ES2984278T3

ES2984278T3 - Partículas que comprenden epiplón descelularizado

Info

Publication number: ES2984278T3
Application number: ES22171404T
Authority: ES
Inventors: Tal Dvir; Assaf Shapira; Michal Shevach; Idan Gal
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 2015-12-16
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2024-10-29
Anticipated expiration: 2036-12-15
Also published as: EP3389678A1; US11213609B2; EP4059507A1; US20180361023A1; EP4059507B1; ES2924732T3; EP4059507C0; WO2017103930A1; US20220118156A1; EP3389678A4; US12311075B2; EP3389678B1

Abstract

Se describe una partícula esférica que comprende un epiplón descelularizado con un diámetro de entre 1 nM y 300 μM. En algunas realizaciones, la partícula comprende células biológicas. En otras realizaciones, la partícula comprende una biomolécula. También se describen usos de las partículas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Partículas que comprenden epiplón descelularizado

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a partículas que consisten en epiplón descelularizado y células de encapsulación. Las partículas se pueden utilizar para el suministro de células y/o biomoléculas.

El epiplón es una lámina doble de peritoneo que se extiende desde la curvatura mayor del estómago y recubre la mayoría de los órganos abdominales. Este tejido está muy vascularizado y su MEC fibrilar es rica en colágenos, proteínas adhesivas y GAG. Dado que los<g>A<g>se unen a una variedad de ligandos de proteínas, pueden servir como depósitos de factores de crecimiento y regular una amplia variedad de actividades biológicas, incluyendo los procesos de desarrollo, la angiogénesis y la cardioprotección. Debido a su composición única, el epiplón también sirve como depósito de células madre adultas con potencial regenerativo. Estas células madre se basan en la matriz del epiplón y, tras señales, migran para curar los órganos lesionados. La capacidad regenerativa global del epiplón, su capacidad para mantener la viabilidad de las células progenitoras, absorber grandes cantidades de fluidos de edema y limitar la formación de tejido cicatricial en el sitio de la lesión, se ha demostrado durante mucho tiempo. Dvir, T.,et al. (Proc Natl Acad SciEE. UU. 106, 14990-14995 (2009)) enseña la utilización del epiplón para inducir la migración celular y la formación de redes de vasos sanguíneos en un armazón sintético implantado. Estos armazones vascularizados se volvieron a implantar después en el corazón infartado y atenuaron completamente su deterioro.

La solicitud de patente internacional n.° WO2009/085547 enseña la generación de armazones de epiplón descelularizados para la ingeniería de tejidos.

La publicación de patente de EE. UU. n.° 20050013870 enseña un armazón que comprende una matriz extracelular descelularizada de una serie de tejidos corporales, incluido el epiplón. Los tejidos corporales han sido acondicionados para producir un material biológico tal como un factor de crecimiento.

La publicación de patente de EE. UU. n.° 20090163990 enseña métodos para descelularizar el epiplón.

La publicación de patente de EE. UU. n.° 20150202348 enseña epiplón descelularizado para la ingeniería de tejidos. Porzionatoet al. (Italian Journal of Anatomy and Embryology,volumen 116, 2011 yEur J Histochem.24 de enero de 2013;57(1):e4. doi: 10.4081/ejh.2013.e4) enseña epiplón descelularizado.

En la técnica, se conocen formas solubles de matriz extracelular descelularizada como las descritas enActa Biomaterialia,volumen 9, número 8, agosto de 2013, páginas 7865-7873 y Singelynet al., J Am Coll Cardiol.21 de febrero de 2012; 59(8): 751-763.

Otros antecedentes de la técnica adicionales incluyen el documento WO2014/037942, Gilbertet al.,“Biomaterials” 27 (2006) 3675-3683 y Flynnet al.,“Biomaterials” 31 (2010), 4715-4724.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se dirige a realizaciones que están dentro del alcance de la reivindicación 1.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente divulgación, que no se reivindican, se proporciona un método para tratar una enfermedad o afección médica que se beneficiaría del trasplante de células en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una pluralidad de las partículas descritas en el presente documento, tratando así la afección médica.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el epiplón comprende epiplón humano.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la célula biológica se selecciona del grupo que consiste en una célula cardíaca, una célula neuronal, una célula pancreática, una célula madre, una célula hepática, una célula muscular, un glóbulo sanguíneo y una célula inmunitaria.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la partícula encapsula además al menos una biomolécula.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la biomolécula se selecciona del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interleucina 10 (IL10), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-1), factor derivado de células estromales 1 (SDF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), neurotrofina (NT-3), dexametasona, noradrenalina, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), angioproteína (Ang-1), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) y factor de crecimiento nervioso (NGF). De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, cada una de las partículas de la pluralidad de partículas tiene esencialmente el mismo tamaño.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, las células biológicas se seleccionan del grupo formado por células cardíacas, células neuronales, células pancreáticas, células madre, células hepáticas y células musculares.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la al menos una biomolécula se selecciona del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interleucina 10 (IL10), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-1), factor derivado de células estromales 1 (SDF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), neurotrofina (NT-3), dexametasona, noradrenalina, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), angioproteína (Ang-1), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) y factor de crecimiento nervioso (NGF).

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el método comprende además separar las partículas sólidas que comprenden epiplón descelularizado del aceite después del calentamiento.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el calentamiento se efectúa a aproximadamente 37 °C.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el aceite es un aceite fluorado.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el aceite fluorado se selecciona del grupo que consiste en FC-40, FC-770, FC-70, FC-77, FC-72, FC-43, FC-3283, FC-3284, perfluorohexano (PFH), perfluorociclohexano (PFC), perfluoro-decalina (PFD), perfluoro-perhidrofenantreno (PFPH) y Novec/hidrofluoroéter (HFE)- 7500/ 7100/ 7200/ 71DA/ 71DE/ 71IPA/ 72DA/ 72DE.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el aceite es un aceite de hidrocarburo.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el aceite de hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste en aceite mineral ligero, aceite mineral pesado, hexadecano, tetradecano, octadecano, dodecano, fluidos isoparafínicos IsoparTM y aceite vegetal.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la separación de las partículas sólidas de epiplón descelularizado del aceite se efectúa poniendo en contacto las partículas sólidas con una solución hidrófila.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la separación se efectúa mediante un dispositivo microfluídico.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la separación se efectúa usando una impresora en 3D.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el método comprende además someter a ultrasonidos las partículas sólidas tras la separación.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la al menos una célula biológica se selecciona del grupo que consiste en una célula cardíaca, una célula neuronal, una célula pancreática, una célula madre, una célula hepática, una célula muscular.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la composición comprende además una biomolécula.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la biomolécula es un factor de crecimiento.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la biomolécula es un neuropéptido.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la biomolécula es un neurotransmisor.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el método comprende además reticular las partículas después de la separación.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, solamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo ahora referencia específicamente a los dibujos de manera detallada, se subraya que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de realizar un análisis ilustrativo de las realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada con los dibujos aclara a los expertos en la materia cómo poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

la FIG. 1 es un esquema de un dispositivo microfluídico ilustrativo. La corriente de gel de epiplón es dispersada por la fase continua, la corriente de aceite, para producir gotículas de gel de epiplón. De acuerdo con algunas realizaciones, todos los canales microfluídicos tienen 25 pm de ancho y alto. De acuerdo con otras realizaciones, los canales microfluídicos tienen 50 pm de ancho y alto, a excepción de la boquilla (en la zona donde se producen las gotículas), que son de 40 pm de ancho.

Las FIGS. 2A-B son imágenes de campo claro (CC) de la zona de generación de gotículas del dispositivo (Figura 2A) y la región de salida de gotículas del dispositivo (Figura 2B). Se pueden observar células dentro de las gotículas. Barra: 100 pm.

La FIG. 3 es un gráfico que ilustra las propiedades reológicas del hidrogel de epiplón. Curvas representativas del módulo de almacenamiento (G', línea continua) y del módulo de pérdida (G”, línea discontinua) durante la gelificación a 37 °C.

Las FIGS. 4A-C ilustran la viabilidad (Figura 4A) y la distribución del tamaño de fibroblastos 3T3 encapsulados mediante un tensioactivo pico-surf ™2 al 5 % (Figura 4B) y al 2 % (Figura 4C). Velocidad de fase continua: 80 pl h-1, velocidad de fase dispersa: 40 pl h-1.

Las FIGS. 5A-E son gráficos que ilustran la viabilidad celular (Figura 5A), el diámetro medio de las gotículas (Figura 5B) y la distribución del tamaño de las gotículas de fibroblastos 3T3 encapsulados mediante una velocidad de fase dispersa de 20 (Figura 5C), 40 (Figura 5D) y 60 (Figura 5E) pl h-1. Velocidad de fase continua: 80 pl h-1.

Las FIGS. 6A-B son fotografías de células encapsuladas. (Figura 6A) Imagen de CC de fibroblastos 3T3 inmediatamente después de la encapsulación (velocidad de fase dispersa: 20 pl h-1, barra: 100 pm) y (B) Imagen de fluorescencia de células vivas (verde) y muertas (rojas) en medio acuoso (velocidad de fase dispersa de 60 pl Ir1). Barra: 100 pm, barra de imágenes ampliadas: 50 pm. Velocidad de fase continua en (A) y (B) de 80 pl h-1.

