ES2985352T3

ES2985352T3 - Anticuerpos para radionúclidos quelados

Info

Publication number: ES2985352T3
Application number: ES19723014T
Authority: ES
Inventors: Christian Klein; Pablo Umana; Alexander Haas; Barbara Weiser; Florian Lipsmeier; Guy Georges; Sebastian Fenn; Joerg Moelleken; Felix Bormann; Daniela Matscheko
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2024-11-05
Anticipated expiration: 2039-04-16
Also published as: IL277575B2; IL277575A; JP2021520832A; HUE067622T2; RS65753B1; TW202011987A; UA130541C2; WO2019201959A1; MA52545A; JP2024056687A; HRP20241013T1; BR112020021061A2; MA52545B1; US20220389116A1; AR115053A1; ZA202006121B; KR20210005885A; PL3781200T3; FI3781200T3; CR20200548A

Abstract

La presente solicitud se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a radionúclidos quelados, incluidos anticuerpos biespecíficos. También se refiere al uso de dichos anticuerpos biespecíficos en aplicaciones tales como radioinmunoimagen y radioinmunoterapia. También se refiere a agentes de limpieza y composiciones útiles en dichos métodos. Los radionúclidos quelados pueden ser un quelato de plomo (Pb)-DOTAM. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos para radionúclidos quelados

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a radionúclidos quelados, incluyendo anticuerpos biespecíficos. Se refiere además al uso de dichos anticuerpos biespecíficos en aplicaciones tales como radioinmunoimagen y radioinmunoterapia. Adicionalmente, se refiere a agentes de aclaramiento y composiciones útiles en dichos procedimientos.

Antecedentes

Se han desarrollado anticuerpos monoclonales para dirigir los fármacos a las células cancerosas. Al conjugar un agente tóxico con un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a tumor, existe el potencial de proporcionar una destrucción tumoral más específica con menos daño a los tejidos circundantes.

En la radioinmunoterapia predirigida (PRIT), se hace uso de una construcción de anticuerpo que tiene afinidad por el antígeno asociado al tumor por una parte y por un compuesto radiomarcado por otra. En una primera etapa, se administra el anticuerpo y se localiza dentro del tumor. Posteriormente, se administra el compuesto radiomarcado. Debido a que el compuesto radiomarcado es pequeño, se puede suministrar rápidamente al tumor y se aclara rápidamente, lo que reduce la exposición a la radiación fuera del tumor (Goldenberget al.,Theranostics 2012, 2(5), 523-540). Además del efecto de destrucción celular directa, PRIT también puede actuar como un inductor de la muerte celular inmunogénica y un potencial compañero de combinación para enfoques de inmunoterapia contra el cáncer y vacunación endógena. También se puede usar un procedimiento similar para la formación de imágenes. El tratamiento predirigido puede hacer uso de un anticuerpo biespecífico o sistemas que usan avidina-biotina, aunque esta última tiene la desventaja de que la avidina/estreptavidina es inmunógena.

Los radionúclidos para su uso en PRIT están comúnmente en forma de un quelato cargado con el radionúclido de interés.

Suet al.(Nucl Med Biol 2005 32:741-747) evaluaron un sistema de tratamiento predirigido de anticuerpo con mAb-estreptavidina y DOTA-biotina. Se encontró que 212Pb-DOTA-biotina radiomarcado no era estable, con más de un 30 % de 212Bi libre (un producto de desintegración de 212Pb) liberado de 212Pb-DOTA.

El documento WO2010/099536 describe un anticuerpo biespecífico que se puede unir a complejos DOTA de itrio, lutecio y gadolinio. Sin embargo, DOTA no se une de forma estable a todos los radionúclidos y puede presentar tasas de formación de complejo lentas (Yong y Brechbiel, Dalton Trans. 21 de junio de 2001; 40 (23) 6068-6076). La ineficacia del quelante para unirse de forma estable a un radionúclido crea el riesgo de reducir el suministro de radiación al tumor mientras se incrementa la toxicidad.

Sumario de la invención

La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier aspecto, modo de realización y ejemplo que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo para ilustración.

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a un quelato metálico que comprende DOTAM y plomo (Pb). DOTAM puede quelar Pb de manera estable, para formar un complejo de Pb [DOTAM].

Los anticuerpos de la presente invención se unen a un quelato que comprende DOTAM y Pb, donde el Pb puede ser un isótopo estable (distinto de radioisótopo) o bien un radioisótopo. Los radioisótopos de plomo son útiles en aplicaciones tales como la radioinmunoimagen y la radioinmunoterapia.

Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención tienen una afinidad extremadamente alta por el quelato de Pb-DOTAM, en el intervalo de pM a fM.

Los anticuerpos se unen adicionalmente a bismuto (Bi) quelado por DOTAM. 212Pb es el radionúclido original de 212Bi y puede servir como un generadorin vivode 212Bi. La capacidad de los anticuerpos para unirse a Bi quelado, así como a Pb quelado, incrementa su utilidad en aplicaciones tales como la radioinmunoterapia, donde se genera un isótopo de Bi como producto de desintegración a partir de un isótopo de Pb. En algunos modos de realización, los anticuerpos se pueden unir tanto a un quelato de Bi-DOTAM como a un quelato de Pb-DOTAM con una afinidad muy alta, en el intervalo de pM a fM.

Además, los presentes anticuerpos son opcional o preferentemente selectivos para un quelato de Bi-DOTAM y un quelato de Pb-DOTAM en comparación con otros complejos quelante-metal, tales como un quelato de Cu-DOTAM.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno específico para quelato de DOTAM-plomo (Pb), en el que dicho sitio de unión a antígeno comprende al menos:

a) una CDR1 de la cadena pesada;

b) CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2), o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 2, en la que estas sustituciones no incluyen Phe50, Asp56 y Tyr58, y opcionalmente tampoco incluyen Gly52 y/o Arg54;

c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidosERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO: 3), o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 3, en la que estas sustituciones no incluyen Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, y opcionalmente tampoco incluyen Ala100C, Tyr100D y/o Pro100E y/u opcionalmente tampoco incluyen Tyr99;

d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) o una variante de la misma que tiene hasta 1,2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 4, en la que estas sustituciones no incluyen Tyr28 y Asp32;

e) una CDR2 de la cadena ligera;

f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) o una variante de la misma que tiene hasta 1,2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 6, en la que estas sustituciones no incluyen Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c y Tyr96,

en las que la numeración es de acuerdo con Kabat.

En algunos modos de realización, la CDR1 de la cadena pesada y la CDR2 de la cadena ligera son opcionalmente:

i) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos<rpí>‘<j 9 T>l l<Y>, ‘<*5>(SEQ ID NO: 1) o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 1;

ii) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos , (SEQ ID NO: 5) o una variante de la misma que tiene al menos 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 5, opcionalmente sin incluir Gln50.

En algunos modos de realización, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se une al mismo epítopo, o a un epítopo superpuesto, de un radionúclido quelado que el unido por un anticuerpo divulgado en el presente documento.

En algunos modos de realización, el anticuerpo se une al mismo epítopo, o a un epítopo superpuesto, que el epítopo unido por Fab PRIT-0213 o PRIT-0214. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir al mismo epítopo, o a un epítopo superpuesto, que:

i) un anticuerpo que tiene un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o

i) un anticuerpo que tiene un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En un modo de realización, el sitio de unión a antígeno comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de:

a) CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos<G>..<F>..<S>..<L>..<S>..<T>..<Y>..<S>;<M>1<S>(SEQ ID NO: 1);

b) CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos<f : gsrgdtyyaswakg>(SEQ ID NO: 2);

c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos<ERDPYGGGAYPPHL>(SEQ ID NO: QSSHSVYSDNDLA d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4);

e) CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos OAo K L A o (SEQ ID NO: 5);

f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos . (SEQ ID NO: 6<) .>

Opcionalmente, el anticuerpo en cualquiera de los aspectos descritos anteriormente es humano, quimérico o humanizado.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, o una variante de las mismas que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno puede comprender un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 8 o 10.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, o una variante de las mismas como se define anteriormente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10, o una variante de las mismas como se define anteriormente. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma. En otro modo de realización, puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma.

El anticuerpo puede estar en cualquier formato, incluyendo anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoespecífico. En esta forma, el anticuerpo encuentra utilidad, por ejemplo, en esquemas de clasificación y purificación, por ejemplo, para separar restos radiomarcados con éxito.

En algunos aspectos, el anticuerpo que se une específicamente al quelato de Pb-DOTAM se acopla a un agente de unión celular/resto dirigido para producir un agente dirigido. Dicho agente es útil, por ejemplo, en radioinmunoterapia predirigida o radioinmunoimagen predirigida.

El acoplamiento puede ser preferentemente por expresión como un polipéptido o proteína de fusión. La fusión puede ser directa o por medio de un conector. El polipéptido o proteína de fusión se puede producir de forma recombinante, evitando cualquier necesidad de química de conjugación.

En algunos modos de realización, el resto dirigido (que comprende el sitio de unión a antígeno para la diana) es un anticuerpo o fragmento del mismo. Es decir, en algunos modos de realización, el anticuerpo descrito anteriormente puede estar en forma de anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico), como se analiza a continuación.

En otro aspecto, la presente invención se refiere además a un complejo de anticuerpo/anticuerpo multiespecífico adecuado para dirigir un quelato de Pb-DOTAM a una célula diana.

En consecuencia, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico o multiespecífico que se une específicamente tanto al quelato de Pb-DOTAM como a un antígeno diana, por ejemplo, un antígeno expresado en la superficie de una célula diana. El anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para el plomo quelado con DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno para el antígeno diana.

El sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM es de acuerdo con cualquiera de los modos de realización descritos anteriormente.

El antígeno diana puede ser cualquier antígeno como se analiza además en el presente documento, por ejemplo, cualquier antígeno específico de tumor. En algunos modos de realización, puede ser una proteína o polipéptido expresado por un patógeno tal como un procariota o un virus.

En algunos modos de realización, el antígeno asociado a tumor puede ser CEA (antígeno carcinoembrionario). Es decir, en algunos modos de realización, el anticuerpo biespecífico puede comprender al menos un sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para CEA. CEA es ventajoso en el contexto de la presente invención porque se internaliza de forma relativamente lenta y, por tanto, un alto porcentaje del anticuerpo biespecífico permanecerá disponible en la superficie de la célula después del tratamiento inicial, para la unión al radionúclido. También pueden ser preferentes y se describen en el presente documento otras dianas de baja internalización/antígenos asociados a tumores. Otros ejemplos de antígeno asociado a tumor que pueden ser útiles en la presente invención incluyen CD20 o HER2.

En algunos modos de realización, cuando el antígeno diana es CEA, el sitio de unión a antígeno específico para CEA puede comprender una cadena pesada que comprende al menos una, dos o tres CDR de la cadena pesada, en la que:

d) CDR1 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;

e) CDR2 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

f) CDR3 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;

y/o el sitio de unión a antígeno específico para CEA puede comprender una cadena ligera que comprende al menos una, dos o tres CDR de la cadena ligera, en la que:

a) CDR1 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14;

b) CDR2 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15;

c) CDR3 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16.

En algunos modos de realización, el sitio de unión a antígeno para CEA puede comprender al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis (es decir, todas) de las CDR seleccionadas de:

a) CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;

b) CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;

d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;

e) CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

En algunos modos de realización, el sitio de unión a antígeno para CEA puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 17, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 17.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno puede comprender un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 18.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno específico para CEA puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una variante de la misma, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una variante de la misma.

Son conocidos en la técnica diversos formatos posibles para los anticuerpos biespecíficos o anticuerpos multiespecíficos, incluyendo los descritos además en el presente documento. Los anticuerpos de la invención pueden adoptar cualquiera de estos formatos. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el anticuerpo biespecífico puede ser bivalente, trivalente o tetravalente.

Puede ser preferente que los presentes anticuerpos incluyan una región Fc. La presencia de una región Fc tiene beneficios en el contexto de la radioinmunoterapia y la radioimagen, por ejemplo, prolongando la semivida circulante de la proteína y/o dando como resultado una mayor captación tumoral que la que se puede observar con fragmentos más pequeños.

En algunos modos de realización, cuando la región Fc está presente, puede ser preferente que la región Fc se genomanipule para reducir la función efectora. Esto puede incluir la sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 y/o 329, por ejemplo, uno o más de 234, 235 y/o 329. En algunos modos de realización, la región Fc se puede modificar para incluir la sustitución de Pro 329 a Gly, Leu 234 a Ala y/o Leu 235 a Ala (numeración de acuerdo con el índice EU).

Son conocidos varios formatos de anticuerpos multiespecíficos que incluyen un dominio Fc.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico o multiespecífico puede comprender i) un dominio Fc, ii) al menos un fragmento Fab, cross-Fab, Fv, scFab o scFv o un anticuerpo de dominio único (VHH) que comprende un sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM y iii) al menos un fragmento Fab, cross-Fab, Fv, scFab o scFv o un anticuerpo de dominio único (VHH) que comprende un sitio de unión a antígeno específico para el antígeno diana.

En algunos modos de realización, puede ser preferente que el anticuerpo biespecífico o multiespecífico sea multivalente, por ejemplo, bivalente, para el antígeno diana (por ejemplo, el antígeno asociado a tumor). Esto tiene la ventaja de incrementar la avidez.

En algunos modos de realización, puede ser preferente que el anticuerpo biespecífico o multiespecífico sea monovalente para Pb-DOTAM. Esto reduce el riesgo de formación de complejos de alto peso molecular cuando se usa un agente de aclaramiento (véase el análisis adicional a continuación).

Por tanto, en algunos modos de realización, el anticuerpo puede ser trivalente: es decir, bivalente para el antígeno diana y monovalente para Pb-DOTAM.

En un formato ejemplar, el anticuerpo biespecífico o multiespecífico puede comprender un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, una IgG) que comprende una primera y segunda cadena pesada de anticuerpo y una primera y segunda cadena ligera de anticuerpo, en el que la primera cadena pesada y la primera cadena ligera se ensamblan para formar un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno, y en el que la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera se ensamblan para formar un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno. Opcionalmente, se pueden fusionar otros restos de unión a antígeno, por ejemplo, por medio de un conector polipeptídico al extremo N o C de la primera y/o segunda cadena pesada, para incrementar la valencia de uno o ambos antígenos. Por ejemplo, otro resto de unión a antígeno para el primer antígeno se puede fusionar al extremo N de una o ambas de las moléculas de cadena pesada.

En otro formato ejemplar, el anticuerpo biespecífico o multiespecífico puede comprender un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, una IgG) que comprende un sitio de unión a antígeno para un primer antígeno (por ejemplo, que puede ser divalente para el primer antígeno), y comprende además al menos un resto de unión a antígeno específico para el segundo antígeno. En diversos modos de realización, el resto de unión a antígeno puede ser un fragmento Fab, una molécula de Fab de entrecruzamiento, un scFab, una molécula de Fv, un scFv o un anticuerpo de dominio único (VHH) o puede ser parte de un segundo anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno, y además comprende al menos un segundo dominio variable de la cadena pesada y un segundo dominio variable de la cadena ligera que conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno para un segundo antígeno. El primer o el segundo antígeno es el quelato de Pb-DOTAM, y el otro antígeno es el antígeno diana.

En algunos modos de realización de los formatos en la presente descripción, el segundo antígeno es el quelato de Pb-DOTAM y el primer antígeno es la diana, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor (CEA, CD20 o ERBB2 en algunos modos de realización).

En otro formato ejemplar, el anticuerpo biespecífico o multiespecífico puede comprender un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno (por ejemplo, que puede ser divalente para el primer antígeno), en el que el extremo N o C de una de las cadenas pesadas se enlaza por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido y en el que el primer polipéptido se asocia con un segundo polipéptido para formar un Fab o un cross-Fab que comprende un sitio de unión para el segundo antígeno. Por ejemplo, este formato puede comprender:

i) un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CL; o

ii) un primer polipéptido que consiste en un dominio VL y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VH y CL;

o

iii) un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CL, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CH1; de modo que el primer y segundo polipéptido conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno para un segundo antígeno.

En algunos modos de realización, la fusión puede estar en el extremo N de una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.

En otro modo de realización particular, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo;

b) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; o

ii) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante pesado (CH1) de anticuerpo; o

iii) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo;

en el que dicho polipéptido se fusiona con el extremo N del dominio VH por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa;

c) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo; o

ii) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo o

iii) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo;

en el que dicho polipéptido se fusiona con el extremo N del dominio VL por medio de un conector peptídico al extremo C de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa;

y en el que el dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo del péptido en (b) y el dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo del péptido en (c) conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno a un segundo antígeno.

En este formato, el primer o bien el segundo antígeno puede ser el quelato de Pb-DOTAM. El otro será el antígeno diana, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor.

En algunos modos de realización, el segundo antígeno es el quelato de Pb-DOTAM y el primer antígeno es la diana, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor (CEA, CD20 o ERBB2 en algunos modos de realización). El anticuerpo descrito anteriormente puede ser trivalente. En otro posible modo de realización, se pueden fusionar otros restos de unión a antígeno para incrementar la valencia de uno o ambos antígenos, como se analiza además en el presente documento.

Opcionalmente, dicho conector (y cualquier conector como se analiza en el presente documento) puede ser un péptido de al menos 5 aminoácidos, preferentemente entre 25 y 50 aminoácidos. El conector puede ser un conector rígido o un conector flexible. En algunos modos de realización, es uno flexible que comprende o consiste en residuos de Thr, Ser, Gly y/o Ala. Por ejemplo, puede comprender o consistir en residuos de Gly y Ser. En algunos modos de realización, puede tener un motivo de repetición tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)<n>, donde n es, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunos modos de realización, el conector puede ser o puede comprender la secuencia GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 13 (SEQ ID NO: 26). Se pueden usar otros conectores y se podrían identificar por el experto en la técnica.

Se proporcionan detalles adicionales de este formato de anticuerpo en el documento WO2010/115589 A1 (Roche Glycart AG).

Opcionalmente,

i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera del anticuerpo de longitud completa en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); o

ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la presente invención puede tener la estructura trivalente como se expone anteriormente, y puede comprender:

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a CEA y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo;

en el que las cadenas pesadas tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 450 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 22 o 23 (es decir, con la porción de la secuencia que precede al conector);

y en el que las cadenas ligeras tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO 21; y/o

b) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7; o

ii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo; o

iii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo;

en el que dicho polipéptido se fusiona con el extremo N del dominio VH por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa; y/o

c) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8; o

ii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo; o

iii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo;

en el que el dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo del péptido en (b) y el dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo del péptido en (c) conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno al quelato de Pb-DOTAM.

En un ejemplo, una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa comprende las denominadas "mutaciones de botón" (T366W y opcionalmente una de S354C o Y349C, preferentemente S354C) y la otra comprende las denominadas "mutaciones de ojal" (T366S, L368A e Y407V y opcionalmente Y349C o S354C, preferentemente Y349C) (véase, por ejemplo, Carter, P.et al.,Immunotechnol. 2 (1996) 73) de acuerdo con la numeración del índice EU.

En algunos modos de realización, las dos cadenas pesadas de anticuerpo en (a) comprenden i) una primera cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 450 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 23 (es decir, la secuencia que precede al conector), y que tiene C en la posición 349, S en la posición 366, A en la posición 368 y V en la posición 407 (numeración EU); y ii) una segunda cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 450 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 22 que tiene C en la posición 354 y W en la posición 366 (numeración EU).

Los residuos "fijos" mencionados en el presente documento son mutaciones "botón en ojal" en CH3 o son otros residuos tales como residuos formadores de puentes disulfuro, que se emparejan con los residuos correspondientes en CH3 de la otra cadena pesada para favorecer la formación de la molécula deseada. Los posibles residuos que pueden estar presentes en la otra cadena pesada se pueden derivar de las secuencias de la tabla 2 (por ejemplo, las secuencias 19 y 20 o 22 y 23). Por ejemplo, en un modo de realización si la primera cadena pesada de anticuerpo tiene C en la posición 349, entonces la segunda cadena pesada de anticuerpo tiene C en 354.

Opcionalmente, el conector es como se describe anteriormente.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la presente invención puede tener la estructura trivalente como se expone anteriormente, y puede comprender:

en el que las cadenas pesadas tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos de 1 a 450 de SEQ ID NO: 19 o 20 (inclusive y en base a la numeración secuencial: es decir, la secuencia que precede al conector) y en el que las cadenas ligeras tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO: 21;

b) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9; o

ii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo; o

iii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo;

c) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 10; o

ii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 10 y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo, o

iii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 10 y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo,

y en el que el dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo del péptido en (b) y el dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo del péptido en (c) conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno al quelato de Pb-DOTAM.

Como se describe anteriormente, en cualquiera de los modos de realización anteriores, una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa puede comprender las denominadas "mutaciones de botón" (T366W y opcionalmente una de S354C o Y349C, preferentemente S354C) y la otra comprende las denominadas "mutaciones de ojal" (T366S, L368A e Y407V y opcionalmente Y349C o S354C, preferentemente Y349C) (véase, por ejemplo, Carter, P.et al.,Immunotechnol. 2 (1996) 73) de acuerdo con la numeración del índice EU.

En un modo de realización, las dos cadenas pesadas de anticuerpo en (a) pueden comprender i) una primera cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 450 de SEQ ID NO: 22, que tiene C en la posición 354 y W en la posición 366 (numeración EU); y

ii) una segunda cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 450 de SEQ ID NO: 23 y que tiene C en la posición 349, S en la posición 366, A en la posición 368 y V en la posición 407 (numeración EU).

Opcionalmente, el conector es como se describe anteriormente.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende:

i) una primera cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 22,

ii) una segunda cadena pesada que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 23,

iii) dos cadenas ligeras de anticuerpo que tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

Aún en otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico es la molécula denominada en el presente documento PRIT-0213, que comprende

i) una primera cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;

ii) una segunda cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y

iii) dos cadenas ligeras de anticuerpo que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende:

i) una primera cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 19,

ii) una segunda cadena pesada que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 20,

Aún en otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico es la molécula denominada en el presente documento PRIT-0214, que comprende

i) una primera cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;

ii) una segunda cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; y

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ERBB2 y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo;

en el que las cadenas pesadas tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 449 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 36 o 37 (es decir, con la porción de la secuencia que precede al conector);

y en el que las cadenas ligeras tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO 38; y/o

b) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 o 9 (en algunos modos de realización, preferentemente 7); o

ii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 o 9 (en algunos modos de realización, preferentemente 7) y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo; o

iii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 o 9 (en algunos modos de realización, preferentemente 7) y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo,

c) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 o 10 (en algunos modos de realización, preferentemente 8); o

ii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 o 10 (en algunos modos de realización, preferentemente 8) y un dominio constante de la cadena ligera (CL) dl anticuerpo; o

iii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 o 10 (en algunos modos de realización, preferentemente 8) y un dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo (CH1);

En un ejemplo, una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa comprende las denominadas "mutaciones de botón" (T366W y opcionalmente una de S354C o Y349C, preferentemente S354C) y la otra comprende las denominadas "mutaciones de ojal" (T366S, L368A e Y407V y opcionalmente S354C o Y349C, preferentemente Y349C) (véase, por ejemplo, Carter, P.et al.,Immunotechnol. 2 (1996) 73) de acuerdo con la numeración del índice EU.

En algunos modos de realización, las dos cadenas pesadas de anticuerpo en (a) comprenden i) una primera cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 449 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 37 (es decir, la secuencia que precede al conector), y que tiene C en la posición 349, S en la posición 366, A en la posición 368 y V en la posición 407 (numeración EU); y ii) una segunda cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 449 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 36 que tiene C en la posición 354 y W en la posición 366 (numeración EU).

Opcionalmente, el conector es como se describe anteriormente.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende:

i) una primera cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 36,

ii) una segunda cadena pesada que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 37,

iii) dos cadenas ligeras de anticuerpo que tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO: 38.

Aún en otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico es la molécula denominada en el presente documento P1AD9827, que comprende

i) una primera cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

ii) una segunda cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; y

iii) dos cadenas ligeras de anticuerpo que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a CD20 y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo;

en el que las cadenas pesadas tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 448 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 47 o 48 (es decir, con la porción de la secuencia que precede al conector);

y en el que las cadenas ligeras tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO 49; y/o

b) un polipéptido que consiste en

ii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 o 9 (en algunos modos de realización, preferentemente 7) y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo, iii) dicho dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 o 9 (en algunos modos de realización, preferentemente 7) y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se fusiona con el extremo N del dominio VH por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa; y/o

c) un polipéptido que consiste en

ii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 o 10 (en algunos modos de realización, preferentemente 8) y un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo; o iii) dicho dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 o 10 (en algunos modos de realización, preferentemente 8) y un dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo;

En algunos modos de realización, las dos cadenas pesadas de anticuerpo en (a) comprenden i) una primera cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 448 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 48 (es decir, la secuencia que precede al conector), y que tiene C en la posición 349, S en la posición 366, A en la posición 368 y V en la posición 407 (numeración EU); y ii) una segunda cadena pesada de anticuerpo que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de aminoácidos 1- 448 (inclusive, usando numeración secuencial) de SEQ ID NO: 47 que tiene C en la posición 354 y W en la posición 366 (numeración EU).

Opcionalmente, el conector es como se describe anteriormente.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende:

i) una primera cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 47,

ii) una segunda cadena pesada que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena pesada de SEQ ID NO: 48,

iii) dos cadenas ligeras de anticuerpo que tienen al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la cadena ligera de SEQ ID NO: 49.

Aún en otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico es la molécula denominada en el presente documento P1AD9826, que comprende

i) una primera cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47;

ii) una segunda cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; y

iii) dos cadenas ligeras de anticuerpo que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado o un conjunto aislado de polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento. En otros modos de realización, la presente invención se refiere a un vector de expresión o conjunto de vectores de expresión que comprende dicho polinucleótido o polinucleótidos. En otros objetivos, la presente invención se refiere a una célula huésped procariota o eucariota que comprende un polinucleótido aislado o un conjunto aislado de polinucleótidos de acuerdo con la invención, o un vector de la presente invención. Además, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende expresar el anticuerpo a partir de la célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo.

Los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos como se describe en el presente documento pueden encontrar uso en una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, tales como radioinmunoterapia predirigida y radioinmunoimagen predirigida.

La solicitud describe un anticuerpo biespecífico o multiespecífico como se describe en el presente documento para su uso en radioimagen predirigida. En dichos modos de realización, el Pb quelado es preferentemente 203Pb. Un procedimiento para dirigir un radioisótopo a un tejido u órgano para la formación de imágenes puede comprender:

i) administrar al sujeto un anticuerpo multiespecífico o biespecífico como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo se une al antígeno diana y se localiza en la superficie de una célula que expresa el antígeno diana; y

ii) administrar posteriormente un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo al individuo, en el que el radionúclido de Pb quelado con DOTAM o dicha variante funcional del mismo se une al anticuerpo localizado en la superficie de la célula diana.

Opcionalmente, entre las etapas (i) y (ii) se administra un agente de aclaramiento, en el que el agente de aclaramiento se une al sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM. El agente de aclaramiento bloquea el sitio de unión a antígeno para Pb-DOTAM, evitando que el anticuerpo circulante se una al radionúclido de Pb quelado. De forma alternativa o adicionalmente, el agente de aclaramiento puede incrementar la tasa de aclaramiento del anticuerpo del cuerpo. El "agente de aclaramiento" se puede denominar de forma alternativa "agente de bloqueo": estos términos se pueden sustituir entre sí en el análisis que sigue.

El agente de aclaramiento puede comprender un complejo de un ion metálico con DOTAM o una variante funcional del mismo, donde dicho complejo se reconoce por el sitio de unión a antígeno para Pb-DOTAM. Preferentemente, el ion metálico es un isótopo estable o un isótopo esencialmente estable. Por "isótopo estable" se quiere decir a un isótopo que no experimenta desintegración radioactiva. Por "isótopo esencialmente estable" se quiere decir un isótopo que experimenta desintegración radioactiva con una semivida muy larga, lo que lo hace seguro para su uso. Preferentemente, el ion metálico se selecciona de iones de Pb, Ca y Bi. Por ejemplo, el agente de aclaramiento puede comprender un isótopo estable de Pb complejado con DOTAM o una variante funcional del mismo, Ca complejado con DOTAM o una variante funcional del mismo, o 209Bi (un isótopo esencialmente estable con una semivida de 1,9 x 1019 años) complejado con DOTAM o una variante funcional del mismo. El Pb puede ser plomo natural, que es una mezcla de los isótopos estables (no radioactivos) 204Pb, 206Pb, 207Pb y 208Pb.

El DOTAM o variante funcional del mismo se conjuga con un resto de aclaramiento. Este resto proporciona al agente de aclaramiento una baja captación en el tumor, por ejemplo, en virtud de su tamaño y/o alto radio hidrodinámico. Los restos de aclaramiento adecuados se analizan además a continuación. En algunos modos de realización, el agente de aclaramiento puede comprender DOTAM o una variante funcional del mismo conjugado con dextrano o un derivado del mismo.

En otro modo de realización de los procedimientos de formación de imágenes, el anticuerpo multiespecífico o biespecífico se puede unir al radionúclido de Pb quelado en el momento de la administración.

Opcionalmente, en cualquier modo de realización, el procedimiento puede comprender además:

iii) formación de imágenes del tejido u órgano donde se ha localizado el radionúclido de Pb quelado con DOTAM o la variante funcional del mismo.

En algunos modos de realización, el antígeno diana puede ser un antígeno específico de tumor y la formación de imágenes puede ser un procedimiento de formación de imágenes de un tumor o tumores.

La solicitud describe un anticuerpo como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de radioinmunoterapia predirigida. En dichos modos de realización, el Pb quelado es preferentemente 212Pb. Un procedimiento para dirigir un radioisótopo a un tejido u órgano para tratamiento puede comprender:

ii) administrar posteriormente un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o con una variante funcional del mismo, en el que el radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo se une al anticuerpo localizado en la superficie de la célula.

Opcionalmente, entre las etapas (i) y (ii) se administra un agente de aclaramiento como se describe anteriormente. En algunos modos de realización, el antígeno diana es un antígeno asociado a tumor y el procedimiento es un procedimiento para tratar el cáncer. En otros modos de realización, el antígeno diana puede ser un antígeno asociado con infección, por ejemplo, una proteína expresada por un procariota o por una célula infectada por virus. En algunos modos de realización, se pueden administrar los anticuerpos descritos en el presente documento como parte de una politerapia. Por ejemplo, se pueden administrar en combinación con uno o más radiosensibilizadores y/o agentes quimioterápicos: el radiosensibilizador o agente quimioterápico y el anticuerpo se pueden administrar de forma simultánea o secuencial, en cualquier orden.

Los procedimientos de radioimagen y radioinmunoterapia descritos en el presente documento se pueden combinar opcionalmente, por ejemplo, administrando el anticuerpo y tanto 203Pb-DOTAM como 212Pb-DOTAM, por ejemplo, como una mezcla.

La solicitud describe composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La solicitud describe un kit que comprende un anticuerpo de la presente invención y uno, dos, tres, cuatro o todos de:

i) un excipiente farmacéuticamente aceptable;

ii) un radionúclido de Pb quelado por DOTAM o una variante funcional del mismo;

iii) un agente de aclaramiento como se describe en el presente documento;

iv) uno o más agentes quimioterápicos adicionales; y/o

v) uno o más radiosensibilizadores.

Como se describe en el presente documento, los autores de la presente invención han desarrollado un agente de aclaramiento novedoso. Dicho agente de aclaramiento se puede usar en cualquiera de los procedimientos de diagnóstico, formación de imágenes o tratamiento como se describe en el presente documento.

La solicitud describe un agente de aclaramiento que comprende dextrano o un derivado del mismo conjugado con un quelante seleccionado de DOTAM y una variante funcional de DOTAM, en el que dicho quelante forma un complejo con Pb, Zn, Ca o Bi. El agente de aclaramiento típicamente incluye un ion metálico quelado, tal como un ion de Pb, Zn, Ca o Bi.

El agente de aclaramiento puede comprender aminodextrano acoplado a DOTAM o a una variante funcional de DOTAM. Por ejemplo, el agente de aclaramiento puede comprender DOTAM acoplado a aminodextrano con acoplamiento de isotiocianato (por ejemplo, un compuesto que se puede obtener haciendo reaccionar aminodextrano con p-SCN-Bn-TCMC).

Una potencial dificultad con el uso de agentes de aclaramiento es la posibilidad de que puedan entrar en tumores, afectando negativamente a la posterior unión de los radioligandos.

Los autores de la presente invención han descubierto además que se puede lograr un buen aclaramiento de la sangre conjuntamente con una baja penetración del agente de aclaramiento en los tumores, cuando se usa un agente de aclaramiento a base de dextrano que tiene i) un peso molecular promedio alto y ii) se ha sometido a un límite de peso molecular, de modo que se han retirado fragmentos por debajo de un determinado tamaño.

Por tanto, un agente de aclaramiento preferente puede ser uno en el que i) el peso molecular promedio del dextrano o derivado del mismo en el agente de aclaramiento es de 200-800 kDa, opcionalmente, mayor de 300, 350, 400 o 450 kDa y, opcionalmente, menor de 700, 650, 600 o 550 kDa, opcionalmente aproximadamente 500 kDa, y ii) se han retirado dextrano, derivados de dextrano o agentes de aclaramiento de menos de un límite de peso molecular especificado, en el que el límite de peso molecular es de 50 kDa o superior, 100 kDa o superior o 200 kDa o superior, opcionalmente, en el intervalo de 50 kDa-250 kDa o 50 kDa-200 kDa, opcionalmente, 100 kDa-200 kDa y, opcionalmente, aproximadamente 100 kDa, 150 kDa o 200 kDa.

La solicitud describe procedimientos de preparación del agente de aclaramiento y el uso de los agentes de aclaramiento en procedimientos de radioinmunoterapia o radioinmunoimagen.

Estos y otros aspectos de la invención se analizan además a continuación.

Figuras

La figura 1 muestra una representación esquemática de un posible formato de anticuerpo biespecífico. Este formato comprende dos sitios de unión a antígeno para una diana (A) y un sitio de unión a antígeno para una segunda diana (B) (formato 2:1).

La figura 2 muestra la estructura de PRIT-0213 en complejo con Pb-DOTAM.

La figura 3 muestra la vista en el sitio de interacción, de PRIT-0213 en complejo con Pb-DOTAM, numerado de acuerdo con Kabat.

La figura 4 muestra la distribución de 212Pb 24 h después de la inyección de DOTAM radiomarcado (%DI/g ± DE, n = 3). PRIT-0206, -0207, -0208 y -0165 se dirigen a T84.66, mientras que PRIT-0186, -0187 y -0156 se dirigen a CH1A1A. PRIT-0175 es un control de no unión a CEA.

La figura 5 muestra la distribución de 203Pb expresado como recuentos por minuto (CPM) 96 h después de la inyección de anticuerpos de PRIT unidos previamente con DOTAM radiomarcado (CPM ± DE, n = 3). PRIT-0205, -0206, -0207, -0208 y -0209 son construcciones completamente humanizadas, mientras que PRIT-0165 y -0175 son controles positivo y negativo, respectivamente.

La figura 6 muestra la acumulación/aclaramiento de 203Pb-DOTAM-bsAb en tumores BxPC3 y sangre expresados como CPM ± DE (n = 3) en diversos puntos temporales después de la inyección de anticuerpos de PRIT unidos previamente con DOTAM radiomarcado. PRIT-0206 es una versión completamente humanizada de PRIT-0165; PRIT-0175 es un control de no unión a CEA.

La figura 7 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 2 horas después de la inyección de agentes de aclaramiento marcados con 212Pb en ratones portadores de tumor MKN45 (%DI/g ± DE, n=3).

La figura 8 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados y orina, 24 horas después de la inyección de agentes de aclaramiento marcados con 212Pb en ratones portadores de tumor MKN45 (%DI/g ± DE, n=3).

La figura 9 muestra la distribución de radioactividad por órganos en tejidos seleccionados y orina, 24 horas después de la inyección de agentes de aclaramiento marcados con 212Pb en ratones portadores de tumor MKN45 (%DI ± DE, n=3).

La figura 10 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 1 semana después de la inyección de agentes de aclaramiento marcados con 203Pb en ratones sin tumor (%DI/g ± DE, n=3).

La figura 11 muestra la distribución de radioactividad por órganos en tejidos seleccionados 1 semana después de la inyección de agentes de aclaramiento marcados con 203Pb en ratones sin tumor (%DI ± DE, n=3).

La figura 12 muestra el contenido de radioactividad en sangre 4 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). La barra rayada representa el control sin CA (sin agente de aclaramiento), con el que se compararon todos los reactivos candidatos. Los asteriscos marcan el nivel de significación estadística, de menor (*) a mayor (* * *).

La figura 13 muestra el contenido promedio de radioactividad en sangre 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). La barra rayada representa el control sin CA (sin agente de aclaramiento), con el que se compararon todos los reactivos candidatos.

La figura 14 muestra el contenido de radioactividad en sangre y tumores 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3).

La figura 15 muestra la distribución de 212Pb 24 h después de la inyección de DOTAM radiomarcado (%DI/g ± DE, n = 3), usando 30 o 100 |jg de anticuerpo biespecífico y 10-100 |jg de agentes de aclaramiento con límites de filtración de 100 o 30 kDa, o sin agente de aclaramiento en absoluto (PBS).

La figura 16 muestra el efecto sobre la concentración de actividad de 212Pb en sangre y tumor con cantidades crecientes de agente de aclaramiento (0-100 jg). Se predirigieron los tumores usando 100 jg de PRIT-0165, seguido 4 días después de Dex500 diafiltrado con un límite de 100 kDa, o PBS. Se administró 212Pb-DOTAM 2 horas después del agente de aclaramiento. Los símbolos representan el %DI/g 24 h después de la inyección radioactiva, y la línea la regresión lineal de los datos del tumor.

La figura 17 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). Las barras gris oscuro y negro representan controles positivos sin CA (sin agente de aclaramiento), con los que se compararon los reactivos candidatos.

La figura 18 muestra el contenido de 212Pb en sangre y tumores 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3) y las proporciones de tumor con respecto a sangre correspondientes. Las barras gris oscuro y negro representan controles positivos sin CA (sin agente de aclaramiento), con los que se compararon los reactivos candidatos.

La figura 19 muestra la proporción de tumor con respecto a sangre 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM en función de la cantidad de agente de aclaramiento (CA) (PJRD08-46) y la saturación de TCMC (9, 20, 39 u de 84 a 1). Las líneas discontinuas representan la regresión lineal (R2 = 0,82) y el ajuste de curva no lineal (R2 = 0,74) de los datos respectivos.

La figura 20 muestra la distribución de 212Pb 24 h después de la inyección de DOTAM radiomarcado (%DI/g ± DE, n = 3). Las barras con fondo blanco y gris representan T84.66 y CH1A1A dirigidos, respectivamente; la barra negra representa el control de no unión a CEA.

La figura 21 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± EEM, n = 3), para los ciclos de tratamiento 1 y 2 en el modelo BxPC3.

La figura 22 muestra los pesos corporales promedio en los grupos A-G (n = 8) después de CEA-PRIT en el modelo BxPC3. Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 23 muestra el cambio de peso promedio en los grupos A-G (n = 8) después de CEA-PRIT en el modelo BxPC3, expresado como el porcentaje del peso corporal inicial. Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 24 muestra los promedios de crecimiento tumoral con error estándar para los grupos A-G en el modelo BxPC3 (n=8). Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 25 muestra las curvas de crecimiento tumoral individuales para los grupos A-G en el modelo BxPC3. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM.

La figura 26 muestra las curvas de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia en los grupos A-G en el modelo BxPC3 (n=8). Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM.

La figura 27 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3), para el ciclo de tratamiento 1 y 2 en el modelo LS174T.

La figura 28 muestra los pesos corporales promedio en los grupos A-G (n = 8) después de CEA-PRIT en el modelo LS174T. Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 29 muestra el cambio de peso promedio en los grupos A-G (n = 8) después de CEA-PRIT en el modelo LS174T, expresado como el porcentaje del peso corporal inicial. Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 30 muestra los promedios de crecimiento tumoral con error estándar para los grupos A-G (n=8) en el modelo LS174T. Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio. La figura 31 muestra las curvas de crecimiento tumoral individuales para los grupos A-G en el modelo LS174T. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM.

La figura 32 muestra las curvas de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia en los grupos A-G en el modelo LS174T (n=8). Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM.

La figura 33 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). Las barras grises representan la acumulación en el tejido después de la inyección de diversas cantidades de agente de aclaramiento (CA) Dex500-(50 %); la barra negra representa el control sin CA (sin agente de aclaramiento).

La figura 34 muestra el contenido de 212Pb en sangre y tumores 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3) y las proporciones de tumor con respecto a sangre correspondientes. Las barras grises representan la acumulación en el tejido después de la inyección de diversas cantidades del agente de aclaramiento (CA) Dex500-(50 %); la barra negra representa el control sin CA (sin agente de aclaramiento).

La figura 35 muestra el contenido de radioactividad en sangre 4 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3).

La figura 36 muestra la unión de un anticuerpo (PRIT-0165) a las células MKN-45, detectándola usando detección secundaria (panel derecho, Alexa 488) o bien DOTAM FITC (panel izquierdo, FITC-A).

La figura 37 muestra posibles formatos para anticuerpos biespecíficos, usando CEA como un antígeno diana ejemplar. También se pueden usar otros antígenos diana.

La figura 38 muestra la unión de P1AD8927 a células KPL-4 para demostrar la competencia de unión de Her2: detección de anticuerpos usando anticuerpos secundarios específicos de IgG humana.

La figura 39 muestra la unión de P1AD8927 a células KPL-4 para demostrar la competencia de unión de DOTAM: detección corregida de isotipo usando Pb-DOTAM-FITC.

La figura 40 muestra la unión de P1AD8926 a células Raji para demostrar la competencia de unión de CD20: detección de anticuerpos usando anticuerpos secundarios específicos de IgG humana.

La figura 41 muestra la unión de P1AD8926 a células Raji para demostrar la competencia de unión de DOTAM: detección corregida de isotipo usando Pb-DOTAM-FITC.

La figura 42 muestra el esquema de estudio del protocolo 103, evaluando CEA-PRIT de tumores BxPC3 s.c. en ratones SCID (h = horas, d = días, w = semanas).

Figura 43: el panel A muestra la acumulación promedio de 212Pb en los tejidos recogidos después de ambos ciclos de tratamiento, expresada como el % DI/g ± DE (n=3). El panel B muestra la captación tumoral individual de 212Pb para cada ratón, junto con los volúmenes tumorales correspondientes (mm3) en el sacrificio.

La figura 44 muestra las curvas de crecimiento tumoral promedio con error estándar para los grupos A-G en el modelo BxPC3 (n=10). Las curvas se truncaron en n<5. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM (30 o 10 |jC¡) para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 45 muestra las curvas de crecimiento tumoral individuales para los grupos A-G en el modelo BxPC3 (n=10). Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM (30 o 10 j C¡).

La figura 46 muestra las curvas de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia en los grupos A-G en el modelo BxPC3 (n=10). Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM (30 o 10 j C¡).

La figura 47 muestra la pérdida de peso corporal promedio en los grupos A-G (n = 10) después de CEA PRIT en el modelo BxPC3. Las curvas se truncaron en n<5. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 48 muestra la distribución de 203Pb-BsAb (20 j C¡, 100 jg ) en ratones SCID portadores de tumores BxPC3 s.c. Se inyectó a los ratones 20 jC i de 203Pb-DOTAM-CEA-DOTAM o 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM (control negativo) unidos previamente seguido de extracción de órganos el día 1, 4, 7 o 10 después de la inyección para evaluar la radioactividad acumulada en los tejidos recogidos (% DI/g ± DE, n = 5).

La figura 49 muestra la acumulación de 203Pb-BsAb en tumores BxPC3 s.c. 1-10 días después de la inyección de 20 jCi/100 jg de 203Pb-DOTAM-CEA-DOTAM o 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM (control negativo) unidos previamente (% DI/g ± DE, n = 5).

La figura 50 muestra la distribución de 212Pb en ratones SCID portadores de tumores BxPC3 s.c. Se inyectó a los ratones BsAb CEA-DOTAM y CA antes de la administración de 212Pb-DOTAM, de 5 min a 48 h después de la inyección radioactiva (% DI/g ± DE, n = 5). *Contenido acumulado de 212Pb en orina y heces a lo largo del tiempo, es decir, cada punto temporal, incluyendo el valor del previo. El % DI/g estimado en orina se basó en 1/5 (10 ml) de una mezcla de orina/solución de lavado de 5 ratones (50 ml).

