ES2985391T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de la infección por hepatitis B - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen composiciones y métodos para el tratamiento de la infección de hepatitis B, incluida la hepatitis B crónica (CHB). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el tratamiento de la infección por hepatitis B

Campo de la tecnología

La presente tecnología se refiere a composiciones y composiciones para usar en métodos para el tratamiento de la infección por hepatitis B, incluida la hepatitis B crónica (h Bc ).

Antecedentes

La referencia en la presente memoria descriptiva a cualquier publicación anterior (o información derivada de ella), o a cualquier asunto conocido, no es y no debe tomarse como un reconocimiento o admisión o cualquier forma de sugerencia de que la publicación anterior (o la información derivada de ella) o la materia conocida forma parte del conocimiento general común en el campo de esfuerzo al que se refiere la presente memoria descriptiva.

La hepatitis B es la hepatitis viral más común, potencialmente mortal, con complicaciones a largo plazo y es uno de los principales desafíos de salud pública en todo el mundo. Actualmente, la vacuna es la herramienta más eficaz contra la infección por hepatitis B. Si bien la disponibilidad de una vacuna ha reducido el número de nuevas infecciones por el virus de la hepatitis B (VHB), no beneficia a los 257 millones de personas que ya están crónicamente infectadas por el virus (hoja informativa de la OMS del 18 de julio de 2018). Se estima que entre 2015 y 2030 se producirán 63 millones de nuevos casos acumulados de infección crónica por VHB y 17 millones de muertes relacionadas con el VHB (Nayagamet al.Lancet Infectious Dis 2016 16:1399-1408).

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) conduce al resultado clínico de enfermedad hepática, incluyendo cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). A pesar de la introducción de una vacuna preventiva contra la hepatitis B hace más de 30 años, la infección crónica por hepatitis B (HBC) sigue siendo un problema de salud mundial (Lozano R,et al.Lancet 2012; 380(9859):2095-128), contribuyendo a más del 50 % de la carga mundial de cáncer de hígado. Aproximadamente un tercio de las personas con hepatitis B crónica (HBC) morirán a causa de enfermedades hepáticas graves, tales como cirrosis, carcinoma hepatocelular (CHC) e insuficiencia hepática, si no se trata. En números, se estima que hay entre 260 y 350 millones de personas que viven con el virus en todo el mundo y más de 780.000 personas mueren cada año por enfermedades hepáticas relacionadas con el VHB, incluidas cirrosis y cáncer de hígado (Lozano R,et al.Lancet. 2012; 380(9859): 2095-128). Las terapias actuales con análogos de nucleós(t)idos (AN) para la HBC se dirigen de forma eficaz a la supresión del ADN viral (ADN del VHB indetectable), pero no la eliminación del antígeno de superficie del VHB (HBsAg), cuya expresión continua se asocia con un riesgo continuo de desarrollar CHC Fattovich G,et al.Am J Gastroenterol. 1998;93(6):896-900; Yuen MFet al.Gastroenterology 2008; 135(4):1192-1199). La curación completa de la hepatitis B se define por la erradicación del virus y todos sus intermediarios replicativos (Revill P,et al.Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 2016, 13(4):239-248), lo que actualmente se considera un resultado poco realista. El criterio de valoración clínico de pérdida de HBsAg y/o seroconversión a anti-HBs es el objetivo actual del tratamiento de la HBC, pero rara vez se logra. La base de esta eliminación es presumiblemente la presión selectiva de una respuesta antiviral (impulsada por anticuerpos) eficaz del hospedador. Sin embargo, se ha demostrado que las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas en pacientes con HBC están comprometidas, caracterizadas por una presentación subóptima del antígeno, agotamiento de los linfocitos T específicos de antígeno y producción insuficiente de anticuerpos (Wang L,et al.World J Hepatol. 2015, 7(30):2980-91). En consecuencia, es necesario desarrollar enfoques terapéuticos adicionales para la HBC.

En la actualidad, las opciones de tratamiento de primera línea preferidas son el interferón alfa-2a pegilado (peglFN-a), entecavir y tenofovir, basado en su eficacia antiviral superior y/o alta barrera de resistencia. Sin embargo, incluso con las opciones de tratamiento de primera línea, el pegIFN-a es eficaz para lograr una respuesta virológica sostenida en solo el 30 % de los casos HBeAg positivos y en el 40 % de los casos HBeAg negativos y suele asociarse a efectos secundarios graves. Por otra parte, los análogos de nucleós(t)idos son bien tolerados y suprimen potentemente la replicación del VHB en la gran mayoría de los pacientes tratados. Sin embargo, incluso los análogos de nucleós(t)idos más potentes rara vez inducen la seroconversión del antígeno de superficie del VHB (HBsAg), el sello distintivo de una respuesta inmunitaria exitosa al VHB con un control completo y duradero de la infección, o una "curación funcional". Por tanto, a largo plazo y posiblemente de por vida, se requiere tratamiento con AN para suprimir continuamente la replicación del VHB, lo que puede estar asociado con una carga de costos significativa y limitada por la toxicidad asociada a los fármacos. Es, por lo tanto, una necesidad apremiante la introducción de regímenes terapéuticos que sean más seguros y eficaces para lograr una curación funcional.

El virión infeccioso del VHB es una partícula esférica de 42 nm de diámetro que consiste en una nucleocápside icosaédrica en la que se empaqueta el genoma del ADN viral y una envoltura lipoproteica que contiene tres proteínas transmembrana relacionadas (HBsAg), denominadas HBsAg grande (HBsAg-L), HBsAg-media (HBsAg-M) y HBsAgpequeña (HBsAg-S). La síntesis de las proteínas de la envoltura se inicia en tres sitios diferentes de inicio de la traducción en marco. Por consiguiente, las proteínas de la envoltura tienen una región compartida conocida como dominio S. La HBsAg-S está compuesta únicamente por el dominio S que consiste en 226 aminoácidos (aa); La HBsAg-M contiene extensiones N-terminales adicionales, el dominio preS2 de 55 aminoácidos; y la HBsAg-L contiene el dominio preS2 y extensiones N-terminales adicionales de 108 o 119 aminoácidos (dependientes del genotipo) denominadas dominio preS1.

La capacidad de la HBsAg-S para autoensamblarse en presencia de lípidos en el retículo endoplásmico (RE) da como resultado la formación de partículas subvirales competentes en secreción (VLP), que no contienen ningún otro componente viral del VHB. Las VLP de HBsAg-S tienen entre 22 y 25 nanómetros (nm) de diámetro, son muy compactas y se estima que una partícula contiene aproximadamente cien moléculas de HBsAg-S. La HBsAg-M también forma VLP competentes en secreción. La HBsAg-L también forma VLP que pueden no ser completamente competentes en secreción.

La formación de partículas de HBsAg es un proceso complicado. La primera etapa en la formación de partículas es la inserción cotraduccional de la proteína en la membrana del RE con una secuencia N-terminal luminal corta expuesta, dos regiones transmembrana separadas por un bucle citosólico de 57 aa y un dominio luminal externo de 70 aa que contiene los principales epítopos de linfocitos B (determinante 'a'). Las VLP de HBsAg-S representan una estructura muy compacta debido a la gran cantidad de enlaces disulfuro intra e intermoleculares dentro y entre las subunidades individuales.

Las VLP son herramientas de un innovador vector de bionanotecnología y desarrollo de vacunas, y tienen una serie de ventajas sobre las vacunas tradicionales. Las VLP no contienen material genético viral y representan exhibiciones de alta densidad de proteínas estructurales virales que activan eficientemente partes clave del sistema inmunitario para respuestas de linfocitos B y/o linfocitos T (Buonaguro L.et al.,(2011), Expert Rev Vaccines 10:1569-1583; Jennings GT and Bachmann MF. (2009) Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2009, 49:303-326; Pushko P,et al.,Intervirology 2013, 56:141-165).

Las VLP quiméricas basadas en las proteínas de la cápside de, por ejemplo, el VHB, el virus del papiloma humano (VPH), así como el fago Qp, han sido diseñadas para expresar secuencias antigénicas extrañas, incluidos antígenos no asociados a patógenos, tales como la nicotina y la angiotensina II, para dejar de fumar y superar la hipertensión, respectivamente (Ambühl PMet al.J. Hypertension. 2007, 25:63-72; Buonaguro L.et al.Exp. Rev. Vaccines 2011, 10:1569-1583; Cornuz J.et al.PlosOne 2008, 3:e2547). A diferencia de las VLP de cápside, que están compuestas únicamente de subunidades proteicas, las VLP de HBsAg-S del VHB están compuestas de proteínas de envoltura y lípidos, siendo el RE el lugar celular para la reunión. Para la presentación de secuencias antigénicas al sistema inmunitario, las VLP de HBsAg-S se han modificado para transportar epítopos extraños (Delpeyroux F.et al.Science 1986, 233:472-475; Eckhart L.,et al.J. Gen. Virology 1996, 77:2001-2008; Fomsgaard A.et al.Scand. J. Immunol.

1998, 47:289-295; Phogat S.et al.Virology 2008, 373:72-84; Netter HJet al.J. Virology 2001, 75:2130-2141). Las VLP compuestas de HBsAg-L se desarrollaron como un sistema de administración de genes y fármacos a los hepatocitos humanos (Yamada Tet al.Nature Biotechnology 2003, 21:885-890). Las proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis B del pato y otras proteínas de la envoltura hepadnaviral se han modificado para expresar antígenos de interés como parte de las VLP.

Las VLP compuestas por proteínas pequeñas de la envoltura (HBsAg-S) derivadas del VHB son los componentes antigénicos de una vacuna protectora exitosa (Jilg W.et al.Lancet ii 1984, 1174-1175; Zuckerman JN. J Med Virology 2006, 78:169-177). No obstante, incluso con la disponibilidad de una vacuna, la hepatitis B sigue representando un enorme problema de salud.

Un problema importante en el desarrollo de vacunas es la capacidad reducida de un sistema inmunitario envejecido y la inmunosenescencia que se asocia con una menor eficacia de la vacuna en los ancianos (Derhovanessian E y Pawelec G. Microbial Biotechnology 2012, 5:226-232; Pera Aet al.Maturitas 2015, 82: 50-55).

El criterio de valoración de la pérdida de HBsAg en ausencia o presencia de seroconversión a anti-HBs en combinación con un nivel indetectable de ADN del VHB en el suero es el objetivo actual del tratamiento de la HBC, pero rara vez se logra. La base de esta eliminación es presumiblemente la presión selectiva de una respuesta antiviral (impulsada por anticuerpos) eficaz del hospedador. Sin embargo, se ha demostrado que las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas en pacientes con HBC están comprometidas, caracterizadas por una presentación subóptima del antígeno, agotamiento de los linfocitos T específicos de antígeno y producción insuficiente de anticuerpos (Wang L,et al.World J Hepatology 2015, 7(30):2980-2991).

Es necesario desarrollar una vacuna de linfocitos B eficaz para el tratamiento de la HBC. En particular, existe la necesidad de desarrollar un protocolo terapéutico que permita lograr una curación funcional.

Sumario

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una bionanopartícula (BNP) (p. ej., un antígeno de partícula similivírica (VLP-Ag)) recombinante que comprende una proteína de fusión de HBsAg-S de la envoltura hepadnaviral que comprende una o más regiones de repetición de epítopo antigénico, en donde dichas regiones de repetición de epítopo antigénico se seleccionan del grupo que consiste en epítopos antigénicos expresados en las regiones del Bucle 1 y del Bucle 2 del dominio HBsAg-S.

En algunas realizaciones, la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico expresadas en el bucle 1 se definen mediante la secuencia de aminoácidos CX<1>TCX<2>X<3>X<4>X<5>QGX<6>SMX<7>PC, en donde X<1>es K o R, X<2>es T o M, X<3>es T o I, X<4>es P T o L, X<5>es A o V, X<6>es N o T, y X<7>es F o Y; o en donde la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico está definida por la secuencia de aminoácidos PCX<8>TCX<9>X<10>X<11>en donde X<8>es K o R, X<9>es T o M, X<10>es T, I o S, y X<11>es P, T o L.

En algunas realizaciones, la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico expresadas en el bucle 2 se definen mediante la secuencia de aminoácidos de consenso CCCTKPX<12>DGNCX<13>, en donde X<12>es T o S; y X<13>es T o S.

En algunas realizaciones, la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico se selecciona del grupo que consiste en PCKTCTTP, PCRTCTTP, CTKPTDGNC, CKTCTTPAQGNSMFPS, CTKP(T/S)TDGNC, PC(K/R)TC(T/M)TP, C(K/R)TC(T/M)T(P/T)AQG(N/T)SM(F/Y)PS, PCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC, and PCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la envoltura hepadnaviral comprende un dominio espaciador entre las regiones de repetición de epítopo antigénico y la proteína de la envoltura.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico que codifica una bionanopartícula (p. ej., VLP-Ag) de la presente tecnología. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un ARNm recombinante que codifica una proteína de fusión de HBsAg-S de la envoltura hepadnaviral que comprende una o más regiones de repetición de epítopo antigénico, en donde dichas regiones de repetición de epítopo antigénico se seleccionan del grupo que consiste en epítopos antigénicos expresados en las regiones del Bucle 1 y del Bucle 2 del dominio HBsAg-S.

En algunas realizaciones, la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico expresadas en el bucle 1 se definen mediante la secuencia de aminoácidos CX<1>TCX<2>X<3>X<4>X<5>QGX<6>SMX<7>PC, en donde X<1>es K o R, X<2>es T o M, X<3>es T o I, X<4>es P T o L, X<5>es A o V, X<6>es N o T, y X<7>es F o Y; o en donde la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico está definida por la secuencia de aminoácidos PCX<8>TCX<9>X<10>X<11>en donde X<8>es K o R, X<9>es T o M, X<10>es T, I o S, y X<11>es P, T o L.

En algunas realizaciones, la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico expresadas en el bucle 2 se definen mediante la secuencia de aminoácidos de consenso CCCTKPX<12>DGNCX<13>, en donde X<12>es T o S; y X<13>es T o S.

