ES2983667T3 - Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas - Google Patents

Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas Download PDF

Info

Publication number
ES2983667T3
ES2983667T3 ES20707930T ES20707930T ES2983667T3 ES 2983667 T3 ES2983667 T3 ES 2983667T3 ES 20707930 T ES20707930 T ES 20707930T ES 20707930 T ES20707930 T ES 20707930T ES 2983667 T3 ES2983667 T3 ES 2983667T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
membrane
constituents
sample
biological sample
chamber
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES20707930T
Other languages
English (en)
Inventor
Qihua Xu
Kristin Weidemaier
Jon Salomon
Alexander Lastovich
Eric Fallows
Sean Connell
Joshua Herr
Meghan Wolfgang
Michael Brasch
Richard Moore
David Sebba
Cristian Clavijo
Shirley Ng
Richard Abbot
Alexander Papp
Henry Fu
Caitlin Austin
Sean Dowling
Owen Joyce
Michael Kiplinger
William Carpenter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson and Co filed Critical Becton Dickinson and Co
Application granted granted Critical
Publication of ES2983667T3 publication Critical patent/ES2983667T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D67/00—Processes specially adapted for manufacturing semi-permeable membranes for separation processes or apparatus
    • B01D67/0002—Organic membrane manufacture
    • B01D67/0023—Organic membrane manufacture by inducing porosity into non porous precursor membranes
    • B01D67/0032—Organic membrane manufacture by inducing porosity into non porous precursor membranes by elimination of segments of the precursor, e.g. nucleation-track membranes, lithography or laser methods
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/02—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor characterised by their properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/12—Purification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
    • A61M5/14—Infusion devices, e.g. infusing by gravity; Blood infusion; Accessories therefor
    • A61M5/165—Filtering accessories, e.g. blood filters, filters for infusion liquids
    • A61M2005/1657—Filter with membrane, e.g. membrane, flat sheet type infusion filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/25—Recirculation, recycling or bypass, e.g. recirculation of concentrate into the feed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
    • B01D2313/24—Specific pressurizing or depressurizing means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/10—Cross-flow filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2317/00—Membrane module arrangements within a plant or an apparatus
    • B01D2317/02—Elements in series
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
    • B01D2325/02—Details relating to pores or porosity of the membranes
    • B01D2325/0283—Pore size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/08—Flat membrane modules
    • B01D63/087—Single membrane modules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)

Abstract

Los métodos y aparatos proporcionan filtración para concentrar analitos, como bacterias o exosomas, de una muestra biológica, como sangre u orina. La tecnología puede emplear dispositivos de membrana que implementan uno o más procesos de filtración de flujo tangencial, como por etapas. Un dispositivo de membrana de ejemplo puede incluir típicamente una membrana que tiene lados y extremos. La membrana puede permitir selectivamente que uno o más constituyentes de la muestra pasen a través de ella mientras retiene otros constituyentes en un lado. Una cámara de entrada del dispositivo puede incluir una entrada cerca de un extremo y una salida cerca del otro extremo, y que puede permitir un flujo tangencial de la muestra a lo largo de la primera superficie lateral, y un paso transmembrana de uno o más constituyentes. Una cámara de salida del dispositivo puede estar configurada en la segunda superficie lateral para recibir los constituyentes que pasan. Dichos dispositivos pueden proporcionarse en un kit para facilitar la selección de una concentración de analito biológico deseada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. Serie No. 62/796,757 presentada el 25 de enero de 2019. Esta solicitud también reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. Serie No. 62/906,822 presentada el 27 de septiembre de 2019.
Campo de la tecnología
La presente tecnología se refiere a los métodos y aparatos que extraen de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas para el análisis o diagnóstico adicional, incluyendo, por ejemplo, la extracción de flujo tangencial, extracción de una sola etapa y extracción de múltiples etapas, utilizando mecanismos de separación tales como membranas. Ciertas realizaciones ejemplares de la tecnología de extracción pueden implicar el filtro de paso banda utilizando filtrado/extracción de flujo tangencial para separar los componentes de muestras biológicas tales como muestras de sangre (diluidas o sin diluir), hemocultivos positivos, muestras de orina, etc., lo que puede facilitar una identificación y/o pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos directas y rápidas.
Antecedentes de la tecnología
Las muestras biológicas (es decir, muestras pertenecientes a la vida u organismos vivos) se analizan en una multitud de contextos. Las muestras biológicas son mezclas complejas de células, proteínas, vesículas y otros componentes. Estos componentes varían entre sí en términos de estructura, tamaño, composición, etc. A menudo es deseable analizar de manera selectiva componentes discretos de muestras biológicas para investigación, diagnóstico, epidemiología, tratamiento, etc. Por ejemplo, la presencia o ausencia de patógenos bacterianos o fúngicos en muestras biológicas se pueden usar para diagnosticar afecciones tales como sepsis o infecciones del tracto urinario en un paciente/sujeto. Como otro ejemplo, el tipo y la distribución de vesículas extracelulares en un componente de la muestra (por ejemplo, células) pueden proporcionar información útil en la detección y el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la detección y el análisis de componentes discretos (por ejemplo, patógenos, células o vasos extracelulares) en muestras biológicas tales como la sangre se complica por la presencia de otros componentes en las muestras biológicas, que pueden interferir con los métodos diseñados para detectar un componente de interés. Por lo tanto, la capacidad para aislar y/o concentrar el componente de interés y separarlo de otros componentes de la muestra biológica es de importancia crítica.
Existen métodos para dicho aislamiento, pero dichos métodos no son completamente deseables. Por ejemplo, los métodos de centrifugación y lavado requieren mucha mano de obra y están sujetos a la variabilidad del usuario. Los métodos de filtración tienen la tendencia a perder el componente de interés debido a las interacciones con la(s) superficie(s) del filtro. Los métodos de microbiología en placas permiten que el componente de interés (por ejemplo, bacterias) crezca y se separe, pero requieren largos tiempos de replicación.
Los métodos de aislamiento/concentración que requieren largos tiempos de espera son particularmente problemáticos. Una aplicación importante donde existe la necesidad de mejorar los métodos de procesamiento de muestras es la detección de sepsis. Los pacientes ingresados en una Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) con sepsis grave tienen un riesgo de muerte del 39,8%. Por lo tanto, es imprescindible identificar rápidamente el patógeno responsable y el tratamiento antibiótico adecuado para mejorar la supervivencia del paciente. Los métodos actuales para determinar la identidad (ID) y las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) de patógenos recuperados de un hemocultivo positivo (PBC) requieren que la muestra se aísle del fondo sanguíneo. El enfoque estándar es subcultivar una alícuota de PBC para aislar y, en algunas realizaciones, concentrar aún más los patógenos. Esta etapa de subcultivo puede retrasar el tiempo de obtención de resultados entre 18 y 24 horas aproximadamente.
Por lo tanto, es deseable implementar técnicas y dispositivos mejorados para evaluar los componentes de interés en muestras biológicas que puedan aislar y evaluar dichos componentes rápidamente. Dichas técnicas pueden mejorar la eficiencia y/o precisión de las pruebas.
El documento de Patente US 2014/190903 A1 describe un sistema para filtración de partículas.
El documento de Patente WO 92/04970 A1 describe un aparato de filtración tangencial mejorado.
El documento de Patente US 2012/085648 A1 describe un separador de fluidos microfluídicos.
Compendio de la tecnología
El objetivo de la invención está definido por las reivindicaciones independientes 1 y 10.
Los ejemplos de la tecnología descritos en la presente memoria pueden proporcionar un proceso que puede separar eficazmente los patógenos del fondo sanguíneo sin subcultivar y, por lo tanto, puede facilitar una ID/AST rápida. La preparación de la muestra puede incluir: i) separar el patógeno objetivo de la muestra (por ejemplo, aislamiento por exclusión de tamaño); ii) aumentar la concentración del patógeno objetivo; o Ni) purificar el patógeno objetivo mediante lavado de las impurezas mientras se retiene el objetivo. En un ejemplo, el patógeno objetivo es una bacteria que se aísla y se recoge para pruebas de identificación o pruebas de susceptibilidad. Dichas pruebas se pueden combinar con análisis automatizados, tales como imágenes digitales de cultivos en placas a lo largo del tiempo para la detección de crecimiento microbiano en los mismos o pruebas de luz de cultivos de patógenos objetivo.
Otro aspecto de la presente tecnología es implementar la extracción de los componentes de una muestra biológica para concentrar un constituyente deseado.
Otro aspecto de la presente tecnología es facilitar el análisis de muestras biológicas sin necesitar una etapa de subcultivo para obtener una muestra con una cantidad suficiente de biomasa/masa de colonia y/o con suficiente pureza.
En una realización, un aparato para extraer constituyentes de una muestra biológica para concentrar un constituyente deseado de la muestra biológica incluye una pluralidad de etapas de membrana, en donde cada una de la pluralidad de etapas de membrana tiene una membrana que tiene un primer lado, un segundo lado, un primer extremo y un segundo extremo, teniendo la membrana una característica para permitir de manera selectiva que uno o más constituyentes de la muestra biológica pasen a través de la membrana desde el primer lado al segundo lado mientras se retienen otros constituyentes de la muestra biológica en el primer lado. La membrana también tiene una cámara de entrada que tiene una entrada próxima al primer extremo y una salida próxima al segundo extremo, estando la cámara de entrada configurada en el primer lado de la membrana para permitir (a) un flujo tangencial de la muestra biológica a lo largo de una primera superficie de la membrana en el primer lado desde la entrada hasta la salida, y (b) un paso transmembrana de uno o más constituyentes de la muestra biológica desde el primer lado al segundo lado. El aparato también tiene una cámara de salida configurada en una segunda superficie de la membrana en el segundo lado y configurada para recibir los uno o más constituyentes de la muestra biológica que pasan a través de la membrana. Las etapas de membrana se configuran de manera colectiva para aislar una pasobanda deseada de constituyentes de la muestra biológica.
En otra realización, hay un dispositivo de membrana de flujo tangencial de una sola etapa que tiene una cámara de entrada que tiene una primera y una segunda salida. El dispositivo también tiene una cámara de salida que tiene una segunda salida. La membrana de filtración define una vía de flujo tangencial que separa la primera cámara de la segunda cámara y también tiene una vía de flujo de recirculación para dirigir la muestra para que pasen sobre la membrana de filtración una pluralidad de veces. Un componente de interés se recupera de la porción de la muestra que es retenida por la membrana de filtración en la cámara de entrada (es decir, el retenido).
En otra realización, el dispositivo de membrana de flujo tangencial de una sola etapa se configura como un cartucho. El cartucho tiene un puerto que recibe un recipiente de muestra y el puerto se acopla de manera fluida a una cámara de muestra en el cartucho. La cámara de muestra se acopla de manera fluida a la primera entrada de la cámara de entrada. La primera salida de la cámara de entrada se acopla de manera fluida a la cámara de muestra de manera que el retenido de la membrana de filtración se recircula de regreso a la cámara de muestra.
En la presente memoria se describe un método para extraer constituyentes de una muestra biológica. Según el método, en un primer proceso de extracción, uno o más constituyentes de la muestra biológica se hacen pasar, mediante una fuerza de presión, a través de una primera membrana desde un primer lado de la primera membrana a un segundo lado de la primera membrana mientras se retienen otros constituyentes de la muestra biológica en el primer lado de la primera membrana y mientras se genera un flujo tangencial de la muestra biológica a lo largo de una superficie de la primera membrana en el primer lado de la primera membrana. En un segundo proceso de extracción, se pasan uno o más constituyentes adicionales de uno o más constituyentes, usando una fuente de presión, a través de una segunda membrana desde un primer lado de la segunda membrana a un segundo lado de la segunda membrana mientras se retiene alguno del uno o más constituyentes en el primer lado de la segunda membrana y mientras se genera un flujo tangencial de uno o más constituyentes a lo largo de una superficie de la segunda membrana en el primer lado de la segunda membrana. Según el método, el primer proceso de extracción y el segundo proceso de extracción aíslan, purifican y/o concentran una pasobanda deseada de constituyentes de la muestra biológica de otros constituyentes de la muestra biológica.
En otra realización, se describe un método para aislar patógenos de un hemocultivo positivo. Según el método, un hemocultivo que se sospecha que contiene patógenos objetivo se introduce en una cámara de muestra. El hemocultivo se transporta por aire a un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración comprende una membrana de filtración que separa una primera cámara de una segunda cámara. El hemocultivo se fluye de manera tangencial a través de la membrana de filtración de manera que los patógenos objetivo, si están presentes en el hemocultivo positivo, fluyen a través de la membrana de filtración y a través de una primera salida de la primera cámara como retenido. Porciones del hemocultivo positivo que tienen un tamaño de partícula inferior a un umbral predeterminado fluyen a través de la membrana de filtración y en la segunda cámara. El retenido fluye a través de la primera salida de la primera cámara para recircular sobre la membrana de filtración, por lo que una porción adicional de la muestra permea a través de la membrana de filtración. Después de recircular el retenido un número predeterminado de veces, el retenido se lava combinando el retenido con un tampón de lavado. El retenido lavado en un vial para pruebas posteriores para determinar la presencia o ausencia de patógenos objetivo en el retenido.
Otras características de la tecnología serán evidentes a partir de la consideración de la información contenida en la siguiente descripción detallada, dibujos y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La presente tecnología se muestra a modo de ejemplo, y no a modo de limitación, en las figuras de los dibujos adjuntos, en los que números de referencia similares se refieren a elementos similares que incluyen:
La FIG. 1 muestra un ejemplo de un dispositivo de membrana adecuado para su uso en algunas versiones de la presente tecnología;
La FIG. 2 es otro ejemplo de un dispositivo de membrana que está configurado con una cámara de vacío para promover la filtración de flujo tangencial de la presente tecnología;
La FIG. 3 es un dispositivo de membrana de ejemplo que está configurado con émbolos tipo jeringa para promover la filtración de flujo tangencial de la presente tecnología;
La FIG. 4 muestra una versión radial de uno o varios dispositivos de membrana de ejemplo que están configurados para promover la filtración de flujo tangencial de la presente tecnología;
La FIG. 5 muestra una versión de bomba de recirculación de un dispositivo de membrana de ejemplo que está configurado para promover la filtración de flujo tangencial de la presente tecnología;
La FIG. 6A muestra las etapas de una metodología de filtración de ejemplo con filtración por membrana de una muestra de sangre que contieneE. coli,lo que permite la concentración en múltiples pasos de las bacterias de la muestra de sangre;
La FIG. 6B es un gráfico que muestra un aumento en la velocidad de diagnóstico cuando las bacterias en la muestra se aíslan con un proceso de filtración de flujo tangencial de la presente tecnología;
Las FIGS. 7A y 7B muestran ejemplos adicionales de dispositivos de membrana que aíslan exosomas en una muestra usando un proceso de múltiples etapas;
La FIG. 8 es un gráfico que muestra datos de dispersión dinámica de luz del retenido para partículas de exosoma extraídas usando un proceso de dos etapas como se describe en la presente memoria;
La FIG. 9 es un gráfico que muestra la intensidad de la señal del filtrado en el que se extraen partículas de exosoma usando un proceso de dos etapas como se describe en la presente memoria;
La FIG. 10 es un gráfico que muestra una comparación de las tasas de recuperación deE. colide frascos BACTEC líticos y frascos BACTEC estándar usando un filtro de una sola etapa para separarE. colide la muestra;
La FIG. 11 es una ilustración de un proceso de filtración de flujo tangencial con membrana de paso bajo de un ejemplo de la presente tecnología;
La FIG. 12 muestra las etapas de una metodología de ejemplo para la filtración de flujo tangencial de múltiples etapas usando dispositivos de membrana de la presente tecnología;
La FIG. 13 muestra componentes y procesamiento para una etapa de un proceso de filtración de flujo tangencial usando un dispositivo de membrana de ejemplo de la presente tecnología;
Las FIGS. 14A-K describen un circuito fluídico para un cartucho desechable que realiza filtrado de flujo tangencial según una realización;
La FIG. 15 muestra los resultados de las pruebas de identificación y susceptibilidad a antibióticos para bacterias aisladas de un hemocultivo positivo artificial usando un proceso de filtración de flujo tangencial de una sola etapa; La FIG. 16 muestra los resultados de las pruebas de identificación y sensibilidad a los antibióticos para bacterias aisladas de muestras de hemocultivo positivo artificial usando un proceso de filtración de flujo tangencial de dos etapas;
La FIG. 17 muestra cómo el método y el dispositivo descritos en la presente memoria se pueden integrar en flujos de trabajo conocidos; compara el tiempo necesario para evaluar las bacterias en un hemocultivo positivo usando el método y sistema descritos en la presente memoria en comparación con otros métodos convencionales;
La FIG. 18 muestra un instrumento de mesa para eliminar, aislar o concentrar patógenos de un hemocultivo positivo; Las FIGS. 19A-F muestran un ejemplo de un flujo de trabajo para el instrumento de mesa mostrado en la FIG. 18; Las FIGS. 20A-D muestran flujos de trabajo y configuraciones alternativas del instrumento de mesa mostrado en la FIG. 18.