La figura 51 muestra el esquema de estudio del protocolo 131, que evalúa la distribuciónin vivode 212Pb después de PRIT usando BsAb CEA-DOTAM, Pb-DOTAM-dextrano-500-CA y 212Pb-DOTAM desactivado con cualquiera de 5 metales diferentes (Zn, Gd, Cu, Ca o Pb) en ratones SCID portadores de tumores BxPC3 s.c. (d = días, h = horas).

La figura 52 muestra la distribución de 212Pb en ratones SCID portadores de tumor 2 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM predirigido a CEA-DOTAM (% DI/g ± DE, n = 4).

La figura 53 muestra la distribución de 212Pb en tejidos normales seleccionados de ratones SCID portadores de tumor 2 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, desactivado con diferentes metales (% DI/g).

La figura 54 muestra la distribución de 212Pb en ratones SCID portadores de tumor 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, predirigido por BsAb CD20-DOTAM o el control negativo DIG-DOTAM (% DI/g ± DE, n = 3).

La figura 55 muestra la distribución de 212Pb en ratones SCID portadores de tumor 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, predirigido por BsAb HER2-DOTAM o el control negativo DIG-DOTAM (% DI/g ± DE, n = 3).

La figura 56 muestra el esquema de estudio del protocolo 154, que evalúa la biodistribución de 212Pb-DOTAM después de CEA-PRIT usando diversas construcciones de BsAb en ratones SCID portadores de tumores HPAF-II s.c. (h = horas, d = días).

La figura 57 muestra la distribución de 212Pb en ratones SCID portadores de tumor 6 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, predirigido por el control negativo DIG-DOTAM, el BsAb CEA-DOTAM estándar o bien una de las construcciones de BsAb alternativas (% DI/g ± DE, n = 3).

La figura 58 muestra el contenido en sangre y la acumulación tumoral de 212Pb 6 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, predirigido por el control negativo DIG-DOTAM, el BsAb CEA-DOTAM estándar o bien una de las construcciones de BsAb alternativas (% DI/g ± DE, n = 3).

La figura 59 muestra la pauta experimental del protocolo 162. Se llevó a cabo CD20-PRIT usando BsAb CD20-DOTAM, CaDOTAM-dextrano-500 CA y 212Pb-DOTAM en ratones SCID portadores de tumores WSU-DLCL2 s.c.; la RIT de 1 etapa se llevó a cabo usando BsAb CD20-DOTAM unido previamente con 212Pb-DOTAM (212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM) en ratones SCID portadores de tumores WSU-DLCL2 s.c.

La figura 60 muestra la distribución de 212Pb en ratones SCID portadores de tumor 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM predirigido a CD20-DOTAM o 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM unido previamente. El contenido radioactivo en órganos y tejidos se expresa como % DI/g promedio y desviación estándar (DE; n = 3).

La figura 61 muestra el crecimiento tumoral s.c. promedio de WSU-DLCL2 para los grupos A-G, expresado en mm3 ± EEM (n = 10).

La figura 62 muestra el cambio promedio en el peso corporal de ratón después de los diversos tratamientos, expresado como % del peso corporal inicial ± EEM. Las líneas punteadas indican 212Pb o inyección de anticuerpo, dependiendo del esquema de tratamiento.

Definiciones

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

"Afinidad" se refiere a la intensidad de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

Los términos "anticuerpo anti-Pb-DOTAM", "un anticuerpo que se une a Pb-DOTAM", "un anticuerpo que se une a un quelato de Pb-DOTAM" y términos equivalentes, se refieren a un anticuerpo que se puede unir al quelato de Pb-DOTAM con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil en un esquema de clasificación y/o purificación para separar restos marcados de Pb-DOTAM, y/o de modo que el anticuerpo puede localizar Pb-DOTAM en el sitio del anticuerpo, por ejemplo, con el propósito de dirigir Pb-DOTAM a una célula. Los términos "anticuerpo antidiana" y "un anticuerpo que se une a una diana" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a una diana con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil en aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico que implican la localización del anticuerpo en la diana, por ejemplo, como se expresa en la superficie de una célula. En un modo de realización, el grado de unión del anticuerpo a un resto no relacionado y/o a una proteína diana no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a Pb-DOTAM o a la diana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo tiene una constante de disociación (Kd) para Pb-DOTAM y/o la diana de < 1|jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10-13 M).

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se puede referir a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y |J, respectivamente.

El término "agente citotóxico", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, 225Ac, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 213Bi, 32P, 212Pb e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2 (L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento. Un anticuerpo de longitud completa puede ser, por ejemplo, una IgG.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias estructurales de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En un modo de realización, para el Vl , el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabatet al., supra.En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabatet al.,supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) se corresponden con las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las Fr se corresponden con las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las Hv R ejemplares incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk,J. Mol. Biol.196:901-917 (1987));

(b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallumet al. J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

En lugar de lo anterior, la secuencia de CDR-H1 como se describe en el presente documento se puede extender desde Kabat26 a Kabat35.

En un modo de realización, los residuos de HVR o CDR comprenden los identificados en la tabla 2 o en otra parte en la memoria descriptiva.

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR/CDR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabatet al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterógenas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Las moléculas como se describe en el presente documento pueden estar "aisladas". Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o un 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatmanet al., J. Chromatogr. B848:79-87 (2007).

El término "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprende un polímero de nucleótidos. Cada nucleótido se compone de una base, específicamente una base de purina o pirimidina (es decir, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) o uracilo (U)), un glúcido (es decir, desoxirribosa o ribosa) y un grupo fosfato. A menudo, la molécula de ácido nucleico se describe por la secuencia de bases, con lo que dichas bases representan la estructura primaria (estructura lineal) de una molécula de ácido nucleico. La secuencia de bases se representa típicamente de 5' a 3'. En el presente documento, el término molécula de ácido nucleico engloba ácido desoxirribonucleico (ADN) que incluye, por ejemplo, ADN complementario (ADNc) y ADN genómico, ácido ribonucleico (ARN), en particular ARN mensajero (ARNm), formas sintéticas de ADN o ARN y polímeros mixtos que comprenden dos o más de estas moléculas. La molécula de ácido nucleico puede ser lineal o circular. Además, el término molécula de ácido nucleico incluye tanto hebras sentido como antisentido, así como formas monocatenarias y bicatenarias. Además, la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento puede contener nucleótidos naturales o no naturales. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen bases nucleotídicas modificadas con glúcidos derivatizados o enlaces de cadena principal de fosfato o residuos modificados químicamente. Las moléculas de ácido nucleico también engloban moléculas de ADN y ARN que son adecuadas como vector para la expresión directa de un anticuerpo de la invenciónin vitroy/oin vivo,por ejemplo, en un huésped o paciente. Dichos vectores de ADN (por ejemplo, ADNc) o ARN (por ejemplo, ARNm) pueden ser no modificados o modificados. Por ejemplo, el ARNm se puede modificar químicamente para potenciar la estabilidad del vector de ARN y/o la expresión de la molécula codificada de modo que el ARNm se pueda inyectar en un sujeto para generar el anticuerpoin vivo(véase, por ejemplo, Stadleret al.,Nature Medicine 2017, publicado en línea el 12 de junio de 2017, do: 10.1038/nm.4356 o el documento EP 2101 823 B1).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades despreciables. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dáltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se enlazan con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo de inmediato precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de los análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, evitar la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del grado de actividad de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindtet al. Kuby Immunology,6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolanoet al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarksonet al., Nature352:624-628 (1991).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

Los términos "Pb" o "plomo" como se usa en el presente documento incluyen iones de los mismos, por ejemplo, Pb(II). Por tanto, el lector experto entiende que, por ejemplo, los términos plomo, Pb, 212Pb o 203Pb pretenden englobar formas iónicas del elemento, en particular, Pb(II). En diversos aspectos de la invención, Pb puede ser un radioisótopo (por ejemplo, cuando se usa en un procedimiento de radioinmunoterapia o radioinmunoimagen) o puede ser un no radioisótopo estable (por ejemplo, como puede ser preferente en el contexto de un agente de aclaramiento).

"DOTAM" tiene la denominación química:

1,4,7,10-tetraquis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano,

que es un compuesto de la siguiente fórmula:

En determinados aspectos y modos de realización, la presente invención también puede hacer uso de variantes o derivados funcionales de DOTAM que incorporan un ion metálico. Las variantes/derivados adecuados de DOTAM tienen una estructura que difiere en determinado grado de la estructura de DOTAM y conservan la capacidad de funcionar (es decir, conserva actividad suficiente para usarse para uno o más de los propósitos descritos en el presente documento). En dichos aspectos y modos de realización, DOTAM o variante/derivado funcional de DOTAM puede ser una de las variantes activas divulgadas en el documento WO 2010/099536.

Las variantes/derivados funcionales adecuados pueden ser un compuesto de la siguiente fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en la que

R<N>es H, alquilo C, haloalquilo C, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>, cicloalquilo C<3 -7>, cicloalquil C<3 -7>-alquilo C<1 -4>, heterocicloalquilo C<2 -7>, heterocicloalquil C<2 -7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-7>y heteroaril C<1 -7>-alquilo C<1 -4>; en el que alquilo C<1 -6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>y alquinilo C<2-6>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<w>seleccionados independientemente; y en el que dichos cicloalquilo C<3-7>, cicloalquil C<3-7>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-7>, heterocicloalquil C<2-7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-7>y heteroaril C<1-7>-alquilo C<1-4>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<x>seleccionados independientemente;

L<1>es independientemente alquileno C<1-6>, alquenileno C<1-6>o alquinileno C<1-6>, de los que cada uno está opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente de grupos R<1>;

L<2>es alquileno de cadena lineal C<2-4>, que está opcionalmente sustituido con un grupo R<1>seleccionado independientemente; y que está opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos seleccionados independientemente de alquilo C<1-4>y/o haloalquilo C<1-4>;

R<1>se selecciona independientemente de D<1>-D<2>-D<3>, halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C<1-6>, haloalcoxi C<1 -6>, alquiltio C<1-6>, alquilsulfinilo C<1-6>, alquilsulfonilo C<1 -6>, amino, alquilamino C<1-6>, di-alquilamino C<1-6>, alquilcarbonilo C<1 -4>, carboxi, alcoxicarbonilo C<1 -6>, alquilcarbonilamino C<1 -6>, di-alquilcarbonilamino C<1-6>, alcoxicarbonilamino C<1-6>, alcoxicarbonil C<1-6>-(alquil C<1-6>)amino, carbamilo, alquilcarbamilo C<1-6>y di-alquilcarbamilo C<1-6>;

cada D<1>se selecciona independientemente de aril C<1-6>-alquilo C<1-4>, heteroaril C<1 -9>-alquilo C<1 -4>, cicloalquil C<3 -10>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquil C<2 -9>-alquilo C<1 -4>, alquileno C<1-8>, alquenileno C<1-8>y alquinileno C<1-8>; en el que dichos alquileno C<1-8>, alquenileno C<1-8>y alquinileno C<1-8>están sustituidos opcionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos R<4>seleccionados independientemente; y en el que dichos aril C<6-10>-alquilo C<1 -4>, heteroaril C<1-9>-alquilo C<1-4>, cicloalquil C<3 -10>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquil C<2 -9>-alquilo C<1-4>están cada uno opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos R<5>seleccionados independientemente;

cada D<2>está independientemente ausente o es alquileno de cadena lineal C<1-20>, en el que de 1 a 6 grupos metileno no contiguos de dicho alquileno de cadena lineal C<1-20>se reemplazan opcionalmente cada uno por un resto -D<4>-seleccionado independientemente, siempre que al menos una unidad de metileno en dicho alquileno de cadena lineal C<1-20>no se reemplace opcionalmente por un resto -D<4>-; en el que dicho alquileno de cadena lineal C<1-20>está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente de halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C<1-4>, haloalquilo C<1-4>, alcoxi C<1-4>, haloalcoxi C<1-4>, amino, alquilamino C<1-4>, di-alquilamino C<1-4>, alquilcarbonilo C<1-4>, carboxi, alcoxicarbonilo C<1-4>, alquilcarbonilamino C<1-4>, di-alquilcarbonilamino C<1-4>, alcoxicarbonilamino C<1-4>, alcoxicarbonil C<1-4>-(alquil C<1-4>)amino, carbamilo, alquilcarbamilo C<1-4>y di-alquilcarbamilo C<1-4>;

cada D<3>se selecciona independientemente de H, halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C<1-6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>, cicloalquilo C<3-14>, cicloalquil C<3-14>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-14>, heterocicloalquil C<2-14>-alquilo C<1-4>, arilo C<6-14>, aril C<6-14>-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-13>, heteroaril C<1-13>-alquilo C<1-4>; en el que dichos alquilo C<1-6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<6>seleccionados independientemente; y en el que dichos cicloalquilo C<3-14>, cicloalquil C<3-14>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-14>, heterocicloalquil C<2-14>-alquilo C<1-4>, arilo C<6-14>, aril C<6-14>-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-13>, heteroaril C<1-13>-alquilo C<1-4>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<7>seleccionados independientemente;

cada D<4>se selecciona independientemente de -O -, -S -, -NR<a>C(=O)-, -NR<a>C(=S)-, -N RC(=O)NR<c>-, -N RC(=S)NR<c>-, -S(=O)-, -S(=O)<2>- , -S(=O)NR<a>-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NR<a>-, -OC(=S)NR<a>- , -NR<a>- , -NRS(=O)NR<c>- y NRS(=O)<2>NR<o>-;

cada R<4>y R<6>se selecciona independientemente de halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C<1-4>, haloalcoxi C<1-4>, alquiltio C<1-4>, alquilsulfinilo C<1-4>, alquilsulfonilo C<1-4>, amino, alquilamino C<1-4>, di-alquilamino C<1-4>, alquilcarbonilo C<1-4>, carboxi, alcoxicarbonilo C<1-4>, alquilcarbonilamino C<1-4>, di-alquilcarbonilamino C<1-4>, alcoxicarbonilamino C<1-4>, alcoxicarbonil C<1-4>-(alquil C<1-4>)amino, carbamilo, alquilcarbamilo C<1-4>y di-alquilcarbamilo C<1-4>;

cada R<5>se selecciona independientemente de halógeno, ciano, cianato, isotiocianato, nitro, hidroxilo, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, alcoxi C<1-4>, haloalcoxi C<1-4>, alquiltio C<1-4>, alquilsulfinilo C<1-4>, alquilsulfonilo C<1-4>, amino, alquilamino C<1-4>, di-alquilamino C<1-4>, alquilcarbonilo C<1-4>, carboxi, alcoxicarbonilo C<1-4>, alquilcarbonilamino C<1-4>, di-alquilcarbonilamino C<1-4>, alcoxicarbonilamino C<1-4>, alcoxicarbonil C<1-4>-(alquil C<1-4>)amino, carbamilo, alquilcarbamilo C<1-4>y di-alquilcarbamilo C<1-4>;

cada R<7>se selecciona independientemente de halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>, cicloalquilo C<3-7>, cicloalquil C<3-7>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-7>, heterocicloalquil C<2-7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-7>, heteroaril C<1-7>-alquilo C<1-4>, -O R<o>, -SR<o>, -S(=O)R, -S(=O)<2>R, -S(=O)NR<s>R<t>, -C(=O)R, -C(=O)OR, -C(=O)NR<s>R<t>, -OC(=O)R, -OC(=O) NR<s>R<t>, -NR<s>R<t>, -NR<q>C(=O)R<r>, -NR<q>C(=O)OR<r>, -N R<q>C(=O)NR<r>, -NR<q>S(=O)<2>R<r>y -NRS(=O)<2>NR<s>R<t>; en el que dichos alquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>están cada uno opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos R' seleccionados independientemente; y en el que dichos cicloalquilo C<3-7>, cicloalquil C<3-7>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-7>, heterocicloalquil C<2-7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-7>, heteroaril C<1-7>-alquilo C<1-4>están cada uno opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos R'' seleccionados independientemente;

cada R<a>, Ry R<c>se selecciona independientemente de H, alquilo C<1-6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>, cicloalquilo C<3-7>, cicloalquil C<3-7>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-7>, heterocicloalquil C<2-7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-7>, heteroaril C<1-7>-alquilo C<1-4>; en los que dichos alquilo C<1-6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<w>seleccionados independientemente; y en los que dichos cicloalquilo C<3 -7>, cicloalquil C<3 -7>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2 -7>, heterocicloalquil C<2 -7>-alquilo C<1 -4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1 - 7>, heteroaril C<1 -7>-alquilo C<1-4>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<x>seleccionados independientemente;

cada R<o>, R, R<q>, R<r>, R<s>y R<t>se selecciona independientemente de H, alquilo C<1-6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>, cicloalquilo C<3-7>, cicloalquil C<3-7>-alquilo C<1-4>, heterocicloalquilo C<2-7>, heterocicloalquil C<2-7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<1-7>, heteroaril C<1-7>-alquilo C<1-4>; en los que dichos alquilo C<1-6>, haloalquilo C<1-6>, alquenilo C<2-6>, alquinilo C<2-6>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<y>seleccionados independientemente; y en los que dichos cicloalquilo C<3-7>, cicloalquil C<3-7>-alquilo C<2-4>, heterocicloalquilo C<2-7>, heterocicloalquil C<2-7>-alquilo C<1-4>, fenilo, fenil-alquilo C<1-4>, heteroarilo C<2-7>, heteroaril C<1-7>-alquilo C<1-4>están cada uno opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos R<z>seleccionados independientemente;

cada R', R<w>y R<y>se selecciona independientemente de hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi C<1-4>, haloalcoxi C<1-4>, amino, alquilamino C<1-4>y di-alquilamino C<1-4>; y

cada R", R<x>y R<z>se selecciona independientemente de hidroxilo, halógeno, ciano, nitro, alquilo C<1-4>, haloalquilo C<1-4>, alcoxi C<1-4>, haloalcoxi C<1-4>, amino, alquilamino C<1-4>y di-alquilamino C<1-4>;

siempre que no se exceda la valencia de cada átomo en los restos opcionalmente sustituidos.

De forma adecuada, las variantes/derivados funcionales de la fórmula anterior tienen una afinidad por un anticuerpo de la presente invención que es comparable a o mayor que la de DOTAM, y tienen una fuerza de unión por Pb que es comparable a o mayor que la de DOTAM (siendo la "afinidad" como se mide por la constante de disociación, como se describe anteriormente). Por ejemplo, la constante de disociación del derivado funcional/variante con el anticuerpo de la presente invención o/Pb puede ser 1,1 veces o menos, 1,2 veces o menos, 1,3 veces o menos, 1,4 veces o menos, 1,5 veces o menos, o 2 veces o menos que la constante de disociación de DOTAM con el mismo anticuerpo/Pb.

Cada R<N>puede ser H, alquilo C<1-6>o haloalquilo C<1-6>; preferentemente H, alquilo C<1-4>o haloalquilo C<1-4>. Lo más preferentemente, cada R<N>es H.

Para las variantes de DOTAM, es preferente que 1, 2, 3 o lo más preferentemente cada L<2>sea alquileno C<2>. De forma ventajosa, las variantes de alquileno C<2>de DOTAM pueden tener una afinidad en particular alta por Pb. Los sustituyentes opcionales para L<2>pueden ser R<1>, alquilo C<1-4>o haloalquilo C<1-4>. De forma adecuada, los sustituyentes opcionales para L<2>pueden ser alquilo C<1-4>o haloalquilo C<1-4>.

Opcionalmente, cada L<2>puede ser alquileno C<2>no sustituido -CH<2>CH<2>-.

Cada L<1>es preferentemente alquileno C<1 -4>, más preferentemente alquileno C<1>tal como -CH<2>-.

Las variantes/derivados funcionales también pueden incluir DOTAM o un compuesto como se describe anteriormente conjugado con uno o más restos adicionales, por ejemplo, una molécula pequeña, un polipéptido o un carbohidrato. Esta fijación se puede producir por medio de uno de los carbonos en la cadena principal del anillo de macrociclo. Una molécula pequeña puede ser, por ejemplo, un tinte (tal como Alexa 647 o Alexa 488), biotina o un resto de biotina. Un polipéptido puede ser, por ejemplo, un oligopéptido, por ejemplo, un péptido o polipéptido terapéutico tal como un anticuerpo. Los carbohidratos ejemplares incluyen dextrano, polímeros o copolímeros lineales o ramificados (por ejemplo, polialquileno, poli(etileno-lisina), polimetacrilato, poliaminoácidos, poli- u oligosacáridos, dendrímeros).

La variante/derivado funcional de DOTAM puede ser un compuesto de la siguiente fórmula:

en la que cada Z es independientemente R1 como se define anteriormente; p, q, r y s son 0, 1 o 2; y p+q+r+s es 1 o mayor. Preferentemente, p, q, r y s son 0 o 1 y/o p+q+r+s es 1. Por ejemplo, el compuesto puede tener p+q+r+s = 1, donde Z es un resto p-SCN-bencilo; dicho compuesto está disponible comercialmente en Macrocyclics, Inc. (Plano, Texas).

Descripción detallada

Composiciones y procedimientos

Anticuerpos

En un aspecto, la invención se basa, en parte, en la provisión de anticuerpos que se unen específicamente a Pb-DOTAM (es decir, un quelato que comprende DOTAM complejado con Pb, también denominado en el presente documento "quelato de Pb-DOTAM").

En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une específicamente a Pb-DOTAM puede tener una o más de las siguientes propiedades:

• se une específicamente a Pb-DOTAM y a Bi-DOTAM;

• es selectivo para Pb-DOTAM en comparación con otros metales quelados, tales como Cu-DOTAM;

• se une a Pb-DOTAM con una afinidad muy alta;

• se une al mismo epítopo en Pb-DOTAM que los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, PRIT-0213 o PRIT-0214 y/o tiene los mismos residuos de contacto que dichos anticuerpos.

Los radioisótopos de Pb son útiles en procedimientos de diagnóstico y tratamiento. Los radioisótopos particulares de plomo que pueden ser útiles en la presente invención incluyen 212Pb y 203Pb. También se pueden usar isótopos estables de plomo en agentes de aclaramiento, por ejemplo, 204Pb, 206Pb, 207Pb o 208Pb. El Pb puede ser plomo natural, que es una mezcla de los isótopos estables (no radioactivos) 204Pb, 206Pb, 207Pb y 208Pb.

Los radionúclidos que son emisores de partículas a tienen el potencial de destruir células tumorales más específicas con menos daño al tejido circundante que los emisores p debido a la combinación de una longitud de trayectoria corta y una alta transferencia de energía lineal. 212Bi es un emisor de partículas a pero su corta semivida dificulta su uso directo. 212Pb es el radionúclido original de 212Bi y puede servir como un generadorin vivode 212Bi, superando, de este modo, eficazmente la corta semivida de 212Bi (Yong y Brechbiel, Dalton Trans. 21 de junio de 2001; 40(23)6068-6076).

203Pb es útil como isótopo de formación de imágenes. Por tanto, un anticuerpo unido a 203Pb-DOTAM puede tener utilidad en la radioinmunoimagen (RII).

En general, los radiometales se usan en forma quelada. En aspectos de la presente invención, se usa DOTAM como agente quelante. DOTAM es un quelante estable de Pb(II) (Yong y Brechbiel, Dalton Trans. 21 de junio de 2001; 40(23)6068-6076; Chappellet al.Nuclear Medicine and Biology, vol. 27, pp. 93-100, 2000). Por tanto, DOTAM es en particular útil junto con isótopos de plomo como se analiza anteriormente, tales como 212Pb y 203Pb. Como se analiza anteriormente, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se unen a Pb-DOTAM. En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos se unan a Pb-DOTAM con un valor de Kd de la afinidad de unión de 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM o menos, por ejemplo, 0,9 pM o menos, 0,8 pM o menos, 0,7 pM o menos, 0,6 pM o menos o 0,5 pM o menos.

Los anticuerpos se unen adicionalmente a Bi quelado por DOTAM. En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos se unan a Bi-DOTAM (es decir, un quelato que comprende DOTAM complejado con bismuto, también denominado en el presente documento "quelato de Bi-DOTAM") con un valor de Kd de la afinidad de unión de 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM o menos, por ejemplo, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM o menos.

En algunos modos de realización, los anticuerpos se pueden unir a Bi-DOTAM y a Pb-DOTAM con una afinidad similar. Por ejemplo, puede ser preferente que la proporción de afinidad, por ejemplo, la proporción de valores de Kd, para Bi-DOTAM/Pb-DOTAM esté en el intervalo de 0,1-10, por ejemplo, 1-10.

Los valores de afinidad de muestra para un anticuerpo ejemplar de acuerdo con la invención (PRIT-0213) se proporcionan a continuación:

Afinidades de quelato de metal-DOTAM de bsAb CEA-DOTAM

Las afinidades se determinaron por mediciones de equilibrio de KinExA.

Además, los presentes anticuerpos son preferentemente selectivos para Bi-DOTAM y/o Pb-DOTAM en comparación con otros metales quelados, tales como Cu-DOTAM. Por ejemplo, la proporción de afinidad, por ejemplo, la proporción de valores de Kd, para Pb-DOTAM/Cu-DOTAM puede ser de al menos 100.000.

En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos se unan a Pb-DOTAM y/o Bi-DOTAM con una afinidad (por ejemplo, valor de Kd de la afinidad) igual o mayor que la de un anticuerpo biespecífico (denominado en el presente documento PRIT-0213) que tiene:

En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos se unan a Pb quelado con DOTAM y/o Bi quelado con DOTAM con una afinidad (por ejemplo, valor de KD de la afinidad) igual o mayor que la de un anticuerpo biespecífico (denominado en el presente documento PRIT-0214) que tiene:

En algunos modos de realización, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se une al mismo epítopo, o a un epítopo superpuesto, de un radionúclido quelado que un anticuerpo divulgado en el presente documento. En algunos modos de realización, el anticuerpo se une al mismo epítopo, o a un epítopo superpuesto, del quelato de Pb-DOTAM (Pb-DOTAM) que Fab PRIT-0213, que tiene

Se puede determinar el epítopo de un radionúclido quelado (por ejemplo, Pb-DOTAM) unido por un anticuerpo dado, y esto se puede comparar con el epítopo del radionúclido quelado que se une por un anticuerpo divulgado en el presente documento (por ejemplo, Fab PRIT-0213).

La presente divulgación en el ejemplo 14 describe la caracterización de la interacción de unión entre Fab PRIT-0213 y Pb-DOTAM, en base a la determinación de la estructura cristalina de Fab PRIT-0213 en complejo con Pb-DOTAM a una resolución de 1,40 A, y el análisis de esta estructura usando el programa de superficies y ensamblajes de interfaces de proteínas (PISA) (Krissinel y Henrick, J Mol Biol (2007) 372(3):774-97).

En algunos modos de realización, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede presentar interacción con uno o más de los siguientes sitios con respecto a Pb-DOTAM, por ejemplo, como se determina por análisis PISA de la estructura del anticuerpo en complejo con Pb-DOTAM: borde-cara con la región de anillo de azaciclododecano debajo del anillo de azaciclododecano (por ejemplo, el anillo de tetraciclododecano), N6, N7, N8, N5 y/o C12. En algunos modos de realización, el anticuerpo puede presentar interacción con uno o más de los siguientes sitios con respecto a Pb-DOTAM: N7, N8, borde-cara con el anillo de azaciclododecano, el anillo de tetraciclododecano y/o N6.

En algunos modos de realización, el anticuerpo puede presentar una o más de las siguientes interacciones con respecto a Pb-DOTAM, por ejemplo, como se determina por el análisis PISA de la estructura del anticuerpo en complejo con Pb-DOTAM: interacción apolar borde-cara con el anillo de azaciclododecano, interacción polar con N8, enlace de hidrógeno con N7, enlace de hidrógeno con N8, interacción polar con N5, interacción apolar con C12, interacción polar con N7, enlace polar (hidrógeno) con N6 y/o interacción apolar con el anillo de tetraciclododecano.

En algunos modos de realización, el anticuerpo puede presentar una o más de las siguientes interacciones con respecto a Pb-DOTAM, por ejemplo, como se determina por análisis PISA de la estructura del anticuerpo en complejo con Pb-DOTAM: enlace de hidrógeno entre uno o más residuos de CDR3 de la cadena pesada de anticuerpo y N7, enlace de hidrógeno entre uno o más residuos de CDR3 de la cadena pesada de anticuerpo y N8, interacción apolar entre uno o más residuos de CDR2 de la cadena pesada de anticuerpo borde-cara con el anillo de azaciclododecano, interacción apolar entre CDR3 de la cadena ligera de anticuerpo y el anillo de tetraciclododecano y/o interacción apolar entre CDR1 de la cadena ligera de anticuerpo y N6.

Los anticuerpos pueden compartir los mismos residuos de contacto que los descritos en el presente documento: por ejemplo, estos residuos pueden ser invariantes. Estos residuos pueden incluir lo siguiente:

a) en CDR2 de la cadena pesada: Phe50, Asp56 y/o Tyr58 y, opcionalmente, también Gly52 y/o Arg 54;

b) en CDR3 de la cadena pesada: Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C y/o Tyr100D y opcionalmente también Pro100E;

c) en CDR1 de la cadena ligera: Tyr28 y/o Asp32;

d) en CDR3 de la cadena ligera: Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c y/o Tyr96;

e) en CDR2 de la cadena ligera: opcionalmente Gln50. Los anticuerpos de la invención comprenden residuos invariantes como se expone en las reivindicaciones.

Determinados aspectos y modos de realización de anticuerpos de acuerdo con la presente invención se analizan anteriormente. Otros aspectos y modos de realización adecuados de acuerdo con la invención se analizan en lo siguiente. En todos los modos de realización, los anticuerpos conservan la capacidad de unirse a Pb-DOTAM y, preferentemente, también a Bi-DOTAM, todavía más preferentemente con la afinidad y/o selectividad como se analiza anteriormente.

En un modo de realización, la invención puede proporcionar un anticuerpo anti-Pb-DOTAM que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En un modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En un modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

En otro modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En un modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En otro modo de realización, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y (iii) CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En otro modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (f) CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6.

En algunos modos de realización, los anticuerpos pueden comprender una o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y/o CDR-L3 que tienen sustituciones en comparación con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-6, respectivamente, por ejemplo, 1,2 o 3 sustituciones.

En los anticuerpos de la presente invención, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG 36 (SEQ ID NO: 2), o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 2, en la que estas sustituciones no incluyen Phe50, Asp56 y Tyr58 y, opcionalmente, tampoco incluyen Gly52 y/o Arg 54, todas numeradas de acuerdo con Kabat.

En algunos modos de realización, CDR-H2 se puede sustituir en una o más posiciones como se muestra a continuación, excluyendo los residuos mencionados anteriormente como fijos. Aquí y en las tablas de sustitución que siguen, las sustituciones se basan en los residuos de línea germinal (subrayados) o por aminoácidos que teóricamente se ajustan estéricamente y también se producen en el repertorio cristalizado en el sitio.

En los anticuerpos de la presente invención, CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos ERDPYGoGAYPPHL (SEQ ID NO: 3), o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 3, en la que estas sustituciones no incluyen Glu95, Arg96, Asp97, Pro98 y, opcionalmente, tampoco incluyen Ala100C, Tyr100D y/o Pro100E y/u opcionalmente tampoco incluyen Tyr99. Por ejemplo, en algunos modos de realización, las sustituciones no incluyen Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99 Ala100C y Tyr100D. En determinados modos de realización, CDR-H3 se puede sustituir en una o más posiciones como se muestra a continuación, excluyendo los residuos mencionados anteriormente como fijos.

En los anticuerpos de la presente invención, CDR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos QSSHSVYSDNDI.A<S^Eq |D N0: 4) 0 una variante de la misma que tiene hasta>1, 2<o>3<sustituciones en>SEQ ID NO: 4, en la que estas sustituciones no incluyen Tyr28 y Asp32 (numeración de Kabat).

En determinados modos de realización, CDR-L1 se puede sustituir en una o más posiciones como se muestra a continuación, excluyendo los residuos mencionados anteriormente como fijos.

En los anticuerpos de la presente invención, CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos i G G YD DFSm YG |q 6) o una variante de la misma que tiene hasta 1,2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 6, en la que estas sustituciones no incluyen Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c y Tyr96 (Kabat).

En determinados modos de realización, CDR-L3 se puede sustituir en las siguientes posiciones como se muestra a continuación, excluyendo los residuos mencionados anteriormente como fijos. (Puesto que la mayoría de los residuos están expuestos al disolvente y sin contactos con antígeno, se pueden concebir muchas sustituciones). WolfGuy Kabat AA Sustitución

Los anticuerpos de la presente invención comprenden además CDR-H1 y CDR-L2, que tienen opcionalmente la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5 respectivamente, o una variante de las mismas que tienen al menos 1, 2 o 3 sustituciones con respecto a las mismas, opcionalmente sustituciones conservadoras.

En cualquiera de los modos de realización anteriores, el anticuerpo anti-Pb-DOTAM se puede humanizar. En un modo de realización, un anticuerpo anti-Pb-DOTAM comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana. En otro modo de realización, un anticuerpo anti-Pb-DOTAM comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además regiones estructurales derivadas de vk 139 y/o vh 226. Para vk 139, en algunos modos de realización puede no haber retromutaciones. Para vh 226, el residuo Ala49 de línea germinal se puede retromutar a Gly49.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno puede comprender un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a Pb-DOTAM, preferentemente con una afinidad como se describe en el presente documento. La secuencia de VH puede conservar los residuos invariantes como se expone anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VH comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de: (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Opcionalmente, el anticuerpo anti-Pb-DOTAM comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-Pb-DOTAM que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a Pb-DOTAM, preferentemente con una afinidad como se describe en el presente documento. La secuencia de VL puede conservar los residuos invariantes como se expone anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-Pb-DOTAM comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VL comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Opcionalmente, el anticuerpo anti-Pb-DOTAM comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En otro aspecto de la invención, un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFab, scFv, diacuerpo o F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudsonet al. Nat. Med.9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate y que tienen una semividain vivoincrementada, véase la patente de<e>E. UU. n.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudsonet al., Nat. Med.9:129-134 (2003); y Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al., Nat. Med.9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada, o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo,E. colio fago), como se describe en el presente documento.

En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.

Agentes dirigidos

En algunos aspectos, un anticuerpo que se une específicamente a Pb quelado con DOTAM se acopla a un agente de unión celular/resto dirigido para producir un agente dirigido. Opcionalmente, el anticuerpo que se une específicamente a Pb quelado con DOTAM puede ser un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los modos de realización descritos anteriormente.

El acoplamiento puede ser preferentemente por expresión como un polipéptido o proteína de fusión. La fusión puede ser directa o por medio de un conector. El polipéptido o proteína de fusión se puede producir de forma recombinante, evitando cualquier necesidad de química de conjugación. Opcionalmente, dicho conector puede ser un polipéptido de al menos 5 aminoácidos, preferentemente entre 25 y 50 aminoácidos. El conector puede ser un conector rígido o un conector flexible. En algunos modos de realización, es uno flexible que comprende o consiste en residuos de Thr, Ser, Gly y/o Ala. Por ejemplo, puede comprender o consistir en residuos de Gly y Ser. En algunos modos de realización, puede tener un motivo de repetición tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunos modos de realización, el conector puede ser o puede

<comprender la secuencia>GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ |D<N0: 26) Se pueden usarotros conectores>y se podrían identificar por el experto en la técnica.

Por tanto, se proporciona un complejo de anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) que se une específicamente tanto a un quelato de Pb-DOTAM como a otro antígeno diana, por ejemplo, un antígeno presente en la superficie de una célula diana.

En la medida en que la solicitud describe procedimientos de tratamiento y productos para su uso en procedimientos de tratamiento, es aplicable a cualquier afección que se pueda tratar por actividad citotóxica dirigida a células afectadas del paciente. El tratamiento es preferentemente de un tumor o cáncer (por ejemplo, cáncer de páncreas, de mama o de próstata). Sin embargo, la aplicabilidad de la invención no se limita a tumores y cánceres. Por ejemplo, el tratamiento también puede ser de infección vírica. Se han investigado inmunotoxinas dirigidas contra antígenos víricos expresados en la superficie de células infectadas para una variedad de infecciones víricas, tales como VIH, rabia y VEB. Cai y Berger 2011 Antiviral Research 90(3):143-50 usaron una inmunotoxina que contenía PE38 para la destrucción dirigida de células infectadas con herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi. Además, Resimmune® (A-dmDT390-bisFv(UCHT1)) destruye selectivamente los linfocitos T malignos humanos y disminuye de forma transitoria los linfocitos T normales y se considera que tiene potencial para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias impulsadas por linfocitos T, tales como esclerosis múltiple y enfermedad de injerto contra huésped, así como neoplasias hemáticas de linfocitos T para los que se está sometiendo a ensayos clínicos.

Por tanto, los antígenos diana adecuados pueden incluir antígenos de células cancerosas, en particular antígenos de células cancerosas humanas, antígenos víricos o antígenos microbianos.

Los anticuerpos dirigidos descritos en el presente documento se diseñan para unirse a células afectadas tales como células tumorales por medio de sus antígenos de superficie celular. Los antígenos normalmente son antígenos de superficie celular normales que se sobreexpresan o bien se expresan en momentos anómalos. Idealmente, el antígeno diana se expresa solo en células afectadas (tales como células tumorales), sin embargo, esto rara vez se observa en la práctica. Como resultado, los antígenos diana normalmente se seleccionan sobre la base de la expresión diferencial entre el tejido afectado y el sano.

Por tanto, el anticuerpo dirigido se puede unir específicamente a cualquier marcador de superficie celular adecuado. La elección de un resto dirigido particular y/o marcador de superficie celular se puede elegir dependiendo de la población de células particular a las que se va a dirigir. Los marcadores de superficie celular son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Mufsonet al.,Front. Biosci., 11:337-43 (2006); Frankelet al.,Clin. Cancer Res., 6:326-334 (2000); y Kreitmanet al.,AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)) y pueden ser, por ejemplo, una proteína o un carbohidrato. En un modo de realización de la invención, el resto dirigido (agente de unión celular) es un ligando que se une específicamente a un receptor en una superficie celular. Los ligandos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Fas, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), una citocina (por ejemplo, IL-2, IL-15, IL-4, IL-13), una linfocina, una hormona y un factor de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento transformante (TGFa), factor de crecimiento neuronal, factor de crecimiento epidérmico).

El marcador de superficie celular puede ser, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor.

El término "antígeno asociado a tumor" o "antígeno específico de tumor" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, proteína, péptido, lípido, carbohidrato, etc.) única o predominantemente expresada o sobreexpresada por células tumorales y/o células cancerosas, de modo que el antígeno se asocia con el/los tumor(es) y/o cáncer(es). El antígeno asociado a tumor se puede expresar adicionalmente por células normales, no tumorales o no cancerosas. Sin embargo, en dichos casos, la expresión del antígeno asociado a tumor por células normales, no tumorales o no cancerosas no es tan sólida como la expresión por células tumorales o cancerosas. A este respecto, las células tumorales o cancerosas pueden sobreexpresar el antígeno o expresar el antígeno a un nivel significativamente mayor, en comparación con la expresión del antígeno por células normales, no tumorales o no cancerosas. Además, el antígeno asociado a tumor se puede expresar adicionalmente por células de un estado diferente de desarrollo o maduración. Por ejemplo, el antígeno asociado a tumor se puede expresar adicionalmente por células de la fase embrionaria o fetal, células estas que no se encuentran normalmente en un huésped adulto. De forma alternativa, el antígeno asociado a tumor se puede expresar adicionalmente por células madre o células precursoras, células estas que no se encuentran normalmente en un huésped adulto.

El antígeno asociado a tumor puede ser un antígeno expresado por cualquier célula de cualquier cáncer o tumor, incluyendo los cánceres y tumores descritos en el presente documento. El antígeno asociado a tumor puede ser un antígeno asociado a tumor de solo un tipo de cáncer o tumor, de modo que el antígeno asociado a tumor se asocia o es característico de solo un tipo de cáncer o tumor. De forma alternativa, el antígeno asociado a tumor puede ser un antígeno asociado a tumor (por ejemplo, puede ser característico) de más de un tipo de cáncer o tumor. Por ejemplo, el antígeno asociado a tumor se puede expresar tanto por células de cáncer de mama como de próstata y no expresarse en absoluto por células normales, no tumorales o no cancerosas.

Los antígenos asociados a tumores ejemplares a los que el agente de unión celular se puede unir específicamente incluyen, pero no se limitan a, mucina 1 (MUC1; mucina epitelial asociada a tumor), antígeno de melanoma expresado preferentemente (FRAME), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), PSCA, EpCAM, Trop2, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSFR), CD56, receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2/neu) (también conocido como erbB-2), CDS, CD7, proteína relacionada con la tirosinasa (TRP) 1 y TRP2. En un modo de realización preferente, el marcador de superficie celular, al que se une específicamente el resto dirigido (agente de unión celular), se selecciona del grupo que consiste en grupo de diferenciación (CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33 (lectina 3 similar a Ig de unión a ácido siálico, antígeno de superficie celular mieloide), CD79b, CD123 (receptor alfa de interleucina 3), receptor de transferrina, receptor de e Gf , mesotelina, cadherina, Lewis Y, glipicano-3, FAP (proteína alfa de activación de fibroblastos), PSMA (antígeno de membrana específico de próstata), CA9 = CAIX (anhidrasa carbónica IX), L1 CAM (molécula de adhesión de células neurales L 1), endosialina, HER3 (conformación activada del miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico 3), complejo Alkl/BMP9 (cinasa de linfoma anaplásico 1/proteína morfogenética ósea 9), TPBG = 5T4 (glucoproteína del trofoblasto), ROR1 (antígeno de superficie similar a tirosina cinasa receptora), HER1 (conformación activada del receptor del factor de crecimiento epidérmico) y CLL1 (familia del dominio de lectina de tipo C 12, miembro A). La mesotelina se expresa, por ejemplo, en cáncer de ovario, mesotelioma, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino y cáncer de páncreas. CD22 se expresa en, por ejemplo, tricoleucemia, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia prolinfocítica (LPL), linfoma no hodgkiniano, linfoma linfocítico pequeño (LLP) y leucemia linfocítica aguda (LLA). CD25 se expresa, por ejemplo, en leucemias y linfomas, incluyendo tricoleucemia y linfoma hodgkiniano. El antígeno Lewis Y se expresa, por ejemplo, en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de pulmón y cáncer pancreático. CD33 se expresa en, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielomonocítica crónica (LMC) y trastornos mieloproliferativos.

En un modo de realización de la invención, el resto dirigido es un anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo) que se une específicamente a la diana, por ejemplo, el antígeno asociado a tumor. En dichos modos de realización, el agente se puede denominar anticuerpo biespecífico o multiespecífico.

Los anticuerpos ejemplares que se unen específicamente a antígenos asociados a tumores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra el receptor de transferrina (por ejemplo, HB21 y variantes del mismo), anticuerpos contra CD22 (por ejemplo, RFB4 y variantes del mismo), anticuerpos contra CD25 (por ejemplo, anti-Tac y variantes del mismo), anticuerpos contra mesotelina (por ejemplo, s S 1, MORAb-009, s S, HN1, Hn 2, MN, MB y variantes de los mismos) y anticuerpos contra antígeno Lewis Y (por ejemplo, B3 y variantes del mismo). A este respecto, el resto dirigido (agente de unión celular) puede ser un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en B3, RFB4, SS, SS1,<m>N, MB, HN1, HN2, HB21 y MORAb-009, y porciones de unión a antígeno de los mismos. Otros restos dirigidos ejemplares adecuados para su uso en las moléculas quiméricas según la invención se divulgan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. 5.242.824 (receptor antitransferrina); 5.846.535 (anti-CD25); 5.889.157 (anti-Lewis Y); 5.981.726 (anti-Lewis Y); 5.990.296 (anti-Lewis Y); 7.081.518 (antimesotelina); 7.355.012 (anti-CD22 y anti-CD25); 7.368.110 (antimesotelina); 7.470.775 (anti-CD30); 7.521.054 (anti-CD25); y 7.541.034 (anti-CD22); la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2007/0189962 (anti-CD22); Frankelet al.,Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000) y Kreitmanet al.,AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006).

