ES2983948T3 - Método para predecir el resultado de un procedimiento de tecnología de reproducción asistida - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere al campo de la reproducción humana, más en particular a situaciones en las que la reproducción humana está fallando. La presente invención proporciona métodos confiables y altamente precisos para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (TRA), tal como un procedimiento de fertilización in vitro e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), no conduzca a un embarazo exitoso. También proporciona medios y métodos para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (TRA), tal como un procedimiento de fertilización in vitro e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), conduzca a un embarazo exitoso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para predecir el resultado de un procedimiento de tecnología de reproducción asistida
Campo de la invención
La invención se relaciona con el campo de la reproducción humana, más en particular a situaciones en las que la reproducción humana falla. La presente invención proporciona un método confiable y altamente preciso para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART), tal como un procedimiento de fertilización in vitro e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), no conduzca a un embarazo exitoso. La descripción también proporciona medios y métodos para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART), como un procedimiento de fertilizaciónin vitroe inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), conduzca a un embarazo exitoso.
Antecedentes de la invención
La subfertilidad afecta entre el 10 y el 15 % de las parejas en el mundo occidental. Esta subfertilidad se puede atribuir en la mitad de los casos a causas relacionadas con el aparato reproductor femenino, en un 20-26 % al masculino y en un 25-30 % la causa es desconocida (Evers, J.L., 2002, Lancet 360:151-159). Muchas parejas recurren a un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART), como la fertilización in vitro (IVF) o la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), para cumplir su deseo de tener hijos.
La rata de éxito de estas técnicas es de aproximadamente 25 % por ciclo iniciado (Andersen, A. et al. 2007, Hum. Reprod. 22:1513-1525). Sería de gran beneficio emocional y económico si se pudiera mejorar esta rata de éxito.
Además, en vista de la carga personal y social que suponen los procedimientos de ART, es deseable identificar a las parejas con pocas posibilidades de éxito en una etapa muy temprana del procedimiento, de modo que se les puedan ofrecer procedimientos alternativos para cumplir su deseo de tener hijos.
Por lo tanto, tanto para mejorar los tratamientos como para decidir en casos individuales si se debe proceder, se necesitan modelos que puedan predecir con precisión si una mujer no quedará embarazada y dará a luz a bebés con vida después de la IVF/ICSI.
Durante más de una década, han estado disponibles modelos que predicen la probabilidad de un nacimiento vivo con base en datos clínicos que incluyen la edad, el número de intentos previos fallidos de IVF y el motivo probable de la infertilidad (Templeton, W. et al., 1996, Lancet 348:1402-1406). Nelson y Lawlor (Nelson, S.M. and Lawlor D.A. 2011, PLOS Medicine 8:1-10) desarrolló un modelo con base en datos de más de 140,000 mujeres, utilizando estratificación por edad y causa de infertilidad, el procedimiento (a ser) utilizado, la fuente del óvulo y la duración del deseo de tener un hijo. Selman et al., (J. Assisted Reproduction and Genetics 24: 395-399 (2007)) divulga la detección de Lactobacillus y Staphylococcus en relación con el resultado de la IVF/embarazo. El documento EP 2742359 B1 describe un método para predecir la probabilidad de un embarazo exitoso o fallido en un sujeto, con base en la cantidad relativa de bacterias pertenecientes al grupo de lactobacilláceas y bacterias pertenecientes a una especie de Staphylococcus en una muestra de orina o vaginal. Además, Haahr et al., Human Reproduction, 31, pp. 795-803, 2016; Mangot-Bertrand et al., Eur.J. Clin. Microbiol. and Infectious Diseases, 32, pp.535-54, 2012; Selman et al., J. Assisted Reproduction and Genetics, 24, 395-399 (2007); Eckert et al., Inf. Disease in obstetrics and Gynecology, 11, pp.11-17, 2003; los documentos WO2013025095 A1; EP1985712 A1, describen métodos para evaluar el resultado de un embarazo y la infertilidad.
Sin embargo, sigue siendo necesario contar con métodos mejores, más confiables y fáciles de usar para limitar el número de procedimientos de ART innecesarios y predecir la posibilidad de un resultado fallido de un procedimiento de ART. Esto ayudaría a reducir los costes en atención médica. Además, a las mujeres que desean tener un hijo se les podría orientar antes hacia soluciones alternativas.
