ES2985799T3 - Partículas autoalimentadas para la propulsión a través de fluidos acuosos líquidos - Google Patents

Abstract

Se describe un sistema de partículas autopropulsadas simple que puede suministrar una carga a través de soluciones acuosas fluidas. Esta descripción proporciona una composición no acuosa que comprende: (i) partículas formadas por una sal de carbonato y que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 100 μm o menos; y (ii) un ácido en forma sólida. Las partículas pueden estar asociadas con una molécula o partícula de carga. En modelos de ratón de hemorragia grave, las partículas propulsadas pueden suministrar una enzima procoagulante y detener el sangrado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Partículas autoalimentadas para la propulsión a través de fluidos acuosos líquidos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a partículas capaces de autopropulsarse.

ANTECEDENTES

Las hemorragias incontroladas se producen en muchas situaciones, tales como hemorragias nasales graves, hemorragias posparto (HPP), traumatismos, procedimientos dentales y hemorragias en pacientes con hemofilia. La principal preocupación durante una hemorragia grave es controlar de manera rápida la pérdida de sangre, aunque también es importante controlar las hemorragias secundarias, la infección y la reparación de los tejidos. La administración de terapias apropiadas, tales como coagulantes, antifibrinolíticos, antimicrobianos o factores de crecimiento a la vasculatura dañada puede ayudar. Sin embargo, la administración de dichos agentes mediante inyecciones sistémicas o a través de un catéter intravascular a menudo no es posible, sobre todo si la persona se encuentra lejos de un entorno clínico avanzado. La administración tópica está limitada por el difícil problema biofísico de trasladar los agentes flujo arriba a través del flujo sanguíneo y lo suficientemente profundo en una zona de hemorragia en donde podrían tratar los vasos con fugas. Las hemorragias graves suelen ser mortales porque los coagulantes no son capaces de alcanzar y coagular la sangre a nivel de los vasos dañados.

Con anterioridad se han propuesto sistemas de partículas propulsadas para la administración de fármacos.1-6 Algunas de estas partículas se basan en la generación de gas y la propulsión de burbujas para crear su velocidad. Dichas partículas pueden contener catalizadores metálicos que convierten el peróxido de hidrógeno disuelto en una solución acuosa en gas oxígeno. Otros ejemplos convierten los iones de hidrógeno en soluciones fuertemente ácidas (pH menor que 1) en gas hidrógeno. De este modo, el «combustible» para la propulsión o un reactivo necesario se sitúa en el entorno de la partícula y no está presente en la propia partícula. También se han propuesto mecanismos tales como los ultrasonidos o los soportes flotantes accionados magnéticamente para la propulsión.78

Las partículas que emplean la propulsión por gas/burbujas no se han utilizadoin vivoporque dependen de tener un «combustible» (por ejemplo, peróxido de hidrógeno) que es tóxico o un reactivo necesario (es decir, un ácido fuerte) disperso en el entorno vivo. Además, por lo general se propulsan a velocidades en muchos órdenes de magnitud más lentas que el flujo sanguíneo.14

A pesar de los inconvenientes con respecto a su usoin vivo,se ha avanzado en el diseño de partículas por lo general capaces de funcionar como motores de microchorros o «cohetes», tales como los microtubos enrollados, incluidas las versiones cónicas de los microtubos3512. Los componentes poliméricos y/o las capas de dichas partículas pueden adaptarse para transportar fármacos, así como para aislar un portador de un reactivo o «combustible», tal como el peróxido de hidrógeno, hasta el momento en que se disuelva una capa de barrera.

Independientemente del desarrollo de partículas propulsoras están los avances que se han realizado en los microportadores de fármacos. Se conocen diversas micropartículas que se utilizan para transportar sustancias biológicamente activas con el fin de mejorar su administración a células objetivo, tejidos, etc. Se han desarrollado micropartículas, incluidas versiones porosas de las mismas que están realizadas de polielectrolitos y son capaces de adsorber materiales biológicamente activos que se han desarrollado para la administración de fármacos. Ejemplos de dichas partículas se han fabricado cristalizando sales inorgánicas tales como el carbonato cálcico. También se han desarrollado procesos para la fabricación controlada de películas y partículas, incluidos los que permiten un control preciso del grosor de la película o de la cubierta de la partícula (es decir, protocolos de capa por capa (ELbL) asistidos por plantillas nanoporosas).

El documento de Volodkin et al.9 describe la producción de partículas porosas de CaCO<3>(vaterita) con una distribución de tamaños de 4 a 6 pm que encapsulan proteínas que se adsorben a las partículas. Dichas partículas resultaron ser biocompatibles y descomponibles a un pH neutro.

Se han dado a conocer composiciones que comprenden carbonatos metálicos y ácidos orgánicos que en efervescencia en contacto con medios acuosos tales como aditivos para dispositivos de recogida de fluidos corporales (patente estadounidense n° 6225123). Esta última patente da a conocer que dichas composiciones pueden incluir un activador del coágulo, tales como partículas de sílice. La efervescencia ayudará a distribuir el activador de coágulos por un recipiente de recogida para promover una rápida coagulación de la sangre antes de la extracción del suero. Dichos aditivos pueden fabricarse en formas sólidas (incluidos comprimidos) para su adición a tubos que contengan muestras de sangre.

Se conoce que la presencia de iones de calcio en el lecho de una herida favorece la cicatrización y esto ha dado lugar a tratamientos que implican la aplicación tópica de calcio en las heridas, tal como el uso de apósitos de alginato cálcico. En Kawai et al.<13>prepararon nanopartículas de 50-200 nm a partir de colágeno y cloruro cálcico para su inyección intravenosa. Constataron una mejor cicatrización de la herida en un modelo de ratón con herida abierta tras la inyección de las nanopartículas a base de calcio en comparación con la inyección intravenosa de cloruro cálcico. También compararon los resultados tras la administración tópica de cloruro cálcico y nanopartículas a base de calcio directamente sobre heridas abiertas. En consonancia con los resultados obtenidos con los apósitos que contienen calcio, la administración tópica de cloruro cálcico aceleró la cicatrización, pero la administración tópica de las nanopartículas a base de calcio no modificó de manera significativa la tasa de cicatrización de las heridas.

