ES2986826T3 - Inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento de la epilepsia - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto que es un antagonista del receptor GluK2/GluK5 o un inhibidor de la expresión del receptor GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento de la epilepsia

CAMPO DE LA INVENCIÓN:

La presente invención se refiere a un compuesto que es un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) para el receptor de GluK2/GluK5, un vector que comprende un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 o una secuencia de ADN que codifica un inhibidor de ARN antisentido del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido para el receptor de GluK2/GluK5 y una composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz de un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) para el receptor de GluK2/GluK5.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

La epilepsia es un conjunto común y diverso de trastornos neurológicos crónicos caracterizados por convulsiones. Algunas definiciones de epilepsia requieren que las convulsiones sean recurrentes y no provocadas, pero otras requieren solo una convulsión única combinada con alteraciones cerebrales que aumentan la posibilidad de convulsiones futuras. En muchos casos, no se puede identificar una causa; sin embargo, los factores asociados incluyen traumatismo cerebral, accidentes cerebrovasculares, cáncer cerebral y abuso de drogas y alcohol, entre otros.

Las convulsiones epilépticas son el resultado de una actividad neuronal anormal, excesiva o hipersíncrona en el cerebro. Alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo tienen epilepsia, y casi el 80 % de la epilepsia se produce en los países en desarrollo. La epilepsia se vuelve más común a medida que las personas envejecen. El inicio de nuevos casos ocurre con mayor frecuencia en bebés y ancianos. Como consecuencia de la cirugía cerebral, pueden ocurrir ataques epilépticos en pacientes en recuperación.

La epilepsia suele controlarse, pero no curarse, con medicación. Sin embargo, más del 30 % de las personas con epilepsia no tienen control de las convulsiones ni siquiera con los mejores medicamentos disponibles. La cirugía puede considerarse en casos difíciles.

Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar nuevos fármacos que sean adecuados para prevenir o tratar la epilepsia y especialmente la epilepsia crónica. De esta manera, se ha sugerido que la caracterización de nuevos compuestos terapéuticos en la epilepsia puede ser altamente deseable.

El kainato (KA), un análogo del glutamato, es una potente neurotoxina que durante mucho tiempo se ha sabido que induce convulsiones agudas conductuales y electrofisiológicas que recuerdan a las que se encuentran en pacientes con epilepsia del lóbulo temporal (TLE -temporal lobe epilepsy).Sin embargo, aún se desconocía si los receptores de kainato (KAR -kainate receptors)activados por el agonista endógeno glutamato desempeñan algún papel en la fase crónica de la TLE hasta el 24 de julio de 2014 (los inventores han publicado los datos de la presente invención; Peret y col. 2014), aunque esto podría representar un enfoque terapéutico prometedor. En modelos animales de TLE y en pacientes humanos, el tejido neuronal experimenta una reorganización importante. El brote de fibras musgosas del hipocampo es uno de los ejemplos mejor documentados de plasticidad reactiva desencadenada por convulsiones en pacientes humanos y modelos animales de TLE [Represa y col., 1989a; Represa y col., 1989b, Sutula y col., 1989; Mello y col., 1993; Isokawa y col., 1993; Franck y col., 1995; Okazaki y col., 1995; Gabriel y col., 2004;]. Este brote conduce a la formación de potentes circuitos excitadores recurrentes entre las células granulares dentadas (DGC -dentate granule cells),lo que explica, en parte, la mayor capacidad del hipocampo para generar actividad epileptiforme en el hipocampo de pacientes humanos y modelos animales de TLE [Tauck y Nadler, 1985; Mello y col., 1993; Patrylo y Dudek, 1998; Lynch y Sutula, 2000; Buckmaster y col., 2002; Scharfman y col., 2003; Gabriel y col., 2004]. Además del recableado axonal, el brote de fibras musgosas desencadena el reclutamiento de receptores de kainato (KAR) en las sinapsis excitadoras recurrentes aberrantes en las DGC. De hecho, las entradas que inciden en las DGC operan principalmente a través de KAR aberrantes y conducen a eventos sinápticos con una cinética anormal de larga duración que no está presente en condiciones sin tratamiento previo [Epsztein y col., 2005; Epsztein y col., 2010; Artinian y col., 2011]. Según esto, se informó previamente un aumento de la densidad de los sitios de unión de kainato en las DG de pacientes epilépticos [Represa y col., 1989b].

UBP310, un antagonista de los receptores de GluK2/GluK5 heteroméricos, bloquea los KAR postsinápticos e inhibe GluK2/GluK5, pero no los receptores de GluK2 homoméricos [Pinheiro y col, 2013].

El estado de la técnica ya muestra la implicación de los receptores GluK1 y GluK2 y el uso potencial de antagonistas de estos KAR en convulsiones agudas (inducidas por agentes químicos convulsivos) en animales sin tratamiento previo [véase, por ejemplo, Jane y col., 2009]. Sin embargo, los experimentos descritos en este estado de la técnica solo se refieren a casos de convulsiones agudas; este conjunto de experimentos no ha abordado la epilepsia crónica y, en particular, la reorganización morfofuncional de las redes neuronales no presentes en animales sin tratamiento previo y el brote de fibras musgosas del hipocampo. Esta reorganización solo está presente cuando se instala la epilepsia crónica (es decir, semanas después del estado epiléptico inicial inducido por una inyección de un agente químico convulsivo como el kainato o la pilocarpina) y, por lo tanto, no solo después de una aplicación de los agentes convulsivos en el tejido sin tratamiento previo. Más, hasta el 24 de julio de 2014 (los inventores han publicado los datos de la presente invención; Peret y col. 2014), el estado de la técnica no reveló el papel de los receptores de kainato en las afecciones epilépticas crónicas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN:

Los inventores exploran las implicaciones fisiopatológicas de los KAR en modelos animales durante la fase crónica de TLE mediante el uso de ratones deficientes en subconjuntos de KAR y agentes farmacológicos seleccionados. Muestran, utilizando el modelo epiléptico de estado de pilocarpina de TLE crónica, que en ratones que carecen del subconjunto GluK2 (GluK2-/-), hay una fuerte reducción de las actividades interictal e ictal recurrentes y espontáneas en la circunvolución dentada (DG -dentate gyrus)registradas in vitro e in vivo en condiciones epilépticas crónicas. Estos resultados están completamente corroborados por el uso de UBP310, un antagonista de los receptores heteroméricos GluK2/GluK5. Este compuesto se diseñó inicialmente como un antagonista de GluK1, pero los autores han demostrado que este agente también bloquea los KAR postsinápticos e inhibe GluK2/GluK5, pero no los receptores de GluK2 homoméricos. Por lo tanto, muestran que los receptores de GluK2/GluK5 heteroméricos y los receptores de GluK2 homoméricos son receptores distintos con diferentes propiedades farmacológicas. Además, UBP310 no interfiere con la transmisión sináptica normal debido al receptor a MpA [Pinheiro y col, 2013]. Por lo tanto, y contrariamente al estado de la técnica que solo describe el interés potencial de los receptores de GluK2, GluA2 o mGluR5 en la epilepsia (véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente WO01/72709, WO02/092086 o WO2007/101116), demuestran por primera vez que los KAR, y en particular los receptores de GluK2/GluK5 heteroméricos, desempeñan un papel importante en las actividades epilépticas en el hipocampo en TLE y pueden constituir una diana antiepiléptica importante para tratar la epilepsia crónica.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un compuesto que es un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) para el receptor de GluK2/GluK5, un vector que comprende un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 o una secuencia de ADN que codifica un inhibidor de ARN antisentido del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido para el receptor de GluK2/GluK5 y una composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz de un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) para el receptor de GluK2/GluK5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN:

Un primer objeto de la invención se refiere a un compuesto que es un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) del receptor de GluK2/GluK5.

Como se usa en esta invención, el término "receptor de GluK2/GluK5" denota un complejo heteromérico formado por los subconjuntos del receptor de kainato GluK2 y GluK5 [véase, por ejemplo, Reiner y col., 2012]. Como se usa en esta solicitud, el término ILTPHAR-2009 "GluK2" (también conocido como GluR6) y el término ILTPHAR-2009 "GluK5" (también conocido como KA2) denota 2 subconjuntos diferentes de la familia de receptores de glutamato ionotrópicos que se unen al kainato.

Como se usa en esta invención, el término "antagonista del receptor de GluK2/GluK5" denota un compuesto que previene la activación del receptor de la vía o un compuesto que previene la formación del complejo heteromérico GluK2/GluK5. Por lo tanto, el compuesto puede ser una molécula que se une al receptor de GluK2/GluK5 para impedir la activación o la formación del complejo heteromérico GluK2/GluK5.

La descripción proporciona un compuesto que impide la activación o la formación del complejo heteromérico GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento de la epilepsia.

El compuesto puede unirse al subconjunto GluK2 o al subconjunto GluK5.

El compuesto puede unirse al receptor de GluK2/GluK5 heteromérico.

El compuesto puede unirse al subconjunto GluK2a o GluK2b.

El compuesto puede unirse a los dominios formados a partir del dominio pre-M1 no contiguo (conocido como S1) y el bucle entre las partes M3 y M4 (conocido como S2) del subconjunto GluK2 [Contractor y col., 2011]. Esto incluye las variantes de empalme de GluK2, GluK2a y GluK2b, que difieren en sus dominios C-terminales y se coensamblan como heterómeros, pero no muestran propiedades funcionales distintas [Coussen y col., 2005].

En una realización, la invención se refiere a un compuesto que es un inhibidor de la expresión sináptica del receptor de GluK2/GluK5 heteromérico para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia.