Sumario de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Además, un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) no dé como resultado un embarazo, en donde se analiza una muestra de una hembra mamífera tomada antes o durante el procedimiento de ART para detectar la presencia de Gardnerella vaginalis IST1 y, además, para al menos uno de los siguientes parámetros:
a) abundancia relativa de especies de Lactobacillus
b) abundancia relativa de Lactobacillus jensenii,
c) abundancia relativa de Proteobacteria,
y en donde se concluye que el sujeto tiene una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si la muestra comprende Gardnerella vaginalis IST1 y se aplica al menos uno de los siguientes:
I. la abundancia relativa de especies de Lactobacillus está por debajo de un valor elegido entre 15 % y 25 % o II. la abundancia relativa de Lactobacillus jensenii está por encima de un valor elegido entre 25 % y 45 % o III. la abundancia relativa de Proteobacteria está por encima de un valor elegido entre 18 % y 38 %.
La invención también se relaciona con un kit para realizar un método de acuerdo con la invención que comprende un cebador con sentido CTGGATCACCTCCTTTCTAWG (SEQ ID NO: 1) y un cebador antisentido AGGCATCCRCCATGCGCCCT (SEQ ID NO: 2) para la detección de un producto de amplificación de ADN de Gardnerella vaginalis IST1, en donde el producto de amplificación de ADN de Gardnerella vaginalis IST1 tiene una longitud de 428-430 nucleótidos, y en donde W indica una A o una T y en donde R indica una A o una G, es descrito.
Proporcionamos aquí un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) no resulte en un embarazo, en donde una muestra de una hembra mamífera tomada antes o durante el procedimiento ART se analiza para detectar la presencia de Gardnerella vaginalis y adicionalmente para al menos uno de los siguientes parámetros:
a) abundancia relativa de especies de Lactobacillus
b) abundancia relativa de Lactobacillus jensenii,
c) abundancia relativa de Proteobacteria,
y en donde se concluye que el sujeto tiene una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si la muestra comprende Gardnerella vaginalis IST1 y se aplica al menos uno de los siguientes:
I. la abundancia relativa de especies de Lactobacillus está por debajo de un valor elegido entre 15 % y 25 % o II. la abundancia relativa de Lactobacillus jensenii está por encima de un valor elegido entre 25 % y 45 % o III. la abundancia relativa de Proteobacteria está por encima de un valor elegido entre 18 % y 38 %.
Los valores elegidos entre 15 % y 25 %, 25 % y 45 % y 18 % y 38 % respectivamente también se denominan valores de corte o valores de umbral. Puede elegirse de manera que el método proporcione la especificidad y sensibilidad deseadas. Una persona experimentada conoce bien los requisitos para determinar un valor adecuado.
Se determina la presencia de Gardnerella vaginalis así como la abundancia relativa de especies de Lactobacillus, la abundancia relativa de Lactobacillus jensenii y la abundancia relativa de Proteobacteria.
En una realización preferida adicional, la invención se relaciona con un método como se describe anteriormente, en donde Gardnerella vaginalis es Gardnerella vaginalis IST1. Gardnerella vaginalis IST1 se define aquí como una especie de Gardnerella específica que puede identificarse realizando un análisis de población microbiana vaginal utilizando amplificación de los espacios intergénicos (IS), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (técnica IS-pro, IS-Diagnostics, Amsterdam, Países Bajos). IS-pro es una técnica eubacteriana con base en la detección y categorización de la longitud de la región IS del gen 16S-23S ARNr. La longitud de esta región IS es específica de cada especie microbiana. Gardnerella vaginalis IST1 se define además como una especie de Gardnerella vaginalis que da como resultado un fragmento IS específico con una longitud de 428, 429 o 430 nucleótidos cuando se utilizan los cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
El término procedimiento ART se utiliza aquí para indicar una tecnología de reproducción artificial. En particular, el término se relaciona con la fertilización in vitro (IVF), inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e inseminación intrauterina (IUI).
El término abundancia relativa se utiliza para indicar una fracción de la cantidad total o número de bacterias en una muestra. La fracción se expresa como un porcentaje (%) o como un número entre 0 y 1.
El término "alta probabilidad" con respecto a predecir la oportunidad de éxito o fracaso de un procedimiento de ART se utiliza aquí para indicar que la rata de éxito o fracaso prevista es mayor que en la población general de mujeres que se someten a un procedimiento de ART. En particular, la probabilidad de no quedar embarazada se denomina "aumentada" si el sujeto tiene una probabilidad superior al 60 %, como por ejemplo un 65 % de probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si se cumplen los criterios para una predicción negativa según lo aquí descrito. Más del 65 % a este respecto incluye, por ejemplo, más del 77 %, tal como 88 % o más o incluso 94 % o más.