También se conocen preparados de fibrina hemostáticos y adhesivos espumantes que pueden contener iones de calcio, tal como los dados a conocer en los documentos WO2000/038752 y WO2011/123346. La dispersión de los componentes que proporcionan una matriz de fibrina resulta de la acción espumante. La formación de espuma resulta de la generación de CO<2>. Ninguna de las referencias da a conocer partículas que se propulsen a sí mismas. Por ejemplo, el documento WO2011/123346 da a conocer la generación de CO<2>mezclando una solución que contiene componentes de soporte de fibrina y bicarbonato sódico con una solución ácida. El documento WO2000/038752 da a conocer una composición en polvo o granulada que contiene componentes para formar una matriz de fibrina, junto con un carbonato y un ácido orgánico fisiológicamente aceptable. Esta última composición entra en efervescencia al entrar en contacto con la humedad.

SUMARIO

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición no acuosa que comprende:

(i) partículas formadas por una sal de carbonato; y

(ii) un ácido en forma sólida,

caracterizada porque el ácido es TXA-NH<3+>(ácido tranexámico protonado).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para transportar una molécula de carga o una partícula de carga a través de un fluido acuoso, comprendiendo dicho método proporcionar una composición del primer aspecto, en donde (i) está asociada con dicha molécula de carga o partícula de carga; en donde el método comprende, además, introducir la composición en dicho fluido; y en donde el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia ni un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona la composición del primer aspecto para su uso en medicina.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición no acuosa que comprende partículas porosas de CaCo<3>y TXA-NH<3+>.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un apósito para heridas que comprende la composición del primer aspecto.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención se proporcionan en las reivindicaciones dependientes del presente documento.

La presente invención se refiere a un sistema de partículas sencillo y autopropulsado que puede suministrar una carga a través de soluciones acuosas fluidas. Este sistema es funcional, y en un modelo de ratón de hemorragia grave las partículas propulsadas son capaces de administrar una enzima procoagulante y detener la hemorragia. Este sistema tiene aplicación para la administración de carga a través de fluidos acuosos que fluyen. El fluido puede fluir a una velocidad inferior a aproximadamente 5, 4, 3, 2 o 1 mm/s. Las composiciones de esta invención pueden ser de utilidad para la administración de terapéuticos a lugares de lesión o hemorragia o en el tratamiento de hemorragias externas que se originan desde el interior del cuerpo, tales como el útero, la cavidad nasal o la cavidad abdominal, en donde los agentes tópicos tradicionales no son particularmente eficaces.

Esta invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las partículas autoalimentadas pueden generar energía suficiente para autopropulsarse contra el flujo de un fluido en movimiento, incluyendo la sangre que fluye. Dichas partículas pueden utilizarse para la administración local de agentes biológicamente activos, incluyendo la administración que permite el movimiento de las partículas hacia zonas de hemorragia. Además, las propias partículas pueden estar diseñadas para ayudar en la coagulación de la sangre y/o la cicatrización de heridas.

La presente invención se refiere a un método de transporte de una molécula de carga o partícula de carga a través de un fluido acuoso, comprendiendo el método proporcionar una partícula autoalimentada asociada con dicha molécula de carga o partícula, comprendiendo la partícula autoalimentada un combustible para liberar gas para propulsar la partícula cuando entra en contacto con el fluido acuoso. Las partículas pueden estar formadas por una sal de carbonato tal como se describe en el presente documento.

Esta invención también se refiere a composiciones que comprenden partículas sólidas que incluyen una sal de carbonato; y, un ácido, en forma sólida, en mezcla o distribuido en o sobre una matriz no acuosa, soporte o portador. En particular, una composición no acuosa puede comprender: (i) partículas formadas por una sal de carbonato y que tengan un diámetro medio de aproximadamente 100 pm o menor; y (ii) un ácido en forma sólida. La composición puede consistir esencialmente en el ácido en forma sólida y las partículas formadas de una sal de carbonato, con o sin una carga asociada.

Las partículas que contienen la sal de carbonato pueden estar asociadas con una partícula de carga o con una molécula de carga, que puede ser un agente biológicamente activo. Por lo tanto, esta invención también se refiere a un método de transporte de una molécula o partícula de carga a través de un fluido acuoso que fluye utilizando una composición de este tipo que se introduce en el fluido. El fluido puede ser un fluido corporal.

Esta invención también se refiere a la utilización de una composición tal como la aquí descrita para administrar un agente biológico a través de un fluido corporal. El fluido corporal puede ser fluyente. Dicho uso puede ser para el tratamiento de hemorragias. Una composición tal como la descrita en el presente documento puede ser para una administración local, incluso en una zona de hemorragia. Una composición tal como la aquí descrita puede estar adaptada para la administración tópica o la colocación directa sobre una zona de hemorragia durante un tratamiento quirúrgico.

Esta invención también se refiere a nanopartículas y/o micropartículas de CaCO<3>que están asociadas con un agente biológico capaz de afectar a la coagulación, incluidos agentes que promueven la coagulación tal como la trombina, el factor tisular y otros procoagulantes o antifibrinolíticos. De manera alternativa, el agente puede ser uno que disminuya los coágulos o la coagulación, tal como el activador tisular del plasminógeno (tPA).

Esta invención también se refiere a composiciones no acuosas que comprenden nanopartículas y/o micropartículas de CaCO<3>y el ácido orgánico THX-NH<3>+. Las partículas pueden estar asociadas con una molécula o partícula de carga tal como se describe en el presente documento. La composición puede consistir esencialmente en el ácido y en las partículas, con o sin carga asociada.

