ES2984286T3

ES2984286T3 - Apómeros

Info

Publication number: ES2984286T3
Application number: ES18773248T
Authority: ES
Inventors: Jean-Louis Dasseux
Original assignee: Abionyx Pharma SA
Current assignee: Abionyx Pharma SA
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2024-10-29
Anticipated expiration: 2038-08-10
Also published as: TW201919686A; US20190046608A1; WO2019030575A1; EP3668549B1; EP3668549A1; US20240123027A1; US20210145932A1

Abstract

Apómeros que comprenden moléculas de apolipoproteína complejadas con moléculas anfipáticas y usos de los mismos para el tratamiento de trastornos dislipidémicos y hepáticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Apómeros

1. Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/543,466, presentada el 10 de agosto de 2017.

2. Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se presentó electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 3 de agosto de 2018, se llama CRN-019WO_ST25.txt y tiene un tamaño de 4694 bytes.

3. Antecedentes

El colesterol circulante es transportado por lipoproteínas plasmáticas - partículas complejas de lípidos y proteínas -que transportan los lípidos en la sangre. Cuatro clases principales de partículas de lipoproteínas circulan en el plasma y están involucradas en el sistema de transporte de grasas: quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Los quilomicrones constituyen un producto de vida corta de la absorción intestinal de grasas. Las VLDL y, particularmente, las LDL son responsables de la administración de colesterol desde el hígado (donde se sintetiza u obtiene de fuentes dietéticas) a los tejidos extrahepáticos, que incluye las paredes arteriales. Las HDL, por el contrario, median el transporte inverso del colesterol (RCT), la eliminación de los lípidos de colesterol, en particular de los tejidos extrahepáticos al hígado, donde se almacena, cataboliza, elimina o se recicla. Las HDL también desempeñan un papel beneficioso en la inflamación, transportando lípidos oxidados e interleucina, lo que a su vez puede reducir la inflamación en las paredes de los vasos sanguíneos.

Las enfermedades cardiovasculares tales como la enfermedad coronaria, la enfermedad de la arteria coronaria y la aterosclerosis están relacionadas abrumadoramente con niveles elevados de colesterol en suero. Por ejemplo, la aterosclerosis es una enfermedad de progresión lenta que se caracteriza por la acumulación de colesterol dentro de la pared arterial. Evidencias convincentes soportan la teoría de que los lípidos que se depositan en las lesiones ateroscleróticas se derivan principalmente de las LDL plasmáticas; por lo tanto, las LDL se conocen popularmente como colesterol "malo". Por el contrario, los niveles séricos de lipoproteínas de alta densidad (HDL) se correlacionan inversamente con la enfermedad coronaria. De hecho, los niveles séricos elevados de HDL se consideran un factor de riesgo negativo. Como consecuencia, las HDL se conocen popularmente como colesterol "bueno" (ver,por ejemplo,Zhang, y otros, 2003 Circulation 108:661-663). Muchas compañías han desarrollado miméticos de HDL que se basan en complejos de apolipoproteína A-I humana ("ApoA-I")/fosfolípidos o en complejos de análogos de péptidos de apolipoproteína/fosfolípidos(por ejemplo,CER-001 desarrollado por Cerenis Therapeutics (ver,por ejemplo,Tardy y otros, 2014, Atherosclerosis 232(1):110-118); MDCO-216, anteriormente conocido como ETC-216, desarrollado por The Medicines Company (ver,por ejemplo,Kallend y otros, Eur Heart J Cardiovasc Pharmacother. (1):23-9); CSL111 y CSL1 12 desarrollados por CSL Behring (ver,por ejemplo,Diditchenko y otros, 2016, Circ Res 119(6):751-763)). Sin embargo, la demostración de la eficacia clínica en la regresión de las placas ateroscleróticas es un desafío y los resultados clínicos no siempre fueron positivos (ver,por ejemplo,Tardif y otros, 2007, JAMA 297(15):1675-82), Tardif y otros, 2014, Eur. Heart J. 35:3277-3286).

Estudios recientes cuestionaron el colesterol HDL como factor predictivo de la enfermedad cardiovascular y soportan la cantidad de partículas HDL como un mejor predictor de riesgo de enfermedad cardiovascular (ver, Jensen y Miedema, 2017, www.acc.org/latest-in-cardiology/articles/2017/02/01/07/34/quality-over-quantity; Qi y otros, 2015, J Am Coll Cardiol. 65(4):355-363; Mackey y otros, 2012, J Am Coll Cardiol. 60(6):508-16; de Goma y Rader, J Am Coll Cardiol 60(6):517-520). Se ha demostrado que los niveles de ApoA-I, el principal componente de proteínas de las HDL, se correlacionan negativamente con el riesgo de enfermedad cardiovascular y que, de hecho, los niveles de ApoA-I son un mejor predictor de riesgo de enfermedad cardiovascular que el colesterol HDL (Luc y otros, 2002, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 22:1155-1161). Los niveles circulantes de ApoA-I están asociados con la capacidad de salida de colesterol (Borja y otros, 2015, The Journal of Lipid Research, 56:2002-2009). El transportador de casete de unión a ATP A1 (a Bc A 1) es responsable del flujo de salida del colesterol celular hacia la ApoA-I libre de lípidos y la ApoA-I pobre en lípidos, en lugar de hacia las HDL discoidales, y se cree que son los principales aceptores del colesterol celular y fosfolípidos a través de ABCA1 (Jayaraman y otros, 2012, Biochem J.

442(3): 703-12). La capacidad de salida de colesterol mediada por ABCA1 mediada por ApoA-I y ApoA-I pobre en lípidos es predictiva del riesgo de enfermedad cardiovascular (Mody y otros, 2016, J Am Coll Cardiol. 67(21):2480-7; Khera y otros, 2011, New England Journal of Medicine 364:127-135).

Se ha especulado que los miméticos de HDL tales como CSL-112 o MDCO-216 podrían proteger contra la enfermedad cardiovascular debido a su capacidad de fusionarse con las HDL endógenas, liberando ApoA-I pobre en lípidos después de la perfusión en pacientes (Diditchenko y otros, 2016, Circ Res 119(6):751-763; Diditchenko y otros, 2013 Arterioscler Thromb Vasc Biol 3(9):2202-11). Sin embargo, dicho mecanismo de acción está sujeto a dudas ya que MDCO-216 no logró mostrar regresión de la placa en los ensayos clínicos (www.themedicinescompany.com/investors/news/medicines-company-discontinues-development-mdco-216-itsinvestigational-cholesterol). Se podría especular que existe la necesidad de tener un fármaco que aumente la capacidad de salida de colesterol mediado por ABCA1 sin estar asociado con los inconvenientes del HDL, específicamente, la presencia de fosfolípidos, que pueden ser potencialmente proaterogénicos. Lo ideal sería poder administrar un fármaco ApoA-I solo, lo cual es bastante difícil ya que ApoA-I tiene la tendencia a agregarse en soluciones tampón a base de agua. El único ensayo clínico que probó la administración de ApoA-I libre de lípidos resultó en un aumento de triglicéridos y VLDL, lo que luego se interpretó como resultado de los agregados de ApoA-I (Nanjee y otros, 1996, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 16:1203-1214). También se describe en la técnica complejos de apómeros con apolipoproteína y una gran cantidad de moléculas anfipáticas tales como lípidos (cf. WO 2012/109162 A1). Estos se han propuesto para el tratamiento de trastornos dislipidémicos.

Por tanto, existe la necesidad de nuevas composiciones de apolipoproteínas pobres en lípidos que sean adecuadas para tratar trastornos dislipidémicos o trastornos hepáticos. Idealmente, dichas composiciones deberían evitar cualquier agregación de apolipoproteínas (que pueden conducir a complejos no funcionales), promover la salida de colesterol celular y tener una baja toxicidad hepática.

4. Resumen

Esta descripción se refiere a complejos pobres en lípidos que comprenden una apolipoproteína en forma monomérica o multimérica que forma complejos con moléculas anfipáticas, que se denominan en la presente descripción como "Apómeros".

En consecuencia, la presente invención se refiere a una composición que comprende una población de apómeros para el uso como medicamento, cada apómero comprende de 1-8 moléculas de apolipoproteína que forman complejos con moléculas anfipáticas, en donde:

(i) las moléculas anfipáticas contribuyen con una carga neta de al menos 1 o -1 por molécula de apolipoproteína; y

(ii) la relación molar de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas varía de 8:1 a 1:15.

Otras modalidades de la presente invención son como se definen en las reivindicaciones anexas.