Las FIGS. 21A-F muestran un proceso de flujo de trabajo potencial de una realización de los desechables y el instrumento de mesa;
Las FIGS. 22A-B muestran dos métodos potenciales para introducir el hemocultivo positivo al sistema; y
Las FIGS. 23A-C muestran métodos potenciales para suministrar cualquier reactivo o tampón necesario.
Descripción detallada
Algunas realizaciones de las presentes tecnologías de extracción biológica pueden implementarse empleando extracción de flujo tangencial empleando una o más etapas de extracción.
Principio y concepto de extracción de flujo tangencial.
La presente tecnología proporciona aparatos y métodos para aislar o purificar (y en algunas realizaciones concentrar) constituyentes particulares de interés a partir de muestras biológicas que incluyen, por ejemplo, sangre, orina, saliva y otros tipos de muestras usando tecnologías basadas en membranas en combinación con extracción de flujo tangencial. Ejemplos de constituyentes particulares de interés pueden ser analitos objetivo, células tumorales disociadas o circulantes (CTC), glóbulos blancos (WBC), vesículas extracelulares como exosomas, levaduras, bacterias y virus, etc. La tecnología basada en membranas se puede implementar con procesamiento de flujo tangencial de una muestra biológica en forma líquida. Dicho flujo de fluido tangencial puede pasar (por ejemplo, repetidamente) la muestra sobre una superficie de membrana específica que tiene una característica de presión transmembrana que está modificada genéticamente para permitir que un constituyente objetivo pase a través de la membrana como un permeado o sea retenido por la membrana como retenido. Por lo tanto, la membrana especificada o el dispositivo de membrana se pueden configurar selectivamente dependiendo del objetivo y de si el objetivo pasará o quedará retenido. Esta técnica, a diferencia de muchas otras tecnologías, ofrece una oportunidad beneficiosa para mantener la viabilidad y la integridad de los componentes extraídos vulnerables, tales como células, bacterias, virus, etc., que pueden verse comprometidos por las duras condiciones de extracción. Además, la separación de flujo tangencial descrita en la presente memoria permite la recuperación eficiente de los componentes extraídos de la muestra, incluso a bajas concentraciones, debido a que la exposición de los componentes al área de la superficie de la membrana se reduce significativamente en comparación con otros enfoques de filtración tales como la filtración sin salida o la filtración pasante en la que el filtro está fabricado de materiales fibrosos. Por tanto, el método y dispositivo de separación descritos en la presente memoria reducen el riesgo de pérdida del objetivo debido a uniones o daños.
Para lograr la extracción de los constituyentes objetivo, se modifican genéticamente el diseño del dispositivo, el tamaño de los poros de la membrana y los parámetros del proceso. El constituyente objetivo puede retenerse o pasar a través de la membrana del dispositivo dependiendo de los objetivos del proceso de extracción. Se prefiere que la membrana porosa tenga un tamaño de poro generalmente uniforme (un tamaño de poro característico) y una superficie lisa con respecto a las partículas que se van a extraer. Uno de esos tipos de membrana es una membrana grabada en pista (TEM) que puede estar hecha de poliéster, polipropileno, policarbonato, poliimida, etc. Los materiales adecuados para las TEMs son bien conocidos por los expertos en la técnica y no se describen en detalle en la presente memoria. Dichas membranas están disponibles comercialmente y pueden tener un tamaño de poro uniforme que varía desde tamaño de nanómetros hasta micrómetros. Además, dichas membranas se pueden tratar adicionalmente para modificar las propiedades de la superficie, tales como la hidrofobicidad, para reducir la obstrucción de la membrana o mejorar de otro modo el rendimiento de la aplicación. Dichos recubrimientos y tratamientos son bien conocidos por el experto y no se describen en detalle en la presente memoria. Preferiblemente, el sistema puede diseñarse para tener un caudal tangencial y una presión transmembrana correlacionados. El caudal tangencial y la presión transmembrana se eligen para: i) evitar la obstrucción de la membrana debido a fenómenos tales como la formación de capas de torta o la obstrucción de los poros con partículas; y ii) optimizar el tiempo de procesamiento de la muestra sin introducir cizallamiento o lisis no deseados del componente celular. Dicha selección de características de caudal y presión puede permitir que el tamaño de partícula objetivo permanezca en la fase retenida o pase a través de la membrana seleccionada como fase de permeado cuando se combina con la selección adecuada del tamaño de poro de la membrana para los constituyentes objetivo que se van a extraer.
Se muestra un proceso de extracción con referencia al dispositivo representado en la FIG. 1, donde la filtración de flujo tangencial fundamental en un dispositivo de membrana 100 puede servir para procesar la muestra 102. El dispositivo de membrana 100 normalmente puede incluir una cámara de entrada o superior 104 y una cámara de salida o inferior 106 que están formadas y unidas mediante una membrana porosa 108 interpuesta entre ellas. La cámara superior 104 normalmente tendrá entrada/salidas de muestra 101 hacia/desde la cámara de entrada para el flujo de entrada y flujo de salida de la muestra con respecto a la cámara de entrada 104. La cámara de salida o inferior puede tener salida(s) 103 para el flujo de salida de los constituyentes más pequeños 110 y el líquido que transporta los constituyentes más pequeños que pasa a través de la membrana 108. Las entradas/salidas están normalmente en o cerca de los extremos de la membrana para promover o maximizar el área de flujo tangencial (TF). Por lo tanto, la muestra biológica fluye de manera tangencial a lo largo de la superficie de la membrana y la materia y los constituyentes objetivo 110 más pequeños y el líquido pueden pasar a través de la membrana y aislarse del resto del fluido y otros constituyentes de la muestra 102 que no pasan a través de la membrana.
Opcionalmente, el flujo tangencial (es decir, a lo largo de la superficie de la membrana) y/o el flujo transmembrana (es decir, a través de la membrana) pueden ser impulsados por un diferencial de presión; es decir, mediante una fuente de presión positiva y/o una fuente de presión negativa (por ejemplo, una fuente de vacío). El flujo tangencial puede ser un flujo unidireccional o un flujo alternativo (donde el flujo de fluido invierte su dirección para permitir que el fluido fluya sobre la misma superficie de la membrana varias veces para completar el proceso de filtración). Múltiples pases de la muestra sobre la membrana proporcionan una serie de beneficios potenciales, incluyendo la reducción del área necesaria de la membrana. En algunas implementaciones, el flujo tangencial puede ser impulsado por una bomba de circulación o presión para impulsar el flujo tangencial en una dirección. En algunos de estos casos, la muestra fluirá varias veces a lo largo de la superficie de la membrana, tal como cuando la vía de flujo emplea un bucle o circuito y una bomba hace circular o recircula el fluido de muestra en el bucle/circuito. En otros ejemplos, la muestra fluye múltiples veces en diferentes direcciones a lo largo de la superficie de la membrana, tal como donde termina la vía de flujo (por ejemplo, sin bucle) y se acopla a una bomba reversible (es decir, bidireccional) o una pluralidad de bombas unidireccionales alternativas que logran el flujo tangencial alternativo. En algunos ejemplos, dichas bombas/vacíos pueden implementarse opcionalmente mediante una o más jeringas, que pueden operarse de forma manual o automática. Opcionalmente, se pueden implementar otros tipos de bombas/vacíos, o implementar configuraciones de válvulas apropiadas usando una única fuente de energía, logrando así el flujo deseado. Las bombas/vacíos que pueden usarse para impulsar el flujo de la muestra a través de la membrana son bien conocidas por los expertos en la técnica y no se describen en detalle en la presente memoria.
En algunas versiones, se puede acoplar un recipiente presurizado y/o un recipiente despresurizado a las entradas/salidas (101, 103) de la(s) cámara(s) para proporcionar la fuerza para el flujo tangencial. Por ejemplo, dicho acoplamiento puede estar en o cerca de los extremos opuestos de la membrana para inducir el flujo tangencial a lo largo de una superficie de la membrana de un extremo a otro (es decir, en una cámara). La cámara puede configurarse para inducir el flujo a lo largo de la membrana, tal como cuando la cámara está limitada por una estructura de pared 107 para formar un espacio estrecho próximo a y a lo largo de la superficie de la membrana. El flujo tangencial se produce dentro del espacio. Un espacio de este tipo puede tener beneficiosamente una dimensión más larga a lo largo de la longitud (L) de la membrana cuando se compara con la profundidad (D) del espacio entre la membrana y una superficie de la estructura de pared 107 que forma el espacio.
Como se muestra en la FIG. 2, una versión despresurizada del recipiente 212 puede ser un tubo de recolección al vacío (por ejemplo, el BD Vacutainer®) que puede acoplarse a una entrada/salida 101-A a la cámara superior cerca de un extremo próximo, tal como a través de un conducto. Opcionalmente, se puede acoplar una aguja, tal como para la extracción de sangre, en o cerca de un extremo opuesto a una entrada/salida 101-B, a través de un conducto. Un recipiente de recolección 214, tal como un vial que puede fijarse o retirarse del dispositivo de membrana 200, puede recolectar el líquido y el constituyente 110 (permeado) que pasa a través de la membrana 108. En el ejemplo de la FIG. 3, múltiples dispositivos de émbolo 316 (por ejemplo, jeringas) sirven para forzar un flujo alternativo de muestra en el dispositivo de membrana 300 para inducir constituyentes/analitos de muestra particulares a través de la membrana interna para su recolección en el recipiente de recolección 214.
Alternativamente, el flujo tangencial también se puede generar moviendo la membrana. Un ejemplo de este tipo se muestra en la FIG. 4. El dispositivo 400 puede ser un husillo rotacional 318 (por ejemplo, una estructura cilíndrica hueca) con una cámara interna y una membrana porosa 108 en la superficie exterior del husillo 318. El husillo 318 puede estar montado de forma rotatoria dentro de una carcasa cilíndrica 320. Se puede introducir una muestra biológica, tal como sangre, en el husillo 318 y en la carcasa cilíndrica 320. El flujo tangencial se genera girando la carcasa 320 mientras se mantiene estático el inserto de membrana cilíndrico del husillo 318 o viceversa. Se puede proporcionar una presión de flujo transmembrana para inducir a componentes más pequeños de la carcasa cilíndrica 320 a pasar a través de la membrana 108 hacia la cámara hueca del husillo a medida que el husillo rota con respecto a la carcasa cilíndrica. En tal caso, la parte hueca del husillo sirve como recipiente de recolección para el permeado. Un ejemplo de dicho dispositivo se muestra en la publicación de Patente US Patent Publication No. 2018/0056243 publicada el 1 de marzo de 2018 y titulada "Plasma Extractor".
En el ejemplo de la FIG. 5, una bomba de recirculación 522 (por ejemplo, una bomba peristáltica) recircula la muestra biológica a través de un bucle 524 (por ejemplo, un conducto que incluye la cámara superior 104 del dispositivo de membrana 500) tangencialmente a lo largo de una superficie de la membrana interna 108. El bucle del conducto permite la re-circulación para múltiples pases a lo largo de la membrana interna 108. En una configuración similar mostrada en la FIG. 13, la bomba de recirculación 1522 recircula la muestra biológica a través de un bucle que incluye la cámara de entrada 1504 del dispositivo de membrana 1500 para que la muestra fluya repetidamente de manera tangencial a lo largo de la membrana 1508. Dicha bomba también puede proporcionar una presión transmembrana. También se puede acoplar una bomba de vacío 1528 a la cámara de salida del dispositivo de membrana 1500 y puede proporcionar una presión transmembrana, arrastrando el permeado a través de la membrana y hacia un recipiente de recolección 1514. La recirculación de la muestra permite la eliminación de componentes adicionales/no deseados (es decir, de fondo) de la muestra, mejorando de este modo el grado y extensión del aislamiento, purificación y/o concentración de los patógenos en la muestra a partir de otros constituyentes de la muestra. La recirculación se puede implementar en configuraciones de una sola etapa o de múltiples etapas del dispositivo de membrana de flujo tangencial descrito en la presente memoria.
A. Proceso de extracción de una sola etapa
Como se mencionó anteriormente, el dispositivo de membrana 100 se puede implementar para una extracción de una sola etapa, tal como cuando la muestra fluye de manera tangencial a lo largo de una sola membrana o múltiples membranas con las mismas características de filtro (por ejemplo, el mismo tamaño de poro). Un proceso de este tipo puede implementarse para la recuperación y concentración de bacterias a partir de sangre entera fresca, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, muestras respiratorias y heridas, así como otros tipos de muestras. En la presente memoria se describen procesos de ejemplo.
(1) Recuperación y concentración de bacterias a partir de sangre entera fresca
Como se mencionó anteriormente, se desean resultados rápidos de identificación/detección de bacterias y pruebas de susceptibilidad a antibióticos para mejorar la eficiencia del tratamiento. Los procedimientos de prueba convencionales implican un largo tiempo de incubación y etapas complejas de purificación de muestras debido a la baja concentración de bacterias en las muestras originales, tal como sangre u orina. Concentrar las bacterias directamente de la muestra del paciente ofrece resultados más rápidos al mejorar la detectabilidad o reducir el tiempo de incubación.