Las partículas de CaCO<3>para su uso en esta invención pueden ser micropartículas de un tamaño comprendido entre 1 y 100 pm de diámetro medio; menor de 50 pm de diámetro medio; entre 20 y 60 pm de diámetro medio; entre 2 y 10 pm de diámetro medio; o entre 4 y 6 o 10 pm de diámetro medio. También se contemplan las nanopartículas con un diámetro inferior a aproximadamente 1 pm (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 pm o superior). Las partículas pueden ser porosas. El tamaño de los poros de las partículas puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm. Dichas partículas pueden ser las preparadas por precipitación de partículas porosas de vaterita a partir de una solución equimolar de Na<2>CO<3>y CaCh.

Esta invención también se refiere a materiales, dispositivos e instrumentos asociados con una composición tal como la descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición puede distribuirse o impregnarse en materiales tales como gasas, apósitos para heridas, instrumentos para la limpieza de heridas, esponjas, taponamientos, material de taponamiento nasal y globos utilizados en tratamientos quirúrgicos. Dicho globo puede ser de aplicación uterina. Esta invención también se refiere a dispositivos de administración, incluidas jeringuillas y catéteres que contienen una composición tal como la aquí descrita, y puede incluir otros dispositivos tales como bombas, aparatos de distribución, tubos o similares, no necesariamente destinados al tratamiento de un organismo vivo. Las composiciones de esta invención pueden emplearse en sistemas microfluídicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1A es un sistema que muestra micropartículas de CaCO<3>asociadas con una carga que se autopropulsan a través de soluciones acuosas cuando se combinan con un ácido orgánico. El sistema de 3 componentes reacciona y se libera CO<2>de las micropartículas cuando se colocan en agua. La Figura 1B es una imagen de micropartículas de CaCO<3>inmovilizadas (10 pm de diámetro) asociadas con una molécula de carga marcada con fluorescencia, FITC-dextrano. La barra de escala es de 30 pm. La Figura 1C es un sistema que muestra cómo se midió la autopropulsión de las partículas para los resultados mostrados en las Figuras 1D y 1E. Las Figuras 1D y 1E son imágenes de partículas marcadas con fluorescencia que aparecen en la superficie de una solución tamponada (D) y de sangre (E), tras la propulsión desde 16 mm por debajo de la superficie. La barra de escala es de 2 mm.

La Figura 2A es una serie de imágenes que muestran partículas de CaCO<3>propulsándose flujo arriba a través de una solución ácida que fluye en el transcurso del tiempo. La partícula marcada con un círculo tenía componentes de velocidad vertical y horizontal de 66 mm/s y 3 mm/s, respectivamente. La Figura 2B es un gráfico que muestra que la velocidad de la partícula aumenta con el volumen de burbujas al que está adherida la partícula. La Figura 2C es una imagen que muestra partículas transportadas hacia arriba por burbujas de CO<2>. Las barras de escala son de 2 mm. La Figura 2D es un sistema que muestra cómo se midió la propulsión a través de soluciones fluidas. Se aplicaron partículas en el fondo de un tubo y se cuantificó el movimiento de las partículas flujo arriba a través del agua que fluía. La Figura 2E es un gráfico que muestra que la cantidad de partículas que se propulsaron flujo arriba disminuyó a velocidades de flujo más altas. El recuadro muestra la fracción de partículas que se acumularon para cada velocidad de flujo a 20 s.

La Figura 3A es un gráfico que muestra las cantidades de trombina adsorbida dentro y fuera de las partículas de CaCO<3>. La Figura 3B es un sistema que muestra cómo se midió el tiempo de coagulación del plasma no fluido. La trombina en una solución tamponada o asociada con partículas de CaCO<3>se colocó en la proximidad de la parte superior de un tubo de plasma sanguíneo no fluente. Las partículas de CaCO<3>se mezclaron con ácido tranexámico protonado o no protonado, obteniéndose mezclas propulsoras o no propulsoras, respectivamente. La Figura 3C es un gráfico que muestra los tiempos de iniciación del coágulo en la parte superior e inferior de los tubos. La Figura 3D es un sistema de coagulación y oclusión del plasma sanguíneo que fluye, que muestra la velocidad de flujo del plasma que se mide tras la aplicación de partículas en el fondo de un tubo. La Figura 3E es un gráfico que muestra la coagulación del plasma a diversas velocidades de flujo por partículas cargadas de trombina.Pmenor que *0,05, **0,01, ***0,001. n = 3. Las barras de error indican la S.E.M.

La Figura 4A es una vista en perspectiva de un ratón utilizado en un modelo de hemorragia grave. Se amputó una parte terminal de 8 mm de la cola del ratón. La Figura 4B es un gráfico que muestra los tiempos totales de hemorragia tras la aplicación de partículas asociadas con trombina propulsadas y no propulsadas en el lugar de la amputación. Se observó a los ratones durante 10 minutos tras la amputación. *p menor que 0,05.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los volúmenes de sangre perdidos por los ratones tras la punción desde sus hígados. *P menor que 0,05, **P menor que 0,01. Las barras de error indican S.E.M.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las composiciones de esta invención comprenden una sal de carbonato y TXA-NH<3+>y, por lo tanto, son sensibles a la humedad. La composición debe prepararse de forma que haya una mínima oportunidad de reacción de la sal de carbonato y del ácido hasta que la composición entre en contacto con un medio acuoso. Las sales pueden ser sales fisiológicamente aceptables. Algunos ejemplos de sales de carbonato fisiológicamente aceptables son el CaCO<3>y el Na<2>CO<3>. Sin embargo, en las aplicaciones en las que se potencia la cicatrización de heridas y, en particular, en los casos en los que la composición se emplea para potenciar la coagulación de la sangre, la sal preferida es CaCO<3>. Las partículas pueden prepararse por cualquier medio, pero en algunos casos, puede ser ventajoso preparar partículas porosas para aumentar la superficie de la partícula y/o para proporcionar la encapsulación, al menos parcial, de una molécula o partícula de carga. Los métodos para obtener partículas porosas de sales de carbonato son conocidos en esta técnica, tal como en la publicación con anterioridad descrita de Volodkin et al.<9>