Se cree que los apómeros proporcionan varias ventajas sobre los complejos de lipoproteínas miméticas de HDL discoidales. La administración de un apómero puede ser una forma más eficiente de promover la salida de colesterol en comparación con los miméticos de HDL porque los apómeros, por el contrario de los complejos de lipoproteínas miméticas de HDL, son pobres en lípidos, evitando de esta manera la necesidad de formar apolipoproteínas pobres en lípidosin vivo.Los apómeros también pueden ser más seguros que los complejos de lipoproteínas miméticas de HDL, ya que la carga lipídica de los apómeros es mínima, evitando de esta manera posibles efectos proaterogénicos de la sobrecarga de lípidos que pueden resultar de la administración de complejos de lipoproteínas miméticas de HDL. Además, la cantidad de apolipoproteína que se administra a través de apómeros se puede aumentar con relación a la cantidad de apolipoproteína que puede administrarse a través de complejos de lipoproteínas miméticas de HDL porque los apómeros contienen un mayor porcentaje de apolipoproteína en comparación con los complejos de lipoproteínas miméticas de HDL. También se cree que los apómeros tienen diferentes farmacocinética y farmacodinámica (por ejemplo, un mayor tiempo de circulación de ApoA-I) en comparación con los complejos de lipoproteínas miméticas de HDL, y pueden penetrar la barrera hematoencefálica y ser absorbidos por la linfa, lo que proporciona ventajas adicionales sobre las partículas discoidales. Los apómeros pueden proporcionar ventajas adicionales sobre la ApoA-I libre de lípidos, ya que pueden tener menos tendencia a formar agregados no funcionales que no pueden disociarsein vivo.Además, los apómeros pueden administrarse a un sujeto por múltiples vías, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal e intramuscular. Además, los apómeros pueden aliviar la carga del paciente asociada con la administración intravenosa cuando se administran por vía subcutánea o intramuscular porque dichas administraciones pueden ser realizadas por un paciente sin enfermera o médico. También pueden usarse formas de depósito para evitar la necesidad de administraciones múltiples o para proporcionar dosificaciones menos frecuentes. Finalmente, la menor cantidad de fosfolípidos en los apómeros en comparación con las partículas de HDL discoidales da como resultado menores costos de producción en comparación con las HDL discoidales.

Generalmente, los apómeros comprenden una o más moléculas de apolipoproteína, cada una de las cuales forma complejos con una o más moléculas anfipáticas. En determinados aspectos, las moléculas anfipáticas juntas contribuyen con una carga neta de al menos 1 o -1 por molécula de apolipoproteína en un apómero. En la sección 6.1.1 se describen apolipoproteínas ilustrativas que pueden usarse en los apómeros de la descripción. En la sección 6.1.2 se describen moléculas anfipáticas ilustrativas.

La descripción proporciona además composiciones que comprenden un apómero de la descripción, que incluye las composiciones farmacéuticas. Las composiciones ilustrativas se describen en la sección 6.2.

La descripción proporciona además los apómeros para el uso en métodos de tratamiento de un sujeto que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un apómero o una composición farmacéutica de la descripción al sujeto. En la sección 6.3 se describen métodos ilustrativos de tratamiento de un sujeto.

5. Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un esquema que muestra un proceso mediante el cual el inventor cree que se forman apómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína y moléculas anfipáticas cargadas negativamente. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que los apómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína se forman primero a partir de monómeros de apolipoproteína y moléculas anfipáticas. Los apómeros con 2 moléculas de apolipoproteína(es decir,los apómeros con dímeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los apómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína y los apómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína(es decir,los apómeros con tetrámeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de apómeros con 2 moléculas de apolipoproteína. Finalmente, los apómeros con 8 moléculas de lipoproteínas(es decir,los apómeros con octámeros de apolipoproteína) se forman mediante dimerización de los apómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína. Aunque las flechas que se muestran en la figura 1 están representadas en una dirección, se cree que la formación de apómeros da como resultado la formación de diferentes especies que están presentes en un equilibrio. El equilibrio puede verse influenciado por condiciones tales como el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1. Debe entenderse que los números de las moléculas componentes que se muestran en la figura 1 son meramente ilustrativos y que se contemplan los apómeros que tienen diferentes relaciones de moléculas componentes.

La figura 2 muestra una superposición de cromatogramas de permeación en gel de ApoA-I humana, CER-001 y apómeros que comprenden ApoA-I humana, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)](DPPG) y esfingomielina en una relación molar de 1:2:2.

La figura 3 muestra los niveles plasmáticos de ApoA-I humana en conejos seguido de la administración intravenosa y subcutánea de apómeros que comprenden ApoA-I humana, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)](DPPG) y esfingomielina en una relación molar de 1:2:2.

6. Descripción detallada

6.1. Apómeros

Los apómeros de la descripción comprenden de 1-8 moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,1, 2, 4 u 8 moléculas de lipoproteína) que forman complejos con un número suficiente de moléculas anfipáticas para solubilizar las moléculas de apolipoproteína.

Las moléculas de apolipoproteína forman complejos con las moléculas anfipáticas en una relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática que varía de 8:1 a 1:15(por ejemplo,de 8:1 a 1:15, de 7:1 a 1:15, de 6:1 a 1:15,

a 1 a 1 a 1 a 1

En algunas modalidades, las moléculas de apolipoproteína forman complejos con las moléculas anfipáticas en una relación molar que varía de 6:1 a 1:6(por ejemplo,de 5:1 a 1:6, de 4:1 a 1:6, de 3:1 a 1:6, de 2:1 a 1:6, de 5:1 a 1:5, de 4:1 a 1:5, de 3:1 a 1:5, de 2:1 a 1:5, de 5:1 a 1:4, de 4:1 a 1:4, de 3:1 a 1:4, de 2:1 a 1:4, de 5:1 a 1:3, de 4:1 a 1:3, de 3:1 a 1:3, de 2:1 a 1:3, de 5:1 a 1:2, de 4:1 a 1:2, de 3:1 a 1:2, de 2:1 a 1:2, de 5:1 a 1:1, de 4:1 a 1:1, de 3:1 a 1:1, de 2:1 a 1:1, de 1:1 a 1:6, de 1:1 a 1:5, de 1:1 a 1:4, de 1:1 a 1:3, de 1:1 a 1:2, de 1:2 a 1:6, de 1:2 a 1:5, de 1:2 a 1:4, de 1:2 a 1:3, de 1:3 a 1:6, de 1:3 a 1:5, de 1:3 a 1:4, de 1:4 a 1:6, de 1:4 a 1:5, de 1:5 a 1:6, de 1.5:1 a 1:2, de 5:4 a

4:5, de 5:3 a 3:5, de 5:2 a 2:5, o de 3:2 a 2:3).

La relación molar de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas puede ser, pero no necesariamente tiene que ser, en números enteros o reflejar una relación uno a uno entre la apolipoproteína y las moléculas anfipáticas. A manera de ejemplo y sin limitación, un apómero puede tener una relación molar de apolipoproteína a molécula anfipática de 2:5, 8:7, 3:2 o 4:7. Las moléculas anfipáticas pueden contribuir juntas con una carga neta de al menos

+ 1 o -1 por apolipoproteína en el apómero(por ejemplo,+1, 2, 3, -1, -2 o -3). En algunas modalidades, la carga neta

es una carga negativa. En otras modalidades, la carga neta es una carga positiva. A menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la carga se mide a pH fisiológico.

Los apómeros de la descripción pueden prepararse, por ejemplo, mediante la combinación y la mezcla de una composición que comprende moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,una composición que comprende agregados de multímeros de apolipoproteína) con una solución que comprende las moléculas anfipáticas hasta que se forma una solución de apómeros.

Por ejemplo, los apómeros pueden prepararse mediante la mezcla de dos soluciones orgánicas, una que contiene una apolipoproteína y la otra que contiene una molécula anfipática cargada, y luego se retira el solvente mediante métodos tales como evaporación, secado por congelación (liofilización), calentamiento o cualquier otro método que se conoce en la técnica. Los apómeros también pueden prepararse mediante la mezcla de dos soluciones acuosas, una que contiene una apolipoproteína y la otra que contiene una molécula anfipática cargada, hasta obtener una solución homogénea. Los apómeros también pueden prepararse mediante la hidratación de una apolipoproteína con una solución acuosa de moléculas anfipáticas cargadas y luego se mezcla hasta obtener una solución homogénea. Las soluciones usadas para fabricar apómeros,por ejemplo,soluciones acuosas, pueden estar a temperatura ambiente, a una temperatura más alta que la temperatura ambiente, o a una temperatura más baja que la temperatura ambiente durante la formación de los apómeros. Alternativamente, las soluciones pueden someterse a un ciclo térmico entre una temperatura más alta y más baja,por ejemplo,como se describió en el ejemplo 1 deWO 2012/109162, preferentemente hasta que se obtengan apómeros de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de homogeneidad.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que el proceso de producción de apómeros da como resultado la formación de múltiples especies de apómeros que tienen diferentes cantidades de moléculas de apolipoproteína en equilibrio. Se conoce en la técnica que la autoasociación de ApoA-I libre de lípidos está influenciada por condiciones tales como el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura (ver,por ejemplo,Gianazza y otros, 1997, Biochemistry, 36:7898-7905; Jayaraman y otros, Journal of Biological Chemistry, 286(41):35610-35623; Schonfeld y otros, 2016 J. Phys. Chem. B, 120:1228-1235) y se cree que el equilibrio entre diferentes especies de apómeros está de manera similar influenciado por el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura. Por ejemplo, el pH ácido promueve la formación de ApoA-I monomérica, mientras que el pH alcalino promueve la formación de formas multiméricas, las concentraciones bajas de ApoA-I favorecen la ApoA-I monomérica, mientras que las concentraciones altas favorecen las formas multiméricas y las formas monoméricas de ApoA-I se favorecen a medida que aumenta la temperatura o disminuye desde el máximo de autoasociación de ApoA-I de 22 °C.

En algunas modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:1. En otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:2. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:3. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:4. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:5. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:6.

En algunas modalidades, un apómero comprende 1 molécula de apolipoproteína.

En otras modalidades, un apómero comprende 2 moléculas de apolipoproteína. Los apómeros que comprenden 2 moléculas de apolipoproteína tienen preferentemente un radio de Stokes de 3 nm o menos. En algunas modalidades, un apómero puede comprender 2 moléculas de apolipoproteína y 1, 2 o 3 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos cargadas negativamente) por molécula de apolipoproteína.

