ES2986963T3 - Métodos para evaluar el riesgo de desarrollar una enfermedad viral mediante una prueba genética - Google Patents

Métodos para evaluar el riesgo de desarrollar una enfermedad viral mediante una prueba genética Download PDF

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Abstract

Este documento proporciona métodos y materiales relacionados con el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, este documento proporciona métodos para tratar la enfermedad de un sujeto basándose en la identificación del riesgo de leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP) mediante una prueba genética. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para evaluar el riesgo de desarrollar una enfermedad viral mediante una prueba genética
Antecedentes de la divulgación
La leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) es una infección oportunista rara y potencialmente mortal del sistema nervioso central causada por un poliomavirus ubicuo, el virus de JC (JCV). Mientras que el JCV está presente en tasas muy elevadas en la población general, la PML sigue siendo un trastorno poco frecuente, aunque importante debido a la escasa supervivencia y a las graves secuelas neurológicas, así como a la asociación recientemente demostrada con una variedad de terapias útiles, p. ej., el natalizumab en la esclerosis múltiple (MS). Se han descrito varios factores de riesgo de PML, pero es mejor considerarlos necesarios, pero no suficientes. Aunque estos factores de riesgo son muy relevantes, no predicen por sí solos quién desarrollará PML, ya que la gran mayoría de los individuos con estos factores de riesgo no desarrollarán el trastorno. Hay que tener en cuenta otros factores y cada vez hay más pruebas del papel de los factores genéticos del huésped en la susceptibilidad a la PML.
La capacidad de predecir con mayor precisión quién está en riesgo de desarrollar PML será de enorme beneficio en el contexto del tratamiento farmacológico con compuestos que son altamente eficaces en el contexto de su enfermedad (natalizumab en la MS, por ejemplo) pero conllevan el riesgo de un trastorno devastador. Es necesario desarrollar una prueba diagnóstica complementaria para excluir eficazmente a las personas con riesgo de PML y, de paso, tranquilizar a las personas con pruebas negativas sobre la drástica reducción del riesgo de desarrollar PML.
El documento WO 2015/131078 enseña marcadores de expresión génica asociados a PML bajo terapia inmunosupresora.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación, y los dibujos adjuntos.
La Figura 1 representa un ejemplo de un gen (PRKCB) afectado por CNV de línea germinal y adquiridas. La Figura 2 representa un ejemplo de genes (TNFRSF13C y CENPM) afectados por CNV adquiridas.
La Figura 3 representa un ejemplo de un gen (PKHD1) afectado por CNV de línea germinal y adquiridas. La Figura 4 representa un ejemplo de un gen (BMPR2) afectado por una CNV (pérdidas homocigotas y heterocigotas).
La Figura 5 representa un ejemplo de un gen (COMMD6) afectado por una CNV (p. ej., duplicación homocigota). La Figura 6 representa un ejemplo de genes (KCTD7, RABGEF1) directa y potencialmente afectados por una CNV (p. ej., duplicación homocigota).
La Figura 7 representa un ejemplo de un gen (FPR2) afectado por una CNV (p. ej., duplicación homocigota). La Figura 8 representa un ejemplo de un gen (PIK3CD) afectado por una CNV (p. ej., pérdida homocigota). La Figura 9 representa un ejemplo de un gen (CD 180) potencialmente afectado por una ganancia de CNV intergénica (p. ej., duplicación homocigota).
La Figura 10 representa un ejemplo de un gen (VDAC1) potencialmente afectado por una CNV intergénica (pérdida homocigota).
La Figura 11 representa un ejemplo de genes (EGR1 y ETF1) potencialmente afectados por una CNV intergénica (pérdida homocigota).
La Figura 12 representa un ejemplo de un gen (ITSN2) potencialmente afectado por una CNV intergénica (pérdida homocigota).
La Figura 13 representa un ejemplo de interacciones proteicas conocidas y/o predichas utilizando la base de datos String para 21 de los 43 genes (lista no redundante) indicadas en la Tabla 7. Junto a cada gen se indica el número de casos de PML en los que se han encontrado variantes que afectan a un gen determinado.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un medicamento inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método de detección para un biomarcador de PML de acuerdo con la reivindicación 9. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar a un sujeto con riesgo de desarrollar PML de acuerdo con la reivindicación 11. Otras características de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.
En algunas realizaciones, la afección es un cáncer, un trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune.
En algunas realizaciones, la afección es una enfermedad autoinmune.
En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Addison, encefalitis por receptor anti-NMDA, síndrome anti sintetasa, anemia aplásica, anemias autoinmunes, anemia hemolítica autoinmune, pancreatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, trastornos ampollosos de la piel, enfermedad celíaca - esprúe (enteropatía sensible al gluten), síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucemia linfocítica crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, enfermedad de Devic, eritroblastopenia, síndrome de Evans, glomeruloesclerosis segmentaria focal, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedades autoinmunes mediadas por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, miastenia gravis, mieloma, linfoma no Hodgkin, síndrome opsoclono mioclono (OMS), penfigoide, penfigo, penfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, psoriasis, aplasia pura de eritrocitos, artritis reactiva, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, diabetes de tipo I, colitis ulcerosa, vasculitis (p. ej., vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos), vitíligo y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple o la enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple. En algunas realizaciones, la esclerosis múltiple es una forma recidivante de esclerosis múltiple. En algunas realizaciones, la esclerosis múltiple es una esclerosis múltiple remitente-recurrente (RRMS). En algunas realizaciones, la esclerosis múltiple es una esclerosis múltiple primaria progresiva (PPMS). En algunas realizaciones, la esclerosis múltiple es una esclerosis múltiple secundaria progresiva (SPMS).
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden un glucocorticoide, citostático, anticuerpo, fármaco que actúa sobre inmunofilinas, interferón, opioide, proteína de unión a TNF, micofenolato, agente biológico pequeño, molécula pequeña, compuesto orgánico, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden abatacept, adalimumab, alefacept, alemtuzumab, anakinra, azatioprina, belimumab, bendamustina, bevacizumab, bortezomib (p. ej., VELCADE), eculizumab (p. ej., SOLIRlS), leflunomida, brentuximab vedotina, capecitabina, carboplatino, cetuximab, clorambucilo, cladribina, ciclofosfamida, ciclosporina, daclizumab, doxorrubicina, efalizumab, etanercept, etopósido, fludarabina, gemcitabina, ibritumomab tiuxetano, imatinib, infliximab, lenalidomida, metotrexato, micofenolato mofetilo, natalizumab, oxaliplatino, rituximab, tocilizumab, tofacitinib, ustekinumab, vedolizumab, vincristina, belatacept, quimioterapia citotóxica, corticosteroides, Ig antitimocítica, basiliximab, muromonab-CD3, ácido micofenólico, prednisona/prednisolona, sirolimus (rapamicina), tacrolimus, fumarato de dimetilo, fingolimod, ruxolitinib, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-1a, teriflunomida, mitoxantrona, ocrelizumab, asparaginasa, bleomicina, busulfano, carmustina, certolizumab, ibrutinib, idarrubicina, idelalisib, hidrocortisona, ifosfamida, levamisol, mercaptopurina, mizoribina, obinutuzumab, ofatumumab, tegafur/gimeracilo/oteracilo, tiotepa, vinblastina, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-1a, teriflunomida, fingolimod, fumarato de dimetilo, alemtuzumab, mitoxantrona, natalizumab, daclizumab, ocrelizumab, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el sujeto no ha tomado uno o más medicamentos inmunosupresores. En algunas realizaciones, el sujeto ha tomado uno o más medicamentos inmunosupresores. En algunas realizaciones, el sujeto está tomando uno o más medicamentos inmunosupresores.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden natalizumab (p. ej., TYSABRI). En algunas realizaciones, se administran al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab, p. ej., al menos aproximadamente 10 mg, al menos aproximadamente 15 mg, al menos aproximadamente 20 mg, al menos aproximadamente 30 mg, al menos aproximadamente 40 mg, al menos aproximadamente 50 mg, al menos aproximadamente 60 mg, al menos aproximadamente 70 mg, al menos aproximadamente 80 mg, al menos aproximadamente 90 mg, al menos aproximadamente 100 mg, al menos aproximadamente 150 mg, al menos aproximadamente 200 mg, al menos aproximadamente 250 mg o al menos aproximadamente 300 mg de natalizumab. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab se administran mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab se administran mediante infusión intravenosa en cuatro semanas.
En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab, p. ej., aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, o aproximadamente 400 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 300 mg de natalizumab. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas.
En algunas realizaciones, la prueba genética comprende la detección de una o más variaciones genéticas asociadas con un riesgo de desarrollar PML en una muestra de ácido polinucleico del sujeto. En algunas realizaciones, la prueba genética comprende la detección de una o más variaciones genéticas asociadas con un alto riesgo de desarrollar PML en una muestra de ácido polinucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, la afección es esclerosis múltiple.
En algunas realizaciones, la afección es la enfermedad de Crohn.
En algunas realizaciones, se identifica que el sujeto no tiene riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) mediante una prueba genética. En algunas realizaciones, se identifica que el sujeto no tiene un alto riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) mediante una prueba genética. En algunas realizaciones, la prueba comprende ensayar una muestra de ácido polinucleico del sujeto para una o más variaciones genéticas.
En algunas realizaciones, el SNV es un SNV heterocigoto.
En algunas realizaciones, el SNV es un SNV homocigoto.
En algunas realizaciones, la prueba genética o la prueba comprende análisis de microarreglos, PCR, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la prueba genética o la prueba comprende un análisis de microarreglos seleccionado del grupo que consiste en un análisis de arreglo de hibridación genómica comparativa (CGH) y un análisis de arreglo SNP
En algunas realizaciones, la prueba genética o la prueba comprende secuenciación, en la que la secuenciación se selecciona del grupo que consiste en secuenciación de firma masivamente paralela (MPSS), secuenciación de Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación de Illumina, secuenciación de Illumina (Solexa) utilizando preparación de biblioteca Genomics 10X, secuenciación SOLiD, secuenciación por semiconductores iónicos, secuenciación por nanobolas de ADN, secuenciación heliscópica de molécula única, secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT), secuenciación de RNAP, secuenciación de ADN Nanopore, secuenciación por hibridación y secuenciación microfluídica de Sanger.
En algunas realizaciones, la prueba genética o las pruebas comprenden el análisis de todo el genoma del sujeto.
En algunas realizaciones, la prueba genética o las pruebas comprenden el análisis de un exoma completo del sujeto.
