ES2984636T3

ES2984636T3 - Anticuerpos anti-IL-5

Info

Publication number: ES2984636T3
Application number: ES17829503T
Authority: ES
Inventors: Mark Terence Liddament; Anthony Doyle; Adam Clarke; David Jose Simon Laine; Bridget Ann Cooksey
Original assignee: Cephalon LLC
Current assignee: Cephalon LLC
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2024-10-30
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: JP2020513761A; EA201991552A1; ZA201904097B; PH12019501452A1; AU2017379853A1; WO2018119016A1; US11111292B2; CN110267986B; EP3559030B1; RU2758008C2; JP7060906B2; US20180186873A1; IL267271B2; EP3559030C0; BR112019012929A2; RU2019123112A; AR110564A1; CL2019001730A1; KR20190126769A; US20210355205A1

Abstract

En el presente documento se describen moléculas de anticuerpos totalmente humanos que se unen inmunoespecíficamente a la IL-5 humana. Las moléculas de anticuerpos pueden unirse a la IL-5 humana con una constante de afinidad de equilibrio (KD) de al menos aproximadamente 40 pM, determinada por resonancia de plasmón superficial. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-IL-5

REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS

[0001]Esta solicitud reivindica prioridad a la U.S. Solicitud provisional estadounidense n.° 62/438.502, presentada el 23 de junio de 2016.

LISTA DE SECUENCIAS

[0002]La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 30 de noviembre de 2017, se denomina 102085.000906_sl.txt y tiene un tamaño de 93.529 bytes.

CAMPO TÉCNICO

[0003]En el presente documento se describen nuevas moléculas de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a IL-5, y usos de los anticuerpos descritos, tal como se definen en las reivindicaciones.

ANTECEDENTES

[0004]La interleucina-5 (IL-5) es una citoquina T-helper 2 (Th2) que provoca la proliferación y diferenciación tanto de los linfocitos B como de los eosinófilos. En las células B, la IL-5 también aumenta la secreción de inmunoglobulinas. La IL-5 es un modulador clave de los eosinófilos, donde también regula la maduración, la migración a los tejidos, la supervivencia y la prevención de la apoptosis.

[0005]A través de dos motivos separados, la IL-5 se une a su receptor específico (IL5-Ra) y a un receptor de señalización, una cadena p común (pc) compartida entre la interleucina 3 (IL-3) y el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF). Se ha informado de que la afinidad de la IL-5 por la IL5- Ra se sitúa en el intervalo medio-bajo de nM (0,2-100 nM); esto se desplaza al intervalo medio de pM (-100 pM) en presencia de pc. IL5-Ra se une específicamente a IL-5, que a su vez recluta pc a IL-5R.

[0006]El potencial terapéutico de dirigirse a la interleucina-5 (IL-5) ha quedado demostrado por la amplia validación en la literatura y los recientes datos clínicos positivos de fase III tanto para el reslizumab como para el mepolizumab.

[0007]El documento WO 96/21000 describe antagonistas recombinantes de IL-5 útiles en el tratamiento de trastornos mediados por IL-5.

[0008]Zhang et al., International Immunology, volumen 11, número 12, 1999 describe el mapeo y caracterización del epítopo(s) de Sch 55700, un mAb humanizado, que inhibe la IL-5 humana.

RESUMEN

[0009]La invención proporciona una molécula de anticuerpo humano que se une inmunoespecíficamente a IL-5 humana con una constante de afinidad de equilibrio (K<d>) de al menos unos 40 pM determinada por resonancia de plasmón superficial, en la que la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

[0010]La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo según la invención.

[0011]La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo según la invención.

[0012]La invención proporciona además un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la invención.

[0013]La invención proporciona además una célula transformada para expresar la molécula de anticuerpo según la invención.

[0014]La invención proporciona además la molécula de anticuerpo según la invención o la composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento del asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangitis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica.

[0015]En el presente documento se describen moléculas de anticuerpos humanos que se unen inmunoespecíficamente a IL-5 humana con una constante de afinidad de equilibrio (K<d>) de al menos aproximadamente 40 pM según se determina por resonancia de plasmón superficial, como se define en las reivindicaciones.

[0016]También se describen moléculas de anticuerpo que comprenden una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 o 66, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 42 o 45, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 48, 51, 54, 57, 60 ó 63, tal como se definen en las reivindicaciones.

[0017]Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 o 67, donde la variabilidad (es decir, el al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad) ocurre fuera de la secuencia CDR, como se define en las reivindicaciones.

[0018]Las moléculas de anticuerpos descritas en el presente documento pueden comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y el segundo dominio FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 20%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, o 68, donde la variabilidad (es decir, la identidad de al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) ocurre fuera de la secuencia CDR, como se define en las reivindicaciones.

[0019]También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de anticuerpo divulgadas, vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico y células transformadas para expresar las moléculas de anticuerpo divulgadas.

[0020]También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de anticuerpo divulgadas en el presente documento.

[0021]En relación con las moléculas de anticuerpo de la invención, existen métodos para tratar a un sujeto que tiene asma eosinofílica, síndrome hipereosinofílico, poliposis nasal con afectación eosinofílica, granulomatosis eosinofílica con poliangitis, dermatitis atópica o esofagitis eosinofílica que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las moléculas de anticuerpo aquí divulgadas, o composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, para tratar el asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica.

[0022]También se describe el uso de una cantidad eficaz de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, o composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, en el tratamiento del asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica, tal como se define en las reivindicaciones.

[0023]Se describe además el uso de cualquiera de las moléculas de anticuerpos descritas en el presente documento, o composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica, tal como se define en las reivindicaciones.

[0024]Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0025]El resumen, así como la siguiente descripción detallada, se comprenden mejor cuando se leen conjuntamente con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar las moléculas de anticuerpos, métodos y usos descritos, tal como se definen en las reivindicaciones, se muestran en los dibujos aspectos ejemplares de moléculas de anticuerpos, métodos y usos; sin embargo, las moléculas de anticuerpos, métodos y usos no se limitan a las realizaciones específicas descritas. En los dibujos:

La FIG. 1 ilustra un ensayo TF-1.6G4 que muestra que la variante de anticuerpo 3A5.001 (en formato IgG4) conservó una potencia equivalente a la del anticuerpo original 3 A5 (en formato IgG1).

La FIG. 2 ilustra un ensayo de TF-1.6G4 que muestra que la variante de anticuerpo 3A5.040 conservó una potencia equivalente a la del anticuerpo progenitor 3A5.001.

La FIG. 3 es una matriz gráfica que muestra la posición y la identidad de las diferentes sustituciones de aminoácidos individuales que se generaron en las CDR 3A5.040 VH, alineadas con la secuencia 3A5.040 VH original (secuencia superior). Los recuadros contienen los residuos designados CDR según la nomenclatura AbM. Además de los residuos CDR, se hicieron variantes en los residuos Kabat números 93 y 94 (adyacentes a HC CDR3) como se describe en el Ejemplo "Pruebas funcionales y caracterización de anticuerpos." Las diversas secuencias recitadas en esta figura se proporcionan en SEQ ID NO:73.

La FIG. 4 es una matriz gráfica que muestra la posición y la identidad de las diferentes sustituciones de aminoácidos individuales que se generaron en las CDR 3A5.040 VL, alineadas con la secuencia 3A5.040 VL original (secuencia superior). Los recuadros contienen los residuos designados CDR según la nomenclatura AbM. Las diversas secuencias recitadas en esta figura se proporcionan en SEQ ID NO:74.

La FIG. 5 ilustra ejemplos de secuencias consenso CDR de cadena ligera alineadas con la secuencia 3A5.040 VL (secuencia superior). Se incluyeron en las secuencias de consenso las variantes de sustitución de un solo aminoácido en el CDR del 3A5.040 VL que mostraron mejoras potenciales según los criterios de inclusión descritos en los Ejemplos de (la relación entre la kd de la variante y la kd del 3A5.040 > 1,5) y (la relación entre el nivel de expresión de la variante y el nivel de expresión del 3A5.040 >0,5). Las definiciones y la numeración de los CDR se ajustan a la nomenclatura AbM y Kabat, respectivamente. Los recuadros identifican las posiciones de los residuos CDR. Las diversas secuencias recitadas en esta figura se proporcionan en SEQ ID NO:75.

La FIG. 6 ilustra un análisis cinético Biacore multiconcentración de la unión del anticuerpo 3A5.046 a IL-5 humana recombinante a 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 y 0,156 pg/mL. Los sensorgramas muestran concentraciones decrecientes de IL-5 en orden desde 2,5 pg/mL de IL-5 en el trazo superior hasta 0,156 pg/mL de IL-5 en el trazo inferior.

La FIG. 7A y FIG. 7B ilustran la proliferación de células TF-1.6G4 en respuesta a IL-5, y la potencia de inhibición de la proliferación impulsada por IL-5 por 3A5.046. El 3A5.046 fue un inhibidor más potente de la IL-5 humana (FIG. 7A) y la IL-5 del mono cynomolgus (FIG. 7B) que el mepolizumab.

