ES2986628T3 - Métodos basados en CCR5 para predecir la supervivencia global y libre de progresión en sujetos con cáncer - Google Patents

Abstract

Se describen medios para predecir la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) de sujetos con cáncer, en los que las predicciones se basan en la cantidad de grupos de CCR5 en células circulantes, como células similares a macrófagos asociadas al cáncer (CAML) circulantes y células tumorales circulantes (CTC) que se encuentran en una muestra biológica, como sangre, del sujeto. La expresión de CCR5 también se puede utilizar para diagnósticos complementarios o complementarios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos basados en CCR5 para predecir la supervivencia global y libre de progresión en sujetos con cáncer

Antecedentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a la utilización de biomarcadores en sangre y otros líquidos corporales para proporcionar diagnósticos auxiliares y complementarios y para realizar predicciones sobre la supervivencia global y la supervivencia libre de progresión en sujetos que presentan cáncer, tal como tumores sólidos.

Técnica relacionada

Cuando se desprenden células tumorales de tumores sólidos primarios, penetran en la circulación sanguínea o linfática y finalmente dejan el torrente sanguíneo y entran en órganos o tejidos para formar metástasis. El 90 % de las muertes relacionadas con cáncer están causadas por el proceso metastásico. Los sitios de metástasis más habituales son los pulmones, el hígado, los huesos y el cerebro. Las células tumorales presentes en la circulación se denominan células tumorales circulantes (CTC). Muchas publicaciones de investigación y ensayos clínicos muestran que las CTC presentan utilidad clínica en: (i) proporcionar información pronóstica de supervivencia y recurrencia del cáncer mediante el recuento de las CTC en el torrente sanguíneo, y (ii) proporcionar información de tratamiento mediante el examen de los niveles de expresión de proteínas y la ocurrencia de mutaciones y traslocaciones génicas en las CTC. Sin embargo, las CTC no están asociadas consistentemente al desarrollo y/o presencia de cáncer en el sujeto, ni siquiera en pacientes de cáncer en estadio IV. Aunque se encuentran CTC con más frecuencia en el estadio IV de los cánceres de mama, próstata y colorrectal, son raras en los estadios tempranos de los mismos cánceres. Las CTC también son raras en otros cánceres.

Las células similares a macrófagos asociadas a cáncer circulante (CAML, por sus siglas en inglés) son otro tipo celular relacionado con el cáncer que se encuentra en la sangre de los sujetos que presentan cáncer. Las CAML están asociadas a todos los tumores sólidos sometidos a ensayo y a todos los estadios de cáncer. Las CAML son poliploides y de tamaño muy grande, de ~25 pm a ~300 pm. Estas células poliploides puede ser CD45(-) o CD45(+) y expresan CD11c, CD14 y CD31, lo que confirma su origen como un linaje mieloide. Con frecuencia se observan en el proceso de fagocitosis de CTC y residuos celulares [14,22]. El examen de los niveles de expresión de proteínas en las CAML también puede ayudar a los clínicos a tomar decisiones de tratamiento informadas.

Los ensayos asociados con la identificación y caracterización de biomarcadores en CTC y CAML, en sangre y otros líquidos corporales, pueden utilizarse para proporcionar importante información pronóstica y de tratamiento para un sujeto que presenta cáncer. La presente invención se refiere a proporcionar dichas herramientas a los clínicos y otros objetivos importantes.

El documento n.° WO 2016/209926 da a conocer métodos de tratamiento del cáncer utilizando inhibidores de CCR5 y detectando CCR5 en células tumorales circulantes.

El documento n.° WO 2018/213732 da a conocer métodos de tratamiento de uno o más cánceres mediante terapia combinada con un agente que inhibe la señalización de la poli[ADP-ribosa]polimerasa (PARP, por sus siglas en inglés) y un agente que regula la actividad dentro del microambiente tumoral.

Yamauchi Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2018 ;198(6) :777-787, discuten las células supresoras mieloides circulantes y tumorales en cáncer pulmonar no microcítico.

Adams D.L. et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2016;25(7):1037-1042, dan a conocer que las células similares a macrófagos asociadas a cáncer circulante diferencian las condiciones del cáncer de mama maligno y benigno.

Sumario

La presente invención se refiere a métodos para predecir la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) de un sujeto que presenta cáncer, basada en la cantidad relativa del receptor proteico CCR5 presente en células circulantes del sujeto. Aunque las células circulantes pueden ser una o más de varios tipos celulares diferentes (definidos posteriormente), como mínimo se determina la expresión de CCR5 en un tipo celular con características únicas que se encuentra en la sangre de los sujetos que presentan tumores sólidos, incluyendo carcinoma, sarcoma, neuroblastoma y melanoma. Estas células circulantes, denominadas “célula similar a macrófago asociada a cáncer circulante” (CAML), se ha mostrado que están asociadas a la presencia de tumores sólidos en un sujeto que presenta cáncer. Se han caracterizado y descrito cinco morfologías asociadas a las CAML[1421]. Se han encontrado CAML consistentemente en la sangre periférica de sujetos que presentan tumores sólidos de estadio I a estadio IV mediante microfiltración utilizando microfiltros de precisión.

Entre las aplicaciones médicas asociadas a las CAML se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la utilización de las células mismas como biomarcador para proporcionar la detección precoz de cáncer y el diagnóstico de cáncer, en particular, en la detección y diagnóstico precoces de la recaída o recurrencia de cáncer, y en la determinación de la mutación del cáncer. También se ha mostrado que las CAML, mediante los datos presentados en la presente memoria, expresan biomarcadores que presentan utilidad clínica en la realización de predicciones respecto a la progresión de la enfermedad y la supervivencia del paciente, tales como CCR5, que pueden ayudar a realizar decisiones de tratamiento informadas.

La expresión de biomarcadores por las CAML puede utilizarse como un marcador de cáncer de manera independiente, o en combinación con la expresión de biomarcador por otras células circulantes, tales como las células tumorales circulantes (CTC), subtipos de CTC que experimentan transición epitelio-mesenquimal (EMTCTC, por sus siglas en inglés), células endoteliales vasculares asociadas a cáncer circulante (CAVE, por sus siglas en inglés), así como la presencia de estos tipos celulares adicionales mismos y también ADN libre de células (ADNlc), ADN tumoral circulante (ADNtc), ADN metilado, y biomarcadores proteómicos, metabolómicos, lipidómicos y otros biomarcadores, para llevar a una comprensión más completa de la enfermedad del paciente.

Las realizaciones de la presente invención se definen en las reivindicaciones. En particular, en una primera realización, la presente invención se refiere a un método para predecir la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) de un sujeto que presenta cáncer, en donde dicho método comprende determinar el número de agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde las células circulantes comprenden células similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML), y en donde las CAML presentan las características siguientes: (a) núcleo poliploide atípico de gran tamaño, de aproximadamente 14 a 64 |jm, o múltiples núcleos en una sola célula, (b) tamaño celular de entre aproximadamente 20 y 300 jm , y (c) forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa; opcionalmente en donde las CAML presentan una o más de las características adicionales siguientes: (d) fenotipo positivo para CD14, (e) expresión de CD45, (f) expresión de EpCAM, (g) expresión de vimentina, (h) expresión de PD-L1, (i) expresión de marcador CD11C, (j) expresión de marcador CD146, (k) expresión de marcador CD202B, (l) expresión de marcador CD31 y (m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19, en donde la fuente de la muestra biológica es uno o más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina, y en donde, en el caso de que por lo menos una célula CAML en dicha muestra presente aproximadamente 10 o más agregados de CCR5: (i) se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o (ii) se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 10 o más agregados de CCR5.

En algunos aspectos de la presente realización, el método comprende determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde en el caso de que una célula en dicha muestra presente aproximadamente 15 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estará acortada, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 16 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 17 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 18 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 19 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 20 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 22 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 23 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 24 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 25 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas.

En otros aspectos de la presente realización, el método comprende determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 15 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las célula en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 15 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 16 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 16 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 17 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 17 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 18 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 18 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 19 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 19 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 20 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 20 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 22 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 22 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 23 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 23 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 24 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 24 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 25 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 25 o más grupos/agregados de CCR5.