Se han obtenido anticuerpos para dirigirse a antígenos específicos relacionados con tumores, que incluyen: Cripto, CD30, CD19, CD33, glucoproteína NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138,S<c>A, PSMA (antígeno de membrana específico de próstata), BC<m>A, CD20, CD70, selectina E, EphB2, melanotransferrina, Muc16 y TMEFF2.

En algunos modos de realización de la presente invención, puede ser preferente que el antígeno asociado a tumor sea antígeno carcinoembrionario (CEA). CEA puede tener la secuencia de aminoácidos de CEA humano, en particular la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5), que se muestra en UniProt (www.uniprot.org) con n .° de acceso P06731 (versión 119) o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2. Los anticuerpos que se han obtenido contra CEA incluyen T84.66 y versiones humanizadas y quiméricas del mismo, tales como T84.66-LCHA como se describe en el documento WO2016/075278 A1 y/o WO2017/055389, CH1A1a, un anticuerpo anti-CEA como se describe en WO2011/034660, y CEA hMN-14 como se describe en la tabla 2 a continuación (véanse también los documentos US 6676924 y US 5874540).

CEA es ventajoso en el contexto de la presente invención porque se internaliza de forma relativamente lenta y, por tanto, un alto porcentaje del anticuerpo permanecerá disponible en la superficie de la célula después del tratamiento inicial, para la unión al radionúclido. También pueden ser preferentes otras dianas de baja internalización/antígenos asociados a tumores. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el antígeno asociado a tumor puede ser CD20 o HER2. Los n.os de acceso de GenBank: NP_001005862, NP_004439, XP_005257196 y XP_005257197 divulgan secuencias de proteína Her2, como se proporciona por GenBank el 4 de octubre de 2013, y la entrada de base de datos SwissProt P11836 divulga una secuencia de CD20. Todavía en otros modos de realización, la diana puede ser EGP-1 (glucoproteína-1 epitelial, también conocida como trofoblasto-2), antígeno-p específico del colon (CSAp) o una mucina pancreática MUC1. Véase, por ejemplo, Goldenberget al.2012 (Theranostics 2(5)). Esta referencia también describe anticuerpos, tales como la unión de Mu-9 a CSAp (véase también Sharkeyet al.Cancer Res. 2003; 63: 354-63), la unión de hPAM4 a MUC1 (véase también Goldet al.Cancer Res. 2008: 68: 4819-26), la unión de valtuzumab a CD20 (véase también Sharkeyet al.Cancer Res. 2008; 68: 5282-90) y hRS7 que se une a EGP-1 (véase también Cubaset al.Biochim Biophys Acta 2009; 1796: 309-14). Cualquiera de estos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden ser útiles en la presente invención, es decir, se pueden incorporar en los anticuerpos descritos en el presente documento.

Anticuerpos multiespecíficos

Como se analiza anteriormente, en determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos recombinantes en el pasado reciente, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos tetravalentes por fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios monocatenarios (véase, por ejemplo, Coloma, M.J.,et al.,Nature Biotech 15 (1997) 159-163; documento WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234).

También se han desarrollado otros varios formatos nuevos en los que la estructura central del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no se conserva, tal como dia-, tria- o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos monocatenarios (scFv, Bis-scFv) que se pueden unir a dos o más antígenos (Holliger, P.,et al.,Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J.,et al.,Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C.,et al.,Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

Todos dichos formatos usan conectores para fusionar el centro del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a otra proteína de unión (por ejemplo, scFv) o bien para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Se debe tener en cuenta que se puede desear conservar funciones efectoras, tales como, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), que se median a través de la unión del receptor de Fc, manteniendo un alto grado de similitud con los anticuerpos naturales.

En el documento WO 2007/024715 se informa de inmunoglobulinas de doble dominio variable como proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas genomanipuladas. En el documento US 6.897.044 se informa de un procedimiento para la preparación de dímeros de anticuerpos biológicamente activos. En el documento US 7.129.330 se informa de una construcción de anticuerpo de Fv multivalente que tiene al menos cuatro dominios variables que se enlazan entre sí por medio de conectores peptídicos. En el documento US 2005/0079170 se informa de estructuras de unión a antígeno diméricas y multiméricas. En el documento US 6.511.663 se informa de una proteína de unión a antígeno monoespecífica tri- o tetravalente que comprende tres o cuatro fragmentos Fab unidos entre sí de forma covalente por una estructura de conexión, con una proteína que no es una inmunoglobulina natural. En el documento WO 2006/020258 se informa de anticuerpos biespecíficos tetravalentes que se pueden expresar eficazmente en células procariotas y eucariotas, y son útiles en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico. En el documento US 2005/0163782 se informa de un procedimiento de separación o de síntesis preferentemente de dímeros que no se enlazan por medio de al menos un enlace disulfuro intercatenario de dímeros que no se enlazan por medio de al menos un enlace disulfuro intercatenario a partir de una mezcla que comprende los dos tipos de dímeros polipeptídicos. En el documento US 5.959.083 se informa de receptores tetravalentes biespecíficos. En el documento WO 2001/077342 se informa de anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales.

En el documento WO 1997/001580 se informa de polipéptidos de unión a antígeno multiespecíficos y multivalentes. El documento WO 1992/004053 informa de homoconjugados, típicamente preparados a partir de anticuerpos monoclonales de la clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico, que se enlazan de forma covalente por reticulación sintética. En el documento WO 1991/06305 se informa de los anticuerpos monoclonales oligoméricos con alta avidez por antígeno con lo que los oligómeros, típicamente de la clase IgG, se secretan teniendo dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados entre sí para formar moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes. En el documento US 6.350.860 se informa de anticuerpos derivados de ovejas y construcciones de anticuerpos genomanipulados, que se pueden usar para tratar enfermedades en las que la actividad de interferón gamma es patógena. En el documento US 2005/0100543 se informa de construcciones que pueden ser dirigidas que son vehículos multivalentes de anticuerpos biespecíficos, es decir, cada molécula de una construcción que puede ser dirigida puede servir como un vehículo de dos o más anticuerpos biespecíficos. En el documento W<o>1995/009917 se informa de anticuerpos tetravalentes biespecíficos genomanipulados. En el documento WO 2007/109254 se informa de moléculas de unión estabilizadas que consisten en o comprenden un scFv estabilizado.

Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden proporcionar en forma asimétrica con un cruce de dominio en uno o más brazos de unión de la misma especificidad de antígeno, es decir, intercambiando los dominios VH/VL (véase, por ejemplo, los documentos WO 2009/080252 y WO 2015/150447), los dominios CH1/CL (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/080253) o los brazos de Fab completos (véase, por ejemplo, los documentos W<o>2009/080251, WO 2016/016299, véase también Schaeferet al,PNAS, 108 (2011) 1187-1191 y Kleinet al.,MAbs 8 (2016) 1010-20). En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico comprende un fragmento cross-Fab. El término "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento" se refiere a un fragmento Fab, en el que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se intercambian. Un fragmento cross-Fab comprende una cadena polipeptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante 1 de la cadena pesada (CH1), y una cadena polipeptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Los brazos de Fab asimétricos también se pueden genomanipular introduciendo mutaciones aminoacídicas con carga o sin carga en las interfaces de dominio para dirigir el emparejamiento de Fab correcto. Véase, por ejemplo, el documento WO 2016/172485.

Se puede usar cualquiera de los formatos anteriores para anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la presente invención.

En un formato ejemplar, el anticuerpo biespecífico es un "trimerizador", por ejemplo, como se describe en el documento WO214/180754. Esto se refiere a una molécula de unión a antígeno trimérica que comprende tres polipéptidos de fusión, comprendiendo cada uno al menos un resto de unión a antígeno fusionado a un dominio de trimerización derivado de la proteína de la matriz del cartílago humano (CMP), en el que dicho dominio de trimerización puede mediar en la asociación estable de la molécula de unión a antígeno trimérica. Los restos de unión a antígeno pueden ser, por ejemplo, una molécula de Fab, una molécula de Fab de entrecruzamiento, un scFab, una molécula de Fv, un scFv, o un anticuerpo de dominio único (VHH). En algunos modos de realización, cada una de las proteínas de fusión comprende dos (un primer y un segundo) restos de unión a antígeno, por ejemplo, donde el primer resto de unión a antígeno se fusiona al aminoácido N terminal de dicho dominio de trimerización y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona al aminoácido C terminal de dicho dominio de trimerización, ambos opcionalmente a través de un conector peptídico. En este formato, el primer o bien el segundo resto de unión a antígeno se puede unir al quelato de Pb-DOTAM. El otro se unirá al antígeno diana, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor. Las tres moléculas de unión a antígeno fusionadas al extremo C pueden ser cada una específica para el mismo antígeno; las tres moléculas de unión a antígeno fusionadas al extremo N pueden ser cada una específica para la otra.

El dominio de trimerización de CMP útil en el mismo se ha derivado de la proteína de cartílago humano como se muestra a continuación y en un modo de realización comprende una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad y lo más preferentemente al menos un 98 % de identidad con la secuencia del dominio de trimerización mostrado a continuación. En un modo de realización, dicho dominio de trimerización comprende la secuencia de dicho dominio de trimerización.

Secuencia de la proteína de cartílago humano (496aa)

MRVLSGTSLM LCSLLLLLQA LCSPGLAPQS RGHLCRTRPT DLVFVVDSSR

SVRPVEFEKV KVFLSQVIES LDVGPNATRV GMVNYASTVK QEFSLRAHVS

KAALLQAVRR IQPLSTGTMT GLAIQFAITK AFGDAEGGRS RSPDISKVVI WTDGRPQDS VQDVSARARA SGVELFAIGV GSVDKATLRQ IASEPQDEHV

DYVESYSVIE KLSRKFQEAF CVVSDLCATG DHDCEQVCI5 SPGSYTCACH

EGFTLNSDGK TCNVCSGGGG SSATDLVFLI DGSKSVRPEN FELVKKFISQ

IVDTLDVSDK LAQVGLVQY S SSVRQEFPLG RFHTKKDIKA AVRNMSYMEK

GTMTGAALKY LIDNSFTVSS GARPGAQKVG IVFTDGRSQD YINDAAKKAK

DLGFKMFAVGVGNAVEDELR EIASEPVAEH YFYTADFKTI NQIGKKLQKK

ICVEEDPCAC ESLVKFQAKV EGLLQALTRK LEAVSKRLAI LENTVV

Secuencia ejemplar del dominio de trimerización (39aa)

CACESLVKFQ AKVEGLLQAL TRKLEAVSKR LA ILE N TV V

Otro formato ejemplar comprende un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, una IgG) que comprende una primera y segunda cadena pesada de anticuerpo y una primera y segunda cadena ligera de anticuerpo, en el que la primera cadena pesada y la primera cadena ligera se ensamblan para formar un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno, y en el que la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera se ensamblan para formar un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno.

El ensamblaje correcto de las cadenas pesadas heterodiméricas se puede ayudar, por ejemplo, por el uso de mutaciones botón en ojal y/u otras modificaciones como se analiza además a continuación.

El ensamblaje correcto de las cadenas ligeras con sus respectivas cadenas pesadas se puede ayudar por el uso de la tecnología cross-mab. En este enfoque, la primera cadena pesada y la primera cadena ligera, o bien la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera, se pueden ensamblar para formar un fragmento cross-Fab (mientras que las otras se ensamblan para formar un Fab convencional). Por tanto, en un modo de realización, la primera cadena pesada puede comprender un dominio VL en lugar del dominio VH (por ejemplo, VL-CH1-bisagra-CH2-CH3) y la primera cadena ligera puede comprender un dominio VH intercambiado por el dominio VL (por ejemplo, VH-CL), o la primera cadena pesada puede comprender un dominio CL en lugar del dominio HC1 (por ejemplo, VH-CL-bisagra-CH2-CH3) y la primera cadena ligera puede comprender un dominio CH1 en lugar del dominio CL (por ejemplo, VL-CH1). En este modo de realización, la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera tienen la estructura de dominio convencional (por ejemplo, VH-CH1-bisagra-CH2-CH3 y VL-CL, respectivamente). En un modo de realización alternativo, la segunda cadena pesada puede comprender un dominio v L en lugar del dominio VH (por ejemplo, VL-CH1-bisagra-CH2-CH3) y la segunda cadena ligera puede comprender un dominio VH intercambiado por el dominio VL (por ejemplo, VH-CL), o la segunda cadena pesada puede comprender un dominio CL en lugar del dominio HC1 (por ejemplo, VH-CL-bisagra-CH2-CH3) y la segunda cadena ligera puede comprender un dominio CH1 en lugar del dominio CL (por ejemplo, VL-CH1). En este modo de realización, la primera cadena pesada y la primera cadena ligera tienen la estructura de dominio convencional.

En algunos modos de realización, el ensamblaje correcto de las cadenas ligeras con su respectiva cadena pesada se puede ayudar adicionalmente o de forma alternativa usando la modificación de carga, como se analiza además a continuación.

Un dicho anticuerpo se muestra en la figura 37 como P1AE1768. Aquí, la segunda cadena pesada comprende un dominio CL en lugar del dominio HC1 (por ejemplo, VH-CL-bisagra-CH2-CH3) y la segunda cadena ligera comprende un dominio CH1 en lugar del dominio CL (por ejemplo, VL-CH1); la primera cadena pesada y la primera cadena ligera tienen la estructura de dominio convencional. El Fab con estructura convencional comprende modificación de carga. Por tanto, en un modo de realización, un anticuerpo de la invención comprende una primera y segunda cadena pesada de SEQ ID NO: 59 y 58 respectivamente, y una primera y segunda cadena ligera de SEQ ID NO: 57 y 60 respectivamente.

En algunos modos de realización del formato anterior, el formato puede ser bivalente. En otro posible modo de realización, se pueden fusionar otros restos de unión a antígeno, por ejemplo, a la primera y/o segunda cadena pesada para incrementar la valencia de uno o ambos antígenos. Por ejemplo, otro resto de unión a antígeno para el primer antígeno se puede fusionar al extremo N de una o ambas de las moléculas de cadena pesada. El anticuerpo puede ser multivalente, por ejemplo, bivalente, para el primer antígeno (por ejemplo, el antígeno asociado a tumor) y monovalente para el segundo antígeno (por ejemplo, Pb quelado con DOTAM).

El otro resto de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un scFab, por ejemplo, que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno (por ejemplo, el antígeno asociado a tumor). El scFab comprende un dominio VH y CH1, enlazado por medio de un conector polipeptídico a un dominio VL y CL, para expresarse como una cadena simple. En otras palabras, el scFab comprende un conector polipeptídico entre el Fd y la cadena ligera.

En otro modo de realización, el otro resto de unión a antígeno es un Fab o un cross-Fab. Por ejemplo, el extremo N o C de una de las cadenas pesadas se puede enlazar por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CL para formar un Fab. En otro modo de realización, el extremo N o C de una de las cadenas pesadas se puede enlazar por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido que consiste en un dominio VL y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VH y CL. En otro modo de realización, el extremo N o C de una de las cadenas pesadas se puede enlazar por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CL, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CH1.

En este formato, puede ser preferente que los brazos de unión de la misma especificidad de antígeno se formen por asociación con la misma cadena ligera. Por tanto, los restos/brazos de unión a antígeno para el primer antígeno pueden ser cross-Fab, y el/los resto(s)/brazo(s) de unión a antígeno para el segundo antígeno puede(n) ser Fab convencionales. De forma alternativa, los restos/brazos de unión a antígeno para el primer antígeno pueden ser Fab convencionales, y el/los resto(s)/brazo(s) de unión a antígeno para el segundo antígeno puede(n) ser cross-Fab.

El formato también puede incorporar modificación de carga, como se analiza además a continuación.

En un modo de realización de este formato, se proporciona un anticuerpo multivalente que comprende

un anticuerpo de longitud completa que comprende una primera y segunda cadena pesada de anticuerpo y una primera y segunda cadena ligera de anticuerpo, en el que la primera cadena pesada y la primera cadena ligera se ensamblan para formar un Fab que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno (por ejemplo, un antígeno específico de tumor, por ejemplo, CEA), y en el que la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera se ensamblan para formar un cross-Fab que comprende un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno (por ejemplo, Pb quelado con DOTAM) (por ejemplo, la segunda cadena pesada tiene un dominio VL en lugar de un dominio VH, y la segunda cadena ligera tiene un dominio VH en lugar del dominio VL);

y en el que la primera o bien la segunda cadena pesada de anticuerpo se fusiona por medio de un conector a un polipéptido que comprende un dominio CH1 y VH, y dicho primer polipéptido se ensambla con un segundo polipéptido que comprende un CL y VL, de modo que el primer y segundo polipéptido se ensamblan para formar un Fab que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno.

La fusión puede ser en el extremo N de una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, opcionalmente la segunda cadena pesada.

Opcionalmente, también se puede usar modificación de carga. Por ejemplo, los Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno pueden comprender sustituciones modificadoras de carga como se analiza a continuación.

Un ejemplo de un formato de este tipo es P1AE1769 mostrado en la figura 37. Por tanto, en un modo de realización, un anticuerpo de la invención comprende una primera y segunda cadena pesada de SEQ ID NO: 64 y 63 respectivamente, y una primera y segunda cadena ligera de SEQ ID NO: 62 y 61 respectivamente.

Otro formato ejemplar comprende un anticuerpo de longitud completa tal como una IgG que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno (por ejemplo, que puede ser divalente para el primer antígeno), enlazado a un resto de unión a antígeno para el segundo antígeno.

Por ejemplo, el resto de unión a antígeno para el segundo antígeno puede ser un scFab que comprende un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno (por ejemplo, el quelato de Pb-DOTAM). En algunos modos de realización, el scFab se puede fusionar al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, en el extremo C de su dominio CH3. El ensamblaje correcto de cadenas pesadas heterodiméricas se puede ayudar, por ejemplo, por el uso de mutaciones botón en ojal y/u otras modificaciones como se analiza además a continuación. Un dicho anticuerpo se ejemplifica en la figura 37, como P1AE1770. Por tanto, en un modo de realización, un anticuerpo de la invención comprende cadenas pesadas de SEQ ID NO: 66 y 67, y una cadena ligera de SEQ ID NO: 65.

Otro formato ejemplar comprende un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno (por ejemplo, que puede ser divalente para el primer antígeno), en el que el extremo N o C de una de las cadenas pesadas se enlaza por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido y en el que el primer polipéptido se asocia con un segundo polipéptido para formar un Fab o un cross-Fab que comprende un sitio de unión para el segundo antígeno. Por ejemplo, este formato puede comprender:

ii) un primer polipéptido que consiste en un dominio VL y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VH y CL; o

iii) un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CL, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CH1;

de modo que el primer y segundo polipéptido conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno para un segundo antígeno.

El ensamblaje correcto de las cadenas pesadas heterodiméricas se puede ayudar, por ejemplo, por el uso de mutaciones botón en ojal y/u otras modificaciones como se analiza además a continuación, incluyendo modificaciones de carga. Por ejemplo, los dominios de Fab del anticuerpo de longitud completa pueden incluir modificaciones de carga.

En un modo de realización, el primer polipéptido se enlaza por medio de un conector polipeptídico al extremo C de una de las cadenas pesadas, por ejemplo, en el extremo C de su dominio CH3. El primer polipéptido puede comprender un dominio VL N terminal y un dominio CH1 C terminal. Por tanto, la cadena pesada que tiene la fusión puede comprender desde el extremo N al extremo C VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL-CH1. La cadena ligera puede comprender VH-CL. Los Fab del anticuerpo de longitud completa pueden incluir sustituciones modificadoras de carga. Un dicho modo de realización se muestra en la figura 37 como P1AE1767. Por tanto, en un modo de realización, un anticuerpo de la invención comprende cadenas pesadas de SEQ ID NO: 63 y 64, y cadenas ligeras de SEQ ID NO: 61 y 62.

En otro modo de realización, el primer polipéptido se enlaza por medio de un conector polipeptídico al extremo N del dominio VH de la cadena pesada. El primer polipéptido puede comprender un dominio VL N terminal y un dominio CH1 C terminal. Por tanto, la cadena pesada con la fusión puede comprender desde el extremo N hasta el extremo C VL-CH1-conector-VH-CH1-bisagra-CH2-CH3. La cadena ligera puede comprender VH-CL.

En otro formato ejemplar, el anticuerpo puede comprender un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, en el que el extremo C de cada una de las cadenas pesadas se fusiona a un resto de unión al antígeno que se une específicamente al segundo antígeno.

En un modo de realización, el primer antígeno es la diana, por ejemplo, el antígeno específico de tumor y el segundo es el quelato de Pb-DOTAM, pero estos también se pueden invertir.

En otro formato ejemplar, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que comprende:

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo;

b) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; o

ii) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo; o

c) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo; o

ii) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo; o

y en el que el dominio variable de la cadena pesada (VL) de anticuerpo del péptido en (b) y el dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo del péptido en (c) conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno a un segundo antígeno.

En este formato, si el primer polipéptido es como se expone en b(i), entonces el segundo polipéptido es como se expone en c(i); si el primer polipéptido es como se expone en b(ii), entonces el segundo polipéptido es como se expone en c(ii); y si el primer polipéptido es como se expone en b(iii), entonces el segundo polipéptido es como se expone en c(iii). También se pueden usar sustituciones modificadoras de carga, por ejemplo, en los Fab del anticuerpo de longitud completa.

En este formato, el primer o el segundo antígeno puede ser Pb quelado con DOTAM. El otro puede ser la diana, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor, por ejemplo, CEA, CD20 o ERBB2. En algunos modos de realización, el segundo antígeno es Pb quelado con DOTAM y el primer antígeno es la diana.

El anticuerpo descrito anteriormente puede ser trivalente. En otro posible modo de realización, se pueden fusionar otros restos de unión a antígeno para incrementar la valencia de uno o ambos antígenos. Por ejemplo, otro resto de unión a antígeno para el primer antígeno se puede fusionar al extremo carboxílico de cualquiera o ambas de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, el antígeno asociado a tumor), por ejemplo, de modo que el anticuerpo tiene una valencia de 4 para el primer antígeno (donde se fusiona al extremo carboxílico de ambas cadenas pesadas) y una valencia de 1 para el segundo antígeno.

Los ejemplos del formato anterior en el que el anticuerpo de (b) consiste en un dominio VH y el anticuerpo de (c) consiste en un dominio VL son PRIT-213 y PRIT214. Un ejemplo del formato anterior en el que (b) consiste en un dominio VH y un dominio CL, y (c) consiste en un dominio V<l>y un dominio CH1 es P1AE1766, como se muestra en la figura 37. Por tanto, en un modo de realización, un anticuerpo de la invención comprende una primera y segunda cadena pesada de SEQ ID NO: 51 y 52 respectivamente, y una cadena ligera de SEQ ID NO: 50.

Opcionalmente, el formato usado para los anticuerpos multiespecíficos de la presente invención puede ser el formato trivalente como se describe en el documento WO2010/115589 A1 (Roche Glycart AG).

El documento WO2010/115589 describe la estabilización opcional de la estructura, con lo que la región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido en (b) y el dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido en (c) se enlazan y se estabilizan por medio de un puente disulfuro intercatenario, por ejemplo, por introducción de un enlace disulfuro entre las siguientes posiciones:

i) la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera,

ii) la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o

iii) la posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat).

El documento WO2010/115589 también describe que los dominios CH3 de dicho anticuerpo de longitud completa de acuerdo con la invención se pueden alterar por la tecnología de "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, el documento W<o>96/027011, Ridgway, J.B.,etal.,Protein Eng 9 (1996) 617-621; y Merchant, A.M.,et al.,Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681.

Por lo tanto, en algunos modos de realización, dicho anticuerpo biespecífico trivalente se caracteriza además por que: el dominio CH3 de una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y el dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo de longitud completa se encuentran cada uno en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 de anticuerpo; en el que dicha interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico trivalente, en el que la alteración se caracteriza por que:

a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de modo que, dentro de la interfase original del dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico trivalente,

se reemplaza un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede situar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada

y

b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico trivalente se reemplaza un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro de la que se puede situar una protuberancia dentro de la interfase del primer dominio CH3.

Dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se puede seleccionar opcionalmente del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). Dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se puede seleccionar opcionalmente del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

Opcionalmente, en algunos modos de realización, ambos dominios CH3 se alteran además por la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que se puede formar un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

Estos y otros detalles del formato de anticuerpo trivalente biespecífico como se describe en el documento WO2010/115589 A1 se pueden utilizar en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que consiste en dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa". Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" puede ser un polipéptido que consiste, en sentido de N terminal a C terminal, en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena pesada 1 (CH1) de anticuerpo, una región bisagra (HR) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena pesada 2 (CH2) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena pesada 3 (CH3) de anticuerpo, abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3; y opcionalmente un dominio constante de la cadena pesada 4 (CH4) de anticuerpo en el caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Preferentemente, la "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en sentido de N terminal a C terminal, en VH, CH1,<h>R, CH2 y CH3. No se pretende excluir la posibilidad de formación de cross-Mab por la referencia a "longitud completa"; por tanto, la cadena pesada puede tener el dominio VH intercambiado por un dominio VL, o el dominio CH1 intercambiado por un dominio CL. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" puede ser un polipéptido que consiste, en sentido de N terminal a C terminal, en un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo, abreviado como VL-CL. De forma alternativa, en el caso de un cross-Mab, el dominio VL se puede intercambiar por un dominio VH o el dominio CL se puede intercambiar por un dominio CH1. El dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo puede ser k (kappa) o y (lambda). Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa se enlazan entre sí por medio de enlaces disulfuro interpolipeptídicos entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos son anticuerpos naturales como IgG (por ejemplo, IgG1 e IgG2), IgM, IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención pueden ser de una única especie, por ejemplo, humana, o pueden ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa como se describe en el presente documento comprenden dos sitios de unión a antígeno, cada uno formado por un par de VH y VL. El extremo C de la cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido en el extremo C de dicha cadena pesada o ligera.

El extremo N del dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido en b) y el dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido en c) indica el último aminoácido en el extremo N del dominio VH o VL.

En cualquiera de los formatos descritos anteriormente, el primer antígeno puede ser un antígeno asociado a tumor y el segundo antígeno puede ser Pb-DOTAM, (pero estos también se pueden invertir en algunos modos de realización).

En cualquiera de los formatos descritos anteriormente, el ensamblaje correcto de los heterodímeros de la cadena pesada se puede ayudar por modificaciones en la secuencia de la cadena pesada. En un modo de realización, se usa la tecnología de botón en ojal. Las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se pueden alterar para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". Por ejemplo, uno comprende las llamadas "mutaciones de botón" (T366W y opcionalmente una de S354C o Y349C, preferentemente S354C) y la otra comprende las denominadas "mutaciones de ojal" (T366S, L368A e Y407V y opcionalmente Y349C o S354C, preferentemente Y349C) (véase, por ejemplo, Carter, P.et al.,Immunotechnol. 2 (1996) 73) de acuerdo con la numeración del índice EU.

La introducción de un puente disulfuro se puede usar adicional o de forma alternativa para estabilizar los heterodímeros (Merchant, A.M,et al.,Nature Biotech 16 (1998) 677-681, Atwell, S.,et al.,J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e incrementar el rendimiento. Los ejemplos incluyen la introducción de un enlace disulfuro entre las siguientes posiciones:

Modificaciones de carga

Los anticuerpos multiespecíficos de la invención pueden comprender sustituciones aminoacídicas en las moléculas de Fab comprendidas en los mismos que son en particular eficaces para reducir el emparejamiento incorrecto de las cadenas ligeras con las cadenas pesadas no coincidentes (productos secundarios de tipo Bence-Jones), que se pueden producir en la producción de moléculas de unión a antígeno bi/multiespecíficas basadas en Fab con un intercambio VH/VL en uno (o más, en el caso de moléculas que comprendan más de dos moléculas de Fab de unión a antígeno) de sus brazos de unión (véase también la publicación PCT n .° WO 2015/150447, en particular los ejemplos en la misma. La proporción de anticuerpos multiespecíficos deseados en comparación con productos secundarios no deseados, en particular productos secundarios de tipo Bence-Jones que se producen en uno de sus brazos de unión, se puede mejorar por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en los dominios CH1 y CL de una molécula de Fab (a veces denominado en el presente documento "modificaciones de carga").

Por lo tanto, en algunos modos de realización, los anticuerpos de la presente invención que comprenden moléculas de Fab, comprenden al menos un Fab con un dominio CH1 de dominio constante de la cadena pesada que comprende modificaciones de carga como se describe en el presente documento, y un dominio CL constante de la cadena ligera que comprende modificaciones de carga como se describe en el presente documento.

Las modificaciones de carga se realizan en la(s) molécula(s) de Fab convencional(es) comprendida(s) en los anticuerpos de la presente invención (tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 37: P1AE1766, P1AE1767 P1AE1768, P1AE1769), o en la(s) molécula(s) de Fab de entrecruzamiento comprendida(s) en los anticuerpos de la presente invención (pero no en ambas). En modos de realización particulares, las modificaciones de carga se realizan en la(s) molécula(s) de Fab convencional(es) comprendida(s) en los anticuerpos de la presente invención (que en modos de realización particulares se une(n) específicamente al antígeno de célula diana).

En consecuencia, en algunos modos de realización los anticuerpos de la presente invención, que comprenden a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno (por ejemplo, un antígeno asociado a tumor) y b) un segundo resto de unión que se une a un segundo antígeno (por ejemplo, Dotam-Pb) en el que el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica son ambos moléculas de Fab, y uno de los restos de unión a antígeno (en algunos modos de realización, en particular el segundo resto de unión a antígeno) es un fragmento cross-Fab, una de las moléculas de Fab comprende un dominio CH1 que comprende modificaciones de carga como se describe en el presente documento, y un dominio CL que comprende modificaciones de carga como se describe en el presente documento. Puede ser preferente que el Fab que comprende las modificaciones de carga sea el Fab convencional (sin entrecruzamiento), por ejemplo, en algunos modos de realización es el resto de unión a antígeno que se une al primer antígeno.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden comprender además una tercera molécula de Fab que se une específicamente al primer antígeno. En modos de realización particulares, dicha tercera molécula de Fab es idéntica a la primera molécula de Fab en a). En estos modos de realización, las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los siguientes modos de realización (modificaciones de carga) se pueden realizar en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de cada una de la primera molécula de Fab y la tercera molécula de Fab. De forma alternativa, las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los siguientes modos de realización se pueden realizar en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la segunda molécula de Fab en b), pero no en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab y la tercera molécula de Fab.

En algunos modos de realización, en una molécula de Fab que comprende un dominio constante de la cadena ligera CL que comprende modificaciones de carga y un dominio constante de la cadena pesada CH1 que comprende modificaciones de carga, las modificaciones de carga en el dominio constante de la cadena ligera CL están en la posición 124 y opcionalmente en la posición 123 (numeración de acuerdo con Kabat), y las modificaciones de carga en el dominio constante de la cadena pesada CH1 están en la posición 147 y/o 213 (numeración de acuerdo con Kabat).

En algunos modos de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K)), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 y/o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat.

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K) o arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat)

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL del aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en un dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y el dominio constante de la cadena pesada CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, el anticuerpo comprende una primera cadena pesada y una primera cadena ligera que se unen específicamente a un primer antígeno, y una segunda cadena pesada y una segunda ligera que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que

a) el dominio constante CL de la primera cadena ligera y el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada comprenden las sustituciones de variante de carga descritas en el presente documento; y

b) el dominio constante de la cadena ligera CL y el dominio constante de la cadena pesada CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí (formando, por tanto, un cross-Fab). Un ejemplo de una disposición de este tipo se muestra para P1AE1768.

En otro modo de realización, el anticuerpo comprende

un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en el que los dos dominios constantes de la cadena pesada CH1 y los dos dominios constantes de la cadena ligera CL del anticuerpo de longitud completa comprenden modificaciones de carga como se describe en el presente documento; y

un scFab que comprende un dominio VH y CH1 enlazado por medio de un conector polipeptídico a un dominio VL y CL (VH-CH1-conector-VL-CL), en el que scFab se fusiona al extremo N de una de las cadenas pesadas, y en el que el scFab forma un sitio de unión a antígeno a un segundo antígeno. Un ejemplo de una disposición de este tipo es P1AE1770.

En otro modo de realización, el anticuerpo multiespecífico comprende un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno (por ejemplo, que puede ser divalente para el primer antígeno), en el que los dos dominios constantes de la cadena pesada CH1 y los dos dominios constantes de la cadena ligera CL del anticuerpo de longitud completa comprenden las modificaciones de carga como se describe en el presente documento,

y en el que el extremo C de una de las cadenas pesadas (por ejemplo, el extremo C de su dominio CH3) se enlaza por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido y en el que el primer polipéptido se asocia con un segundo polipéptido para formar un cross-Fab que comprende un sitio de unión para el segundo antígeno.

El primer polipéptido puede comprender un dominio VL N terminal y un dominio CH1 C terminal. Por tanto, la cadena pesada que tiene la fusión puede comprender desde el extremo N al extremo C VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL-CH1. La cadena ligera puede comprender VH-CL. Un ejemplo de una disposición de este tipo es P1AE1767.

En otro modo de realización, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que comprende:

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, en el que el dominio CH1 de las cadenas pesadas y el dominio CL de las cadenas ligeras comprenden modificaciones de carga como se describe en el presente documento;

b) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; o

ii) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo o

iii) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo

c) un polipéptido que consiste en

i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo; o

iii) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena pesada (CH1) de anticuerpo,

y en el que el dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo del péptido en (b) y el dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo del péptido en (c) conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno a un segundo antígeno. Los ejemplos de una disposición de este tipo son PRIT-213 y p1AE1766.

En algunos modos de realización, el anticuerpo de la invención comprende a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno, y c) un tercer resto de unión a antígeno que se une al primer antígeno, en el que el primer, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno del anticuerpo son todos moléculas de Fab, y en uno de los restos de unión a antígeno (en particular el segundo resto de unión a antígeno) los dominios variables VL y VH de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab respectivamente se reemplazan entre sí, en el que

i) las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los modos de realización anteriores se realizan en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de cada una de la primera molécula de Fab y la tercera molécula de Fab, pero no en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la segunda molécula de Fab en b); o ii) las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los modos de realización anteriores se realizan en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la segunda molécula de Fab en b), pero no en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab y la tercera molécula de Fab. En algunos modos de realización, las modificaciones de carga están presentes en el Fab convencional (no intercambiado): por tanto, por ejemplo, cuando el segundo resto de unión a antígeno es un cross-Fab, la opción (i) es preferente.

En un modo de realización particular, un anticuerpo multivalente de la invención comprende

y en el que la primera o bien la segunda cadena pesada de anticuerpo se fusiona por medio de un conector a un polipéptido que comprende un dominio CH1 y VH, y dicho primer polipéptido se ensambla con un segundo polipéptido que comprende un CL y VL, de modo que el primer y segundo polipéptido se ensamblan para formar un Fab que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno

en el que el dominio CH1 de la primera cadena pesada y el dominio CL de la primera cadena ligera comprenden modificaciones de carga como se describe en el presente documento.

El dominio CH1 del primer polipéptido y el dominio CL del segundo polipéptido también pueden comprender modificaciones de carga como se describe en el presente documento.

La fusión puede ser en el extremo N de una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, opcionalmente la segunda cadena pesada. Un ejemplo de una disposición de este tipo es P1AE1769.

Anticuerpos multiespecíficos que se unen a Pb-DOTAM y CEA

En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos de la presente invención sean anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, que se unen tanto a Pb-DOTAM como a CEA. Por tanto, comprenden un sitio de unión a antígeno para el quelato de Pb-DOTAM y un sitio de unión a antígeno para CEA. En dichos modos de realización, el sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM puede estar de acuerdo con cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento. El formato puede ser cualquiera de los formatos descritos en el presente documento.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA se puede unir con un valor de Kd de 1 nM o menos, 500 pM o menos, 200 pM o menos, o 100 pM o menos para la unión monovalente.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA puede comprender al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA puede comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En un modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En un modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y (iii) CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

En otro aspecto, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y (f) CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16.

En cualquiera de los modos de realización anteriores, el anticuerpo multiespecífico se puede humanizar. En un modo de realización, el sitio de unión a antígeno anti-CEA comprende las c Dr como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sitio de unión a antígeno que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a CEA, preferentemente con la afinidad como se expone anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 17. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 17, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VH comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de: (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sitio de unión a antígeno que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a CEA, preferentemente con la afinidad expuesta anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 18. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno para CEA comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 18, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VL comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a CEA comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En algunos modos de realización, el anticuerpo multiespecífico se puede unir al mismo epítopo de CEA que un anticuerpo PRIT-0213 o PRIT-0214 proporcionado en el presente documento.

Anticuerpos multiespecíficos que se unen a Pb-DOTAM y ERBB2

En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos de la presente invención sean anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, que se unen tanto a Pb-DOTAM como a ERBB2. Por tanto, comprenden un sitio de unión a antígeno para el quelato de Pb-DOTAM y un sitio de unión a antígeno para ERBB2. En dichos modos de realización, el sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM puede estar de acuerdo con cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento. El formato puede ser cualquiera de los formatos descritos en el presente documento.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 se puede unir con un valor de Kd de 1 nM o menos, 500 pM o menos, 200 pM o menos, o 100 pM o menos para la unión monovalente.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 puede comprender al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a)

CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 puede comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En un modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En un modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y (iii) CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 30; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

En otro aspecto, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y (f) CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 33.

En cualquiera de los modos de realización anteriores, el anticuerpo multiespecífico se puede humanizar. En un modo de realización, el sitio de unión a antígeno anti-ERBB2 comprende las CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sitio de unión a antígeno que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a ERBB2, preferentemente con la afinidad como se expone anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 34. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 34, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VH comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de: (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sitio de unión a antígeno que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a ERBB2, preferentemente con la afinidad expuesta anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 35. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno para CEA comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 35, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VL comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a ERBB2 comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En algunos modos de realización, el anticuerpo multiespecífico se puede unir al mismo epítopo de ERBB2 que un anticuerpo P1AD9827 proporcionado en el presente documento.

Anticuerpos multiespecíficos que se unen a Pb-DOTAM y CD20

En algunos modos de realización, puede ser preferente que los anticuerpos de la presente invención sean anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, que se unen tanto a Pb-DOTAM como a CD20. Por tanto, comprenden un sitio de unión a antígeno para el quelato de Pb-DOTAM y un sitio de unión a antígeno para CD20. En dichos modos de realización, el sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM puede estar de acuerdo con cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento. El formato puede ser cualquiera de los formatos descritos en el presente documento.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 se puede unir con un valor de Kd de 1 nM o menos, 500 pM o menos, 200 pM o menos, o 100 pM o menos para la unión monovalente.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 puede comprender al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a)

CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 puede comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. En un modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. En un modo de realización, el anticuerpo comprende (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VH seleccionadas de (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y (iii) CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 41; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de VL seleccionadas de (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

En otro aspecto, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y (f) CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 44.

En cualquiera de los modos de realización anteriores, el anticuerpo multiespecífico se puede humanizar. En un modo de realización, el sitio de unión a antígeno anti-CD20 comprende las c Dr como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sitio de unión a antígeno que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a CD20, preferentemente con la afinidad como se expone anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 45. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 45, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VH comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de: (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, y (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sitio de unión a antígeno que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a CD20, preferentemente con la afinidad expuesta anteriormente. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 46. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sitio de unión a antígeno para CD20 comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 46, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VL comprende una, dos o tres CDR seleccionadas de (a) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y (c) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

En otro modo de realización, el sitio de unión a antígeno que se une a CD20 comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO:45 y SEQ ID NO:46, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En algunos modos de realización, el anticuerpo multiespecífico se puede unir al mismo epítopo de CD20 que un anticuerpo P1AD9826 proporcionado en el presente documento.

Variantes de anticuerpo

En determinados modos de realización se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados modos de realización se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR (CDR) y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

Tabla 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro:

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar con facilidad, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para detectar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury,Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), y/o residuos que se ponen en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración de la afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboomet al.enMethods in Molecular Biology178:1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos modos de realización de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para su maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado por barrido de alanina. A menudo se seleccionan, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados modos de realización se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden preparar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos que se ponen en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden dirigir para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989)Science,244:1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos con carga tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden dirigir o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

Variantes de glucosilación

En determinados modos de realización se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr con facilidad alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crea o retira uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wrightet al. TIBTECH15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras fijadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración Eu de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función de ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "carentes de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazakiet al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiet al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripkaet al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); la sol. de pat. de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adamset al.,especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen alfa-1,6-fucosiltransferasa,FUT8,células CHO con genes inactivados (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnukiet al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Y.et al., Biotechnol. Bioeng.,94 (4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairetet al.);la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umanaet al.);y el documento US 2005/0123546 (Umanaet al.).También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener función de CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patelet al.);WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

Puede ser preferente que el anticuerpo se modifique para reducir el grado de glucosilación. En algunos modos de realización, el anticuerpo puede ser aglucosilado o desglucosilado. El anticuerpo puede incluir una sustitución en N297, por ejemplo, N297D/A.

Variantes de la región Fc

En determinados modos de realización se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo con función efectora reducida, por ejemplo, unión a CDC, ADCC y/o FcyR reducida o eliminada. En determinados aspectos, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que lo hacen un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)) son innecesarias o perjudiciales.

Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/disminución de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a F<cy>R (de ahí que probablemente carece de actividad de ADCC). Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan F<cy>RI, F<cy>RII y F<cy>RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Los ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. U. n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I.et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, Iet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985); el documento 5.821.337 (véase Bruggemann, M.et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CelITechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluarin vivo,por ejemplo, en un modelo animal, tal como el divulgado en Clyneset al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y de ahí que carece de actividad de<c>D<c>. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos w O 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoroet al., J. Immunol. Methods202:163 (1996); Cragg, M.S.et al., Blood101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie,Blood103:2738-2743 (2004)). La unión a FcRn y las determinaciones de aclaramiento/semividain vivose pueden realizar también usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B.et al., Int'l.Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006); documento WO 2013/120929 A1).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056), por ejemplo, P329G. Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

En determinados aspectos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que disminuyen la unión a F<cy>R, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 234 y 235 de la región Fc (numeración EU de residuos). En un aspecto, las sustituciones son L234A y L235A (LALA). En determinados aspectos, la variante de anticuerpo comprende además D265A y/o P329G en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. En un aspecto, las sustituciones son L234A, L235A y P329G (LALA-PG) en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. (Véase, por ejemplo, el documento WO 2012/130831). En otro aspecto, las sustituciones son L234A, L235A y D265A (LALA-DA) en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana.

En otros modos de realización, puede ser posible usar un subtipo de IgG con función efectora reducida tal como IgG4 o IgG2.

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión a FcR mejorada o disminuida. (Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shieldset al., J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001)).

En algunos modos de realización, las alteraciones se realizan en la región Fc que dan como resultado unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o bien disminuidas, preferentemente disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogieet al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

En algunos modos de realización, la unión a FcRn se puede reducir, por ejemplo, para una semivida más corta. En otros modos de realización, la unión de FcRn puede ser normal. Por ejemplo, en algunos modos de realización, la unión a FcRn normal se puede usar en procedimientos que implican un agente de aclaramiento.

En determinados aspectos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a FcRn, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 253 y/o 310 y/o 435 de la región Fc (numeración EU de residuos). En determinados aspectos, la variante de anticuerpo comprende una región Fc con las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 253, 310 y 435. En un aspecto, las sustituciones son I253A, H310A y H435A en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. Véase, por ejemplo, Grevys, A.et al.,J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

En determinados aspectos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a FcRn, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 310 y/o 433 y/o 436 de la región Fc (numeración EU de residuos). En determinados aspectos, la variante de anticuerpo comprende una región Fc con las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 310, 433 y 436. En un aspecto, las sustituciones son H310A, H433A e Y436A en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. (Véase, por ejemplo, el documento WO 2014/177460 A1). Por ejemplo, en algunos modos de realización, se puede usar la unión a FcRn normal.

Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de EE. UU. n.° 5.648.260; la patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

El extremo C de la cadena pesada del anticuerpo como se informa en el presente documento puede ser un extremo C completo que termina con los residuos aminoacídicos PGK. El extremo C de la cadena pesada puede ser un extremo C acortado en el que se han retirado uno o dos de los residuos aminoacídicos C terminales. En un aspecto preferente, el extremo C de la cadena pesada es un extremo C acortado que termina en PG.