La FIG. 8A y FIG. 8B ilustran un ELISA ejemplar desarrollado utilizando el anticuerpo 3 A5 y un anticuerpo de captura de control (R&D Systems). El ELISA fue capaz de detectar la IL-5 recombinante (FIG. 8A) e IL-5 producida a partir de células T humanas primarias activadas CD3/CD28/IL-33 de 3 donantes (FIG. 8B). La FIG. 8B panel superior: Donante 1, FIG. 8B panel central: Donante 3; FIG. 8B panel inferior: Donante 4.

La FIG. 9 ilustra los resultados de un experimento en el que células de sangre de cordón umbilical CD34+ se diferenciaron en eosinófilos fenotípicamente maduros utilizando IL-5 y otras citoquinas como se describe en los Ejemplos. El anticuerpo 3A5.046 fue más potente que el mepolizumab en la inhibición de la diferenciación de eosinófilos inducida por IL-5. La FIG. 10A, FIG. 10B, F<i>G. 10C, FIG. 10D y FIG. 10E ilustran los resultados del análisis de reactividad cruzada Biacore de la unión del anticuerpo 3A5.046 a la IL-5 humana (FIG. 10A) y la IL-5 del mono cynomolgus (FIG. 10B), IL-5 de ratón (FIG. 10C), IL-5 de rata (FIG. 10D), y la IL-5 de cobaya (FIG. 10E). Se muestran los sensorgramas de doble referencia para la unión a citocinas a 1 pg/ml o 10 pg/ml.

La FIG. 11 A, FIG. 11B, FIG. 11C y FIG. 11D ilustran los resultados de un análisis de especificidad Biacore del anticuerpo 3A5.046. Se muestran sensorgramas de doble referencia para la unión a citocinas a 10 pg/ml (FIG. 11A y FIG. 1 IB) o 1 pg/ml (FIG. 8A y FIG. 11D).

La FIG. 12 ilustra los resultados de la provocación con Ascaris suum (A. suum) en un modelo de eosinofilia de las vías respiratorias en mono cynomolgus. En el día 2 hubo una diferencia sustancial en el número de eosinófilos pulmonares (BALF) al comparar los animales tratados con 3A5.046 y los tratados con vehículo (placebo) (p<0,01; prueba de Mann-Whitney).

Las FIG 13A y FIG. 13B ilustran la respuesta de los eosinófilos en sangre durante 10 días tras una provocación por A. su um en monos cynomolgus que fueron pretratados con 3A5.046 o con un anticuerpo de control del mismo isotipo ("placebo") una semana antes de la provocación por A. suum (FIG. 1A; La Figura 13B ilustra más detalles de los recuentos de eosinófilos en sangre de los animales tratados con el anticuerpo 3A5.046, hasta 45 días después de la provocación (52 días después de la dosis). Los recuentos de eosinófilos se mantuvieron por debajo del valor basal durante al menos 45 días tras una dosis única de 3 A5.046 una semana antes de la provocación.

La FIG. 14 ilustra los niveles de eosinófilos en BALF en un modelo de rata humana con IL-5 knock-in (KI) en respuesta a un desafío conAlternaría alternata.Este modelo puede utilizarse para probar la potencia de un anticuerpo anti-IL-5 para modular el número de eosinófilos del BALF tras la exposición aAlternaría.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

[0026]Las moléculas de anticuerpos, métodos y usos descritos pueden comprenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las figuras adjuntas, que forman parte de la presente divulgación. Debe entenderse que las moléculas de anticuerpos, los métodos y los usos descritos no se limitan a las moléculas de anticuerpos, los métodos y los usos específicos descritos y/o mostrados en el presente documento, y que la terminología utilizada en el presente documento tiene por objeto describir realizaciones particulares a modo de ejemplo únicamente y no pretende ser limitativa de las moléculas de anticuerpos, los métodos y los usos reivindicados.

[0027]A menos que se indique específicamente lo contrario, cualquier descripción de un posible mecanismo o modo de acción o motivo de mejora tiene carácter meramente ilustrativo, y las moléculas de anticuerpos, métodos y usos descritos no se verán limitados por la corrección o incorrección de cualquier mecanismo o modo de acción o motivo de mejora sugerido.

[0028]A lo largo de este texto, las descripciones se refieren a moléculas de anticuerpos y métodos de uso de dichas moléculas de anticuerpos. Cuando la divulgación describe o reivindica una característica o realización asociada a una molécula de anticuerpo, dicha característica o realización es igualmente aplicable a los métodos de utilización de dicha molécula de anticuerpo. Del mismo modo, cuando la divulgación describe o reivindica una característica o realizaciónasociada a un método de utilización de una molécula de anticuerpo, dicha característica o realización es igualmente aplicable a la molécula de anticuerpo.

[0029] Cuando se recita o establece en el presente documento un intervalo de valores numéricos, el intervalo incluye los puntos extremos del mismo y todos los números enteros y fracciones individuales dentro del intervalo, y también incluye cada uno de los intervalos más estrechos formados por todas las diversas combinaciones posibles de esos puntos extremos y números enteros y fracciones internos para formar subgrupos del grupo más grande de valores dentro del intervalo establecido en la misma medida que si se recitara explícitamente cada uno de esos intervalos más estrechos. Cuando en el presente documento se indica que un intervalo de valores numéricos es superior a un valor establecido, el intervalo es, no obstante, finito y está limitado en su extremo superior por un valor operable en el contexto de la invención tal como se describe en el presente documento. Cuando en el presente documento se indica que un intervalo de valores numéricos es inferior a un valor establecido, el intervalo está, no obstante, limitado en su extremo inferior por un valor distinto de cero. No se pretende que el alcance de la invención se limite a los valores específicos recitados al definir un rango. Todas las gamas son inclusivas y combinables.

[0030] La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

[0031] Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "sobre", se entenderá que el valor particular forma otra realización. El término "aproximadamente" cuando se utiliza en referencia a rangos numéricos, límites o valores específicos se utiliza para indicar que los valores mencionados pueden variar hasta en un 10% del valor indicado. Así, el término "aproximadamente" se utiliza para abarcar variaciones de ± 10% o menos, variaciones de ± 5% o menos, variaciones de ± 1% o menos, variaciones de ± 0,5% o menos, o variaciones de ± 0,1% o menos del valor especificado.

[0032] Debe apreciarse que ciertas características de las moléculas de anticuerpos, métodos y usos descritos que, para mayor claridad, se describen aquí en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de las moléculas de anticuerpos, métodos y usos descritos que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación.

[0033] Tal como se utilizan aquí, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen el plural.

[0034] A lo largo de la especificación y las reivindicaciones se utilizan diversos términos relacionados con aspectos de la descripción. A menos que se indique lo contrario, estos términos tienen el significado habitual en la técnica. Los demás términos específicamente definidos deberán interpretarse de forma coherente con las definiciones que figuran en el presente documento.

[0035] El término "que comprende" pretende incluir, pero no se limita necesariamente a, ejemplos englobados por los términos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en"; de forma similar, el término "que consiste esencialmente en" pretende incluir, pero no se limita necesariamente a, ejemplos englobados por el término "que consiste en".

[0036] El término "molécula de anticuerpo" se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina de longitud completa y fragmentos de unión a antígeno de las mismas.

[0037] Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. Las IgA y las IgG se subclasifican a su vez en los isotipos IgAl, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente diferenciados, a saber, kappa(k)y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0038] "Fragmento de unión a antígeno" se refiere a una porción de una molécula de inmunoglobulina que conserva las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo parental de longitud completa (es decir, "fragmento de unión a antígeno del mismo"). Los fragmentos de unión a antígeno ejemplares pueden tener: regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1, 2, y/o 3; regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1, 2, y/o 3; una región variable de cadena pesada (VH); una región variable de cadena ligera (VL); y combinaciones de las mismas. Los fragmentos de unión a antígeno incluyen: ¡Un fragmento Fab, un fragmento monovalente formado por los dominios VL, VH, luz constante (CL) y pesado constante 1 (CHI); un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente formado por dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd formado por los dominios VH y CHI; un fragmento Fv formado por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward et a!.. Nature 341:544- 546, 1989), que consiste en un dominio VH o un dominio VL. Los dominios VH y VL pueden diseñarse y unirse mediante un enlazador sintético para formar varios tipos de diseños de anticuerpos de cadena simple en los que los dominios VH/VL se emparejan intramolecularmente, o intermolecularmente en aquellos casos en los que los dominios VH y VL se expresan mediante construcciones de anticuerpos de cadena simple separadas, para formar un sitio de unión a antígeno monovalente, como Fv de cadena simple (scFv) o diabody, descrito por ejemplo en Int'l Pat. estadounidense n.°. W01998/44001, WO1988/01649, WO 1994/13804, and WO 1992/01047. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, y la utilidad de los fragmentos se comprueba del mismo modo que la de los anticuerpos de longitud completa.