En otras modalidades, un apómero comprende 4 moléculas de apolipoproteína. Los apómeros que comprenden 4 moléculas de apolipoproteína tienen preferentemente un radio de Stokes de 4 nm o menos. En algunas modalidades, un apómero puede comprender 4 moléculas de apolipoproteína y 1, 2 o 3 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos cargadas negativamente) por molécula de apolipoproteína.

En otras modalidades, un apómero comprende 8 moléculas de apolipoproteína. Los apómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína tienen preferentemente un radio de Stokes de 5 nm o menos. En algunas modalidades, un apómero puede comprender 8 moléculas de apolipoproteína y 1, 2 o 3 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos cargadas negativamente) por molécula de apolipoproteína.

Los apómeros de la descripción pueden contener uno o más esteroles y/o derivados de esteroles(por ejemplo,un esterol vegetal, un esterol animal o un derivado de esterol tal como una vitamina). Por ejemplo, un apómero puede contener colesterol o un derivado de colesterol,por ejemplo,un éster de colesterol. El derivado de colesterol también puede ser un colesterol sustituido o un éster de colesterol sustituido. Los apómeros de la descripción también pueden contener un esterol oxidado tal como, pero no se limita a, colesterol oxidado o un derivado de esterol oxidado (tal como, pero no se limita a, un éster de colesterol oxidado).

En determinadas modalidades, los apómeros de la descripción no contienen colesterol y/o un derivado de colesterol(por ejemplo,como se describió en el párrafo anterior, por ejemplo un éster de colesterol).

Los apómeros de la descripción son preferentemente solubles en un fluido biológico, por ejemplo uno o más de linfa, líquido cefalorraquídeo, humor vítreo, humor acuoso y sangre o una fracción de la sangre(por ejemplo,suero o plasma).

Los apómeros pueden incluir una funcionalidad de direccionamiento, por ejemplo para dirigir los apómeros a un tipo de célula o tejido particular. En algunas modalidades, un apómero incluye un resto de direccionamiento unido a una molécula de apolipoproteína o una molécula anfipática.

6.1.1. Apolipoproteínas

Las apolipoproteínas adecuadas que pueden incluirse en los apómeros de la descripción incluyen las apolipoproteínas ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ, ApoH y cualquier combinación de dos o más de los anteriores. También pueden usarse las formas polimórficas, isoformas, variantes y mutantes, así como también las formas truncadas de las apolipoproteínas anteriores, siendo las más comunes la apolipoproteína A-I<Milano>(ApoA-Im), apolipoproteína A-I<París>(ApoA-I<P>), y la apolipoproteína A-I<Zaragoza>(ApoA-I<z>). También se conocen mutantes de apolipoproteínas que contienen residuos de cisteína y también pueden usarse (ver,por ejemplo,publicación de los Estados Unidos núm. 2003/0181372). Las apolipoproteínas pueden modificarse en su secuencia primaria para hacerlas menos susceptibles a las oxidaciones, por ejemplo, como se describió en las publicaciones de Estados Unidos núms. 2008/0234192 y 2013/0137628, y las patentes de Estados Unidos núms.

8,143,224 y 8,541,236. Las apolipoproteínas pueden incluir residuos correspondientes a elementos que facilitan su aislamiento, tal como etiquetas de His, u otros elementos que se diseñan para otros fines. Preferentemente, la apolipoproteína en el apómero es soluble en un fluido biológico(por ejemplo,linfa, líquido cefalorraquídeo, humor vítreo, humor acuoso, sangre o una fracción de la sangre(por ejemplo,suero o plasma)).

Las apolipoproteínas pueden purificarse a partir de fuentes animales (y en particular de fuentes humanas) o producirse de forma recombinante como se conoce bien en la técnica, ver,por ejemplo,Chung y otros, 1980, J. Lipid Res. 21 (3):284-91; Cheung y otros, 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29. Ver también las patentes de Estados Unidos núms.

5,059,528, 5,128,318, 6,617,134; las publicaciones de los Estados Unidos núms. 2002/0156007, 2004/0067873, 2004/0077541, y 2004/0266660; y las publicaciones PCT núms. WO 2008/104890 y WO 2007/023476. También son posibles otros métodos de purificación, por ejemplo como se describió en la publicación PCT núm. WO 2012/109162.

La apolipoproteína puede estar en forma de preproforma, proforma o madura. Por ejemplo, un apómero puede comprender ApoA-I(por ejemplo,ApoA-I humana) en el que la ApoA-I es preproApoA-I, proApoA-I o ApoA-I madura. En algunas modalidades, un apómero comprende ApoA-I que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, un apómero comprende ApoA-I que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, un apómero comprende ApoA-I que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, un apómero comprende ApoA-I que tiene al menos 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, un apómero comprende ApoA-I que tiene una identidad de secuencia del 100 % con la SEQ ID NO:2.

La(s) molécula(s) de apolipoproteína pueden comprender una apolipoproteína quimérica que comprende una apolipoproteína y uno o más restos funcionales unidos, tales como, por ejemplo, uno o más restos de direccionamiento, un resto que tiene una actividad biológica deseada, una etiqueta de afinidad para ayudar con la purificación, y/o una molécula reportera para estudios de caracterización o localización. En una modalidad, un resto funcional unido de una apolipoproteína quimérica no está en contacto con las superficies hidrófobas del apómero. En otra modalidad, un resto funcional unido está en contacto con las superficies hidrófobas del apómero. En algunas modalidades, un resto funcional de una apolipoproteína quimérica puede ser intrínseco a una proteína natural. En algunas modalidades, una apolipoproteína quimérica incluye un ligando o secuencia reconocida por o capaz de interactuar con un receptor de la superficie celular u otro resto de la superficie celular.

En una modalidad, una apolipoproteína quimérica incluye un resto de direccionamiento que no es intrínseco a la apolipoproteína nativa, tal como, por ejemplo, el péptido del factor de apareamiento a de S.cerevisiae,ácido fólico, transferrina o lactoferrina. En una modalidad, una apolipoproteína quimérica puede incluir un resto funcional intrínseco a una apolipoproteína. Un ejemplo de un resto funcional intrínseco de apolipoproteína es el resto de direccionamiento intrínseco formado aproximadamente por los aminoácidos 130-150 de la ApoE humana, que comprende la región de unión al receptor que se reconoce por los miembros de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad. Otros ejemplos de restos funcionales intrínsecos de apolipoproteína incluyen la región de ApoB-100 que interactúa con el receptor de lipoproteínas de baja densidad y la región de ApoA-I que interactúa con el receptor depurador de tipo B 1. En otras modalidades, puede añadirse un resto funcional de forma sintética o recombinante para producir una apolipoproteína quimérica. Otro ejemplo es una apolipoproteína con la secuencia prepro o pro de otra preproapolipoproteína(por ejemplo,la secuencia prepro de preproapoA-II sustituida por la secuencia prepro de preproapoA-I). Otro ejemplo es una apolipoproteína en la que algunos de los segmentos de la secuencia anfipática fueron sustituidos por otros segmentos de la secuencia anfipática de otra apolipoproteína.

Como se usa en la presente, "quimérico" se refiere a dos o más moléculas que son capaces de existir por separado y están unidas para formar una única molécula que tiene la funcionalidad deseada de todas sus moléculas constituyentes. Las moléculas constituyentes de una molécula quimérica pueden unirse sintéticamente mediante conjugación química o, cuando las moléculas constituyentes son todas polipéptidos o análogos de los mismos, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos pueden fusionarse de forma recombinante de manera que se exprese un único polipéptido continuo. Dicha molécula quimérica se denomina proteína de fusión. Una "proteína de fusión" es una molécula quimérica en la que las moléculas constituyentes son todas polipéptidos y están unidas (fusionadas) entre sí de manera que la molécula quimérica forma una cadena única continua. Los diversos constituyentes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden acoplarse a través de uno o más enlazadores. Uno o más segmentos de diversos constituyentes pueden, por ejemplo, insertarse en la secuencia de una apolipoproteína o, como otro ejemplo, pueden añadirse como un extremo N o extremo C a la secuencia de una apolipoproteína.

En algunas modalidades, se prepara una apolipoproteína quimérica mediante conjugación química de la apolipoproteína y el resto funcional que se va a unir. Los expertos en la técnica se conocen bien los medios para conjugar químicamente moléculas. Dichos medios variarán de acuerdo con la estructura del resto a unir, pero serán fácilmente determinables por los expertos en la técnica. Los polipéptidos contienen típicamente una variedad de grupos funcionales;por ejemplo,grupos ácido carboxílico (--COOH), amino libre (--NH2) o sulfhidrilo (--SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en el resto funcional o en un enlazador, para unir el resto al mismo. Un resto funcional puede estar unido al extremo N, al extremo C o a un grupo funcional en un residuo interior(es decir,un residuo en una posición intermedia entre los extremos N y C de una molécula de apolipoproteína. Alternativamente, la apolipoproteína y/o el resto a etiquetar puede derivatizarse para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales.

En algunas modalidades, las proteínas de fusión que incluyen un resto funcional polipeptídico se sintetizan mediante el uso de sistemas de expresión recombinantes. Típicamente, esto implica la creación de un ácido nucleico(por ejemplo,ADN) secuencia que codifica la apolipoproteína y el resto funcional de manera que los dos polipéptidos estarán en marco cuando se expresen, colocando el ADN bajo el control de un promotor, mediante la expresión de la proteína en una célula huésped y el aislamiento de la proteína expresada.