Las FIGS. 7A-E son gráficos que ilustran la viabilidad celular (Figura 7A), el diámetro medio de las gotículas (Figura 7B) y la distribución del tamaño de las gotículas de fibroblastos 3T3 encapsulados mediante una velocidad de fase continua de 60 (Figura 7C), 80 (Figura 7D) y 100 (Figura 7E) pl h-1. Velocidad de fase dispersa: 40 pl h-1.

Las FIGS. 8A-F son gráficos que ilustran la viabilidad celular (Figura 8A), el número de células por gotícula (Figura 8B), la distribución del tamaño de gotícula (Figuras 8C-D) y la imagen de campo claro (Figuras 8E-F) de fibroblastos 3T3 encapsulados mediante 25 x 106 ml-1 (Figuras 8C,E) y 50 x 106 ml-1 (Figuras 8D,F). Barra de escala (Figuras 8E-F): 100 pm. Velocidad de fase dispersa: 40 pl h-1. Velocidad de fase continua: 80 pl h-1.

Las FIGS. 9A-C ilustran microscopía electrónica de barrido de gotículas de hidrogel de epiplón con (Figuras 9A-B) y sin (Figura 9C) fibroblastos 3T3 encapsulados.

Las FIGS. 10A-C son imágenes de inmunofluorescencia de neuronas de la médula espinal encapsuladas (el colágeno se tiñó de verde, los núcleos permanecieron azules y la p-tubulina se tiñó de rojo). Barra de escala: 100 pm.

Las FIGS. 11A-D son imágenes de inmunofluorescencia de CM neonatales encapsulados (el colágeno se tiñó de verde, los núcleos permanecieron azules y la a-actinina se tiñó de rojo), en el día 8 (Figuras 11A-B) y el día 13 (Figuras 11C-D) después de la encapsulación. Barra de escala (A): 100 pm.

Las FIGS. 12A-B: Encapsulación de fibroblastos 3T3 en gotículas de gel de epiplón mediante mezcla de emulsión. A. Imagen de campo claro de una gotícula. B. Los núcleos celulares se visualizan mediante una imagen de fluorescencia de la tinción Hoechst. Se dispersó gel de epiplón al 1 %, que contenía 50.000 fibroblastos/ml, en aceite al vacío, span 80 al 0,2 %.

Las FIGS. 13A-B ilustran la encapsulación de fibroblastos 3T3 en gotículas de gel de epiplón generadas mediante microfluidos. A. Imagen de campo claro de las gotículas. B. Las gotículas se visualizan mediante microscopía de fluorescencia (autofluorescencia verde). Se dispersó gel de epiplón al 0,67 %, que contenía 1.000.000 fibroblastos/ml, en aceite fluorado-40 (FC-40), span 80 al 2 %.

La FIG. 14 ilustra la producción de gotículas de gel de epiplón al 1%mediante la bioimpresión de inyección de tinta 3D. Las gotículas tenían un tamaño muy homogéneo y presentaban un diámetro de aproximadamente 40 |jm. Las gotículas se imprimieron directamente en aceite mineral pesado.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La encapsulación de células en hidrogeles ha mostrado resultados prometedores para reducir la respuesta inmunitaria, pero muchos resultados de ensayos preclínicos y clínicos han sido contradictorios debido a la capacidad limitada de los hidrogeles para respaldar la viabilidad y función celular durante un período de tiempo prolongado. Por lo tanto, se han comercializado completamente pocos productos exitosos basados en estas tecnologías de encapsulación celular.

Los presentes inventores han generado ahora micropartículas de biomaterial autólogo procedente del epiplón. El epiplón se obtuvo de sujetos a través de un procedimiento laparoscópico sencillo. Después de la descelularización mediante procesamiento físico, químico y/o enzimático, se convirtió la matriz extracelular (MEC) del epiplón en una sustancia líquida que se emulsionó para generar partículas de MEC de epiplón que respondían térmicamente y se gelificaban tras la incubación a 37 °C. Los presentes inventores han demostrado que las células y, opcionalmente, las biomoléculas (por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, fármacos, etc.) y/u otras nanopartículas pueden quedar atrapadas en estas partículas (Figuras 10A-C, 11A-D, 12A-B y 13A-B). Después de la gelificación, las partículas resultantes pueden servir como vehículos para la protección y liberación de la carga para diferentes aplicaciones, tales como la ingeniería y los procedimientos de regeneración de tejidos. Como las micropartículas tienen un área superficial mucho mayor que la misma cantidad de gel no formulado en gotículas, su liberación puede controlarse con mucha más precisión y adaptarse al uso específico deseado. Además, la transferencia de masa de oxígeno y nutrientes es más eficiente, lo que mejora la viabilidad celular.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un producto mediante el proceso definido en la reivindicación 5.

Como se usa en el presente documento, la expresión “epiplón descelularizado” se refiere a la matriz extracelular que soporta la organización tisular del epiplón que se ha sometido a un proceso de descelularización (es decir, una eliminación de todas las células del tejido) y, por tanto, que carece de componentes celulares.

El epiplón descelularizado comprende componentes de la matriz extracelular (MEC).

La expresión “matriz extracelular (MEC)”, como se usa en el presente documento, se refiere a una red compleja de materiales producidos y secretados por las células del tejido en el espacio y/o medio extracelular circundante y que normalmente, junto con las células del tejido, confieren al tejido sus propiedades mecánicas y estructurales. En general, la m Ec incluye elementos fibrosos (particularmente colágeno, elastina y/o reticulina), polipéptidos de adhesión celular (por ejemplo, fibronectina, laminina y/o glucoproteínas adhesivas), y moléculas de relleno de espacio [generalmente glucosaminoglucanos (GAG), proteoglucanos].

El epiplón se puede obtener de especies de mamíferos, tales como ser humano, cerdo, bovino, cabra y similares. Tras la obtención del tejido, este se puede colocar en solución salina al 0,9 % para su procesamiento inmediato o almacenarse para su uso posterior, preferentemente a una temperatura de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 80 °C.

De acuerdo con una realización preferida, el epiplón deriva de un ser humano.

Los métodos para descelularizar el epiplón se pueden encontrar en la patente de EE. UU. n.° 20150202348 y WO2014/037942.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la descelularización se lleva a cabo mediante:

(a) la exposición del epiplón a una solución hipotónica;

(b) la deshidratación del epiplón tras la etapa (a);

(c) la extracción de grasa del epiplón deshidratado mediante agentes de extracción polares y no polares tras la etapa (b);

(d) la rehidratación del epiplón deshidratado tras la etapa (c); y

(e) la extracción de células del epiplón rehidratado tras la etapa (d).

De acuerdo con una realización preferida, el epiplón deriva de un ser humano.

Una solución hipotónica es aquella en la que la concentración de electrolitos es inferior a la de las células. En esta situación, la presión osmótica conduce a la migración del agua hacia el interior de las células, en un intento de igualar la concentración de electrolitos dentro y fuera de las paredes de la célula.

Preferentemente, el tampón hipotónico utilizado por el método de acuerdo con este aspecto de la presente invención es una solución de Tris 10 mM a un pH de aproximadamente 8,0, e incluye EDTA al aproximadamente 0,1 % (p/v) (EDTA 5 mM).

El tampón hipotónico puede comprender agentes adicionales tales como inhibidores de serina proteasa (por ejemplo, fluoruro de fenilmetanosulfonilo o fluoruro de fenilmetilsulfonilo, PMSF) y/o detergentes aniónicos tales como dodecilsulfato de sodio (SDS).

De acuerdo con este aspecto de la presente invención, el tejido se somete al tampón hipotónico durante un período de tiempo que conduce al efecto biológico, es decir, inflamación y ruptura celular.

Tras un choque hipotónico, opcionalmente, el tejido puede someterse a ciclos de congelación-descongelación. El proceso de congelación/descongelación comprende preferentemente congelar el tejido a, por ejemplo, entre -10 y -80 °C, y normalmente a -80 °C entre 2 y 24 horas y, posteriormente, descongelar el tejido durante aproximadamente 2, 3 o 4 horas hasta que alcance la temperatura ambiente o una temperatura superior (por ejemplo, a 37 °C). Este proceso se lleva a cabo al menos una vez y preferentemente dos o tres veces en presencia de un tampón hipotónico.

La deshidratación implica el tratamiento del epiplón con uno o más disolventes de deshidratación, tal como uno o más tratamientos del epiplón con uno o más disolventes de deshidratación y/o dicho(s) disolvente(s) en solución con agua. El uno o más tratamientos pueden ser etapas secuenciales del método realizadas con soluciones que tienen diferentes proporciones del (de los) disolvente(s) de deshidratación con respecto al agua, de modo que se tienen cantidades reducidas gradualmente de agua en la solución para cada tratamiento sucesivo, y el tratamiento final puede implicar el uso de disolvente puro, es decir, disolvente no en solución con agua.