En un aspecto de todos los aspectos como se informa en el presente documento, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3 C terminal, como se especifica en el presente documento, comprende un residuo de glicina C terminal (G446, numeración del índice EU de posiciones aminoacídicas). Esto todavía se engloba explícitamente con el término "anticuerpo de longitud completa" o "cadena pesada de longitud completa" como se usa en el presente documento.

Derivados de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar, y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro modo de realización se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kamet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células proximales al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

Procedimientos y composiciones recombinantes

Se pueden producir anticuerpos usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de e E. UU. n.° 4.816.567. En un modo de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En otro modo de realización, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro modo de realización, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo.

En el caso de anticuerpos multiespecíficos, se pueden proporcionar ácidos nucleicos que codifican cada uno de los componentes de la cadena pesada y ligera del formato de anticuerpo particular. También se proporciona un vector o conjunto de vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos.

En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos, que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton,Methods in Molecular Biology, vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli).Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross,Nat. Biotech.

22:1409-1414 (2004) y Li I.,Nat. Biotech.24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adapten al cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Grahamet al., J. Gen Virol.36:59 (1977; células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather,Biol. Reprod.23:243-251, (1980); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI como se describe, por ejemplo, en Matheret al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), que incluyen células CHO DHFR- (Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu,Methods in Molecular Biology, vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.

255-268 (2003).

Ensayos

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o sus actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.

En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con, por ejemplo, PRIT-0213 o PRIT-0214 por la unión a Pb-DOTAM o CEA. En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por PRIT-0213 o PRIT-0214. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" enMethods in Molecular Biologyvol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo, PRIT-0213 y PRIT-0214) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a antígeno. Véase Harlow y Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manualcap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Afinidad del anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de 1 nM o menos, 500 pM o menos, 200 pM o menos, 100 pM o menos, 50 pM o menos, 20 pM o menos, 10 pM o menos, 5 pM o menos o 1 pM o menos, o como se indica de otro modo en el presente documento.

En un modo de realización, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En un modo de realización, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chenet al.,J. Mol. Biol.293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocilios MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones sucesivas de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Prestaet al., Cáncer Res.57:4593-4599 (1997)). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que den menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otro modo de realización, se mide Kd usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 jg/m l (~0,2 jM ) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones sucesivas 1:2 de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y las velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión uno a uno de Langmuir simple (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chenet al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación excede 106 M'1 s_1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, a continuación, se puede determinar la velocidad de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

En otro modo de realización, se mide Kd usando un ensayo SET (valoración de equilibrio en solución). De acuerdo con este ensayo, los anticuerpos de prueba se aplican típicamente en una concentración constante y se mezclan con diluciones sucesivas del antígeno de prueba. Después de la incubación para establecer un equilibrio, se captura la porción de anticuerpos libres en una superficie recubierta con antígeno y se detecta con anticuerpo antiespecie marcado/con marca, en general usando electoquimioluminiscencia (por ejemplo, como se describe en Haenelet al.Analytical Biochemistry 339 (2005) 182-184).

Por ejemplo, en un modo de realización, se incuban placas de estreptavidina de 384 pocillos (Nunc, Microcoat n.° 11974998001) durante la noche a 4 °C con 25 |jl/pocillo de una mezcla de antígeno-biotina-isómero en tampón PBS a una concentración de 20 ng/ml. Para el equilibrio de muestras de anticuerpos con antígeno libre: se valora 0,01 nM - 1 nM de anticuerpo con el antígeno pertinente en etapas de dilución 1:3, 1:2 o 1:1,7 comenzando a una concentración de 2500 nM, 500 nM o 100 nM de antígeno. Las muestras se incuban a 4 °C durante la noche en microplacas de polipropileno de almacenamiento REMP selladas (Brooks). Después de la incubación durante la noche, se lavan las placas de estreptavidina 3x con 90 j l de PBST por pocillo. Se transfieren 15 j l de cada muestra de la placa de equilibrado a la placa de ensayo y se incuban durante 15 min a TA, seguido de etapas de lavado de 3x 90 j l con tampón PBST. La detección se lleva a cabo añadiendo 25 j l de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-POD (Jackson, 109-036-088, 1:4000 en OSEP), seguido de etapas de lavado de 6x 90 j l con tampón PBST. Se añaden 25 j l de sustrato TMB (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat.: 11835033001) a cada pocillo. La medición tiene lugar a 370/492 nm en un lector Safire2 (Tecan).

En otro modo de realización, se mide Kd usando un ensayo KinExA (exclusión cinética). De acuerdo con este ensayo, el antígeno se valora típicamente en una concentración constante de sitios de unión de anticuerpo, las muestras se dejan equilibrar y, a continuación, se extraen rápidamente a través de una cubeta de lectura donde los sitios de unión de anticuerpo libres se capturan en microesferas recubiertas con antígeno, mientras que el complejo antígeno-anticuerpo saturado se elimina por lavado. A continuación, el anticuerpo capturado en microesferas se detecta con un anticuerpo antiespecie marcado, por ejemplo, marcado con fluorescencia (Beeet al.PloS One, 2012; 7(4): e36261). Por ejemplo, en un modo de realización, los experimentos KinExA se realizan a temperatura ambiente (TA) usando p Bs , pH 7,4, como tampón de migración. Las muestras se preparan en tampón de migración complementado con 1 mg/ml de BSA ("tampón de muestra"). Se usa un caudal de 0,25 ml/min. Se valora una cantidad constante de anticuerpo con concentración de sitio de unión de 5 pM con antígeno por dilución sucesiva a la mitad comenzando en 100 pM (intervalo de concentración 0,049 pM - 100 pM). Una muestra de anticuerpo sin antígeno sirve como señal de un 100 % (es decir, sin inhibición). Los complejos antígeno-anticuerpo se incuban a TA durante al menos 24 h para dejar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas equilibradas se extraen a través de una columna de microesferas acopladas a antígeno en el sistema KinExA a un volumen de 5 ml, lo que permite que el anticuerpo no unido se capture por las microesferas sin perturbar el estado de equilibrio de la solución. El anticuerpo capturado se detecta usando 250 ng/ml de anticuerpo secundario específico de anti-fragmento Fc humano conjugado con Dylight 650© en tampón de muestra. Cada muestra se mide por duplicado para todos los experimentos de equilibrio. La KD se obtiene a partir del análisis de regresión no lineal de los datos usando un modelo de unión homogéneo de un sitio contenido en el programa informático KinExA (versión 4.0.11) usando el procedimiento de "análisis estándar".

Composiciones y procedimientos terapéuticos

Como se analiza anteriormente, los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la presente invención son adecuados para cualquier tratamiento en el que se desee suministrar un radionúclido a una diana. De acuerdo con esto, la solicitud describe un anticuerpo dirigido tal como un anticuerpo multiespecífico o biespecífico como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento. Más en particular, se describe un anticuerpo dirigido (por ejemplo, anticuerpo multiespecífico o biespecífico) como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de radioinmunoterapia predirigida. En dichos modos de realización, el Pb quelado es preferentemente 212Pb.

Como se indica anteriormente, el tratamiento puede ser de cualquier afección que se pueda tratar por actividad citotóxica dirigida a células afectadas del paciente. El tratamiento es preferentemente de un tumor o cáncer. Sin embargo, la aplicabilidad de la invención no se limita a tumores y cánceres. Por ejemplo, el tratamiento también puede ser de infección vírica o infección por otro organismo patógeno, por ejemplo, un procariota. Opcionalmente, el tratamiento dirigido también ser a linfocitos T para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias impulsadas por linfocitos T o neoplasias hemáticas de linfocitos T. Por tanto, las afecciones que se van a tratar pueden incluir infecciones víricas tales como VIH, rabia, VEB y herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, y enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple y fármacos para la enfermedad de injerto contra huésped.

El término "cáncer", como se usa en el presente documento, incluye cánceres tanto sólidos como hematológicos, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células bronquioloalviolares, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad hodgkiniana, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje medular, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, incluyendo las versiones resistentes de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

Un procedimiento para dirigir un radioisótopo a un tejido u órgano para tratamiento puede comprender:

i. administrar al sujeto un anticuerpo multiespecífico o biespecífico como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo se une al antígeno diana y se localiza en la superficie de una célula que expresa el antígeno diana; y

ii. administrar posteriormente un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo al individuo, en el que un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo se une al anticuerpo localizado en la superficie celular.

Opcionalmente, entre las etapas (i) y (ii) se administra un agente de aclaramiento/bloqueo. El agente de aclaramiento/bloqueo se puede unir al sitio de unión a antígeno específico para Pb-DOTAM y bloquear la unión posterior por el radionúclido quelado. El agente de aclaramiento puede comprender DOTA<m>o una variante funcional del mismo, quelado con un ion metálico y conjugado con un resto de aclaramiento.

Los ejemplos de restos de aclaramiento adecuados pueden incluir restos que incrementan el tamaño y/o el radio hidrodinámico de la molécula, lo que dificulta la capacidad de la molécula para acceder al tumor, sin interferir con la capacidad de la molécula para unirse al anticuerpo en la circulación. Los restos ejemplares incluyen polímeros hidrófilos. El resto puede ser un polímero o copolímero, por ejemplo, de dextrano, dextrina, PEG, ácidos polisiálicos (PSA), ácido hialurónico, hidroxietilalmidón (HES) o poli(2-etil 2-oxazolina) (PEOZ). En otros modos de realización, el resto puede ser un péptido o proteína no estructurada tal como polipéptidos XTEN (polímeros de proteínas hidrófilas no estructuradas), polímero de homoaminoácidos (HAP), polímero de prolina-alanina-serina (PAS), péptido similar a elastina (ELP) o proteína similar a gelatina (GLK). Los pesos moleculares adecuados para los polímeros pueden estar en el intervalo, por ejemplo, de al menos 50 kDa, por ejemplo, entre 50 kDa a 2000 kDa. Por ejemplo, el peso molecular puede ser de 200-800 kDa, opcionalmente, mayor de 300, 350, 400 o 450 kDa y, opcionalmente, menor de 700, 650, 600 o 550 kDa, opcionalmente, de aproximadamente 500 kDa.

En algunos modos de realización, el agente de aclaramiento puede ser DOTAM o una variante funcional del mismo (quelado con un ion metálico), conjugado con dextrano o un derivado del mismo, por ejemplo, como se describe además a continuación.

En algunos modos de realización, la proporción en peso de anticuerpo con respecto al agente de aclaramiento puede estar en el intervalo de desde 1:1, 2:1, 3:1 o 4:1 hasta 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 6:1 o 5:1, por ejemplo, en el intervalo de 1:1 a 20:1, 1:1 a 10:1, 2:1 a 8:1 o 2:1 a 6:1.

En algunos modos de realización, se puede administrar el agente de aclaramiento en cuestión de horas o días después del tratamiento con el anticuerpo multiespecífico. En algunos modos de realización, puede ser preferente que el agente de aclaramiento se administre al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 22 o 24 horas después del anticuerpo multiespecífico, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. Para algunos modos de realización, puede ser preferente que el agente de aclaramiento se administre no más de 14 días después del anticuerpo, por ejemplo, no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días.

Opcionalmente, el agente de aclaramiento se administra en el período entre 4 y 10 días, 4 y 7 días, 2 y 7 días, o de 2 a 4 días después del anticuerpo multiespecífico.

En algunos modos de realización, el radionúclido de Pb se administra en cuestión de minutos, horas o días después del agente de aclaramiento. En algunos modos de realización, puede ser preferente que el radionúclido de Pb se administre al menos 30 minutos después del agente de aclaramiento y, opcionalmente, dentro de 48 horas, 24 horas, 8 horas o 4 horas de la administración del agente de aclaramiento. En algunos modos de realización, se puede administrar el radionúclido de Pb el día después de la administración del agente de aclaramiento.

En algunos modos de realización, se pueden administrar los anticuerpos descritos en el presente documento como parte de una politerapia. Por ejemplo, se pueden administrar en combinación con uno o más agentes quimioterápicos: el agente quimioterápico y el anticuerpo se pueden administrar de forma simultánea o secuencial, en cualquier orden.

En algunos modos de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden administrar adicionalmente o de forma alternativa en combinación con radiosensibilizadores. El radiosensibilizador y el anticuerpo se pueden administrar de forma simultánea o secuencial, en cualquier orden.

Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-Pb-DOTAM como se describe en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico o biespecífico, se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales(Remington's Pharmaceutical Sciences16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; glúcidos, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además agentes quimioterápicos y/o radiosensibilizadores como se analiza anteriormente. Dichos ingredientes activos están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan enRemington's Pharmaceutical Sciences,16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administraciónin vivoson en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

La solicitud describe el anticuerpo diana, por ejemplo, anticuerpo multiespecífico como se describe en el presente documento, para su uso en un procedimiento de diagnóstico llevado a cabo en un sujeto. El procedimiento de diagnóstico puede ser un procedimiento de radioinmunoimagen predirigida, por ejemplo, con el propósito de diagnosticar a un sujeto sospechoso de tener un trastorno proliferativo o una enfermedad infecciosa. En dichos modos de realización, el Pb quelado es preferentemente 203Pb.

Un procedimiento para dirigir un radioisótopo a un tejido u órgano para la formación de imágenes puede comprender:

i) administrar al sujeto un anticuerpo multiespecífico o biespecífico como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo se une a un antígeno diana y se localiza en la superficie de una célula que expresa el antígeno diana; y

ii) administrar posteriormente un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo al individuo, en el que el radionúclido de Pb quelado con DOTAM de dicha variante funcional del mismo se une al anticuerpo localizado en la superficie de la célula.

En otro modo de realización, el anticuerpo multiespecífico o biespecífico como se describe en el presente documento se puede unir con el radionúclido de Pb quelado en el momento de la administración.

Opcionalmente, el procedimiento puede comprender además:

iii) formación de imágenes del tejido u órgano donde el radionúclido de Pb quelado con DOTAM o la variante funcional del mismo se ha localizado, o se espera que se localice.

En otro modo de realización, el procedimiento descrito en el presente documento puede comprender la formación de imágenes de un tejido u órgano de un sujeto, en el que al sujeto se le ha administrado previamente:

i) un anticuerpo multiespecífico o biespecífico como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo se une a un antígeno diana y se localiza en la superficie de una célula que expresa el antígeno diana; y

ii) un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo al individuo, en el que el radionúclido de Pb quelado con DOTAM de dicha variante funcional del mismo se une al anticuerpo localizado en la superficie de la célula.

Opcionalmente, entre las etapas (i) y (ii) se administra un agente de aclaramiento/bloqueo. El agente de aclaramiento, la pauta de administración para el agente de aclaramiento y la proporción en peso de anticuerpo con respecto a agente de aclaramiento pueden ser como se describe anteriormente.

El antígeno diana puede ser cualquier antígeno diana como se analiza en el presente documento. En algunos modos de realización, el antígeno diana puede ser un antígeno específico de tumor como se analiza anteriormente, y la formación de imágenes puede ser un procedimiento de formación de imágenes de un tumor o tumores. Se puede saber o sospechar que el individuo tiene un tumor.

Por ejemplo, el procedimiento puede ser un procedimiento de formación de imágenes de tumores en un individuo que tiene o se sospecha que tiene cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células bronquioloalviolares, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad hodgkiniana, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje medular, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, incluyendo las versiones resistentes de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

Agentes de aclaramiento

La solicitud describe un agente de aclaramiento a base de dextrano que comprende dextrano o un derivado del mismo, conjugado con M-DOTAM o una variante funcional del mismo.

En algunos modos de realización, el agente de aclaramiento puede ser un compuesto de la siguiente fórmula:

dextrano-(conector-(M-DOTAM))x

en la que

dextrano es dextrano o derivado del mismo;

el conector es un resto conector;

M-DOTAM es DOTAM o una variante funcional del mismo que incorpora un ion metálico;

y

x > 1.

En algunos modos de realización, el resto conector puede ser o comprender uno o más grupos funcionales bivalentes seleccionados de un grupo urea (-NH-C(O)-NH-), un grupo urea sustituido (-NRx-C(O)-NRx-, donde uno o ambos grupos Rx no son H), un grupo tiourea (-NH-C(S)-NH-), un grupo tiourea sustituido (-NRx-C(S)-NRx-, donde uno o ambos grupos Rx no son H), un grupo amida (-C(O)-NH-), un grupo amida sustituido (-C(O)-NRx-, donde Rx no es H), un grupo tioamida (-C(S)-NH-), un grupo amida sustituido (-C(S)-NRx-, donde Rx no es H), un grupo triazol o un triazol sustituido. En estos modos de realización, el resto conector puede comprender opcionalmente uno o más grupos funcionales bivalentes adicionales, tales como un grupo alquileno, un grupo arileno, un grupo heteroarileno, un grupo aralquileno y un grupo heteroaralquileno. El sustituyente Rx no está en particular limitado. En modos de realización particulares, Rx, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C6, arilo C5-C12, heteroarilo C5-C12 y halo.

En modos de realización particulares, el resto conector puede ser o comprender uno o más grupos funcionales bivalentes seleccionados de un grupo urea, un grupo tiourea, un grupo amida, un grupo tioamida o un grupo triazol.

En un modo de realización preferente, el resto de unión comprende un grupo funcional tiourea bivalente o un grupo funcional tioamida bivalente.

En algunos modos de realización, el resto conector comprende un grupo funcional tiourea bivalente y un grupo arileno opcionalmente sustituido. En algunos modos de realización, el resto conector comprende un grupo funcional tiourea bivalente, un grupo arileno opcionalmente sustituido y un grupo alquileno opcionalmente sustituido. En modos de realización particulares, el resto conector comprende un grupo funcional tiourea bivalente enlazado de forma covalente a través de uno de sus átomos de nitrógeno a un grupo arileno opcionalmente sustituido. En otros modos de realización, el resto conector comprende un grupo funcional tiourea bivalente enlazado de forma covalente a través de uno de sus átomos de nitrógeno a un grupo arileno opcionalmente sustituido y el grupo arileno opcionalmente sustituido se enlaza de forma covalente a un grupo alquileno opcionalmente sustituido. En modos de realización preferentes, el grupo arileno es no sustituido. En modos de realización particulares, el grupo arileno es un grupo fenileno. En modos de realización preferentes, el grupo alquileno es no sustituido. En modos de realización particulares, el grupo alquileno es un grupo alquileno C1-C6. En modos de realización en particular preferentes, el grupo alquileno se selecciona de metileno y etileno. Cuando está presente en el resto conector, el grupo arileno y el grupo alquileno pueden ser no sustituidos. En modos de realización particulares, el resto conector consiste en un grupo funcional tiourea bivalente enlazado de forma covalente a través de uno de sus átomos de nitrógeno a un grupo arileno y el grupo arileno se enlaza de forma covalente a un grupo alquileno.

En algunos modos de realización, el resto conector comprende un grupo funcional tioamida bivalente y un grupo arileno opcionalmente sustituido. En algunos modos de realización, el resto conector comprende un grupo funcional tioamida bivalente, un grupo arileno opcionalmente sustituido y un grupo alquileno opcionalmente sustituido. En modos de realización particulares, el resto conector comprende un grupo funcional tioamida bivalente enlazado de forma covalente a través de uno de sus átomos de nitrógeno a un grupo arileno opcionalmente sustituido. En otros modos de realización, el resto conector comprende un grupo funcional tioamida bivalente enlazado de forma covalente a través de uno de sus átomos de nitrógeno a un grupo arileno opcionalmente sustituido y el grupo arileno opcionalmente sustituido se une de forma covalente a un grupo alquileno opcionalmente sustituido. En modos de realización preferentes, el grupo arileno es no sustituido. En modos de realización particulares, el grupo arileno es un grupo fenileno. En modos de realización preferentes, el grupo alquileno es no sustituido. En modos de realización particulares, el grupo alquileno es un grupo alquileno C1-C6. En modos de realización en particular preferentes, el grupo alquileno se selecciona de metileno y etileno. Cuando está presente en el resto conector, el grupo arileno y el grupo alquileno pueden ser no sustituidos. En modos de realización particulares, el resto conector consiste en un grupo funcional tioamida bivalente enlazado de forma covalente a través de uno de sus átomos de nitrógeno a un grupo arileno y el grupo arileno se enlaza de forma covalente a un grupo alquileno.

En algunos modos de realización, el resto conector puede ser o comprender un grupo de la siguiente fórmula:

en la que y es de 1 a 6 (preferentemente 1 o 2), * representa el punto de fijación al dextrano o a un derivado del mismo, y ** representa el punto de fijación a un átomo de anillo de DOTAM o una variante funcional del mismo.

En algunos modos de realización, el resto conector se puede formar a partir de la conjugación de una amina (preferentemente una amina primaria) y un isocianato o isotiocianato. Dicha conjugación forma un grupo funcional de urea bivalente y un grupo funcional de tiourea, respectivamente. En dichos modos de realización, cuando un isocianato es uno de los reactivos, se puede considerar que el resto conector comprende un grupo funcional urea bivalente o un grupo funcional amida bivalente, según corresponda. En dichos modos de realización, cuando un isotiocianato es uno de los reactivos, se puede considerar que el resto conector comprende un grupo funcional tiourea bivalente o un grupo funcional tioamida bivalente, según corresponda.

Preferentemente, x es mayor que 1, de modo que cada dextrano tiene un promedio de mayor que 1 M-DOTAM o variante funcional del mismo por molécula. Por ejemplo, x puede ser 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, o preferentemente 50 o más. Los autores de la presente invención han descubierto que se puede lograr un aclaramiento mejorado usando dextrano marcado con múltiples grupos M-DOTAM.

El DOTAM o variante funcional del mismo puede incorporar solo un conector, para evitar la reticulación del dextrano.

Los derivados de dextrano que pueden encontrar uso en el agente de aclaramiento incluyen aminodextranos, en los que el dextrano se sustituye con una o más aminas. De uso particular son los aminodextranos en los que uno o más grupos hidroxilo del dextrano se sustituyen con un grupo carboximetilamida sustituido con amino. Dichos compuestos se pueden producir modificando el dextrano con un grupo carboximetilo (por ejemplo, haciendo reaccionar con ácido cloroacético) y, a continuación, haciendo reaccionar además con una diamina opcionalmente sustituida (preferentemente una alquildiamina, tal como una a,w-alquilendiam¡na, por ejemplo, etilendiamina).

El grupo amino proporciona un punto de fijación para el conector. Al menos un 30%de los grupos amino disponibles se pueden sustituir con DOTAM o una variante funcional del mismo, preferentemente al menos un 40 %, más preferentemente al menos un 50 %.

Preferentemente, "dextrano" en la fórmula anterior es un aminodextrano, correspondiente a un dextrano sustituido con uno o más grupos carboximetilo que se sustituyen con etilendiamina.

El dextrano se puede sustituir con uno o más grupos de fórmula -CH 2C(=O)NH(CH2)fNHRF, donde RF indica hidrógeno o el conector a DOTAM, y f es 1-6, lo más preferentemente 2. Por ejemplo, los grupos pueden tener la siguiente fórmula:

donde la línea ondulada indica el punto de fijación al oxígeno en el dextrano.

El aminodextrano puede tener una cadena principal de unidades de repetición de glucopiranosilo predominantemente a(1,6)-enlazadas, opcionalmente con ramificaciones de otras unidades de glucopiranosilo enlazadas, por ejemplo, por medio de enlaces glucosídicos a(1,2), a(1,3) o a(1,4). Al menos algunos de los grupos hidroxilo se sustituyen con un grupo carboximetilamida sustituido con amino como se analiza anteriormente (en particular, un grupo de fórmula -CH 2C(=O)NHCH2CH2NHRF). En otras palabras, el aminodextrano puede comprender unidades de la siguiente fórmula:

en la que cada RG es H, un grupo carboximetilamida sustituido con amino (tal como -CH 2C(=O)NHCH2CH2NHRF), o un enlace a otra unidad de glucopiranosilo, predominantemente por un enlace a(1,6) y en la que la línea discontinua indica el enlace a una unidad contigua.

El agente de aclaramiento puede incluir una o más unidades de la fórmula a continuación:

donde ** representa el punto de fijación a DOTAM o a una variante funcional del mismo, e y es como se define anteriormente.

Los derivados de dextrano pueden incluir dextrano o aminodextrano modificado con uno o más grupos seleccionados de un aminoácido, o un sacárido distinto de glucosa. Por ejemplo, el dextrano se puede modificar (por ejemplo, con adición de caperuza) con una o más unidades de ácido glutámico o ácido poliglutámico, incluyendo Glu, (Glu)2, (Glu)3 o (Glu)4. Adicionalmente o de forma alternativa, el dextrano se puede modificar (por ejemplo, con adición de caperuza) con un sacárido distinto de glucosa, tal como N-acetilgalactosamina (GalNAc), o un polisacárido formado a partir de dichos sacáridos, tal como tri-GalNAc.

En algunos modos de realización, el peso molecular del componente de dextrano puede ser de al menos 50 kDa, por ejemplo, entre 50 kDa a 2000 kDa. Por ejemplo, el peso molecular puede ser de 200-800 kDa, opcionalmente, mayor de 300, 350, 400 o 450 kDa y, opcionalmente, menor de 700, 650, 600 o 550 kDa, opcionalmente, de aproximadamente 500 kDa.

Puede ser preferente que el número de grupos amino como porcentaje del número de unidades de glucosa del dextrano o derivado de dextrano del mismo (la "saturación" de las unidades de glucosa con grupos amino) pueda ser de al menos un 0,5 %, al menos un 1 %, al menos un 2, al menos un 5 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o sea de un 100 %. En algunos modos de realización, puede ser preferente que la saturación de dextrano con grupos amino sea al menos o aproximadamente de un 1 % o un 10 %, por ejemplo, un 1 %-10 %

Puede ser preferente que el número de grupos DOTAM como porcentaje del número de unidades amino del derivado de dextrano (la "saturación" del componente de dextrano amino con DOTAM) pueda ser de al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o sea de un 100 %. En algunos modos de realización, puede ser preferente que la saturación de los grupos amino disponibles del derivado de dextrano con DOTAM sea de al menos o aproximadamente un 40 % o un 50 %, por ejemplo, un 40 %-60 %.

Una potencial dificultad con el uso de agentes de aclaramiento es la posibilidad de que puedan entrar en los tumores y unirse a los anticuerpos asociados a tumor, afectando negativamente a la posterior unión de los radioligandos.

Los autores de la presente invención han descubierto además que se puede lograr un buen aclaramiento de la sangre conjuntamente con una baja penetración del agente de aclaramiento en los tumores, cuando se usa un agente de aclaramiento a base de dextrano que tiene i) un peso molecular promedio alto y ii) se ha sometido a un límite de peso molecular, de modo que se han retirado fragmentos por debajo de un determinado tamaño. El límite se puede aplicar al dextrano o derivado de dextrano antes de la etapa de conjugación; y/o se puede aplicar al agente de aclaramiento tras la conjugación; y/o se puede aplicar al agente de aclaramiento después de la complejación con el metal.

Por tanto, un agente de aclaramiento útil en la presente invención puede ser un agente de aclaramiento a base de dextrano que comprende dextrano o un derivado del mismo (por ejemplo, como se define anteriormente, preferentemente un aminodextrano), conjugado con un quelato metálico, en el que i) el peso molecular promedio del dextrano o derivado del mismo es preferentemente de 200-800 kDa, opcionalmente, mayor de 300, 350, 400 o 450 kDa y, opcionalmente, menor de 700, 650, 600 o 550 kDa, opcionalmente, de aproximadamente 500 kDa, y ii) se han retirado dextrano, derivados de dextrano o agentes de aclaramiento de menos de un límite de peso molecular, en el que el límite de peso molecular es de 50 kDa o superior, 100 kDa o superior o 200 kDa o superior, opcionalmente, en el intervalo de 50 kDa-250 kDa o 50 kDa-200 kDa, opcionalmente, de 100 kDa-200 kDa, opcionalmente, de alrededor de 100 kDa o 150 kDa o 200 kDa. (Para evitar dudas, se señala que si el límite se indica como 50 kDa o superior, esto quiere decir que el límite puede ser de 50 kDa o cualquier valor sobre 50 kDa, pero todavía es dextrano, derivados de dextrano o agentes de aclaramiento de menos del límite los que se retiran).

La cantidad de especies que tienen un peso molecular por debajo del límite puede ser, por ejemplo, un 5 % en peso o menos, un 4 % en peso o menos, un 3 % en peso o menos, un 2 % en peso o menos, un 1 % en peso o menos, un 0,5 % en peso o menos, un 0,4 % en peso o menos, un 0,3 % en peso o menos, un 0,2 % en peso o menos, un 0,1 % en peso o menos o un 0,01 % en peso o menos, como un porcentaje en peso del agente de aclaramiento. Preferentemente, el agente de aclaramiento está esencialmente libre de especies que tienen un peso molecular por debajo del límite.

El límite de peso molecular se puede lograr por filtración, por ejemplo, por diafiltración, ultrafiltración, filtración de flujo tangencial o filtración de flujo cruzado. Preferentemente, se llevan a cabo al menos 2 etapas de filtración, opcionalmente, al menos 3. Por "peso molecular promedio", se quiere decir el peso molecular promedio ponderado como se determina por análisis de SEC-MALS.

Se apreciará que cuando se incorporan en DOTAM o en una variante funcional del mismo, los metales estarán presentes como iones metálicos, y que los estados de oxidación variarán dependiendo del elemento específico. Por tanto, el lector experto entiende que, por ejemplo, los términos plomo, Pb o 206Pb pretenden englobar formas iónicas del elemento, en particular, Pb(II).

El metal presente en el agente de aclaramiento puede ser un isótopo estable (no radioactivo) de plomo, o un isótopo estable o esencialmente estable de otro ion metálico, siempre que el complejo ion metálico-DOTAM se reconozca con alta afinidad por el anticuerpo. Por ejemplo, otros metales adecuados pueden ser Zn (Zn2+), Ca (Ca2+) o 209Bi (Bi2+), de los que el último es radioactivo, pero se considera que es prácticamente estable debido a su semivida muy larga.

La solicitud describe un procedimiento de preparación de un agente de aclaramiento, que comprende conjugar un dextrano o derivado de dextrano con DOTA<m>o una variante o derivado funcional del mismo, en el que el procedimiento implica quelar DOTAM con Pb u otro ion metálico como se describe anteriormente [por ejemplo, Pb(II)] antes y/o después de la conjugación de DOTAM o una variante funcional del mismo con el dextrano.

La solicitud describe un procedimiento de preparación de un agente de aclaramiento, que comprende:

formar un conjugado conjugando DOTAM o una variante o derivado funcional del mismo con un dextrano o derivado de dextrano;

en el que antes de la conjugación, el dextrano o derivado de dextrano se somete a una etapa de filtración para retirar las especies por debajo de un límite/umbral de peso molecular, por ejemplo, de 50 kDa o superior, 100 kDa o superior o 200 kDa o superior, opcionalmente, en el intervalo de 50 kDa-250 kDa o 50 kDa-200 kDa, opcionalmente, 100 kDa-200 kDa, por ejemplo, las especies por debajo de 100 kDa, 150 kDa o 200 kDa, o en el que

el procedimiento comprende además someter el conjugado a una etapa de filtración para retirar las especies por debajo de un límite/umbral de peso molecular, por ejemplo, de 50 kDa o superior, 100 kDa o superior o 200 kDa o superior, opcionalmente, en el intervalo de 50 kDa-250 kDa o 50 kDa-200 kDa, opcionalmente, 100 kDa-200 kDa, por ejemplo, las especies por debajo de 100 kDa, 150 kDa o 200 kDa.

Como se describe anteriormente, los autores de la presente invención han encontrado beneficioso aplicar un límite de peso molecular, para retirar fragmentos por debajo de un determinado tamaño. El procedimiento de filtración puede ser, por ejemplo, diafiltración. El lector experto apreciará que la palabra "retirar" en "retirar las especies por debajo de un límite/umbral de peso molecular" es sinónimo de "reducir en número", y que algunas especies residuales de bajo peso molecular pueden permanecer, dependiendo del procedimiento de filtración particular empleado. La cantidad de especies que tienen un peso molecular por debajo del límite puede ser, por ejemplo, un 5 % en peso o menos, un 4 % en peso o menos, un 3 % en peso o menos, un 2 % en peso o menos, un 1 % en peso o menos, un 0,5 % en peso o menos, un 0,4 % en peso o menos, un 0,3 % en peso o menos, un 0,2 % en peso o menos, un 0,1 % en peso o menos o un 0,01 % en peso o menos, como un porcentaje en peso del agente de aclaramiento. Preferentemente, el agente de aclaramiento está esencialmente libre de especies que tienen un peso molecular por debajo del límite/umbral después de la filtración.

La variante o derivado funcional de DOTAM puede ser como se define anteriormente, en el que al menos uno de los grupos R1 sirve como resto conector. Por ejemplo, se puede formar un grupo (conector-(M-DOTAM)) adecuado haciendo reaccionar un compuesto de la siguiente fórmula con un aminodextrano como se describe anteriormente:

La síntesis de este compuesto se describe en Chappellet al.Nuclear Medicine and Biology, vol. 27, pp. 93-100, 2000, y los derivados de DOTAM están disponibles comercialmente en Macrocyclics, Inc. (Plano, Texas).

El DOTAM o variante funcional del mismo se puede añadir en exceso, de modo que cada derivado de dextrano tenga un promedio de más de 1 DOTAM. El número promedio de DOTAM o variantes funcionales del mismo en cada dextrano puede ser mayor que 1, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 50 o más, 100 o más o preferentemente 40 o más. Los autores de la presente invención han descubierto que se puede lograr un aclaramiento mejorado usando dextrano conjugado con múltiples grupos M-DOTAM.

Preferentemente, el dextrano tiene un peso molecular promedio de 200-800 kDa, opcionalmente, mayor de 300, 350, 400 o 450 kDa y, opcionalmente, menor de 700, 650, 600 o 550 kDa, opcionalmente, de aproximadamente 500 kDa

El procedimiento de preparación de un agente de aclaramiento también puede comprender una etapa de quelación, que implica quelar el DOTAM o variante funcional del mismo con un ion metálico. El ion metálico puede ser un isótopo no radioactivo, por ejemplo, un isótopo no radioactivo de Pb, Ca, Zn, o un isótopo prácticamente estable, tal como 209Bi.

La etapa de quelación se lleva a cabo antes de la conjugación del DOTAM o variante funcional del mismo con el dextrano y/o después de la conjugación del DOTAM o variante funcional del mismo con el dextrano, pero, opcionalmente, antes de la etapa de filtración. La quelación del ion metálico por el DOTAM o variante funcional del mismo puede ser necesaria para garantizar la unión apropiada del anticuerpo biespecífico al agente de aclaramiento, por ejemplo, para garantizar que el DOTAM o variante funcional del mismo adopte la conformación correcta para acoplarse con el anticuerpo.

Cuando el procedimiento comprende una etapa de quelación, el procedimiento preferentemente también implica una etapa posterior de retirar el metal no unido. Esto se puede lograr añadiendo agente quelante adicional que se puede separar posteriormente del DOTAM o la variante funcional del mismo unido a dextrano durante la etapa de filtración. El agente quelante adicional es preferentemente diferente de DOTAM o una variante funcional del mismo. Preferentemente, el agente quelante adicional tiene un peso molecular menor que el conjugado de dextrano-agente quelante, para facilitar la separación basada en tamaño. Por ejemplo, el agente quelante adicional puede ser un ácido poliaminocarboxílico, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o una sal del mismo. Preferentemente, el procedimiento de preparación de un agente de aclaramiento implica:

i) formar un conjugado conjugando DOTAM o una variante o derivado funcional del mismo con un dextrano o derivado de dextrano;

ii) opcionalmente, retirar las especies de bajo peso molecular del producto de la etapa (i);

iii) quelar el conjugado con un ion metálico, por ejemplo, un ion de Pb, Bi, Zn o Ca;

iv) añadir un agente quelante adicional para quelar el ion metálico no unido; y

v) llevar a cabo una etapa de filtración para retirar las especies por debajo de un límite/umbral de peso molecular.

Radionúclido de Pb quelado con DOTAM

Un radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo se puede usar en cualquiera de los procedimientos de diagnóstico, formación de imágenes o tratamiento como se describe en el presente documento. Se apreciará que cuando se usa en dichos procedimientos, el radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo está comprendido en una composición. En un modo de realización particular, la composición comprende el radionúclido de Pb quelado por DOTAM o una variante funcional del mismo y DOTAM o una variante funcional del mismo que no está quelado con el radionúclido de Pb. Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición de este tipo y/o a una composición de este tipo para su uso en cualquiera de los procedimientos de formación de imágenes o tratamiento descritos en el presente documento. Un radionúclido de Pb quelado con DOTAM como se menciona en dichos procedimientos puede estar en forma de una composición como se describe en el presente documento.

El DOTAM o una variante funcional del mismo que no está quelado con el radionúclido de Pb puede ser DOTAM no quelado o una variante funcional del mismo. Cuando se usain vivo,el DOTAM no quelado o una variante funcional del mismo puede formar complejos con iones metálicos del entorno, por ejemplo, con iones de calcio. Dichos iones de calcio quelados con DOTAM o una variante funcional del mismo son farmacológicamente inactivos y pueden bloquear potencialmente el radionúclido de Pb farmacológicamente activo quelado con DOTAM o una variante del mismo de las dianas en el tumor y, por lo tanto, pueden reducir la eficacia del tratamiento y/o el valor de captación estandarizado de la formación de imágenes y diagnóstico. Los autores de la presente invención descubrieron que desactivando el DOTAM no quelado o variante funcional del mismo en condiciones definidas, se puede incrementar el control de la formulaciónin vivodel radionúclido de Pb quelado y/o se puede evitar o reducir la competencia potencial entre el quelato farmacéuticamente activo y el quelato farmacéuticamente inactivo. Por lo tanto, en algunos modos de realización, el DOTAM o una variante funcional del mismo que no está quelado con el radionúclido de Pb es DOTAM o una variante funcional que está quelado con un ion metálico no radioactivo.

En algún modo de realización, el radionúclido de Pb quelado es 212Pb. En algunos modos de realización, el radionúclido de Pb quelado es 203Pb.

Se apreciará que cuando se incorpora en DOTAM o en una variante funcional del mismo, el radionúclido de Pb estará presente como iones metálicos, y que los estados de oxidación variarán dependiendo del elemento específico. Por tanto, el lector experto entiende que, por ejemplo, los términos plomo, Pb o 206Pb pretenden englobar formas iónicas del elemento, en particular, Pb(II).

El metal no radioactivo presente en la composición puede ser un isótopo estable (no radioactivo) de plomo, o un isótopo estable o esencialmente estable de otro ion metálico. Por ejemplo, otros metales adecuados pueden ser Gd (Gd2+), Cu (Cu2+), Zn (Zn2+), Ca (Ca2+) o 209Bi (Bi2+), de los que el último es radioactivo pero se considera que es prácticamente estable debido a su semivida muy larga. En algún modo de realización, el metal es Ca o Cu. En algún modo de realización, el metal es Ca.

La variante o derivado funcional de DOTAM puede ser como se define anteriormente.

La solicitud describe un procedimiento de preparación de una composición que comprende radionúclido de Pb quelado con DOTAM o una variante funcional del mismo, que comprende:

i) proporcionar radionúclidos de Pb,

ii) quelar el radionúclido de Pb con DOTAM o una variante funcional del mismo

iii) quelar el DOTAM no quelado o una variante funcional del mismo con un ion metálico no radioactivo.

DOTAM no quelado o una variante funcional del mismo en la etapa iii) es DOTAM o una variante funcional del mismo que no se queló con el radionúclido de Pb en la etapa ii).

El ion metálico no radioactivo puede ser un ion de Pb, Ca, Zn, Gd o Cu. En algún modo de realización, el ion metálico es un ion de Ca o Cu. En algún modo de realización, el ion metálico es un ion de Ca, en particular Ca2+.

En algún modo de realización, el DOTAM no quelado o variante funcional del mismo que permanece después de la etapa ii) es al menos un 90 % mol, al menos un 95 % mol, al menos un 99 % mol del DOTAM o variante funcional del mismo añadido al radionúclido de Pb. En un modo de realización particular, el DOTAM no quelado o variante funcional del mismo que permanece después de la etapa ii) es de al menos un 99 % mol. En algunos modos de realización, el DOTAM no quelado o variante funcional del mismo que permanece después de la etapa iii) es menos de un 5 % mol, menos un 2 % mol, menos de un 1 % mol, menos de un 0,1 % mol, menos de un 0,01 % mol del DOTAM o variante funcional del mismo añadido al radionúclido de Pb. En un modo de realización particular, el DOTAM no quelado o variante funcional del mismo que permanece después de la etapa iii) es menos de un 1 % mol, menos de un 0,1 % mol, menos de un 0,01 % mol.

Los radionúclidos de Pb proporcionados en la etapa a) se pueden generar colocando material radioactivo que se desintegra en el radionúclido de Pb de interés en un generador, en el que el material radioactivo se une a un material sólido. Por ejemplo, dicho material radioactivo en la producción de 212Pb puede ser radio-224. A continuación, el radionúclido de interés se extrae del generador en una solución acuosa que puede contener impurezas radiológicas y químicas. La solución acuosa que contiene el radionúclido de Pb de interés y las impurezas se purifica por medio de cromatografía de líquidos en una columna. La cromatografía de líquidos en una columna puede ser una cromatografía de extracción o una cromatografía de reparto. Una cromatografía de extracción o reparto se basa en la distribución de los elementos que se van a separar entre una fase orgánica, o extractante, y una fase acuosa, en la que el extractante se une a un soporte inerte y forma con él la fase estacionaria, mientras que la fase acuosa representa la fase móvil.

La cromatografía de extracción puede usar una fase estacionaria que incluye una corona de éter como agente de extracción y, en particular, un diciclohexano-18-corona-6 o un dibenzo-18-corona-6 con grupos ciclohexilo o bencilo que se sustituyen por uno o más grupos alquilo C [a C] 2, con una cadena lineal o ramificada, en solución en un diluyente orgánico no miscible con agua, típicamente un alcohol de cadena de hidrocarburo larga, en otras palabras, una cadena Cx y superior.

En particular, se puede usar una fase estacionaria que comprende 4,4'(5')-di-er-butilciclohexano-18-corona-6 como extractante, preferentemente diluido en octan-1-ol. Una fase estacionaria de este tipo tiene la ventaja de retener selectivamente más de un 99 % de 212Pb presente en una solución acuosa que contiene de 1,5 a 2,5 moles/l de un ácido fuerte, que típicamente corresponde a los tipos de soluciones acuosas que se usan para extraer 212Pb de un generador de radio-224. Este tipo de fase estacionaria está disponible, por ejemplo, en frascos, pero también envasada en columnas o cartuchos listos para usar para cromatografía, de la empresa TRISKEM International bajo el nombre comercial "Pb resin".

De forma alternativa, la solución que comprende el radionúclido deseado y las impurezas también se puede purificar con una cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico.

Un procedimiento de producción y purificación de 212Pb se describe en el documento WO2013174949.

SECUENCIAS

Determinadas secuencias como se hace referencia en el presente documento se proporcionan en la tabla a continuación.

Tabla 2

La invención se describe ahora además con referencia a ejemplos específicos. Se entenderá que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1: descripción de la inmunización

Inmunización de conejos

Se usó una mezcla 1:1 de las 2 fracciones enantioméricas de Pb-DOTAM-alquil-PEG4-KLH(fracción 1 de MS2-DOTAM-KLHyfracción 2 de MS2-DOTAM-KLH)para la inmunización de conejos blancos de Nueva Zelanda o conejos transgénicos que comprenden un locus de inmunoglobulina humana como se informa en los documentos WO 2000/46251, WO 2002/12437, WO 2005/007696, WO 2006/047367, US 2007/0033661 y WO 2008/027986. Se inmunizó cada conejo con 500 ug de la mezcla de inmunógenos, se emulsionó con adyuvante de Freund completo, el día 0 por aplicación intradérmica y 500 ug cada uno los días 7, 14, 28, 56 alternando aplicaciones intramusculares y subcutáneas. Después de esto, los conejos recibieron inmunizaciones subcutáneas mensuales de 500 ug, y se extrajeron pequeñas muestras de sangre 7 días después de la inmunización para la determinación de valores séricos. Se extrajo una muestra de sangre más grande (un 10 % del volumen de sangre total estimado) durante el tercer y durante el noveno mes de inmunización (a los 5-7 días después de la inmunización), y se aislaron leucocitos monomorfonucleares periféricos, que se usaron como fuente de linfocitos B específicos de antígeno en el proceso de clonación de linfocitos B (ejemplo 2).