Además, la probabilidad de quedar embarazada aumenta si el sujeto tiene una probabilidad superior al 35%de quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si se cumplen los criterios para una predicción positiva como se describe aquí. Más del 35 % en este sentido significa 41%, 49 % o incluso 50 % o más.
Gardnerella es un género de bacterias anaeróbicas facultativas con tinción de Gram variable de las cuales Gardnerella vaginalis es la única especie. Los organismos son cocobacilos pequeños (1.0-1.5 |jm de diámetro) que no forman esporas y no son móviles. Una vez clasificado como Haemophilus vaginalis y luego como Corynebacterium vaginalis, G. vaginalis crece como colonias pequeñas, circulares, convexas y grises en agar chocolate; también crece en agar HBT Un medio selectivo para G. vaginalis es el agar sangre con colistina y ácido oxolínico. La determinación de la presencia de Gardnerella vaginalis se realiza preferentemente mediante PCR, como la PCR cuantitativa.
Lactobacillus es un género de bacterias Gram positivas, anaeróbicas facultativas o microaerófilas, con forma de bastón y que no forman esporas. Son una parte importante del grupo de bacterias del ácido láctico (es decir, convierten los azúcares en ácido láctico). En humanos, constituyen un componente importante de la microbiota en varias partes del cuerpo, como el sistema digestivo, el sistema urinario y el sistema genital. En las mujeres de ascendencia europea, las especies de Lactobacillus normalmente constituyen una parte importante de la microbiota vaginal. Lactobacillus forma biopelículas en la microbiota vaginal e intestinal, lo que les permite persistir en condiciones ambientales adversas y mantener poblaciones amplias. Lactobacillus exhibe una relación mutualista con el cuerpo humano, ya que protege al huésped contra posibles invasiones de patógenos y, a su vez, el huésped proporciona una fuente de nutrientes.
El término especie de Lactobacillus se utiliza aquí para referirse a todas las especies de Lactobacillus colectivamente.
El Lactobacillus jensenii es un habitante común del tracto reproductivo inferior en mujeres sanas. En una población normal, L. jensenii representa aproximadamente el 23 % de la microflora vaginal natural.
Las proteobacterias son un filo importante de bacterias. Son bacterias gramnegativas. Esto significa que no retienen el tinte violeta en el protocolo de tinción de Gram. En una prueba de tinción de Gram, se añade una contratinción (comúnmente safranina) después del cristal violeta, coloreando todas las bacterias gramnegativas con un color rosado. La prueba en sí es útil para clasificar dos tipos distintos de bacterias según las diferencias estructurales de sus paredes celulares.
Las proteobacterias incluyen una amplia variedad de patógenos, como Escherichia coli, Salmonella, Vibrio, Helicobacter y muchos otros géneros notables. Otros son de vida libre e incluyen muchas de las bacterias responsables de la fijación de nitrógeno. El grupo se define principalmente en términos de secuencias de ARN ribosómico (ARNr).
Existen numerosas formas de determinar estos microorganismos y la persona experimentada conoce bien las técnicas sobre cómo determinar y cuantificar las cantidades relativas de Gardnerella, especies de Lactobacillus, L. jensenii y Proteobacteria en una muestra. Proporcionamos aquí los resultados de un estudio en donde determinamos la presencia y las cantidades relativas de estas bacterias en muestras obtenidas de una población de 192 mujeres sometidas a un procedimiento de ART.
Correlacionamos la presencia y las cantidades relativas de estos microorganismos y descubrimos que su presencia y/o abundancia era indicativa de la rata de éxito o de fracaso de un procedimiento de ART
De 192 mujeres, 125 no quedaron embarazadas después del primer intento, mientras que 67 sí quedaron embarazadas. Esta es una rata de fracaso del procedimiento ART del 65 % y una rata de éxito del 35 % (Tabla 1 y Tabla 2).
En un método de acuerdo con la invención, la abundancia relativa de una especie o género particular de bacterias debe compararse con un valor de referencia o valor de corte predeterminado. El valor de referencia predeterminado puede ser cualquier valor de corte adecuado. Este proceso de determinar un valor de corte adecuado está dentro de las habilidades de una persona experimentada y puede ser determinado empíricamente fácilmente por la persona experimentada.