Se pueden utilizar disolventes orgánicos de bajo peso molecular para el disolvente de deshidratación. En una realización, el disolvente de deshidratación es uno o más alcoholes, tales como los seleccionados del grupo que consiste en metanol, etanol, isopropanol, propanol y combinaciones de los mismos.

De acuerdo con una realización particular, el epiplón se deshidrata enjuagándolo una vez con etanol al 70 % (por ejemplo, durante 10 a 60 minutos) y dos o tres veces en etanol al 100 % durante 10 a 60 minutos cada vez.

Tras la deshidratación, se puede extraer la grasa del epiplón mediante al menos un disolvente polar y un disolvente no polar, lo que puede tener lugar en una o más etapas de extracción.

Son ejemplos de disolventes no polares los disolventes orgánicos no polares tales como hexano, xileno, benceno, tolueno, acetato de etilo y combinaciones de los mismos. Los disolventes polares útiles para el disolvente de extracción incluyen acetona, dioxano, acetonitrilo y combinaciones de los mismos. En una realización, el disolvente de extracción se selecciona entre acetona, hexano, xileno y combinaciones de los mismos. Los disolventes no polares incluyen, por ejemplo, hexano, xileno y combinaciones de los mismos.

La extracción de grasa se puede realizar en etapas de extracción de grasa poniendo en contacto el epiplón deshidratado con los disolventes de extracción durante períodos de tiempo variables.

Preferentemente, los lípidos polares del tejido se extraen lavándolos con el agente de extracción polar (por ejemplo, 100 % de acetona) entre 10 minutos y 60 minutos. Esto puede repetirse varias veces (por ejemplo, tres veces). A continuación, se pueden extraer los lípidos no polares incubando en una mezcla de agentes no polares:polares (por ejemplo, solución de hexano:acetona 60/40 (v/v) (con 3 cambios) o solución de hexano:isopropanol 60/40 (v/v) (con 3 cambios)) durante aproximadamente 24 horas.

Tras la extracción de la grasa, opcionalmente, se rehidrata el epiplón desgrasado. El epiplón desgrasado puede rehidratarse poniendo en contacto el mismo con un disolvente de rehidratación, tal como alcohol o una solución de alcohol en agua, tal como una solución de alcohol que tiene de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 % de alcohol. Se pueden utilizar alcoholes de bajo peso molecular, tales como metanol, etanol, isopropanol, propanol y combinaciones de los mismos.

A continuación, se descelulariza el epiplón desgrasado. Puede aplicarse cualquier proceso de descelularización conocido por un experto en la materia para descelularizar el epiplón desgrasado. En una realización, el epiplón desgrasado puede descelularizarse mediante la solubilización de los componentes nucleares y citoplasmáticos. Por ejemplo, se puede sumergir el epiplón desgrasado en un tampón de descelularización, tal como uno que tenga detergente no iónico y sal metálica disueltas en ácido durante un período de tiempo, normalmente al menos aproximadamente 30 minutos. Los detergentes no iónicos útiles en la invención incluyen polisorbatos, tales como TWEEN 80, alcoholes etoxilados, tales como TRITON® X-100 y polietanoles, tales como HP 40 e IGEPAL CA-630, y combinaciones de los mismos. Las sales metálicas que se pueden utilizar incluyen cloruro de magnesio, fosfato, acetato y citrato, y combinaciones de los mismos, y estas sales metálicas normalmente se disuelven en Tris-HCl. De acuerdo con otra realización, el epiplón desgrasado puede descelularizarse mediante digestión proteolítica enzimática, que digiere los componentes celulares de dentro del tejido, pero conserva los componentes de la MEC (por ejemplo, colágeno y elastina) y, por tanto, produce una matriz que presenta las propiedades mecánicas y estructurales de la MEC del tejido original. Se apreciará que deben tomarse medidas para conservar los componentes de la MEC mientras se digieren los componentes celulares del tejido. Estas medidas se describen con más detalle a continuación e incluyen, por ejemplo, ajustar la concentración del principio activo (por ejemplo, tripsina) dentro de la solución de digestión, así como el tiempo de incubación.

La digestión proteolítica de acuerdo con este aspecto de la presente invención se puede efectuar mediante una variedad de enzimas proteolíticas. Los ejemplos no limitantes de enzimas proteolíticas adecuadas incluyen tripsina y pancreatina que pueden tener diferentes orígenes tales como Sigma (St Louis, MO, EE. UU.). De acuerdo con una realización preferida de este aspecto de la presente invención, la digestión proteolítica se efectúa mediante tripsina. La digestión con tripsina se efectúa preferentemente a una concentración de tripsina que varía del 0,01 al 0,25 % (p/v), más preferentemente, 0,02-0,2 % (p/v), más preferentemente, 0,05-0,1 (p/v), incluso más preferentemente, una concentración de tripsina de aproximadamente el 0,05 % (p/v). Por ejemplo, se puede utilizar una solución de tripsina que contiene tripsina al 0,05 % (p/v; Sigma), EDTA al 0,02 % (p/v) y antibióticos (penicilina/estreptomicina, 1000 unidades/ml y 0,1 mg/ml respectivamente), pH = 7,2] para digerir eficazmente todos los componentes celulares del tejido.

Preferentemente, mientras están en la solución de digestión, los segmentos de tejido se agitan lentamente (por ejemplo, a aproximadamente 150 rpm) para permitir la penetración completa de la solución de digestión en todas las células del tejido.

Cabe señalar que la concentración de la solución de digestión y el tiempo de incubación en la misma dependen del tamaño de los segmentos de tejido utilizados, y los expertos en la materia son capaces de ajustar las condiciones de acuerdo con el tamaño y el tipo de tejido deseado.

Preferentemente, los segmentos de tejido se digieren durante al menos 1 hora y puede efectuarse durante hasta 24 horas.

Tras la descelularización, opcionalmente, el epiplón se puede volver a desgrasar (por ejemplo, mediante una combinación de disolventes polares y no polares).

El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluye opcional y preferentemente una etapa adicional de eliminación de ácidos nucleicos (así como ácidos nucleicos residuales) del tejido para obtener de este modo un tejido exento de ácidos nucleicos. Como se usa en el presente documento, la expresión “tejido exento de ácido nucleico” se refiere a un tejido que está exento en más del 99 % de cualquier ácido nucleico o fragmentos del mismo, según lo determinado mediante métodos convencionales (por ejemplo, espectrofotometría, electroforesis). Dicha etapa utiliza una solución de desoxirribonucleasa (y, opcionalmente, también una solución de ribonucleasa). Las nucleasas adecuadas incluyen desoxirribonucleasa y/o ribonucleasa [Sigma, Bet Haemek Israel, 20 pg/ml en solución salina equilibrada de Hank (SSEH)] o combinaciones de ambas, por ejemplo, benzonasa. También se puede utilizar una alta concentración de sales de 0,5 M a 3 M, tal como de cloruro de sodio, para la eliminación de los ácidos nucleicos.

Seguidamente, normalmente se eliminan los componentes celulares del tejido. La eliminación de los componentes digeridos del tejido se puede efectuar mediante diferentes soluciones de lavado, tales como soluciones detergentes (por ejemplo, detergentes iónicos y no iónicos tales como SDS Triton X-100, Tween-20, Tween-80) que se pueden obtener de, por ejemplo, Sigma (St Louis, MO, EE. UU.) o Biolab (Atarot, Israel, Merck Germany).

Preferentemente, la solución de detergente utilizada mediante el método de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluye TRITON-X-100 (disponible en Merck). Para una eliminación eficaz de todos los componentes celulares digeridos, el TRITON-X-100 se proporciona en un intervalo de concentraciones del 0,05-2,5 % (v/v), más preferentemente, al 0,05-2 % (v/v), más preferentemente al 0,1-2 % (v/v), incluso más preferentemente a una concentración del 1 % (v/v).

Opcionalmente, la solución de detergente también incluye hidróxido de amonio, que, junto con el TRITON-X-100, ayuda a romper y disolver los núcleos celulares, las proteínas esqueléticas y las membranas.

Preferentemente, el hidróxido de amonio se proporciona a una concentración del 0,05-1,5 % (v/v), más preferentemente, a una concentración del 0,05-1 % (v/v), incluso más preferentemente, a una concentración del 0,1 1 % (v/v) (por ejemplo, 0,1 %).

Las concentraciones de TRITON-X-100 e hidróxido de amonio en la solución de detergente pueden variar, dependiendo del tipo y tamaño del tejido que se esté tratando, y los expertos en la materia son capaces de ajustar dicha concentración de acuerdo con el tejido utilizado.

La incubación del tejido (o segmentos de tejido) con la solución de detergente puede durar de unos cuantos minutos a horas e incluso varios días, dependiendo del tipo y tamaño del tejido y de la concentración de la solución de detergente utilizada, y los expertos en la materia son capaces de ajustar dichos períodos de incubación. Preferentemente, la incubación con la solución de detergente se efectúa durante al menos 1 hora. De acuerdo con una realización, se realizan de 1 a 4 ciclos de incubación con la solución de detergente hasta que se deja de observar espuma.

