etil]pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,17 (s, 1H), 8,75 (d, J = 5,6 Hz, 3H), 8,37 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,32 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 8,14 -8,09 (m, 2H), 5,89 (c, J = 7,3 Hz, 1H), 1,84 (d, J = 7,2 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 318,1.
Ejemplo 184: N-terc-butil-2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,13 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,38 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 7,85 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,37 (s, 3H), 1,59 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 283,1.
Ejemplo 185: (1 -{[2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}ciclobutil)metanol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,07 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,38 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,25 -8,12 (m, 1H), 3,93 (s, 2H), 2,62 (s, 3H), 2,39 (t, J = 7,8 Hz, 4H), 1,85 (dq, J = 12,0, 8,4 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 311,2.
Ejemplo 186: 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(1-metilciclobutil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,12 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,62 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,31 - 8,24 (m, 1H), 7,53 - 7,46 (m, 1H), 6,97 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,38 - 4,31 (m, 3H), 2,48 - 2,41 (m, 2H), 2,22 (tt, J = 8,4, 3,2 Hz, 2H), 1,98 - 1,78 (m, 2H), 1,65 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 295,2.
Ejemplo 187: (1 -{[2-(1 -metil-1H-pirazol-5-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il]amino}ciclobutil)metanol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19 -9,11 (m, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,63 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,40 (dd, J = 5,7, 0,7 Hz, 1H), 7,54 - 7,47 (m, 1H), 6,95 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,32 (s, 3H), 3,90 (s, 2H), 2,35 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,92 - 1,76 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 311,2.
Ejemplo 188: 2-(1H-pirazol-4-il)-N-[1 -(trifluorometil)ciclopropil]pirido[3,4-d]pirim idin-4-am ina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,56 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,27 (s, 2H), 8,16 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 1,61 - 1,53 (m, 2H), 1,33 (d, J = 6,0 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 321,1.
Ejemplo 189: 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-[1-(trifluorometil)ciclopropil]pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,32 (s, 1H), 9,19 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,23 (dd, J = 5,7, 0,8 Hz, 1H), 7,58 - 7,47 (m, 1H), 7,07 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,37 (s, 3H), 1,64 - 1,49 (m, 2H), 1,37 (d, J = 5,8 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 335,1.
Ejemplo 190: 2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-N-[1-(piridin-4-il)etil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,00 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,54 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,51 - 8,47 (m, 2H), 8,30 (dd, J = 5,6, 0,8 Hz, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,50 - 7,40 (m, 2H), 5,54 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 2,48 (s, 3H), 1,63 (d, J = 7,1 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 332,2.
Ejemplo 191: (1-{[2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il]amino}ciclobutil)metanol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,11(m, 2H), 8,69(m, 2H), 8,39 (s, 2H), 3,92 (s, 2H), 2,39 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 1,87 (p, J = 7,7, 6,6 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 297,1.
Ejemplo 192: (1-{[2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il]ammo}ciclopropil)metanol (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,65(s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,65 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 8,41 (s, 2H), 8,26 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 3,73 (m, 2H), 1,06 - 0,96 (m, 2H), 0,94 - 0,77 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 283,1.
Ejemplo 193: 2-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-[1-(piridin-4-il)etil]pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,37 (s, 1H), 7,93 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 7,85 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,89 (c, J = 7,2 Hz, 1H), 3,43 (s, 3H), 1,00 (d, J = 7,2 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 332,2.
Ejemplo 194: N-(1-metilciclopropil)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
1HNMR (400 MHz, CD3OD) d 9,03 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,43 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,24 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,93 (dd, J = 5,6, 0,8 Hz, 1H), 1,61 (s, 3H), 0,99-0,95 (m, 2H), 0,90-0,85 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 267,1.
Ejemplo 195: 2-(1-etil-1H-pirazol-4-il)-N-(2-metilpropil)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de referencia) a) d 9,20 (s, 1H), 8,50 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,43 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,87
Hz, 2H), 3,58 (dd, J = 6,8, 6,0 Hz, 2H), 2,11 (nonet, J = 6,8 Hz, 1H), 1,56 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,06 (m/z [M+H]+): 297,2.
metil-1H-pirazol-4-il)-N-(1-metilciclopropil)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de
O-d6) d 8,99 (s, 1H), 8,72 (s, 1H), 8,46 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,03 (d, J = 1,54 (s, 3H), 0,90-0,80 (m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 281,1.
amino-2-metilpropan-2-il)-2-(1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo de
O-d6) 59,05 (s, 1H), 8,56 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 8,32 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,28 (m, 1H), 7,76 (m, H), 1,59 (s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 284,2.
-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 3c) como en el Esquema 3 usando el procedimiento del Ejemplo 1 con 1-metilcidopropanamina. 1<h>RMN (400 MHz, Metanol-d4) 58,78 - 8,66 (m, 2H), 8,61 - 8,49 (m, 2H), 8,30 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 1,63 (s, 3H), 1,04 - 0,96 (m, 2H), 0,95 - 0,86 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 312,1.
Ejemplo 199: 8-metil-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir del Ejemplo 198 usando el procedimiento para el intermedio 6b con 2,4,6-trimetil-1,3,5,2,4,6-trioxatriborinano en lugar de ácido 4-piridinborónico. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 58,79 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 8,44 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,41 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 7,98 (dd, J = 5,8, 0,8 Hz, 1H), 2,91 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 0,97 -0,75 (m, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 292,2.
Ejemplo 251: N-(terc-butil)-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó a partir de 4,5-dicloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 5d) como en el Esquema 5 usando la Etapa C del Ejemplo 1 con terc-butilamina. 1H<r>M<n>(400<m>H<z>, Metanol-d4) 59,07 (s, 1H), 8,73 (s, 2H), 8,55 (s, 1H), 8,46 - 8,39 (m, 2H), 1,72 (s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 314,1.
Ejemplo 252: 5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se preparó como el Ejemplo 251 usando 4,5-dicloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 5d) y 1-metilciclopropan-1-amina. 1HNMR (400 MHz, CDCls) d 9,18 (s, 1H), 8,81 (s a, 2H), 8,50 (s, 1H), 8,42 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 8,00 (s a, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,00-0,90 (m, 4H). LCMS (M/Z [M+H]+): 312,1.
Ejemplo 253: 5-cloro-N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-amina (Ejemplo de referencia)
Se disolvieron N-(terc-butil)-5-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-amina (Ejemplo 251, 10 mg, 0,032 mmol) y 2-(2-aminoetoxi)etanol (670 mg, 6,37 mmol) en NMP (1 ml) en un reactor de microondas de 2 ml. La reacción se calentó a 160 °C durante 1 hora (irradiación de microondas). La reacción se enfrió a ta y se diluyó con agua (20 ml), se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purificó mediante HPLC activada por masas para proporcionar el compuesto del título (40 %). 1H RMN (400 MHz, Metanold4) 58,63 (s, 1H), 8,23 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 8,18 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 8,08 (s, 1H), 3,4-3,8 (m, 8H), 1,72 (s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 383,2.
Ejemplo 254: N-(4-metoxi-2-metilbutan-2-N)-2-(pmdm-4-N)-1,7-naftmdm-4-amma
El compuesto del título se preparó a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) usando la Etapa B como en el Esquema 6.
Etapa B: En un vial de 20 ml se añadieron trietilamina (0,044 ml, 0,25 mmol), fluoruro de potasio (7,2 mg, 0,124 mmol), 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b, 30 mg, 0,124 mmol) y 4-metoxi-2-metilbutan-2-amina (16 mg, 0,137 mmol) en DMSO (1 ml) para proporcionar una suspensión de color amarillo. La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 24 horas. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (21 %).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,71 (m, 2H), 8,48(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,09(ddd, J = 12,9, 5,2, 1,3 Hz, 2H), 8,05(m, 1H), 7,26(s, 1H), 6,81 (s, 1H), 3,50(t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,22(s, 3H), 2,11 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,52(s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 323,2.
Ejemplos 255-268:
Estos compuestos se sintetizaron de acuerdo con el protocolo descrito para el Ejemplo 1 usando 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y diversas aminas respectivamente, excepto que se indique otra cosa.
Ejemplo 255: N-[2-metil-1-(propan-2-iloxi)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18(dd, J = 7,4, 0,9 Hz, 1H), 8,80(m, 2H), 8,64(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39(dd, J = 5,7, 0,9 Hz, 1H), 8,29(d, J = 6,1 Hz, 2H), 7,70(s, 1H), 3,90(s, 2H), 3,55-3,50(m, 1H), 1,61 (s, 6H), 1,00(s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 337,2.
Ejemplo 256: N-[(2S)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 7,4, 0,9 Hz, 1H), 8,73(m, 2H), 8,49(m, 1H), 8,29(d, J = 6,1 Hz, 1H), 8,20(m, 2H), 7,24(s, 1H), 7,19(d, J = 0,9 Hz, 1H), 4,02-3,99(m, 1H), 1,79-1,75(m, 1H), 1,69-1,65(m, 1H), 1,29(m, 3H), 0,09(t, J = 4,9 Hz,3H). LCMS (M/Z [M+H]+): 279,1.
Ejemplo 257: N-[(2R)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,73(m, 2H), 8,49(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,29(dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 8,20(m, 2H), 7,24(s, 1H), 7,19(d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,02-3,99(dt, J = 13,6, 6,5 Hz, 1H), 1,79-1,75(dq, J = 14,4, 7,2 Hz, 1H), 1,69-1,65(m, 1H), 1,29(d, J = 6,4 Hz, 3H), 0,09(t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (M/Z [M+H]+): 279,3.
Ejemplo 258: N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-N)-2-(pmdm-4-N)-1,7-naftmdm-4-amma
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,25(dd, J = 6,6, 0,8 Hz, 1H), 8,77(m, 2H), 8,75(s, 1H), 8,24(dt, J = 4,5, 1,9 Hz, 2H), 8,21(s, 1H), 8,11 (m, 1H), 7,52(s, 1H), 3,62(s, 2H), 3,34(s, 3H), 1,52(s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 309,4.
Ejemplo 259: N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,34(dd, J = 5,2, 0,9 Hz, 1H), 8,77(ddd, J = 6,2, 4,4, 1,7 Hz, 2H), 8,50(dd, J = 6,5, 5,8 Hz, 1H), 8,20(m, 2H), 7,80(s, 1H), 7,58(s, 1H), 4,20-4,14(m, 1H), 2,97(s, 3H), 1,25(s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 279,4. Ejemplo 260: 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butan-1-ol
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,40(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,79(m, 2H), 8,60(d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,26(m, 2H), 7,95(dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 7,89(s, 1H), 4,55(t, J = 6,8 Hz, 2H), 4,08-4,04(c, J = 5,2 Hz, 1H), 1,95(t, J = 6,9 Hz, 2H), 1,14(s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 309,3.
Ejemplo 261: N-(terc-butil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
Etapa 1: En un reactor de microondas de 20 ml se añadieron PaladioTetraquis (58,1 mg, 0,050 mmol), carbonato de potasio (1,256 ml, 2,51 mmol) y 2,4-didoro-1,7-naftiridina (200 mg, 1,005 mmol) y ácido piridin-4-Mborónico (130 mg, 1,055 mmol) en acetonitrilo (Volumen: 2 ml) para proporcionar una suspensión de color naranja. La mezcla de reacción se agitó a 120 °C durante 60 min bajo microondas. La mezcla en bruto se diluyó con DCM, H2O, se separó y se extrajo con DCM x3. Se combinaron las fases orgánicas y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLA<s>H® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DCM para proporcionar el producto (62 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,58 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,85 - 8,78 (m, 4H), 8,32 - 8,29 (m, 2H), 8,11 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H). LCMS [M+H] = 242.
Etapa 2: En un vial de 40 ml se añadieron fluoruro de potasio (11,54 mg, 0,199 mmol), 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (40 mg, 0,166 mmol) y 2-metilpropan-2- amina (0,035 ml, 0,331 mmol) en DMSO (volumen: 2 ml) para proporcionar una suspensión de color amarillo. La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 24 h. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el producto (82 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,22 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,78 -8,72 (m, 2H), 8,48 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,30 (dd, J = 6,0, 0,9 Hz, 1H), 8,15 - 8,06 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,73 (s, 1H), 1,56 (s, 9H). LCMS [M+H] = 279,2.
Ejemplo 262: 2,2-dimetil-1 -[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-M]piperidin-4-ol
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,41 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,80 - 8,75 (m, 2H), 8,60 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,23 - 8,20 (m, 2H), 8,18 -8,14 (m, 1H), 8,11 (s, 1H), 4,15 -3,99 (m, 1H), 3,52 (d, J = 16,1 Hz, 1H), 3,16 (s, 1H), 1,86 - 1,68 (m, 2H), 1,46 (d, J = 16,0 Hz, 3H), 1,16 -1,00 (m, 3H), 0,87 (d, J = 6,8 Hz, 2H). LCMS (M/Z [M+H]+): 335,2.
Ejemplo 263: 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}pentan-2-ol
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,22 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78 -8,67 (m, 2H), 8,63 (s, 1H), 8,40 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,19 - 8,09 (m, 2H), 7,81 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 2,08 (s, 2H), 1,75 (s, 6H), 1,47 (d, J = 0,7 Hz, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 337,2.
Ejemplo 264: N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
tona-d6) 59,26 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,77 - 8,66 (m, 2H), 8,44 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,23 - 8,15 (m, ,9 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,70 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,40 - 4,25 (m, 1H), 2,29 -2,19 (m, 2H), 1,86 -Z [M+H]+): 279,1.
-metil-3-[[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butil)amina
tanol-d4) 59,40 (s, 1H), 8,91 (s, 2H), 8,62 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 8,48 (s, 2H), 8,40 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 3,28 - 3,23 (m, 2H), 2,92 - 2,81 (m, 6H), 2,48 (dd, J = 8,3, 5,1 Hz, 2H), 1,71 (d, J = 2,7 Hz, ): 336,2.
l-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
tona-d6) 59,35 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,78 - 8,74 (m, 2H), 8,51 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,23 - 8,19 (m, ,9 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 3,62 (c, J = 7,1 Hz, 4H), 1,29 (t, J = 7,1 Hz, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+):
-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol
1H RMN (500 MHz, Metanol-d4) 59,25 (s, 1H), 8,73 (d, J = 5,2 Hz, 2H), 8,45 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,14 -8,08 (m, 3H), 7,40 (s, 1H), 3,73 (s, 2H), 3,39 (s, 2H), 1,63 (s, 6H), 1,18 (s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 367,2.
Ejemplo 268: N-propil-2-(pmdm-4-N)-1,7-naftmdm-4-amma
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,22 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,77 - 8,70 (m, 2H), 8,48 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,22 - 8,16 (m, 3H), 7,60 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 3,43 (ddd, J = 7,6, 6,6, 5,5 Hz, 2H), 1,79 - 1,67 (m, 2H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (M/Z [M+H]+): 265,1.
Ejemplo 269: N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
El compuesto del título se preparó a partir de 2,4-dicloro-1,7-naftiridina (intermedio 6a') como en el Esquema 6 usando 3 metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-carboxilato de terc-butilo y terc-butilamina. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 12,81 (s, 1H), 9,00(d, J = 0,7 Hz, 1H), 8,31 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,14(dd, J = 5,9, 0,8 Hz, 1H), 8,00(s, 1H), 6,97(s, 1H), 6,36(s, 1H), 2,65(s, 3H), 1,51 (s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 282,4.
Ejemplo 270: N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
Etapa 1: Se agitó 2,4-dicloro-1,7-naftiridina (6a, 100 mg, 0,502 mmol) en DMF seca a temperatura ambiente. Se añadió 4-(tributilestanil)pirimidina (165 ul, 0,502 mmol) y después 41 mg de aducto de PdCl2(dppf).CH2Cl2 (41 mg, 0,05 mmol, sólido de color naranja) y por último Cul (10 mg, 0,05 mmol, sólido de color beige). La reacción se agitó durante 1 hora a 130 °C. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el producto 4-cloro-2-(pirimidin-4-M)-1,7-naftiridina (30 %). LCMS (m/z [M+H]+): 243,6.
Compuesto del título: se preparó después con 4-cloro-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridina usando el procedimiento detallado en la Etapa C, Ejemplo 1.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,48(d, J = 1,4 Hz, 1H), 9,25(d, J = 0,8 Hz, 1H), 9,00(d, J = 5,3 Hz, 1H), 8,54(m, 1H), 8,50(m, 1H), 8,31 (dd, J = 6,1,0,9 Hz, 1H), 8,01 (s, 1H), 6,80(s, 1H), 1,56(s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 280,3.
Ejemplo 271: 2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina
Etapa 1: Se agitaron 2,4-dicloro-1,7-naftiridina (6a', 400 mg, 2 mmol), Pd2(dba)3 (58 mg, 0,1 mmol) y PPh3 (53 mg, 0,2 mmol) en 3 ml de tolueno a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después se añadieron 680 microlitros de tributil(1-etoxivinil)estanano (680 microlitros, 2 mmol) en 1,5 ml de tolueno y la reacción se agitó a 110 °C durante 1 hora. La reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron 4 ml de HCl 1 N y la mezcla se agitó durante la noche. Después, la reacción se neutralizó con NaOH y se extrajo con éter. Después, el residuo en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBlFLASH® (ISCO) usando EtOAc al 0-70 %/hexano para proporcionar el producto 1-(4-cloro-1,7-naftiridin-2-il)etanona (40 %). LCMS (m/z [M+H]+): 207,5.
Etapa 2: Se agitó 1-(4-cloro-1,7-naftiridin-2-il)etanona (38 mg, 0,18 mmol) en DMF (2 ml) a temperatura ambiente y se desgasificó con N2. Se añadió TEA (37 microlitros, 0,27 mmol) y se agitó durante 5 minutos, después se añadieron 14 mg de KF (14 mg, 0,27 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió 2-metilpropan-2-amina (28 microlitros, 0,27 mmol) y la mezcla se desgasificó, después se agitó a 80 °C durante dos horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando EtOAc al 0-100 %/hexano para proporcionar el producto 1-(4-(terc-butilamino)-1,7-naftiridin-2-il)etanona (60%). LCMS (m/z [M+H]+): 244,3.
Etapa 3: Se agitó 1-(4-(terc-butilamino)-1,7-naftiridin-2-il)etanona (25 mg, 0,1 mmol) en 0,8 ml de DMF/DMA a 110 °C durante 6 horas. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISc O) usando EtOAc al 0-100 %/hexano para proporcionar el producto (E)-1-(4-(terc-butilamino)-1,7-naftiridin-2-il)-3-(dimetilamino)prop-2-en-1-ona (30%). LCMS (m/z [M+H]+): 299,4.
Etapa 4: Se agitó (E)-1-(4-(terc-butilamino)-1,7-naftiridin-2-il)-3-(dimetilamino)prop-2-en-1-ona (8 mg, 0,027 mmol) en EtOH (0,7 ml) a temperatura ambiente. Se añadió nitrato de guanidina (4 mg, 0,034 mmol) y la reacción se agitó a 100 °C durante 20 minutos. Después se añadió etóxido de sodio (en EtOH, 20 microlitros, 0,054 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante la noche. Después, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-20 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (30 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,48(m, 1H), 8,41(m, 1H), 8,29(dd, J = 6,0, 0,9 Hz, 1H), 7,91(s, 1H), 7,62(d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,74(s, 2H), 6,65(s, 1H), 1,56(s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 295,4.
Ejemplos 272-274:
Estos compuestos se sintetizaron de acuerdo con el protocolo utilizado para la preparación del Ejemplo 269 con 2,4-dicloro-1,7-naftiridina (6a') y diversos ácidos o ésteres borónicos respectivamente.
Ejemplo 272: N-terc-butil-2-{1H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il}-1,7-naftiridin-4-amina
O-d6) 11,86(s, 1H), 9,23(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,50(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,39(d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,61(m, 1H), 7,32(s, 1H), 6,96(dd, J = 3,4, 1,9 Hz, 1H), 6,67(s, 1H), 1,56(s, 9H). LCMS (M/Z
il-2-(piridazin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
-d6) 59,97(s, 1H), 9,40(d, J = 0,8 Hz, 1H), 9,24(s, 1H), 8,50(d, J = 4,6 Hz, 1H), 8,36(d, J = 0,8 (s, 1H), 6,80(s, 1H), 1,58(s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 280,3.
piridin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina
O-d6) 59,18(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,45(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,26(m, 1H), 8,05(dd, J = 5,30,7 Hz, 1H), 7,14(m, 1H), 6,63(s, 1H), 6,09(s, 2H), 1,55(s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 294,4.
tetizaron de acuerdo con el protocolo utilizado para la preparación del Ejemplo 270 con 2,4-rmedio 6a', Esquema 6) y diversos reactivos ded organoestaño y aminas respectivamente.
2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,33(d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,78(d, J = 2,7 Hz, 1H), 8,62(dd, J = 4,9, 1,1 Hz, 1H), 8,55(d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,02(dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 7,88(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,42(d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,50(c, J = 7,0 Hz, 4H), 1,21(t, J = 7,0 Hz, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 297,1.
Ejemplo 276: (3-{[2-(3-fluoropmdm-4-N)-1,7-naftmdm-4-N]ammo}-3-metNbutN)dimetNamma
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,74(d, J = 2,8 Hz, 1H), 8,60(dd, J = 4,9, 1,1 Hz, 1H), 8,53(d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,04(dd, J = 6,9, 4,9 Hz, 1H), 7,91-7,83(s, 1H), 7,25(d, J = 1,4 Hz, 1H), 2,60-2,54(m, 2H), 2,33-2,24(m, 6H), 1,96-1,88(m, 2H), 1,51(s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 354,2.
Ejemplo 277: 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-(propan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,33(m, 1H), 8,78(d, J = 2,7 Hz, 1H), 8,61(dd, J = 4,9, 1,1 Hz, 1H), 8,55(dd, J = 5,9, 2,5 Hz, 1H), 8,05-8,01(dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 7,85(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,41(d, J = 1,4 Hz, 1H), 4,20-4,14(m, 1H), 2,93(s, 3H), 1,28(m, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 297,1.
Ejemplo 278: 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(piperidin-1-il)-1,7-naftiridina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,39(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,78(d, J = 2,7 Hz, 1H), 8,63(m, 1H), 8,60(m, 1H), 8,03(dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 7,85(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,50(d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,32-3,28(m, 4H), 1,87-1,79(m, 4H), 1,72-1,65(m, 2H). LCMS (M/Z [M+H]+): 309,4.
Ejemplo 279: 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(morfolin-4-il)-1,7-naftiridina
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,40(d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,79(d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,62(m, 1H), 8,60(m, 1H), 8,03(dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 7,95(dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,54(d, J = 1,4 Hz, 1H), 3,91-3,86(m, 4H), 3,36-3,33(m, 4H). LCMS (M/Z [M+H]+): 311,1.
Ejemplo 280: N-terc-butil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
Etapa 1: En un reactor de microondas de 20 ml se agitó 2,4-didoro-1,7-naftiridina (6a, 100 mg, 0,502 mmol) en DMF seca (1 ml) a temperatura ambiente. Se añadió 3-fluoro-4-(tributilestanil)piridina (194 mg, 0,502 mmol) y después aducto de PdCl2(dppf).CH2Cl2 (41,0 mg, 0,050 mmol) y Cul (9,6 mg, 0,050 mmol). La reacción se agitó durante 0,5 horas a 130 °C. La mezcla en bruto se diluyó con DCM, H2O, se separó y se extrajo con DCM x3. Se combinaron las fases orgánicas y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DCM para proporcionar el producto 4-cloro-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridina (71 %). 1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,56 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,83 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,74 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 8,67 (dd, J = 5,0, 1,2 Hz, 1H), 8,44 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 8,18 (dd, J = 6,7, 4,9 Hz, 1H), 8,14 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H). LCMS [M+H] = 260.
Etapa 2: En un vial de 40 ml se añadieron fluoruro de potasio (7 mg, 0,12 mmol), 4-cloro-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridina (26 mg, 0,10 mmol) y 2-metilpropan-2-amina (0,035 ml, 0,331 mmol) en DMSO (Volumen: 1 ml) para proporcionar una suspensión de color amarillo. La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 24 horas. El disolvente se evaporó bajo flujo de aire. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el producto (42 %). 1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,24 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,59 (dd, J = 4,9, 1,2 Hz, 1H), 8,46 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 8,06 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,30 (s, 1H), 1,61 (s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 297,1.
Ejemplo 281: 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-(2-metilbutan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (500 MHz, Acetona-d6) 59,24 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,58 (dd, J = 4,9, 1,2 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 8,07 (dd, J = 5,9, 0,9 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,12 (s, 1H), 2,03 - 1,98 (m, 2H), 1,56 (s, 6H), 0,94 (t, J = 7,5 Hz, 3H). LCMS (M/Z [M+H]+): 311,2.
Ejemplo 282: 2-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-2-metilpropan-1-ol
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,24 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 8,59 (dd, J = 4,9, 1,2 Hz, 1H), 8,49 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 7,97 (dt, J = 5,8, 1,3 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,29 (s, 1H), 3,78 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 1,56 (s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 313,1.
Ejemplo 283: 1-[2-(3-cloropiridm-4-il)-1,7-naftiridm-4-il]-2,2-dimetilpiperidm-4-ol
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,40(s, 1H), 8,79(d, 1H), 8,62(d, 1H), 8,60(d, 1H), 8,03(dd, 1H), 7,95(d, 1H), 7,54(s, 1H), 3,91-3,86(m, 4H), 3,36-3,33(m, 4H). LCMS (M/Z [M+H]+): 311,3.
Ejemplo 284: 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-[2-metil-1 -(morfolin-4-il)propan-2-il]-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (500 MHz, Acetona-d6) 59,25 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,59 (dd, J = 4,9, 1,2 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 6,8, 4,9 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 5,9, 0,8 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,77 (s, 1H), 3,70 - 3,64 (m, 4H), 2,75 (s, 2H), 2,69 - 2,62 (m, 4H), 1,60 (s, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 382,2.
Ejemplo 285: N-terc-butil-2-(3-cloropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,20 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,78 - 8,69 (m, 1H), 8,65 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,06 (dt, J = 5,9, 1,0 Hz, 1H), 7,79 -7,70 (m, 1H), 7,25 (s, 1H), 1,60 (s, 9H). LCMS (M/Z [M+H]+): 313,1.
Ejemplo 286: 2-(3-cloropiridin-4-il)-N,N-dietil-1,7-naftiridin-4-amina
1H RMN (400 MHz, Acetona-d6) 59,31 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,75 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 8,67 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,93 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 7,76 (dd, J = 4,9, 0,6 Hz, 1H), 7,39 (s, 1H), 3,58 (c, J = 7,1 Hz, 4H), 1,29 (t, J = 7,1 Hz, 6H). LCMS (M/Z [M+H]+): 313,1.
Ejemplo 287: M-propil-2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-amma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó de acuerdo con el protocolo descrito para el Ejemplo 111 usando 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 2c) y propan-1-amina y 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-carboxilato de terc-butilo. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 513,81 (s, 1H), 9,01 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,64 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 8,61 - 8,57 (m, 1H), 8,55 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,11 (dd, J = 5,6, 1,0 Hz, 1H), 3,64 - 3,56 (m, 2H), 1,73 - 1,62 (m, 2H), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 3H). LCMS (M/Z [M+H]+): 323,1.
Ejemplo 288: 3-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclopropil)-2,6-naftiridin-1-amina (Ejemplo de referencia)
Etapa A: A una suspensión de ácido 3-metilisonicotínico (1) (10 g, 72,9 mmol) en diclorometano (200 ml) se le añadió DMF (200 ml) a 0 °C. Se añadió cloroformiato de etilo (8,6 ml, 12,5 g, 98,4 mmol) gota a gota durante 10 min a 0 °C para dar como resultado una mezcla que se agitó a 0°C durante 15 min. Se añadió ferc-butilamina (35,0 ml, 24,2 g, 330.0 mmol) gota a gota durante 15 min a la mezcla de reacción a 0 °C y la mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar como resultado un residuo que se sometió a cromatografía (hexanos:EtOAc) para proporcionar 2 (11,6 g, 83%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-^) 58,46 (s, 1 H), 8,43 (d,J= 5,0 Hz, 1 H), 7,20 (d,J= 5,0 Hz, 1 H), 2,29 (s, 3H), 1,37 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 193.
Etapa B: A una solución de 2 (11,6 g, 60,3 mmol) en THF (440 ml) se le añadió una solución de N-BuLi (58,0 ml, 145.0 mmol, 2,5 M en hexanos) gota a gota durante 15 min a -45 °C en atmósfera de N2 para dar como resultado una mezcla que se agitó durante 45 min a -45 °C. Después, una solución de isonicotinato de etilo (10,0 g, 66,3 mol) en THF (20 ml) se añadió gota a gota durante 15 minutos a -45 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 h y se vertió en una solución acuosa saturada de NH4Cl (1000 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3x400 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCI (100 ml), se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron a presión reducida para proporcionar 3 en bruto. LCMS (m/z [M+H]+): 298. El producto en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación.
Etapa C: Una solución de 3 en bruto de la Etapa B en ácido acético (200 ml) se calentó a 100 °C durante 16 h, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a ~80 ml a presión reducida. Se añadió agua (120 ml) y la mezcla se filtró para proporcionar un precipitado de color blanco que se lavó con agua (2 x 50 ml) y se secó a presión reducida para proporcionar 4 en bruto (8,08 g). LCMS (m/z [M+H]+): 225. El producto en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación.
Etapa D: A una suspensión de 4 en bruto (8,08 g) en EtOH (100 ml) se le añadió una solución acuosa de NH4OH (80 ml, 28,5 %) a temperatura ambiente para dar como resultado una mezcla que se agitó durante 2,5 h y se evaporó para proporcionar 5 en bruto. LCMS (m/z [M+H]+): 242. El producto en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación.
Etapa E: A una suspensión de crudo. 5 del Etapa D en EtOH (100 ml) se le añadió agua (20 ml) y después solución acuosa de HCl (12 M, 25 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 19 h a temperatura ambiente y se filtró para proporcionar un sólido de color blanco que se secó a presión reducida para proporcionar 6 en bruto (10,2 g). LCMS (m/z [M+H]+): 224. El producto en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación.
Etapa F: Una suspensión de 6 en bruto (10,2 g) en POCl3 (75 ml) en un recipiente a presión ChemGlass abierto de pared gruesa y fondo redondo (350 ml) se calentó muy lentamente hasta que la temperatura alcanzó 100 °C y se agitó a 100 °C durante 30 min. Después, el recipiente a presión se selló y la mezcla de reacción se calentó a 135 °C durante 14 h. El POCl3 se retiró a presión reducida y el residuo se mezcló con agua helada (50 g de hielo y 50 ml de agua). El pH de la mezcla se ajustó a ~7 con solución acuosa de NaOH (1 M) y después a ~10 con solución acuosa saturada de Na2CO3. La filtración de la mezcla proporcionó un sólido que se secó a presión reducida para proporcionar 7 (7,1 g, rendimiento del 49 % para 5 etapas de 2). 1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 59,59 (s, 1H), 8,94 (s, 1H), 8,89 (d,J= 5,6 Hz, 1H), 8,78 (d,J= 4,8 Hz, 2H), 8,15 (d,J= 4,8 Hz, 2H), 8,14 (d,J= 5,6 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 242.
Etapa G: A una solución de intermedio 7 (60,0 mg, 0,25 mmol) y 1-(trifluorometil)ciclopropan-1-amina (93,0 mg, 0,74 mmol) en dioxano (1 ,0 ml) se le añadieron bis(tri-terc-butilfosfina)paladio (13,0 mg, 0,2 micromol) y terc-butóxido de sodio (71,0 mg, 0,74 mmol). La mezcla de reacción se calentó a atmósfera de N2 a 130 °C durante la noche y se concentró dando como resultado un residuo que se sometió a cromatografía (MeOH/DCM) para proporcionar el compuesto del título.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 59,35 (s, 1H), 8,95 (d,J= 8,0 Hz, 2H), 8,75 (d,J= 4,0 Hz, 1H), 8,71 (s, 1H), 8,57 (d,J= 8,0 Hz, 2H), 8,34 (s, 1H), 8,31 d,J= 4,0 Hz, 1H), 1,57 (m, 2H), 1,31 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 331.
Ejemplo 289: N-(1-metilciclopropil)-7-(piridin-4-il)isoquinolin-5-amina (Ejemplo de referencia)
EtapaA:Una suspensión de 7-bromoisoquinolina (1) (300 mg, 1,44 mmol), ácido piridin-4-ilborónico (213 mg, 1,73 mmol), dicloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(M) (PdCl2(PPh3)2, 98 mg, 0,14 mmol) y carbonato de potasio (2 N, 4,3 ml) en DMF (7 ml) se agitó y se calentó a 100 °C durante 3 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de celite. La solución se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc x3. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl, se secaron sobre MgSO4y se evaporaron a presión reducida. El producto en bruto resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema COMBIFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DCM para proporcionar 7-(piridin-4-il)isoquinolina (2, 282 mg) en forma de un aceite de color pardo pálido. LCMS (m/z [M+H]+): 207.
Etapa B: A una solución de 7-(piridin-4-il)isoquinolina (2) (282 mg, 1,37 mmol) en H2SO4 concentrado (3 ml) se le añadió N-bromosuccinimida (NBS, 488 mg, 2,74 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 h, se vertió en agua con hielo (20 ml) y se añadió solución acuosa saturada de NaHCO3 a pH ~8. La capa acuosa se extrajo con EtOA x3. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl, se secaron sobre MgSO4y se evaporaron a presión reducida. El producto en bruto resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en un sistema C<o>M<b>IFLASH® (ISCO) usando MeOH al 0-10%/DCM para proporcionar 5-bromo-7-(piridin-4-il)isoquinolina (3, 110 mg). LCMS (m/z [M+H]+): 285/287.
Etapa C: Una suspensión de 5-bromo-7-(piridin-4-il)isoquinolina (3) (30 mg, 0,105 mmol), clorhidrato de 1-metilciclopropan-1-amina (28,3 mg, 0,263 mmol), tris(dibencilidenacetona)dipaladio(0) (Pd2dba3, 9,7 mg, 0,0105 mmol), 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo (BINAP, 6,5 mg, 0,0105 mmol) y ferc-butóxido de sodio (44,3 mg, 0,462) en tolueno (1,5 ml) se calentó en atmósfera de N2 a 90 °C durante 16 h, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El residuo se diluyó en MeOH y se filtró, después se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa activada por masas con acetonitrilo al 10-90 %/agua para proporcionar el compuesto del título (6 mg). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,24 (s, 1H), 8,74 (s, 2H), 8,49 (s, 1H), 7,69 - 7,60 (m, 2H), 7,59 - 7,56 (m, 1H), 7,52 - 7,46 (m, 1H), 7,39 - 7,36 (m, 1H), 1,52 (s, 3H), 0,98 - 0,92 (m, 2H), 0,88 - 0,81 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 276.
Ejemplo 290: 2-(pmdm-4-N)-4-(3-(trifluorometil)piperazm-1-N)pmdo[3,4-d]pmmidma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó de acuerdo con el protocolo descrito, por ejemplo, 111 usando 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 2c) con 2-(trifluorometil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo y ácido piridin-4-ilborónico seguido de la desprotección del grupo N-Boc con TFA.
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 59,46 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,83 - 8,78 (m, 2H), 8,63 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,35 - 8,30 (m, 2H), 7,74 (dd, J = 5,8, 0,9 Hz, 1H), 5,80 - 5,67 (m, 1H), 4,07 (dt, J = 24,3, 12,4 Hz, 2H), 3,65 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 3,34 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 3,18 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,89 (t, J = 11,0 Hz, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 361,1.
Ejemplo 291: 4-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-(pirid¡n-4-il)-1,7-naftiridina
El compuesto del título se sintetizó a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y 1-metilpiperazina de la siguiente manera:
Una solución de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b, 30 mg, 0,124 mmol), 1-metilpiperazina (50 mg, 0,499 mmol), fosfato de potasio (132 mg, 0,621 mmol), RuPhos Pd G3 (16 mg, 0,019 mmol) y RuPhos (13 mg, 0,028 mmol) en dioxano (2 ml) se calentó en atmósfera de argón en un vial para microondas a 130 °C durante 10 min. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando acetato de etilo al 20-100 %/ciclohexano, seguido de metanol al 2-30 %/diclorometano para proporcionar el compuesto del título (21 %).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,38 (s, 1H), 8,76 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 8,55 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,85 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 3,37 (s, 4H), 2,63 (s, 4H), 2,30 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 306,3, Rt1=0,38 min. Ejemplo 292: 4-(piperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 291 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando HCl en dietiléter (etapa 2).
Etapa 2 (desprotección de Boc):
A una solución de 4-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (24 mg, 0,061 mmol) en diclorometano (5 ml) se le añadió HCl 6 M en dietil éter (2 ml, 12 mmol). La suspensión de color amarillo resultante se agitó a t.a. durante 1 h. El precipitado de color amarillo se separó mediante filtración y se lavó con diclorometano. La sal clorhidrato se disolvió en MeOH y la solución se proporcionó en un cartucho PoraPak Rxn CX de 20 cc (2 g). Después, el cartucho se lavó dos veces con 5 ml de MeOH. Por último, el compuesto se eluyó con NH37 N en MeOH. El filtrado se evaporó a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (76 %).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,37 (s, 1H), 8,76 (d, J = 4,7 Hz, 2H), 8,55 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,22 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,86 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 3,28 (s, 4H), 2,99 (s, 4H). LCMS (m/z [M+H]+): 292,3, Rti=0,38 min.
Ejemplo 293: 4-(2-metilpiperidin-1 -il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 291 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y 2-metilpiperidina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,48 - 9,32 (m, 1H), 8,86 - 8,74 (m, 2H), 8,56 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,30 - 8,16 (m, 2H), 7.86 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,72 (s, 1H), 4,10 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 3,53 -3,41 (m, 1H), 3,21 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 2,05 (s, 1H), 1.86 - 1,74 (m, 3H), 1,62 (s, 2H), 1,06 (d, J = 6,5 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 305,3, Rt1=0,98 min.
Ejemplo 294: 2-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclobutil)-1,7-naftiridin-4-amina
El compuesto del título se sintetizó a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y 1-(trifluorometil)ciclobutan-1-amina de la siguiente manera:
Una solución de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b, 100 mg, 0,414 mmol), 1-(trifluorometil)ciclobutan-1-amina (115 mg, 0,828 mmol), terc-butilato de potasio (139 mg, 1,241 mmol), Pd2(dba)3 * CHCl3 (43 mg, 0,042 mmol) y PhCPhos (36 mg, 0,085 mmol) en dioxano (5 ml) se calentó en argón en un vial para microondas a 100 °C durante 30 min. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando acetato de etilo al 20-100 %/ciclohexano, seguido de metanol al 2-10 %/diclorometano para proporcionar el compuesto del título (9 %).
1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 59,30 (s, 1H), 8,78 - 8,74 (m, 2H), 8,57 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,40 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,08 - 8,04 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 2,85 - 2,78 (m, 2H), 2,74 (d, J = 11,6 Hz, 2H), 2,04 (dd, J = 18,6, 9,7 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 345,3, Rt1=0,84 min.
Ejemplo 295: 2-metil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,2-diamina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y (1-amino-2-metilpropan-2-il)carbamato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando HCl en dietil éter (etapa 2, descrita en el Ejemplo 292).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,24 (s, 1H), 8,75 (d, J=5,14 Hz, 2H), 8,51 (d, J=5,75 Hz, 1H), 8,26 (d, J=5,75 Hz, 1H), 8,21 (d, J=5,26 Hz, 2H), 7,40 (s, 1H), 7,29 (s a, 1H), 3,38 (s a, 2H), 1,63-2,22 (m, 2H), 1,16 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,4, Rti=0,37 min.
Ejemplo 296: N-(oxetan-3-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y oxetan-3-amina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,28 (s, 1H), 8,76 (d, J=5,99 Hz, 2H), 8,57 (d, J=5,75 Hz, 1H), 8,29 (d, J=5,75 Hz, 1H), 8,21 (d, J=5,99 Hz, 2H), 8,11 (a d, J=5,75 Hz, 1H), 7,03 (s, 1H), 4,99-5,17 (m, 3H), 4,73 (t, J=5,93 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 279,3, Rt1=0,49 min.
Ejemplo 297: N-(1 -metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y 1-metilciclopropan-1-amina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,34 (s, 1H), 8,78 (d, J=5,75 Hz, 2H), 8,48 (d, J=5,87 Hz, 1H), 8,20 (d, J=5,87 Hz, 2H), 8,07 (d, J=5,87 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 3,29 (s, 3H), 3,14-3,20 (m, 1H), 0,89-0,97 (m, 2H), 0,52-0,61 (m, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 277,3, Rt1=0,73 min.