En una segunda realización, la presente invención se refiere a un método para predecir la SG y la SLP de un sujeto que presenta cáncer, en donde dicho método comprende: (i) determinar el número de agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde la SG y la SLP del sujeto que presenta un mayor número de agregados de CCR5 se predice que sean más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta menos agregados de CCR5, (ii) determinar el número medio de agregados de CCR5 en un número seleccionado de células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde la SG y la SLP del sujeto con un mayor número medio de agregados de CCR5 se predice que sean más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta un número medio menor de agregados de CCR5, o (iii) determinar la mediana del número de agregados de CCR5 en un número seleccionado de células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde la SG y la SLP del sujeto con una mediana mayor del número de agregados de CCR5 se predice que sean más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta una mediana menor del número de agregados de CCR5, en donde las células circulantes comprenden células similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) y en donde las CAML presentan las características siguientes:

(a) núcleo poliploide atípico de gran tamaño, de entre aproximadamente 14 y 64 pm, o múltiples núcleos en una sola célula,

(b) tamaño celular de entre aproximadamente 20 y 300 pm, y

(c) forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa,

y en donde la fuente de la muestra biológica es uno o más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina.

En determinados aspectos de las realizaciones de la invención, puede identificarse adicionalmente que las CAML presentan una o más de las características adicionales siguientes:

(d) fenotipo positivo para CD14,

(e) expresión de CD45,

(f) expresión de EpCAM,

(g) expresión de vimentina,

(h) expresión de PD-L1,

(i) expresión del marcador CD11C,

(j) expresión del marcador CD146,

(k) expresión del marcador CD202b,

(l) expresión del marcador CD31, y

(m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, los agregados/grupos de CCR5 puede estar localizados en el núcleo de la célula, o estar localizados en el citoplasma de la célula, o estar localizados en la superficie de la célula, o alguna combinación de los mismos.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, el CCR5 de las células circulantes puede estar en un estado activado, o un estado inactivado, o las células pueden presentar tanto receptores activados como inactivados.

En determinados aspectos de las realizaciones de la invención, la SG o la SLP, o ambas, son superiores a un periodo de por lo menos 12 meses. En otro aspectos de las realizaciones de la invención, la SG o la SLP, o ambas, son superiores a un periodo de por lo menos 24 meses.

En determinados aspectos de las realizaciones de la invención, el tamaño de la muestra biológica es de entre 5 y 15 ml.

En cada aspecto y realización de la invención, las células circulantes comprenden, además, una o más de entre CTC, PDCTC, CTC apoptóticas, EMTCTC y CAVE. De esta manera, los métodos de la invención pueden llevarse a cabo mediante el ensayo de la expresión de CCR5 en las CAML solas, o los métodos de la invención pueden llevarse a cabo mediante el ensayo de la expresión de CCR5 en las CAML y una o más de CTC, PDCTC, CTC apoptóticas, EMTCTC y CAVE.

En determinados aspectos de las realizaciones de la invención, en el caso de que la muestra biológica sea de sangre, la sangre puede ser sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior, sangre de la vena femoral, sangre de la vena portal o sangre de la vena yugular. La muestra puede ser una muestra fresca o una muestra crioconservada apropiadamente preparada que se descongela.

En cada aspecto y realización de la invención, el cáncer es uno en que las células del mismo expresan CCR5. Los cánceres expresantes de CCR5 pueden ser un tumor sólido, cáncer de estadio I, cáncer de estadio II, cáncer de estadio III, cáncer de estadio IV, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, melanoma, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer pulmonar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer esofágico y otro cáncer de tumor sólido.

En determinados aspectos de las realizaciones de la invención, las células circulantes se aíslan a partir de las muestras biológicas para las etapas de determinación utilizando uno o más medios seleccionados de metodología de exclusión por tamaño, inmunocaptura, lisis de glóbulos rojos, reducción del número de glóbulos blancos, FICOLL, electroforesis, dielectroforesis, citometría de flujo, levitación magnética y diversos chips de microfluidos, o una combinación de los mismos.

En un aspecto de la invención, las células circulantes se aíslan de las muestras biológicas utilizando metodología de exclusión por tamaño que comprende la utilización de un microfiltro. El microfiltro puede presentar un tamaño de poro comprendido entre aproximadamente 5 micras y aproximadamente 20 micras. Los poros del microfiltro pueden presentar cualquier forma, en donde entre las formas aceptables se incluyen redonda, forma de pista de carreras, ovalada, ranurada, cuadrada, rectangular y/o otras formas. El microfiltro puede presentar una geometría de poros de precisión, una distribución uniforme de los poros, más de una geometría de los poros, y/o distribución no uniforme de los poros. El microfiltro puede presentar una sola capa o ser multicapa con diferentes formas en diferentes capas.

En otro aspecto de la invención, las células circulantes se aíslan a partir de las muestras biológicas utilizando un chip de microfluidos mediante separación a base del tamaño físico, ranuras, canales, separación hidrodinámica basada en el tamaño, agrupamiento, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de las células grandes, eliminación de las células pequeñas basándose en el tamaño, o una combinación de los mismos.

En un aspecto adicional de la invención, las células circulantes se aíslan a partir de las muestras biológicas utilizando un ensayo de microfiltración de baja presión.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Imágenes de una CAML teñida para CCR5.

Figura 2. Imágenes de una CAML teñida para CCR5.

Figuras 3A-3C. Imágenes de CAML teñidas para CCR5. Se observan niveles medios/altos de expresión de CCR5 en el citoplasma; el receptor está inactivado y no se ha traslocado al núcleo.

Figuras 4A-4C. Imágenes de CAML teñidas para CCR5. Se observan niveles bajos/negativos de expresión de CCR5 en el citoplasma; el receptor está inactivado y no se ha traslocado al núcleo. Figuras 5A-5C. Imágenes de CAML teñidas para CCR5. Se observan niveles altos de expresión de CCR5 en estas CAML. Los grupos/agregados de CCR5 en las figuras 5B-5C se encuentran mayoritariamente en el núcleo; el receptor está inactivado y se ha traslocado al núcleo. Figuras 6A-6B. Imágenes de CAML teñidas para CCR5. Se observan niveles medios/bajos de expresión de CCR5 en el núcleo; los grupos/agregados de CCR5 en la figura 6B están mayoritariamente inactivados y se han traslocado al núcleo.

Figura 7. Imágenes de EMTCTC teñidas para CCR5 que muestran la expresión de CCR5 agregada en una ubicación sobre la superficie celular.

Figura 8. Imágenes de EMTCTC teñidas para CCR5 que no muestran expresión de CCR5.

Figuras 9A-9C. Las imágenes en estos paneles muestran la variabilidad de la tinción de CCR5 que se observa en algunas células. Las CTC están teñidas para CCR5 y muestran niveles moderados de expresión de CCR5 en las figuras 9A y 9B, y niveles muy altos de expresión de CCR5 en la fig. 9C.

Figuras 10A-10B. Imágenes de CTC teñidas para CCR5 que muestran una baja expresión de CCR5.

Figura 11. Gráficos de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia global y la supervivencia libre de progresión basadas en el número de grupos/agregados de CCR5 en las CAML.

Figura 12. Se muestra la intensidad de los marcadores de diferenciación celular utilizados para identificar y clasificar las CAML en subtipos.

Descripción detallada

Las biopsias líquidas proporcionan un seguimiento secuencial en tiempo real de células circulantes importantes para el diagnóstico aisladas de un sujeto que presenta cáncer. Se encuentran células tales como las células tumorales circulantes (CTC) en la sangre periférica de los pacientes de cáncer y trabajos anteriores han mostrado que los ensayos basados en CTC pueden utilizarse como un sustituto de las biopsias de tejidos[1-4]. Diferentes subgrupos de CTC regulan positiva y/o negativamente los fenotipos y la expresión de marcadores en relación con la progresión tumoral, la extensión de los tumores y en respuesta a los tratamientos tumorales. Por lo tanto, la evaluación de las CTC y los marcadores expresados por tales células en la sangre periférica pueden proporcionar información importante con respecto al estado del cáncer en el sujeto.