En algunas realizaciones, la prueba genética o la prueba comprende el análisis de información de ácido nucleico que ya se ha obtenido para un genoma o un exoma completos del sujeto.
En algunas realizaciones, la información sobre el ácido nucleico se obtiene a partir de un análisisin silico.En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano.
En algunas realizaciones, la muestra de ácido polinucleico comprende un ácido polinucleico de sangre, saliva, orina, suero, lágrimas, piel, tejido o pelo del sujeto.
En algunas realizaciones, el método comprende además tratar al sujeto con un agente que reduce una carga viral en el sujeto.
En algunas realizaciones, el agente inmunosupresor se administra después de reducir la carga viral.
En algunas realizaciones, la carga viral es una carga viral de JCV.
En algunas realizaciones, el agente que reduce la carga viral es un agente dirigido contra el JCV.
En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o el método comprende además analizar la presencia de JCV en una muestra biológica del sujeto. En algunas realizaciones, el medicamento o método inmunosupresor comprende una prueba de anticuerpos contra el JCV. En algunas realizaciones, la prueba de anticuerpos contra el JCV tiene un resultado negativo. En algunas realizaciones, la prueba de anticuerpos contra el JCV no detecta la presencia del JCV en la muestra biológica del sujeto. En algunas realizaciones, la prueba de anticuerpos contra el JCV detecta la presencia del JCV en la muestra biológica del sujeto.
En algunas realizaciones, el análisis para detectar la presencia del JCV comprende poner en contacto un reactivo de detección del JCV con la muestra biológica.
En algunas realizaciones, el reactivo de detección del JCV se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-JCV, un cebador específico del JCV y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o el método comprende analizar la presencia de JCV en una muestra biológica del sujeto. En algunas realizaciones, el análisis de la presencia del JCV comprende una prueba de anticuerpos contra el JCV, una prueba de CD62L o una prueba de bandas oligoclonales IgM del CSF. En algunas realizaciones, el análisis para detectar la presencia del JCV se lleva a cabo antes de la prueba genética. En algunas realizaciones, el análisis para detectar la presencia del JCV se lleva a cabo después de la prueba genética. En algunas realizaciones, el análisis para detectar la presencia del JCV se lleva a cabo simultáneamente con la prueba genética. En algunas realizaciones, el análisis de la presencia del JCV identifica al sujeto como vehículo del JCV. En algunas realizaciones, el análisis de la presencia del JCV identifica al sujeto como no portador del JCV. En algunas realizaciones, el resultado de la prueba genética identifica que el sujeto tiene un riesgo o un riesgo aumentado de desarrollar PML. En algunas realizaciones, el resultado de la prueba genética identifica que el sujeto no tiene riesgo o no tiene un riesgo aumentado de desarrollar PML.
En algunas realizaciones, el sujeto está inmunodeprimido. En algunas realizaciones, el sujeto tiene VIH. En algunas realizaciones, el sujeto tiene infección por VIH. En algunas realizaciones, el sujeto está en riesgo de infección por VIH. En algunas realizaciones, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más medicamentos antivirales, tal como inhibidores de la proteasa (lopinavir/ritonavir {p. ej., KALETRA}, indinavir {p. ej., CRIXIVAN}, ritonavir {p. ej., NORVIR}, nelfinavir {p. ej., VIRACEPT}, saquinavir en cápsulas de gelatina dura {p. ej., INVIRASE}, atazanavir {p. ej., REYA<t>AZ}, amprenavir {p. ej., AGENERASE}, fosamprenavir {p. ej., t ElZIR}, tipranavir {p. ej., APTIVUS}), inhibidores de la transcriptasa inversa, incluidos los inhibidores no nucleósidos y nucleósidos/nucleótidos (A<z>T {zidovudina, p. ej., Retrovir}, ddI {didanosina, p. ej., VIDEX}, 3TC {lamivudina, p. ej., EPIVIR}, d4T {estavudina, p. ej., ZERIT}, abacavir {p. ej., Z iAg EN}, FTC {emtricitabina, p. ej., EMTRIVA}, tenofovir {p. ej., V iREAD}, efavirenz {p. ej., SUSTIVA} y nevirapina {p. ej., VIRAMUNE}), inhibidores de la fusión<t>20 {enfuvirtida, p. ej., FU<z>E<o>N}, inhibidores de la integrasa (Raltegravir, p. ej., ISENTRESS, MK-0518; y elvitegravir, p. ej., VlTEKTA, GS-9137) e inhibidores de la maduración (bevirimat {PA-457}).
En algunas realizaciones, la afección es un cáncer, una neoplasia hematológica, un trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune. En algunas realizaciones, la afección es linfocitopenia CD4+ idiopática (ICL).
En algunas realizaciones, la afección es una enfermedad autoinmune.
En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Addison, enfermedad de Behcet, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca - esprúe (enteropatía sensible al gluten), enfermedad de Crohn, dermatomiositis, glomeruloesclerosis segmentaria focal, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, penfigoide, anemia aplásica, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, eritroblastopenia, púrpura trombocitopénica, síndrome de Evans, vasculitis, granulomatosis con poliangeítis, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis por receptores anti-NMDA, enfermedad de Devic, pancreatitis autoinmune, síndrome opsoclono-mioclono, enfermedad relacionada con IgG4, psoriasis, artritis reactiva, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, sarcoidosis, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo I, vitíligo o colitis ulcerosa.
En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple o la enfermedad de Crohn.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden un glucocorticoide, citostático, anticuerpo, fármaco que actúa sobre inmunofilinas, interferón, opioide, proteína de unión a TNF, micofenolato, agente biológico pequeño, molécula pequeña, compuesto orgánico, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden un interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-1a, teriflunomida, fingolimod, fumarato de dimetilo, alemtuzumab, mitoxantrona, natalizumab, daclizumab, ocrelizumab, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden natalizumab (p. ej., TYSABRI).
En algunas realizaciones, el análisis comprende análisis de microarreglos, PCR, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el resultado de la prueba genética comprende un resultado de prueba genética de un análisis de microarreglos, PCR, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la detección comprende un análisis de microarreglos, PCR, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el análisis de microarreglos se selecciona del grupo que consiste en un análisis de arreglo de hibridación genómica comparativa (CGH) y un análisis de arreglo SNP
En algunas realizaciones, la secuenciación se selecciona del grupo que consiste en secuenciación de firmas masivas en paralelo (MPSS), secuenciación de Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación de Illumina, secuenciación de Illumina (Solexa) utilizando la preparación de bibliotecas Genomics 10X, secuenciación SOLiD, secuenciación por semiconductores iónicos, secuenciación por nanobolas de ADN, secuenciación heliscópica de moléculas individuales, secuenciación de moléculas individuales en tiempo real (SMRT), secuenciación RNAP, secuenciación de ADN Nanopore, secuenciación por hibridación y secuenciación microfluídica Sanger.
En algunas realizaciones, el análisis comprende analizar un genoma completo o un exoma completo del sujeto. En algunas realizaciones, el análisis comprende analizar información de ácido nucleico que ya se ha obtenido para un genoma completo o un exoma completo del sujeto.
En algunas realizaciones, la información sobre el ácido nucleico se obtiene a partir de un análisisin silico.En algunas realizaciones, el análisis comprende analizar un genoma completo o un exoma completo del sujeto. En algunas realizaciones, el análisis comprende analizar información de ácido nucleico que ya se ha obtenido para un genoma completo o un exoma completo del sujeto.
En algunas realizaciones, la información sobre el ácido nucleico se obtiene a partir de un análisisin silico.En algunas realizaciones, la detección comprende analizar un genoma completo o un exoma completo del sujeto.
En algunas realizaciones, la detección comprende el análisis de información de ácido nucleico que ya se ha obtenido para un genoma completo o un exoma completo del sujeto.
En algunas realizaciones, la información sobre el ácido nucleico se obtiene a partir de un análisisin silico.En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano.
En algunas realizaciones, la muestra de ácido polinucleico comprende un ácido polinucleico de sangre, saliva, orina, suero, lágrimas, piel, tejido o pelo del sujeto.
En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o el método comprende además analizar la presencia de JCV en una muestra biológica del sujeto.
En algunas realizaciones, el análisis para detectar la presencia del JCV comprende poner en contacto un reactivo de detección del JCV con la muestra biológica.
En algunas realizaciones, el reactivo de detección del JCV se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-JCV, un cebador específico del JCV y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden un glucocorticoide, citostático, anticuerpo, fármaco que actúa sobre inmunofilinas, interferón, opioide, proteína de unión a TNF, micofenolato, agente biológico pequeño, molécula pequeña, compuesto orgánico, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden abatacept, adalimumab, alefacept, alemtuzumab, anakinra, azatioprina, belimumab, bendamustina, bevacizumab, bortezomib, brentuximab vedotina, capecitabina, carboplatino, cetuximab, clorambucilo, cladribina, ciclofosfamida, ciclosporina, daclizumab, doxorrubicina, efalizumab, etanercept, etopósido, fludarabina, gemcitabina, ibritumomab tiuxetano, imatinib, infliximab, lenalidomida, metotrexato, micofenolato mofetilo, natalizumab, oxaliplatino, rituximab, tocilizumab, tofacitinib, ustekinumab, vedolizumab, vincristina, belatacept, quimioterapia citotóxica, corticosteroides, Ig antitimocítica, basiliximab, muromonab-CD3, ácido micofenólico, prednisona/prednisolona, sirolimus, tacrolimus, fumarato de dimetilo, fingolimod, ruxolitinib, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-1a, teriflunomida, mitoxantrona, ocrelizumab, asparaginasa, bleomicina, busulfano, carmustina, certolizumab, ibrutinib, idarrubicina, idelalisib, hidrocortisona, ifosfamida, levamisol, mercaptopurina, mizoribina, obinutuzumab, ofatumumab, tegafur/gimeracilo/oteracilo, tiotepa, vinblastina, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, uno o más medicamentos inmunosupresores pueden comprender natalizumab.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden una molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma es una molécula de anticuerpo recombinante o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma es una molécula de anticuerpo humanizada o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma es una molécula de anticuerpo recombinante humanizada o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma es una molécula de anticuerpo monoclonal recombinante IgG4K humanizada o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende una secuencia en número de registro CAS: 189261-10-7. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende dos cadenas pesadas de anticuerpo. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo y al menos una cadena ligera de anticuerpo.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se produce en células de mieloma. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se produce en células de hibridoma de conejo.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se une a un receptor. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se une a una integrina. En algunas realizaciones, la integrina se expresa en la superficie de un leucocito. En algunas realizaciones, el leucocito es un neutrófilo. En algunas realizaciones, el leucocito no es un neutrófilo. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se une a la integrina a4p1, a la integrina a4p7 o a ambas. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se une a la subunidad a4 de la integrina a4p1, a la integrina a4p7, o a ambas. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma inhibe la adhesión mediada por a4 de un leucocito a su receptor.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 9o %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2178 (QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DTYIHWVRQA PGQRLEWMGR IDPANGYTKY DPKFQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAREG YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK). En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia que tiene aproximadamente un 50 %-100 % de identidad, p. ej., aproximadamente un 50 %-60 %, aproximadamente un 50 %-70 %, aproximadamente un 60 %-70 %, aproximadamente un 60 %-80 %, aproximadamente un 70 %-80 %, aproximadamente un 70 %-90 %, aproximadamente un 80 %-90 %, aproximadamente un 80 %-95 %, aproximadamente un 90 %-95 %, aproximadamente un 90 %-99 %, aproximadamente un 90 %-100 %, aproximadamente un 95 %-99 %, o aproximadamente un 99 %-100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2178.