La extracción de flujo tangencial puede servir como un proceso de concentración usando un dispositivo de membrana 100 y puede lograr el enriquecimiento de las bacterias en la muestra original, tal como en una prueba de recuperación de bacteriasde E. coli.Por ejemplo, se pueden aislar bacterias y, en algunas realizaciones, concentrarlas a partir de una muestra de sangre. En un ejemplo de dicho proceso, como se muestra en la FIG. 6A, se recoge una muestra de sangre del paciente de 10 mL. Para fines de prueba se enriquece conE. coli.La muestra se diluye utilizando 40 mL de medio de lisis BD BACTEC™ Lytic. BACTEC es una marca comercial de Becton, Dickinson and Company (BD). El medio permite una lisis diferencial en la que los componentes de la sangre se lisan pero las bacterias no se lisan. La muestra lisada se aplica a un proceso de extracción de flujo tangencial donde se aislarán las bacterias del medio líquido. El dispositivo de membrana 600 (o dispositivo de extracción de flujo tangencial), similar a los ejemplos discutidos anteriormente, tiene una primera cámara 610 (por ejemplo, cámara de entrada o superior) y una segunda cámara 620 (por ejemplo, cámara de salida o inferior) separadas por una membrana grabada en pista (TEM) 630. La muestra de sangre lisada fluye (repetidamente en un proceso de múltiples pases) a lo largo de la membrana grabada en pista en el dispositivo de membrana 600 en la primera cámara (por ejemplo, cámara superior; 104 en la FIG. 1) y la fase líquida parcial fluye a través de la membrana grabada en pista 630 (TEM 108 en la FIG. 1) hacia la segunda cámara (por ejemplo, cámara inferior; 106 en la FIG. 1) aplicando una presión transmembrana. La TEM puede tener un tamaño de poro que varía de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2,0 pm o, alternativamente, de aproximadamente 0,4 pm a aproximadamente 1 pm. Dicho tamaño de poro se selecciona para retener las bacterias en la fase de retenido. El caudal tangencial puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, 10 mL/min o, alternativamente, de aproximadamente 5 mL/min. Un experto en la técnica apreciará que la velocidad del flujo a través de la membrana se ve afectada por la geometría de la sección transversal de las cámaras. El intervalo del caudal anterior se basa en una geometría de la cámara de 10 mm x 40 mm x 0,08 mm. En esta realización, la presión transmembrana está en el intervalo de aproximadamente 0,1 psi (aproximadamente 0,69 kPa) a aproximadamente 10 psi (aproximadamente 68,95 kPa), alternativamente en el intervalo de aproximadamente 0,5 (aproximadamente 3,45 kPa) a aproximadamente 6 psi (aproximadamente 41,4kPa). Dentro de un breve período de tiempo (por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 minutos), las bacterias se concentran a medida que se reduce el volumen. En un ejemplo en el que la muestra se diluye (por ejemplo, una muestra de sangre de 10 mL diluida a un volumen de 50 mL en un medio lítico), 10 mL de la muestra diluida (proporcionalmente aproximadamente 2 mL de sangre y 8 mL de medio) se reducen a un volumen de 0,5 mL (es decir, una reducción de aproximadamente 4:1) en el que se aísla la bacteria en una cámara de recolección acoplada al dispositivo de membrana. El volumen final se puede variar basándose en la concentración objetivo y generalmente solo está limitado por el volumen muerto del dispositivo y la capacidad de continuar moviendo el fluido a medida que aumenta la viscosidad debido a la mayor proporción de contenido sólido. En un ejemplo, la muestra de bacterias aisladas se sembró en una placa de eosina-azul de metileno (EMB) y se incubó durante la noche. Se utilizó un recuento de unidades formadoras de colonias (CFU) para determinar la concentración de bacterias y la tasa de recuperación.
En un ejemplo, un sistema de filtración de flujo tangencial es similar al dispositivo de membrana 600 con una geometría de la primera cámara de 10 mm x 40 mm x 0,08 mm. Se utilizó un tamaño de poro de membrana de 0,4 pm. La muestra de sangre diluida de 10 mL (2 mL de sangre completa y 8 ml de medio BACTEC) que contenía bacterias enriquecidas(E. coli)se procesó a un caudal tangencial de 10 mL/min con una presión transmembrana de aproximadamente 3 psi en un modo de flujo alternativo en el que el flujo de fluido invierte la dirección del flujo varias veces a lo largo de la superficie de la membrana. El proceso se detuvo cuando el volumen del retenido alcanzó aproximadamente 0,5 mL y el retenido se recogió para una determinación adicional del recuento de bacterias sembrando en una placa de eosina-azul de metileno (EMB) e incubando durante la noche. La Tabla 1 a continuación muestra que la viabilidad de las bacterias no se vio afectada por el proceso de filtración de flujo tangencial de múltiples pases alternativos y mostró una buena recuperación. El porcentaje de recuperación promedio se calcula basándose en el recuento promedio de CFU de bacterias recuperadas de los dispositivos TEM con respecto al recuento de la muestra tomada directamente de la solución de sangre lisada diferencialmente (centrifugando la sangre para recoger las bacterias). En este estudio se logra una recuperación de aproximadamente el 95 al 100% para concentraciones de bacterias superiores a 03 CFU/mL. Con la concentración poco enriquecida de 5 CFU/mL de sangre completa de entrada, la recuperación es del 82%en promedio. La pérdida se puede atribuir a la pérdida de bacterias que se produce en el dispositivo debido al volumen muerto o debido a una pérdida menor de viabilidad de unos pocos microorganismos. La pérdida de sólo unos pocos organismos en el poco enriquecido da como resultado una pérdida medida mayor, ya que cada uno representa un porcentaje más alto del total que aquellos de las muestras con títulos más altos.
Tabla 1Resultados de la prueba de recuperación de bacterias deE. coli
(2) Recuperación y aislamiento de bacterias a partir de un hemocultivo positivo
Como se describió anteriormente, se busca la identificación de bacterias y pruebas de susceptibilidad a los antibióticos de bacterias rápida para mejorar la eficiencia del tratamiento. Los procedimientos de prueba convencionales implican una larga etapa de subcultivo después de la identificación de un hemocultivo positivo para obtener bacterias para las pruebas de identificación y de susceptibilidad a los antibióticos. Aislar y lavar las bacterias directamente de la muestra de hemocultivo positivo ofrece resultados más rápidos al reducir la necesidad de una larga etapa de subcultivo. Las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos y las pruebas de identificación mediante MALDI-TOF requieren una muestra de bacterias limpia. Los componentes de fondo del hemocultivo, tales como células, restos celulares, sales, proteínas y otros, deben eliminarse para obtener resultados de prueba confiables. Además, la concentración de bacterias en la muestra de salida debe ser suficientemente alta para que haya suficiente biomasa disponible (aproximadamente 10 8 CFU/mL) para la ID mediante MALDI-TOF). Los beneficios de la identificación rápida (por ejemplo, mediante MALDI-TOF) y de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos (por ejemplo, mediante métodos microbiológicos o bioquímicos) aumentan al aislar rápidamente las bacterias directamente de un hemocultivo y evitar la etapa de subcultivo que se utiliza ampliamente en la actualidad.
La extracción de flujo tangencial puede servir para aislar bacterias de una muestra usando el dispositivo de membrana 100. Por ejemplo, en un proceso, se pueden aislar bacterias de un hemocultivo positivo. En un ejemplo de dicho proceso, se recogen 10 mL de muestra de sangre del paciente en una frasco BACTEC y se inoculan con bacterias tales comoE. coli, S. aureus, S. pneumoniaeu otras bacterias. La muestra se incuba en un instrumento de hemocultivo BACTEC hasta que se detecta un hemocultivo positivo. Dentro de las 0 a 8 horas posteriores a la detección, el hemocultivo positivo se aplica a un proceso de extracción de flujo tangencial donde se aislarán y lavarán las bacterias. Haciendo referencia nuevamente a la FIG. 6A, el dispositivo de membrana 600 (o dispositivo de extracción de flujo tangencial), similar a los ejemplos discutidos anteriormente, tiene una primera cámara 610 (por ejemplo, cámara de entrada o superior) y una segunda cámara 620 (por ejemplo, cámara de salida o inferior) separadas por una membrana grabada en pista (TEM) 630.
La muestra de hemocultivo positivo fluye (repetidamente en un proceso de múltiples pasos) a lo largo de la membrana grabada en pista en el dispositivo de membrana 600 en la primera cámara (por ejemplo, cámara superior; 104 en la FIG. 1) y la fase líquida parcial fluye a través de la membrana grabada en pista 108 (TEM; FIG. 1) en la segunda cámara (por ejemplo, cámara inferior; 106 en la FIG. 1) mediante la aplicación de una presión transmembrana.
El éxito de una filtración de flujo tangencial usando un dispositivo de membrana 600 depende de varios parámetros interrelacionados de un sistema de filtración seleccionado para un constituyente objetivo. En este ejemplo, el constituyente objetivo son las bacterias en un hemocultivo positivo. Los parámetros críticos incluyen el tamaño de los poros de la membrana, la geometría de la cámara, el caudal tangencial y la presión transmembrana. Además, la muestra que se va a procesar puede tener variaciones en el contenido de sólidos, la distribución y concentración del tamaño de las partículas, la viscosidad, la sensibilidad al cizallamiento, la propensión a adherirse a las superficies, el grado de bioincrustación, la coagulación, etc. La recuperación altamente eficiente de una variedad de bacterias potencialmente diferentes de una muestra grande requiere un equilibrio de muchos parámetros. Los problemas tales como bioincrustaciones, obstrucción de la membrana, viabilidad reducida del organismo objetivo, baja pureza de la muestra de salida, tiempo de procesamiento excesivo o baja recuperación pueden ocurrir durante el proceso de filtración si los parámetros de procesamiento y la geometría no se eligen adecuadamente.
En la filtración de flujo tangencial de una sola etapa de hemocultivo donde se van a retener las bacterias objetivo, el tamaño de los poros de la membrana se selecciona para evitar que las bacterias (que normalmente tienen un tamaño de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 2 pm) pasen a través de los poros de la membrana. El tamaño de poro de la membrana se selecciona para que sea más pequeño que el tamaño típico de las bacterias. Sin embargo, si el tamaño de los poros de la membrana es demasiado pequeño, dará como resultado un proceso de filtración lento y una posible retención de algunas partículas y desechos no deseados en la fase de retenido junto con las bacterias. Las membranas con un tamaño de poro muy pequeño requieren una presión transmembrana mayor para impulsar la filtración, ya que la resistencia al flujo es normalmente mayor a medida que se reduce el tamaño de los poros. Si el tamaño de los poros de la membrana es demasiado grande, el tiempo de filtración puede ser más corto, pero las bacterias objetivo pueden atravesar la membrana y la tasa de recuperación se reducirá.
En la filtración de flujo tangencial, el caudal tangencial y la presión transmembrana normalmente se eligen para proporcionar una filtración exitosa y eficiente. La eficiencia deseada o la eficiencia objetivo significa que no solo el porcentaje de recuperación de las bacterias objetivo y su pureza son altos, sino que también la velocidad de filtración está optimizada para el área de filtración fija. Una velocidad de flujo tangencial más alta generalmente ayuda a prevenir la formación de una capa de torta en la superficie de la membrana o la obstrucción de la membrana. La presión transmembrana se selecciona para proporcionar una tasa de filtración suficiente, pero la presión transmembrana no es tan grande como para provocar la obstrucción de la membrana al arrastrar partículas objetivo hacia los poros de la membrana (reduciendo el diámetro efectivo) o bloqueando todas las entradas de los poros de la membrana. Esta obstrucción se produce cuando la velocidad del flujo tangencial es demasiado baja incluso en dispositivos que tienen una presión transmembrana baja. La obstrucción de la membrana puede reducir significativamente la eficiencia de la filtración tangencial o hacer que el proceso de filtración/purificación sea casi imposible. El problema de obstrucción de la membrana es particularmente grave cuando el contenido de sólidos y/o la viscosidad de la muestra es alto, como se observa a menudo en hemocultivos positivos.
En la filtración de flujo tangencial, la geometría de la cámara es un factor importante que afecta al rendimiento de la filtración. Normalmente hay dos cámaras en dichos dispositivos, estando las cámaras separadas por la membrana. La selección de la altura, el ancho y la longitud de la cámara afecta la resistencia al flujo del fluido, lo que afecta el caudal tangencial, la velocidad y la presión transmembrana efectiva. Para un área de filtración fija (ancho x largo = constante), una mayor altura de la cámara dará como resultado una menor resistencia al flujo. Para lograr una velocidad de flujo suficiente para evitar o minimizar la formación de capa de torta en la membrana o la obstrucción de la membrana, el caudal tiene que ser mayor que el caudal utilizado para un sistema de altura de cámara baja. Para la mayoría de las aplicaciones, una altura de cámara más pequeña proporciona una filtración más eficiente en cada paso del volumen de muestra. Sin embargo, en este caso la resistencia al flujo tangencial aumenta y se requiere una mayor diferencia de presión para impulsar el flujo a lo largo de la superficie de la membrana. Una longitud de cámara más corta y un ancho de cámara más amplio pueden reducir la resistencia al flujo. Por el contrario, la introducción de una vía de flujo uniforme excesivamente ancha en la entrada de la muestra dificulta el mantenimiento de la velocidad del flujo. Por lo tanto, se requiere una geometría correspondiente adecuada para los parámetros de filtración previstos y el rendimiento para un tipo de muestra de entrada y un volumen de entrada específicos.
En una realización, un ejemplo del dispositivo de membrana 600 puede tener una geometría de primera cámara de aproximadamente 20 mm x aproximadamente 42 mm x aproximadamente 0,8 mm con un tamaño de poro de membrana TEM que varía de aproximadamente 0,2 pm a aproximadamente 2,0 pm. Más preferiblemente, la TEM tiene un tamaño de poro en el intervalo de aproximadamente 0,4 pm a aproximadamente 1 pm. Dicho tamaño de poro se selecciona para retener las bacterias en la fase de retenido. Se introduce un hemocultivo positivo en un depósito conectado a la entrada del dispositivo. El flujo tangencial es impulsado por una bomba, jeringa o fuente de presión, etc. En esta realización, la fuente de alimentación es una bomba peristáltica que permite un flujo de recirculación que permite que la muestra fluya a través del dispositivo de membrana en múltiples pases de manera continua en una configuración similar a la FIG. 5.
El caudal tangencial puede estar en un intervalo de 10 a 90 mL/min y más preferiblemente en un intervalo de 40 a 70 mL/min. La presión transmembrana puede estar en el intervalo de 0,5 (aproximadamente 3,45 kPa) a 10 psi (aproximadamente 68,95 kPa) y más preferiblemente en el intervalo de 3 (20,68 kPa) a aproximadamente 8 psi (55,16). La presión transmembrana se aplica utilizando una fuente de presión, vacío, una bomba, una jeringa u otros mecanismos convencionales. El flujo tangencial impulsa la solución de muestra a lo largo de la membrana, mientras que un gradiente de presión a través del filtro/membrana crea la fuerza motriz para impulsar los constituyentes más pequeños o partículas más pequeñas que el tamaño de los poros de la membrana a través de la membrana. El volumen de la fase de retenido disminuye y las bacterias se concentran a medida que continúa el proceso de filtración.
Para reducir la cantidad de constituyentes en la muestra, la muestra se puede tratar previamente para eliminar algunos constituyentes para reducir la posibilidad de que se obstruya la membrana. Por ejemplo, cuando la muestra es un hemocultivo positivo, las células de la sangre del fondo del hemocultivo positivo se eliminan antes del proceso de filtración de la muestra. Esto se puede lograr mediante prefiltración. En otro ejemplo, las células de la sangre en el fondo del hemocultivo positivo se lisan selectivamente antes del proceso de filtración de la muestra. La lisis selectiva de las células de la sangre se puede lograr utilizando un tampón de lisis líquido o un agente de lisis seco que se disuelve o se mezcla con el hemocultivo positivo. Cabe señalar que la selección cuidadosa del agente de lisis diferencial es fundamental para que las células de la sangre se lisen de manera eficiente y rápida sin afectar la viabilidad de las bacterias o su respuesta a los fármacos en la prueba de AST. Estos tampones de lisis suaves son bien conocidos por el experto y no se describen en detalle en la presente memoria. Las sales disueltas, proteínas, etc. en el fondo de un hemocultivo positivo se pueden eliminar enjuagando o lavando con un tampón de lavado adicional, tal como agua desionizada (DI). Este proceso se puede repetir según sea necesario para purificar la fase de retenido para satisfacer el requisito de pureza de las bacterias para las pruebas de MALDI-TOF. Al retenido de bacterias se le pueden añadir tampones de lisis y lavado adicionales para reducir aún más los contaminantes que pueden afectar de manera adversa a los resultados de las pruebas de identificación y susceptibilidad a los antibióticos. En algunas implementaciones, se añade un agente antiespumante al tampón de lisis y/o al tampón de lavado para evitar la formación de espuma durante el proceso de filtración, ya que muchos cultivos positivos pueden crear espumas durante el proceso de filtración dependiendo del tipo de bacteria. La formación de espuma durante el proceso puede ser perjudicial para el proceso y la calidad de la muestra de salida. El agente antiespumante se selecciona y utiliza en cantidades que no afectarán la viabilidad de las bacterias, la ID de MALDI-TOF o la susceptibilidad a los fármacos en la prueba a St . Los agentes antiespumantes son bien conocidos por el experto y no se describen en detalle en la presente memoria.