Las CTC, que se utilizan como medios diagnósticos del cáncer, además de como medios para el cribado y seguimiento del tratamiento, y para determinar la susceptibilidad de un tumor en un sujeto particular a un tratamiento particular, pueden dividirse en tres subgrupos. El primer subgrupo son las CTC definibles patológicamente (PDCTC, por sus siglas en inglés)[6-10]. En las PDCTC, el patrón de la citoqueratina es filamentoso. El segundo grupo son las CTC apoptóticas. Cuando muere una CTC, el patrón de citoqueratina se degrada formando puntos. Por lo tanto, las CTC apoptóticas presentan algunos puntos de citoqueratina y las CTC apoptóticas más tardías presentan toda la citoqueratina celular degradada formando puntos. En el tercer subgrupo de CTC, las células están experimentando transición epiteliomesenquimal (EMTCTC, por sus siglas en inglés)[235"9]. La transición epiteliomesenquimal (EMT, por sus siglas en inglés) es un proceso morfogenético gradual, y las EMTCTC comprenden células en diversos estadios de transición[6]. Las EMTCTC pueden describirse generalmente por la regulación negativa de las proteínas epiteliales, p. ej., las EpCAM y las CK, y la regulación positiva de las proteínas de las células madre mesenquimales, p. ej., la vimentina y CD34[13]. La clasificación en subtipos de EMTCTC normalmente se lleva a cabo utilizando métodos no proteómicos, es decir, el análisis de la expresión de ARNm o del ADN[13].

Un tipo adicional de las células circulantes asociadas al cáncer que pueden servir como medios diagnósticos es la célula endotelial vascular asociada a cáncer, o CAVE (por sus siglas en inglés). Las CAVE son un subtipo de células endoteliales circulantes. Los tumores requieren el suministro sanguíneo proporcionado por las células endoteliales tumorales. Las CAVE son células endoteliales tumorales que se han desprendido del sitio tumoral hacia el torrente sanguíneo. Las CAVE se encuentran con frecuencia en agregados. Las CAVE expresan citoqueratina y diversos subtipos de marcadores celulares endoteliales, tales como CD31, CD146, CD144, CD105, pero no expresan CD14 ni CD45[20].

Recientemente se ha identificado otro tipo de célula circulante asociado a cáncer en la sangre periférica de pacientes de cáncer. Este subtipo de célula estromal de cáncer se ha denominado “célula similar a macrófago asociado a cáncer”, o CAML (por sus siglas en inglés). Las CAML han sido identificados en la sangre utilizando un método basado en microfiltración sin afinidad, que captura tanto las CTC como las CAML, y permite el análisis singular o paralelo de dichos subtipos de célula circulante específica de cáncer[16-16]. Las CAML son una célula estromal derivada de mieloide circulante definida recientemente, presente en todos los estadios de neoplasia maligna invasiva y en diversas neoplasias malignas sólidas (p. ej., carcinoma de mama, prostático, pulmonar no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) y pancreático)[11131417]. Las CAML son células poliploides mieloides especializadas presentes en la sangre en todos los estadios de los tumores sólidos. Son fáciles de identificar por su gran tamaño (superior a 25 |jm), núcleo poliploide y morfologías: redonda, de bastón, con una cola o dos colas separadas por 180 grados. Las CAML normalmente expresan CD31, CD14, CD45 y citoqueratina, y también pueden expresar EpCAM, CD146, CD11c y t¡e2[11>13,14,17]

Aunque la simple presencia de uno o más de dichos tipos celulares circulantes en una muestra de sangre obtenida de un sujeto que presenta cáncer proporciona información diagnóstica, la presencia de biomarcadores seleccionados en las células puede proporcionar información adicional. Por ejemplo, y tal como se comenta en la presente memoria, los presentes inventores han encontrado que el nivel de expresión de CCR5 en las células circulantes, tales como las CAML, CTC, PDCTC, CTC apoptóticas, EMTCTC y CAVE están asociadas a la supervivencia global (SG) y supervivencia libre de progresión (SLP) de un sujeto que presenta cáncer. En particular, se ha encontrado que los niveles elevados de expresión del receptor de proteína CCR5 se correlaciona con una supervivencia global (SG) más corta y una supervivencia libre de progresión (SLP) en un sujeto que presenta cáncer.

CCR5

La CCR5 es una proteína receptora que se expresa sobre la superficie de las células T, macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, microglía y subpoblaciones de algunas células de cáncer, tales como las células de cáncer de mama y células de cáncer prostático. CCR5 desempeña un papel vital en la respuesta inflamatoria mediante el direccionamiento de las células a los sitios de inflamación. CCR5 es un agente clave en la entrada del VIH-1 en las células diana. CCR5 se ha implicado en otras enfermedades infecciosas y enfermedades no infecciosas, tales como cáncer, ateroesclerosis y enfermedad intestinal inflamatoria. Se ha implicado CCR5 en el desarrollo de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, cáncer ovárico y cervical, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer pancreático, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple y otros[2425]. Aproximadamente el 50 % de los cánceres de mama humanos expresan CCR5, especialmente el cáncer de mama triple negativo y la mayoría de cánceres de mama basales. La tinción de CCR5 citoplasmática más alta se correlaciona con un mal pronóstico[23].

Entre los ligandos afines de CCR5 se incluyen CCL3, CCL4, CCL5 y CCL3L1. Se ha mostrado que los inhibidores de CCR5 y fármacos que activan antagonistas de CCR5 reducen la metástasis [26]. En el tumor, el CCR5 activado entra en el núcleo. En efecto, la activación de CCR5 y la posterior endocitosis del receptor es indicativa de células de cáncer altamente agresivas que promueven la metástasis y causan la extensión del tumor. La línea celular mamaria MDA-MB-231 se ha utilizado como un sistema modelo para visualizar la activación e internalización de CCR5 mediante la unión del receptor a su ligando CCL5. La activación y endocitosis de CCR5 dependiente de CCL5 se visualiza mediante la formación de endosomas de CCR5 endocíticos, que han sido anteriormente definidos como “grupos” por Signoret et al.[29].

En particular, la unión de ligandos activa el CCR5 localizado en la superficie celular, conduciendo a su fosforilación y posterior endocitosis y traslocación de la superficie celular al núcleo desde la superficie celular[2729]. Dicha endocitosis mediada por receptor es la internalización del complejo de receptor-ligando activado desde la superficie celular al interior de la célula[28]. El nivel de expresión de CCR5, de esta manera, está regulado por la endocitosis y el reciclado[2930]. En la superficie celular, se ha mostrado que los receptores se agregan entre sí formando agregados o grupos de CCR5 de tamaño generalmente comprendido entre la escala nanométrica y la escala micrométrica[30-32]. Dichos grupos pueden observarse en las figuras como puntos que son claros y diferenciados, o de naturaleza más difusa. Se desconoce cuál es el mecanismo en que se basa la formación y existencia de estos grupos de CCR5[32]. La p-arrestina se une a CCR5 en sitios de fosforilación en el receptor y desensibiliza el receptor frente a una activación posterior[29]. La p-arrestina entonces permite que ocurra la endocitosis, asistiendo en la unión del receptor fosforilado a fosas recubiertas con clatrina[29'30]. Estas fosas recubiertas con clatrina seguidamente se fusionan con endosomas tempranos, que se traslocan al espacio perinuclear[29]. Los endosomas son orgánulos vesiculares presentes dentro de las células que realizan la clasificación del material endocitado[28]. Dentro del endosoma perinuclear, CCR5 se sensibiliza a su forma desfosforilada y es devuelto a la superficie celular[2930]. De esta manera, en cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, la expresión “grupos de CCR5” se refiere a agregados diferenciados de receptores de CCR5, sea sobre la superficie de la célula, en el citoplasma, en el espacio perinuclear o en el núcleo.

Células tumorales circulantes

Tal como se define en la presente memoria, las CTC asociadas a carcinomas expresan varias citoqueratinas (CK, por sus siglas en inglés). Las CK 8, 18 y 19 son las citoqueratinas que se expresan y se utilizan más habitualmente en medios diagnósticos, aunque el estudio no se limita necesariamente a solo estos marcadores. En la superficie de las CTC de tumores sólidos habitualmente se expresa molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM, por sus siglas en inglés). Sin embargo, dicha expresión no es uniforme o consistente. Las CTC no expresan ningún CD45 debido a que es un marcador de glóbulo blanco. En los ensayos para identificar las células asociadas a tumor, tales como CTC y CAML, resulta suficiente utilizar anticuerpos contra marcadores asociados al tumor sólido, tales como CK 8, 18 y 19, o anticuerpos contra CD45 o DAPI. Mediante la combinación de técnicas de tinción con análisis morfológicos, pueden identificarse las CTC definibles patológicamente (PDCTC), las CTC apoptóticas y las CAML.

Las PDCTC asociadas a tumores sólidos expresan CK 8, 18 y 19, y pueden identificarse y definirse a partir de las características siguientes:

- un núcleo “de tipo canceroso” teñido por DAPI.