Ejemplo 298: 4-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 291 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y 2,2-dimetilpiperazina-1-carboxilato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando HCl en dietiléter (etapa 2, descrita en el Ejemplo 292).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,41 (s, 1H), 8,79 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 8,59 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,26 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 3,31 (s, 1H), 3,25 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 3,10 (s, 4H), 1,26 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 320,3, Rt1=0,45 min.
Ejemplo 299: 2,2-dimetil-4-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)morfolina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 291 a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y 2,2-dimetilmorfolina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,43 (s, 1H), 8,80 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 8,61 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,93 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 4,01 - 3,94 (m, 2H), 3,31 (s, 2H), 3,21 (s, 2H),1,39 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 321,3, Rt1=0,81 min.
Ejemplo 300: N-(1-metilciclobutil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y 1 -metilciclobutan-1-amina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,23 (s, 1H), 8,75 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 8,49 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,26 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 7,64 (s, 1H), 6,83 (s, 1H), 2,45 (t, J = 10,4 Hz, 2H), 2,32 (t, J= 9,2 Hz, 2H), 1,97 (ddd, J = 25,6, 20,0, 9,7 Hz, 2H), 1,62 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 291,3, Rt1=0,70 min.
Ejemplo 301: 2,2-dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,3-diamina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y (3-amino-2,2-dimetilpropil)carbamato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando HCl en dietil éter (etapa 2, descrita en el Ejemplo 292).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20 (s, 1H), 8,72 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 8,47 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 8,01 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,31 (s, 1H), 3,36 (s, 2H), 3,27 (s, 2H), 2,60 (s, 2H), 0,97 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 308,3, Rt1=0,41 min.
Ejemplo 302: W2,W2,2-trimetil-W1-(2-(piridm-4-il)-1,7-naftiridm-4-il)propano-1,2-diamma
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y N2,W2,2-trimetilpropano-1,2-diamina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,27 (s, 1H), 8,76 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 8,54 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 8,05 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 3,42 (s, 2H), 2,29 (d, J = 15,6 Hz, 6H), 1,16 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 322,3, Rti=0,39 min.
Ejemplo 303: 4-(2-metilpiperazin-1 -il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 291 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y 3-metilpiperazina-1-carboxilato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección con Boc usando HCl en dietil éter (etapa 2, descrita en el Ejemplo 292).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,44 (s, 1H), 8,80 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 8,60 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,28 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 7,98 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,84 (s, 1H), 4,08 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 3,60 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,42 (dd, J = 12,3, 2,9 Hz, 1H), 3,29 - 3,17 (m, 2H), 3,12 (t, J = 9,3 Hz, 1H), 2,98 (dd, J = 12,3, 4,1 Hz, 1H), 1,10 (d, J = 6,5 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 306,3, Rti=0,43 min.
Ejemplo 304: 2-metil-W1-(2-(piridm-4-il)-1,7-naftiridm-4-il)propano-1,3-diamma
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (Intermedio 6b) y (3-amino-2-metilpropil)carbamato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando HCl en dietil éter (etapa 2, descrita en el Ejemplo 292).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,25 (s, 1H), 8,76 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 8,51 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,24 - 8,16 (m, 3H), 7,96 (s, 1H), 7,27 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,50 (dd, J = 13,4, 6,8 Hz, 1H), 3,40 (dd, J = 13,8, 6,8 Hz, 1H), 2,80 (dd, J = 12,6, 6,0 Hz, 1H), 2,70 (dd, J = 12,5, 6,4 Hz, 1H), 2,11 (dq, J = 13,2, 6,6 Hz, 1H), 1,04 (d, J = 6,7 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 294,3, Rt1=0,37 min.
Ejemplo 305: (ft)-2-(piridm-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazm-1-il)-1,7-naftiridma
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 291 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y (R)-2-(trifluorometil)piperazina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,40 (s, 1H), 8,84 -8,71 (m, 2H), 8,58 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,35 -8,18 (m, 2H), 7,88 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H), 3,79 (s, 1H), 3,66 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,53 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 3,23 -2,94 (m, 5H). LCMS (m/z [M+H]+): 360,3, Rt1=0,71 min.
Ejemplo 306: N-(terc-butil)-N-metil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (intermedio 6b) y N,2-dimetilpropan-2-amina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,43 (s, 1H), 8,81 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 8,61 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,24 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 2,97 (s, 3H), 1,30 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 293,3, Rti=1,01 min.
Ejemplo 307: W-(1-metilciclobutil)-2-(pirimidm-4-il)-1,7-naftiridm-4-amma
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 270 en 2 etapas a partir de 2,4-dicloro-1,7-naftiridina (Intermedio 6a') y 4-(tributilestanil)pirimidina (etapa 1) y a partir de 4-cloro-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridina y 1-metilciclobutan-1-amina (etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,37 (s, 1H), 9,27 (s, 1H), 9,01 (dd, J = 5,2, 1,5 Hz, 1H), 8,59 - 8,48 (m, 2H), 8,29 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,58 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 2,46 (s, 2H),
2,27 (t, J = 9,8 Hz, 2H), 1,98 (dc, J = 31,9, 10,6, 10,2 Hz, 2H), 1,62 (s, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 292,4, Rt1 = 0,82 min. Ejemplo 308: W1,W1,3-trimetil-W8-(2-(pirimidm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)butano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 159 en 2 etapas a partir de 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (etapa 1) y a partir de N3-(2-cloropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina y 4-(tributilestanil)pirimidina (etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 9,29 - 9,48 (m, 2 H), 9,22 (s, 1 H), 9,05 (a d, J=5,01 Hz, 1 H), 8,70 (a d, J=5,50 Hz, 1 H), 8,38 (a d, J=5,01 Hz, 1 H), 7,91 (a d, J=4,89 Hz, 1 H), 2,21 - 2,43 (m, 8 H), 2,05 (s a, 2 H), 1,66 (s, 6 H). LCMS (m/z [M+H]+): 338,3, Rt1=0,47 min.
Ejemplo 309: W1,W1,3-trimetil-W3-(2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)butano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 111 en 2 etapas a partir de 2,4-didoropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (etapa 1) y a partir de N3-(2-doropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina y ferc-3-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-carboxilato de butilo (n.° de CAS 1009071-34-4, etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 12,57 - 12,95 (m, 1 H), 8,89 - 9,00 (m, 2 H), 8,48 (d, J=5,50 Hz, 1 H), 7,93 - 8,29 (m, 1 H), 7,75 (a d, J=5,38 Hz, 1 H), 2,55 - 2,84 (m, 5 H), 2,25 (s, 6 H), 1,99 (s a, 2 H), 1,61 (s, 6 H). LCMS (m/z [M+H]+): 340,3, Rt1=0,48 min.
Ejemplo 310: (2-metiM-((2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirim idm-4-il)amino)propan-2-il)carbamato de tere-butilo (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (1-amino-2-metilpropan-2-il)carbamato de terc-butilo.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (s, 1H), 8,78 (dd, J = 8,9, 4,9 Hz, 3H), 8,68 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,44 - 8,34 (m, 2H), 8,22 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 6,88 (s, 1H), 3,90 (d, J = 6,1 Hz, 2H),1,35 (s, 6H), 1,27 (d, J = 6,1 Hz, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 395,2, Rti=0,97 min.
Ejemplo 311: (2-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)etil)carbamato de tere-butilo (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (2-aminoetil)carbamato de terc-butilo.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19 (s, 1H), 8,93 - 8,81 (m, 1H), 8,79 - 8,68 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,03 (t, J = 6,0 Hz, 1H),3,73 (c, J = 6,2 Hz, 2H), 3,40 - 3,32 (m, 2H), 1,33 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 367,2, Rt1=0,78 min.
Ejemplo 312: 2-metil-W,-(2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)propano-1,2-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (1-amino-2-metilpropan-2-il)carbamato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando TFA (etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,83 -8,74 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,38 -8,33 (m, 2H), 8,31 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,70 (s, 2H), 1,13 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 295,2, Rt1=0,41 min.
Ejemplo 313: W1-(2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)etano-1,2-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 en 2 etapas a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (2-aminoetil)carbamato de terc-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando TFA (etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,81 -8,71 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,43 -8,30 (m, 2H), 8,20 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,73 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,94 (t, J = 6,4 Hz, 2H). LCMS (m/z [M+H]+): 267,2, Rt1=0,38 min.
Ejemplo 314: M,M,2-trimetil-2-((2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)ammo)propanamida (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y 2-amino-N,N,2-trimetilpropanamida.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,22 (s, 1H), 8,74 (dd, J = 6,9, 2,4 Hz, 3H), 8,68 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,36 - 8,31 (m, 2H), 2,95 - 2,69 (m, 6H), 1,6(s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 337,2, Rt1=0,58 min.
Ejemplo 315: W1,3-dimetil-W,-(2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)butano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y N1,3-dimetilbutano-1,3-diamina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20 (s, 1H), 8,83 - 8,69 (m, 2H), 8,55 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,40 - 8,29 (m, 2H), 8,12 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,04 -3,92 (m, 2H), 3,52 (s, 3H), 1,87 - 1,74 (m, 2H), 1,56 (s, 2H), 1,15 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 323,2, Rt1=0,49 min.
Ejemplo 316: (2,2-dimetil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirim idin-4-il)amino)propil)carbamato de tere-butilo (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (3-amino-2,2-dimetilpropil)carbamato de ferc-butilo.
1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 59,20 (s, 1H), 8,77 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 8,68 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 8,61 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 8,43 -8,30 (m, 2H), 8,17 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 7,01 (t,J = 6,6 Hz, 1H), 3,62 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 2,93 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H), 0,92 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 409,3, Rt1=1,06 min.
Ejemplo 317: 2,2-dimetN-W,-(2-(piridm-4-N)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)propano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 en 2 etapas a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (3-amino-2,2-dimetilpropil)carbamato deterc-butilo(etapa 1) y desprotección de Boc usando TFA (etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,81 -8,71 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39 -8,29 (m, 2H), 8,16 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H), 0,95 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 309,2, Rt1=0,43 min.
Ejemplo 318: 3-metil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)amino)butanamida (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y 3-amino-3-metilbutanamida.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,21 (s, 1H), 8,94 -8,80 (m, 2H), 8,77 -8,60 (m, 2H), 8,48 -8,35 (m, 2H), 8,10 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,12 (s, 1H), 2,76 (s, 2H), 1,71 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 323,3, Rt1=0,57 min.
Ejemplo 319: (ft)-2-(piridm-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazm-1-il)pirido[3,4-d]pirim idma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (R)-2-(trifluorometil)piperazina.
1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 59,31 (s, 1H), 8,79 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 8,63 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,31 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 7,97 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,60 - 4,49 (m, 1H), 4,28 - 4,21 (m, 1H), 3,82 - 3,74 (m, 1H), 3,71 - 3,64 (m, 1H), 3,63 - 3,56 (m, 1H), 3,20 - 3,12 (m, 1H), 3,12 - 3,04 (m, 1H), 2,96 - 2,87 (m, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 361,1, Rt1=0,72 min.
Ejemplo 320: 2,3-dimetil-M2-(2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)butano-2,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-doro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y 2,3-dimetilbutano-2,3-diamina.
1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 59,18 (s, 1H), 8,88 -8,74 (m, 2H), 8,66 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,40 -8,19 (m, 2H), 7,74 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 1,63 (s, 6H), 1,21 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 323,2, Rt1=0,48 min.
Ejemplo 321: (S)-2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)pirido[3,4-d]pirim idina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y (S)-2-(trifluorometil)piperazina.
1H RMN (600 MHz, DMSO-da) 59,31 (s, 1H), 8,81 - 8,77 (m, 2H), 8,63 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,34 - 8,29 (m, 2H), 7,97 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,57 - 4,52 (m, 1H), 4,28 - 4,21 (m, 1H), 3,83 - 3,74 (m, 1H), 3,71 - 3,65 (m, 1H), 3,63 - 3,57 (m, 1H), 3,20 - 3,14 (m, 1H), 3,11 -3,05 (m, 1H), 2,95 -2,88 (m, 1H). LCMS (m/z [M+H]+): 361,1, Rt1=0,72 min.
Ejemplo 322: 2-met¡l-2-((2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡dof3.4-d]p¡r¡mid¡n-4-¡l)am¡no)propanoato de etilo (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y 2-amino-2-metilpropanoato de etilo.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,23 (s, 1H), 8,83 (s, 1H), 8,80 - 8,74 (m, 2H), 8,69 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,28 - 8,23 (m, 2H), 3,99 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 1,69 (s,6H), 0,91 (t, J = 7,1 Hz, 3H). LCMS (m/z [M+H]+): 338,2, Rti=0,78 min.
Ejemplo 323: W1,W1,2,2-tetrametil-W3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)propano-1,3-diamina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (intermedio 1c) y N1,N1,2,2-tetrametilpropano-1,3-diamina. 1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 59,20 - 9,17 (m, 1H), 9,04 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 8,80 - 8,74 (m, 2H), 8,68 - 8,63 (m, 1H), 8,38 - 8,31 (m, 2H), 8,13 - 8,08 (m, 1H), 3,72 - 3,65 (m, 2H), 2,36 - 2,28 (m, 8H), 0,99 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 337,2, Rt1=0,46 min.
Ejemplo 324: 4-(4-(terc-butNammo)pirído[3,4-d]pmmidm-2-N)-1,2,5-oxadiazol-3-amma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema a partir de 3-aminoisonicotinamida y ácido 4-amino-1,2,5- oxadiazol-3-carboxílico.
Etapa 1: 4-am¡no-N-(4-carbamo¡lp¡rid¡n-3-¡l)-1.2.5-oxad¡azol-3-carboxam¡da
En un matraz ed F.R. de dos bocas equipado con bolsillo para termómetro y entrada de nitrógeno, se añadieron TBTU (4,75 g, 14,8 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,6 ml, 14,8 mmol) a una solución agitada de 3-aminoisonicotinamida (1,7 g, 12,4 mmol) y ácido 4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-carboxílico (1,92 g, 14,8 mmol) en DMF (40 ml) a 25-30 °C. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 72 h a 25-30 °C. La mezcla de reacción se vertió sobre agua (200 ml) y el sólido precipitado se recogió mediante filtración. Lavado con agua (100 ml). La purificación se realizó mediante trituración usando acetato de etilo al 20% en n-hexano para proporcionar 4-amino-N-(4-carbamoilpiridin-3-il)-1,2,5-oxadiazol-3-carboxamida (0,84 g, 27,45 %) en forma de un sólido de color blanquecino. 1H-RMN (400 MHz, DMsO-d6): 5 12,60 (s, 1H, Intercambiable con D2O), 9,70 (s, 1H), 8,64 (s, 1H, Intercambiable con D2O), 8,52 (d,J= 4,4Hz, 1H), 8,81 (s, 1H, Intercambiable con D2O), 7,80 (d,J= 4,8 Hz, 1H), 6,25 (s, 2H, Intercambiable con D2O). LCMS (m/z [M+H]+): 249,1, Rt2=1,312 min.
Etapa 2: 2-(4-am¡no-1.2.5-oxad¡azol-3-¡l)p¡r¡dof3.4-d1p¡r¡m¡d¡n-4(3H)-ona
En un tubo sellado, se añadió DBU (0,98 g, 6,45 mmol) a una suspensión agitada de 4-amino-N-(4-carbamoilpiridin-3-il)-1.2.5- oxadiazol-3-carboxamida (0,8 g, 3,22 mmol) enterc-butanol(8,0 ml). Se selló la tapa y se calentó la mezcla de reacción a 100 °C durante 16 h. El disolvente se evaporó, el residuo resultante se diluyó con agua (20 ml) y se agitó durante 0,5 h a 25-30 °C. El sólido precipitado se recogió mediante filtración y se lavó el sólido con agua (2 x 10 ml) yN-hexano (10 ml). El sólido obtenido se secó a 55 °C en un matraz giratorio para obtener (0,421 g, 56,73 %) de 2-(4-amino-1.2.5- oxadiazol-3-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4(3H)-ona en forma de un sólido de color blanquecino.
1H-RMN(400 MHz, DMSO-d6): 513,31 (s, 1H, Intercambiable con D2O), 9,36(s, 1H), 8,74 (d,J =5,2Hz, 1H), 8,01 (d,J = 5,2Hz, 1H), 6,95 (s, 2H, Intercambiable con D2O). LCMS (m/z [M+H]+): 231,2, Rts=1,279 min.
Etapa 3: 4-metilbencenosulfonato de 2-(4-am¡no-1.2.5-oxad¡azol-3-¡l)p¡r¡dor3,4-dlp¡r¡m¡d¡n-4-¡lo
En un matraz de F.R. de dos bocas equipado con un bolsillo para termómetro y entrada de nitrógeno, se añadió DMAP (0,015 g, 0,116 mmol) a una solución agitada de 2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4(3H)-ona (0,27 g, 1.168 mmol) y trietilamina (0,245 ml, 1,752 mmol) en diclorometano (10 ml) a 0 °C. Se añadió p-TsCI (0,245 g, 1.168 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 0,5 h. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a 25-30 °C retirando el baño de hielo y se agitó a 25-30 °C durante 1,5 h. La mezcla se diluyó con DCM (20 ml), se lavó con agua (2 x 20 ml) y salmuera (20 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se filtraron. El filtrado se concentró en rotavapor para proporcionar 4-metilbencenosulfonato de 2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-ilo (0,285 g, 63,21 %) en forma de producto en bruto. El producto en bruto se usó para la siguiente etapa sin purificación. LCMS (m/z [M+H]+): 385,1, Rt2 = 1,779 min.
Etapa 4: 4-(4-(terc-but¡lam¡no)p¡r¡dor3.4-dlp¡r¡m¡d¡n-2-¡l)-1.2.5-oxad¡azol-3-am¡na
En un matraz de F.R. de dos bocas equipado con bolsillo para termómetro y entrada de nitrógeno, Se añadióterc-butilamina (0,0714 g, 0,976 mmol) a una solución agitada del 4-metilbencenosulfonato de 2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-ilo (0,25 g, 0,651 mmol) en DMSO (2,5 ml) seguido de la adición de KF (0,0566 g, 0,976 mmol) y trietilamina (0,18 ml, 1,304 mmol) a 25-30 °C. Después de agitarse a temperatura ambiente durante 45 min, la mezcla de reacción se vertió sobre agua (25 ml). El sólido precipitado se recogió mediante filtración. Se lavó el sólido con agua (25 ml) y n-hexano (10 ml). La purificación se realizó mediante trituración en n-hexano: dietil éter; 1:1 (5 ml) para proporcionar 4-(4-(terc-butilamino)pirido[3,4-cf]pirimidin-2-il)-1,2,5-oxadiazol-3-amina (0,135 g, 72,75%) en forma de un sólido de color blanquecino.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 9,30 (s, 1 H), 8,67 (d, J=5,57 Hz, 1 H), 8,39 (d, J=5,58 Hz, 1 H), 8,00 (s, 1 H), 6,89 (s, 2 H), 1,60 (s, 9 H). LCMS (m/z [M+H]+): 286,1, Rt1=0,92 min.
Ejemplo 325: W2,W2,2-tr¡met¡l-W1-(2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡do[3,4-d]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)propano-1,2-d¡am¡na (Ejemplo de referenc¡a)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (Intermed¡o 1c) y N2,N2,2-trimetilpropano-1,2-diamina. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,19 (s, 1H), 8,85 - 8,72 (m, 2H), 8,65 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,36 - 8,31 (m, 2H), 8,27 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,79 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 2,27 (s, 6H), 1,09 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 323,2, Rt1=0,44 min.
Ejemplo 326: 2-met¡l-2-((2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)p¡r¡do[3,4-d]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)am¡no)propanam¡da (Ejemplo de referenc¡a)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidina (¡ntermed¡o 1c) y 2-amino-2-metilpropanamida.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,20 (s, 1H), 8,77 - 8,71 (m, 2H), 8,67 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,39 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,36 - 8,30 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 1,63 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 309,2, Rt1=0,50 min.
Ejemplo 327: (S)-1,1,1-tr¡fluoro-2-met¡l-3-((2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-1,7-naft¡r¡d¡n-4-¡l)am¡no)propan-2-ol
El compuesto del título se sintetizó de acuerdo con el esquema a continuación a partir de 2,4-dibromo-1,7-naftiridina.
Etapa 1: Una solución de 2,4-dibromo-1,7-naftiridina (350 mg, 1,22 mmol), ácido 4-piridinilborónico (194 mg, 1,58 mmol), fosfato de potasio (1032 mg, 4,86 mmol) y Pd(PPh3)4 (140 mg, 0,122 mmol) en dioxano (6 ml)/agua (1,5 ml) se calentó en atmósfera de argón en un vial para microondas a 110 °C durante 60 min. Se añadió agua a t.a. y la mezcla de reacción se extrajo 3 veces con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de sodio y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando acetato de etilo/ciclohexano al 0-100% para proporcionar 4-bromo-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina (44%). LCMS (m/z [M+H]+): 286,0/288,0, Rt1 = 0,83 min.
Etapa 2: El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 254 a partir de 4-bromo-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina y (S)-3-amino-1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-ol [1334547-38-4].
1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 9,26 (s, 1 H), 8,77 (d, J=5,69 Hz, 2 H), 8,53 (d, J=5,87 Hz, 1 H), 8,20 (d, J=5,69 Hz, 1 H), 8,14 - 8,18 (m, 2 H), 7,48 - 7,55 (m, 2 H), 6,34 (s, 1 H), 3,82 (dd, J=14,58, 6,33 Hz, 1 H), 3,69 - 3,76 (m, 1 H), 1,40 (s, 3 H). LCMS (m/z [M+H]+): 349,3, Rt=0,62 min.
Ejemplo 328: (3-metil-3-((2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)ammo)butil)carbamato de terc-butilo (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidina (Intermedio 1c) y (3-amino-3-metilbutil)carbamato de tere-butilo.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,88 -8,73 (m, 2H), 8,64 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,33 - 8,25 (m, 2H), 7,73 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 2,97 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,31 - 2,19 (m, 2H), 1,60 (s, 6H), 1,25 (s, 9H). LCMS (m/z [M+H]+): 409,2, Rt1=0,96 min.
Ejemplo 329: W1,W1,W3,2,2-pentametil-W3-(2-(piridm-4-il)pirido[3,4-dJpirimidm-4-il)propano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 a patir de 4-doro-2-(piridin-4-N)pirido[3,4-d]pirimidina 3,2,2-pentametilpropano-1,3-diamina.
-d6) 59,18 (s, 1H), 8,76 (d, 2H), 8,54 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 8,34 (d, 2H), 8,23 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 2,30 (s, 6H), 2,23 (s, 2H), 0,96 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 351,2, Rt1=0,50 min.
etil-3-metil-W3-(2-(piridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)butano-1,3-diamma (Ejemplo de
El compuesto del título se sintetizó de acuerdo con el esquema a continuación a partir del Ejemplo 328 ((3-metil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)amino)butil)carbamato de tere-butilo).
Etapa 1: A una solución de (3-metil-3-((2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)amino)butil)carbamato de tere-butilo (80 mg, 0,196 mmol) en diclorometano (2 ml) se le añadió TFA (0,377 ml, 4,90 mmol) y la solución de color amarillo resultante se agitó a t.a. durante 2 h. Después, la solución se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en MeOH y la solución se proporcionó en un cartucho PoraPak Rxn CX de 20 cc (2 g). Después, el cartucho se lavó dos veces con 5 ml de MeOH.
Por último, el compuesto se eluyó con NH37 N en MeOH. El filtrado se evaporó a presión reducida para proporcionar 3-metil-W3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina (66 %). Lc MS (m/z [M+H]+): 309,1, Rti = 0,53 min. Etapa 2: Una solución de 3-metil-W3-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cf]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina (40 mg, 0,130 mmol), ácido acético (0,037 ml, 0,649 mmol) y acetaldehído (57 mg, 1,297 mmol) en diclorometano (5 ml) se agitó a t.a. durante 1 h. Después se añadió NaBH(OAc)3 (137 mg, 0,649 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 h adicional a t.a. Se añadió una solución saturada de NaHCO3y la fase acuosa se extrajo 3 veces con diclorometano (3 x 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de sodio y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando un gradiente de acetato de etilo al 12-100 %/ciclohexano seguido de un gradiente de metanol al 2-30 % (+ NH37 N al 10 % en metanol)/diclorometano para proporcionar un aceite de color amarillo. El aceite se recogió en diclorometano (2 ml) y se añadió HCl 4 N en dioxano (0,2 ml). El precipitado se separó mediante filtración y se lavó con pentano para proporcionar el compuesto del título en forma de sal de HCl (17 %).
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 59,52 (s, 1H), 9,22 - 9,02 (m, 4H), 8,82 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 8,74 (dd, J = 6,2, 0,9 Hz, 1H), 3,27 (dd, J = 8,4, 4,7 Hz, 2H), 3,21 (c, J = 7,3 Hz, 4H), 2,84 -2,70 (m, 2H), 1,79 (s, 6H), 1,23 (t, J = 7,3 Hz, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 365,2, Rt,=0,59 min.
Ejemplo 331: W3-(2-(2-fluoropiridm-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)-W1,W1,3-trimetilbutano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 111 en 2 etapas a partir de 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (etapa 1) y a partir de N3-(2-cloropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina y ácido (2-fluoropiridin-4-il)borónico (n.° de CAS 401815-98-3, etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,53 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,69 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,46 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,26 (dd, J = 4,7, 2,0 Hz, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,85 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 2,26 (s, 6H), 2,00 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 1,66 (s, 6H), observación: una señal de C<h>2 se superpone con la señal de<d>M<s>O.<l>C<m>S (m/z [M+H]+): 355,2, Rt1=0,67 min.
Ejemplo 332: W3-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidm-4-il)-W1,W1,3-trimetilbutano-1,3-diamma (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 111 en 2 etapas a partir de 2,4-dicloropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (etapa 1) y a partir de N3-(2-cloropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina y fe/'c-3,5-dimetil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-carboxilato de butilo (n.° de CAS 1073354-70-7, etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,41 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,95 (s, 1H), 8,49 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 2,56 (s, 6H), 2,27 (s, 6H), 1,92 (t, J = 6,1 Hz, 2h ), 1,61 (s, 6h ). observación: una señal de CH2 se superpone con la señal de DMSO. LCMS (m/z [M+H]+): 354,2, Rt,=0,50 min.
Ejemplo 333: W1,W1,3-trimetil-W3-(2-(3-(trifluorometil)-1H-pirazol-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 111 en 2 etapas a partir de 2,4-didoropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (etapa 1) y a partir de N3-(2-doropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina y 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol (n.° de CAS.
1218790-40-9, etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 513,80 (s, 1H), 9,25 (s, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,57 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,75 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 2,25 (s, 6H), 1,93 (t, J = 6,3 Hz, 2<h>), 1,60 (s, 6H). observación: una señal de CH2 se superpone con la señal de DMSO. LCMS (m/z [M+H]+): 394,3, Rt1=0,62 min.
Ejemplo 334: W3-(2-(2-aminopiridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-W1,W1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 111 en 3 etapas a partir de 2,4-didoropirido[3,4-d]pirimidina (Intermedio 2c) y N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina (etapa 1), a partir de N3-(2-cloropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-N1,N1,3-trimetilbutano-1,3-diamina y (4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridin-2-il)carbamato de terc-butilo n.° de CAS.
1095708-32-9 (etapa 2) y desprotección de Boc usando TFA (etapa 3).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,30 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,62 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,43 (dd, J = 5,3, 1,4 Hz, 1H), 6,11 (s, 2H), 2,47 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 2,24 (s, 6H), 1,99 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 1,66 (s, 6H). LCMS (m/z [M+H]+): 352,2, Rt1=0,48 min.
Ejemplo 335: 3-metil-W1-(2-(piridin-4-il)pirido[3,4-d]pirimidin-4-il)butano-1,3-diamina (Ejemplo de referencia)
El compuesto del título se sintetizó en analogía con el Ejemplo 1 en 2 etapas a partir de 4-cloro-2-(piridin-4-il)pirido[3,4-cfjpirimidina (intermedio 1c) y (4-amino-2-metilbutan-2-il)carbamato de tere-butilo (etapa 1) y desprotección de Boc usando TFA (etapa 2).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,18 (s, 1H), 8,80 -8,71 (m, 2H), 8,63 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,37 -8,31 (m, 2H), 8,07 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 3,83 - 3,73 (m, 2H), 1,80 - 1,68 (m, 2H), 1,15 (s, 6H), 3 protones intercambiables. LCMS (m/z [M+H]+): 309,2, Rti=0,45 min.
Expansión de poblaciones celularesex vivoy uso en una terapia
Material de partida para preparar una población expandida de células:
Método autólogo
La población de siembra de células para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares para proporcionar una población expandida de células puede obtenerse del propio receptor. En pacientes en los que la deficiencia de tejido, órgano o célula es parcial, por ejemplo, hay células sanas presentes, la población de siembra de células puede obtenerse de una fuente de tejido, órgano o célula no afectada. Por ejemplo, en el caso de deficiencia unilateral de células oculares, la población de siembra puede obtenerse a partir de una biopsia del ojo no afectado. También puede obtenerse del tejido sano que queda en un órgano parcialmente dañado.
Método alógeno
En una opción preferida, la población de siembra de células para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares para obtener una población expandida de células puede obtenerse a partir de células derivadas originariamente de tejido donante (por ejemplo, ser humano, conejo, mono, etc., preferentemente ser humano). Por ejemplo, una fuente de tejido humano procede de donantes cadavéricos o tejidos de donantes vivos, incluyendo parientes vivos.
A partir de tejido autólogo o alógeno derivado como se describió anteriormente mediante métodos autólogos y alógenos, que se ha retirado del cuerpo, las células pueden, por ejemplo, extraerse y prepararse de la siguiente manera: El área deseada se puede disecar, por ejemplo, usando bisturíes y después las células se disocian (por ejemplo, usando colagenasa, dispasa, tripsina, accutasa o TripLE; por ejemplo, 1 mg/ml de colagenasa a 37 °C), hasta que el desprendimiento celular se vuelve evidente mediante observación microscópica (por ejemplo, usando un microscopio invertido Zeiss Axiovert) de 45 minutos a 3 horas.
Para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares divulgado en el presente documento, las células aisladas se añaden después al medio, por ejemplo, mediante pipeteo, como se describe a continuación en la sección "Expansión de poblaciones celulares".
En una opción preferida, se realiza una evaluación de la calidad del material celular recogido del donante. Por ejemplo, aproximadamente 24 horas después de recoger las células y comenzar el cultivo en medio (medio de crecimiento o proliferación celular, como se describe a continuación), puede realizarse una evaluación visual bajo un microscopio de campo claro para buscar células flotantes presentes (como indicador de células muertas). Lo ideal es que esta evaluación muestre que hay aproximadamente menos del 10 % de células flotantes para que el material sea adecuado para su uso para generar una población expandida de células
El número de células adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares
no se limita, pero como ejemplo con fines ilustrativos, la población de células de siembra adecuada para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares
puede comprender aproximadamente 1000 células.
Si se desea medir el número de células en la población de células de siembra, esto puede hacerse, por ejemplo, mediante recuento celular manual o automatizado usando un microscopio óptico, inmunohistoquímica o fAc S según protocolos convencionales bien conocidos en la técnica.
Expansión de poblaciones celulares ocularesex vivoy uso en una terapia
A continuación se describe con más detalle una descripción de la metodología relacionada con la expansión de poblaciones de células oculares (preparación del material de partida, seguida de la fase de expansión de poblaciones celulares, almacenamiento de las células) como se aplica a células oculares con los ejemplos específicos de células madre del limbo y células endoteliales corneales.
Material de partida para preparar una población expandida de células madre del limbo: Células epiteliales corneales y del limbo
Método autólogo
La población de siembra de células para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares para proporcionar una población expandida de células del limbo puede obtenerse del propio receptor. En pacientes en los que la deficiencia de células madre del limbo es parcial, la población de células de siembra puede obtenerse de partes no afectadas del limbo. Por ejemplo, en el caso de deficiencia unilateral de células madre del limbo, la población de siembra puede obtenerse a partir de una biopsia del ojo no afectado. También puede obtenerse del tejido sano que queda en un limbo parcialmente dañado.
Método alógeno
En una opción preferida, la población de siembra de células para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares para proporcionar una población expandida de células madre del limbo puede obtenerse a partir de células originalmente derivadas de tejido corneal de mamífero donante (por ejemplo, humano, conejo, mono, etc., preferentemente humano).
Por ejemplo, una fuente de tejido corneal humano procede de donantes cadavéricos (por ejemplo, obtenido a través de bancos de ojos) o tejidos de donantes vivos, incluyendo parientes vivos. Una gama de tejido del limbo de donante es adecuada para su uso como se divulga en el presente documento. En una opción preferida, el tejido del limbo se obtiene de familiares vivos o de donantes con un perfil de HLA compatible.
El tejido que se usa para proporcionar las LSC puede ser, por ejemplo, un anillo de tejido del limbo de aproximadamente 4 mm de ancho y 1 mm de alto.
A partir del tejido corneal como se describió anteriormente mediante métodos autólogos y alógenos, que se ha retirado del cuerpo, las LSC pueden, por ejemplo, extraerse y prepararse de la siguiente manera: El área epitelial del limbo se puede disecar, por ejemplo, usando bisturíes y después las células se disocian (por ejemplo, usando colagenasa, dispasa, tripsina, accutasa o TripLE; por ejemplo, 1 mg/ml de colagenasa a 37 °C), hasta que el desprendimiento celular se vuelve evidente mediante observación microscópica (por ejemplo, usando un microscopio invertido Zeiss Axiovert) de 45 minutos a 3 horas.
Para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares, las células aisladas se añaden después al medio, por ejemplo, mediante pipeteo, como se describe a continuación en la sección "Expansión de poblaciones celulares".
En una opción preferida, se realiza una evaluación de la calidad del material celular recogido de la córnea de donante. Por ejemplo, aproximadamente 24 horas después de recoger las células y comenzar el cultivo en medio (medio de crecimiento o proliferación celular, como se describe a continuación), puede realizarse una evaluación visual bajo un microscopio de campo claro para buscar células flotantes presentes (como indicador de células muertas). Lo ideal es que esta evaluación muestre que hay aproximadamente menos del 10% de células flotantes para que el material sea adecuado para su uso para generar una población expandida de células
El número de células adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares
no se limita, pero como ejemplo con fines ilustrativos, la población de células de siembra adecuada para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares
puede comprender aproximadamente 1.000 células madre del limbo.
Si se desea medir el número de células en la población de células de siembra, esto puede hacerse, por ejemplo, mediante recuento celular manual o automatizado usando un microscopio óptico, inmunohistoquímica o<f>A<c>S según protocolos convencionales bien conocidos en la técnica.
Material de partida para preparar una población expandida de células endoteliales corneales
La población de siembra de células endoteliales corneales (CEC) para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares puede obtenerse a partir de células originariamente derivadas de tejido corneal de mamífero (por ejemplo, ser humano, conejo, mono, etc., preferentemente ser humano). Por ejemplo, una fuente de tejido corneal humano proviene de donantes humanos cadavéricos (que pueden obtenerse a través de bancos de ojos).
La edad de los donantes puede variar, por ejemplo, desde la infancia hasta los 70 años. Preferentemente, también son donantes adecuados aquellos que no tienen antecedentes de enfermedad o traumatismo corneal. En una opción, las córneas de donantes preferidas son aquellas en las que el recuento de células endoteliales corneales es superior a 2.000 células/mm2 (área). En una opción más preferida, el recuento de células endoteliales corneales es de 2.000 a 3.500 células/mm2 (área). Esto se mide, por ejemplo, examinando la córnea del material del donante bajo un microscopio de luz directa o un microscopio especular según las técnicas convencionales de Eye Bank conocidas en la técnica para la evaluación del tejido del donante antes del trasplante a los pacientes (véase Tranet al.(2016)Comparison of Endothelial Cell Measurements by Two Eye Bank Specular Micorscopes; International Journal of Eye Banking;vol 4., n.° 2; 1-8.
La superficie de la córnea que se usa para proporcionar las CEC no se limita, sino que puede ser, por ejemplo, un área de aprox. 8-10 mm de diámetro.
Las CEC pueden, por ejemplo, extraerse y prepararse de la siguiente manera a partir del tejido corneal del donante: La capa de células endoteliales corneales y la membrana de Descemet (DM) se marcan, por ejemplo, con un separador endotelial inverso de Sinsky de grado quirúrgico. La capa de células endoteliales de DM se despega del estroma corneal y las células se disocian de la DM, por ejemplo, usando 1 mg/ml de colagenasa a 37 °C hasta que el desprendimiento de las células se vuelve evidente mediante observación microscópica (por ejemplo, usando un microscopio invertido Zeiss Axiovert) (de 45 minutos a 3 horas). Como la DM sólo transporta células endoteliales corneales en la córnea, la población de células aislada de esta manera es una población de CEC, que es adecuada para su uso como población de siembra de células.
Para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares, las células endoteliales corneales aisladas pueden añadirse al medio como se describe a continuación en la sección "Expansión de poblaciones celulares".
En una opción preferida, se realiza una evaluación de la calidad del material celular recogido de la córnea de donante. Por ejemplo, aproximadamente 24 horas después de recoger las células y comenzar el cultivo en medio (medio de crecimiento o proliferación celular, como se describe a continuación), puede realizarse una evaluación visual bajo un microscopio de campo claro para buscar células flotantes presentes (como indicador de células muertas). Lo ideal es que esta evaluación muestre que hay aproximadamente menos del 10% de células flotantes para que el material sea adecuado para su uso para generar una población expandida de células.
El número inicial de células adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares
no se limita, pero como ejemplo con fines ilustrativos, la población de siembra de células endoteliales corneales adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares puede ser de 100.000 a 275.000 células.
Si se desea medir el número de células en la población de células de siembra, esto puede hacerse, por ejemplo, tomando una alícuota y realizando inmunocitoquímica (por ejemplo, para contar núcleos teñidos con Sytox Orange) o mediante formación de imágenes de células vivas bajo un microscopio de campo claro para contar el número de células.
El ensayo Sytox Orange puede realizarse de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica. En resumen, una vez que las células se han adherido a la placa de cultivo celular (normalmente 24 h después del cultivo en placa celular), las células se fijan en paraformaldehído. Después, las células se permeabilizan (por ejemplo, usando una solución de Triton X-100 al 0,3 %) y después se marcan en una solución de Sytox Orange (por ejemplo, usando 0,5 micromolar de Sytox Orange en PBS). Después, el número de núcleos teñidos con Sytox Orange por área de superficie se cuenta bajo un microscopio de epifluorescencia Zeiss.
Expansión de poblaciones celulares
Una población de células que comprenden células de un paciente o un donante puede cultivarse en medio en un recipiente de cultivo conocido en la técnica, tal como placas, placas de múltiples pocillos y matraces de cultivo celular. Por ejemplo, puede usarse una placa de cultivo que no esté recubierta o que esté recubierta con colágeno, synthemax, gelatina o fibronectina. Un ejemplo preferido de un recipiente de cultivo adecuado es una placa no recubierta. También pueden usarse recipientes y equipos de cultivo convencionales, tales como biorreactores conocidos en la técnica para su uso industrial.
El medio utilizado puede ser un medio de crecimiento o un medio de proliferación celular. En general, un medio de crecimiento es un medio de cultivo que respalda el crecimiento y mantenimiento de una población de células. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente un medio de crecimiento adecuado para un tipo particular de población celular. Son medios de crecimiento adecuados que se conocen en la técnica para el cultivo de células madre o de células epiteliales, por ejemplo: DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con FBS (suero bovino fetal) (Invitrogen), medio S<f>(sin suero) endotelial humano (Invitrogen) suplementado con suero humano, medio X-VIVO15 (Lonza) o DMEM/F12 (Thermo Fischer Scientific) (opcionalmente suplementado con cloruro de calcio). Estos pueden suplementarse adicionalmente con factores de crecimiento (por ejemplo, bFGF) y/o antibióticos tales como penicilina y estreptomicina.
Como alternativa, pueden añadirse en primer lugar células aisladas a un medio de proliferación celular.
El medio de proliferación celular como se define en el presente documento comprende un medio de crecimiento y un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención.
En determinados casos, un medio de proliferación celular comprende un medio de crecimiento y un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención. El inhibidor de LATS se selecciona preferentemente del grupo que comprende compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma y como se describe adicionalmente en la sección "Inhibidores de LATS".
En una opción preferida, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se añaden a una concentración aproximadamente de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente aproximadamente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente aproximadamente de 1 a 20 micromolar. En una opción específica, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se añaden a una concentración aproximadamente de 3 a 10 micromolar.