En algunas realizaciones, la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico se selecciona del grupo que consiste en PCKTCTTP, PCRTCTTP, CTKPTDGNC, CKTCTTPAQGNSMFPS, CTKP(T/S)TDGNC, PC(K/R)TC(T/M)TP, C(K/R)TC(T/M)T(P/T)AQG(N/T)SM(F/Y)PS, PCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC, and PCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la envoltura hepadnaviral modificada comprende un dominio espaciador entre las regiones de repetición de epítopo antigénico y la proteína de la envoltura.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende un ARNm recombinante de la presente tecnología. En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que comprende: la bionanopartícula de la presente divulgación o el ARNm recombinante de la presente divulgación; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona la bionanopartícula de la presente divulgación o el ARNm recombinante de la presente divulgación para usar en un método para tratar la infección por hepatitis B en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto la bionanopartícula o el ARNm recombinante.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona la bionanopartícula de la presente divulgación o el ARNm recombinante de la presente divulgación para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra el virus de la hepatitis B en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto la bionanopartícula o el ARNm recombinante.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un kit para tratar la infección por hepatitis B en un sujeto que lo necesita que comprende la bionanopartícula de la presente divulgación o el ARNm recombinante de la presente divulgación.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que comprende uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en TCTTPAQGNSMFPSC (SEQ ID NO: 17), TCTIPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 18), TCTTPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 19), CTKPTDGNCT (SEQ ID NO: 20), y CTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 21), en donde el uno o más péptidos son cíclicos y/o están conjugados con una proteína transportadora. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es la hemocianina de lapa californiana (KLH). En algunas realizaciones, la composición comprende además un transportador farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en TCTTPAQGNSMFPSC (SEQ ID NO: 17), TCTIPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 18), TCTTPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 19), CTKPTDGNCT (SEQ ID NO: 20), y CTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 21) para usar en un método para tratar la infección por hepatitis B en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración del uno o más péptidos al sujeto.

En algunas realizaciones, el uno o más péptidos está conjugado con una proteína transportadora. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es la hemocianina de lapa californiana (KLH). En algunas realizaciones, el uno o más péptidos es cíclico.

Breve descripción de los dibujos

LaFigura 1es una representación esquemática que muestra el ensayo de ocupación de epítopos de HBsAg. 1. Perla magnética; 2. Ab de captura: Ab monoclonales (mAb) anti-HBs de ratón a la región externa del HBsAg; 3. Muestra de HBsAg de referencia. Ag solo frente a Ag unido con muestra anti-HBs; 4. Ab informador: Anti-HBs policlonales conjugados con PE. NCP: perfil de no eliminación; CP: perfil de eliminación.

LaFigura 2es una representación esquemática de biomarcadores predictivos de curación funcional de la HBC (ensayo 1) y actividad de respuesta inmunitaria de Ab (ensayo2). Ensayo 1 (panel superior): 1. Perla magnética; 2. Ab de captura: mAb anti-HBs de ratón multiplexados frente en la "región externa" del HBsAg; 3. Muestra de HBsAg del paciente; 4. Ab informador: Anti-HBs policlonales conjugados con PE. Ensayo 2 (panel inferior): 1. Perla magnética; 2. Ab de captura: mAb anti-HBs de ratón 2 plex frente en la "región externa" del HBsAg; 3. Muestra del paciente: anti-HBs complejados (con HBsAg); 4. Ab informador: Anti-dominio Fc de IgG humana de cabra conjugado con HRP.

LaFigura 3es una representación esquemática que muestra a pacientes curados de la HBC que presentan un perfil de eliminación (CP) de HBsAg. HBC: Hepatitis B crónica.

LaFigura 4es una representación esquemática que muestra pacientes que no se curan o que no responden y que presentan un perfil de no eliminación (NCP) de HBsAg. UFR: Unidad de fluorescencia relativa.

LaFigura 5es un esquema que muestra una descripción general de la estructura propuesta del antígeno de superficie (envoltura) pequeño de la hepatitis B (HBsAg-S), 226 aminoácidos de longitud y subtipo ayw (genotipo D). La región externa del bucle antigénico entre los aminoácidos 100 y 160 de HBsAg-S está ampliada: cada aminoácido está representado por un círculo gris, los residuos de cisteína se muestran como círculos negros, se destacan los posibles enlaces disulfuro -S-S-. El sitio de glicosilación (asparagina) en la posición 146 se muestra en blanco y se indica la estructura de glicano. La posición utilizada para insertar la secuencia extraña se encuentra en los aminoácidos 127 y 128.

LaFigura 6es un esquema que muestra el plegamiento propuesto de la proteína HBsAg-S, 226 aminoácidos de longitud, para las BNP 1, 2, 3 y 4. La región externa del bucle antigénico entre los aminoácidos 100 y 160 de HBsAg-S está ampliada: cada aminoácido está representado por un círculo gris, los residuos de cisteína se muestran como círculos negros, se destacan los posibles enlaces disulfuro -S-S-. El sitio de glicosilación (asparagina) en la posición 146 se muestra en blanco y se indica la estructura de glicano. La posición utilizada para insertar la secuencia extraña se encuentra en los aminoácidos 127 y 128, el subtipo de secuencia HBsAg-S ayw se utiliza como molde original. Se insertan secuencias antigénicas adicionales derivadas de HBsAg-S en las posiciones 127 y 128 en el molde original. El panel derecho muestra las secuencias del bucle asociadas a la curación para b Np 1, 2, 3 y 4 (SEQ ID NO: 41-44, por orden de aparición), la secuencia antigénica específica de HBsAg-S está en negrita, el enlazador "GSGS" en cursiva y subrayado. BNP-1 es un molde original "ayw" con un inserto de trímero PCKTCTTP (SEQ ID NO: 28) (bucle1, específico de genotipo A, serotipo adw); b Np -2 es un molde original "ayw" con un inserto de trímero PCRTCTTP (SEQ ID NO: 33) (bucle 1, genotipo B/C, serotipo ayw); BNP-3 es un molde original "ayw" con un inserto trímero de la secuencia del bucle 2 CTKPTDGNC (SEQ ID NO: 34) (derivada del serotipo "adw"); BNP-4 es un molde original "ayw" con un inserto (dímero) de la secuencia del bucle 1 extendida CKTCTTPAQGNSMFPS (SEQ ID NO: 35) (serotipo "adw").

LaFigura 7es un esquema que muestra el plegamiento propuesto de la proteína HBsAg-S, 226 aminoácidos de longitud, para BNP 5. La región externa del bucle antigénico entre los aminoácidos 100 y 160 de HBsAg-S está ampliada: cada aminoácido está representado por un círculo gris, los residuos de cisteína se muestran como círculos negros, los posibles enlaces disulfuro -S-S- resaltados, el enlazador "GSGS" mediante círculos rayados. El sitio de glicosilación (asparagina) en la posición 146 se muestra en blanco y se indica la estructura de glicano. Se añaden dos secuencias adicionales del bucle 2 al bucle de tipo silvestre para generar una estructura repetitiva.

Las repeticiones de la secuencia CTKP(T/S)TDGNC (SEQ ID NO: 36) del bucle 2 están encuadradas. El panel derecho muestra la secuencia (SEQ ID NO: 45), la secuencia antigénica específica de HBsAg-S está en negrita, el enlazador "GSGS" en cursiva y subrayado. BNP-5 es un molde original "ayw" con una región del bucle trímero 2. La secuencia del bucle 2 "ayw" está extendida con dos secuencias del bucle 2 "adw" adicionales.

LaFigura 8es un esquema que muestra el plegamiento propuesto de la proteína HBsAg-S, 226 aminoácidos de longitud, para BNP 6. La región externa del bucle antigénico entre los aminoácidos 100 y 160 de HBsAg-S está ampliada: cada aminoácido está representado por un círculo gris, los residuos de cisteína se muestran como círculos negros, los posibles enlaces disulfuro -S-S- resaltados, el enlazador "GSGS" mediante círculos rayados. El sitio de glicosilación (asparagina) en la posición 146 se muestra en blanco y se indica la estructura de glicano. Se añaden dos secuencias adicionales del bucle 1 PC(K/R)TC(T/M)t P (SEQ ID NO: 37) y bucle 2 CTKP(T/S)TDGNC (SEQ ID NO: 36) dentro de la secuencia del bucle correspondiente. Las repeticiones de las secuencias del bucle 1 y del bucle 2 están encuadradas. El panel derecho muestra las secuencias extendidas (SEQ ID NO: 46 y 47, por orden de aparición), las secuencias antigénicas específicas de HBsAg-S están en negrita, el enlazador "GSGS" en cursiva y subrayado. Se insertan dos secuencias adicionales del bucle 1 (serotipo adw) seguidas de la secuencia del bucle 1 original del molde original (serotipo ayw). La secuencia del bucle 2 original (serotipo original ayw) va seguida de dos secuencias del bucle 2 insertadas, serotipo adv.

LaFigura 9es un esquema que muestra el plegamiento propuesto de la proteína HBsAg-S, 226 aminoácidos de longitud, para BNP 7. La región externa del bucle antigénico entre los aminoácidos 100 y 160 de HBsAg-S está ampliada: cada aminoácido está representado por un círculo gris, los residuos de cisteína se muestran como círculos negros, los posibles enlaces disulfuro -S-S- resaltados, el enlazador "GSGS" mediante círculos rayados. El sitio de glicosilación (asparagina) en la posición 146 se muestra en blanco y se indica la estructura de glicano. Se añaden dos secuencias adicionales del bucle 1 C(K/R)TC(T/M)T(P/T)AQG(N/T)SM(F/Y)PS (SEQ ID NO: 38) dentro de la secuencia del bucle 1. Las repeticiones del bucle 1 están encuadradas. Las posiciones de los aminoácidos originales para la secuencia HBsAg-S de tipo silvestre no están modificadas y los aminoácidos adicionales están marcados con "y". El panel derecho muestra las secuencias extendidas (SEQ ID NO: 52, 48 y 49, por orden de aparición), las secuencias antigénicas específicas de HBsAg-S están en negrita, el enlazador "GSGS" en cursiva y subrayado. Se insertaron dos secuencias del bucle 1 extendidas (serotipo adw), secuencia de aminoácidos 121 a 136, seguidas de la secuencia del bucle 1 original (serotipo ayw).

LaFigura 10es un esquema que muestra el plegamiento propuesto de la proteína HBsAg-S, 226 aminoácidos de longitud, para BNP 8. La región externa del bucle antigénico entre los aminoácidos 100 y 160 de HBsAg-S está ampliada: cada aminoácido está representado por un círculo gris, los residuos de cisteína se muestran como círculos negros, los posibles enlaces disulfuro -S-S resaltados, el enlazador "GSGS" está representado por círculos rayados. El sitio de glicosilación (asparagina) en la posición 146 se muestra en blanco y se indica la estructura de glicano. Se duplicaron las regiones del bucle 1 y del bucle 2. Las posiciones de aminoácidos originales para la secuencia HBsAg-S de tipo silvestre no se modifican, y los aminoácidos adicionales de los bucles 1 y 2 repetidos están marcados con '. BNP-8 contiene la región original del bucle 1 y del bucle 2 ("ayw", aminoácido (aa) 120-147) seguido de una secuencia "adw" adicional del bucle 1 y del bucle 2 (aa 120-147).

LaFigura 11es un gráfico que muestra el análisis del perfil de epítopo de HBsAg (plataforma Bioplex) de las preparaciones de CP-BNP 1,2, 3 y 4 y de las formulaciones de CP-<b>N<p>1+3, 1 3+4, y 3+4. Las CP-BNp incorporan inserciones de epítopos de "eliminación" específicos del bucle 1 (CP-BNP 1, 2, 4) o del bucle 2 (CP-<b>N<p>3) presentados para inducir respuestas de anticuerpos anti-HBs de "eliminación" específicos después de la inmunización. El análisis del perfil de epítopos de HBsAg indica que los epítopos en los bucles 1 y 2 se conservan (dentro del intervalo normal de /- 0,5 veces) y/o aumentan (>0,5 veces) en todas las preparaciones y formulaciones de CP-BNP analizadas, lo que indica antigenicidad para los epítopos de "eliminación" diana presentados correctamente e intactos, donde la retención de epítopo más fuerte/amplia se logra en las formulaciones de BNP.

LaFigura 12Es un gráfico que muestra un análisis de anticuerpos monoclonales derivados y purificados generados para los péptidos cíclicos. El gráfico muestra el análisis del perfil CP inducido por anticuerpos anti-HBs (plataforma Bioplex) de anticuerpos monoclonales generados seleccionados después de la inmunización con formulaciones de péptidos ciclados pangenotípicos/serotípicos del bucle 1 o 2. Los anticuerpos monoclonales anti-HBs generados n=8 se analizaron para determinar la inducción de IndCP (p. ej., pérdida de reconocimiento de epítopos en los epítopos del bucle 1 y 2) tras la preincubación con antígeno VLP de referencia, indicativo de perfil de "eliminación" o anti-HBs asociado a CP.

LasFiguras 13A-13Dson gráficos que muestran el análisis de la reactividad del anticuerpo anti-HBs después de la inmunización con el antígeno CP-BNP. El análisis de sueros mediante inmunoensayo enzimático estándar (EIA) se realizó en sangrados de animales (sangrados 1-4, o promediados entre todos los sangrados) después de n=3 inmunizaciones con CP-BNP 1,2, 3 y 4 preparaciones de formulaciones de CP-BNP 1+3, 1+3+4, y 3+4. Se analizó la respuesta de anticuerpos inducida para determinar su especificidad para: HBsAg WT recombinante (VLP)(Figura 13A); péptidos ciclados específicos del bucle 1 de HBsAg (Figura 13B); y péptidos ciclados específicos del bucle 2 de HBsAg (Figura 13C). LaFigura 13Dpresenta la reactividad anti-Hbs para WT-BNP, antígenos peptídicos del buclel y peptídicos del bucle2. Las respuestas de inmunogenicidad de anticuerpos anti-HBs más fuertes, más rápidas y más amplias o más conservadas (para VLP y para los péptidos del bucle 1 y del bucle 2) se observaron para la formulación de CP-BNP 1 3+4, 1+4+5, 5+7 y 5, que produjeron epítopos de "eliminación" diana tanto para el bucle 1 como para el bucle 2 (encerrados en un círculo).