Para probar el sistema descrito en la presente memoria, se procesaron hemocultivos positivos utilizando una filtración de flujo tangencial de una sola etapa con 8 especies de bacterias diferentes en tres tipos de medios BACTEC. Las bacterias probadas fueronE. coli, S. aureus, S. pneumoniae, S. epidermidis, E. faecalis, K. pneumoniae, P. aeruginosa y E. cloacae.Los frascos de cultivo utilizados fueron un frasco BACTEC estándar, un frasco BACTEC plus y un frasco BACTEC lítico. Se recogió una muestra de sangre (10 mL) en el frasco BACTEC respectivo, que después se inoculó con una especie de bacteria para simular una concentración de bacterias de ~50 CFU/mL en el volumen de sangre. La muestra se incubó en un instrumento de hemocultivo BACTEC hasta que se detectó crecimiento bacteriano. En BACTEC, el crecimiento se detecta monitoreando los cambios en uno de la concentración de oxígeno, la concentración de dióxido de carbono o un cambio en el pH que se considera indicativo de crecimiento microbiano. La concentración típica de bacterias en un cultivo positivo varía entre aproximadamente 106 CFU/mL y 108 CFU/mL. El hemocultivo positivo (aproximadamente 10 mL) se toma del frasco de BACTEC y se lisa mezclándolo con 10 mL de medio de BACTEC lítico (u otra solución tampón de lisis adecuada).
Tradicionalmente, esta mezcla se realiza manualmente rotando con la mano el recipiente con el hemocultivo positivo desde una posición vertical hasta una posición invertida repetidamente. Esta mezcla a veces también se logra mediante características adicionales en el cartucho fluídico, tal como una característica de espina de pescado o burbujeo del fluido. Sin embargo, dicho método es completamente externo a la vía fluídica del cartucho desechable. En una realización de la presente invención, esta mezcla se automatiza y se logra usando un motor para rotar el cartucho desechable desde una posición vertical hasta una rotación entre 1 y 180°. La automatización reduce el tiempo de intervención del técnico, lo que reduce los costos de mano de obra.
Los 20 mL de solución de mezcla lisada se introducen en un sistema de extracción de flujo tangencial como se describe en la presente memoria. Se utilizó un dispositivo de filtración similar al dispositivo de membrana 600 descrito anteriormente. La geometría de la cámara de flujo tangencial en el lado del retenido (es decir, el lado superior como se muestra) de la membrana es de 20 mm de ancho x 42 mm de largo x 0,08 mm de profundidad con un tamaño de poro de membrana de 0,8 pm. El caudal tangencial fue de 60 mL/min. El flujo de la muestra a través del dispositivo de filtración fue impulsado por una bomba peristáltica en el lado de salida de la cámara de filtración de flujo tangencial. La salida de la bomba peristáltica se devolvió al depósito de muestra unido a la entrada del dispositivo de membrana en una disposición similar a la mostrada en la FIG. 5. Dicha disposición permite el flujo tangencial de recirculación continuo de la muestra de fluido múltiples veces sobre la misma superficie de la membrana de filtración. Se aplicó un vacío de 6 psi al lado del permeado de la cámara para proporcionar una presión transmembrana que permitiera que la fase líquida de la muestra que contenía los componentes disueltos o partículas objetivo más pequeñas fluyera a través de la membrana. A medida que continúa el proceso de filtración, se reduce el volumen de la fase de retenido. Las bacterias se retienen en la membrana y se concentran debido al hecho de que está separada de los constituyentes líquidos de la muestra. Cuando el volumen del retenido se reduce a aproximadamente 2 mL, se realizan dos lavados consecutivos con 2,5 mL de agua desionizada (DI) mientras continúa el proceso de filtración, seguidos de una etapa de lisis secundaria utilizando 5 mL del mismo agente lisante. Es posible que el reactivo de lisis ya esté presente en el PBC o que se haya añadido al dispositivo. Los reactivos (por ejemplo, agua desionizada, reactivo de lisis, etc.) se pueden llenar previamente en el dispositivo, añadirse al dispositivo de forma manual o automática a través de conexiones de fluido desde el dispositivo a los depósitos de reactivos. El proceso de filtración continuó y se utilizan cuatro (4) lavados adicionales consecutivos con agua desionizada (2,5 mL cada uno) para eliminar aún más los componentes no deseados. Estas fueron etapas para eliminar los componentes de la muestra no deseados (por ejemplo, sal, restos celulares, hemoglobina, etc.) del componente objetivo (por ejemplo, patógenos) y mantener los componentes objetivo suspendidos en el fluido para su recuperación del dispositivo después del aislamiento, purificación y/o concentración en el dispositivo. Después del lavado final con agua DI, el proceso de filtración se detiene cuando el volumen de retenido alcanza aproximadamente de 1 a 1,5 mL y se recoge la muestra aislada, purificada y/o concentrada para su análisis. En la FIG. 15 se muestran la identificación y la susceptibilidad a antibióticos resultantes de una variedad de bacterias. En los datos de la FIG. 15, los resultados de MALDI se basan en un promedio de tres réplicas biológicas, con tres réplicas técnicas por réplica biológica. Los resultados de AST se basan en un promedio de tres réplicas biológicas. AST EA es el acuerdo esencial de susceptibilidad a los antibióticos y se refiere al porcentaje de afecciones en las que la concentración inhibidora mínima (MIC) está dentro de una dilución doble de la MIC del método de referencia. AST CA es el acuerdo categórico de la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y se refiere al porcentaje de afecciones en las que la interpretación susceptible, intermedia o resistente concuerda con el método de referencia. Tanto para AST EA como para CA, el método de referencia utilizado fue el método Becton Dickinson Phoenix™ según las instrucciones del prospecto del producto.
El proceso descrito anteriormente se puede modificar para tener más o menos etapas de lavado, más o menos volumen por lavado y más o menos etapas de lisis adicionales dependiendo de los requisitos para el tiempo de procesamiento, pureza de la muestra, limitaciones volumétricas, etc. Los parámetros y/o la geometría del proceso se pueden ajustar a partir de aquellos descritos anteriormente para adaptarse a un uso particular del método/dispositivo descrito en la presente memoria.
(3) Recuperación y concentración de bacterias de la muestra de orina
Como se mencionó anteriormente, el dispositivo de membrana 100 se puede implementar para una extracción de una sola etapa, tal como cuando la muestra fluye de manera tangencial a lo largo de un filtro de membrana. Dicho proceso puede implementarse para la recuperación y concentración de bacterias a partir de la orina en un proceso similar al descrito en relación con el ejemplo de muestra de sangre anterior. El siguiente ejemplo muestra cómo se puede aplicar la extracción de flujo tangencial a una muestra de orina para la extracción de bacterias. Se adquirieron muestras de orina y todas dieron negativo en el cultivo antes de recibirlas. Para el procesamiento de la orina se implementó la misma configuración del dispositivo, utilizada para los experimentos de concentración de TEM de sangre entera fresca mencionados anteriormente, con una membrana de tamaño de poro de aproximadamente 0,2 pm a aproximadamente 3 pm. En la prueba, las muestras de orina se enriquecieron conE. colia una concentración de 56 CFU/10 mL antes del proceso de concentración con un dispositivo de membrana. Se usó un sistema de control de presión (por ejemplo, un sistema obtenido de Fluigent) para proporcionar presiones de 1 y 4 psi en el lado de entrada (primera cámara del dispositivo de membrana) para impulsar el flujo tangencial de múltiples pasos. De este modo se procesó una muestra de 10 mL en un dispositivo TEM hasta que el volumen restante alcanzó 0,5 mL, que se recuperó y se sembró en una placa EMB y se cultivó durante la noche. Se utilizó un total de cinco muestras de sujetos distintos. En esta prueba preliminar, la concentración inicial deE. colien la muestra de orina fue de 5,6 CFU/mL y la concentración final deE. colifue de 87 CFU/mL después del proceso de concentración a través del dispositivo de membrana. La recuperación promedio fue del 77 % con un factor de concentración de aproximadamente 16 veces, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2: Resultados promedio de la concentración del dispositivo de TEM para muestras de orina enriquecidas conE. coli,N=5
En otro experimento, la concentración de bacterias en la muestra de orina mostró un aumento de 10 veces en la concentración de bacterias de la muestra original. La p-lactamasa (marcador de resistencia a los antibióticos) se detectó aproximadamente 4 horas más rápido usando la concentración implementada por TEM de muestras de orina enriquecidas que cuando se usó la muestra de orina no concentrada. Los resultados se muestran en el gráfico de la FIG. 6B (mostrando las dos curvas superiores el aumento de velocidad).
B. Proceso de extracción de múltiples etapas
Como se mencionó anteriormente, el dispositivo de membrana 100 se puede implementar para una extracción de múltiples etapas, tal como cuando los componentes de la muestra fluyen de manera tangencial a lo largo de varias membranas, tal como cuando las membranas de cada etapa tienen diferentes características de poro (por ejemplo, tamaño). Dicho proceso puede implementarse para la recuperación y concentración de bacterias o incluso para la extracción y concentración de exosomas a partir de sangre entera fresca o diluida.
(1) Extracción y concentración de exosomas en dos etapas
Los exosomas son vesículas extracelulares cuyo tamaño de partícula varía entre 120 nm y 30 nm encontrándose en muestras de sangre u orina. La mayoría de las células las secretan a través del complejo corporal multivesicular del endosoma y transmiten información a células vecinas o remotas mediante el suministro de RNA y proteínas, afectando así diversas vías de señalización fisiológicas y patológicas. Los exosomas han sido ampliamente investigados debido a su disponibilidad a través de un proceso de biopsia líquida no invasivo y su valor diagnóstico potencial, tal como para la detección de cáncer. La extracción de exosomas se ha realizado mediante varias técnicas, incluyendo el proceso estándar de oro que utiliza tecnologías de ultracentrifugación, precipitación y columnas basadas en afinidad o de exclusión de tamaño. Estas tecnologías pueden llevar mucho tiempo, procedimientos tediosos o adolecer de mala calidad o baja eficiencia de recuperación.
La tecnología actual permite un nuevo proceso para extraer exosomas de muestras biológicas, tal como el uso de una extracción de flujo tangencial de múltiples etapas con dispositivos de membrana. Dicho proceso se describe con referencia a las FIGS. 7A y 7B. Para el proceso de la primera etapa de la FIG. 7A, se recoge sangre completa de un paciente; se aíslan de la sangre partículas grandes tales como los glóbulos rojos (RBCs), los glóbulos blancos (WBCs) y las plaquetas. Como se muestra, este proceso se puede lograr mediante extracción de flujo tangencial para separar el plasma de los componentes de la sangre más grandes usando un dispositivo de membrana como se describió anteriormente. Alternativamente, dicha extracción/separación se puede lograr con centrifugación normal. En relación al proceso de flujo tangencial mostrado, los exosomas permanecen en la fase de plasma junto con otras especies tales como proteínas, péptidos y sales disueltas. Dicha separación del plasma de la sangre se puede lograr usando un dispositivo de membrana tal como una TEM con un tamaño de poro del orden de aproximadamente 0,2 pm a aproximadamente 1 pm (0,4 pm como se muestra en la FIG. 7A). La<t>E<m>puede intercalarse entre una primera cámara (cámara 704) para flujo tangencial y una segunda cámara (cámara 706) para recoger plasma con exosomas. Se aplica una presión transmembrana para impulsar el flujo de plasma a través de la membrana 708 (por ejemplo, TEM) del dispositivo de membrana 700A (lado de salida de la membrana en la cámara 706) mientras se mantienen las células y plaquetas en la primera cámara (cámara 704) (lado de entrada de la membrana en la cámara 704).
La segunda etapa, como se muestra en la FIG. 7B se puede implementar con un dispositivo de membrana adicional 700B para procesar la salida (es decir, el permeado) del dispositivo de membrana 700A. El dispositivo procesará el plasma que contiene exosomas en la entrada de la muestra (primer lado de la membrana 708 en la cámara 704) y aislará las partículas de exosomas en el lado de entrada eliminando las especies disueltas tales como proteínas, péptidos, DNA, etc. a la salida (segundo lado de la membrana 708 en la cámara 706). La extracción se puede lograr mediante un proceso de flujo tangencial de TEM usando un dispositivo que consiste en una primera cámara (cámara 704) y una segunda cámara de filtrado (cámara 706) separadas por una membrana 708 (por ejemplo, TEM). El tamaño de los poros de la membrana puede ser del orden de 0,1 pm o menor (0,05 pm como se muestra). La muestra de plasma fluye de manera tangencial a lo largo de la membrana grabada en pista en la primera cámara y el líquido con sales disueltas y otras partículas más pequeñas fluye a través de la membrana aplicando una presión transmembrana. El sistema modificado genéticamente permite un flujo dual equilibrado a lo largo (tangencial) y a través (trans) de TEM (membrana 708), donde los exosomas se retienen en el lado de la primera cámara (cámara 704) de la membrana y se enriquecen. Un proceso adicional, tal como el lavado de los exosomas mediante la introducción de un tampón de lavado en la primera cámara en esta etapa y la repetición del proceso, puede purificar aún más los exosomas aislados. Alternativamente, se puede añadir un tampón de lavado al comienzo de la segunda etapa o en medio de la segunda etapa de extracción de exosomas. El proceso de lavado se puede repetir si es necesario.
Alternativamente, se pueden añadir etapas adicionales al proceso para extraer exosomas de diferentes tamaños y/o aumentar la pureza de los exosomas extraídos. Por ejemplo, después de la primera etapa de separación de plasma usando TEM de poro de 0,4 pm y la segunda etapa del proceso TEM de poro de 0,05 pm como se describió anteriormente, la muestra (por ejemplo, retenido de la etapa 2) se puede filtrar adicionalmente usando un dispositivo de membrana con una membrana que tiene un tamaño de poro del orden de 0,1 o 0,2 pm para eliminar partículas más grandes. Esta tercera etapa de filtración también se puede realizar entre el proceso de la primera etapa y el de la segunda etapa.
En un ejemplo de la filtración de la segunda etapa de la FIG. 7B usando un dispositivo de TEM de flujo tangencial con un tamaño de poro de 0,05 pm, se caracterizó la tasa de filtración de plasma y se confirmó que era factible. La Tabla 3 a continuación muestra que la tasa de filtración varía con la presión transmembrana.
Tabla 3
El análisis del tamaño de partículas mediante dispersión dinámica de luz (DLS) mostró que el radio hidrodinámico de las partículas extraídas coincide con el intervalo de tamaño esperado de los exosomas. El análisis del tamaño de partículas en función de la presión transmembrana se muestra en las FIGS. 8 y 9. El filtrado después de la filtración con un tamaño de poro de 0,05 pm mostró un tamaño de partícula promedio de alrededor de 10 nm para las tres presiones transmembrana: 20,68 kPa (3 psi), 41,37 kPa (6 psi) y 62,05 kPa (9 psi). No se encontraron partículas con un radio hidrodinámico superior a 50 nm. El retenido contiene tamaños de partículas de alrededor de 100 nm en promedio, que son tamaños de partículas típicos de exosomas. Como se muestra en la FIG. 9, la presión transmembrana tuvo cierta influencia en el tamaño promedio de las partículas recogidas en el retenido. La FIG. 8 (retenido) y FIG. 9 (filtrado) muestran el tamaño hidrodinámico ponderado por intensidad de las partículas de exosoma extraídas usando un proceso de dos etapas como se describe, sin el proceso de lavado.