El componente ácido de una composición aquí mostrada puede ser cualquier ácido adecuado para la preparación de la composición en forma sólida y/o para el uso previsto de la composición. Por ejemplo, el ácido puede ser fisiológicamente aceptable para su uso en sistemas biológicos. Entre los ejemplos de ácidos adecuados se incluyen los ácidos orgánicos. Algunos ejemplos de ácidos orgánicos fisiológicamente aceptables son el ácido cítrico y el ácido málico. Sin embargo, en aplicaciones para favorecer la coagulación sanguínea, es deseable que el ácido orgánico no sea capaz de quelar cationes de calcio a pH fisiológico (es decir, de pH 6,5 a 8,0). Son adecuados los aminoácidos y los ácidos orgánicos derivados de aminoácidos que no son quelantes a pH fisiológico. Entre ellos, se incluyen los aminoácidos que se protonan a pH fisiológico (por ejemplo, la glicina) o que pueden protonarse en dicho pH (por ejemplo, el ácido tranexámico). Esta última sustancia está aprobada para su uso clínico como agente antilítico y mejorará la coagulación de la sangre. Otro ejemplo de ácido orgánico derivado de un aminoácido que mejora la coagulación sanguínea es el ácido aminocaproico. Sin embargo, cuando la indicación requiera la lisis de coágulos sanguíneos, deben evitarse los agentes antifibrinolíticos tales como el ácido tranexámico o el ácido aminocaproico o los procoagulantes.

Las partículas o moléculas de carga que pueden asociarse con las partículas de sal carbonatada para su uso en esta invención pueden ser cualquier sustancia que pueda asociarse de este modo. La carga puede estar presente para actuar como etiqueta o la carga puede tener otra función, tal como una función biológica. Se entiende que el término «asociado» incluye cualquier forma de unión, incluida la interacción electrostática. Los polielectrolitos tales como las partículas de CaCO<3>son especialmente adecuados para adsorber material biológico tales como proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y otras sustancias cargadas tales como dextranos. El término «asociado» también pretende incluir limitaciones físicas tales como encapsular o encerrar de otro modo, una sustancia asociada.

Las partículas de carga que se asocien a las partículas de sal carbonatada para su uso en esta invención deben tener un tamaño aproximadamente similar al de la partícula de sal carbonatada o menor. De este modo, en formas de realización particulares, es deseable que una partícula de carga tenga un tamaño de magnitud de 10 |jm o 5 |jm o inferior.

Los agentes biológicamente activos que pueden asociarse como moléculas de carga con las partículas de sal de carbonato en esta invención pueden ser cualquier macromolécula activa (tal como una proteína) o una molécula pequeña que pueda asociarse de este modo y pueden incluir, sin limitación: factores de crecimiento; antimicrobianos; antibióticos; estípticos; anestésicos; fármacos antiproliferativos tales como el metotrexato y otros fármacos anticancerosos; procoagulantes tales como la trombina; agentes antifibrinolíticos; agentes fibrinolíticos tales como el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA); antifibróticos tales como el ácido acetilsalicílico (AAS); y agentes antiinflamatorios tales como la dexametasona.

Las partículas de sal de carbonato empleadas en esta invención pueden tener un tamaño que no sea deseable para la administración sistémica ni se recomendaría la administración sistémica si una composición concreta de esta invención comprende un procoagulante. No obstante, las composiciones de esta invención pueden ser adecuadas para su aplicación directa en una zona a tratar. Dicha aplicación incluye la administración local, la administración tópica, la colocación de una composición de esta invención en una zona durante un tratamiento quirúrgico, y similares. La administración local puede comprender el suministro de una composición de esta invención mediante un dispositivo tal como un catéter en una zona objetivo concreta. La administración tópica puede comprender la colocación de una composición de esta invención directamente sobre una herida o zona de hemorragia. Las composiciones que comprenden no-partículas pueden ser útiles para la administración sistémica.

Las composiciones de esta invención pueden ser para uso en la propulsión de una carga a través de un fluido acuoso que está en movimiento en prácticamente cualquier sistema, incluidos los sistemas biológicos. Las composiciones de esta invención pueden formularse para uso terapéutico utilizando técnicas y materiales conocidos, tal como se describe en textos tales como los de Remington:La ciencia y la práctica de la farmacia(última edición). Una composición de la presente invención puede formularse en composiciones terapéuticas con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados. Las preparaciones pueden ser formas sólidas o no acuosas, semisólidas y líquidas, tales como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, grageas, geles, cremas, lechadas, pomadas y suspensiones.

Las composiciones de esta invención pueden estar presentes en microportadores conocidos en esta técnica, incluidas microestructuras físicas que se han empleado con anterioridad tales como partículas autopropulsoras. Entre ellas, se encuentran las estructuras tubulares, incluidas las de extremos abiertos, así como las de forma cónica con extremos abiertos de diferentes diámetros. Dichos microportadores también pueden tener forma de perla, microcápsula, etc. Pueden estar compuestos de materiales tales como vidrio, metal y/o polímeros y pueden ser magnéticos y/o estar etiquetados. Las microesferas de polímeros degradables son conocidas por su uso con proteínas terapéuticas. Las microesferas pueden prepararse a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(ortoésteres), polímeros de etilvinilacetato no biodegradables, en los que las proteínas quedan atrapadas en el polímero (por ejemplo, véase: Ranade y Hollinger, «Sistemas de administración de fármacos» (CRC Press 1996).

Las composiciones de esta invención pueden asociarse con otro material que tenga un efecto biológico deseable, incluyendo materiales que afecten a la coagulación. Por ejemplo, las composiciones de esta invención pueden contener o estar asociadas con composiciones a base de sílice o caolín tal como las empleadas actualmente para el control de hemorragias.