LaFigura 14es un gráfico que muestra el análisis del perfil CP inducido por anticuerpos anti-HBs (plataforma Bioplex) de las respuestas de sueros seleccionados después de la inmunización con preparaciones únicas o combinadas de CP-BNP 1, 3, 4, 5 y 7. Se analizaron los sueros de sangrado terminal siguiendo el programa de inmunización n=3 con las preparaciones y formulaciones de CP-BNP para determinar el perfil de anticuerpos anti-HBs. Se evaluó el perfil del epítopo HBsAg del antígeno VLP de referencia+/preincubación con sueros de ratón individuales anti-HBs positivos del estudio de inmunogenicidad para determinar la inducción de un CP debido a la "eliminación" o anti-HBs asociado a CP en los sueros. Este desarrollo de anti-HBs de epítopo de "eliminación" dirigido se observó de manera más constante en ratones (9-5, 13-2, 16-5 y 17-3) que recibieron inmunización con la formulación CP-BNP 1+4+5, 1+3+4, 5, o 5+7.

LasFiguras 15A-15Cson gráficos que muestran el cambio en los niveles de ADN del VHB (log10 UI/ml) respecto al basal (S10) después de la vacunación terapéutica de varias combinaciones de CP-BNP en un modelo murino de infección por HBC. CP-BNP 1+4+5 a una dosis de 0,5 |jg tuvo la disminución sostenida más rápida y absoluta en el ADN del VHB respecto al placebo o WT-BNP con la misma dosis. Otras combinaciones de CP-BNP también disminuyeron los niveles de ADN del VHB, pero lo hicieron a un ritmo más lento y con una disminución absoluta menor en comparación con CP-BNP 1+4+5.

LasFiguras 16A-16Cson gráficos que muestran el cambio en los niveles de HBsAg (log 10 UI/ml) respecto al basal (S10) después de la vacunación terapéutica de varias combinaciones de CP-BNP en un modelo murino de infección por HBC. CP-BNP 1+4+5 a una dosis de 0,5 jg tuvo la disminución sostenida más rápida y absoluta de HBsAg respecto al placebo o WT-BNP a la misma dosis. Otras combinaciones de CP-BNP también disminuyeron los niveles de HBsAg, pero lo hicieron a un ritmo más lento y con una disminución absoluta menor en comparación con CP-BNP 1+4+5.

LasFiguras 17A-17Bson imágenes que muestran el análisis Western de la expresión de HBsAg BNP de WT-BNP y CP-BNP 4 a partir de ARN después de la transcripción y transfecciónin vitroen líneas celulares HEK293T (Figura 17A) y Huh7 (Figura 17B). Usando un anticuerpo anti-HBsAg, se detectaron bandas de HBsAg (+/-glicosilación, ~50 %) tanto en WT-BNP (24 o 27 kDa) como en CP-BNP 4 (29 o 32 kDa), producidas después de la transfección de los ARNm apropiados en ambas líneas celulares. Las transfecciones no tratadas y de control del ensayo con reactivos fueron negativas para HBsAg. Los controles incluyeron HBsAg purificado (con etiqueta Flag, 25 o 28 kD) y muestras posteriores a la transfección de ADN WT-BNP (con etiqueta Flag, 25 o 28 kD). Las transcripciones de ARNm codifican subunidades de HBsAg específicas de WT-BNP o BNP4 en ausencia de una etiqueta Flag.

Descripción detallada

Se apreciará que algunos aspectos, modos, realizaciones, variaciones y rasgos de la presente tecnología se describen a continuación con diversos niveles de detalle con el objetivo de proporcionar una comprensión sustancial de la presente tecnología. A continuación, se proporcionan las definiciones de determinados términos tal y como se utilizan en esta memoria descriptiva. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen en general el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente tecnología.

I. General

La curación funcional de la hepatitis B se define como la pérdida de HBsAg con o sin seroconversión a anticuerpos anti-HBsAg ("anti-HBs") mientras se mantiene la indetectabilidad del ADN del VHB en suero (Revill P,et al.Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 2016, 13(4):239-248)). En el presente documento se describen bionanopartículas (BNP) de HBsAg que incorporan una presentación antigénica mejorada de epítopos asociados al perfil de eliminación (CP) para imitar la presión selectiva de un CP y promover respuestas inmunitarias anti-HBs de linfocitos B eficientes y específicas para la eliminación de HBsAg. La inmunogenicidad de las BNP se valida inicialmente en ratones BALB/c normales, antes de la evaluación de los resultados de la vacunación terapéutica para impulsar la eliminación del HBsAg y la seroconversión en un modelo murino de HBC recientemente desarrollado y validado CBA Carter J (CBA/CaJ) (véase, por ejemplo, Chen HH,et al.PNAS 112(7):2175-2180 (2015)). En algunas realizaciones, el objetivo de una vacuna terapéutica de BNP que expresa CP, cuando se administra a pacientes con HBC, es acelerar e impulsar la curación funcional de la hepatitis B. En algunas realizaciones, la función terapéutica de las BNP que expresan CP se puede mejorar aún más mediante la modificación por hiperglicosilación para mejorar y acelerar las respuestas de los linfocitos B y promover la seroconversión del HBsAg, y/o la modificación de la estructura de referencia de suministro de BNP para inducir un estado "sigiloso" de las BNP a anticuerpos anti-HBs potencialmente preexistentes, neutralizantes, pero sin capacidad de eliminación, circulantes en pacientes con HBC.

II. Definiciones

En el presente documento se usan las siguientes expresiones, cuyas definiciones se proporcionan a modo de orientación.

Tal como se usa en la memoria descriptiva objeto, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen aspectos plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Así pues, por ejemplo, la referencia a "un perfil" incluye un solo perfil, así como dos o más perfiles; la referencia a "un epítopo" incluye un solo epítopo, así como dos o más epítopos, "un anticuerpo" incluye un solo anticuerpo, así como dos o más anticuerpos; la referencia a "la divulgación" incluye uno y múltiples aspectos enseñados por la divulgación; y así sucesivamente.

El término "aproximadamente" y el uso de intervalos en general, independientemente de que estén modificados o no por el término "aproximadamente", significa que el número comprendido no está limitado al número exacto establecido en el presente documento y se entiende que hace referencia a intervalos sustancialmente dentro del intervalo citado sin alejarse del alcance de la invención. Como se utiliza en el presente documento, "aproximadamente" será entendido por personas expertas en la materia y variará en cierta medida en función del contexto en el que se use. Si hay usos del término que no estén claros para un experto en la técnica, dado el contexto en el que se use, "aproximadamente" significará hasta más o menos el 10 % del término particular.

El término "antígeno" se utiliza en el presente documento en su sentido más amplio para referirse a una sustancia que es capaz de reaccionar y/o inducir una respuesta inmunitaria. La referencia a un "antígeno" incluye un determinante o epítopo antigénico.

Por "determinante antigénico" o "epítopo" se entiende la parte de una molécula antigénica contra la cual se dirige una respuesta inmunitaria particular e incluye un hapteno. Normalmente, en un animal, los antígenos presentan varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Un "hapteno" es una sustancia que puede combinar especificidad con un anticuerpo pero que no puede inducir una respuesta inmunitaria, o solo la induce de manera deficiente, a menos que se una a un vehículo. Un hapteno normalmente comprende un único determinante antigénico o epítopo.

Como se utiliza en el presente documento, el término "bionanopartícula" o "BNP" se refiere a una partícula similivírica (VLP) que se ha modificado para incluir o presentar uno o más epítopos de inserto diana. Para los fines de la presente divulgación, los términos "bionanopartícula" o "BNP" también se refieren a "antígeno de partícula similivírica recombinante" o "VLP-Ag".

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para lograr un efecto biológico, terapéutico y/o profiláctico deseado, p. ej., una cantidad que dé lugar a la prevención de una enfermedad, afección y/o síntoma o síntomas de las mismas. En el contexto de aplicaciones terapéuticas o profilácticas, la cantidad de una composición administrada al sujeto dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos de composición. También dependerá del grado, la gravedad y el tipo de enfermedad o afección. El experto podrá determinar las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores. En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis. De manera adicional o como alternativa, en algunas realizaciones, se administran múltiples composiciones o compuestos terapéuticos (p. ej., composiciones inmunogénicas, tales como vacunas).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "curación funcional" se refiere a una curación funcional de la HBC y se define por la pérdida de HBsAg detectable con o sin presencia de anticuerpos anti-HBsAg naturales o introducidos (también denominados en el presente documento "anticuerpos anti-HBs" o "anticuerpos anti-HBs"), que incluyen una población de anticuerpos que se unen selectivamente a epítopos seleccionados del HBsAg, que cuando está ocupado por anticuerpos anti-HBs, produce la eliminación del HBsAg y, en última instancia, del VHB. El VHB no es detectable en un sujeto completamente curado.

La expresión "composición inmunogénica" se utiliza en el presente documento para referirse a una composición que provocará una respuesta inmunitaria en un mamífero que ha estado expuesto a la composición. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye al menos una de ocho CP-BNP (por ejemplo, BNP 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) y/o péptidos cíclicos del epítopo CP.

En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden formularse para administración en varias formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas se preparan para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, oral, nasal o tópica. También se pueden formular composiciones para formas farmacéuticas específicas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición inmunogénica puede formularse como una formulación líquida, gel, aerosol, pomada, crema, liofilizada, polvo, torta, comprimido o cápsula. En otras realizaciones, la composición inmunogénica se formula como una formulación de liberación controlada, formulación de liberación retardada, formulación de liberación lenta, formulación de liberación pulsátil y formulación mixta de liberación inmediata. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica se proporciona en forma de líquido. En otras realizaciones, la composición inmunogénica se proporciona en forma liofilizada.

Como se utiliza en el presente documento, el término "infectado" se refiere a albergar una enfermedad o patógeno, tal como un virus. Una infección puede ser intencionada, tal como por la administración de un virus o patógeno (p. ej., por vacunación), o no intencionada, tal como por transferencia natural del patógeno de un organismo a otro, o de una superficie contaminada al organismo. En algunas realizaciones, la infección se induce en un organismo modelo (por ejemplo, modelo murino) por transfecciónin vivode ADN con capacidad de replicación mediante un enfoque de inyección hidrodinámica.

Como se usa en el presente documento, "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a un animal, por ejemplo, un miembro de cualquier especie de vertebrado. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren a un tratamiento terapéutico, en donde el objetivo es reducir, aliviar, o ralentizar la progresión o avance de, y/o revertir la progresión de la afección o trastorno patológico objetivo. Por ejemplo, un sujeto es "tratado" con éxito por una infección de hepatitis B existente y/o persistente, incluida la infección crónica por hepatitis B (HBC) si, después de recibir una cantidad terapéutica de las composiciones de la presente tecnología, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, el sujeto muestra una inducción observable y/o medible de anticuerpos que eliminan el HBsAg y/o la pérdida de HBsAg detectable y/o niveles reducidos de HBsAg y/o ADN del VHB.

El término "vacuna" se usa en el presente documento para referirse a una composición que se administra a un sujeto para producir o aumentar la inmunidad a una enfermedad particular. En algunas realizaciones, las vacunas incluyen un adyuvante farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 1" o "CP-BNP 1" se refiere a la SEQ ID NO: 1, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 1, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 9, partículas similivíricas (VLP) o bionanopartículas (BNP) que comprenden la SEQ ID NO: 1, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 1, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 1.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 2" o "CP-BNP 2" se refiere a la SEQ ID NO: 2, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 10, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 2, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 2, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 2.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 3" o "CP-BNP 3" se refiere a la SEQ ID NO: 3, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 3, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 3, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 3.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 4" o "CP-BNP 4" se refiere a la SEQ ID NO: 4, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 4, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 4, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 4.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 5" o "CP-BNP 5" se refiere a la SEQ ID NO: 5, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 5, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 5, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 5.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 6" o "CP-BNP 6" se refiere a la SEQ ID NO: 6, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 14, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 6, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 6, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 6.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 7" o "CP-BNP 7" se refiere a la SEQ ID NO: 7, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 15, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 7, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 7, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 7.

Como se utiliza en el presente documento, "BNP 8" o "CP-BNP 8" se refiere a la SEQ ID NO: 8, secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8, tales como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 16, VLP o BNP que comprenden la SEQ ID NO: 8, composiciones inmunogénicas que comprenden la SEQ ID NO: 8, o una vacuna que comprende la SEQ ID NO: 8.

Como se utiliza en el presente documento, "péptido cíclico 1 de epítopo de perfil de eliminación (CP)" se refiere a la SEQ ID NO: 17. Como se utiliza en el presente documento, "péptido cíclico 2 de epítopo CP" se refiere a la SEQ ID NO: 18. Como se utiliza en el presente documento, "péptido cíclico 3 de epítopo CP" se refiere a la SEQ ID NO: 19. Como se utiliza en el presente documento, "péptido cíclico 4 de epítopo CP" se refiere a la SEQ ID NO: 20. Como se utiliza en el presente documento, "péptido cíclico 5 de epítopo CP" se refiere a la SEQ ID NO: 21.

Como se utiliza en el presente documento, los anticuerpos dentro de una respuesta anti-HBs que dan como resultado una curación funcional se denominan "anticuerpos de eliminación". Estos anticuerpos definen un "perfil de eliminación" de anticuerpos que se dirigen a los epítopos específicos del HBsAg y que, en última instancia, dan como resultado la eliminación del HBsAg y la curación funcional. Los epítopos se denominan "epítopos de eliminación", es decir, una vez ocupados por anticuerpos en el sujeto hospedador, el sujeto experimentará o probablemente experimentará una curación funcional. Por tanto, un "perfil de eliminación" puede referirse a la huella digital de epítopos no disponibles en el HBsAg o al conjunto o población de anticuerpos de un individuo que ocupan estos epítopos y, cuando los ocupan, predicen la consecución de una curación funcional. El perfil de eliminación de anticuerpos o epítopos del HBsAg representa biomarcadores del potencial o probabilidad de que un sujeto en tratamiento consiga una curación funcional. La referencia a una "probabilidad" de una curación funcional generalmente significa que la probabilidad es del 100 %, es decir, una vez que se detecta un perfil de eliminación de anticuerpos, el sujeto alcanzará un estado de curación funcional o, en ausencia de HBsAg circulante, ha logrado una curación funcional. Sin embargo, como en cualquier sistema biológico, puede ocurrir variabilidad. Por tanto, para los fines de la presente tecnología, la referencia a una "probabilidad" de una curación funcional significa al menos un 80 % de probabilidad de que un sujeto con un perfil de eliminación de anticuerpos consiga una curación funcional. Por "al menos un 80 %" significa 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.