(2) Extracción de bacterias en dos etapas a partir de sangre completa, sangre diluida o un hemocultivo positivo
Cuando se extraen bacterias de sangre completa donde están presentes muchos glóbulos rojos, se puede utilizar un proceso de múltiples etapas (al menos dos o más) para lograr el nivel de pureza y concentración de la sustancia objetivo (por ejemplo, bacterias). Por ejemplo, se puede implementar un proceso de dos etapas donde el proceso de la primera etapa separará partículas celulares grandes (por ejemplo, glóbulos rojos, glóbulos blancos o plaquetas) de la sangre completa, sangre completa diluida o muestra de hemocultivo completo y los desechos más grandes (en caso de sangre lisada). Los desechos más grandes son partículas mayores que un tamaño de poro predeterminado que permitirán que las bacterias u otras sustancias objetivo pasen a través de la membrana. Las bacterias permanecen en la fase de permeado que pasa a través la membrana en el proceso de la primera etapa. En la FIG. 13 se muestra una ilustración del flujo tangencial y el flujo transmembrana (filtro) que permite a las bacterias pasar a través de la membrana.
Para permitir que las bacterias pasen a través del dispositivo de membrana, se debe utilizar una membrana con tamaños de poros del orden del tamaño de las bacterias o mayores. Se encontró que una membrana grabada en pistas con un tamaño de poro del orden de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 pm es adecuada para este propósito. Como se describió anteriormente, el dispositivo de membrana incluye una primera cámara (una cámara de entrada) y una segunda cámara (una cámara de salida) separadas por una membrana (por ejemplo, TEM). Se aplica una presión transmembrana para impulsar las bacterias a través de la membrana (es decir, en el permeado) mientras se mantienen las células y plaquetas en la primera cámara (es decir, el retenido). Tanto el flujo tangencial como el flujo transmembrana (como se describió anteriormente) pueden ser impulsados por fuentes de presión y/o vacío en el lado de entrada y/o el lado de salida. El flujo tangencial puede ser un flujo unidireccional. Un flujo unidireccional puede ser un flujo tangencial de un solo paso o un flujo rotacional de múltiples pasos en la primera cámara, tal como un flujo de recirculación impulsado por una bomba de fluido.
Alternativamente, el flujo tangencial puede ser un flujo alternativo donde el flujo sanguíneo invierte su dirección para permitir que el fluido fluya sobre la misma superficie de la membrana múltiples veces para completar el proceso de filtración con un volumen de entrada de muestra limitado y reducir la obstrucción de la membrana.
El proceso de la segunda etapa puede tomar el permeado rico en bacterias de la primera etapa como entrada de muestra y procesarse usando una membrana secundaria, tal como una TEM adicional para el flujo tangencial en otro dispositivo de membrana. Este proceso de flujo tangencial de TEM secundaria utilizando un dispositivo que tiene una cámara primera o superior y una cámara segunda o inferior separadas por una TEM con un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 pm a aproximadamente 1,2 pm. A medida que el permeado rico en bacterias del proceso de filtración de la etapa 1 se utiliza como muestra de entrada a la segunda etapa, y la muestra fluye a lo largo de la membrana grabada en pista en la cámara superior, el líquido fluye a través de la membrana aplicando una presión transmembrana. El sistema modificado genéticamente permite flujos duales equilibrados a lo largo (tangencial) y a través (trans) de la membrana TEM donde las bacterias se enriquecen, retienen y permanecen viables en la primera cámara. Los caudales tangenciales y trans se seleccionan para evitar la obstrucción de la membrana debido a fenómenos tales como la formación de capas de torta o la obstrucción de los poros con partículas y para optimizar el tiempo de procesamiento de la muestra sin introducir cizallamientos o lisis no deseadas de componentes celulares. Las bacterias que permanecen en la cámara primera o superior se pueden recuperar para las pruebas de la siguiente etapa, tales como la detección, la identificación o la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Opcionalmente, se puede utilizar un lavado adicional para purificar aún más la muestra eliminando las sales disueltas, proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, lípidos, etc., tal como utilizando uno o más dispositivos de membrana adicionales. El tampón de lavado u otro líquido adecuado se puede introducir al principio, durante o al final del proceso de concentración. El proceso de concentración se puede repetir después de la adición de la solución tampón para alcanzar un factor de concentración objetivo.
En un ejemplo de dicho proceso, se evaluó el rendimiento de un dispositivo de TEM de mayor tamaño de poro para una primera etapa en un proceso de múltiples etapas con bacterias en sangre completa en frascos BD BACTEC lítico (sangre lisada) y BD BACTEC estándar (sangre no lisada) aunque podrían usarse otros tipos de medios de hemocultivo. La selección inicial utilizó membranas grabadas en pistas con tamaños de poro de aproximadamente 2 pm y aproximadamente 5 pm respectivamente. Se encontró queE. colien la sangre puede atravesar membranas con tamaños de poro de 2 pm y 5 pm con alta eficiencia (>95%). En el gráfico de la FIG. 10, se representa gráficamente la tasa de recuperación de bacterias que muestra que tanto el frasco lítico (barra 1024) como el frasco estándar (barra 1022) tuvieron una buena recuperación de bacterias.
Se seleccionó un dispositivo de TEM con un tamaño de poro de membrana de aproximadamente 2 pm para realizar otra prueba para comprender la eficacia de separar las células de la sangre de las bacterias de la muestra de hemocultivo positiva. Se creó una muestra de sangre rica en bacterias utilizando sangre enriquecidacon E. colien un frasco BACTEC estándar con incubación. Se utilizó un dispositivo de TEM de un solo paso para separar las bacterias del hemocultivo positivo. Se procesó una muestra de sangre rica en bacterias de 5 mL mediante un proceso de paso único impulsado por una fuente de vacío. Se varió la potencia del vacío para estudiar el efecto de la presión transmembrana sobre la recuperación de bacterias y la eliminación de células de la sangre después del proceso de filtración. La solución bacteriana recuperada se analizó adicionalmente para determinar el recuento sanguíneo completo (CBC) del residuo, la hemoglobina libre en plasma y la concentración deE. coli,para estimar la pureza de la suspensión bacteriana. Los resultados de la Tabla 4 a continuación mostraron que el rendimiento del permeado, la tasa de recuperación de bacterias y el CBC residual en la fase de permeado no cambian mucho a medida que cambia la presión transmembrana (TMP). El único residuo en la fase plasma/bacterias es una pequeña porción de plaquetas. Esto es una indicación de que el proceso tiene una ventana de operación relativamente grande. Cabe señalar que también se realizó un proceso de múltiples pases y tiene un rendimiento de separación similar al del proceso de un solo pase.
Tabla 4
De lo anterior, queda claro que el permeado contiene muy pocos glóbulos blancos y glóbulos rojos, ya que la cantidad está por debajo de los límites de detección (LOD). El rendimiento en el permeado fue ligeramente mayor para los dispositivos con mayor presión transmembrana, con una recuperación ligeramente mayor deE. Coli.Estos resultados preliminares mostraron que es posible la separación de bacterias de la sangre completa.
Como se describió anteriormente, la extracción de flujo tangencial puede servir como un proceso de concentración y lavado que aislará rápidamente las bacterias de hemocultivos positivos (ya sean muestras de sangre completa o muestras de sangre diluidas) para la identificación y/o las pruebas de susceptibilidad a antibióticos. En un ejemplo de dicho proceso, se recogen de aproximadamente 8 mL a aproximadamente 10 mL de muestra de sangre del paciente en un frasco BACTEC y se inoculan con bacterias tales comoE. coli, S. aureus, S. pneumoniaey otras bacterias. La muestra se incuba en un instrumento de hemocultivo BACTEC hasta que se detecta un hemocultivo positivo. Aproximadamente 8 horas o menos después de la detección, el hemocultivo positivo se aplica a un proceso de extracción de flujo tangencial donde se aislarán y lavarán las bacterias. El dispositivo de membrana 600 (o dispositivo de extracción de flujo tangencial), similar a los ejemplos discutidos anteriormente, tiene una primera cámara 610 (por ejemplo, cámara de entrada o superior) y una segunda cámara 620 (por ejemplo, cámara de salida o inferior) separadas por una membrana grabada en pista (TEM) 630. La muestra fluye (repetidamente si se utiliza un proceso de múltiples pases) a lo largo de la membrana grabada en pista en el dispositivo de membrana 600 en la primera cámara (por ejemplo, la cámara superior (104 en la FIG. 1) y la fase líquida parcial fluye a través de la membrana grabada en pista 108 (TEM; FIG. 1) en la segunda cámara (por ejemplo, cámara inferior; 106 en la FIG. 1) aplicando una presión transmembrana. Esta primera etapa del proceso de filtración puede tener un tamaño de poro que varía de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 5,0 pm. Dicho tamaño de poro se selecciona para permitir que las bacterias pasen a la fase de permeado. En un breve período de tiempo (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 minutos), 20 mL de la muestra de PBC se procesa, con bacterias viables en la fase de permeado y células sanguíneas huéspedes y desechos en la fase de retenido. El permeado de la etapa 1 (aproximadamente 17 mL) se procesa después para la segunda etapa. La segunda etapa del proceso de filtración puede tener un tamaño de poro que varía de aproximadamente 0,2 pm a aproximadamente 1,2 pm. Dicho tamaño de poro se selecciona para permitir que la bacteria permanezca en la fase de retenido. Al permeado de la etapa 1 se le pueden añadir tampones de lisis o lavado adicionales para reducir aún más los contaminantes que pueden afectar de manera adversa a los resultados de las pruebas de identificación y susceptibilidad a los antibióticos. El flujo tangencial impulsa la solución de alimentación (por ejemplo, el permeado de la etapa 1) a lo largo de la membrana, lo que puede evitar la obstrucción como se analiza con más detalle en la presente memoria, mientras que un gradiente de presión a través del filtro/membrana crea la fuerza motriz para impulsar los constituyentes o partículas más pequeños que el tamaño de los poros de la membrana, a través de la membrana. En un breve período de tiempo (por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 minutos), las bacterias se concentran a medida que se reduce el volumen según sea necesario para permitir el nivel de concentración requerido con la pureza necesaria. En la FIG. 16 se muestran los resultados de identificación y susceptibilidad a los antibióticos de una variedad de bacterias procesadas mediante este proceso de filtración en dos etapas. En los datos de la FIG. 16, los resultados de MALDI se basan en un promedio de tres réplicas biológicas, con tres réplicas técnicas por réplica biológica. Los resultados de AST se basan en un promedio de tres réplicas biológicas. AST EA es el acuerdo esencial de susceptibilidad a los antibióticos y se refiere al porcentaje de afecciones en las que la concentración inhibidora mínima (MIC) está dentro de una dilución doble de la MIC del método de referencia.<a>S<t>CA es el acuerdo categórico de la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y se refiere al porcentaje de afecciones en las que la interpretación susceptible, intermedia o resistente concuerda con el método de referencia. Tanto para AST EA como para CA, el método de referencia utilizado fue el método Becton Dickinson Phoenix™ que utiliza una etapa de subcultivo de 18-24.
(C) Realizaciones adicionales
En otro ejemplo, la tecnología del dispositivo de membrana de flujo tangencial se puede implementar para proporcionar una solución de un filtro paso banda que emplea un proceso de dos etapas que separa/extrae los constituyentes de interés, tales como patógenos de interés, de componentes tanto más grandes como más pequeños en la muestra basada en diferencias de tamaño inherentes de los diversos componentes/constituyentes. El filtro paso banda, tal y como el mostrado en la FIG. 11, retiene componentes extraños grandes (por ejemplo, células sanguíneas) mientras que la muestra de interés (bacterias) y los desechos pequeños pasan hasta el retenido. Dicho proceso de filtración puede considerarse en relación con las siguientes etapas:
1. Dispositivo de membrana de filtro paso alto. Una etapa de filtración emplea un dispositivo de membrana como un filtro paso alto que deja pasar los componentes más pequeños de una muestra, tal como una bacteria de interés, mientras excluye componentes más grandes, tales como glóbulos rojos y blancos. El dispositivo de membrana de filtro paso alto emplea una membrana (por ejemplo, TEM) con tamaños de poro en un intervalo suficientemente mayor de aproximadamente 0,5 pm y menor de aproximadamente 8 pm tal como en un intervalo de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 5 pm en diámetro para establecer un tamaño de corte que excluya los componentes de la sangre que normalmente son mayores de aproximadamente 5 pm de diámetro.
2. Dispositivo de membrana de filtro paso bajo. En otra etapa de filtración, se emplea un dispositivo de membrana como filtro paso bajo. Por ejemplo, las bacterias y los desechos que las acompañan que pasaron a través del dispositivo de membrana de filtro paso alto entonces se procesan posteriormente con un dispositivo de membrana que sirve como filtro paso bajo. El filtro paso bajo utiliza una membrana tal como una TEM con diámetros de tamaño de poro elegidos para retener las bacterias relativamente grandes y permitir la eliminación de restos, analitos y desechos. Por ejemplo, dicho tamaño de poro puede ser del orden de aproximadamente 0,4 pm a aproximadamente 1 pm para la membrana de filtro paso bajo.
El resultado final es la muestra de interés separada del fondo sanguíneo, de manera rápida (por ejemplo, del orden de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 minutos), y lista para procesos posteriores, tales como pruebas de identificación, pruebas de marcadores de resistencia, pruebas de susceptibilidad, siembra en placas, medición de turbidez, cultivo, secuenciación y/u otros procesos que se realizan de forma rutinaria en un laboratorio de microbiología, clínico o de investigación.
Dicho proceso de ejemplo se muestra aún más en el diagrama de flujo del proceso de la FIG. 12. En la etapa 1, se obtiene un hemocultivo. En la etapa 2, el hemocultivo se aplica a un dispositivo de membrana de flujo tangencial que produce un permeado de constituyentes de la muestra más pequeños que el tamaño del filtro, tal como 3,0 pm. Opcionalmente, en la etapa 3 de lisis, el permeado se puede combinar con un medio lítico. Después, en la etapa 4, el permeado se puede aplicar a otro dispositivo de membrana de flujo tangencial que produce otro permeado de constituyentes más pequeños que el tamaño del filtro, tal como 0,4 pm, eliminando los constituyentes más pequeños del retenido de interés. En la etapa 5, las bacterias se recuperan del concentrado del retenido de la etapa 4. Un aparato de ejemplo para dicho proceso se muestra, por ejemplo, en la FIG. 13.
(D) Beneficios de la tecnología
Los procesos tecnológicos descritos en esta memoria descriptiva pueden tener diversos beneficios. Por ejemplo, la tecnología podría facilitar las pruebas de identificación y de susceptibilidad a los antimicrobianos directamente a partir de un hemocultivo (PBC) positivo sin necesidad de subcultivos adicionales, reduciendo el tiempo de obtención de resultados hasta aproximadamente dieciocho (18) horas o más. Esta reducción del tiempo para obtener resultados puede tener un impacto positivo significativo en las decisiones terapéuticas clínicas, lo que resulta en mejores resultados para los pacientes, así como en ahorros de costos institucionales.
Los métodos actuales para procesar un PBC incluyen técnicas tradicionales de subcultivo o centrifugación. Los intentos anteriores se ven seriamente limitados por los tiempos de procesamiento y los procedimientos complicados.
Alternativamente, se pueden emplear técnicas de centrifugación tradicionales para aislar bacterias directamente del PBC para superar este retraso, pero requieren una serie de laboriosas etapas de centrifugación y lavado para obtener una muestra pura lista para las pruebas de ID/AST posteriores.
La tecnología propuesta puede superar las limitaciones de dichos procesos proporcionando una solución que aísla la muestra de interés del p Bc en un corto período de tiempo, tal como menos de aproximadamente 15 a 30 minutos, sin la necesidad de múltiples etapas de centrifugación o lavado disminuyendo tanto el tiempo de obtención de resultados como el número de procedimientos laboriosos. Además, la tecnología actual puede automatizarse fácilmente, a diferencia de los enfoques de centrifugación, para permitir un procesamiento de alto rendimiento.