En algunas realizaciones, uno o más medicamentos inmunosupresores comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2179 (DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY TSALQPGIPS RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC). En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia que tiene aproximadamente un 50 %-100 % de identidad, p. ej., aproximadamente un 50 %-60 %, aproximadamente un 50 %-70 %, aproximadamente un 60 %-70 %, aproximadamente un 60 %-80 %, aproximadamente un 70 %-80 %, aproximadamente un 70 %-90 %, aproximadamente un 80 %-90 %, aproximadamente un 80 %-95 %, aproximadamente un 90 %-95 %, aproximadamente un 90 %-99 %, aproximadamente un 90 %-100 %, aproximadamente un 95 %-99 %, o aproximadamente un 99 %-100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2179.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende CDR no humanas en las posiciones 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) (numeración de Kabat) de un anticuerpo anti-a4 de ratón y que tiene residuos no humanos en las posiciones marco 27-30 (numeración de Kabat), en las que las posiciones 27-30 tienen la secuencia de aminoácidos Phe 27, Asn 28, Ile 29 y Lys 30.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2180 (KTSQDINKYMA), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2181 (YTSALQP), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2182 (LQYDNLWT).
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2183 (q ASq Di IKYLN), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2184 (EASNLQA), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2185 (QQYQSLPYT).
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2186 (KASQ<s>V<t>NDVA), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2187 (YASNRYT), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2188 (QQDYSSPYT).
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena pesada (HC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2189 (DTYIH), una CDR2 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2190 (RIDPANGYTKYDPKFQG), y una CDR3 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2191 (EGYYGNYGVYAMDY).
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena pesada (HC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2192 (DT<y>M<h>), una CDR2 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2193 (RIDPASGDTKYD<p>K<f>QV), y una CDR3 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2194 (DGMWVSTGYALDF).
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende una cadena pesada humanizada, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una región de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO.: 2195 (MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFNIKDTYMHWVRQPPGRGLEWIGRID PASGDTKYDPKFQVKATITADTSSNQFSLRLSSVTAADTAVYYCADGMWVSTGYALDFWGQGTTVTVSSGES, la SEQ ID NO: 2196 (QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFNIKDTYMHWVRQPPGRGLEWIGRIDPASGD TKYDPKF QVRVTMLVDTSSNQFSLRLSSVTSEDTAVYYCADGMWVSTGYALDFWGQGTTVTVSSGES), la SEQ ID NO: 2197 (MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFNIKDTYMHWVKQR PGRGLEWIGRIDPASGDTKYDPKFQVRVTMLVDTSSNQFSLRLSSVTAADTAVYYCADGMWVSTGYALDFWG QGTTVTVSSGES), la SEQ ID NO: 2198 (MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTAS GFNIKDTYMHWVRQPGR GLEWIGRIDPASGDTKYDPKFQVRVTMLVDTSSNQFSLRLSSVTAADTAVYCADG MWVSTGYALDFWGQGTTVSSGES), y la SEQ ID NO: 2199 (QYQLYQSGAEYKKPGASYKYSCKASGFNIKDT YIHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANGYTKYDPKFQGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYGN YGVYAMDYWGQGTLVTVVSS).
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende una cadena ligera humanizada, o un fragmento de unión a4 de la misma, que comprende una región de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO.: 2200 (MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSAS VGDRVTITCKASQSVTNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQD YSSPYTFGQGTKVEIKRK), la SEQ ID NO: 2201 (MGWSCIILFLVATATGVHSSIVMTQSPSSLSASVGDRVTIT CKASQSVTNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQDYSSPY TFGQGTKVEIKRK), la SEQ ID NO: 2202 (MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAS QSVTNDVAWYQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQDYSSPYTFGQG TKVEIKRK), y la SEQ ID NO: 2203 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQDINKYMAWYQQTPGKAPRLL IHYTSALQPGIPSRFSGS GSGRDYTFTISSLQPEDIATYYCLQYDNLWTFGQGTKVEIKRTV).
En algunas realizaciones, un producto biológico puede ser un producto biológico aprobado por una agencia reguladora. Por ejemplo, el producto biológico puede estar aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) y/o la Agencia Europea de Medicamentos (EMA). En algunas realizaciones, el producto biológico puede ser un producto de referencia. En algunos casos, el producto biológico puede ser un producto biosimilar. En algunas realizaciones, el producto biológico puede ser un producto intercambiable.
En algunas realizaciones, un producto biosimilar puede ser similar a un producto de referencia. En algunas realizaciones, un producto biosimilar puede no presentar diferencias clínicamente significativas en términos de seguridad y eficacia con respecto al producto de referencia. En algunas realizaciones, un producto biosimilar puede tener los mismos componentes clínicamente inactivos. En algunas realizaciones, un producto biosimilar puede tener diferentes componentes clínicamente inactivos. En algunas realizaciones, un producto biosimilar interactúa específicamente con un sustrato y el producto de referencia interactúa específicamente con el mismo sustrato. En algunas realizaciones, la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto biosimilar puede ser del 50 % al 150 % de la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto de referencia. Por ejemplo, la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto biosimilar puede ser del 50 %-100 %, 50 %-110 %, 50 %-120 %, 50 %-130 %, 50 %-140 %, 50 %-150 %, 60 %-100 %, 60 %-110 %, 60 %-120 %, 60 %-130 %, 60 %-140 %, 60 %-150 %, 70 %-100 %, 70 %-110 %, 70 %-120 %, 70 %-130 %, 70 %-140 %, 70 %-150 %, 80 %-100 %, 80 %-110 %, 80 %-120 %, 80 %-130 %, 80 %-140 %, 80 %-150 %, 90 %-100 %, 90 %-110 %, 90 %-120 %, 90 %-130 %, 90 %-140 %, 90 %-150 %, 100 %-110 %, 100 %-120 %, 100 %-130 %, 100 %-140 %, 100 %-150 %, 110 %-120 %, 110 %-130 %, 110 %-140 %, 110 %-150 %, 120 %-130 %, 120 %-140 %, 120 %-150 %, 130 %-140 %, 130 %-150 %, o 140 %-150 % de la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administró el producto de referencia. En algunas realizaciones, un producto biosimilar y un producto de referencia pueden utilizar el mismo mecanismo o mecanismos de acción para la condición o condiciones de uso prescritas, recomendadas o sugeridas en el marcaje propuesto, pero sólo en la medida en que el mecanismo o mecanismos sean conocidos para el producto de referencia.
En algunas realizaciones, un producto intercambiable puede ser un producto biosimilar que cumple normas adicionales de intercambiabilidad. En algunas realizaciones, un producto intercambiable puede producir el mismo resultado clínico que un producto de referencia en todas las condiciones de uso autorizadas del producto de referencia. En algunas realizaciones, un producto intercambiable puede ser sustituido por el producto de referencia por un farmacéutico sin la intervención del profesional sanitario que prescribió el producto de referencia. En algunas realizaciones, cuando se administra más de una vez a un individuo, el riesgo en términos de seguridad o disminución de la eficacia de alternar o cambiar entre el uso del producto biológico y el producto de referencia no es mayor que el riesgo de usar el producto de referencia sin dicha alternancia o cambio. En algunas realizaciones, un producto intercambiable puede ser un producto aprobado por una agencia reguladora. En algunas realizaciones, la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto intercambiable puede ser del 80 % al 120 % de la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto de referencia. Por ejemplo, la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto intercambiable puede ser del 80 %-100 %, 80 %-110 %, 80 %-120 %, 90 %-100 %, 90 %-110 %, 90 %-120 %, 100 %-110 %, 100 %-120 % o 110 %-120 de la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se administra el producto de referencia.
En algunas realizaciones, la afección es la esclerosis múltiple o la enfermedad de Crohn. En algunos casos, la enfermedad es una forma recidivante de esclerosis múltiple. En algunas realizaciones, el natalizumab se administra mediante infusión intravenosa.
En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab, p. ej., aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, o aproximadamente 400 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 300 mg de natalizumab. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas.
En algunas realizaciones, una o más variaciones genéticas están asociadas con un riesgo de desarrollar PML en una muestra de ácido polinucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o método comprende probar al sujeto para una predisposición genética para PML con un ensayo genético. En algunas realizaciones, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos el 5 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos aproximadamente 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de aproximadamente 1 %-5 %, 1 %-10 %, 1 %-20 %, 5 %-10 %, 5
%-20 %, 10 %-20 %, 10 %-30 %, 20 %-30 %, 20 %-40 %, 30 %-40 %, 30 %-50 %, 40 %-50 %, 40 %-60 % %-60 %, 50 %-70 %, 60 %-70 %, 60 %-80 %, 70 %-80 %, 70 %-90 %, 80 %-90 %, 80 %-95 %, 90 %-95 % %-99 %, 90 %-100 %, 95 %-99 %, o 99 %-100 %. En algunas realizaciones, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos el 20 %.
En algunas realizaciones, la disminución del riesgo del sujeto se debe además a la ausencia de una o más variaciones genéticas que alteran o modulan un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 25A, 25B y 26.