El "perfil de eliminación de epítopos" o "CP de epítopos" del HBsAg es la presencia de epítopos disponibles o no disponibles en el HBsAg que tienen el potencial de ser ocupados por los anticuerpos de eliminación. Cuando el perfil de eliminación de epítopos del HBsAg no comprende epítopos disponibles para la unión, entonces los epítopos se consideran "no disponibles" y esto significa que los epítopos están ocupados por anticuerpos y es probable que se produzca una curación funcional. Como alternativa, si no se detecta HBsAg ni ADN del VHB circulante, entonces se ha logrado una curación funcional y solo está presente el perfil de eliminación de anticuerpos (o puede inducirse una respuesta inmunitaria después de la exposición al VHB).

El término "estandarizado" también abarca la "normalización" del nivel de HBsAg o del complejo HBsAg-Ab y representa el nivel óptimo de HBsAg o del complejo HBsAg-Ab para el ensayo. Una "muestra derivada de sangre" incluye suero.

III. Cura funcional de la hepatitis B crónica (HBC)

La eliminación del HBsAg sérico y/o la seroconversión a anti-HBs, con ADN del VHB en suero indetectable, se considera una curación funcional de la HBC, ya que permite no solo el cese de la terapia, sino que también se asocia con una reducción significativa en las tasas de cirrosis hepática y el desarrollo de carcinoma hepatocelular (CHC), y una mayor tasa de supervivencia global (Fattovich G,et al.Am J Gastroenterol. 1998; 93(6):896-900; Yuen MF,et al.Gastroenterology 2008, 135(4):1192-1199; Simonetti J,et al.Hepatology 2010, 51: 1531-1537). Durante la resolución espontánea de la infección aguda por hepatitis B, una interacción coordinada de linfocitos T y linfocitos B específicos del VHB elimina los hepatocitos infectados, suprimen la replicación viral mediante vías no citolíticas y neutralizan los viriones mediante la producción de anticuerpos específicos del virus (anti-HBs). La infección crónica representa un fallo de la respuesta inmunitaria del hospedador para controlar la replicación del VHB, donde es poco común la eliminación espontánea del HBsAg y se ha observado que ocurre solo en el 1-2 % de los pacientes. Esta tasa no mejora con las terapias antivirales actuales, pero un factor clave asociado con esta pérdida espontánea es un nivel sérico bajo de HBsAg de <100 UI/ml (Tseng TC,et al.Gastroenterology 2011, 141(2):517-525, 25 e1-2), y las estrategias diseñadas para alcanzar dicho nivel formarán parte del arsenal de tratamiento. Se desconocen los mecanismos asociados con la pérdida y/o la seroconversión del HBsAg, pero se ha demostrado que una respuesta eficaz de los linfocitos B es esencial para mantener una curación funcional de la hepatitis B, estando las terapias de agotamiento de linfocitos B (p. ej., rituximab, anti-CD 20) asociadas a la reactivación del VHB que conduce a insuficiencia hepática y muerte (Shouval D. Semin Liver Dis. 2013; 33(2): 167-177). Las observaciones clínicas y diagnósticas sugieren que en pacientes con HBC existen clones de linfocitos B que codifican anti-HBs con baja afinidad por el HBsAg homólogo (Gerlich WH. Clin Infect Dis. 2007; 44(9): 1170-1172). La expresión simultánea de anti-HBs en pacientes con HBC HBsAg positivo sugiere además que la respuesta anti-HBs es cuantitativa y/o cualitativamente insuficiente o inadecuada (débil) para superar la infección crónica, pero sí indica que la producción de anticuerpos específicos no está completamente inhibida (Zhang JM,et al.Clin Infect Dis. 2007; 44(9): 1161-1169).

IV. Enfermedad por hepatitis B crónica (HBC)

La hepatitis B crónica (HBC) es una enfermedad infecciosa que abarca cinco fases reconocibles y separadas: La fase 1 es la fase de inmunotolerancia (IT) que abarca el tiempo desde la infección y el establecimiento de una infección crónica hasta los primeros signos de enfermedad activa. Por lo general, es asintomática (sin enfermedad hepática significativa) y estos individuos adquirieron la infección al nacer o poco después, y son HBeAg positivo. La fase 2 o fase de eliminación inmunitaria (CI) es una fase activa de la enfermedad con una progresión significativa en la enfermedad hepática de la persona. Estos pacientes también son HBeAg positivo. En la fase 3 o fase no replicativa (NR) hay poca o ninguna evidencia de enfermedad hepática activa; los virus se pueden identificar en niveles bajos y la persona es HBeAg negativo. La fase 4 es una recaída o recrudecimiento de la actividad de la enfermedad hepática y la replicación viral y esta fase también se conoce como enfermedad HBeAg negativo. Esta fase tiende a desaparecer con el tiempo y los pacientes suelen tener cirrosis. La fase final, fase 5, se identifica como pérdida de HBsAg y seroconversión a anti-HBs. Esta también se reconoce como la fase de curación funcional (FC).

La HBC comprende al menos 4 enfermedades diferentes basadas en los genotipos del VHB. Así pues, la HBC puede considerarse como HBC asiática (genotipos B y C), HBC europea (genotipos A-2 y D), HBC africana (genotipos A-1 y E) y HBC latinoamericana (genotipos F y H) y cada uno de estos 4 grupos tiene diferentes etnias (asiática frente a europea/caucásica frente a africana frente a latina), edad de adquisición (perinatal frente a niñez temprana frente a edad adulta temprana) y modo de transmisión (madre a bebé, niño a niño, escarificación cultural, iatrogénica/parenteral y sexual), respectivamente. La recombinación entre diferentes genotipos (p. ej., A y D, o B y C) no es infrecuente. La HBC se puede estratificar aún más de acuerdo con el HBeAg y el estado de la enfermedad; ya sea HBeAg positivo o HBeAg negativo, con o sin enfermedad hepática.

Un FC-P está asociado con FC y se demuestra por la pérdida de reconocimiento de epítopos en el bucle 1 y el bucle 2 dentro de la región del bucle externa, que incluye el determinante "a" del HBsAg cuando se utilizan mAb 5, 6, 7 y 8 (véase lasFiguras 1y2). Las respuestas anti-HBs después de un resultado de curación "inducen" un FC-P frente a muestras de HBsAg de referencia. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la vacunación utilizando una plataforma de BNP que comprende epítopos asociados al FC-P (bucle 1 bucle 2) genera una respuesta anti-HBs asociada con un FC-P que mejora las posibilidades de curación.

V. HBsAg, anti-HBs y CP/F-CP

La medición del perfil de epítopo de la proteína de la envoltura (HBsAg) del VHB que circula en la sangre de un paciente es una medida directa del virus; comprende la detección de un antígeno extraño que se encuentra en la sangre del paciente. La lógica o argumento desarrollado en el CP es que una persona infectada generará una respuesta inmunitaria contra el virus y los efectos de esa presión de selección de respuesta inmunitaria sobre el virus se pueden medir. El efecto se puede demostrar ya que el epítopo del HBsAg cambia en la envoltura del virus en esa persona. El CP se mide a través de un panel de resultados multiplex (Figura 2). Se describe el FC-P frente a la reactividad de un panel 4plex aplicado a una cohorte de historia natural realizada en el St. Vincent's Hospital Melbourne, dentro del cual los pacientes eran HBeAg negativo y tenían actividad mínima o nula de la enfermedad, estaban en la fase 4 y en transición a la fase 5, con el genotipo infectante sin restricciones (es decir, genotipos A, B, C, o D). Por el contrario, la medida de un anticuerpo producido por el paciente es una medida directa de la respuesta del hospedador al virus; también se encuentra circulando en la sangre del paciente. La lógica o argumento desarrollado en el FC-P es que una persona que se ha curado de la HBC ha logrado generar una respuesta de anticuerpos, cuyo efecto se puede medir. El efecto puede demostrarse por la capacidad de ese anticuerpo para inducir cambios de epítopo del HBsAg de paneles de VHB suministrados exógenamente; es decir, el anticuerpo del paciente "induce" una respuesta de perfil de epítopo en el antígeno exógeno suministrado. Se aplica un FC-P "inducido" a la cohorte de historia natural de pacientes con HBC fase 4/5, HBeAg negativo, genotipo sin restricciones, que se basa en un panel de informes 4plex.

VI. HBsAg, VLP y BNP

El VHB codifica tres proteínas HBsAg que forman la envoltura viral; la pequeña (S), la mediana (M) y la grande (L) (Carman WF,et al.J Hepatol. 1999; 31(2):195-201; Seeger C,et al.Hepadnavirus. 2013). Todas comparten un dominio HBsAg-S común de 226 residuos (Seeger C,et al.Hepadnaviruses. En "Fields Virology", 2013, 6a edición. págs. 2180 2221), mientras que las extensiones N-terminal de M y L codifican los dominios PreS2 y PreS1 respectivamente. Las proteínas de la envoltura HBsAg son antígenos virales clave; durante la infección, S, M y L se expresan y se empaquetan conjuntamente a través de la membrana del RE de la célula hospedadora, para la formación de la envoltura de partículas infecciosas del VHB. Las proteínas S son los únicos componentes antigénicos de la vacuna contra la hepatitis B capaces de inducir anticuerpos protectores dirigidos principalmente al determinante antigénico "a" principal de la región externa del bucle (residuos 99-169). Las proteínas S se autoensamblan fácilmente en VLP asociadas a lípidos y forman la base de las vacunas recombinantes actuales, que se elaboran en levadura y no están glicosiladas. La proteína S no ha sido cristalizada pero se considera una proteína conformacionalmente dinámica que contiene numerosos residuos de cisteína y prolina, que se predice que formará dominios de bucle discretos (bucle 1:aa 107-135; bucle 2:aa 139-149) dentro del determinante inmunodominante "a" (Stirk HJ,et al.Intervirology. 1992, 33(3):148-158). La secuencia de ADNc que codifica la proteína S se expone en la SEQ ID NO: 22. La secuencia de ADNc que codifica la proteína S con un sitio de restricción Agel y una etiqueta FLAG se establece en la SEQ ID NO: 23. Las alteraciones (variantes y ocupación de anticuerpos) dentro del determinante "a" pueden modificar la topología del HBsAg e influir directamente en el fenotipo de neutralización del VHB (Carman WF,et al.J Hepatol. 1999; 31(2): 195-201).

La secuencia de ADNc que codifica la proteína HBsAg-S que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 se establece en la SEQ ID NO: 22. La secuencia de ADNc que codifica la proteína S que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 se establece en la SEQ ID NO: 23. El ADNc y las secuencias de aminoácidos de HBsAg-S se proporcionan a continuación en laTabla A.

_______________________ Tabla A. ADNc de HBsAg-S y secuencias de aminoácidos_______________________ADNc que codifica la versión pequeña del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (SEQ ID NO: 22) Codón de inicio ATG y codón de terminación TAA en negrita

La secuencia que codifica la región externa del bucle (aminoácidos 100-160) está subrayada ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTT TTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT CTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACC_______________________ TCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGT CTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTG GTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCA ACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATGACTACCGGTCAAGGAACCTCTATG TATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC CCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCC TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTT TGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTG AGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA___________________________ ADNc que codifica la versión pequeña del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, con el sitio de restricción AgeI introducido

y una secuencia de ADNc que codifica la etiqueta "FLAG" (SEQ ID NO: 23)

Codón de inicio ATG y terminación TAA en negrita

Secuencia de ADN específica de FLAG (resaltada en gris)

El sitio de restricciónAgeIintroducido encursiva

La secuencia que codifica la región externa del bucle (aminoácidos 100-160) está subrayada ATGGACTATAAAGACGACGAT GACAAAGAGAACAT CACAT CAGGAT T CC TAGGACC C CTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAG AGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTT GGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACT TGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTG CTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTT TGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATG ACTACCGGTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGAC GGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGG GAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGG TTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGG GGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTT TGTCTTTGGGTATACATTTAA________________________________________________________________________ Proteína del antígeno de superficie S del virus de la hepatitis B (HBsAg-S) (SEQ ID NO: 50)

La región externa del bucle entre la posición de los aminoácidos 100 y 160 está subrayada MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPT SNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFI IFLFIL L L C L IFL L V L L D YQGMLPyCP-LJPG.S.S'TTSTGPCRTCMTTGQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI *________________________ Proteína del antígeno de superficie S del virus de la hepatitis B (HBsAg-S) y una etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 51) Secuencia FLAG (resaltada en gris)

La región externa del bucle entre la posición de los aminoácidos 100 y 160 está subrayada MDYRDDDDKENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCL GQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPV CPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTGQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLW EWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFF CLWVYI *____________________________________________________________________________________________

Las VLP de HBsAg son muy compactas debido a la gran cantidad de enlaces disulfuro intra e intermoleculares dentro y entre las subunidades individuales (Seeger C,et al.Hepadnaviruses. En "Fields Virology", 2013, 6a edición. págs.

2180-2221; Mangold CM,et al.Arch Virol. 1997, 142(11):2257-2267), y los ensayos clínicos han establecido que se pueden modificar con éxito para mostrar secuencias antigénicas extrañas y médicamente relevantes insertadas como plataformas de administración de bionanopartículas (BNP) (Beaumont E,et al.Vaccine. 2015, 33(8):973-976; Buonaguro L,et al.Expert Rev Vaccines. 2011, 10(11):1569-1583; Cheong WS,et al.Antiviral Res. 2009, 81(2):113122; Moffat JMet al.Vaccine. 2013, 31(18):2310-2316; Netter HJ,et al. JVirology 2001;75(5):2130-2141; Phogat Set al.Virology. 2008, 373(1):72-84).