Los intentos tecnológicos anteriores para procesar directamente un PBC usando filtración se basaban tradicionalmente en técnicas de filtración sin salida. En la filtración sin salida, la solución de alimentación solo se impulsa perpendicular a la membrana y la presión resultante se utiliza para forzar las partículas más pequeñas que el diámetro de los poros a través del filtro. Sin embargo, las partículas más grandes que el diámetro de los poros se acumulan en la superficie de la membrana para formar una torta que eventualmente obstruye el filtro. Las soluciones comunes para superar esta limitación son lisar y digerir la muestra de PBC antes de la filtración en un intento de reducir el tamaño total de las partículas para restringir la formación de la torta. Sin embargo, estudios previos han demostrado que lisar y digerir la muestra tiene un impacto negativo en la viabilidad de los microorganismos objetivo, lo que afecta al rendimiento de los estudios de ID/AST posteriores, impidiendo de manera efectiva la adopción de intentos de la técnica anterior.
La tecnología propuesta como se describe en la presente memoria puede basarse en la filtración de flujo tangencial que ofrece ventajas significativas sobre la filtración sin salida, tal como por ejemplo evitar la obstrucción de la filtración. La filtración de flujo tangencial (como se describe en detalle en la presente memoria) lava continuamente el filtro a medida que la solución se alimenta de manera tangencial a lo largo de la membrana para evitar la obstrucción, tal como con una bomba peristáltica en una operación de múltiples pases. También puede proporcionar el beneficio de la filtración repetida de una muestra determinada para mejorar la concentración y evitar la obstrucción. Como resultado, la entrada de PBC (tal cual, lisada o digerida) puede ser más flexible para esta filtración de flujo tangencial, lo que reduce aún más la complejidad y aumenta el rendimiento.
Como se analiza en la presente memoria, el aparato con dispositivos de membrana de filtro paso banda puede habilitarse con filtración de flujo tangencial (una filtración de flujo cruzado). Como se describe, la filtración de flujo tangencial (TFF) puede entenderse como un tipo de filtración que pasa la solución de alimentación (la muestra) de manera tangencial a lo largo de la superficie de la membrana en lugar de simplemente directamente perpendicular como en la filtración sin salida. Una ventaja significativa de la TFF es que la solución de alimentación que fluye de manera tangencial reduce el endurecimiento de la membrana y la obstrucción de los poros de la membrana, aumentando de manera efectiva tanto el rendimiento como la duración de la operación. El flujo repetido de la solución sobre la misma área de superficie reduce la posibilidad de pérdida de microorganismos específicos a la superficie de la membrana, ya que se puede lograr una filtración efectiva mediante múltiples pases de la muestra sobre la misma superficie. Además, dado que la muestra está expuesta preferiblemente a la superficie superior de la membrana en lugar de a una gran superficie interior (como ocurre con las membranas fibrosas), existe una menor posibilidad de pérdida de microorganismos objetivo debido a la adherencia a la membrana en comparación con enfoques en los que la muestra se permite pasar a través de un espesor de filtro fibroso u otro de superficie interior superior. Además, se forma un diferencial de presión normal a la membrana que sirve como fuerza motriz para impulsar las partículas más pequeñas que el diámetro de los poros a través de la membrana, tal como mediante la aplicación de un diferencial de presión negativo (por ejemplo, un diferencial de presión negativo constante) mantenido con vacío o bomba de vacío.
Los ejemplos de la tecnología descrita pueden aislar bacterias de interés del PBC (u otra muestra biológica) separando los componentes de la muestra basándose en diferencias inherentes de tamaño usando, por ejemplo, un enfoque de paso banda. La tecnología puede emplear filtración de flujo tangencial de múltiples pases como se describe en la presente memoria.
Opcionalmente, se usa un cartucho desechable para aislar bacterias de las otras partes de la muestra usando un dispositivo de membrana de flujo tangencial. El funcionamiento de un ejemplo de dicho cartucho desechable se describe en la FIGS. 14A-K. Como se muestra, el cartucho 800, que está formado sobre un sustrato de cartucho (no mostrado), tiene una vía de fluido 805 para extraer muestra de una jeringa o frasco de cultivo (no mostrado) al cartucho y posteriormente procesar la muestra. La muestra se extrae de una jeringa o frasco de cultivo a través del puerto 810. Un ejemplo de un puerto 810 adecuado es un conector luer.
La muestra se extrae a través de una pantalla de filtro o membrana porosa 815. El tamaño de poro del filtro o membrana porosa se selecciona para evitar que la resina en la jeringa o frasco de cultivo fluya hacia la cámara principal 820. El tamaño de poro para un filtro o membrana que evitará selectivamente que la resina pase a través de la membrana o filtro, pero permitirá que otros constituyentes de la muestra pasen a través, es bien conocido por un experto en la técnica. Se contemplan tamaños de poro de membrana en el intervalo de aproximadamente 25 pm a aproximadamente 100 pm, pero el experto puede seleccionar otro tamaño de poro si así lo justifica el tamaño de partícula de la resina. Las partículas de la resina tienen normalmente al menos aproximadamente 10 pm o más de diámetro, que es mucho más grande que los otros constituyentes de la muestra (glóbulos rojos, glóbulos blancos, contaminación microbiana (si está presente), etc.
Aunque se muestra como una disposición aparentemente plana, en una realización el puerto 810, el filtro 815 y el vial 845 están en un lado de un sustrato de cartucho (no mostrado) y el compartimento principal 820, el filtro 835, la cámara de lavado 830 y otros componentes para procesar el muestra y mostrados en las FIGS. 14A-14K están en el lado opuesto del sustrato.
Haciendo referencia a la FIG. 14A, el dispositivo 800 está en su estado inicial con todas las válvulas 821, 822, 823, 824, 825 y 826 cerradas. Cuando el cartucho está en este estado, la cámara principal 820 se llena previamente con tampón de lisis y la cámara de lavado 830 se llena con tampón de lavado. Los tampones de lisis y los tampones de lavado que son adecuadamente suaves para garantizar que la contaminación microbiana aislada de la muestra biológica permanezca viable para el análisis posterior son bien conocidos por el experto y no se describen en detalle en la presente memoria.
Haciendo referencia a la FIG. 14B, después de que el dispositivo 800 está instalado en el instrumento (no mostrado), la válvula 821 se abre para ventilar la vía de fluido 805. Esto se muestra mediante la vía de flujo 859. El frasco de muestra (no mostrado) está conectado al puerto y la válvula 821 a continuación, se vuelve a cerrar.
En las FIGS. 14C-F, el dispositivo 800 se rota desde la posición vertical (por ejemplo, FIG. 14B) a la posición lateral (por ejemplo, FIG. 14C). El procesamiento de la muestra requiere que el frasco de cultivo de PBC esté en posición vertical para determinada etapa (es decir, ventilación) y con el cuello ligeramente hacia abajo para otras etapas (alícuotas).
Haciendo referencia a la FIG. 14C, el dispositivo 800 se rota hasta la posición en la que la muestra (es decir, el hemocultivo positivo (PBC)) se extraerá del dispositivo. En esta posición, la válvula de salida del filtro 826 se abre y se genera un vacío a través de la línea 860. La bomba 855 (por ejemplo, una bomba peristáltica) se hace funcionar para generar un vacío en la cámara principal 820. La cámara principal 820 se expulsa a la atmósfera a través del colector de vacío como se muestra para la vía de flujo 860. En algunas realizaciones, se pueden tomar alícuotas automáticamente de un volumen de aproximadamente 2 mL-20 mL del hemocultivo positivo. Actualmente, se utilizan técnicas manuales para volúmenes de alícuotas inferiores a 2 mL y para ventilar frascos de PBC. La ventilación se realiza normalmente colocando una aguja (no mostrada) a presión atmosférica en el septum del frasco de PBC. Los medios de alícuotas tradicionales utilizan una jeringa con una aguja o un vacío conectado a un sistema de aguja para extraer la muestra del frasco de cultivo. Ambos métodos funcionan para volúmenes pequeños, pero encuentran dificultades significativas al extraer volúmenes más grandes debido a la falta de espacio de cabeza en el frasco. El cuello del frasco de PBC es largo y estrecho, por lo que una aguja de longitud normal no alcanzará el nivel del fluido cuando el frasco esté en posición vertical. Para superar esto, los técnicos suelen poner la botella boca abajo para desplazar el fluido hacia el cuello de la botella. Aunque este método funciona para la mayoría de los tipos de medios, los frascos tales como los frascos BACTEC™ Plus contienen perlas de resina que se llenan y se depositan en el cuello del frasco. Si un técnico intenta utilizar una jeringa normal en esa posición, las perlas de resina obstruirán la punta de la aguja impidiendo el flujo de líquido. Si el técnico rota la botella en ángulo en lugar de al revés, podrá extraer volúmenes de 1 a 2 mL del frasco, pero todavía con dificultad. Las perlas de resina pueden seguir obstruyendo total o parcialmente la aguja.
El cartucho descrito en la presente memoria resuelve estos problemas y facilita un flujo de trabajo ventajoso. En la primera etapa, se conecta el frasco de PBC a un cartucho. Esto se muestra con referencia a la FIG. 22B. Allí, se puede ver que el frasco 3010 se inserta en un puerto 3055. En una realización, el frasco de PBC 3010 ingresa al cartucho 2070 en una posición vertical. Este puerto 3055 contiene un material (tal como una esponja) que contiene un desinfectante. Esto es para garantizar que la superficie del septum del frasco de PBC no contamine la muestra de PBC. A medida que el frasco de PBC 3010 se presiona contra el material desinfectante, una aguja (no mostrada) perfora el septum del frasco de PBC 3010. Después, el instrumento acciona una válvula (no mostrada) y ventila el frasco de PBC 3010 (por ejemplo, a través de una ventilación hidrofóbica). Para reducir cualquier riesgo de aerosolización, se proporcionan rejillas de ventilación hidrofóbicas con tamaños de poro (por ejemplo, aproximadamente 0,1-0,45 pm) para evitar que la contaminación microbiana (por ejemplo, bacterias) escape del sistema, pero permiten la liberación de vacío o presión del frasco de PBC 3010.
Volviendo a hacer referencia a la FIG. 14C, una vez que se rota el frasco de PBC, es ventajoso hacer una pausa de aproximadamente 1 a 120 segundos para permitir que las perlas de resina se asienten en la base del frasco. Se puede usar un instrumento para rotar el frasco de PBC 3010 (FIG. 22B)/dispositivo desechable 800 desde una posición vertical hasta un ángulo en el que el cuello del frasco sea igual o inferior al paralelo (por ejemplo, 0°-25°) con un motor pequeño (no mostrado). Para alícuotas del frasco de PBC (3010 en la FIG. 22B), el instrumento utiliza un mecanismo de bombeo del instrumento 855 (por ejemplo, vacío, peristáltico, etc.) para extraer aproximadamente 2-20 mL del contenido del frasco de PBC 3010 (FIG. 22B) en la cámara de llenado principal 820 del cartucho desechable 2070. Todos los fluidos permanecen en el dispositivo 800 y no tienen contacto directo con el instrumento. El volumen de extracción está definido por la geometría de la cámara de llenado principal 820 en combinación con un sensor de llenado automático 865 que detecta cuando la cámara está llena y detiene el llenado automático. A medida que el fluido llena la cámara de llenado principal 820 en el dispositivo desechable, el fluido eventualmente llena un área delante de un sensor capacitivo del sensor de llenado automático 850. Una vez que el sensor capacitivo detecta el fluido, detiene la extracción de muestra y el instrumento rota la botella de PBC 3010 (FIG. 22B)/dispositivo 800 de nuevo a la posición vertical. En esta realización, el volumen de la cámara de llenado principal 820 define el volumen de la alícuota extraída del frasco de muestra 3010 (FIG. 22B). Para evitar que cualquier perla de resina entre en el dispositivo desechable 800, se dispone una membrana dentro de una carcasa (no mostrada). La membrana filtra las perlas mediante flujo lateral o transversal a medida que la muestra del frasco de PBC 3010 (FIG. 22B) se introduce en el dispositivo 800 (FIG. 14C).
Haciendo referencia a la FIG. 14D, el dispositivo 800, las válvulas en línea 822 y 824 se abren y el tampón de lisis en el canal sensor 865 se purga dentro de la cámara principal 820. Después se apaga la bomba peristáltica 855 y después se cierra la válvula de salida del filtro 826 (mostrada como abierta).
Haciendo referencia a la FIG. 14E, después se opera el dispositivo 800 para extraer el PBC a la cámara principal 820 a través de la vía de flujo 870. Como se señaló anteriormente, la membrana 815 evita que la resina en el PBC entre en la cámara principal 820. Sin embargo, el resto de la muestra de PBC pasa a través de la membrana 815 para entrar a la cámara a través de la vía de flujo 870. Las válvulas 822 y 824 se abren y el vacío 875 se activa para extraer la muestra de PBC hacia la cámara principal 820. Una vez que el PBC llena la cámara principal 820 suficientemente, el PBC será extraído en el canal del sensor 865. El sensor 850 después apagará el vacío 875 y cerrará las válvulas 822 y 824 (mostradas como abiertas).
Haciendo referencia a la FIG. 14F, el dispositivo 800 se rota después a una posición vertical. Las válvulas 821, 822, 824 y 826 se abren, lo que hace que el aire fluya hacia la cámara principal 820 a través de la válvula 821. El PBC fluye desde la cámara principal 820 a través del filtro 835 extraído por el vacío 875. El permeado de la muestra fluye a través de la membrana de filtro 835 hacia la cámara de residuos 880 como se describe en la presente memoria. El retenido, que transporta los microorganismos, fluye de manera tangencial a lo largo de la membrana de filtro 835. La bomba peristáltica 855 mueve el fluido retenido de regreso a la cámara principal 820.
Haciendo referencia a la FIG. 14G, las válvulas 824 y 826 se cierran y la válvula de la cámara de lavado 825 se abre para permitir que el tampón de lavado fluya desde la cámara del tampón de lavado 830 a la cámara principal 820. La cámara principal 820 se ventila a la atmósfera en esta configuración. La bomba peristáltica 855 se activa durante un tiempo predeterminado para dosificar una cantidad predeterminada de tampón de lavado en la cámara principal 820. Después de añadir el tampón de lavado a la cámara principal 820, el dispositivo 800 reanuda la configuración descrita en la FIG. 14F para filtrar aún más el contenido de la cámara principal 820. El funcionamiento del dispositivo se controla a través de un número predeterminado de ciclos de filtrado y lavado. Cuando el sistema alcanza el ciclo de lavado final, la bomba peristáltica 855 se activa durante un tiempo establecido más prolongado para garantizar que la cámara de lavado esté completamente vacía. La cámara de lavado se vacía para que el dispositivo pueda purgarse del retenido y extraerse el retenido como se describe a continuación.
Haciendo referencia a la FIG. 14H, en la primera etapa de purga, el dispositivo 800 purga el retenido del bucle de flujo de retenido descrito anteriormente de regreso a la cámara principal 820. En la primera etapa de purga, la bomba peristáltica 855 se activa para limpiar el canal de retorno 885 que está entre la salida del filtro 835 y la cámara principal 820. Como se describió anteriormente, la cámara de lavado 830 está vacía en esta etapa y la válvula 825 se abre y el canal se ventila, purgando así el canal 885.
Haciendo referencia a la FIG. 14I, en la segunda etapa de purga, la bomba peristáltica 855 se activa para limpiar el filtro 835 y evacuar el aire del vial de extracción 845. En este estado, las válvulas 821, 823, 824 y 826 se abren. Bajo esta condición, se crea un vacío dentro del vial de extracción 845. El vial 845 puede evacuarse en otras etapas del proceso. En una realización, el vial está al vacío cuando se ensambla con el sistema. En otra realización, el vial se puede evacuar a través de una línea de vacío. En esa configuración, las válvulas 823 y 824 están abiertas y al menos las válvulas 822 y 826 están cerradas.