La solución de detergente descrita anteriormente se elimina preferentemente sometiendo la matriz a varios lavados en agua o solución salina (por ejemplo, al menos 3 lavados), hasta que no haya evidencia de solución de detergente en la matriz.

Opcionalmente, a continuación, se esteriliza la MEC descelularizada. La esterilización de la MEC descelularizada puede efectuarse mediante métodos conocidos en la técnica. En una realización, el epiplón descelularizado se pone en contacto con una solución desinfectante durante un período de tiempo suficientemente eficaz para desinfectar el epiplón descelularizado, tal como al menos aproximadamente 0,5 horas, normalmente de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas. El epiplón descelularizado puede sumergirse completamente en la solución desinfectante. La solución desinfectante puede comprender alcohol o una solución de alcohol en agua, y también puede incluir ácido. La solución desinfectante puede incluir uno o más de los siguientes etanol, metanol, isopropanol, propanol, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y combinaciones de los mismos. En una realización, la solución desinfectante tiene etanol, tal como una solución de etanol al 70 %. Opcionalmente, el epiplón descelularizado se puede lavar una o más veces con agua ultrapura.

Tras el lavado y la esterilización opcional, después se puede deshidratar el tejido descelularizado, por ejemplo, mediante liofilización.

Otros métodos contemplados por los presentes inventores para descelularizar tejido incluyen los descritos en las patentes de EE. UU. n.° 4.776.853, 4.801.299 y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2009163990.

El epiplón descelularizado de este aspecto de la presente invención normalmente comprende menos del 20 % de las células en comparación con la cantidad de células del epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 15 % de las células en comparación con la cantidad de células del epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 10 % de las células en comparación con la cantidad de células del epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 5 % de las células en comparación con la cantidad de células del epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 2 % de las células en comparación con la cantidad de células del epiplón antes de la descelularización.

En una realización, el epiplón descelularizado está desprovisto de componentes celulares.

La expresión “desprovisto de componentes celulares”, como se usa en el presente documento, se refiere a desprovisto más del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, (por ejemplo, 100 %) de los componentes celulares presentes en el epiplón natural (por ejemplo, nativo).

Como se usa en el presente documento, la expresión “componentes celulares” se refiere a componentes de la membrana celular o componentes intracelulares que forman la célula. Los ejemplos de componentes celulares incluyen estructuras celulares (por ejemplo, orgánulos) o moléculas comprendidas en las mismas. Los ejemplos de dichos componentes incluyen, pero sin limitación, núcleos celulares, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos residuales (por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos fragmentadas), membranas celulares y/o membranas celulares residuales (por ejemplo, membranas fragmentadas) que están presentes en las células del tejido. Se apreciará que debido a la eliminación de todos los componentes celulares del tejido, dicha matriz descelularizada no puede inducir una respuesta inmunitaria cuando se implanta en un sujeto.

El epiplón descelularizado de este aspecto de la presente invención está esencialmente desprovisto de lípidos. Los presentes inventores han descubierto que el grado de extracción de lípidos del tejido se correlaciona con la capacidad de inducir la unión celular, mantener la viabilidad celular y promover el ensamblaje adecuado de las células en los tejidos.

La expresión “desprovisto de lípidos”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una composición que comprende menos del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de los lípidos presentes en el epiplón natural (por ejemplo, nativo).

La solubilización de la MEC descelularizada puede efectuarse como se describe en Freyteset al.,“Biomaterials” 29 (2008) 1630-1637 y la solicitud de patente de EE. UU. n.° 20120156250.

Normalmente, para llevar a cabo la solubilización del epiplón descelularizado, primero se deshidrata, por ejemplo, se liofiliza.

El epiplón descelularizado liofilizado se puede cortar en fragmentos pequeños, por ejemplo, desmenuzarse o molerse en polvo y, después, someterse a una segunda sesión de digestión proteolítica. La digestión se efectúa en condiciones que permitan que la enzima proteolítica digiera y solubilice la MEC. Por tanto, de acuerdo con una realización, la digestión se lleva a cabo en presencia de un ácido (por ejemplo, HCl) para obtener un pH de aproximadamente 1-4.

La digestión proteolítica de acuerdo con este aspecto de la presente invención se puede efectuar mediante una variedad de enzimas proteolíticas. Los ejemplos no limitantes de enzimas proteolíticas adecuadas incluyen tripsina, pepsina, colagenasa y pancreatina que tienen diferentes orígenes, tales como Sigma (St Louis, MO, EE. UU.) y combinaciones de las mismas. También se contemplan las enzimas que degradan la matriz tales como las metaloproteinasas de la matriz.

Cabe señalar que la concentración de la solución de digestión y el tiempo de incubación en la misma dependen del tipo de tejido que se esté tratando y del tamaño de los segmentos de tejido utilizados, y los expertos en la materia son capaces de ajustar las condiciones de acuerdo con el tamaño y el tipo de tejido deseados.

Preferentemente, los segmentos de tejido se incuban durante al menos aproximadamente 20 horas, más preferentemente, al menos aproximadamente 24 horas. Preferentemente, la solución de digestión se reemplaza al menos una vez de modo que el tiempo total de incubación en la solución de digestión sea de al menos 40-48 horas. Una vez que se solubiliza la MEC descelularizada, se aumenta el pH de la solución para inactivar irreversiblemente la enzima proteolítica (por ejemplo, hasta aproximadamente pH 7). El epiplón descelularizado y solubilizado puede almacenarse en esta etapa a temperaturas inferiores a 20 °C, por ejemplo, a 4 °C, de modo que la MEC descelularizada permanezca en solución.

El epiplón descelularizado y solubilizado puede formar un gel a una temperatura superior a aproximadamente 30 °C, superior a aproximadamente 31 °C, superior a aproximadamente 32 °C, superior a aproximadamente 33 °C, superior a aproximadamente 34 °C, superior a aproximadamente 35 °C, superior a aproximadamente 36 °C, superior a aproximadamente 37 °C.

A continuación, se emulsiona en aceite la forma líquida del epiplón descelularizado y solubilizado (emulsión de agua en aceite - W/O[Water in Oil emulsión])para producir gotículas.

En una realización, el aceite es un aceite fluorado como un aceite de perfluorocarburo tal como FC-40, FC-770, FC-70, FC-77, FC-72, FC-43, FC-3283, FC-3284, perfluorohexano (P<f>H), perfluorociclohexano (PFC), perfluorodecalina (PFD), perfluoroperhidrofenantreno (PFPH) y Novec/hidrofluoroéter (HFE)-7500/ 7100/ 7200/ 71DA/ 71DE/ 71IPA/ 72DA/ 72DE.

En otra realización, el aceite es un aceite de hidrocarburo (por ejemplo, aceite mineral ligero, aceite mineral pesado, hexadecano, tetradecano, octadecano, dodecano, fluidos isoparafínicos Isopar™ o aceite vegetal).

La fase dispersa puede romperse en gotículas mediante cualquier método conocido en la técnica, incluido la mezcla, molienda coloidal u homogeneización. Se pueden añadir tensioactivos (durante o después de la fase de dispersión) para mejorar la estabilidad de estos sistemas separando las gotículas y manteniendo su forma. Los ejemplos de tensioactivos incluyen, por ejemplo, pico-surf™1, pico-surf™2, span80, monooleína, ácido oleico, tween 20/80, sinperónico, PEF, C12e8, SDS, n-butanol, ABIL EM90 y fosfolípidos.

La adición de tensioactivo reduce la tensión superficial entre el aceite y el agua. Por lo tanto, el aumento de la concentración de tensioactivo produce gotículas de aceite más pequeñas.

La siguiente etapa es la separación de las gotículas de gel de epiplón de la fase oleosa. Para hacer esto, la solución puede centrifugarse a una velocidad apropiada varias veces para eliminar cualquier solución de aceite residual. Otra manera posible de producir las partículas usando una estrategia de agua en aceite es la fabricación microfluídica. Este enfoque permite controlar las dimensiones de las gotículas de una manera muy precisa, ajustando las velocidades de las fases de gel y aceite, y mediante un diseño preciso de los canales microfluídicos de gel y aceite para la creación de las gotículas más homogéneas y óptimas. La microfluídica ofrece muchas ventajas, incluida la baja necesidad de disolventes, reactivos y células, el bajo coste y la versatilidad del diseño.

Tras la generación de las partículas, la partícula se calienta para endurecerla. Preferentemente, la partícula se calienta hasta una temperatura de entre 30 y 40 °C, por ejemplo, 34-39 °C, por ejemplo, aproximadamente 37 °C. A continuación se retiran las partículas sólidas del aceite aclarándolas usando una solución hidrófila. En una realización, se extraen las partículas con solución acuosa/hidrófila y después se centrifugan, y. A continuación puede descartarse la solución de aceite con el fin de suspender las partículas de nuevo en una solución acuosa/hidrófila. Las partículas pueden transferirse a la solución acuosa con o sin adición de perfluoro-1-octanol (PFO, Sigma-aldrich, Rehevot, Israel).