Determinación de valores séricos (ELISA)

Se inmovilizó cada una de las 2 fracciones enantioméricas de Pb-DOTAM(PJRD05.133F1 o PJRD05.133F2)en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 1 ug/ml, 100 ul/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con Crotein C al 2 % en PBS, 200 ul/pocillo; aplicación de diluciones sucesivas de antisueros, por duplicado, en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo; detección con anticuerpo de burro anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16.000) y estreptavidina-HRP; cada uno diluido en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo. Para todas las etapas, se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se produjo la señal por adición de sustrato de POD BM Blue soluble (Roche), 100 ul/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 ul/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.

Ejemplo 2: clonación de linfocitos B de conejos

Aislamiento de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de conejo

Se extrajeron muestras de sangre de conejos inmunizados. Se diluyó a la mitad la sangre completa que contenía EDTA con 1x PBS (PAA, Pasching, Austria) antes de la centrifugación por densidad usando Lympholyte Mammal (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se lavaron los PBMC dos veces con 1x PBS.

Medio EL-4 B5

Se usó RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.), glutamina 2 mM, solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (PAA, Pasching, Austria), piruvato de sodio 2 mM, HEPES 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) y b-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escocia).

Recubrimiento de placas

Se recubrieron placas de 6 pocilios de cultivo celular estériles con 2 |jg/ml de KLH en tampón carbonato (bicarbonato de sodio 0,1 M, hidrogenocarbonato disódico 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso. Se recubrieron placas de 6 pocillos recubiertas con estreptavidina estériles (Microcoat, Bernried, Alemania) con una mezcla de enantiómeros 1 1 de isómero A (1 jg/m l) y B (1 jg/m l) de TCMC-Pb-dPEC3-biotina biotinilado en PBS durante 3 h a temperatura ambiente. Antes de la etapa de selección, estas placas de 6 pocillos se lavaron tres veces con PBS estéril.

Disminución de macrófagos/monocitos

Se sembraron los PBMC en placas de 6 pocillos recubiertas con KLH estériles para disminuir los macrófagos y monocitos a través de la adhesión inespecífica y para retirar las células que se unen a KLH. Se llenó cada pocillo como máximo con 4 ml de medio y hasta 6 x 10e6 PBMC del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C y CO2 al 5 %. Se usaron las células en el sobrenadante (linfocitos en la sangre periférica (PBL)) para la etapa de selección de antígeno.

Enriquecimiento de linfocitos B en el enantiómero de TCMC que contiene Pb

Se sembraron placas de 6 pocillos recubiertas con la mezcla de enantiómeros de isómero A y B de TCMC-Pb-dPEC3-biotina con hasta 6 x 10e6 PBL por 4 ml de medio y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C y CO2 al 5 %. Se retiraron las células no adherentes lavando cuidadosamente los pocillos 1-3 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adherentes restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C y CO2 al 5 %. Se detuvo la tripsinización con medio EL-4 B5. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Tinción con inmunofluorescencia y citometría de flujo

Se usó anti-IgG con FITC (AbD Serotec, Dusseldorf, Alemania) para la separación de células individuales. Para la tinción superficial, se incubaron las células de la etapa de disminución y enriquecimiento con el anticuerpo anti-IgG con FITC en PBS y se incubaron durante 45 min en la oscuridad a 4 °C. Después de la tinción, se lavaron dos veces los PBMC con PBS enfriado en hielo. Finalmente, se resuspendieron los PBMC en PBS enfriada con hielo y se sometieron de inmediato a los análisis por FACS. Se añadió yoduro de propidio en una concentración de 5 jg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.) antes de los análisis de FACS para discriminar entre células muertas y vivas.

Se usaron un Becton Dickinson FACSAria equipado con un ordenador y el programa informático FACSDiva (BD Biosciences, EE. UU.) para la separación de células individuales.

Cultivo de linfocitos B

Se preparó el cultivo de los linfocitos B de conejo por un procedimiento descrito por Lightwoodet al.(J Immunol Methods, 2006, 316: 133-143). En resumen, se incubaron linfocitos B de conejo separados individuales en placas de 96 pocillos con 200 jl/pocillo de medio EL-4 B5 que contenía células Pansorbin (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % (MicroCoat, Bernried, Alemania) y células de timoma EL-4 B5 murino irradiadas con gamma (5 x 10e5 células/pocillo) durante 7 días a 37 °C en la estufa de incubación. Se retiraron los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B para el cribado y se extrajeron de inmediato las células restantes y se congelaron a -80 °C en 100 j l de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

Ejemplo 3: expresión de anticuerpo de conejo

Amplificación por PCR de dominios V

Se preparó ARN total a partir del lisado de linfocitos B (resuspendido en tampón RLT - Qiagen - n.° de cat. 79216) usando el kit de ARN NucleoSpin 8/96 (Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se eluyó el ARN con 60 j l de agua sin RNasa. Se usaron 6 j l de ARN para generar ADNc por reacción de retrotranscriptasa usando SuperMix de síntesis de primera hebra Superscript III (Invitrogen 18080-400) y un cebador oligo-dT de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se realizaron todas las etapas en un sistema Hamilton ML Star. Se usaron 4 j l de ADNc para amplificar las regiones variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (VH y VL) con AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) en un volumen final de 50 j l usando los cebadores rbHC.up y rbHC.do para la cadena pesada y rbLC.up y rbLC.do para la cadena ligera (tabla 3). Todos los cebadores directos eran específicos para el péptido señal (de VH y VL respectivamente) mientras que los cebadores inversos eran específicos para las regiones constantes (de VH y VL respectivamente). Las condiciones de PCR para RbVH+RbVL fueron como sigue: inicio en caliente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 70 °C, 45 s a 68 °C y una extensión final a 68 °C durante 7 min.

Tabla 3

Se cargaron 8 |jl de 50 |jl de solución de PCR en un 48 E-Gel al 2 % (Invitrogen G8008-02). Se limpiaron las reacciones de la PCR positivas usando el kit NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se eluyeron en 50 j l de tampón de elución. Se realizaron todas las etapas de limpieza en un sistema Hamilton ML Starlet.

Expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo

Para la expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo, se clonaron los productos de PCR que codifican VH o VL como ADNc en vectores de expresión por el procedimiento de clonación con protuberancia (RS Haunet al.,BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Liet al.,Nature Methods (2007) 4, 251-256). Los vectores de expresión contenían un casete de expresión que consistía en un promotor de CMV en 5' que incluía el intrón A y una secuencia de poliadenilación de BGH en 3'. Además del casete de expresión, los plásmidos contenían un origen de replicación derivado de pUC18 y un gen de betalactamasa que confería resistencia a ampicilina para la amplificación del plásmido enE. coli.Se usaron tres variantes del plásmido básico: un plásmido que contiene la región constante de IgG de conejo diseñado para aceptar las regiones VH mientras que dos plásmidos adicionales que contienen la región constante LC kappa de conejo o humana para aceptar las regiones VL. Los plásmidos de expresión linealizados que codifican la región constante kappa o gamma y los insertos VL/VH se amplificaron por PCR usando cebadores superpuestos. Se incubaron productos de PCR purificados con ADN-polimerasa T4 lo que generó protuberancias monocatenarias. Se detuvo la reacción por la adición de dCTP. En la siguiente etapa, se combinaron el plásmido y el inserto y se incubaron con recA, lo que indujo la recombinación específica de sitio. Los plásmidos recombinados se transformaron enE. coli.Al día siguiente, se recogieron las colonias cultivadas y se sometieron a prueba para determinar el plásmido recombinado correcto por preparación de plásmidos, análisis de restricción y secuenciación de ADN. Para la expresión de anticuerpo, se cotransfectaron de forma transitoria los plásmidos de HC y LC aislados en 2 ml (placa de 96 pocillos) de células HEK293-F Freestyle (Invitrogen R790-07) usando reactivo de transfección 239-Free (Novagen) siguiendo el procedimiento sugerido por el proveedor de reactivos. Se recogieron los sobrenadantes después de 1 semana y se suministraron para purificación.

Ejemplo 4: selección de anticuerpos monoclonales de conejo

La tabla a continuación muestra las propiedades de diversos anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo. Se seleccionó PRIT-0128 como el candidato principal, ya que tiene una unión comparable a Pb y Bi quelados, unión reducida a otros metales quelados y alta afinidad (<100 pM).

El ensayo SET (valoración de equilibrado en solución) se llevó a cabo como se describe a continuación.

Preparación de la placa de ensayo: se incubaron placas de estreptavidina de 384 pocillos (Nunc, Microcoat n.° 11974998001) durante la noche a 4 °C con 25 jl/pocillo de una mezcla de DOTAM-biotina-isómero en tampón PBS a una concentración de 20 ng/ml.

Equilibrado de muestras de anticuerpo anti-DOTAM con quelatos de DOTAM-metal libres (Pb, Bi, Ca, Cu, Zn, Mg, Fe): se valoraron 0,01 nM - 1 nM de anticuerpo con los quelatos de DOTAM-metal pertinentes en etapas de dilución 1:3, 1: 2 o 1:1,7 comenzando a una concentración de 2500 nM, 500 nM o 100 nM de quelato de DOTAM-metal. Se incubaron las muestras a 4 °C durante la noche en microplacas de polipropileno de almacenamiento REMP selladas (Brooks).

Después de la incubación durante la noche, se lavaron las placas de estreptavidina 3x con 90 jl de PBST por pocillo. Se transfirieron 15 j l de cada muestra de la placa de equilibrado a la placa de ensayo y se incubaron durante 15 min a TA, seguido de etapas de lavado de 3x 90 j l con tampón PBSt . La detección se llevó a cabo añadiendo 25 j l de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-POD (Jackson, 109-036-088, 1:4000 en OSEP), seguido de etapas de lavado de 6x 90 j l con tampón PBST. Se añadieron 25 j l de sustrato TMB (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat.: 11835033001) a cada pocillo. La medición tuvo lugar a 370/492 nm en un lector Safire2 (Tecan).

Materiales:

1. Mezcla DOTAM-biotina-isómero:

Mezcla de los siguientes componentes, conc. = 20 ng/ml

- Pb-Dotam-Bn-biotina/ TCMC-Pb-dPEG3-biotina, isómero A

- Pb-Dotam-Bn-biotina/ TCMC-Pb-dPEG3-biotina, isómero B

- Isómero A de Pb-Dotam-alquil-biotina

- Isómero B de Pb-Dotam-alquil-biotina

2. PBS: DPBS, PAN, P04-36500

3. BSA: Roche, 10735086001

4. Tween 20: Polisorbato 20 (usb, n.° 20605, 500 ml)

5. PBST: 10x, Roche, n.° 11666789001/Tween 20 al 0,1 %

6. OSEP: PBS (10x, Roche, n.° 11666789001) /BSA al 0,5 % (fracción V de seroalbúmina bovina, sin ácidos grasos, Roche, n.° 10735086001)/Tween 20 al 0,05 %

Tabla 4

WTRa: conejos naturales; TgRa: conejos transgénicos

Ejemplo 5: biología molecular

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J.et al.,Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis génica y oligonucleotídica

Se prepararon segmentos de genes deseados por síntesis química en Geneart GmbH (Ratisbona, Alemania). Los fragmentos de genes sintetizados se clonaron en un plásmido enE. colipara su propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de los fragmentos de genes subclonados se verificaron por secuenciación de ADN. De forma alternativa, se ensamblaron fragmentos cortos de ADN sintético por hibridación de oligonucleótidos sintetizados químicamente o por medio de PCR. Los oligonucleótidos respectivos se prepararon por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).

Determinación de proteínas

Se determinó la concentración de proteínas de polipéptidos purificados determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

Generación de plásmidos para la expresión recombinante de las cadenas pesadas o ligeras de anticuerpoLas proteínas deseadas se expresaron por transfección transitoria de células de riñón embrionario humano (HEK 293). Para la expresión de un gen/proteína deseado (por ejemplo, la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa o una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa que contiene un dominio adicional (por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina en su extremo C) se usó una unidad de transcripción que comprende los siguientes elementos funcionales:

- el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A, - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

- una secuencia señal (SS) de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un gen/proteína que se va a expresar, y

- la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

Además de la unidad/casete de expresión que incluye el gen deseado que se va a expresar, el plásmido de expresión de mamífero básico/estándar contenía un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido enE. co liy un gen de betalactamasa que confiere resistencia a ampicilina enE. coli.a) Plásmido de expresión para las cadenas pesadas de anticuerpo

Se ensamblaron genes que codifican la cadena pesada de anticuerpo que incluyen genes de fusión C terminales que comprenden una cadena pesada de anticuerpo completa y funcional, seguida de un dominio V pesado o V ligero de anticuerpo adicional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia (V pesado o V ligero) separados cada uno por un conector G4Sx4 al extremo C del dominio CH3 de una molécula de IgG humana (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VH o VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL). Se expresaron moléculas de anticuerpo recombinante que portan un dominio VH y uno VL en los extremos C de los dos dominios CH3, respectivamente, usando la tecnología botón en ojal.

Los plásmidos de expresión para la expresión transitoria de una cadena pesada de anticuerpo con un dominio VH o VL C terminal en células HEK293 comprendían, además del fragmento de la cadena pesada de anticuerpo con casete de expresión de dominio VH o VL C terminal, un origen de replicación del vector pUC18, que permite la replicación de este plásmido enE. coli,y un gen de betalactamasa que confiere resistencia a ampicilina enE. coli.La unidad de transcripción del fragmento de la cadena pesada de anticuerpo con el gen de fusión de dominio VH o VL C terminal comprende los siguientes elementos funcionales:

- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de anticuerpo (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VH o VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL), y

Los plásmidos de expresión que codifican todos los polipéptidos/proteínas de la cadena pesada mencionados en la tabla 2 se construyeron de acuerdo con los procedimientos como se explica anteriormente.

b) Plásmido de expresión para las cadenas ligeras de anticuerpo

Se ensamblaron genes que codifican la cadena ligera de anticuerpo que comprenden una cadena ligera de anticuerpo completa y funcional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia.

El plásmido de expresión para la expresión transitoria de una cadena ligera de anticuerpo comprendía además del fragmento de la cadena ligera de anticuerpo un origen de replicación del vector pUC18, que permite la replicación de este plásmido enE. coli,y un gen de betalactamasa que confiere resistencia a ampicilina enE. coli.La unidad de transcripción del fragmento de la cadena ligera de anticuerpo comprende los siguientes elementos funcionales: - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A, - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de anticuerpo (VL-CL), y

Los plásmidos de expresión que codifican todos los polipéptidos/proteínas de la cadena ligera mencionados en la tabla 2 se construyeron de acuerdo con los procedimientos como se explica anteriormente

Una representación esquemática del formato usado se representa en la figura 1. La estrella se refiere a las sustituciones PGLALA: 1 se refiere a la proteína fijadora de DOTAM y 2 y 3 se refieren a la proteína fijadora antidiana (aquí CEA).

Ejemplo 6: expresión transitoria de moléculas de PRIT

Expresión transitoria de las moléculas de anticuerpo

Se generaron las moléculas de anticuerpo en células HEK293 transfectadas de forma transitoria (derivadas de la línea de células de riñón embrionario humano 293) cultivadas en medio F17 (Invitrogen Corp.). Para la transfección se usó el reactivo de transfección "293-Free" (Novagen). Las respectivas moléculas de la cadena pesada y ligera de anticuerpo como se describe anteriormente se expresaron a partir de plásmidos de expresión individuales. Se realizaron las transfecciones como se especifica en las instrucciones del fabricante. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular que contenían inmunoglobulina de tres a siete (3-7) días después de la transfección. Los sobrenadantes se almacenaron a temperatura reducida (por ejemplo, -80 °C) hasta la purificación.

La información general con respecto a la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas, por ejemplo, en células HEK293, se da en: Meissner, P.et al.,Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Ejemplo 7: purificación de proteínas

Se aplicó el sobrenadante de cultivo celular recogido sobre una columna (1,1 cm de diámetro y 5 cm de longitud) llena con 5 ml de resina de proteína A (Mab Select Sure) a un caudal de 5 ml/min. Después de lavar con 20 ml de tampón PBS, se eluyó el anticuerpo con 25 ml de citrato de Na, pH 3,0.

A continuación, se ajustó el eluido a pH 5,0 con Tris 1 M, pH 9,0 y se incubó a 4 °C durante la noche.

Después de la centrifugación 10 min a 10000 x g y la filtración sobre un filtro de 0,2 |jm, a continuación, se aplicó el filtrado sobre una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (2,6 cm de diámetro, 60 cm de longitud) preequilibrada en un tampón que contenía histidina 20 mM, NaCl 140 mM a pH 6,0 y se eluyó con el mismo tampón.

Se recogió el pico de elución principal que contenía el anticuerpo purificado y se analizó para determinar la pureza final.

Material- tabla 5

Ejemplo 8: FACS

Se separaron las células MKN-45 del frasco de cultivo usando tripsina y se contaron usando un contador de células Casy. Después de sedimentar a 4 °C, se resuspendieron 300 g de las células en tampón FACS (FCS al 2,5%en PBS), se ajustaron a 2,0E+06 células/ml distribuidas en una placa con fondo en V de PP de 96 pocillos (25iJl/pocillo = 5,0E+04 células/pocillo).

- Tinción para FACS usando DOTAM-FITC

Los anticuerpos específicos de CEA primarios se ajustaron hasta 40 jg/m l en tampón de FACS, dando como resultado una concentración final de 1o jg/ml. Se usó RS-CEA-Il2v como referencia. Pb-DOTAM marcado con FITC y los anticuerpos primarios se usaron en proporciones equimolares. Se mezclaron y se incubaron durante 10 min a TA para permitir la unión de los anticuerpos a Pb-DOTAM. Posteriormente, se añadieron 20 j l de la mezcla preparada a 25 j l de suspensión celular y se incubó durante 1 h a 4 °C. A continuación, se lavaron las células dos veces en tampón de FACS y se resuspendieron en 70 jl/pocillo de tampón de FACS para la medición usando un FACS Canto (BD, Pharmingen).

- Tinción para FACS usando <hu kappa>

Los anticuerpos específicos de CEA primarios se ajustaron hasta 20 jg/m l en tampón de FACS, dando como resultado una concentración final de l0 jg/ml. Se usó RS-CEA-Il2v como referencia. Se añadieron 20 j l a 25 j l de suspensión celular y se incubó durante 1 h a 4 °C. A continuación, se lavaron las células dos veces en tampón de FACS. Después del lavado, se resuspendieron las células en 50 j l de tampón de FACS que contenía anticuerpo secundario (<huIgG>-Alexa488, c=10 jg/m l) y se incubaron 1 h a 4 °C. A continuación, se lavaron las células dos veces en tampón de FACS y se resuspendieron en 70 jl/pocillo de tampón de FACS para la medición usando un FACS Canto (BD, Pharmingen).

En la figura 36 se representa un ejemplo que muestra la unión de un anticuerpo (PRIT-0165) a las células MKN-45, detectándola usando detección secundaria (panel derecho, Alexa 488) o bien DOTAM FITC (panel izquierdo, FITC-A).

Ejemplo 9: humanización:

Para la identificación de una región estructural aceptora humana adecuada durante la humanización de la proteína fijadora de DOTAM PRIT-0128 se usó una combinación de dos técnicas. Por una parte, se adoptó un enfoque clásico buscando una región estructural aceptora con alta homología de secuencia con respecto al anticuerpo original y el posterior injerto de las regiones CDR en esta región estructural aceptora. Cada diferencia de aminoácidos de las regiones estructurales identificadas con respecto al anticuerpo original se consideró por el impacto en la integridad estructural de la proteína fijadora y se introdujeron retromutaciones hacia la secuencia original cuando fue apropiado.

Por otra parte, se usó una herramientain silicodesarrollada internamente para predecir la orientación de los dominios VH y VL de las versiones humanizadas entre sí (véase el documento WO2016/062734). Esto se llevó a cabo para los injertos virtuales de las CDR en todas las combinaciones posibles de la línea germinal humana. Los resultados se compararon con la orientación del dominio VH-VL de la proteína fijadora original para seleccionar las combinaciones de región estructural que tienen una geometría cercana al anticuerpo de partida.

En cada caso, las siguientes regiones CDR del anticuerpo original se injertaron en la región estructural aceptora (numeración de acuerdo con Kabat):

VH_CDR1: 31-35

VH_CDR2: 50-65

VH_CDR3: 95-102

VL_CDR1: 24-34

VL_CDR2: 50-56

VL_CDR3: 89-97

Las variantes de humanización se produjeron en el formato final con la proteína fijadora de DOTAM fusionada al extremo C del Fc de la IgG dirigida al tumor como una fusión VH/VL Fv (sin CH1 y Ck, respectivamente). La molécula derivada de la proteína fijadora de DOTAM original (no humanizada) PRIT-0128 en el formato final se denomina PRIT-0156.

También se incluyó la región estructural de Herceptin debido a la idoneidad en términos de predicción de VH/VL y la estabilidad incrementada de la región estructural. Para todas las variantes humanizadas de VH, se usó el elemento J humano hJH2. Para todas las variantes humanizadas de VK, se usó el elemento J humano hJK4. La HC4 es un injerto de PRIT-128 en la línea germinal humana IGHV3-30-02 con una retromutación de Kabat A49G

Para obtener la cadena pesada variable HC5, las CDR se injertaron en la línea germinal humana hVH_2_26 con A49G como retromutación y la deleción del primer aminoácido para reflejar el extremo N original de conejo. Injertada en la región V de Herceptin (derivada de la línea germinal humana hVH3_66), la variante HC7 se caracteriza por unas pocas modificaciones en la región estructural aceptora: deleción del extremo N E, A49G, A71R y S93A.

Para HC10, las CDR de PRIT-128 se injertaron en la línea germinal humana IGHV4_34_01.

Aquí, el extremo N se modificó, comenzando con V2, para reflejar el anticuerpo de conejo original que comienza con Q2. Además, G29F y F31L se consideraron como la nomenclatura de Kabat de retromutación wrt, así como V71R y F78V en la región estructural 3.

Para la cadena ligera LC1, las CDR se injertaron en la línea germinal humana IGKV1_39_01 sin ninguna retromutación. El comienzo se eligió como I2 para reflejar el Ab de conejo original que comienza con A2.

La variante de la cadena ligera LC3 se obtuvo por injerto de las CDR en la línea germinal humana hVK1_5. D1 se delecionó y una retromutación I2A se consideró como un nuevo extremo N. Como retromutaciones adicionales, se tuvieron en cuenta K42Q y A43P.

No se produjeron todas las combinaciones posibles de la matriz de humanización, pero se eligió una selección de combinaciones definidas en base a consideraciones como la predicción de VH/VL y los riesgos de secuencia de la combinación dada.

El objetivo de la humanización fue obtener proteínas fijadoras humanizadas que no pierden más de un factor de 10 en términos de afinidad por DOTAM y presentan una estabilidad incrementada si es posible. Esto se logró con varias proteínas fijadoras de afinidad comparable o incluso mejor por DOTAM, así como un incremento de la estabilidad térmica como se mide por DLS de aproximadamente 10-15 °C. Véanse las tablas 7 y 8 a continuación.

Ejemplo 10: determinación de kd basada en el equilibrio de la solución

Para cribar una mayor cantidad de candidatos de humanización para determinar su afinidad por Pb-DOTAM, se usó valoración en equilibrio de la solución (SET).

La tabla 6 detalla la determinación de afinidad basada en SET de proteínas fijadoras de DOTAM humanizadas seleccionados contra Pb-DOTAM. Todos los anticuerpos de la tabla 6 son anticuerpos biespecíficos que comprenden unión bivalente a CEA y unión monovalente a Pb-DOTAM (formato 2:1, véase la figura 1):

Tabla 6

Ejemplo 11: determinación de kd basada en Kinexa

Para un análisis más detallado y un procedimiento ortogonal para la determinación de la afinidad, se usó Kinexa.

Instrumental y materiales

Se usó un instrumento KinExA 3200 de Sapidyne Instruments (Boise, ID) con automuestreador. Se adquirieron microesferas de polimetilmetacrilato (PMMA) de Sapidyne, mientras que PBS (solución salina tamponada con fosfato), BSA (fracción V de seroalbúmina bovina) y los anticuerpos anti-DOTAM se prepararon internamente (Roche). Se adquirió el anticuerpo de cabra con adsorción cruzada de anti-IgG humana-fragmento Fc purificado por afinidad conjugado con Dylight650® de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). Se obtuvieron los antígenos de Pb-DOTAM biotinilados (isómero A y B de Pb-DOTAM-alquil-biotina, isómero A y B de Pb-DOTAM-Bn-biotina/TCMC-Pb-dPEG3-biotina) y el Pb-DOTAM no biotinilado, de AREVA Med (Bethesda, MD).

Preparación de microesferas recubiertas de antígeno

Las microesferas de PMMA se recubrieron de acuerdo con el protocolo del manual de KinExA para moléculas biotiniladas (Sapidyne). En resumen, en primer lugar, se añadieron 10 pg de biotina-BSA (Thermo Scientific) en 1 ml de PBS (pH 7,4) por vial (200 mg) de microesferas para el recubrimiento por adsorción. Después de rotar durante 2 h a temperatura ambiente, se retiró el sobrenadante y se lavaron las microesferas 5 veces con 1 ml de PBS. En segundo lugar, se añadió 1 ml de 100 |jg de proteína de unión a biotina NeutrAvidin (Thermo Scientific) en PBS que contenía 10 mg/ml de BSA a las microesferas y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h adicionales para acoplar NeutrAvidin a las microesferas y proporcionar sitios de unión a biotina adicionales para la posterior unión de proteínas biotiniladas. A continuación, se aclararon las microesferas recubiertas con NeutrAvidin 5 veces con 1 ml de PBS. Finalmente, se recubrieron las microesferas con 200 ng/ml de mezcla isómero-Pb-DOTAM biotinilado (50 ng para cada isómero) en PBS y se incubaron durante 2 h adicionales a temperatura ambiente. A continuación, se resuspendieron las microesferas en 30 ml de PBS y se usaron de inmediato.

Ensayos de equilibrio KinExA

Se realizaron todos los experimentos KinExA a temperatura ambiente (TA) usando PBS, pH 7,4, como tampón de migración. Se prepararon las muestras en tampón de migración complementado con 1 mg/ml de BSA ("tampón de muestra"). Se usó un caudal de 0,25 ml/min. Se valoró una cantidad constante de anticuerpo anti-DOTAM con concentración de sitio de unión de 5 pM con antígeno de Pb-DOTAM por dilución sucesiva a la mitad comenzando en 100 pM (intervalo de concentración 0,049 pM - 100 pM). Una muestra de anticuerpo sin antígeno sirvió como señal de un 100 % (es decir, sin inhibición). Los complejos antígeno-anticuerpo se incubaron a TA durante al menos 24 h para deja que se alcanzara el equilibrio. A continuación, se extrajeron las mezclas equilibradas a través de una columna de microesferas acopladas a Pb-DOTAM en el sistema KinExA a un volumen de 5 ml, lo que permitió que se capturara el anticuerpo no unido por las microesferas sin perturbar el estado de equilibrio de la solución. Se detectó el anticuerpo capturado usando 250 ng/ml de anticuerpo secundario específico anti-fragmento Fc humano conjugado con Dylight 650© en tampón de muestra. Cada muestra se midió por duplicado para todos los experimentos de equilibrio.

La KD se obtuvo a partir del análisis de regresión no lineal de los datos usando un modelo de unión homogéneo de un sitio contenido en el programa informático KinExA (versión 4.0.11) usando el procedimiento de "análisis estándar". El programa informático calcula la KD y determina el intervalo de confianza del 95 % ajustando los puntos de datos a una curva de KD teórica. El intervalo de confianza del 95 % (Sapidyne TechNote TN207R0) se da como KD baja y KD alta.

A continuación, se proporcionan otros ejemplos de valores de afinidad como se determina por Kinexa, para PRIT-213. PRIT-0213 es la misma molécula que PRIT-0186, excepto por otro VH /VL de unión a CEA, véase la tabla 8.

PRIT-213

Afinidades de quelato de metal-DOTAM de bsAb CEA-DOTAM

Los valores adicionales son como se muestra a continuación:

*intervalo de confianza amplio, que indica que la Kdmedida no es tan precisa °ensayo no completamente optimizado para nM - afinidad

Ejemplo 12: mediciones de termoestabilidad para moléculas de PRIT humanizadas

Procedimiento y análisis de datos

Se diluyeron diferentes variantes de las moléculas de PRIT humanizadas en el formato final (en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0) en el mismo tampón hasta 1 mg/ml. Se transfirieron 30 |jl de cada muestra a un dispositivo de filtro de placa de 384 pocillos (junto con un anticuerpo anti-HER3 como referencia). Después de la centrifugación a 1000 g durante 1 min, se cubrieron los pocillos con 10 j l de aceite de vaselina. Se centrifugó la placa de nuevo (1000 g durante 1 min) y se transfirió al lector de placas DLS (Dyna Pro PlateReader-II, Wyatt). Comenzando en 25 °C, se incrementó la temperatura a una velocidad de 0,05 °C/min hasta 79,9 °C. Se registró la luz dispersa usando el programa informático Dynamics (V7.0).

Los datos se transfirieron a Excel (Microsoft), se clasificaron por muestra y temperatura y se usó un complemento de programa informático para crear curvas de fusión. La temperatura, donde se produjo una clara desviación del valor de referencia, se definió como "inicio de la agregación" y el punto de inflexión de la curva de fusión como "temperatura de fusión".

Resultados - Tabla 7

Ejemplo 13: selección de candidatos

PRIT-0156 es un anticuerpo 2:1 que comprende la proteína fijadora de DOTAM de conejo PRIT-0128 combinada con la proteína fijadora de CEA CH1A1A. De PRIT-0178 a PRIT-0204 son variantes humanizadas en el mismo formato que la misma proteína fijadora de CEA. De PRIT-0205 hasta PRIT-0221 corresponden a las variantes de humanización de PRIT-0178 a PRIT-0204 en la parte de unión a DOTAM, pero se ha cambiado la proteína fijadora de CEA a T84.66.

La tabla a continuación compara las propiedades de diversas moléculas de PRIT. Los compuestos preferentes fueron PRIT-213 y PRIT-214.

(a) Tabla 8: Selección de candidatos

Secuencias

HC5:

VTT.K?:snP7T.VKPn'RTiriTnTV.':;nF.c;i..c;TY5;MSWTRQPPf;KAT.HM!.f-FT';.q^fXTYYASM7-KnR7.T7.cKDTStf.SQVVT.TMTKMDPVDTf.TYYrAABRDPYnnrAY--'CHr.WnRnT' VTVSS LC1 :

3IQNTv3P33L3A3VGDRVTITCQ33H3V5f3DNCIJA>JYQQKPGE<APKLLI,/QAGI‘:LA3GVPí:RFjG3GI;GTDFTLTIGGLQFEDFATYYCIGGYDDSGHTYGFGGGTK7EIK LC3:aqmtqspstl sasvgdivti tcqsshsvys

bOl dndlavyqqkpgqppklliy qasklasgvp srísqsgsgt eftltisslq

551 pddfatyyclggyddeedty gfgggtkvei k

HC?:vql/esgggl vqpggslrls caasgfslst

501 ysirsw/rqapgkg,ewvgíi gsrgdtyycs waJegrttisr dtskntaylq

551 mnsl vyyoé* yOQO^ypP^ wrj~rjt1vtv« s

HC10: vqlqqwgagl _kpaetlslt cavygfslst

501 yswswixqpp gkglewigfi gsigdtyyés wakgxvcidz dtskuqvtlk

551 lssvtaadta vyycarerdp yqggayppfcl wgrgtlvtvs £

T84.66 V31 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasafnik dtymhwvrqa pgqglewmgr

51 ldpangnsky vpktqgrvtl tadtststay nelsslrsec tavyycapfg

101 yyvadyamay wgqgtlvtvs e

i '34.66 VL:

ElVLTgSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFCVGFLHWYQQKPGQAPRLLlYRASNRATGIPA

KhSCiSGSG IÜ H LFJSSLhFhüF AVYYLW I NKDPY h ü Q ü l KLtIK

CHIAIA VH:

qvqlvqsgae vkkngasvkv scka&gytft efgmmwrqa pgqglcwmgw

51 inlktgeaty veefkgrvtf ttdtttátav melrslrsdd tavyyearud

101 íayyveamdy wgqgtlvtvs s

CHIAIA VI.:

I diqmtqspss Isasvgdrvt ilckasaavg tyvawyqqlcp gkapklliys

51 asyrkrgvps rlsgsgsgld tlltisslqp edl'atyychq \yt\plltlg

101 qgtklcik

Ejemplo 14: Cristalización, obtención de datos y determinación de la estructura del complejo Fab P1AA1227 Pb-DOTAM

Para la formación del complejo, se mezcló el Fab derivado del VH / VL humanizado en PRIT-0213, llamado P1AA1227 a 26 mg/ml, con polvo de Pb-DOTAM en una proporción molar de 1:4,2. Después de 2 horas de incubación a 4 °C, se realizaron ensayos de cristalización inicial en configuraciones de difusión de vapor de gota sedente a 21 °C usando la criba JCSG+ (Qiagen, Hilden). Aparecieron cristales dentro de 5 días de (NH4)2SO4 O, 2 M, BIS-TRIS 0,1 M, pH 5,5, PEG3350 al 25 % p/v. Se recogieron los cristales directamente de la placa de cribado sin ninguna etapa de optimización adicional.

Obtención de datos y determinación de estructura.Para la obtención de datos, los cristales se congelaron rápidamente a 100 K en solución precipitante que contenía etilenglicol al 10 %. Se obtuvieron los datos de difracción a una longitud de onda de 1.0000 A usando un detector PILATUS 6M en la línea de haz X10SA del Swiss Light Source (Villigen, Suiza). Los datos se han procesado con XDS (Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)) y se aumentaron a escala con SADABS (BROKER). Los cristales del complejo pertenecen al grupo espacial C2 con ejes de celda de a= 135,63 A, b= 56,42 A, c= 64,52 A y p=108,36° y difractan a una resolución de 1,40 A. Se determinó la estructura por reemplazo molecular con PHASER (McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P. D., Storoni, L.C. y Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)) usando las coordenadas de una estructura de Fab interna como modelo de búsqueda. La diferencia de densidad electrónica se usó para colocar el Pb-DOTAM y para cambiar los aminoácidos de acuerdo con las diferencias de secuencia por el refinamiento del espacio real. Las estructuras se refinaron con programas del paquete de programas CCP4 (Collaborative Computational Project, número 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) y b UsTER (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O. (2011). Versión Buster 2.9.5 Cambridge, Reino Unido: Global Phasing Ltd.). La reconstrucción manual se realizó con COOT (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. y Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)).

La obtención de datos y las estadísticas de refinamiento se resumen en la tabla 9.

Todas las presentaciones gráficas se prepararon con PYMOL (The Pymol Molecular Graphics System, versión 1.7.4. Schrodinger, LLC.).

Tabla 9- Obtención de datos y estadísticas de refinamiento para el complejo de Fab P1AA1227-Pb-DOTAM

P1AA1227-Pb-DO

__________________________ TAM___________

Obtención de datos

Grupo espacial Dimensiones C2

de celda

a, b, c(A) 135,63,

56,42, 64,52

a, P, Y (°)90, 108,36, 90

Resolución (A) 1,40

Rsim o Rfusión 0,041

I / 5I10,3 (0,94)

Completitud (%) Redundancia 94,4 (86,1)

3,37 (3,33)

Refinamiento

Resolución (A) 48,9 - 1,40

N.° de reflexiones 81631

Rtrabajo/ Rlibre 19,21/22,38

N.° de átomos

Proteína 3342

Agua 523

Pb-Dotam 29

Factores-S

Proteína 14,81

Agua 37,46

Pb-Dotam 21,09

Desviación c.r.m.

Longitudes de enlace 0,011

(A) ^

Ángulos de enlace 1,57

(°)

*Los valores entre paréntesis son para la concha de mayor resolución.

Estructura de Fab P1AA1227 en complejo con Pb-Dotam

Para caracterizar los detalles de interacción del Pb-Dotam con FabP1AA1227se determinó la estructura cristalina del complejo a una resolución de 1,40 A. La estructura revela que FabPLAA1227se une a Pb-DOTAM por los principales aportes de la CDR1 y CDR3 de la cadena ligera y por la CDR2 y CDR3 de la cadena pesada.

El análisis de la interfaz de unión con el programa PISA revela un patrón de interacción de FabP1AA1227con Pb-DOTAM por medio de 3 enlaces de hidrógeno, interacciones polares y contactos de Van der Waals. El Pb-DOTAM se une en una cavidad formada por la cadena pesada y ligera. Esta cavidad tiene la conformación de una caja que está abierta por un lado. Las paredes laterales y el fondo de la cavidad aportan interacciones apolares, mientras que en el borde de las paredes dominan las interacciones polares. Los enlaces de hidrógeno de cadena lateral se forman entre los residuos de CDR3 de Glu95 y Asp97 de la cadena pesada con los átomos de nitrógeno de carbamoílo N7 y N8 de DOTAM. Un enlace de hidrógeno adicional se establece por medio del átomo de carbonilo de la cadena principal de Arg96 con el átomo N7 de DOTAM. El complejo se estabiliza además a través de interacciones apolares de cadenas laterales de CDR2 Phe50 y Tyr58 de la cadena pesada que están orientadas de borde a cara con el anillo de azaciclododecano. La cadena ligera contribuye en su mayor parte al "fondo" de la cavidad con los residuos de CDR3 Gly91-Tyr96 que proporcionan contactos apolares al anillo de tetraciclododecano. Asp32 alberga un enlace de hidrógeno con el átomo de nitrógeno de carbamoílo N6 de DOTAM. (Numeración de acuerdo con Kabat).

La figura 2 muestra la estructura de P1AA1227 en complejo con Pb-DOTAM.

La figura 3 muestra la vista en el sitio de interacción.

La tabla a continuación muestra los residuos de parátopos de la cadena pesada, en base al análisis con el programa PISA.

Tabla 10

La tabla a continuación muestra los residuos de parátopos de la cadena ligera, en base al análisis con el programa PISA.

Tabla 11

Los residuos de parátopos también están subrayados en las secuencias a continuación:

>P1AA1227_HC

VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALESÍLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKS

QVVLTIYTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV

KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

>P1AA1227_LC

STQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSENDTAWYQQKPGKAPKT.LIYQASKI.ASGVPSRFSGSGSGTDFTL

t i s s l q p e d f a t y y c l g g y d d e s d t y g f g g g t k v e i k r t v a a p s v f i f p p s d e q l k s g t a s v v c l l n n f y p r e a k VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Ejemplo 15: biodistribución y eficacia in vivo: material y procedimientos

Glosario para los siguientes ejemplos

Material y procedimientos de los protocolos

General

Todos los protocolos experimentales se revisaron y aprobaron por las autoridades locales (Comité Régional d'Ethique de l'Expérimentation Anímale du Limousin (CREEAL), Laboratoire Départemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne). Se mantuvieron ratones hembra con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) (Charles River) en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de luz y oscuridad (12 h/12 h), de conformidad con las pautas éticas. No se realizaron manipulaciones durante la primera semana después de su llegada, para permitir que los animales se aclimataran al nuevo entorno. Se supervisaron todos los ratones diariamente para evaluar la condición física y el bienestar general.

Los volúmenes tumorales se estimaron a través de calibración, calculados de acuerdo con la fórmula:volumen= 0,5 xlargoxancho2.Se extrajo sangre al final del seno venoso usando venopunción retrorbitaria, seguido de extracción de tejido adicional para mediciones radioactivas y/o análisis histológico, según lo estipulado por los protocolos. Se registraron afecciones inesperadas o anómalas.

Se realizó un análisis estadístico usando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) y JMP 8 (SAS Institute Inc.).

Reactivos

Se proporcionaron anticuerpos biespecíficos por Roche Diagnostics GmbH, Pharma Research Penzberg (Penzberg, Alemania) y se almacenaron a -80 °C hasta el día de la inyección. A continuación, se descongelaron y se diluyeron en tampón de vehículo estándar (histidina/histidina HCl 20 mM, NaCl 140 mM; pH 6,0).

Anticuerpos biespecíficos

Compuesto Diana Protocolos Proveedor

PRIT-0155 PSCA 83, 87 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0156 CH1A1A 80, 91 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0165 T84.66 80, 85, 90, 91, 95 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0175 Digoxigenina 80, 91, 93 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0186 CH1A1A 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0187 CH1A1A 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0205 T84.66 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0206 T84.66 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0207 T84.66 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0208 T84.66 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0209 T84.66 80 Roche Pharma Research PZ

PRIT-0213 = T84.66 93, 105, 106 Roche Pharma Research PZ

CEA-PRIT

PRIT-0214 T84.66 93 Roche Pharma Research PZ

Los reactivos de clarificación se proporcionaron por Macrocyclics (Plano, TX, EE. UU.). Se almacenaron a -80 °C hasta el día de la inyección, cuando se descongelaron y se diluyeron en PBS hasta la concentración deseada.

Agentes de aclaramiento

Compuesto TCMC Protocolos Proveedor

Sustitución de

Dex500-TriGalNAc 3:1f 81-1 44 Macrocyclics

Dex500-TriGalNAc 9:1 f 101-1 44, 70 Macrocyclics

Dex20 14-1 83, 85, 87 Macrocyclics

D ex20f 16-1 70 Macrocyclics

Dex70 8-1 83, 85, 87 Macrocyclics

Dex70f 10-1 44, 70 Macrocyclics

Dex70-TriGalNacf 70 Macrocyclics

Dex250 19-1 83, 87 Macrocyclics

Dex250f 24-1 44, 70 Macrocyclics

Dex500f* 70 Macrocyclics

Dex500* 84-1 80, 83, 85, 87, Macrocyclics

90, 91

CDex500- (Glu) 3* 95-1 83, 87 Macrocyclics

CDex500- (Glu) 2* 84-1 83, 87 Macrocyclics

CDex500- (Glu) 4* 78-1 83, 85, 87 Macrocyclics

Dex500-M (Glu) 2* 11-1 83, 85, 87 Macrocyclics

Dex20-M (Glu) 2 2-1 83, 87 Macrocyclics

Dex500- (10 %) ** 9-1 95 Macrocyclics

Dex500- (20 %) ** 20-1 95 Macrocyclics

Dex500- (40 %) ** 39-1 95 Macrocyclics

Dex500- (100 %) ** 84-1 90, 95 Macrocyclics

Dex500- (50 %) ** 47-1 105, 106 Macrocyclics

fS in desactivación de Pb; *límite de filtración de 30 kDa; **límite de filtración de 100 kDa

Los quelatos de DOTAM para el radiomarcaje se proporcionaron por Macrocyclics y se mantuvieron a -20 °C antes del radiomarcaje. El marcaje posterior con plomo-203 (203Pb) o bien plomo-212 (212Pb) se realizó por AREVA Med (Razés, Francia). A los ratones se les inyectaron por vía intravenosa (i.v.) 100 |jl de las respectivas soluciones de Pb-DOTAM, diluidas con PBS para obtener la concentración de dosis/actividad de Pb deseada. 203Pb-DOTAM se usó unido previamente con anticuerpos biespecíficos, mientras que 212Pb-DOTAM se administró después de PRIT y el agente de aclaramiento. Las mediciones radioactivas se realizaron usando un contador gamma automático 2470 WIZARD2 (PerkinElmer).

Quelatos radiomarcados_______________________________________________________________________ Compuesto Tampón de formulación Proveedor

212Pb-DOTAM PBS Macrocyclics, AREVA Med

203Pb-DOTAM PBS Macrocyclics, AREVA Med

BxPC3 es una línea celular de adenocarcinoma pancreático primario humano que expresa CEA de forma natural. Se cultivaron células BxPC3 en medio RPMI-1640 (Gibco, n.° de ref. 42401-018) enriquecido con suero fetal bovino al 10 % y GlutaMAX al 1 % (Gibco, n.° de ref. 35050-061). LS174T es una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano que expresa CEA de forma natural. Se cultivaron células LS174T en medio DMEM (Gibco, n.° de ref. 42430-082) enriquecido con suero fetal bovino al 10 %. MKN45 es una línea celular de adenocarcinoma gástrico humano que expresa CEA de forma natural. Se cultivaron células MKN45 en medio RPMI-1640 (Gibco, n.° de ref. 42401-018) enriquecida con suero fetal bovino al 20 %. Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea de células en medios RPMI o DMEM, mezclados 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat. 354230), en el flanco derecho.