Puede incorporarse un ácido nucleico que codifica una apolipoproteína quimérica en un vector de expresión recombinante en una forma adecuada para la expresión en una célula huésped. Como se usa en la presente, un "vector de expresión" es un ácido nucleico que, cuando se introduce en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. El vector también puede incluir secuencias reguladoras tales como promotores, potenciadores u otros elementos de control de la expresión(por ejemplo,señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se conocen por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.; Berger y Kimmel, Guide a Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2a ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, etc.).

En algunas modalidades, se modificó una apolipoproteína de manera que cuando la apolipoproteína se incorpora a un apómero, la modificación aumentará la estabilidad del apómero o conferirá capacidad de direccionamiento. En una modalidad, la modificación incluye la introducción de residuos de cisteína en moléculas de apolipoproteína para permitir la formación de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares,por ejemplo,por mutagénesis dirigida al sitio. En otra modalidad, se usa un agente reticulante químico para formar enlaces intermoleculares entre moléculas de apolipoproteína para mejorar la estabilidad de los apómeros. La reticulación intermolecular previene o reduce la disociación de moléculas de apolipoproteína de los apómeros y/o previene el desplazamiento por moléculas de apolipoproteína endógenas dentro de un individuo al que se administran los apómeros. En otras modalidades, una apolipoproteína se modifica mediante derivatización química de uno o más residuos de aminoácidos o mediante mutagénesis dirigida al sitio, para conferir capacidad de direccionamiento o reconocimiento por parte de un receptor de superficie celular.

Los apómeros pueden dirigirse a un receptor de superficie celular específico mediante la ingeniería de propiedades de reconocimiento del receptor en una apolipoproteína. Por ejemplo, los apómeros pueden dirigirse a los macrófagos mediante la alteración de la apolipoproteína para conferir el reconocimiento por parte del receptor depurador endocítico de clase A de los macrófagos (SR-A). La capacidad de unión de SR-A puede conferirse a un apómero mediante la modificación de la apolipoproteína mediante mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar uno o más aminoácidos cargados positivamente con un aminoácido neutro o cargado negativamente. El reconocimiento de SR-A también puede conferirse mediante la preparación de una apolipoproteína quimérica que incluye una extensión del extremo N o C que tiene un ligando reconocido por SR-A o una secuencia de aminoácidos con una alta concentración de residuos cargados negativamente. Los apómeros también pueden interactuar con receptores de apolipoproteína tales como, pero no se limita a, receptores ABCA1, receptores ABCG1, receptores de megalina, cubulina y HDL tales como SR-Bl.

6.1.2. Moléculas anfipáticas

Una molécula anfipática es una molécula que posee elementos tanto hidrófobos (apolares) como hidrófilos (polares). Las moléculas anfipáticas que pueden usarse en los apómeros de la descripción incluyen lípidos, detergentes, ácidos grasos y moléculas apolares unidas covalentemente a moléculas polares tales como, pero no se limita a, azúcares o ácidos nucleicos. Los apómeros de la descripción pueden incluir una única clase de molécula anfipática(por ejemplo,una sola especie de fosfolípidos o una mezcla de fosfolípidos), o puede contener una combinación de clases de moléculas anfipáticas(por ejemplo,fosfolípidos y detergentes). El apómero puede contener una especie de moléculas anfipáticas o una combinación de moléculas anfipáticas configuradas para facilitar la solubilización de la(s) molécula(s) de apolipoproteína(s).

61.2.1. Lípidos

Los apómeros de la descripción pueden incluir uno o más lípidos. En diversas modalidades, uno o más lípidos pueden ser saturados y/o insaturados, naturales y/o sintéticos, cargados o no, zwitteriónicos o no. Los fosfolípidos pueden tener dos cadenas de acilo que son iguales o diferentes (por ejemplo, cadenas que tienen un número diferente de átomos de carbono, un grado diferente de saturación entre las cadenas de acilo, una ramificación diferente de las cadenas de acilo o una de sus combinaciones). El lípido también puede modificarse para que contenga una sonda fluorescente(por ejemplo,como se describió en avantilipids.com/product-category/products/fluorescent-lipids/). Preferentemente, el lípido comprende al menos un fosfolípido.

Los fosfolípidos pueden tener cadenas de acilo saturadas o insaturadas que varían de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 átomos de carbono(por ejemplo,6-20, 6-16, 6-12, 12-24, 12-20, 12-16, 16-24, 16-20 o 20-24). En algunas modalidades, un fosfolípido usado en un apómero tiene una o dos cadenas de acilo de 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24 carbonos(por ejemplo,dos cadenas de acilo de la misma longitud).

En la tabla 1, más abajo, se proporcionan ejemplos no limitantes de cadenas de acilo presentes en ácidos grasos comunes que pueden incluirse en fosfolípidos:

Los lípidos que pueden estar presentes en los apómeros incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos de cadena de alquilo pequeña, fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina de soja, dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, 1 -miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina, 1 -estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina dioleofosfatidiletanolamina, dilauroilfosfatidilglicerol fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilgliceroles, difosfatidilgliceroles tales como dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, diestearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipalmitoilfosfatídico, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina, fosfatidilserina cerebral, esfingomielina cerebral, palmitoilesfingomielina, dipalmitoilesfingomielina, esfingomielina de huevo, esfingomielina de leche, fitoesfingomielina, diestearoilesfingomielina, sal de dipalmitoilfosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, galactocerebrósido, gangliósidos, cerebrósidos, dilaurilfosfatidilcolina, (1,3)-D-manosil-(1,3)diglicérido, aminofenilglucósido, glicolípidos de éter de 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexilo y colesterol y sus derivados. Pueden usarse lípidos sintéticos, tales como la palmitoilesfingomielina sintética o la N-palmitoil-4-hidroxiesfinganina-1-fosfocolina (una forma de fitoesfingomielina) para minimizar la oxidación de los lípidos.

En algunas modalidades, un apómero incluye dos tipos de fosfolípidos: un lípido neutro,por ejemplo,lecitina y/o esfingomielina (abreviada SM o SPH) y un fosfolípido cargado(por ejemplo,un fosfolípido cargado negativamente). Un fosfolípido "neutro" tiene una carga neta de aproximadamente cero a pH fisiológico. En muchas modalidades, los fosfolípidos neutros son zwitteriones, aunque se conocen y pueden usarse otros tipos de fosfolípidos neutros netos. En algunas modalidades, la relación molar del fosfolípido cargado(por ejemplo,fosfolípido cargado negativamente) a fosfolípido neutro varía de 1:1 a 1:3, por ejemplo, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:3.

El fosfolípido neutro puede comprender, por ejemplo, una o ambas de lecitina y/o SM, y opcionalmente puede incluir otros fosfolípidos neutros. En algunas modalidades, el fosfolípido neutro comprende lecitina, pero no S<m>. En otras modalidades, el fosfolípido neutro comprende SM, pero no lecitina. En otras modalidades más, el fosfolípido neutro comprende tanto lecitina como SM. Todas estas modalidades ilustrativas específicas pueden incluir fosfolípidos neutros además de la lecitina y/o SM, pero en muchas modalidades no incluyen dichos fosfolípidos neutros adicionales.

La identidad del SM que se usa no es fundamental para el éxito. Por tanto, como se usa en la presente, la expresión "SM" incluye esfingomielinas derivadas o que se obtienen de fuentes naturales, así como también análogos y derivados de SM de origen natural que son impermeables a la hidrólisis por LCAT, como lo es el SM de origen natural. La SM es un fosfolípido muy similar en estructura a la lecitina, pero, a diferencia de la lecitina, no tiene una cadena principal de glicerol y, por lo tanto, no tiene enlaces éster que unan las cadenas de acilo. Más bien, la SM tiene una cadena principal de ceramida, con enlaces amida que conectan las cadenas de acilo. La SM puede obtenerse prácticamente de cualquier fuente. Por ejemplo, la SM puede obtenerse a partir de leche, huevo o cerebro. También pueden usarse análogos o derivados de Sm . Los ejemplos no limitantes de análogos y derivados de SM útiles incluyen, pero no se limitan a, palmitoilesfingomielina, N-palmitoil-4-hidroxiesfinganina-1-fosfocolina (una forma de fitoesfingomielina), palmitoilesfingomielina, estearoilesfingomielina, D-eritro-N-16:0-esfingomielina y su isómero dihidro, D-eritro-N-16:0-dihidro-esfingomielina. Pueden usarse SM sintéticas tales como la palmitoilesfingomielina sintética o la N-palmitoil-4-hidroxiesfinganina-1-fosfocolina (fitoesfingomielina) para producir complejos más homogéneos y con menos contaminantes y/o productos de oxidación que los esfingolípidos de origen animal. Los métodos para sintetizar SM se describen en la publicación de Estados Unidos núm. 2016/0075634.