En una realización, la epilepsia se puede clasificar según los síndromes electroclínicos siguiendo la Clasificación y Terminología de la Liga Internacional contra la Epilepsia (ILAE) [Berg y col., 2010]. Estos síndromes se pueden clasificar por edad de inicio, constelaciones distintivas (síndromes quirúrgicos) y causas estructurales y metabólicas: (A) edad de inicio: (i) el período neonatal incluye epilepsia neonatal familiar benigna (BF-NE), encefalopatía mioclónica temprana (EME), síndrome de Ohtahara. (ii) El período de la infancia incluye la epilepsia de la infancia con crisis focales migratorias, el síndrome de West, la epilepsia mioclónica en la infancia (MEI), la epilepsia infantil benigna, la epilepsia infantil familiar benigna, el síndrome de Dravet y la encefalopatía mioclónica en trastornos no progresivos. (iii) El período de la infancia incluye convulsiones febriles más (FS+), síndrome de Panayiotopoulos, epilepsia con convulsiones atónicas mioclónicas (previamente astáticas), epilepsia benigna con picos centrotemporales (BECTS), epilepsia del lóbulo frontal nocturna autosómica dominante (ADNFLE), epilepsia occipital infantil de inicio tardío (tipo Gastaut), epilepsia con ausencias mioclónicas, síndrome de Lennox-Gastaut, encefalopatía epiléptica con picos y ondas continuas durante el sueño (CSWS), síndrome de Landau-Kleffner (LKS), epilepsia por ausencia de Infancia (CAE). (iv) Adolescencia - Período adulto incluye epilepsia de ausencia juvenil (JAE), epilepsia mioclónica juvenil (JME), epilepsia con convulsiones tónico-clónicas generalizadas solas, epilepsias mioclónicas progresivas (PME), epilepsia autosómica dominante con características auditivas (ADEAF), otras epilepsias del lóbulo temporal familiar. (v) El inicio de la edad variable incluye epilepsia focal familiar con focos variables (de la infancia al adulto), epilepsias reflejas. (B) Las constelaciones distintivas (síndromes quirúrgicos) incluyen epilepsia del lóbulo temporal mesial (MTLE), síndrome de Rasmussen, convulsiones gelásticas con hamartoma hipotalámico, hemiconvulsión-hemiplejíaepilepsia. (C) Las epilepsias atribuidas y organizadas por causas estructurales-metabólicas incluyen malformaciones del desarrollo cortical (hemimegalencefalia, heterotopías, etc.), Síndromes neurocutáneos (complejo de esclerosis tuberosa, Sturge-Weber, etc.), tumor, infección, traumatismo, angioma, lesiones perinatales, accidente cerebrovascular, etc.

En otra realización, la epilepsia puede ser una epilepsia rolándica benigna, una epilepsia del lóbulo frontal, un espasmo infantil, una epilepsia mioclónica juvenil, una epilepsia de ausencia juvenil, una epilepsia de ausencia infantil (pyknolepsia), una epilepsia de agua caliente, un síndrome de Lennox-Gastaut, un síndrome de Landau-Kleffner, un síndrome de Dravet, una epilepsia mioclónica progresiva, una epilepsia refleja, un síndrome de Rasmussen, una epilepsia del lóbulo temporal, una epilepsia límbica, un estado epiléptico, una epilepsia abdominal, un mioclono bilateral masivo, una epilepsia catamenial, un trastorno convulsivo jacksoniano, una enfermedad de Lafora o una epilepsia fotosensible.

En una realización particular, la epilepsia es una epilepsia del lóbulo temporal.

En una realización, la epilepsia es una epilepsia crónica.

En otra realización, la epilepsia puede ser una epilepsia refractaria.

Como se usa en esta invención, el término "epilepsia refractaria" denota una epilepsia que es refractaria al tratamiento farmacéutico actual, es decir, que el tratamiento farmacéutico actual no permite un tratamiento de pacientes (véase, por ejemplo, Dario J. Englot y col., 2013).

En una realización particular, la epilepsia refractaria es una epilepsia refractaria crónica.

Como se usa en esta solicitud, el término "Epilepsia del Lóbulo Temporal" o "TLE -Temporal Lobe Epilepsydenota una afección neurológica crónica caracterizada por convulsiones crónicas y recurrentes (epilepsia) que se originan en el lóbulo temporal del cerebro. Esta enfermedad es diferente de las convulsiones agudas en el tejido cerebral sin tratamiento previo, ya que en la TLE aparece una reorganización morfofuncional de la red neuronal y la brotación de fibras musgosas del hipocampo, mientras que en las convulsiones agudas en el tejido sin tratamiento previo dicha reorganización no está presente.

Por lo tanto, la invención también se refiere a un compuesto que es un inhibidor de la expresión de los receptores de GluK2/GluK5 como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia con la reorganización funcional de la red neuronal y el brote de fibras musgosas del hipocampo.

También se describe un antagonista del receptor de GluK2/GluK5, donde dicho antagonista del receptor de GluK2/GluK5 puede ser un antagonista de bajo peso molecular, por ejemplo, una molécula orgánica pequeña (natural o no).

El término "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula (natural o no) de un tamaño comparable a aquellas moléculas orgánicas generalmente utilizadas en productos farmacéuticos. El término excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en tamaño hasta aproximadamente 10000 Da, más preferentemente hasta 5000 Da, más preferentemente hasta 2000 Da y lo más preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.

Antagonistas ejemplares son UBP310, UBP302 y UBP316 y NBQX.

Otro antagonista ejemplar es (2S,4R)-4- Metilglutamato (SYM2081), un compuesto que es un potente agonista de amplio espectro de receptores de kainato; se une a receptores de kainato homoméricos y heteroméricos que incluyen receptores GluK1 y GluK2 homoméricos y receptores GluK1/GluK2, GluK1/GluK5 y GluK2/GluK5 heteroméricos [Jane y col., 2009]. Este compuesto se utiliza actualmente para bloquear selectivamente la señalización del receptor de kainato a través de la desensibilización de los receptores en condiciones de control y epilépticas [Jane y col., 2009] [Li y col., 1999; Cossart y col., 2002; Epsztein y col., 2005; Epsztein y col., 2010; Joseph y col., 2011].

El antagonista puede ser una proteína o un péptido. La proteína o el péptido pueden unirse al dominio citosólico o de membrana del receptor de GluK2/GluK5 e impedir el reclutamiento o la estabilización de los receptores de GluK2/GluK5 sinápticos. Por lo tanto, la proteína o el péptido pueden usarse en el tratamiento o la prevención de la epilepsia.

Otro antagonista del receptor de GluK2/GluK5 puede ser un anticuerpo anti-GluK2/GluK5 que neutraliza GluK2/GluK5 o un fragmento anti-GluK2/GluK5 del mismo que neutraliza GluK2/GluK5 [véase, por ejemplo, Xie JH y col., 2003].

El antagonista puede ser un anticuerpo de subconjunto anti-GluK2/GluK5 o un fragmento de subconjunto anti-GluK2/GluK5 del mismo.

Anticuerpos dirigidos contra el receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5 se pueden generar según procedimientos conocidos mediante la administración del antígeno o epítopo apropiado a un animal huésped seleccionado, por ejemplo, de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Varios adyuvantes conocidos en la técnica se pueden utilizar para mejorar la producción de anticuerpos. Aunque los anticuerpos útiles pueden ser policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales contra el receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5 se pueden preparar y aislar utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción y el aislamiento incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975); la técnica de hibridoma de células B humanas (Cote y col., 1983); y la técnica de hibridoma de EBV (Cole y col. 1985). De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N .° 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios del receptor anti-GluK2/GluK5, el subconjunto anti-GluK2 o el subconjunto anti-GluK5. Los antagonistas del receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5 útiles también incluyen fragmentos de anticuerpo anti-receptor de GluK2/GluK5, subconjunto anti-GluK2 o subconjunto anti-GluK5 que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos F(ab')2, que se pueden generar mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab y/o scFv para permitir la identificación rápida de fragmentos que tienen la especificidad deseada para el receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5.

Los anticuerpos contra el receptor anti-GluK2/GluK5 humanizado, el subconjunto anti-GluK2 o el subconjunto anti-GluK5 y los fragmentos de anticuerpo de los mismos también se pueden preparar según técnicas conocidas. Los "anticuerpos humanizados" son formas de anticuerpos quiméricos no humanos (por ejemplo, de roedor) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) donde los residuos de una región hipervariable (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,<los residuos de la región de estructura>(F<r - Framework Región) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por>los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en Winter (patente de EE. UU. N.° 5.225.539) y Boss (Celltech, patente de EE.UU. N.° 4.816.397).

A continuación, se seleccionan los anticuerpos neutralizantes del receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5.

El receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o los antagonistas del subconjunto GluK5 pueden seleccionarse de aptámeros. Los aptámeros son una clase de molécula que representa una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos se pueden aislar a través de la Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias, como se describe en Tuerk C. y Gold L., 1990. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, eventualmente modificado químicamente, de una secuencia única. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas se han revisado en Jayasena S.D., 1999. Los aptámeros peptídicos consisten en una región variable de anticuerpo conformacionalmente restringida mostrada por una proteína de plataforma, tal como tiorredoxina A de E. coli que se seleccionan de bibliotecas combinatorias mediante dos procedimientos híbridos (Colas y col., 1996).

A continuación, se seleccionan los aptámeros neutralizantes del receptor de GluK2/GluK5, el subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5.

El compuesto según la invención es un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 como se define adicionalmente en las reivindicaciones.

En una realización, el compuesto según la invención es un inhibidor de la expresión sináptica de los receptores de GluK2/GluK5.

Como se usa en esta invención, el término "inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5" denota un compuesto que inhibe la expresión del subconjunto GluK2 o el subconjunto GluK5 o ambos en las sinapsis.

Según la invención, un "inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5" debería conducir a la pérdida parcial o completa de los receptores de GluK2/GluK5 sinápticos.