En una opción, la solución madre del compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma puede prepararse disolviendo el polvo del compuesto a una concentración madre de 10 mM en DMSO.
En un aspecto, el inhibidor de LATS de acuerdo con la invención inhibe la actividad de LATS1 y/o LATS2 en la población celular. En una realización preferida, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2.
Las células pueden pasar por una ronda o rondas de adición de medio de crecimiento nuevo y/o medio de proliferación celular. No es necesario hacer pases de las células con el fin de añadir medio nuevo, pero hacer pases de las células también es una forma de añadir medio nuevo.
También puede usarse una serie de medios, en diversas combinaciones de órdenes: por ejemplo, un medio de proliferación celular, seguido de la adición de un medio de crecimiento (que no está suplementado con inhibidores de LATS de acuerdo con la invención y puede ser diferente del medio de crecimiento utilizado como base para el medio de proliferación celular).
La fase de expansión de poblaciones celulares se produce durante el período en que las células están expuestas al medio de proliferación celular.
Pueden usarse condiciones de temperatura convencionales conocidas en la técnica para cultivar células, por ejemplo, preferentemente aproximadamente de 30 °C a 40 °C. En particular preferentemente, el crecimiento celular, así como la fase de expansión de poblaciones celulares, se realizan a aproximadamente 37 °C. Puede usarse una incubadora de células convencional con CO2 al 5-10 %. Preferentemente, las células se exponen a CO2 al 5 %.
Pueden hacerse pases de las células durante el cultivo en el medio de crecimiento o proliferación celular según sea necesario. Pueden hacerse pases de células cuando son confluentes o subconfluentes. Preferentemente, se hacen pases de las células cuando alcanzan aproximadamente el 90 %-100 % de confluencia, aunque también se pueden realizar a niveles de confluencia en porcentaje más bajos. El pase de células se realiza de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, en resumen, se hacen pases de células tratando cultivos con Accutase (por ejemplo, durante 10 minutos), aclarando la suspensión celular mediante centrifugación y sembrando las células en placa en medio de crecimiento o medio de proliferación celular nuevo según se desee. Las relaciones de división celular varían, por ejemplo, de 1:2 a 1:5.
Para la fase de expansión de poblaciones celulares del método de expansión de poblaciones celulares,
la expansión de la población de células de siembra en el medio de proliferación celular puede realizarse hasta que se obtenga la cantidad requerida de material celular.
Las células pueden exponerse al medio de proliferación celular durante un intervalo de períodos de tiempo para ampliar la población celular.
En una opción preferida, la población de células de siembra se expone a los inhibidores de LATS como se divulga en el presente documento (tales como aquellos compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma) directamente después del aislamiento celular del tejido del paciente o del donante y se mantiene durante todo el tiempo que necesite la proliferación celular, por ejemplo, de 12 a 16 días.
En una opción, opcionalmente puede realizarse una técnica de edición génica para modificar células genéticamente y/o expresar un compuesto bioterapéutico. Por ejemplo, las células pueden modificarse para reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen mediador de la respuesta inmunitaria, que de otro modo puede contribuir al rechazo inmunitario cuando la población celular se suministra al paciente. La aplicación de técnicas de edición génica en el método de expansión de poblaciones celulares es opcional y, en su lugar, puede usarse la administración al paciente de inmunosupresores tópicos y/o agentes antiinflamatorios (como se describe adicionalmente en la sección Agente inmunosupresor y antiinflamatorio) para mitigar los problemas con el inmunorrechazo del material trasplantado en el paciente.
De acuerdo con un aspecto, la modificación genética comprende reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción preferida, la modificación genética comprende introducir en una célula madre aislada o en una población de células madre un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción específica, dicho sistema de edición génica se selecciona del grupo que consiste en CRISPR (CRISPR: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas en intervalos regulares, también conocidas como sistemas CRISPR/Cas), ZFN (nucleasas con dedos de cinc), TALEN (nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción), meganucleasas modificadas por ingeniería genética (por ejemplo, nucleasas ARCUS, tales como la nucleasa ARC), vectores de AAV (virus adenoasociados) y tecnologías de edición genómica basadas en vectores lentivíricos.
Una técnica de edición génica, si ha de usarse, puede realizarse en diferentes puntos, como por ejemplo, (1) en el tejido, antes del aislamiento celular o (2) en el momento del aislamiento celular o (3) durante la fase de expansión de poblaciones celularesin vitro(cuando las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invenciónin vitro)o (4)in vitroal final de la fase de expansión de poblaciones celulares (después de que las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invenciónin vitro).En una opción específica, se usa CRISPR después de dos semanas de expansiónin vitrode la población celular en presencia del inhibidor de LATS de acuerdo con la invención.
Las técnicas de edición génica adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares se describen adicionalmente en la sección "Reducción del inmunorrechazo".
En el método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS, que son preferentemente compuestos, producen una expansión superior al doble de la población de células sembrada.
En un aspecto del método de expansión de poblaciones celulares, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión superior a 30 veces de la población sembrada de células aisladas (es decir, células obtenidas de un paciente o un donante). En una opción específica del método de expansión de poblaciones celulares
los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión de 100 veces a 2200 veces de la población sembrada de células aisladas. En una opción más específica del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión de 600 veces a 2200 veces de la población sembrada de células aisladas. El factor de multiplicación de expansión conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares puede conseguirse en uno o más pases de las células. En otro aspecto, el factor de expansión de multiplicación conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares de acuerdo con la invención puede conseguirse después de la exposición al compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma durante aproximadamente 12 a 16 días, preferentemente aproximadamente 14 días.
Si se desea medir el número de células o la expansión de la población celular, esto puede hacerse, por ejemplo, tomando una alícuota y realizando inmunocitoquímica (por ejemplo, para contar núcleos teñidos con Sytox Orange) o mediante formación de imágenes de células vivas bajo un microscopio de campo claro para contar el número de células o realizando un análisis cuantitativo de células vivas en tiempo real de la confluencia celular en diversos puntos temporales durante la fase de expansión de poblaciones celulares del método.
El ensayo Sytox Orange puede realizarse de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica. En resumen, una vez que las células se han adherido a la placa de cultivo celular (normalmente 24 h después del cultivo en placa celular), las células se fijan en paraformaldehído. Después, las células se permeabilizan (por ejemplo, usando una solución de Triton X-100 al 0,3 %) y después se marcan en una solución de Sytox Orange (por ejemplo, usando 0,5 micromolar de Sytox Orange en PBS). Después, el número de núcleos teñidos con Sytox Orange por área de superficie se cuenta bajo un microscopio de epifluorescencia Zeiss.
La población celular expandida mediante el método de expansión de poblaciones celulares
puede añadirse a una solución y después almacenarse, por ejemplo, en una solución de conservación o crioconservación (tales como las que se describen a continuación), o pueden añadirse directamente a una composición adecuada para el suministro a un paciente. La solución o composición de conservación o crioconservación adecuada para el suministro ocular puede comprender opcionalmente un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención.
En una opción más preferida, la preparación de poblaciones celulares que se suministra a un paciente comprende niveles de muy bajos a insignificantes de un compuesto inhibidor de LATS. Por lo tanto, en una opción específica, el método de expansión de poblaciones celulares
comprende la etapa adicional de aclarado para retirar sustancialmente el compuesto como se divulga en el presente documento (tal como el compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma). Esto puede implicar aclarar las células después de la fase de expansión de poblaciones celulares. Para aclarar las células, las células se desprenden de la placa de cultivo (por ejemplo, tratándolas con Accutase), después, las células desprendidas se centrifugan y se prepara una suspensión celular en PBS o medio de crecimiento. Esta etapa puede realizarse varias veces, por ejemplo, de una a diez veces, para aclarar las células. Por último, las células pueden resuspenderse en una solución de conservación, una solución de crioconservación, una composición adecuada para el suministro ocular, un medio de crecimiento o combinaciones de los mismos, según se desee.
La población expandida de células preparada mediante el método de expansión de poblaciones celulares y aclarada del medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención puede transferirse a una composición adecuada para el suministro a un paciente, tal como, por ejemplo, un agente localizador. Opcionalmente, la población celular se almacena durante un período de tiempo antes de añadirla a un agente localizador adecuado para el suministro a un paciente. En una opción preferida, la población celular expandida puede añadirse en primer lugar a una solución adecuada para conservación o crioconservación, que preferentemente no comprende un inhibidor de LATS, y la población celular puede almacenarse (opcionalmente con congelación) antes de la adición a un agente localizador adecuado para el suministro a un paciente, que además preferentemente no comprende un inhibidor de LATS.
En la solución de crioconservación pueden usarse soluciones típicas adecuadas para crioconservación, glicerol, sulfóxido de dimetilo, propilenglicol o acetamida. La preparación crioconservada de células normalmente se mantiene a -20 °C o -80 °C.
Expansión de poblaciones celulares: Preparar una población expandida de células madre del limbo
En una opción, una población de células que comprenden células epiteliales corneales y del limbo, incluyendo células madre del limbo, obtenidas, por ejemplo, como se describe en la sección "Material de partida para preparar una población expandida de células madre del limbo: Células epiteliales corneales y del limbo", puede cultivarse en medio en un recipiente de cultivo conocido en la técnica, tal como placas, placas de múltiples pocillos y matraces de cultivo celular. Por ejemplo, puede usarse una placa de cultivo que no esté recubierta o que esté recubierta con colágeno, synthemax, gelatina o fibronectina. Un ejemplo preferido de un recipiente de cultivo adecuado es una placa no recubierta. También pueden usarse recipientes y equipos de cultivo convencionales, tales como biorreactores conocidos en la técnica para su uso industrial.
El medio utilizado puede ser un medio de crecimiento o un medio de proliferación celular. Un medio de crecimiento se define en el presente documento como un medio de cultivo que respalda el crecimiento y mantenimiento de una población de células. Son medios de crecimiento adecuados que se conocen en la técnica para el cultivo de células madre o de células epiteliales, por ejemplo: DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con FBS (suero bovino fetal) (Invitrogen), medio SF (sin suero) endotelial humano (Invitrogen) suplementado con suero humano, medio X-VIVO15 (Lonza) o DMEM/F12 (Thermo Fischer Scientific) (opcionalmente suplementado con cloruro de calcio). Estos pueden suplementarse adicionalmente con factores de crecimiento (por ejemplo, bFGF) y/o antibióticos tales como penicilina y estreptomicina. Un medio de crecimiento preferido es el medio X-VIVO15 (que no está suplementado adicionalmente con factores de crecimiento).
Como alternativa, las células aisladas pueden añadirse en primer lugar a un medio de proliferación celular.
El medio de proliferación celular como se define en el presente documento comprende un medio de crecimiento y un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención. En el medio de proliferación celular
el componente del medio de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con FBS (suero bovino fetal) (Invitrogen), medio SF (sin suero) endotelial humano (Invitrogen) suplementado con suero humano, medio X-VIVO15 (Lonza) o DMEM/F12 (Thermo Fischer Scientific) (opcionalmente suplementado con cloruro de calcio). Estos pueden suplementarse adicionalmente con factores de crecimiento (por ejemplo, bFGF) y/o antibióticos tales como penicilina y estreptomicina.
Un medio de proliferación celular preferido es el medio X-VIVO15 (Lonza) con un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención. Este medio de proliferación celular tiene la ventaja de que no necesita factores de crecimiento adicionales ni células alimentadoras para facilitar la proliferación de las LSC. El medio X-VIVO comprende, entre otras cosas, albúmina humana de calidad farmacéutica, insulina humana recombinante y transferrina humana pasteurizada. Opcionalmente, pueden añadirse antibióticos al medio X-VIVO15. En una opción preferida, se usa el medio X-VIVO15 sin la adición de antibióticos.
El medio de proliferación celular comprende un medio de crecimiento y un inhibidor de LATS divulgado en el presente documento.
El inhibidor de LATS se selecciona preferentemente del grupo que comprende compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma y como se describe adicionalmente en la sección "Inhibidores de LATS".
En una opción preferida, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se añaden a una concentración aproximadamente de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente aproximadamente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente aproximadamente de 1 a 20 micromolar. En una opción específica, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se añaden a una concentración aproximadamente de 3 a 10 micromolar.
En una opción, la solución madre del compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma puede prepararse disolviendo el polvo del compuesto a una concentración madre de 10 mM en DMSO.
En un aspecto, el inhibidor de LATS de acuerdo con la invención inhibe la actividad de LATS1 y/o LATS2 en las células del limbo. En una realización preferida, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2.
Las células pueden pasar por una ronda o rondas de adición de medio de crecimiento nuevo y/o medio de proliferación celular. No es necesario hacer pases de las células con el fin de añadir medio nuevo, pero hacer pases de las células también es una forma de añadir medio nuevo.
También puede usarse una serie de medios, en diversas combinaciones de órdenes: por ejemplo, un medio de proliferación celular, seguido de la adición de un medio de crecimiento (que no está suplementado con inhibidores de LATS de acuerdo con la invención y puede ser diferente del medio de crecimiento utilizado como base para el medio de proliferación celular).
La fase de expansión de poblaciones celulares se produce durante el período en que las células están expuestas al medio de proliferación celular.
Pueden usarse condiciones de temperatura convencionales conocidas en la técnica para cultivar células, por ejemplo, preferentemente aproximadamente de 30 °C a 40 °C. En particular preferentemente, el crecimiento celular, así como la fase de expansión de poblaciones celulares, se realizan a aproximadamente 37 °C. Puede usarse una incubadora de células convencional con CO2 al 5-10 %. Preferentemente, las células se exponen a CO2 al 5 %.
Pueden hacerse pases de las células durante el cultivo en el medio de crecimiento o proliferación celular según sea necesario. Pueden hacerse pases de células cuando son confluentes o subconfluentes. Preferentemente, se hacen pases de las células cuando alcanzan aproximadamente el 90 %-100 % de confluencia, aunque también se pueden realizar a niveles de confluencia en porcentaje más bajos. El pase de células se realiza de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, en resumen, se hacen pases de células tratando cultivos con Accutase (por ejemplo, durante 10 minutos), aclarando la suspensión celular mediante centrifugación y sembrando las células en placa en medio de crecimiento o medio de proliferación celular nuevo según se desee. Las relaciones de división celular varían, por ejemplo, de 1:2 a 1:5.
Para la fase de expansión de poblaciones celulares del método de expansión de poblaciones celulares,
la expansión de la población de células de siembra en el medio de proliferación celular puede realizarse hasta que se obtenga la cantidad requerida de material celular.
Las células pueden exponerse al medio de proliferación celular durante un intervalo de períodos de tiempo para ampliar la población celular. Por ejemplo, esto puede incluir todo el tiempo que las LSC se mantienen en cultivo, o durante la primera semana después del aislamiento de las LSC o durante 24 horas después de la disección del limbo de la córnea.
En una opción preferida, la población de células de siembra se expone a los inhibidores de LATS como se divulga en el presente documento (tales como aquellos compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma) directamente después del aislamiento celular de la córnea y se mantiene durante todo el tiempo que necesite la proliferación de lSc , por ejemplo, de 12 a 16 días.
En una opción, opcionalmente puede realizarse una técnica de edición génica para modificar genéticamente células, para reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen mediador de la respuesta inmunitaria, que de otro modo puede contribuir al rechazo inmunitario cuando la población celular se suministra al paciente. La aplicación de técnicas de edición génica en el método de expansión de poblaciones celulares es opcional y, en su lugar, puede usarse la administración al paciente de inmunosupresores tópicos y/o agentes antiinflamatorios (como se describe adicionalmente en la sección Agente inmunosupresor y antiinflamatorio) para mitigar los problemas con el inmunorrechazo del material trasplantado en el paciente.
De acuerdo con un aspecto, la modificación genética comprende reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción preferida, la modificación genética comprende introducir en una célula madre del limbo un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción específica, dicho sistema de edición génica se selecciona del grupo que consiste en CRISPR (CRISPR: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas en intervalos regulares, también conocidas como sistemas CRISPR/Cas), ZFN (nucleasas con dedos de cinc), TALEN (nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción), meganucleasas modificadas por ingeniería genética (por ejemplo, nucleasas ARCUS, tales como la nucleasa ARC), edición génica con vectores de AAV (virus adenoasociado) (por ejemplo, recombinación homóloga impulsada por vectores de AAV) y tecnologías de edición genómica basadas en vectores lentivíricos. El suministro de genes impulsado por vectores de AAV, tal como impulsado por recombinación homóloga, puede conseguirse mediante un AAV seleccionado del grupo que consiste en: AAV2, AAv 3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, a Av 8, AAV9 o un derivado de los mismos.
Una técnica de edición génica, si ha de usarse, puede realizarse en diferentes puntos, como por ejemplo, (1) en tejido epitelial del limbo, antes del aislamiento de LSC o (2) en el momento del aislamiento celular o (3) durante la fase de expansión de poblaciones celularesin vitro(cuando las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invenciónin vitro)o (4)in vitroal final de la fase de expansión de poblaciones celulares (después de que las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invenciónin vitro).En una opción específica, se usa CRISPR después de dos semanas de expansiónin vitrode la población celular en presencia del inhibidor de LATS de acuerdo con la invención.
Las técnicas de edición génica adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares se describen adicionalmente en la sección "Reducción del inmunorrechazo".
En el método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS, que son preferentemente compuestos, producen una expansión superior al doble de la población de células sembrada.
En un aspecto del método de expansión de poblaciones celulares, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión superior a 30 veces de la población sembrada de células del limbo. En una opción específica del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión de 100 veces a 2200 veces de la población sembrada de células del limbo. En una opción más específica del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión de 600 veces a 2200 veces de la población sembrada de células del limbo. El factor de expansión de multiplicación conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares
puede conseguirse en uno o más pases de las células. En otro aspecto, el factor de expansión de multiplicación conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares puede conseguirse después de la exposición al compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma durante aproximadamente 12 a 16 días, preferentemente aproximadamente 14 días.
En un aspecto del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una población celular con más del 6 % de células positivas para p63alfa en comparación con la cantidad total de células. En una opción específica del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una población celular con más del 20 % de células positivas para p63alfa en comparación con la cantidad total de células. En otra opción específica del método de expansión de poblaciones celulares,
los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una población celular con más del 70 % de células positivas para p63alfa en comparación con la cantidad total de células. En otra opción específica más del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una población celular con más del 95 % de células positivas para p63alfa en comparación con la cantidad total de células. El aumento en el porcentaje de células positivas para p63alfa conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares puede conseguirse en uno o más pases de las células. En otro aspecto, el aumento en el porcentaje de células positivas para p63alfa conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares puede conseguirse después de la exposición al compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma durante aproximadamente 12 a 16 días, preferentemente aproximadamente 14 días.
Si se desea medir el número de células o la expansión de la población celular, esto puede hacerse, por ejemplo, tomando una alícuota y realizando inmunocitoquímica (por ejemplo, para contar núcleos teñidos con Sytox Orange) o mediante formación de imágenes de células vivas bajo un microscopio de campo claro para contar el número de células o realizando un análisis cuantitativo de células vivas en tiempo real de la confluencia celular en diversos puntos temporales durante la fase de expansión de poblaciones celulares del método.
El ensayo Sytox Orange puede realizarse de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica. En resumen, una vez que las células se han adherido a la placa de cultivo celular (normalmente 24 h después del cultivo en placa celular), las células se fijan en paraformaldehído. Después, las células se permeabilizan (por ejemplo, usando una solución de Triton X-100 al 0,3 %) y después se marcan en una solución de Sytox Orange (por ejemplo, usando 0,5 micromolar de Sytox Orange en PBS). Después, el número de núcleos teñidos con Sytox Orange por área de superficie se cuenta bajo un microscopio de epifluorescencia Zeiss.
En un aspecto, la población de LSC obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares muestra preferentemente al menos una de las siguientes características. Más preferentemente, muestra dos o más de las siguientes características, más preferentemente todas.
(1) La preparación celular es positiva para células p63alfa. La expresión de p63alfa puede estimarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, inmunohistoquímica y RT-PCR cuantitativa.
(2) La preparación celular comprende más del 6 % de células positivas para p63alfa. Preferentemente, la preparación celular comprende más del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de células positivas para p63alfa. En una opción preferida, la preparación celular comprende más del 95%de células positivas para p63alfa. El porcentaje de células p63alfa puede medirse mediante inmunohistoquímica o FACS.
(3) Las células expresan uno o más de ABCB5, ABCG2 y C/EBP8. La expresión de ABCB5, ABCG2 y C/EBPS puede estimarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, inmunohistoquímica y RT-PCR cuantitativa.
(4) Las células pueden diferenciarse en células del epitelio corneal como se observa mediante la expresión de queratina-12. Estas características pueden observarse mediante inmunohistoquímica o FACS.
La población celular expandida mediante el método de expansión de poblaciones celulares
puede añadirse a una solución y después almacenarse, por ejemplo, en una solución de conservación o crioconservación (tales como las que se describen a continuación), o pueden añadirse directamente a una composición adecuada para el suministro ocular. La solución o composición de conservación o crioconservación adecuada para el suministro ocular puede comprender opcionalmente un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención.
En una opción más preferida, la preparación de poblaciones celulares que se suministra al ojo comprende niveles de muy bajos a insignificantes de un compuesto inhibidor de LATS. Por lo tanto, en una opción específica, el método de expansión de poblaciones celulares
comprende la etapa adicional de aclarado para retirar sustancialmente el compuesto como se divulga en el presente documento (tal como el compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma). Esto puede implicar aclarar las células después de la fase de expansión de poblaciones celulares. Para aclarar las células, las células se desprenden de la placa de cultivo (por ejemplo, tratándolas con Accutase), después, las células desprendidas se centrifugan y se prepara una suspensión celular en PBS o medio de crecimiento. Esta etapa puede realizarse varias veces, por ejemplo, de una a diez veces, para aclarar las células. Por último, las células pueden resuspenderse en una solución de conservación, una solución de crioconservación, una composición adecuada para el suministro ocular, un medio de crecimiento o combinaciones de los mismos, según se desee.
La población expandida de células preparada mediante el método de expansión de poblaciones celulares y aclarada del medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS puede transferirse a una composición adecuada para el suministro ocular, tal como, por ejemplo, un agente localizador. Opcionalmente, la población celular se almacena durante un período de tiempo antes de añadirla a un agente localizador adecuado para el suministro ocular. En una opción preferida, la población celular expandida puede añadirse en primer lugar a una solución adecuada para conservación o crioconservación, que preferentemente no comprende un inhibidor de LATS, y la población celular puede almacenarse (opcionalmente con congelación) antes de la adición a un agente localizador adecuado para el suministro ocular, que además preferentemente no comprende un inhibidor de LATS.
Las soluciones típicas adecuadas para la conservación de LSC son Optisol o PBS, preferentemente Optisol. Optisol es un medio de almacenamiento corneal que comprende sulfato de condroitina y dextrano para potenciar la deshidratación corneal durante el almacenamiento (véase, por ejemplo, Kaufmanet al.,(1991)Optisol corneal Storage médium; Arch Ophthalmol Jun;109(6): 864-8). Para la crioconservación, puede usarse glicerol, sulfóxido de dimetilo, propilenglicol o acetamida en la solución de crioconservación. La preparación crioconservada de células normalmente se mantiene a -20 °C o -80 °C.
En un aspecto se divulga una preparación conservada o crioconservada de células madre del limbo obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares. En un aspecto alternativo, se divulga una preparación de células frescas en la que las células madre del limbo obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares están en suspensión en PBS y/o medio de crecimiento o se combinan con un agente localizador. La preparación de células frescas normalmente se mantiene a aproximadamente 15 y 37 °C. Pueden usarse recipientes de cultivos celulares convencionales conocidos en la técnica para almacenar las células, tales como un vial o un matraz.
En una opción preferida, antes de su uso en el ojo, una preparación crioconservada de células se descongela (por ejemplo, incubando a una temperatura de aproximadamente 37 °C en una incubadora o baño de agua). Preferentemente, pueden añadirse 10 volúmenes de PBS o medio de crecimiento para aclarar las células de la solución crioconservante. Después, las células pueden aclararse mediante centrifugación y puede prepararse una suspensión celular en PBS y/o medio de crecimiento, antes de la combinación con un agente localizador para el suministro ocular, que tampoco comprende preferentemente un inhibidor de LATS.
En un aspecto, la población expandida de células preparada mediante el método de expansión de poblaciones celulares se prepara en forma de una suspensión (por ejemplo, en PBS y/o medio de crecimiento, tal como por ejemplo, medio X-VIVO) y se combina con un agente localizador adecuado para el suministro ocular (tal como una biomatriz como GelMA). En una opción específica del método de tratamiento, esta combinación de células, PBS y/o medio de crecimiento y biomatriz se suministra al ojo a través de un portador (tal como una lente de contacto). En otra opción específica más, esta combinación de células, PBS y/o medio de crecimiento y biomatriz comprende como máximo sólo niveles traza de un inhibidor de LATS.
El término "niveles traza", como se usa en el presente documento, significa menos del 5 % p/v (por ejemplo, no más del 5 % p/v, 4 % p/v, 3 % p/v, 2 % p/v o 1 % p/v). p/v), y preferentemente menos del 0,01 % p/v (por ejemplo, no más del 0,01 % p/v, 0,009 % p/v, 0,008 % p/v, 0,007 % p/v, 0,006 % p/v, 0,005 % p/v, 0,004 % p/v, 0,003 % p/v, 0,002 % p/v o 0,001 % p/v), que puede medirse, por ejemplo, usando cromatografía de alta resolución como se describe en los Ejemplos del presente documento. En determinadas opciones, los niveles traza de un compuesto inhibidor de LATS de la invención son los niveles de compuestos residuales presentes después de una o más etapas de lavado, que colectivamente están por debajo de la potencia celular de dichos compuestos y, en consecuencia, no inducen un efecto biológicoin vivo.En consecuencia, los niveles residuales de compuestos están por debajo de la cantidad que se espera que tenga un efecto biológico sobre la expansión de poblaciones celulares en un cultivo celular o en un sujeto (por ejemplo, después del trasplante de una población celular expandida al sujeto). Los niveles traza pueden medirse, por ejemplo, como la eficiencia de retirada por lavado, que puede calcularse de la siguiente manera: Eficiencia de retirada por lavado = 100 -(concentración promedio en sedimento post-lavado x volumen de sedimento x peso de la molécula) / (concentración del compuesto x volumen del medio de cultivo x peso de la molécula). Como se usa en el presente documento, "aclarar para retirar sustancialmente" un compuesto inhibidor de LATS de la invención de las células se refiere a etapas para establecer niveles traza del compuesto inhibidor de LATS.
Como alternativa, las células pueden cultivarse y la fase de proliferación de poblaciones celulares puede tener lugar en un medio de proliferación celular sobre un agente localizador adecuado para el suministro de células a la superficie ocular (por ejemplo, fibrina, colágeno).
Expansión de poblaciones celulares: Preparar una población expandida de células endoteliales corneales
En una opción preferida, las células endoteliales corneales, por ejemplo, aisladas y obtenibles como se describe en la sección "Material de partida para preparar una población expandida de células endoteliales corneales", pueden cultivarse en medio en un recipiente de cultivo conocido en la técnica, tal como placas, placas de múltiples pocillos y matraces de cultivo celular. Por ejemplo, puede usarse una placa de cultivo que no esté recubierta o que esté recubierta con colágeno, synthemax, gelatina o fibronectina. Un ejemplo preferido de un recipiente de cultivo adecuado es una placa no recubierta. También pueden usarse recipientes y equipos de cultivo convencionales, tales como biorreactores conocidos en la técnica para su uso industrial.
El medio utilizado puede ser un medio de crecimiento o un medio de proliferación celular. Un medio de crecimiento se define en el presente documento como un medio de cultivo que respalda el crecimiento y mantenimiento de una población de células. Son medios de crecimiento adecuados que se conocen en la técnica para el cultivo de células endoteliales corneales, por ejemplo: DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con FBS (suero bovino fetal) (Invitrogen), medio SF (sin suero) endotelial humano (Invitrogen) suplementado con suero humano, medio X-VIVO15 (Lonza) o medio acondicionado con células madre mesenquimáticas. Estos pueden suplementarse adicionalmente con factores de crecimiento (por ejemplo, bFGF) y/o antibióticos tales como penicilina y estreptomicina. Un medio de crecimiento preferido es el medio X-VIVO15 (que no está suplementado adicionalmente con factores de crecimiento).
Como alternativa, las células aisladas pueden añadirse en primer lugar a un medio de proliferación celular.
El medio de proliferación celular como se define en el presente documento comprende un medio de crecimiento y un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención. En el medio de proliferación celular
el componente del medio de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con FBS (suero bovino fetal) (Invitrogen), medio SF (sin suero) endotelial humano (Invitrogen) suplementado con suero humano, medio X-VIVO15 (Lonza) o medio acondicionado con células madre mesenquimáticas. Estos pueden suplementarse adicionalmente con factores de crecimiento (por ejemplo, bFGF) y/o antibióticos tales como penicilina y estreptomicina.
Un medio de proliferación celular preferido es el medio X-VIVO15 (Lonza) con un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención. Este medio de proliferación celular tiene la ventaja de que no necesita factores de crecimiento adicionales ni células alimentadoras para facilitar la proliferación de las CEC. El medio X-VIVO comprende, entre otras cosas, albúmina humana de calidad farmacéutica, insulina humana recombinante y transferrina humana pasteurizada. Opcionalmente, pueden añadirse antibióticos al medio X-VIVO15. En una opción preferida, se usa el medio X-VIVO15 sin la adición de antibióticos.
El medio de proliferación celular comprende un medio de crecimiento y un inhibidor de LATS divulgado en el presente documento.
El inhibidor de LATS se selecciona preferentemente del grupo que comprende compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma y como se describe adicionalmente en la sección "Inhibidores de LATS".
En una opción preferida, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se añaden a una concentración aproximadamente de 0,5 a 100 micromolar, preferentemente aproximadamente de 0,5 a 25 micromolar, más preferentemente aproximadamente de 1 a 20 micromolar. En una opción específica, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma se añaden a una concentración aproximadamente de 3 a 10 micromolar.
En una opción, la solución madre del compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma puede prepararse disolviendo el polvo del compuesto a una concentración madre de 10 mM en DMSO.
En un aspecto, el inhibidor de LATS de acuerdo con la invención inhibe la actividad de LATS1 y/o LATS2 en las células endoteliales corneales. En una opción preferida, el inhibidor de LATS inhibe LATS1 y LATS2.
Las células pueden pasar por una ronda o rondas de adición de medio de crecimiento nuevo y/o medio de proliferación celular. No es necesario hacer pases de las células con el fin de añadir medio nuevo, pero hacer pases de las células también es una forma de añadir medio nuevo.
También puede usarse una serie de medios, en diversas combinaciones de órdenes: por ejemplo, un medio de proliferación celular, seguido de la adición de un medio de crecimiento (que no está suplementado con inhibidores de LATS de acuerdo con la invención y puede ser diferente del medio de crecimiento utilizado como base para el medio de proliferación celular).
La fase de expansión de poblaciones celulares se produce durante el período en que las células están expuestas al medio de proliferación celular.
Pueden usarse condiciones de temperatura convencionales conocidas en la técnica para cultivar células, por ejemplo, preferentemente aproximadamente de 30 °C a 40 °C. En particular preferentemente, el crecimiento celular, así como la fase de expansión de poblaciones celulares, se realizan a aproximadamente 37 °C. Puede usarse una incubadora de células convencional con CO2 al 5-10 %. Preferentemente, las células se exponen a CO2 al 5 %.
Pueden hacerse pases de las células durante el cultivo en el medio de crecimiento o proliferación celular según sea necesario. Pueden hacerse pases de células cuando son confluentes o subconfluentes. Preferentemente, se hacen pases de las células cuando alcanzan aproximadamente el 90 %-100 % de confluencia, aunque también se pueden realizar a niveles de confluencia en porcentaje más bajos. El pase de células se realiza de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, en resumen, las células se desprenden del recipiente de cultivo, por ejemplo, usando colagenasa. Después, las células se centrifugan y se aclaran en PBS o el medio de crecimiento celular y se siembran en placas en medio de crecimiento o proliferación celular nuevo según se desee a una dilución de, por ejemplo, 1:2 a 1:4.
Para la fase de expansión de poblaciones celulares del método de expansión de poblaciones celulares,
la expansión de la población de células de siembra en el medio de proliferación celular puede realizarse hasta que se obtenga la cantidad requerida de material celular.
Las células pueden exponerse al medio de proliferación celular durante un intervalo de períodos de tiempo para ampliar la población celular. Por ejemplo, esto puede incluir todo el tiempo que las CEC se mantienen en cultivo, o sólo durante la primera semana o dos después del aislamiento de CEC o sólo durante 24 horas después de la disección de la córnea.
En una opción preferida, las células endoteliales corneales se exponen a los inhibidores de LATS divulgados en el presente documento (tales como aquellos compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma) directamente después del aislamiento celular de la córnea y se mantiene durante todo el tiempo que necesite la proliferación de CEC, por ejemplo, de una a dos semanas.
En una opción más preferida, después de la fase de expansión de poblaciones celularesin vitro(es decir, después de que las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención durante un período de tiempo para expandir la población de células), el método de expansión de poblaciones celulares
comprende una etapa adicional en donde las células pueden cultivarse durante un período de tiempo (por ejemplo, dos semanas) en un medio de crecimiento sin suplementación de un inhibidor de LATS, para permitir que se forme un endotelio corneal maduro. Un endotelio corneal maduro se define en el presente documento como una monocapa de CEC con morfología hexagonal, uniones estrechas positivas para ZO-1 y expresión de Na/K ATPasa. En una opción preferida, no se hacen pases de las células mientras se forma el endotelio corneal maduro.
En una opción, opcionalmente puede realizarse una técnica de edición génica para modificar genéticamente células, para reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen mediador de la respuesta inmunitaria, que de otro modo puede contribuir al rechazo inmunitario cuando la población celular se suministra al paciente. La aplicación de técnicas de edición génica en el método de expansión de poblaciones celulares es opcional y, en su lugar, puede usarse la administración al paciente de inmunosupresores tópicos y/o agentes antiinflamatorios (como se describe adicionalmente en la sección Agente inmunosupresor y antiinflamatorio) para mitigar los problemas con el inmunorrechazo del material trasplantado en el paciente.
De acuerdo con un aspecto, para el escenario en el que se usa una técnica de edición génica, la modificación genética comprende reducir o eliminar la expresión y/o función de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción preferida, la modificación genética comprende introducir en una célula endotelial corneal un sistema de edición génica que se dirige específicamente a un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción específica, dicho sistema de edición génica se selecciona del grupo que consiste en CRISPR (CRISPR: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas en intervalos regulares, también conocidas como sistemas CRISPR/Cas), ZFN (nucleasas con dedos de cinc), TALEN (nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción), meganucleasas modificadas por ingeniería genética (por ejemplo, nucleasas ARCUS, tales como la nucleasa ARC), edición génica con vectores de AAV (virus adenoasociado) (por ejemplo, recombinación homóloga impulsada por vectores de AAV) y tecnologías de edición genómica basadas en vectores lentivíricos. El suministro de genes impulsado por vectores de AAV, tal como impulsado por recombinación homóloga, puede conseguirse mediante un AAV seleccionado del grupo que consiste en: AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 o un derivado de los mismos.
Una técnica de edición génica, si ha de usarse, puede realizarse en diferentes puntos, como por ejemplo, (1) en el tejido corneal, antes del aislamiento de CEC o (2) en el momento del aislamiento celular o (3) durante la fase de expansión de poblaciones celularesin vitro(cuando las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invenciónin vitro)o (4)in vitroal final de la fase de expansión de poblaciones celulares (después de que las células se exponen a un inhibidor de LATS de acuerdo con la invenciónin vitro).
Las técnicas de edición génica adecuadas para su uso en el método de expansión de poblaciones celulares se describen adicionalmente en la sección "Reducción del inmunorrechazo".
En el método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS, que son preferentemente compuestos, producen una expansión superior al doble de la población de células sembrada.
En un aspecto del método de expansión de poblaciones celulares, los compuestos de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión superior a 10 veces de la población sembrada de células endoteliales corneales. En una opción específica del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión de 15 veces a 600 veces de la población sembrada de células endoteliales corneales. En una opción más específica del método de expansión de poblaciones celulares, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma producen una expansión de 20 veces a 550 veces de la población sembrada de células endoteliales corneales. El factor de multiplicación de expansión conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares puede conseguirse en uno o más pases de las células. En otro aspecto, el factor de expansión de multiplicación conseguido mediante el método de expansión de poblaciones celulares puede conseguirse después de la exposición al compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma durante una a dos semanas, preferentemente después de aproximadamente 10 días.
Si se desea medir el número de células o la expansión de la población celular, esto puede hacerse, por ejemplo, tomando una alícuota y realizando inmunocitoquímica (por ejemplo, para contar núcleos teñidos con Sytox Orange) o mediante formación de imágenes de células vivas bajo un microscopio de campo claro para contar el número de células o realizando un análisis cuantitativo de células vivas en tiempo real de la confluencia celular en diversos puntos temporales durante la fase de expansión de poblaciones celulares del método
En un aspecto, la población de CEC obtenible u obtenida mediante el método de expansión de poblaciones celulares muestra preferentemente al menos una de las siguientes características. Más preferentemente, muestra dos o más de las siguientes características, en particular preferentemente todas.
(1) Las células expresan Na/K ATPasa. La expresión de Na/K ATPasa puede estimarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, inmunohistoquímica, RT-PCR cuantitativa o mediante análisis por FACS.
(2) Las células expresan uno o más de Colágeno 8a2, AQP1 (acuaporina 1) y SLC4A11 (Miembro 11 de la Familia 4 de Portadores de Soluto). Preferentemente, los niveles de expresión relativos son más altos que los de las células que normalmente no expresan Colágeno 8a2, AQP1 y SLC4A11, tal como, por ejemplo, en los fibroblastos dérmicos. La expresión de Colágeno 8a2, AQP1 o SLC4A11 se puede estimar mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, inmunohistoquímica, RT-PCR cuantitativa o mediante análisis por FACS.
(3) Las células no expresan (o como mucho expresan niveles relativamente bajos de) RPE65 (un marcador del epitelio pigmentado de la retina) y/o CD31 (un marcador del endotelio vascular). Los niveles de expresión relativos son similares a los de las células que normalmente no expresan RPE65, CD31, tal como en los fibroblastos dérmicos. La expresión de RPE65 y c D31 puede estimarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, inmunohistoquímica o análisis por FACS.
(4) Las células expresan niveles relativamente bajos de CD73. Los niveles de expresión relativos son más bajos que los de las células que han experimentado una transición de endoteliales a mesenquimatosas. La expresión de CD73 puede estimarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, análisis por FACS o inmunohistoquímica.
En otro aspecto, cuando está en una capa, por ejemplo, cuando se cultiva en una placa, la población de CEC obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares
preferentemente muestra al menos una de las siguientes características.
Más preferentemente, muestra dos o más de las siguientes características, en particular preferentemente todas:
(1) Las células son capaces de formar una estructura de una sola capa. Ésta es una de las características de la capa de células endoteliales corneales en el cuerpo. Esto puede observarse mediante tinción nuclear (por ejemplo, con colorante nuclear tal como Sytox, Hoechst) seguida de un examen microscópico.
(2) Las células son capaces de formar uniones estrechas. Esto puede comprobarse mediante una técnica convencional conocida en la técnica, la tinción por inmunofluorescencia del marcador de unión estrecha Zonula Occludens-1 (ZO-1).
(3) Las células son capaces de disponerse regularmente en la capa celular. Esto puede comprobarse mediante una técnica convencional conocida en la técnica, la tinción por inmunofluorescencia del marcador de unión estrecha Zonula Occludens-1 (ZO-1). En la capa de células endoteliales corneales sanas del cuerpo, las células que constituyen la capa se disponen regularmente, debido a lo cual se considera que las células endoteliales corneales mantienen una función normal y una alta transparencia y se considera que la córnea presenta adecuadamente una función de control de agua.
La población celular expandida mediante el método de expansión de poblaciones celulares
puede añadirse a una solución y después almacenarse, por ejemplo, en una solución de conservación o crioconservación (tales como las que se describen a continuación), o pueden añadirse directamente a una composición adecuada para el suministro ocular. La solución o composición de conservación o crioconservación adecuada para el suministro ocular puede comprender opcionalmente un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención.