- expresión de una o más CK 8, 18 y 19; las CTC de cánceres epiteliales habitualmente expresan por lo menos CK 8, 18 y 19. Las citoqueratinas presentan un patrón filamentoso.

- Falta de expresión de CD45.

Las CTC apoptóticas asociadas a cáncer expresan CK 8, 18 y 19, y pueden identificarse y definirse a partir de las características siguientes:

- núcleos en degradación.

- Expresión de uno o más de CK 8, 18 y 19; no todas las citoqueratinas presentan un patrón filamentoso, aunque partes o la totalidad presenta una apariencia fragmentada en la forma de puntos.

- Falta de expresión de CD45.

Células similares a macrófagos asociadas a cáncer circulante (CAML).

Tal como se define en la presente memoria, las células circulantes utilizadas en los métodos de la invención pueden denominarse “CAML”. Cada referencia a “células circulantes” es sinónima a CAML, y cada referencia a “CAML” es sinónima de células circulantes. Se denominen CAML o “células circulantes”, estas células se caracterizan por presentar una o más de las características siguientes:

- las CAML presentan un núcleo polipoide atípico grande o múltiples núcleos individuales, con frecuencia dispersos en la célula, aunque los nucléolos fusionados agrandados son habituales. Los núcleos de las CAML generalmente presentan un diámetro comprendido entre aproximadamente 10 pm y aproximadamente 70 pm, más habitualmente un diámetro de entre aproximadamente 14 pm y aproximadamente 64 pm.

- Para muchos cánceres, las CAML expresan el marcador de cáncer de la enfermedad. Por ejemplo, las CAML asociadas a cánceres epiteliales pueden expresar CK 8, 18 o 19, vimentina, etc.

Los marcadores normalmente están difundidos, o están asociados a vacuolas y/o material ingerido. El patrón de tinción de cualquier marcador está difundido de manera prácticamente uniforme en toda la célula. Para sarcomas, neuroblastomas y melanomas, pueden utilizarse otros marcadores asociados a los cánceres, en lugar de CK 8, 18 y 19.

- Las CAML pueden ser positivas para CD45 o negativas para CD45, y la presente invención comprende la utilización de ambos tipos de CAML.

- Las CAML son grandes, de entre aproximadamente 20 micras y aproximadamente 300 micras, en su dimensión más larga.

- Las CAML se encuentran en muchas formas morfológicas diferentes, incluyendo las formas ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos etapas, con patas delgadas o amorfa.

- Las CAML de los carcinomas normalmente presentan citoqueratinas difundidas.

- Si las CAML expresan EpCAM, EpCAM normalmente está difundido en toda la célula, o asociado a vacuolas y/o material ingerido, y de manera prácticamente uniforme en toda la célula, aunque no todas las CAML expresan EpCAM, debido a que algunos tumores expresan un nivel muy bajo o nulo de EpCAM.

- Si las CAML expresan un marcador, el marcador con frecuencia está difundido en toda la célula, o asociado a las vacuolas y/o material ingerido, y distribuido prácticamente de manera uniforme en toda la célula, aunque no todas las CAML expresan los mismos marcadores con la misma intensidad y en el caso de un número limitado de marcadores, estos no están distribuidos uniformemente en toda la célula.

- Las CAML con frecuencia expresan marcadores asociados a los marcadores de origen tumoral, p. ej., si el tumor es de origen de cáncer de próstata y expresa PSMA, las CAML de dicho paciente también expresan PSMA. A título de otro ejemplo, en el caso de que el tumor primario sea de origen pancreático y exprese PDX-1, las CAML de dicho paciente también expresan PDX-1. A título de ejemplo adicional, en el caso de que el tumor primario o CTC de origen canceroso expresen CXCR-4, las CAML de dicho paciente también expresan CXCR-4.

- En el caso de que el tumor primario o CTC originado en el cáncer exprese un biomarcador de una diana farmacológica, las CAML de dicho paciente también expresan el biomarcador de la diana farmacológica. Un ejemplo de dicho biomarcador de inmunoterapia es PD-L1.

- Las CAML expresan marcadores monocíticos (p. ej., CD11c y CD14) y marcadores endoteliales (p. ej., CD146, CD202b y CD31).

- Las CAML presentan la capacidad de unirse a fragmentos Fc.

Se evaluó un conjunto extenso de marcadores para su expresión sobre las CAML, y se muestran los resultados en la figura 12. En un aspecto de la invención, las CAML de la presente invención expresan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o la totalidad de los 21 marcadores mostrados en la figura 12. Los marcadores se cribaron frente a 1118 CAML procedentes de 93 pacientes diferentes con cánceres diferentes. Las CAML se aislaron e identificaron inicialmente con DAPI, citoqueratina y CD45; a continuación, se tiñeron nuevamente en secuencia con un total de 27 marcadores, incluyendo células mieloides/macrófagos, glóbulos blancos, megacariocitos, células epiteliales, células endoteliales, células progenitoras/madre y marcadores de motilidad. Tal como puede observarse en la figura 12, la expresión de marcadores está comprendida entre 0 % y 96 %. Se ha encontrado que la práctica totalidad de las CAML expresan niveles de CD31 y coexpresan normalmente citoqueratina, CD14, CXCR4, vimentina y otros marcadores. Sin embargo, aunque las CAML contenían un claro marcador del linaje mieloide (CD14), el marcador CD31 se expresaba con mayor frecuencia, al 96 %.

Las CAML también estaban presentes con numerosos fenotipos que aparentemente no coinciden con la comprensión de la diferenciación celular clásica (es decir, coexpresión de CD45 [leucocitos] y citoqueratina [epiteliales], CD11c/CD14 [macrófagos] y CD41 [macrófagos/megacariocitos], CD146 [endoteliales] y CD61 [macrófagos/endoteliales/megacariocitos], CD31 [glóbulos blancos/macrófagos/endoteliales/megacariocitos/células madre] y CD68/CD163 [macrófagos}). Muchos de los marcadores aparecen en múltiples tipos celulares. En combinación, dichos datos muestran que las CAML son células derivadas de mieloides pronto en su proceso de diferenciación que poseen muchos atributos fenotípicos asociados a las células madre y capacidad proangiogénica.

Las CAML pueden visualizarse mediante tinciones colorimétricas, tales como H+E, o tinción fluorescente de marcadores específicos, tal como se muestra en la figura 12. Para el citoplasma, CD31 es el fenotipo más positivo. Se recomienda el marcador CD31 solo, o en combinación con otros marcadores positivos en la figura 12, o marcadores de cáncer asociados al tumor.

De esta manera, y en las diversas realizaciones y aspectos de al invención, pueden definirse las células circulantes (CAML) como presentando cada una de las características siguientes:

(a) núcleo poliploide atípico grande, de aproximadamente 14 a 64 pm, o múltiples núcleos en la misma célula, (b) tamaño celular de entre aproximadamente 20 y 300 pm, y

(c) forma morfológica seleccionado del grupo que consiste en ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa.

En determinados aspectos de las realizaciones de la invención, las células circulantes (CAML) pueden identificarse adicionalmente como presentando una o más de las características adicionales siguientes:

(d) fenotipo positivo para CD14,

(e) expresión de CD45

(f) expresión de EpCAM,

(g) expresión de vimentina,

(h) expresión de PD-L1,

(i) expresión de marcador CD11c,

(j) expresión de marcador CD146,

(k) expresión de marcador CD202b,

(l) expresión de marcador CD31, y

(m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19.

Tal como se ha propuesto anteriormente, las características únicas de las CAML y CTC descritas en la presente memoria las hacen muy adecuadas para la utilización en metodología clínica, incluyendo métodos de cribado y diagnóstico de enfermedades tales como cáncer, el seguimiento de tratamientos, o el seguimiento de la progresión y recurrencia de enfermedades.

Predicción de la SG y la SLP utilizando valores de medias y medianas de grupos/agregados de CCR5.