En una realización particular, el inhibidor de la invención es un inhibidor de la expresión del subconjunto GluK2 o un inhibidor de la expresión del subconjunto GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia.

Los ARN inhibidores pequeños (ARNip) también pueden funcionar como inhibidores de la expresión génica del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en la presente invención. La expresión del gen del receptor de GluK2/GluK5 se puede reducir poniendo en contacto un sujeto o célula con un ARN bicatenario pequeño (ARNbc), o un vector o construcción que provoca la producción de un ARN bicatenario pequeño, de modo que la expresión del gen del receptor de GluK2/GluK5 se inhibe específicamente (es decir, interferencia de ARN o ARNi). Los procedimientos para seleccionar un vector que codifica ARNbc o ARNbc adecuado son bien conocidos en la técnica para genes cuya secuencia es conocida (por ejemplo, véase, por ejemplo, Tuschl, T. y col. (1999); Elbashir, S. M. y col. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. Y col. (2002); Brummelkamp, TR. Y col. (2002); Pat. EE. UU. N .° 6.573.099 y 6.506.559; y las publicaciones de patente internacional n .° WO 01/36646, WO 99/32619 y WO 01/68836).

Las ribozimas también pueden funcionar como inhibidores de la expresión del gen del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en la presente invención. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguida de la escisión endonucleolítica. Las moléculas de ribozima con motivo de horquilla o cabeza de martillo modificadas genéticamente que catalizan específica y eficazmente la escisión endonucleolítica de las secuencias de ARNm del receptor de GluK2/GluK5 son, por lo tanto, útiles dentro del alcance de la presente invención. Los sitios de escisión de ribozimas específicos dentro de cualquier diana de ARN potencial se identifican inicialmente mediante el escaneo de la molécula diana en busca de sitios de escisión de ribozimas, que típicamente incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias de ARN cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión pueden evaluarse para determinar las características estructurales predichas, tales como la estructura secundaria, que pueden hacer que la secuencia de oligonucleótidos sea inadecuada. La idoneidad de las dianas candidatas también se puede evaluar probando su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, utilizando, por ejemplo, ensayos de protección de ribonucleasa.

Tanto los oligonucleótidos antisentido como las ribozimas útiles como inhibidores de la expresión génica del receptor de GluK2/GluK5 se pueden preparar mediante procedimientos conocidos. Estos incluyen técnicas para la síntesis química tales como, por ejemplo, mediante síntesis química de fosforamadita en fase sólida. De manera alternativa, las moléculas de ARN antisentido se pueden generar mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Dichas secuencias de ADN se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados, tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Se pueden introducir diversas modificaciones en los oligonucleótidos de la invención como un medio para aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Posibles modificaciones incluyen, entre otras, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro de la estructura principal del oligonucleótido.

Los ARNip y ribozimas de oligonucleótidos antisentido de la invención se pueden administrar in vivo solos o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ARNip de oligonucleótido antisentido o ácido nucleico de ribozima a las células y preferiblemente células que expresan el receptor de GluK2/GluK5. Preferentemente, el vector transporta el ácido nucleico a células con degradación reducida en relación con el grado de degradación que daría como resultado la ausencia del vector. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, entre otros, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes virales o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico de ribozima o ARNip de oligonucleótido antisentido. Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, entre otros, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina de Moloney, el virus del sarcoma murino de Harvey, el virus del tumor mamario murino y el virus del sarcoma de Rouse; adenovirus, virus adenoasociados; virus de tipo SV40; virus de polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de vaccinia; virus de la polio; y virus de ARN tal como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la técnica.

Los vectores virales preferidos se basan en virus eucariotas no citopáticos donde los genes no esenciales se han reemplazado con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus (por ejemplo, lentivirus), cuyo ciclo de vida implica la transcripción inversa del ARN viral genómico en ADN con la posterior integración proviral en el ADN celular del huésped. Los retrovirus han sido aprobados para ensayos de terapia génica en humanos. Los más útiles son aquellos retrovirus que son deficientes en replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retrovirales genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de genes de alta eficiencia in vivo. Los protocolos estándar para producir retrovirus deficientes en replicación (que incluyen las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una célula de empaquetamiento revestida con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular de empaquetamiento, recolección de partículas virales de medios de cultivo de tejidos e infección de las células diana con partículas virales) se proporcionan en Kriegler, 1990 y en Murry, 1991).

Los virus preferidos para ciertas aplicaciones son los adenovirus y los virus adenoasociados, que son virus de ADN bicatenario que ya han sido aprobados para uso humano en terapia génica. El virus adenoasociado puede diseñarse para ser deficiente en la replicación y es capaz de infectar una amplia gama de tipos y especies celulares. Además, tiene ventajas como la estabilidad al calor y a los solventes lipídicos; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluidas las células hematopoyéticas; y la falta de inhibición de la superinfección, lo que permite múltiples series de transducciones. Según se informa, el virus adenoasociado puede integrarse en el ADN celular humano de una manera específica del sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis de inserción y la variabilidad de la expresión génica insertada característica de la infección retroviral. Además, las infecciones por virus adenoasociados de tipo salvaje se han seguido en cultivo de tejidos durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un evento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de manera extracromosómica.

Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la materia y son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sam- brook y col., 1989. En los últimos años, los vectores plasmídicos se han utilizado como vacunas de ADN para administrar genes que codifican antígenos a las células in vivo. Son particularmente ventajosos para esto porque no tienen los mismos problemas de seguridad que con muchos de los vectores virales. Sin embargo, estos plásmidos, que tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido de un gen codificado operativamente dentro del plásmido. Algunos plásmidos comúnmente utilizados incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript. Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos en la materia. Además, los plásmidos pueden diseñarse a medida utilizando enzimas de restricción y reacciones de ligación para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN. Los plásmidos pueden administrarse mediante una variedad de vías parenterales, mucosas y tópicas. Por ejemplo, el plásmido de ADN puede inyectarse por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea u otras vías. También puede administrarse mediante aerosoles o gotas intranasales, supositorio rectal y por vía oral. También se puede administrar en la epidermis o en una superficie de la mucosa utilizando una pistola de genes. Los plásmidos pueden administrarse en una solución acuosa, secarse sobre partículas de oro o en asociación con otro sistema de administración de ADN que incluye, entre otros, liposomas, dendrímeros, cocleato y microencapsulación.

En una realización preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico del oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhc o ribozima está bajo el control de una región reguladora heteróloga, por ejemplo, un promotor heterólogo. El promotor puede ser específico para células gliales de Muller, células de la microglía, células endoteliales, células de pericitos y astrocitos. Por ejemplo, se puede obtener una expresión específica en células gliales de Muller a través del promotor del gen de la glutamina sintetasa. El promotor también puede ser, por ejemplo, un promotor viral, tal como un promotor de CMV o cualquier promotor sintético.

Con el fin de probar la funcionalidad del supuesto antagonista del receptor de GluK2/GluK5 en la epilepsia, se realizarán pruebas in vitro e in vivo. Para las pruebas in vitro, se utilizarán cultivos de cortes corticales y de hipocampo organotípicos, ya que este modelo in vitro es muy adecuado para estudiar la actividad epileptiforme espontánea [Albus y col., 2013; Dyhrfjeld-Johnsen y col., 2010;Zimmer y Gahwiler, 1984]. También se pueden utilizar pruebas in vitro como se explica en Barberis y col, 2008, o en Pinheiro y col, 2013 para probar el efecto del supuesto antagonista sobre la función de GluK2/GluK5 recombinante. Para las pruebas in vivo, los experimentos se pueden realizar utilizando un modelo animal de epilepsia del lóbulo temporal (por ejemplo, el modelo de epilepsia de estado de pilocarpina en ratas o ratones) [Loscher, 2002]. La prueba sobre el supuesto antagonista del receptor de GluK2/GluK5 se llevará a cabo durante la fase crónica de la epilepsia del lóbulo temporal, es decir, varios meses después del estado epiléptico inaugural. La prueba comparativa del antagonista del receptor de GluK2/GluK5 en las descargas cardinales interictal e ictal se realizará utilizando registros electroencefalográficos telemétricos (EEG) corticales o intrahipocampales continuos (24 h por día).

El compuesto, vector o composición farmacéutica de la invención se utiliza en un procedimiento para tratar o prevenir la epilepsia. El procedimiento puede comprender administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de o un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 como se define en las reivindicaciones.

Los compuestos de la invención se pueden administrar en forma de una composición farmacéutica, como se define a continuación.

Por lo tanto, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz de un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) para su uso en el tratamiento o prevención de la epilepsia.

En una realización, la composición farmacéutica según la invención contiene adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición como se describe a continuación se usa para tratar o prevenir la epilepsia.

Por una "cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende una cantidad suficiente de compuesto para tratar y/o prevenir la epilepsia.

Se entenderá que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención será decidido por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está dentro de la habilidad de la técnica iniciar dosis del compuesto en niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1000 mg por adulto por día. Preferentemente, las composiciones contienen 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del principio activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar. Un medicamento contiene típicamente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del principio activo, preferentemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del principio activo. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra normalmente a un nivel de dosis de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por día.

Cualquier agente terapéutico de la invención se puede combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.

«Farmacéuticamente» o «farmacéuticamente aceptable» se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según proceda. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un relleno, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido no tóxico de cualquier tipo.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen dependen naturalmente de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para una administración tópica, oral, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea y similares.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estos pueden ser, en particular, soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administración se pueden adaptar según varios parámetros, y en particular según el modo de administración utilizado, de la patología relevante o, alternativamente, de la duración deseada del tratamiento.

Además, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración por vía oral; cápsulas de liberación prolongada; y actualmente se puede usar cualquier otra forma.