En algunas realizaciones, el ensayo genético comprende análisis de microarreglos, PCR, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o el método comprende analizar al sujeto con una
prueba de anticuerpos contra el JCV, una prueba de CD62L o una prueba de bandas oligoclonales IgM del
CSF. En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o el método comprenden analizar al sujeto
con la prueba de anticuerpos contra el JCV, en la que la prueba de anticuerpos contra el JCV no detecta la presencia del JCV. En algunas realizaciones, el medicamento inmunosupresor o el método comprende analizar
al sujeto con la prueba de anticuerpos contra el JCV, en la que la prueba de anticuerpos contra el JCV detecta
la presencia del JCV. En algunas realizaciones, la prueba de anticuerpos contra el JCV comprende poner en
contacto un reactivo de detección del JCV con una muestra biológica del sujeto. En algunas realizaciones, el
reactivo de detección del JCV se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-JCV, un cebador específico del JCV y combinaciones de los mismos.
Descripción detallada de la divulgación
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos, en las reivindicaciones y en la presente descripción. Otras características, objetivos y ventajas de las realizaciones
inventivas divulgadas y contempladas en el presente documento se desprenderán de la descripción y los
dibujos, así como de las reivindicaciones.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el artículo "un" significa uno
o más, a menos que se disponga explícitamente lo contrario.
Tal como se utilizan en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, términos como "contiene",
"que contiene", "incluye", "que incluye" y similares significan "que comprende"
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "o" puede ser conjuntivo o disyuntivo. Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, cualquier forma de realización puede combinarse con cualquier otra forma de realización.
Tal como se utilizan en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, algunas realizaciones
inventivas del presente documento contemplan intervalos numéricos. Cuando hay intervalos presentes, los
intervalos incluyen los puntos finales de los intervalos. Además, todos los subintervalos y valores dentro del
intervalo están presentes como si se hubieran escrito explícitamente.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "aproximadamente" en relación con un valor numérico de referencia y sus equivalentes gramaticales incluyen
un intervalo de valores más o menos el 10 % de dicho valor, tal como un intervalo de valores más o menos el
10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de dicho valor. Por ejemplo, la cantidad "aproximadamente
10" incluye las cantidades de 9 a 11.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto biológico" se refiere a un virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina, vacuna, sangre, componente sanguíneo o derivado, producto alergénico, proteína (cualquier polímero de aminoácidos alfa con una secuencia específica
definida que tenga un tamaño superior a 40 aminoácidos), o producto análogo, o arsfenamina o derivado de arsfenamina (o cualquier compuesto orgánico trivalente de arsénico), aplicable a la prevención, tratamiento o
curación de una enfermedad o afección de los seres humanos.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto biosimilar" se refiere a 1) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un
producto de referencia; 2) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos diferente (p. ej., truncamientos del terminal N o C) de un producto de referencia; o 3) un producto biológico que tiene una modificación postraduccional diferente (p. ej., glicosilación o fosforilación) de un producto de referencia, en el
que el producto biosimilar y el producto de referencia utilizan el mismo mecanismo o mecanismos de acción
para la prevención, tratamiento o curación de una enfermedad o afección.
Como se usa en el presente documento, "mecanismo de acción" se refiere a una interacción o actividad a
través de la cual un producto farmacológico (p. ej., un producto biológico) produce un efecto farmacológico.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto intercambiable" se refiere a un producto biosimilar, en el que la tasa de respuesta de un sujeto humano al que se le administra el producto intercambiable es del 80 % al 120 % de la tasa de respuesta del sujeto humano al que se le administra el producto de referencia.
Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto de referencia" se refiere a 1) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un producto biosimilar; 2) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos diferente (p. ej., truncamientos del terminal N o C) de un producto biosimilar; o 3) un producto biológico que tiene una modificación postraduccional diferente (p. ej., glicosilación o fosforilación) de un producto biosimilar, en el que el producto de referencia y el producto biosimilar utilizan el mismo mecanismo o mecanismos de acción para la prevención, tratamiento o curación de una enfermedad o afección.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, cualquier denominación común o genérica de un producto biológico incluye el producto biológico y cualquier producto biosimilar del mismo. Por ejemplo, la denominación común, filgrastim, se refiere al producto biológico vendido bajo el nombre comercial NEUPOGEN; también incluye el producto biosimilar, filgrastim-sndz, vendido bajo el nombre comercial ZARXIO. En otro ejemplo, la denominación común, natalizumab, se refiere al producto biológico vendido bajo el nombre comercial TYSABRI; también incluye cualquier producto biosimilar del producto biológico.
Leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML)
La leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) es una enfermedad viral rara y generalmente mortal que se caracteriza por un daño o inflamación progresiva de la sustancia blanca del cerebro en múltiples localizaciones. La causa de la PML puede ser un tipo de poliomavirus denominado virus de John Cunningham (JC) (o JCV), que puede ser inofensivo salvo en casos de sistemas inmunitarios debilitados. Mientras que el JCV está presente en tasas muy elevadas en la población general, la PML sigue siendo un trastorno poco frecuente, aunque importante debido a las secuelas clínicas.
La PML puede ocurrir en pacientes con inmunodeficiencia grave, que permite la reactivación del virus de JC, tal como: 1) más comúnmente entre pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que resulta de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), 2) pacientes con medicamentos inmunosupresores como corticosteroides, tacrolimus, sirolimus, y otros medicamentos o biológicos inmunosupresores, para trasplante de órganos (por ej., renal, hepático, pulmonar y cardíaco) y en personas con cáncer (p. ej., enfermedad de Hodgkin, leucemia o linfoma, y neoplasias mieloproliferativas como la mielofibrosis), y 3) individuos con enfermedades autoinmunes (p. ej., esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis y lupus eritematoso sistémico) con terapias que deprimen la respuesta inmunitaria. Se han notificado varios fármacos inmunosupresores en el contexto de la PML inducida por fármacos o PML asociada a fármacos. Por ejemplo, véase: Melis et al., CNS Drugs. 2015; 29(10): 879-91); Maas et al. J Neurol. Octubre de 2016; 263(10): 2004-21; Colin et al., Fundam Clin Pharmacol. Octubre 13 de 2016. Los medicamentos inmunosupresores pueden incluir, entre otros, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-1a, teriflunomida, mitoxantrona, ocrelizumab, abatacept, adalimumab, alefacept, alemtuzumab, anakinra, bortezomib (p. ej., VELCADE), eculizumab (p. ej., SOLIRIS), leflunomida y varios otros medicamentos para trasplantes como Ig antitimocitos, asparaginasa, azatioprina, basiliximab, belatacept, belimumab, bendamustina, bevacizumab, bleomicina, brentuximab vedotina, busulfano, capecitabina, carboplatino, carmustina, certolizumab, cetuximab, clorambucilo, cladribina, corticosteroides, ciclofosfamida, ciclosporina, quimioterapia citotóxica, daclizumab, fumarato de dimetilo, doxorrubicina, efalizumab, etanercept, etopósido, fingolimod, fludarabina, gemcitabina, hidrocortisona, ibritumomab tiuxetano, ibrutinib, idarrubicina, idelalisib, ifosfamida, imatinib, infliximab, lenalidomida, levamisol, mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, muromonab-CD3, micofenolato mofetilo, ácido micofenólico, natalizumab, obinutuzumab, ofatumumab, oxaliplatino, prednisona/prednisolona, rituximab, ruxolitinib, sirolimus (rapamicina), tacrolimus, tegafur/gimeracilo/oteracilo, tiotepa, tocilizumab, tofacitinib, ustekinumab, vedolizumab, vinblastina y vincristina. Algunos ejemplos de medicamentos inmunosupresores de molécula pequeña incluyen el fumarato de dimetilo, el fingolimod y el ruxolitinib. Una terapia inmunosupresora puede clasificarse como un agente terapéutico de Clase 1 (alto riesgo), tal como efalizumab y natalizumab, según se informa en Calabrese L. H. et al., Nat Rev Rheumatol. (2015).
En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser agentes de entrecruzamiento de ADN y/o ARN, incluyendo, agentes alquilantes, agentes alquilantes de mostaza nitrogenada, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas y fármacos anticancerígenos basados en platino. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la quinasa, incluida la fosfoinositida-3-quinasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la tirosina quinasa, incluidos los inhibidores de la región del grupo del punto de ruptura de la proteína de fusión-homólogo 1 del oncogén viral de leucemia murina de Abelson (BCR-ABL), tirosina quinasa de Bruton (BTK), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), quinasa Janus (JAK) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser anticuerpos monoclonales y/o conjugados anticuerpo-fármaco dirigidos contra proteínas que incluyen grupos de proteínas de diferenciación (CD), tales como CD2, CD3, CD11a, CD20, CD30, CD52; interleucinas (IL), tales como IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23; proteínas de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), tales como TNFa; e integrinas, tales como integrina a4. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de mTOR y/o calcineurina. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores del complemento. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser antimetabolitos inmunosupresores, inhibidores metabólicos de nucleósidos, nucleósidos de imidazol, análogos de nucleótidos, inhibidores de la síntesis de nucleósidos, inhibidores de la síntesis de purinas, inhibidores de la síntesis de pirimidinas o inhibidores de la pirimidina sintasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser proteínas recombinantes, tal como el interferón beta recombinante. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser moduladores del receptor de esfingosina-1-fosfato y/o del receptor nicotínico de acetilcolina. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser anticuerpos terapéuticos, incluida la inmunoglobulina G. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la asparaginasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores específicos del estimulador de linfocitos B (BLyS). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser moduladores de la coestimulación de las células T En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inmunosupresores polipeptídicos cíclicos y/o polipéptidos sintéticos que modifican los procesos inmunitarios. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser corticosteroides. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser fármacos quimioterapéuticos citotóxicos. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser antibióticos glucopéptidos citotóxicos y/o mezclas de los mismos. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser moléculas que inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser análogos de la talidomida. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de las vías de degradación celular, tal como los inhibidores del proteasoma.
La PML puede diagnosticarse en un paciente con un curso progresivo de la enfermedad, encontrando ADN del virus de JC en el líquido cefalorraquídeo en el presente documento junto con lesiones consistentes de la sustancia blanca en las imágenes de resonancia magnética (MRI) cerebral; alternativamente, una biopsia cerebral puede ser diagnóstica cuando la histopatología típica de desmielinización, astrocitos extraños y núcleos oligodendrogliales agrandados están presentes, junto con técnicas que muestran la presencia del virus de JC. La evidencia característica de la PML en las imágenes de escaneo de CT cerebral pueden ser lesiones hipodensas multifocales, sin realce de contraste y sin efecto de masa, pero la MRI puede ser más sensible que la CT. La zona más común de afectación puede ser la sustancia blanca cortical de los lóbulos frontal y parietooccipital, pero las lesiones pueden producirse en cualquier parte del cerebro, tal como los ganglios basales, la cápsula externa y estructuras de la fosa craneal posterior como el tronco encefálico y el cerebelo.