[0039] La frase "se une inmunoespecíficamente" se refiere a la capacidad de las moléculas de anticuerpos descritas de unirse preferentemente a su diana (IL-5 en el caso de moléculas de anticuerpos anti-IL-5) sin unirse preferentemente a otras moléculas en una muestra que contenga una población mixta de moléculas. Las moléculas de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la IL-5 están sustancialmente libres de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-5 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de la IL-5). Sin embargo, las moléculas de anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a la IL-5 pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos, como los ortólogos de la IL-5 humana, incluida la IL-5 deMacaca fascicularis(mono cynomolgus). Las moléculas de anticuerpos aquí divulgadas son capaces de unirse inmunoespecíficamente tanto a IL-5 humana producida naturalmente como a<i>L-5 producida recombinantemente en células de mamífero o procariotas, como se define en las reivindicaciones.

[0040] Una región variable de anticuerpo consta de cuatro regiones "marco" interrumpidas por tres "sitios de unión a antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen utilizando varios términos: (i) Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3), y tres en la VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) se basan en la variabilidad de la secuencia (Wu y Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991); y (ii) "Regiones hipervariables" ("HVR" o "HV"), tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3) se refieren a las regiones de los dominios variables de anticuerpos que son hipervariables en estructura según la definición de Chothia y Lesk (Chothia y Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). La definición AbM de CDR también se utiliza ampliamente; es un compromiso entre los esquemas de numeración de Kabat y Chothia y se denomina así porque fue utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (Rees, A.R., Searle, S.M.J., Henry, A.H.y Pedersen, J.T.). (1996) En Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). Otros términos son "IMGT-CDRs" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) y "Specificity Determining Residue Usage" (SDRU) (Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004). La base de datos International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizadas de los sitios de unión a antígenos. La correspondencia entre CDR, HV y delineaciones IMGt se describe en Lefranc etal., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.

[0041] "Marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable distintas de las definidas como sitios de unión a antígenos. Dado que los sitios de unión al antígeno pueden definirse mediante diversos términos, como se ha descrito anteriormente, la secuencia exacta de aminoácidos de una estructura depende de cómo se haya definido el sitio de unión al antígeno. "Anticuerpo humano", "anticuerpo totalmente humano" y términos similares se refieren a un anticuerpo que tiene regiones variables de cadena pesada y ligera en las que tanto la estructura como los sitios de unión al antígeno derivan de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante, ésta también se deriva de secuencias de origen humano. Un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que son "derivadas de" secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que utiliza inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reordenados. Dichos sistemas incluyen bibliotecas de genes de inmunoglobulinas humanas desplegadas en fagos, y animales transgénicos no humanos como ratones portadores de loci de inmunoglobulinas humanas, tal como se describe en el presente documento. Un "anticuerpo humano" puede contener diferencias de aminoácidos con respecto a la línea germinal humana o a secuencias de inmunoglobulinas reordenadas debidas, por ejemplo, a la presencia de mutaciones somáticas naturales, o introducción intencionada de sustituciones en el dominio variable (marco y sitios de unión al antígeno), o dominio constante. Típicamente, un "anticuerpo humano" es al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina humana de línea germinal o reordenada. En algunos casos, un "anticuerpo humano" puede contener secuencias marco consenso derivadas de análisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000, o HCDR3 sintético incorporado en bibliotecas de genes de inmunoglobulinas humanas desplegadas en fagos, como se describe, por ejemplo, en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 y IntT Pat. estadounidense n.° W02009/085462. Los anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno proceden de una especie no humana no se incluyen en la definición de "anticuerpo humano".

[0042] Los anticuerpos humanos, aunque derivados de secuencias de inmunoglobulina humana, pueden generarse utilizando sistemas como la visualización de fagos que incorporan CDR sintéticas y/o estructuras sintéticas, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades del anticuerpo en las regiones variables o las regiones constantes o ambas, dando lugar a anticuerpos que no existen de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

[0043] "Anticuerpo recombinante" incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como: anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo (descrito más adelante); anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo; anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante; y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN, o anticuerpos que se generan in vitro utilizando intercambio de brazos Fab.

[0044]"Anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular, o en el caso de un anticuerpo monoclonal biespecífico, una especificidad de unión dual a dos epítopos distintos. Por lo tanto, anticuerpo monoclonal se refiere a una población de anticuerpos con una única composición de aminoácidos en cada cadena pesada y cada cadena ligera, salvo posibles alteraciones bien conocidas como la eliminación de la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales pueden tener una glicosilación heterogénea dentro de la población de anticuerpos. El anticuerpo monoclonal puede ser monoespecífico o multiespecífico, o monovalente, bivalente o multivalente. Un anticuerpo biespecífico se incluye en el término anticuerpo monoclonal.

[0045]"Epítopo" se refiere a una porción de un antígeno a la que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas (como polares, no polares o hidrófobas) de elementos como aminoácidos o cadenas laterales de polisacáridos, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto por aminoácidos contiguos y/o discontinuos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo discontinuo, los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se encuentran muy próximos en un espacio tridimensional a través del plegamiento de la molécula de proteína.

[0046]"Variante" se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia por una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones. El término "mutación", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una o más sustituciones intencionadas realizadas en un polipéptido o polinucleótido.

[0047]Tal como se utiliza en el presente documento, "90% idéntico a" abarca al menos 90% idéntico, 91% idéntico, 92% idéntico, 93% idéntico, 94% idéntico, 95% idéntico, 96% idéntico, 97% idéntico, 98% idéntico, 99% idéntico o 100% idéntico al elemento de referencia (por ejemplo, una secuencia biológica). La especificación actual utiliza el término "% idéntico" para describir una serie de secuencias. Como se entenderá, el término "% idéntico" significa que en una comparación de dos secuencias sobre la región especificada las dos secuencias tienen el número especificado de residuos idénticos en la misma posición. El nivel de identidad puede determinarse utilizando CLUSTAL W con parámetros por defecto.

[0048]"Tratar", "tratamiento" y términos similares se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, e incluyen reducir la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas, eliminar los síntomas y/o la causa subyacente de los síntomas, reducir la frecuencia o probabilidad de los síntomas y/o su causa subyacente, mejorar o remediar el daño causado, directa o indirectamente, por el asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangitis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica. El tratamiento también incluye la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada de un sujeto que no recibe tratamiento. Entre los sujetos a tratar se incluyen los que padecen la enfermedad o trastorno, así como los propensos a padecerla o aquellos en los que se desea prevenirla.

[0049]Tal como se utiliza en el presente documento, "administrar al sujeto" y términos similares indican un procedimiento mediante el cual las moléculas de anticuerpo divulgadas o las composiciones que comprenden las mismas se inyectan en un paciente de forma que las células, tejidos o segmentos diana del cuerpo del sujeto entran en contacto con las moléculas de anticuerpo divulgadas.

[0050]La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de las moléculas de anticuerpo, como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biológico o terapéutico particular como, pero no limitado a, los resultados biológicos o terapéuticos divulgados, descritos o ejemplificados en el presente documento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar en función de factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la composición para provocar una respuesta deseada en un sujeto. Los indicadores ejemplares de una cantidad con efecto terapéutico incluyen, por ejemplo, la mejora del bienestar del paciente, la reducción de un síntoma de la enfermedad, la detención o ralentización de la progresión de los síntomas de la enfermedad y/o la ausencia de síntomas de la enfermedad.

[0051]En el presente documento se utilizan las siguientes abreviaturas:Alternaría alternata(Alternaria),Ascaris suum(A. suum); región determinante de la complementariedad (CDR); cadena pesada (HC); cadena ligera (LC); región variable de la cadena pesada (VH); región variable de la cadena ligera (VL); resonancia de plasmón superficial (SPR).

Moléculas de anticuerpos

[0052]En el presente documento se describen moléculas de anticuerpos humanos que se unen inmunoespecíficamente a IL-5 humana, según se define en las reivindicaciones. Las moléculas de anticuerpos humanos pueden unirse inmunoespecíficamente a la IL-5 humana con una constante de afinidad de equilibrio (KD ) de al menos unos 40 pM, determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR). Como se utiliza en el presente documento, "de al menos aproximadamente 40 pM" significa que los anticuerpos divulgados se unen inmunoespecíficamente a la IL-5 humana con una KD de menos o igual a aproximadamente 40 pM. Por ejemplo, los anticuerpos divulgados pueden unirse inmunoespecíficamente a IL-5 humana con una KD de aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 10 pM, o menos de aproximadamente 10 pM.

[0053] También se describen moléculas de anticuerpo que comprenden una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, tal como se definen en las reivindicaciones.

[0054] La cadena ligera consenso CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GX1X2X3X4X5X6KX7X8Y (SEQ ID NO: 1 ); en donde

XI es G o K;

X2 es N o D;

X3 es N o H;

X4 es I o A;

X5 es G o D;

X6 es S o K;

X7 es N o H; y

X8 es V o A.

[0055] Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNNIGSKNVY (SEQ ID NO: 5). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GKNNIGSKNVY (SEQ ID NO: 21). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGDNIGSKNVY (SEQ ID NO: 24). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNHIGSKNVY (SEQ ID NO: 27). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNNAGSKNVY (SEQ ID NO: 30). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNNIDSKNVY (SEQ ID NO: 66). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNNIGKKNVY (SEQ ID NO: 33). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNNIGSKHVY (SEQ ID NO: 36). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera puede comprender GGNNIGSKNAY (SEQ ID NO: 39).