Las composiciones de esta invención pueden distribuirse sobre o dentro de diversos materiales que se emplean con fines terapéuticos, incluidas gasas, empaquetaduras, globos, etc. Pueden utilizarse diversos medios para adherir o impregnar una composición de esta invención en dichos materiales. En formas de realización particulares, dicho material presente en forma de láminas o capas puede contener por separado la sal de carbonato y los componentes ácidos de una composición de esta invención, para ayudar a la localización de los componentes y minimizar la reacción antes de la aplicación a una zona en donde el material será humedecido por un fluido corporal.

Las composiciones de esta invención y los materiales que comprenden dichas composiciones son típicamente secos, pero también pueden estar presentes en un gel no acuoso o en un líquido tal como un aceite. La preparación de soportes no acuosos con fines terapéuticos que emplean polímeros hidrófilos es conocida en esta técnica. Por ejemplo, se conocen geles no acuosos para la administración tópica de fármacos sensibles a la humedad14.

En el presente documento se dan a conocer kits que comprenden la sal de carbonato y los componentes ácidos de una composición tal como la definida con anterioridad, cuyos componentes están presentes en recipientes o envases separados. Dicho kit puede incluir instrucciones de uso de los componentes para la preparación y el uso de una composición de esta invención.

Los dispositivos de administración pueden comprender una composición de esta invención. Dichos dispositivos pueden ser para uso en la administración terapéutica de una composición de esta invención y pueden incluir aparatos que contengan catéteres adecuados para la administración de un agente biológico tal como el tPA localmente a una zona objetivo.

Las formas de realización, a modo de ejemplo de la presente invención, incluidas las adecuadas para el tratamiento de hemorragias, se describen en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Para preparar partículas autopropulsoras que fueran particularmente aplicables para el tratamiento de hemorragias, elegimos materiales ya aprobados para uso clínico y que pudieran formularse en un polvo que solamente requiriera agua para producir gas. El carbonato cálcico (CaCO<3>) es una sustancia de uso común en comprimidos antiácidos y en formulaciones de fármacos y produce con rapidez burbujas de gas de CO<2>en soluciones ácidas. Con anterioridad se habían preparado micropartículas de CaCO<3>que son porosas y pueden adsorber proteínas.<9>

Las micropartículas porosas utilizadas en este ejemplo pueden prepararse por precipitación de CaCO<3>al añadir Na<2>CO<3>a una solución que contenga CaCh, según el procedimiento descrito por Volodkin et al.<9>Por ejemplo, puede añadirse 0,33 M de Na<2>CO<3>helado a un volumen igual de 0,33 M de CaCh helado con mezclado rápido. Las partículas pueden marcarse con fluorescencia, por ejemplo, precipitando el CaCO<3>en presencia de 0,1 mg/mL de FITC-dextrano (4 KDa mw) o con micro o nanopartículas de poliestireno fluorescentes (tales como las microesferas verde-fluorescentes disponibles en Polysciences, Inc. o las nanopartículas de poliestireno modificadas con carboxilato rojo oscuro fluorescentes disponibles en Life Technologies).

Las partículas de CaCO<3>precipitado pueden purificarse por centrifugación, lavarse con agua desionizada y secarse (por ejemplo, a 60°C). Dichas partículas tendrán por lo general una geometría esférica y podrán tener diámetros que oscilen entre aproximadamente 2 a aproximadamente 10 pm (Figura 1B). Descubrimos que cuando dichas micropartículas de CaCO<3>se mezclaban con un ácido orgánico sólido, se propulsaban con rapidez tanto a través de soluciones acuosas tamponadas como de sangre entera (Figura 1A).

Para convertir el ácido tranexámico (TXA) en su forma doblemente protonada (TXA-NH<3+>), se añadió HCl 6 M a TXA 0,5 M cargado neutralmente (TXA-NH<2>) hasta un de pH 4,3. La solución acidificada se liofilizó obteniendo TXA-NH<3+>sólido.

Con el fin de evaluar la capacidad de propulsión, se mezclaron micropartículas de CaCO<3>en una proporción molar aproximada de 1:1 con TXA-NH<3+>y se inyectaron directamente en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en sangre entera, a 16 mm por debajo de la superficie mediante una aguja (Figura 1C). Las partículas reaccionaron enérgicamente, elevándose y extendiéndose en la superficie en cuestión de segundos (Figura 1D). Tras la reacción, el pH de la solución era neutro, ya que el ácido se neutralizó cuando el CO<32'>procedió a protonarse y a reaccionar.

Cuando las micropartículas de CaCO<3>se mezclaron con ácido tranexámico no protonado (TXA-NH<2>), en lugar de TXA-NH<3+>, las partículas no reaccionaron ni se propulsaron. Recientemente, se había sugerido que la propulsión de las partículas a través de la sangre total sería inalcanzable mediante micromotores catalíticos.<2>Sin embargo, los resultados aquí obtenidos demuestran que la generación de burbujas gaseosas puede lograr la propulsión a través de la sangre.

Para ilustrar la gama de aplicaciones en las que las partículas de CaCO<3>pueden ser de utilidad, se cuantificó la velocidad de las partículas tanto en soluciones estancadas como en flujo. Para simplificar el análisis inicial, el ácido orgánico (TXA-NH<2>) se disolvió en primer lugar en agua. Se inyectaron micropartículas de CaCO<3>en el fondo del recipiente y se obtuvieron imágenes de las trayectorias de las partículas con una resolución de 35 ms (Figura 2A). Las micropartículas reaccionaron normalmente como agregados, con un diámetro de 0,4 ± 0,16 mm, que se rompieron en partículas más pequeñas a medida que reaccionaban y se propulsaban. Las partículas presentaban velocidades ascendentes de 71 ± 23 mm/s y velocidades laterales de 3,6 ± 3,5 mm/s. Estas velocidades se encuentran entre las más rápidas informadas para cualquier partícula autopropulsada.<14>La velocidad de las partículas aumentó en función del volumen de la burbuja (Figura 2B). También utilizamos este método para demostrar la propulsión ascendente de dichas partículas desde una gasa impregnada con las micropartículas de CaCO<3>y TXA-NH<3+>colocada en el fondo de un recipiente tubular invertido que contenía agua.