Preferiblemente es un valor derivado de la composición bacteriana de muestras obtenidas de una población comparable a la población de prueba. Aún más preferido es un valor de referencia obtenido a partir de un valor promedio de varios experimentos independientes de procedimientos ART en una población de referencia. La persona experimentada conoce los detalles de la determinación de valores de referencia para medir y determinar la abundancia relativa de bacterias.
Por lo tanto, el valor de referencia predeterminado puede determinarse empíricamente o elegirse arbitrariamente para lograr la especificidad y/o sensibilidad apropiadas del método. Una persona experimentada sabe perfectamente cómo elegir un valor de referencia apropiado. Una persona experimentada sabrá cómo alterar el valor de referencia predeterminado para obtener la especificidad y sensibilidad deseadas del método.
Como ejemplo, en el método descrito anteriormente, el primer valor de referencia predeterminado puede estar entre 15 y 25 %, tal como 20 %, el segundo valor de referencia predeterminado puede estar entre 25 y 45 %, tal como 35 % y el tercer valor de referencia predeterminado puede estar entre 18 y 38 %, tal como 28 %.
Cuando se eligieron los valores de referencia primero, segundo y tercero como 20 %, 35 % y 28 % respectivamente y se combinaron los datos de la tabla 1 con los datos de la composición microbiana de la población bacteriana vaginal, resultó que 32 de los 125 resultados fallidos del ART se pudieron predecir correctamente, es decir, el 26 % de los casos donde el procedimiento de ART falló se pudieron predecir correctamente (Tabla 2).
Por lo tanto, un método de acuerdo con la invención como se divulga anteriormente produce resultados altamente confiables, es decir, no logró predecir un resultado fallido del procedimiento ART en sólo 2 casos. En estos dos casos, el procedimiento ART resultó en un embarazo que se considera el resultado deseado; es decir, un resultado exitoso. La precisión del método para predecir que un sujeto no quedará embarazada, como se describe anteriormente, es por tanto 32/34 = 94 % (Tabla 5).
Tabla 2: Matriz de correlación con base en al menos uno de 4 parámetros
Si el método de acuerdo con la invención como se describió anteriormente se hubiera utilizado como criterio de exclusión en este estudio, entonces 34 mujeres habrían sido excluidas de este estudio y se habría permitido participar en el procedimiento a 158 en lugar de 192 mujeres, de las cuales 65 hubieran quedado embarazadas. Esto significa que la rata de éxito del procedimiento ART en ese caso habría aumentado de 67/192 = 35 % a 65/158= 41 %. Este es un aumento de la eficiencia relativa del procedimiento ART del 6 %. Una ventaja adicional sería que las 34 mujeres no tendrían que someterse a uno o varios procedimientos de ART antes de que se les ofrecieran metodologías alternativas.
Si se aplicara a la población actual en el estudio como se describe aquí, el procedimiento de selección habría llevado a una reducción del número de procedimientos de ART con 34/192 = 18 %. Los costes promedio totales de un procedimiento ART como IVF o ICSI son del orden de 5,000 €. En total, aplicando el método de acuerdo con la invención se habría ahorrado un promedio de 900 € por paciente de IVF/ICSI o, en otras palabras, los costes del procedimiento se habrían reducido en un 18 %.
También determinamos el valor predictivo de un método con base en la presencia de Gardnerella vaginalis, como G. vaginalis IST, en particular G. vaginalis IST1, sola. Parecía que las mujeres con Gardnerella vaginalis IST1 tenían un 88 % de posibilidades de no quedar embarazadas (Tabla 3, Tabla 5). Por lo tanto, un método como el descrito anteriormente, en donde Gardnerella vaginalis es G. vaginalis IST1, produjo buenos resultados.
Tabla 3: Matriz de correlación con base en Gardnerella vaginalis IST1
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método como se describió anteriormente en donde se determina en la muestra la presencia de Gardnerella vaginalis, preferiblemente G. vaginalis IST, tal como G. vaginalis IST1 y en donde el sujeto tiene una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si la muestra comprende Gardnerella vaginalis, preferiblemente G. vaginalis IST1.
La precisión y otras características de este método como se describió anteriormente podrían incluso mejorarse aún más aplicando un método en donde se mida al menos uno de los siguientes parámetros:
a) abundancia relativa de especies de Lactobacillus
b) abundancia relativa de Lactobacillus jensenii,
c) abundancia relativa de Proteobacteria,
y en donde se concluye que el sujeto tiene una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si la muestra comprende Gardnerella vaginalis IST1 y se aplica al menos uno de los siguientes:
I. la abundancia relativa de especies de Lactobacillus está por debajo de un valor elegido entre 15 % y 25 % o II. la abundancia relativa de Lactobacillus jensenii está por encima de un valor elegido entre 25 % y 45 % o III. la abundancia relativa de Proteobacteria está por encima de un valor elegido entre 18 % y 38 %.