Tal como se ha propuesto en el sumario, anteriormente, la presente invención se refiere a un método para la predicción de la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) de un sujeto que presenta cáncer, en donde dicho método comprende: determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde se predice que la SG y la SLP del sujeto que presenta un número mayor de grupos/agregados de CCR5 son más cortas que la SG y la SLP del sujeto con menor número de grupos/agregados de CCR5, o determinar el número medio de grupos/agregados de CCR5 en un número seleccionado de células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde se predice que la SG y la SLP del sujeto con un mayor número medio de grupos/agregados de CCR5 son más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta un menor número de grupos/agregados de CCR5, o determinar la mediana del número de grupos/agregados de CCR5 en un número seleccionado de células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde se predice que la SG y la SLP del sujeto con una mediana mayor del número de grupos/agregados de CCR5 son más cortas que la SG y la SLP del sujeto con una mediana menor del número de grupos/agregados de CCR5, en donde las células circulantes comprende células similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) y en donde las CAML presentan las características siguientes: (a) un núcleo polipoide atípico grande, de aproximadamente 14 a 64 pm, o múltiples núcleos en una sola célula, (b) un tamaño celular entre aproximadamente 20 y 300 pm, y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en las formas ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa; opcionalmente, en donde las CAML presentan una o más de las características adicionales siguientes: (d) fenotipo positivo para CD14, (e) expresión de CD45, (f) expresión de EpCAM, (g) expresión de vimentina, (h) expresión de PD-L1, (i) expresión de marcador CD11c, (j) expresión de marcador CD146, (k) expresión de marcador CD202b, ((l) expresión de marcador CD31 y (m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19, y en donde la fuente de la muestra biológica es una 0 más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina.

Al comparar el número de grupos/agregados de CCR5 en las células circulantes (p. ej., las CAML) entre dos sujetos que presentan cáncer, resulta preferente que los sujetos presenten el mismo tipo de cáncer. Sin embargo, puede ser difícil hacer coincidir completamente dos sujetos en términos del tipo de cáncer, el estadio del cáncer, la tasa de progresión del cáncer, los antecedentes de tratamiento y los antecedentes de remisión y/o reaparición del cáncer, entre otros factores. Por lo tanto, debe entenderse que existen algunas variaciones en las características de los cánceres de los dos sujetos que se están comparando en el presente método.

También debe entenderse que los datos con los que se comparan las determinaciones, p. ej., el número de grupos/agregados de CCR5 de un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, pueden ser datos de un solo sujeto, o pueden ser los resultados combinados de datos de dos o más sujetos. El valor predictivo de los métodos de la invención se incrementará durante el tiempo a medida que se establezcan niveles basales para datos de grupos de sujetos que presentan los mismos cánceres o cánceres similares. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer” se refiere a un solo sujeto o a datos de un grupo de dos o más sujetos que presentan el mismo tipo de cáncer.

En dichos aspectos de la invención, el número de células circulantes en las que se cuentan los grupos/agregados de CCR5 puede estar comprendido entre 1 y 100 células, e incluye 1 células y los intervalos de 1 a 2 células, 1 a 3 células, 1 a 4 células, 1 a 5 células, 1 a 6 células, 1 a 6 células, 1 a 8 células, 1 a 9 células, 1 a 10 células, 1 a 20 células, 1 a 30 células, 1 a 40 células y 1 a 50 células.

En cada aspecto de la presente realización, las células circulantes son CAML. En aspectos relacionados, los métodos pueden llevarse a cabo utilizando CAML y además una o más de CTC, PDCTC, CTC apoptóticas, EMTCTC y CAVE.

La predicción de la SG y la SLP utilizando el número de grupos/agregados de CCR5.

La presente invención se refiere, además, a un método para predecir la SG y la SLP de un sujeto que presenta cáncer, en donde dicho método comprende determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en las células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde las células circulantes comprenden células similares a macrófagos asociados a cáncer (CAML) y en donde las CAML presentan las características siguientes: (a) un núcleo poliploide atípico grande, de aproximadamente 14 a 64 pm, o múltiples núcleos en una sola célula, (b) tamaño celular de entre aproximadamente 20 y 300 pm, y (c) forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa; opcionalmente en donde las CAML presentan una o más de las características adicionales siguientes: (d) fenotipo positivo para CD14, (e) expresión de CD45, (f) expresión de EpCAM, (g) expresión de vimentina, (h) expresión de PD-L1, (i) expresión de marcador CD11C, (j) expresión de marcador CD146, (k) expresión de marcador CD202b, (l) expresión de marcador CD31 y (m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19, en donde la fuente de la muestra biológica es uno o más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina, y en donde, en el caso de que por lo menos una célula CAML en dicha muestra presente aproximadamente 10 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto estarán acortadas, o se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 10 o más grupos/agregados de CCR5.

Generalmente, en el caso de que el método esté basado en identificar por lo menos una célula que presenta 15 o más grupos/agregados de CCR5 y la muestra biológica sea sangre, el volumen de la muestra de sangre es aproximadamente 7,5 ml.

Estos métodos pueden llevarse a cabo utilizando los números enteros siguientes en lugar del entero 15 comentado anteriormente: 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30. Por ejemplo, el método comprende, además, determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 15 o más grupos/agregados de CCR5, la Sg y la SLP del sujeto se predice que estarán acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 16 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 17 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 18 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 19 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 20 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 22 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 23 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 24 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 25 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto están acortadas.

El método comprende, además, determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestre presente aproximadamente 15 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 15 o más grupos/agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 16 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 16 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 17 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 17 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 18 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 18 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 19 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 19 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 20 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 20 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 21 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 22 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 22 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 23 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 23 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 24 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 24 o más grupos/ agregados de CCR5, o

en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presente aproximadamente 25 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y SLP del sujeto serán más cortas que en un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en el que ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 25 o más grupos/ agregados de CCR5.

En otro ejemplo específico, el método comprende, además, determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestre presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, la SG y la SLP del sujeto se predice que están acortadas, y en donde la muestra biológica es de 7,5 ml de sangre.

En un ejemplo específico, el método comprende, además, determinar el número de grupos/agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer, en donde, en el caso de que por lo menos una célula en dicha muestra presenta aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presente el mismo tipo de cáncer, en donde ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presente aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5, y en donde la muestra biológica es de 7,5 ml de sangre.

Para evitar cualquier confusión, la expresión “ninguna de las células en una muestra biológica correspondiente presenta aproximadamente 21 o más grupos/agregados de CCR5” debe entenderse que significa que cada una de las células en la muestra biológica presenta 20 o menos grupos/agregados de CCR5.

El valor de “21 o más” grupos/agregados de CCR5 puede considerarse un valor de corte para dicho método. En aspectos relacionados de dicho método, el valor de corte puede ser cualquiera de 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más o 25 grupos/agregados de CCR5 o más.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, los grupos/agregados de CCR5 pueden estar localizados en el núcleo de la célula, o estar localizados en el citoplasma de la célula, o estar localizados en la superficie de la célula, o alguna combinación de los mismos.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, el CCR5 de las células circulantes puede encontrarse en un estado activado, o en un estado inactivado, o las células pueden presentar receptores tanto activados como inactivados.

En cada aspecto de dicha realización, las células circulantes son CAML. En aspectos relacionados, los métodos pueden llevarse a cabo utilizando CAML y uno o más CTC, PDCTC, CTC apoptóticas, EMTCTC y CAVE.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la supervivencia global (SG) se refiere al periodo de tiempo sobrevivido por un sujeto que presenta cáncer desde una fecha seleccionada, tal como la fecha del diagnóstico, la fecha en la que se inició el tratamiento y la fecha en la que se extrajo sangre para evaluar la progresión del cáncer.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la supervivencia libre de progresión (SLP) se refiere a la longitud de tiempo sobrevivido por un sujeto que presenta cáncer desde una fecha seleccionada, tal como la fecha en la que se inició el tratamiento o la fecha en la que se extrajo sangre para evaluar la progresión del cáncer, y en la que el cáncer no ha empeorado o progresado.

En cada uno de los métodos de la invención, la SG o la SLP, o ambas, se refieren a un periodo de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 meses, o más. En un aspecto de la invención, la SG o la SLP, o ambas, se refieren a un periodo de por lo menos aproximadamente 24 meses.

En cada uno de los métodos de la invención, en donde se predice que la SG y/o la SLP se “acorten”, la SG y/o la SLP presentará una duración menor que en el caso de un sujeto que presente cáncer en el que no se haya encontrado el número señalado de grupos/agregados de CCR5.