En una opción más preferida, la preparación de poblaciones celulares que se suministra al ojo comprende niveles de muy bajos a insignificantes de un compuesto inhibidor de LATS. Por lo tanto, en una opción específica, el método de expansión de poblaciones celulares
comprende la etapa adicional de aclarado para retirar sustancialmente el compuesto divulgado en el presente documento (tal como el compuesto de acuerdo con la Fórmula A1 o subfórmulas de la misma). Esto puede implicar aclarar las células después de la fase de expansión de poblaciones celulares (directamente después de la fase de expansión de poblaciones celulares y/o después de que las células se hayan cultivado para formar un endotelio corneal maduro en un medio de crecimiento que no se haya suplementado con un inhibidor de LATS). Para aclarar las células, las células se centrifugan y se prepara una suspensión celular en PBS o medio de crecimiento.
Esta etapa puede realizarse varias veces, por ejemplo, de una a diez veces, para aclarar las células. Por último, las células pueden resuspenderse en una solución de conservación, una solución de crioconservación, una composición adecuada para el suministro ocular, un medio de crecimiento o combinaciones de los mismos, según se desee.
La población expandida de células preparada mediante el método de expansión de poblaciones celulares y aclarada del medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención puede transferirse a una composición adecuada para el suministro ocular, tal como, por ejemplo, un agente localizador. Opcionalmente, la población celular se almacena durante un período de tiempo antes de añadirla a un agente localizador adecuado para el suministro ocular. En una opción preferida, la población celular expandida puede añadirse en primer lugar a una solución adecuada para conservación o crioconservación, que preferentemente no comprende un inhibidor de LATS, y la población celular puede almacenarse (opcionalmente con congelación) antes de la adición a un agente localizador adecuado para el suministro ocular, que además preferentemente no comprende un inhibidor de LATS.
Las soluciones típicas adecuadas para la conservación de CEC son Optisol o PBS, preferentemente Optisol. Optisol es un medio de almacenamiento corneal que comprende sulfato de condroitina y dextrano para potenciar la deshidratación corneal durante el almacenamiento (véase, por ejemplo, Kaufmanet al.,(1991)Optisol corneal Storage médium; Arch Ophthalmol Jun;109(6): 864-8). Para la crioconservación, puede usarse glicerol, sulfóxido de dimetilo, propilenglicol o acetamida en la solución de crioconservación. La preparación crioconservada de células normalmente se mantiene a -20 °C o -80 °C.
En un aspecto se divulga una preparación conservada o crioconservada de células endoteliales corneales obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares.
En un aspecto alternativo, la invención se refiere a una preparación de células frescas donde las células endoteliales corneales obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares
están en suspensión en PBS y/o medio de crecimiento o combinadas con un agente localizador. La preparación de células frescas normalmente se mantiene a aproximadamente 37 °C. Pueden usarse recipientes de cultivos celulares convencionales conocidos en la técnica para almacenar las células, tales como un vial o un matraz.
En una opción preferida, antes de su uso en el ojo, una preparación crioconservada de células se descongela (por ejemplo, incubando a una temperatura de aproximadamente 37 °C en una incubadora o baño de agua). Preferentemente, pueden añadirse 10 volúmenes de PBS o medio de crecimiento para aclarar las células de la solución crioconservante. Después, las células pueden aclararse mediante centrifugación y puede prepararse una suspensión celular en PBS y/o medio de crecimiento, antes de la combinación con un agente localizador para el suministro ocular, que tampoco comprende preferentemente un inhibidor de LATS.
En un aspecto, la población expandida de células preparada mediante el método de expansión de poblaciones celulares, (preferentemente incluyendo también la etapa de crecimiento en medio sin suplementación con inhibidor de LATS para formar un endotelio corneal maduro), se prepara en forma de una suspensión (por ejemplo, en PBS y/o medio de crecimiento, tal como por ejemplo, medio X-VIVO) y se combina con un agente localizador adecuado para el suministro ocular (tal como una biomatriz como GeIMA). En una opción específica del método de tratamiento divulgado en el presente documento,
esta combinación de células, PBS y/o medio de crecimiento y biomatriz se suministra en forma de una suspensión al ojo. En otra opción específica más, esta combinación de células, PBS y/o medio de crecimiento y biomatriz comprende como máximo sólo niveles traza de un inhibidor de LATS.
Como alternativa, las células pueden cultivarse y la fase de proliferación de poblaciones celulares puede tener lugar en un medio de proliferación celular sobre un agente localizador adecuado para el suministro de células a la superficie ocular.
En una opción, la población celular expandida como se divulga en el presente documento puede aislarse en forma de una lámina de células contiguas para el suministro a la córnea, usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Kimet al., JSM Biotechnol. Bioeng.,2016, pág.1047). Las láminas de células pueden estar soportadas mecánicamente sobre un material o materiales para su suministro a la córnea.
Reducción del inmunorrechazo
Tras el trasplante, las células madre del limbo alógenas corren el riesgo de ser rechazadas por el sistema inmunitario del receptor. Pueden usarse pautas de inmunosupresión para reducir el riesgo de inmunorrechazo de células trasplantadas, tales como las LSC.
Los agentes inmunosupresores sistémicos adecuados utilizados en receptores de LSC alógenos incluyen tacrolimus, micofenolato de mofetilo, prednisona y valganciclovir profiláctico y trimetoprim/sulfametoxazol. (Véase: Holland EJ, Mogilishetty G, Skeens HM, Hair DB, Neff KD, Biber JM, Chan CC (2012)Systemic immunosuppression in ocular surface stem cell transplantation: results of a 10-year experience. Cornea.Junio de 2012; 31(6):655-61).
Como los métodos de expansión de poblaciones celulares divulgados en el presente documento proporcionan altas capacidades de expansión de una población de células, opcionalmente pueden usarse tecnologías de edición génica para retirar los impulsores del inmunorrechazo o añadir genes que reduzcan la respuesta inmunitaria del receptor.
En un aspecto, la edición génica se realiza en una población celular "exvivo".En otro aspecto, opcionalmente pueden usarse tecnologías de edición génica para reducir o eliminar la expresión de un gen asociado a la facilitación de una respuesta inmunitaria de hospedador contra injerto. En una opción preferida, el gen se selecciona del grupo que consiste en: B2M, HLA-A, HLA-B y HlA-C. En una opción específica el gen es B2M. B2M es beta 2 microglobulina y es un componente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. Tiene el identificador 914 del Comité de Nomenclatura Genética de la HUGO (HGNC). HLA-A es el complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, A (ID del HGNC 4931). HLA-B es el complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, B (ID del HGNC 4932). HLA-C es el complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, C (ID del HGNC 4933).
Pueden usarse varios métodos de edición génica, incluidos, pero sin limitación, métodos seleccionados del grupo que consiste en CRISPR (CRISPR: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas en intervalos regulares, también conocidas como sistemas CRISPR/Cas), ZFN (nucleasas con dedos de cinc), TALEN (nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción), meganucleasas modificadas por ingeniería genética (por ejemplo, nucleasas ARCUS, tales como la nucleasa a Rc ), suministro génico con vectores de AAV (virus adenoasociado) (por ejemplo, recombinación homóloga impulsada por vectores de AAV) y tecnologías de edición genómica basadas en vectores lentivíricos. El suministro de genes impulsado por vectores de AAV, tal como impulsado por recombinación homóloga, puede conseguirse mediante un AAV seleccionado del grupo que consiste en: AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 o un derivado de los mismos. En un aspecto, la edición génica se realiza en una población celular "exvivo".
Sistema de edición génica
Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema de edición génica" se refiere a un sistema que comprende uno o más dominios o componentes de unión a ADN y uno o más dominios o componentes modificadores de ADN, o ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, uno o más vectores, que codifican dichos dominios o componentes de unión y modificadores de ADN. Los sistemas de edición génica se usan para modificar el ácido nucleico de un gen diana y/o para modular la expresión de un gen diana. En sistemas de edición génica conocidos, por ejemplo, uno o más dominios o componentes de unión a ADN se asocian al uno o más dominios o componentes modificadores de ADN, de manera que el uno o más dominios de unión a ADN dirigen el uno o más dominios o componentes modificadores de ADN a un sitio de ácido nucleico específico. Como se describe en el presente documento, la edición génica puede realizarseex vivo.
Sistemas de edición génica de AAV
El uso de vectores derivados de AAV para transferir genesin vitroein vivoes bien conocido en la técnica (véase la patente de los EE. UU. N.° 9.707.304, por ejemplo). El uso de vectores víricos para editar genes en una célula se ha descrito, por ejemplo, en Chenet al.,2016,Molecular Therapy,24:447-457; Gornalusseet al., Nature Biotechnology,2017, 35(8):765-772; y el documento WO2017087961. Puede prepararse un vector de AAV usando métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Flotte T R.Adeno-associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res.Diciembre de 2005; 58(6):1143-7; Goncalves M A.Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector, Virol J.6 de mayo de 2005; 2:43; Surace E M, Auricchio A.Adeno-associated viral vectors forretinal gene transfer. Prog Retin Eye Res.Noviembre de 2003; 22(6):705-19; Mandel R J, Manfredsson F P, Foust K D, Rising A, Reimsnider S, Nash K, Burger C.Recombinant adeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol Ther.Marzo de 2006; 13(3):463-83.
Sistemas de edición génica CRISPR
"CRISPR", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas en intervalos regulares, o un sistema que comprende un conjunto de repeticiones de este tipo. "Cas", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Los diversos sistemas CRISPR-Cas pueden dividirse en dos clases de acuerdo con la configuración de sus módulos efectores: los sistemas CRISPR de clase 1 utilizan varias proteínas Cas y el ARNcr para formar un complejo efector, mientras que los sistemas CRISPR de clase 2 emplean una proteína Cas de un solo componente grande junto con ARNcr para mediar la interferencia. Un ejemplo de sistema CRISPR-Cas de clase 2 emplea Cpf1 (CRISPR de Prevotella y Francisella 1). Véase, por ejemplo, Zetscheet al., Cell163:759-771 (2015). El término "Cpf1", como se usa en el presente documento, incluye todos los ortólogos y variantes que pueden usarse en un sistema CRISPR.
Se han encontrado sistemas CRISPR de origen natural en aproximadamente un 40 % de los genomas eubacterianos secuenciados y en un 90 % de las arqueas secuenciadas. Grissaet al.(2007)BMC Bioinformatics8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunitario procariota que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos tales como plásmidos y fagos y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangouet al.(2007)Science315: 1709-1712; Marraginiet al.,(2008)Science322: 1843-1845.
El sistema CRISPR se ha modificado para su uso en la edición génica (silenciamiento, potenciación o cambio de genes específicos) en eucariotas tales como ratones, primates y seres humanos. Wiedenheftet al.(2012)Nature482: 331-8. Esto se logra, por ejemplo, introduciendo en la célula eucariota uno o más vectores que codifican un ARN guía (ARNg) modificado por ingeniería genética específicamente (por ejemplo, un ARNg que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de un genoma eucariota) y una o más nucleasas guiadas por ARN adecuadas, por ejemplo, proteínas Cas. La nucleasa guiada por ARN forma un complejo con el ARNg, que después se dirige al sitio de ADN diana mediante la hibridación de la secuencia del ARNg con la secuencia complementaria de un genoma eucariótico, donde la nucleasa guiada por ARN induce una ruptura bicatenaria o monocatenaria en el ADN. La introducción o supresión de nucleótidos en o cerca de la ruptura de la cadena crea el genoma modificado.
Ya que esto se produce de manera natural en muchos tipos diferentes de bacterias, las disposiciones exactas de las CRISPR y la estructura, función y número de genes Cas y su producto difieren algo entre especies. Haftet al.(2005)PLoS Comput.Biol. 1: e60; Kuninet al.(2007)Genome Biol.8: R61; Mojicaet al.(2005)J. Mol. Evol.60: 174-182; Bolotinet al.(2005)Microbiol.151: 2551-2561; Pourcelet al.(2005)Microbiol.151: 653-663; y Sternet al.(2010)Trends.Genet.
28: 335-340. Por ejemplo, las proteínas Cse (subtipo Cas,E. coli)(por ejemplo, CasA) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa los transcritos de ARN de CRISPR para proporcionar unidades de espaciador-repetición que Cascade retiene. Brounset al.(2008)Science321: 960-964. En otras procariotas, Cas6 procesa el transcrito CRISPR. La inactivación de fagos basada en CRISPR enE. colirequiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 o Cas2. Las proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) enPyrococcus furiosusy otras procariotas forman un complejo funcional con ARN de CRISPR pequeños que reconoce y escinde ARN diana complementarios.
Un sistema CRISPR más simple depende de la proteína Cas9, que es una nucleasa con dos sitios de corte activos, uno para cada cadena de la doble hélice. La combinación de Cas9 y ARN del locus CRISPR modificado puede usarse en un sistema para la edición génica. Pennisi (2013)Science341: 833-836.
En algunas opciones, la nucleasa guiada por ARN es una molécula de Cas, por ejemplo, una molécula de Cas9. La "molécula de Cas9" puede interactuar con una molécula de ARNg (por ejemplo, secuencia de un dominio de un tracr, también conocido como ARNtracr o ARN CRISPR transactivador) y, junto con la molécula de ARNg, ubicarse (por ejemplo, dirigirse o alojarse) en un sitio que comprende una secuencia diana y una secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador).
En los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse moléculas de Cas9 de, derivadas de o basadas en las proteínas Cas9 de una diversidad de especies. Por ejemplo, en los sistemas, métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse moléculas de Cas9, derivadas de, o basadas en, por ejemplo, moléculas de Cas9 de S.pyogenes, S. thermophilus, Staphylococcus aureusy/oNeisseria meningitidis.Las especies de Cas9 adicionales incluyen:Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomycessp.,cycliphilus denitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroidessp.,Blastopirellula marina, Bradyrhiz' obiumsp.,Brevibacillus latemsporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lad, Candidatus Puniceispirillum, Clostridiu cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter sliibae, Eubacterium dolichum, gamma proteobacterium, Gluconacetobacler diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacler polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystissp.,Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica. Neisseriasp.,Neisseria wadsworthii, Nitrosomonassp.,Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulumsp.,Simonsiella muelleri, Sphingomonassp.,Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugduncensis,St.,Tislrella mobilis, Treponemasp. oVerminephrobacter eiseniae.
En algunas opciones, la capacidad de una molécula de Cas9 activa para interactuar con un ácido nucleico diana y escindirlo depende de la secuencia PAM. Una secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador) es una secuencia en el ácido nucleico diana. Normalmente es corta, por ejemplo, de 2 a 7 pares de bases de longitud. En una opción, la escisión del ácido nucleico diana se produce en dirección 5' de la secuencia PAM. Las moléculas de Cas9 activas de diferentes especies bacterianas pueden reconocer diferentes motivos de secuencia (por ejemplo, secuencias PAM). En una opción, una molécula de Cas9 activa de S.pyogenesreconoce el motivo de secuencia NGG y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana de 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5 pares de bases en dirección 5' de esa secuencia. Véase, por ejemplo, Maliet al., SCIENCE2013; 339(6121): 823-826. En una opción, una molécula de Cas9 activa de S.thermophilusreconoce el motivo de secuencia NGg Ng (SEQ ID NO: 4) y NNAG AAW (SEQ ID NO: 5) (W = A o T y N es cualquier nucleobase) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana central de 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5, pares de bases en dirección 5' de estas secuencias. Véase, por ejemplo, Horvathet al., SCIENCE2010; 327 (5962): 167-170, y Deveauet al., J BACTERIOL2008; 190(4): 1390-1400. En una opción, una molécula de Cas9 activa de S.mutansreconoce el motivo de secuencia NGG o NAAR (R: A o G) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana central de 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5 pares de bases en dirección 5' de esta secuencia. Véase, por ejemplo, Deveauet al., J BACTERIOL2008; 190(4): 1390-1400.
En una opción, una molécula de Cas9 activa de S.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRR (SEQ ID NO: 6) (R = A o G) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana de 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5 pares de bases en dirección 5' de esa secuencia. Véase, por ejemplo, Ran F.et al., NATURE,vol. 520, 2015, págs. 186-191. En una opción, una molécula de Cas9 activa deN. meningitidisreconoce el motivo de secuencia NNNNGATT (SEQ ID NO: 7) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana de 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5 pares de bases en dirección 5' de esa secuencia. Véase, por ejemplo, Houet al., PNAS EARLY e Di TION2013, 1-6. La capacidad de una molécula de Cas9 para reconocer una secuencia PAM se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de transformación descrito en Jineket al., SCIENCE2012, 337:816.
En Chylinskiet al., RNA Biology2013; 10:5, 727-737, se describen moléculas de Cas9 naturales de ejemplo. Dichas moléculas de Cas9 incluyen moléculas de Cas9 de una familia bacteriana del grupo 1, familia bacteriana del grupo 2, familia bacteriana del grupo 3, familia bacteriana del grupo 4, familia bacteriana del grupo 5, familia bacteriana del grupo 6, una familia bacteriana del grupo 7, una familia bacteriana del grupo 8, una familia bacteriana del grupo 9, una familia bacteriana del grupo 10, una familia bacteriana del grupo 11, una familia bacteriana del grupo 12, una familia bacteriana del grupo 13, una familia bacteriana del grupo 14, una familia bacteriana del grupo 15, una familia bacteriana del grupo 16, un grupo 17 familia bacteriana, una familia bacteriana del grupo 18, una familia bacteriana del grupo 19, una familia bacteriana del grupo 20, una familia bacteriana del grupo 21, una familia bacteriana del grupo 22, una familia bacteriana del grupo 23, una familia bacteriana del grupo 24, una familia bacteriana del grupo 25, una familia bacteriana del grupo 26, una familia bacteriana del grupo 27, una familia bacteriana del grupo 28, una familia bacteriana del grupo 29, una familia bacteriana del grupo 30, una familia bacteriana del grupo 31, una familia bacteriana del grupo 32, una familia bacteriana del grupo 33, una familia bacteriana del grupo 34, una familia bacteriana del grupo 35, una familia bacteriana del grupo 36, una familia bacteriana del grupo 37, una familia bacteriana del grupo 38, una familia bacteriana del grupo 39, una familia bacteriana del grupo 40, una familia bacteriana del grupo 41, una familia bacteriana del grupo 42, una familia bacteriana del grupo 43, una familia bacteriana del grupo 44, una familia bacteriana del grupo 45, una familia bacteriana del grupo 46, una familia bacteriana del grupo 47, una familia bacteriana del grupo 48, una familia bacteriana del grupo 49, una familia bacteriana del grupo 50, una familia bacteriana del grupo 51, una familia bacteriana del grupo 52, una familia bacteriana del grupo 53, una familia bacteriana del grupo 54, una familia bacteriana del grupo 55, una familia bacteriana del grupo 56, una familia bacteriana del grupo 57, una familia bacteriana del grupo 58, una familia bacteriana del grupo 59, una familia bacteriana del grupo 60, una familia bacteriana del grupo 61, una familia bacteriana del grupo 62, una familia bacteriana del grupo 63, una familia bacteriana del grupo 64, una familia bacteriana del grupo 65, una familia bacteriana del grupo 66, una familia bacteriana del grupo 67, una familia bacteriana del grupo 68, una familia bacteriana del grupo 69, una familia bacteriana del grupo 70, una familia bacteriana del grupo 71, una familia bacteriana del grupo 72, una familia bacteriana del grupo 73, una familia bacteriana del grupo 74, una familia bacteriana del grupo 75, una familia bacteriana del grupo 76, una familia bacteriana del grupo 77 o una familia bacteriana del grupo 78.
Las moléculas de Cas9 de origen natural de ejemplo incluyen una molécula de Cas9 de una familia bacteriana del grupo 1. Los ejemplos incluyen una molécula de Cas9 de: S.pyogenes(por ejemplo, cepa SF370, MGAS 10270, MGAS 10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 y SSI-1), S.thermophilus(por ejemplo, cepa LMD-9), S.pseudoporcinus(por ejemplo, cepa SPIN 20026), S.mutans(por ejemplo, cepa UA 159, NN2025), S.macacae(por ejemplo, cepa NCTC1 1558), S.gallolylicus(por ejemplo, cepa UCN34, A<t>CC BAA-2069), S.equines(por ejemplo, cepa ATCC 9812, MGCS 124), S.dysdalactiae(por ejemplo, cepa GGS 124), S.bovis(por ejemplo, cepa A<t>CC 700338), S.cmginosus(por ejemplo; cepa F021 1 ), S.agalactia*(por ejemplo, cepa NEM316, A909),Listeria monocytogenes(por ejemplo, cepa F6854),Listeria innocua (L. innocua,por ejemplo, cepa Clip I1262),EtUerococcus italicus(por ejemplo, cepa DSM 15952) oEnterococcus faecium(por ejemplo, cepa 1,23, 408). Son moléculas de Cas9 de ejemplo adicionales una molécula de Cas9 deNeisseria meningitidis(Hou et'al.PNAS Early Edition2013, 1-6) y una molécula de Cas9 de S.aureus.
En una opción, una molécula de Cas9, por ejemplo, una molécula de Cas9 activa comprende una secuencia de aminoácidos: que tiene un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología con; difiere en no más del 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % de los restos de aminoácidos en comparación con; difiere en al menos 1, 2, 5, 10 o 20 aminoácidos, pero en no más de 100, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 aminoácidos de; o es idéntica a; cualquier secuencia de moléculas de Cas9 descrita en el presente documento o una secuencia de moléculas de Cas9 de origen natural, por ejemplo, una molécula de Cas9 de una especie enumerada en el presente documento o descrita en Chylinskiet al., RNA Biology2013, 10:5, 'I2'I-T,1 Houet al. Pn As Early Edition2013, 1-6.
En una opción, una molécula de Cas9 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología con; difiere en no más del 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % de los restos de aminoácidos en comparación con; difiere en al menos 1, 2, 5, 10 o 20 aminoácidos, pero en no más de 100, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 aminoácidos de; o es idéntica a; Cas9 de S.pyogenes(UniProt Q99ZW2). En algunas opciones, la molécula de Cas9 es una variante de Cas9 de S.pyogenes,como una variante descrita en Slaymakeret al., Science Express,disponible en línea desde el 1 de diciembre de 2015 en Science DOI: 10.1126/science.aad5227; Kleinstiveret al., Nature,529, 2016, págs. 490-495, disponible en línea desde el 6 de enero de 2016 en doi:10.1038/nature16526; o el documento US2016/0102324.
En algunas opciones, la molécula de Cas9, por ejemplo, una Cas9 de S.piogenes,puede comprender adicionalmente una o más secuencias de aminoácidos que confieren actividad adicional. En algunos aspectos, la molécula de Cas9 puede comprender una o más secuencias de localización nuclear (NLS), tales como al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS. Normalmente, una NLS consiste en una o más secuencias cortas de lisinas o argininas con carga positiva expuestas en la superficie de la proteína, pero se conocen otros tipos de NLS. Los ejemplos no limitantes de NLS incluyen una secuencia de NLS que comprende o se obtiene de: la NLS del antígeno T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoácidos PKKKRKV (SEQ ID NO: 8). Se conocen en la técnica otras secuencias de NLS adecuadas (por ejemplo, Sorokin,Biochemistry(Moscú) (2007) 72:13, 1439-1457; Lange JBiol Chem.(2007) 282:8, 5101-5). En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la molécula de Cas9 puede comprender adicionalmente (o como alternativa) un marcador, por ejemplo, un marcador His, por ejemplo, un marcador His (6) (SEQ ID NO: 25) o marcador His(8) (SEQ ID NO: 26), por ejemplo, en el extremo N y/o en el extremo C.
Por lo tanto, los sistemas CRISPR de edición génica, por ejemplo, para la edición génica en células eucariotas, normalmente incluyen (1) una molécula de ARN guía (ARNg) que comprende un dominio diana (que es capaz de hibridarse con la secuencia diana de ADN genómico), y una secuencia que es capaz de unirse a una enzima Cas, por ejemplo, Cas9, y (2) una proteína Cas, por ejemplo, Cas9. La secuencia que es capaz de unirse a una proteína Cas puede comprender un dominio denominado dominio tracr o ARNtracr. El dominio de direccionamiento y la secuencia que es capaz de unirse a un Cas, por ejemplo, la enzima Cas9, pueden estar dispuestos en la misma (en ocasiones denominada ARNg única, ARNg quimérico o ARNgu) o moléculas diferentes (en ocasiones denominadas ARN ARNg doble o ARNgd). Si se dispone en diferentes moléculas, cada una incluye un dominio de hibridación que permite que las moléculas se asocien, por ejemplo, a través de la hibridación.
Se conocen en la técnica formatos de moléculas de ARNg. Una molécula de ARNg de ejemplo, por ejemplo, una molécula de ARNdg, como se divulga en el presente documento comprende, por ejemplo, consiste en, un primer ácido nucleico que tiene la secuencia:
5'nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' (SEQ ID NO: 9),
donde las "n" se refieren a los restos del dominio de direccionamiento, por ejemplo, como se describe en el presente documento, y que puede consistir en 15-25 nucleótidos, por ejemplo, consiste en 20 nucleótidos;
y una segunda secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia de ejemplo:
5'AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 3', opcionalmente con 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 (por ejemplo, 4 o 7, por ejemplo, 7) nucleótidos U adicionales en el extremo 3' (SEQ ID NO: 10).
La segunda molécula de ácido nucleico puede consistir como alternativa en un fragmento de la secuencia anterior, siendo dicho fragmento capaz de hibridarse con el primer ácido nucleico. Un ejemplo de dicha segunda molécula de ácido nucleico es:
5'AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCAC CGAGUCGGUGC 3', opcionalmente con 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 (por ejemplo, 4 o 7, por ejemplo, 7) nucleótidos U adicionales en el extremo 3' (SEQ ID NO: 11).
Otra molécula de ARNg de ejemplo, por ejemplo, una molécula de ARNgu, de la presente invención comprende, por ejemplo, consiste en un primer ácido nucleico que tiene la secuencia:
5'nnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 3' (SEQ ID NO:12), donde las "n" se refieren a los restos del dominio de direccionamiento, por ejemplo, como se describe en el presente documento, y pueden consistir en 15-25 nucleótidos, por ejemplo, consistir en 20 nucleótidos, opcionalmente con 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 (por ejemplo, 4 o 7, por ejemplo, 4) nucleótidos U adicionales en el extremo 3'.
Los componentes y/o elementos adicionales de los sistemas de edición génica CRISPR conocidos en la técnica, por ejemplo, se describen en la publicación de los EE.UU. N.° 2014/0068797, el documento WO2015/048577, y en Cong (2013)Science339: 819-823.
Dichos sistemas pueden generarse para inhibir un gen diana, por ejemplo, mediante la modificación por ingeniería genética de un sistema de edición génica CRISPR para incluir una molécula de ARNg que comprenda un dominio diana que se hibride con una secuencia del gen diana. En opciones, el ARNg comprende un dominio de direccionamiento que es totalmente complementario con 15-25 nucleótidos, por ejemplo, 20 nucleótidos, de un gen diana. En algunas opciones, los 15-25 nucleótidos, por ejemplo, 20 nucleótidos, del gen diana, se disponen inmediatamente en 5' a una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM) reconocida por la nucleasa guiada por ARN, por ejemplo, proteína Cas, del sistema de edición génica CRISPR (por ejemplo, cuando el sistema comprende una proteína Cas9 de S.pyogenes,la secuencia PAM comprende NGG, donde N puede ser cualquiera de A, T, G o C).
En algunas opciones, la molécula de ARNg y la nucleasa guiada por ARN, por ejemplo, la proteína Cas, del sistema de edición génica CRISPR pueden formar complejos para formar un complejo de RNP (ribonucleoproteína). Dichos complejos de RNP pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento. En otras opciones, puede usarse ácido nucleico que codifica uno o más componentes del sistema de edición génica CRISPR en los métodos descritos en el presente documento.
En algunas opciones, puede introducirse ADN extraño en la célula junto con el sistema de edición génica CRISPR, por ejemplo, ADN que codifique un transgén deseado, con o sin un promotor activo en el tipo de célula diana. Dependiendo de las secuencias del ADN extraño y la secuencia diana del genoma, este proceso puede usarse para integrar el ADN extraño en el genoma, en el sitio diana del sistema de edición génica CRISPR o cerca del mismo. Por ejemplo, las secuencias 3' y 5' que flanquean el transgén pueden incluirse en el ADN extraño que son homólogas a la secuencia génica 3' y 5' (respectivamente) del sitio en el genoma cortado por el sistema de edición génica. Dicha molécula de ADN extraño puede denominarse "ADN molde".
En una opción, el sistema de edición génica CRISPR divulgado en el presente documento comprende Cas9, por ejemplo, Cas9 de S.pyogenes,y un ARNg que comprende un dominio de direccionamiento que se hibrida con una secuencia de un gen de interés. En una opción, el ARNg y Cas9 se complejan para formar una RNP (ribonucleoproteína). En una opción, el sistema de edición génica CRISPR comprende un ácido nucleico que codifica un ARNg y un ácido nucleico que codifica una proteína Cas, por ejemplo, Cas9, por ejemplo, Cas9 de S.pyogenes.En una opción, el sistema de edición génica CRISPR comprende un ARNg y un ácido nucleico que codifica una proteína Cas, por ejemplo, Cas9, por ejemplo, Cas9 deS. pyogenes.
En algunas opciones, puede utilizarse el control inducible sobre Cas9 y la expresión de ARNgu para optimizar la eficiencia y al mismo tiempo reducir la frecuencia de los efectos no deseados, aumentando de este modo la seguridad. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, interruptores transcripcionales y postranscripcionales enumerados a continuación; transcripción inducible por doxiciclina Loewet al.(2010)BMC Biotechnol.10:81, estabilización de proteína inducible por Shield1 Banaszynskiet al.(2016)Cell126: 995-1004, activación de proteínas inducida por tamoxifeno Daviset al.(2015)Nat. Chem. Biol.11: 316-318, activación o dimerización de Cas9 dividida inducida por rapamicina u optogenética Zetsche (2015)Nature Biotechnol.33(2): 139-142, Nihongakiet al.(2015)Nature Biotechnol.33(7): 755-760, Polstein y Gersbach (2015)Nat. Chem. Biol.11: 198-200, y degradación inducible por fármacos del marcador SMASh Chunget al.(2015)Nat. Chem. Biol.11: 713-720.
En general, el sistema CRISPR-Cas o CRISPR se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión o en la dirección de la actividad de genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia de tracr (CRISPR transactivador) (por ejemplo, ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia tracr-mate (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada un "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) o "ARN(es)", como se usa ese término en el presente documento, (por ejemplo, ARN(s) para guiar a Cas9, por ejemplo, ARN CRISPR y ARN transactivador (tracr) o un ARN guía único (ARNgu) (ARN quimérico)) u otras secuencias y transcritos de un locus de CRISPR. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo de CRISPR en el sitio de una secuencia diana (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo de CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia para la que se diseña una secuencia guía para que tenga complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía promueve la formación de un complejo de CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas opciones, una secuencia diana se ubica en el núcleo o citoplasma de una célula. En algunas opciones, puede preferirse en un complejo de CRISPR que la secuencia tracr tenga una o más horquillas y tenga una longitud de 30 o más nucleótidos, una longitud de 40 o más nucleótidos o una longitud de 50 o más nucleótidos; que la secuencia guía tenga entre 10 y 30 nucleótidos de longitud, y que la enzima CRISPR/Cas sea una enzima Cas9 de tipo II. En las opciones, las expresiones secuencia guía y ARN guía se usan indistintamente. En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tenga suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos diana para hibridarse con la secuencia diana y la unión específica de secuencia directa de un complejo de CRISPR a la secuencia diana. En algunas opciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su correspondiente secuencia diana, cuando se alinea de forma óptima usando un algoritmo de alineación adecuado, es de aproximadamente o superior al 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % o más. La alineación óptima puede determinarse con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, cuyos ejemplos incluyen, pero sin limitación, el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la transformada de Burrows-Wheeler (por ejemplo, el alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies); ELAND (Illumina, San Diego, CA) y SOAP. En algunas opciones, una secuencia guía tiene aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunas opciones, una secuencia guía tiene menos de aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. Preferentemente, la secuencia guía tiene una longitud de 10 - 30 nucleótidos. La capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión específica de secuencia de un complejo de CRISPR a una secuencia diana puede evaluarse mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, se pueden proporcionar los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo de CRISPR, incluida la secuencia guía que se probará, a una célula hospedadora que tenga la secuencia diana correspondiente, como por transfección con vectores que codifiquen los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de una evaluación de la escisión preferencial dentro de la secuencia diana, tal como mediante el ensayo Surveyor. De manera similar, la escisión de una secuencia polinucleotídica diana puede evaluarse en un tubo de prueba proporcionando la secuencia diana, los componentes de un complejo de CRISPR, incluyendo la secuencia guía que se probará y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de prueba, y comparando la unión o la velocidad de escisión en la secuencia diana entre las reacciones de la secuencia guía de prueba y de control. Otros ensayos son posibles, y se les ocurrirán a los expertos en la técnica. Una secuencia guía puede seleccionarse para dirigirse a cualquier secuencia diana. En algunas opciones, la secuencia diana es una secuencia de dentro del genoma de una célula. Las secuencias diana de ejemplo incluyen aquellas que son únicas en el genoma diana. Por ejemplo, para Cas9 de S.pyogenes,una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de la forma MM M MMMNNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 13), donde NNN NNN NN XGG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una única aparición en el genoma. Una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de S.pyogenesde la forma MMM MMMMMNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 14), donde N N N N XGG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una única aparición en el genoma. Para Cas9 de CRISPRI de S.thermophilus,una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de la forma MMMMMMMMNN N N NN XXAGAAW (SEQ ID NO: 15), donde NNN NN N XXAGAAW (SEQ ID NO: 29) (N es A, G, T o C; X puede ser cualquier cosa; y W es A o T) tiene una única aparición en el genoma. Una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de CRISPRI de S.thermophilusde la forma MMMMMM MN N NNN NNXXAGAAW (SEQ ID NO: 16), donde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 30) (N es A, G, T o C; X puede ser cualquier cosa; y W es A o T) tiene una única aparición en el genoma. Para Cas9 de S.pyogenes,una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNN NNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 17), donde NNNNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una única aparición en el genoma. Una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de S.pyogenesde la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 31) donde NNNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 18), (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una única aparición en el genoma. En cada una de estas secuencias, N es cualquier nucleobase y "M" puede ser A, G, T o C, y no es necesario tenerlo en cuenta al identificar una secuencia como única. En algunas opciones, se selecciona una secuencia guía para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. En algunas opciones, aproximadamente o menos de aproximadamente el 75 %, 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % o menos de los nucleótidos de la secuencia guía participan en el emparejamiento de bases autocomplementarias cuando se pliegan de manera óptima. El plegamiento óptimo puede determinarse mediante cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado. Algunos programas se basan en el cálculo de la energía libre mínima de Gibbs. Un ejemplo de uno de dichos algoritmos es mFold, como describen Zuker y Stiegler(Nucleic Acids Res.9 (1981), 133-148). Otro ejemplo de algoritmo de plegamiento es el servidor web en línea RNAfold, desarrollado en el Instituto de Química Teórica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de predicción de la estructura del centroide (véase, por ejemplo, A. R. Gruberet al.,2008, Cell 106(1): 23-24; y PA Carr y GM Church, 2009,Nature Biotechnology27(12): 1151-62).
Métodos para diseñar moléculas de ARNg
Se proporcionan métodos para seleccionar, diseñar y validar dominios de direccionamiento para su uso en los ARNg descritos en el presente documento. En el presente documento también se proporcionan dominios de direccionamiento de ejemplo para su incorporación en ARNg.
Se han descrito métodos para la selección y validación de secuencias diana, así como análisis inespecífico (véase, por ejemplo, Mali 2013; Hsu 2013; Fu 2014; Heigwer 2014; Bae 2014; y Xiao 2014). Por ejemplo, las secuencias diana pueden elegirse identificando la secuencia PAM para una molécula de Cas9 (por ejemplo, PAM pertinente, por ejemplo, PAM de NGG para S.pyogenes,NNNNGATT (SEQ ID NO: 19) o PAM de NNNNGCTT (SEQ ID NO: 20), paraN. meningitides,y NNg RrT (SEQ ID NO: 21) o PAM de Nn GRRV (SEQ ID NO: 22), para S.aureus),e identificando la secuencia adyacente como la secuencia diana para un sistema CRISPR usando esa molécula de Cas9. Puede usarse una herramienta de software para refinar adicionalmente la elección de posibles dominios diana correspondientes a la secuencia diana de un usuario, por ejemplo, para minimizar la actividad total inespecífica en todo el genoma. Los dominios de direccionamiento candidatos y los ARNg que comprenden esos dominios de direccionamiento pueden evaluarse funcionalmente usando métodos conocidos en la técnica y/o como se expone en el presente documento.
Como ejemplo no limitante, los dominios de direccionamiento para su uso en ARNg para su uso con Cas9 de S.pyogenes, N. meningiitidisy S.aureusse identifican usando un algoritmo de búsqueda de secuencias de ADN. Se diseñan dominios de direccionamiento de 17 monómeros, 18 monómeros, 19 monómeros, 20 monómeros, 21 monómeros, 22 monómeros, 23 monómeros y/o 24 monómeros para cada Cas9. Con respecto a Cas9 de S.pyogenes,preferentemente, el dominio de direccionamiento tiene 20 monómeros. El diseño de ARNg se realiza usando un software de diseño de ARNg personalizado basado en la herramienta pública cas-offinder (Bae 2014). Este software califica las guías después de calcular su propensión a desviarse de la diana en todo el genoma.
Análisis funcional de moléculas candidatas
Las moléculas de Cas9 candidatas, las moléculas de ARNg candidatas y los complejos de molécula de Cas9/molécula de ARNg candidatos, pueden evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica o como se describe en el presente documento. Por ejemplo, anteriormente se han descrito métodos de ejemplo para evaluar la actividad endonucleasa de la molécula de Cas9 (Jinek 2012). Cada técnica descrita en el presente documento puede usarse sola o en combinación con una o más técnicas para evaluar la molécula candidata. Las técnicas divulgadas en el presente documento pueden usarse para una diversidad de métodos que incluyen, pero sin limitación, métodos de determinación de la estabilidad de un complejo de molécula de Cas9/molécula de ARNg, métodos de determinación de una condición que promueve un complejo de molécula de Cas9/molécula de ARNg estable, métodos de cribado para un complejo de molécula de Cas9/molécula de ARNg estable, métodos de identificación de un ARNg óptimo para formar un complejo de molécula de Cas9/molécula de ARNg estable y métodos de selección de un complejo de Cas9/ARNg para la administración a un sujeto.
Ensayo de unión y escisión: Prueba de la actividad endonucleasa de la molécula de Cas9 La capacidad de un complejo de molécula de Cas9/molécula de ARNg para unirse a un ácido nucleico diana y escindirlo puede evaluarse en un ensayo de escisión de plásmido. En este ensayo, la molécula de ARNg sintética o transcritain vitrose pre-hibrida antes de la reacción calentándola a 95 °C y enfriándola lentamente a temperatura ambiente. Se incuba ADN plasmídico nativo o linealizado por digestión de restricción (300 ng (~8 nM)) durante 60 minutos a 37 °C con una molécula de proteína Cas9 purificada (50-500 nM) y ARNg (50-500 nM, 1: 1) en un tampón de escisión de plásmido de Cas9 (HEPES 20 mM, pH 7,5, KC1 150 mM, DTT 0,5 mM, Ed Ta 0,1 mM) con o sin MgCl2 10 mM. Las reacciones se detienen con tampón de carga de ADN 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA250 mM), se resuelven mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 o 1 % y se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio. Los productos de escisión resultantes indican si la molécula de Cas9 escinde ambas cadenas de ADN o solo una de las dos. Por ejemplo, los productos de ADN lineales indican la escisión de ambas cadenas de ADN. Los productos circulares abiertos mellados indican que sólo una de las dos cadenas está escindida.
Como alternativa, la capacidad de un complejo de molécula de Cas9/molécula de ARNg para unirse a un ácido nucleico diana y escindirlo puede evaluarse en un ensayo de escisión de ADN de oligonucleótidos. En este ensayo, se marcan radiactivamente oligonucleótidos de ADN (10 pmol) incubando con 5 unidades de polinucleótido cinasa T4 y -3-6 pmol ( 20-40 mCi) [<y>-32P]-ATP en tampón de reacción de polinucleótido cinasa T4 IX a 37 °C durante 30 min, en una reacción de 50 microlitros. Después de la inactivación por calor (65 °C durante 20 min), las reacciones se purifican a través de una columna para retirar el marcador no incorporado. Los agentes de localización de dúplex (100 nM) se generan hibridando oligonucleótidos marcados con cantidades equimolares de oligonucleótido complementario no marcado a 95 °C durante 3 minutos, seguido de un enfriamiento lento a temperatura ambiente. Para los ensayos de escisión, las moléculas de ARNg se hibridan calentándolas a 95 °C durante 30 s, seguido de un enfriamiento lento a temperatura ambiente. Cas9 (concentración final de 500 nM) se preincuba con las moléculas de ARNg hibridadas (500 nM) en tampón de ensayo de escisión (HEPES 20 mM, pH 7,5, KCI 100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5% ) en un volumen total de 9 microlitros. Las reacciones se inician mediante la adición de 1 microlitro de ADN diana (10 nM) y se incuban durante 1 hora a 37 °C. Las reacciones se interrumpen mediante la adición de 20 microlitros de colorante de carga (EDTA 5 mM, SDS al 0,025 %, glicerol al 5 % en formamida) y se calientan a 95 °C durante 5 min. Los productos de escisión se resuelven en geles de poliacrilamida desnaturalizante al 12 % que contienen urea 7 M y se visualizan mediante formación de imágenes fosforadas. Los productos de escisión resultantes indican si se escinden la cadena complementaria, la cadena no complementaria o ambas.