Haciendo referencia a la FIG. 14J, la bomba peristáltica 855 se apaga y las válvulas 821, 822 y 823 se abren y todas las demás válvulas se cierran. La vía de flujo va desde la cámara principal 820 hasta el vial 845. Debido a que el vial 845 está al vacío, el retenido en la cámara principal 820 se extrae hacia el vial 845
Haciendo referencia a la FIG. 14K, todas las válvulas del dispositivo 800 están cerradas. El vial 845 se separa del dispositivo y el retenido que contiene se utiliza para pruebas microbianas (u otros usos posteriores). Las porciones restantes del dispositivo 800 pueden desecharse. Cabe señalar a este respecto que la bomba peristáltica, el vial y el frasco de muestra están unidos al dispositivo, pero no forman parte del dispositivo consumible. El dispositivo tiene un tubo que está acoplado a la bomba peristáltica. Sin embargo, la muestra no pasa a través de la bomba en sí, lo que permite reutilizar la bomba aunque el dispositivo consumible no lo haga.
La FIG. 17 muestra el tiempo de procesamiento de 30 minutos de un aparato de mesa 1600 adaptado para recibir cartuchos desechables que llevan los dispositivos de membrana de flujo tangencial de una sola etapa o de múltiples etapas descritos anteriormente. La FIG. 17 también muestra cómo el aparato de mesa 1600 se puede integrar con flujos de trabajo convencionales para la evaluación de muestras de ID y AST. El aparato de mesa reemplaza la necesidad de subcultivar patógenos recuperados de un hemocultivo positivo. Como se señaló anteriormente, sólo se necesitan aproximadamente 30 minutos para obtener el componente de interés de la muestra (por ejemplo, el PBC) 1610 que es la fuente de muestra en el dispositivo de membrana de una sola etapa o de múltiples etapas. Después de 30 minutos, el componente de interés aislado, purificado y/o concentrado (por ejemplo, patógenos) se puede suministrar a un aparato de identificación (por ejemplo, MALDI-TOF) 1640 o un aparato para pruebas de susceptibilidad a antibióticos (AST) 1650. Los resultados del MALDI-TOF se puede obtener al instante. Los resultados de AST tardan aproximadamente de 6 a 14 horas. Si la AST se realiza utilizando la difusión de disco 1660, los resultados pueden tardar de 8 a 24 horas. Si se realiza un subcultivo antes de la AST, el resultado de la AST tardará aproximadamente 18 horas adicionales. El aparato de mesa evita la necesidad de preparar un subcultivo. El aparato de mesa se puede utilizar en paralelo con la tinción de Gram 1620 o una placa de pureza 1630 para identificar infecciones polimicrobianas.
La FIG. 18 muestra los componentes básicos de un aparato de mesa 1700 que puede recibir muestras tales como de un frasco de hemocultivo positivo 1710. El aparato de mesa 1700 está configurado para recibir uno o más cartuchos 1720 que pueden contener el dispositivo de membrana de flujo tangencial de una sola etapa o de múltiples etapas descrito en la presente memoria. El cartucho 1720 incluye un vial 1730 que puede recibir el componente de interés aislado, purificado o concentrado (por ejemplo, patógenos) del dispositivo de membrana de flujo tangencial de una sola etapa o de múltiples etapas. El vial 1730 se puede separar del cartucho 1720. El cartucho 1720 se puede retirar del instrumento 1700 y después se desecha. En un ejemplo, el usuario introduce el frasco de PBC 1710 o una alícuota del frasco de PBC 1710 en el cartucho 1720 que después se coloca en el aparato de mesa 1700. El aparato de mesa 1700 procesa automáticamente la muestra para generar una suspensión del componente de muestra objetivo (por ejemplo, bacterias). Si el componente objetivo son bacterias, esa muestra aislada, purificada y/o concentrada está lista para la prueba de ID y/o AST. Como se señaló anteriormente, el tiempo desde el PBC hasta el inicio de las pruebas de ID y/o AST es sólo de aproximadamente 30 minutos. El tamaño del instrumento es una cuestión de elección de diseño, pero se contemplan los tamaños típicos de mesa (por ejemplo, aproximadamente el tamaño de un microondas). Alternativamente, el instrumento de mesa se puede integrar en un flujo de trabajo automatizado tal como BD Kiestra™ TLA (sistema de automatización total de laboratorio). El aparato de mesa 1700 es totalmente compatible con los instrumentos y métodos de ID y AST actuales, ya que el instrumento genera la muestra para su uso en esos instrumentos y no requiere modificaciones en dichos instrumentos. El aparato de mesa 1700 se muestra como capaz de recibir tres cartuchos 1720, pero un instrumento del aparato de mesa puede configurarse para recibir más o menos cartuchos. El sistema no necesita ser monitoreado y puede integrarse con un flujo de proceso manual o automatizado para preparar muestras para pruebas de ID y AST.
Actualmente, los viales 1730 que están disponibles comercialmente contienen un tapón de rosca y requieren la esterilización manual del tapón antes de acoplarlo al cartucho desechable 1720 y antes de que el usuario acceda al vial 1730 con una jeringa. Las frascos actuales 1710 requerirían un método secundario para unir el vial 1730 al cartucho desechable 1720 para mantener la posición durante el procesamiento. En algunas realizaciones de la presente invención, el vial 1730 se conecta de forma segura al cartucho 1720, evitando así la exposición del usuario y permitiendo al usuario acceder al contenido del vial 1730 una vez bajo una cabina de bioseguridad mediante una jeringa o pipeta. En una realización de la presente invención, la tapa del vial 1730 tiene varias características, incluyendo las siguientes características ilustrativas, que pueden estar presentes independientemente una de otra: (1) La tapa puede contener una esponja u otro material que contenga un desinfectante. Esto asegura que cualquier pequeña cantidad de líquido que se escape durante el desprendimiento quede atrapada en la esponja y esterilizada. (2) La tapa también puede contener un septum incorporado, tal como un septum de goma, que una aguja puede perforar fácilmente y que se volverá a sellar después de retirarlo. El septum facilita la liberación del vial 1730 del cartucho 1720 sin riesgo de derrame o fuga. (3) La tapa también se puede enroscar de modo que se pueda desenroscar del vial 1730 una vez en una cabina de bioseguridad. Esto le ofrece al usuario varias opciones para acceder a la muestra microbiana altamente concentrada, con medidas de seguridad para reducir el riesgo del usuario. (4) La tapa puede contener una muesca mecánica que bloquea el vial de salida 1730 en el cartucho desechable 1720 para garantizar que el vial 1730 no se desprenda del cartucho 1720 durante el procesamiento. (5) El sistema 1700 puede generar un vacío en el vial de salida 1730. Este vial 1730 puede entonces impulsar el flujo de fluido hacia el interior del vial 1730 como etapa final del procesamiento.
Las FIGS. 19A-F muestran un flujo de trabajo para el instrumento utilizado para procesar un PBC para aislar, purificar o concentrar patógenos en el PBC. En la etapa 1800 (FIG. 19A), el cartucho 1820 que contiene el dispositivo de membrana de flujo tangencial descrito en la presente memoria se coloca en una cabina de bioseguridad 1830. El cartucho 1820 se inocula con el PBC del dispositivo 1810. En la etapa 1801 (FIG. 19B), el cartucho 1820 se inserta en el aparato de mesa 1840. El cartucho 1820 contiene un dispositivo de membrana de flujo tangencial tales como aquellos mostrados en las FIGS. 5 y 13 de la presente memoria. El PBC se procesa completamente en el cartucho 1820 y no entra al aparato de mesa 1840. El aparato de mesa 1840 puede proporcionar la presión necesaria para mover el PBC a través del dispositivo de membrana de flujo tangencial, sin recibir el PBC del dispositivo. En la etapa 1802 (FIG. 19C), el PBC se hace circular y recircular a través del dispositivo de membrana de flujo tangencial en el cartucho 1820. Este etapa dura aproximadamente 30 minutos. En la etapa 1803 (FIG. 19D), el componente de interés aislado, purificado y/o concentrado (por ejemplo, patógenos) se recogen en un vial 1850 que se separa del cartucho 1820. En la etapa 1804 (FIG. 19E), el cartucho 1820 se elimina del aparato de mesa 1840. En la etapa 1805 (FIG.
19F), se observa que solo se requirieron de 10 a 20 mL de PBC para el método y que una porción del<p>B<c>permanece para pruebas adicionales o se desecha como residuo de riesgo biológico. El cartucho 1820 también es desechable y descartado.
Las FIGS. 20A-D muestran diferentes formas en las que se carga la muestra en el cartucho. En 1900 de la FIG. 20A, el recipiente de PBC 1910 se inocula en el cartucho 1920 en una cabina de seguridad como se describió anteriormente.
En una opción, la muestra de PBC se dispensa en un recipiente desechable mientras se encuentra en una cabina de bioseguridad antes de entrar al sistema. En 1901 de la FIG. 20A, el recipiente de PBC 1910 se introduce en el cartucho 1920 mientras está en la cabina de bioseguridad 1925. El cartucho 1920 después lleva el recipiente de PBC 1910 al aparato de mesa 1930. En 1902 de la FIG. 20A, el recipiente de PBC 1910 se inserta en el cartucho 1920 que ya está sostenido en el aparato de mesa 1930. No hay contacto fluido entre la muestra y el instrumento de mesa 1930. En 1903 de la FIG. 20A, un sistema integrado 1940 tiene el recipiente de hemocultivo en comunicación con el dispositivo de membrana de flujo tangencial. En esta configuración, no hay necesidad de colocar manualmente el recipiente de PBC 1910 en contacto con el cartucho 1920, ya que dicha transferencia se produce automáticamente. La FIG. 20B observa que una porción del PBC (por ejemplo, 10 mL o 20 mL) se procesa a través del dispositivo de membrana de flujo tangencial, dejando una porción del PBC para otros usos. Las FIGS. 20C-D también muestran que los reactivos 1950 (por ejemplo, el tampón de lavado o el tampón de lisis descritos anteriormente) usados en el dispositivo de membrana de flujo tangencial pueden proporcionarse envasados previamente en el cartucho 1920 (FIG. 20C) o integrarse con el instrumento 1930 (FIG. 20D). La integración de reactivos con el aparato de mesa 1930 requerirá conexiones de fluido con el dispositivo de membrana de flujo tangencial y por lo tanto no proporciona un aislamiento completo del contenido de la cámara del aparato de mesa.
Las FIGS. 21A-F ilustran un flujo de trabajo opcional para procesar un PBC para aislar, purificar y/o concentrar patógenos en el PBC. La etapa 2000 (FIG. 21A) muestra los componentes desechables; un cartucho 2010 que contiene el dispositivo de membrana de flujo tangencial, un recipiente de reactivo precargado 2030 necesario para procesar el p Bc y un aparato 2020 que se usa para obtener una alícuota del PBC para su procesamiento. Los desechables se retiran de cualquier embalaje antes de su uso. La etapa 2001 (FIG. 21B) muestra el ensamblaje del recipiente de reactivo 2030 a una bandeja 2035 en el cartucho 2010. Dicho ensamblaje pone el recipiente de reactivo 2030 en comunicación fluida con el cartucho 2010. En la etapa 2002 (FIG. 21C), el aparato 2020 se usa para extraer el volumen necesario del frasco de cultivo de PBC 2040 en una cabina de seguridad (no mostrado). El aparato 2020 incluye un recipiente removible 2050, mostrado como una jeringa, que después se conecta al cartucho 2010 a través de un puerto 2051 en el mismo. El puerto 2051 proporciona una conexión hermética con la jeringa. En un ejemplo, el puerto 2051 tiene un cierre luer para una conexión hermética con la jeringa 2050. Un ejemplo ilustrado de un dispositivo de recolección que se acopla con una jeringa para obtener una alícuota de PBC de un frasco de cultivo se describe en la Solicitud Provisional de Patente de EE. UU. No. 62/883,427 presentada el 6 de agosto de 2019 y la Solicitud Provisional de Patente de EE. UU. No. 62/907,060 presentada el 27 de septiembre de 2019. Ambas solicitudes se asignan comúnmente con la presente solicitud. La etapa 2003 (FIG. 21D) muestra el dispositivo de procesamiento ensamblado 2070 cargado en un instrumento 2060, que se abre y se cierra usando el interruptor 2061. Durante el procesamiento, la muestra inyectada en el cartucho 2010 se fuerza a través del dispositivo de membrana de flujo tangencial (localizado en la carcasa 2011) que separa los componentes de interés (por ejemplo, patógenos) de otros constituyentes de la muestra. Los componentes de interés se recogen en el vial 2080 que está dispuesto en un receptáculo 2082 que está en comunicación fluida con el lado permeado de la membrana grabada en pista dispuesta dentro del cartucho 2010. Una vez que se completa el procesamiento, el dispositivo de procesamiento ensamblado 2070 se retira del instrumento 2060 como se muestra en la etapa 2004 (FIG. 21E). Finalmente, en la etapa 2005 (FIG.
21F), el componente de interés aislado, purificado y/o concentrado (por ejemplo, patógenos) que se ha recogido en el vial 2080 se separa del dispositivo 2070 que es desechable y, por lo tanto, se descarta. El vial 2080 se retira de la conexión de fluido con el dispositivo 2070 en una cabina de bioseguridad (no mostrada).
Las FIGS. 22A-B muestran diferentes maneras en las que la muestra de PBC puede introducirse en el dispositivo de procesamiento ensamblado 2070. En 3000 (FIG. 22A), se usa un aparato 3020 para dividir en alícuotas el volumen necesario de PBC (por ejemplo, 10 mL) del frasco de cultivo 3010 en un recipiente 3030. Como en el ejemplo anterior, la recogida de alícuotas se realiza en una cabina de bioseguridad (no mostrado). En este ejemplo, el recipiente 3030 es una jeringa, pero se considera adecuado cualquier recipiente alternativo con la capacidad de proporcionar una fuerza de extracción subatmosférica para recoger una alícuota de PBC de un frasco de cultivo, por ejemplo un BD Vacutainer®. Después, el recipiente 3030 se conecta de manera fluida al cartucho ensamblado 2070, a través del puerto 2051. El cartucho contiene el dispositivo de membrana de flujo tangencial en la carcasa 3050. En una configuración opcional diferente 3001 (FIG. 22B), el frasco de PBC 3010 se carga directamente en el cartucho 2070 que contiene el dispositivo de membrana de flujo tangencial 3050 a través del puerto 3055. Durante el procesamiento, el volumen de PBC necesario se extrae del frasco de PBC 3010 mediante el dispositivo de procesamiento 2070 y hacia el dispositivo de membrana dispuesto en la carcasa 3050 por el instrumento (no mostrado). Como en la realización anterior, la fracción de muestra objetivo se dispensa desde el dispositivo de membrana 3050 y a través del cartucho 2010 y hacia el vial 2080.
La FIG. 23A-C muestra una vía opcional en la que se pueden suministrar los reactivos. En la opción 4000 (FIG. 23A), los reactivos 4020 se cargan en el instrumento 4010 y el instrumento 4010 distribuye los reactivos 4020 al cartucho de procesamiento (no mostrado). El instrumento 4010 almacena reactivos para procesar una o más muestras de PBC. En la opción 4001 (FIG. 23B), se une un recipiente de reactivo precargado 4030 al cartucho 2070 que contiene el dispositivo de membrana de flujo tangencial 4040 recibiéndolos en la bandeja 4031. En la opción 4001 (FIG. 23B), el frasco de PBC (no mostrado) está conectado de manera fluida al cartucho 2070 a través del puerto 3055. En la opción 4002 (FIG. 23C), los reactivos 4021 se cargan previamente en el cartucho 2070 que contiene el dispositivo de membrana de flujo tangencial en la carcasa 4050.