En una realización, el compuesto o la composición según la invención puede administrarse directamente en el cerebro para alcanzar directamente las neuronas y/o los astrocitos.

Los procedimientos de administración del compuesto o la composición de la invención a neuronas y/o astrocitos incluyen generalmente cualquier procedimiento adecuado para administrar el compuesto o la composición de la invención a las neuronas y/o astrocitos de modo que se transduce al menos una porción de células de una población celular seleccionada conectada sinápticamente. El compuesto o la composición de la invención pueden administrarse a cualquier célula del sistema nervioso central, o a ambas. En general, el compuesto o la composición de la invención se administra a las células del sistema nervioso central, que incluyen, por ejemplo, células de gránulos dentados, células de la médula espinal, tronco encefálico (médula, protuberancia y mesencéfalo), cerebelo, diencéfalo (tálamo, hipotálamo), telencéfalo (hipocampo, cuerpo estriado, corteza cerebral o, dentro de la corteza, los lóbulos occipital, temporal, parietal o frontal), o combinaciones de los mismos, o preferentemente cualquier subpoblación adecuada de los mismos. Otros sitios preferidos para la administración incluyen el núcleo ruber, el cuerpo amigdalino, la corteza entorrinal y las neuronas en ventralis lateralis, o en los núcleos anteriores del tálamo.

Para administrar el compuesto o la composición de la invención específicamente a una región particular y a una población particular de células del SNC, el compuesto o la composición de la invención pueden administrarse mediante microinyección estereotáxica. Por ejemplo, los pacientes tienen la base del marco estereotáctico fijada en su lugar (atornillada en el cráneo). Se obtienen imágenes del cerebro con base de marco estereotáctico (IRM compatible con marcas fiduciales) mediante IRM de alta resolución. A continuación, las imágenes de resonancia magnética se transfieren a un ordenador que ejecuta software estereotáctico. Se utilizan una serie de imágenes coronales, sagitales y axiales para determinar la diana (sitio de inyección del compuesto o composición) y la trayectoria. El software traduce directamente la trayectoria en coordenadas tridimensionales apropiadas para el marco estereotáctico. Los orificios de trepanación se perforan por encima del sitio de entrada y el aparato estereotáctico se coloca con la aguja implantada a la profundidad dada. El compuesto o la composición de la invención se inyecta a continuación en los sitios diana.

Las vías de administración adicionales también pueden comprender la aplicación local del compuesto o la composición de la invención bajo visualización directa, por ejemplo, aplicación cortical superficial u otra aplicación no estereotáctica. El compuesto o la composición de la invención puede administrarse por vía intratecal, en los ventrículos o por inyección intravenosa.

Las células diana del compuesto o la composición de la invención de la presente invención son células del sistema nervioso central de un sujeto afectado por la enfermedad de la epilepsia. Preferentemente, el sujeto es un ser humano, generalmente un adulto.

Sin embargo, el procedimiento de administración abarca administrar el compuesto o la composición de la invención a modelos biológicos de la enfermedad. En ese caso, el modelo biológico puede ser cualquier mamífero en cualquier etapa de desarrollo en el momento del parto, por ejemplo, embrionario, fetal, infantil, juvenil o adulto, preferentemente es un adulto. Además, las células diana del SNC pueden ser esencialmente de cualquier fuente, especialmente primates y mamíferos no humanos de los órdenes Rodenta (ratones, ratas, conejos, hámsteres), Carnivora (gatos, perros) y Arteriodactyla (vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos), así como cualquier otro sistema no humano (por ejemplo, sistema modelo de pez cebra).

Preferentemente, el procedimiento de administración comprende la administración intracerebral a través de inyecciones estereotáxicas. Sin embargo, también se pueden adaptar otros procedimientos de administración conocidos según la invención. Por ejemplo, para una distribución más generalizada del compuesto o la composición de la invención a través del SNC, se puede inyectar en el líquido cefalorraquídeo, por ejemplo, mediante punción lumbar. Para dirigir el compuesto o la composición de la invención al sistema nervioso periférico, se puede inyectar en la médula espinal o en los ganglios periféricos, o en la carne (por vía subcutánea o intramuscular) de la parte del cuerpo de interés. En determinadas situaciones, el compuesto o la composición de la invención se puede administrar a través de un enfoque intravascular. Por ejemplo, el compuesto o la composición de la invención se pueden administrar por vía intraarterial (carótida) en situaciones donde la barrera hematoencefálica se altera o no se altera. Además, para una administración más global, el compuesto o la composición de la invención se pueden administrar durante la "apertura" de la barrera hematoencefálica lograda mediante infusión de soluciones hipertónicas que incluyen manitol.

Alternativamente, el compuesto de la invención se puede identificar adicionalmente mediante procedimientos de selección como se describe a continuación.

La descripción proporciona un procedimiento para seleccionar un compuesto que es un antagonista del receptor de GluK2/GluK5 o un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5.

En particular, la descripción proporciona un procedimiento para seleccionar un compuesto que es un antagonista del receptor de GluK2/GluK5 o un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento de la epilepsia.

Por ejemplo, el procedimiento de selección puede medir la unión de un compuesto candidato al receptor de GluK2/GluK5, o a células o membranas que portan el receptor de GluK2/GluK5 o una proteína de fusión del mismo por medio de una etiqueta directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Como alternativa, un procedimiento de detección puede implicar medir o, cualitativa o cuantitativamente, detectar la competencia de la unión de un compuesto candidato al receptor con un competidor marcado (por ejemplo, antagonista).

El procedimiento de cribado puede comprender la etapa que consiste en:

a) proporcionar una pluralidad de células que expresan el receptor de GluK2/GluK5:

b) incubar dichas células con un compuesto candidato;

c) determinar si dicho compuesto candidato se une al receptor de GluK2/GluK5; y

d) seleccionar el compuesto candidato que antagoniza el receptor de GluK2/GluK5 o que impide la activación del receptor de la vía o que impide la formación del complejo heteromérico GluK2/GluK5.

En general, dichos procedimientos de detección implican proporcionar células apropiadas que expresan el receptor de GluK2/GluK5, sus ortólogos y derivados de los mismos en su superficie. En particular, los ácidos nucleicos que codifican los subconjuntos del receptor GluK2 y GluK5 pueden emplearse para cotransfectar células para expresar así el receptor de GluK2/GluK5. Dicha transfección puede lograrse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

Las células pueden ser células neuronales.

Un compuesto candidato puede seleccionarse de una biblioteca de compuestos sintetizados previamente, o una biblioteca de compuestos para los cuales la estructura se determina en una base de datos, o de una biblioteca de compuestos que se han sintetizado de novo o compuestos naturales.

El compuesto candidato puede seleccionarse del grupo de (a) proteínas o péptidos, (b) ácidos nucleicos y (c) compuestos orgánicos o químicos (naturales o no). De manera ilustrativa, las bibliotecas de ácidos nucleicos candidatos preseleccionados se pueden obtener mediante la realización del procedimiento SELEX como se describe en los documentos US 5.475.096 y US 5.270.163. De manera ilustrativa adicional, el compuesto candidato puede seleccionarse del grupo de anticuerpos dirigidos contra el receptor de GluK2/GluK5.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

FIGURAS:

Figura 1: Actividad epileptiforme reducida en la circunvolución dentada (dentate gyrus) de cortes organotípicos de ratones GluK2-/-.(A) Frecuencia de actividad epileptiforme registrada en cortes WT y GluK2-/-. ***P<0,001 mediante la prueba U de Mann-Whitney (n=32 y n=25 cortes, respectivamente). (B) Análisis del espectro de potencia (izquierda) de las PD filtradas y potencia máxima en cada grupo (derecha). P>0,05 por la prueba U de Mann-Whitney (n=32 y n=25 cortes). (C) Análisis del espectro de potencia (izquierda) de MB filtradas y potencia máxima en cada grupo (derecha). **P<0,01 mediante la prueba U de Mann-Whitney (n=32 y n=25 cortes por grupo). En esta y siguientes figuras: barras de error = sem.

Figura 2: Los antagonistas del receptor de kainato disminuyen la actividad epileptiforme en la circunvolución dentada (dentate gyrus) de cortes organotípicos de ratones WT.(A) Frecuencia de actividad epileptiforme registrada en presencia y ausencia de 5 pM UBP310 (*P<0,05, n=32 y n=11) o 10 pM SYM2081 (*P<0,05, n=32 y n=10); prueba U de Mann-Whitney. (B) Análisis del espectro de potencia de las PD filtradas (izquierda) y el valor máximo de la potencia (derecha). P>0,05 mediante la prueba U de Mann-Whitney (n=10-32 cortes por grupo). (C) Análisis del espectro de potencia de las MB filtradas (izquierda) y potencia máxima en cada grupo (derecha). ***P<0,001, *P<0,05 por la prueba U de Mann-Whitney (n=10-32 cortes por grupo).

Figura 3: Las EPSC con cinética lenta son determinantes importantes de la actividad epileptiforme.(A) Frecuencia de la actividad epileptiforme. ***P<0,001 por la prueba U de Mann-Whitney (n=32 en WT, n=25 en GluK2-/- y n=10 en GluK2-/- CTZ). (B) Análisis del espectro de potencia de MB filtradas. *P<0,05 mediante la prueba U de Mann-Whitney.

Figura 4: Las ráfagas evocadas se reducen en la circunvolución dentada (dentate gyrus) de ratones GluK2-/- y por UBP310 en ratones WT.(A) Amplitud EPSC<ka>antes y después de UBP310 en cortes WT (A, **P<0,01 mediante la prueba de Wilcoxon, n=9). (B) Amplitud de EPSCampa antes y después de GYKI53655 en cortes de GluK2-/- (B,***P<0,001 mediante la prueba de Wilcoxon, n=11). (C) Índice medio de ráfaga de la costa en cortes WT antes y después de UBP310 o en cortes GluK2-/-. **P<0,01, ***P<0,001 mediante la prueba U de Mann-Whitney (n=5-11 cortes por grupo).