Cuando se aplican estos criterios, se podrían predecir correctamente más muestras.
Como se puede deducir de los datos de la Tabla 1, se predijo que 34 del total de 192 muestras no lograrían quedar embarazadas. Treinta y dos de estas 34 muestras pudieron predecirse correctamente mediante un método de acuerdo con la invención (Tabla 1, Tabla 2). De las 32 muestras predichas correctamente, 15 fueron atribuibles a la presencia de G. vaginalis IST1 (criterio 1). Si este criterio se combinara con el criterio de que la abundancia relativa de especies de Lactobacillus (criterio 2) fuera inferior al 15 %, entonces se podrían predecir correctamente 7 muestras adicionales de estas 32. Si el criterio 1 se combinara con el criterio de que la abundancia relativa de Lactobacillus jensenii (criterio 3) fuera superior al 25 %, entonces se podrían predecir correctamente 6 muestras adicionales de estas 32. Si el criterio 1 se combinara con el criterio de que la abundancia relativa de Proteobacteria (criterio 4) fuera superior al 18 %, entonces se podrían predecir correctamente 5 muestras adicionales de estas 32. Otras combinaciones de estos criterios también produjeron una mejora en el método. La siguiente Tabla 7 proporciona el número de predicciones correctas según los criterios utilizados. Si se utilizaron los 4 criterios, se detectaron las 32 muestras.
Tabla 7: Predicción correcta de no quedar embarazada en función de diferentes criterios.
También determinamos la presencia de dos especies de Lactobacillus, L. crispatus y L. iners en las muestras proporcionadas, mediante la técnica ISPRO (Ejemplo 4). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Lactobacillus crispatus es un habitante común del tracto reproductivo inferior en mujeres sanas. En una población normal, L. crispatus es la especie dominante en más del 30 % de todas las mujeres en edad reproductiva.
Lactobacillus iners también es una especie del género Lactobacillus. Es una bacteria Gram positiva, catalasa negativa y anaeróbica facultativa con forma de bastón. Lactobacillus iners es un habitante normal del tracto reproductivo inferior en mujeres sanas. Se han secuenciado los genomas de al menos 15 cepas y codifican entre 1,152 y 1,506 proteínas. Por lo tanto, esta especie tiene uno de los genomas de Lactobacillus más pequeños en comparación con otras especies, como L. crispatus, que normalmente codifica más del doble de proteínas.
Existen numerosas formas de determinar estos microorganismos y la persona experimentada conoce bien las técnicas sobre cómo determinar y cuantificar las cantidades relativas de especies de Lactobacillus, L. crispatus y L. iners en una muestra.
Descubrimos que estas dos especies (L. crispatus y L. iners) también eran indicativas del fracaso o el éxito de un procedimiento ART.
En particular, se encontró que un sujeto tenía una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado de un procedimiento ART, si la abundancia relativa de Lactobacillus crispatus estaba por encima de un cuarto valor de referencia predeterminado. Este cuarto valor de referencia predeterminado se eligió preferentemente entre 50 y 70 %, tal como 60 %. Cuando se tomó el 60 % como cuarto valor de referencia, 65 mujeres cumplieron este criterio, de las cuales 15 quedaron embarazadas como resultado del procedimiento ART (Tabla 6). Esta es una rata de fracaso del 77 %, que es más alta que la rata de fracaso en todo el grupo (Tabla 5).
También se encontró que un sujeto tenía una alta probabilidad de quedar embarazada como resultado del procedimiento ART, si la abundancia relativa de Lactobacillus crispatus estaba por debajo de un quinto valor de referencia predeterminado. Este quinto valor de referencia predeterminado se eligió preferentemente entre 50 y 70 %, tal como 60 %. Cuando se tomó el 60 % como quinto valor de referencia, 127 mujeres cumplieron este criterio, de las cuales 52 quedaron embarazadas como resultado del procedimiento ART (Tabla 6). Esta es una rata de éxito del 41 %, que es más alta que la rata de éxito en todo el grupo (Tabla 5). Estos resultados se muestran en la Tabla 6 y la Tabla 5.