En una realización, a continuación, la partícula se reticula.

Para la reticulación, se pueden utilizar reticulantes químicos como carbodiimidas (EDC y DCC), ésteres de N-hidroxisuccinimida (ésteres de NHS), imidoésteres, maleimidas, haloacetilos, disulfuros de piridilo, hidrazidas, alcoxiaminas, arilazidas, diazirinas y pares de reactivos de Staudinger.

De forma alternativa o adicional, se pueden utilizar enzimas tales como transglutaminasa, sortasa, lacasa/peroxidasa, lisil oxidasa/amina oxidasa. Otras enzimas se divulgan en Hecket al., Appl Microbiol Biotechnol.enero de 2013; 97(2): 461-475.

Los reticulantes químicos que se pueden utilizar para la presente invención incluyen carbodiimidas (EDC y DCC), ésteres de N-hidroxisuccinimida (ésteres de NHS), imidoésteres, maleimidas, haloacetilos, disulfuros de piridilo, hidrazidas, alcoxiaminas, arilazidas, diazirinas, reactivo de Staudinger.

De acuerdo con otra realización, las partículas se someten a ultrasonidos antes o después de la etapa de reticulación.

Las partículas generadas normalmente son esferas distintas que tienen un tamaño homogéneo. Tienen una forma regular de manera que pueden inyectarse sin pegarse entre sí en una jeringa.

La partícula es una micropartícula de entre 50-300 pm o 100-300 pm.

Los ejemplos de agentes que pueden estar comprendidos en las partículas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, los que fomentan la adhesión celular (por ejemplo, fibronectina, integrinas), colonización celular, proliferación celular, diferenciación celular, extravasación celular y/o migración celular. Por tanto, por ejemplo, el agente puede ser un aminoácido, un compuesto químico de molécula pequeña, un péptido, un polipéptido, una proteína, un ADN, un ARN, un lípido y/o un proteoglucano.

Las proteínas que pueden incorporarse en las partículas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, proteínas de matriz extracelular, proteínas de adhesión celular, factores de crecimiento, citocinas, hormonas, proteasas y sustratos de proteasas. Por tanto, los ejemplos de proteínas incluyen factor de crecimiento derivado de endotelio vascular (VEGF), activina A, ácido retinoico, factor de crecimiento epidérmico, proteína morfogenética ósea, TGFp, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, TGFa, IGF-I y II, factores de crecimiento hematopoyéticos, factor de crecimiento de unión a heparina, factores de crecimiento peptídicos, eritropoyetina, interleucinas, factores de necrosis tumoral, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de crecimiento de fibroblastos básicos y ácidos, factor de crecimiento nervioso (NGF) o factor morfogenético muscular (MMP). El factor de crecimiento particular empleado debe ser apropiado para la actividad celular deseada. Los expertos en la materia conocen bien los efectos reguladores de una gran familia de factores de crecimiento. Para la incorporación celular, las células se añaden a la MEC descelularizada y solubilizada del epiplón.

Las células pueden derivar de cualquier organismo, incluidas, por ejemplo, células de mamíferos, (por ejemplo, de ser humano), células vegetales, células de algas, células fúngicas (por ejemplo, células de levadura), células procarióticas (por ejemplo, células bacterianas).

Los ejemplos de células incluyen células cardíacas, células neuronales, células pancreáticas, células madre, células hepáticas y células musculares.

De acuerdo con una realización particular, las células comprenden células madre, por ejemplo, células madre adultas tales como células madre mesenquimatosas o células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pueden modificarse para someterse a diferenciaciónex-vivo.

De acuerdo con otra realización, las células se han diferenciadoex-vivode células madre pluripotentes inducidas que se han generado, a su vez, a partir de células de epiplón.

Las células pueden ser nuevas, congeladas o conservadas de cualquier otra forma conocida en la técnica (por ejemplo, crioconservadas).

En una realización, las células son células cardíacas (por ejemplo, cardiomiocitos humanos).

Como se usa en el presente documento, el término “cardiomiocitos” se refiere a cardiomiocitos total o al menos parcialmente diferenciados. Por tanto, los cardiomiocitos pueden derivar del tejido cardíaco o de células madre (tales como células madre embrionarias o células madre adultas, tales como células madre mesenquimatosas). Los métodos para diferenciar células madre a lo largo de un linaje cardíaco son bien conocidos en la técnica - [Muller-Ehmsen J.,et al.,“Circulation”.2002; 105:1720-6; Zhang M,et al., J Mol Cell Cardiol.2001;33:907-21, Xuet al.,Circ Res. 2002; 91:501-508 y solicitud de patente de EE. UU. n.° 20050037489]. De acuerdo con una realización, las células madre derivan de estirpes de células madre humanas, tales como H9.2 (Amit, M.et al.,2000.Dev Biol.

227:271).

De acuerdo con una realización, los cardiomiocitos de la presente invención son al menos capaces de contraerse espontáneamente. De acuerdo con otra realización, los cardiomiocitos de la presente invención expresan al menos un marcador (más preferentemente, al menos dos marcadores e, incluso más preferentemente, al menos tres marcadores) de cardiomiocitos inmaduros tempranos (por ejemplo, factor natriurético atrial (ANF,Atrial Natriuretic Factor),Nkx2.5, MEF2C y a-actina esquelética). De acuerdo con otra realización, los cardiomiocitos de la presente invención expresan al menos un marcador (más preferentemente, al menos dos marcadores e, incluso más preferentemente, al menos tres marcadores) de cardiomiocitos completamente diferenciados (por ejemplo, MLC-2V, a-MHC, a-actina cardíaca y troponina I).

El cribado de cardiomiocitos parcialmente diferenciados puede realizarse mediante un método que permita la detección de al menos una característica asociada con un fenotipo cardíaco, como se describe a continuación, por ejemplo, a través de la detección de la contracción mecánica específica del corazón, detección de estructuras cardíacas específicas, detección de proteínas cardíacas específicas, detección de ARN específicos cardíacos, detección de actividad eléctrica cardíaca específica y detección de cambios cardíacos específicos en la concentración intracelular de un ion fisiológico.

En cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento, el epiplón descelularizado puede derivar del propio paciente (es decir, autólogo del paciente) o derivar de un sujeto que no sea el paciente (es decir, no autólogo) y/o las poblaciones de células que se administran al paciente junto con el epiplón descelularizado derivan del propio paciente (es decir, autólogas del paciente) o derivan de un sujeto que no sea el paciente (es decir, no autólogas).

Las partículas de la presente invención se pueden utilizar para tratar cualquier trastorno asociado con la degeneración de tejidos. De acuerdo con una realización específica, las composiciones se utilizan para tratar un trastorno cardíaco que esté asociado con un miocardio defectuoso o ausente.

No se reivindican métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal. Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar un trastorno cardíaco asociado con un miocardio defectuoso o ausente en un sujeto, comprendiendo el método trasplantar una cantidad terapéuticamente eficaz de las partículas de la presente invención en el sujeto, tratando así el trastorno cardíaco.

Preferentemente, las partículas de este aspecto de la presente invención comprenden (por ejemplo, encapsulan) células cardíacas. El método se puede aplicar para reparar tejido cardíaco en un sujeto humano que tenga un trastorno cardíaco para así tratar el trastorno. El método también se puede aplicar para reparar tejido cardíaco susceptible de estar asociado con el inicio o desarrollo futuro de un trastorno cardíaco para inhibir de este modo dicho inicio o desarrollo.

La presente invención se puede utilizar ventajosamente para tratar trastornos asociados con, por ejemplo, miocardio necrótico, apoptótico, dañado, disfuncional o morfológicamente anormal. Dichos trastornos incluyen, pero sin limitación, enfermedad isquémica del corazón, infarto cardíaco, cardiopatía reumática, endocarditis, enfermedad cardíaca autoinmunitaria, enfermedad valvular del corazón, cardiopatías congénitas, trastornos del ritmo cardíaco, alteración de la conductividad miocárdica e insuficiencia cardíaca. Dado que la mayoría de las enfermedades cardíacas implican miocardio necrótico, apoptótico, dañado, disfuncional o morfológicamente anormal, y dado que el tejido cardíaco vascularizado de la presente invención muestra un fenotipo cardiomiocítico muy diferenciado, muy funcional y proliferante, el método de reparación de tejido cardíaco de la presente invención se puede utilizar para tratar la mayoría de los casos de trastornos cardíacos.

De acuerdo con una realización, el método de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación se puede utilizar ventajosamente para invertir, inhibir o prevenir el daño cardíaco provocado por la isquemia debida a un infarto de miocardio.

De acuerdo con otra realización, el método de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación se puede utilizar para tratar trastornos cardíacos caracterizados por un ritmo cardíaco anormal, tales como, por ejemplo, arritmia cardíaca.

Como se usa en el presente documento, la expresión “arritmia cardíaca” se refiere a cualquier variación del ritmo normal del latido del corazón, incluidos, pero sin limitación, arritmia sinusal, calor prematuro, bloqueo cardíaco, fibrilación auricular, aleteo auricular, pulso alternante y taquicardia paroxística.