La rápida propulsión de las partículas en dirección vertical se atribuyó a las burbujas de CO<2>que transportaban las partículas de CaCO<3>hacia arriba mientras reaccionaban (Figura 2C). Cuando las partículas se agruparon formando agregados aún mayores y más pesados, tendieron a hundirse y a propulsarse con velocidades horizontales similares de ~ 3 mm/s. Se observó que las partículas grandes de carbonato, tales como las de Na<2>CO<3>de aproximadamente 1 mm de diámetro, se propulsaban horizontalmente en 0,4 mm de ácido málico en agua.

Para ilustrar la propulsión flujo arriba a través de una solución que fluye, se mezclaron CaCO<3>y TXA-NH<3+>, y se añadieron a una solución que fluía a velocidades comprendidas entre 0,06 y 5,9 mm/s a través de un capilar de vidrio (Figura 2D). La solución acuosa de agua contenía un 0,1% de un tensioactivo, para imitar los tensioactivos del plasma, y tenía un pH neutro. Las partículas se aplicaron en el fondo del tubo y se impulsaron hacia arriba. Se midió la zona del tubo que se llenó de partículas y burbujas (Figura 2E). Las partículas se desplazaron a través del capilar incluso contra velocidades de flujo de hasta 3,0 mm/s. La cantidad de partículas que entraron en la solución que fluía disminuyó a velocidades de flujo más altas. Las imágenes de fluorescencia mostraron que las partículas de CaCO<3>marcadas con fluorescencia se desplazaron con las burbujas de CO<2>y alcanzaron la parte superior de la solución que fluía. Utilizando este método, hemos observado partículas que se desplazaban hasta aproximadamente 1 metro flujo arriba en el tubo.

La velocidad de flujo de la sangre varía mucho según el tamaño de los vasos sanguíneos y de los tipos de heridas. En los capilares, la velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mm/s, mientras que, en las arterias, con diámetros de varios milímetros, tales como las arterias coronarias, la velocidad oscila entre 10 y 100 mm/s.<10>Las partículas de CaCO<3>descritas con anterioridad eran capaces de alcanzar una velocidad de 3 mm/s. Aunque dicha velocidad sería insuficiente para trasladarse en contra del flujo sanguíneo dentro de una arteria, dichas partículas son capaces de propulsarse a través del flujo sanguíneo en heridas y lechos capilares.

En entornos clínicos avanzados, a veces pueden utilizarse catéteres intravasculares para administrar agentes a la vasculatura que alimenta los vasos dañados, y este método se utiliza para administrar agentes embólicos con el fin de detener el flujo sanguíneo. Sin embargo, el tratamiento de hemorragias graves procedentes de vasos a los que no se puede llegar con catéteres, o cuando es necesario un tratamiento inmediato, requiere métodos más tradicionales, tales como la compresión tópica. Comprimir o empaquetar materiales en la zona de la hemorragia es el tratamiento estándar.<11>Se han desarrollado muchas tecnologías y materiales para este fin, tales como espumas de gelatina, celulosa modificada y otros apósitos funcionalizados, y polvos compuestos de zeolitas. La trombina también puede aplicarse tópicamente en solución. Sin embargo, ninguno de estos métodos es muy eficaz durante una hemorragia grave o cuando la pérdida de sangre externa se origina en el interior de una cavidad del cuerpo.

Para crear partículas que afecten a la coagulación de la sangre, se adsorbió trombina (una proteasa de serina que activa el sistema de coagulación y escinde directamente el fibrinógeno) en partículas porosas de CaCO<3>preparadas tal como se ha descrito con anterioridad. Las micropartículas de carbonato se suspendieron al 10% p/v en 447 pM de trombina bovina (Thr) en 10mM de HEPES y se incubaron a 4° durante 1 hora. Las partículas se purificaron por centrifugación (5 minutos a 10.000 g) para eliminar el exceso de líquido, y se secaron por liofilización. También se han fabricado partículas porosas de CaCO<3>asociadas con el agente fibrolítico, uPA.

Para determinar la concentración de Thr activo inmovilizado en las partículas, se utiliza un sustrato de trombina fluorescente (Boc-Val-Pro-Arg-MCA, Peptide Institute Inc.), cuya escisión por la trombina da lugar a un producto azul fluorescente detectable por espectrofotometría. Para determinar el contenido total de trombina, las partículas de trombina-carbonato cálcico (Thr-CaCO<3>) se solubilizaron en 100mM de HCl antes de añadir el sustrato fluorescente. Para determinar la trombina adsorbida en el interior de los poros de las micropartículas, éstas se lavaron con solución salina tamponada con HEPES (HBS) antes de la solubilización. Para determinar la trombina en el exterior de las partículas, éstas no se solubilizaron antes de añadir el sustrato fluorescente. Las partículas sin lavar contenían 0,9 pmol de trombina activa por gramo de CaCO<3>, y tras lavar las partículas con una solución acuosa, las partículas retuvieron 0,2 pmol/g (Figura 3A). Se observó que aproximadamente 0,6 pmol de trombina activa por gramo de CaCO<3>se adsorbía a las partículas. Estas partículas coagularon de manera rápida la sangre, tanto solas como cuando se combinaron con TXA-NH<3+>(Figura 3B, C).

Se mezcló Thr-CaCO<3>en una proporción de masa 1:1 con TXA-NH<3+>para obtener una mezcla de partículas propulsoras. Una mezcla no propulsora consistió en una proporción de 1:1 de Thr-CaCO<3>con TXA-NH<2>liofilizado. Se midió la capacidad de las dos mezclas para iniciar la coagulación en plasma sanguíneo pobre en plaquetas y se comparó con la adición de una cantidad similar de trombina (aproximadamente 1 pmol) en tampón HEPES y un control que no recibió tratamiento.