Tabla 6: Matriz de correlación con base en L. crispatus
También determinamos la abundancia relativa de Lactobacillus iners y encontramos que el sujeto tenía una alta probabilidad de quedar embarazada como resultado del procedimiento ART, si la abundancia relativa de Lactobacillus iners estaba por encima de un sexto valor de referencia predeterminado. Este sexto valor de referencia predeterminado se eligió preferentemente entre 50 y 70 %, tal como 60 %. Cuando se tomó el 60 % como sexto valor de referencia, 38 mujeres cumplieron este criterio, de las cuales 19 quedaron embarazadas como resultado del procedimiento ART (Tabla 5). Esta es una rata de éxito del 50 %, que es más alta que la rata de éxito en todo el grupo (Tabla 5).
Por lo tanto, describimos un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) no dé como resultado un embarazo, en donde se analiza una muestra de una hembra mamífera tomada antes o durante el procedimiento ART para determinar la abundancia relativa de Lactobacillus crispatus y en donde el sujeto tiene una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART, si la abundancia relativa de Lactobacillus crispatus está por encima de un cuarto valor de referencia predeterminado.
También describimos un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) dé como resultado un embarazo, en donde se analiza una muestra de una hembra mamífera tomada antes o durante el procedimiento ART para determinar la abundancia relativa de Lactobacillus crispatus y en donde el sujeto tiene una alta probabilidad de quedar embarazada como resultado del procedimiento ART, si la abundancia relativa de Lactobacillus crispatus está por debajo de un quinto valor de referencia predeterminado.
También describimos un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) dé como resultado un embarazo, en donde se analiza una muestra de una hembra mamífera tomada antes o durante el procedimiento ART para determinar la abundancia relativa de Lactobacillus iners y en donde el sujeto tiene una alta probabilidad de quedar embarazada como resultado del procedimiento ART, si la abundancia relativa de Lactobacillus iners está por debajo de un sexto valor de referencia predeterminado.
También describimos aquí un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) dé como resultado un embarazo, en donde una muestra de una hembra mamífera tomada antes o durante el procedimiento ART se analiza para determinar la presencia de Lactobacillus crispatus y de Lactobacillus iners, y en donde se determinan las cantidades relativas de L. crispatus [LC] y L. iners [LI], y en donde la probabilidad de un embarazo aumenta si [LC] está por debajo de un séptimo valor de referencia predeterminado y en donde
a.
y
b.
y
en donde a es un valor entre -0.55 y -0.70, b es un valor entre 0.80 y 0.90, c es un valor entre -0.50 y -0.65 y en donde d es un valor entre 0.3 y 0.45.
En una realización preferida, a = -0.62, b = 0.85, c = -0.58 y d = 0.38. En este caso, 77 de las 192 mujeres del estudio aquí descrito cumplieron con el criterio, de las cuales 38 (49 %) quedaron embarazadas como resultado del procedimiento ART (Tabla 5). Estos resultados se representan gráficamente en la figura 1.
Se obtuvieron resultados especialmente buenos cuando los valores de referencia predeterminados cuarto, quinto, sexto y séptimo se eligieron independientemente entre sí entre el 50 % y el 70 %, incluso más particularmente el 60 %.
Leyenda de la figura
Figura 1: Diagrama de dispersión de datos obtenidos con uno de los métodos de ejemplo aquí en donde la probabilidad de un embarazo aumenta si [LC] es inferior al 60 % y en donde
[LC} < (a * [LI]) b ;y en donde ;[LC} > (c * [LI]) d
y en donde
a = -0.62,
b = 0.85,
c = -0.58 y
d = 0.38.
Tabla 5
Ejemplos
Ejemplo 1: Población de estudio
Este estudio prospectivo del microbioma vaginal de mujeres subfértiles en edad reproductiva se llevó a cabo en ocho centros de IVF en los Países Bajos. Los centros participantes fueron: Erasmus Medical Centre (Rotterdam), Radboud UMC (Nijmegen),<u>M<c>Utrecht (Utrecht), VU MC (Amsterdam), Isala kliniek (Zwolle), Sint Elisabeth Ziekenhuis (Tilburg), MC Kinderwens (Leiderdorp), MUMC+ (Maastricht). Las inclusiones se llevaron a cabo durante un período de casi un año (del 1 de junio de 2015 al 31 de marzo de 2016). El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad Erasmus. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.