En cada uno de los métodos de la invención, resultará evidente que la cantidad de la muestra biológica en la que se someten a ensayo las células circulantes (p. ej., las CAML) puede variar. Sin embargo, la muestra biológica generalmente debe ser de por lo menos aproximadamente 2,5 ml. La cantidad de muestra biológica también puede ser de por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 12,5, 13, 14, 15,16, 17, 17,5, 18, 19, 20, 21, 22, 22,5, 23, 24, 25, 26, 27, 27,5, 28, 29 o 30 ml, o más. La cantidad de la muestra biológica también puede ser de entre aproximadamente 2,5 y 20 ml, de entre aproximadamente 5 y 15 ml, o de entre aproximadamente 5 y 10 ml. En un aspecto de la invención, la muestra biológica es de aproximadamente 7,5 ml.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, la fuente de la muestra biológica es una o más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina. En el caso de que la muestra biológica sea de sangre, la sangre puede ser sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior, sangre de la vena femoral, sangre de la vena portal o sangre de la vena yugular, por ejemplo. La muestra puede ser una muestra recién obtenida o una muestra crioconservada que se ha descongelado [14].

Al comparar el número de grupos/agregados de CCR5 en las células circulantes (p. ej., las CAML) entre dos sujetos que presentan cáncer, resulta preferente que los sujetos presenten el mismo tipo de cáncer. Sin embargo, puede resultar difícil hacer coincidir completamente dos sujetos en términos del tipo de cáncer, el estadio del cáncer, la tasa de progresión del cáncer, los antecedentes de tratamiento y los antecedentes de remisión y/o reaparición del cáncer, entre otros factores. Por lo tanto, debe entenderse que existen algunas variaciones en las características de los cánceres de los dos sujetos que se están comparando en el presente método

Debe entenderse, además, que los datos con los que se comparan las determinaciones, p. ej., el número de grupos/agregados de CCR5 de un sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, pueden ser datos de un solo sujeto, o los resultados combinados de datos de dos o más sujetos. El valor predictivo de los métodos de la invención se incrementará con el tiempo a medida que se establezcan los valores basales de los datos de grupos que sujetos que presentan el mismo cáncer o cánceres similares. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente memoria, “un sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer” se refiere a un solo sujeto o a datos de un grupo de dos o más sujetos que presentan el mismo tipo de cáncer.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, el cáncer es cáncer en el que las células del mismo expresan CCR5. Los cánceres expresantes de CCR5 pueden ser un tumor sólido, cáncer de estadio I, cáncer de estadio II, cáncer de estadio III, cáncer de estadio IV, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, melanoma, cáncer de células epiteliales, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer ovárico, neuroblastoma, sarcoma, osteosarcoma, esofágico, cerebro y SNC, laringe, bronquios, cavidad oral y faringe, estómago, testículos, tiroides, cuello uterino, cáncer de cuerpo uterino u otro cáncer de tumor sólido. El experto en la materia apreciará que los métodos de la invención no se encuentran limitados a formas o tipos particulares de cáncer y que pueden ser puestos en práctica en asociación con una amplia variedad de cánceres.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, las células circulantes (p. ej., las CAML) se aíslan a partir de las muestras biológicas para las etapas de determinación utilizando uno o más medios seleccionados de metodología de exclusión por tamaño, inmunocaptura, lisis de glóbulos rojos, reducción del número de glóbulos blancos, FICOLL, electroforesis, dielectroforesis, citometría de flujo, levitación magnética y diversos chips de microfluidos, ranuras, canales, separación basada en el tamaño hidrodinámico, agrupamiento, atrapamiento, concentración de células grandes, eliminación de células pequeñas, o una combinación de los mismos. En un aspecto particular, la metodología de exclusión por tamaño comprende la utilización de un microfiltro.

En un aspecto de la invención, las células circulantes se aíslan a partir de las muestras biológicas utilizando metodología de exclusión por tamaño que comprende la utilización de un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden presentar una variedad de tamaños y formas de los poros. El microfiltro puede presentar un tamaño de poro comprendido entre aproximadamente 5 micras y aproximadamente 20 micras. En determinados aspectos de la invención, el tamaño de poro es de entre aproximadamente 5 y 10 micras; en otros aspectos, el tamaño de poro es de entre aproximadamente 7 y 8 micras. Los tamaños de poro más grandes eliminarán la mayor parte de la contaminación por glóbulos blancos en el filtro. Los poros del microfiltro pueden presentar cualquier forma, en donde las formas aceptables son redonda, forma de pista de carreras, ovaladas, de ranura, cuadrada, rectangular y/o otras formas. El microfiltro puede presentar geometría de poros de precisión, distribución uniforme de los poros, más de una geometría de los poros y/o una distribución no uniforme de los poros. El microfiltro puede ser una sola apa o multicapa con diferentes formas en las diferentes capas.

En otro aspecto de la invención, las células circulantes se aíslan a partir de las muestras biológicas utilizando un chip de microfluidos mediante separación física basada en el tamaño, ranuras, canales, separación basada en el tamaño hidrodinámico, agrupamiento, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes, o eliminación de células pequeñas basándose en el tamaño. La eficiencia de captura de células circulantes puede variar dependiendo del método de recolección. El tamaño de la célula circulante que puede capturarse en diferentes plataformas también puede variar, dependiendo, por ejemplo, de la identidad de la célula. La recolección de células circulantes utilizando microfiltros CellSieve™ proporciona una eficiencia de captura de 100 % y células de alta calidad.

En otro aspecto de la invención, en el caso de que la muestra biológica sea de sangre periférica o de sangre, la muestra puede recolectarse del sujeto utilizando un tubo de recolección de sangre. Los tubos de recolección de sangre CellSave (Menarini Silicon Biosystems Inc., San Diego, CA), por ejemplo, proporcionan una morfología y tamaño celulares estables.

En otro aspecto de la invención, las células circulantes pueden capturarse y analizarse sin identificar específicamente las células como células CAML per se. Por el contrario, pueden identificarse simplemente las células basándose en el tamaño del citoplasma y del núcleo. Son ejemplos de ello, técnicas que utilizan tinciones de métrica de color, tales como las tinciones de H+E, o simplemente observar las células CK(+).

En un aspecto adicional de la invención, las células circulantes se aíslan de las muestras biológicas utilizando un ensayo de microfiltración de baja presión.

En cada una de las realizaciones y aspectos de la invención, puede determinarse el número de grupos/agregados de CCR5 en una célula por medios que incluyen la puesta en contacto de las células con un marcador marcado que presenta especificidad de unión para CCR5, y después detectar el marcador. Entre dichos marcadores se incluyen anticuerpos anti-CCR5 conjugados con un marcaje detectable. Entre los anticuerpos adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los clones 45549, 45531 y 45523 de MAB183 de R&D Systems. Entre los marcajes adecuados que pueden conjugarse con los anticuerpos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, FITC, PE, cianina, Alexa Fluor y DyLight. Entre los medios adecuados para detectar los marcadores marcados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un microscopio de fluorescencia y un microscopio óptico estándar para la tinción colorimétrica de IHQ. Se obtienen imágenes de los grupos/agregados de CCR5 generalmente en una microscopio de fluorescencia a una magnificación de 40x.

Los sujetos mencionados en los métodos de la presente invención serán seres humanos, primates no humanos, aves, caballos, vacas, cabras, ovejas, animales de compañía, tales como perros, gatos o roedores, u otros mamíferos. El sujeto que presenta cáncer puede estar sometido a un tratamiento para el cáncer. Entre dichos tratamientos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes dirigidos, quimioterapia y terapia de radiación.

Diagnósticos auxiliares

La información obtenida utilizando los métodos de la invención, es decir, la expresión, la intensidad y/o el número de grupos/agregados de CCR5 en poblaciones seleccionadas de células circulantes en un sujeto puede utilizarse como un diagnóstico auxiliar o complementario. Un diagnóstico auxiliar o complementario es un ensayo diagnóstico que puede utilizarse en combinación con un fármaco terapéutico para una enfermedad o afección seleccionada. El diagnóstico auxiliar determina la idoneidad del fármaco para el tratamiento de la enfermedad o afección en un paciente particular, es decir, el diagnóstico auxiliar puede ayudar a predecir si el sujeto será un respondedor o un no respondedor a los efectos del fármaco sobre la enfermedad o afección en el sujeto. De esta manera, el diagnóstico auxiliar proporciona información que se utiliza en decisiones de tratamiento y que resulta esencial para el uso seguro y eficaz de un fármaco o producto biológico correspondiente.