VII. Epítopos de eliminación del HBsAg Bucle 1 y Bucle 2

Los epítopos de eliminación del HBsAg son aquellos que, cuando están ocupados por anticuerpos en un sujeto, el resultado probable es una curación funcional. Los epítopos están ubicados en cada uno del Bucle 1 y Bucle 2 del HBsAg-S. En relación con el ensayo, los anticuerpos monoclonales (mAb) se seleccionan para usar en un ensayo multiplex que se dirige a una variedad de epítopos del HBsAg-S. Un conjunto de mAb denominado mAb5 y 6 se dirige a los epítopos del Bucle 1. Se seleccionan dos epítopos del Bucle 1 definidos por la secuencia de aminoácidos de consenso:

CX<1>TCX<2>X<3>X<4>X<5>QGX<6>SMX<7>PC (SEQ ID NO: 24), en donde:

X<I>es sK122 (Genotipos A1, A2, A6, B1, B2, B3, B6, C, F, G, H, I) o sR122 (Genotipos A3, A4, A5, B3, B4, B5, B7, B8, B9, C2, C4, D, E);

X<2>es sT125 (Genotipo A, B, C, D, E, F, G, H, I) o sM125 (genotipo D3, D5);

X<3>es sT126 (Genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I) o sI126 (Genotipo C);

X<4>es sP127 (Genotipos A, B, E, C, D, G, I) o sT127 (genotipo C4, D2, D5) o sL127 (genotipo E, F, H);

X<5>es sA128 (A, B, C, D, E, F, G, H, I) o sV128 (D2);

X6 es sN131 (Genotipos A, G, I) o sT131 (Genotipos B, C, D, E, F, H);

X<7>es sF134 (Genotipo A, B, C, E, F, H) o sY134 (Genotipo D, G, I);

y la secuencia de aminoácidos consenso a la que mAb 10 se une a PCX<8>TCX<9>X<10>X<11>(SEQ ID NO: 25), en donde: Xa es sK122 (Genotipos A1, A2, A6, B1, B2, B3, B6, C, F, G, H, I) o sR122 (Genotipos A3, A4, A5, B3, B4, B5, B7, B8, B9, C2, C4, D, E);

X<9>es sT125 (Genotipo A, B, C, D, E, F, G, H, I) o sM125 (genotipo D3, D5);

X<10>es sT126 (Genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I) o sI126 (Genotipo C) o sS126 o sA126 (variantes comunes); X<I I>es sP127 (Genotipos A, B, E, C, D, G, I) o sT127 (genotipo C4, D2, D5) o sL127 (genotipo E, F, H);

Otro conjunto de mAb (denominados mAb, 7, 8, 11, 12, 16 y 17) se dirige a un epítopo en el bucle 2 definido por la secuencia de consenso de aminoácidos:

CCCTKPX<12>DGNCX<13>(SEQ ID NO: 26)

en donde:

X<12>es sT140 (Genotipo A, B, C, D, G, H, I) o sS140 (Genotipo E o F); y

X<13>es sT143 (Genotipo A, B) o sS143 (Genotipo C, D, E, F, G, H, I).

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se propone en el presente documento que cuando cualquiera de los epítopos en el Bucle 1 esté ocupado, cuando el epítopo en el Bucle 2 esté ocupado, o cuando cualquiera de los epítopos en el Bucle 1 está ocupado junto con el epítopo en el Bucle 2, entonces se ha logrado un perfil de eliminación de anticuerpos que da como resultado una eliminación funcional.

En una realización, los epítopos ocupados son CKTCTTPAQGNSMFPSC (SEQ ID NO: 27); y/o PCKTCTTP (SEQ ID NO: 28); y CCCTKPTDGNCT (SEQ ID NO: 29).

En una realización, los epítopos ocupados son CKTCTIPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 30); y/o PCKTCTTP (SEQ ID NO: 28); y CCTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 31).

En una realización, los epítopos ocupados son CRTCTTPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 32); y/o PCKTCTTP (SEQ ID NO: 28); y CCTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 31).

VIII. Perfil de liberación: formulaciones de vacunas terapéuticas con bionanopartículas (CP-BNP)

La divulgación de la presente tecnología se refiere al desarrollo de 8 CP-BNP (SEQ ID NO: 1-8) que abarca los epítopos diana de HBsAg pangenotípicos/serotípicos del bucle 1 y del bucle 2, junto con un BNP de control de tipo silvestre (WT). La estructura de referencia de la BNP está formado por partículas subvirales no infecciosas de la proteína de la envoltura HBsAg-S (partículas similivíricas o VLP), que no contienen todos los componentes del virus completo). En algunas realizaciones, el genotipo del VHB es el genotipo A, A1, A2, A3, A4, A5, A6, B, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, C, C1, C2, C4, D, D2, D3, D5, E, F, G, H, o I. En algunas realizaciones, el genotipo del VHB es el genotipo D. En algunas realizaciones, el serotipo es ayw o adw. En algunas realizaciones, el serotipo es ayw. La modificación de las VLP como bionanopartículas (BNP) para administrar epítopos de inserto diana representa un enfoque activo, que estimula el sistema inmunitario para inducir una respuesta capaz de tratar o curar (eliminar) una infección persistente por el virus de la hepatitis B. Se generarán anticuerpos que podrán inducir la curación de una infección por hepatitis B existente y persistente. Las secuencias diana (inserto) del epítopo CP se enumeran en laTabla 1a continuación. Las BNP se producen y purifican (sin endo) y se evalúa su inmunogenicidad individualmente y en formulaciones que consideran combinaciones de epítopos diana del bucle 1 y 2. Las formulaciones analizada se enumeran a continuación en laTabla 2a continuación.

Tabla 1. Direccionamiento a los e íto os CP del HBsA

Tabla 2. Formulaciones de CP-BNP

En laTabla 3se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las 8 construcciones CP-BNP, Construcción 1 (BNP 1) (SEQ ID NO: 1), Construcción 2 (BNP 2) (SEQ ID NO: 2), Construcción 3 (BNP 3) (SEQ ID NO: 3), Construcción 4 (BNP 4) (SEQ ID NO: 4), Construcción 5 (BNP 5) (SEQ ID NO: 5), Construcción 6 (BNP 6) (SEQ ID NO: 6), Construcción 7 (BNP 7) (SEQ ID NO: 7) y Construcción 8 (BNP 8) (SEQ ID NO: 8).

��

��

�� En laTabla 4se proporcionan secuencias de nucleótidos de ejemplo que codifican las 8 construcciones de aminoácidos CP-BNP.

��

�� IX. Vacuna terapéutica con péptido CP

Basado en los epítopos CP del HBsAg descritos en laTabla 1, que se incorporaron a las vacunas terapéuticas de CP-BNP, también se desarrolló una administración alternativa de estas vacunas de epítopos como vacunas de péptidos cíclicos pangenotípicos/serotípicos. Los péptidos cíclicos del epítopo CP de la presente tecnología se enumeran en la

Tabla 5.

T l . P i F rm l i n i l ífi l í P

Los estudios de inmunogenicidad han demostrado que la vacuna de péptido cíclico líder es una formulación equimolar de péptidos cíclicos CTKPTDGNCT (SEQ ID NO: 20) y CTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 21), conjugados con hemocianina de lapa californiana (KLH). La administración de esta vacuna a ratones fue antigénica, generando una respuesta de anticuerpos anti-HBs concordante con un PC, indicativo de "eliminación" de Ab anti-HBs. El análisis implicó ELISA

(para péptidos inmunizantes, péptidos de control, antígeno VLP), análisis de CP inducido, inmunoprecipitación y transferencia Western.

X. Vacunas de ARNm

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a construcciones de ARNm para usar en un método para provocar una respuesta inmunitaria en la hepatitis B existente y/o persistente, incluida la hepatitis B crónica (HBC). En algunas realizaciones, el ARNm codifica una región de repetición de epítopo antigénico a partir de epítopos antigénicos expresados en las regiones del bucle 1 y del bucle 2 del dominio HBsAg-S. En algunas realizaciones, el ARNm codifica

BNP 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En algunas realizaciones, el ARNm codifica un péptido cíclico de epítopo CP, tales como los mostrados en laTabla 5.

XI. Modos de administración y dosis eficaces

Una composición inmunogénica (p. ej., vacuna) como se describe en el presente documento puede administrarse mediante cualquiera de las vías convencionalmente utilizadas o recomendadas para las vacunas (p. ej., vía parenteral), y puede presentarse en diversas formas (p. ej., líquido inyectable). Las vacunas podrán administrarse mediante jeringa o mediante un inyector sin aguja para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica.

De acuerdo con la presente tecnología, una "cantidad eficaz" de una composición inmunogénica es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Se entiende que, en algunas realizaciones, la dosis efectiva dependerá de la edad, el sexo, el estado de salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, caso de haberlo, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. No se pretende que los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación sean limitantes y representan intervalos de dosis ilustrativos. Así pues, en algunas realizaciones, la dosificación se puede adaptar al sujeto individual, tal como entiende y puede determinar un experto en la materia. La dosis de CP-BNP, péptido cíclico de epítopo CP o vacuna de ARNm para mamíferos (p. ej., humanos) adulto puede ser de 0,01 |jg a 10.000 |jg, o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis de ser de 0,10 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis ide ser de 1 j a 10.0 cualquier intervalo o valor dentro del mis realizaciones, la dosis ide ser de 2 j 10.0 cualquier intervalo o valor dentro del mis realizaciones, l a dosis puede ser de 3 jg a 10.000 j cualquier intervalo valor dentro del mismo realizaciones, la dosis ide ser de 4 j 10.0 cualquier intervalo o valor dentro del mis realizaciones, la dosis ide ser de 5 jg a 10.0 cualquier intervalo o valor dentro del mis realizaciones, la dosis de ser de 10 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis ser de 15 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis ser de 20 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis ser de 25 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis ser de 50 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis de ser de 100 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis de ser de 500 jg a 10.000 jg , o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. En algunas realizaciones, la dosis

realizaciones, la dosis

XII. Productos para usar en métodos terapéuticos

La siguiente exposición se presenta sólo a modo de ejemplo y no pretende ser limitante.

Un aspecto de la presente tecnología incluye productos para usar en métodos de tratamiento de hepatitis B existente y/o persistente, incluyendo hepatitis B crónica (HBC) en un sujeto diagnosticado o en el que se sospecha una infección por hepatitis B. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos que comprenden las CP-BNP, péptidos cíclicos de epítopo CP y/o construcciones de ARNm de la presente tecnología se administrarán a un sujeto del que se sospecha o que ya padece, una infección por hepatitis B en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad.

XIII. Determinación del efecto biológico de las CP-BNP, péptidos cíclicos del epítopo CP o ARNm de la tecnología actual

Cuando se haya logrado o se logrará una curación funcional en función de los resultados del inmunoensayo de HBsAg descrito en el presente documento, entonces, el médico puede decidir suspender el tratamiento. Por tanto, el inmunoensayo de HBsAg descrito en el presente documento puede hacer un seguimiento del tratamiento para determinar si un individuo logrará una curación funcional, determinar si un individuo ha logrado una curación funcional y determinar si un individuo ha logrado una curación mediante mecanismos de defensa naturales.

El protocolo podrá variarse sin apartarse de la esencia de la tecnología actual. El criterio de valoración crítico es la determinación de la huella digital de los epítopos del HBsAg que han sido ocupados por la respuesta de anticuerpos de un individuo. Cuando se ha ocupado la huella digital de los epítopos del Bucle 1 y del Bucle 2, entonces se puede esperar una curación funcional. Cuando los anticuerpos que tienen la capacidad de unirse a esta huella digital estén presentes o sean indicativos tras la exposición al VHB pero el HBsAg no sea detectable, entonces se ha logrado una curación funcional. En este punto, el tratamiento puede cesar.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan solo como ilustración y no como limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente iguales o similares. No se deberá interpretar que los ejemplos limitan el ámbito de la presente tecnología, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Desarrollo del ensayo de perfil de eliminación

Se utiliza una plataforma de citometría de flujo basada en perlas multiplex ("Bioplex") para desarrollar un ensayo de epítopo de HBsAg y establecer y cartografiar el perfil de HBsAg de los epítopos que constituyen el perfil de eliminación de epítopos de HBsAg (véaseFigura 2). El "perfil de eliminación de epítopos" es un perfil de epítopos a los que se dirigen los anticuerpos de un individuo. Cuando todos los epítopos están unidos por los anticuerpos generados por el individuo, se puede esperar la eliminación del HBsAg. El ensayo se deriva de un ensayo de Limet al.(2014) Hepatology 60 (1) suplemento: 1623, 980A. Brevemente, el inmunoensayo multiplex de HBsAg comprende paneles de perlas identificadas mediante fluorescencia, cada una de ellas conjugada con un anticuerpo anti-HBs diferente que se une al HBsAg, seguido de un anticuerpo de detección policlonal conjugado con ficoeritrina (PE). Los paneles multiplex del HBsAg comprenden anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra la región externa del bucle del HBsAg, incluido el determinante "a" y epítopos del dominio C-terminal que abarcan los residuos 99-226 del HBsAg. Los epítopos del HBsAg se clasifican en los siguientes dominios (con los anticuerpos monoclonales que se unen a esos dominios): N-terminal (mAb 1); Bucle 1 (mAb 5,6,10); Bucle 2 (mAb 7,8,11,12,16,17,19); Bucle 1/2 combinado (mAb 13,14,15); C-terminal (mAb 2,3,4); y conformacional (mAb 9,18). La intensidad de la PE asociada con cada perla proporciona una medida sensible del reconocimiento de anticuerpos del epítopo específico de HBsAg dentro de la muestra. El perfil de epítopo del HBsAg en comparación con la estructura de referencia de la cepa de VHB coincidente se ha expresado como un cambio en la unión de anticuerpos o el reconocimiento de epítopos después del análisis de datos bioinformáticos. El IC del 95 % para el intervalo normal de variación del reconocimiento de epítopos de la estructura de referencia se ha establecido como un cambio de /- 0,5 veces. Una ganancia de reconocimiento de epítopo corresponde a un factor de cambio positivo (> 0,5 veces), y los factores de cambio negativos (> -0,5 veces) corresponden a una pérdida o reducción de la unión del epítopo. Una representación del ensayo se muestra en laFigura 1.