Líneas celulares

celular Células por inyectado Proveedor

Línea ratón Volumen

BxPC3 5x106 100 j l ECACC*

LS174T 1x106 100 j l ATCC**

MKN45 0,5x106 100 j l DSMZ ***

*Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados

(Salisbury, Reino Unido)

**American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.)

***Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Alemania)

Ejemplo 16: tratamiento predirigido con diversos anticuerpos biespecíficos dirigidos a CEA (protocolo 80 (a, b, c))

Este estudio tuvo como objetivo evaluar la acumulación de Pb en xenoinjertos de adenocarcinoma pancreático en ratones después del tratamiento predirigido con diversos anticuerpos biespecíficos dirigidos a CEA, para optimizar la pauta posológica y seleccionar el candidato más adecuado para la transición a ensayos clínicos. Los experimentos se dividieron en tres protocolos separados, realizados en el orden i) 80b, ii) 80c y iii) 80a. El protocolo 80b evaluó la captación tumoral de cinco construcciones de anticuerpos biespecíficos completamente humanizados, unidos previamente con 203Pb-DOTAM. El protocolo 80c evaluó la captación tumoral de construcciones de anticuerpos biespecíficos unidos previamente con 203Pb-DOTAM en tres puntos temporales diferentes después de la inyección, para optimizar el tiempo entre la inyección de PRIT y la inyección de CA/quelato en las pautas posológicas predirigidas. Finalmente, el protocolo 80a evaluó la captación tumoral de 212Pb-DOTAM en un ámbito de tratamiento predirigido estándar, usando cinco construcciones de anticuerpos biespecíficos completamente humanizados, dirigidos a T84.66 o bien a CH1A1A.

Diseño de estudio, protocolo 80a

Día de

estudi Fecha Procedimiento experimental

0

1 10/02/2016 Inyección s.c.* de células BxPC3

6 15/02/2016 Inyección i.v.* de bsAb PRIT

9 18/02/2016 Inyección i.v.* de CA

9 18/02/2016 Elución de 212Pb-DOTAM

9 18/02/2016 Inyección i.v.* de 212Pb-DOTAM

10 19/02/2016 Sacrificio y necropsia; recuento gamma de tejidos

*Volumen de inyección de 100 |jl

Diseño de estudio, protocolo 80b

Día de Fecha Procedimiento experimental

estudi

0

1 13/01/2016 Inyección s.c.* de células BxPC3

6 18/01/2016 Elución de 203Pb-DOTAM y unión previa con bsAb PRIT

6 18/01/2016 Inyección i.v.* de 203Pb-DOTAM-bsAb

10 22/01/2016 Sacrificio y necropsia; recuento gamma de tejidos

*Volumen de inyección de 100 jL

Diseño de estudio, protocolo 80c

Día de

estudi Fecha Procedimiento experimental

0

1 20/01/2016 Inyección s.c.* de células BxPC3

6 25/01/2016 Elución de 203Pb-DOTAM y unión previa con

bsAb PRIT

6 25/01/2016 Inyección i.v.* de 203Pb-DOTAM-bsAb

7 26/01/2016 Sacrificio y necropsia; recuento gamma de tejidos

9 28/01/2016 Sacrificio y necropsia; recuento gamma de tejidos

13 01/02/2016 Sacrificio y necropsia; recuento gamma de tejidos

*Volumen de inyección de 100 jL

A cada ratón (de 6-7 semanas de edad) se le inyectaron por vía subcutánea (s.c.) células BxPC3 (paso 30) en 100 j l de RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Cinco días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 160-170 mm3. Se diluyeron los anticuerpos hasta una concentración final de 30 jg por 100 j l y posteriormente se administraron i.v., solos (80a) o bien unidos previamente con 203Pb-DOTAM (80b, 80c). Se usaron PRIT-0165 y PRIT-0156 como controles positivos de unión a CEA, dirigidos a T84.66 y CH1A1A, respectivamente. Se usó PRIT-0175 como control de no unión a CEA.

En el protocolo 80a, se inyectó un agente de aclaramiento por vía intravenosa a una concentración de 30 jg por 100 j l tres días después del anticuerpo biespecífico, seguido dos horas después de 212Pb-DOTAM.

Grupos de estudio, protocolo 80a (ntot = 24)

Grupo A B C D E F G H bsAbPRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT-0206 0207 0208 0165 0186 0187 0156 0175 * ** ***Dosis de30 30 30 30 30 30 30 30bsAb

(jg )

CADex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500Dosis de CA30 30 30 30 30 30 30 30 (jg )

Quelato212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212PbDOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAMPb13 13 13 13 13 13 13 13Actividad de

(pCi)

n3 3 3 3 3 3 3 3 *Control positivo (T84.66); **Control positivo (CH1A1A); ***Control negativo

Grupos de estudio, protocolo 80b (ntot = 21)

Grupo A B C D E F G

bsAb PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT-

0205 0206 0207 0208 0209 0165 0175

Dosis de bsAb 30 30 30 30 30 30 30

* **

(pg)

CA

Dosis de CA - - - - - - -(pg)

unido 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pbpreviamente

Quelato DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM

Pb 4 4 4 4 4 4 4

Actividad de

(pCi)

n 3 3 3 3 3 3 3

*Control positivo (T84.66); **Control negativo

Grupos de estudio, protocolo 80c (ntot = 27)

Grupo A B C

bsAb PRIT-0206 PRIT-0165 PRIT-0175

* **

Dosis de bsAb 30 30 30

(pg)

CA - - -Dosis de CA - - -(pg)

unido previamente 203Pb-DOTAM 203Pb-DOTAM 203Pb-DOTAM

Quelato

Actividad de Pb 1-2 1-2 1-2

(PCi)

necropsia 24, 72, 168 24, 72, 168 24, 72, 168

Puntos temporales

de

(h p.i.)

n 9 9 9

(por punto (3) (3) (3)

temporal)

*Control positivo (T84.66); **Control negativo

Se sacrificaron los ratones con propósitos de biodistribución después de 24 h (80a); 96 h (80b); o 24, 72 o 168 h (80c). Se extrajeron de todos los ratones en el protocolo 80a: sangre, vejiga, bazo, riñones, hígado, pulmón, corazón, músculo y tumor. Se extrajeron de todos los ratones en los protocolos 80b y 80c: sangre, vejiga, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, hígado, pulmón, corazón, fémur, músculo y tumor. Las muestras recogidas se pesaron y se pusieron en tubos de plástico para la medición inmediata de radioactividad. A continuación, se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (%DI/g), incluyendo las correcciones por desintegración radioactiva y fondo.

Resultados, 80a

Todos los anticuerpos biespecíficos de unión a CEA dieron como resultado un tratamiento dirigido contra el tumor específico de 212Pb-DOTAM, con poca o ninguna captación en tejidos normales 24 horas después de la inyección de DOTAM. Para PRIT-0206, PRT-0207 y PRIT-0208, la captación tumoral promedio ± DE fue de 8,62 ± 1,05, 7,30 ± 3,84 y 7,75 ± 2,61 %DI/g, respectivamente, con su correspondiente control positivo de unión a T84.66 PRIT-0165 a 9,13 ± 1,82 %DI/g. Los proteínas fijadoras de CH1A1A P<r>IT-0186 y PRIT-0187 dieron como resultado valores tumorales de 17,44 ± 1,39 y 16,50 ± 3,25 %DI/g, su control positivo PRIT-0156 a 18,98 ± 1,89 %DI/g. El PRIT-0175 de no unión a CEA dio como resultado 0,41 ± 0,42 %DI/g en el tumor.

En general, los anticuerpos biespecíficos dirigidos a CH1A1A dieron como resultado captaciones tumorales significativamente mayores que los dirigidos a T84.66 (prueba de la T para datos independientes, p<0,0001); CH1A1A y T84.66 ambos dieron como resultado una captación significativamente mayor en comparación con el control negativo (ANOVA unifactorial, p<0,0001). Los resultados se muestran en la figura 4.

Resultados, 80b

Se logró un tratamiento dirigido específico a los tumores con todos los anticuerpos biespecíficos de unión a CEA unidos previamente, aunque el %DI/g fue ligeramente menor para las versiones completamente humanizadas en comparación con el control positivo PRIT-0165. El control de no unión a CEA dio como resultado una acumulación tumoral comparativamente insignificante.

En general, el %DI/g calculado en este ámbito de experimento unido previamente alcanzó niveles que eran aproximadamente diez veces mayores que los de las pautas posológicas de PRIT correspondientes; sin embargo, los datos de salida reflejaron las mediciones de actividad del contador gamma y no se encontraron errores de cálculo. De modo importante, las proporciones de tejido tumoral con respecto al normal permanecieron dentro del intervalo esperado. Específicamente, la proporción de tumor con respecto a sangre (± DE, n = 3) fue de 6,76 ± 2,95 para PRIT-0205, 7,56 ± 2,27 para PRIT-0206, 9,33 ± 0,91 para PRIT-0207, 10,77 ± 0,84 para PRIT-0208, 11,71 ± 0,84 para PRIT-0209, 10,78 ± 0,88 para PRIT-0165 y 0,85 ± 0,12 para PRIT-0175. Los resultados se muestran en la figura 5.

Resultados, 80c

Ambos anticuerpos de unión a CEA dieron como resultado una acumulación tumoral significativa en comparación con el control negativo. El análisis estadístico no mostró ninguna diferencia significativa entre el tratamiento dirigido contra el tumor usando PRIT-0206 o PRIT-0165 para ninguno de los puntos temporales estudiados, ni tampoco hubo ninguna diferencia significativa en el %DI/g entre el día 3 y 7 para ninguno de los anticuerpos estudiados (ANOVA bifactorial,p< 0,05). De forma análoga al protocolo 80b, los valores de %DI/g calculados fueron altos en general; sin embargo, las proporciones de tumor con respecto a sangre permanecieron dentro del intervalo esperado. No se observaron diferencias significativas en las proporciones de tumor con respecto a sangre entre los días 1 y 3, pero para PRIT-0165 y PRIT-0206, esperar 7 días incrementa significativamente la proporción para PRIT-0213 (ANOVA bifactorial,p< 0,05). Los resultados se muestran en la figura 6.

Proporciones de tumor con respecto a sangre (± DE; n=3) de 203Pb-DOTAM-bsAb en diversos puntos temporales después de la inyección.___________________________________________________________

Días después de PRIT-6206 PRIT-6165 PRIT-0175

la inyección

1 4,48 ± 0,38 4,28 ± 1,31 0,84 ± 0,22

3 8,73 ± 4,07 7,13 ± 0,33 0,75 ± 0,30

7 29,67 ± 10,52 17,87 ± 12,15 0,76 ± 0,25

Sumario y conclusión

Todos los anticuerpos biespecíficos completamente humanizados dirigidos a T84.66 o bien a CH1A1A dieron como resultado una acumulación significativa de radioactividad en tumores BxPC3, comparable a la de sus respectivos controles positivos.

El %DI/g de 203Pb-DOTAM-bsAb en el tumor no difirió significativamente entre 3 y 7 días, pero la proporción de tumor con respecto a sangre correspondiente favoreció el punto temporal posterior debido a la disminución de la radioactividad en sangre.

Ejemplo 17: biodistribución de agentes de aclaramiento (protocolo 44)

El objetivo de este estudio fue abordar la biodistribución de una selección de agentes de aclaramiento con diferentes propiedades (por ejemplo, cadena principal molecular, tamaño y carga) y, más específicamente, su presencia y/o acumulación en tumores. Esto fue de interés ya que los agentes de aclaramiento pueden entrar potencialmente en los tumores, unirse a los anticuerpos unidos a tumor y/o extraerlos del tumor, lo que afecta negativamente la unión posterior de los radioligandos.

Diseño de estudio, protocolo 44

2____________ | 2015-03 | Sacrificio y necropsia; recuento gamma de tejidos (24 h p.i.)

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio, protocolo 44 (nto = 24)

fTodos los agentes de aclaramiento sin desactivación de Pb antes del marcaje de 212Pb

Se desactivaron 30 jg de agentes de aclaramiento modificados con Dex70, Dex250 y TriGalNac con 5 jC i de 212Pb y se diluyeron en PBS para obtener 30 jg por 100 j l de volumen total para inyección i.v.

Se sacrificaron los ratones y se sometieron a necropsia 2 o 24 horas después de la inyección de 212Pb-CA. Se recogieron sangre, vejiga urinaria, corazón, pulmón, hígado, bazo, riñones, intestino (duodeno, yeyuno, íleon), colon, páncreas, estómago, ovarios, cerebro, fémur con médula ósea, y tumor, se pesaron y se midió el contenido de radioactividad y, posteriormente, se calcularon el %DI y el %DI/g. Además, se tomaron muestras de orina en el punto temporal de 24 h.

Resultados, 44

Todos los agentes de aclaramiento se aclararon rápidamente de la circulación sanguínea, acumulándose principalmente en el hígado y el colon ya a las 2 horas después de la inyección. Aproximadamente un 50 % del 212Pb inyectado se encontró en el hígado 24 horas después de la inyección, como se demuestra por la distribución de radioactividad por órganos (%DI). Los agentes de aclaramiento modificados con TriGalNAc también se acumularon en determinado grado en el bazo, lo que se explica por la presencia de moléculas de TriGalNAc. En general, se encontró poca radioactividad en la orina después de 24 horas. Sin embargo, el agente de aclaramiento más pequeño (Dex70) se excretó más lentamente de lo esperado.

La figura 7 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 2 horas después de la inyección de agentes de aclaramiento marcados con 212Pb en ratones portadores de tumor MKN45 (%Dl/g ± DE, n=3).

Sumario y conclusión

Ninguno de los CA radiomarcados dio como resultado la captación tumoral de 212Pb, administrado a una dosis de 30 jg por ratón. La modificación de Dex500 con TriGalNac no fue beneficiosa en comparación con los agentes de aclaramiento Dex70 y Dex250 no modificados.

Ejemplo 18: biodistribución a largo plazo de agentes de aclaramiento (protocolo 70)

Este estudio comparó la biodistribución a largo plazo de seis agentes de aclaramiento diferentes. El seguimientoin vivose realizó a través de radiomarcaje con 203Pb.

Diseño de estudio, protocolo 70

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio, protocolo 70 (ntot = 18)

fTodos los agentes de aclaramiento sin desactivación de Pb antes del marcaje de 203Pb

Resultados, 70

Ejemplo 19: agente de aclaramiento en sangre (protocolos 83 y 87)

Esta parte abarca dos estudios, de los que el primero incluye un cribado inicial que compara nueve agentes de aclaramiento a base de dextrano diferentes con PBS, en términos de tiempo de permanencia en sangre. El objetivo era identificar candidatos prometedores para futuros experimentos de tratamiento predirigido, permitiendo tratamientos repetidos separados por tres semanas. La hipótesis era que los agentes de aclaramiento que permanecen en circulación durante un tiempo prolongado se unen a los anticuerpos biespecíficos administrados, bloqueando eficazmente la unión de DOTA<m>radiomarcado inyectado posteriormente. Los reactivos de aclaramiento variaron en términos de tamaño, carga y carga de 1,4,7,10-tetraquis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (TCMC).

El segundo estudio evaluó los nueve agentes de aclaramiento en términos de eficacia de aclaramiento de anticuerpos. El experimento se diseñó como una pauta posológica de PRIT de inyección única estándar en ratones sin tumor, evaluando la retención de 212Pb-DOTAM en sangre como una indicación de bsAb retenido después de la administración de CA.

Diseño de estudio, protocolo 83

*Volumen de inyección de 100 j l

Diseño de estudio, protocolo 87

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio en protocolo 83 y 87 (ntot = 30 por protocolo)

En el momento de la primera inyección de PRIT, los ratones tenían 7-9 semanas de edad. Todos los ratones en el estudio estaban libres de tumor; por lo tanto, se podría usar cualquier anticuerpo biespecífico de unión a DOTAM para propósitos de cribado. Los agentes de aclaramiento se administraron por vía intravenosa un día después de PRIT-0155, se diluyeron en PBS hasta una concentración final de 30 (protocolo 83) o 60 (protocolo 87) jg por 100 jl. El grupo O recibió PBS en lugar de agente de aclaramiento. Los compuestos en los grupos A-D se basaron en tamaños de dextrano de 20, 70, 250 o 500 kDa, con sustitución de TCMC variable. Los compuestos en los grupos J-N se basaron en dextrano-500 (CDex) con caperuza (es decir, con neutralización del exceso de aminas) con carga variable (Glu), o dextrano-500 y dextrano-20 con versiones mono de Glu (M(Glu)). El dextrano con caperuza con -(Glu)4, -(Glu)3 y -(Glu)2 correspondió a una carga neta muy negativa, negativa y neutra, respectivamente; la versión mono -M(Glu)2 correspondió a una carga neta de negativa a ligeramente positiva.

Resultados, 83

Los promedios de grupo de contenido de radioactividad (%DI/g) en sangre que fueron significativamente diferentes de los del grupo de control de PBS (41,1 ± 1,4 %DI/g) indicaron retención del agente de aclaramiento en circulación, tres semanas después de la administración. Tres compuestos no difirieron significativamente del control: Dex500-(Glu)4 con caperuza, Dex500-mono-(Glu)2 y Dex20-mono-(Glu)3; otros difirieron en un grado variable.

La figura 12 muestra el contenido de radioactividad en sangre 4 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). La barra rayada representa el control sin CA, con el que se compararon todos los reactivos candidatos. Los asteriscos marcan el nivel de significación estadística, de menor (*) a mayor (***).

Resultados, 87

Los agentes de aclaramiento sometidos a prueba funcionaron bien en general, con una excepción: Dex500-M(Glu)2, que se destacó con 8,07 ± 0,61 %DI/g restante en sangre después de 24 horas.

La figura 13 muestra el contenido promedio de radioactividad en sangre 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). La barra rayada representa el control sin CA, con el que se compararon todos los reactivos candidatos.

Sumario y conclusión

Los reactivos cribados funcionaron bien en general en términos de autoaclaramiento y lograron el aclaramiento de anticuerpo de la circulación. Los tratamientos repetidos con tres semanas entre inyecciones de CA demostraron ser viables sin arriesgar la unión de 212Pb-DOTAM a los anticuerpos biespecíficos. Además, los anticuerpos biespecíficos se aclararon dentro de 2 horas después de la inyección de CA usando la mayoría de los compuestos sometidos a prueba.

Ejemplo 20: penetración tumoral de agentes de aclaramiento (protocolo 85)

La penetración tumoral del agente de aclaramiento es un problema potencial en las pautas posológicas de PRIT, ya que los fragmentos de CA unidos a DOTAM penetrantes competirían con 212Pb-DOTAM en la unión a células tumorales a las que se predirige el anticuerpo. En este estudio, se compararon seis agentes de aclaramiento diferentes en términos de inhibición de la asociación de 212Pb-DOTAM a tumores. Los candidatos se eligieron en base a los resultados del cribado de CA de referencia (protocolo 83) para evaluar el impacto en la radioactividad asociada a tumor de i) el tamaño del dextrano y ii) la carga de la molécula.

Diseño de estudio, protocolo 85

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio en el protocolo 85 (ntot = 18)

A cada ratón (de 7 semanas de edad) se le inyectaron s.c. células BxPC3 (paso 33) en 100 j l de RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Cinco días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 200 mm3.

Los agentes de aclaramiento se basaron en tamaños de dextrano de 20, 70 o 500 kDa, con sustitución de TCMC variable. CDex500- (Glu) 4 se basó en dextrano-500 (CDex) con caperuza (es decir, con neutralización del exceso de aminas) con una carga neta negativa; Dex500-M (Glu) 2 tenía la versión mono de Glu (M (Glu)) y una carga neta de neutra a ligeramente positiva. Todos se administraron por vía intravenosa, 30 jg por 100 jl, tres días después de PRIT-0165. El grupo G recibió PBS en lugar de agente de aclaramiento.

Se sacrificaron los ratones 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM. Se recogieron sangre y tumores, y se calculó su %DI/g respectivo a partir de los pesos de muestra y el contenido de radioactividad.

Resultados, 85

Tres de los candidatos presentaron muy poca o ninguna captación tumoral: Dex20 (0,26 ± 0,03 %DI/g), Dex70 (4,06 ± 2,06 %DI/g) y CDex500-(Glu) 4 (2,98 ± 0,73 %DI/g), lo que indica una amplia penetración de CA en los tumores. Por el contrario, Dex500-M (Glu) 2 dio como resultado una alta radioactividad tanto en el tumor (69,39 ± 9,70 %DI/g) como en la sangre (20,68 ± 1,22 %DI/g), a niveles que fueron similares a los del control de Pb S (59,02 ± 15,53 y 27,92 ± 2,38 %DI/g en el tumor y la sangre, respectivamente), interpretado como un fallo de aclaramiento de bsAb. Dex500 presentó una considerable acumulación de radioactividad en el tumor (20,78 ± 3,76 %DI/g), lo que indica poca penetración tumoral, mientras que el aclaramiento sanguíneo fue esencialmente completo (0,17 ± 0,01 %DI/g). No obstante, la captación tumoral lograda en el control sin CA indicó que también estaba presente un determinado grado de fragmentos de DOTAM-dextrano de bajo peso molecular (PM) en el lote de Dex500.

Sumario y conclusión

Este experimento confirmó la noción de que la presencia de especies de CA de bajo PM puede interferir sustancialmente con la acumulación tumoral de 212Pb-DOTAM. También demostró el amplio intervalo de PM de moléculas que están presentes en cualquier lote de CA, independientemente del tamaño especificado. Debido a esto, cuanto mayor es el tamaño de CA especificado, menor es el riesgo de introducir fragmentos de bajo PM que pueden penetrar en los tumores. Sin embargo, incluso para Dex500 se reveló un determinado nivel de penetración, indicado por la diferencia en la captación tumoral en comparación con el control sin CA. En consecuencia, esta solución se debe diafiltrar usando un límite de PM más alto en el futuro, para retirar la mayor cantidad posible de estos fragmentos interferentes. Se tomó la decisión de incrementar el límite de PM de 30 a 100 kDa para Dex500.

Ejemplo 21: procedimiento de fabricación del agente de aclaramiento para Dex500

Se disolvió aminodextrano (20,0 g) en una mezcla de Na2CO3 0,1 M en H2O (400 ml) y NaHCO3 0,1 M en H2O (400 ml). Después de obtener una solución incolora transparente, se añadió sal tetraclorhidrato de p-SCN-Bn-DOTAM4HCl

(S-2-(4-isotiocianatobencil)-1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10-tetra(2-carbamoilmetil)ciclododecano, 2,03 g) en agitación. Se agitó la solución ligeramente turbia resultante a temperatura ambiente durante 4 horas antes de que se neutralizara la mezcla de reacción a pH 6-7 añadiendo HCl 2 M. Se purificó la solución resultante por filtración de flujo tangencial con un límite de 100 kDa (Sartorius Hydrosart, corte 200 de 100 kDa, 0,02m2, membrana a base de celulosa estabilizada, casete de ultrafiltración) para retirar las impurezas de bajo peso molecular. Se liofilizó la solución resultante bajo presión reducida para dar 17,9 g del intermedio deseado.

Se disolvieron 16,1 g del sólido obtenido de la liofilización en una mezcla de AcOH 0,1 M en H2O (60 ml) y NaOAc3H 2O 0,1 M (540 ml). A la solución incolora transparente se le añadió Pb(OAc)2-3H2O (744 mg) como un sólido. Se agitó la solución incolora transparente durante 60 min antes de que se añadiera una solución de naranja de xilenol (al 1 % en H2O, 250 |jl). El color púrpura indicaba la presencia de Pb(II) libre en la solución. Se añadió una solución de EDTA (0,01 M en H2O) hasta que se observó un cambio de color a amarillo (65,2 ml). Se purificó la solución resultante por filtración de flujo tangencial con un límite de 100 kDa (Sartorius Hydrosart, corte 200 de 100 kDa, 0,02m2, membrana a base de celulosa estabilizada, casete de ultrafiltración) para retirar las impurezas de bajo peso molecular. Se liofilizó la solución resultante bajo presión reducida para dar 14,0 g del agente de aclaramiento deseado.

El agente de aclaramiento resultante se sustituye con múltiples restos Pb-DOTAM de la forma mostrada esquemáticamente a continuación:

Ejemplo 22: dosis de agente de aclaramiento en la acumulación tumoral (protocolo 90)

Este estudio tuvo como objetivo investigar el impacto de la dosis de agente de aclaramiento en la acumulación tumoral en un modelo de tumor subcutáneo, planteando la hipótesis de que una mayor cantidad de agente de aclaramiento podría dar lugar a un mayor grado de penetración del agente de aclaramiento en los tumores, disminuyendo de este modo la captación posterior del quelato marcado al bloquear el brazo de unión a DOTAM de los anticuerpos biespecíficos unidos a tumor. Sin embargo, una dosis demasiado baja daría lugar a una acumulación menos eficaz de radioactividad asociada a tumor, debido a niveles mayores de anticuerpos biespecíficos de unión a DOTAM en circulación.

Además, se realizó una comparación entre los lotes de agente de aclaramiento que se habían diafiltrado para retirar los componentes de bajo PM, con un límite de 30 o 100 kDa, en un esfuerzo por disminuir la penetración tumoral de los fragmentos de dextrano unidos a DOTAM.

Diseño de estudio, protocolo 90

*Volumen de inyección de 100 j l

Grupos de estudio en el protocolo 90 (ntot = 24)

*Límite de filtración de 100 kDa; **Límite de filtración de 30 kDa

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea de células BxPC3 (paso 30) en medio RPMI mezclado 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat.

354230). A cada ratón (de 11 semanas de edad) se le inyectaron s.c. 5x106 células en 100 |jl de RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Cinco días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 150 mm3.

Se inyectó PRIT-0165 i.v. a una concentración de 30 o bien 100 |jg por 100 jl, seguido cuatro días después de agente de aclaramiento (grupos A-F) a una concentración de 10, 25, 30, 50 o 100 jg por 100 jl. Se inyectó 212Pb-DOTAM dos horas después del CA. Los grupos G y H no recibieron agente de aclaramiento entre las administraciones de anticuerpo biespecífico y quelato radiomarcado.

Se sacrificaron los ratones con propósitos de biodistribución 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, y se recogieron sangre, vejiga, bazo, riñones, hígado, pulmón, músculo, cola y tumor. Se pesaron las muestras y se midió la radioactividad y, posteriormente, se calculó el %DI/g para cada órgano, incluyendo las correcciones por desintegración y fondo.

Resultados, 90

La acumulación de 212Pb en tejidos normales fue baja para todos los grupos a los que se administró un agente de aclaramiento; por el contrario, los grupos que no recibieron agente de aclaramiento presentaron niveles significativos de radioactividad en general. Los datos de biodistribución demuestran el efecto de variar la cantidad de agente de aclaramiento (límite de 100 kDa). La regresión lineal de los datos tumorales individuales proporcionó una pendiente significativa, lo que indica una mayor captación tumoral con cantidades decrecientes de Dex500(p= 0,03, R2 = 0,31). El efecto sobre el contenido de radioactividad en sangre fue drástico, pasando de 31,5 ± 0,2 %Dl/g usando PBS a 1,6 ± 0,5 %DI/g usando 10 jg de Dex500.

Dos grupos recibieron PRIT-0165 y Dex500 en una proporción igual (1:1); 100 o bien 30 jg de cada agente. El %DI/g resultante en el tumor no fue significativamente diferente entre los dos grupos (prueba de la T para datos independientes,p= 0,726). De modo importante, la comparación entre cantidades iguales de Dex500 con diferentes límites de filtración mostró un aumento significativo en la acumulación tumoral usando el límite de PM más alto: 54,9 ± 6,9 en lugar de 32,5 ± 4,4 %DI/g (prueba de la T para datos independientes,p= 0,009).

La figura 15 muestra la distribución de 212Pb 24 h después de la inyección de DOTAM radiomarcado (%DI/g ± DE, n = 3), usando 30 o 100 jg de anticuerpo biespecífico y 10-100 jg de agentes de aclaramiento con límites de filtración de 100 o 30 kDa, o sin agente de aclaramiento en absoluto (PBS).

La figura 16 muestra el efecto sobre la concentración de actividad de 212Pb en sangre y tumor con cantidades crecientes de agente de aclaramiento (0-100 jg). Se predirigieron los tumores usando 100 jg de PRIT-0165, seguido 4 días después de Dex500 diafiltrado con un límite de 100 kDa, o PBS. Se administró 212Pb-DOTAM 2 horas después del C<a>. Los símbolos representan el %DI/g 24 h después de la inyección radioactiva, y la línea la regresión lineal de los datos del tumor.

Sumario y conclusión

El estudio demostró un incremento radical en la acumulación tumoral de 212Pb, mientras se mantienen bajos niveles de radioactividad circulante. Se concluyeron dos hallazgos clave: 1) la diafiltración con un límite de 100 kDa disminuyó significativamente la penetración tumoral de los fragmentos de dextrano unidos a DOTAM, y 2) la proporción de CA con respecto a bsAb afectó el resultado más que la cantidad absoluta de CA. Se logró una excelente proporción de tumor con respecto a sangre usando una proporción anticuerpo:CA de 10:1 después de la administración de 100 |jg de anticuerpo biespecífico. Además, se concluyó que todos los estudios futuros que usen agentes de aclaramiento a base de Dex500 deben usar reactivos diafiltrados usando un límite de 100 kDa.

Ejemplo 23: impacto en la radioactividad asociada a tumor (protocolo 95)

En este estudio, se compararon nueve agentes de aclaramiento diferentes a base de dextrano-500 en términos de inhibición de la asociación de 212Pb-DOTAM a tumores. Más específicamente, el experimento evaluó el impacto en la radioactividad asociada a tumor de i) la saturación de TCMC, ii) la proporción de agente de aclaramiento con respecto a anticuerpo y iii) el procedimiento de producción/purificación. Además, se comparó la captación tumoral después de la inyección de 10 o 30 jC i de 212Pb-DOTAM, sin tratamiento predirigido o CA, para evaluar si la saturación de radioactividad del tumor ya se había logrado a la dosis más baja.

Diseño de estudio, protocolo 95

*Volumen de inyección de 100 j l

Grupos de estudio en el protocolo 95 (ntot = 27)

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea de células BxPC3 (paso 20) en medio RPMI mezclado 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat.

354230). A cada ratón (de 8 semanas de edad) se le inyectaron s.c. 5*10® células en 100 j l de RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Quince días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 210 mm3.

Se administró PRIT-0165 (100 jg por 100 j l) i.v., seguido tres días después de reactivos de aclaramiento a base de dextrano-500 (10-170 jg por 100 j l) con sustitución de TCMC variable (10-100 %). Los grupos J y K recibieron PBS en lugar de agente de aclaramiento. Dos horas después, se les inyectaron i.v. a los ratones 100 |jl de las respectivas soluciones de 212Pb-DOTAM (10 o 30 jCi).

Se sacrificaron los ratones y se sometieron a necropsia 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM. Se recogieron sangre, vejiga, bazo, riñones, hígado, pulmón, músculo, cola y tumores, se pesaron y se midió el contenido de radioactividad y, posteriormente, se calculó el %DI/g.

Resultados, 95

Los datos de biodistribución revelaron una tendencia aparente en el contenido promedio de radioactividad (%DI/g ± DE) en los tejidos recogidos 24 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM dependiendo de la cantidad administrada, con una mayor concentración de 212Pb en sangre y tejidos normales con menor cantidad de CA. Además, una mayor actividad de 212Pb dio como resultado una mayor acumulación de 212Pb en el tumor, sin un incremento correspondiente en la captación en tejido normal.

La figura 17 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). Las barras gris oscuro y negro representan controles positivos sin Ca , con los que se compararon los reactivos candidatos.

ANOVA unifactorial con corrección para comparaciones múltiples reveló que solo Dex500-(40 %) (76,79 ± 33,28,p< 0,0001) y Dex500-(100 %) (43,26 ± 24,66,p= 0,0115) diferían significativamente del control negativo de 10 |jC¡ (2,26 ± 0,25) en términos de proporción de tumor con respecto a sangre. La diferencia percibida entre el reactivo de aclaramiento con la proporción de tumor con respecto a sangre más alta (Dex500-(40 %)) y el estándar previo (Dex500-(100 %)) no fue estadísticamente significativa (prueba de la T para datos independientes,p= 0,2336).

La figura 18 muestra el contenido de 212Pb en sangre y tumores 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3) y las proporciones de tumor con respecto a sangre correspondientes. Las barras gris oscuro y negro representan controles positivos sin CA, con los que se compararon los reactivos candidatos.

La regresión lineal y el ajuste de la curva polinómica (cúbica) se realizaron para analizar el impacto del incremento de las cantidades de agente de aclaramiento (Dex500-(10 %)) y la carga de TCMC (sin CA, Dex500-(10 %), Dex500-(20 %), Dex500-(40 %), Dex500-(100 %)) en la proporción de tumor con respecto a sangre. La pendiente de la curva lineal fue estadísticamente significativa (p < 0,0001) a favor de mayores cantidades de Dex500-(10 %) para una proporción de tumor con respecto a sangre incrementada, mientras que para una determinada cantidad de TCMC inyectados, en base a 100 jg de Dex500-(10 %), se indicó un máximo a una proporción de TCMC con respecto a Dex500 de alrededor de 60. Es importante destacar que estos resultados no se deben tomar fuera de su contexto para producir conclusiones generales sobre las cantidades de reactivos o la saturación de TCMC; son válidos solo para los ámbitos aplicados.

La figura 19 muestra la proporción de tumor con respecto a sangre 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM como función de la cantidad de CA (PJRD08-46) y la saturación de TCMC (9, 20, 39 u 84 a 1). Las líneas discontinuas representan la regresión lineal (R2 = 0,82) y el ajuste de curva no lineal (R2 = 0,74) de los datos respectivos.

La prueba final comparó 10 frente a 30 jC i de 212Pb-DOTAM, sin inyección de anticuerpos o agentes de aclaramiento. El contenido en sangre fue similar para los dos grupos de estudio, pero 30 jC i dio como resultado una mayor acumulación tumoral que 10 jC i: 107,74 ± 14,71 frente a 72,38 ± 10,83 %Dl/g (± DE, n = 3). Las proporciones de tumor con respecto a sangre resultantes fueron significativamente diferentes: 3,20 ± 0,20 frente a 2,26 ± 0,25 para 30 y 10 jC i, respectivamente (prueba de la T para datos independientes,p= 0,007).

Sumario y conclusión

En conclusión, 20 jg de Dex500 con 39 TCMC por molécula (Dex500-(40 %)) generaron una acumulación muy alta de 212Pb en tumores predirigidos combinada con una baja retención en sangre, 24 horas después de la administración de 212Pb-DOTAM.

Fue el agente de aclaramiento de mejor rendimiento, junto con 10 jg del CA estándar previo, Dex500-(100 %), con 84 TCMC por molécula. Debido a la considerable variabilidad intragrupo y al pequeño tamaño de muestra, la diferencia en la proporción de tumor con respecto a sangre no fue estadísticamente diferente entre los dos reactivos, pero los promedios indicaron que Dex500-(100 %) puede ser favorable. Además, se concluyó que 30 jC i de 212Pb-DOTAM pueden proporcionar una acumulación tumoral mayor que 10 jC i, es decir, no se alcanzó la saturación a la dosis más baja.

Ejemplo 24: impacto de la dosis de anticuerpo biespecífico en la acumulación tumoral (protocolo 91)

Este estudio tuvo como objetivo investigar el impacto de la dosis de anticuerpo biespecífico en la acumulación tumoral en un modelo de tumor subcutáneo. La hipótesis era que una mayor cantidad de anticuerpo biespecífico podría saturar más fácilmente los sitios de unión disponibles en las células tumorales, incrementando de este modo la captación posterior de quelato marcado. Por otra parte, un incremento excesivo de la dosis podría dar lugar a una acumulación menos eficaz de radioactividad asociada a tumor, debido a niveles mayores de anticuerpos biespecíficos circulantes. Diseño de estudio, protocolo 91

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio en el protocolo 91 (ntot = 21)

*Control de no unión a CEA

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea de células BxPC3 (paso 34) en medio RPMI mezclado 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat.

354230). A cada ratón (de 7-12 semanas de edad) se le inyectaron s.c. 5*10® células en 100 j l de RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Cinco días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 220 mm3.

A los ratones se les administraron por vía i.v. anticuerpos biespecíficos de unión a CEA PRIT-0165 o PRIT-0156 a una concentración de 30-200 jg por 100 jl, o 100 jg del anticuerpo de control de no unión a CEA PRIT-0175. Después de cuatro días, se les inyectó i.v. a todos los grupos un agente de aclaramiento a una concentración de 3, 10 o 20 |jg por 100 |jl (1/10 de la dosis de anticuerpo inyectada), seguido dos horas después de 10|jC¡ de 212Pb-DOTAM. Se sacrificaron los ratones 24 horas después y se realizaron necropsias. Se recogió sangre, vejiga, bazo, riñones, hígado, pulmón, músculo, cola y tumor. Se pesaron las muestras y se midió la radioactividad, y se calculó el %DI/g para cada órgano.

Resultados, 91

El tratamiento predirigido usando 100 jg de cualquier anticuerpo biespecífico de unión a CEA dio como resultado una acumulación significativa de 212Pb en los tumores, en comparación con 100 jg del control de no unión a CEA (prueba de la T para datos independientes,p= 0,027 y 0,008 para la comparación con PRIT-0156 y PRIT-0165, respectivamente). No se observó ninguna diferencia significativa en la captación tumoral cuando se incrementó la dosis de anticuerpo de 30 a 200 jg para ninguna construcción de unión a CEA. Sin embargo, los niveles globales de radioactividad estaban ligeramente elevados en la mayoría de los tejidos normales para dosis de anticuerpos superiores a 30 jg . De modo importante, el %DI/g en sangre se incrementó significativamente para cada incremento de dosis, excepto entre 100 y 200 jg de PRIT-0156 (prueba de la T para datos independientes, p<0,05).

Sumario y conclusión

Los tres niveles de dosis de anticuerpo (30, 100 y 200 jg ) dieron como resultado una captación específica alta de radioactividad en tumores para ambas construcciones biespecíficas sometidas a prueba. La falta de diferencia en la acumulación tumoral con la dosis incrementada indicó que los sitios de unión ya estaban saturados a la dosificación más baja, o que el tiempo entre la administración de PRIT y la inyección de agente de aclaramiento (cuatro días) era demasiado corto para permitir una acumulación tumoral adicional. Como se esperaba, los niveles de radioactividad en sangre se incrementaron con el incremento de la dosis, estrechando ligeramente el margen terapéutico del tratamiento.

Ejemplo 25: eficacia de CEA-PRIT (protocolo 93 (a, b))

En este estudio, se evaluó la eficacia de CEA-PRIT usando dos candidatos clínicos de bsAb (PRIT-0213 y PRIT-0214) en dos modelos de tumor subcutáneo paralelos: BxPC3 y LS174T. Los anticuerpos biespecíficos se compararon lado a lado en pautas posológicas de tratamiento de ciclo único y doble.

Diseño de estudio, protocolo 93a (BxPC3)

*Volumen de inyección de 100 |jl

Diseño de estudio, protocolo 93b (LS174T)

*Volumen de inyección de 100 j l

Los grupos A-G representan los ratones tratados a los que se les hizo seguimiento para la evaluación de eficacia, mientras que los grupos H-L comprenden ratones que se sacrificaron con propósitos de biodistribución 24 h después de su última inyección de 212Pb-DOTAM.

Grupos de estudio en el protocolo 93a (BxPC3; ntot = 71)

Grupos de estudio en el protocolo 93b (LS174T; ntot = 71)

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea de células en medios RPMI (BxPC3) o DMEM (LS174T) mezclados 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat. 354230).

Para el protocolo 93a, a los ratones (de 7 semanas de edad) se les inyectaron s.c. en el flanco derecho 5*10® células BxPC3 (paso 33) en 100 |jl de RPMI/Matrigel. Doce días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 235 mm3.

Para el protocolo 93b, a los ratones (de 9 semanas de edad) se les inyectaron s.c. en el flanco derecho 1*10® células LS174T (paso 2®) en 100 j l de DMEM/Matrigel. Tres días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 150 mm3.

Cada ciclo de tratamiento comenzó con la inyección de bsAb humanizados (PRIT-0213, PRIT-0214 o PRIT-0175). Después de cuatro días, se administró el agente de aclaramiento (Dex500), seguido dos horas después de 212Pb-DOTAM. Para minimizar la reingestión de orina/heces radioactivas después del ciclo de tratamiento 1, se cambiaron las jaulas 4 horas después de la administración de 212Pb-DOTAM y, a continuación, de nuevo a las 24 h p.i. Para el ciclo 2, los ratones se colocaron en jaulas con suelos de rejilla durante 4 horas después de la administración de 212Pb-DOTAM, antes de transferirse a nuevas jaulas con lecho estándar. A continuación, se cambiaron todas las jaulas a las 24 h p.i., como después del ciclo 1.

El desarrollo del tumor en los ratones se siguió a través de calibración repetida tres veces por semana. Si era necesario, se realizó un calibrado adicional en los huecos entre las mediciones programadas. Se midió el peso corporal de los animales repetidamente de la misma manera. Los ratones con un volumen tumoral que alcanzó 3000 mm3 se sacrificaron de inmediato. Otros factores que se tuvieron en cuenta para el sacrificio por motivos éticos fueron la pérdida de peso corporal, el estado del tumor (por ejemplo, ulceración) y el aspecto general del animal. Se proporcionó alimento húmedo a todos los animales comenzando a partir de los cinco días después de la inyección radioactiva si así lo exigía una pérdida aguda de peso corporal (colectiva o individual) debido a la toxicidad inducida por radiación, hasta que todos los individuos se hubieran recuperado lo suficiente.

Se extrajeron los siguientes órganos y tejidos de los grupos A-G en el momento del sacrificio: vejiga, ovarios, hígado, bazo, riñones, fémur (incluyendo la médula ósea), colon, yeyuno, estómago y tumor. Se observaron y fotografiaron afecciones inesperadas o anómalas. Los tejidos se pusieron de inmediato en formol tamponado neutro al 10 % (4 °C) y a continuación se transfirieron a PBS (4 °C) después de 5 días. A continuación, se enviaron las muestras fijadas con formol a Roche Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, para su posterior procesamiento y análisis.

Los ratones en los grupos H, J y L se sacrificaron y se sometieron a necropsia 24 horas después de su primera y única inyección de 212Pb-DOTAM; los grupos I y K se sacrificaron y se sometieron a necropsia 24 horas después de su segunda inyección de 212Pb-DOTAM. Se extrajeron los siguientes órganos y tejidos: sangre, vejiga, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, hígado, pulmón, corazón, fémur, músculo, cola y tumor. Se pesaron las muestras recogidas y se midió la radioactividad y, posteriormente, se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (%DI/g), incluyendo las correcciones por desintegración y fondo.

Resultados, 93a

Los resultados después del ciclo de tratamiento 1 se correspondieron bien con las captaciones tisulares logradas previamente en este modelo, con alta acumulación tumoral (25,0 ± 9,7 y 19,5 ± 6,4 %DI/g para PRIT-0213 y PRIT-0214, respectivamente) y baja acumulación en tejidos normales. Sin embargo, el ciclo 2 dio como resultado un perfil de distribución de 212Pb diferente, con un contenido radioactivo incrementado en todos los tejidos recogidos.

Todos los ratones a los que se les inyectó 30 |jC¡ de 212Pb-DOTAM experimentaron un descenso inicial en el peso corporal que se mitigó el día 10 después de la primera inyección radioactiva. Los grupos a los que se les administró una segunda inyección de 30 jC i padecieron una pérdida de peso aguda más pronunciada, probablemente debido al aclaramiento más lento de la radioactividad y la acumulación resultante de 212Pb en tejidos normales observada en la biodistribución asociada del ciclo 2. No se observó dicho efecto para los grupos que recibieron un segundo ciclo de 10 jC i, después de lo que la pérdida de peso fue moderada.