[0056] La secuencia de aminoácidos CDR2 de la cadena ligera comprende DDX8X9RPS (SEQ ID NO: 2); en donde:

X8 es S o L; y

Xg es D o S.

[0057] Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR2 de cadena ligera puede comprender DDSDRPS (SEQ ID NO: 7). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR2 de cadena ligera puede comprender DDLDRPS (SEQ ID NO: 42). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR2 de cadena ligera puede comprender DDSSRPS (SEQ ID NO: 45).

[0058] La secuencia de aminoácidos CDR3 de la cadena ligera comprende QVWXIOSSSDXIIVXI2(SEQ ID NO: 3); en donde

X10 es D o L;

XII es H, S, Y o D; y

X12 es V, A o W.

[0059] Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO: 15). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWLSSSDHVV (SEQ ID NO: 48). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWDSSSDSVV (SEQ ID NO: 51). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWDSSSDYVV (SEQ ID NO: 54). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWDSSSDDVV (SEQ ID NO: 57). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWDSSSDHVA (SEQ ID NO: 60). Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena ligera puede comprender QVWDSSSDHVW (SEQ ID NO: 63).

[0060] También se describen moléculas de anticuerpo que comprenden una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 o 66, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 42 o 45, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 48, 51, 54, 57, 60 o 63. También se describen moléculas de anticuerpo que comprenden una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y

a. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

b. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

c. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

d. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

e. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

f. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

g. una c DR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

h. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

i. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

j. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

k. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

l. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;

m. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51;

n. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54;

o. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57;

p. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; o

q. una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;

en el que la posición de los residuos de aminoácidos de la CDR se determina según AbM.

[0061]Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 o 67, donde la variabilidad (es decir, la identidad de al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) se produce fuera de la secuencia CDR. Las moléculas específicas de anticuerpos se indican en la Tabla 1 y en la Tabla 15.

Tabla 1. Resumen de la composición de la cadena/dominio del anticuerpo

(Continuación)