Figura 5: El número de picos interictales (IS) y descargas ictales disminuye in vivo en ratones GluK2-/-y por UBP310 en ratones WT. (A)Número de IS/min en ratones WT (n=14) y GluK2'/_ (n=8); *P=0,012 por prueba t no emparejada (izquierda). Número de IS/min antes (n=6) y después de 60 mg/kg de UBP310 (n=6); *P=0.0313 por prueba de Wilcoxon (derecha).(B)Gráfico circular que muestra la fracción de descargas ictal registradas en ratones WT (n=5) y GluK2'/_ (n=5) (193 y 55 descargas ictal en ratones WT y GluK2'/_, respectivamente)(izquierda). Número de descargas ictal en ratones WT (n=5) y GluK2'/_ (n=5) por día; *P=0.031 por prueba U de Mann-Whitney (medio). Número de descargas ictales antes y durante el tratamiento con 60 mg/kg de UBP310 (n=5); **P=0,005 por prueba t pareada (derecha).

EJEMPLO:

Materiales y procedimientos

Modelo de ratón de epilepsia del lóbulo temporal.

Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de cuidado y uso de animales del Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale del 29 de mayo de 2001 (2001-464) y la directiva del consejo de la com. conjunta europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC). Los ratones (antecedentes FVB/N) tuvieron acceso a alimentos y aguaad libitumy se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22-24 °C. A ratones GluK2-/- y WT macho (P60-80) se les administró escopolamina (1 mg/kg) por vía subcutánea (s.c.) 15 minutos antes de la administración s.c. de pilocarpina (200-600 mg/kg). Se utilizó un protocolo de rampa mediante el cual se administró a los animales una dosis inicial de 200 mg/kg, seguida de medias dosis cada 30 minutos hasta que aparecieron las convulsiones. Tanto los ratones WT como los GluK2-/- típicamente experimentaron al menos dos convulsiones antes de entrar en el estado epiléptico (SE). Se administró diazepam (10 mg/kg) 45 minutos después del inicio de SE.

Cultivo de cortes.

Se prepararon cortes de corteza hipocampal/entorrinal (350 pM) a partir de ratones GluK2-/- y WT pregenotipados (P9-10, antecedentes FVB/N) usando un cortador de tejido Mcllwain. Los cortes se colocaron en insertos de malla (Millipore # PICMORG50) dentro de placas de cultivo que contenían 1 ml del siguiente medio: MEM 50 %, HS 25 %, HBSS 25 %, HEPES 15 mM glucosa 6,5 mg/ml e insulina 0,1mg/ml. El medio de cultivo se cambió cada 2-3 días y los cortes se mantuvieron en una incubadora a 37 °C/5 % de CO2. Se añadió pilocarpina (0,5 pM) al medio a 5 D.I.V. y se retiró a 7 D.I.V.; se utilizaron cortes para los experimentos de 9 D.I.V.

Preparación de cortes agudos.

Se prepararon cortes de hipocampo a partir de ratones GluK2-/- y WT tratados con pilocarpina y de control, a los 5-9 meses de edad. Los animales se anestesiaron profundamente con xilazina 13 mg/kg / ketamina 66 mg/kg y se perfundieron transcardialmente con un líquido cefalorraquídeo artificial modificado (mACSF) que contenía lo siguiente (en mM): 132 colina, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 7 MgCl2, 0.5 CaCl2 y 8 D-glucosa antes de la decapitación. A continuación, se extrajo rápidamente el cerebro, se diseccionaron los hipocampos y se hicieron cortes transversales de 350 pM de espesor utilizando un vibratomo Leica VT1200S en mACSF oxigenado enfriado con hielo (95 % de O2 y 5 % de CO2). Los cortes se transfirieron a reposo a ~30 °C durante 30 min y a continuación a temperatura ambiente durante otros 30 min, en solución oxigenada que contenía 50 % de mACSF y 50 % de ACSF normal que contenía lo siguiente (en mM): 126 NaCl, 3,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,3 MgCl2, 2,0 CaCl2 y 10 D-glucosa, pH 7,4.

Registros y análisis electrofisiológicos.

Los cortes cultivados o agudos se transfirieron individualmente a una cámara de registro mantenida a 30-32 °C y se perfundieron continuamente (2 ml/min) con ACSF normal o adaptado oxigenado que contenía gabazina 5 pM. Los potenciales de campo locales se realizaron en la capa de células granulares de la DG con electrodos de vidrio (2-3 MS2; rellenos con ACSF normal) utilizando un amplificador DAM-80 (filtro bajo, 1 Hz; filtro de paso alto, 3 KHz; World Precision Instruments, Sarasota, FL). Para la transmisión sináptica evocada, la estimulación eléctrica se realizó con un electrodo bipolar de NiCh (#762000, sistemas AM). Los registros de abrazadera de voltaje de célula completa de los DGC se realizaron utilizando electrodos de sello hermético (5-8 MS2) llenos de una solución interna que contenía lo siguiente (en mM): 135 ácido glucónico, 135 CsOH, 10 MgCl2, 0,1 CaCl2, 1 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,4 NaGTP y 0,5 % de biocitina, pH 7,25. Utilizamos un amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices): los datos se filtraron a 2 kHz, se digitalizaron (20 kHz) con un Digidata 1440A (Molecular Devices) a un PC y se adquirieron utilizando el software Clam- pex 10.1 (PClamp, Molecular Devices). Las señales se analizaron fuera de línea utilizando Clampfit 9.2 (PClamp) y MiniAnalysis 6.0.1 (Synaptosoft, Decatur, GA). En los cortes organotípicos, se registraron EPSC espontáneas en el potencial de inversión de las corrientes GABAérgicas (Vh = -70 mV). Para caracterizar la naturaleza y las propiedades cinéticas de los eventos rápidos y lentos, se registraron EPSC en miniatura (mEPSC) evocadas en condiciones de Sr2+ (el Ca2+ externo se sustituyó con Sr2+ 1,2 mM) en DGC de cortes de GluK2-/- y WT. La estimulación eléctrica se realizó en la capa molecular en presencia continua de gabazina 5 jM y D-APV 40 |jM; las mEPSC asíncronas se midieron durante el período de 300 ms después del artefacto de estímulo. Los cortes cultivados WT mostraron espontáneas de descomposición lenta y mEPSC mediadas por KAR (Epsztein y col., 2005). Las mEPSC mediadas por KAR fueron insensibles al antagonista de AMPAR GYKI53655 y se abolieron en presencia del antagonista de KAR de amplio espectro SYM2081 (10 jM (Epsztein y col., 2005; Epsztein y col., 2010; Artinian y col., 2011) o 5 jM UBP310, un potente antagonista de KAR en las sinapsis de fibra musgosa-CA3 (Pinheiro y col., 2013). Estos eventos estuvieron ausentes en los cortes de GluK2-/- (datos no mostrados); las EPSC rápidas restantes fueron completamente bloqueadas por el antagonista de AMPAR GYKI53655 (30 jM ) en los cortes de GluK2-/- (datos no mostrados). En los cortes cultivados, la representación visual del análisis de tiempo-frecuencia de los potenciales de campo locales se realizó utilizando el software Autosignal (Seasolve 1.7). En resumen, la actividad de campo se filtró por paso alto (>100 Hz) y el análisis de tiempo-frecuencia se realizó utilizando una ondícula continua (Morlet) que informó la potencia integrada (amplitud al cuadrado de la integral de tiempo, TISA) a lo largo del tiempo. Las trazas filtradas también se analizaron mediante análisis de Fourier (Hamming) utilizando Clampfit 9.2. En los cortes agudos del hipocampo, la intensidad de las ráfagas evocadas antidrómicamente se cuantificó utilizando el índice de la costa (Epsztein y col., 2005).

Análisis electrofisiológico in vivo.

Ratones sin tratamiento previo de tipo salvaje (WT) y tratados con pilocarpina WT o GluK2-/- (5-6 meses de edad) se anestesiaron con xilazina 13 mg/kg / ketamina 66 mg/kg y se colocaron en un marco estereotáxico (se administró una dosis suplementaria según necesario). La temperatura corporal se mantuvo usando una almohadilla térmica. Se retiró el cuero cabelludo y se perforó una pequeña ventana ósea por encima del hipocampo (2,1 mm posterior al bregma y 1,4 mm lateral a la línea media sobre el hemisferio derecho). Para los registros de potenciales de campo locales realizados en ratones anestesiados, se insertó un electrodo de vidrio (~5 mS2) lleno de solución de Ringer (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1,8 mM, HEPES 5 mM) en el DG (profundidad, 1650 jM ). Los registros se realizaron utilizando un amplificador DAM-80 (filtro bajo, 1 Hz; filtro alto, 3 KHz; World Precision Instruments, Sarasota, FL). UBP310 o vehículo (solución salina/DMSO al 10 %) se inyectó posteriormente por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los registros y el análisis posterior, el experimentador fue ciego al genotipo. Para los registros electroencefalográficos (EEG) intrahipocampales realizados en animales que se mueven libremente, se insertó un electrodo de acero inoxidable (Plastic One, Roanoke, VA) en la DG bajo anestesia (véase más arriba). Después de una recuperación de 4 días, se controló el EEG (amplificado (1000X), filtrado a un paso de 0,16-97 Hz, adquirido a 500 Hz) utilizando un sistema telemétrico (Data Sciences International, St. Paul, MN) durante 4 días, 24 h por día. Las trazas de EEG intrahipocampal representaron la diferencia de potencial entre el electrodo insertado en el DG y un electrodo colocado sobre el cerebelo; se proporcionaron alimentos y agua ad libitum. Se inyectó UBP310 o vehículo (solución salina/DMSO al 10 %) por vía intraperitoneal dos veces al día.