Todos los grupos duplicaron su volumen tumoral para el día 14-19 en comparación con el valor de referencia. El primer tratamiento con 212Pb-DOTAM se dio el día 16, después de lo que los tumores en los grupos de PRIT-0213 y PRIT-0214 continuaron creciendo durante aproximadamente una semana antes de presentar un retroceso en el volumen. Ningún tumor remitió por completo, pero los volúmenes permanecieron relativamente constantes en el nivel bajo hasta el día 40-47, cuando una vez más alcanzaron el doble volumen en comparación con el valor de referencia. La segunda inyección de 30 jC i de 212Pb-DOTAM se administró en este punto (día 44), lo que, como se analiza previamente, dio como resultado una pérdida de peso aguda y el posterior sacrificio para la mayoría de los ratones afectados dentro de la semana siguiente. Los ratones a los que se les dio un segundo ciclo de tratamiento con 10 en lugar de 30 jC i de 212Pb-DOTAM (día 55) experimentaron menos toxicidad inducida por radiación. La inyección de 10 jC i dio como resultado una segunda fase de remisión tumoral, que duró entre aproximadamente los días 58 y 75. PRIT con el bsAb inespecífico dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral significativa pero limitada en comparación con 212Pb-DOTAM solo o PBS. Las comparaciones de medias usando el procedimiento de Dunnet revelaron que todas las pautas posológicas de tratamiento usando PRIT-0213 y PRIT-0214 dieron como resultado proporciones iguales de tratamiento con respecto a control, todas significativamente diferentes en comparación con cualquier grupo de control desde el día 23-26 en adelante.

El día 47, el último día en que todos los grupos de tratamiento todavía estaban representados, la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) fue de un 87,3, 88,8, 84,1, 88,7, 57,5 y 15,8 % para los grupos "PRIT-0213, 30 10 jCi", "PRIT-0213, 30 30 jC i", "PRIT-0214, 30 10 jC i", "PRIT-0214, 30 30 jC i", "PRIT-0175, 30 30 jC i" y "DOTAM solo, 30 30 jC i", respectivamente, en comparación con PBS. El último ratón en el grupo de control de vehículo se representó el día 66, momento en el que la TGI fue de un 87,8, 84,5 y 87,3 % para los tres grupos restantes: "PRIT-0213, 30 10 jC i", "PRIT-0214, 30 10 jC i" y "PRIT-0214, 30 30 jC i", respectivamente. Un total de seis ratones sobrevivieron hasta el final del experimento (día 84): uno del grupo "PRIT-0213, 30 10 jCi", tres del grupo "PRIT-0214, 30 10 jC i" y dos del grupo "PRIT-0214, 30 30 jCi".

Se realizaron pruebas por pares para especificar qué grupos eran significativamente diferentes en términos de supervivencia: la prueba del orden logarítmico (más peso en acontecimientos de supervivencia posteriores) y la prueba de Wilcoxon (más peso en tiempos de supervivencia temprana), ambas usando la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples. Debido a la toxicidad inducida por radiación, "PRIT-0213, 30 30|jC¡" funcionó igual a o peor que los grupos de control. El tratamiento PRIT-0214 correspondiente logró resultados ligeramente mejores, incrementando la supervivencia en comparación con PBS y el anticuerpo inespecífico. Los dos grupos con 10<j>C¡ de 212Pb-DOTAM en el segundo ciclo incrementaron significativamente la supervivencia en comparación con todos los grupos, excepto entre sí y "PRIT-0214, 30 30 j C¡".

Prueba del orden logarítmico por pares (nivel de prueba múltiple = 0,00238)

Prueba de Wilcoxon por pares (nivel de prueba múltiple = 0,00238)

Resultados, 93b

Ambos ciclos de tratamiento dieron como resultado una alta acumulación tumoral de 212Pb y una baja acumulación de 212Pb en tejidos normales. La captación tumoral después del ciclo 1 fue de 30,9 2,9 y 21,4 ± 1,9 %DI/g para PRIT-0213 y PRIT-0214, respectivamente; después del ciclo 2 los números correspondientes fueron 33,2 ± 0,7 y 40,1 ± 6,5 %DI/g.

Todos los ratones a los que se les inyectó 212Pb-DOTAM experimentaron una disminución moderada en el peso corporal, de forma similar después de ambos ciclos de tratamiento de 30 j C¡. Sin embargo, se sacrificaron prematuramente muchos animales por motivos éticos debido al mal estado del tumor.

El primer tratamiento con 212Pb-DOTAM se dio el día 8. Ningún tumor remitió en comparación con el valor de referencia, pero los promedios de grupo de PRIT-0213 y PRIT-0214 permanecieron relativamente constantes, incrementándose muy lentamente. La segunda inyección de 30|jC¡ de 212 Pb-DOTAM se administró el día 36; sin embargo, debido al rápido crecimiento tumoral en los grupos de control y al problema previamente analizado con el mal estado del tumor en todos los grupos, muchos ratones ya se habían sacrificado para ese momento. Aquellos que recibieron una segunda inyección de 30 j C¡ de 212Pb-DOTAM recuperaron o retuvieron su control tumoral, pero ningún tumor remitió por completo. Las comparaciones de medias usando el procedimiento de Dunnet revelaron que todas las pautas posológicas de tratamiento usando PRIT-0213 y PRIT-0214 dieron como resultado proporciones de tratamiento con respecto a control significativamente diferentes en comparación con el grupo de PBS, comenzando a partir del día 14. Además, los controles de PRIT-0175 y DOTAM difirieron significativamente del control de vehículo, comenzando a partir del día 16 y 22, respectivamente.

El día 22, el último día en que todos los grupos de tratamiento todavía estaban representados, la TGI fue de un 83,1, 88,8, 87,5, 91,0, 53,0 y 64,7 % para los grupos "PRIT-0213, 30 j C¡", "PRIT-0213, 30 30 j C¡", "PRIT-0214, 30 Ci", "PRIT-0214, 30 30 j C¡", "PRIT-0175, 30 30 j C¡" y "DOTAM solo, 30 30 j C¡", respectivamente, en comparación con PBS. El último ratón en el grupo de control de vehículo se representó el día 30, momento en el que la TGI fue de un 92,5, 89,5, 90,8, 92,6 y 79,9 % para los grupos restantes "PRIT-0213, 30 j C¡", "PRIT-0213, 30 30 j C¡", "PRIT-0214, 30 j C¡", "PRIT-0214, 30 30 j C¡" y "PRIT-0175, 30 30 j C¡", respectivamente. Dos ratones sobrevivieron hasta el final del experimento (día 101), ambos del grupo "PRIT-0214, 30 30 j C¡".

La figura 30 muestra los promedios de crecimiento tumoral con error estándar para los grupos A-G (n=8) en el modelo LS174T. Las curvas se truncaron en la primera muerte de cada grupo. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM para algunos o todos los grupos, de acuerdo con el diseño de estudio.

La figura 31 muestra las curvas de crecimiento tumoral individuales para los grupos A-G en el modelo LS174T. Las líneas verticales punteadas indican la administración de 212Pb-DOTAM.

Las pruebas del orden logarítmico y de Wilcoxon se realizaron con corrección de Bonferroni, para especificar qué grupos eran significativamente diferentes en términos de supervivencia. Los hallazgos clave fueron que "PRIT-0214, 30 30<j>C¡" incrementó significativamente la supervivencia en comparación con todos los grupos, excepto "PRIT-0213, 30 j C¡". Sin embargo, la supervivencia global en el grupo "PRIT-0213, 30 30 j C¡" no fue significativamente diferente de la de "PRIT-0213, 30<j>C¡", difiriendo, por tanto, solo ligeramente de la de "PRIT-0214, 30 30<j>C¡".

Prueba del orden logarítmico por pares (nivel de prueba múltiple = 0,00238)

Prueba de Wilcoxon por pares (nivel de prueba múltiple = 0,00238)

Sumario y conclusión

CEA-PRIT usando cualquiera de los dos anticuerpos biespecíficos PRIT-0213 y PRIT-0214, con uno o dos ciclos de tratamiento, dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral significativa y un incremento de la supervivencia para ambos modelos de tumor estudiados. Los esfuerzos de solución de problemas tras la inesperada biodistribución de 212Pb del segundo ciclo y la posterior toxicidad inducida por radiación en el estudio BxPC3 concluyeron que la situación probablemente se provocó por un problema no identificado relacionado con la inyección. Se debe repetir el estudio de eficacia de BxPC3 para confirmar que el problema no es inherente a la pauta posológica de tratamiento. No se deben realizar experimentos futuros en el modelo LS174T hasta que se resuelva el problema del mal estado del tumor. Para incrementar la eficacia del segundo ciclo de tratamiento, se propone que el tiempo entre los dos ciclos se acorte para evitar la recidiva del tumor. Además, añadir un tercer ciclo de tratamiento a la pauta posológica también podría ser una opción para una evaluación adicional.

Finalmente, los estudios de los mecanismos subyacentes detrás del crecimiento tumoral son de gran interés para aclarar por qué, aunque su crecimiento se inhibe, los tumores no remiten por completo, sino que comienzan a recidivar después de un determinado tiempo.

Ejemplo 26: dosis de agente de aclaramiento (protocolo 105)

En este estudio, se evaluó un intervalo de dosis del agente de aclaramiento a base de dextrano-500 con un 50 % de saturación de TCMC en términos de efecto sobre la asociación de 212Pb-DOTAM a tumores predirigidos. Diseño de estudio, protocolo 105

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio en el protocolo 105 (ntot = 18)

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea de células BxPC3 (paso 26) en medio RPMI mezclado 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat.

354230). A cada ratón (de 6 semanas de edad) se le inyectaron s.c. 5*106 células en 100 |jl de RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Quince días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 222 mm3.

Se administró CEA-PRIT (100 jg por 100 j l) i.v., seguido tres días después de Dex500- (50 %) (5-250 jg por 100 jl). El grupo F recibió PBS en lugar de agente de aclaramiento. Dos horas después, a los ratones se les inyectaron i.v. 100 j l de 212Pb-DOTAM (10 jC i).

Resultados, 105

La acumulación tumoral de 212Pb fue en general alta para todas las dosis de CA, excepto 250 jg . El aclaramiento sanguíneo del anticuerpo biespecífico CEA-PRIT fue más eficiente para dosis de CA de 30, 75 y 250 jg . En consecuencia, las proporciones más altas de tumor con respecto a sangre se lograron para 30, 75 y 250 jg de CA: 187,7, 180,2 y 243,5, respectivamente. La captación tumoral correspondiente de 212Pb fue de 91,8 ± 18,9, 70,5 ± 11,1 y 35,2 ± 17,0 %DI/g (±DE, n=3).

La figura 33 muestra la distribución de radioactividad en tejidos seleccionados 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3). Las barras grises representan la acumulación en el tejido después de la inyección de diversas cantidades de CA Dex500- (50 %); la barra negra representa el control sin CA.

La figura 34 muestra el contenido de 212Pb en sangre y tumores 24 h después de la inyección de 212Pb-DOTAM (%DI/g ± DE, n = 3) y las proporciones de tumor con respecto a sangre correspondientes. Las barras grises representan la acumulación en el tejido después de la inyección de diversas cantidades de CA Dex500- (50 %); la barra negra representa el control sin CA.

Sumario y conclusión

En base a la acumulación de 212Pb lograda en los tumores, el aclaramiento sanguíneo y la posterior proporción de tumor con respecto a sangre, una dosis de 30 jg de Dex500- (50 %) pareció favorable para CEA-PRIT en el modelo BxPc 3.

Ejemplo 27: tiempo de permanencia en sangre del agente de aclaramiento a base de dextrano-500 (protocolo 106)

En este estudio, se evaluó el agente de aclaramiento a base de dextrano-500 con un 50 % de saturación de TCMC en términos de tiempo de permanencia en sangre. El objetivo era identificar un margen de tiempo adecuado para tratamientos repetidos (1-4 semanas), garantizando que permanezca en circulación poco o ningún agente de aclaramiento que se pueda unir a los anticuerpos biespecíficos administrados, bloqueando eficazmente la unión de DOTAM radiomarcado inyectado posteriormente.

Diseño de estudio, protocolo 106

*Volumen de inyección de 100 |jl

Grupos de estudio en el protocolo 106 (ntot = 24)

A los ratones (9 semanas) se les administró i.v. CEA-PRIT (100 jg por 100 jl), seguido un día después de Dex500-(50 %) (25 jg por 100 jl). Los grupos B, D, F y H recibieron PBS en lugar de agente de aclaramiento. Después de 1, 2, 3 o 4 semanas, se volvió a inyectar a los ratones i.v. CEA-PRIT (100 jg por 100 jl), seguido un día después de 100 j l de 212Pb-DOTAM (10 jC i).

Se sacrificaron los ratones 4 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM. Se extrajo sangre en el momento del sacrificio y se pesaron y midieron las muestras para determinar el contenido de radioactividad. Posteriormente se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de sangre (%DI/g), incluyendo las correcciones por desintegración y fondo.

Resultados, 106

No hubo diferencias estadísticamente significativas en el contenido promedio de radioactividad entre los ratones que recibieron Dex500-(50 %) o PBS para ninguno de los puntos temporales estudiados (ANOVA unifactorial, prueba de comparaciones múltiples de Sidak, p>0,05).

Sumario y conclusión

Los resultados muestran que se puede iniciar un ciclo de tratamiento repetido con CEA-PRIT ya una semana después de la última inyección de Dex500-(50 %), sin bloquear la unión de 212Pb-DOTAM administrado posteriormente a bsAb CEA-DOTAM.

Ejemplo 28: formatos adicionales de anticuerpos biespecíficos

- una secuencia señal (SS) de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un gen/proteína que se va a expresar, y

Además de la unidad/casete de expresión que incluye el gen deseado que se va a expresar, el plásmido de expresión de mamífero básico/estándar contenía

- un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido enE. coli,y - un gen de betalactamasa que confiere resistencia a ampicilina enE. coli.

P1AE1766

Se ensamblaron genes que codifican la cadena pesada de anticuerpo que incluyen genes de fusión C terminal que comprenden una cadena pesada de anticuerpo completa y funcional, seguida de un dominio VL-CH1 o VH-C-kappa de anticuerpo adicional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia separados cada uno por un conector G4Sx4 al extremo C del dominio CH3 de una molécula de IgG humana (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL-CH1 o VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VH-Ck). Se expresaron moléculas de anticuerpo recombinante que portan un dominio VL-CH1 y un dominio VH-Ck en el extremo C de los dos dominios CH3, respectivamente, usando la tecnología botón en ojal.

P1AE1768

Se ensamblaron genes que codifican la cadena pesada de anticuerpo que comprenden una cadena pesada de anticuerpo completa y funcional que se dirige a CEA o bien DOTAM, usando la tecnología botón en ojal.

Se ensamblaron genes que codifican la cadena ligera de anticuerpo que comprenden una cadena ligera de anticuerpo completa y funcional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia. Se garantizó la asociación correcta usando la tecnología CrossMab (intercambiando los dominios CL y CH1 por uno de los brazos).

P1AE1769

Se ensambló un gen de fusión fusionando un fragmento de ADN que codifica un dominio VH-CH1 por medio de un conector G4Sx4 al extremo N del dominio VL de una molécula de IgG humana que contenía un intercambio del dominio VL por el dominio VH (por tanto, preparando un gen de fusión que codifica la estructura VH-CH1-conector-VL-CH1-bisagra-CH2-CH3). Se expresaron moléculas de anticuerpo recombinante que portan un VH-CH1 y sin fusión en los extremos N, respectivamente, usando la tecnología botón en ojal.

Se ensamblaron genes que codifican VH-C kappa que comprenden una cadena ligera de anticuerpo completa y funcional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia.

Se garantizó la asociación correcta usando la tecnología CrossMab.

P1AE1767

Se ensamblaron genes que codifican la cadena pesada de anticuerpo que incluyen genes de fusión C terminal que comprenden una cadena pesada de anticuerpo completa y funcional, seguida de un dominio V-ligero-CHI de anticuerpo adicional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia separados cada uno por un conector G4Sx4 al extremo C del dominio CH3 de una molécula de IgG humana (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL-CH1). Se expresaron moléculas de anticuerpo recombinante que portan un VL-CH1 y sin fusión en los extremos C de los dos dominios CH3, respectivamente, usando la tecnología botón en ojal.

Se garantizó la asociación correcta usando la tecnología CrossMab.

P1AE1770

Se ensamblaron genes que codifican la cadena pesada de anticuerpo que incluyen genes de fusión C terminal que comprenden una cadena pesada de anticuerpo completa y funcional, seguida de un dominio V-ligero-C-Kappa-conector-V-pesado-CH1 de anticuerpo adicional fusionando un fragmento de ADN que codifica los respectivos elementos de secuencia separados cada uno por un conector G4Sx4 al extremo C del dominio CH3 de una molécula de IgG humana (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3-conector-VL-Ck-conector-VH-CH1). Se expresaron moléculas de anticuerpo recombinante que portan un Fab monocatenario y sin fusión en los extremos C de los dos dominios CH3, respectivamente, usando la tecnología botón en ojal.

Expresión transitoria de las moléculas de anticuerpo

Las moléculas se han purificado por un MabSelect Sure (cromatografía de afinidad) y seguido de Superdex 200 (cromatografía de exclusión por tamaño).

Evaluación de Kinexa de las propiedades de unión a DOTAM de los diferentes formatos

Para el análisis detallado de la determinación de afinidad, se usó Kinexa.

Instrumental y materiales

Preparación de microesferas recubiertas de antígeno

Las microesferas de PMMA se recubrieron de acuerdo con el protocolo del manual de KinExA para moléculas biotiniladas (Sapidyne). En resumen, en primer lugar, se añadieron 10 |jg de biotina-BSA (Thermo Scientific) en 1 ml de PBS (pH 7,4) por vial (200 mg) de microesferas para el recubrimiento por adsorción. Después de rotar durante 2 h a temperatura ambiente, se retiró el sobrenadante y se lavaron las microesferas 5 veces con 1 ml de PBS. En segundo lugar, se añadió 1 ml de 100 jg de proteína de unión a biotina NeutrAvidin (Thermo Scientific) en PBS que contenía 10 mg/ml de BSA a las microesferas y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h adicionales para acoplar NeutrAvidin a las microesferas y proporcionar sitios de unión a biotina adicionales para la posterior unión de proteínas biotiniladas. A continuación, se aclararon las microesferas recubiertas con NeutrAvidin 5 veces con 1 ml de PBS. Finalmente, se recubrieron las microesferas con 200 ng/ml de mezcla isómero-Pb-DOTAM biotinilado (50 ng para cada isómero) en PBS y se incubaron durante 2 h adicionales a temperatura ambiente. A continuación, se resuspendieron las microesferas en 30 ml de PBS y se usaron de inmediato.

Ensayos de equilibrio KinExA

Todas las construcciones son comparables en KD ya que los intervalos de confianza se superponen.

Secuencias de moléculas en diferentes formatos:

Las modificaciones de carga opcionales se muestran en negrita y subrayado: EQ->RK o KK->EE

P1AE1766

>CEA Cadena ligera RK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTI

35LQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKl.KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>CEA Cadena pesada con DOTAM VL / CH1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVYVSWNñGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTI PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASK LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSC

> CEA Cadena pesada con DOTAM VH / CK

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPFAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV3HEDPF.VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKE5GPVLVKPTETLTLTCTV3GF5L5TY5MSWIRQPPGKALEWLGFIG5RG DTYYñSWAKGRLTISKDTSKSQWLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVf i f p p s d e q l k s g t a s v v c l l n n f y p r e a k v g w k v d n a l q s g n s q e s v t e q d s k d s t y s l s s t i / t l s x a d y e k h kVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

P1AE1767

>DOTAM "LC" con VH / CK

VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIKgPPGKALEWLÜFIGSRGDTYYASWAKGRLriSKUTSKSOVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE$VTEQDSKDSTYSLSSrLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

> CEA Cadena ligera RK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRK1KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC

> CEA Cadena pesada con DOTAM VL / CH1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWrNTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALrSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEECVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASK LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSC

>CEA Cadena pesada

QVQLVQSC3AEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGrTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICKVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKMQVSDSCAVKG

ryPSDrAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K

P1AE1768

>CEA LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCHQYYrYPLFTFGQGTK1EIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

> DOTAM Cadena pesada con VL / CH1

IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VI/TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIñV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHKHYTQKSLSLSPGK

> CEA Cadena pesada

q v q l v q s g a e v k k p g a s v k v s c k a s g y t f t e f g m n w v r q a p g q g le w m g w : n t k t g e a t y v e e f k g r v t f t t d t s TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTIMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALGAFIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K

>DOTAM "LC" VH / CK

VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKS QVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYFREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

P1AE1769

- DOTAM "LC" con VH / CK VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLT1SKDTSKS QVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLKGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

> CEA LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP5DRKLK5GTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDYALQSGNSQESVTEQDSKGSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

> CEA HC con CEA VH / CH1 / DOTAM VL / CH1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS

t s t a y m e l r s l r s d d t a v y y c a r w d f a y y v e a m d y w g q g t t v t v s s a s t k g p s v f p l a p s s k s t s g g t a a l g c l v EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPñVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD g g g g s g g g g s iq m t q s p s s l s a s v g d r v t it c q s s h s v y s d n d l a w y q q k p g k a p k l l iy q a s k l a s g v p s r f s g s g s g t d f t l t is s l q p e d f a t y y c l g g y d d e s d t y g f g g g t k v e ik s s a s t k g p s v f p l a p s s k s t s g g t a a l g c l v k d y f p e p v t v s w n s c -a l t s g v h t f p a v l q s s g t .y s l s s w t v p s s s l g t q t y ic n v n h k p s n t k v d k k v e p k s c d k t h t c p p c p a p e a a g g p s v f l f p p k p k d t l m is r t p e v t c v v v d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t k p r e eQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKriSKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK

>CEA HC

QVQLVQSGAEVKKPGASVKV3CKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS t s t a y m e l r s l r s d d t a v y y c a r w d f a y y v e a m d y w g q g t t v t v s s a s t k g p s v f p l a p s s k s t s g g t a a l g c l v EDYFPEPVTVSWNSGñLTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

n s t y r v v s v l t v ih o d w l n g k e y k c k v s n k a l g a p ie k t is k a k g q p r e p q v c t l p p s r d e l t k n q v s l s c a v k g FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K

P1AE1770

> CEA LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQFSVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

> CEA HC con DOTAM scFab: DOTAM VL / Ck / conector / VH CH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKV3CKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELrKN'QVSLWCLVKG FYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASK LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGVTLKESGPVLVKPTETLTITCTVSGFSLS TYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCflRERDPYGGG AYPPHLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

5SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVCKKVEPKSC

> CEA HC

q v q lv q s g a e v k k p g a s v k v s c k a s g y t f t e f g m n w v r q a p g q g le w m g w in t k t g e a t y v e e f k g r v t f t t d t s TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDE1TKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K

Ejemplo 29: anticuerpos biespecíficos que se unen a Pb-DOTAM y CD20 o Her2

Generación de plásmidos para la expresión recombinante de las cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo Las proteínas deseadas se expresaron por transfección transitoria de células de riñón embrionario humano (HEK 293). Para la expresión de un gen/proteína deseado (por ejemplo, la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa o una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa que contiene un dominio adicional (por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina en su extremo C) se usó una unidad de transcripción que comprende los siguientes elementos funcionales:

- una secuencia señal (SS) de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un gen/proteína que se va a expresar, y

a) Plásmido de expresión para las cadenas pesadas de anticuerpo

- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

La secuencia de aminoácidos del fragmento de la cadena pesada de anticuerpo maduro con la proteína de fusión de dominio VH o VL C terminal es

P1AD9826 ^ CD20-DOTAM QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD

y f p e f v t v s w n s g a l t s g v h t f p a v l q s s g l y s l s s w t v p s s s l g t q t y ic n v n h k p s n t k v d k k v e p k s c d k t HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG

g g s g g g g s g g g g s g g g g s iq m t q s p s s l s a s v g d r v t it c q s s h s v y s d n d l a w y q q k p g k a p k l l iy q a s k l a s GVPSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIK

q v q l v q s g a e v k k p g s s v k v s c k a s g y a f s y s w in w v r q a p g q g l e w m g r if p g d g d t d y n g k f k g r v t it a d k s t s t a y iy e l s s i.r s e d t a v y y c a r n v f d g y w g v y w g q g t l v t v s s a s t k g p s v f p l a p s s k s t s g g t a a l g c l v k d YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPF.VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS t y r v v s v l t v l h q d w l n g k e y k c k v s k k a l g a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t l p p c r d e l t k n q v s l w c l v k g f y PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDrY y a s w a k g r l t is k d t s k s q v v l t m t n m d p v d t a t y y c a r e r d p y g g g a y p p h l w g r g t l v t v s s

P1AD9827 ^ ERBB2-DOTAM

e v q l v e s g g g l v q p g g s l r l s c a a s g f k ik d t y ih w v r q a p g k g l e w v a r iy p t n g y t r y a d s v k g r f t ís a d t s KNTAYLQKNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

d y f p e p v t v s w n s g a l t s g v h t f p a v l q s s g l y s l s s v v t v p s s s l g t c t y ic n v n h k p s n t k v d k k v e p k s c d k THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLKISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYK

SrYRVVSVLTVLHQnWLNGKFYKCKVSNKALGflPIEKTTSKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSESCAVKGF YPSDIAVFWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHMHYTQKSLSLSPGG GGGSGGGC-SGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKIKDTYIKWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVGVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCOK THrCPPCPAPEAASGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHFDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN SGYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNXALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG

gggsggggsggggsc-g g g s v t l k e s g p v l v k p t e t l t l t c t v s g f s l s t y s m s w ir q p p g k a l e w l g f ig s r g d t YYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWCRGTIVTVSS

b) Plásmido de expresión para las cadenas ligeras de anticuerpo

- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de anticuerpo (VL-CL), y

P1AD9827 ^ ERBB2-DOTAM

d iq m t q s p s s l s a s v g d r v t it c r a s q d v n t a v a w y q q k p g k a p k l l iy s a s f l y s g v p s r f s g s r s g t d f t l t i SSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG'TASVVCLL.NNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVIEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKÜKVYACEVTIIQGLSSPVIKSFNRGEC

P1AD9826 ^ CD20-DOTAM DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTD FTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGECExpresión transitoria de las moléculas de anticuerpo

Purificación de las moléculas de anticuerpo P1AD8926 y P1AD8927

Las moléculas de PRIT se han purificado por un MabSelect Sure (cromatografía de afinidad) y seguido de Superdex 200 (cromatografía de exclusión por tamaño).

Análisis de masas:

Para confirmar la identidad de las moléculas de PRIT, se usó ESI-EM.

Análisis de FACS de la funcionalidad de P1AD8927

Para evaluar la funcionalidad de P1AD8927, se separaron las células KPL-4 del recipiente de cultivo usando Accutase a 37 °C durante 10 minutos. Posteriormente, se lavaron las células dos veces en PBS y se sembraron en placas de fondo en V de 96 pocillos hasta una densidad final de 4x106 células/pocillo.

El anticuerpo se marcó previamente con Zenon<IgG humana>A488, se añadió a las células en concentraciones como se indica en la fig. 38. Posteriormente, se incubaron las células durante 1 h en hielo y se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 200 |jl de PBS / FCS al 5 % para la medición de la fluorescencia FITC usando un FACS canto.

Los resultados se muestran en la figura 38.

Para evaluar la capacidad de unión del anticuerpo a DOTAM, después de la unión a las células KPL-4, se lavaron las células para retirar el anticuerpo no unido. Posteriormente, se añadió Pb-DOTAM-FITC para detectar anticuerpos unidos a células competentes de unión a DOTAM (figura 39). P1AD8927 muestra una señal de FITC dependiente de la dosis que se corrigió por isotipo. Este experimento muestra que la unión a DOTAM es funcional en este anticuerpo.

Análisis de FACS de la funcionalidad de P1AD8926

Para evaluar la funcionalidad de P1AD8926, se lavaron células Raji dos veces en PBS y se sembraron en placas de fondo en V de 96 pocillos hasta una densidad final de 4x106 células/pocillo.

El anticuerpo se marcó previamente con Zenon<IgG humana>A488, se añadió a las células en concentraciones como se indica en la fig. 40. Posteriormente, se incubaron las células durante 1 h en hielo y se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 200 j l de PBS / FCS al 5 % para la medición de la fluorescencia FITC usando un FACS canto.

Para evaluar la capacidad de unión del anticuerpo a DOTAM, después de la unión a las células Raji, se lavaron las células para retirar el anticuerpo no unido. Posteriormente, se añadió Pb-DOTAM-FITC para detectar anticuerpos unidos a células competentes de unión a DOTAM (figura 41). P1AD8927 muestra una señal de FITC dependiente de la dosis que se corrigió por isotipo. Este experimento muestra que la unión a DOTAM es funcional en este anticuerpo.

Ejemplo 30: Material y procedimientos de los ejemplos 31 a 37

Este ejemplo expone materiales y procedimientos para los estudios de los ejemplos 31-37.

PRIT de tres etapas (un ciclo)

Etapa 1: administración de un BsAb (i.v. o i.p.): El BsAb usado en los estudios se une a Pb-DOTAM con alta afinidad y se dirige al tumor, por ejemplo, por medio de CEA.

Etapa 2: administración de CA (i.v. o i.p.): Para permitir la acumulación tumoral eficaz de 212Pb-DOTAM, es necesario neutralizar el BsAb circulante en la sangre usando un CA que bloquee la unión de 212Pb-DOTAM al BsAb no unido, sin penetrar en el tumor y, en consecuencia, bloquear los sitios predirigidos. El CA se administra una vez que el BsAb se ha acumulado en un grado suficiente en el tumor, en general, después de 4-10 días. El Pb-DOTAM-dextrano-500-CA se desarrolló en base a un aminodextrano con un peso molecular medio de 500 kDa, al que se conjuga DOTAM por medio de un conector de tiourea, como se muestra a continuación.

Etapa 3: administración de 212Pb-DOTAM (i.v.): La inyección radioactiva se realiza en la última etapa, en general de 24 a 48 horas después de la inyección de CA, lo que permite que 212Pb-DOTAM se una preferentemente a los sitios tumorales predirigidos, reduciendo eficazmente la exposición a radiación sistémica.

Materiales y procedimientos generales

Los protocolos experimentales realizados en ARCoLab se revisaron y aprobaron por las autoridades locales (Comité Regional d'Ethique de l'Experimentation Animale du Limousin (CREEAL), Laboratoire Départemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne). Se proporcionaron ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) por Charles River y CD1 y se mantuvieron en condiciones sin patógenos específicos y oportunistas (SPEO) con ciclos diarios de luz y oscuridad (12 h/12 h), de conformidad con las pautas éticas. El estudio 121 empleó condiciones sin patógenos específicos (SPF), con ratones proporcionados por Envigo. No se realizaron manipulaciones durante los primeros 5 días después de su llegada, para permitir que los animales se aclimataran al nuevo entorno. Todos los ratones se controlaron diariamente para determinar síntomas clínicos y detección de acontecimientos adversos.

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección subcutánea (s.c.) de células tumorales que expresan CEA en medios de cultivo celular mezclados 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat. 354230). Los volúmenes tumorales se estimaron a través de calibración manual, calculada de acuerdo con la fórmula:volumen = 0,5 x longitud x ancho2.

Para minimizar la reingestión de orina/heces radioactivas, todos los ratones del estudio de eficacia se colocaron en jaulas con suelos de rejilla durante 4 horas después de la administración de 212Pb-DOTAM, antes de transferirse a nuevas jaulas con lecho estándar. A continuación, se cambiaron todas las jaulas 24 horas posinyección (p.i.). Este procedimiento no se realizó para ratones sacrificados con propósitos de biodistribución hasta 24 horas después de la inyección radioactiva.

El peso corporal (PC) de los animales de estudio se midió al menos 3 veces por semana, con mediciones adicionales según era necesario dependiendo del estado de salud. Los ratones con una pérdida de PC que excedía un 25 % de su PC inicial o con un volumen tumoral que alcanzaba 3000 mm3 se sacrificaron de inmediato. Otros factores que se tuvieron en cuenta para el sacrificio por motivos éticos fueron el estado del tumor (por ejemplo, áreas necróticas, fuga de sangre/líquido, signos de automutilación) y el aspecto general del animal (por ejemplo, pelaje, postura, movimiento). Se proporcionó alimento húmedo a todos los ratones comenzando a partir de los 5 días después de la inyección radioactiva, si así lo exigía una pérdida aguda de PC (colectiva o individual), hasta que todos los individuos se hubieran recuperado lo suficiente.

Se extrajo sangre al final del seno venoso usando venopunción retrorbitaria, seguido de extracción de tejido adicional para mediciones radioactivas y/o análisis histológico, según lo estipulado por los protocolos. Se registraron afecciones inesperadas o anómalas. Los tejidos recogidos para la fijación con formol se pusieron de inmediato en formol tamponado neutro al 10 % (4 °C) y a continuación se transfirieron a solución salina tamponada con fosfato (PBS; 4 °C) después de 5 días. Los órganos y tejidos recogidos con propósitos de biodistribución se pesaron y midieron para determinar la radioactividad usando un contador gamma automático 2470 WIZARD2 (PerkinElmer), y posteriormente se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% DI/g), incluyendo las correcciones por desintegración y fondo.

Se realizó un análisis estadístico usando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) y JMP 8 (SAS Institute Inc.). El análisis de la curva de inhibición del crecimiento tumoral (t G i) se realizó en base a los volúmenes tumorales medios usando la fórmula:

TGI=100-vtratamiento,d * vtratamiento,0

*100

vref,d~vref,0

dondedindica el día de tratamiento y0el valor de referencia. El vehículo (PBS) se seleccionó como el grupo de referencia. Se calculó la remisión tumoral (TR) de acuerdo con:

Tr=vtratamiento,0 vtratamiento,d

vtratamiento,0

donde los valores positivos indicaron remisión tumoral y valores por debajo de -1 crecimiento más allá del doble valor de referencia.

Se realizaron pruebas por pares para especificar qué grupos eran significativamente diferentes en términos de supervivencia: la prueba del orden logarítmico (más peso en acontecimientos de supervivencia posteriores) y la prueba de Wilcoxon (más peso en tiempos de supervivencia temprana), ambas usando la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples.

Compuestos de prueba

Los compuestos utilizados en los estudios descritos se presentan en las tablas tituladas "anticuerpos biespecíficos", "agentes de aclaramiento" y "quelatos radiomarcados", a continuación.

CEA-DOTAM (PRIT-0213) es un BsAb completamente humanizado dirigido al epítopo T84.66 de CEA, mientras que DIG-DOTAM (PRIT-0l75) es un BsAb de no unión a CEA usado como control negativo. P1AE1766, PlAE1767, P1AE1768, P1AE1769 y P1AE1770 son BsAb de CEA-DOTAM humanizados dirigidos al epítopo CH1A1A de CEA, como se describe en el ejemplo 28 anterior. Se almacenaron las construcciones de anticuerpo a -80 °C hasta el día de la inyección, cuando se descongelaron y se diluyeron en tampón de vehículo estándar (histidina 20 mM, NaCl 140 mM; pH 6,0) o NaCl al 0,9 % hasta sus concentraciones finales respectivas para administración intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.).

Se almacenaron Ca-DOTAM-dextrano-500 y Pb-DOTAM-dextrano-500-CA a -20 °C hasta el día de la inyección cuando se descongelaron y se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para administración i.v. o i.p.

El quelato de DOTAM para el radiomarcaje se proporcionó por Macrocyclics y se mantuvo a -20 °C antes del radiomarcaje. Se generó 212Pb-DOTAM por elución con DOTAM a partir de un generador de torio y, posteriormente, se desactivó con Cu, Ca, Zn, Gd o Pb después del marcaje. Se diluyó la solución de 212Pb-DOTAM con PBS o NaCl al 0,9 % para obtener la concentración de actividad de 212Pb deseada para inyección i.v.

Los ratones en los grupos de control de vehículo recibieron múltiples inyecciones de PBS en lugar de BsAb, CA y 212Pb-DOTAM.

Anticuerpos biespecíficos

Agentes de aclaramiento

Quelatos radiomarcados (proveedor: Orano Med)

Modelos tumorales

Las líneas de células tumorales usadas y la cantidad inyectada para la inoculación en ratones se describen en la tabla "líneas celulares tumorales" a continuación. BxPC3 es una línea celular de adenocarcinoma pancreático primario humano que expresa CEA de forma natural. Se cultivaron células BxPC3 en medio RPMI-1640, complemento GlutaMAX™, HEPES (Gibco, n.° de ref. 72400-021) enriquecido con suero fetal bovino al 10 % (GE Healthcare Hyclone SH30088.03). HPAF-II (CRL-1997) es una línea celular de adenocarcinoma pancreático humano que expresa CEA de forma natural. Se cultivaron células HPAF-II en medio EMEM (Gibco 31095-029) enriquecido con suero fetal bovino estándar al 10 %, GlutaMAX 100X al 1 %, MEM NEAA al 1 % (aminoácidos no esenciales en medio esencial mínimo) 100X (Gibco 11140-035) y piruvato de sodio al 1 % (100 mM; Gibco 11360-070). WSU-DLCL2 es una línea celular de linfoma de linfocitos B humano que expresa CD20 de forma natural. Se cultivaron células WSU-DLCL2 en medio RPMI-1640 (Gibco, n.° de ref. 72400-021) enriquecida con suero fetal bovino al 10%. NCI-N87 es una línea celular de cáncer gástrico que expresa HER2 de forma natural. Se cultivaron células NCI-N87 en medio RPMI-1640 (Gibco, n.° de ref. 72400-021) enriquecida con suero fetal bovino al 10%. Se establecieron xenoinjertos sólidos en cada ratón SCID el día de estudio 0 por inyección subcutánea de células en medios RPMI o DMEm mezclados 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel® Corning® (factor de crecimiento reducido; n.° de cat. 354230), en el flanco derecho.

Líneas celulares tumorales

*Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (Salisbury, Reino Unido)

**American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.)

Estudios

Ejemplo 31: eficacia de CEA-PRIT en el modelo tumoral (protocolo 103)

Este estudio evaluó la eficacia de CEA-PRIT usando el BsAb CEA-DOTAM para el tratamiento de tumores BxPC3 s.c. en ratones. El tratamiento se administró como un tratamiento único con 10 o 30|jC¡ de 212Pb-DOTAM, o bien en tres ciclos repetidos para cada uno de los dos niveles de radioactividad. Se realizaron comparaciones con PRIT usando un anticuerpo de control de no unión a CEA (DIG-DOTAM), el BsAb CEA-DOTAM solo (sin radioactividad) y sin tratamiento (PBS). Se realizaron las biodistribuciones después del primer y segundo ciclo para confirmar el tratamiento dirigido a 212Pb-DOTAM y el aclaramiento, y se evaluó la eficacia del tratamiento en términos de TGI, TR y supervivencia. Se supervisaron los ratones cuidadosamente durante todo el estudio para evaluar la tolerabilidad de las diferentes pautas de tratamiento. El esquema de estudio se muestra en la figura 42.

Diseño de estudio

La evolución temporal y el diseño del protocolo 103 se muestran en las tablas a continuación.

Evolución temporal del protocolo 103

Grupos de estudio en el protocolo 103

Se establecieron xenoinjertos sólidos en cada ratón SCID el día de estudio 0 por inyección s.c. de 5x106 células (paso 24) en RPMI/Matrigel en el flanco derecho. Veinte días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 290 mm3.

Debido a motivos logísticos, los tratamientos se comenzaron durante el transcurso de 2 días, con inyecciones de BsAb o PBS de los grupos C, D, E, F, G, J, K y L el primer día, como se describe en la tabla anterior, seguido de inyecciones de BsAb de los grupos A, B, H e I al día siguiente. Cuatro días después, se inyectó el CA, seguido 2 horas después der 212Pb-DOTAM o PBS. Los grupos que recibieron 30 o 0|jC¡ se inyectaron en primer lugar, seguidos al día siguiente de los que recibieron l0 j C¡. Los grupos B, D, E, F, G, I, K y L recibieron múltiples tratamientos con 2 semanas entre las inyecciones radioactivas. Todos los ciclos de tratamiento repetidos (2.° y 3.°) se iniciaron simultáneamente, es decir, todos los ratones recibieron la inyección de BsAb oB<s>el mismo día, seguido de CA y 212Pb-DOTAM, o PBS, 4 días después. Se extrajeron los siguientes órganos y tejidos de los grupos A-G en el momento del sacrificio: vejiga, ovarios, hígado, bazo, riñones, fémur (incluyendo la médula ósea), colon, yeyuno, estómago y tumor.

Los ratones en los grupos H y J se sacrificaron y se sometieron a necropsia 24 horas después de su primera y única inyección de 212Pb-DOTAM; los grupos I, K y L se sacrificaron y se sometieron a necropsia 24 horas después de su segunda inyección de 212Pb-DOTAM. Se extrajeron sangre, vejiga, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, hígado, pulmón, corazón, fémur, músculo, cola y tumor para la medición radioactiva en el sacrificio.

Resultados

La distribuciónin vivode 212Pb 24 horas p.i. demostró una alta captación en tumores BxPC3 subcutáneos y una baja acumulación en tejidos normales, como se observa en la figura 43. La diferencia significativa entre los tumores predirigidos por CEA-DOTAM y los predirigidos por el BsAb de no unión a CEA DIG-DOTAM confirmó la alta especificidad del tratamiento. El análisis de varianza unifactorial (ANOVA) con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak mostró que no hubo diferencias significativas en la captación tumoral promedio de 212Pb, ni entre 1 (50,3 % DI/g) y 2 (43,0 % DI/g) inyecciones de 10<j>C¡, ni entre 1 (37,6 % DI/g) y 2 (24,1 % DI/g) inyecciones de 30 j C¡. Del mismo modo, no hubo diferencias significativas entre la administración de 1 ciclo de 10 j C¡ y 1 ciclo de 30<j>C¡ (p>0,05). Sin embargo, la captación tumoral fue significativamente menor después de 2 ciclos de 30<j>C¡ en comparación con 2 ciclos de 10<j>C¡, al igual que la captación tumoral después de 2 ciclos de 30<j>C¡ en tumores predirigidos con DIG-DOTAM (2,9 % DI/g) en comparación con cualquiera de los tratamientos con CEA-DOTAM. El panel B de la figura 43 muestra que el % DI/g fue comparable para tumores de diferentes tamaños, dentro de los diversos grupos de tratamiento.

El desarrollo tumoral promedio y las curvas de crecimiento tumoral individuales se muestran en la figura 44 y la figura 45, respectivamente. Todos los grupos duplicaron su volumen tumoral para el día 20-24. El primer tratamiento con 212Pb-DOTAM se dio el día 24, después de lo que los tumores en los grupos de CEA-DOTAM continuaron creciendo durante aproximadamente 1 semana antes de comenzar a reducirse. Ningún tumor remitió por completo, pero los volúmenes para los grupos tratados múltiples (B y D) permanecieron relativamente constantes hasta el último tratamiento el día 52. Los tumores en ratones a los que se les inyectó solo una vez 10 o 30<j>C¡ comenzaron a recidivar el día 44, aunque los que recibieron la mayor actividad tuvieron una tasa de crecimiento ligeramente más lenta. El PRIT inespecífico con DIG-DOTA<m>dio como resultado una TGI estadísticamente significativa pero limitada en comparación con CEA-DOTAM solo o con el vehículo. Los dos últimos grupos de control presentaron un desarrollo tumoral idéntico.

El día 63, el último día en que se pudieron analizar todos los grupos de tratamiento en base a las medias, la TGI fue de un 57,2, 89,8, 77,7, 96,6, -6,2 y 67,3 % para los grupos A, B, C, D, E y F, respectivamente, en comparación con ningún tratamiento. El último ratón en el grupo de control de vehículo se representó el día 74, momento en el que la TGI fue de un 48,5, 83,3, 63,5 y 95,7 % para los cuatro grupos restantes: A, B, C, y D, respectivamente. El estudio finalizó el día 118 después de la inyección de células, por el sacrificio del último ratón restante (grupo D).

Se realizaron pruebas del orden logarítmico y de Wilcoxon para especificar qué grupos eran significativamente diferentes en términos de supervivencia, los resultados se muestran en las dos tablas a continuación. Todas las pautas posológicas de PRIT con CEA-DOTAM incrementaron significativamente la supervivencia en comparación con los tres grupos de control. La supervivencia global fue ligeramente mejor después de 3 ciclos de 10|jC¡ que después de un único ciclo de 10 j C¡(p= 0,0110), pero no hubo diferencia significativa entre 3 ciclos de 10 j C¡ y cualquiera de las pautas posológicas de 30 j C¡ con tratamiento predirigido a CEA-DOTAM. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se muestran en la figura 46.