Los niveles de expresión de CCR5 en las células circulantes pueden utilizarse como un indicador del potencial de un paciente para responder a fármacos con diana en CCR5, tal como leronlimab. Por ejemplo, los pacientes con una expresión baja o nula de CCR5 sobre las células circulantes no se espera que se beneficien de fármacos tales como leronlimab. De esta manera, el nivel de expresión de CCR5 en las células circulantes puede utilizarse como un diagnóstico auxiliar o complementario para fármacos con diana en CCR5 en la terapia del cáncer, y la determinación de los niveles de CCR5 en las células circulantes según los métodos de la presente invención puede utilizarse para realizar decisiones de tratamiento para el sujeto en el que se aplican los métodos de la presente invención. La determinación del nivel de expresión también implica la determinación de la intensidad de la fluorescencia del tinte conjugado con el anticuerpo de CCR5 en los grupos/agregados de CCR5.

Los diagnósticos auxiliares o complementarios con frecuencia requieren tejido. La terapia quimioterapéutico y la terapia de radiación potencialmente pueden alterar los niveles de expresión de CCR5 en las células tumorales. Las células circulantes en sangre proporcionan la capacidad de analizar la expresión de CCR5 y de realizar un seguimiento de la expresión durante el tiempo.

Ejemplos

Recolección y procesamiento de muestras

Las muestras de sangre (7,5 ml) recolectadas en tubos CellSave preservative tubes™ se procesaron con un ensayo de microfiltración CellSieve™ utilizando un sistema de vacío de baja presión[112] o una bomba de jeringa[12]. El ensayo de microfiltración de ensayo CellSieve™ aísla las células circulantes basándose en la exclusión de tamaños >7 micras. Un citólogo experimentado identificó las CTC definibles patológicamente y pronósticamente pertinentes (PDCTC), las EMTCTC y las CAML basándose en características morfológicas y la expresión fenotípica de CD45, EpCAM, citoqueratinas 8, 18 y 19, y DAPI[1612] utilizando características citológicas preestablecidas ya descritas[61114]. Para la captación de imágenes se utilizó un microscopio de fluorescencia Olympus BX54WI con Carl Zeiss AxioCam y Zen2011 Blue (Carl Zeiss).

Recuento de subtipos de PDCTC/EMTCTC y CAML

Las características definitorias de los dos subtipos de CTC más habituales observados en los pacientes de cáncer (PDCTC y EMTCTC) y aquellas para la identificación de las CAML han sido descritas anteriormente^’6’10-1^ . Para el presente estudio solo se caracterizaron PDCTC, EMTCTC y CAML intactas[1610-14]. Las PDCTC son negativas para CD45, con positividad para citoqueratina filamentosa y núcleos positivos para DAPI con criterios patológicos malignos, clasificadas como el subtipo CellSearch® de CTC[1610-14]. Las EMTCTC son negativas para<c>D45 con una señal de queratina difusa y con frecuencia débil y un núcleo positivo en DAPI con criterios de anormalidad, tal como se ha definido anteriormente [1,6-9,1213]. Las CAML se describen como células multinucleares agrandadas (>25 |jm) con tinción citoplasmática de citoqueratina difusa, y/o una o más de CD45+, CD14+ y CD31 P,11,14,17-1^ . Un citólogo experimentado identificó y captó imágenes de la totalidad de los 3 tipos celulares y estas fueron confirmadas por un patólogo. Las CTC apoptóticas y las CTC que no podían clasificarse citológicamente tal como se ha descrito anteriormente no fueron incluidas. Tras la identificación, se obtuvieron imágenes de las células y se marcó el eje x-y de cada célula para el análisis posterior. Las muestras se archivaron a 4 °C durante 1 a 3 años.

Extinción y retinción QUAS-R.

Tras la identificación y cuantificación iniciales de las PDCTC, EMTCTC y CAML, se extinguió la fluorescencias y las muestras se retiñeron con CCR5. En algunos casos, el marcador CCR5 se tiñó junto con una variedad de otros marcadores, tales como PD-L1 y PD-1. Se utilizó la técnica QUAS-R (Quench, Underivatize, Amine-Strip and Restain) tal como se ha descrito anteriormente [13]. Brevemente, tras obtener imágenes de las muestras y marcarlas, los filtros se sometieron a etapas secuenciales de tratamiento químico de solución de extinción, Tris, y lavado. Tras la extinción química, se lavaron los filtros con PBS, se incubaron con 1XPBS/FBS al 20 % y después se incubaron con anticuerpos contra CCR5 durante 1 hora a temperatura ambiente (figura 1). Tras la incubación con anticuerpos, los filtros se lavaron en 1xPBST y se montaron en portaobjetos con Fluoromount-G/DAPI (Southern Biotech). Las muestras se orientaron a lo largo del eje x/y y las células previamente fotografiadas se relocalizaron utilizando el software de marcado y búsqueda Zen2011 Blue (Carl Zeiss). Para procesar las imágenes se utilizó Zen2011 Blue (Carl Zeiss).

Cuantificación de CCR5 en células circulantes

Se analizó la expresión de CCR5 utilizando anticuerpos MAB183 clon n.° 45549 de R&D Systems siguiendo las directrices del fabricante.

Resultados

La mayoría de las imágenes de células circulantes asociadas a cáncer en sangre mostradas en las figuras son de pacientes de cáncer de mama en estadios III y IV. Cada muestra presentaba CAML, aunque solo aproximadamente la mitad de los pacientes presentaba CTC.

La figura 1 muestra una célula CAML inicialmente teñida con DAPI, citoqueratina 8, 18 y 19, EpCAM y CD45 (fila superior). La segunda fila en la figura 1 muestra que la célula fue reteñida para DAPI, PD-L1, CCR5 y PD-1. En el presente ejemplo, tanto la expresión de PD-L1 como de CCR5 era alta, indicando que una combinación de inmunoterapias con diana en estas dos proteínas podría ser un tratamiento adecuado para este paciente. CCR5 se encuentra en el citoplasma; no fue traslocado al núcleo, lo que indica que se encontraba en una forma activa.

La figura 2 muestra una célula CAML teñida con DAPI, citoqueratina 8, 18 y 19, EpCAM y CD45 (fila superior). La segunda fila en la figura 2 muestra que la célula fue reteñida para DAPI, PD-L1, CCR5 y PD-1. En el presente ejemplo, hay expresión de CCR5 pero no hay expresión de PD-L1, indicando que una inmunoterapia por sí sola no resultará eficaz, mientras que una terapia con diana en CCR5 podría ser un tratamiento adecuado para este paciente. Los grupos/agregados de CCR5 se encuentran en el citoplasma; no se han traslocado al núcleo, lo que indica que se encontraban en una forma activa.

Las figuras 3 a 10 se centran en la expresión de CCR5. Se proporcionan las versiones en blanco y negro y en color de estas figuras. Las imágenes en color permite visualizar la traslocación al núcleo. En las imágenes en color, los núcleos son rojos, el citoplasma es azul y la tinción de CCR5 es amarilla.

Los tamaños de imagen para las figuras 3, 4 y 6 son 60 jm x 60 jm . El tamaño de imagen para la figura 5A es 60 jm x 60 jm ; la figura 5B es 90 jm x 90 jm ; la figura 5C es 60 jm x 60 jm ; la figura 6A es 60 jm x 60 jm ; la figura 6B es 75 jm x 75 jm . El tamaño de imagen para las figuras 7 a 10 es de 30 jm x 30 jm .

Las figuras 3A-C son CAML con expresión alta/intermedia de CCR5 en la forma de grupos/agregados que se observan sobre la superficie de la célula y en el citoplasma, lo que indica que la proteína se encuentra en una forma activada.

Las figuras 4A-C son CAML con expresión baja/nula de CCR5 en la forma de grupos/agregados que se observan en la superficie de la célula y en el citoplasma, lo que indica que la proteína se encuentra en una forma activada.

Las figura 5A-C son CAML con expresión alta de CCR5 en la forma de grupos/agregados que se observan en la forma de grupos/agregados, con la mayoría de grupos/agrupados traslocados al núcleo, lo que indica que la proteína se encuentra en una forma activada. La figura 5A muestra un nivel elevado de expresión de CCR5 en el citoplasma. La figura 5B muestra que CCR5 se ha traslocado mayoritariamente al núcleo. La figura 5C muestra que CCR5 se ha traslocado completamente al núcleo.

Las figuras 6A-B son CAML con un nivel de expresión medio/bajo de CCR5 en la forma de grupos/agregados, con la mayoría de grupos/agregados traslocados al núcleo en la figura 6B, lo que indica que la proteína se encuentra en una forma inactivada.