Tinción de fibras musgosas - sinaptoporina: Los cortes organotípicos cultivados se fijaron e incubaron con anticuerpo primario contra sinaptoporina (SPO: Synaptic systems, 1:300) en PBS que contiene albúmina de suero bovino (1 %) y suero de cabra normal (5 %) durante 2 días a 4 °C con agitación. Los cortes a continuación se lavaron, se colocaron en el anticuerpo secundario Alexa555 (Invitrogen 1:500) durante 2 horas y se contratiñeron con Neurotracer fluorenscent Nissl (invitrogen). Se visualizó la inmunofluorescencia SPO utilizando un microscopio confocal Zeiss y se evaluó el análisis cuantitativo de la densidad óptica (DO) de la fluorescencia en las capas de células moleculares y granulares utilizando un programa ImageJ personalizado (T. Tressard, INMED, INSERM U901). Solo se utilizaron para el análisis los cortes que mostraron fluorescencia clara en el estrato lúcido. También se realizaron mediciones en el subículo, una región con niveles de tinción consistentemente bajos, para determinar la fluorescencia de fondo y posteriormente se restaron para tener en cuenta la variabilidad en la tinción de SPO en cortes individuales. Todos los análisis se realizaron a ciegas utilizando cortes de ratones GluK2-/- y WT; se calculó la DO media de fluorescencia en el gránulo y las capas moleculares para cada grupo.

Revelación de biocitina y Prox1 de DGC.

Como los cultivos de cortes organotípicos muestran cierta dispersión de DGC, las células que se registraron en configuración de células completas se llenaron con biocitina y posteriormente se marcaron con Prox1, un marcador de células granulares; las células negativas para prox1 se excluyeron del análisis electrofisiológico. Los cortes se fijaron y a continuación se permeabilizaron (Triton al 0,5 %) en solución de bloqueo que contenía suero de cabra normal (NGS) al 5 % en Triton al 0,5 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cortes a continuación se incubaron en el anticuerpo policlonal de conejo anti-Poxl (Millipore) a 1:2000 en NGS al 5%en Tritón al 0,5%durante la noche a 4 °C. Los cortes se incubaron durante 2 horas en anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488, invitrogen) y a continuación se cubrieron en fluoromount. Para la revelación de biocitina, los cortes se fijaron, lavaron y a continuación se incubaron durante la noche (4 °C) con estreptavidina conjugada con Cy3 (Jackson) diluida 1:500 en una solución que contenía NGS al 2 % y Triton al 0,3 %.

Análisis estadísticos.

Todos los valores se dan como medias SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism (software GraphPad, versión 5.01). Para la comparación entre grupos con distribución normal, se utilizó la prueba t de Student de dos muestras no emparejadas o emparejadas para dos grupos. Cuando los datos no se distribuyeron normalmente, se utilizó la prueba de suma de intervalos de Mann-Whitney (para datos no emparejados) o la prueba de suma de intervalos de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras (para datos emparejados). Los valores porcentuales indicados en el texto se calculan utilizando datos emparejados, excepto cuando se comparan los grupos WT y GluK2-/-.

Agentes farmacológicos.

La gabazina (SR-95531); D-APV; GYKI53655; SYM2081 y DCGIV se adquirieron en Tocris Bioscience. La ciclotiazida y UBP310 se adquirieron en ABCAM. El nitrato de metilo de escopolamina y el clorhidrato de pilocarpina se adquirieron en sigma, el diazepam en Roche.

Resultados

La eliminación de los KAR reduce la actividad epileptiforme en la DG en cortes organotípicos

En un primer intento de dilucidar si los KAR desempeñan algún papel en las descargas epileptiformes espontáneas en la DG, utilizamos cultivos de cortes de hipocampo organotípicos tratados con pilocarpina. Este modelo in vitro es muy adecuado para estudiar el brote de fibras musgosas y la actividad epileptiforme espontánea (Zimmer y Gahwiler, 1984; McBain y col., 1989; Gutiérrez y Heinemann, 1999; Thomas y col., 2005; Dyhrfjeld-Johnsen y col., 2010; Grabs y col., 1994; Albus y col., 2013). Observamos un brote similar de fibras musgosas en cortes WT (n=32) y GluK2-/-(n=27) después de la incubación con pilocarpina, según lo revelado por la tinción con sinaptoporina (SPO) (Grabs y col., 1994) (ver procedimientos) (OD: 26,1 ± 2,9 en WT y 25,0 ± 3,0 en GluK2-/-, P>0,05, datos no mostrados). En consecuencia, la frecuencia de las corrientes postinápticas excitadoras en curso (EPSC) fue similar en las DGC de los cortes WT y GluK2-/- (P>0,05, no se muestra). En roedores epilépticos crónicos, pero no en animales sin tratamiento previo, se producen eventos sinápticos lentos mediados por KAR en las DGC debido a fibras musgosas recurrentes (Epsztein y col., 2005; Epsztein y col., 2010; Artinian y col., 2011). Confirmamos que los cortes organotípicos de ratones WT también mostraron EPSC espontáneas y en miniatura de descomposición lenta mediadas por KAR (ver procedimientos; datos no mostrados). Estos eventos estuvieron ausentes en los cortes de GluK2-/- destacando la importancia del subconjunto GluK2 en la actividad sináptica aberrante; las EPSC rápidas restantes fueron mediadas por AMPAR (datos no mostrados). Se confirmó que las KAR-EPSC se generaron en las sinapsis de fibra musgosa recurrentes utilizando el agonista de mGluR del grupo II DCGIV (Feng y col., 2003; Epsztein y col., 2005) (datos no mostrados).

A continuación, se probó el papel de los KAR en la actividad epileptiforme espontánea utilizando registros de campo extracelulares en cortes cultivados. Los registros se realizaron en ACSF que contenía K+ 5 mM y en presencia de gabazina 5 pM para mejorar la excitabilidad neuronal y registrar de manera confiable la actividad interictal espontánea estereotipada (Berdichevsky y col., 2012). Según informes anteriores, la actividad de tipo interical consistió en dos fases distintas: en primer lugar, la descarga paroxística (EP) seguida de una fase tardía que contenía múltiples ráfagas recurrentes (MB) (McBain y col., 1989; Gutiérrez y Heinemann, 1999; Thomas y col., 2005; Dyhrfjeld-Johnsen y col., 2010) (datos no mostrados). La frecuencia de la actividad de tipo interictal se redujo notablemente en cortes cultivados de ratones GluK2-/-, en un 46 % en comparación con WT (eventos/min: de 3,2 ± 0,4 en WT a 1,7 ± 0,3 en GluK2-/-) (Figura 1A). La actividad de tipo interictal anidó oscilaciones patológicas de alta frecuencia con un intervalo de frecuencia máxima de 250-300 Hz (n=32) (datos no mostrados) según lo observado anteriormente (Bragin y col., 2004; Dyhrfjeld-Johnsen y col., 2010). Estudiamos el poder de la actividad patológica de alta frecuencia dentro de las dos fases de la actividad de tipo interictal. La actividad se visualizó mediante filtrado de paso alto (datos no mostrados) y mediante representaciones de tiempo-frecuencia (no mostradas). El análisis de potencia no reveló ninguna alteración<en la fase>P<d de la actividad (Figura 1B). Por el contrario, la potencia durante la fase tardía de las MB se redujo>notablemente en un 77 % en ratones GluK2-/- (Figura 1C).

El papel de los KAR en la actividad de tipo interictal de los cortes cultivados se evaluó farmacológicamente utilizando SYM2081, un antagonista de KAR de amplio espectro (Epsztein y col., 2005; Epsztein y col., 2010; Artinian y col., 2011) o UBP310, un potente antagonista de GluK2/GluK5 KAR postsináptico en las sinapsis de fibra-CA3 musgosa (Pinheiro y col., 2013). En cortes de ratones WT, la frecuencia de actividad de tipo interictal se redujo significativamente en presencia de antagonistas de KAR: en un 47 % en SYM2081 (eventos/min: 3,2 ± 0,4 vs 1,69 ± 0,3 en SYM2081) y en un 49%en UBP310 (1,47 ± 0,4 en UBP310) (Figura 2A). Se observó una reducción similar de la actividad de tipo interictal en presencia de UBP310 en cortes donde se realizaron cortes para aislar la DG (datos no mostrados), lo que indica que la actividad se originó y se propagó dentro de la propia DG. No se observó ninguna alteración significativa de la fase PD en presencia de SYM2081 o UBP310 (Figura 2B). Por el contrario, la fase de MB tardía se interrumpió significativamente en presencia de antagonistas de KAR; el poder de las ráfagas se redujo en un 68 % en SYM2081 y en un 67 % en UBP310 (Figura 2C). En apoyo de la importancia del subconjunto GluK2, observamos que (i) no hubo efecto sobre la actividad de tipo interictal en presencia de UBP310 en ratones GluK2-/-(P=0.563, n=7); (ii) la frecuencia de la actividad de tipo interictal fue similar en los cortes de ratones GluK1-/- y WT (P=0.936, n=6) en contraste con los ratones GluK2-/-. (iii) UBP310 fue igualmente eficaz para reducir la frecuencia de la actividad de tipo interictal en ratones WT y GluK1-/- (P=0,902, n=6).