En general, el tratamiento de la PML tiene como objetivo revertir la inmunodeficiencia para ralentizar o detener el progreso de la enfermedad. Los pacientes en régimen de inmunosupresión pueden dejar de tomar el medicamento inmunosupresor o se puede recurrir al recambio plasmático (PLEX) para acelerar la eliminación del medicamento inmunosupresor que puso a la persona en riesgo de PML. Los pacientes infectados por el VIH pueden iniciar un tratamiento antirretroviral de gran actividad (HAART). La aparición de la PML también puede ocurrir en el contexto del síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (IRIS), en el que la aparición de la PML puede ocurrir o los síntomas de la PML pueden empeorar después del cese de la inmunosupresión (p. ej., de acuerdo con lo revisado por Pavlovic et al., Ther Adv Neurol Disord. noviembre de 2015; 8(6): 255 73 y Bowen et al., Nat Rev Neurol. Octubre 27 de 2016;12(11): 662-674). Por ejemplo, en pacientes con MS que desarrollan PML durante el tratamiento con natalizumab, a menudo se produce IRIS cuando se interrumpe el tratamiento y se utiliza PLEX para eliminar el natalizumab de la circulación del paciente. El tratamiento del IRIS en pacientes con PML puede incluir la administración de corticosteroides. Otros posibles tratamientos de la PML pueden incluir cidofovir, citarabina, fármaco antipalúdico mefloquina, interleucina-2 y 1-O-hexadeciloxipropil-cidofovir (CMX001, también conocido como brincidofovir). Según la revisión de Pavlovic (Ther Adv Neurol Disord. 2015 noviembre de; 8(6): 255-73), los tratamientos potenciales para la PML incluyen agentes antivirales (p. ej., clorpromazina, citalopram, mirtazapina, risperidona, ziprasidona, retro-2cycl, brefeldina A, cidofovir, brincidofovir, citarabina, ganciclovir, leflunomida, topotecano, mefloquina, 3-aminobenzamida, imatinib y Ag122), moduladores de la respuesta inmune (p. ej., IFN-alfa, IL-2, IL-7, maraviroc y glucocorticoides) e inmunización (p. ej., anticuerpos monoclonales recombinantes humanos VP-1 anti-JCV, terapia con linfocitos T citotóxicos específicos del<j>C<v>, IL-7 más vacuna VP1 contra el JCV y vacuna oral contra el JCV).
El término "rendimiento diagnóstico" como se usa en el presente documento se refiere al porcentaje de casos que identificarían la presencia de una o más variaciones genéticas (p. ej., CNV, SNV) en una cohorte de PML usando un ensayo. Por ejemplo, si 40 casos identificaran la presencia de una o más variaciones genéticas (p. ej., CNV, SNV) en una cohorte de 100 pacientes con PML, el rendimiento diagnóstico del ensayo es del 40 %. En algunos casos, los pacientes de la cohorte de PML son diagnosticados clínicamente con<p>M<l>. En algunos casos, un paciente es diagnosticado clínicamente con PML cuando el ADN del virus de JC está presente en el líquido cefalorraquídeo y se observan lesiones consistentes de la sustancia blanca en las imágenes de resonancia magnética (MRI) cerebral. En algunos casos, un paciente es diagnosticado clínicamente con PML cuando en una biopsia cerebral se observa la histopatología típica de desmielinización, astrocitos extraños y núcleos oligodendrogliales agrandados, junto con la presencia del virus de JC. En algunos casos, la cohorte de PML tiene al menos 5 casos de PML, p. ej., al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 casos de PML. En algunos casos, la cohorte de PML es una cohorte de las enumeradas en el presente documento. Por ejemplo, la cohorte de PML es la cohorte de pacientes con PML que aparece en la Tabla 7. En algunos casos, el ensayo es un ensayo de anticuerpos contra el JCV. En algunos casos, el ensayo no es un ensayo de anticuerpos contra el JCV. En algunos casos, el ensayo es un ensayo genético. En algunos casos, el ensayo genético comprueba la predisposición genética a la PML.
El ensayo genético puede comprender cualquier método divulgado en el presente documento. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos aproximadamente 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de aproximadamente 1 %-5 %, 1 %-10 %, 1 %-20 %, 5 %-10 %, 5 %-20 %, 10 %-20 %, 10 %-30 %, 20 %-30 %, 20 %-40 %, 30 %-40 %, 30 %-50 %, 40 %-50 %, 40 %-60 %, 50 %-60 %, 50 %-70 %, 60 %-70 %, 60 %-80 %, 70 %-80 %, 70 %-90 %, 80 %-90 %, 80 %-95 %, 90 %-95 %, 90 %-99 %, 90 %-100 %, 95 %-99 %, o 99 %-100 %.
Variaciones genéticas asociadas a la PML
La presente invención implica una variación genómica seleccionada de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. A continuación se ofrece una explicación general de las variaciones genéticas y se describen ejemplos de variaciones que no forman parte de la materia reivindicada en el presente documento, en la medida en que se refieren a variaciones distintas de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. En el presente documento se describen métodos que pueden utilizarse para detectar variaciones genéticas. La detección de variaciones genéticas específicas, p. ej., marcadores polimórficos y/o haplotipos, número de copias, ausencia o presencia de un alelo, o genotipo asociado con una afección (p. ej., enfermedad o trastorno) como se describe en el presente documento, puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica para analizar ácidos nucleicos y/o detectar secuencias en sitios polimórficos o genéticamente variables, p. ej., técnicas de amplificación, técnicas de hibridación, secuenciación, microarreglos/arreglos, o cualquier combinación de las mismas. De este modo, mediante el uso de estos métodos divulgados en el presente documento u otros métodos disponibles para el experto en la materia, pueden identificarse uno o más alelos en marcadores polimórficos, incluidos microsatélites, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variaciones de un solo nucleótido (SNV), inserciones/eliminaciones (indels), variaciones del número de copias (CNV) u otros tipos de variaciones genéticas, en una muestra obtenida de un sujeto.
Las secuencias genómicas dentro de las poblaciones muestran variabilidad entre individuos en muchas localizaciones del genoma. Por ejemplo, el genoma humano presenta variaciones de secuencia que se producen en promedio cada 500 pares de bases. Estas variaciones genéticas en las secuencias de ácido polinucleico se denominan comúnmente polimorfismos o sitios polimórficos. Como se utiliza en el presente documento, un polimorfismo, p. ej., una variación genética, incluye una variación en la secuencia del genoma entre una población, tal como variaciones alélicas y otras variaciones que surgen o se observan. De este modo, un polimorfismo se refiere a la aparición de dos o más secuencias o alelos alternativos determinados genéticamente en una población. Estas diferencias pueden darse en porciones codificantes (p. ej., exónicas) y no codificantes (p. ej., intrónicas o intergénicas) del genoma, y pueden manifestarse o detectarse como diferencias en las secuencias de ácidos polinucleicos, la expresión génica, incluyendo, p. ej., la transcripción, el procesamiento, la traducción, el transporte, el procesamiento de proteínas, el tráfico, la síntesis de ADN; las proteínas expresadas, otros productos génicos o productos de vías bioquímicas o en modificaciones postraduccionales y cualquier otra diferencia manifestada entre los miembros de una población. Los polimorfismos que surgen como resultado de un cambio de una sola base, tal como los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o variaciones de un solo nucleótido (SNV), pueden incluir una inserción, eliminación o cambio en un nucleótido. Un marcador o sitio polimórfico es el locus en el que se produce la divergencia. Estos sitios pueden ser tan pequeños como un par de bases (un SNP o SNV). Los marcadores polimórficos incluyen, entre otros, los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), el número variable de repeticiones en tándem (VNTR), las regiones hipervariables, los minisatélites, las repeticiones dinucleotídicas, las repeticiones trinucleotídicas, las repeticiones tetranucleotídicas y otros patrones de repetición, las repeticiones de secuencia simple y los elementos de inserción, tales comoAlu. Las formas polimórficas también se manifiestan como diferentes alelos mendelianos para un gen. Los polimorfismos pueden observarse por diferencias en las proteínas, las modificaciones de las proteínas, la modificación de la expresión del ARN, la mutilación del ADN y el ARN, los factores reguladores que alteran la expresión de los genes y la replicación del ADN, y cualquier otra manifestación de alteraciones en el ácido polinucleico genómico o en los ácidos polinucleicos de los orgánulos. Los expertos en la materia pueden apreciar que los polimorfismos se consideran a veces como una subclase de variaciones, definidas sobre la base de un corte de frecuencia particular en una población. Por ejemplo, se pueden considerar polimorfismos a las variantes/variaciones genéticas que se producen con una frecuencia >1 %, o >5 %, en la población.
Estas variaciones genéticas pueden encontrarse asociadas a uno o más trastornos y/o enfermedades utilizando los métodos divulgados en el presente documento. Estas variaciones genéticas pueden asociarse con la ausencia de uno o más trastornos y/o enfermedades (es decir, una o más variantes son protectoras contra el desarrollo del trastorno y/o enfermedades) utilizando los métodos divulgados en el presente documento.
Estas variaciones genéticas pueden comprender mutaciones puntuales, polimorfismos, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variaciones de un solo nucleótido (SNV), translocaciones, inserciones, eliminaciones, amplificaciones, inversiones, eliminaciones intersticiales, variaciones del número de copias (CNV), variación estructural (SV), pérdida de heterocigosidad, o cualquier combinación de las mismas. Como variación genética se incluye cualquier eliminación, inserción o sustitución de bases del ADN genómico de uno o más individuos de una primera porción de una población total que, de este modo, da lugar a una diferencia en el lugar de la eliminación, inserción o sustitución de bases con respecto a uno o más individuos de una segunda porción de la población total. Por lo tanto, el término "variación genética" abarca el "tipo silvestre" o la variación que se produce con más frecuencia, y también incluye la "mutante", o la variación que se produce con menos frecuencia. Un alelo de tipo silvestre puede denominarse alelo ancestral.
Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula diana que está "asociada con" o "correlacionada con" una variación genética particular es una molécula que puede distinguirse funcionalmente en su estructura, actividad, concentración, compartimentación, degradación, secreción y similares, tal como resultado de dicha variación genética. Los polimorfismos (p. ej., marcadores polimórficos, variaciones genéticas o variantes genéticas) pueden comprender cualquier posición nucleotídica en la que dos o más secuencias son posibles en una población de sujetos. Cada versión de una secuencia de nucleótidos, con respecto al polimorfismo/variación, puede representar un alelo específico del polimorfismo/variación. El ADN genómico de un sujeto puede contener dos alelos para cualquier marcador polimórfico dado, representativos de cada copia del marcador en cada cromosoma. Un alelo puede ser una secuencia de nucleótidos de una localización determinada en un cromosoma. Los polimorfismos/variaciones pueden comprender cualquier número de alelos específicos. Un polimorfismo/variación puede caracterizarse por la presencia de dos o más alelos en una población. El polimorfismo/variación puede caracterizarse por la presencia de tres o más alelos. El polimorfismo/variación puede caracterizarse por cuatro o más alelos, cinco o más alelos, seis o más alelos, siete o más alelos, nueve o más alelos, o diez o más alelos. Un alelo puede estar asociado con una o más enfermedades o trastornos, p. ej., un alelo de riesgo de PML puede ser un alelo que está asociado con un mayor o menor riesgo de desarrollar PML. Las variaciones genéticas y los alelos pueden utilizarse para asociar un fenotipo heredado a un genotipo responsable. Un alelo de riesgo de PML puede ser un alelo variante que está estadísticamente asociado con una detección de PML. Las variaciones genéticas pueden tener cualquier frecuencia medible en la población, p. ej., una frecuencia superior al 10 %, una frecuencia del 5-10 %, una frecuencia del 1-5 %, una frecuencia del 0.1-1 % o una frecuencia inferior al 0.1 %. Como se utiliza en el presente documento, los alelos variantes pueden ser alelos que difieren de un alelo de referencia. Tal y como se utiliza en el presente documento, una variante puede ser un segmento de ADN que difiere del ADN de referencia, tal como una variación genética. Las variaciones genéticas pueden utilizarse para rastrear la herencia de un gen que aún no se ha identificado, pero cuya localización aproximada se conoce.
Tal y como se utiliza en el presente documento, un "haplotipo" puede ser información relativa a la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos en una región cromosómica determinada en un sujeto. Un haplotipo puede ser un segmento de ADN caracterizado por uno o más alelos dispuestos a lo largo del segmento, p. ej., un haplotipo puede comprender un miembro del par de alelos para cada variación genética o locus. El haplotipo puede comprender dos o más alelos, tres o más alelos, cuatro o más alelos, cinco o más alelos, o cualquier combinación de los mismos, en el que, cada alelo puede comprender una o más variaciones genéticas a lo largo del segmento.
Una variación genética puede ser una aberración funcional que puede alterar la función génica, la expresión génica, la expresión polipeptídica, la función polipeptídica o cualquier combinación de las mismas. Una variación genética puede ser una mutación de pérdida de función, una mutación de ganancia de función, una mutación dominante negativa o una reversión. Una variación genética puede formar parte de la región codificante o de la región reguladora de un gen. Las regiones reguladoras pueden controlar la expresión de los genes y, por lo tanto, la expresión de los polipéptidos. Una región reguladora puede ser un segmento de ADN al que pueden unirse polipéptidos reguladores, p. ej., factores de transcripción o de empalme. Una región reguladora puede situarse cerca del gen que se está regulando, p. ej., posiciones secuencia arriba o secuencia abajo del gen que se está regulando. Una región reguladora (p. ej., un elemento potenciador) puede tener varios miles de pares de bases secuencia arriba o secuencia abajo de un gen.
Las variantes pueden incluir cambios que afectan a un polipéptido, tal como un cambio en el nivel de expresión, secuencia, función, localización, compañeros de unión o cualquier combinación de los mismos. Una variación genética puede ser una mutación con cambio de marco, una mutación no sentido, una mutación de sentido erróneo, una mutación neutra o una mutación silenciosa. Por ejemplo, las diferencias de secuencia, cuando se comparan con una secuencia de nucleótidos de referencia, pueden incluir la inserción o eliminación de un solo nucleótido, o de más de un nucleótido, que da como resultado un desplazamiento de marco; el cambio de al menos un nucleótido, que da como resultado un cambio en el aminoácido codificado; el cambio de al menos un nucleótido, que da como resultado la generación de un codón de parada prematuro; la eliminación de varios nucleótidos, que da como resultado la eliminación de uno o más aminoácidos codificados por los nucleótidos; la inserción de uno o varios nucleótidos, tal como por recombinación desigual o conversión génica, que da como resultado la interrupción de la secuencia codificante de un marco de lectura; la duplicación de toda o parte de una secuencia; la transposición; o el reordenamiento de una secuencia de nucleótidos. Tales cambios de secuencia pueden alterar el polipéptido codificado por el ácido nucleico, p. ej., si el cambio en la secuencia del ácido nucleico causa un desplazamiento de marco, el desplazamiento de marco puede dar lugar a un cambio en los aminoácidos codificados, y/o puede dar lugar a la generación de un codón de parada prematuro, causando la generación de un polipéptido truncado. Una variación genética asociada con PML puede ser un cambio sinónimo en uno o más nucleótidos, p. ej., un cambio que no resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos. Dicho polimorfismo puede, p. ej., alterar los sitios de empalme, afectar a la estabilidad o el transporte del ARNm, o afectar de otro modo a la transcripción o traducción de un polipéptido codificado. Una mutación sinónima puede dar lugar a que el producto polipeptídico tenga una estructura alterada debido al uso de codones poco frecuentes que afectan al plegamiento del polipéptido durante la traducción, lo que en algunos casos puede alterar su función y/o propiedades de unión a fármacos si se trata de una diana farmacológica. Los cambios que pueden alterar el Ad N aumentan la posibilidad de que se produzcan cambios estructurales, tal como amplificaciones o eliminaciones, a nivel somático. Un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia puede ser un polipéptido de referencia con una secuencia de aminoácidos de referencia particular, y los polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos variantes pueden ser polipéptidos variantes con secuencias de aminoácidos variantes.
Las variantes de secuencia más comunes comprenden variaciones de base en una única posición de base en el genoma, y dichas variantes de secuencia, o polimorfismos, se denominan comúnmente polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o variantes de un solo nucleótido (SNV). Un SNP puede representar una variante genética presente en una frecuencia mayor o igual al 1 % en una población y un SNP o una SNV puede representar una variante genética presente en cualquier nivel de frecuencia en una población. Un SNP puede ser una variación en la secuencia de nucleótidos que se produce cuando un solo nucleótido en un lugar del genoma difiere entre miembros de una especie o entre cromosomas emparejados de un sujeto. Los SNP pueden incluir variantes de un solo nucleótido, p. ej., en una posición de nucleótido determinada, algunos sujetos pueden tener una "G", mientras que otros pueden tener una "C". Los SNP pueden producirse en un único evento mutacional, por lo que puede haber dos alelos posibles en cada sitio del SNP: el alelo original y el alelo mutado. Los SNP que tienen dos bases diferentes en una única posición nucleotídica se denominan SNP bialélicos, los que tienen tres se denominan trialélicos y los que tienen las cuatro bases representadas en la población son cuadralélicos. Los SNP pueden considerarse neutros. Los SNP pueden afectar a la susceptibilidad a una enfermedad (p. ej., p Ml ). Los polimorfismos SNP pueden tener dos alelos, p. ej., un sujeto puede ser homocigoto para un alelo del polimorfismo en el que ambas copias cromosómicas del individuo tienen el mismo nucleótido en la localización del SNP, o un sujeto puede ser heterocigoto en el que los dos cromosomas hermanos del sujeto contienen nucleótidos diferentes. La nomenclatura de SNP presentada en el presente documento es el marcador oficial de identificación ID del SNP de referencia (rs) asignada a cada SNP único por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).
Otras variaciones genéticas de la divulgación pueden ser las variaciones en el número de copias (CNV). Tal y como se utiliza en el presente documento, las "CNV" incluyen alteraciones del ADN de un genoma que dan lugar a un número anormal de copias de una o más secciones de ADN. Una CNV puede comprender una subregión de CNV. Tal y como se utiliza en el presente documento, una "subregión de la CNV" incluye una secuencia continua de nucleótidos dentro de una CNV. La secuencia de nucleótidos de una subregión de CNV puede ser más corta que la secuencia de nucleótidos de la CNV. La subregión de CNV puede ser equivalente a la CNV (p. ej., tal como en el caso de algunas CNV). Las CNV pueden ser heredadas o causadas por mutaciones de novo y pueden ser responsables de una parte sustancial de la variabilidad fenotípica humana, de los rasgos de comportamiento y de la susceptibilidad a las enfermedades. Las CNV de la presente divulgación pueden asociarse con la susceptibilidad a una o más afecciones, p. ej., PML. Las CNV pueden incluir un único gen o incluir un conjunto contiguo de genes. Las CNV pueden estar causadas por reordenamientos estructurales del genoma, p. ej., translocaciones o inversiones desequilibradas, inserciones, eliminaciones, amplificaciones y eliminaciones intersticiales. Estos reordenamientos estructurales pueden producirse en uno o varios cromosomas. Las repeticiones de baja copia (CSF), que son secuencias repetidas específicas de una región (también conocidas como duplicaciones segmentarias), pueden ser susceptibles a estos reordenamientos estructurales, que da como resultado CNV. Factores como el tamaño, la orientación, el porcentaje de similitud y la distancia entre las copias pueden influir en la susceptibilidad de las CSF al reordenamiento genómico. Además, los reordenamientos pueden estar mediados por la presencia de repeticiones de alto número de copias, tal como elementos intercalados largos (LINE) y elementos intercalados cortos (SINE), a menudo a través de recombinación no homóloga. Por ejemplo, los reordenamientos cromosómicos pueden surgir de la recombinación homóloga no alélica durante la meiosis o a través de un mecanismo basado en la replicación, tal como el bloqueo de horquilla y el cambio de molde (FoSTeS) (Zhang F. et al., Nat. Genet. (2009)) o la reparación inducida por rotura mediada por microhomología (MMBIR) (Hastings P J. et al., PLoS Genetics (2009)). Las CNV pueden llamarse variantes estructurales, que son una clase más amplia de variante que también incluye alteraciones neutras del número de copias, tal como inversiones equilibradas y translocaciones equilibradas.