De acuerdo con otra realización, el método de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación se puede utilizar para tratar la alteración de la función cardíaca debida a la pérdida o disfunción del tejido que se producen en sitios críticos del sistema de conducción eléctrica del corazón, que puede conducir a un inicio del ritmo ineficaz o a una conducción del impulso que da lugar a anomalías en la frecuencia cardíaca.

El método de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación se efectúa trasplantando una cantidad terapéuticamente eficaz de las partículas de la presente invención en el corazón del sujeto (ya sea junto con las células cardíacas o sin las células cardíacas).

Como se usa en el presente documento, “trasplantar” se refiere a proporcionar las partículas de la presente invención, mediante cualquier vía adecuada.

Como se usa en el presente documento, una dosis terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado, cuya dosis podría administrarse en una o más administraciones. De acuerdo con una realización, se emplea una sola administración. La inyección se puede administrar en cualquier sitio en el que se requiera la regeneración del tejido. Por ejemplo, para el tratamiento de trastornos cardíacos, las partículas se pueden administrar en diferentes regiones del corazón, dependiendo del tipo de reparación del tejido cardíaco que se requiera. La administración intramiocárdica es particularmente ventajosa para reparar el tejido cardíaco en un sujeto que tenga un trastorno cardíaco caracterizado por arritmia cardíaca, tejido conductor cardíaco deteriorado o isquemia miocárdica.

Dicho trasplante directamente en el tejido cardíaco garantiza que las células/los tejidos administrados no se pierdan debido a los movimientos de contracción del corazón.

Las partículas de la presente invención se pueden trasplantar mediante inyección transendocárdica o transepicárdica, dependiendo del tipo de reparación del tejido cardíaco que se efectúe y del contexto fisiológico en el que se efectúe la reparación cardíaca. Esto permite que las células o los tejidos administrados penetren en las capas protectoras que rodean la membrana del miocardio.

Preferentemente, se utiliza un enfoque basado en un catéter para administrar una inyección transendocárdica. El uso de un catéter excluye métodos de administración más invasivos en donde sería necesaria la apertura de la cavidad torácica.

Las partículas de la presente invención se pueden utilizar para regular la velocidad de contracción de un corazón en respuesta al estado fisiológico o metabólico del individuo receptor, sirviendo así como un marcapasos biológico. En caso de reparar tejido cardíaco en un sujeto que tenga un trastorno cardíaco caracterizado por arritmia cardíaca, se pueden realizar ventajosamente la cartografía electrofisiológica del corazón y/o la inactivación del tejido cardíaco mediante un tratamiento de radiofrecuencia junto con la administración de las células y de los tejidos de la presente invención si es necesario.

Para reparar el tejido cardíaco dañado por la isquemia, por ejemplo, debido a un infarto cardíaco, las partículas de la presente invención se administran preferentemente en el área del borde del infarto. Como sabrá un experto en la materia, el área infartada se ve a simple vista, permitiendo que sea posible dicha localización específica de la aplicación de las células terapéuticas. La determinación precisa de una dosis eficaz en este caso particular puede depender, por ejemplo, del tamaño de un infarto y del tiempo transcurrido desde el inicio de la isquemia miocárdica. De acuerdo con una realización, el trasplante de las composiciones de la presente invención para la reparación del miocardio dañado se efectúa tras una reducción suficiente de la inflamación de los tejidos cardíacos afectados y antes de la formación de tejido cicatricial excesivo.

La presente invención se puede utilizar para generar células y tejidos cardiomiocíticos que muestren una capacidad proliferativa deseada, por tanto, preferentemente se seleccionan células y tejidos que muestren una capacidad proliferativa adecuada para la administración, dependiendo del tipo de reparación del tejido cardíaco que se esté efectuando. La administración de células muy proliferativas puede ser particularmente ventajosa para revertir el daño miocárdico debido a la isquemia ya que, como se ha descrito previamente, es la incapacidad esencial de proliferar de los cardiomiocitos adultos normales lo que provoca la irreversibilidad del daño miocárdico inducido por la isquemia.

Dado que los modelos porcinos son ampliamente considerados como excelentes modelos para protocolos terapéuticos en seres humanos, y dado que dichos modelos han sido ampliamente empleados y caracterizados, está al alcance del experto en la materia determinar una dosis terapéuticamente eficaz para un ser humano basándose en las directrices proporcionadas en el presente documento, y en las proporcionadas por la amplia bibliografía de la técnica.

La determinación de una dosis eficaz generalmente se realiza en función de factores individuales de cada sujeto, incluidos, por ejemplo, el peso, la edad, el estado fisiológico, los antecedentes médicos y los parámetros relacionados con el trastorno cardíaco, tales como, por ejemplo, el tamaño del infarto y el tiempo transcurrido desde el inicio de la isquemia. Un experto en la materia, específicamente un cardiólogo, podría determinar la cantidad y el número de células comprendidas en la composición de la presente invención que constituirían una dosis eficaz, y el modo óptimo de administración de la misma sin necesidad de experimentación.

El médico experto reconocerá que, cuando se administran células o tejidos no singénicos a un sujeto, habitualmente hay un rechazo inmunitario de dichas células o tejidos por parte del sujeto. Por tanto, el método de la presente divulgación también puede comprender tratar al sujeto con una pauta inmunosupresora, preferentemente antes de dicha administración, para inhibir dicho rechazo. Los protocolos inmunosupresores para inhibir el rechazo de injertos alogénicos, por ejemplo, mediante la administración de ciclosporina A, anticuerpos inmunosupresores y similares son una práctica clínica habitual y extendida.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, las partículas se pueden administrar por sí mismas o como parte de una composición farmacéutica que además comprenda un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los conjugados químicos descritos en el presente documento, con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes farmacéuticamente adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de las partículas a un sujeto.

A continuación en el presente documento, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo o un diluyente que no provoca irritación significativa en un sujeto y que no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. Son ejemplos, sin limitación, de vehículos el propilenglicol, la solución salina, las emulsiones y las mezclas de disolventes orgánicos con agua.

En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de los excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el vehículo farmacéutico es una solución acuosa de solución salina.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Se puede administrar la composición farmacéutica de manera sistémica (como se ha detallado anteriormente). Como alternativa, se puede administrar la composición farmacéutica localmente, por ejemplo, mediante la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse mediante procesos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procesos de mezcla convencional, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional mediante uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprendan excipientes y adyuvantes que faciliten la transformación de los principios activos en preparados que se puedan utilizar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración escogida.

Para la inyección, los principios activos de la composición farmacéutica pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa, en la formulación, se utilizan penetrantes adecuados a la barrera que se va a atravesar. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

Dependiendo de la afección médica, el sujeto puede recibir la administración de fármacos químicos adicionales (por ejemplo, inmunomoduladores, quimioterapia, etc.) o células.

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero sin limitación, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores de TNFa, un agente biológico que se dirige a una citocina inflamatoria y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, pero sin limitación, ácido acetilsalicílico, salicilato de magnesio colino, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de la Cox-2 y tramadol.

Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.

Los términos y expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluyen, pero sin limitación”.

La expresión “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.

La expresión “que consiste esencialmente en” significa que la composición, el método o la estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran sustancialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura que se reivindica.

Como se usan en el presente documento, las formas en singular “un”, “uno(a)”, “el” y “la”, incluyen los referentes en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Las expresiones “que varía/varía entre” un primer número indicado y un segundo número indicado y “que varía/varía de” un primer número indicado “a” un segundo número indicado se utilizan indistintamente en el presente documento, y pretenden incluir el primer y el segundo número indicado, así como todos los números fraccionarios y enteros que hay entre los mismos.

Como se usa en el presente documento, el término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea dada, incluyendo, pero sin limitación, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarrollados fácilmente a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Como se usa en el presente documento, el término “tratar” incluye anular, inhibir sustancialmente, retardar o invertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección, o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Diferentes realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se han definido anteriormente y se reivindican en el apartado de reivindicaciones que figura a continuación, se sustentan experimentalmente en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que, junto con las descripciones anteriores, ilustran algunas realizaciones de la invención de manera no limitativa.