* La "b" minúscula en cada una de estas secuencias se refiere a la numeración Kabat para la posición CDR. La numeración de Kabat permite CDRs de tamaños variables, mediante el uso de numeración alfanumérica para denotar inserciones de aminoácidos en determinadas posiciones. En estas secuencias CDR estaban presentes aminoácidos adicionales, que se numeraron como posiciones 95a y 95b (correspondientes a las posiciones 95a y 95B de Kabat, respectivamente). Así, para el anticuerpo 3A5.276, por ejemplo, H95bS indica una mutación de histidina ("H") a serina ("S") en la posición 95B según el número de Kabat relativo a la cadena 3A5.040 VL. Por lo tanto, la notación en minúsculas se utiliza aquí para distinguir el número de Kabat, separado de la mutación en la posición de Kabat indicada. ;;[0062]Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y ;;a. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; b. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; c. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; d. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; f. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; g. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; h. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; i. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; j. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; k. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; l. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; m. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; n. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; o. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; p. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; o ;q. una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, ;donde la variabilidad (es decir, la identidad de al menos 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 99%, o 100%) ocurre fuera de la secuencia CDR, como se define en las reivindicaciones. ;[0063]Las moléculas de anticuerpo pueden comprender una o más mutaciones, deleciones o inserciones en las regiones marco y/o constante. En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo IgG4 puede comprender una mutación S228P. S228 está situado en la región bisagra de la molécula de anticuerpo IgG4. La mutación de la serina ("S") por una prolina ("P") sirve para estabilizar la bisagra de la IgG4 y evitar el intercambio del brazo Fab in vitro e in vivo. En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo pueden comprender una o más modificaciones que aumentan la vida media in vivo de las moléculas de anticuerpo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el anticuerpo puede incluir una mutación M252Y, una mutación S254T y una mutación T256E (denominadas colectivamente mutación "YTE"). M252, S254 y T256 se encuentran en el dominio CH2 de la cadena pesada. La mutación de estos residuos a tirosina ("Y"), treonina ("T") y glutamato ("E"), respectivamente, protege a las moléculas de anticuerpo de la degradación lisosomal, aumentando así la semivida sérica de las moléculas de anticuerpo. Basándose en el ejemplo de otros anticuerpos, se contempla que la introducción de la mutación YTE en un anticuerpo anti-IL-5 puede proporcionar una extensión suficiente de la semivida sérica para permitir regímenes de administración con intervalos entre dosis de 3 meses o más. En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo pueden comprender una deleción del residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada. La supresión del residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada reduce la heterogeneidad de las moléculas de anticuerpo cuando son producidas por células de mamífero. En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo pueden comprender una combinación de mutaciones, deleciones o inserciones. Por ejemplo, en algunos aspectos, las moléculas de anticuerpo divulgadas pueden comprender una mutación S228P y una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada. Los anticuerpos divulgados que comprenden una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 18, por ejemplo, comprenden una mutación S228P y una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada. En algunos aspectos, la molécula de anticuerpo divulgada puede comprender una mutación S228P, una mutación M252Y, una mutación S254T, una mutación T256E, y una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada. El anticuerpo 3A5.046, por ejemplo, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 20, comprende una mutación S228P, una mutación M252y , una mutación S254T, una mutación T256E y una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada. ;;[0064]La molécula de anticuerpo puede comprender una región constante de cadena pesada IgG1 o IgG4 y una región constante de cadena ligera lambda. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada IgG1 y una región constante de cadena ligera lambda (anticuerpo 3 A5, por ejemplo). En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada IgG4 y una región constante de cadena ligera lambda. ;;[0065]Las moléculas de anticuerpo pueden comprender una cadena pesada que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 18 o 20 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, o 68, donde la variabilidad (i. es decir, la identidad de al menos el 90%) se produce fuera de la secuencia CDR. En la Tabla 1 y la Tabla 15 se proporcionan moléculas de anticuerpos específicas. Las moléculas de anticuerpo pueden comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y ;;a. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; ;b. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 23; ;c. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 26; ;d. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 29; ;e. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 32; ;f. una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35; ;g. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; ;h. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 41; ;i. una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 ;j. una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 ;k. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 50; ;l. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53; ;m. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; ;n. Una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ<i>D NO: 59; ;o. una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62 ;p. una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65; o ;q. una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68, ;;en la que la variabilidad (es decir, la identidad de al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) se produce fuera de la secuencia CDR. ;;[0066]Las moléculas de anticuerpo pueden comprender una cadena pesada que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, en la que la variabilidad (es decir. es decir, la identidad de al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) se produce fuera de la secuencia CDR. ;;[0067]En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo son moléculas de anticuerpo de longitud completa (con o sin una deleción del residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada). En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo son fragmentos de unión a antígeno. Los fragmentos de unión de anticuerpos adecuados incluyen, entre otros, un fragmento Fab, un fragmento Fab2 o un anticuerpo de cadena simple. ;[0068]Las moléculas de anticuerpo tienen una o más de las siguientes propiedades, tal como se definen en las reivindicaciones: ;;a. se une a la IL-5 humana con una constante de afinidad de equilibrio (KD) de al menos unos 40 pM determinada por resonancia de plasmón superficial; ;b. reduce la unión de la IL-5 al receptor de la IL-5; ;c. tiene una semivida sérica de al menos unos 20 días; o ;d. Se une a la IL-5 humana y de mono cynomolgus, pero no a la IL-5 de ratón, rata o cobaya. ;;[0069]También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de anticuerpo divulgadas. ;;[0070]También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las moléculas de anticuerpo divulgadas y vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico divulgadas. ;;[0071]Se proporcionan además células transformadas para expresar cualquiera de las moléculas de anticuerpo divulgadas. ;;Métodos y usos;;[0072]Las moléculas de anticuerpos descritas, o las composiciones farmacéuticas que las comprenden, pueden utilizarse para tratar el asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica y la esofagitis eosinofílica. Cualquiera de las características de la molécula de anticuerpo aquí descritas se aplica igualmente a los anticuerpos utilizados en los métodos y usos descritos. ;;[0073]En relación con las moléculas de anticuerpo de la invención, existen métodos para tratar a un sujeto que tiene asma eosinofílica, síndrome hipereosinofílico, poliposis nasal con afectación eosinofílica, granulomatosis eosinofílica con poliangitis, dermatitis atópica o esofagitis eosinofílica que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las moléculas de anticuerpo aquí divulgadas, o composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, para tratar el asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica. ;;[0074]También se describe el uso de una cantidad eficaz de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, o composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, en el tratamiento del asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica, tal como se define en las reivindicaciones. ;;[0075]Se describe además el uso de cualquiera de las moléculas de anticuerpos descritas en el presente documento, o composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica, tal como se define en las reivindicaciones. ;EJEMPLOS ;[0076]Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir con más detalle algunos de los aspectos descritos en el presente documento. Los ejemplos pretenden ilustrar, no limitar, los aspectos descritos. ;;Generación de anticuerpos anti-N-5 humanos;[0077]Los anticuerpos anti-Il-5 humanos se obtuvieron de ratas transgénicas (OMT) con genes V humanos clonados en sus genomas y que producen anticuerpos con dominios V humanos y dominios Fc de rata. Brevemente, las ratas transgénicas fueron inmunizadas genéticamente con ADN que codifica la IL-5 cuatro veces a lo largo de 21 días (en los días 0, 7, 14, 21) y reforzadas con IL-5 humana recombinante en el día 28 del protocolo de inmunización. Los títulos de anticuerpos séricos se determinaron en los días 0 y 38 del protocolo de inmunización mediante un ensayo ELISA utilizando IL-5 humana recombinante. Brevemente, los sueros de cada animal se diluyeron en PBS 1% BSA y se analizaron utilizando placas ELISA recubiertas con 1 pg/ml de IL-5 humana, o BSA como control. Se utilizó un conjugado IgG R-ficoeritrina anti-cabra (SouthemBiotech, #3030-09) al 10 pg/ml como anticuerpo secundario. Se eligieron animales específicos para la fusión de hibridomas basándose en estos títulos séricos. ;;[0078]Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales contra la IL- 5 humana, se aislaron esplenocitos y/o células de ganglios linfáticos de animales inmunizados y se fusionaron con células de mieloma de ratón no secretoras P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL-1580). Las células se sembraron a aproximadamente 1 x105 células/mL en placas de microtitulación de fondo plano, seguidas de una incubación de dos semanas en medio selectivo que incluía 10% de suero clónico fetal y 1 x HAT (Sigma). Las hibridomas se expandieron mediante pases en serie a través de cuatro cambios de medio en placas de 96 pocillos (estadios 1 a 4 de 96 pocillos), luego en matraces T25 y finalmente en matraces T75. ;;[0079]Los sobrenadantes de los clones de hibridoma se ensayaron durante el proceso de expansión de la hibridoma, inicialmente en un ELISA de células enteras usando células transfectadas con IL-5 humana anclada a GPL y luego ELISA usando un ensayo ELISA de IL-5 humana recombinante (este último como se describió anteriormente). Las hibridomas que sobrevivieron al proceso de escalado hasta el estadio T75 y que dieron señales por encima de un umbral dado de unión en ambos ensayos se congelaron como pellets celulares, para la clonación y secuenciación de los dominios Ig v. Se seleccionaron aproximadamente 20 hibridomas productores de IgG quiméricas para su clonación tras estos pasos de cribado. ;;[0080][0093] Los v-dominios humanos de las IgG quiméricas candidatas se aislaron mediante generación de ADNc a partir de pellets de células de hibridoma, amplificación por PCR de los v-dominios, subclonación y secuenciación del ADN. De la secuenciación de estas hibridomas se obtuvo un total de aproximadamente 35 combinaciones de cadenas pesadas y ligeras. Todos los anticuerpos se clonaron en un vector de expresión de mamíferos y se transfectaron transitoriamente en células HEK-293. Los anticuerpos se purificaron utilizando protocolos estándar de purificación de Proteína A. ;;Pruebas funcionales y caracterización de anticuerpos;[0081]Los anticuerpos seleccionados en formato IgG1 humano se ensayaron primero para determinar su especificidad en un ELISA de IL-5 humana. Brevemente, los anticuerpos se diluyeron en PBS 0,1% BSA y se probaron utilizando placas ELISA recubiertas con 1 pg/ml de IL-5 humana, o una proteína de control irrelevante. Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo Anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante. ;;[0082]Los anticuerpos que mostraron unión inmunoespecífica a IL-5 humana se clasificaron por potencia en un ensayo de proliferación celular dependiente de IL-5 humana utilizando células TF-1.6G4 humanas (un derivado de la línea celular eritroleucémica humana TF-1). La línea celular TF-1.6G4 fue subclonada y seleccionada por su mayor expresión superficial de IL-5Ra y su respuesta proliferativa consistente a la IL-5 humana. La línea celular TF-1.6G4 se mantuvo en cultivo siguiendo las condiciones estándar utilizadas para la línea celular eritroleucémica humana TF-1 (ATCC: CRL-2003). Brevemente, se incubaron diluciones de cada anticuerpo en presencia de 45 pM de IL-5 humana y 5 x104 células TF-1.6G4 por pocillo, se incubaron durante 48 h y se determinó la proliferación celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, WI). Todas las curvas de proliferación e inhibición se ajustaron utilizando un modelo dosis-respuesta de tres o cuatro parámetros en el software GraphPad Prism 6 (Versión 6.04). La tabla 2 resume estos resultados. ;Tabla 2. Resumen del cribado y caracterización de un panel de pruebas inicial en formato IgG1. ;;; ;;; [0083]En la Tabla 2, los resultados de las pruebas se clasificaron por orden de potencia del ensayo TF1.6G4. El panel de pruebas inicial se seleccionó en función de la potencia, la afinidad, la inhibición de IL-5Ra y las responsabilidades de secuencia (inmunogenicidad y desarrollabilidad). ;;[0084]Se utilizaron ensayos Biacore para determinar la afinidad de los anticuerpos de prueba a la IL-5 humana recombinante y su potencia en la inhibición de la unión de IL-5Ra a la IL-5 humana. El cuadro 2 resume estos resultados. Afinidad de unión de los anticuerpos de prueba a la IL-5 humana (KD; FIG. 6) se determinó en un sistema Biacore T200 (GE Healthcare) recubriendo un Biacore Series S Sensor Chip Protein A (GE Healthcare) con anticuerpo IgG purificado seleccionado hasta un nivel de captura de 75 RU, a continuación, se inyectó IL-5 humana recombinante a 60 pL/min a través de un rango de dilución en serie de dos veces en 7 pasos, comenzando en 1 pg/mL. Todos los experimentos se realizaron con el tampón HBS-EP+ (GE Healthcare). Los sensorgramas resultantes se sometieron a una doble referencia (los valores de las celdas de flujo de prueba se restaron de los valores de las celdas de flujo de control (superficie de proteína A sin anticuerpo recubierto) y también de un blanco de tampón). Las constantes de unión se determinaron ajustando un modelo de unión de Langmuir 1:1 a los sensorgramas de doble referencia. ;;[0085]Para determinar si cada anticuerpo de prueba inhibía la unión de IL-5 a IL- 5Ra, se utilizó un sistema Biacore T200 o Biacore 3000 (GE Healthcare). Primero se derivatizó un Biacore CM5 Sensor Chip con un kit de captura Fab (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en dos celdas de flujo adyacentes (prueba y control). Esta superficie se utilizó para capturar cada anticuerpo de prueba IgG purificado en una única celda de flujo de prueba. A continuación, se inyectó IL-5 humana recombinante a 5 pg/mL o un blanco de tampón a través de las celdas de flujo de prueba y de control, para saturar la superficie de la celda de flujo de prueba y controlar la asociación no específica de IL-5, respectivamente. Se realizó una segunda inyección de anticuerpo de prueba IgG purificado a 10 pg/mL o un blanco de tampón en la celda de flujo de prueba para bloquear los sitios de unión de IL-5 libres y controlar la disociación del anticuerpo de prueba IgG del anticuerpo de captura Fab, respectivamente. ;;[0086]La inyección posterior de IL-5Ra-Fc (R&D Systems) a 5 o 20 pg/mL o un blanco de tampón a través de ambas celdas de flujo se utilizó para determinar si el anticuerpo de prueba IgG bloqueaba la interacción entre IL-5 e IL-5Ra o para controlar la disociación del anticuerpo IgG del anticuerpo de captura Fab durante este paso. Los anticuerpos que inhibían la unión de IL-5 a IL-5Ra mostraron una señal marcadamente reducida tras la inyección de IL-5Ra (Tabla 2). Se utilizó un método de sustracción de referencia triple para analizar los datos de la manera detallada anteriormente. Todos los datos se exportaron del software de evaluación Biacore y se restaron en el software Excel (Microsoft). Todos los experimentos se realizaron con el tampón HBS-EP+ (GE Healthcare). ;;[0087]Sobre la base de estos resultados se eligió un panel más pequeño de anticuerpos de prueba (3 A5, 5H11 y 2B4 en la Tabla 2). Los anticuerpos se reformatearon como IgG4 humana y se probaron en los mismos ensayos. La versión IgG4 del anticuerpo 3A5 (originalmente una IgG1) se designó como 3A5.001. Se demostró que este anticuerpo totalmente humano tiene una potencia equivalente a la prueba original 3A5 en formato IgG1 (FIG. 1). ;;[0088]Se preparó una variante del anticuerpo 3A5.001 (designada 3A5.040) con sustituciones específicas de aminoácidos (VH: S[68]T, N[82A]S; VL: S[2]Y, I[3]V, Y[92]D, donde los residuos entre corchetes representan las posiciones Kabat) introducidos en el dominio V para eliminar los epítopos de células T previstos. Se demostró que el anticuerpo 3A5.040 tenía una potencia equivalente a la de su anticuerpo parental, el 3A5.001 (FIG. 2) en el ensayo TF-1.6G4. ;;Exploración CDR del anticuerpo 3A5.040;;[0089]Generación de variantes del anticuerpo 3 A5.040 - Se fabricaron variantes de un solo mutante del anticuerpo 3A5.040 sustituyendo uno de un grupo de nueve aminoácidos representativos - A, S, L, Y, D, Q, K, H, W -en cada posición de aminoácido en la CDR1 de la cadena ligera (CDR-L1), la c Dr 2 de la cadena ligera (CDR-L2), la CDR1 de la cadena pesada (CDR-H1) y la CDR2 de la cadena pesada (CDR-H2) (como se define en la nomenclatura AbM). También se hicieron variantes del anticuerpo sustituyendo uno de un grupo de diez aminoácidos representativos - A, S, L, Y, D, Q, K, H, W, P - en cada posición de aminoácido CDR en la cadena ligera CDR3 (CDR-L3), cadena pesada CDR3 (CDR-H3), y en las posiciones Kabat 93 y 94 en la cadena pesada variable. En la FIG. se muestra una lista completa de todas las variantes de anticuerpos monomutantes generadas. 3 (cadena pesada variable) y FIG. 4 (cadena ligera variable), respectivamente. ;;[0090]Construcción de vectores que expresan anticuerpos - Las variantes de región variable se generaron por retrotraducción de secuencias de aminoácidos en secuencias de ADN que posteriormente se sintetizaron de novo por ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos. Las variantes pesadas variables (VH) se subclonaron en un vector de expresión de mamíferos que contenía una región constante humana para producir cadenas pesadas de anticuerpos de longitud completa (dominios CHI, bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada IgG4 humana). Del mismo modo, las variantes variables ligeras (VL) se subclonaron en un vector de expresión de mamíferos que contenía una región constante de cadena ligera lambda humana para producir cadenas lambda de anticuerpos de longitud completa. ;;[0091]Expresión de variantes de anticuerpos - Los anticuerpos se produjeron transfectando conjuntamente vectores de expresión separados que codificaban cadenas pesadas y cadenas ligeras de anticuerpos en células EXPI293® (Life Technologies, Carlsbad, CA). Cada cadena mutante única se emparejó con una cadena parental para la expresión de proteínas en el sistema EXPI293®. Para cada transfección de 20 mL, se necesitaron 3,6 *107 células en 20 mL de Medio de Expresión EXPI293®. El día anterior a la transfección, las células se sembraron a una densidad de 0,9 x 106 células viables/mL y se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 8% en aire en un agitador orbital que giraba a 200 rpm. El día de la transfección, se determinó el número de células y su viabilidad utilizando un contador celular automatizado. Sólo se utilizaron cultivos con >98% de células viables. Para cada transfección de 20 mL, se prepararon complejos lípido-ADN diluyendo 10 pg de ADN de cadena pesada y 10 pg de ADN de cadena ligera en OPTI-MEM® (Life Technologies, Carlsbad, CA) I Reduced Serum Medium (Cat. no. 31985-062) hasta un volumen total de 1,0 mL. 54 pL del reactivo EXPIFECTAMINE® 293 (Life Technologies, Carlsbad, CA) se diluyó en medio OPTL MEM® I hasta un volumen total de 1,0 mL. Ambos viales se mezclaron suavemente y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, el ADN diluido se mezcló con el reactivo EXPIFECFAMINE® 293 diluido y con la mezcla de reactivo ADN-EXPIFECTAMINE® 293 y se incubó otros 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos ADN-EXPIFECTAMINE® 293. Tras la incubación, se añadieron 2 mL del complejo reactivo DNA-EXPIFECTAMINE® 293 a cada tubo biorreactor de 50 mL (TPP Techno Plastic Products AG). Se añadieron 2 mL de medio OPTI-MEM® (Life Technologies, Carlsbad, CA) I al tubo de control negativo en lugar del complejo de reactivos DNA-EXPIFECTAMINE® 293. Las células se incubaron en un incubador a 37 °C con una atmósfera humidificada de 8% de CO2 en aire en un agitador orbital que giraba a 200 rpm. Aproximadamente 16-18 horas después de la transfección, se añadieron 100 pL de EXPIFECTAMINE® 293 Transfection Enhancer 1 y 1,0 mL de EXPIFECTAMINE® 293 Transfection Enhancer 2 a cada biorreactor. Los sobrenadantes se recogieron aproximadamente 48 horas después de la transfección.