Las CNV pueden explicar la variación genética que afecta a una proporción sustancial del genoma humano, p. ej., las CNV conocidas pueden cubrir más del 15 % de la secuencia del genoma humano (Estivill y Armengol, PLoS Genetics (2007)). Las CNV pueden afectar a la expresión génica, la variación fenotípica y la adaptación al interrumpir o alterar la dosificación génica, y pueden causar enfermedades, p. ej., trastornos por microeliminación y microduplicación, y pueden conferir susceptibilidad a enfermedades y trastornos. Puede encontrarse información actualizada sobre la ubicación, el tipo y el tamaño de las CNV conocidas en una o varias bases de datos, p. ej., la Base de Datos de Variantes Genómicas (véase, MacDonald JR et al., Nucleic Acids Res., 42, D986-92 (2014), que actualmente contiene datos de más de 500,000 CNV (a mayo de 2016).
Otros tipos de variantes de secuencia pueden encontrarse en el genoma humano y pueden asociarse con una enfermedad o trastorno, incluyendo, pero no limitándose a, microsatélites. Los marcadores microsatélite son estables, polimórficos, fáciles de analizar y pueden aparecer regularmente en todo el genoma, lo que los hace especialmente adecuados para el análisis genético. Un microsatélite polimórfico puede comprender múltiples repeticiones pequeñas de bases, p. ej., repeticiones de CA, en un sitio concreto en el que el número de longitudes de repetición varía en una población. Los microsatélites, p. ej., el número variable de repeticiones en tándem (VNTR), pueden ser segmentos cortos de ADN que tienen una o más secuencias repetidas, p. ej., aproximadamente de 2 a 5 nucleótidos de longitud, que pueden ocurrir en el ADN no codificante. Los cambios en los microsatélites pueden producirse durante la recombinación genética de la reproducción sexual, aumentando o disminuyendo el número de repeticiones que se encuentran en un alelo, o cambiando la longitud del alelo.
Las variaciones genéticas divulgadas en el presente documento pueden asociarse con un riesgo de desarrollar PML en un sujeto. En algunos casos, el sujeto puede tener un riesgo disminuido debido a la ausencia de una o más variaciones genéticas que alteren o modulen un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 1 a 26. Por ejemplo, el sujeto puede tener un riesgo disminuido debido a la ausencia de una o más variaciones genéticas que alteren o modulen un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 3 y 6. En algunos casos, el sujeto puede tener un riesgo aumentado debido a la presencia de una o más variaciones genéticas que alteran o modulan un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 1 a 26. Por ejemplo, el sujeto puede tener un riesgo aumentado debido a la presencia de una o más variaciones genéticas que alteren o modulen un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 3 y 6. En algunos casos, uno o más genes enumerados en las Tablas 25A, 25B y 26 pueden eliminarse de cualquiera de las Tablas 1-24. En algunos casos, uno o más genes enumerados en las Tablas 25A, 25B y 26 pueden añadirse a cualquiera de las Tablas 1-24.
Tabla 25A: panel eemplar de 8 enes
Tabla 25B: panel eemplar de 16 enes
Tabla 26: panel ejemplar de 2 genes
Sujetos
Un "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, puede ser un individuo de cualquier edad o sexo del que se obtiene una muestra que contiene polinucleótidos para su análisis mediante uno o más métodos descritos en el presente documento con el fin de obtener información sobre el ácido polinucleico; p. ej., un adulto de sexo masculino o femenino, un niño, un recién nacido o un feto. Un sujeto puede ser cualquier diana de administración terapéutica. Un sujeto puede ser un sujeto de prueba o un sujeto de referencia.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "cohorte" puede representar un grupo étnico, un grupo de pacientes, un grupo de edad particular, un grupo no asociado con una afección particular (p. ej., enfermedad o trastorno), un grupo asociado con una afección particular (p. ej., enfermedad o trastorno), un grupo de sujetos asintomáticos, un grupo de sujetos sintomáticos, o un grupo o subgrupo de sujetos asociados con una respuesta particular a un régimen de tratamiento o inscritos en un ensayo clínico. Un paciente puede ser un sujeto aquejado de una afección (p. ej., enfermedad o trastorno). Un paciente puede ser un sujeto no afectado por una afección (p. ej., enfermedad o trastorno) y considerado aparentemente sano, o un sujeto normal o de control. Un sujeto puede ser un sujeto de prueba, un paciente o un candidato a una terapéutica, en el que el ADN genómico del sujeto, paciente o candidato se obtiene para su análisis mediante uno o más métodos de la presente divulgación, con el fin de obtener información sobre la variación genética del sujeto, paciente o candidato.
La muestra de ácido polinucleico puede obtenerse prenatalmente de un feto o embrión o de la madre, p. ej., de células fetales o embrionarias en la circulación materna. La muestra de ácido polinucleico puede obtenerse con la ayuda de un profesional sanitario, p. ej., para extraer sangre. La muestra de ácido polinucleico puede obtenerse sin la asistencia de un profesional sanitario, p. ej., cuando la muestra de ácido polinucleico se obtiene de forma no invasiva, tal como una muestra de saliva, o una muestra que comprende células bucales que se obtiene utilizando un hisopo o cepillo bucal, o una muestra de enjuague bucal.
La presente divulgación también proporciona métodos para evaluar variaciones genéticas en sujetos que son miembros de una población diana. Dicha población diana puede ser una población o grupo de sujetos en riesgo de desarrollar la afección (p. ej., enfermedad o trastorno), basándose, p. ej., en otros factores genéticos, biomarcadores, parámetros biofísicos, pruebas diagnósticas como las imágenes de resonancia magnética (MRI), antecedentes familiares de la afección, detección previo o historial médico, o cualquier combinación de los mismos.
Las variaciones genéticas de la presente divulgación que se encuentren asociadas con una afección (p. ej., enfermedad o trastorno) pueden mostrar una asociación similar en otras poblaciones humanas. Por lo tanto, también se contemplan poblaciones humanas de sujetos y dentro del alcance de la divulgación. Los sujetos humanos pueden pertenecer a una o más poblaciones humanas, incluidas, entre otras, poblaciones caucásicas, judías asquenazíes, judías sefardíes, europeas, americanas, euroasiáticas, asiáticas, centro/sudasiáticas, asiáticas orientales, de Oriente Medio, africanas, hispanas, caribeñas y oceánicas. Las poblaciones europeas incluyen, entre otras, suecas, noruegas, finlandesas, rusas, danesas, islandesas, irlandesas, celtas, inglesas, escocesas, neerlandesas, belgas, francesas, alemanas, españolas, portuguesas, italianas, polacas, búlgaras, eslavas, serbias, bosnias, checas, griegas y turcas. La contribución étnica en los sujetos también puede determinarse mediante análisis genéticos; p. ej., el análisis genético de la ascendencia puede llevarse a cabo utilizando marcadores de microsatélite no vinculados o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como los expuestos en Smithet al.,(Smith M. W. et al., Am. J. Hum. Genet, 74: 1001 (2004)).
Ciertas variaciones genéticas pueden tener frecuencias poblacionales diferentes en poblaciones diferentes, o ser polimórficas en una población, pero no en otra. Los métodos disponibles y tal como se plantean en el presente documento pueden aplicarse para poner en práctica la presente divulgación en cualquier población humana. Esto puede incluir la evaluación de las variaciones genéticas de la presente divulgación, con el fin de identificar los marcadores que dan la asociación más fuerte dentro de la población específica. De este modo, las variantes de riesgo de la presente divulgación pueden residir en diferentes haplotipos y en diferentes frecuencias en diversas poblaciones humanas.
Afecciones y medicamentos inmunosupresores
Un sujeto puede ser diagnosticado o no diagnosticado con una afección (p. ej., enfermedad o trastorno), puede ser asintomático o sintomático, puede tener susceptibilidad aumentada o disminuida a una afección (p. ej., enfermedad o trastorno), puede estar actualmente bajo o previamente bajo o no bajo un tratamiento para una afección (p. ej., enfermedad o trastorno), o cualquier combinación de los mismos. La afección puede ser sida, cáncer, trasplante de órganos, tuberculosis, sarcoidosis o una enfermedad autoinmune. La afección puede ser PML.
Un sujeto puede ser diagnosticado o no diagnosticado con PML, puede ser asintomático o sintomático, puede tener susceptibilidad aumentada o disminuida a PML, puede estar actualmente bajo o previamente bajo o no bajo un tratamiento para PML, o cualquier combinación de los mismos. Un sujeto puede estar diagnosticado o no de SIDA (p. ej., individuos infectados por el VIH), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una susceptibilidad aumentada o disminuida al SIDA, puede estar sometido actual o con anterioridad a un tratamiento contra el SIDA, o no estarlo, o cualquier combinación de los mismos. Un sujeto puede estar diagnosticado o no de cáncer (p. ej., enfermedad de Hodgkin, leucemia, linfoma o mielofibrosis), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una susceptibilidad aumentada o disminuida al cáncer, puede estar sometido actual o con anterioridad a un tratamiento contra el cáncer, o no estarlo, o cualquier combinación de los mismos. Un sujeto puede estar actualmente diagnosticado o previamente diagnosticado o no diagnosticado de una enfermedad autoinmune (p. ej., esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, lupus eritematoso sistémico), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una susceptibilidad aumentada o disminuida a una enfermedad autoinmune, puede estar actualmente sometido o previamente sometido o no a un tratamiento para una enfermedad autoinmune, o cualquier combinación de los mismos.
Se entiende que el término "cáncer" incluye todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos malignamente transformados, independientemente del tipo histopatológico o estadio de invasividad. Un tumor metastásico puede surgir de multitud de tipos de tumores primarios, incluidos, entre otros, los de mama, pulmón, hígado, colon y ovario. Algunos ejemplos de cánceres son, entre otros, fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer cerebral, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mielofibrosis o sarcoma de Kaposi.
El término "enfermedad autoinmune" incluye todos los tipos de estados patológicos que surgen de respuestas inmunes anormales del cuerpo a sustancias y tejidos que están normalmente presentes en el cuerpo. Ejemplos de enfermedades autoinmunes son, entre otras, la enfermedad de Addison, la encefalitis por receptores anti-NMDA, el síndrome antisintetasa, la anemia aplásica, las anemias autoinmunes, la anemia hemolítica autoinmune, la pancreatitis autoinmune, la enfermedad de Behcet, los trastornos bullosos de la piel, la enfermedad celíaca - esprúe (enteropatía sensible al gluten), síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucemia linfocítica crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, enfermedad de Devic, eritroblastopenia, síndrome de Evans, glomeruloesclerosis segmentaria focal, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedades autoinmunes mediadas por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, miastenia gravis, mieloma, linfoma no Hodgkin, síndrome opsoclonomioclono (OMS), penfigoide, pénfigo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, psoriasis, aplasia pura de eritrocitos, artritis reactiva, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, diabetes de tipo I, colitis ulcerosa, vasculitis (por ej., vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos) y vitíligo.