Ejemplo 2: Selección de mAb

Los mAb anti-HBs utilizados en el ensayo multiplex del HBsAg (Figura 2panel superior) fueron seleccionados y obtenidos para proporcionar una amplia cobertura de epítopos con reactividad contra los dominios antigénicos y C-terminales del HBsAg (residuos 99-226), que cubren epítopos tanto continuos como discontinuos, y regiones de epítopos sujetas a una alta variabilidad y también a un reconocimiento conservado. El alto nivel de cobertura de epítopo proporcionado por los mAb permitió el análisis del perfil de HBsAg según la disponibilidad de epítopo cartografiado y descrito de acuerdo con la región del epítopo: N-terminal (mAb 1); Bucle 1 (mAb 5,6,10); Bucle 2 (mAb 7,8,11,12,16,17,19); Bucle 1/2 combinado (mAb 13,14,15); C-terminal (mAb 2,3,4); y conformacional (mAb 9,18). La consulta de las cepas del VHB (genotipos A-G) identificó mAb anti-HBs que mostraban patrones de reconocimiento de epítopos conservados (es decir, indicativos de huellas dactilares de HBsAg conservadas en genotipos y serotipos), que eran los mAb 3 y 4 (C-terminal), mAb 15 (Bucle 1/2 combinado) y mAb 18 (conformacional). Los mAb anti-HBs restantes fueron sensibles a las variaciones en el perfil del HBsAg que se identifican mediante patrones alterados de reconocimiento de epítopos entre cepas del VHB, en comparación con el genotipo A2, cepa vacunal serotipo adw2.

Ejemplo 3: Optimización del ensayo/dinámica

El ensayo del perfil de HBsAg se desarrolló y optimizó utilizando HBsAg de la cepa del VHB A2 adw2, que forma la base común de la mayoría de las vacunas genéricas contra el VHB y, por lo tanto, representa una base o estructura de referencia relevante para la comparación del reconocimiento del epítopo del HBsAg. La fuente de HBsAg fueron principalmente sueros de pacientes con HBsAg, confirmado mediante secuenciación del VHB como A2 adw2 de tipo silvestre (en comparación con las secuencias de consenso), con confirmación utilizando HBsAg A2 adw2 recombinante de tipo silvestre del sobrenadante de cultivo celular. El desarrollo inicial del ensayo se basó en dos de los mAb anti-HBs bien caracterizados en el laboratorio (incluido mediante transferencia Western, Elisa y fluorescencia) para determinar la reactividad al HBsAg, los cuales fueron los mAb 10 (Bucle 1) y 18 (conformacional). Los conjuntos de perlas preparados que se marcaron con una serie de concentraciones de mAb se incuban frente a una serie de concentraciones de HBsAg. Estas concentraciones representan la estandarización del HBsAg. Se identificaron condiciones que correspondían a una lectura fluorescente cómoda (dentro del intervalo de 10000-20000 UFR), sin causar sobrecarga ni agregación de los complejos perla/mAb-HBsAg. Se determinó que la concentración de ensayo de HBsAg era de aproximadamente 16 UI/pocillo (el nivel estandarizado), con detección de HBsAg de tan solo 1 UI/pocillo y hasta 100 UI/pocillo. Se incorporó en el ensayo una serie de diluciones de muestra para HBsAg de 8, 16 y 32 UI/pocillo, para tener en cuenta cualquier ligera inexactitud en la determinación diagnóstica de la concentración de HBsAg. La concentración óptima de mAb anti-HBs marcados en perlas se optimizó como la concentración de mAb que da como resultado reactividad de fluorescencia con el intervalo dinámico del instrumento (15000-18000 UFR), y esto se determinó específica/empíricamente para cada mAb. La multiplexación del ensayo se construyó mediante la adición secuencial de mAb anti-HBs individuales conjugados con perlas, lo que permitió la identificación de la competencia de epítopos debido a epítopos compartidos parcialmente por mAb. Para evitar medir la competencia de epítopos entre mAb (es decir, registrar correctamente el perfil de epítopo del HBsAg), se establecieron tres conjuntos de mAb/esferas anti-HBs multiplex, como un 4 plex, 5 plex y 10 plex. Las muestras de HBsAg se analizaron en paralelo (en la misma placa) con estos plex y los datos resultantes se combinaron para lograr una lectura multiplex del perfil de HBsAg (Figura 2panel superior).

Ejemplo 4: Validación del ensayo/perfiles de HBsAg en cepas de VHB

El ensayo fue desarrollado contra HBsAg A2 adw2, que corresponde a la cepa vacunal común del VHB y, por lo tanto, refleja el perfil de reconocimiento de epítopo del HBsAg para los mAb anti-HBs multiplexados en el ensayo. El ensayo fue validado tanto para sueros con HBsAg A2 adw2 de tipo silvestreex-vivocomo HBsAg recombinante de cultivo celularin vitropara confirmar el perfil de HBsAg para A2 adw2, que formó una reserva de cepas vacunales para la comparación de otras cepas del VHB (genotipos y serotipos), que pueden no coincidir con la vacuna y para las variantes de HBsAg notificadas con potencial de escape de la vacuna (p. ej., sG145R/A, sP120T/L, sD144E/A). El ensayo se validó además frente a HBsAg de diferentes genotipos (A-G) y serotipos, procedente tanto de sueros de pacientes como de sobrenadantes recombinantes, que estableció el perfil de HBsAg de cada cepa en comparación con la cepa vacunal (A2 adw2) de reserva. Se estableció un panel de referencia de sueros representativos de cada cepa de VHB para su inclusión continua en el ensayo como puntos de datos de control en las cohortes de estudio. Variaciones específicas del genotipo en el perfil de HBsAg entre los genotipos comunes (A, B, C, D) son evidentes en los epítopos del Bucle 1 (mAb6) y del Bucle 2 (mAb8), mientras que el serotipo en el epítopo del Bucle 2 (mAb7). Las cepas de VHB que son más divergentes de la cepa vacunal (C4, E y F) muestran una variación más exagerada de la cepa vacunal en su perfil de reconocimiento de epítopo del HBsAg.

Ejemplo 5: Caracterización del perfil de eliminación asociada a una respuesta anti-HBs de "eliminación"

LaFigura 1muestra la aplicación del ensayo descrito en el Ejemplo 1 para caracterizar un perfil de eliminación (CP) asociado con anticuerpos que dan como resultado una curación funcional. El ensayo determina la ocupación de epítopo del HBsAg utilizando un panel de mAb en donde los mAb 5 y 6 se dirigen a la secuencia de consenso en el Bucle 1 de:

CX<1>TCX<2>X<3>X<4>X<5>QGX<6>SMX<7>PC (SEQ ID NO: 24)

en donde:

X<1>es K o R;

X<2>es T o M;

X<3>es T o I;

X<4>es P, T o L;

X<5>es A o V;

X<6>es N o T; y

X<7>es F o Y.

El mAb 10 se une a otro epítopo del Bucle 1 dentro de los aminoácidos 120 a 127 de la secuencia de consenso: PCX<8>TCX<9>X<10>X<11>(SEQ ID NO: 25)

en donde:

X<8>es K o R;

X<9>es T o M

X<10>es T, I o S; y

X<11>es P, T o L.

Los mAb 7, 8, 11, 12, 16 y 17 se unen a un epítopo dentro de los aminoácidos 137 a 147 de la secuencia de consenso SEQ ID NO: 26 en el Bucle 2, en donde la secuencia de consenso es:

CCCTKPX<12>DGNCX<13>(SEQ ID NO: 26)

en donde:

X<12>es T o S; y

X<13>es T o S.

Se propone que una población de anticuerpos que ocupa tanto la SEQ ID NO: 24 como la SEQ ID NO: 25 y también ocupa la SEQ ID NO: 26 represente un perfil de eliminación de anticuerpos que indique una curación funcional. Ejemplo 6: Biomarcadores predictivos de la curación funcional de la HBC

LaFigura 2describe un ensayo que detecta el HBsAg con epítopos ocupados (panel superior) y un ensayo que detecta el HBsAg formando complejos con anticuerpos anti-HBs (panel inferior). Los ensayos emplean un inmunoensayo multiplex que detecta la ocupación de epítopos en el Bucle 1 (secuencia de consenso SEQ ID NO: 24 y 25) y en el Bucle 2 (secuencia de consenso SEQ ID NO: 26).

Ejemplo 7: Perfil de eliminación del HBsAg en la curación de la HBC

LaFigura 3y laFigura 4son representaciones esquemáticas que muestran el perfil de eliminación (CP) del HBsAg en la curación de la HBC. En laFigura 3, los pacientes con curación funcional desarrollan una respuesta de anticuerpos que elimina la infección. En laFigura 4,los pacientes que no se curan o no responden no portan los epítopos de HBsAg ocupados. El término HBsAgCP significa el perfil de eliminación de los epítopos del HBsAg. Un perfil de no eliminación del HBsAg se denomina HBsAg-NCP.

Ejemplo 8: Perfil de eliminación del HBsAg en la curación de la HBC

El reconocimiento por cada mAb de ensayo para epítopos del HBsAg se registra como un cambio de reconocimiento; factor de cambio positivo relacionado con un reconocimiento aumentado o mejorado del epítopo del HBsAg, reconocimiento del epítopo de intervalo normal o sin cambios (dentro de /- 0,5 veces) y reconocimiento del epítopo del HBsAg reducido indicado por un factor de cambio negativo. Un HBsAg CP está indicado por un reconocimiento reducido del epítopo de HBsAg (p. ej., debido a la ocupación del epítopo) en los epítopos del HBsAg del bucle 1 y del bucle 2.

Ejemplo 9: Identificación de un biomarcador de perfil de eliminación predictivo

Ensayo del perfil de HBsAg.El ensayo de panel multiplex anti-HBs (Figura 2, panel superior) en el Bioplex se desarrolló originalmente con el concepto de seguimiento diagnóstico de pacientes con HBC para detectar cambios en el HBsAg. Por ejemplo, el ensayo se puede utilizar en pacientes que reciben terapia con análogos de nucleótidos (AN) en los que el<a>D<n>del VHB es indetectable pero el HBsAg sigue siendo positivo, y en la búsqueda del desarrollo de mutaciones de resistencia al tratamiento o variantes de escape de la vacuna. Además, el ensayo es útil para intentar comprender el perfil del HBsAg y los cambios que ocurren durante las fases de la enfermedad de la HBC, es decir, biomarcadores predictivos de la enfermedad de la HBC. Una cohorte de pacientes que lograron la curación funcional de la HBC (de la cohorte de Historia Natural) son relevantes para la identificación del biomarcador de PC y se detallan más a continuación.

Los resultados del ensayo del perfil del HBsAg condujeron al desarrollo del biomarcador CP (es decir, reconocimiento del HBsAg por subconjuntos de Ab anti-HBs en el ensayo). Los resultados de estos ensayos permitieron comprender que: (a) la curación funcional está relacionada con una respuesta anti-HBs; (b) la respuesta anti-HBs de "eliminación" se dirige específicamente a epítopos de/dentro de los Ab anti-HBs específicos del bucle 1 y del bucle 2 en el ensayo; (c) los pacientes tienen muchos Ab anti-HBs diferentes, pero solo aquellos que se dirigen a estos epítopos del bucle 1 y del bucle 2 (epítopos CP) se asocian con el logro de una curación funcional; y (d) la presentación mejorada y dirigida de estos epítopos asociados a CP impulsa la producción de Ab anti-HBs de "eliminación" asociados a CP.

Historia Natural/Cohorte de curación funcional: Análisis anti-HBs realizado.En este estudio participaron seis pacientes con HBC identificados en el estudio de San Vicente (Cohorte de Historia Natural) que cumplían la definición de caso de curación funcional (FC). Los seis pacientes no habían recibido tratamiento antiviral y el HBsAg se había vuelto indetectable y se habían seroconvertido exitosamente con anti-HBs. Los seis pacientes de la Cohorte de Historia Natural dieron positivo a anti-HBs en sus muestras de suero (después de la seroconversión), que luego se analizaron para determinar la capacidad de ese estado anti-HBs para "inducir" un FC-P (perfil de eliminación de curación funcional; basado en el análisis anti-HBs de pacientes con curación funcional y el panel de ensayo 4 plex) cuando se incuba con HBsAg de referencia (véaseFigura 1). El FC-P se definió como una pérdida de unión del epítopo tanto en el bucle 1 como en el bucle 2 en la región externa del bucle, incluido el determinante "a" del HBsAg, usando cuatro mAb: mAb 5, mAb 6, mAb 7 y mAb 8: (los mAb 5 y mAb 6 reconocen epítopos en el bucle 1; los mAb 7 y mAb 8 reconocen epítopos en el bucle 2) (véaseFigura 2, panel superior). Uno de los seis pacientes con historia natural tenía muestras de suero previamente disponibles que todavía eran positivas para HBsAg. Usando Ab anti-HBs 4 plex en la plataforma Bioplex, se cartografió en la muestra HBsAg positivo el epítopo y cumplió con la definición de caso del perfil FC (FC-P).

Los epítopos derivados del HBsAg reconocidos por los Ab anti-HBs del bucle 1 o 24 plex (detallados en laTabla 1)se han insertado como repeticiones múltiples en una plataforma de administración de vacuna HBsAg VLP para generar BNP/FC-P (CP-BNP). Estas vacunas BNP/FC-P se prepararon como un formato de administración de un único epítopo o como mezclas de múltiples epítopos que se administraron como inmunizaciones a ratones. Las respuestas anti-HBs resultantes se analizaron para determinar su capacidad para inducir un FC-P cuando se incubaron con HBsAg de referencia, y se identificaron FC-P para mezclas de inmunización con BNP que cubrían los epítopos del bucle 1 y del bucle 2. Estas formulaciones de inmunización BNP/FC-P comprendían las construcciones detalladas en laTabla 2. Estas vacunas probadas hasta la fecha comprendían epítopos del bucle 1 y del bucle 2 y dieron como resultado la generación de anticuerpos asociados a FC-P.

Ejemplo 10: Producción de VLP/BNP

Los métodos para la producción de proteínas en líneas celulares de mamíferos y su purificación mediante ultracentrifugación, purificación por afinidad y filtración en gel son protocolos estándar y se describen a continuación, y en Hyakumura,et al.,Journal of Virology 2015, 89 (22): 11312-11322 (2015).