Las esfingomielinas aisladas de fuentes naturales pueden enriquecerse artificialmente en una cadena de acilo saturada o insaturada particular. Por ejemplo, la esfingomielina de la leche (Avanti Phospholipid, Alabaster, Alabama) se caracteriza por largas cadenas de acilo saturadas(es decir,cadenas de acilo que tienen 20 o más átomos de carbono). Por el contrario, la esfingomielina de huevo se caracteriza por cadenas de acilo cortas y saturadas (es decir, cadenas de acilo que tienen menos de 20 átomos de carbono). Por ejemplo, mientras que solo aproximadamente el 20 % de la esfingomielina de la leche comprende cadenas de acilo C16:0 (16 carbonos, saturadas), aproximadamente el 80 % de la esfingomielina de huevo comprende cadenas de acilo C16:0. Mediante el uso de extracción con solventes, la composición de la esfingomielina de la leche puede enriquecerse para tener una composición de cadena de acilo comparable a la de la esfingomielina del huevo, o viceversa.

La SM puede ser semisintética de manera que tenga cadenas de acilo particulares. Por ejemplo, la esfingomielina de la leche puede purificarse primero a partir de la leche, luego una cadena acilo particular,por ejemplo,la cadena de acilo C16:0, puede escindirse y reemplazarse por otra cadena de acilo. La SM también puede sintetizarse completamente, mediantepor ejemplo,síntesis a gran escala. Ver,por ejemplo,Dong y otros, patente de Estados Unidos núm. 5,220,043, titulada Synthesis of D-erythro-sphingomyelins, expedida el 15 de junio de 1993; Weis, 1999, Chem. Phys. Lipids 102 (1-2):3-12. La SM puede ser completamente sintética,por ejemplo,como se describió en la publicación de Estados Unidos núm. 2014/0275590.

Las longitudes y los niveles de saturación de las cadenas de acilo que comprenden una SM semisintética o sintética pueden variarse selectivamente. Las cadenas de acilo pueden ser saturadas o insaturadas y pueden contener de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 átomos de carbono. Cada cadena puede contener el mismo número de átomos de carbono o, alternativamente, cada cadena puede contener diferentes números de átomos de carbono. En algunas modalidades, la SM semisintética o sintética comprende cadenas de acilo mixtas de manera que una cadena está saturada y la otra insaturada. En dichas SM de cadena de acilo mixta, las longitudes de cadena pueden ser iguales o diferentes. En otras modalidades, las cadenas de acilo de la SM semisintética o sintética están ambas saturadas o ambas insaturadas. Nuevamente, las cadenas pueden contener el mismo o diferente número de átomos de carbono. En algunas modalidades, ambas cadenas de acilo que comprenden la SM semisintética o sintética son idénticas. En una modalidad específica, las cadenas corresponden a las cadenas acilo de un ácido graso natural, tal como por ejemplo el ácido oleico, palmítico o esteárico. En otra modalidad, se usa una SM con cadenas funcionalizadas saturadas o insaturadas. En otra modalidad específica, ambas cadenas de acilo están saturadas y contienen de 6 a 24 átomos de carbono. En la tabla 1 anterior se proporcionan ejemplos no limitantes de cadenas de acilo presentes en ácidos grasos comunes que pueden incluirse en SM semisintéticas y sintéticas.

En algunas modalidades, la SM es palmitoil SM, tal como palmitoil SM sintética, que tiene cadenas de acilo C16:0, o es SM de huevo, que incluye como componente principal palmitoil SM.

En una modalidad específica, se usa una SM funcionalizada, tal como fitoesfingomielina.

La lecitina puede derivarse o aislarse de fuentes naturales o puede obtenerse sintéticamente. Ejemplos de lecitinas adecuadas aisladas de fuentes naturales incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina de huevo y fosfatidilcolina de soja. Ejemplos adicionales no limitantes de lecitinas adecuadas incluyen, dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina 1 -miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina, 1 -estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina, 1 -oleoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina y los derivados éteres o análogos del mismo.

Las lecitinas derivadas o aisladas de fuentes naturales pueden enriquecerse para incluir cadenas de acilo específicas. En modalidades que emplean lecitinas semisintéticas o sintéticas, la(s) identidad(es) de las cadenas de acilo pueden variarse selectivamente, como se analizó anteriormente en relación con SM. En algunas modalidades de los apómeros que se describen en la presente descripción, ambas cadenas de acilo en la lecitina son idénticas. En algunas modalidades de apómeros que incluyen tanto SM como lecitina, las cadenas de acilo de la SM y la lecitina son todas idénticas. En una modalidad específica, las cadenas de acilo corresponden a las cadenas de acilo del ácido mirístico, palmítico, oleico o esteárico.

Los apómeros incluyen preferentemente uno o más fosfolípidos cargados negativamente(por ejemplo,solos o en combinación con uno o más fosfolípidos neutros). Como se usa en la presente, "fosfolípidos cargados negativamente" son fosfolípidos que tienen una carga negativa neta a pH fisiológico. El fosfolípido cargado negativamente puede comprender un único tipo de fosfolípido cargado negativamente, o una mezcla de dos o más fosfolípidos diferentes, cargados negativamente. En algunas modalidades, los fosfolípidos cargados son glicerofosfolípidos cargados negativamente. Ejemplos específicos de fosfolípidos cargados negativamente adecuados incluyen, pero no se limitan a, un 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], un fosfatidilglicerol, un fosfatidilinositol, una fosfatidilserina, un ácido fosfatídico y sales del mismo (por ejemplo, sales de sodio o sales de potasio). En algunas modalidades, el fosfolípido cargado negativamente comprende uno o más de fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y/o ácido fosfatídico. En una modalidad específica, el fosfolípido cargado negativamente comprende o consiste en una sal de un fosfatidilglicerol o una sal de un fosfatidilinositol. En otra modalidad específica, el fosfolípido cargado negativamente comprende o consiste en 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], o DPPG, o una sal del mismo.

Los fosfolípidos cargados negativamente pueden obtenerse de fuentes naturales o prepararse mediante síntesis química. En modalidades que emplean fosfolípidos sintéticos cargados negativamente, las identidades de las cadenas de acilo pueden variarse selectivamente, como se analizó anteriormente en relación con SM. En algunas modalidades de los apómeros que se describen en la presente descripción, ambas cadenas de acilo en los fosfolípidos cargados negativamente son idénticas. En algunas modalidades, las cadenas de acilo de todos los tipos de fosfolípidos que se incluyen en un apómero son todas idénticas. En una modalidad específica, el apómero comprende fosfolípidos cargados negativamente y/o SM, todos ellos con cadenas de acilo C16:0 o C16:1. En una modalidad específica, el resto de ácido graso de la SM es predominantemente palmitoilo C16:1. En una modalidad específica, las cadenas de acilo del(los) fosfolípido(s) cargado(s), lecitina y/o SM corresponden a la cadena de acilo del ácido palmítico. Aún en otra modalidad específica, las cadenas de acilo del(los) fosfolípido(s) cargado(s), lecitina y/o SM corresponden a la cadena de acilo del ácido oleico.

Los apómeros pueden incluir uno o más lípidos cargados positivamente(por ejemplo,solos o en combinación con uno o más fosfolípidos neutros). Ejemplos de fosfolípidos cargados positivamente que pueden incluirse en los apómeros de la descripción incluyen N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-amino-propil)amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida, 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano, 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dilauroil-snglicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano, 1,2-dimiristoil-3-dimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-dimetilamonio-propano, N-(4-carboxibencil)-N,N-dimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-1-amonio, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-estearoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, bromuro de N-[1-(2,3-dimiristiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amonio, metilsulfato de N,N,N-trimetil-2-bis[(1-oxo-9-octadecenil)oxi]-(Z,Z)-1propanaminio y sales de los mismos(por ejemplo,sales de cloruro o bromuro). También pueden usarse otros lípidos cargados positivamente tales como estearilamina.

Los lípidos que se usan son preferentemente al menos 95 % puros y/o tienen niveles reducidos de agentes oxidantes (tales como, pero no se limita a, peróxidos). Los lípidos que se obtienen de fuentes naturales tienen preferentemente menos restos de ácidos grasos poliinsaturados y/o restos de ácidos grasos que no son susceptibles a la oxidación. El nivel de oxidación en una muestra puede determinarse mediante el uso de un método yodométrico, que proporciona un valor de peróxido, que se expresa en miliequivalentes de yoduros aislados por kg de muestra, abreviado meq O/kg.Ver, por ejemplo,Gray, 1978, Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal ofthe American Oil Chemists Society 55:539-545; Heaton, F.W. y Ur, Improved iodometric Methods forthe Determination of Lipid Peroxides, 1958, Journal ofthe Science of Food and Agriculture 9:781-786. Preferentemente, el nivel de oxidación, o nivel de peróxido, es bajo,por ejemplo,menos de 5 meq O/kg, menos de 4 meq O/kg, menos de 3 meq O/kg o menos de 2 meq O/kg.

Los apómeros en algunas modalidades pueden incluir pequeñas cantidades de lípidos adicionales. Puede usarse prácticamente cualquier tipo de lípidos, que incluye, pero no se limita a, lisofosfolípidos, galactocerebrósidos, gangliósidos, cerebrósidos, glicéridos, triglicéridos y esteroles y derivados de esteroles(por ejemplo,un esterol vegetal, un esterol animal, tal como colesterol, o un derivado de esterol, tal como un derivado de colesterol). Por ejemplo, un apómero puede contener colesterol o un derivado de colesterol,por ejemplo,un éster de colesterol. El derivado de colesterol también puede ser un colesterol sustituido o un éster de colesterol sustituido. Los apómeros de la descripción también pueden contener un esterol oxidado tal como, pero no se limita a, colesterol oxidado o un derivado de esterol oxidado (tal como, pero no se limita a, un éster de colesterol oxidado). En algunas modalidades, los apómeros no incluyen colesterol y/o sus derivados (tales como un éster de colesterol o un éster de colesterol oxidado).