[0092]Purificación de variantes de anticuerpos - Cada variante de anticuerpo se expresó en células EXPI293® en 20 o 100 mL de cultivo celular. Los cultivos se centrifugaron en tubos falcon de 50 mL a 3000 x g durante 20 minutos, y los sobrenadantes se filtraron con un filtro de 0,22 |jm. Los sobrenadantes se purificaron utilizando un robot Gilson ASPEC GX274. Brevemente, los cartuchos SPE (Agilent, 12131014) empaquetados con 1,2 mL de resina de proteína A MABSELECT SURE® (GE Healthcare) se preequilibraron con 3 volúmenes de columna de IX PBS. El sobrenadante se pasó por las columnas seguido de un lavado con 4 mL IX de PBS. Cada columna se lavó con 9 mL de ácido cítrico 1 M, pH 2,9. Los anticuerpos se eluyeron con 2 mL de ácido cítrico 0,1 M, pH 2,9. Los anticuerpos se desalaron en Sorensens PBS (5 mM KH2PO4, 3 mM Na2HPO4.2H2O, 145,4 mM NaCl (pH ~5,8)) utilizando columnas PD-10 (GE Healthcare).

[0093]Determinación del título del anticuerpo variante 3 A5.040 en el sobrenadante mediante Biacore - Los sobrenadantes que contienen anticuerpos procedentes de la expresión en células EXPI293® se analizaron utilizando un chip de la serie S de la proteína A en el Biacore T200 para determinar su título y clasificarlos con respecto al anticuerpo parental 3A5.040. Cada muestra sobrenadante se diluyó con tampón de funcionamiento (1 x HBS-EP+, 350 mM NaCl) y se capturó mediante inyección a 60 jL/min en la celda de flujo (FC) 2. El nivel de captura resultante en unidades de respuesta (UR) se midió en FC 2-1 restando un punto de informe 5 s después del inicio del ciclo de uno 5 s después de la inyección. La superficie se regeneró inyectando NaOH 50 mM durante 12 s a un caudal de 60 jL/min en las Fc 1 y 2 cada 4 ciclos. Después de cada regeneración, la superficie y el sensorgrama se estabilizaron durante 120 segundos por inyección de tampón de funcionamiento. Se realizaron varios lotes debido al gran número de anticuerpos que se analizaron de esta manera.

[0094]Los niveles de captura (en unidades de respuesta Biacore "RU") obtenidos para cada muestra de sobrenadante se ajustaron multiplicando los valores obtenidos para cada inyección de 30 s por el factor de dilución del sobrenadante, lo que permitió comparar los niveles de captura entre sobrenadantes diluidos en diversos grados en diferentes series experimentales. El nivel relativo de expresión de anticuerpos (título) de cada mutante se comparó con un sobrenadante 3A5.040 específico del lote, (Tabla 3) utilizando la siguiente fórmula:

(RUI de referencia 3A5.040 ajustada para inyección de 30 s / RU de anticuerpo variante ajustada para inyección de 30 s) x 100 = título proporcional del anticuerpo parental (% título 3A5.040)

Fórmula 1

[0095]Los anticuerpos variantes con un título más alto que el anticuerpo 3A5.040 parental tenían un valor "% título 3A5.040" >100% y los que tenían un título más bajo, un valor <100%. Esto permitió la identificación de anticuerpos variantes que podrían tener una expresión mejorada con respecto al anticuerpo parental, 3A5.040. Los títulos de algunas variantes no se determinaron mediante análisis Biacore de muestras sobrenadantes, sino que se expresaron y purificaron como se ha indicado anteriormente y sus rendimientos purificados se determinaron mediante análisis espectrofotométrico (A280), comparándose después con el anticuerpo parental 3A5.040 (Tabla 5).

[0096]Determinación de la cinética de unión a IL-5 del anticuerpo variante 3 A5.040 mediante Biacore - Los sobrenadantes que contenían anticuerpo procedente de la expresión en células EXPI293® o anticuerpos purificados se analizaron utilizando un chip de la serie S de Protein A en un sistema Biacore T200 (GE Healthcare) para determinar su afinidad de unión a IL-5 humana recombinante y clasificarlos con respecto al anticuerpo parental 3A5.040.

[0097]Cada anticuerpo se diluyó en tampón de ejecución (1 x HBS-EP+, 350 mM NaCl) y se capturó a 60 jL/min hasta aproximadamente 50 RU en FC 2. A continuación, la superficie y el sensorgrama se estabilizaron durante 120 segundos mediante la inyección de tampón de funcionamiento. Se inyectó IL-5 humana recombinante a 5 jg/m L o tampón de funcionamiento en FC 1 y 2 a un caudal de 60 jL/min durante 70 seg. Se dejó que la IL-5 se disociara en tampón durante 300 segundos. La superficie se regeneró inyectando NaOH 50 mM durante 12 segundos a un caudal de 60 jL/min en las FC 1 y 2. Se inyectó tampón para limpiar aún más la deriva durante 60 segundos a un caudal de 60 pL/min en FC 1 y 2. La superficie se estabilizó durante 300 s con tampón de funcionamiento sobre FC 1 y 2.