Brevemente, para la producción de VLP o BNP, células HEK293-T cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado con GlutaMax-1 (Gibco-BRL), 10 % suero de ternera fetal (FCS), penicilina y estreptomicina (Gibco-BRL) se transfectaron con construcciones de expresión usando polietilenimina (PEI) (Polysciences, Warrington, EE. UU.) o FectoPRO (PolyPlus Transfection EE. UU.). Las VLP/BNP se recogieron del sobrenadante del cultivo celular 5-8 días después de la transfección. Las VLP/BNP que incluyen una etiqueta Flag N-terminal, se purificaron por afinidad a partir del sobrenadante del cultivo de tejidos recogido y se purificaron por afinidad sobre columnas de resina de afinidad anti-Flag (CSIRO, Australia). Las proteínas de fusión se eluyeron competitivamente de la columna de afinidad anti-Flag con péptido Flag recombinante (0,4 mg/ml; CSIRO, Australia) en PBS. Las preparaciones de VLP/BNP purificadas por afinidad en PBS se purificaron luego mediante exclusión por tamaño en columnas de filtración en gel Superdex 200 o Superose 6 (GE Healthcare). Las preparaciones finales purificadas de VLP/BNP se analizaron para detectar endotoxinas (prueba Endosafe, Charles River, EE. UU.) y se concentraron por centrifugación a <1 ml utilizando dispositivos concentradores centrífugos de corte Amicon de 50 kDa. Como alternativa, las VLP/BNP se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo de tejidos recogido mediante clarificación por centrifugación utilizando una centrífuga de mesa, a continuación el sobrenadante se transfirió a un tubo de ultracentrífuga, se recubrió con un cojín de sacarosa al 20 % y las partículas sedimentaron por ultracentrifugación. Se descartó el sobrenadante y las VLP sedimentadas se resuspendieron en tampón STE (NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH8, EDTA 1 mM) para fines de vacunación. La pureza del rendimiento de la preparación de VLP/BNP se evaluó mediante: i) perfil de espectros A260/280 utilizando un coeficiente de extinción de VLP calculado de 37,26; ii) serología cuantitativa de HBsAg (kit Elecsys HBsAG II; Roche); iii) SDS-PAGE seguida de tinción de Coomassie y transferencia Western (WB) con anticuerpos de detección tanto anti-HBs como anti-Flag; iv) análisis del ensayo del perfil de epítopo de HBsAg en la plataforma Bioplex (ensayo interno); y, v) técnicas ELISA estándar con detección por anticuerpos anti-HBs (ensayo interno).

Ejemplo 11: Retención del epítopo CP-BNP

Después de la producción y purificación de BNP, y del análisis de garantía de calidad para el rendimiento y la pureza de las preparaciones de BNP, se analizaron las CP-BNP para determinar el perfil de epítopo de HBsAg (plataforma Bioplex) como preparaciones de BNP individuales y también como formulaciones de BNP para evaluar la retención de la presentación de epítopos en los bucles 1 y 2 (es decir, se muestran o presentan los epítopos del bucle 1 y del bucle 2) según corresponda a la antigenicidad en el momento de la administración. Como se muestra en laFigura 11,Las formulaciones de CP-BNP retienen los insertos de epítopo de la tecnología actual.

Ejemplo 12: Producción de péptidos cíclicos del epítopo CP

Péptidos ciclados del epítopo CP.Los péptidos ciclados se diseñaron para imitar los epítopos de "eliminación" diana del bucle 1 y el bucle 2 identificados dentro del HBsAg, similar a los insertos de epítopo CP suministrados en las CP-BNP. Existen variaciones de secuencia dentro de estos epítopos que dependen de las variaciones naturales del genotipo del VHB y del serotipo del HBsAg, y se diseñaron múltiples péptidos cíclicos basándose en esta consideración, generando formulaciones equimolares pangenotípicas/panserotípicas de péptidos ciclados del epítopo CP del bucle 1 o del bucle 2 para su administración como antígenos inmunizantes en estudios de inmunogenicidad para el desarrollo de anticuerpos anti-HBs de "eliminación" asociados a CP. Los péptidos diseñados fueron encargados para su producción a Mimotopes (Australia) con amina libre N-terminal, ácido libre C-terminal, ciclados por enlaces disulfuro en residuos de cisteína de secuencia nativa. La producción tuvo una pureza de >85 % mediante HPLC y se determinó mediante análisis de perfil de espectrometría de masas. El péptido ciclado se acopló mediante un enlazador glutaraldehído a KLH (hemocianina de lapa californiana) para la inmunización o a BSA (albúmina sérica bovina) para ensayos de detección. Los péptidos cíclicos de ejemplo de la presente tecnología se enumeran en laTabla 5anterior.

Un estudio de inmunogenicidad para generar anti-HBs asociados a CP comprendió la inmunización con formulaciones de péptido cíclico de mezcla de bucle 1 o de péptido cíclico de mezcla de bucle 2 administradas a n = 2 ratones BALB/c y n = 2 ratones C57/B6 para cada formulación peptídica. Los ratones se inmunizaron con 3 dosis de 2 pg de mezcla de péptidos.

Los sueros de prefusión recolectados se examinaron mediante protocolos ELISA estándar para detectar respuestas de anticuerpos específicas de HBsAg (VLP) recombinante y de péptidos ciclados del bucle 1 o del bucle 2 de HBsAg (formulación de formulaciones de péptidos individuales y combinadas). También se analizaron para la generación de un análisis de ensayo del perfil CP inducido por anticuerpos anti-HBs en la plataforma Bioplex (ensayo interno). Estos datos se utilizaron para informar qué ratones deberían seleccionarse para la recogida y fusión del bazo para desarrollar anticuerpos monoclonales anti-HBs específicos.

El sobrenadante posterior a la fusión se analizó inicialmente mediante protocolos ELISA estándar para detectar respuestas de anticuerpos específicas del HBsAg (VLP) recombinante y de los péptidos ciclados del bucle 1 y 2 (formulación de péptidos individuales y formulaciones de péptidos agrupados). Los sobrenadantes de los clones se analizaron adicionalmente para la detección del HBsAg después de la SDS-PAGE y la transferencia Western, para determinar la afinidad por los epítopos lineales. Los sobrenadantes de los clones se analizaron para la generación de un análisis de ensayo del perfil CP inducido por anticuerpos anti-HBs en la plataforma Bioplex (ensayo interno), en comparación con el HBsAg pangenotípico/serotípico previo a la incubación. Estos datos se utilizaron para determinar qué clones deberían seleccionarse para rondas posteriores de desarrollo de anticuerpos monoclonales, con análisis de sobrenadantes de clones en cada ronda, e incluyendo análisis de anticuerpos monoclonales anti-HBs seleccionados finales (Tabla 6; Figura 12).

T l . l i n l n -f i n r l r i n lín n i r m n l n l

Ejemplo 13: Estudio de inmunogenicidad de CP-BNP y péptidos cíclicos de epítopo CP

Este ejemplo demuestra la inmunogenicidad de las CP-BNP y los péptidos cíclicos de epítopo CP de la presente tecnología. Se evaluó la inmunogenicidad de las formulaciones de CP-BNP y CP-BNP que presentan el bucle 1 diana, epítopos de "eliminación" del bucle 2, o del bucle 1 y 2 (véaseTabla 2anterior) mediante inmunización de ratones de la cepa BALB/c. Las CP-BNP 1-4 y sus formulaciones (en comparación con el control de fondo WT-BNP) se evaluaron en una primera ronda de estudio de inmunogenicidad de BNP. Estas se reevaluarán junto con la evaluación de CPBNP 5-8 y sus formulaciones en un segundo estudio de inmunogenicidad.

El estudio de inmunogenicidad n.° 1 incorporó CP-BNP 1-4 y formulaciones como se indica en laTabla 2(en comparación con los controles de WT-BNP y placebo de PBS), mientras que el estudio de inmunogenicidad IMM001 repitió la evaluación realizada en el estudio original y además evaluó el rendimiento de CP-BNP 5-8 y las formulaciones 1+3+4 y 5+7. Se inmunizaron ratones BALB/c de seis semanas de edad (hasta 5 por grupo) con 3 dosis de 2 |jg de antígeno CP-BNP purificado a intervalos quincenales. Se tomaron sangrados antes de cada administración de antígeno y luego después de la inmunización a intervalos semanales durante 5 semanas. Los ratones se sacrificaron en el momento final y se recogió el sangrado terminal. Se analizaron los sueros recogidos de cada momento de sangrado para investigar la respuesta de los anticuerpos anti-HBs a la inmunización con CP-BNP mediante: i) títulos de anticuerpos anti-HBs (Ul/l) mediante pruebas serológicas de diagnóstico (kit Elecsys Anti-HBs, Roche); ii) metodología ELISA estándar para la detección de WT-VLP o péptidos del HBsAg del buclel o bucle2; y, iii) análisis del ensayo del perfil de CP inducido por anticuerpos anti-HBs en la plataforma Bioplex (ensayo interno). La reactividad del buclel y bucle2 presentada en esta tabla presenta el análisis de CP-BNP o formulaciones mediante ensayo del perfil de HBsAg, para determinar la presentación retenida del epítopo o epítopos CP de HBsAg identificados como asociados con la eliminación (es decir, epítopos diana de una respuesta anti-HBs de "eliminación").

LaFigura 13Amuestra la respuesta de inmunogenicidad del anticuerpo anti-HBs para preparaciones y formulaciones de CP-BNP. LaFigura 13By laFigura 13Cmuestra para el bucle 1 y el bucle 2, respectivamente, las respuestas de inmunogenicidad de anticuerpos anti-HBs para los péptidos cíclicos de epítopo CP. LaFigura 13Dpresenta la reactividad anti-Hbs para WT-BNP, antígenos peptídicos del bucle1 y peptídicos del bucle2. En conjunto, estos resultados muestran que las CP-BNP y los péptidos cíclicos de epítopo CP de la presente tecnología provocan respuestas inmunitarias específicas del VHB y son útiles en métodos para inducir la producción de anti-HBs.

Ejemplo 14: Las CP-BNP inducen un perfil de eliminación de la HBC

Este ejemplo demuestra que las CP-BNP de la presente tecnología son capaces de inducir un perfil de eliminación en sujetos inmunizados.

Los sueros de sangrado terminal siguiendo el calendario de inmunización n=3 con las preparaciones de CP-BNP (CP-BNP 1-8) y formulaciones (CP-BNP 1+3, 1+3+4, 1+4, WT+4, 5+7 o 1+4+5) se analizaron para determinar el perfil de anticuerpos anti-HBs. Los resultados mostrados en laFigura 14demuestran que las CP-BNP de la tecnología actual inducen un perfil de eliminación (p. ej., pérdida de reconocimiento de epítopo en los epítopos del bucle 1 y bucle 2). En consecuencia, estos resultados demuestran que las composiciones que comprenden las CP-BNP de la presente tecnología son útiles en métodos de tratamiento de la hepatitis B crónica.

Ejemplo 15: El ARNm que codifica las CP-BNP y los péptidos cíclicos de epítopo CP induce un perfil de eliminación de la HBC

Este ejemplo demostrará que los ARNm que codifican las CP-BNP y los péptidos cíclicos de epítopo CP de la presente tecnología son capaces de inducir un perfil de eliminación en sujetos inmunizados.

Se inmunizan ratones BALB/c de seis semanas de edad (5 por grupo) con 3 dosis de 2 jg de ARNm purificado que codifica CP-BNP o péptidos cíclicos de epítopo CP a intervalos quincenales. Los sangrados se toman antes de cada administración de antígeno y luego después de la inmunización a intervalos semanales durante 5 semanas. Los ratones se sacrifican en el momento final y se recoge el sangrado terminal. Los sueros recogidos de cada momento de sangrado se analizan para investigar la respuesta de anticuerpos anti-HBs a la inmunización con CP-BNP mediante: i) títulos de anticuerpos anti-HBs (Ul/l) mediante pruebas serológicas de diagnóstico (kit Elecsys Anti-HBs, Roche); ii) metodología ELISA estándar para la detección de WT-VLP o péptidos del bucle 1 o bucle 2 del HBsAg; y, iii) análisis del ensayo del perfil de CP inducido por anticuerpos anti-HBs en la plataforma Bioplex (ensayo interno).

Los resultados mostrarán que las construcciones de ARNm de la tecnología actual inducen un perfil de eliminación (p. ej., pérdida de reconocimiento de epítopo en los epítopos del bucle 1 y bucle 2) en ratones inmunizados. En consecuencia, estos resultados demostrarán que las composiciones que comprenden las construcciones de ARNm de la presente tecnología son útiles en métodos de tratamiento de la hepatitis B crónica.

Ejemplo 16: Las CP-BNP reducen los niveles de ADN del VHB y HBsAg en un modelo murino de hepatitis B crónica (HBC)

Materiales y métodos para la producción de candidatos a vacunas de prueba (CP-BNP 1, 3, 4, 5, 7) para probar en el modelo murino de HBC.Plásmidos que contienen insertos de ADNc específico de HBsAgS (WT o varios insertos como se describe en laTabla 3y laTabla 4) se clonaron en pCAGGS (con una etiqueta FLAG N-terminal) y se usaron para transfectar células HEK293T usando polietilenimina (PEI) como se ha descrito anteriormente (Longo, 2013). Las proteínas HBsAgS funcionales, incluidas las proteínas HBsAgS quiméricas con secuencias adicionales insertadas, se ensamblan en partículas similivíricas competentes en secreción, bionanopartículas (BNP). Cinco días después de la transfección, se recogió medio de cultivo celular y se centrifugó para eliminar los restos celulares. El medio de cultivo celular se centrifugó a alta velocidad (ultracentrifugación) sobre un cojín de sacarosa al 20% parasedimentar y purificar parcialmente las BNP, a continuación se resuspendió en tampón de cloruro de sodio (NaCl)-T ris-EDTA (STE). Se realizó una purificación adicional de las BNP mediante ultracentrifugación utilizando un gradiente de sacarosa (20 - 50 %) en STE. Se recogieron fracciones que contenían VLP, se agruparon (según necesidad), se intercambió el tampón y se concentraron en PBS (Hyakumura, 2015; Cheong, 2009; Patzer, 1986) y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Las VLP de HBsAg se confirmaron mediante ELISA o transferencia Western como se ha descrito anteriormente.