Se contactó a mujeres que visitaron la clínica ambulatoria de la clínica de salud reproductiva y que se esperaba que se sometieran a su primer procedimiento de IVF (con o sin ICSI) dentro de dos meses para participar en este estudio. Los criterios por cumplir fueron: mujeres entre 20 y 44 años y tener pareja masculina. Se excluyeron del estudio: mujeres con indicación de IVF de emergencia por cáncer u otros motivos, endometriosis AFS III/IV y pretratadas con un análogo de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), uso de anticonceptivos hormonales 3 meses antes de iniciar la IVF o IVF-ICSI (uso exclusivo de 3 semanas de píldora anticonceptiva oral con el fin de regular el ciclo) y que tuvieran en su historial médico un embarazo o aborto espontáneo previo.
En este estudio, al principio se inscribieron 301 mujeres. Se excluyeron veintiún pacientes según criterios de exclusión y otros 86 abandonaron el estudio por motivos personales o desconocidos. Se perdieron dos muestras por errores de manipulación, por lo que finalmente el estudio se realizó con muestras de 192 individuos.
Ejemplo 2: Materiales
Las participantes obtuvieron un hisopo vaginal por sí mismas antes del inicio del procedimiento de IVF o IVF-ICSI. Se eligió un método de autorecolección porque es mínimamente invasivo para el paciente y por lo tanto adecuado para uso en la práctica diaria. Las muestras vaginales fueron tomadas con FLOQSwabs™ (Copan Italia S.p.A., Italia) y se indicó a las participantes que insertaran el hisopo de 3-5 centímetros en la vagina y luego frotaran el hisopo a lo largo de la pared vaginal durante 10-15 segundos. Después de este procedimiento, los hisopos se colocaron inmediatamente en tubos Eppendorf llenos con regulador de líquido de transporte reducido (RTF), obtenido de IS-Diagnostics (IS-Diagnostics, Ámsterdam, Países Bajos). Hasta el momento del análisis, las muestras se almacenaron entre -20 y -80 °C en el congelador.
Las muestras de orina se recolectaron en un dispositivo recolector de orina estéril de 100 ml. Se centrifugó una muestra de 10 ml durante 10 minutos a 1500 r Cf. Se decantó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 3 ml de orina. La muestra resuspendida se almacenó para su posterior procesamiento a -20 grados Celsius.
Las muestras fueron transportadas en hielo seco desde las 8 clínicas hasta el laboratorio microbiológico de IS-Diagnostics, donde se realizaron los análisis.
Ejemplo 3: aislamiento de ADN
La extracción de ADN se realizó a partir de los hisopos vaginales con la máquina automatizada de extracción de ADN Chemagen (Chemagen, Baesweiler, Alemania) utilizando el kit de extracción de hisopos bucales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Primero se descongelaron los hisopos y se agitaron. Se incubaron 200 |jl de muestra con 200 j l de regulador de lisis Chemagen y 10 j l de proteinasa K (Qiagen, Hilden, Alemania) a 56 grados Celsius mientras se agitaba a 500 rpm. El ADN se extrajo utilizando el protocolo de pre llenado con hisopo bucal. La elución del ADN se realizó en 100 j l de regulador de elución Chemagen.
El ADN se extrajo de suspensiones de orina concentradas con la máquina automatizada de extracción de ADN Chemagen (Perkin-Elmer, Baesweiler, Alemania) utilizando el kit de extracción con hisopo bucal de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las muestras de orina se descongelaron y agitaron. Se incubaron 200 j l de muestra con 200 j l de regulador de lisis Chemagen y 10 j l de proteinasa K a 56 grados Celsius mientras se agitaba a 500 rpm. La elución del ADN se realizó en 100 j l de regulador de elución Chemagen.
Ejemplo 4: perfil interespacial (IS)
La amplificación de las regiones de los espacios intergénicos (IS) se realizó con el ensayo IS-pro, de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (IS-Diagnostics, Amsterdam, Países Bajos). IS-pro es una técnica eubacteriana con base en la detección y categorización de la longitud de la región IS del gen 16S-23S ARNr. La longitud de esta región IS es específica para cada especie microbiana. Para la clasificación taxonómica se utilizan cebadores de PCR marcados con fluorescencia específicos del filo.