Tal como se ha descrito con anterioridad, las partículas de CaCO<3>se propulsan hacia arriba a mayor velocidad que en dirección lateral. La capacidad de las partículas para coagular tanto en el lugar de aplicación como por debajo del mismo se evaluó inyectando partículas en la proximidad de la parte superior de una columna de plasma de 25 mm de altura. El inicio de la coagulación se midió tanto en la parte superior como en la inferior de la columna mediante el seguimiento de la formación de fibrina. El plasma sanguíneo se recubrió con perlas verde-fluorescentes para controlar el movimiento y la formación de la malla sólida de fibrina y la iniciación de la coagulación. La coagulación en la parte superior se midió de manera visual y, cuando el plasma se volvió opaco o pareció gelificado, se confirmó la coagulación mediante una manipulación suave con una micropipeta.

Tanto las partículas propulsoras como las no propulsoras coagularon de manera inmediata el plasma en la parte superior de la columna, lo que se detectó en 2 minutos. La misma respuesta se produjo cuando se añadió una solución que contenía una cantidad equivalente de trombina disuelta. Sin embargo, hubo diferencias mucho mayores en los tiempos de coagulación en la parte inferior de las columnas de plasma entre estas muestras.

En particular, la solución de trombina no causó ninguna aceleración de la iniciación del coágulo en la parte inferior en comparación con el control. La coagulación tardó unos 30 minutos, ya que el coágulo necesitaba propagarse hacia abajo a través de la columna por difusión. La coagulación en el fondo fue más rápida utilizando partículas no propulsadas, produciéndose en 3,7 minutos en comparación con los 10 minutos de las partículas propulsadas. Sin embargo, esta mayor velocidad de coagulación descendente se debió a que las partículas de CaCO<3>cargadas de trombina sin reaccionar se hundieron hasta el fondo. La mayoría de las partículas propulsadas reaccionaron y produjeron gas en la parte superior, por lo que solamente una fracción de las partículas se hundió hasta el fondo, lo que produjo un tiempo de coagulación ligeramente más lento en comparación con las partículas no propulsadas. Aunque las partículas propulsoras superaron a la solución de trombina en este ensayo, una ventaja particular de las partículas propulsoras provendría de su capacidad para propulsarse a través de soluciones fluidas.

Para demostrar que las partículas propulsoras de trombina coagulan el plasma que fluye, se aplicaron partículas al fondo del plasma que fluía a través de un tubo capilar de vidrio (Figura 3D, E). Se utilizó un sistema microfluídico para controlar el flujo de plasma y supervisar el flujo para determinar cuándo la coagulación ocluía el flujo en el tubo capilar. A velocidades de flujo comprendidas entre 0,006 y 3,4 mm/s, los tiempos de oclusión de fondo en el sistema fueron de aproximadamente 30 minutos. Cuando no se aplicó ningún tratamiento, o cuando se aplicaron partículas propulsadas que no contenían trombina, la oclusión también se produjo aproximadamente a los 30 minutos. La trombina sola ocluyó, a velocidades muy lentas de hasta 0,06 mm/s, y no mostró diferencias con los controles a 0,6 mm/s. La trombina no propulsada fue capaz de formar un coágulo a la salida del tubo, pero solamente a flujos bajos este coágulo fue capaz de persistir y propagarse por el tubo. A flujos altos, el coágulo se expulsó con facilidad y el flujo de plasma se reanudó. La trombina propulsada inició la coagulación y ocluyó el flujo a velocidades muy superiores a las de la trombina no propulsada. Las partículas se propulsaron hacia arriba, en contra del flujo, y se acumularon en lo alto del tubo. Se observó que la coagulación se iniciaba en las zonas con mayor concentración de partículas. A una velocidad de flujo de 3 mm/s, el tiempo de oclusión seguía siendo considerablemente más rápido que el de la mezcla no propulsada o los controles. Lo que antecede demuestra que las partículas autopropulsadas cargadas con trombina serían eficaces para coagular el plasma que fluye iniciando la coagulación flujo arriba del lugar de aplicación.

También se probó la capacidad de las partículas autopropulsadas para detener la hemorragia en un modelo de hemorragia en ratones. Se amputaron colas de ratón a 8 mm de la punta para conseguir una hemorragia grave (Figura 4A). En el lugar de la amputación, se aplicaron 20 mg de partículas cargadas de trombina propulsoras o no propulsoras durante 30 segundos. Los ratones de control no recibieron ningún tratamiento tras la amputación. Tras la aplicación, las colas se sumergieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) caliente que contenía citrato, y se monitorizó la hemorragia durante 10 minutos. El experimento concluyó tras 10 minutos para garantizar que la muerte del ratón no fuera un punto final. La trombina propulsada redujo de manera significativa el tiempo de hemorragia en comparación con los otros dos grupos (Figura 4B). En 7 de los 9 ratones (78%) que recibieron esa mezcla propulsada, la hemorragia se detuvo durante la observación. Por el contrario, sin propulsión, solamente 3 de 9 ratones (33%) y 2 de 8 ratones (25%) detuvieron la hemorragia en los grupos que recibieron trombina no propulsada y ningún tratamiento, respectivamente. También se emplearon partículas marcadas con fluorescencia para determinar la distancia recorrida dentro de la cola del ratón. Las partículas marcadas con FITC-dextrano se localizaron hasta 10 mm flujo arriba en la cola, mientras que las partículas de CaCO<3>transportaron partículas de carga marcadas (perlas de poliestireno fluorescentes de 0,2 |jm de diámetro) hasta 4 mm flujo arriba en la cola. Además, no se produjo ningún aumento de la inflamación en los ratones tratados con las partículas autopropulsadas 3 días después del procedimiento. Estos resultados demuestran el uso de esta incorporación como procoagulante de aplicación local o tópicain vivo.