Modelo murino de HBC.El modelo de ratón de HBC CBA/caJ se desarrolló mediante inyección hidrodinámica (HDI) de un replicón del VHB (pAAV/HBV1.2), que permite la administración de ADN a los hepatocitos mediante una inyección intravenosa en la vena de la cola (Kim, 2013; Yang, 2002; Huang, 2006). Este modo de transfecciónin vivoera necesaria porque el virus de la hepatitis B (VHB) no infecta de forma natural a los ratones. Una única HDI de un plásmido que contiene ADN del VHB con capacidad de replicación indujo un VHB estable dependiendo de la cepa de ratón utilizada (para ratones CBA persistió > 6 meses con producción de marcador viral del VHB específico del hígado (hasta 32 semanas)). La expresión prolongada del VHB en ratones portadores no causa daño hepático, lo cual se evidencia por niveles normales de un indicador de daño hepático (alanina aminotransferasa, ALT). Después de la HDI, se midió el ADN del VHB en el suero del ratón para confirmar que se había establecido la persistencia del VHB. A continuación, se utilizaron ratones con un VHB persistente para estudios de inmunización para probar la capacidad de las BNP quiméricas con repeticiones de epítopos específicos del perfil de eliminación (CP-BNP) para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica capaz de interferir y/o eliminar el VHB del hígado.

T ras el establecimiento de la hepatitis B crónica (aproximadamente la semana 10), se trataron grupos de 6 a 8 ratones CBA/caJ con placebo (control adyuvante), partículas de control (Engerix B (vacuna contra el VHB comercializada fabricada en células de levadura), BNP de tipo silvestre (WT-BNP])) o candidatos a vacunas de prueba (CP-BNP 1 -7, en varias combinaciones en proporciones equimolares con concentraciones finales como se enumeran en lasFiguras 15A-15Cy16A-16C). El esquema de tratamiento incluyó una mezcla de diferentes BNP quiméricas adyuvadas con hidróxido de aluminio. Se administraron tres dosis de vacuna por vía subcutánea con 2 semanas entre dosis. Los sangrados submandibulares se realizaron cada 2 semanas hasta 26 semanas post-HDI, con pruebas para determinar la carga de ADN del VHB en suero (Sitnik, 2010) y los niveles de HBsAg (según el protocolo recomendado por el fabricante; qHBsAg Elecsys).

Resultados del modelo murino de HBC-Niveles de ADN del VHB.Los resultados del nivel de ADN del VHB que se describen a continuación se muestran en lasFiguras 15A-15C.El placebo (grupo 1) no cambió significativamente los niveles de ADN del VHB durante la duración del estudio. WT-BNP se dosificó a 0,05 (grupo 2), 0,1 (grupo 3) o 0,5 (grupo 4 y 12) |jg. La dosis de WT-BNP de 0,05 |jg (grupo 2) no tuvo efecto sobre los niveles de ADN del VHB, mientras que las dosis de 0,1 (grupo 3) o 0,5 (grupo 4 y 12) jg mostraron una disminución dependiente de la dosis en los niveles de ADN del VHB. La combinación de CP-BNP 1+4+5 a 0,5 jg (grupos 8 y 13) mostró la disminución más rápida y pronunciada en el ADN del VHB con efectos sostenidos desde la S12 (dos semanas después de la primera dosis) hasta el final del estudio (S26). La mayor disminución se observó con las CP-BNP 1+4+5 a 0,5 jg , mostrando una reducción de 3 log en el ADN del VHB con respecto al valor inicial en la S10 y también una reducción de al menos 2 log en el ADN del VHB con respecto a las WT-BNP con la misma dosis a partir de la S12, observándose disminuciones máximas a partir de la S14 (reducción >3 log). Utilizando dosis inferiores a 0,5 jg , las CP-BNP 1+4+5 también mostraron una disminución de la dependencia de la dosis en el ADN del VHB, pero las dosis más bajas de 0,05 (grupo 6) o 0,1 (grupo 7) jg tenían un mayor ADN del VHB con respecto a las mismas dosis de WT-BNP. También se probaron otras combinaciones de CP-BNP en este modelo y se observó que eran menos eficaces que las CP-BNP 1+4+5. Por ejemplo, la combinación de CP-BNP 1+3+4 a 0,5 jg y combinaciones reducidas (CP-BNP 3+4 (grupo 9), CP-BNP 4+5 (grupo 10), CP-BNP 5+7 (grupo 11)) también disminuyó en los niveles de ADN del VHB, pero lo hizo a un ritmo más lento y con una disminución menos absoluta, con una reducción >1 log lograda a partir de la S12 y mantenida durante toda la duración del estudio. Los datos representados en lasFiguras 15A-15Ctambién se muestran en formato tabular como cambios individuales medias cambios medios res ecto al basal en lasTablas 7 8 9res ectivamente.

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Tabla 9. Cambios medios con res ecto a los datos del ADN del VHB basal.

Resultados del modelo murino de HBC: niveles de HBsAg.Los resultados del nivel de HBsAg que se describen a continuación se muestran en lasFiguras 16A-16C.El placebo (grupo 1) no cambió significativamente los niveles de HBsAg durante la duración del estudio. WT-BNP se dosificó a 0,05 (grupo 2), 0,1 (grupo 3) o 0,5 (grupo 4 y 12) |jg. La dosis de 0,05 jg de WT-BNP (grupo 2) no tuvo efecto sobre los niveles de HBsAg, mientras que las dosis de 0,1 (grupo 3) o 0,5 (grupo 4 y 12) jg mostraron una disminución dependiente de la dosis en los niveles de HBsAg. La combinación de CP-BNP 1+4+5 a 0,5 jg (grupos 8 y 13) mostró la disminución más rápida y pronunciada del HBsAg con efectos sostenidos desde la S12 (dos semanas después de la primera dosis) hasta el final del estudio (S26). La mayor disminución se observó con las CP-BNP 1+4+5 a 0,5 jg , mostrando una reducción de 3 log en el HBsAg con respecto al basal en la S10 y también una reducción > 1 log en HBsAg en relación con las WT-BNP en la misma dosis a partir de la S12, observándose las disminuciones máximas a partir de la S14. Utilizando dosis inferiores a 0,5 jg , las CP-BNP 1+4+5 también mostraron una disminución dependiente de la dosis en el HBsAg, pero la dosis más baja de 0,05 jg (grupo 6) fue similar a WT-BNP en la misma dosis o 0,1 jg (grupo 7) tuvo HBsAg más alto en relación con la misma dosis de WT-BNP. También se probaron otras combinaciones de CP-BNP en este modelo y se observó que eran menos eficaces que las CP-BNP 1+4+5. Por ejemplo, la combinación de CP-BNP 1+3+4 a 0,5 jg y combinaciones reducidas (CP-BNP 3+4 (grupo 9), CP-BNP 4+5 (grupo 10), CP-BNP 5+7 (grupo 11)) también disminuyó los niveles de HBsAg, pero lo hizo a un ritmo más lento y con una disminución menos absoluta, con una reducción >0,5 log lograda a partir de la S12 y mantenida durante toda la duración del estudio.

Los datos representados en lasFiguras 16A-16Ctambién se muestran en formato tabular como cambios individuales, medias y cambios medios respecto al basal en lasTablas 10, 11,y12,respectivamente.

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Tabla 12. Cambios medios con respecto a los datos del HBsAg del basal.

Los resultados mostrados en lasFiguras 15A-15Cy16A-16Cdemuestran que las CP-BNP de la presente tecnología son eficaces para reducir la carga viral del ADN del VHB y los niveles de HBsAg en un modelo de HBC. En consecuencia, estos resultados demuestran que las composiciones que comprenden las CP-BNP de la presente tecnología son útiles en métodos de tratamiento de la hepatitis B crónica.

Ejemplo 17: Producción de vacunas candidatas a partir de ARNm y la expresión de proteínas después de la transfección de ácidos nucleicos que codifican BNP en células de mamíferos

Producción de vacunas candidatas WT y CP-BNP4 a partir de ARNm.El plásmido pBluescript II SK(+) que contiene la secuencia codificante WT o BNP4 se linealizó con la enzima de restricción EcoRV-HF, se purificó y se confirmó mediante técnicas estándar de biología molecular. El plásmido linealizado se utilizó como molde para la producción de ARNm utilizando un kit de transcripciónin vitrosegún las recomendaciones del fabricante (Life Technologies), a continuación se purificó (Life Technologies, Thermo Fisher). Los transcritos resultantes se almacenaron a -80 °C hasta que estuvieron listos para usar. Las transfecciones se realizaron utilizando el reactivo Lipofectamine MessengerMAX (ThermoFisher) en células HEK293T o Huh7 durante 5 días. A continuación, los medios se recogieron y procesaron utilizando el método de ultracentrifugación de sacarosa descrito anteriormente. Como alternativa, los lisados celulares se procesaron utilizando tampón de lisis NP-40 y los restos celulares sedimentaron. Las muestras se evaluaron mediante transferencia Western como se ha descrito anteriormente.

La expresión de proteínas se produce después de la transfección de ácidos nucleicos que codifican BNP (ARNm y ADN) en líneas celulares de mamíferos.La expresión de HBsAg BNP a partir de la transfección de ARNm se logró con éxito en dos líneas celulares diferentes (HEK293T y Huh7), medida mediante análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-HBsAg.(Figuras 17A-17B).La transferencia Western identificó múltiples bandas, incluido el tamaño esperado del monómero (Wt -BNP, 24 kD; c P-BNP 4, 29 kD) y variantes glicosiladas (WT-BNP, 27 kD; CP-BNP 4, 32 kD). Adicionalmente, se detectó HBsAg después de la transfección con una construcción de ADN que expresaría WT-BNP (con etiqueta Flag de 15 y 28 kDa).

Estos resultados demuestran que las construcciones de ARNm de la presente tecnología son capaces de expresar subunidades funcionales de HBsAg-S, como se demuestra por su capacidad para secretar en el sobrenadante del cultivo celular, lo cual es una indicación para la formación de BNP. Las CP-BNP de la tecnología actual, generadas por transfección de ARN, podrían ser útil en composiciones para el tratamiento de la hepatitis B crónica.

REFERENCIAS

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una bionanopartícula (BNP) que comprende una proteína de fusión HBsAg-S de la envoltura hepadnaviral que comprende una o más regiones de repetición de epítopo antigénico, en donde dichas regiones de repetición de epítopo antigénico se seleccionan del grupo que consiste en epítopos antigénicos expresados en las regiones del Bucle 1 y del Bucle 2 del dominio HBsAg-S.

2. La bionanopartícula de la reivindicación 1, en donde la bionanopartícula es un antígeno de partícula similivírica recombinante (VLP-Ag).

3. La bionanopartícula de la reivindicación 1 o 2, en donde:

(a) la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico se seleccionan del grupo que consiste en CKTCTTPAQGNSMFPS, CTKP(T/S)TDGNC, PCKTCTTP, PCRTCTTP, CTKPTDGNC, PC(K/R)TC(T/M)TP, C(K/R)TC(T/M)T(P/T)AQG(N/T)SM(F/Y)PS, PCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC, y PCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC; o

(b) la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico expresadas en el Bucle 1 se definen mediante la secuencia de aminoácidos CX<1>TCX<2>X<3>X<4>X<5>QGX<6>SMX<7>PC, en donde X<1>es K o R, X<2>es T o M, X<3>es T o I, X<4>es P T o L, X<5>es A o V, X6 es N o T, y X<7>es F o Y; o

(c) la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico se definen por la secuencia de aminoácidos PCX<8>TCX<9>X<10>X<11>en donde X8 es K o R, X<9>es T o M, X<10>es T, I o S, y X<11>es P, T o L; o

(d) la una o más regiones de repetición de epítopo antigénico expresadas en el Bucle 2 se definen por la secuencia de aminoácidos de consenso CCCTKPX<12>DGNCX<13>, en donde X<12>es T o S; y X<13>es T o S.

4. La bionanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión de la envoltura hepadnaviral comprende un dominio espaciador entre las regiones de repetición de epítopo antigénico y la proteína de la envoltura.

5. Un ácido nucleico que codifica la bionanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un ARNm recombinante que codifica una proteína de fusión HBsAg-S de la envoltura hepadnaviral como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 o el ARNm recombinante de la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende: la bionanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el ARNm recombinante de la reivindicación 6; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una bionanopartícula o un ARNm recombinante para usar en un método para tratar la infección por hepatitis B en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto:

(a) una bionanopartícula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; o

(b) un ARNm recombinante como se define en la reivindicación 6.

10. Una bionanopartícula o un ARNm recombinante para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra el virus de la hepatitis B en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto:

(a) una bionanopartícula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; o

(b) un ARNm recombinante como se define en la reivindicación 6.

11. Un kit para tratar la infección por hepatitis B en un sujeto que lo necesita, que comprende una bionanopartícula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un ARNm recombinante como se define en la reivindicación 6.

12. Una composición que comprende uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en TCTTPAQGNSMFPSC (SEQ ID NO: 17), TCTIPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 18), TCTTPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 19), CTKPTDGNCT (SEQ ID NO: 20) y CTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 21);

en donde el uno o más péptidos son cíclicos y/o están conjugados con una proteína transportadora; opcionalmente en donde la proteína transportadora es hemocianina de lapa californiana (KLH).

13. La composición de la reivindicación 12 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en TCTTPAQGNSMFPSC (SEQ ID NO: 17), TCTIPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 18), TCTTPAQGTSMFPSC (SEQ ID NO: 19), CTKPTDGNCT (SEQ ID NO: 20), y CTKPSDGNCT (SEQ ID NO: 21) para usar en un método para tratar la infección por hepatitis B en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto el uno o más péptidos.

15. El uno o más péptidos para usar de la reivindicación 14, en donde el uno o más péptidos son cíclicos y/o están conjugados con una proteína transportadora; opcionalmente en donde la proteína transportadora es hemocianina de lapa californiana (KLH).