Los grupos/agregados de CCR5 se encuentran en otras células asociadas a cáncer, tales como EMTCTC y CTC. La figura 7 muestra las EMTCTC con expresión alta localizada de CCR5 agregados en un punto sobre la superficie celular. La figura 8 muestra EMTCTC sin expresión de CCR5.

Las figuras 9A-C muestra CTC con expresión moderada o elevada de CCR5. La cantidad de CCR5 en la figura 9C es significativamente superior a la habitual. Las figuras 10A-B son CTC con niveles bajos de expresión de CCR5 con solo unos pocos grupos/agregados pequeños.

La figura 11 muestra la importancia de los grupos/agregados o grupos/agregados basados en 21 pacientes de cáncer de mama en estadios III y IV. En el caso de que el paciente presente una CAML en la que el número de grupos/agregados de CCR5 sea superior o igual a 21, el paciente tendrá un pronóstico muy malo. Para la supervivencia libre de progresión (SLP), el cociente de riesgos (CR) es de 7,8 (IC al 95 %=2,2-27,9, p=0,005). Para la supervivencia global (SG), la cociente de riesgos es de 4,1 (IC al 95 %=1,2-14,0, p=0,057). CCR5 puede estar activado o inactivado, es decir, localizado en el núcleo o en el citoplasma.

El valor de corte de 20 grupos/agregados de CCR5 o grupos/agregados utilizados en la figura 11 es un ejemplo que proporciona el mejor valor de p para los 21 pacientes de cáncer de mama.

Métodos estadísticos.

Se llevaron a cabo análisis de Kaplan-Meier en MATLAB R2013A utilizando los recuentos de todos los subtipos y las poblaciones de pacientes conocidas. Para el análisis de la supervivencia libre de progresión, se definió el tiempo hasta la progresión como el intervalo entre el momento en que se obtuvo la muestra de sangre de T0 y la fecha de progresión; todos los pacientes se mantuvieron en el estudio hasta el punto final de los 24 meses, es decir, no se excluyó ningún paciente.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Método para predecir la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) de un sujeto que presenta cáncer, comprendiendo dicho método la determinación del número de agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto que presenta cáncer,

   en el que las células circulantes comprenden células similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) y en el que las CAML presentan las características siguientes:

   (a) núcleo poliploide atípico grande, de aproximadamente 14 a 64 pm, o múltiples núcleos en la misma célula,

   (b) tamaño celular de entre aproximadamente 20 y 300 pm, y

   (c) forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa; opcionalmente en la que las CAML presentan una o más de las características adicionales siguientes:

   (d) fenotipo positivo para CD14,

   (e) expresión de CD45

   (f) expresión de EpCAM,

   (g) expresión de vimentina,

   (h) expresión de PD-L1,

   (i) expresión de marcador CD11C,

   (j) expresión de marcador CD146,

   (k) expresión de marcador CD202b,

   (l) expresión de marcador CD31, y

   (m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19,

   en el que la fuente de la muestra biológica es una o más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina, y

   en el que, en el caso de que por lo menos una célula CAML en dicha muestre presente aproximadamente 10 o más agregados de CCR5:

   (i) se predice que la SG y SLP del sujeto estarán acortadas, o

   (ii) se predice que la SG y la SLP del sujeto serán más cortas que las de un sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer donde ninguna de las células en la muestra biológica correspondiente presenta aproximadamente 10 o más agregados de CCR5.

   Método para predecir la SG y la SLP de un sujeto que presenta cáncer, comprendiendo dicho método:

   (i) determinar el número de agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde se predice que la SG y la SLP del sujeto que presenta un mayor número de agregados de CCR5 serán más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta un menor número de agregados de CCR5,

   (ii) determinar el medio número de agregados de CCR5 en un número seleccionado de células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde se predice que la SG y la SLP del sujeto con el mayor número de agregados de CCR5 serán más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta el número medio menor de agregados de CCR5, o

   (iii) determinar la mediana del número de agregados de CCR5 en un número seleccionado de células circulantes en una muestra biológica de un primer sujeto que presenta cáncer, y comparar los resultados con los determinados en un segundo sujeto que presenta el mismo tipo de cáncer, en donde se predice que la SG y la SLP del sujeto con la mediana más alta del número de agregados de CCR5 serán más cortas que la SG y la SLP del sujeto que presenta la mediana más baja del número de agregados de CCR5,

   en el que las células circulantes comprenden células similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) y en el que las CAML presentan las características siguientes:

   (a) núcleo poliploide atípico grande, de aproximadamente 14 a 64 pm, o múltiples núcleos en una sola célula,

   (b) tamaño celular de entre aproximadamente 20 y 300 pm, y

   (c) forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en ahusada, flagelada, redonda, oblonga, con dos patas, con más de dos patas, con patas delgadas y amorfa; opcionalmente en la que las CAML presentan una o más de las características adicionales siguientes:

   (d) fenotipo positivo para CD14,

   (e) expresión de CD45

   (f) expresión de EpCAM,

   (g) expresión de vimentina,

   (h) expresión de PD-L1,

   (i) expresión de marcador CD11C,

   (j) expresión de marcador CD146,

   (k) expresión de marcador CD202b,

   (l) expresión de marcador CD31, y

   (m) fenotipo epitelial CK8, 18, 19,

   y en el que la fuente de la muestra biológica es una o más de sangre periférica, sangre, ganglio linfático, médula ósea, líquido espinal cerebral, tejido y orina.

   3. Método según la reivindicación 1, en el que el número de agregados de CCR5 es 15 o superior, 16 o superior, 17 o superior, 18 o superior, 19 o superior, 20 o superior, 21 o superior, 22 o superior, 23 o superior, 24 o superior, o 25 o superior.

   4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha SG y/o SLP es a lo largo de un periodo de por lo menos 12 meses, o en el que dicha SG y/o SLP es a lo largo de un periodo de por lo menos 24 meses.

   5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tamaño de la muestra biológica es de entre 5 y 15 ml.

   6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células circulantes comprenden, además, uno o más de células CTC, PDCTC, CTC apoptóticas, EMt Ct C y CAVE.

   7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra biológica es sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior, sangre de la vena femoral, sangre de la vena portal o sangre de la vena yugular.

   8. Método según la reivindicación 7, en el que la muestra biológica es de 7,5 ml de sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior, sangre de la vena femoral, sangre de la vena portal o sangre de la vena yugular.

   9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el cáncer es cáncer que expresa CCR5 seleccionado de un tumor sólido, cáncer de estadio I, cáncer de estadio II, cáncer de estadio MI, cáncer de estadio IV, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, melanoma, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer pulmonar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer esofágico u otro cáncer de tumor sólido.

   10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se aíslan células circulantes a partir de las muestras biológicas para las etapas de determinación utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaño, inmunocaptura, lisis de glóbulos rojos, reducción del número de glóbulos blancos, FICOLL, electroforesis, dielectroforesis, citometría de flujo, levitación magnética y diversos chips de microfluidos, o una combinación de los mismos.

   11. Método según la reivindicación 10, en el que se aíslan células circulantes a partir de muestras biológicas utilizando metodología de exclusión por tamaño que comprende la utilización de un microfiltro, preferentemente en el que el microfiltro presenta un tamaño de poro comprendido entre aproximadamente 5 micras y aproximadamente 20 micras, opcionalmente en el que los poros del microfiltro presentan una forma de los poros redonda, de pista de carreras, ovalada, cuadrada y rectangular, o en el que el microfiltro presenta geometría de poros de precisión y una distribución uniforme de los poros.

   12. Método según la reivindicación 10, en el que se aíslan células circulantes utilizando un chip de microfluidos mediante separación física basada en el tamaño, ranuras, canales, separación hidrodinámica basada en el tamaño, agrupamiento, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes o eliminación de células pequeñas basada en el tamaño.

   13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se aíslan células circulantes a partir de las muestras biológicas para las etapas de determinación utilizando un ensayo de microfiltración de baja presión.

   14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los agregados de CCR5 se localizan en el núcleo de la célula, o los agregados de CCR5 se localizan en el citoplasma de la célula o se localizan en la superficie de la célula, o alguna combinación de los mismos, y/o en el que el CCR5 de las células circulantes está en un estado activado, o en un estado inactivado, o en el que las células presentan tanto receptores activados como receptores inactivados.

   15. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, la utilización de la determinación del número de agregados de CCR5 en células circulantes en una muestra biológica de un sujeto como diagnóstico auxiliar o complementario en decisiones de tratamiento para dicho sujeto.