Una de las características específicas de las EPSC mediadas por KAR en comparación con las mediadas por AMPAR es su cinética lenta (Castillo y col., 1997; Frerking y col., 1998; Bureau y col., 2000; Ben-Ari y Cossart, 2000; Epsztein y col., 2005; Zhang y col., 2009; Copits y col., 2011). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que esta característica en particular probablemente sería un determinante importante de la actividad de tipo interictal. Para probar principalmente la hipótesis de la cinética, utilizamos ciclotiazida (CTZ) para ralentizar la cinética de descomposición de las EPSC mediadas por AMPAR y, por lo tanto, para imitar la cinética lenta de las EPSC mediadas por KAR en células DG, en ratones GluK2-/- que carecen de eventos sinápticos lentos (datos no mostrados). La actividad de tipo interictal reducida observada con registros de potencial de campo extracelular en cortes de GluK2-/- se pudo recuperar con la aplicación de baño de CTZ (Figura 3A/B). Esto muestra que los eventos sinápticos con cinética lenta son importantes para la génesis de la actividad de tipo interictal.

Por lo tanto, estos experimentos demuestran que los KAR que contienen los subconjuntos GluK2/GluK5 desempeñan un papel central en la actividad de tipo interictal en este modelo in vitro de TLE.

La participación de KAR en la actividad de ráfaga es impulsada por fibras musgosas recurrentes en DG

Los experimentos realizados en cortes cultivados han proporcionado una fuerte evidencia de un papel de los KAR en las descargas epileptiformes en la DG. A continuación, preguntamos si esta constatación podría establecerse en un modelo animal de TLE. Con este fin, se realizaron experimentos en ratones WT o GluK2-/- tratados con pilocarpina varios meses después del estado epiléptico inaugural (ver procedimientos). En estas condiciones, se observó un brote similar de fibras musgosas en ratones WT (n=33) y GluK2-/- (n=25) (OD: 15,9 ± 1,1 en WT y 20,9 ± 3,9 en GluK2-/-, P>0,05, datos no mostrados) pero no en condiciones sin tratamiento previo (datos no mostrados) como se revela por la tinción SPO (Grabs y col., 1994). Esto indica que GluK2 no juega un papel en el establecimiento de conexiones de fibra musgosa recurrentes en el modelo de pilocarpina de TLE según los hallazgos en cortes cultivados. En consecuencia, los registros en cortes agudos de hipocampo varios meses después del estado epiléptico inaugural, revelaron una frecuencia similar de EPSC en curso en DGC de cortes WT y GluK2-/- (P>0.05, no se muestra). Al estimular en el tercio interno de la capa molecular y, por lo tanto, dirigirse a las fibras musgosas brotadas, las EPSC<mediadas por KAR se pudieron registrar en DGC de>W<t>,<mientras que solo se registraron EPSC mediadas por AMPA>en DGC de cortes de GluK2-/- (Figura 4A/B). Las EPSC mediadas por KAR se generaron en las sinapsis de fibra musgosa, ya que fueron fuertemente inhibidas por DC-GIV (1 pM, en un 84 %, datos no mostrados). A continuación, probamos el papel de los KAR en la actividad epileptiforme impulsada por fibras musgosas recurrentes. Las ráfagas fueron evocadas por la estimulación antidrómica de la vía de la fibra musgosa en el área CA3b mientras se registraban los potenciales de campo locales en la capa DGC (datos no mostrados). En ratones WT, el bloqueo de los KAR mediante la aplicación en baño de UBP310 redujo fuertemente las ráfagas (en un 55 %) (ver procedimientos) (Figura 4C). Por consiguiente, las ráfagas fueron significativamente menores en ratones GluK2-/- en comparación con WT (reducidos en un 63 %) (Figura 4C).

Por lo tanto, los KAR que contienen los subconjuntos GluK2/GluK5 desempeñan un papel central en la actividad de ráfaga impulsada por fibras musgosas recurrentes en la DG.

La frecuencia de los picos interictales y las descargas ictales in vivo se reducen en ausencia de KAR

En TLE, los picos interictales (IS -interictal spikes)representan uno de los biomarcadores de epilepsia mejor documentados en modelos de pacientes y animales (Staley y col., 2005). Intentamos extender nuestros hallazgos in vitro al modelo de animal completo y preguntamos si los KAR están involucrados en este tipo de actividad patológica crónica en TLE en la DG. Los registros de potencial de campo local se realizaron in vivo en ratones anestesiados sin tratamiento previo y tratados con pilocarpina. Como se informó anteriormente (Turski y col., 1984), los registros de ratones epilépticos WT mostraron numerosos IS (137,2 27,9 IS/min) varios meses después de la inauguración del estado epiléptico, pero este tipo de actividad nunca se observó en animales sin tratamiento previo (n=5). De manera notable, en ratones GluK2-/-, el número de IS se redujo fuertemente en un 84 % en comparación con WT (21,6 7,5 IS/min, Figura 5A). Esta reducción no se asoció con un cambio significativo en la amplitud de IS (datos no mostrados). A continuación, probamos los efectos de un antagonista de KAR en ISS. La inyección intraperitoneal de 60 mg/kg de UBP310 redujo significativamente el número de IS (en un 64 %) (Figura 5A) sin cambios en la amplitud (datos no mostrados). Cuando la dosis inyectada de UBP310 se redujo 10 veces, no hubo un efecto significativo del fármaco sobre el número de IS (P=0,548). No se observó ningún efecto significativo con la inyección de vehículo (datos no mostrados). Además, en apoyo de la importancia del subconjunto GluK2, no hubo efecto sobre el número de IS al inyectar UBP310 (60 mg/kg) en ratones GluK2-/- (P=0,497, datos no mostrados).

En la epilepsia del lóbulo temporal, la actividad electroencefalográfica fisiopatológica cardinal (EEG) son descargas ictales recurrentes que se originan en estructuras límbicas, incluido el hipocampo, y que conducen a manifestaciones clínicas incapacitantes profundas. Estos eventos ictales se deben a una actividad neuronal hipersíncrona anormal y de larga duración (decenas de segundos). Para probar definitivamente el papel de los KAR en las descargas ictales, se realizaron registros de EEG intrahipocampales en la DG de ratones tratados con pilocarpina WT y GluK2-/- que se movían libremente varios meses después de la inauguración del estado epiléptico. El EEG se monitoreó continuamente durante varios días utilizando un sistema telemétrico (procedimientos ee). Los ratones WT mostraron numerosas descargas ictales (9,6 2,3 por día) que duraron 36,9 1,8 s (n=5) e incluyeron fases tónicas y clónicas. Estos eventos ictales correspondieron a las convulsiones tónico-clónicas generalizadas bien descritas con convulsiones motoras y pérdida de control postural (no se muestra). Al comparar los ratones WT y GluK2-/-, observamos una fuerte reducción del número de eventos ictales (en un 71 %, Figura 5B) sin un cambio significativo en su duración (P>0,05). La reducción de las descargas ictales observadas en ratones GluK2'/_ se corroboró mediante el uso de UBP310. De hecho, las inyecciones intraperitoneales durante 3 días de UBP310 (60 mg/kg, ver procedimientos) redujeron significativamente el número de eventos ictales (en un 41 %) (Figura 5B) sin un cambio significativo en su duración (P=0,286). No se observó ningún efecto significativo con la inyección de vehículo (datos no mostrados).

Por lo tanto, los KAR están involucrados de manera crucial en la generación de IS y descargas ictales in vivo en ratones epilépticos. En conjunto, estos experimentos demuestran que los KAR aberrantes que contienen los subconjuntos GluK2/GluK5 desempeñan un papel importante en la actividad epiléptica en la fase crónica de la TLE.

Conclusión:

Los inventores muestran por el momento que el receptor de GluK2/GluK5 heteromérico, que es un receptor con propiedades farmacológicas diferentes a los receptores de GluK2 homoméricos o el receptor de GluKI, desempeña un papel importante en la epilepsia y especialmente en la epilepsia crónica.

Más importante aún, muestran que en un modelo crónico de epilepsia, es decir, un modelo de estado epiléptico (inducido por un agente convulsivo como la inyección de pilocarpina) y donde la enfermedad ha tenido tiempo de asentarse (con reorganización morfofuncional de la red neuronal y brotación de fibras musgosas del hipocampo), el uso de un antagonista del receptor de GluK2/GluK5 podría representar una alternativa importante para tratar la epilepsia crónica (TLE) en el paciente. Esta es la primera vez que se obtienen resultados con antagonistas de KAR para modelos de epilepsia crónica; el estado de la técnica solo muestra efectos de los agentes de KAR sobre las convulsiones agudas (es decir, directamente después de una inyección de un agente químico convulsivo sin reorganización morfofuncional de la red neuronal y brotación de fibras musgosas del hipocampo).

REFERENCIAS:

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

Albus K, Heinemann U, Kovacs R (2013) Network activity in hippocampal slice cultures revealed by long-term in vitro recordings. J Neurosci Methods 217:1-8.

Artinian J, Peret A, Marti G, Epsztein J, Crepel V (2011) Synaptic kainate receptors in interplay with INaP shift the sparse firing of dentate granule cells to a sustained rhythmic mode in temporal lobe epilepsy. J Neurosci 31:10811-10818.

Ben-Ari Y, Cossart R (2000) Kainate, a double agent that generates seizures: two decades of progress. Trends Neurosci 23:580-587.

Berdichevsky Y, Dzhala V, Mail M, Staley KJ (2012) Interictal spikes, seizures and ictal cell death are not necessary for post-traumatic epileptogenesis in vitro. Neurobiol Dis 45:774-785.

<Berg AT, Berkovic>S<f>,<Brodie MJ, Buchhalter J, Cross JH, van Emde BW, Engel J, French J, Glauser TA, Mathern>GW, Moshe SL, Nordli D, Plouin P, Scheffer IE (2010) Revised terminology and concepts for organization of seizures and epilepsies: report of the ILAE Commission on Classification and Terminology, 2005-2009. Epilepsia 51:676-685.

Bragin A, Wilson CL, Almajano J, Mody I, Engel J, Jr. (2004) High-frequency oscillations after status epilepticus: epileptogenesis and seizure genesis. Epilepsia 45:1017-1023.