Uno o ambos de estos ensayos pueden usarse para evaluar la idoneidad de una molécula de ARNg candidata o una molécula de Cas9 candidata.
Detección e identificación de indeles. Las modificaciones específicas del genoma también pueden detectarse mediante Sanger o mediante secuenciación profunda. Para el primero, el ADN genómico de la región modificada puede amplificarse con cualquiera de los cebadores que flanquean la secuencia diana del ARNg. Pueden subclonarse amplicones en un plásmido tal como pUC19 para su transformación y deben secuenciarse colonias individuales para revelar el genotipo clonal.
Como alternativa, la secuenciación profunda es adecuada para tomar muestras de una gran cantidad de muestras o sitios diana. Se diseñan cebadores de NGS para amplicones más cortos, normalmente en el intervalo de tamaño de 100-200 pb. Para la detección de indeles, es importante diseñar cebadores situados al menos a 50 pb del sitio diana de Cas9 para permitir la detección de indeles más largos. Los amplicones pueden evaluarse usando instrumentos disponibles en el mercado, por ejemplo, el sistema Illumina. Pueden encontrarse descripciones detalladas de la optimización por NGS y la solución de problemas en el manual del usuario de Illumina.
Sistemas de edición génica de TALEN
Las TALEN se producen de manera artificial fusionando un dominio de unión a ADN del efector TAL con un dominio de escisión de ADN. Los efectos de tipo activador de la transcripción (TALE) pueden manipularse por ingeniería genéticapara unirse a cualquier secuencia de<a>D<n>deseada, por ejemplo, un gen diana. Al combinar una TALE modificada por ingeniería genética con un dominio de escisión de ADN, puede producirse una enzima de restricción que es específica para cualquier secuencia de ADN deseada. Estas pueden introducirse posteriormente en una célula, en donde pueden usarse para la edición genómica. Boch (2011)Nature Biotech.29: 135-6; y Bochet al.(2009)Science326: 1509-12; Moscouet al.(2009)Science326: 3501.
Las TALE son proteínas secretadas por bacterias Xanthomonas. El dominio de unión a ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos muy conservados con excepción de los aminoácidos 12 y 13. Estas dos posiciones son muy variables y muestran una sólida correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos. Por lo tanto, se pueden modificar para unirse a una secuencia de ADN deseada.
Para producir una TALEN, una proteína TALE se fusiona con una nucleasa (N), que es, por ejemplo, una endonucleasa Fokl de tipo silvestre o mutada. Se han realizado varias mutaciones de Fokl para su uso en TALEN; estos, por ejemplo, mejoran la especificidad o actividad de escisión. Cermaket al.(2011)Nucl.Acids Res. 39: e82; Milleret al.(2011)Nature Biotech.29:: 143-8; Hockemeyeret al.,(2011)Nature Biotech.29: 731-734; Woodet al.,(2011)Science333: 307; Doyonet al.,(2010)Nature Methods8: 74-79; Szczepeket al.,(2007)Nature Biotech.25: 786-793; y Guoet al.(2010)J. Mol. Biol.200: 96.
El dominio Fokl actúa como un dímero, lo que requiere dos construcciones con dominios de unión a ADN únicos para sitios en el genoma diana con orientación y espaciado adecuados. Tanto el número de restos de aminoácidos entre el dominio de unión a ADN de TALE y el dominio de escisión de Fokl como el número de bases entre los dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para conseguir niveles altos de actividad. Milleret al.,(2011)Nature Biotech.29: 143-8.
Puede usarse una TALEN para HLA o TCR dentro de una célula para proporcionar una rotura bicatenaria (DSB). Se puede introducir una mutación en el sitio de rotura si los mecanismos de reparación reparan de manera incorrecta la rotura mediante unión de extremos no homólogos. Por ejemplo, la reparación incorrecta puede introducir una mutación de desplazamiento del marco de lectura. Como alternativa, puede introducirse ADN extraño en la célula junto con TALEN, por ejemplo, ADN que codifica un transgén, y dependiendo de las secuencias del ADN extraño y la secuencia cromosómica, este proceso puede usarse para integrar el transgén en el sitio diana o cerca de él por la TALEN. Pueden construirse TALEN específicas para un gen diana usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo diversos esquemas que usan componentes modulares. Zhanget al.,(2011)Nature Biotech.29: 149-53; Geibleretal. (2011)PLoS O NE6: e19509; documento US 8.420.782; documento US 8.470.973.
Sistemas de edición génica de nucleasa de dedos de cinc (ZFN)
"ZFN" o "Nucleasa de dedos de cinc" se refieren a una nucleasa de dedos de cinc, una nucleasa artificial que puede usarse para modificar, por ejemplo, suprimir uno o más ácidos nucleicos de una secuencia de ácido nucleico deseada.
Al igual que una TALEN, un ZFN comprende un dominio de nucleasa Fokl (o un derivado del mismo) fusionado con un dominio de unión a ADN. En el caso de una ZFN, el dominio de unión a ADN comprende uno o más dedos de cinc. Carrollet al.,(2011)Genetics Society of America188: 773-782; y Kimet al.,(1996)Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 93: 1156-1160.
Un dedo de cinc es un pequeño motivo estructural proteico estabilizado por uno o más iones de cinc. Un dedo de cinc puede comprender, por ejemplo, Cys2His2, y puede reconocer una secuencia de aproximadamente 3 pb. Pueden combinarse diversos dedos de cinc de especificidad conocida para proporcionar polipéptidos con múltiples dedos que reconocen secuencias de aproximadamente 6, 9, 12, 15 o 18 pb. Se puede disponer de diversas técnicas de selección y ensamblaje modular para generar dedos de cinc (y combinaciones de los mismos) que reconocen secuencias específicas, incluyendo la presentación en fagos, sistemas de un único híbrido en levaduras, sistemas de un único híbrido y de doble híbrido bacterianos y células de mamífero.
Como una TALEN, una ZFN debe dimerizar para escindir ADN. Por lo tanto, se necesita un par de ZFN para dirigirse a sitios de ADN no palindrómicos. Las dos ZFN individuales deben unirse a cadenas opuestas del ADN con sus nucleasas debidamente separadas. Bitinaiteet al.,(1998)Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 95: 10570-5.
También al igual que una TALEN, una ZFN puede crear una rotura bicatenaria en el ADN, que puede crear una mutación de desplazamiento del marco de lectura si se repara de forma incorrecta, lo que conlleva un descenso de la expresión y cantidad de HLA y/o TCR en una célula. También pueden usarse ZFN con recombinación homóloga para mutar el gen o locus diana, o para introducir un ácido nucleico que codifica un transgén deseado en un sitio en o cerca de la secuencia diana.
Pueden construirse ZFN específicas de secuencias en un gen diana usando cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Provasi (2011)Nature Med.18: 807-815; Torikai (2013)Blood122: 1341-1349; Cathomenet al.(2008)Mol. Ther.16: 1200-7; y Guoet al.(2010)J. Mol. Biol.400: 96; publicación de patente de los EE. UU. 2011/0158957; y publicación de patente de los EE. UU. 2012/0060230.
En algunas realizaciones, el sistema de edición génica de ZFN también puede comprender ácido nucleico que codifica uno o más componentes del sistema de edición génica de ZFN.
Sistema de edición génica de meganucleasa
"Meganucleasa" se refiere a una meganucleasa, una nucleasa artificial que puede usarse para editar un gen diana.
Las meganucleasas derivan de un grupo de nucleasas que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases. Las meganucleasas se agrupan en familias basándose en sus motivos estructurales que afectan a la actividad nucleasa y/o al reconocimiento de ADN. Los miembros de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 23) se caracterizan por tener una o dos copias del motivo LAGLIDADG conservado (SEQ ID NO: 23) (véase Chevalieret al.(2001),Nucleic Acids Res.29(18): 3757-3774). Las meganucleasas LAGLIDADG (SEQ ID NO: 23) con una única copia del motivo LAGLlDADG (Se Q iD NO: 23) forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLlDADG (SEQ ID NO: 23) se encuentran como monómeros. Los miembros de la familia GIY-YIG tienen un módulo GIY-YIG, que tiene 70-100 restos de largo e incluye cuatro o cinco motivos de secuencia conservados con cuatro residuos invariantes, dos de los cuales son necesarios para la actividad (véase Van Roeyet al.(2002),Nature Struct. Biol.9: 806-811). Las meganucleasas de caja His-Cys se caracterizan por una serie altamente conservada de histidinas y cisteínas en una región que abarca varios cientos de restos de aminoácidos (véase Chevalieret al.(2001),Nucleic Acids Res.29(18): 3757-3774). En la familia NHN, los miembros se definen por motivos que contienen dos pares de histidinas conservadas rodeadas por restos de asparagina (véase Chevalieret al.(2001),Nucleic Acids Res.29(18): 3757-3774).
En la técnica se conocen estrategias para diseñar una meganucleasa con especificidad de unión a ADN alterada, por ejemplo, para unirse a una secuencia de ácido nucleico predeterminada. Por ejemplo, Chevalieret al.(2002),Mol. Cell.,10:895-905; Epinatet al.(2003)Nucleic Acids Res31: 2952-62; Silvaet al.(2006)J Mol Biol361: 744-54; Seligmanet al.(2002)Nucleic Acids Res30: 3870-9; Sussmanet al.(2004)J Mol Biol342: 31-41; Rosenet al.(2006)Nucleic Acids Res;Doyonet al.(2006)J. Am Chem Soc128: 2477-84; Chenet al.(2009)Protein Eng Des Sel22: 249-56; Arnould S (2006)J Mol Biol.355: 443-58; Smith (2006)Nucleic Acids Res.363(2): 283-94.
Una meganucleasa puede crear una rotura bicatenaria en el ADN, lo que puede crear una mutación de desplazamiento de marco si se repara incorrectamente, por ejemplo, mediante una unión de extremos no homólogos, conduciendo a una disminución en la expresión de un gen diana en una célula. Como alternativa, puede introducirse ADN extraño en la célula junto con la meganucleasa; dependiendo de las secuencias del ADN extraño y la secuencia cromosómica, este proceso puede usarse para modificar un gen diana, por ejemplo, corregir un defecto en el gen diana, provocando de este modo la expresión de un gen diana reparado, o por ejemplo, introducir dicho defecto en un gen wt (tipo silvestre, por sus sigñas en inglés), disminuyendo de este modo la expresión de un gen diana, por ejemplo, como se describe en Silvaet al.(2011)Current Gene Therapy11:11-27.
Adm inistración ocular de la población celular expandida
En un aspecto, la población celular expandida obtenible mediante los métodos divulgados en el presente documento como se describió anteriormente se suministra al ojo. El suministro se realiza en condiciones asépticas.
En una opción relacionada con el uso para la terapia con células madre del limbo después de una peritomía del limbo de 360°, el pannus corneal fibrovascular puede retirarse cuidadosamente de la superficie.
En un aspecto, la población celular se combina con un agente localizador adecuado para el suministro ocular (como se describe adicionalmente a continuación) y se suministra al ojo. En una opción preferida, las células y el agente localizador adecuado para el suministro ocular se combinan y administran al ojo a través de un portador tal como, por ejemplo, una lente de contacto o una membrana amniótica terapéuticas. En una opción alternativa, las células y el agente localizador adecuado para su uso en el ojo, tal como una biomatriz fotocurable, como GelMA, se suministran al ojo mediante bioimpresión.
En una opción, se divulga un método de trasplante de una población de células que comprenden células endoteliales corneales en la córnea de un sujeto, comprendiendo el método expandir una población de células que comprenden células endoteliales corneales cultivando dicha población con medio de proliferación celular que comprende un inhibidor de LATS de acuerdo con la invención, aclarar la población expandida de células para retirar sustancialmente el inhibidor de LATS y administrar dichas células en la córnea de dicho sujeto. Preferentemente, dichas células se combinan con una biomatriz antes de dicha administración. En una opción específica, dichas células se combinan con una biomatriz que es GelMA antes de dicha administración. En una opción más específica, dichas células endoteliales corneales se combinan con una biomatriz que está bioimpresa sobre la superficie ocular. En particular preferentemente, dichas células endoteliales corneales se combinan con una biomatriz que es GelMA y se bioimprimen sobre la superficie ocular polimerizando el GelMA mediante una reacción desencadenada por luz.
En otra opción, se divulga un método de trasplante de una población de células al ojo de un sujeto, que comprende combinar las células con una biomatriz para formar una mezcla de células/biomatriz, inyectar la mezcla en el ojo del sujeto o aplicar la mezcla sobre la superficie del ojo del sujeto, y bioimprimir las células en o sobre el ojo guiando y fijando las células, tal como sobre la córnea, usando una fuente de luz, tal como una fuente de luz ultravioleta A o blanca. En determinadas opciones, la fuente de luz produce luz con una longitud de onda de al menos 350 nm. En determinadas opciones, la fuente de luz produce luz en el intervalo de 350 nm a 420 nm. Por ejemplo, puede usarse una fuente de luz LED para proporcionar una luz que tenga una longitud de onda de 365 nm o 405 nm, o cualquier otra longitud de onda superior a 350 nm, o puede usarse una lámpara de mercurio con un filtro de paso de banda para proporcionar una luz que tenga una longitud de onda de 365 nm. En otra opción, la fuente de luz produce luz blanca visible que tiene una longitud de onda, por ejemplo, en el intervalo de 400 nm a 700 nm. En determinadas opciones, las células son células oculares, tales como células corneales (por ejemplo, células endoteliales corneales), células del cristalino, células de lamalla trabecular o células que se encuentran en la cámara anterior. En una opción particular, las células son células endoteliales corneales. Determinadas opciones de dicho método incluyen:
Un método de trasplante de una población de células aisladas al ojo de un sujeto, que comprende combinar las células con una biomatriz para formar una mezcla de células/biomatriz, inyectar la mezcla en el ojo del sujeto (por ejemplo, en la cámara anterior) y bioimprimir las células en el ojo guiando y fijando las células en el ojo usando una fuente de luz. Opcionalmente en dicho método:
(a) las células aisladas se combinan con una biomatriz que es GelMA y se bioimprimen sobre la córnea polimerizando GelMA mediante una reacción desencadenada por luz;
(b) la fuente de luz produce una luz que tiene una longitud de onda en el intervalo de 350 nm a 700 nm;
(c) la longitud de onda es de 350 nm a 420 nm;
(d) la longitud de onda es de 365 nm, y/o
(e) las células aisladas son células endoteliales corneales.
Un método de trasplante de una población de células aisladas al ojo de un sujeto, que comprende combinar las células con una biomatriz para formar una mezcla de células/biomatriz, aplicar la mezcla en el ojo del sujeto y bioimprimir las células sobre el ojo guiando y fijando las células en el ojo usando una fuente de luz.
Opcionalmente en dicho método:
(a) las células aisladas se combinan con una biomatriz que es GelMA y se bioimprimen sobre la superficie ocular polimerizando GelMA mediante una reacción desencadenada por luz;
(b) la fuente de luz produce una luz que tiene una longitud de onda en el intervalo de 350 nm a 700 nm;
(c) la longitud de onda es de 350 nm a 420 nm;
(d) la longitud de onda es de 365 nm; y/o
(e) las células aisladas son células madre del limbo.
En una opción alternativa, la población celular expandida obtenible mediante los métodos
como se describieron anteriormente puede administrarse directamente al ojo a través de una lente de contacto terapéutica, sin el uso de un agente localizador adecuado para el suministro ocular (tal como GeIMA).
Agente localizador adecuado para el sum inistro ocular
La preparación celular puede suministrarse al ojo mediante un agente localizador adecuado para su uso ocular. Las células pueden estar incluidas dentro del agente localizador o adheridas a la superficie del agente localizador, o ambas cosas. El tipo de agente localizador no se limita siempre que sea capaz de transportar LSC o CEC y sea adecuado para su uso en el ojo. En una opción preferida, el agente localizador es degradable y biocompatible. Cuando se administran CEC, preferentemente el agente localizador puede facilitar la unión de CEC a la córnea después del suministro quirúrgico a la superficie del ojo.
En una opción preferida, las células sólo se combinan con el agente localizador después de la expansión de poblaciones celulares. En una opción particularmente preferida, la población celular expandida se combina con el agente localizador adecuado para el suministro ocular después de aclarar la población celular para retirar sustancialmente la presencia del inhibidor de LAT de acuerdo con la invención. En una opción, las LSC o CEC y el agente localizador se combinan y almacenan en una forma adecuada para su uso ocular. En otra opción, las LSC o CEC y el agente localizador se almacenan por separado y se combinan inmediatamente antes del uso ocular.
El agente localizador se selecciona preferentemente de la lista que consiste en fibrina, colágeno, gelatina, celulosa, membrana amniótica, pegamento de fibrina, diacrilato de polietileno (glicol) (PEGDA), GeIMA (que es gelatina modificada con metacrilamida y también se conoce como metacrilato de gelatina), agentes localizadores que comprenden un polímero, polímero reticulado, o hidrogel que comprende uno o más de ácido hialurónico, polietilenglicol, polipropilenglicol, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, poloxámero, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, polivinilpirrolidona, poli(lactida-co-glicolida), alginato, gelatina, colágeno, fibrinógeno, celulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropil-guar, goma gellan, goma guar, goma xantana y carboximetilcelulosa, así como derivados de los mismos, copolímeros de los mismos y combinaciones de los mismos.
En una opción más preferida, el agente localizador se selecciona de la lista que consiste en fibrina, colágeno, gelatina, membrana amniótica, pegamento de fibrina, diacrilato de polietileno (glicol) (PEGDA), GeIMA, agentes localizadores que comprenden un polímero, polímero reticulado o hidrogel que comprende uno o más de ácido hialurónico, polietilenglicol, polipropilenglicol, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, poloxámero, ácido poliacrílico, poli(lactida-co-glicolida), alginato, gelatina, colágeno, fibrinógeno, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropil-guar, así como derivados de los mismos, copolímeros de los mismos y combinaciones de los mismos.
En una opción preferida, la población celular expandida puede suministrarse a un receptor a través de un agente localizador que es una biomatriz. En una opción más preferida, el agente localizador es una biomatriz degradable y fotocurable. Preferentemente, ésta puede inyectarse en el ojo. Un ejemplo específico de biomatriz es GeIMA, que es gelatina modificada con metacrilamida y también se conoce como metacrilato de gelatina.
Puede prepararse GelMA de acuerdo con protocolos convencionales conocidos en la técnica (Van Den Bulckeet al., Biomacromolecules,2000, págs. 31-38; Yueet al., Biomaterials,2015, págs. 254-271). Por ejemplo, se disuelve gelatina de piel de cerdo (fuerza de gel 300 g Bloom, tipo A) en PBS sin calcio ni magnesio (Dulbeccos PBS) y puede añadirse anhídrido metacrílico con agitación fuerte a la solución de gelatina para alcanzar la concentración deseada (por ejemplo 8 % (vol/vol). La mezcla puede agitarse antes y después de añadir DPBS adicional. La mezcla diluida puede purificarse mediante diálisis frente a agua Milli-Q usando tubos de diálisis para retirar el ácido metacrílico. Opcionalmente, las muestras purificadas pueden liofilizarse y el sólido puede almacenarse a -80 °C, -20 °C o 4 °C hasta su uso posterior.
Se prepara una solución madre de GelMA disolviendo GelMA liofilizada en una formulación adecuada para su uso ocular que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables. Para preparar una solución madre de GelMA, puede disolverse GelMA liofilizada en DPBS. Una vez que la GelMA se haya disuelto por completo, puede introducirse un fotoiniciador (por ejemplo, tal como fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio) en la solución de GelMA. Para ajustar el pH a neutro, puede añadirse NaOH a la solución antes de filtrar usando membranas estériles de 0,22 micrómetros. El filtrado final puede separarse en alícuotas y almacenarse a 4 °C hasta su uso posterior.
En un aspecto, las células se encapsulan dentro de la biomatriz usando un fotoiniciador para polimerizar la biomatriz, que es preferentemente GelMa. Son agentes fotoiniciadores adecuados Irgacure 2959, fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio, fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de sodio, bis(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfinato de litio, bis(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfinato de sodio, óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina, eosina Y, fosfato de riboflavina, alcanforquinona, Quantacure BPQ, Irgacure 819, Irgacure 1850 y Darocure 1173. En una opción preferida, el fotoiniciador es fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio, fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de sodio y fosfato de riboflavina. En otra opción, el fotoiniciador es fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio.
Antes de la polimerización, la biomatriz fotocurable se combina con un fotoiniciador adecuado en una formulación adecuada para su uso ocular que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables en recipientes adecuados conocidos en la técnica, tales como viales. El fotoiniciador puede combinarse con la biomatriz antes de mezclarlo con las células; como alternativa, el fotoiniciador puede combinarse con la biomatriz después de mezclarlo con las células; como alternativa, el fotoiniciador puede añadirse primero a las células y después combinarse con la biomatriz. La concentración de la biomatriz y el fotoiniciador depende de la biomatriz específica y del fotoiniciador específico utilizados, pero se elige para proporcionar polimerización dentro de una duración conveniente de exposición a la luz, normalmente menos de aproximadamente 5 minutos; preferentemente menos de aproximadamente 2 minutos; más preferentemente menos de aproximadamente un minuto. En una opción, el fotoiniciador es fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio y su concentración en la formulación para el suministro de células al ojo es de aproximadamente el 0,01 % p/v a aproximadamente el 0,15% p/v. En otro aspecto, la concentración de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio en la formulación para el suministro de células al ojo es de aproximadamente el 0,05 % p/v o aproximadamente el 0,075 % p/v. Puede sintetizarse LAP usando un procedimiento publicado(Biomaterials2009, 30, 6702-6707) y también está disponible en TCI (N.° de Prod. L0290) y Biobots (BioKey).
Las células pueden añadirse a la GelMA en recipientes adecuados conocidos en la técnica, tales como viales o tubos. Las células pueden añadirse, por ejemplo, pipeteando en GelMA y mezclando mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. En una opción, la concentración de GelMA en la composición adecuada para el suministro ocular es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg/ml, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 150mg/ml, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mg/ml. En una opción preferida, la concentración de GelMA en la composición adecuada para el suministro ocular es de aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml o aproximadamente 75 mg/ml.
Para polimerizar la biomatriz fotocurable, la biomatriz, el fotoiniciador y las células se exponen a una fuente de luz durante un período de tiempo preferido, como se describió anteriormente. La longitud de onda de la luz utilizada para la polimerización dependerá de las propiedades fotoquímicas del fotoiniciador específico utilizado. Por ejemplo, el fotoinicio de la polimerización de Irgacure 2959 se producirá con luz de longitud de onda entre 300 y 370 nm; el fotoinicio de la polimerización del fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio se producirá con luz de longitud de onda entre 300 y 420 nm; el fotoinicio de la polimerización de la riboflavina-5'-fosfato se producirá con luz de longitud de onda entre 300 y 500 nm. La fuente de luz utilizada puede emitir un intervalo de longitudes de onda, como el que se consigue con las lámparas incandescentes, las lámparas de descarga de gas o las lámparas de vapor metálico; como alternativa, la fuente de luz utilizada puede emitir un intervalo estrecho de longitudes de onda, como el que se consigue con filtros ópticos o con un diodo emisor de luz (LED). Preferentemente, la fuente de luz utilizada no emite luz con una longitud de onda inferior a 315 nm para evitar los efectos dañinos de la irradiación UV en las células. En una opción, la fuente de luz es una fuente de luz blanca con un intervalo espectral de 415-700 nm. En otra opción, la fuente de luz es una fuente de luz LED con un intervalo espectral de aproximadamente 365 ± 5 nm, aproximadamente 375 ± 5 nm, aproximadamente 385 ± 5 nm, aproximadamente 395 ± 5 nm, aproximadamente 405 ± 5 nm, aproximadamente 415 ± 5 nm, aproximadamente 425 ± 5 nm, aproximadamente 435 ± 5 nm, aproximadamente 445 ± 5 nm, aproximadamente 455 ± 5 nm o aproximadamente 465 ± 5 nm. La intensidad de la luz se elige para minimizar la fototoxicidad y proporcionar polimerización dentro de una duración conveniente de exposición a la luz, normalmente inferior a aproximadamente 5 minutos; preferentemente inferior a aproximadamente 2 minutos; más preferentemente inferior a aproximadamente un minuto. Un indicio de polimerización es un aumento en la viscosidad de la solución. Otro indicio de polimerización es el inicio de la gelificación.
La polimerización de la biomatriz puede producirse en la superficie ocular a través de técnicas de bioimpresión o, como alternativa, sobre un portador que después se trasplanta a la superficie ocular. Opcionalmente, la polimerización de la biomatriz puede producirse en la superficie de la córnea en la cámara anterior o, como alternativa, sobre un portador que después se trasplanta a la superficie de la córnea en la cámara anterior.
Portador
Las células y el agente de localización adecuados para el suministro ocular se suministran preferentemente a través de un portador tal como una lente de contacto o una membrana amniótica.
Las lentes de contacto adecuadas para su uso como se divulga en el presente documento son preferentemente aquellas que se ajustan a la curvatura corneal del paciente y pueden ser bien toleradas por el paciente en la práctica clínica para su uso continuo como lentes de contacto de tipo vendaje durante varios días.
Los ejemplos de tipos adecuados de lentes de contacto son coherentes con lo que se ha validado ampliamente en el uso clínico para el uso de lentes de contacto de tipio vendaje a largo plazo con queratoprótesis Boston de tipo 1 (que también puede usarse en pacientes con deficiencia de células madre del limbo) y se describe en: Thomas, Merina M.D.; Shorter, Ellen O.D.; Joslin, Charlotte E. O.D., Ph.D.; McMahon, Timothy J. O.D.; Cortina, M. Soledad M.D.Contact Lens Use in Patients With Boston Keratoprosthesis Type 1: Fitting, Management, and Complications. Eye Contact Lens.Noviembre de 2015; 41(6):334-40.
Una lente de contacto puede ser de cualquier material adecuado conocido en la técnica o desarrollado posteriormente, y puede ser una lente blanda, una lente dura o una lente híbrida, preferentemente una lente blanda, más preferentemente una lente de contacto de hidrogel convencional o una lente de contacto de hidrogel de silicona (SiHy).
Una "lente de contacto de hidrogel convencional" se refiere a una lente de contacto que comprende un material de masa de hidrogel (núcleo) que es un material polimérico reticulado, insoluble en agua, está teóricamente exento de silicona y puede contener al menos el 10 % en peso de agua dentro de su matriz polimérica cuando está totalmente hidratado. Una lente de contacto de hidrogel convencional normalmente se obtiene mediante copolimerización de una formulación de lente de hidrogel convencional (es decir, una composición polimerizable) que comprende componentes polimerizables hidrófilos, exentos de silicona, conocidos por un experto en la técnica.
Los ejemplos de formulación de lentes de hidrogel convencionales para fabricar lentes de contacto de hidrogel comerciales incluyen, sin limitación, alfafilcon A, acofilcon A, deltafilcon A, etafilcon A, focofilcon A, helfilcon A, helfilcon B, hilafilcon B, hioxifilcon A, hioxifilcon B, hioxifilcon D, metafilcon A, metafilcon B, nelfilcon A, nesofilcon A, ocufilcon A, ocufilcon B, ocufilcon C, ocufilcon D, omafilcon A, phemfilcon A, polimacon, samfilcon A, telfilcon A, tetrafilcon A y vifilcon A.
Una "lente de contacto de SiHy" se refiere a una lente de contacto que comprende un material de masa de hidrogel de silicona (núcleo) que es un material polimérico reticulado, insoluble en agua, que contiene silicona y puede contener al menos el 10 % en peso de agua dentro de su matriz polimérica cuando está totalmente hidratado. Una lente de contacto de hidrogel de silicona normalmente se obtiene mediante copolimerización de una formulación de lente de hidrogel de silicona que comprende al menos un componente polimerizable que contiene silicona y componentes polimerizables hidrófilos conocidos por un experto en la técnica.
Los ejemplos de formulación de lentes de SiHy para fabricar lentes de contacto de SiHy comerciales incluyen, sin limitación, asmofilcon A, balafilcon A, comfilcon A, delefilcon A, efrofilcon A, enfilcon A, fanfilcon A, galyfilcon A, lotrafilcon A, lotrafilcon B, narafilcon A, narafilcon. B, senofilcon A, senofilcon B, senofilcon C, smafilcon A, somofilcon A y stenfilcon A.
En una opción preferida, el portador es una lente de contacto seleccionada del grupo que consiste en Balafilcon A, Lotrafilcon A, Lotrafilcon B, Senofilcon A y metafilcon A.
En una opción especialmente preferida, el portador es una lente de contacto, que es Lotrafilcon B.
El portador puede mantenerse en su lugar en la superficie ocular usando pegamento de fibrina o suturas para evitar que los movimientos oculares desalojen la construcción.
El portador combinado con la biomatriz y las células se puede dejar en el ojo durante un intervalo de tiempo con el fin de suministrar las células, por ejemplo, desde unos pocos días hasta una semana, preferentemente una semana.
Otros métodos de sum inistro:
En una opción alternativa, las LSC pueden suministrarse en forma de una suspensión celular a la superficie ocular (sin un agente de localización tal como una biomatriz y con/o sin un portador tla como una lente de contacto). En la formulación pueden incluirse compuestos y excipientes conocidos en la técnica para mejorar la adhesión al tejido, tales como agentes mucoadhesivos, potenciadores de la viscosidad o gelificantes térmicos inversos.
Etapa de bioimpresión
La población de células oculares, por ejemplo, células endoteliales corneales, que pueden obtenerse de acuerdo con el método de expansión de poblaciones celulares descrito en el presente documento, puede injertarse en el ojo de un sujeto, por ejemplo, en la córnea de un sujeto.
La población celular como se divulga en el presente documento puede suministrarse a través de un agente localizador adecuado para su uso ocular que es una biomatriz degradable y fotocurable, tal como GeIMA. Los siguientes métodos describen procedimientos para controlar el suministro a la pared interna de la córnea.
Método 1. Método de depresión de burbuja (se muestra en la Figura 22)
Las células endoteliales disfuncionales pueden desprenderse primero de la pared interna de la córnea pelándolas/raspándolas o de manera controlada usando fotodisrupción con un láser de femtosegundos. Después se inyecta un pequeño bolo de la biomatriz cargada de células cerca de la superficie interior de la córnea. Esto puede hacerse manualmente usando una jeringa convencional o un aplicador personalizado. También puede controlarse mediante un sistema quirúrgico (por ejemplo, constellation) o bombas de jeringa. Después se inyecta una burbuja de gas debajo del bolo. La burbuja de gas aprieta el bolo contra la córnea posterior, creando una capa delgada. Después, todo el gel se cura usando una fuente de luz UV o casi UV, o cualquier otra banda espectral necesaria para curar la biomatriz. Como alternativa, puede dejarse el tejido disfuncional y curar la biomatriz encima. La fuente de luz puede enfocarse en diferentes tamaños usando otros métodos de enfoque óptico para controlar el área de curado. El área restante sin curar puede lavarse abundantemente usando una cánula de irrigación/aspiración.
Método 2. Método sustractivo usando láser de femtosegundos (se muestra en la Figura 23)
Las células endoteliales disfuncionales pueden desprenderse primero de la pared interna de la córnea pelándolas/raspándolas o de manera controlada usando fotodisrupción con un láser de femtosegundos. Como alternativa, pueden dejarse en su lugar. Después, la biomatriz cargada de células se inyecta en la superficie interior de la córnea que cubre el hueco donde se extrajo el tejido o sobre el tejido disfuncional. Esto puede hacerse manualmente usando una jeringa convencional o un aplicador personalizado. También puede controlarse mediante un sistema quirúrgico (por ejemplo, constellation) o bombas de jeringa. Después, la biomatriz se cura usando una fuente de luz UV o casi UV, o cualquier otra banda espectral necesaria para curar la biomatriz. Después se usa el láser de femtosegundos para separar el exceso de material, controlando el grosor y el área hasta la distribución deseada. Después se retira el exceso de material con unas pinzas a través de una incisión corneal.
Método 3. Máscara de tinción y control de grosor basado en la absorción (se muestra en la Figura 24)
En primer lugar, se usa un colorante biocompatible (azul de tripano, azul brillante, etc.) para teñir la superficie interna de la córnea. Después, las células endoteliales disfuncionales se desprenden de la pared interna de la córnea mediante pelado/raspado. Después, la biomatriz cargada de células que contiene el tinte biocompatible se inyecta en la superficie interior de la córnea que cubre el hueco de donde se extrajo el tejido. Después, la biomatriz se cura usando una fuente de luz UV o casi UV, o cualquier otra banda espectral necesaria para curar la biomatriz. La tinción en el tejido corneal aumenta la absorción de luz actuando como una máscara para controlar el área de la biomatriz curada. De manera similar, el tinte en la biomatriz aumenta la absorción de luz controlando de este modo la profundidad/grosor del material curado. Después, el material de gel no curado se lava abundantemente de la cámara anterior usando una cánula de irrigación/aspiración.
Método 4. Aplicación en cámara anterior seca (se muestra en la Figura 25)
Las células endoteliales disfuncionales pueden desprenderse primero de la pared interna de la córnea pelándolas/raspándolas o de manera controlada usando fotodisrupción con un láser de femtosegundos. Como alternativa, puede dejarse en su lugar. Desués, se drena el líquido acuoso de la cámara anterior del segmento anterior y se reemplaza por gas (por ejemplo, aire). Después, la biomatriz cargada de células se aplica a la superficie interior de la córnea en pequeñas gotitas controladas (lo que permite que la tensión superficial disperse las gotas) o se pinta con un pincel o una cánula de punta suave. Puede aplicarse ácido hialurónico a la biomatriz para alterar sus propiedades viscosas y permitir un mejor control sobre la dispensación/aplicación. Después, toda la biomatriz se cura usando una fuente de luz UV o casi UV, o cualquier otra banda espectral necesaria para curar la biomatriz. Por último, la cámara anterior se vuelve a llenar con una solución salina equilibrada.
Método 5. Formulación que flota de forma natural
Las células endoteliales disfuncionales pueden desprenderse primero de la pared interna de la córnea pelándolas/raspándolas o de manera controlada usando fotodisrupción con un láser de femtosegundos. Después se inyecta un pequeño bolo de la biomatriz cargada de células cerca de la superficie interior de la córnea. La biomatriz se formula para flotar de forma natural con respecto al humor acuoso o se airea para conseguir el mismo efecto. Esto provoca que la biomatriz se eleve de forma natural hasta la córnea posterior, creando una capa delgada. Después, toda la biomatriz se cura usando una fuente de luz UV o casi UV, o cualquier otra banda espectral necesaria para curar la biomatriz. Como alternativa, puede dejarse el tejido disfuncional y curar la biomatriz encima. La fuente de luz ultravioleta puede enfocarse en diferentes tamaños usando métodos de enfoque óptico para controlar el área de curado. El área restante sin curar puede lavarse abundantemente usando una cánula de aspiración.
Otros métodos de sum inistro
En una opción alternativa, puede suministrarse una población celular expandida, tal como CEC como se describe en el presente documento, en forma de una suspensión celular (sin un agente localizador tal como una biomatriz degradable y fotocurable) y puede dejarse que se adhiera por gravedad haciendo que el paciente mire hacia abajo durante 3 horas. En la formulación pueden incluirse compuestos y excipientes conocidos en la técnica para mejorar la adhesión al tejido, tales como agentes adhesivos, potenciadores de la viscosidad o gelificantes térmicos inversos.
En otra opción alternativa más, también puede suministrarse una población celular expandida, tal como CEC como se describe en el presente documento, mediante el uso de perlas magnéticas. Se prepara una suspensión de CEC/perlas en un medio adecuado para el suministro ocular y después se inyecta en el ojo. La unión de las células se promueve mediante un imán aplicado al ojo.(Magnetic fieldguided cell delivery with nanoparticle-loaded human corneal endothelial cells.Moysidis SN, Alvarez-Delfin K, Peschansky VJ, Salero E, Weisman AD, Bartakova A, Raffa GA, Merkhofer RM Jr, Kador KE, Kunzevitzky NJ, Goldberg JL.Nanomedicine.Abril de 2015; 11(3):499-509. doi: 10.1016/j.nano.2014.12.002.)
Otros métodos de uso de los inhibidores de LATS de acuerdo con la invención
En un aspecto, es posible añadir directamente los inhibidores de LATS de acuerdo con la invención directamente a la superficie del ojo para conseguir la expansión de poblaciones celulares. Por ejemplo, esto puede hacerse si la pérdida de células no fue total y queda una población de siembra de células restante para expandir. Por ejemplo, si quedan células madre del limbo en el ojo del paciente o si quedan células endoteliales corneales en la córnea del paciente, según sea el caso. Por ejemplo, esto puede conseguirse preparando los compuestos como se divulga en el presente documento en una formulación adecuada para su uso ocular que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables y aplicándolos al ojo mediante colirios. Como alternativa, los compuestos divulgados en el presente documento en una formulación adecuada para su uso ocular que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables pueden aplicarse por vía intraocular, por ejemplo, por vía intracameral.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables potencian o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición. Algunos excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles.
El inhibidor de LATS de acuerdo con la invención puede combinarse con conservantes, codisolventes, tensioactivos, potenciadores de la viscosidad, potenciadores de la penetración, tampones, cloruro de sodio o agua oftalmológicamente aceptables para formar una suspensión o solución oftálmica acuosa. Los productos oftálmicos tópicos pueden acondicionarse, por ejemplo, en forma de múltiples dosis. Por lo tanto, pueden ser necesarios conservantes para evitar la contaminación microbiana durante su uso. Los conservantes adecuados incluyen: clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico, policuaternio-1 u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. Dichos conservantes se emplean normalmente a un nivel del 0,001 al 1,0 % p/v.
Los inhibidores de LATS de acuerdo con la invención podrían usarse para conservar células, por ejemplo, células epiteliales corneales y del limbo hasta el trasplante. Después de la disección post mortem realizada por especialistas del banco de ojos, las córneas se conservan en medios tales como Optisol o PBS hasta el trasplante. En una opción específica, puede añadirse un inhibidor de LATS a una solución generalmente utilizada para trasplante de córnea, tal como Optisol o PBS. Preferentemente, la concentración del inhibidor de LATS en la solución de conservación es de 0,5 a 100 micromolar, más preferentemente de 0,5 a 25 micromolar, en particular preferentemente de 1 a 20 micromolar. En una opción específica, los inhibidores de LATS de acuerdo con la Fórmula I se añaden a una concentración de aproximadamente 3 a 10 micromolar.
Agentes inmunosupresores, antiinflamatorios y antibióticos
Además de, o como alternativa a, el uso de una técnica de edición génica realizadain vitroen una población celular, como se describe para las células madre del limbo o las células endoteliales corneales, para mitigar el riesgo de rechazo inmunitario de las células trasplantadas al paciente, la población celular divulgada en el presente documento puede administrarse simultánea o secuencialmente con un agente o agentes inmunosupresores y/o antiinflamatorios. Pueden usarse agentes convencionales para inmunosupresión o agentes o agentes antiinflamatorios que incluyen, pero sin limitación, dexametasona o ciclosporina.
También pueden administrarse antibióticos al paciente junto con una población celular expandida (por ejemplo, células madre del limbo o células endoteliales corneales como se describe en el presente documento), tales como los antibióticos cefazolina y tobramicina.
Cuando la población celular divulgada en el presente documento se administra junto con otro agente o agentes, la población celular y el agente o agentes pueden administrarse secuencialmente en cualquier orden o simultáneamente. En algunas opciones, una población celular expandida divulgada en el presente documento
se administra junto con tratamientos quirúrgicos. En otras realizaciones, la población de células madre del limbo divulgada en el presente documento se administra junto con tratamientos quirúrgicos. En otras opciones, la población de células endoteliales corneales divulgada en el presente documento
se administra junto con tratamientos quirúrgicos.