Prueba del orden logarítmico por pares (nivel de prueba múltiple = 0,00238)

Prueba de Wilcoxon por pares (nivel de prueba múltiple = 0,00238)

Acontecimientos adversos y toxicidad

Los acontecimientos adversos observados que motivan el sacrificio de ratones por motivos éticos se pueden clasificar en dos grupos: 1) estado tumoral y 2) toxicidad inducida por radiación. El primero se refiere a tumores necróticos y/o ulcerantes, lo que lleva a los ratones a "limpiar" el área del tumor por sí mismos o por sus compañeros de jaula. Los ratones que alcanzaron esta fase se sacrificaron de inmediato para evitar su sufrimiento.

El segundo grupo de acontecimientos adversos comprendía síntomas típicos de toxicidad inducida por radiación, por ejemplo, pérdida de PC, diarrea y letargo. La figura 47 muestra el desarrollo de PC en los grupos de tratamiento. Todos los ratones a los que se les inyectó 30 j C¡ de 212Pb-DOTAM experimentaron un descenso inicial de PC que se mitigó el día 8 después de la primera inyección radioactiva. Los grupos a los que se les administraron múltiples inyecciones de 30<j>C¡ (D y F) padecieron una pérdida de PC más prolongada. La pérdida de PC fue leve en los grupos que recibieron 10 j C¡ (A y B), incluso con múltiples inyecciones. Por tanto, se percibió una clara diferencia entre los ratones que recibieron 10 y 30<j>C¡ de 212Pb-DOTAM. Incluso después de tratamientos con 10 j C¡ repetidos, los ratones no presentaron, en general, signos importantes de toxicidad adversa. Los ratones tratados con un ciclo de 30<j>C¡ expresaron pérdida de peso transitoria, pero se recuperaron. Sin embargo, el segundo y tercer ciclos de 30 j C¡ dieron como resultado una toxicidad adversa más amplia, dando como resultado una serie de animales sacrificados debido a una combinación de pérdida de PC y signos de dolor y/o molestias. De esto se puede concluir que 10 j C¡ es un nivel de radioactividad seguro en las condiciones aplicadas, mientras que 30|jC¡ se está acercando a la actividad máxima tolerada.

Conclusión

Se concluye que dado como una pauta posológica de monoterapia, CEA-PRIT repetido con 10 o 30<j>C¡ de 212Pb-DOTAM proporcionó un incremento significativo en la supervivencia y la TGI, pero ni la erradicación completa del tumor ni el control del tumor mantenido en este ámbito. Para evitar la toxicidad inducida por radiación mientras se mantiene el control del tumor a lo largo del tiempo, estos resultados sugieren el uso de menos de 30 pero más de 10 j C¡ de 222Pb-DOTAM.

Ejemplo 32: selección de un tiempo apropiado entre la inyección de BsAb y CA para CEA-PRIT (protocolos 116 y 121)

Los protocolos 116 y 121 se diseñaron para guiar la selección de un tiempo apropiado entre la inyección de BsAb y CA para CEA-PRlT, sobre la base de una alta captación tumoral y una distribución de BsAb intratumoral homogénea. El protocolo 116 evaluó la distribución de BsAb intratumoral en comparación con la expresión de CEA en el modelo BxPC3 el día 4, 7 y 14 después de la inyección i.v., detectada por tinción de inmunofluorescencia. El protocolo 121 evaluó la acumulación de BsAb directamente marcado con plomo-203 (203Pb) en tumores BxPC3 después de 1,4, 7 y 10 días. El BsAb se marcó con el isótopo de Pb 203Pb (semivida de 2,2 días), para poder seguir el desarrollo durante un período de tiempo más largo en comparación con 212Pb (semivida de 10,6 horas).

Diseño de estudio

Las evoluciones temporales y los diseños de los protocolos 116 y 121 se muestran en las cuatro tablas a continuación.

Evolución temporal del protocolo 116

Grupos de estudio en el protocolo 116

G

*Días después de la segunda inyección de BsAb (iniciada 1,5 semanas después de 212Pb-DOTAM)Evolución temporal del protocolo 121

Grupos de estudio en el protocolo 121

Se establecieron xenoinjertos sólidos a través de la inyección s.c. de células BxPC3. Diecinueve días después de la inoculación, los ratones en el protocolo 116 se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 227 mm3. En el protocolo 121, el volumen tumoral promedio fue de 203 mm3 después de 20 días.

Tinción de inmunofluorescencia

Los ratones en el protocolo 116 se sometieron a necropsia después del sacrificio, y se extrajeron bazo, riñones, hígado, músculo y tumor. Se dividieron los tejidos recogidos en dos trozos: uno se puso en un molde criogénico que contenía el compuesto de inclusión a temperatura de corte óptima (OCT) Tissue-Tek®, y se puso en hielo seco para una congelación rápida, y el otro se fijó en formol tamponado neutro (NBF) al 10 % durante 24 horas y a continuación se transfirió a PBS para su almacenamiento hasta la inclusión en parafina. Se mantuvieron las muestras congeladas en OCT a -80 °C antes del corte. Se realizó la tinción histológica usando los reactivos enumerados en la tabla a continuación.

Reactivos usados para la tinción histológica en el protocolo 116

Tinción para CEA

Se cortaron los tumores congelados en cortes de 12 |jm usando un criótomo UV Leica CM1850, y se almacenaron los portaobjetos a -20 °C. Antes de la tinción, se descongelaron los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) y, a continuación, se lavaron durante 5 minutos con PBS (1X, pH 7,4), seguido de 5 minutos en acetona fría (-20 °C), y una vez más con PBS durante 5 minutos. Se secaron los portaobjetos con un trozo de papel alrededor del tejido y se dibujó un círculo alrededor del tejido usando un bolígrafo hidrófobo (Dako; Agilent). Se realizó la incubación de los cortes con 400 |jl de suero de bloqueo (caprino) durante 1 hora a TA. Se retiró el suero de bloqueo y se añadieron 200 j l de anticuerpo primario (IgG de conejo anti-CEA humano) a los cortes, seguido de incubación durante la noche a 4 °C en una cámara oscura. El día 2, se lavaron los cortes dos veces con PBS durante 10 minutos y se añadieron 400 j l de suero de bloqueo. Después de la incubación durante 1 hora a TA, se retiró el suero de bloqueo y se añadieron 200 j l de anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 488) y contratinción (Hoechst) a los cortes, seguido de incubación en una cámara oscura durante 2 horas a TA. A continuación, se lavaron los portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos. Finalmente, se añadieron el medio de montaje de fluorescencia (Dako S3023; Agilent) y el cubreobjetos a los portaobjetos, que posteriormente se secaron al aire y se almacenaron en la oscuridad a -20 °C. Se realizó el análisis de los portaobjetos teñidos usando un microscopio modular Zeiss Axio Scope.A1.

Tinción para CEA-DOTAM

Se almacenaron los cortes tumorales congelados y se procesaron como se describe para la tinción de CEA anterior, pero con PBS en lugar de anticuerpo primario. El anticuerpo secundario fue un anti-IgG humana de cabra marcado con Alexa Fluor 555.

Tinción con H y E

Se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H y E) de cortes tumorales congelados del protocolo 116 usando un sistema de tinción de portaobjetos automatizado Leica Autostainer XL.

Biodistribución

Los ratones en el protocolo 121 se sacrificaron con propósitos de biodistribución y se extrajo su sangre a través de venopunción retrorbitaria antes del sacrificio. Además, se extrajeron vejiga, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, estómago, hígado, pulmón, corazón, cerebro, fémur, músculo, piel, cola y tumor después del sacrificio y se midió la radioactividad.

Resultados

Tinción de inmunofluorescencia: protocolo 116

El control no tratado presentó altos niveles de CEA distribuidos uniformemente en los tumores recogidos. La tinción de control para BsAb CEA-DOTAM no dio como resultado ninguna señal, como se esperaba.

Se tomaron tumores de ratones a los que se les había inyectado BsAb CEA-DOTAM a los 4, 7 y 14 días p.i. A los 4 días, el BsAb cubría completamente los límites de los nódulos de las células tumorales dentro del tejido, pero no había penetrado totalmente en los nódulos más grandes. Esto se demuestra por la presencia de áreas más oscuras, teñidas según Hoechst, rodeadas por capas de células limítrofes de color rojo brillante. Después de 7 días, la señal de la tinción de CEA-DOTAM apareció distribuida de forma más homogénea y hubo menos estructuras de células tumorales con áreas interiores oscuras. Una semana después, 14 días p.i., la distribución de la señal fluorescente permaneció similar al punto temporal del día 7, pero con una señal más baja en general.

Las muestras tumorales de los dos grupos a los que se administró todo el ciclo de PRIT, incluyendo la irradiación con 212Pb-DOTAM, presentaron áreas de necrosis debido a la muerte celular inducida por radiación. Los hallazgos incluyeron hinchazón celular, pérdida de detalle celular (células fantasma), algo de atipia nuclear y un potencial incremento de la fibrosis intersticial. Los tumores de los ratones en el grupo F que recibieron una segunda dosis de CEA-DOTAM 2 semanas después de la primera inyección de BsAb conservaron una expresión de CEA alta y homogénea, y la distribución de CEA-DOTAM 4 días después de la segunda inyección de BsAb se asemejó a la de los tumores no irradiados, es decir, el BsAb se distribuyó a todas las partes del tumor que expresan CEA, pero con penetración limitada en determinadas estructuras más grandes, lo que dio como resultado áreas más oscuras en las imágenes. Las muestras de control correspondientes se adquirieron al mismo tiempo del grupo G, que no recibió una segunda inyección de BsAb después del ciclo de PRlT inicial. En estos cortes tumorales, se pudo observar una señal débil para la tinción de CEA-DOTAM, lo que indica que una determinada cantidad de BsAb todavía estaba unida al tumor 18 días después de la inyección.

Biodistribución: protocolo 121

La acumulación y aclaramiento promedio de 203Pb en ratones SCID portadores de tumor BxPC3 se presenta en la figura 48. El aclaramiento sanguíneo fue lento, como se esperaba de un anticuerpo sin la ayuda de un CA. No se reveló ninguna captación inesperada del BsAb marcado en órganos o tejidos normales. La acumulación tumoral a lo largo del tiempo se muestra en la figura 49, comenzando con un promedio de un 49 % Dl/g 1 día después de la inyección, incrementándose a un 130, 189 y 197%Dl/g el día 4, 7 y 10, respectivamente. El control negativo marcado no dio como resultado acumulación tumoral, con un 3 % DI/g el día 4 después de la inyección.

Se realizó un análisis estadístico por un análisis unifactorial de la varianza (ANOVA) usando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak, para evaluar si las diferencias percibidas en la captación tumoral en diferentes puntos temporales eran significativas. De acuerdo con la prueba, se logró un incremento significativo en la acumulación de 203Pb solo entre los días 1 y 7, y los días 1 y 10; ningún otro punto temporal fue significativamente diferente entre sí. Someter a prueba simplemente 4 frente a 7 días usando una prueba de la T para datos independientes dio como resultado un incremento estadísticamente significativo a los 7 días(p= 0,0468), mientras que realizar la prueba correspondiente durante 7 frente a 10 días no lo hizo (p = 0,8316).

Conclusión

Los resultados mostraron un incremento global en la captación de 203Pb-BsAb en el tumor entre 4 y 7 días después de la inyección, pero no se logró ninguna mejora adicional cuando se extendió el intervalo de tiempo a 10 días. Microscópicamente, la penetración de BsAb en los tumores mejoró después de 7 días en comparación con 4. No se observó ningún beneficio en el punto temporal del día 14, momento en el que la señal fluorescente global parecía disminuir, sin mejorar la distribución intratumoral. Los estudios respaldan la elección de un intervalo de tiempo de 7 días para BsAb-CA sobre 4 días.

Ejemplo 33: biodistribución (datos de distribución de 212Pb-DOTAM in vivo para estimaciones de la dosis radioactiva absorbida en tejidos tumorales y normales) (protocolo 146)

El protocolo 146 se diseñó para proporcionar datos de distribución de 212Pb-DOTAMin vivodespués de PRIT para estimaciones de la dosis radioactiva absorbida en tejidos tumorales y normales, en ratones SCID portadores de tumores BxPC3 s.c. Se realizó la desactivación de 212Pb-DOTAM usando Ca (véase el ejemplo 34).

Se realizó el tratamiento predirigido por inyección de BsAb CEA-DOTAM, seguido 7 días después por el CA. Después de 24 horas, se administró 212Pb-DOTAM. Se sacrificaron grupos de ratones en múltiples puntos temporales de 5 minutos a 48 horas después de la inyección radioactiva, y se extrajo sangre y órganos para la medición radioactiva. Se muestrearon los excrementos en puntos temporales seleccionados por el uso de jaulas metabólicas para evaluar la tasa de excreción del compuesto radioactivo. Se calcularon las dosis absorbidas finalmente a través de procedimientos establecidos usando las curvas de tiempo-actividad resultantes.

Diseño de estudio

La evolución temporal y el diseño del protocolo 146 se muestran en las dos tablas a continuación.

Evolución temporal del protocolo 146

Grupos de estudio en el protocolo 146

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección s.c. de células BxPC3 en ratones SCID (Envigo) de 8 semanas de edad. Veintiocho días después de la inoculación, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 310 mm3.

Los ratones en el grupo E y F se alojaron individualmente (es decir, un ratón por jaula) en jaulas metabólicas con suelo de rejilla. Se recogieron orina y heces de cada jaula 2, 6 y 24 horas después de la inyección radioactiva y, posteriormente, se midió la radioactividad de las muestras individuales. Los ratones en el grupo F se transfirieron a una jaula regular 24 horas p.i.

Se extrajo sangre/suero de todos los ratones a través de venopunción retrorbitaria antes del sacrificio. Después del sacrificio, se extrajeron los siguientes órganos y tejidos adicionales para la medición de radioactividad y el cálculo del % DI/g: vejiga, útero, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, estómago, hígado, pulmón, corazón, cerebro, fémur, piel, músculo, grasa abdominal, cola y tumor.

Dosimetría de radiación

Se calcularon las dosis absorbidas siguiendo el formalismo explicado en el Folleto n.° 21 del Comité de Dosis de Radiación Interna Médica (MIRD) (Bolch WE, Eckerman k F, Sgouros G y Thomas SR. J Nucl Med 2009; 50:477-484). Formalmente, la dosis absorbidaD(rr)en un tejido o región dianarrse calcula como la integral en el tiempo de la actividadA(rs,t)multiplicada por la tasa de dosis absorbida por unidad de actividadS(rr^ rs),sumada en todas las regiones de origen r<s .>Dado que la gran mayoría de la energía liberada por la cadena de desintegración de 212Pb proviene de la radiación alfa y, además, por la eficacia biológica mucho mayor de la radiación alfa (caracterizada por la eficacia biológica relativa, EBR), se realizaron dos aproximaciones:

1. la energía se absorbe localmente debido al corto alcance de las partículas alfa, lo que quiere decir que solo se considera el términoS(rr ^ rr),y

2. se ignora la contribución de la radiación beta y gamma.

Siendo Aa la energía liberada por las desintegraciones alfa, o más bien la suma de las energías medias liberadas por las desintegraciones alfa en la cadena de desintegración de 212Pb, expresada aquí en unidades,J/(yC/h),la dosis absorbida en un tejido o región dianarrse calcula por la fórmula:

Los cálculos se basan en la concentración radioactiva compuesta (promedio) corregida por desintegración en el tiempo t, expresada como [%D//g]t. En una primera etapa, estos se transforman en concentraciones radioactivas comoyC iporkgde peso de tejido para el tejido dianarr.

A(rr,t) An(uCi) g

AM r(rrr -)r =100%, e ’ f%D//g],■1000kfg-

Aq[p CÍ]es la actividad inyectada yAes la tasa de desintegración exponencial para 212Pb, 0,065 h-1 (correspondiente a la semivida de 10,6 horas).

En una segunda etapa, se integró la concentración radioactiva a lo largo del tiempo para cada tejido. Esto se logró usando el "procedimiento de cálculo trapezoidal semilogarítmico" en el programa informático farmacocinético Phoenix WinNonlin 6.4 (Certara USA, Inc., 100 Overlook Center, Suite 101, Princeton, NJ 08540 EE. UU.). Se usó el tipo de modelo "Plasma" con ponderación uniforme.

En la etapa final, se calcularon las dosis absorbidas multiplicando las integrales de tiempo de la concentración radioactiva por la liberación de energía Aa = 170 10-6J/(yC/h).Adicionalmente, se calcularon las dosis absorbidas ponderadas por EBR usando un EBR de 5, como se sugiere en el folleto MIRD n.° 22 (Sgouros G, Roeske JC, McDevitt MR,et al.J Nucl Med 2010; 51:311-328).

Resultados

Biodistribución

La acumulación y aclaramiento promedio de 212Pb en ratones SCID portadores de tumor se presenta en la figura 50. La acumulación de radioactividad fue alta en el tumor, con un 17 % de DI/g ya a los 5 minutos después de la inyección, incrementándose a más de un 40 % a las 6 horas p.i. y permaneciendo en ese nivel durante al menos 48 horas. No se descubrieron diferencias importantes en los tejidos normales en comparación con la condición libre de tumor.

Dosis absorbidas

Las dosis absorbidas medias en Gy calculadas para el protocolo 146 se muestran en la tabla 24, tanto como valores absolutos (EBR = 1) como corregidos para la mayor citotoxicidad de los emisores alfa (EBR = 5). Para los ratones SCID, el peso promedio fue de 18,5 g; con una actividad de 212Pb inyectado de 20|jC¡, esto dio como resultado actividades inyectadas normalizadas de 1,1 jC i/g de peso corporal.

Se logró una dosis absorbida de aproximadamente 20 Gy en el tumor, mientras que la dosis absorbida permaneció muy por debajo de 2 Gy en la mayoría de los tejidos normales, excepto la vejiga. El contenido de 212Pb en la vejiga difirió significativamente entre ratones individuales, lo que indica una alta variabilidad para este tejido. Se proporcionaron dosis corregidas por EBR para posibilitar la comparación con radioterapia usando radiación gamma externa, lo que dio como resultado una dosis absorbida estimada para el tumor de aproximadamente 100 Gy por 20<j>C¡ de 222Pb-DOTAM inyectado.

Dosis absorbidas medias (Gy) en los órganos y tejidos recogidos después de la inyección de 20 ^Ci de 212Pb-DOTAM

Conclusión

Se logró una dosis absorbida de aproximadamente 20 Gy en el tumor, mientras que la dosis absorbida en la mayoría de los tejidos normales permaneció muy por debajo de 2 Gy. En general, el estudio no indicó riesgos importantes de toxicidad limitante de la dosis usando la pauta posológica de PRIT evaluada.

Ejemplo 34: desactivación de DOTAM no quelado (protocolo 131)

El emisor alfa 212Pb se quela a DOTAM después de la elución de una resina que contiene torio, produciendo 212 Pb-DOTAM farmacológicamente activo. Después del radiomarcaje, un exceso (>99 %) de DOTAM libre no quelado permanece en solución, capturando fácilmente los iones metálicos del entorno. Tras la inyección a un paciente, se uniría rápidamente al Ca2+ circulante, formando el Ca-DOTAM farmacológicamente inactivo. Aunque el BsAb CEA-DOTAM se diseña para unirse preferentemente a Pb-DOTAM, también formará complejos estables con Ca-DOTAM en un grado comparable. Como consecuencia, el bloqueo de 212Pb-DOTAM de los sitios tumorales predirigidos se podría producir en condiciones saturadas, disminuyendo potencialmente la eficacia del tratamiento con PRIT. Para evitar una potencial competencia, se añade, por lo tanto, una etapa de desactivación al procedimiento de elución de 212Pb-DOTAM, en el que se introduce un ion metálico ("X") para controlar la formación de "X-DOTAM" con una constante de disociación (Kd) significativamente mayor. La afinidad de la proteína fijadora de DOTAM hacia diversos quelatos de X-DOTAM como se determina por las mediciones de equilibrio de KinExA (ensayo de exclusión cinética) se muestra en la tabla a continuación.

Afinidades de quelato de metal-DOTAM de bsAb CEA-DOTAM

La elección inicial para la desactivación fue Cu, reemplazando, por tanto, DOTAM no quelado con Cu-DOTAM desactivado, no competitivo, y se ejecutaron un gran número de estudios dentro del programa de CEA-PRIT usando esta condición. Sin embargo, después se descubrió que el complejo Cu-DOTAM no era, de hecho, establein vivo,y se llevó a cabo un estudio para evaluar su estabilidad en comparación con iones de desactivación alternativos en suero, plasma y sangre humanos y de ratón. Los iones seleccionados fueron, por una parte, Pb y Ca, con afinidad similar, y por otra parte, Zn y Cu, con afinidad significativamente menor. El estudio demostró una estabilidad significativamente mayor de Zn-DOTAM en comparación con Cu-DOTAM en sangre humana y de ratón, como se mide por la formación espontánea de Ca-DOTAM durante 35 minutos p.i., alcanzando aproximadamente un 25 % y un 30 % en sangre de ratón y humana, respectivamente, para Cu-DOTAM inyectado inicialmente, en comparación con un 0 % y un 0 % para Zn-DOTAM, y un 4 % y un 4 % para Pb-DOTAM

El protocolo 131 se diseñó para evaluar los metales candidatos a desactivación de DOTAMin vivo,comparando su efecto en la acumulación en tejido tumoral y normal de 212Pb-DOTAM después del tratamiento predirigido con CEA-DOTAM y el aclaramiento con Pb-DOTAM-dextrano-500. Se evaluaron Zn y Gd, que tienen una estabilidad razonable del complejoin vitrocon DOTAM, lado a lado con Cu. Además, se usaron Ca y Pb estable como controles. El esquema de estudio se muestra en la figura 51.

La evolución temporal y el diseño del protocolo 131 se muestran en las dos tablas a continuación.

Evolución temporal del protocolo 131

Grupos de estudio en el protocolo 131

E

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección s.c. de células BxPC3 en el flanco derecho de ratones SCID de 5-7 semanas de edad. Dieciocho días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 200 mm3 Se inyectó 212Pb-DOTAM el día 26 después de la inoculación, momento en el que el volumen tumoral promedio era de 350 mm3.

Se diluyó el anticuerpo en His/His-HCl 20 mN, NaCl 140 mM, pH 6,0 hasta una concentración final de 100 |jg por 100 j l para la administración i.v. de acuerdo con la tabla "Grupos de estudio en el protocolo 131" y la figura 51. Se descongeló el CA y se diluyó en PBS hasta una concentración final de 25 jg por 100 j l para la administración i.v., 7 días después de la inyección de BsAb. Después de otras 24 horas, se inyectó i.v. 212 Pb-DOTAM, desactivado usando cualquiera de los 5 metales diferentes (10 jC i en 100 j l de NaCl al 0,9 %).

Se sacrificaron los ratones con propósitos de biodistribución 2 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, y se extrajeron los siguientes tejidos y órganos: sangre, vejiga, bazo, riñones, hígado, pulmón, músculo, cola y tumor.

Resultados

La acumulación y aclaramiento promedio de 212Pb en todos los tejidos recogidos 2 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM se presenta en la figura 52. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el % Dl/g promedio entre ninguno de los metales de desactivación, en comparación con el control de Pb (ANOVA bifactorial con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). Los valores individuales para los tumores y los tejidos normales seleccionados se muestran en la figura 53. Se observó una mayor variación individual en el contenido de 212Pb en el bazo y el músculo después de la desactivación con Zn y Gd en comparación con los otros metales, aunque la diferencia en el % Dl/g promedio entre los diferentes grupos de tratamiento no fue significativa (ANOVA unifactorial con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey).

Conclusión

El protocolo 131 evaluó el efecto en la acumulación en tejido tumoral y normal de 212 Pb-DOTAM predirigido a partir de la desactivación con Zn, Gd o Cu de DOTAM, en comparación con la desactivación con Ca o Pb. No se observó ninguna diferencia en la captación tumoral de 212Pb, lo que indica que no hay un bloqueo significativo de los sitios de unión predirigidos usando los controles Ca y Pb en las condiciones experimentales aplicadas. Se observó una variación incrementada en el contenido de 212Pb en el bazo y el músculo después de la desactivación con Zn y Gd, lo que indica que los complejos metal-DOTAM que compiten con 212Pb-DOTAM podrían contribuir a la neutralización de CEA-DOTAM no unido a CA en tejidos no dirigidos. La desactivación con Cu dio como resultado resultados comparables a la desactivación de Ca, lo que confirma además la inestabilidadin vivoindicada de Cu-DOTAM. Finalmente se eligió Ca para la desactivación de DOTAM, por tres motivos principales: control incrementado de la formulaciónin vivode la solución de 212Pb-DOTAM, en comparación con la desactivación de Cu; el potencial para aumentar la neutralización de BsAb no unido a CA, reduciendo la variabilidad en la captación de tejido normal de 212Pb; y el potencial para reducir el efecto del hipotético fenómeno de "barrera del sitio de unión", por el que la penetración de moléculas con alta afinidad hacia un antígeno se restringe debido a la unión inmediata a dianas fácilmente accesibles en condiciones de subsaturación.

Ejemplo 35: evaluación de CD20-DOTAM y HER2-DOTAM para PRIT (protocolos 151 y 152)

Los protocolos 151 y 152 tenían como objetivo evaluar la unión de 212Pb-DOTAM a tumores subcutáneos en ratones predirigidos por los BsAb CD20-DOTAM y HER2-DOTAM completamente humanizados, respectivamente. Se realizó PRIT de tres etapas por inyección de las construcciones de anticuerpos, seguido después de 7 días por Ca-DOTAM-dextrano-500-CA y finalmente 222Pb-DOTAM, 24 horas después. Se sacrificaron los ratones 24 horas después de la inyección radioactiva, y se extrajo sangre y órganos para la medición radioactiva.

Diseño de estudio

Las evoluciones temporales y los diseños de los protocolos 151 y 152 se muestran en las siguientes cuatro tablas.

Evolución temporal del protocolo 151

Grupos de estudio en el protocolo 151

Evolución temporal del protocolo 152

Grupos de estudio en el protocolo 152

Se establecieron xenoinjertos sólidos en el protocolo 151 por inyección s.c. de células de linfoma de linfocitos B humano WSU-DLCL2 que expresan CD20 en medio DMEM en ratones SCID de 9 semanas de edad. Cuatro días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 105 mm3. Se inyectó 212Pb-DOTAM el día 13 después de la inoculación, momento en el que el volumen tumoral promedio era de 242 mm3.

En el protocolo 152, se realizaron xenoinjertos en ratones SCID de 10 semanas de edad por inyección s.c. de células de carcinoma gástrico humano NCI-N87 que expresan HER2 en medio RPMI 1640. Catorce días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 74 mm3. Se inyectó 212Pb-DOTAM el día 22 después de la inoculación; el volumen tumoral promedio era de 61 mm3 el día 21.

Se sacrificaron los ratones de biodistribución 24 horas después de la inyección radioactiva. Se extrajo sangre antes del sacrificio a través de una venopunción retrorbitaria bajo anestesia. Todos los ratones se sometieron a necropsia después del sacrificio, con recogida adicional de piel, vejiga, estómago, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, hígado, pulmón, corazón, fémur, músculo, cola y tumor.

Resultados

Biodistribución: protocolo 151

El contenido promedio de 212Pb en todos los tejidos recogidos 24 horas después de la inyección se presenta en la figura 54. El control negativo BsAb DIG-DOTAM no produjo acumulación de radioactividad en tumores WSU-DLCL2 (0,4 ± 0,3 % DI/g), mientras que el BsAb CD20-D<o>T<a>M dio como resultado un 25,0 ± 3,7 % DI/g. No se observó una captación significativa de 212Pb en tejidos/órganos normales, excepto en la vejiga (12,5 ± 4,5 % DI/g), los riñones (3,1 ± 0,3% DI/g) y el pulmón (2,2 ± 0,2 % DI/g).

Biodistribución: protocolo 152

El contenido promedio de 212Pb en todos los tejidos recogidos 24 horas después de la inyección se presenta en la figura 55. El control negativo BsAb DIG-DOTAM no produjo acumulación de radioactividad en tumores NCI-N87 (0,8 ± 0,4 % DI/g), mientras que el BsAb HER2-DOTAM dio como resultado un 24,6 ± 1,5 % DI/g. No se observó una captación significativa de 212Pb en tejidos/órganos normales, excepto por valores muy bajos en los riñones (1,6 ± 0,1 % DI/g) y el pulmón (1,4 ± 0,2 % DI/g)

Conclusión

Los resultados de los protocolos 151 y 152 demostraron el tratamiento dirigido específico y la viabilidad preliminarin vivode CD20-PRIT y HER2-PRIT usando el enfoque de tratamiento predirigido de tres etapas desarrollado para CEA-PRIT.

Ejemplo 36: datos de distribución y acumulación tumoral in vivo para otros formatos (protocolo 154)El protocolo 154 tuvo como objetivo evaluar el uso de 5 construcciones novedosas de BsAb CEA-DOTAM para PRIT. Se diseñó para proporcionar datos de distribución y acumulación tumoralin vivode 212Pb-DOTAM en ratones SCID portadores de xenoinjertos de HPAF-II subcutáneos. Se realizó PRIT de tres etapas por inyección de las construcciones de CEA-DOTAM, seguido 7 días después de un Ca-DOTAM-dextrano-500-CA y finalmente 212Pb-DOTAM, 24 horas después del CA. Se sacrificaron los ratones 6 horas después de la inyección radioactiva, y se extrajo sangre y órganos para la medición radioactiva. Las comparaciones se realizaron con PRIT usando el BsAb<c>EA-DOTAM estándar y un BsAb de no unión a CEA. El esquema de estudio se muestra en la figura 56.

Diseño de estudio

La evolución temporal y el diseño del protocolo 154 se muestran en las dos tablas a continuación.

Evolución temporal del protocolo 154

Grupos de estudio en el protocolo 152

Se establecieron xenoinjertos sólidos por inyección s.c. de células HPAF-II en el flanco derecho de ratones de 9 semanas de edad. Once días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral promedio de 79 mm3. Se inyectó 212Pb-DOTAM el día 20 después de la inoculación, momento en el que el volumen tumoral promedio era de 230 mm3.

Se diluyeron todos los anticuerpos en His/His-HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 hasta una concentración final de 100 |jg por 100 |jl para la administración i.v. de acuerdo con la tabla "Grupos de estudio en el protocolo 154" y la figura 56. Se descongeló el CA y se diluyó en PBS hasta una concentración final de 25 jg por 100 j l para la administración i.v., 7 días después de la inyección de BsAb. Después de otras 24 horas, se inyectó i.v.

212Pb-DOTAM desactivado con Ca (10 jC i en 100 j l de NaCl al 0,9 %).

Se sacrificaron los ratones con propósitos de biodistribución 6 horas después de la inyección de 212Pb-DOTAM, y se extrajeron los siguientes tejidos y órganos: sangre, piel, vejiga, estómago, intestino delgado, colon, bazo, páncreas, riñones, hígado, pulmón, corazón, fémur, músculo, cerebro, cola y tumor.

Resultados

La acumulación y aclaramiento promedio de 212Pb en todos los tejidos recogidos 6 horas después de la inyección se presenta en la figura 57. El contenido en sangre y la acumulación tumoral se muestran con mayor detalle en la figura 58. El control negativo BsAb DIG-DOTAM no produjo acumulación de radioactividad en tumores (1,4 ± 0,1 % Dl/g), mientras que el BsAb CEA-DOTAM estándar dio como resultado un 36,8 ± 3,4 % Dl/g. Para las construcciones novedosas, los números correspondientes fueron un 31,8 ± 3,1 % Dl/g (P1AE1766), un 35,0 ± 8,5% Dl/g (P1AE1767), un 14,2 ± 6,7 % Dl/g (P1AE1768), un 38,8 ± 10,1% Dl/g (P1AE1769) y un 39,5 6,8 % Dl/g (P1AE1770). La acumulación tumoral significativamente menor de P1AE1768 se puede explicar por la monovalencia de CEA de esta construcción de anticuerpo.

No se observó una captación significativa de 212Pb en tejidos/órganos normales, excepto en la vejiga, en la que la radioactividad alcanzó niveles en general observados a las 6 h p.i. para esta pauta posológica de PRlT.

Conclusión

Los resultados del estudio demostraron la viabilidad preliminarin vivode todas las construcciones de anticuerpos CEA-DOTAM sometidas a prueba (P1AE1766, P1AE1767, P1AE1768, P1AE1769 y P1AE1770) para PRlT de tres etapas.

Ejemplo 37: eficacia para CD20-PRIT (protocolo 162)

El objetivo de este estudio fue mostrar la viabilidad preliminar de la pauta posológica de tratamiento desarrollado para CEA-PRlT dirigido contra una diana alternativa: grupo de diferenciación 20 (CD20). Se evaluó la eficacia terapéutica después de 3 ciclos de CD20-PRlT en ratones portadores de tumores WSU-DLCL2 subcutáneos. También se realizaron comparaciones con: CD20-RlT de 1 etapa, usando BsAb que se preincubaron con 212Pb-DOTAM antes de la inyección; con rituximab, un anticuerpo monoclonal de tipo l dirigido contra CD20 y una referencia en el tratamiento de enfermedades CD20+; y con GA101, un anticuerpo monoclonal de tipo ll también dirigido contra CD20.

Diseño de estudio, protocolo 162

Grupos de estudio en el protocolo 162 (ntot = 85)

Se trataron los animales de acuerdo con la pauta experimental ilustrada en la figura 59. Se establecieron xenoinjertos sólidos de WSU-DLCL2 en ratones SCID de 8 semanas de edad el día 0 del estudio por inyección subcutánea de 1,5x105 células en el flanco derecho. Siete días después de la inyección de células tumorales, los ratones se clasificaron en grupos experimentales con un volumen tumoral medio de 144 mm3. Se inyectó 212Pb-DOTAM el día 15 después de la inoculación; el volumen tumoral promedio era de 306 mm3 el día 14.

Se siguió a los ratones en los grupos A-G para evaluar la eficacia de los tratamientos. Para PRIT, la actividad administrada fue de 20|jC¡ por ciclo, mientras que la actividad correspondiente para RIT de 1 etapa fue de 10|jC¡, para evitar la toxicidad aguda inducida por radiación tras el mayor tiempo de permanencia en sangre y tejidos normales usando esta pauta posológica.

Se sacrificaron los ratones en los grupos H, I y L y se sometieron a necropsia con propósitos de biodistribución 24 horas después de su primera y única inyección de 212Pb-DOTAM o 212Pb-DOTAM-BsAb; se sacrificaron los grupos J y K y se sometieron a necropsia 24 horas después de su segunda y tercera inyección de 212Pb-DOTAM, respectivamente. Se extrajeron los siguientes órganos y tejidos de estos ratones: sangre, vejiga, bazo, riñones, hígado, pulmón, músculo, cola, piel y tumor. Se pesaron las muestras recogidas y a continuación se midió la radioactividad usando un contador gamma automático 2470 WIZARD2 (PerkinElmer) y, posteriormente, se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% Dl/g), incluyendo las correcciones por desintegración y fondo.

Para PRIT, se diluyó BsAb CEA-DOTAM o bien DIG-DOTAM (BsAb de control negativo) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM (pH 6,0) hasta una concentración final de 100 jg por 200 j l para administración i.p. Se administró Ca-DOTAM-dextrano-500-CA i.p. (25 jg por 200 j l) 7 días después de la inyección de BsAb, seguido 24 horas después de 212Pb-DOTAM desactivado con Ca (20 jC i en 100 jl).

Los ratones tratados con RIT de 1 etapa recibieron 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM unido previamente, preparado incubando 212Pb-DOTAM con el BsAb CD20-DOTAM durante 10 minutos a 37 °C antes de la inyección i.v. (20 jC i/20 jg de BsAb en 100 j l de NaCl al 0,9 %).

Se inyectaron i.v. a los ratones tratados con rituximab (MabThera®) o GA101 (obinutuzumab) los anticuerpos respectivos, diluidos en histidina 20 mM, NaCl 140 mM (pH 6,0) hasta una concentración final de 600 jg en 200 jl. Las inyecciones se realizaron el mismo día que las inyecciones radioactivas para los grupos tratados con PRIT y RIT.

Resultados preliminares, 162

El estudio todavía está en curso en el momento de escribir este ejemplo, pero los resultados preliminares se pueden informar en consecuencia:

La acumulación y aclaramiento promedio de 212Pb en todos los tejidos recogidos 24 horas después de la inyección se muestra para el primer ciclo de tratamiento en la figura 60. El control PRIT negativo no dio como resultado ninguna captación (0,7 % DI/g) en el tumor. La captación tumoral fue de un 22 % DI/g tanto para CD20-PRIT como para CD20-RIT.

El desarrollo tumoral promedio para los tratamientos evaluados se muestra en la figura 61. Los tumores en el grupo de vehículo no tratado, el grupo de DIG-DOTAM y los grupos de tratamiento a base de anticuerpos crecieron de forma constante. Por el contrario, los tumores en los grupos CD20-RIT y CD20-PRIT disminuyeron de tamaño después del primer ciclo de tratamiento.

El desarrollo de PC en todos los grupos de tratamiento se muestra en la figura 62. Las inyecciones múltiples de 20 |<j>C¡ de 212Pb-DOTAM se toleraron bien, pero las de 10 |<j>C¡ de 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM unidos previamente dieron como resultado un descenso significativo en el peso corporal.

Sumario y conclusión

El estudio mostró una viabilidad preliminar de CD20-PRIT, con indicios de inhibición del crecimiento tumoral comparable a la demostrada previamente para CEA-PRIT. El tratamiento con CD20-PRIT se toleró bien, lo que no fue el caso para el tratamiento con CD20-RIT de 1 etapa.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno específico para quelato de DOTAM-plomo (Pb), en el que dicho sitio de unión a antígeno comprende al menos: a) una CDR1 de la cadena pesada; b)<CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos>FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ<ID>NO: 2), o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 2, en la que estas sustituciones no incluyen Phe50, Asp56 y Tyr58, y opcionalmente tampoco incluyen Gly52 y/o Arg54; <c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos>ERDP/GGGAYPPHL (SEQ<ID>NO: 3), o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 3, en la que estas sustituciones no incluyen Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, y opcionalmente tampoco incluyen Ala100C, Tyr100D y/o Pro100E y/u opcionalmente tampoco incluyen Tyr99;

d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) o una variante de la misma que tiene hasta 1,2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 4, en la que estas sustituciones no incluyen Tyr28 y Asp32; e) una CDR2 de la cadena ligera; y f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos L G G Y D D E S D T Y G (SEQIDNO: 6) o una variante de la misma que tiene hasta 1,2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 6, en la que estas sustituciones no incluyen Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c y Tyr96, en las que la numeración es de acuerdo con Kabat.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que: a) la CDR1 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos GFSLSTYSMS(SEQ ID NO: 1) o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 1, sustituciones opcionalmente conservadoras; y/o e) la CDR2 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos QASKLñS (SEQ ID NO: 5) o una variante de la misma que tiene al menos 1, 2 o 3 sustituciones en SEQ ID NO: 5, opcionalmente sustituciones conservadoras.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el sitio de unión a antígeno comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de: r' tp q CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos<t>a<ti y>o K/r c a) 10110 (SEQ ID NO: 1);<b) CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos>EIGSRCDTYYA3WAKC<(SEQ ID>NO: 2); c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); e) CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QASKLAS(SEQ ID NO: 5); y f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos LGG:£DP>ESDTYG (SEQ ID NO: 6).
4. El anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el sitio de unión a antígeno comprende: b) CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos EIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2) c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos<FRnpyr>1<rrAVPPKT>(SEQ ID NO: 3); QSSHSVYSDNDLA d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4); y f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).
5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el sitio de unión a antígeno comprende: a) CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); <b) CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos E>IGSRGOT YYASWAKG<(SEQ ID>NO: 2); c) CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos EPY)PYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); d) CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); e) CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5); y f) CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).
6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es humano, quimérico o humanizado.
7. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que i) el sitio de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, o una variante de las mismas que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9; y/o ii) el sitio de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 8 o 10.
8. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que i) el sitio de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o ii) el sitio de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
9. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sitio de unión a antígeno se une al quelato de Pb-DOTAM con un valor de Kd de 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM o menos, como se mide por el ensayo KinExA (exclusión cinética).
10. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sitio de unión a antígeno se une al quelato de Pb-DOTAM y a un quelato de Bi-DOTAM, y en el que la proporción de valores de Kd para el quelato de Bi-DOTAM/quelato de Pb-DOTAM está en el intervalo de 0,1-10 o 1-10, como se mide por el ensayo KinExA (exclusión cinética).
11. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo completo, o que es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en una molécula de Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpo, anticuerpo lineal o anticuerpo monocatenario.
12. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo se acopla a un resto que se une específicamente a un antígeno diana.
13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el antígeno diana es un antígeno específico de tumor.
14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, que es un anticuerpo multiespecífico o biespecífico.
15. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 14, en el que el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en CEA, HER2 y CD20.
16. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 14 o 15, en el que el anticuerpo multiespecífico o biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para CEA, y en el que el sitio de unión a antígeno específico para CEA comprende una cadena pesada que comprende al menos una, dos o tres CDR de la cadena pesada: en el que: a) CDR1 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 b) CDR2 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 c) CDR3 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y/o el sitio de unión a antígeno específico para CEA comprende una cadena ligera que comprende al menos una, dos o tres CDR de la cadena ligera: en el que: d) CDR1 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14; e) CDR2 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15; f) CDR3 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16.
17. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 14 o 15, en el que el anticuerpo multiespecífico o biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para CEA, y en el que el sitio de unión a antígeno específico para CEA comprende i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 17; y/o ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 18.
18. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que el anticuerpo multiespecífico o biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para un quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para HER2, y en el que el sitio de unión a antígeno específico para HER2 comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
19. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que el anticuerpo multiespecífico o biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para HER2, y en el que el sitio de unión a antígeno específico para HER2 comprende i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 34; y/o ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%de identidad con SEQ ID NO: 35.
20. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que el anticuerpo multiespecífico o biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para un quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para CD20, y en el que el sitio de unión a antígeno específico para CD20 comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
21. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el anticuerpo multiespecífico o biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para el quelato de Pb-DOTAM y al menos un sitio de unión a antígeno específico para CD20, y en el que el sitio de unión a antígeno específico para CD20 comprende i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 45; y/o ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 46.
22. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, que comprende una región Fc.
23. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 22, en el que la región Fc se genomanipula para reducir la función efectora, opcionalmente por la sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 y/o 329.
24. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 22 o 23, que comprende: i) un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para un primer antígeno; y ii) al menos un segundo dominio variable de la cadena pesada y un segundo dominio variable de la cadena ligera que conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno para un segundo antígeno, en el que el primer o bien el segundo antígeno es el quelato de Pb-DOTAM, y el otro es el antígeno diana, opcionalmente en el que el primer antígeno es el antígeno diana y el segundo antígeno es el quelato de Pb-DOTAM.
25. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 24, que comprende un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno, en el que el extremo N o C de una de las cadenas pesadas se enlaza por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido y en el que el primer polipéptido se asocia con un segundo polipéptido para formar un Fab o un cross-Fab que comprende un sitio de unión para el segundo antígeno.
26. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 25, que comprende: i) un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CL; o ii) un primer polipéptido que consiste en un dominio VL y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VH y CL; o iii) un primer polipéptido que consiste en un dominio VH y un dominio CL, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VL y CH1; de modo que el primer y segundo polipéptido conjuntamente forman un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno.
27. El anticuerpo multiespecífico o biespecífico de la reivindicación 26, que comprende un anticuerpo de longitud completa que comprende un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno, en el que el extremo C de una de las cadenas pesadas se enlaza por medio de un conector polipeptídico a un primer polipéptido que consiste en un dominio VL y un dominio CH1, que se asocia con un segundo polipéptido que consiste en un dominio VH y CL.
28. Un polinucleótido aislado o un conjunto aislado de polinucleótidos que codifican un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
29. Un vector de expresión o conjunto de vectores de expresión que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 28.
30. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende un polinucleótido aislado o un conjunto aislado de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende opcionalmente el vector o conjunto de vectores de la reivindicación 29.
31. Un procedimiento de producción de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que comprende expresar el anticuerpo a partir de la célula huésped de la reivindicación 30.