Buckmaster PS, Zhang GF, Yamawaki R (2002) Axon sprouting in a model of temporal lobe epilepsy creates a predominantly excitatory feedback circuit. J Neurosci 22:6650-6658.

Bureau I, Dieudonne S, Coussen F, Mulle C (2000) Kainate receptor-mediated synaptic currents in cerebellar Golgi cells are not shaped by diffusion of glutamate. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6838-6843. Castillo PE, Malenka RC, Nicoll RA (1997) Kainate receptors mediate a slow postsynaptic current in hippocampal CA3 neurons. Nature 388:182-186.

Contractor A, Mulle C, Swanson GT (2011) Kainate receptors coming of age: milestones of two decades of research. Trends Neurosci 34:154-163.

Copits BA, Robbins JS, Frausto S, Swanson GT (2011) Synaptic targeting and functional modulation of GluKI kainate receptors by the auxiliary neuropilin and tolloid-like (NETO) proteins. J Neurosci 31:7334-7340.

Cossart R, Epsztein J, Tyzio R, Becq H, Hirsch J, Ben-Ari Y, Crepel V (2002) Quantal release of glutamate generates pure kainate and mixed AMPA/kai- nate EPSCs in hippocampal neurons. Neuron 35:147-159.

Coussen F, Perrais D, Jaskolski F, Sachidhanandam S, Normand E, Bockaert J, Marin P, Mulle C (2005) Coassembly of two GluR6 kainate receptor splice variants within a functional protein complex. Neuron 47:555-566. Dario J. Englot, M.D., Ph.D., John D. Rolston, M.D., Ph.D., Doris D. Wang, M.D., Ph.D., Peter P. Sun, M.D., Edw ard F. Chang, M.D. Seizure outcomes after temporal lobectomy in pediatric patients. J Neu- rosurg Pediatrics 12:134-141, 2013.

and Kurtis I. Auguste, M.D.1,2

Dyhrfjeld-Johnsen J, Berdichevsky Y, Swiercz W, Sabolek H, Staley KJ (2010) Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. J Clin Neurophysiol 27:418-424. Epsztein J, Represa A, Jorquera I, Ben-Ari Y, Crepel V (2005) Recurrent mossy fibers establish aberrant kainate receptor-operated synapses on granule cells from epileptic rats. J Neurosci 25:8229-8239.

Epsztein J, Sola E, Represa A, Ben-Ari Y, Crepel V (2010) A selective interplay between aberrant EP- SPKA and INaP reduces spike timing precision in dentate granule cells of epileptic rats. Cereb Cortex 20:898-911.

Feng L, Molnar P, Nadler JV (2003) Short-term frequency-dependent plasticity at recurrent mossy fiber synapses of the epileptic brain. J Neurosci 23:5381-5390.

<Franck>J<e>,<Pokomy J, Kunkel DD, Schwartzkroin PA (1995) Physiologic and morphologic characteristics of granule>cell circuitry in human epileptic hippocampus. Epilepsia 36:543-558.

<Frerking M, Malenka r>C,<Nicoll RA (1998) Synaptic activation of kainate receptors on hippocampal interneurons.>Nat Neurosci 1:479-486.

Gabriel S, Njunting M, Pomper JK, Merschhemke M, Sanabria ER, Eilers A, Kivi A, Zeller M, Meencke HJ, Cavalheiro EA, Heinemann U, Lehmann TN (2004) Stimulus and potassium-induced epileptiform activity in the human dentate gyrus from patients with and without hippocampal sclerosis. J Neurosci 24:10416-10430.

Grabs D, Bergmann M, Schuster T, Fox PA, Brich M, Gratz M (1994) Differential expression of synaptophysin and synaptoporin during pre- and postnatal development of the rat hippocampal network. Eur J Neurosci 6:1765-1771. Gutierrez R, Heinemann U (1999) Synaptic reorganization in explanted cultures of rat hippocampus. Brain Res 815:304-316.

Isokawa M, Levesque MF, Babb TL, Engel J, Jr. (1993) Single mossy fiber axonal systems of human dentate granule cells studied in hippocampal slices from patients with temporal lobe epilepsy. J Neurosci 13:1511-1522. Jane DE, Lodge D, Collingridge GL (2009) Kainate receptors: pharmacology, function and therapeutic potential. Neuropharmacology 56:90-113.

Joseph DJ, Williams DJ, MacDermott AB (2011) Modulation of neurite outgrowth by activation of calcium-permeable kainate receptors expressed by rat nociceptive-like dorsal root ganglion neurons. Dev Neurobiol 71:818-835. Li P, Wilding TJ, Kim SJ, Calejesan AA, Huettner JE, Zhuo M (1999) Kainate-receptor-mediated sensory synaptic transmission in mammalian spinal cord. Nature 397:161-164.

Loscher W (2002) Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res 50:105-123.

Lynch M, Sutula T (2000) Recurrent excitatory connectivity in the dentate gyrus of kindled and kainic acid-treated rats. J Neurophysiol 83:693-704.

McBain CJ, Boden P, Hill RG (1989) Rat hippocampal slices 'in vitro' display spontaneous epileptiform activity following long-term organotypic culture. J Neurosci Methods 27:35-49.

Mello LE, Cavalheiro EA, Tan AM, Kupfer WR, Pretorius JK, Babb TL, Finch DM (1993) Circuit mechanisms of seizures in the pilocarpine model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting. Epilepsia 34:985-995. Okazaki MM, Evenson DA, Nadler JV (1995) Hippocampal mossy fiber sprouting and synapse formation after status epilepticus in rats: visualization after retrograde transport of biocytin. J Comp Neurol 352:515-534.

Patrylo PR, Dudek FE (1998) Physiological unmasking of new glutamatergic pathways in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-induced epileptic rats. J Neurophysiol 79:418-429.

Peret A, Christie LA, Ouedraogo DW, Gorlewicz A, Epsztein J, Mulle C, Crepel V. Contribution of Aberrant GluK2-Containing Kainate Receptors to Chronic Seizures in Temporal Lobe Epilepsy. Cell Rep. 2014 Jul 24.

Pinheiro P. and Mulle Christophe. Kainate receptors. Cell Tisses Res, 2006.

Pinheiro PS, Lanore F, Veran J, Artinian J, Blanchet C, Crepel V, Perrais D, Mulle C (2013) Selective block of postsynaptic kainate receptors reveals their function at hippocampal mossy fiber synapses. Cereb Cortex 23:323-331.

Reiner A, Arant RJ, Isacoff EY (2012) Assembly stoichiometry of the GluK2/GluK5 kainate receptor complex. Cell Rep 1:234-240.

Represa A, Le Gall La SG, Ben-Ari Y (1989a) Hippocampal plasticity in the kindling model of epilepsy in rats. Neurosci Lett 99:345-350.

Represa A, Robain O, Tremblay E, Ben Ari Y (1989b) Hippocampal plasticity in childhood epilepsy. Neurosci Lett 99:351-355.

Scharfman HE, Sollas AL, Berger RE, Goodman JH (2003) Electrophysiological evidence of monosynaptic excitatory transmission between granule cells after seizure-induced mossy fiber sprouting. J Neurophysiol 90:25362547.

Staley K, Hellier JL, Dudek FE (2005) Do interictal spikes drive epileptogenesis? Neuroscientist 11:272-276. Sutula T, Cascino G, Cavazos J, Parada I, Ramírez L (1989) Mossy fiber synaptic reorganization in the epileptic human temporal lobe. Ann Neurol 26:321-330.

Tauck DL, Nadler JV (1985) Evidence of functional mossy fiber sprouting in hippocampal formation of kainic acidtreated rats. J Neurosci 5:1016-1022.

Thomas AM, Corona-Morales AA, Ferraguti F, Capogna M (2005) Sprouting of mossy fibers and pre- synaptic inhibition by group II metabotropic glutamate receptors in pilocarpine-treated rat hippocampal slice cultures. Neuroscience 131:303-320.

Turski WA, Cavalheiro EA, Bortolotto ZA, Mello LM, Schwarz M, Turski L (1984) Seizures produced by pilocarpine in mice: a behavioral, electroencephalographic and morphological analysis. Brain Res 321:237-253.

Zhang W, St-Gelais F, Grabner CP, Trinidad JC, Sumioka A, Morimoto-Tomita M, Kim KS, Straub C, Burlingame AL, Howe JR, Tomita S (2009) A transmembrane accessory subunit that modulates kainate-type glutamate receptors. Neuron 61:385-396.

Zimmer J, Gahwiler BH (1984) Cellular and connective organization of slice cultures of the rat hippocampus and fascia dentata. J Comp Neurol 228:432-446.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que es un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) para el receptor de GluK2/GluK5.

2. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, donde el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido para el subconjunto GluK2.

3. El compuesto para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde el oligonucleótido antisentido es un ARN antisentido.

4. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto inhibe la expresión del subconjunto Gluk2.

5. Un vector que comprende un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 o una secuencia de ADN que codifica un inhibidor de ARN antisentido de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido para el receptor de GluK2/GluK5.

6. El vector para su uso según la reivindicación 5, donde el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido para el subconjunto GluK2.

7. El vector para su uso según la reivindicación 5 o 6, donde el compuesto inhibe la expresión del subconjunto Gluk2.

8. Una composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz de un inhibidor de la expresión del receptor de GluK2/GluK5 para su uso en el tratamiento o prevención de la epilepsia, donde el inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARN bicatenario pequeño (ARNbc) o un ARN inhibidor pequeño (ARNip) del receptor de GluK2/GluK5.

9. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, donde el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido para el subconjunto GluK2.

10. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8 o 9, donde el oligonucleótido antisentido es un ARN antisentido.

11. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el compuesto inhibe la expresión del subconjunto Gluk2.

12. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o la composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8-11, donde la epilepsia es una epilepsia del lóbulo temporal.