Aunque la tecnología se ha descrito en la presente memoria con referencia a ejemplos particulares, debe entenderse que estos ejemplos son meramente ilustrativos de los principios y aplicaciones de la tecnología. En algunos casos, la terminología y los símbolos pueden implicar detalles específicos que no son necesarios para practicar la tecnología. Por ejemplo, aunque se pueden utilizar los términos "primero" y "segundo", a menos que se especifique lo contrario, no se pretende que requieran ningún orden, sino que se pueden utilizar para distinguir entre elementos distintos. Además, aunque las etapas del proceso en las metodologías pueden describirse o ilustrarse en un orden, dicho orden no es necesario. Los expertos en la técnica reconocerán que dicho ordenamiento puede modificarse y/o aspectos del mismo pueden realizarse de manera concurrente o incluso sincrónica. En esta divulgación, cuando se proporciona un intervalo, se entiende que el intervalo puede incluir cualquier valor dentro del intervalo así como de los límites. Se pueden utilizar valores aproximados y se entenderá que incluyen todos los valores significativamente cercanos a un valor indicado con referencia a los dígitos significativos del valor indicado.
Por lo tanto, debe entenderse que se pueden realizar numerosas modificaciones a los ejemplos ilustrativos y que se pueden idear otras disposiciones sin apartarse del alcance de la tecnología, definiéndose la invención mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un aparato para extraer constituyentes de una muestra biológica para concentrar un constituyente deseado de la muestra biológica, comprendiendo el aparato:
una pluralidad de dispositivos de membrana, en donde cada uno de la pluralidad de dispositivos de membrana (600) comprende:
una membrana (630) que tiene un primer lado, un segundo lado, un primer extremo y un segundo extremo, teniendo la membrana una pluralidad de poros que tienen un tamaño de poro para permitir selectivamente que uno o más constituyentes de la muestra biológica pasen a través de la membrana desde el primer lado al segundo lado conservando al mismo tiempo otros constituyentes de la muestra biológica en el primer lado;
una cámara de entrada (610) que tiene una entrada próxima al primer extremo y una salida próxima al segundo extremo, la cámara de entrada (610) configurada en el primer lado de la membrana (630) para permitir (a) un flujo tangencial de la muestra biológica a lo largo de una primera superficie de la membrana (630) en el primer lado desde la entrada hasta la salida, y (b) un paso transmembrana de uno o más constituyentes de la muestra biológica desde el primer lado al segundo lado;
una cámara de salida (620)
configurada en una segunda superficie de la membrana (630) en el segundo lado y configurada para recibir los uno o más constituyentes de la muestra biológica que pasan a través de la membrana (630); y
una fuente de presión acoplada a la entrada de la cámara de entrada (610), en donde la pluralidad de dispositivos de membrana están configurados de manera colectiva para aislar una paso banda deseada de constituyentes de la muestra biológica, caracterizado porque cada dispositivo de membrana (600) comprende además una fuente de presión adicional acoplada a la salida de la cámara de entrada (610) y configurada para inducir el flujo tangencial de la muestra biológica a lo largo de la primera superficie de la membrana (630), en donde el flujo tangencial es un flujo alternativo.
2. El aparato de la reivindicación 1, en donde la membrana (630) comprende una membrana grabada en pista formada de uno cualquiera de un material de poliéster, un material de poliimida, un material de polipropileno y un material de policarbonato.
3. El aparato de la reivindicación 1, en donde el tamaño de poro de la pluralidad de poros es un ancho de abertura elegido para aislar los constituyentes de la muestra biológica en un intervalo de tamaño de aproximadamente 0,01 a 8,0 micrómetros (pm) y opcionalmente en donde el tamaño de poro de la membrana es sustancialmente uniforme para la membrana.
4. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el tamaño de poro de la pluralidad de poros de la membrana de la pluralidad de dispositivos de membrana (600) es de aproximadamente 0,03 a 8,0 pm y, opcionalmente, en donde el tamaño de poro de la pluralidad de poros de la membrana de la pluralidad de dispositivos de membrana (600) es de aproximadamente 0,03 a 0,40 pm.
5. El aparato de la reivindicación 1, en donde la fuente de presión comprende una bomba, un émbolo, una jeringa, una bomba peristáltica, una cámara presurizada, una cámara despresurizada o un vacío.
6. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además una fuente de presión acoplada a una salida de la cámara de salida y configurada para inducir el paso transmembrana de uno o más constituyentes.
7. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6, en donde la fuente de presión acoplada a la salida de la cámara de salida comprende una bomba, un émbolo, una jeringa, una bomba peristáltica, una cámara despresurizada o un vacío.
8. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el aparato comprende un recipiente integrado que incluye un primer dispositivo de membrana de la pluralidad de dispositivos de membrana.
9. El aparato de la reivindicación 8, en donde el recipiente integrado incluye un recipiente de muestra acoplado a la cámara de entrada (610) del primer dispositivo de membrana, comprendiendo el recipiente de muestra al menos una de una salida para proporcionar la muestra biológica al primer dispositivo de membrana o una entrada para recibir el retenido del primer dispositivo de membrana (600);
en donde el recipiente integrado incluye opcionalmente además un recipiente de recolección (1514) acoplado a la cámara de salida del primer dispositivo de membrana, comprendiendo el recipiente de recolección al menos una de una entrada o una salida para proporcionar un enjuague al primer dispositivo de membrana y opcionalmente recibir el permeado desde el primer dispositivo de membrana (600).
10. Un método para extraer constituyentes de una muestra biológica usando el aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo el método:
en un primer proceso de extracción, hacer pasar, mediante una fuerza de presión, uno o más constituyentes de la muestra biológica a través de la membrana de un primer dispositivo de membrana desde el primer lado de la membrana al segundo lado de la membrana mientras se retienen otros constituyentes de la muestra biológica en el primer lado de la membrana y mientras se genera el flujo tangencial de la muestra biológica a lo largo de la superficie de la membrana en el primer lado de la membrana en donde el flujo tangencial es el flujo alternativo inducido por la fuente de presión del primer dispositivo de membrana y la fuente de presión adicional del primer dispositivo de membrana, en donde la primera membrana tiene un primer tamaño de poro característico; y
en un segundo proceso de extracción, hacer pasar mediante una fuerza de presión, uno o más constituyentes adicionales de uno o más constituyentes a través de la membrana de un segundo dispositivo de membrana desde el primer lado de la membrana al segundo lado de la membrana mientras se retiene algo de uno o más constituyentes en el primer lado de la membrana y mientras se genera el flujo tangencial de uno o más constituyentes a lo largo de la superficie de la segunda membrana en el primer lado de la membrana, en donde la membrana es una segunda membrana y en donde la segunda la membrana tiene un segundo tamaño de poro característico que es diferente al primer tamaño de poro característico,
mediante lo cual el primer proceso de extracción y el segundo proceso de extracción aíslan una paso banda deseada de constituyentes de la muestra biológica a partir de la muestra biológica.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en hemocultivo positivo, sangre completa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, muestras respiratorias y heridas en donde la muestra biológica está diluida o sin diluir, y en donde la paso banda deseada de los constituyentes es una bacteria aislada de la muestra biológica.
12. El método de la reivindicación 10, en donde el tamaño de poro característico de la primera membrana es de aproximadamente 3,0 pm a 5 pm y el tamaño de poro característico de la segunda membrana es de aproximadamente 0,40 pm a aproximadamente 1 pm.
13. El método de la reivindicación 10, en donde la muestra biológica es una de sangre u orina, y en donde la paso banda deseada de constituyentes son exosomas aislados de la muestra biológica.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el tamaño de poro característico de la primera membrana es de aproximadamente 0,40 pm a aproximadamente 1 pm y el tamaño de poro característico de la segunda membrana es de aproximadamente 0,050 pm o menos.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, que comprende además:
en un tercer proceso de extracción, hacer pasar mediante una fuerza de presión, una pluralidad de constituyentes de la muestra biológica a través de la membrana de un tercer dispositivo de membrana desde el primer lado de la membrana al segundo lado de la membrana mientras se retiene algo de la muestra biológica en el primer lado de la membrana y mientras se genera el flujo tangencial de la muestra biológica a lo largo de la superficie de la membrana en el primer lado de la membrana, en donde la membrana es una tercera membrana y en donde la tercera membrana tiene un tamaño de poro característico que es aproximadamente 3,0 pm.
16. El método de la reivindicación 15, que comprende además
en un cuarto proceso de extracción, hacer pasar mediante una fuerza de presión, algunos constituyentes de uno o más constituyentes retenidos desde el primer lado de la segunda membrana, siendo el paso a través de la membrana de un cuarto dispositivo de membrana desde el primer lado de la membrana al segundo lado de la membrana mientras se retienen algunos de los uno o más constituyentes retenidos, y mientras se genera el flujo tangencial de los uno o más constituyentes retenidos a lo largo de la superficie de la membrana en el primer lado de la membrana, en donde la membrana es una cuarta membrana y en donde la cuarta membrana tiene un tamaño de poro característico que es aproximadamente de 0,10 o 0,20 pm.
ES20707930T 2019-01-25 2020-01-23 Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas Active ES2983667T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962796757P 2019-01-25 2019-01-25
US201962906822P 2019-09-27 2019-09-27
PCT/US2020/014758 WO2020154484A1 (en) 2019-01-25 2020-01-23 Methods and apparatus to selectively extract constituents from biological samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2983667T3 true ES2983667T3 (es) 2024-10-24

Family

ID=69724100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES20707930T Active ES2983667T3 (es) 2019-01-25 2020-01-23 Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220074831A1 (es)
EP (1) EP3914388B1 (es)
JP (1) JP7510944B2 (es)
KR (1) KR102958073B1 (es)
CN (2) CN113329820B (es)
AU (1) AU2020212005B2 (es)
BR (1) BR112021014233A2 (es)
CA (1) CA3126717A1 (es)
ES (1) ES2983667T3 (es)
MX (1) MX2021008758A (es)
WO (1) WO2020154484A1 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2983667T3 (es) * 2019-01-25 2024-10-24 Becton Dickinson Co Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas
EP4491747A3 (en) 2019-04-12 2025-03-26 Pathotrak, LLC Apparatuses and methods for rapid collection of microbe from a sample
CN115176138B (zh) 2020-02-24 2026-04-28 康宁股份有限公司 包含具有尼龙-6和染料的纳米颗粒的校准装置
JP2023546736A (ja) * 2020-10-15 2023-11-07 エージーシー バイオロジクス，インコーポレーテッド 二重容器接線流濾過による連続的高細胞密度培養
EP4436697A1 (en) * 2021-11-24 2024-10-02 Corning Incorporated Advanced scalable extracellular vesicle (ev) isolation, separation, and concentration
US12252678B2 (en) * 2021-12-01 2025-03-18 Microfluidx Ltd Systems and methods for bioprocessing
CN114471163B (zh) * 2021-12-13 2024-12-06 宁波甬恒瑶瑶智能科技有限公司 二次两级切向流分离纯化和浓缩外泌体的超滤装置及方法
JP7764758B2 (ja) * 2021-12-27 2025-11-06 株式会社島津製作所 濃縮装置、それを備えた分析システムおよび濃縮方法
US20250084451A1 (en) * 2023-07-07 2025-03-13 Astek Diagnostics Inc. Method and Device for Detecting Presence, Concentration, and Antibiotic Resistance of Bacteria in Urine Samples
KR20250084002A (ko) 2023-12-01 2025-06-10 한양대학교 에리카산학협력단 고농축 나노 입자 분리 장치 및 고농축 나노 입자 분리 방법
KR20250146978A (ko) * 2024-04-03 2025-10-13 고려대학교 산학협력단 생물학적 샘플로부터 세포외 소포체를 대량으로 추출하고 고순도로 정제하는 방법 및 장치
US12235195B1 (en) * 2024-07-29 2025-02-25 Chinese Research Academy Of Environmental Science Water environmental DNA collection apparatus

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256294A (en) * 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
GB0606144D0 (en) * 2006-03-28 2006-05-10 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Automated crossflow filtration method and system
US20070246406A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-25 Dibel Kevin R Tangential flow filtration apparatuses, systems, and processes for the separation of compounds
AU2010336424B2 (en) * 2009-12-23 2013-06-13 Cytovera, Inc. A system and method for particle filtration
US8480978B2 (en) 2010-08-12 2013-07-09 University Of Southern California Microfluidic fluid separator and related methods
KR20230142653A (ko) * 2013-09-16 2023-10-11 젠자임 코포레이션 세포 배양물을 가공하는 방법 및 시스템
CN104275090A (zh) * 2014-09-17 2015-01-14 重庆澳龙生物制品有限公司 一种生物制品的超滤过滤装置
EP3302764A1 (en) * 2015-06-08 2018-04-11 Becton, Dickinson and Company Filtration cell and method for filtering a biological sample
EP4122586B1 (en) 2015-06-08 2025-08-13 Becton, Dickinson and Company Plasma extractor
JP7039477B2 (ja) * 2015-11-10 2022-03-22 レプリゲン・コーポレイション 交互接線流の使い捨て濾過ユニット
US10493409B2 (en) * 2016-03-02 2019-12-03 Becton, Dickinson And Company Biological fluid separation device
WO2018129429A1 (en) * 2017-01-08 2018-07-12 University Of Rochester Device and method for isolating extracellular vesicles from biofluids
WO2018159847A1 (ja) * 2017-03-03 2018-09-07 富士フイルム株式会社 細胞培養装置及び細胞培養方法
TWI675696B (zh) * 2017-06-01 2019-11-01 美商Ｅｍｄ密理博公司 用於灌注應用之切向流過濾裝置
ES2983667T3 (es) * 2019-01-25 2024-10-24 Becton Dickinson Co Métodos y aparatos para extraer de manera selectiva los constituyentes de muestras biológicas

Also Published As

Publication number Publication date
JP7510944B2 (ja) 2024-07-04
BR112021014233A2 (pt) 2021-09-28
AU2020212005A1 (en) 2021-08-26
EP3914388B1 (en) 2024-07-03
JP2022524915A (ja) 2022-05-11
CA3126717A1 (en) 2020-07-30
EP3914388C0 (en) 2024-07-03
MX2021008758A (es) 2021-08-24
EP3914388A1 (en) 2021-12-01
AU2020212005B2 (en) 2023-10-12
KR20210122273A (ko) 2021-10-08
WO2020154484A1 (en) 2020-07-30
US20220074831A1 (en) 2022-03-10
CN113329820B (zh) 2023-12-15
KR102958073B1 (ko) 2026-04-29
WO2020154484A8 (en) 2021-08-19
CN113329820A (zh) 2021-08-31
CN213222222U (zh) 2021-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3914388B1 (en) Methods and apparatus to selectively extract constituents from biological samples
JP6782998B2 (ja) 装置
JP6958934B2 (ja) タンジェンシャルフィルタリングによって抽出された粒子を処理し分析するための方法と装置
CN104302301B (zh) 用于样品处理的方法和装置
KR101656037B1 (ko) 희소 세포 분리장치, 희소 세포 분리 방법 및 이를 이용한 희소 세포 검출 방법
EP2352533B1 (en) System and method for separating nucleated cells from body fluids
US12139697B2 (en) Apparatus for efficient genetic modification of cells
KR20140147805A (ko) 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 방법 및 장치
US10213742B2 (en) Micro flow filtration system and flow filtration method
JP2023508411A (ja) 血液試料からセルフリー核酸を抽出するための方法、自動化システムおよびカートリッジ
JP2011509657A (ja) 濾過により生体物質を分離する装置および方法
US20190201848A1 (en) Device for blood collection
KR100738100B1 (ko) 액체 시편의 예비 처리 및 주입 장치 및 방법
JPWO2017154349A1 (ja) 核酸抽出装置、核酸抽出ユニット及び核酸抽出方法
EP3048163B1 (en) Particle filtering device and particle filtering method
KR20200000792A (ko) 유체 샘플로부터 세포 외 소포체를 고농축하는 크기 기반 분리법
CN108441471B (zh) 一种血液中稀有细胞的分离方法
HK40081265A (en) Liquid to liquid biological particle concentrator with disposable fluid path