[0098]El sobrenadante que contenía el anticuerpo parental 3A5.040 y que había sido transfectado con cada lote se analizó aproximadamente cada 25 ciclos a lo largo de cada serie. Se analizó una muestra purificada de 3 A5.040 y un control de isotipo IgG4 lambda con cada lote para medir la variabilidad entre ensayos. Se realizaron varios lotes debido al gran número de anticuerpos que se analizaron de esta manera.

[0099]Los datos fueron doblemente referenciados (la celda de flujo 2 se restó de la celda de flujo 1 y de un blanco de tampón) y los sensorgramas se ajustaron a un modelo de unión Langmuir 1:1 con el software Biacore Evaluation. Para cada muestra de sobrenadante 3A5.040 se calculó un valor kd (off-rate) a lo largo de la serie y se promediaron para obtener un kd de referencia, con la excepción de la serie 2.1, que sólo tenía una muestra de sobrenadante 3 A5.040 (Tabla 3 y Tablas 6-11). El valor de kd calculado para cada anticuerpo sobrenadante se comparó con la kd media de referencia 3A5.040 mediante la siguiente fórmula:

(3A5.040 kd de referencia / kd de anticuerpo variante) x 100 = kd proporcional de

anticuerpo parental (% 3A5.040 kd)

Fórmula 2

[0100]Los anticuerpos variantes con una kd más bajan (tasa de desactivación más lenta) que el anticuerpo 3A5.040 parental tenían un valor "% 3A5.040 kd" >100% y aquellos con una kd más alta (tasa de desactivación más rápida) un valor <100%. Esto permitió la identificación de anticuerpos variantes que podrían tener una cinética de unión mejorada para la IL-5 y, por tanto, una función mejorada con respecto al anticuerpo parental, 3A5.040. Para las variantes en las que sólo se fabricó proteína purificada (Tabla 6), el análisis cinético Biacore se realizó por triplicado como se ha indicado anteriormente utilizando estos anticuerpos purificados y los valores medios de cada análisis por triplicado se utilizaron para realizar el cálculo proporcional de kd, como se ha indicado anteriormente (Tabla 4 y Tablas 8-11).

Continuación

(Continuación)

nin i n

(Continuación)

Continuación

(Continuación)

Tabla 5. Rendimiento de la expresión de proteínas purificadas para variantes seleccionadas del anticuerpo 3A5.040

Tabla 7: Matriz de exploración VH CRD2

Construcción del vector de expresión

[0101] La secuencia de nucleótidos puede influir en la expresión génica y en el subsiguiente nivel de expresión proteica. Se examinaron varias secuencias de nucleótidos diferentes para la expresión óptima de 3A5.046. Estas secuencias se resumen en la tabla siguiente:

Tabla 12: Secuencia de nucleótidos

Medida de la afinidad del anticuerpo 3A5.046 por la IL-5 recombinante humana mediante SPR

[0102] La afinidad del anticuerpo 3A5.046 por la IL-5 humana recombinante se determinó utilizando un sistema Biacore T200 (GE Healthcare). Brevemente, se acopló un anticuerpo comercial IgG antihumano de ratón (Thermo Scientific) a dos celdas de flujo adyacentes (control y prueba) en un chip Biacore CM5 (GE Healthcare) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El anticuerpo 3A5.046 se capturó a baja densidad (aproximadamente 125 RU) en la superficie de la celda de flujo de prueba y se inyectaron diluciones de IL-5 humana recombinante o un blanco de tampón sobre las celdas de flujo de prueba y de control, a 30 pL/min (FIG. 6, Tabla 13).

[0103] Los sensorgramas resultantes fueron doblemente referenciados (los valores de la célula de flujo de prueba restados de los valores de la célula de flujo de control (superficie acoplada con IgG antihumana sin anticuerpo recubierto) y también un blanco de tampón). Los sensorgramas sustraídos de inyecciones de IL-5 humana a 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 y 0,156 pg/mL se ajustaron a un modelo de unión Langmuir 1:1 utilizando el software Biacore Evaluation para determinar las constantes de unión de ensayos duplicados (Tabla 13).

Tabla 13: Constantes cinéticas de un análisis cinético Biocore multiconcentración de la unión del anticuerpo 3A5.046 a la IL-5 humana recombinante a 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 y 0,156 pg/mL

[0104] Estos resultados demuestran que el anticuerpo 3A5.046 tiene una alta afinidad por la IL-5 humana recombinante.

Potencia del 3A5.046 en comparación con el mepolizumab en el ensayo de proliferación de la línea celular TF-1.6G4.

[0105] 3A5.046 y mepolizumab se utilizaron en el ensayo de proliferación de la línea celular TF-1.6G4. 3A5.046 y mepolizumab inhibieron la proliferación de IL-5 humana con una IC50 media de 13,8 pM y 534 pM respectivamente (Ver Tabla 14 y FIG. 7A). Ambos anticuerpos demostraron la inhibición de la IL-5 del mono cynomolgus en la línea celular TF1.6G4 (FIG. 7B), con una IC50 media para el 3A5.046 de 43,8 pM y para el mepolizumab de 584 pM.

Detección de IL5 nativa a partir de células primarias mediante ELISA utilizando anticuerpos anti-IL-5 de la invención.

[0106] El anticuerpo 3A5 se utilizó como reactivo de captura en un ELISA tipo sándwich. En combinación con un anticuerpo de detección disponible en el mercado (TRFk5R; R&D systems, #MAB405) se pudo determinar la cuantificación de los niveles de IL-5 recombinante en muestras de tampón enriquecidas (FIG. 8). A continuación, este método se aplicó a la detección de IL-5 nativa secretada por células primarias. Se estimuló a las células T CD4+ de cuatro donantes para que segregaran IL-5. A continuación, se determinaron los niveles de IL-5 mediante el ELISA sándwich con el anticuerpo 3A5 como reactivo de captura. Tres de cada cuatro células T del donante respondieron a la estimulación de células T y presentaron niveles detectables de IL-5 en el sobrenadante del cultivo celular (FIG. 8). Se realizaron estudios similares con IL-5 humana secretada a partir de células T CD4+ de donantes humanos primarios utilizando el anticuerpo 3A5.046 como agente de captura, y los resultados obtenidos fueron coherentes con los obtenidos con el anticuerpo 3 A5 (datos no mostrados).

Inhibición de la diferenciación de eosinófilos por anticuerpos anti-IL-5

[0107] Se utilizó un ensayo de supervivencia con células de sangre de cordón umbilical CD34+ para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-IL-5 para inhibir la diferenciación dependiente de IL-5 de los progenitores de médula ósea a eosinófilos y para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-IL-5 para inhibir la supervivencia de eosinófilos fenotípicamente maduros. En las células de control tratadas con IL-5, los eosinófilos fenotípicamente maduros eran la población predominante en el día 28 (Figura 9, región sombreada en el gráfico). El anticuerpo 3A5.046 fue capaz de inhibir la diferenciación de las células de sangre de cordón CD34+, incubadas con IL-5 durante 28 días, en eosinófilos. El anticuerpo 3A5.046 fue un inhibidor más potente de la diferenciación de eosinófilos mediada por IL-5 que el mepolizumab (FIG. 9).

Análisis de cristalografía de rayos X

[0108] La estructura molecular del complejo entre el anticuerpo 3A5.046 Fab y la IL-5 humana recombinante se investiga mediante cristalografía de rayos X. Para preparar los experimentos de cristalografía de rayos X, el 3A5.046 se digiere con papaína, que escinde el anticuerpo intacto en la región bisagra, separando los dominios Fc y Fab. El Fab 3A5.046 se purifica mediante cromatografía de afinidad estándar con proteína A y se compleja con IL-5 humana recombinante no glicosilada. El complejo 3A5.046 Fab:IL-5 humana se purifica para experimentos de cristalización mediante cromatografía de exclusión por tamaño estándar. El complejo se coloca en concentraciones variables, en cribas de cristalización de matriz dispersa disponibles en el mercado para un amplio muestreo de las condiciones de cristalización. Se optimizan las condiciones de "éxito" que proporcionan cristales del complejo a partir de las pantallas de matriz dispersa para mejorar la morfología cristalina y la difracción de cristales según sea necesario.

[0109] Los cristales del complejo 3A5.046 Fab:IL-5 humana se recogen, se congelan en nitrógeno líquido y se transportan a una instalación de sincrotrón para pruebas de difracción y recogida de datos. Los ensayos de difracción de cristales se realizan en un sincrotrón, que alberga líneas de microhaces de rayos X de alta energía para producir difracción de alta resolución. De este modo, se recogen datos de difracción de rayos X en cristales del complejo 3 A5.046 Fab:IL-5 humana. Puede obtenerse un modelo de estructura inicial del complejo utilizando técnicas estándar de sustitución molecular con estructuras moleculares publicadas de IL-5 y Fab como plantillas. La estructura final del complejo 3A5.046 Fab e IL-5 humana puede obtenerse mediante el refinamiento iterativo del modelo de estructura, hasta que los errores de ajuste sean mejores del 30% (Rfree final de 0,3) y los parámetros de enlace químico (por ejemplo, la distribución de longitudes y ángulos de enlace, la estereoquímica y los enlaces de hidrógeno) se encuentren dentro de límites aceptables.