En general, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican minuciosamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrooket al.,(1989); “Current Protocols in Molecular Biology”, volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubelet al.,“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watsonet al.,“Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birrenet al.(eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como las expuestas en las patentes de EE. UU. n°. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; “Current Protocols in Immunology”, volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al.(eds), “Basic and Clinical Immunology” (8.a edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshaket al.,“Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). A lo largo del presente documento, se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos descritos en las mismas son muy conocidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector. Toda la información contenida en las mismas se incorpora en el presente documento por referencia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del dispositivo:los dispositivos microfluídicos se fabricaron mediante litografía blanda. El fotorresistente negativo SU-8 (3050, MicroChem, Corp. Newton, MA) se recubrió por centrifugación sobre una oblea de silicio limpia (300 |jm de espesor, University Wafer, Boston, MA) hasta un espesor de 50 jm y se modeló mediante la exposición UV a través de una fotomáscara de transparencia. Tras desarrollar la microestructura, se vertió sobre el diseño una mezcla desgasificada 10:1 de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) Sylgard 184 (Sylgard 184, Dow Corning Corp. Midland, MI) y reticulante (proporción 10:1), se desgasificó y se endureció durante 1 hora a 65 °C. Se retiraron los moldes de PDMS del patrón, y se crearon las entradas y salidas de los canales mediante un punzón de biopsia de 0,75 mm de diámetro (World Precision Instruments, Sarasota, FL). Se unieron las réplicas de PDMS a un portaobjetos de vidrio tras la activación con plasma de oxígeno de ambas superficies mediante plasma de oxígeno (Diener Electronic GmbH & Co. KG, Alemania). Para evitar la humectación de los canales por la fase dispersa, los dispositivos se trataron con Aquapel (PPG Industries, Pittsburgh, PA, EE. UU.) lavando abundantemente los canales con la solución tal como se recibe y secando al aire inmediatamente.

Descelularización del epiplón:se adquirieron epiplones de cerdos sanos del instituto de investigación animal de Kibutz Lahav, Israel. Se lavaron los tejidos recién obtenidos con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y los desechos. A continuación, se agitó el epiplón durante 1 hora en un tampón hipotónico de Tris 10 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1 pM a pH 8,0. Seguidamente, el tejido pasó por tres ciclos de congelación (-80 °C) y descongelación (37 °C) utilizando el mismo tampón. Tras la última descongelación, el tejido se deshidrató lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 minutos y tres veces con etanol al 100 % durante 30 minutos cada vez. A continuación, se extrajeron los lípidos polares del tejido mediante tres lavados de 30 min con acetona al 100 %. Finalmente, se extrajeron los lípidos apolares mediante la incubación de 24 horas en una solución de hexano:acetona 60/40 (v/v) (con 3 cambios). El tejido desgrasado se rehidrató mediante un lavado de 30 minutos en etanol al 100 % y una incubación durante la noche en etanol al 70 % a 4 °C. A continuación, el tejido se lavó cuatro veces con PBS a pH 7,4 y se incubó en una solución de tripsina-EDTA al 0,25 % (Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel) durante la noche. A continuación, el tejido se lavó minuciosamente con PBS y se incubó con NaCl 1,5 M durante 24 horas (3 cambios) para la degradación de los ácidos nucleicos. Finalmente, el tejido se lavó con solución de Tris 50 mM y Triton-X100 al 1 % a pH 8,0 durante 1 hora. El tejido descelularizado se lavó tres veces con PBS y tres veces con agua bidestilada. El tejido descelularizado se congeló (-20 °C) y se liofilizó.

Preparación de MECd de epiplón solubilizada:Tras la liofilización, se molió el epiplón descelularizado en un polvo grueso mediante un molino Mini-Mill de Wiley y luego se congeló hasta su uso posterior. Se digirió enzimáticamente MECd de epiplón molida seca mediante la adición de 1 mg ml-1 de solución de pepsina (Sigma, 3200-4500 unidades mg-1 de proteína) en HCl 0,1 M. La concentración final de MECd fue del 1 % (p/v). La MECd se digirió durante 96 h a temperatura ambiente con agitación constante hasta que el líquido fue homogéneo sin partículas visibles. Posteriormente, se elevó el pH hasta 6,5 mediante NaOH 5 M, a continuación, se añadió DMEM/F12(HAM) x10 (Biological industries, Beit-Haemek, Israel) y se volvió a elevar el pH de nuevo hasta 7,2-7,4. La elevación del pH hace finalizar la actividad de la pepsina (la enzima se desactiva por encima del pH 6).

Propiedades reológicas:los experimentos reológicos se realizaron mediante un reómetro híbrido Discovery HR-3 (TA Instruments, DE) con geometría de placas paralelas de 8 mm de diámetro con una placa Peltier para mantener la temperatura de la muestra. Se cargaron las muestras en el reómetro con la placa Peltier manteniendo una temperatura de 4 °C. La muestra se protegió de la evaporación humedeciendo la tapa de la cámara. A continuación, se ajustó la temperatura hasta 37 °C para inducir la gelificación; durante este tiempo, los módulos oscilatorios de la muestra se controlaron de manera continua a una frecuencia fija de 0,127 Hz y una deformación del 1 %.

Generación de gotículas:para fabricar gotículas de hidrogel de epiplón, se cargó la mezcla líquida de hidrogel de epiplón en una jeringa desechable estéril de 1 ml (Pic solution, Italia). Se utilizó una mezcla de tensioactivo Pico-Surf 2 al 2 % en aceite de perfluorocarburo (Sphere fluidics, Cambridge, Reino Unido) como fase exterior. Se utilizaron tubos de polietileno de diámetro interior fino (Smiths Medical International Ltd., Kent, Reino Unido) con un diámetro exterior de 1,09 mm y un diámetro interior de 0,38 mm para conectar las entradas del canal con las jeringas. Los caudales se controlaron mediante una bomba de jeringa única programable NE-1000 (New era pump systems, EE. UU.).

La generación de gotículas se controló con un microscopio digital (microscopio digital Dino-lite, New Taipei city, Taiwán). Los caudales se ajustaron individualmente para obtener el tamaño de gotícula aspirado. Las gotículas generadas se recogieron del canal de salida y se transfirieron inmediatamente a 37 °C durante cuatro minutos, para su gelificación. Tras la gelificación, las gotículas se transfirieron a un medio acuoso mediante la suspensión simple de las gotículas. Después de una centrifugación de tres minutos a 600 rpm, se desechó la fase oleosa y las gotículas se volvieron a suspender en medio de cultivo.

Cultivo celular - fibroblastos 3T3:se cultivaron fibroblastos 3T3 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle Médium)complementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (SBF, Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) y penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v). Las células se dividieron cada cinco días en condiciones estériles y se incubaron a 37 °C y CO<2>al 5 %.

Aislamiento de cardiomiocitos:se obtuvieron los ventrículos izquierdos de ratas Sprague-Dawley neonatales de 0 3 días de vida y se aislaron las células mediante 6 ciclos (30 min cada uno) de digestión enzimática con colagenasa de tipo II (345 U/mg dW, Worthington biochemical corporation, NJ, EE. UU.) y pancreatina de páncreas porcino (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) en DMEM. Tras cada serie de digestión, las células se centrifugaron (600 g, 5 min) y se volvieron a suspender en medio de cultivo que comprendía M-199 (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) complementado con CuSO4-5H2O 0,6 mM, ZnSO4'7H2O 0,5 mM, vitamina B12 1,5 mM, 500 U ml-1 de penicilina y 100 mg ml'1 de estreptomicina y suero bovino fetal (SBF) al 0,5 % (v/v). Para enriquecer la población de cardiomiocitos, se suspendieron las células en medio de cultivo con SBF al 5 % y se sembraron previamente en placas dos veces durante 50 minutos.

Neuronas motoras de la médula espinal:se diferenciaron neuronas motoras de la médula espinal de Células Madre Pluripotentes inducidas humanas (CMPih) derivadas del epiplón.

Encapsulación:antes de la encapsulación, se contaron las células, se centrifugaron y se volvieron a suspender en medio de cultivo para obtener la densidad celular deseada, y se suspendieron en una mezcla de hidrogel de epiplón:medio de cultivo 9:1. A continuación, se cargó la mezcla de hidrogel en una jeringa de plástico de 1 ml para la generación de gotículas como se ha descrito anteriormente. Después de la gelificación, se transfirieron los microgeles a una solución acuosa seguido de centrifugación (600 rpm, 3 minutos). La fase oleosa resultante se desechó y las gotículas se volvieron a suspender en medio de cultivo celular. Las gotículas cargadas de células se incubaron a 37 °C bajo CO<2>al 5 %. Se utilizó FDA/PI para determinar la viabilidad celular.

Microscopía electrónica de barrido:para generar imágenes de microscopio electrónico de barrido (MEB), se fijaron muestras de gotículas cargadas de células con glutaraldehído al 2,5 % en PBS durante 24 horas a 4 °C, seguido de la deshidratación mediante una serie graduada de soluciones de agua y etanol (50-100 %). Todas las muestras se desecaron en punto crítico, se recubrieron con pulverización de oro en un aparato de recubrimiento Polaron E 5100 (Quorum technologies, Laughton, Reino Unido) y se observaron con un MEB JSM-840A (JEOL, Tokio, Japón).

RESULTADOS

Diseño del dispositivo:el dispositivo microfluídico de enfoque de flujo se diseñó para encapsular gotículas de gel de epiplón de aprox. 50-300 pm de diámetro con o sin células. El dispositivo tiene dos entradas de combinación de tensioactivo/aceite (fase continua) y de hidrogel de epiplón (fase dispersa), respectivamente, y una salida para recoger las gotículas producidas (Figura 1).

Se tomaron imágenes de microscopía de campo claro (CC) del dispositivo durante el proceso de encapsulación de fibroblastos 3T3 (una estirpe celular modelo). Como se puede observar en la Figura 2A, las gotículas fueron desmenuzadas, por las dos corrientes de aceite, en la zona de producción de gotículas. El tensioactivo estabilizó las gotículas mientras fluían hacia la corriente de salida del dispositivo (Figura 2B).