Las moléculas de lípidos(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos) pueden contribuir juntas con una carga neta de 1-3(porejemplo,1-3,1-2, 2-3, 1, 2 o 3) por molécula de apolipoproteína en el apómero. En algunas modalidades, la carga neta es negativa. En otras modalidades, la carga neta es positiva.

6.1.2.2. Detergentes

Los apómeros de la descripción pueden contener uno o más detergentes. El detergente puede ser zwitteriónico, no iónico, catiónico, aniónico o una de sus combinaciones. Los detergentes zwitteriónicos ilustrativos incluyen 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO) y N-óxido de N,N-dimetildodecilamina (LDAO). Los detergentes no iónicos ilustrativos incluyen 6-monooleato de D-(+)-trehalosa, N-octanoil-N-metilglucamina, N-nonanoil-N-metilglucamina, N-decanoil-N-metilglucamina, 1-(7Z-hexadecenoil)-rac-glicerol, 1-(8Z-hexadecenoil)-rac-glicerol, 1-(8Z-heptadecenoil)-rac-glicerol, 1-(9Z-hexadecenoil)-rac-glicerol, 1-decanoil-rac-glicerol. Los detergentes catiónicos ilustrativos incluyen clorhidrato de (S)-O-metil-serina dodecilamida, cloruro de dodecilamonio, bromuro de deciltrimetilamonio y sulfato de cetiltrimetilamonio. Los detergentes aniónicos ilustrativos incluyen hemisuccinato de colesterilo, colato, sulfatos de alquilo y sulfonatos de alquilo.

En algunas modalidades, los apómeros de la descripción carecen de detergentes.

6.1.2.3. Ácidos grasos

Los apómeros pueden contener uno o más ácidos grasos. El uno o más ácidos grasos pueden incluir ácidos grasos de cadena corta que tienen colas alifáticas de cinco o menos carbonos(por ejemplo,ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico o ácido isovalérico), ácidos grasos de cadena media que tienen colas alifáticas de 6 a 12 carbonos(por ejemplo,ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico o ácido láurico), ácidos grasos de cadena larga que tienen colas alifáticas de 13 a 21 carbonos(por ejemplo,ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido araquídico), ácidos grasos de cadena muy larga que tienen colas alifáticas de 22 o más carbonos(por ejemplo,ácido behénico, ácido lignocérico o ácido cerótico), o una de sus combinaciones. El uno o más ácidos grasos pueden estar saturados(por ejemplo,ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido lignocérico o ácido cerótico), insaturado(por ejemplo,ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido sapienico, ácido oleico, ácido elaídico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido linoelaídico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico o ácido docosahexaenoico) o una de sus combinaciones. Los ácidos grasos insaturados pueden ser ácidos grasos cis o trans. En algunas modalidades, los ácidos grasos insaturados que se usan en los apómeros de la descripción son ácidos grasos cis.

6.1.2.4. Moléculas apolares y esteroles unidos a un azúcar

Los apómeros pueden contener una o más moléculas anfipáticas que comprenden una molécula o resto apolar(por ejemplo,una cadena de hidrocarburo, una cadena de acilo o diacilo) o un esterol (por ejemplo, colesterol) unido a un azúcar(por ejemplo,un monosacárido tal como glucosa o galactosa, o un disacárido tal como maltosa o trehalosa). El azúcar puede ser un azúcar modificado o un azúcar sustituido. Las moléculas anfipáticas ilustrativas que comprenden una molécula apolar unida a un azúcar incluyen dodecan-2-iloxi-p-D-maltósido, tridecan-3-iloxi-p-D-maltósido, tridecan-2-iloxi-p-D-maltósido, n-dodecil-p-D-maltósido (DDM), n-octil-p-D-glucósido, n-nonil-p-D-glucósido, n-decil-p-D-maltósido, n-dodecil-p-D-maltopiranósido, 4-n-dodecil-a,a-trehalosa, 6-n-dodecil-a,a-trehalosa y 3-n-dodecil-a,a-trehalosa.

6.2. Composiciones que comprenden apómeros

La descripción proporciona composiciones que comprenden una población de apómeros de la descripción.

Las composiciones de la descripción pueden comprender poblaciones de apómeros que tienen diferentes relaciones promedio de apolipoproteína a molécula anfipática. Por ejemplo, una población que comprende apolipoproteína y moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,fosfolípidos cargados negativamente) pueden tener un promedio de 1,8 a 2,5 moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,aproximadamente 2) y de 0,9 a 2,5 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,aproximadamente 1 o aproximadamente 2). Como otro ejemplo, una población que comprende apolipoproteína y moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,fosfolípidos cargados negativamente) pueden tener un promedio de 3,5 a 4,5 moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,aproximadamente 4) y de 0,9 a 2,5 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,aproximadamente 1 o aproximadamente 2). Como otro ejemplo, una población que comprende apolipoproteína y moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,fosfolípidos cargados negativamente) pueden tener un promedio de 7 a 9 moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,aproximadamente 8) y de 0,9 a 2,5 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,aproximadamente 1 o aproximadamente 2).

La identidad y cantidad de moléculas de lipoproteínas en una composición de apómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas (ver,por ejemplo,Zhang y otros, 2010, Methods Mol Biol. 673: 211-222). La identidad y cantidad de moléculas anfipáticas en una composición de apómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante cromatografía en capa delgada (ver,por ejemplo,Clogston y Patri, 2011, Methods Mol Biol. 697:109-17). La presencia de partículas discoidales en una composición de apómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de espectroscopía de RMN, microscopía de fuerza atómica, microscopía electrónica u otra técnica adecuada conocida en la técnica.

Preferentemente, las composiciones contienen, en todo caso, solo una pequeña cantidad de apolipoproteína agregada. Por ejemplo, en algunas modalidades, no más del 10 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma agregada. En otras modalidades, no más del 5 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma agregada. Aún en otras modalidades, no más del 2 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma agregada. Aún en otras modalidades, los agregados de apolipoproteína son indetectables, por ejemplo, cuando se miden mediante el uso de cromatografía de permeación en gel.

En algunas modalidades, los apómeros en una composición comprenden principalmente moléculas de apolipoproteína multiméricas. En algunas modalidades, no más del 20 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma monomérica. En otras modalidades, no más del 10 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma monomérica. Aún en otras modalidades, no más del 5 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma monomérica. Aún en otras modalidades, no más del 2 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en forma monomérica.

Preferentemente, las composiciones de la descripción contienen solo una pequeña cantidad de moléculas anfipáticas no complejadas. En algunas modalidades, no más del 20 % de las moléculas anfipáticas en la composición están en forma no complejada. En otras modalidades, no más del 10 % de las moléculas anfipáticas están en forma no complejada. Aún en otras modalidades, no más del 5 % de las moléculas anfipáticas están en forma no acomplejada. Aún en otras modalidades, no más del 2 % de las moléculas anfipáticas están en forma no complejada.

La homogeneidad de los apómeros y las composiciones de las descripciones puede medirse mediante cromatografía de permeación en gel. Una composición altamente homogénea generalmente tendrá un pico principal correspondiente a los apómeros y, posiblemente, uno o más picos secundarios correspondientes a una o más de proteínas libres y moléculas anfipáticas libres. También pueden observarse picos secundarios correspondientes a apómeros o complejos que tienen diferente tamaño que los apómeros del pico principal. El área del pico principal en un cromatograma de permeación en gel con relación al área total de los picos principal y secundario determina el por ciento de homogeneidad de una composición. En algunas modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 75 % homogéneas. En otras modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 85 % homogéneas. En otras modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 95 % homogéneas. Aún en otras modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 98 % homogéneas.

En algunas modalidades, la homogeneidad de una población de apómeros en una composición(es decir,el área del pico principal con relación al área total de los picos principal y secundario correspondientes a los apómeros) es al menos el 75 %. En otras modalidades, la población es al menos 85 % homogénea. En otras modalidades, la población es al menos 95 % homogénea. En otras modalidades, la población es al menos 98 % homogénea.

Las composiciones de la descripción que comprenden poblaciones de apómeros pueden caracterizarse además mediante el análisis de los radios de Stokes de las partículas en una composición determinada(por ejemplo,mediante cromatografía de filtración en gel). Preferentemente, las composiciones de la descripción contienen, si las hay, solo una pequeña cantidad de complejos de lipoproteínas discoidales. En algunas modalidades, los complejos de lipoproteínas que tienen radios de Stokes superiores a 3,4 nm, si están presentes, representan no más del 10 % de la apolipoproteína en una composición en base al peso. En otras modalidades, los complejos de lipoproteínas que tienen radios de Stokes superiores a 3,4 nm, si están presentes, representan no más del 5 % de la apolipoproteína en una composición en base al peso. Aún en otras modalidades, los complejos de lipoproteínas que tienen radios de Stokes superiores a 3,4 nm, si están presentes, representan no más del 2 % de la apolipoproteína en una composición en base al peso.

En algunas modalidades, al menos el 75 % de las partículas en una composición tienen un radio de Stokes menor que 3,5 nm. En otras modalidades, al menos el 85 % de las partículas en una composición tienen un radio de Stokes menor que 3,5 nm. En otras modalidades, al menos el 95 % de las partículas en una población tienen un radio de Stokes menor que 3,5 nm. En otras modalidades, al menos el 98 % de las partículas en una población tienen un radio de Stokes menor que 3,5 nm.