Caracterización de la unión del anticuerpo 3A5.046 a IL-5 de especies modelo no humanas

[0110] El anticuerpo 3A5.046 se probó mediante ensayo Biacore utilizando un sistema T200 (GE Healthcare) para la unión a citoquinas recombinantes IL-5 humana, IL-5 de rata, IL-5 de ratón e IL-5 de cobaya. Este panel de IL-5 no humanos se eligió para representar a las principales especies de modelos animales utilizados en el desarrollo preclínico. Se inmovilizaron un anticuerpo de control del isotipo (IgG4) y el anticuerpo 3A5.046 en las celdas de flujo 1 y 2 de un chip Series S CM5 (GE Healthcare), respectivamente, utilizando métodos estándar de acoplamiento con aminas. Las citocinas se diluyeron a 1 y 10 pg/ml en tampón de funcionamiento HBS-EP+ (GE Healthcare) y se inyectaron a través de las celdas de flujo 1 y 2. Se incluyeron inyecciones de sólo tampón en las celdas de flujo 1 y 2 para obtener una doble referencia. El análisis de los datos se realizó con el software de evaluación Biacore T200. Los sensorgramas resultantes se sometieron a una doble referencia (los valores de las celdas de flujo de prueba se restaron de los valores de las celdas de flujo de control y también de un blanco de tampón).

[0111] Se observó que el anticuerpo 3A5.046 se unía a la IL-5 humana y a la IL-5 de mono cynomolgus, pero no a la IL-5 de ratón, a la IL-5 de rata ni a la iL-5 de cobaya (FIG. 10A - FIG. 10E). Esto indicaba que el 3A5.046 podía utilizarse en modelos preclínicos de macaco cynomolgus.

El anticuerpo 3A5.046 no se une a otras citocinas humanas estrechamente relacionadas con la IL-5

[0112] El anticuerpo 3A5.046 se probó mediante ensayo Biacore utilizando un sistema T200 (GE Healthcare) para la unión a citoquinas humanas recombinantes IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M- CSF) y hormona de crecimiento (GH). Este panel representativo de citocinas humanas estrechamente relacionadas se eligió en función de su similitud estructural y funcional con la IL-5 humana. Se inmovilizaron un anticuerpo de control del isotipo (IgG4) y el anticuerpo 3A5.046 en las celdas de flujo 1 y 2 de un chip Series S CM5 (GE Healthcare), respectivamente, utilizando métodos estándar de acoplamiento con aminas. Las citocinas se diluyeron a 1 y 10 pg/ml en tampón de funcionamiento HBS-EP+ (GE Healthcare) y se inyectaron a través de las celdas de flujo 1 y 2. Se incluyeron inyecciones de sólo tampón en las celdas de flujo 1 y 2 para obtener una doble referencia. El análisis de los datos se realizó con el software de evaluación Biacore T200. Los sensorgramas resultantes se sometieron a una doble referencia (los valores de las celdas de flujo de prueba se restaron de los valores de las celdas de flujo de control y también de un blanco de tampón).

[0113] Se observó que el anticuerpo 3A5.046 sólo se unía a la IL-5 humana y no a las citocinas humanas IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, M-CSF o GH (FIG. 11A - FIG. 11D), demostrando así la alta especificidad del 3A5.046 para la IL-5 humana.

Evaluación del anticuerpo 3A5.046 en un modelo de eosinofilia de las vías respiratorias de mono cynomolgus inducido porAscaris suum

[0114] El anticuerpo 3 A5.046 se probó utilizando el modelo de Ascaris suum cynomolgus de eosinofilia aguda de las vías respiratorias descrito en Hart, T.K., et al., Preclinical efficacy and safety of mepolizumab (SB-240563), a humanized monoclonal antibody to IL-5, in cynomolgus monkeys. J Allergy Clin Immunol, 2001. 108(2): p. 250-7.

[0115] Dieciséis macacos cynomolgus hembras que habían sido previamente sensibilizadas a Ascaris suum fueron evaluadas para determinar el nivel de sensibilidad retenida mediante provocación intradérmica con A. suum. Catorce de estos animales fueron seleccionados para participar en el estudio en función de la respuesta cutánea a la provocación y distribuidos aleatoriamente en dos grupos de n=7 por grupo. Dos semanas después de la intradermotuberculinización, se recogieron muestras de sangre y de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) (día 8). Unas 24 horas después de la recogida de muestras basales, se trató a los animales con placebo (compuesto de tampón acuoso pH 6,3 con 200 mM de arginina y 25 mM de histidina) o con el anticuerpo 3A5.046 (10 mg/kg por vía intravenosa, en tampón acuoso pH 6,3 con 200 mM de arginina y 25 mM de histidina) de forma ciega (Día 7). Una semana después del tratamiento con placebo o anticuerpo se realizó una segunda provocación intradérmica con A. suum y se administró una provocación inhalatoria con A. suum a todos los animales mediante la administración de una cantidad igual de extracto de A. suum (Greer Laboratories Inc.; 5 mg/ml en agua estéril) administrado a través del nebulizador PARI LC (Día 0). El diámetro del habón cutáneo se midió 15 minutos después de la provocación. Dos días después de la provocación por inhalación de A. suum, se recogieron muestras de sangre y BALF. Semanalmente, desde el día 10 hasta el día 45, se recogieron muestras de sangre adicionales para los criterios de valoración hematológicos y el análisis PK.

[0116] No hubo diferencias significativas en las respuestas cutáneas al habón entre la primera y la segunda provocación intradérmica con A. suum. Todos los animales mostraron un aumento de eosinófilos en el BALF como resultado de la provocación con A. suum, pero en los animales tratados con el anticuerpo 3A5.046, este aumento fue insignificante. Hubo un número significativamente menor de eosinófilos en el BALF de los animales tratados con el anticuerpo 3A5.046, en comparación con los animales tratados con placebo 48 horas después de la provocación con A. suum (p<0,01; prueba de Mann-Whitney; FIG. 12).

[0117] La provocación con A. suum también condujo a un aumento significativo de los eosinófilos en sangre con respecto al valor basal en los animales tratados con placebo hasta el día 10 después de la provocación (FIG. 13A; El tratamiento con el anticuerpo 3A5.046 produjo una disminución significativa de los eosinófilos en sangre hasta niveles inferiores a los basales (FIG. 13 A), y esta disminución del número de eosinófilos en sangre se mantuvo durante un periodo de al menos 52 días tras la dosis inicial (FIG. 13B).

[0118] En resumen, el tratamiento con 3A5.046 redujo significativamente la eosinofilia de las vías respiratorias inducida por A . suum 48 horas después de la provocación, y disminuyó significativamente los eosinófilos sanguíneos, por debajo de los niveles basales, durante al menos 52 días después de una dosis única intravenosa (IV) de 10 mg/kg.

Investigación de la función de los anticuerpos en un modelo humanizado de eosinofilia de las vías respiratorias en ratas con IL-5

[0119]Alternaría alternata(Altemaria) es un alérgeno fúngico conocido por desencadenar asma en humanos y puede causar eosinofilia y síntomas similares al asma en roedores. Cuando se las desafía con Altemaria, las ratas humanizadas con IL-5 knock-in (animales en los que la IL-5 de rata ha sido sustituida por IL-5 humana) muestran niveles elevados de eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de los pulmones (FIG. 14).

[0120] Se administra una única instilación intratraqueal de suspensión de Altemaria a ratas humanizadas IL-5, y se recogen muestras de sangre y BALF 2, 3 o 4 días después de la administración de Alternaria. Típicamente, en este modelo los eosinófilos aumentan significativamente en las muestras de BALF y pueden aumentar o no cambiar en las muestras de sangre. Los anticuerpos de prueba se administran antes de la inducción de la eosinofilia con Alternaria y se evalúa su capacidad para reducir el número de eosinófilos en BALF y sangre.

Tabla 15. Secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo humano que se une inmunoespecíficamente a la IL-5 humana,

en la que la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

2. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, en la que la molécula de anticuerpo comprende:

a. una mutación S228P;

b. una mutación M252Y, una mutación S254T y una mutación T256E;

c. una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada; o

d. cualquier combinación de a a c.

3. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 2, en la que la molécula de anticuerpo comprende una mutación S228P y una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada.

4. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en la que la molécula de anticuerpo comprende una mutación S228P, una mutación M252Y, una mutación S254T, una mutación T256E y una deleción de un residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada.

5. La molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada IgG4 y una región constante de cadena ligera lambda.

6. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, en la que la molécula de anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fab2 o un anticuerpo de cadena simple.

7. La molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo tiene una semivida sérica de al menos unos 20 días.

8. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. Una célula transformada para expresar la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. La molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento del asma eosinofílica, el síndrome hipereosinofílico, la poliposis nasal con afectación eosinofílica, la granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, la dermatitis atópica o la esofagitis eosinofílica.