Usos terapéuticos
La población de células oculares divulgada en el presente documento puede usarse en un método de tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células que comprende células oculares.
La población de células madre del limbo divulgada en el presente documento puede usarse en un método de tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células que comprende células madre del limbo. Preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular se asocia a una deficiencia de células madre del limbo.
La deficiencia de células madre del limbo puede surgir como resultado de varias afecciones diversas que incluyen, pero sin limitación:
• daño directo de las células madre por quemaduras químicas o térmicas o lesión por radiación;
• afecciones congénitas tales como aniridia, esclerocórnea, neoplasia endocrina múltiple;
• trastornos autoinmunitarios tales como síndrome de Stevens Johnson o penfigoide cicatricial ocular o enfermedades vasculares del colágeno;
• trastornos inflamatorios crónicos no autoinmunitarios tales como uso de lentes de contacto, enfermedad del ojo seco, rosácea, estafilococo marginal, queratitis (bacteriana, fúngica y vírica), pterigión o neoplasia;
• iatrogénica, tal como después de múltiples cirugías oculares, escisión de pterigión o neoplasia, crioterapia;
• como resultado de la toxicidad de medicamentos tales como conservantes (timerosal, benzalconio), anestésicos tópicos, pilocarpina, betabloqueantes, mitomicina, 5-fluorouracilo, nitrato de plata y medicamentos orales que provocan el síndrome de Stevens Johnson.
(Véase:Dry Eye: a practical guide to ocular surface disorders and stem cell surgery. SLACK2006 - Rzany B, Mockenhaupt M, Baur Set al. J. Clin. Epidemiol.49, 769-773 (1996)).
Las causas más comunes de deficiencia de células madre del limbo en la práctica clínica son las quemaduras químicas, la aniridia, el síndrome de Stevens Johnson y el uso de lentes de contacto.
Más preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular es una deficiencia de células madre del limbo que surge debido a una lesión o enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en quemaduras químicas, quemaduras térmicas, lesiones por radiación, aniridia, esclerocórnea, neoplasia endocrina múltiple, síndrome de Stevens Johnson, penfigoide cicatricial ocular, enfermedades vasculares del colágeno; trastornos inflamatorios crónicos no autoinmunitarios que surgen del uso de lentes de contacto, enfermedad del ojo seco, rosácea, estafilococos marginales, queratitis (incluyendo queratitis bacteriana, fúngica y vírica), pterigión o neoplasia, deficiencia de células madre del limbo que surge después de múltiples cirugías oculares o escisión de pterigión o neoplasia o crioterapia; y deficiencia de células madre del limbo que surge como resultado de la toxicidad por medicamentos de un medicamento seleccionado del grupo que consiste en conservantes (timerosal, benzalconio), anestésicos tópicos, pilocarpina, betabloqueantes, mitomicina, 5-fluorouracilo, nitrato de plata y medicamentos orales que provocan el síndrome de Stevens Johnson.
En el presente documento se divulga un método de tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una población de células madre del limbo obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
En una opción más específica, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo que surge debido a una lesión o trastorno seleccionado del grupo que consiste en quemaduras químicas, quemaduras térmicas, lesiones por radiación, aniridia, esclerocórnea, neoplasia endocrina múltiple, síndrome de Stevens Johnson, penfigoide cicatricial ocular, enfermedades vasculares del colágeno, trastornos inflamatorios crónicos no autoinmunitarios derivados del uso de lentes de contacto, enfermedad del ojo seco, rosácea, estafilococo marginal, queratitis (incluyendo queratitis bacteriana, fúngica y vírica), pterigión o neoplasia, deficiencia de células madre del limbo que surge después de múltiples cirugías oculares o escisión de pterigión o neoplasia o crioterapia; y deficiencia de células madre del limbo que surge como resultado de la toxicidad de medicamentos de un medicamento seleccionado del grupo que consiste en conservantes (timerosal, benzalconio), anestésicos tópicos, pilocarpina, betabloqueantes, mitomicina, 5-fluorouracilo, nitrato de plata y medicamentos orales que provocan el síndrome de Stevens Johnson mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células madre del limbo obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
Aún en una opción más específica, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo que surge debido a una lesión, enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en quemaduras químicas, aniridia, síndrome de Stevens Johnson y uso de lentes de contacto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células madre del limbo obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
Cuando un adulto es un receptor (receptor de trasplante), preferentemente pueden administrarse más de 1.000 células que expresan p63alfa a un paciente en los métodos de tratamiento como se divulga en el presente documento.
En una opción preferida, pueden administrarse de 1.000 a 100.000 células que expresan p63alfa a un paciente en los métodos de tratamiento como se divulga en el presente documento.
La población de células endoteliales corneales como se divulga en el presente documento puede usarse en un método de tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una población celular que comprende células endoteliales corneales. Preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular se asocia a una disminución de la densidad de células endoteliales corneales. En una opción preferida, la enfermedad o trastorno ocular es una disfunción endotelial corneal.
Más preferentemente, la enfermedad o trastorno ocular es una disfunción endotelial corneal que se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, queratopatía ampollosa (incluyendo queratopatía ampollosa pseudofáquica y queratopatía ampollosa afáquica), fracaso del trasplante de córnea, distrofia corneal polimorfa posterior, distrofia endotelial hereditaria congénita, distrofia corneal endotelial ligada al cromosoma X, aniridia y endotelitis corneal. En una realización específica, la enfermedad o trastorno ocular se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, queratopatía ampollosa (incluyendo queratopatía ampollosa pseudofáquica y queratopatía ampollosa afáquica) y fracaso del trasplante de córnea.
En una opción específica, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de la disfunción endotelial corneal mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una población de células endoteliales corneales obtenibles mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
En una opción más específica, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de la disfunción endotelial corneal que se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, queratopatía ampollosa (incluyendo queratopatía ampollosa pseudofáquica y queratopatía ampollosa afáquica), fracaso del trasplante de córnea, distrofia corneal polimorfa posterior, distrofia endotelial hereditaria congénita, distrofia corneal endotelial ligada al cromosoma X, aniridia y endotelitis corneal mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una población de células endoteliales corneales obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
En una opción aún más específica, en el presente documento se divulga un método de tratamiento de la disfunción endotelial corneal seleccionado del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, queratopatía ampollosa (incluyendo queratopatía ampollosa pseudofáquica y queratopatía ampollosa afáquica) y fracaso del trasplante de córnea mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una población de células endoteliales corneales obtenible mediante el método de expansión de poblaciones celulares como se divulga en el presente documento.
Cuando un adulto es un receptor (receptor de trasplante), la capa de células endoteliales corneales para su uso en el método de tratamiento de acuerdo con la invención tiene preferentemente una densidad celular final en el ojo de aproximadamente al menos 500 células/mm2 (área), preferentemente de 1.000 a 3.500 células/mm2 (área), más preferentemente de 2.000 a aproximadamente 4.000 células/mm2 (área).
SECCIONES DE EJEMPLOS A-C
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención resultarán fácilmente evidentes para un experto en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende generalmente un especialista familiarizado con el campo al que pertenece la divulgación.
Ejemplo A1: Ensayo bioquímico de LATS1: Ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) (compuestos de los ejemplos 1-290)
El ensayo de HTRF bioquímico de LATS1 se realizó usando el kit HTRF KinEASE-STK S1 (CisBio, número de catálogo 62ST1PEC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína de dominio cinasa LATS1 humana se adquirió en Carnabio (número de catálogo 01-123), que alberga el dominio catalítico de los aminoácidos 589-1130, y se purificó conjuntamente con MOBKL1A humana etiquetada con His (NP_775-739). Los compuestos se añadieron mediante el manipulador de líquidos ECHO (Labcyte) en placas de 384 pocillos. Después se añadieron 5 microlitros de la siguiente solución a los pocillos (HEPES 50 mM, BSA al 0,01 %, ortaovanadato 100 nM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM, enzima LATS1 0,6 ng/microlitro (Carnabio, 01-123), adyuvante de localización STK1 2 micromolar (CisBio)), seguido de 5 microlitros de ATP 2 mM en el tampón de cinasa (HEPES 50 mM, BSA al 0,01 %, ortaovanadato 100 nM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 10 microlitros de mezcla de detección (HEPES 50 mM, BSA al 0,01 %, ortaovanadato 100 nM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM, criptato de anticuerpo STK (CisBio), estreptavidina-XL665 (CisBio), fluoruro de potasio 500 micromolar, EDTA 50 nM) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se leyeron en Pherastar (BMG Labtech) para HTRF (665 nm/620 nm). La CI50 se mide cuando el efecto del compuesto reduce la señal de HTRF en un 50 %. Los valores de CI50 de LATS1 para los compuestos ejemplificados se muestran en la Tabla 1A.
Ejemplo A2: Ensayo bioquímico Caliper de LATS1
La proteína de dominio cinasa LATS1 humana se adquirió en Carnabio (número de catálogo 01-123), que alberga el dominio catalítico de los aminoácidos 589-1130, y se purificó conjuntamente con MOBKL1A humana etiquetada con His (NP_775-739). Se añadieron 5 microlitros de tampón enzimático, 100 nl de compuestos y 5 microlitros de tampón adyuvante de localización en placas de 384 pocillos. La mezcla de reacción de ensayo final contiene HEPES 100 mM, pH 7,5, BSA al 0,1 %, Triton X-100 al 0,01 %, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM, ortovanadato de sodio 10 micromolar, betaglicerofosfato 10 micromolar, ATP 400 micromolar, DMSO al 1 %, enzima LATS1 1,1 nM (Carnabio, 01-123), adyuvante de localización 1 micromolar de FAM-KKLRRTLSVA-COOH (SEQ ID NO: 24) (NanoSyn). Las placas se incubaron a 25 °C durante 3 horas. Se añadieron a cada pocillo 40 microlitros de tampón de parada con EDTA 25 mM (NanoSyn) para terminar la reacción. Los adyuvantes de localización y los productos se separaron electroforéticamente usando el sistema de descubrimiento de fármacos Caliper Labchip 3000 basado en microfluidos (Caliper Life Sciences). Las placas se leyeron mediante excitación con láser azul y detección de fluorescencia verde y se cuantificaron por intensidad de fluorescencia. La CI50 se mide cuando el efecto del compuesto reduce la señal de fluorescencia del producto en un 50 %. De acuerdo con este ensayo, los valores de CI50 de LATS1 en micromolar para los siguientes compuestos son:
Ej. 49: 0,012, Ej. 14: 0,034, Ej. 65: 0,022, Ej. 139: 0,028, Ej. 133: 0,004.
Ejemplo A3: Ensayo bioquímico Caliper de LATS2 (compuestos de Ejemplos 1-290)
La proteína de dominio cinasa LATS2 humana se adquirió en Carnabio (número de catálogo 01-124), que alberga el dominio catalítico de los aminoácidos 553-1088, y se purificó conjuntamente con MOBKL1A humana etiquetada con His (NP_775-739). Se añadieron 5 microlitros de tampón enzimático, 100 nl de compuestos y 5 microlitros de tampón adyuvante de localización en placas de 384 pocillos. La mezcla de reacción de ensayo final contiene HEPES 100 mM, pH 7,5, BSA al 0,1 %, Triton X-100 al 0,01 %, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM, ortovanadato de sodio 10 micromolar, betaglicerofosfato 10 micromolar, ATP 400 micromolar, DMSO al 1 %, enzima LATS2 1,1 nM (Carnabio, 01-124), adyuvante de localización 1 micromolar de FAM-KKLRRTLSVA-COOH (SEQ ID NO: 24) (NanoSyn). Las placas se incubaron a 25 °C durante 3 horas. Se añadieron a cada pocillo 40 microlitros de tampón de parada con EDTA 25 mM (NanoSyn) para terminar la reacción. Los adyuvantes de localización y los productos se separaron electroforéticamente usando el sistema de descubrimiento de fármacos Caliper Labchip 3000 basado en microfluidos (Caliper Life Sciences). Las placas se leyeron mediante excitación con láser azul y detección de fluorescencia verde y se cuantificaron por intensidad de fluorescencia. La CI50 se mide cuando el efecto del compuesto reduce la señal de fluorescencia del producto en un 50 %. Los valores de CI50 de LATS2 para los compuestos ejemplificados 1-290 se muestran en la Tabla 1A.
T a b la 1A: A c tiv id a d inh ib id o ra con tra LATS1 y LA T S 2
n.d. significa no determinada
Ejemplo A4: Ensayo bioquímico Caliper de LATS1 (compuestos de Ejemplos 291-335)
El ensayo Caliper bioquímico de LATS1 se realizó de la siguiente manera.
La proteína del dominio cinasa LATS1 humana se adquirió en Carnabio (número de catálogo 01-123; lote 15CBS-0098D). Se coexpresó LATS1 humana, dominio catalítico [589-1130(fin) aminoácidos del número de acceso NP_004681.1] como proteína de fusión de GST N terminal (90 kDa) con MOBKL1A humana marcada con His [1-216(fin) aminoácidos del número de acceso NP_775739.1] usando el sistema de expresión de baculovirus. GST-LATS1 se purificó mediante cromatografía en glutatión sefarosa. El sustrato (Fluo-SGKtide; Péptido para LATS1; lote BS-41067) tiene la siguiente secuencia: 5-Fluo-Nva-KKRNRRLSVA-amida (SEQ ID NO: 27) * TFA y se adquirió en Biosyntan.
La reacción se realiza en tampón de reacción que contiene Hepes 50 mM, pH 7,5; Tween 20 al 0,02 %; BSA al 0,02 %; DTT 1 mM; Na3VO410 uM y beta-glicerolfosfato 10 mM y MgCh 1 mM recién añadido y c.s.p. de H2O.
La solución de sustrato (2 * conc.) en el tampón de reacción contiene ATP 300 jM y Fluo-SGKtide 4 jM .
La solución de cinasa (2 * conc.) en el tampón de reacción contiene cinasa LATS1 20 nM.
4,5 j l de conc. 2x. Se añadieron solución de cinasa, 50 nl de compuestos 1,8 mM y 4,5 j l de solución de sustrato a placas de 384 pocillos de volumen pequeño de color negro de Greiner y se incubaron a 32 °C durante 1 hora. Se añadieron 15 j l de tampón de parada que contenía Hepes 100 mM, pH 7,5; DMSO al 5 %; Reactivo de recubrimiento al 0,1 %; EDT<a>10 mM y Brij35 al 0,02 % y c.s.p. de H2O a cada pocillo para terminar la reacción.
Los sustratos y los productos se separaron electroforéticamente usando el sistema Caliper EZ Reader basado en microfluidos (Caliper Life Sciences) usando un chip de 12 sorbos (cat 760404). La separación tiene lugar en un tampón de recubrimiento (ídem tampón de parada) que contiene reactivo de recubrimiento CR3 al 0,1 % y reactivo de recubrimiento CR8 al 0,5 % (Perkin Elmer).
Las placas se leyeron usando un LED con excitación a 488 nm y detección a 520 nm para cuantificar la intensidad de fluorescencia. La CI50 se mide cuando el efecto del compuesto reduce la señal de fluorescencia del producto en un 50 %. Los valores de CI50 de LATS1 para los compuestos ejemplificados 291-335 se muestran en la Tabla 1B.
Tabla 1B. Actividad inhibidora contra LATS1
Ejemplo A5: Ensayo de proliferación de células progenitoras hepáticas de ratón
El ensayo de proliferación consiste en medir el crecimiento tridimensional inducido por el compuesto de células progenitoras hepáticas (HPC, por sus siglas en inglés) en organoides pequeños mediante métodos de formación de imágenes de alto contenido. Las células progenitoras se aislaron de ratones C57BI/6 de tipo silvestre y se expandieron como se describe (Lu, WYet al., Nat. Cell Biol.17, 971-983 (2015)). Las células se almacenan en nitrógeno líquido, se descongelan según sea necesario y se prueban usando el siguiente protocolo:
Las HPC se recolectan de su recipiente de cultivo recubierto con colágeno I (Corning; Número de cat. 354487), se cuentan y evalúan para determinar su viabilidad usando un contador de células CEDEX (Roche). Después de la centrifugación, se resuspenden 12 millones de células en 2 ml de medio William's E (Life Technologies; Número de cat. 22551089) suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% (Amimed; Número de cat. 2-01F10-I); Penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma; Número de cat. 15140-122); NaHCO3 17,6 mM (Sigma; Número de cat. S8761); HEPES 20 mM (Gibco; Número de cat. H3375); Nicotinamida 10 mM (Sigma; Número de cat. N0636-100); Glucosa 14 mM (Sigma; Número de cat. G7021); Piruvato de sodio 1 mM (Sigma; Número de cat. TMS-005); Insulina Transferrina Selenio (ITS) diluida 100 veces a partir de una solución madre (Sigma; Número de cat. I3148); Dexametasona 100 nM (Sigma; Número de cat. D4902); Ácido ascórbico 0,2 mM (Sigma; Número de cat. A7506-100G); 10ng/ml de IL-6 humana recombinante (Preprotech; Número de cat. 200-06); 10 ng/ml de HGF murino (Preprotech; Número de cat. 315-23; Lote. 0711S527); 10 ng/ml de EGF murino (Preprotech; Número de cat. 315-09; Lote. 0217179-1). Se añaden seis mililitros de Matrigel (Corning; Número de cat. 354277; Lote: 5187006) a la solución de células/medio, por lo que la concentración celular final es de 1,5 millones de HPC por mililitro, en 25 % de medio de cultivo y 75 % de Matrigel. Se transfieren cinco microlitros ( jl) de la suspensión de células/Matrigel a cada pocillo de la placa de ensayo de 96 pocillos de fondo transparente (Corning; Número de cat.
356649) usando el dispensador Star (Hamilton). Después de 20 minutos de incubación a 37 °C y CO2 al 5 % para permitir la polimerización de Matrigel, se dispensan encima 45 pl de medio de cultivo celular.
En la placa de origen del compuesto, se dispensan 300 pl de medio de cultivo celular en 1,2 pl de compuestos disueltos en DMSO al 90 %. Después de mezclar adecuadamente, se transfieren 50 pl de la solución del compuesto a la placa de ensayo usando un Pocillo CyBi (CyBio). Cada compuesto se prueba en curvas de concentración de 8 puntos que tienen un factor de dilución de 3,16 entre cada concentración. La concentración máxima del compuesto probado es de 20 pM y la más baja es de 9 nM. Las placas de ensayo se incuban durante 4 días a 37 °C y CO2 al 5 %.
Después de la incubación, los organoides se fijan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco; Número de cat. 10010-015) que contiene paraformaldehído al 4% (Electron Microscopy Sciences; Número de cat. 15714-S) y Hoechst 33342 (Life Technologies; Número de cat. H3570) diluido 1/5000 de la solución madre para teñir los núcleos. Las placas se incuban durante 90 minutos a temperatura ambiente y se lavan una vez con 300 pl de PBS que contiene penicilina/estreptomicina al 1 %.
Se obtienen imágenes de las placas con el generador de imágenes CV7000 (Yokogawa) con un aumento de 10 veces usando la lámpara de campo brillante (potencia de la lámpara: 10 %; tiempo de exposición: 20 ms) y el láser de 405 nanómetros (potencia del láser: 100%; tiempo de exposición 200 ms). Se adquirieron y analizaron cuatro imágenes diferentes por pocillo con el software de análisis de imágenes de Yokogawa (YAS). La característica de salida utilizada para determinar el tamaño del organoide es el número medio de núcleos por organoide, promediado en el pocillo. El número medio de núcleos por organoide (x) se normaliza con respecto al tratamiento de control neutro (DMSO), usando el siguiente cálculo: [xn = 100 (x - CN) / CN]. Los datos normalizados a control neutro se usan para el ajuste automatizado de curvas para derivar parámetros de curva por compuesto, incluyendo los valores de CE50.
El ensayo de proliferación de células progenitoras hepáticas de ratón puede usarse fácilmente para probar si un compuesto es eficaz para inducir la proliferación de células progenitoras hepáticas. Determinados compuestos
se probaron en el ensayo de proliferación de células progenitoras hepáticas de ratón y se encontró que tenían valores de CE50 de menos de 20 pM, por ejemplo, se encontró que los Ejemplos 48a y 58 tenían valores de CE50 de 0,26 y 0,84 pM, respectivamente. Determinados otros compuestos se probaron en el ensayo de proliferación de células progenitoras hepáticas de ratón y se encontró que tenían valores de CE50 superiores a 20 pM, por ejemplo, el Ejemplo 303.
Ejemplo A6: Ensayo de HTRF de pYAP (células HaCaT)
El ensayo de HTRF de pYAP se realizó usando el kit de prueba Fosfo-YAP (SER127) 10000 (CisBio, número de catálogo 64YAPPEH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se suspendieron células HaCaT a 1,1 x 106 células/ml en DMEM (sin rojo fenol) FBS al 10 % con penicilina-estreptomicina-glutamina. Se dispensaron 5 pl de células en placas tratadas con cultivo de tejidos, de fondo sólido de color blanco, de 1536 pocillos (5500 células/pocillo) y se incubaron durante 48 horas a 37 °C. Se transfirieron 50 nl del compuesto de prueba a las placas de prueba que contenían células HaCaT usando Pintool (GNF) y se incubaron durante 2 horas. Se añadió tampón de lisis (CisBio) a los pocillos de ensayo y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 2 pl de anticuerpos de detección (dilución 1:40 de cada solución madre de ab d2 contra pYAP y anticuerpo de criptato contra pYAP). Las placas se incubaron durante la noche (20 horas) a temperatura ambiente cubiertas con tapas metálicas. Las placas se leyeron en Pherastar (BMG Labtech) para HTRF (665 nm/620 nm). La CI50 se mide cuando el efecto del compuesto reduce la señal de HTRF en un 50 %. Los resultados se muestran en la Tabla 1C.
Ejemplo A7: Ensayo de translocación de YAP (células HaCaT)
Se suspendieron células HaCaT a 0,4 * 106 células/ml en DMEM FBS al 10 % con penicilina-estreptomicina-glutamina. Se dispensaron 50 pl de células en placas de prueba de fondo transparente de 384 pocillos (20.000 células/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se transfirieron 100 nl del compuesto de prueba a los pocilios de prueba que contenían células HaCaT usando ECHO (Labcyte). Después de 24 horas de incubación a 37 °C, se dispensaron 7 j l de PFA al 32 % en cada pocillo y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS, dejando 20 j l de PBS por pocillo, después se trataron con Triton al 0,1 % y BSA al 1,5 % en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 5 veces con PBS, dejando 20 j l de PBS por pocillo. Se añadieron a cada pocillo 20 j l de ab primario contra YAP 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology, número de catálogo 63.7) y Draq5 1:1500 en PBS con BSA al 1,5 % y se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de 3 lavados con PBS, dejando 20 j l de PBS por pocillo, cada pocillo se incubó con 20 j l de anticuerpo secundario AlexaFluor 488_A21202 1:2000 (Molecular Probes) durante 4 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron adicionalmente 3 veces con PBS, se sellaron y se tomaron imágenes en el sistema de formación de imágenes Opera de alto contenido (PerkinElmer). Los resultados se muestran en la Tabla 1C.
Tabla 1C: Inhibidor de la fosforilación de YAP y de la Translocaclón Nuclear de YAP
n.d. significa no determinada
Ejemplo A8: Identificación de dianas
Se transfectaron ARNip contra MST1/2 o LATS1/2 en células HaCaT humanas. Cuarenta y ocho horas después, las células se trataron con 1 pM de ácido okadaico durante dos horas para mejorar las señales de pYAP Los lisados celulares se sometieron a análisis por transferencia Western para pYAP (Ser127) que se describe a continuación. Los resultados del experimento se presentan en las Figuras 33A a 33C.
Análisis por transferencia Western
Se mezclaron lisados celulares (25 pg por calle) con tampón de muestra XT y agente reductor (Bio-Rad), se separaron mediante gel prefabricado SDS Criterion con gradiente del 4-12% (Bio-Rad) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Las proteínas se detectaron con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante mediante el uso de un kit de quimioluminiscencia potenciado (ThermoFisher). Los anticuerpos primarios utilizados fueron el anticuerpo anti-pYAP (Cell Signaling, número de catálogo 13008S) y el anticuerpo anti ACTINA (Abcam, número de catálogo ab8227)
Ejemplo A9: Farmacodinamia (PD)in vivo
Se usaron ratones C57BL6 (Envigo) macho, de 8-10 semanas de edad, para el estudio PDin vivo.Se usó una herramienta de biopsia por punción quirúrgica estéril de 6 mm para realizar dos heridas de escisión de grosor total en el dorso del ratón anestesiado. Se formularon inhibidores de L<a>T<s>en propilenglicol al 49,5 %/Tween 80 al 0,5 %/PBS al 49 %/HPMC al 1 %, y se administraron por vía tópica en un volumen de dosificación de 3 pl. La zona de la herida se cubrió con un apósito adhesivo (Tegaderm). Después se envolvió a los animales con una venda autoadhesiva. Después de dos dosis diarias, se recogieron muestras de piel alrededor del borde de la herida (muestras en forma de anillo de 2 mm) usando tijeras 7 horas después de la última dosis.
Las muestras recogidas se sometieron a extracción de ARN usando el kit RNeasy (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó un análisis por RT-PCR TaqMan de dos etapas en un ciclador térmico Peltier PTC-200 (MJ Research) y un sistema de detección de secuencia ABI pRlSM 7900HT (Applied Biosystems). Se sintetizó ADNc usando un kit de archivo de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis de TaqMan usando la mezcla TaqMan Universal Master (Applied Biosystems) y sondas deCyr61yGapdh(Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de ARNm para los genes diana se normalizaron a los niveles de ARNm deGapdhy los datos se analizaron usando el software SDS 2.0 (Applied Biosystems) para calcular cantidades relativas de<a>R<n>.
Todos los estudios con animales se realizaron en el Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación Novartis (GNF). Los protocolos experimentales cumplieron con las normas de bienestar animal y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de GNF.
Los niveles de expresión relativos resultantes deCyr61/Gapdhfrente a las concentraciones del compuesto de prueba se representaron como un gráfico de barras en la Figura 34.
Ejemplo A10: Histología y tinción con Ki67in vivo
Se usaron ratones macho, de 7 semanas de edad, C57BL6 para el estudio de histologíain vivo.Se formularon inhibidores de LATS en PG al 70 %/EtOH al 30 % y se administraron por vía tópica en un volumen de dosificación de 25 |jl (250 |jg por dosis) en la superficie dorsal afeitada. Después de 3 días de dosificación dos veces al día, se recogieron muestras de piel y se sometieron a tinción inmunohistológica para Ki67 (ThermoFisher Scientific, número de catálogo RM-9106). Las secciones se observaron visualmente y las células positivas para Ki67 se contaron mediante un algoritmo de imágenes interno. En la Figura 35A se muestran micrografías representativas de la tinción con Ki67. La abundancia de células positivas para Ki67 en células de piel de ratón tratadas y sin tratar se representó como un diagrama de dispersión en la Figura 35B.
Ejemplo A11: Ensayo de HTRF de pYAP (células JHH-5)
El ensayo pYAP HTRF se realiza usando células JHH-5 tratadas con el compuesto (Fujiseet al., Hepatogastroenterology.Octubre de 1990; 37(5):457-60) que se analizan con el kit de prueba Fosfo-YAP (Ser127) 50000 (número de catálogo CisBio 64YAPPEI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se suspenden células JHH-5 a 0,48 x 10A6 células/ml en medio William's E sin rojo fenol (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific Gibco A1217601) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v) (Número de catálogo de Thermo Fisher Scientific Gibco 16140071) y penicilina-estreptomicina a 100 U/ml cada una (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific Gibco 15140122). Se dispensan células en placas de cultivo de fondo transparente de 384 pocillos (50 ul/pocillo, a 24.000 células por pocillo, número de catálogo Greiner 781091) y se incuban durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular a 37 °C. Los compuestos de prueba se transfieren a placas de cultivo que contienen células JHH-5 usando un dispensador acústico Echo550 (Labcyte) (50 nl/pocillo), seguido de incubación durante 2 horas a 37 °C. Se añade tampón de lisis (parte del kit CisBio número de catálogo 64YAPPEI) a las placas de prueba como un concentrado cuádruple (correspondiente a 16 ul/pocillo) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El lisado se transfiere de las placas de cultivo a placas de ensayo de color blanco de bajo volumen de 384 pocillos (12 ul/pocillo, número de catálogo de Greiner 784075), seguido de la adición de 3 ul/pocillo de anticuerpos de detección (parte del kit CisBio número de catálogo 64 YAPPEI: dilución 1:40 de cada solución madre de anticuerpo de d2 contra pYAP y anticuerpo de criptato contra pYAP). Las placas se sellan y se incuban durante la noche (18 horas) a temperatura ambiente protegidas de la luz. Las placas se leen en un lector de placas EnVision (Perkin Elmer) a longitudes de onda de emisión de 665 nm y 620 nm. La relación de señal de HTRF x por pocillo se calcula como [x = Señal (665 nm)/Señal (620 nm) x10000] como se especifica en el protocolo del fabricante. La relación de señal x por pocillo se normaliza para el tratamiento de control activo y control neutro (DMSO), puntuando la mediana de CN como el 0 % y la mediana de CA como -100 % para calcular la relación de señal normalizada xn por pocillo como [xn = ±100 (x - CN ) / (CA - CN)]. Los datos normalizados por control se usan para el ajuste automatizado de curvas para derivar parámetros de curva por compuesto, incluyendo los valores de CI50. Los valores de CI50 de pYAP en células JHH-5 para los compuestos ejemplificados se muestran en la Tabla 1D.
Tabla 1D. Inhibición de la fosforilación de YAP en células JHH5
Ejemplo A12: Ensayo de translocación nuclear de YAP (células JHH-5)
El ensayo de translocación nuclear de YAP se realiza usando células JHH-5 tratadas con el compuesto (Fujiseet al., Hepatogastroenterology.Octubre de 1990; 37(5):457-60) que se analizan mediante formación de imágenes de alto contenido después de una tinción con anticuerpo anti-YAP1. Brevemente, se suspenden células JHH-5 a 0,48 x 10A6 células/ml en medio William's E sin rojo fenol (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific Gibco A1217601) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v) (Número de catálogo de Thermo Fisher Scientific Gibco 16140071) y penicilina-estreptomicina a 100 U/ml cada una (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific Gibco 15140122). Se dispensan células en placas de cultivo de fondo transparente de 384 pocillos (50 ul/pocillo, a 24.000 células por pocillo, número de catálogo Greiner 781091) y se incuban durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular a 37 °C. Los compuestos de prueba se transfieren a placas de cultivo que contienen células JHH-5 usando un dispensador acústico Echo550 (Labcyte) (50 nl/pocillo). Después de una incubación de 4 horas a 37 °C, se dispensan 12,5 ul de solución madre de PFA al 20 % (número de catálogo de Electron Microscopy Sciences 15713S) en cada pocillo para una concentración final del 4 % (v/v) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavan con TBS (preparado a partir de concentrado diez veces mayor, número de catálogo de Sigma Aldrich T5912) y después se permeabilizan con solución Triton X-100 al 0,1 % (v/v) (número de catálogo de Sigma Aldrich 93443) en DPBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavan nuevamente con TBS, seguido de la adición de anticuerpo anti-YAP1 (número de catálogo de Novus Biologicals NB110-58358) a cada pocillo en una dilución de 1:500 en BSA al 3 % (p/v) en DPBS (preparado a partir de solución madre al 35 %, número de catálogo de Sigma Aldrich A7979) e incubación durante la noche a 4 °C. Después de retirar la solución de anticuerpo primario y lavar con TBS, cada pocillo se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente con una dilución 1:1000 de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 647 (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific A-21244) en BSA al 3 % (p/v) en DPBS (preparado a partir de una solución madre al 35 %, número de catálogo de Sigma Aldrich A7979) suplementada con una solución Hoechst 33342 (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific 3570) a una dilución 1:10000. Las placas se lavan nuevamente con TBS y después se sellan y se obtienen imágenes en el sistema de análisis de alto contenido IN Cell Analyzer (GE Healthcare Life Sciences). Mediante la comparación de la tinción nuclear de Hoechst con la tinción intracelular total de YAP Alexa Flour 647 usando el software de análisis de imágenes CellProfiler (Carpenteret al., Genome Biol.2006; 7(10):R100), se deriva la señal correspondiente a YAP nuclear. La señal de YAP nuclear x se normaliza para el tratamiento de control activo y control neutro (DMSO), puntuando la mediana de CN como el 0 % y la mediana de CA como 100 % para calcular la señal de YAP nuclear normalizada xn por pocillo como [xn = ±100 (x - CN) / (CA - CN)]. Los datos normalizados a control se usaron para el ajuste automatizado de curvas para derivar parámetros de curva por compuesto, incluyendo los valores de CE50.
Ejemplo A13: Tratamientoin vivode ratones
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las directrices federales, estatales, locales e institucionales que rigen el uso de animales de laboratorio en investigación. Se adquirieron ratones macho C57BL/6J (de 8-10 semanas de edad) en Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Se formuló Ejemplo 46 para dosificación oral a 3 mg/ml y Ejemplo 261 a 1 mg/ml, en una suspensión de metilcelulosa:Tween80:Agua (0,5:0,5:99). La dosis oral única de cualquiera de los compuestos fue de 10 ml/kg de peso corporal. Se recogieron sangre y tejido hepático bajo anestesia profunda (isoflurano) 2 h después de la dosis (para análisis de ARNm) o 24 h después de la dosis (para inmunohistoquímica).
HTRF de Fosfo-YAP (pYAP) en te jido hepático
Se transfirió tejido hepático congelado a un tubo Lysing Matrix (MP, n.° de cat. 6913-500) con una solución 1:50 de inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, n.° de cat. P8340) en tampón de extracción Phosphosafe (Novagen, n.° de cat. 71296-3) y se homogeneizó usando el FastPrep-24 (MP biomedicals). La mezcla se mantuvo en hielo durante 20 min y después se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. La concentración de proteína se midió usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce cat.23227)siguiendo el protocolo del fabricante. Todas las muestras se normalizaron a una concentración final de 5 pg/pl en un volumen total de 180 pl de Phosphosafe y se sembraron en una placa de 96 pocillos para el ensayo de h Tr F. Se probó pYAP mediante HTRF usando el kit de prueba Fosfo-YAP (SER127) 50000 (Cisbio, número de catálogo 64YAPPEI). Se analizaron lisados de hígado de ratón en tampón de extracción solo (Phosphosafe) o en una mezcla 1:1 de Phosphosafe con tampón de lisis HTRF (Cisbio) en pocillos duplicados de placas de ensayo de 384 pocillos (12 pl/pocillo). Se usó la misma cantidad de entrada para cada muestra, según el contenido total de proteína (30-60 ug por muestra por pocillo). Se añadieron anticuerpos de detección d2 contra fosfo-YAP y criptato contra fosfo-YAP, cada uno diluido 1:40 en tampón de detección (Cisbio) (3 pl/pocillo, dilución final 1:200 para cada anticuerpo), después de lo cual las placas se sellaron y se incubaron durante la noche (18 horas) a temperatura ambiente protegidos de la luz. Las placas se leyeron en un EnVision (PerkinElmer) con longitudes de onda de emisión de 665 nm y 620 nm. La relación de señal de HTRf se calculó como Señal (665 nm)/Señal (620 nm)) * 10000 como se especifica en el protocolo del fabricante. Se usó un valor de señal de HTRF (media de pocillos duplicados) para cada muestra de lisado en los gráficos del grupo de tratamiento.
RT-PCR cuantitativa
Se aisló ARN hepático total del tejido después del almacenamiento en reactivo RNAlater (Qiagen), usando un método TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Se midió la abundancia relativa de ARNm mediante RT-PCR cuantitativa usando ensayos de expresión génica TaqMan y reactivos de acuerdo con protocolos convencionales (Applied Biosystems). Las sondas de ratón para los genes diana de YAP fueron CTGF (Mm01192933_g1) y Cyr61 (Mm00487498_m1). Se usó GAPDH de ratón como control interno (sonda 4351309). Los cambios relativos en el ARNm se calcularon mediante el método AACt. Los cambios en la expresión génica con el tratamiento con compuestos se expresan como cambios con respecto al grupo de vehículo.
Inmunohistoquímica (IHC) para Ki67
Se fijó tejido hepático en formol tamponado neutro al 10 % durante 24-48 h. El procesamiento y la inclusión en parafina se realizaron mediante procedimientos convencionales. Se cortaron secciones de 5 micrómetros de grosor y se tiñeron usando un sistema automatizado Ventana. El anticuerpo primario para Ki67 de ratón era una IgG de conejo (Betilo Labs). Los hepatocitos positivos para Ki67 se cuantificaron mediante análisis de imágenes usando la plataforma HALO. Se analizaron al menos 3 secciones por animal, desde la mitad del lóbulo medial.
Tabla 1E. Resultados del compuesto de tratamiento en ratón
Los ARNm para los genes diana de YAP, CTGF y Cyr61, aumentaron 2 h y la proliferación indicada por inmunohistoquímica (IHC) de Ki67 aumentó 24 h después de una dosis oral única de inhibidores de cinasas LATS. Los valores se expresan como cambio con respecto al el grupo de vehículo con (media /- ETM).
Ejemplo B1: Aislam iento de células epiteliales del limbo humano
Se obtuvieron córneas humanas cadavéricas autorizadas para la investigación de bancos de ojos. Se diseccionaron bordes del limbo y se disociaron parcialmente en una solución de dispasa de 1,2 mg/ml durante 2 horas a 37 °C seguido de 10 minutos en TrypLE (Life Technologies). Después se cortaron cuidadosamente trozos de criptas del limbo de los bordes del limbo parcialmente disociados y se aclararon mediante centrifugación). Las células obtenidas de esta manera se usaron en los Ejemplos B2-B11 a continuación.
Ejemplo B2: Exposición de células a inhibidores de LATS y medición de la d istribución intracelular de YAP
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 24 pocillos con fondo de vidrio y pared de color negro en medio de cultivo de células de epitelio del limbo (DMEM F12 suplementado con suero humano al 10 % y cloruro de calcio 1,3 mM) suplementado con el compuesto inhibidor de LATS, ejemplo n.° 133 o 49 a una concentración de 10 micromolar o suplementado en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron en estas condiciones durante 24 horas a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para medir el efecto de los inhibidores de LATS sobre la YAP diana corriente abajo, se analizó la distribución de YAP intracelular mediante inmunohistoquímica. Se fijaron cultivos celulares con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Tritón X-100 al 0,3%(Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. El anticuerpo primario utilizado fue anti-YAP de Santa Cruz Biotechnology. Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se omitió el control negativo con anticuerpo primario (datos no mostrados). La fluorescencia se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Solo se observó una inmunotinción débil de YAP en el núcleo de LSC cultivadas sin los inhibidores de LATS (control de DMSO). La inmunotinción de YAP fue más fuerte en el núcleo de las LSC expuestas al compuesto inhibidor de LATS, ejemplo n.° 133 o 49 (datos no mostrados).
Ejemplo B3: Exposición de células a inhibidores de LATS y medición de la fosforilación de YAP
Las células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 se separaron de la placa de cultivo con Accutase durante 10 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se sembraron en DMEM F12 suplementado con suero humano al 10 % y cloruro de calcio 1,3 mM en placas de 6 pocillos (Corning) y se cultivaron sin compuestos inhibidores de LATS durante 2-4 días.
Después, el medio se reemplazó por medio de cultivo de células de epitelio del limbo nuevo (DMEM F12 suplementado con suero humano al 10 % y cloruro de calcio 1,3 mM) suplementado con el compuesto inhibidor de LATS, ejemplo n.° 133 o 49 a una concentración de 10 micromolar o suplementado en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron en estas condiciones durante 1 hora a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para medir el efecto de los inhibidores de LATS sobre la YAP diana corriente abajo, los niveles de fosforilación de YAP se midieron mediante transferencia Western de la siguiente manera. Los sedimentos de células se obtuvieron mediante disociación con tripsina y centrifugación y se lavaron con PBS. Los sedimentos se lisaron con 30 microlitros de tampón de lisis RIPA que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Life Technologies) durante 30 minutos, con agitación vorticial cada 10 minutos. Después, los residuos celulares se sedimentaron a 4 °C durante 15 minutos a 14.000 rpm y se recogió el lisado de proteínas. La concentración de proteínas se cuantificó usando un kit micro BCA (Pierce). Se cargaron quince microgramos de proteína total en cada pocillo de geles de TGX al 4-20 % (BioRad) y se realizó una transferencia Western de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se sondaron con anticuerpo contra fosfo-YAP (ser127) (CST, 1:500) o Yap total (Abnova, 1:500) y se usó el marcaje con actina (Abcam) como control de carga. Las membranas se tiñeron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, se aclararon y se tomaron imágenes usando un sistema ChemiDoc (Biorad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El análisis por transferencia Western (véase la Figura 1) mostró que ambos compuestos del ejemplo n.° 133 y 49 provocaron una reducción en los niveles de fosforilación de YAP en LSC humanas. Estos resultados sugieren que el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo n.° 133 y 49 pueden activar la señalización de YAP en LSC humanas.