Brevemente, el procedimiento consta de dos PCR estándar separadas: la primera mezcla de PCR contiene dos cebadores directos diferentes marcados con fluorescencia que son direccionados a diferentes grupos bacterianos y tres cebadores antisentido que brindan una cobertura universal para esos grupos. El primer cebador sentido es específico para los filos Firmicutes, Actinobacteria, Fusobacteria y Verrucomicrobia (FAFV), y el segundo cebador sentido marcado es específico para el filo Bacteroidetes. Una PCR separada con un cebador sentido marcado combinado con siete cebadores antisentido es específica para el filo Proteobacteria [Budding, E. et al., J. Clin. Microbiol. (2016) 54: 934-943].
El sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) realizó las amplificaciones. Después de la PCR, se mezclaron 5 j l de producto de p Cr con 20 j l de formamida y 0.2 j l de marcador de tamaño personalizado (IS-Diagnostics). El análisis de fragmentos de ADN se realizó en un analizador genético ABI Prism 3500 (Applied Biosystems). Los datos se analizaron con el paquete de software propietario IS-pro (IS-Diagnostics) y los resultados se presentan como perfiles microbianos. La llamada automática de especies de picos IS-pro se realizó con el paquete de software IS-pro dedicado (IS-Diagnostics), en el que los picos están vinculados a una base de datos que contiene información del perfil IS de > 500 especies microbianas. Los picos de <128 unidades relativas de fluorescencia (RFU) se consideraron ruido de fondo y se descartaron de análisis posteriores. Todo el procedimiento, desde el aislamiento del ADN hasta los datos analizados, se realizó en 5 horas.
Ejemplo 5: Medición de resultados
Se utilizó como criterio de valoración el resultado del embarazo después de la primera transferencia de embriones (ET). El embarazo en curso se definió como un feto con actividad cardíaca establecida mediante ecografía entre las semanas 7 y 9 de gestación.
Ejemplo 6: Determinación de Gardnerella vaginalis IST1
La Gardnerella vaginalis IST1 se identificó realizando un análisis de población microbiana vaginal con la técnica IS-pro. G.vaginalis IST1 se detectó por la presencia de un fragmento IS específico con una longitud de 428 430 nucleótidos.
Ejemplo 7: Determinación del microbioma
El análisis del microbioma se realizó con la técnica IS-pro como se describió anteriormente [Automated Broad-Range Molecular Detection of Bacteria in Clinical Samples. Budding AE, Hoogewerf M, Vandenbroucke-Grauls CM, Savelkoul PH.. J Clin Microbiol. 2016 Apr;54(4):934-43. doi: 10.1128/JCM.02886-15. Epub 2016 Jan 13; IS-pro: highthroughput molecular fingerprinting of the intestinal microbiota., Budding AE, Grasman ME, Lin F, Bogaards JA, Soeltan-Kaersenhout DJ, Vandenbroucke-Grauls CM, van Bodegraven AA, Savelkoul PH.]
LO CCNNJJCLOD<c>c<o>o Oco)<co>o<O>-No- Nf co CCNNJJ<O>CNJ<o>o O Nf CcoO CNJ LO o O Q O O CD h NT cNofco- C<O">
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Tabla 4: Composición microbiana de la flora vaginal; predicción de la probabilidad de fracaso del procedimiento ART.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir la probabilidad de que un procedimiento de tecnología de reproducción asistida (ART) no dé como resultado un embarazo, en donde se analiza una muestra de una hembra de mamífero tomada antes o durante el procedimiento de ART para determinar:
a) la presencia de Gardnerella vaginalis IST1,
b) abundancia relativa de especies de Lactobacillus,
c) abundancia relativa de Lactobacillus jensenii, y
d) abundancia relativa de Proteobacteria,
y en donde se concluye que el sujeto tiene una alta probabilidad de no quedar embarazada como resultado del procedimiento ART si se aplica al menos uno de los siguientes:
1. la muestra comprende Gardnerella vaginalis IST1;
II. la abundancia relativa de especies de Lactobacillus está por debajo de un valor del 20 %;
III. la abundancia relativa de Lactobacillus jensenii está por encima de un valor del 35 %; o
IV. la abundancia relativa de Proteobacteria está por encima de un valor del 28 %,
en donde Gardnerella vaginalis IST1 se define como una especie de Gardnerella vaginalis que da como resultado un fragmento IS específico con una longitud de 428, 429 o 430 nucleótidos cuando se amplifica con cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, para aplicar a un análisis microbiano vaginal, en donde la muestra es un hisopo vaginal o una muestra de orina.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la presencia de Gardnerella vaginalis IST1 se determina mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el sujeto mamífero es un humano.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el procedimiento ART es un procedimiento de fertilización in vitro (IVF), tal como un procedimiento de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
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