Mediciones reológicas del hidrogel de epiplón:las propiedades reológicas del hidrogel de epiplón son características importantes para predecir su comportamiento bajo fuerzas aplicadas. Cuando la temperatura se elevó de 4 a 37 °C y durante el período de gelificación, tanto el módulo de almacenamiento (G') como el módulo de pérdida (G”) aumentaron con el tiempo y se caracterizaron por una forma sigmoidal (Figura 3). Como G' fue mayor que G” a lo largo de las mediciones, el hidrogel de epiplón posee propiedades de gel elástico destacadas, lo que es esencial para el tejido cardíaco diseñado.

Optimización de tensioactivo pico-surf™2 en aceite FC-40 para mantener la viabilidad celular:se probaron diferentes porcentajes de tensioactivo pico-surf™ 2. Se investigó la viabilidad de los fibroblastos 3T3 encapsulados para demostrar que el proceso de encapsulación no es tóxico para las células. Como se puede observar en la Figura 4A, se lograron altos porcentajes de viabilidad para ambas concentraciones de tensioactivo. Además, se midió el diámetro de las gotículas para cada experimento a fin de examinar la distribución del tamaño en el proceso de encapsulación. Como se puede observar en las Figuras 4B y 4C, el tamaño medio del diámetro de gotícula, mediante pico-surf™2 al 5 % y 2 %, fue de 73,71 pm y 67,86 pm, respectivamente. El tamaño medio de las gotículas fue reproducible mediante tensioactivo al 5 % y 2 %, y se logró una distribución del tamaño gaussiana para ambos. Mediante el tensioactivo al 5 %, se puede observar una distribución más amplia (Figura 4B), que puede atribuirse a trozos de hidrogel de epiplón que obstruyen el canal de la fase dispersa, lo que conduce a cambios en la velocidad de la fase dispersa, dando lugar a un perfil de flujo interrumpido en la zona de la boquilla. Dado que no hubo diferencias significativas entre el tensioactivo al 5 % y al 2 %, se escogió pico-surf™2 al 2 % para realizar más experimentos.

Efecto de la velocidad de la fase dispersa en la producción de gotículas y la viabilidad celular:a través del cambio de las velocidades de la fase continua y dispersa, se puede controlar el tamaño de las gotículas. Por tanto, se cambiaron las velocidades de la fase dispersa, y se examinaron la viabilidad celular y el diámetro de las gotículas. Como se puede observar en la Figura 5A, la viabilidad de los fibroblastos 3T3 encapsulados fue excelente para cada una de las velocidades. Los diámetros medios de las gotículas mediante las velocidades de la fase dispersa de 20, 40 y 60 pl h-1, fueron de 64,01, 67,86 y 79,42 pm, respectivamente (Figura 5B). Como era de esperar, a medida que aumentaba la velocidad de la fase dispersa, el diámetro de las gotículas también aumentaba. Mediante una velocidad de 20 pl Ir1 (Figura 5C), se logró una distribución gaussiana estrecha. Las velocidades más altas (40 y 60 pl h-1, Figuras 5D y 5E, respectivamente) produjeron una distribución gaussiana más amplia, llegando a gotículas de 150 pm de tamaño.

Como se puede observar en la Figura 6A, se produjo una cantidad significativa de gotículas homogéneas mientras que un alto porcentaje contenía células encapsuladas. El tensioactivo evitó la coalescencia de las gotículas, produciendo gotículas estables bien ordenadas. Tras la separación de las gotículas en un medio acuoso, se realizó un ensayo vivo/muerto, para la cuantificación de la viabilidad celular. La Figura 6B es un ejemplo visual de la alta viabilidad celular que se logró mediante el presente sistema.

Efecto de la velocidad de la fase continua en la producción de gotículas y la viabilidad celular:se cambió la velocidad de la fase continua, y se examinaron la viabilidad celular y el diámetro de las gotículas. Como se puede observar en la Figura 7A, la viabilidad de los fibroblastos 3T3 encapsulados fue excelente independientemente de la velocidad de la fase continua. La gotícula media, mediante las velocidades de fase continua de 60, 80 y 100 pl h-1, fue de 77,6, 74,2 y 73,2 pm, respectivamente (Figura 7B). Hubo una buena correlación entre la velocidad de la fase continua y el diámetro de la gotícula. A medida que aumentaba la velocidad de la fase continua, disminuía el diámetro de las gotículas. Mediante una velocidad de 60 j l h-1 (Figura 7C), se alcanzó una distribución gaussiana amplia. La velocidad del aceite es demasiado baja para desmenuzar las gotículas de manera homogénea. Las velocidades más altas (80 y 100 j l h-1, Figuras 7D y 7E, respectivamente) produjeron una distribución gaussiana más estrecha, alcanzando el 65 % de las gotículas un diámetro de 70-75 jm. El efecto de aumentar la velocidad de la fase continua no fue dominante al aumentar la velocidad de la fase dispersa, como se esperaba. Se atribuye a la mayor viscosidad del hidrogel de epiplón en comparación con la viscosidad de la fase oleosa.

Efecto de la concentración celular sobre la producción de gotículas y la viabilidad celular:se cambió la concentración celular, y se examinaron la viabilidad celular y el diámetro de las gotículas. Como se puede observar en la Figura 8A, la viabilidad de los fibroblastos 3T3 encapsulados no se vio afectada por la concentración celular. Mediante 25 x 106 y 50 x 106 células ml-1, el número de células por gotícula fue de 4,4 y 17, respectivamente (Figura 8B). Mediante 25 x 106 y 50 x 106 células ml-1, se logró una distribución gaussiana estrecha (Figura 8C y 8D, respectivamente).

Imágenes de MEB de gotículas de hidrogel de epiplón:con el fin de confirmar la existencia de fibras de epiplón y su soporte a las células, tras la producción y separación de las gotículas, se tomaron imágenes de las gotículas de hidrogel de epiplón con y sin células encapsuladas mediante MEB. Como se puede observar en las Figuras 9A-B, las células se encapsularon dentro del hidrogel de epiplón de manera que cada célula está rodeada por las fibras del epiplón, proporcionando soporte mecánico y bioquímico.

Tinción de inmunofluorescencia de células encapsuladas en gotículas de hidrogel de epiplón:se diferenciaron CMPih en neuronas de la médula espinal en cultivo hasta el día 19, a continuación, se encapsularon dentro de gotículas de hidrogel de epiplón y se cultivaron mientras se diferenciaban hasta el día 28. El día 30, se fijaron las gotículas y se tiñeron las neuronas encapsuladas para determinar la p-tubulina y los núcleos, mientras que las gotículas de hidrogel de epiplón se tiñeron para determinar el colágeno I. Las células encapsuladas se ilustran en las Figuras 10A-C.

Además, se aislaron cardiomiocitos (CM) neonatales y se encapsularon dentro de gotículas de hidrogel de epiplón, se fijaron el día 8 (Figuras 11A-B) y el día 13 (Figuras 11C-D), y se tiñeron para determinar el colágeno I, los núcleos y la actinina. Como se puede observar en las Figuras 11A-D, todos los CM se distribuyen uniformemente dentro de la gotícula de hidrogel de epiplón.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Una partícula esférica que tiene entre 50 y 300 |jm de diámetro generada a partir de un material que consiste en epiplón descelularizado, en donde la partícula encapsula al menos una célula biológica intacta, viable.
2. La partícula de la reivindicación 1, en donde dicho epiplón comprende epiplón humano.
3. Una composición que comprende:

(i) una pluralidad de partículas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. La composición de la reivindicación 3, en donde cada una de las partículas de dicha pluralidad de partículas tiene esencialmente el mismo tamaño.
5. La partícula de las reivindicaciones 1 o 2, generada mediante un método que comprende:

(a) dispersar una composición que comprende epiplón descelularizado solubilizado en un aceite en condiciones que permitan la generación de epiplón descelularizado emulsionado; y

(b) calentar dicho epiplón descelularizado emulsionado para generar partículas sólidas de epiplón descelularizado, generando de ese modo partículas que comprenden epiplón descelularizado.
6. La partícula de la reivindicación 5, en donde el método comprende además separar dichas partículas sólidas que comprenden epiplón descelularizado de dicho aceite después de dicho calentamiento.
7. La partícula de la reivindicación 5, en donde dicho aceite es un aceite fluorado o un aceite de hidrocarburo.
8. La partícula de la reivindicación 5, en donde dicha composición comprende además al menos una biomolécula.
9. La partícula de la reivindicación 6, en donde el método comprende además reticular dichas partículas después de dicha separación.
10. La partícula de las reivindicaciones 1 o 2 o la composición de las reivindicaciones 3 o 4, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección médica que se beneficiaría del trasplante de células.
11. La partícula de las reivindicaciones 1o 2 o la composición de las reivindicaciones 3 o 4, para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la enfermedad es una enfermedad cardíaca.