También empleamos un modelo de ratón para cuantificar la pérdida de sangre de una hemorragia resultante de la punción hepática. La pérdida de sangre tras la punción hepática se cuantificó recogiendo sangre en papeles de filtro previamente pesados de aproximadamente 2 cm por 2 cm, dispuestos para revestir el lugar de la punción, que se compararon con papeles de control previamente empapados con volúmenes conocidos de sangre fresca. Comprobamos que la pérdida total de sangre disminuía de manera significativa con la aplicación de partículas de Thr-CaCO<3>con TXA-NH<3+>, en comparación con la ausencia de tratamiento o la aplicación de las partículas sin trombina asociada. Además, se produjo una reducción significativa de la pérdida de sangre cuando se emplearon las partículas de Thr-CaCO<3>, en comparación con la aplicación de una solución de trombina recombinante (Figura 5). Además, comprobamos que la administración intravenosa de las micropartículas de CaCO<3>o de una mezcla reaccionada de las micropartículas con TXA-NH<3+>a ratones no producía signos significativos de toxicidad hepática o embolia pulmonar en los ratones tres días después de la inyección, en comparación con la inyección de solución salina. Lo que antecede se determinó midiendo los niveles séricos de alanina aminotransferasa y asparato aminotransferasa, así como el examen histológico de secciones pulmonares teñidas con H & E y tricrómico de Masson.

REFERENCIAS

1. Paxton, W. F., Sundararajan, S., Mallouk, T. E. & Sen, A. Chemical locomotion. Angewandte Chemie-International Edition 45, 5420-5429 (2006).

2. Zhao, G., Viehrig, M. & Pumera, M. Challenges of the movement of catalytic micromotors in blood. Lab on a Chip 13, 1930-1936 (2013).

3. Wu, Z. et al. Self-Propelled Polymer-Based Multilayer Nanorockets for Transportation and Drug Release. Angewandte Chemie-International Edition 52, 7000-7003 (2013).

4. Patra, D. et al. Intelligent, self-powered, drug delivery systems. Nanoscale 5, 1273-1283 (2013).

5. Kuralay, F. et al. Self-Propelled Carbohydrate-Sensitive Microtransporters with Built-In Boronic Acid Recognition for Isolating Sugars and Cells. Journal of the American Chemical Society 134, 15217-15220 (2012).

6. Ismagilov, R. F., Schwartz, A., Bowden, N.&Whitesides, G. M.Autonomous movement and self-assembly. Angewandte Chemie-International Edition 41, 652-654 (2002).

7. Garcia-Gradilla, V. et al. Functionalized ultrasound-propelled magnetically guided nanomotors: toward practical biomedical applications. ACS nano 7, 9232-9240 (2013).

8. Dreyfus, R. et al. Microscopic artificial swimmers. Nature 437, 862-865 (2005).

9. Volodkin, D. V., Larionova, N. I. & Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules 5, 1962-1972 (2004).

10. Vennemann, P., Lindken, R. & Westerweel, J. In vivo whole-field blood velocity measurement techniques. Experiments in Fluids 42, 495-511 (2007).

11. Kozen, B. G., Kircher, S. J., Henao, J., Godinez, F. S. & Johnson, A. S. An alternative hemostatic dressing: Comparison of CELOX, HemCon, and QuikClot. Academic Emergency Medicine 15, 74-8 (2008).

12. Gao, W., et al., Hydrogen-Bubble-Propelled Zinc-Based Microrockets in Strongly Acidic Media. J. Am. Chem. Soc. 134:897-900 (2012).

13. Kawai, K., et al., Calcium-Based Nanoparticles Accelerate Skin Wound Healing. PLoS ONE 6(11):e27106 (2011).

14. Chow, K. T., et al., Formulation of Hydrophilic Non-Aqueous Gel: Drug Stability in Different Solvents and Rheological Behavior of Gel Matrices, Pharmaceutical Research 25(1):207-217 (2008).

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una composición no acuosa que comprende:

(i) partículas formadas por una sal de carbonato; y

(ii) un ácido en forma sólida,

caracterizado porque el ácido es TXA-NH<3+>(ácido tranexámico protonado).

2. La composición según la reivindicación 1, en donde las partículas de (i) están unidas a, son absorbidas por o encapsulan una molécula de carga o partícula de carga, de manera opcional en donde la molécula de carga o partícula de carga está unida por interacción electrostática a las partículas de (i).

3. La composición según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2, en donde las partículas de (i) son porosas.

4. La composición según cualquier reivindicación anterior, en donde las partículas de (i) tienen un diámetro medio de 100 pm o menor, o inferior a aproximadamente 50 pm.

5. La composición según cualquier reivindicación precedente, en donde la sal de carbonato es CaCO<3>.

6. La composición según la reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, cuando dependa según la reivindicación 2, en donde la molécula de carga es un agente biológicamente activo.

7. La composición según la reivindicación 6, en donde el agente biológicamente activo afecta a la coagulación.

8. La composición según la reivindicación 7, en donde el agente biológicamente activo es la trombina.

9. La composición según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición está en forma de polvo o de gránulos o está presente en un, o sobre un microportador, en o sobre un portador no acuoso, sobre o dentro del material de una gasa, un apósito para heridas, un instrumento para limpiar heridas, un globo para aplicación quirúrgica, una esponja, una gasa, un taponamiento o un material de taponamiento nasal o sobre o dentro de un dispositivo de administración.

10. Un método de transporte de una molécula de carga o partícula de carga a través de un fluido acuoso, comprendiendo el método proporcionar una composición tal como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde (i) está asociada con dicha molécula de carga o partícula de carga; en donde el método comprende, además, introducir la composición en dicho fluido; y en donde el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

11. El método según la reivindicación 10, en donde el fluido es un fluido biológico.

12. El método según la reivindicación 10 o según la reivindicación 11, en donde el fluido está en movimiento y el transporte se realiza en una dirección que tiene una componente opuesta a la dirección de movimiento del fluido.

13. La composición definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en medicina.

14. La composición tal como se define en la reivindicación 7 o en la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento de hemorragias.

15. Una composición no acuosa que comprende partículas porosas de CaCO<3>y TXA-NH<3+>.

16. Un apósito para heridas que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

17. El apósito para heridas según la reivindicación 16, en donde el apósito para heridas es una gasa.