Ejemplo B4: Expansión de la población de células madre del limbo humanas y observación inmunohistoquím ica del fenotipo celular
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 24 pocillos (Corning) en medio de cultivo de células de epitelio del limbo (DMEM F12 suplementado con suero humano al 10% y cloruro de calcio 1,3 mM) suplementado con el compuesto inhibidor de LATS, ejemplo n.° 133 o 49 a una concentración de 10 micromolar o suplementado en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron primero a 37 °C en CO2 al 5 % durante 6 días después del aislamiento sin pases (Figuras 2A, 2B y 2C).
Para evaluar la capacidad de los compuestos para permitir la expansión de las LSC después de dos pases, se hicieron pases de las LSC y se cultivaron durante dos semanas en presencia del compuesto del ejemplo 49 para permitir la expansión (Figura 2D). Se hicieron pases de células madre del limbo (LSC) tratando los cultivos con Accutase durante 10 minutos a 37 °C, aclarando la suspensión celular mediante centrifugación y sembrando las células en medio de cultivo LSC nuevo suplementado con el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo 49.
Para observar que la población de células expandidas expresaba p63alfa, esto se midió mediante inmunohistoquímica de la siguiente manera. Se fijaron cultivos celulares con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. El anticuerpo primario utilizado fue p63alfa de Cell Signalling. Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se tiñeron con un anticuerpo contra antígeno nuclear humano (Millipore) a una dilución 1:500 para marcar todas las células en el cultivo y confirmar su identidad humana. Se omitió el control negativo con anticuerpo primario (datos no mostrados). La fluorescencia se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
La Figura 2A muestra que en presencia de medio de crecimiento y DMSO, sólo unas pocas células aisladas se adhieren a la placa de cultivo y sobreviven hasta 6 días. La mayoría de las células expresaron el marcador nuclear humano, pero pocas expresaron p63alfa. Por el contrario, en presencia de inhibidores de LATS, el compuesto del ejemplo n.° 133 (Figura 2B) y el compuesto del ejemplo n.° 49 (Figura 2C), las células formaron colonias y expresaron p63alfa. Este resultado indicó que los inhibidores de LATS promueven la expansión de la población de células con el fenotipo positivo para p63alfa. Figura 2D: El pase de células y cultivarlas en presencia del inhibidor de LATS compuesto del ejemplo n.° 49 durante dos semanas permitió la expansión de poblaciones celulares y la formación de cultivos confluentes que expresaban p63alfa.
Ejemplo B5: Expansión de la población de células madre del limbo humanas y medición de la misma
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 48 pocillos (Corning) en medio XVIVO15 (Lonza) suplementado con inhibidores de LATS (como se enumeran en las Tablas 2 y 3 a continuación) a una concentración de 10 micromolar o suplementadas en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para cada compuesto, se generaron dos conjuntos de cultivos. Un primer conjunto de cultivos se fijó en PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente después de que las células aisladas de la córnea se hubieran adherido a la placa de cultivo celular (normalmente 24 h después del cultivo en placas celulares). Un segundo conjunto de cultivos se fijó en PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente después de cultivarse durante dos pases. Se hicieron pases de las células cuando alcanzaron una confluencia del 90-100 %.
Para observar que la población de células expandidas expresaba p63alfa, esto se midió mediante inmunohistoquímica de la siguiente manera. Los cultivos celulares fijados se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. El anticuerpo primario utilizado fue p63alfa de Cell Signalling. Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, los núcleos celulares se marcaron en una solución 0,5 micromolar de Sytox Orange (ThermoFisher) en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Para evaluar el porcentaje de células positivas para p63alfa, se contó el número de células marcadas por el anticuerpo anti-p63alfa y se determinó el número total de células contando el número de núcleos teñidos con Sytox Orange. Después se determinó la proporción de células positivas para p63alfa calculando el porcentaje de núcleos positivos para Sytoxnaranja que también expresaban p63alfa.
Para evaluar las relaciones de expansión celular, se contaron los núcleos usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880. Después se determinó el factor de expansión calculando la relación entre la población expandida de células y la población de células sembradas.
Los resultados de las Tablas a continuación indican que los inhibidores de LATS permitieron la expansión de poblaciones celulares. En presencia de los inhibidores de LATS, del 57 al 97 por ciento de las células expresan el fenotipo positivo para p63alfa.
Tabla 2
Tabla 3
Ejemplo B6: inactivación de ARNip de LATS1 y LATS2 en células del limbo humanas
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 24 pocilios (Corning) en medio XVIVO15 (Lonza). Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 %. Se inactivaron LATS1 y LATS2 mediante transfección (lipofección, usando RNAiMax, Thermofisher). Cada pocillo de la placa de cultivo celular se transfectó con 0,5 microgramos de conjuntos de 4 ARNip dirigidos a cada gen. Los ARNip utilizados en este estudio fueron el ARNip de LATS1 S100067172 y el ARNip de LATS2 S100106925 de Qiagen. Se usaron ARNip codificados como controles negativos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen).
Para medir la proliferación celular, la tinción con EdU se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies) 48 horas después de la transfección con ARNip de LATS1 y LATS2 o controles de ARNip revueltos. Los núcleos celulares se marcaron con Sytox Orange. La fluorescencia de EdU y Sytox Orange se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 para medir el porcentaje de núcleos celulares positivos para EdU.
La Figura 3 muestra que el porcentaje de células positivas para EdU aumentó tras la inactivación de LATS1 y LATS2, lo que muestra que la inactivación de LATS conduce a la proliferación celular.
Ejemplo B7: Expansión de la población de células madre del limbo humanas y observación inmunohistoquím ica de los marcadores DeltaN-p63 alfa/beta/gamma, ABCG2 y C/EBP delta
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 48 pocillos (Corning) en medio XVIVO15 (Lonza) suplementado con inhibidores de LATS (Compuesto del ej. 49 y compuesto del ej. 133) a una concentración de 10 micromolar o suplementado en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 8 a 10 días.
Para observar que la población celular expandida expresa marcadores normalmente expresados por células madre del limbo, la capacidad de las células para expresar DeltaN-p63 alfa/beta/gamma, ABCG2 y C/EBP delta se midió mediante inmunohistoquímica de la siguiente manera. Se fijaron cultivos celulares con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron p63a (Cell Signaling Technology), ABCG2 (EMD Millipore) y C/EBP8 (Abcam), citoqueratina 15, citoqueratina 12 (Abcam). Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, los núcleos celulares se marcaron en una solución 0,5 micromolar de Sytox Orange (ThermoFisher) en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después se observaron las muestras usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Los resultados indicaron (véase la Figura 4) que las células cultivadas en medio XVIVO suplementado con DMSO solo (sin compuesto inhibidor de LATS) normalmente no expresan marcadores normalmente expresados por las LSC. Por el contrario, las células cultivadas en presencia de inhibidores de LATS expresan marcadores normalmente expresados por las LSC.
Ejemplo B8: Diferenciación de células madre del limbo humanas en células epiteliales corneales
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 48 pocilios (Corning) en medio XVIVO15 suplementado con inhibidores de LATS, compuesto del ejemplo n.° 49, 47, 12 o 261 a una concentración de 10 micromolar 0 suplementado en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 8 a 10 días.
Después se realizó un análisis para determinar si una población de LSC positivas para p63alfa expandidas en presencia de inhibidores de LATS conservaba la capacidad de diferenciarse en células epiteliales corneales positivas para queratina-12, lo que es necesario para restablecer la transparencia corneal en los pacientes que reciben el trasplante de LSC.
Para promover la diferenciación de LSC en células del epitelio corneal, el medio de cultivo se cambió a DMEM (Invitrogen) sin suero ni inhibidores de LATS y las células se cultivaron durante 4-8 días. Para observar la diferenciación de LSC en células del epitelio corneal, los cultivos celulares se fijaron con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron p63a (Cell Signaling Technology) y citoqueratina 12 (Abcam). Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro conjugado con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 647 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se observaron las muestras usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Los resultados indicaron que los cultivos mantenidos en presencia de inhibidores de LATS y después inducidos a diferenciarse, contenían áreas donde los grupos de células positivas para p63alfa son contiguos a grupos de células que son negativas para p63alfa, pero positivas para queratina-12 (Figura 5). Por lo tanto, las células del limbo expandidas en presencia de inhibidores de LATS pueden diferenciarse en células positivas para queratina-12 cuando se encuentran en condiciones adecuadas.
Ejemplo B9: Sum inistro de preparación de LSC-biomatriz a o jos de conejo
Modelo en conejo de deficiencia de células madre del limbo
La deficiencia de células madre del limbo (LSCD, por sus siglas en inglés) se creó unilateralmente en el ojo derecho de conejos NZA mediante el desbridamiento de células epiteliales y la ablación de células madre del limbo (LSC) con papel Whatman empapado en una solución de hidróxido de sodio 1 M. Se trató la conjuntiva del limbo con mitomicina C para reducir la neovascularización corneal. El ojo izquierdo quedó intacto. La población celular se expandió en el compuesto inhibidor de LATS, se suministró ejemplo n.° 12 como se describe a continuación. Después del suministro de células, los conejos recibieron tratamiento analgésico (Tramadol 10 mg/kg VO dos veces al día en las primeras 2 semanas, Meloxicam 0. 3 mg/kg VO SID en las primeras 2 semanas o mientras el animal mostrase signos de malestar ocular), tratamiento antiinflamatorio (Ancef® (cefazolina) 50 mg sub-Tenon inmediatamente después del procedimiento, Tobrex® solución oftálmica tres veces al día en la 1.a semana y dos veces al día a partir de entonces, ampicilina 80 mg/kg/día (40 mg dos veces al día) SC durante la primera semana) e inmunosupresión (Ciclosporina A (0,5 %) ocular tópica tres veces al día la 1. a semana y dos veces al día a partir de entonces, Gentocin®-durafilm® (Sulfato de gentamicina y betametasona, MERCK) ocular tópica tres veces al día la 1.a semana y dos veces al día a partir de entonces, Ciclosporina A (5 mg/kg/día) SC en la 1.a semana y después A dosis a partir de entonces).
Preparación de biomatriz.
Se sintetizó metacrilato de gelatina (GelMA) de acuerdo con un protocolo publicado anteriormente. (Nichol, J. W.et al. Cell-laden microengineered gelatin methacrylate hydrogels. Biomaterials31, 5536-5544, doi:10.1016/j.biomaterials.2010.03.064 (2010). En resumen, se disolvieron 20 gramos de gelatina derivada de porcino (N.° de Cat. G2500, Sigma) durante la noche a 50 °C en 200 ml de PBS sin calcio ni magnesio (DPBS, N.° de Cat. 21-031, Corning). Con fuerte agitación, se añadió gota a gota anhídrido metacrílico (N.° de Cat. 276685, Sigma) (aproximadamente 1 ml/min) a la solución de gelatina para alcanzar la concentración del 8 % (vol/vol). La mezcla se agitó a 60 °C en un baño de aceite durante 3 horas antes de añadir 200 ml de DPBS y después se mezcló minuciosamente durante 15 minutos más. La mezcla diluida se purificó mediante diálisis frente a agua Milli-Q usando tubos de diálisis (PCPM de 15 kDa, Spetrua/Por) durante 1 semana a 45 °C para retirar el ácido metacrílico. Las muestras purificadas se liofilizaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Para preparar una solución madre de GelMA al 15 %, se disolvieron 1,5 gramos de la espuma de GelMA liofilizada en 10 ml de DPBS precalentado a 37 °C. Después de que la espuma de GelMA se disolviese totalmente, se introdujo el fotoiniciador añadiendo a la solución de GelMA 15 mg de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP). Se añadieron 500 microlitros de NaOH 1 N (n.° de catálogo BDH-7222-1, VWR) a la solución para ajustar el pH a neutro antes de filtrar la solución usando membranas estériles de 0,22 micrómetros (Millipore). El filtrado final se separó en alícuotas de 500 microlitros y se almacenó a 4 °C hasta su uso posterior.
Trasplante de LSC in vivo.
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 6 pocilios (Corning) en medio XVIVO15 suplementado con el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo n.° 12 a una concentración de 10 micromolar. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante dos pases (dos semanas).
Las suspensiones de células para trasplante se prepararon de la siguiente manera. Las células se separaron de la placa de cultivo con Accutase durante 10 minutos a 37 °C. Después, las células se aclararon mediante centrifugación y se resuspendieron en 16 microlitros de medio XVIVO15 sin inhibidores de LATS.
Se preparó una solución de GelMAal 5 % mezclando 16 microlitros de la suspensión de LSC o control de solución salina con 8 microlitros de la solución madre de GelMA al 15 % y después se añadió toda la mezcla a la lente de contacto terapéutica (Lotrafilcon B, Alcon) sobre un portaobjetos de vidrio de soporte. La solución final contenía 300.000 células y GelMA al 5 %. La potencia de la fuente de luz LED UV (365 nm, Hamamatsu) se ajustó al 15 % con una lectura de intensidad UV de 30 mW/cm2. Se usó una breve exposición a los rayos UVA de 25 segundos para el proceso de fotopolimerización para bioimprimir las LSC humanas en la superficie interna de la lente de contacto. Después del proceso de polimerización, la lente de contacto cargada con LSC se aplicó a un ojo de conejo disecadoex vivoo al ojo de conejoin vivo.
Para los experimentos en los que se aplicó la lente de contacto cargada con LSCex vivo,las muestras se observaron bajo un microscopio de epifluorescencia Zeiss en un plazo de dos horas.
Para experimentosin vivo,la lente de contacto cargada con LSC se aplicó al ojo derecho del modelo de conejo de LSCD descrito anteriormente y se realizó tarsorrafia para mantener la lente de contacto en la superficie ocular durante 1 semana. Después de una semana, se retiró la lente de contacto y los conejos se mantuvieron vivos durante 4 semanas más.
Los conejos se sacrificaron cinco semanas después del suministro de células, las córneas se diseccionaron y se fijaron en PFA al 4 %. Las muestras se incluyeron en parafina y se seccionaron. Se realizó inmunohistoquímica para detectar la presencia de queratina-12, un marcador de células del epitelio corneal y queratina-19, un marcador de células conjuntivales. Los anticuerpos primarios anti-queratina 12 y 19 eran de Abcam. Se usó proteína mitocondrial humana para confirmar el origen humano de las células. El anticuerpo primario anti-proteína mitocondrial humana era de Novus. Después, las muestras se tiñeron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (ThermoFisher) y se observaron con un microscopio Zeiss.
Los resultados indicaron que las LSC adheridas a una lente de contacto mediante polimerización de GelMA pueden aplicarse a la superficie del ojo de conejoex vivo(Figura 6).
La Figura 7 muestra que en un modelo de conejo con deficiencia de células madre del limbo, una población de LSC se expandió en presencia del inhibidor de LATS (compuesto del ej. 12), adherido a una lente de contacto mediante polimerización de GelMA y administradoin vivoa la superficie corneal del conejo, condujo a la regeneración del epitelio corneal positivo para queratina-12 y evitó la conjuntivalización por células conjuntivales positivas para queratina-19 en el ojo trasplantado (Figura 7A y B, respectivamente). Por el contrario, los ojos de conejo no trasplantados mostraron ausencia de restauración del epitelio corneal positivo para queratina-12. En cambio, se observaron signos de conjuntivalización, como se muestra mediante la presencia de tinción con queratina-19 (Figura 7C y D, respectivamente).
La Figura 8 muestra que las células que restablecieron el epitelio corneal de ojos trasplantados eran humanas, como se muestra mediante la presencia de proteína mitocondrial humana (Figura 8A). Por el contrario, la superficie ocular de los ojos no trasplantados no mostró tinción de proteínas mitocondriales humanas (Figura 8B).
Ejemplo 810: Sum inistro de LSCex vivousando TISSEEL
Para preparar la solución de trabajo TISSEEL (Baxter, n.° de cat. NDC 0944-4301-02), se siguieron las instrucciones del fabricante para reconstituir los ingredientes suministrados. Puede realizarse una dilución adicional de la solución de fibrinógeno reconstituida añadiendo agua esterilizada hasta alcanzar la concentración deseada de fibrinógeno. La solución de trabajo de trombina se diluyó 500 veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, GIBCO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para conseguir una solución de 1 unidad/ml.
Suministro de LSC a la superficie de cultivo in vitro.
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 6 pocillos (Corning) en medio XVIVO15 suplementado con el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo n.° 12 a una concentración de 10 micromolar. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante dos pases (dos semanas).
Las suspensiones de células para trasplante se prepararon de la siguiente manera. Las células se separaron de la placa de cultivo con Accutase durante 10 minutos a 37 °C. Después, las células se aclararon mediante centrifugación y se resuspendieron en la solución de trabajo de trombina mencionada anteriormente y las densidades celulares finales se ajustaron mediante dilución en serie entre 0,1 millones por ml y 30 millones por ml.
Inmediatamente después de mezclar la suspensión celular con solución de fibrinógeno, se sembraron 10 ul de la mezcla en el centro de una placa de 24 pocillos recubierta de colágeno y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos para solidificar la fibrina. Después de reponer cada pocillo con medio XVIVO15 sin inhibidores de LATS, se controlaron todas las muestras durante 2 semanas para determinar la degradación de la fibrina y la repoblación celular. Los resultados (Figura 9) sugirieron que se usó TISSEEL con éxito para suministrar LSC, y que el área de cultivo, de tamaño similar a la córnea humana, se puede cubrir entre 1 y 2 semanas en las muestras con 100.000 y 300.000 LSC administradas inicialmente.
Suministro de LSC a la córnea humana ex vivo.
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en placas de 6 pocillos (Corning) en medio XVIVO15 suplementado con el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo n.° 12 a una concentración de 10 micromolar. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante dos pases (dos semanas). Un día antes del experimento de suministro, las células se marcaron con colorante CMFDA verde CellTracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las suspensiones de células para trasplante se prepararon de la siguiente manera. Las células se separaron de la placa de cultivo con Accutase durante 10 minutos a 37 °C. Después, las células se aclararon mediante centrifugación y se resuspendieron en la solución de trabajo de trombina mencionada anteriormente para alcanzar la densidad celular final de 30 millones por ml.
Inmediatamente después de mezclar la suspensión celular con solución de fibrinógeno, se sembraron 10 ul de la mezcla en el centro de una córnea humana y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos para solidificar la fibrina. Se usó una lente de contacto LotraB (Air Optix Night and Day, Alcon) para cubrir la construcción de LSC-fibrina en la córnea humana para imitar el procedimiento clínico real. Las imágenes de fluorescencia se tomaron con un estereomicroscopio de fluorescencia Nikon. Los datos (Figura 10) demostraron que se usó TISSEEL con éxito para suministrar una gran cantidad de LSC en la superficie cornealex vivoy la construcción LSC-fibrina parece robusta para tolerar manipulaciones adicionales, tales como la aplicación de lentes de contacto protectoras.
Ejemplo 811: Suministro de múltiples poblaciones celulares a la superficie ocular en patrones designados a través de bioimpresión
Se construyó una bioimpresora personalizada basada en la tecnología DOPsL publicada enAdvanced Materials(2015, DOl: 10.1002/adma.201202024).
Se prepararon suspensiones celulares para bioimpresión de la siguiente manera. Se marcaron células HEK-293 anteriormente con colorante CMFDA verde Celltracker o colorante CMTPX rojo (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) antes de la recogida. Se mezclaron 25 pl de la suspensión celular con 25 pl de la solución madre de GelMA al 15 % para alcanzar una densidad celular final de 200 millones de células/ml.
Se colocaron globos oculares de conejo en una placa de Petri llena con agarosa al 1 % de bajo punto de fusión y el epitelio se desbridó cuidadosamente con un bisturí quirúrgico inmediatamente antes del proceso de bioimpresión. Después, la mezcla de células-GelMA se aplicó a la parte superior de la córnea con una junta tórica de polidimetilsiloxano (PDMS) (Specialty Silicone Products, Inc., Ballston Spa, NY) colocada en el limbo para evitar que la mezcla de células-GelMA gotee desde la superficie ocular curvada.
Se proyectó un patrón de luz personalizado (es decir, la mitad del patrón Yin-Yang) a la mezcla de células (verde)-GelMA en la parte superior del ojo del conejo durante 4 segundos antes de aclarar la mezcla no polimerizada. Se proyectó otro patrón de luz (es decir, la otra mitad del patrón Yin-Yang) en la muestra durante 4 segundos después de que se aplicara una nueva mezcla de células (rojas)-GeIMA en la parte superior de la misma córnea de conejo. Se realizaron varios aclarados con PBS antes de la formación de imágenes. Véase la Figura 11.
Ejemplo 812: Reducción del rechazo inmunitario mediante la supresión mediada por CRISPR/Cas9 del gen de beta-2-microglobulina en LSC
En el siguiente ejemplo, se eliminó la expresión de HLA clase I de la superficie del LSC mediante la supresión mediada por CRISPR del gen de la beta-2-microglobulina.
Transfección celular: Se cultivaron LSC obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 en medio X-VIVO15 suplementado con el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo n.° 48a hasta una confluencia del 50-60 % en una placa de Petri de 35 mm ocho días después del aislamiento de las LSC. Las LSC se transfectaron con una mezcla de ARNm de ARNtracrcrRNA-Cas9. Para obtener la mezcla del tamaño de una placa de Petri de 35 mm, se combinaron 12,5 microlitros de ARNcr de 10 micromolar (Dharmacon, N.° de Cat U-002000-20), 12,5 microlitros de ARNcr de 10 micromolar dirigido a B2M humana (Dharmacon, N.° de Cat CR-004366-01 ), 50 microlitros de ARNm de Cas9 de 0,1 microgramos/microlitro (Dharmacon, N.° de cat. de CAS11195) y 15 microlitros de reactivo de transfección DharmaFECT Duo (Dharmacon, n.° de cat. T-2010-02) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se añadió gota a gota a la placa de cultivo en 2,5 ml de medio (XVIVO15 suplementado con el compuesto inhibidor de LATS, ejemplo n.° 48a) (sin antibióticos). Para reducir la citotoxicidad del ARNm, se añadieron al medio 0,2 microgramos/ml de B18R (eBioscience, N.° de Cat. 34-8185-81). El reactivo de transfección por sí solo representa el control negativo de la transfección.
Después de 6 h de incubación en CO2 al 5 % a 37 °C, el medio se reemplazó con medio X-VIVO15 nuevo suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a (sin antibióticos) que incluye el compuesto y B18R. Después de 72 h en una incubadora con CO2 al 5 %, se hicieron pases de las células 1:2 y se expandieron durante 72 h adicionales en medio de LSC (sin antibióticos) que incluía el compuesto y B18R en placas de Petri recubiertas con Synthemax para proporcionar más células para la clasificación por FACs .
Análisis por FACS: Las LSC se trataron con Accutase (ThermoFisher, N.° de Cat. A1110501) durante 20 minutos en CO2 al 5 % a 37 °C. Después de raspar las células, la reacción se detuvo usando medio de cultivo celular que contenía suero al 10 % y se transfirió a un tubo Falcon para una etapa de centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de aspirar, las células del medio se resuspendieron en 200 microlitros de tampón FACS (PBS/FBS al 10 %).
Para analizar la expresión de B2M y HLA-ABC, se añadieron 5 microlitros de anticuerpo anti-p2-microglobulina humana de ratón APC (Biolegend, n.° de cat. 316312) y 20 microlitros de anticuerpo anti-HLA-ABC humano de ratón PE (BD Bioscience, n.° de cat. 560168) a la suspensión celular y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron 3 veces después del marcaje con anticuerpo con tampón de FACS y se resuspendieron en 500 microlitros en tampón de FACS. Antes de la clasificación por FACS, las células se filtraron a través de un filtro de 70 micrómetros y se almacenaron en hielo hasta su clasificación.
Para evitar que las células se adhieran a la pared, los tubos de recogida se llenaron con el suero durante 30 minutos antes de la clasificación. Las células se clasificaron en un instrumento BD FACSAria II en tubos de recogida preparados, usando medio de LSC enriquecido con suero humano que incluía el compuesto y B18R. Los datos de FACS se analizaron usando el software BD FACSDiva.
Los resultados presentados en la Figura 12 muestran que la supresión de B2M mediada por CRISPR y la posterior eliminación de HLA A, B y C se produjeron en el 21 por ciento de las LSC. Como el medio XVIVO15 suplementado con el compuesto inhibidor de LATS del ejemplo n.° 48a permite la expansión eficiente de las LSC, la población de LSC del 21 por ciento negativas para B2M/negativas para HLA A,B,C podría entonces expandirse para proporcionar una preparación celular en la que el 97 por ciento de las células no expresan los impulsores de HLA de clase I del rechazo inmunitario (Figura 13).
Ejemplo 813: Estudio de estimación de compuestos residuales
Preparación de curva patrón
Se realizó una serie de diluciones de patrones de solución madre a concentraciones de 100 micromolar, 10 micromolar, 1 micromolar, 500 nM, 100 nM y 0 micromolar. Se añadió solución madre del compuesto del ejemplo n.° 48a (10 mM en DMSO) a acetonitrilo al 50 % y agua al 50 % para preparar los patrones de adición. Se usaron patrones de adición para enriquecer las muestras de medios en blanco. Se añadieron 10 microlitros de patrón de adición enriquecido a 90 microlitros de medio para crear los patrones de medios enriquecidos. Se usaron patrones de medios de 10.000 nM, 1.000 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM y 0 nM para generar la curva patrón del compuesto del ejemplo n.° 48a.
Se trataron 50 microlitros de cada muestra de medio con 400 microlitros de la solución de extracción. La solución de extracción consiste en acetonitrilo/metanol (3:1). Las muestras de la curva patrón se extrajeron usando los mismos volúmenes y condiciones que las muestras de medios desconocidos. Las muestras extraídas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 min. Después de la centrifugación, se transfirieron 200 microlitros de cada sobrenadante de muestra a una placa limpia de 96 pocillos. Las muestras extraídas se analizaron mediante LC-MS de alta resolución. Se usaron el software Thermo Xcalibur y Quan Browser para generar la curva patrón y calcular los valores de concentración. Se usó un método de calibración externo para calcular la concentración del compuesto del ejemplo n.° 48a en las muestras de medios de cultivo.
Análisis por LC-MS
La cromatografía de alta resolución se realizó usando Thermo Ultimate UPLC y una columna Kinetex 2,1 * 50 mM C18 RP (partículas de 2,6 micrómetros). Las fases móviles consistieron en acetato de amonio 5 mM en H2O para el tampón A y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo para el tampón B. Se usó un gradiente lineal binario convencional para la cromatografía de fase inversa. Para este estudio se usó el espectrómetro de masas Thermo Q Exactive. El efluente de UPLC se dirigió al espectrómetro de masas Q Exactive que estaba equipado con una fuente de iones de ESI. El espectrómetro de masas se programó para funcionar en modo de barrido completo de alta resolución y modo MS2.
Sistema de prueba
Preparación de células para el lavado de LSC: el experimento de lavado se realizó por triplicado, donde cada muestra contenía 0,5 millones de células. Todas las muestras (solo medio, medio con células, suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a y células en medio suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a) se cultivaron en una incubadora a 37 grados durante el experimento. El medio utilizado para el experimento fue X-VIVO 15.
Las células se cultivaron hasta el pase 2 en medio X-VIVO-15 suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a 3 micromolar. Cuando el cultivo alcanzó una confluencia del 70 %, el medio se retiró mediante aspiración y se reemplazó con medio nuevo suplementado con compuesto del ejemplo n.° 48a 3 micromolar; las células se cultivaron durante seis días adicionales. El día siete, se generaron las siguientes muestras:
1. 2 ml de medio "blanco" (no suplementado con el compuesto)
2. 2 ml de medio cultivado en presencia del compuesto (prelavado)
3. 2 ml de medio para cada muestra de lavado 1-10
4. Sedimentos de células (posteriores al lavado)
Las células se recogieron usando el elevador de células Cell Lifter (Costar, n.° de cat. 3008).
Las muestras de medios y sedimentos de células se analizaron y cuantificaron mediante LC-MS de alta resolución. Para estimar los niveles residuales del compuesto del ejemplo n.° 48a, se recogieron sedimentos de células y sobrenadante. La cantidad de compuesto del ejemplo n.° 48a se determinó mediante LC-MS. Se resumen la estimación del compuesto del ejemplo n.° 48a, las concentraciones en el medio de prelavado, el medio de lavado (Tabla 4) y el sedimento de células (Tabla 5). Las muestras de medio de prelavado tienen los niveles más altos de compuesto del ejemplo n.° 48a (intervalo de aproximadamente 9.830 nM a 10.837 nM). Los niveles de sedimentos posteriores al lavado tienen niveles bajos, pero detectables, del compuesto del ejemplo n.° 48a (nanomolar).
Tabla 4: Estimación de concentraciones para el compuesto del ejemplo n.° 48a en el medio de prelavado y el medio de lavado
T l : E im i n n nr i n r l m l m l n.° 4 n l im n l l
La cantidad de compuesto del ejemplo n.° 48a en el medio de prelavado de tres incubaciones varía entre 9.830-10.838 nM. La concentración del compuesto del ejemplo n.° 48a en el sedimento de células posterior al lavado estaba en el intervalo de 19,9-20,8 nM.
Cantidad residual de otros compuestos de ejemplo después del lavado
Para los compuestos de los ejemplos números 12, 261 y 5, las cantidades residuales en LSC expandidas se midieron usando el mismo método que para el compuesto del ejemplo n.° 48a.
Tabla 6 Estimación de concentraciones ara el com uesto del e.12 en el sedimento de células
T l 7: E im i n n nr i n r l m l m l n ° 21 n l im n l l
T l : E im i n n nr i n r l m l m l n ° n l im n l l
Ejemplo C1: Aislam iento de células endoteliales corneales humanas
Se obtuvieron córneas humanas cadavéricas autorizadas para la investigación de bancos de ojos. La capa de células del endotelio corneal (CEC) y la membrana de Descemet (DM) se marcaron con un separador endotelial inverso de Sinsky de grado quirúrgico. La capa de células DM-endotelio se despegó cuidadosamente del estroma corneal y las células se disociaron de la DM usando 1 mg/ml de colagenasa a 37 °C hasta que el desprendimiento celular se hizo evidente mediante observación microscópica (de 45 minutos a 3 horas). Las células obtenidas de esta manera se usaron en los Ejemplos C1-C17 a continuación.
Ejemplo C2: Exposición de células a inhibidores de LATS y medición de la d istribución intracelular de YAP
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 en placas de 24 pocillos con fondo de vidrio y pared de color negro en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF (sin suero) endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 133 o el compuesto del ejemplo n.° 49 inhibidores de LATS a una concentración de 10 micromolar o suplementado en DMSO como control negativo. Las células se cultivaron en estas condiciones durante 24 horas a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para medir el efecto de los inhibidores de LATS sobre la YAP diana corriente abajo, se analizó la distribución de YAP intracelular mediante inmunohistoquímica. Se fijaron cultivos celulares con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 40C. El anticuerpo primario utilizado fue anti-YAP de Santa Cruz Biotechnology. Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se omitió el control negativo con anticuerpo primario (datos no mostrados). La fluorescencia se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
La inmunotinción de YAP es más fuerte en CEC expuestas a un medio de proliferación celular con el compuesto del ejemplo n.° 133 o del ejemplo 49 inhibidores de LATS como lo indica la tinción por inmunofluorescencia de YAP, como se muestra en la Figura 14. Por lo tanto, estos compuestos tuvieron un efecto sobre la localización intracelular de la YAP diana corriente abajo.
Ejemplo C3: Exposición de células a inhibidores de LATS y medición de la fosforilación de YAP
Se separaron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 de la placa de cultivo con 1 mg/ml de colagenasa durante 15 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se sembraron en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) en placas de 6 pocillos (Corning) y se cultivaron durante 2 a 4 días. Después, el medio se reemplazó por medio de cultivo de células endoteliales corneales nuevo (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) suplementado con inhibidor de LATS, compuesto del ejemplo n.° 133 o del ejemplo n.° 49 (diluido en DMSO) a una concentración de 10 micromolar o como DMSO de control negativo solo sin compuesto. Las células se cultivaron en estas condiciones durante 1 hora a 37 °C en CO2 al 5 %.
Se obtuvieron sedimentos de células mediante disociación con tripsina y centrifugación y se lavaron con PBS. Los sedimentos se lisaron con 30 micromolar de tampón de lisis RIPA que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Life Technologies) durante 30 minutos, con agitación vorticial cada 10 minutos. Después, los residuos celulares se sedimentaron a 4 °C durante 15 minutos a 14.000 rpm y se recogió el lisado de proteínas. La concentración de proteínas se cuantificó usando un kit micro BCA (Pierce). Se cargaron quince (15) microgramos de proteína total en cada pocillo de geles de TGX al 4-20 % (BioRad) y se realizó una transferencia Western de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se sondaron con anticuerpo contra fosfo-YAP (ser127) (CST, 1:500) o Yap total (Abnova, 1:500) y se usó el marcaje con actina (Abcam) como control de carga. Las membranas se tiñeron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, se aclararon y se tomaron imágenes usando un sistema ChemiDoc (Biorad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El análisis por transferencia Western mostró que ambos compuestos del ejemplo n.° 133 y del ejemplo n.° 49 provocaron una reducción en los niveles de fosforilación de YAP en CEC humanas. Se observó una marcada diferencia después de una hora de tratamiento con el compuesto del ejemplo n.° 133 y del ejemplo n.° 49 en CEC humanas, como se muestra mediante transferencia Western en la Figura 15a. La Figura 15b muestra mediante representación gráfica los niveles de YAP fosforilada normalizados a beta-actina y la Figura 15c muestra los niveles de yAp fosforilada normalizados a YAP total.
Estos resultados sugieren que los compuestos del ejemplo n.° 133 y del ejemplo n.° 49 inhibidores de LATS pueden activar la señalización de YAP en CEC humanas.
Ejemplo C4: Expansión de la población de células endoteliales corneales humana y medición de la densidad celular
Se separaron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 de la placa de cultivo con 100 microlitros de Accutase (ThermoFisher) durante 10 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se sembraron en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) en placas de 6 pocillos (Corning) suplementadas con el compuesto del ejemplo n.° 133 o del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS (diluido en DMSO) a una concentración de 10 micromolar o como DMSO de control negativo solo sin compuesto. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para medir la proliferación celular, se usó una máquina Incucyte siguiendo las instrucciones del fabricante (Essen Biosciences) para realizar un análisis cuantitativo en tiempo real de la confluencia celular de células vivas cada 3 horas durante 10 días.
La Figura 16 muestra el porcentaje de confluencia de la población celular a lo largo del tiempo después de la exposición al inhibidor de LATS o DMSO solo. Aunque las CEC humanas normalmente no son proliferativas, los resultados muestran que ambos compuestos del ejemplo n.° 133 y del ejemplo n.° 49 inhibidores de LATS podrían activar la proliferación en estas células.
Ejemplo C5: Expansión de la población de células endoteliales corneales humana y medición de la densidad celular
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 en placas de 48 pocillos (Corning) en medio X-VIVO15 suplementado con inhibidores de LATS como se enumeran en las Tablas 9 y 10 (diluidos en DMSO) a una concentración de 10 micromolar o como DMSO de control negativo solo sin compuesto. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para cada compuesto, se generaron dos conjuntos de cultivos. Un primer conjunto de cultivos se fijó en PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente después de que las células aisladas de la córnea se hubieran adherido a la placa de cultivo celular (normalmente 24 h después del cultivo en placas celulares). Se fijó un segundo conjunto de cultivos en PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente 10 días después del primero.
Para medir la densidad celular en todos los cultivos fijados, se contó el número de núcleos teñidos con Sytox Orange (ThermoFisher) por área de superficie de la siguiente manera: los cultivos celulares fijados se permeabilizaron en una solución de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich). Después, las células se marcaron en una solución de 0,5 micromolar de Sytox Orange en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se contaron bajo un microscopio de epifluorescencia Zeiss. Después se determinó el factor de expansión calculando la relación entre la población expandida de células y la población de células sembradas.
La expansión de poblaciones celulares conseguida con los compuestos probados se muestra en las Tablas 9 y 10 a continuación.
Tabla 9: Multiplicación de expansión de células
Tabla 10: Densidad de células endotelialesin vitrocélulas/mm2 de área
Ejemplo C6: inactivación de ARNip de LATS1 y LATS2 en células endoteliales corneales humanas
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 en placas de 24 pocilios (Corning) en medio X-VIVO15 (Lonza). Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 %. Se inactivaron LATS1 y LATS2 mediante transfección (lipofección, usando RNAiMax, Thermofisher). Cada pocillo de la placa de cultivo celular se transfectó con 0,5 microgramos de conjuntos de 4 ARNip dirigidos a cada gen. Los ARNip utilizados en este estudio fueron el ARNip de LATS1 SI00067172 y el ARNip de LATS2 SI00106925 de Qiagen. Se usaron ARNip codificados como controles negativos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen).
Para medir la proliferación celular, la tinción con EdU se realizó 48 horas después de la transfección con ARNip de LATS1 y LATS2 o controles de ARNip revueltos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Los núcleos celulares se marcaron con Sytox Orange. La fluorescencia de EdU y Sytox Orange se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 para medir el porcentaje de núcleos celulares positivos para EdU.
La Figura 17 muestra que el porcentaje de CEC positivas para EdU aumentó tras la inactivación de LATS1 y LATS2, lo que muestra que la inactivación de LATS conduce a la proliferación de CEC.
Ejemplo C7: Expansión de la población de células endoteliales corneales humanas y observación inmunohistoquím ica de la morfología celular
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 en placas de 24 pocillos (Corning) en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS (diluido en DMSO) a una concentración de 10 micromolar o suplementado con un control negativo de DMSO sin compuesto. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 10 días.
Para observar que la población celular expandida tiene la morfología celular requerida para su usoin vivo,se midió mediante inmunohistoquímica la capacidad de las células para formar uniones estrechas de la siguiente manera. Se fijaron cultivos celulares con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución de bloqueo de Triton X-100 al 0,3% (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3% en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. El anticuerpo primario utilizado fue ZO-1 de Invitrogen. Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicó el anticuerpo secundario originado en burro Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces en PBS y los núcleos (ADN) se tiñeron con Sytox Orange (567 nm, Life Technologies). Se omitió el control negativo con anticuerpo primario (datos no mostrados). La fluorescencia se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Las CEC proliferaron en presencia de medio y el control de DMSO muestra signos de polimegatismo característico de las CEC disfuncionales (Figura 18A). Las CEC expuestas a un medio de proliferación celular con el ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS conservaron una morfología de células endoteliales corneales normales y la capacidad de formar uniones estrechas como lo indica la tinción por inmunofluorescencia del marcador de uniones estrechas Zonula Occludens-1 (ZO-1), como se muestra en Figura 18B. Tanto la morfología normal de las células endoteliales corneales como la capacidad de formar uniones estrechas son cruciales para el mantenimiento de las funciones del endotelio corneal.
Ejemplo C8: Expansión de la población de células endoteliales corneales humana y medición de los marcadores Colágeno 8a2, AQP1, SLC4A11, RPE65, CD31 y Na/K ATPasa.
Para verificar que la población celular expandida expresa genes normalmente expresados por células endoteliales cornealesin vivo,se cultivaron células y después se realizó un análisis por RT-PCR para medir los niveles de expresión de Colágeno 8a2, AQP1, SLC4A1 1, RPE65 y CD31. También se realizó un análisis inmunohistoquímico para analizar los niveles de Na/K ATPasa y Colágeno 8a2 de la siguiente manera.
Se sembraron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 en placas de 24 pocillos (Corning) en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS (diluido en DMSO) a una concentración de 10 micromolar o suplementado con un control negativo de DMSO sin compuesto. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante l0 días. Para el control negativo, se cultivaron fibroblastos dérmicos (Lonza) en DMEM-F12 (LifeTechnologies) sin inhibidores de LATS.
Para realizar el análisis por RT-PCR, se extrajo el ARN total usando Trizol (Invitrogen), RNeasy Mini y QIA Shredder (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad y cantidad del ARN se midieron usando Nanodrop 100 (Thermo-Fisher Scientific) y Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). El ADNc se preparó mediante transcripción inversa y la expresión relativa del ARNm se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa usando un sistema 7900HT (Applied Biosystems). Se utilizaron los siguientes parámetros cíclicos:
1) 50 °C durante 2 minutos; 2) 95 °C durante 10 minutos; 3) 95 °C durante 15 segundos 4) 60 °C durante 1 minuto. Las etapas 3 y 4 se repitieron 40 veces.