Una composición de apómero de la descripción puede estar en forma de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una población de apómeros y uno o más portadores, excipientes, diluyentes farmacéuticamente aceptables o una de sus combinaciones.

Los portadores ilustrativos incluyen solventes o medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Los diluyentes ilustrativos incluyen agua para inyección, solución salina, soluciones tamponadas tales como solución salina tamponada con fosfato y soluciones de azúcares tales como soluciones de sacarosa o dextrano. Los excipientes ilustrativos incluyen rellenos, aglutinantes, desintegrantes, solventes, agentes solubilizantes y agentes colorantes.

Las composiciones de la descripción pueden formularse de acuerdo con técnicas que se conocen en la técnica(por ejemplo,como se describió en Allen y otros, eds., 2012, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición, Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido.). Por ejemplo, las composiciones pueden formularse para inyección subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal(por ejemplo,como una solución), inhalación (inhalación intranasal o intrapulmonar), implantación (por ejemplo,como un supositorio), administración ocular o intraocular(por ejemplo,mediante gotas para los ojos).

En algunas modalidades, las composiciones se envasan en cantidades de dosificación unitarias adecuadas para la administración. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones comprenden cantidades de dosificación unitaria de apómeros secos (por ejemplo liofilizados) envasados en viales sellados. Dichas composiciones son adecuadas para la reconstitución con agua, solución fisiológica (tal como solución salina) o tampón y la administración mediante inyección. Dichas composiciones pueden incluir opcionalmente uno o más agentes antiaglomerantes y/o antiaglutinantes para facilitar la reconstitución de los apómeros, o uno o más agentes tamponantes, agentes de isotonicidad (por ejemplo, sacarosa y/o manitol), azúcares o sales (por ejemplo, cloruro de sodio) diseñado para ajustar el pH, la osmolalidad y/o la salinidad de la suspensión reconstituida. Las composiciones que se describieron anteriormente pueden fabricarse en condiciones que minimicen la oxidación, reduciendo de esta manera el riesgo de efectos secundarios, tales como daño hepático, causado por productos oxidados. Por ejemplo, las composiciones pueden fabricarse bajo un gas inerte, tal como nitrógeno, helio o argón.

Los apómeros también pueden formularse en composiciones farmacéuticas para liberación controlada. Como se usa en la presente, "liberación controlada" se refiere a la liberación de un apómero de una formulación a una velocidad en la que la concentración sanguínea del apómero en un individuo se mantiene dentro del intervalo terapéutico durante un período prolongado, durante un período de tiempo del orden de horas, días, semanas o más. Los apómeros pueden formularse en una matriz controlada bioerosionable o no bioerosionable, algunas de las cuales se conocen bien en la técnica. Una matriz de liberación controlada puede incluir un polímero o copolímero sintético, por ejemplo en forma de hidrogel. Ejemplos de dichos polímeros incluyen poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos, polisacáridos, poli(fosfoésteres), poliamidas, poliuretanos, poli(imidocarbonatos) y poli(fosfacenos), y polilactida-co-glicolida (PLGA), un copolímero de poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico). También pueden usarse materiales que contienen colágeno, albúmina y fibrinógeno.

6.3. Usos de los apómeros

Los apómeros y las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden usarse para tratar trastornos dislipidémicos y trastornos hepáticos. Los siguientes usos y métodos deben interpretarse como dirigidos a los apómeros para el uso en dichos métodos y usos.

Los trastornos dislipidémicos incluyen, pero no se limitan a, hiperlipidemia o susceptibilidad a la hiperlipidemia (tal como hipercolesterolemia), enfermedad cardiovascular o susceptibilidad a la enfermedad cardiovascular. Ejemplos no limitantes de enfermedades cardiovasculares para las cuales los apómeros y las composiciones farmacéuticas pueden ser útiles son aterosclerosis, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, síndrome coronario agudo, angina de pecho, claudicación intermitente, isquemia crítica de miembros, esclerosis de la válvula auricular y reestenosis. Los trastornos dislipidémicos causados por defectos genéticos tales como, pero no se limita a, deficiencia de ApoA-I, deficiencia de ABCA1 e hipercolesterolemia familiar en estados homocigotos o heterocigotos pueden tratarse con los apómeros y las composiciones farmacéuticas de la descripción.

Ejemplos no limitantes de trastornos hepáticos para los cuales los apómeros y las composiciones farmacéuticas pueden ser útiles son la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y la hepatitis, que incluye la hepatitis viral tal como la causada por la infección con el virus de la hepatitis A, B o C y hepatitis no viral, por ejemplo resultantes del uso de medicamentos recreativos o recetados.

Los métodos de tratamiento pueden comprender administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un apómero o una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del apómero.

Los apómeros y las composiciones pueden administrarse en los métodos de la descripción a un sujeto (que es preferentemente un mamífero y con la máxima preferencia un ser humano) por cualquier vía adecuada. Por ejemplo, la administración puede ser mediante inyección(por ejemplo,inyección subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal), inhalación(por ejemplo,inhalación intranasal o intrapulmonar, implantación, opcionalmente(por ejemplo,a través de un supositorio), o por vía ocular o intraocular(por ejemplo,mediante gotas para los ojos). En algunas modalidades, la solución se administra como una inyección de depósito.

Los métodos de la descripción pueden comprender además la administración complementaria de un segundo agente terapéutico al sujeto. Por ejemplo, el segundo agente terapéutico puede comprender una resina de ácidos biliares, niacina, un agente antiinflamatorio, una estatina, un fibrato, un inhibidor de CETP, un inhibidor de la agregación plaquetaria, un anticoagulante, un agonista de PCSK9, un inhibidor de la absorción de colesterol, o cualquiera de sus combinaciones (tal como una combinación de una estatina y niacina o una combinación de una estatina y un inhibidor de la absorción de colesterol).

Las resinas de ácidos biliares ilustrativas incluyen colestiramina, colestipol y colesevelam.

Los agentes antiinflamatorios ilustrativos incluyen alclofenaco; dipropionato de alclometasona; acetónido de algestona; alfa amilasa; amcinafal; amcinafida; amfenaco de sodio; clorhidrato de amiprilosa; anakinra; anirolaco; anitrazafeno; apazona; aspirina; balsalazida disódica; bendazaco; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelinas; broperamol; budesonida; carprofeno; cicloprofeno; cintazone; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopiraco; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; deflazacort; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenaco de potasio; diclofenaco de sodio; diacetato de diflorasona; diflumidona de sodio; diflunisal; difluprednato; diftalona; sulfóxido de dimetilo; drocinonida; endrisona; enlimomab; enolicam de sodio; epirizola; etodolaco; etofenamato; felbinaco; fenamol; fenbufeno; fenclofenaco; fencloraco; fendosal; fenpipalona; fentiazaco; flazalona; fluazacort; ácido flufenámico; flumizola; acetato de flunisolida; flunixina; flunixina meglumina; fluocortina de butilo; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; furaprofeno; furobufeno; halcinonida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenaco; ibuprofeno; ibuprofeno aluminio; ibuprofeno piconol; ilonidap; indometacina; indometacina de sodio; indoprofeno; indoxol; intrazol; acetato de isoflupredona; isoxepaco; isoxicam; ketoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lornoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato de sodio; ácido meclofenámico; dibutirato de meclorisona; ácido mefenámico; mesalamina; meseclazona; suleptanato de metilprednisolona; morniflumato; nabumetona; naproxeno; naproxeno de sodio; naproxol; nimazona; olsalazina de sodio; orgoteína; orpanoxina; oxaprozina; oxifenbutazona; clorhidrato de paranilina; polisulfato de pentosano de sodio; glicerato de fenbutazona de sodio; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; piroxicam olamina; pirprofeno; prednazato; prifelona; ácido prodólico; procuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarit; salcolex; salnacedina; salsalato; salicilatos; cloruro de sanguinaria; seclazona; sermetacina; sudoxicam; sulindaco; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap de sodio; tenoxicam; tesicam; tesimida; tetridamina; tiopinaco; pivalato de tixocortol; tolmetina; tolmetina de sodio; triclonida; triflumidato; zidometacina; glucocorticoides; y zomepiraco de sodio. En algunas modalidades, el agente antiinflamatorio comprende aspirina.

Las estatinas ilustrativas incluyen atorvastatina, rosuvastatina, pravastatina, simvastatina y lovastatina. En algunas modalidades, la estatina comprende atorvastatina. En otras modalidades, la estatina comprende rosuvastatina. En otras modalidades, la estatina comprende pravastatina. En otras modalidades, la estatina comprende simvastatina. En otras modalidades, la estatina comprende lovastatina.

Los fibratos ilustrativos incluyen fenofibrato, bezafibrato, clinofibrato y gemfibrozilo. En algunas modalidades, el fibrato comprende fenofibrato. En algunas modalidades, el fibrato comprende bezafibrato. En algunas modalidades, el fibrato comprende clinofibrato. En algunas modalidades, el fibrato comprende gemfibrozilo.

Los inhibidores de CETP ilustrativos incluyen anacetrapib, dalcetrapib y evacetrapib.

Los inhibidores de la agregación plaquetaria ilustrativos incluyen inhibidores irreversibles de la ciclooxigenasa (COX)(por ejemplo,aspirina) y los inhibidores de los receptores de difosfato de adenosina (ADP)(por ejemplo,clopidogrel, prasugrel, ticagrelor y ticlopidina).