Se midieron los niveles de ARNm de actina y se usaron como controles endógenos para normalizar los niveles de expresión génica y calcular los valores de delta Ct de acuerdo con la fórmula dCt = Ct para el gen de interés - Ct para el control endógeno. Los cebadores se obtuvieron de Applied Biosystems.
El análisis por RT-PCR como se muestra en la Figura 19 indica que una población de células endoteliales corneales expandida con el compuesto del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS expresa genes normalmente expresados por células endoteliales cornealesin vivo,incluyendo Colágeno 8a2, AQP1, SLC4A11. Las células no expresan marcadores de otros epitelios presentes en el ojo, incluyendo RPE65 (un marcador del epitelio pigmentado retiniano) y CD31 (un marcador del epitelio vascular).
Para comprobar la expresión de Na/K ATPasa y Colágeno 8a2 mediante inmunohistoquímica, los cultivos celulares se fijaron con PFA al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron y bloquearon en una solución bloqueadora de Triton X-100 al 0,3 % (Sigma-Aldrich) y suero de burro al 3 % en PBS durante 30 minutos. Después, las células se marcaron con anticuerpos primarios en la solución de bloqueo durante 12 horas a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron Na/K ATPasa y Colágeno 8a2 (Santa Cruz Biotechnology). Las muestras se lavaron en PBS tres veces y se aplicaron anticuerpos secundarios originados en burros Alexa Fluor 488 o 647 (Molecular Probes) a una dilución 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces en PBS y los núcleos (ADN) se tiñeron con Sytox Orange (567 nm, Life Technologies). A los controles negativos se les omitió el anticuerpo primario o el anticuerpo de control de isotipo (datos no mostrados). La fluorescencia se observó usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
El análisis inmunohistoquímico como se muestra en la Figura 20 indica que una población de células endoteliales corneales expandida con el compuesto del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS expresa genes normalmente expresados por células endoteliales cornealesin vivo,incluyendo Na/K ATPasa (Figura 20a) y Colágeno 8a2 (Figura 20b).
Ejemplo C9: Expansión de la población de células endoteliales corneales humana y medición de los marcadores CD44, CD105, CD166 y CD73
Para verificar que la población de células expandidas no experimenta una transición de endoteliales a mesenquimáticas, se cultivaron CEC de la siguiente manera y después se realizó un análisis por FACS para analizar los niveles de CD44, CD105, CD166 y CD73.
Para generar cultivos de CEC maduras, las células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 se sembraron en placas en X-VIVO15 suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a inhibidor de LAT<s>(diluido en DMSO) a una concentración de 3 micromolar. Las células se cultivaron en placas de 48 pocillos (corning) a 37 °C en CO2 al 5 % durante dos semanas. Se hicieron pases de las células dos veces durante este tiempo separando las células con 1 mg/ml de colagenasa durante 15 minutos a 37 °C, aclarando las suspensiones celulares mediante centrifugación y sembrando en medio nuevo. Después, estas células se cultivaron en medio XVIVO sin inhibidor de LATS durante 2 semanas más.
Para medir los niveles de CD44, CD105, CD166 y CD73 mediante FACS, las CEC se trataron con Accutase (ThermoFisher, N.° de Cat. A1 110501) durante 20 minutos en CO2 al 5 % a 37 °C. La reacción se detuvo usando medio de cultivo celular que contenía suero al 10 % y se transfirió a un tubo Falcon para una etapa de centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de aspirar, las células del medio se resuspendieron en 200 microlitros de tampón FACS (PBS/FBS al 10 %).
Se añadieron anticuerpos contra CD44, CD105, CD166 y CD73 (BD Biosciences) a la suspensión celular y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron 3 veces después del marcaje con anticuerpo con tampón de FACS y se resuspendieron en 500 microlitros en tampón de FACS. Antes de la clasificación por FACS, las células se filtraron a través de un filtro de 70 micrómetros y se almacenaron en hielo hasta su clasificación. Las células se clasificaron en un instrumento BD FACSAria II. Los datos de FACS se analizaron usando el software BD FACSDiva.
El análisis por FACS como se muestra en la Figura 21 indica que el perfil de expresión del marcador de FACS de la población celular expandida en presencia del inhibidor de LATS es diferente del perfil de expresión del marcador de FACS de células que han experimentado una transición de endoteliales a mesenquimáticas. Específicamente, las células cultivadas en presencia del inhibidor de LATS expresan niveles más bajos de CD44,<c>D73, CD105 y CD166 en comparación con las células cultivadas en ausencia del inhibidor de LATS. Es importante destacar que CD73 es un marcador de transición de endoteliales a mesenquimáticas, por lo tanto, estos resultados indican que las CEC cultivadas en presencia de inhibidores de LATS no experimentan una transición de endoteliales a mesenquimáticas.
Ejemplo C10: Bioimpresión celular: Preparación de GelMA
Síntesis de GelMA
Se sintetizó metacrilato de gelatina (GeIMA) con aproximadamente el 100% de los residuos de Lys metacrilados de acuerdo con un protocolo publicado anteriormente (Nichol, J. W.et al. Biomaterials,2010, págs. 5536-5544). Se disolvieron 20 gramos de gelatina derivada de porcino (N.° de Cat. G2500, Sigma) durante la noche a 50 °C en 200 ml de PBS sin calcio ni magnesio (DPBS, N.° de Cat. 21-031, Corning). Con fuerte agitación, se añadió gota a gota anhídrido metacrílico (N.° de Cat. 276685, Sigma) (aproximadamente 1 ml/min) a la solución de gelatina para alcanzar la concentración del 8 % (vol/vol). La mezcla se agitó a 60 °C en un baño de aceite durante 3 horas antes de añadir 200 ml de DPBS y después se mezcló minuciosamente durante 15 minutos más. La mezcla diluida se purificó mediante diálisis frente a agua Milli-Q (se usó tubo de diálisis Spectra/Por de PCPM de 15 kDa) durante 1 semana a 45 °C para retirar el ácido metacrílico. Las muestras purificadas se liofilizaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Se usó 1H RMN (400 MHz, D2O, 35 °C) para determinar el grado de metacrilación para una solución de GeIMA de 15 mg/ml. Se encontró que la relación de área del pico de Phe a metacrilamida era de 1,00:0,82 comparando el área del multiplete a 7,25-7,50 ppm (se supone que son protones de Phe, 5H por cada Phe en GeIMA) con la suma de las áreas de cuatro singletes a 5,47 ppm, 5,51 ppm, 5,71 ppm y 5,76 ppm (se supone que son protones de vinilo, 2H por cada metacrilamida en GeIMA). Se determinó que la relación molar de Phe:Lys en la gelatina utilizada en esta reacción era de 1,00:2,06 mediante análisis de aminoácidos. Por lo tanto, la relación molar de Phe:Lys:metacrilamida en GelMA es de 1,00:2,06:2,05. Suponiendo que el sitio principal de metacrilación de la gelatina está en los restos de Lys, el análisis por 1H RMN indica que el grado de metacrilación es del -100 % (2,05/2,06 x 100 % = 99,5 %).
Se prepararon soluciones madre de GelMA y LAP en DPBS, se ajustó el pH, se esterilizaron por filtración y se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior como se describe a continuación. El siguiente protocolo ejemplifica la preparación de una solución madre de GelMA al 15% p/v y LAP al 0,15% p/v, pero se prepararon otras concentraciones siguiendo un procedimiento idéntico. Para preparar una solución madre de GelMA al 15% p/v, se disolvieron 1,5 gramos del GelMA liofilizada preparada como se describió anteriormente en 10 ml de DPBS precalentado a 37 °C. Después de que la GelMA se disolviese totalmente, se introdujo el fotoiniciador añadiendo a la solución de GelMA 15 mg de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP), lo que dio como resultado una solución madre que contenía GelMA al 15 % p/v y LAP al 0,15 % p/v. LAP se sintetizó usando un procedimiento publicado(Biomaterials2009, 30, 6702-6707). Se añadieron 500 microlitros de NaOH 1 N (n.° de catálogo BDH-7222-1, VWR) a la solución para ajustar el pH a neutro antes de filtrar la solución usando membranas estériles de 0,22 micrómetros (Millipore). El filtrado final se separó en alícuotas de 500 ul y se almacenó a 4 °C hasta su uso posterior.
Ejemplo C11: Bioimpresoras: diseño y funcionamiento
Para desarrollar una terapia celular en la que la ubicación del suministro de células se controle con precisión, se usa una tecnología de bioimpresión para colocar con precisión las CEC en el lado posterior de la córnea.
Los experimentos de bioimpresión se realizaron en cubreobjetos de vidrio usando células HEK293. Se cultivaron células HEK293 marcadas con proteína fluorescente roja hasta confluencia en placas de cultivo de 6 pocillos en DMEM-F12 con suero bovino fetal al 5%. Después, las células se separaron de la placa de cultivo con 100 microlitros de TripLE (Invitrogen) durante 10 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se resuspendieron en DMEM-F12 a una concentración de 80 millones de células por ml.
Se diseñó una primera bioimpresora basada en tecnología de proyección dinámica de luz (DLP) y el esquema del sistema se ilustra en la Figura 26. El sistema consiste en cinco componentes principales: 1. Una fuente de luz UVA (365 nm, S2000, EXPO); 2. Un dispositivo de matriz de microespejos digitales (DMD, DLP-07 XGA; Texas Instruments) para modular la luz y generar patrones de luz; 3. Un sistema óptico para proyectar el patrón de luz hacia la muestra; 4. Unaplataforma automatizada para moverse en los tres ejes de forma sincronizada con los correspondientes patrones de luz generados por el DMD; 5. Un ordenador que alimenta la imagen del chip de DMD fluye y controla todos los componentes.
Para la bioimpresión, se preparó una mezcla de células HEK293/biomatriz mezclando 50 microlitros de la solución madre de GelMA al 15 % que contenía LAP al 0,15 % con el mismo volumen de suspensión de células HEK293 para alcanzar una densidad celular final de 40 millones por ml. Después, la mezcla de células/GelMA se añadió al centro de un cubreobjetos de vidrio y se polimerizó en la forma de la letra "e" aplicando una máscara de luz UVA de 365 nm durante 30 segundos. Después, se obtuvieron imágenes usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Los resultados mostraron que las construcciones cargadas de células podían bioimprimirse con precisión en la forma de la letra "e" (los resultados reales se muestran en la parte inferior izquierda de la Figura 26: la "e"). Esto indicó que la tecnología de bioimpresión podría permitir un control preciso de la ubicación del suministro de células.
Para facilitar el trabajo con animalesin vivo,la tecnología central de la bioimpresora descrita anteriormente se convirtió en un diseño portátil compacto de la siguiente manera. Un cabezal emisor de luz estaba compuesto por un emisor de LED de alta potencia (365 nm, LED Engin) y una lente asférica para proporcionar un haz de luz colimado. El cabezal emisor de luz se construyó en una carcasa de aluminio personalizada para una mejor disipación del calor. Una batería recargable, un interruptor de encendido y otros dispositivos electrónicos se alojaron en un mango de plástico impreso en 3D, que se ensambló junto con el cabezal emisor de luz mediante un pivote para permitir más libertad para girar el cabezal. Los adaptadores impresos en 3D permitieron acoplar guías de luz de diferentes dimensiones a los cabezales para controlar el tamaño del área de iluminación. Inspirándose en el sistema basado en DMD, este dispositivo portátil puede utilizar máscaras impresas en una lámina transparente adherida a la parte frontal del cabezal para generar un patrón de luz personalizado para controlar la fotopolimerización.
Ejemplo C12: Bioimpresión de construcciones cargadas de células en el lado posterior de la córnea humanaex vivo
Para determinar si el dispositivo portátil de bioimpresión permitiría el posicionamiento preciso de las células en el lado posterior de la córnea humana, se realizaron experimentos de bioimpresiónex vivousando células HEK293 y córneas humanas obtenidas de bancos de ojos. Se cultivaron células HEK293 marcadas con proteína fluorescente roja hasta confluencia en placas de cultivo de 6 pocillos en DMEM-F12 con suero bovino fetal al 5 %. Después, las células se separaron de la placa de cultivo con 100 microlitros de TripLE (Invitrogen) durante 10 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se resuspendieron en DMEM-F12 a una concentración de 80 millones de células por ml.
Para la bioimpresión, se preparó una mezcla de células HEK293/biomatriz mezclando 50 microlitros de la solución madre de GelMA al 15 % que contenía LAP al 0,15 % con el mismo volumen de suspensión de células HEK293 para alcanzar una densidad celular final de 40 millones por ml.
Después, la mezcla de células/GelMA se añadió al centro de un cubreobjetos de vidrio y se polimerizó en la forma de la letra "e" aplicando una máscara de luz UVA de 365 nm durante 30 segundos. Después, se obtuvieron imágenes usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Las córneas de donantes humanos obtenidas de bancos de ojos se retiraron de su solución de almacenamiento (Optisol) y se aclararon brevemente con DPBS. Bajo el microscopio de disección, se raspó cuidadosamente la membrana de Descement antes de aclarar adicionalmente las córneas con DPBS. Después se colocó una córnea sobre una tapa de plástico de una placa de Petri de 35 mm con la superficie interna hacia arriba. Se preparó una mezcla nueva de células/biomatriz mezclando 50 microlitros de la solución madre de GelMA al 15 % que contenía LAP al 0,15 % con el mismo volumen de suspensión de células HEK-293-RFP para alcanzar la densidad celular final de 40 millones por ml. Después, la mezcla de células/GelMA se añadió al centro de la córnea y después se aplicó un soporte de plástico de forma convexa para formar una cámara cerrada que imitaba la cámara anterior del ojo. Después, toda la construcción se volteó cuidadosamente y se usó el dispositivo de bioimpresión portátil para proyectar un patrón circular de 5,5 mm de diámetro de luz UVA de 365 nm a través de la córnea durante 30 segundos. Se esperaba que este patrón de luz ultravioleta polimerizase la mezcla de células/GelMA en la forma de un disco adherido al lado posterior de la córnea. Para determinar si esto ocurrió, se separó la córnea de la tapa, se aclaró cualquier material no polimerizado y no adherido pipeteando DPBS en el lado posterior de la córnea y se obtuvieron imágenes usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Los resultados muestran que después de aclarar el material no polimerizado y no adherido, se conservó un patrón circular de células marcadas con proteínas fluorescentes rojas en el lado posterior de la córnea (Figura 27). Esto confirmó que se podrían bioimprimir células en la parte posterior de la córnea mediante el uso de un dispositivo portátil que proyecta luz UVA de 365 nm a través de la córnea.
Ejemplo C13: Bioimpresión de construcciones cargadas de células en el lado posterior de la córnea de conejo in vivo
Preparación de CEC
Se separaron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 de la placa de cultivo con 100 microlitros de Accutase (ThermoFisher) durante 10 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se sembraron en X-VIVO15 suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a inhibidor de LATS (diluido en DMSO) a una concentración de 3 micromolar. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos (Corning) a 37 °C en CO2 al 5 % durante dos semanas. Se hicieron pases de las células dos veces durante este tiempo separando las células con 1 mg/ml de colagenasa durante 15 minutos a 37 °C, aclarando las suspensiones celulares mediante centrifugación y sembrando en medio nuevo. Después, estas células se cultivaron en medio XVIVO sin inhibidor de LATS durante 2 semanas más para crear CEC maduras.
Para preparar CEC para la bioimpresión dentro del ojo de conejo, se generó una mezcla de células/biomatriz mezclando 15 microlitros de la solución madre de GelMA al 15 % que contenía LAP al 0,15 % con 30 microlitros de suspensión de CEC para alcanzar la densidad celular final de 0,625 millones por ml a 25 millones por ml. Después se añadió la mezcla de células/GelMA al centro de la córnea.
Modelo en conejo de deficiencia de células endoteliales corneales
La deficiencia de células endoteliales corneales se creó unilateralmente en el ojo derecho de conejos NZA raspando todo el endotelio de la córnea con una aguja con punta de silicona. La cámara anterior se aclaró usando una cánula de aspiración para retirar los residuos flotantes. Se inyectaron cuarenta microlitros de mezcla de células/GelMA recién preparada en la cámara anterior y se siguió una exposición a rayos UVA de 365 nm durante 30 segundos usando la bioimpresora portátil equipada con una guía de luz de 3 mm a aproximadamente 1 cm de distancia de la superficie ocular. Se realizó un aclarado suave usando una cánula pequeña para inyectar 500 microlitros de solución salina equilibrada suplementada con heparina para retirar el material no polimerizado y las células flotantes. El ojo izquierdo de cada conejo se dejó intacto y sirvió como control. Después del suministro de células, los conejos recibieron tratamiento analgésico (Tramadol 10 mg/kg VO dos veces al día en las primeras 2 semanas, Meloxicam 0,3 mg/kg VO SID en las primeras 2 semanas o mientras el animal mostrase signos de malestar ocular), tratamiento antiinflamatorio (Ancef®(cefazolina) 50 mg sub-Tenon inmediatamente después del procedimiento, Tobrex® solución oftálmica tres veces al día en la 1.a semana y dos veces al día a partir de entonces, ampicilina 80 mg/kg/día (40 mg dos veces al día) SC durante la primera semana) e inmunosupresión (Ciclosporina A (0,5 %) ocular tópica tres veces al día la 1.a semana y dos veces al día a partir de entonces, Gentocin®-durafilm® (Sulfato de gentamicina y betametasona, MERCK) ocular tópica tres veces al día la 1.a semana y dos veces al día a partir de entonces, Ciclosporina A (5 mg/kg/día) SC en la 1.a semana y después A dosis a partir de entonces).
Los conejos se sacrificaron tres semanas después del suministro de células, las córneas se diseccionaron y se fijaron en PFA al 4 %. Se realizó inmunohistoquímica para detectar la presencia de antígeno nuclear humano (Millipore) para confirmar la presencia de células humanas y ZO-1 (Invitrogen) para determinar si las CEC bioimpresas podían formar las uniones estrechas observadas en un endotelio corneal normal. Después, se obtuvieron imágenes usando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
Los resultados indicaron que en conejos experimentales, la estructura del endotelio corneal puede detectarse mediante inmunohistoquímica de ZO-1 (Figura 28, panel A). En el ojo derecho de un conejo en el que se extirpó quirúrgicamente el endotelio corneal y no se bioimprimieron CEC, la tinción con ZO-1 está ausente, lo que indica una ausencia de endotelio corneal de estructura normal (Figura 28, panel B). En el ojo derecho de un conejo en el que se extirpó quirúrgicamente el endotelio corneal y se bioimprimieron c Ec , la tinción con ZO-1 está presente, lo que indica que se ha reconstruido una estructura de endotelio corneal (Figura 28, panel C).
Se usó tinción con antígeno nuclear humano para confirmar que las células que reconstruyeron el endotelio corneal en la Figura 28, panel C son las CEC humanas suministradas mediante bioimpresión. La Figura 28, paneles D y E muestran que la inmunotinción con antígeno nuclear humano está ausente en ojos que no recibieron ninguna CEC humana. Por el contrario, las células positivas para el antígeno nuclear humano cubren el campo de imagen en los ojos en los que se bioimprimieron CEC humanas (Figura 28, panel F), lo que indica que la estructura del endotelio corneal marcada con ZO-1 que se muestra en la Figura 28, panel C está compuesta por las CEC humanas bioimpresas en el lado posterior de la córnea de conejo.
Ejemplo C14: Bioimpresión de construcciones cargadas de células de formas altamente personalizables en el lado posterior de la córnea humanaex vivo
Las córneas de donantes humanos obtenidas de bancos de ojos se retiraron de su solución de almacenamiento (Optisol) y se aclararon brevemente con DPBS. Bajo el microscopio de disección, se raspó cuidadosamente la membrana de Descement antes de aclarar adicionalmente las córneas con DPBS. Después se colocó una córnea sobre una tapa de plástico de una placa de Petri de 35 mm con la superficie interna hacia arriba.
Se preparó una mezcla nueva de células/biomatriz mezclando 50 |jl de la solución madre de GelMA al 15%que contenía LAP al 0,15 % con el mismo volumen de suspensión de células HEK-293-RFP para alcanzar la densidad celular final de 40 millones por ml. Después, la mezcla de células/GelMA se añadió al centro de la córnea y después se aplicó un soporte de plástico de forma convexa para formar una cámara cerrada que imitaba la cámara anterior del ojo. Después se volteó cuidadosamente toda la construcción y se usó el dispositivo de bioimpresión de DLP mencionado en el Ejemplo C11 para proyectar patrones personalizables de luz UVA de 365 nm a través de la córnea durante 7,5 segundos. Después se aclaró con DPBS cualquier material no polimerizado y no adherido en el lado posterior de la córnea y se obtuvieron imágenes usando un estereomicroscopio de fluorescencia Zeiss.
Para demostrar la reproducibilidad y personalización de la tecnología de bioimpresión de los presentes inventores, se proyectaron sobre las muestras patrones de luz en el diseño de diferentes letras, que pueden reconocerse fácilmente. Los resultados (Figura 29) muestran que pueden bioimprimirse construcciones personalizables cargadas de células con alta precisión en el lado posterior de la córnea determinadas por los patrones de luz a través de la córnea.
Ejemplo C15: Estudio de estimación de compuestos residuales
Preparación de curva patrón
Se realizó una serie de diluciones de patrones de solución madre a concentraciones de 30 micromolar, 3 micromolar, 300 nM, 30 nM, 3 nM, 0,3 nM y 0 micromolar. Se añadió solución madre del compuesto del ejemplo 48a (10 mM en DMSO) a acetonitrilo al 50 % y agua al 50 % para preparar los patrones de adición. Se usaron patrones de adición para enriquecer las muestras de medios en blanco. Se añadieron 10 microlitros de patrón de adición enriquecido a 90 microlitros de medio para crear los patrones de medios enriquecidos. Se usaron patrones de medios de 3000 nM, 300 nM, 30 nM, 3 nM, 300 pM, 30 pM y 0 nM para generar la curva patrón del compuesto del ejemplo n.° 48a.
Se trataron 50 microlitros de cada muestra de medio con 300 microlitros de la solución de extracción. La solución de extracción consiste en acetonitrilo/metanol (3:1). Las muestras de la curva patrón se extrajeron usando los mismos volúmenes y condiciones que las muestras de medios desconocidos. Las muestras extraídas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 min. Después de la centrifugación, se transfirieron 200 microlitros de cada sobrenadante de muestra a una placa limpia de 96 pocillos. Las muestras extraídas se analizaron mediante LC-MS de alta resolución. Se usaron el software Thermo Xcalibur y Quan Browser para generar la curva patrón y calcular los valores de concentración. Se usó un método de calibración externo usando escalado lineal log-log para calcular la concentración del compuesto del ejemplo n.° 48a en las muestras de medios de cultivo.
Análisis por LC-MS
La cromatografía de alta resolución se realizó usando Thermo Ultimate UPLC y una columna Kinetex 2,1 * 50 mM C18 RP (partículas de 2,6 micrómetros). Las fases móviles consistieron en acetato de amonio 5 mM en H2O para el tampón A y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo para el tampón B. Se usó un gradiente lineal binario convencional para la cromatografía de fase inversa. Para este estudio se usó el espectrómetro de masas Thermo Q Exactive. El efluente de UPLC se dirigió al espectrómetro de masas Q Exactive que estaba equipado con una fuente de iones de ESI. El espectrómetro de masas se programó para funcionar en modo de barrido completo de alta resolución. Se usaron cromatogramas de iones extraídos para la integración cromatográfica.
Sistema de prueba
Preparación de células para el lavado de CEC: el experimento de lavado se realizó por triplicado, donde cada muestra contenía 0,5 millones de células. Todas las muestras (solo medio, medio con células, suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a y células en medio suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a) se cultivaron en una incubadora a 37 grados durante el experimento. El medio utilizado para el experimento fue X-VIVO 15 (Lonza, n.° de cat. 04-744Q).
Las células se cultivaron hasta el pase 2 en medio X-VIVO-15 suplementado con 3 micromolar del compuesto del ejemplo n.° 48a. Tras alcanzar la confluencia, el medio se retiró mediante aspiración y se reemplazó por medio nuevo no suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a. Las células se cultivaron durante una semana adicional en ausencia del compuesto del ejemplo n.° 48a. Después de una semana de cultivo en ausencia del compuesto, el medio se retiró mediante aspiración, se renovó con el medio sin el compuesto y se continuó el cultivo celular en ausencia del compuesto durante otros seis días. El día 7, se generaron las siguientes muestras:
5. 2 ml de medio "blanco" (no suplementado con el compuesto)
6. 2 ml de medio cultivado en presencia del compuesto (prelavado)
7. 2 ml de medio para cada muestra de lavado 1-10
8. Sedimentos de células (posteriores al lavado)
Las células se recogieron usando el Cell Lifter (Costar, n.° de cat. 3008).
Las muestras de medios y sedimentos de células se analizaron y cuantificaron mediante LC-MS de alta resolución. Para estimar los niveles residuales del compuesto del ejemplo n.° 48a, se recogieron sedimentos de células y sobrenadante. La cantidad de compuesto del ejemplo n.° 48a se determinó mediante LC-MS. Se resumen la estimación del compuesto del ejemplo n.° 48a, las concentraciones en el medio de prelavado, el medio de lavado (Tabla 11) y el sedimento de células (Tabla 12). Las muestras de medio de prelavado tienen los niveles más altos de compuesto del ejemplo n.° 48a (intervalo de aproximadamente 35 nM a 122 nM). Los niveles de sedimentos posteriores al lavado tienen niveles bajos, pero detectables, del compuesto del ejemplo n.° 48a (picomolar).
Tabla 11: Estimación de concentraciones para el compuesto del ejemplo n.° 48a en el medio de prelavado y el medio de lavado
Tabla 12: Estimación de concentraciones ara el com uesto del eem lo n.° 48a en el sedimento de células
La cantidad de compuesto del ejemplo n.° 48a en el medio de prelavado de tres incubaciones varía entre 35,344 121,863 nM. La cantidad promedio de compuesto del ejemplo n.° 48a en el sedimento de células era de 0,75 picogramos para 500.000 células.
Ejemplo C16: Reducción del rechazo inmunitario mediante la supresión mediada por AAV del gen de beta-2-m icroglobulina en LSC
Diseño de vector de AAV:
El mapa de vector que se muestra en la Figura 30 proporciona el diseño del vector de AAV utilizado para expresar el sistema CRISPR en LSC. El vector expresó Cas9 deStaphylococcus aureus(Ranet al., Nature.9 de abril de 2015; 520(7546):186-191) y un ARN guía específico de B2M insertado en el sitio de restricción Aar I.
Transducción celular: Las LSC obtenidas como se describe en el Ejemplo B1 se cultivaron en medio X-VIVO15 suplementado con el compuesto del ejemplo n.° 48a inhibidor de LAT<s>. Las LSC se transdujeron en suspensión inmediatamente después del aislamiento de córneas humanas o después del aislamiento, unión y expansión en el compuesto inhibidor de LATS hasta una confluencia del 50-60 % en una placa de Petri de 35 mm ocho días después del aislamiento de las LSC. Las LSC se transdujeron a una MOl (multiplicidad de infección, por sus siglas en inglés) de 10.000, 50.000, 100.000 o 200.000. Las partículas de vector se diluyeron en un tampón compuesto por IxPBS Pluronic al 0,001 % y se pipetearon en la placa de cultivo. El tampón de almacenamiento de partículas víricas solo representó el control negativo de la transducción. Las células se cultivaron durante 72 horas en una incubadora de CO2 al 5 % antes de realizar la clasificación y el análisis por FACS.
Análisis por FACS:
Las LSC se trataron con Accutase (ThermoFisher, N.° de Cat. A1 110501) durante 20 minutos en CO2 al 5 % a 37 °C. Después de raspar las células, la reacción 5 se detuvo usando medio de cultivo celular que contenía suero al 10 % y se transfirió a un tubo Falcon para una etapa de centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de aspirar, las células del medio se resuspendieron en 200 microlitros de tampón FACS (PBS/FBS al 10 %).
Para analizar la expresión de B2M y HLA-ABC, se añadieron 5 microlitros de anticuerpo anti-Beta2-microglobulina humana de ratón APC (Biolegend, n.° de cat. 316312) y 20 microlitros de anticuerpo anti-HLA-ABC humano de ratón PE (BD Bioscience, n.° de cat. 560168) a la suspensión celular y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron 3 veces después del marcaje con anticuerpo con tampón de FACS y se resuspendieron en 500 microlitros en tampón de FACS.
Antes de la clasificación por FACS, las células se filtraron a través de un filtro de 70 micrómetros y se almacenaron en hielo hasta su clasificación. Para evitar que las células se adhieran a la pared, los tubos de recogida se llenaron con el suero durante 30 minutos antes de la clasificación. Las células se clasificaron en un instrumento BD FACSAria II en 20 tubos de recogida preparados, usando medio de LSC enriquecido con suero humano. Los datos de FACS se analizaron usando el software BD FACSDiva.
Los resultados presentados en la Figura 31 muestran a una MOI de 200.000, que la expresión mediada por AAV del sistema CRISPR permitió la supresión de B2M y la posterior eliminación de HLA A, B y C se produjo en el 24,9 por ciento de las LSC cuando se transfectaron células adheridas y en el 20,0 por ciento de las LSC cuando se transdujeron células en suspensión.
Ejemplo C17: Reducción del rechazo inmunitario mediante la supresión mediada por AAV del gen de beta-2-m icroglobulina en CEC
Diseño de vector de AAV:
El mapa de vector que se muestra en la Figura 30 proporciona el diseño del vector de AAV utilizado para expresar el sistema CRISPR en CEC. El vector expresó Cas9 deStaphylococcus aureus(Ranet al., Nature.9 de abril de 2015; 520(7546):186-191) y un ARN guía específico de B2M insertado en el sitio de restricción Aar I.
Transducción celular:
Se separaron células obtenidas como se describe en el Ejemplo C1 de la placa de cultivo con 100 microlitros de Accutase (ThermoFisher) durante 10 minutos a 37 °C, las suspensiones celulares se aclararon mediante centrifugación y se sembraron en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) en placas de 6 pocillos (Corning) 10 suplementadas con el compuesto del ejemplo n.° 133 o del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS (diluido en DMSO) a una concentración de 10 micromolar o como DMSO de control negativo solo sin compuesto. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 %.
Las CEC se cultivaron en medio de cultivo de células endoteliales corneales (medio SF endotelial humano (Invitrogen) con suero humano) en placas de 6 pocillos (Corning) suplementadas con el compuesto del ejemplo n.° 133 o del ejemplo n.° 49 inhibidor de LATS (diluido en DMSO) a una concentración de 10 micromolar. Las CEC se transdujeron después del aislamiento, unión y expansión en el compuesto inhibidor de LATS hasta una confluencia del 50-60 % en una placa de 6 pocillos ocho días después del aislamiento de CEC. Las CEC se transdujeron a una MOl de 10.000, 50.000, 100.000 o 200.000. Las partículas de vector se diluyeron en un tampón compuesto por 1xPBS Pluronic al 0,001 % y se pipetearon en la placa de cultivo. El tampón de almacenamiento de partículas víricas solo representó el control negativo de la transducción. Las células se cultivaron durante 72 horas en una incubadora de CO2 al 5 % antes de realizar la clasificación y el análisis por FACS.
Análisis por FACS:
Las CEC se trataron con Accutase (ThermoFisher, N.° de Cat. A1110501) durante 20 minutos en CO2 al 5 % a 37 °C. Después de raspar las células, la reacción 5 se detuvo usando medio de cultivo celular que contenía suero al 10 % y se transfirió a un tubo Falcon para una etapa de centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de aspirar, las células del medio se resuspendieron en 200 microlitros de tampón FACS (PBS/FBS al 10 %).
Para analizar la expresión de B2M y HLA-ABC, se añadieron 5 microlitros de anticuerpo anti-Beta2-microglobulina humana de ratón APC (Biolegend, n.° de cat. 316312) y 20 microlitros de anticuerpo anti-HLA-ABC humano de ratón PE (BD Bioscience, n.° de cat. 560168) a la suspensión celular y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron 3 veces después del marcaje con anticuerpo con tampón de FACS y se resuspendieron en 500 microlitros en tampón de FACS.
Antes de la clasificación por FACS, las células se filtraron a través de un filtro de 70 micrómetros y se almacenaron en hielo hasta su clasificación. Para evitar que las células se adhieran a la pared, los tubos de recogida se llenaron con el suero durante 30 minutos antes de la clasificación. Las células se clasificaron en un instrumento BD FACSAria II en 20 tubos de recogida preparados, usando medio de cultivo de CEC enriquecido con suero humano. Los datos de FACS se analizaron usando el software BD FACSDiva.
Los resultados presentados en la Figura 32 muestran que la expresión mediada por AAV del sistema CRISPR permitió la supresión de B2M y la posterior eliminación de HLA A, B y C. A una MOI de 40.000, la supresión de B2M se produjo en el 17 por ciento de las CEC.
A menos que se indique otra cosa, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida en sí, como quedará claro para el experto en la técnica. Se hace referencia de nuevo, por ejemplo, a los manuales convencionales y a la técnica anterior general mencionados en el presente documento, y a las referencias adicionales citadas en los mismos.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto, en donde el compuesto es de Fórmula II:
    o una sal o estereoisómero del mismo, en donde el Anillo A es (a) un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que está unido al resto de la molécula a través de un miembro del anillo de carbono y comprende, como miembro del anillo, de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, O y S, a condición de que al menos uno de los miembros del anillo heteroátomo sea un nitrógeno sin sustituir (-N=) ubicado en la posición 3 o 4 con respecto al miembro del anillo de carbono de unión del heteroarilo de 5 miembros o en la posición del anilloparadel heteroarilo de 6 miembros; o b un heteroarilo bicíclico condensado de 9 miembros que se selecciona del rupo que consiste en:
    en donde "*" representa el punto de unión del anillo A al resto de la molécula; y en donde el anillo A está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, ciano, alquilo C i-6, haloalquilo C i-6, -NH2, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, cicloalquilo C3-6 y fenilsulfonilo; R0 es hidroxilo o alcoxi C1-6; R1 es hidrógeno o alquilo C1-6; R2 se selecciona del grupo que consiste en: (a) alquilo Ci-s que está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (i) halógeno; (ii) ciano; (iii) oxo; (iv) alquenilo C2; (v) alquinilo C2; (vi) haloalquilo C1-6; (vii) -OR6, en donde R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; (viii) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona de hidrógeno, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0; (ix) -C(O)R8, en donde R8 es R0 o -NH-alquil C1-6-C(O)R0; (x) -S(O)2alquilo C1-6; (xi) cicloalquilo C3-6 monocíclico o cicloalquilo C7-10 policíclico que están cada uno sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, haloalquilo C1-6, R0, -NH2, alquilamino C1-6 y di-(alquil C1-6)amino; (xii) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxilo, halógeno, alquilo C1-6, alquilamino C1-6y di-(alquil C1-6)amino; (xiii) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno; (xiv) heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; y (xv) heteroarilo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende, como miembro del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de N y O; (b) -S(O)2alquilo C1-6; (c) fenilo que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6 y R0; (d) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, di-(alquil C1-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; y (e) heterocicloalquilo de 4 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S y que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en haloalquilo C i-6, R0, alquilamino C i-6, di-(alquil C i-6)amino, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; o, R1 y R2 pueden tomarse junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros que puede incluir, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 4 a 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6y R0. R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno y alquilo C1-6; y R45 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno y -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros), en donde el hetero-alquilo C3-8 de 3 a 8 miembros del -NH-(heteroalquilo de 3 a 8 miembros) comprende de 1 a 2 átomos de oxígeno como miembros de la cadena y está sin sustituir o sustituido con R0.
  2. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal o estereoisómero del mismo, en donde el anillo A se selecciona del rupo que consiste en ;cada uno de los cuales está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halógeno, ciano, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y -NH2; ;que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6.
  3. 3. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o una sal o estereoisómero del mismo, en donde el anillo A es ;
  4. 4. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal o estereoisómero del mismo, en donde R2 se selecciona del grupo que consiste en: (a) alquilo Ci-s que está sin sustituir o sustituido con A1 a A3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (i) ciano; (ii) alquinilo C2; (iii) haloalquilo C1-6; (iv) -OR6 *, en donde R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con R0 o -C(O)R0; (v) -NR7aR7b, en donde R7a es hidrógeno o alquilo C1-6 y R7b se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -C(O)R0 y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -C(O)R0; (vi) -C(O)R8, en donde R8 es R0; (vii) -S(O)2alquilo C1-4; (viii) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6y R0; (ix) heterocicloalquilo de 6 miembros que comprende, como miembros del anillo, de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en N y O, y en donde el heterocicloalquilo de 6 miembros está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6; (x) fenilo que está sin sustituir o sustituido con halógeno; y (b) cicloalquilo C3-6 que está sin sustituir o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de haloalquilo C1-6, R0, alquilamino C1-6, -C(O)R0, alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con -R0 o -C(O)R0.
  5. 5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal o estereoisómero del mismo, en donde R2 se selecciona del grupo que consiste en: n-propilo, isopropilo, /-butilo,
  6. 6. El compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, o una sal o estereoisómero del mismo, en donde R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos para formar un heterocicloalquilo de 6 miembros que puede incluir, como miembro del anillo, un heteroátomo adicional seleccionado del grupo que consiste en N, O y S, en donde el heterocicloalquilo de 6 miembros formado por R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que ambos están unidos está sin sustituir o sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6.
  7. 7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal o estereoisómero del mismo, en donde el compuesto es de Fórmula A3:
    X1 es CH; el Anillo A es cada uno de los cuales sin sustituir o sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6 y -NH2; R1 es hidrógeno o alquilo C1-6 sin sustituir; y R2 es (a) alquilo C1-8 que está sin sustituir o sustituido con 1 sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en: (i) haloalquilo C1-4; y (ii) -OR6, en donde R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-6 que está sin sustituir o sustituido con hidroxilo; o (b) cicloalquilo C3-6 monocíclico que está sin sustituir o sustituido con alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6 y R0.8
  8. 8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: N-(4-metoxi-2-metilbutan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[2-metil-1-(propan-2-iloxi)propan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[(2S)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-[(2R)-butan-2-il]-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-(1-metoxi-2-metilpropan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-metil-N-(propan-2-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butan-1-ol; N-terc-butil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2,2-dimetil-1-[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]piperidin-4-ol; 2,4-dimetil-4-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}pentan-2-ol; N-ciclopentil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; dimetil(3-metil-3-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}butil)amina; N,N-dietil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-metil-1-(2-metil-2-{[2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}propoxi)propan-2-ol; N-propil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(2-aminopirimidin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-{1H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il}-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(piridazin-4-il)-1,7-naftiridin-4amina; 2-(2-aminopiridin-4-il)-N-terc-butil-1,7-naftiridin-4-amina; N,N-dietil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; (3-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-3-metilbutil)dimetilamina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-metil-N-(propan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(piperidin-1-il)-1,7-naftiridina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-4-(morfolin-4-il)-1,7-naftiridina; N-terc-butil-2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-(2-metilbutan-2-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-{[2-(3-fluoropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]amino}-2-metilpropan-1-ol; 1-[2-(3-cloropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il]-2,2-dimetilpiperidin-4-ol; 2-(3-fluoropiridin-4-il)-N-[2-metil-1-(morfolin-4-il)propan-2-il]-1,7-naftiridin-4-amina; N-terc-butil-2-(3-cloropiridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 4-(piperazin-1- il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 4-(2-metilpiperidin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 2-(piridin-4-il)-N-(1-(trifluorometil)ciclobutil)-1,7-naftiridin-4-amina; 2-metil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,2-diamina; N-(oxetan-3-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; N-(1-metilciclopropil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 4-(3,3-dimetilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 2,2-dimetil-4-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)morfolina; N-(1-metilciclobutil)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; 2,2-dimetil-N1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,3-diamina; W2,W2,2-trimetil-W1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,2-diamina; 4-(2-metilpiperazin-1-il)-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridina; 2-metil-W1-(2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)propano-1,3-diamina; (R)-2-(piridin-4-il)-4-(3-(trifluorometil)piperazin-1-il)-1,7-naftiridina; N-(terc-butil)-N-metil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; W-(1-metilciclobutil)-2- (pirimidin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina; (S)-1,1,1-trifluoro-2-metil-3-((2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-il)amino)propan-2-ol; y 2-(3-doropiridin-4-il)-N,N-dietil-1,7-naftiridin-4-amina, o una sal o estereoisómero de cualquiera de los mismos.
  9. 9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el compuesto es N-terc-butil-2-(piridin-4-il)-1,7-naftiridin-4-amina o una sal o estereoisómero de la misma.
  10. 10. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal o estereoisómero del mismo, como principio activo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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