Los anticoagulantes ilustrativos incluyen cumarinas(por ejemplo,warfarina, acenocumarol, fenprocumón, atromentina, fenindiona), heparinas(por ejemplo,heparina no fraccionada y heparinas de bajo peso molecular (BPM) tales como enoxaparina, nadroparina y dalteparina), inhibidores directos del factor Xa(por ejemplo,apixaban, rivaroxaban, dabigatran y edoxaban), ácidos grasos omega-3, ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 y sus combinaciones. En algunas modalidades, el anticoagulante comprende aspirina.

Los antagonistas de PCSK9 ilustrativos incluyen anticuerpos tales como alirocumab, bococizumabevolocumab, 1D05-IgG2 (Ni y otros, 2011, J Lipid Res. 52(1):78-86), y LY3015014 (Kastelein y otros, 2016, Eur Heart J 37(17):1360-9) y una terapia de ARNi como ALN-PCSSC (la Compañía de Medicamentos)).

Los inhibidores de la absorción de colesterol ilustrativos incluyen ezetimiba y bisulfato de clopidogrel. En algunas modalidades, el inhibidor de la absorción de colesterol comprende ezetimiba. En otras modalidades, el inhibidor de la absorción de colesterol comprende clopidogrel(por ejemplo,bisulfato de clopidogrel).

Otros moduladores de lípidos, tales como gemcabeno (desarrollado porGemphire Therapeutics) y ácido bempedoico (desarrollado por Esperion Therapeutics) también pueden administrarse de forma complementaria con un apómero de la descripción.

A menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la identificación de un agente específico abarca las sales de los mismos. Por tanto, por ejemplo, la mención de "warfarina" abarca "warfarina de sodio", la mención de "dopidogrel" abarca "bisulfato de clopidogrel",etc.

7. Ejemplos

7.1. Ejemplo 1: ApoA-I/DPPG/Apómeros de esfingomielina

Cantidades equimolares de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DPPG) y esfingomielina (SM) se pesaron y se solubilizaron en CHCh y se secaron bajo una corriente de N<2>. La película lipídica se dispersó en tampón fosfato 10 mM, pH 8,0 a 37 °C mediante el uso de un mezclador Ultra-Turax T25 de alto cizallamiento durante 5 minutos. La solución se mantuvo bajo una capa de nitrógeno durante la preparación.

Se descongeló una solución de ApoA-I humana purificada a temperatura ambiente. Luego se mezclaron la solución de ApoA-I y la solución de DPPG:SM para proporcionar una mezcla que tenía ApoA-I, DPPG y SM en una relación molar de 1:2:2. La mezcla se calentó a 37 °C durante 4 horas. Luego, la mezcla se sometió a ciclado térmico (tres ciclos de 20 minutos a 57 /- 2 °C y 5 minutos a 37 /- 2 °C) para completar la formación de los apómeros. Después de la terminación del ciclo térmico, la solución de apómero se enfrió y se almacenó durante la noche a 4 °C.

La solución de apómero se analizó mediante cromatografía de permeación en gel. Como se muestra en la figura 2, los apómeros fueron más pequeños que el CER-001 discoidal, que comprende ApoA-I, SM y DPPG en una relación en peso de proteína:lípido de 1:2,7 con una relación en peso de SM:DPPG de 97:3. La solución de apómero se administró a conejos mediante inyección intravenosa y subcutánea. Los niveles de ApoA-I humana en plasma después de las administraciones se muestran en la figura 3.

8. Listado de secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una población de apómeros para el uso como medicamento, cada apómero comprende de 1-8 moléculas de apolipoproteína que forman complejos con moléculas antipáticas, en donde: (i) las moléculas antipáticas contribuyen con una carga neta de al menos 1 o -1 por molécula de apolipoproteína; y

(ii) la relación molar de moléculas de apolipoproteína a moléculas antipáticas varía de 8:1 a 1:15.

2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la relación molar de apolipoproteína a molécula antipática varía de 6:1 a 1:6.

3. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las moléculas antipáticas comprenden un fosfolípido, un detergente, un ácido graso, una molécula apolar o esterol unido covalentemente a un azúcar, o una de sus combinaciones, opcionalmente en donde:

(a) la molécula apolar es una cadena de acilo o una de diacilo; y/o

(b) el azúcar es un azúcar modificado o un azúcar sustituido.

4. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las moléculas antipáticas comprenden o consisten en moléculas de tostolípidos, opcionalmente en donde las moléculas de tostolípidos comprenden tostolípidos cargados negativamente, tostolípidos neutros o una de sus combinaciones, y además opcionalmente, las moléculas de tostolípidos contribuyen con una carga neta de 1-3 por molécula de apolipoproteína en el apómero.

5. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las moléculas de tostolípidos consisten en una combinación de tostolípidos cargados negativamente y neutros, opcionalmente en donde la relación molar de tostolípido cargado negativamente a tostolípido neutro varía de 1:1 a 1:3, además opcionalmente aproximadamente 1:1o aproximadamente 1:2.

6. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde no más del 20 %, no más del 10 %, no más del 5 % o no más del 2 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en torma agregada y/o no más del 20 %, no más del 10 %, no más del 5 % o no más del 2 % de las moléculas de apolipoproteína en la composición están en torma monomérica.

7. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde al menos 75 %, al menos 85 %, al menos 95 % o al menos 98 % de las partículas en la población tienen un radio de Stokes menor que 3,5 nm.

8. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde:

(a) Los apómeros en la población tienen en promedio de 1,8 a 2,5 moléculas de apolipoproteína y de 0,9 2,5 moléculas antipáticas cargadas negativamente, opcionalmente aproximadamente 2 moléculas de apolipoproteína y aproximadamente 1 o aproximadamente 2 moléculas antipáticas cargadas negativamente;

(b) Los apómeros en la población tienen en promedio de 3,5 a 4,5 moléculas de apolipoproteína y de 0,9 2,5 moléculas antipáticas cargadas negativamente, opcionalmente aproximadamente 4 moléculas de apolipoproteína y aproximadamente 1 o aproximadamente 2 moléculas antipáticas cargadas negativamente; o

(c) Los apómeros en la población tienen en promedio de 7 a 9 moléculas de apolipoproteína y de 0,9-2,5 moléculas antipáticas cargadas negativamente, opcionalmente aproximadamente 8 moléculas de apolipoproteína y aproximadamente 1 o aproximadamente 2 moléculas antipáticas cargadas negativamente.

9. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde:

(a) no más del 20 %, no más del 10 %, no más del 5 % o no más del 2 % de las moléculas antipáticas están en torma no complejada;

(b) los apómeros en la composición son al menos 75 %, al menos 85 %, al menos 95 % o al menos 98 % homogéneos; y/o

(c) los complejos de lipoproteínas que tienen radios de Stokes superiores a 3,4 nm, si están presentes, representan no más del 10 %, no más del 5 % o no más del 2 % de la apolipoproteína en base al peso.

10. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde:

(a) las moléculas de apolipoproteína comprenden o consisten en moléculas de apolipoproteína A-I (ApoA-I), que son opcionalmente moléculas de ApoA-I humana, que son opcionalmente recombinantes, opcionalmente en donde:

(i) las moléculas de ApoA-I son moléculas de apolipoproteína A-I<Milano>(ApoA-I<m>), apolipoproteína AI<París>(ApoA-I<P>), o apolipoproteína AI<Zaragoza>(ApoA-I<Z>); y/o

(ii) las moléculas de ApoA-I comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2; o

(b) las moléculas de apolipoproteína son moléculas de ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ o ApoH.

11. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las moléculas anfipáticas comprenden un fosfolípido cargado negativamente que opcionalmente comprende una sal de un fosfatidilinositol, una fosfatidilserina, un fosfatidilglicerol o un ácido fosfatídico, opcionalmente en donde la sal es una sal de sodio o una sal de potasio, opcionalmente en donde el fosfolípido cargado negativamente es una sal de un fosfatidilglicerol, que es opcionalmente una sal de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)](DPPG).

12. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde los apómeros comprenden un fosfolípido neutro, que es opcionalmente una lecitina o una esfingomielina, opcionalmente en donde la esfingomielina es esfingomielina de huevo, una esfingomielina vegetal o una esfingomielina sintética, opcionalmente en donde los apómeros comprenden un fosfolípido cargado negativamente y un fosfolípido neutro, en donde la relación molar de fosfolípido cargado negativamente a fosfolípido neutro en la composición varía de 1:1 a 1:3, opcionalmente aproximadamente 1:1o aproximadamente 1:2.

13. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que tiene forma de una composición farmacéutica que comprende uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para el uso en el tratamiento de un trastorno dislipidémico en un sujeto que necesita del mismo, opcionalmente en donde el sujeto es humano, opcionalmente en donde:

(a) el sujeto tiene o es susceptible a hiperlipidemia o enfermedad cardiovascular, opcionalmente en donde dicha hiperlipidemia es hipercolesterolemia, y opcionalmente en donde la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, síndrome coronario agudo, angina de pecho, claudicación intermitente, isquemia crítica de miembros, esclerosis de la válvula auricular o reestenosis; o

(b) el sujeto tiene una deficiencia de ApoA-I, una deficiencia de ABCA1 o hipercolesterolemia familiar.

15. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para el uso en el tratamiento de un trastorno hepático en un sujeto que necesita del mismo, opcionalmente en donde el sujeto es humano, y opcionalmente en donde dicho sujeto tiene enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o hepatitis.