Un sujeto puede ser tratado actualmente con un medicamento inmunosupresor. Un sujeto puede ser tratado previamente con un medicamento inmunosupresor. Un sujeto puede no estar aún tratado con un medicamento inmunosupresor. El medicamento inmunosupresor puede incluir, entre otros, glucocorticoides, citostáticos, anticuerpos, fármacos que actúan sobre las inmunofilinas, interferones, opioides, proteínas de unión al TNF, micofenolato u otros agentes biológicos pequeños. Por ejemplo, los glucocorticoides pueden incluir, entre otros, cortisol (hidrocortisona), cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA) o aldosterona. Los citostáticos pueden incluir, entre otros, mostazas nitrogenadas (p. ej., ciclofosfamida), nitrosoureas, compuestos de platino, análogos del ácido fólico como el metotrexato, análogos de las purinas como la azatioprina y la mercaptopurina, análogos de las pirimidinas como el fluorouracilo, inhibidores de la síntesis de proteínas, antibióticos citotóxicos como la dactinomicina, las antraciclinas, la mitomicina C, la bleomicina o la mitramicina. Los anticuerpos pueden incluir, entre otros, anticuerpos policlonales como atgam y timoglobulina, anticuerpos monoclonales como anticuerpos dirigidos contra CD25 y CD3, muromonab-CD3, basiliximab (p. ej., SIMULECT) y daclizumab (p. ej., ZENAPAX). Los fármacos que actúan sobre las inmunofilinas pueden ser, entre otros, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus o everolimus. Las proteínas de unión al TNF pueden incluir, entre otras, infliximab (p. ej., REMICADE), etanercept (p. ej., ENBREL) o adalimumab (p. ej., HUMIRA). Otros agentes biológicos pequeños pueden incluir, entre otros, el fingolimod y la miriocina.
El medicamento inmunosupresor puede ser fármacos para el tratamiento de la esclerosis múltiple, entre ellos, interferón beta-1a (p. ej., AVONEX, REBIF), interferón beta-1b (p. ej., BETASERON, EXTAVIA), acetato de glatiramero (p. ej., Co PAXONE, GLATOPA), peginterferón beta-1a (p. ej., PLEGRIDY), teriflunomida (p. ej., AUBAGIO), fingolimod (p. ej., GILENYA), fumarato de dimetilo (p. ej., TECFIDERA), alemtuzumab (p. ej., LEMTRADA), mitoxantrona (p. ej., N<o>V<a>NTRONE), natalizumab (p. ej., TYSABRI), daclizumab (p. ej., ZINBRYTA) u ocrelizumab (p. ej., OCREVUS).
El medicamento inmunosupresor puede ser adalimumab (p. ej., HUMIRA), alemtuzumab (p. ej., LEMTRADA), alentuzumab (p. ej., CAMpAt H), azatioprina (p. ej., IMUrAn ), belimumab (p. ej., BENLYs Ta ), bevacizumab (p. ej., AVASTATIN), bortezomib (p. ej., VEL<c>A<d>E), eculizumab (p. ej., SOLIRIS), leflunomida, brentuximab vedotina (p. ej., ADCETRIS), cetuximab (p. ej., ERBITUX), ciclofosfamida, fumarato de dimetilo (p. ej., TECFID<e>R<a>), efalizumab (p. ej., RAPTIVA), fingolimod (p. ej., GILENYA), fludarabina (p. ej., FLUDARA), ácido fumárico, imatinib (p. ej., Gl e Ev EC, GLIVEC), infliximab (p. ej., REMiCa DE), metotrexato (p. ej., Tr Ex ALL, RHEUMATREX), micofenolato de mofetilo (p. ej., CELLCe Pt ), natalizumab (p. ej., TYSABRI), daclizumab (p. ej., ZINBRYTA), rituximab (p. ej., RITUXIN), vedolizumab (p. ej., ENTYVIO), ruxolitinib (p. ej., JAKAFI, JAKAVI) u ocrelizumab (p. ej., Ocrevus).
Muestras
Las muestras que son adecuadas para su uso en los métodos descritos en el presente documento pueden ser muestras de ácido polinucleico de un sujeto. Una "muestra de ácido polinucleico", tal como se utiliza en el presente documento, puede incluir ARN o ADN, o una combinación de ambos. Una "muestra de polipéptidos" (p. ej., péptidos o proteínas, o fragmentos de los mismos) puede utilizarse para determinar la información de que se ha producido un cambio de aminoácidos, que es el resultado de una variante genética. Los ácidos polinucleicos y los polipéptidos pueden extraerse de una o más muestras, incluidas, entre otras, sangre, saliva, orina, raspados mucosos del revestimiento de la boca, expectorante, suero, lágrimas, piel, tejido o cabello. Una muestra de ácido polinucleico puede analizarse para obtener información sobre el ácido polinucleico. "Información sobre el ácido polinucleico", tal como se utiliza en el presente documento, incluye una secuencia de ácido polinucleico en sí, la presencia/ausencia de variación genética en la secuencia de ácido polinucleico, una propiedad física que varía en función de la secuencia del ácido polinucleico (p. ej., Tm) y la cantidad de ácido polinucleico (p. ej., el número de copias de ARNm). Por "ácido polinucleico" se entiende cualquiera de los siguientes: ADN, ARN, ADN con nucleótidos artificiales o ARN con nucleótidos artificiales. Tal como se utiliza en el presente documento, un "ácido polinucleico purificado" incluye ADNc, fragmentos de ácidos polinucleicos genómicos, ácidos polinucleicos producidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ácidos polinucleicos formados por tratamiento con enzimas de restricción de ácidos polinucleicos genómicos, ácidos polinucleicos recombinantes y moléculas de ácido polinucleico sintetizadas químicamente. Una molécula de ácido polinucleico "recombinante" incluye una molécula de ácido polinucleico fabricada mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, p. ej., por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos polinucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. Tal como se utiliza en el presente documento, un "polipéptido" incluye proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos, ya sean aislados de fuentes naturales, producidos mediante técnicas recombinantes o sintetizados químicamente. Un polipéptido puede tener una o más modificaciones, tal como una modificación postraduccional (p. ej., glicosilación, fosforilación, etc.) o cualquier otra modificación (p. ej., pegilación, etc.). El polipéptido puede contener uno o más aminoácidos no naturales (p. ej., tal como un aminoácido con una modificación de la cadena lateral).
La muestra de ácido polinucleico puede comprender células o tejidos, p. ej., líneas celulares. Algunos tipos celulares ejemplares a partir de los cuales pueden obtenerse ácidos nucleicos mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, los siguientes: una célula sanguínea, tal como un linfocito B, un linfocito T, un leucocito, un eritrocito, un macrófago o un neutrófilo; una célula muscular, tal como una célula esquelética, una célula muscular lisa o una célula muscular cardiaca; una célula germinal, tal como un espermatozoide o un óvulo; una célula epitelial; una célula del tejido conjuntivo, tal como un adipocito, un condrocito, un fibroblasto o un osteoblasto; una neurona; un astrocito; una célula estromal; una célula específica de un órgano, tal como una célula renal, una célula pancreática, una célula hepática o un queratinocito; una célula madre; o cualquier célula que se desarrolle a partir de ellas. Una célula a partir de la cual pueden obtenerse ácidos nucleicos puede ser una célula sanguínea o un tipo particular de célula sanguínea incluyendo, p. ej., una célula madre hematopoyética o una célula que surge de una célula madre hematopoyética como un glóbulo rojo, un linfocito B, un linfocito T, una célula asesina natural, un neutrófilo, un basófilo, un eosinófilo, un monocito, un macrófago o una plaqueta. En general, puede utilizarse cualquier tipo de célula madre, incluyendo, sin limitación, una célula madre embrionaria, una célula madre adulta o una célula madre pluripotente.
Una muestra de ácido polinucleico puede procesarse para el aislamiento de ARN o ADN, p. ej., el ARN o ADN de una muestra de células o tejido puede separarse de otros componentes de la muestra de ácido polinucleico. Las células pueden extraerse de una muestra de ácido polinucleico mediante técnicas estándar, p. ej., centrifugando una muestra de células y resuspendiendo las células precipitadas, p. ej., en una solución tamponada, p. ej., solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tras centrifugar la suspensión celular para obtener un sedimento celular, las células pueden lisarse para extraer el ADN. La muestra de ácido nucleico puede concentrarse y/o purificarse para aislar el ADN. Todas las muestras de ácido nucleico obtenidas de un sujeto, incluidas las sometidas a cualquier tipo de procesamiento posterior, se consideran obtenidas del sujeto. Para extraer ARN o ADN de una muestra de ácido nucleico se pueden utilizar técnicas y kits estándar conocidos en la técnica, tal como p. ej., la extracción con fenol, un kit para tejido QIAAMP® (Qiagen, Chatsworth, California), un kit de purificación de ADN genómico WIZARD® (Promega) o un método Autopure de Qiagen que utiliza la química Puregene, que puede permitir la purificación de ADN altamente estable y adecuado para archivo.
Determinar la identidad de un alelo o determinar el número de copias puede, pero no es necesario, incluir la obtención de una muestra de ácido polinucleico que comprenda ARN y/o ADN de un sujeto, y/o evaluar la identidad, el número de copias, la presencia o ausencia de una o más variaciones genéticas y sus localizaciones cromosómicas dentro del ADN genómico (es decir, el genoma del sujeto) derivado de la muestra de ácido polinucleico.
El individuo u organización que realiza la determinación no necesita realmente llevar a cabo el análisis físico de una muestra de ácido nucleico de un sujeto. Los métodos pueden incluir el uso de información obtenida mediante el análisis de la muestra de ácido polinucleico por un tercero. Los métodos pueden incluir etapas que tienen lugar en más de un sitio. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de ácido polinucleico de un sujeto en un primer lugar, tal como en un centro sanitario o en el domicilio del sujeto en el caso de un kit de autodiagnóstico. La muestra de ácido polinucleico puede analizarse en el mismo lugar o en un segundo lugar, p. ej., en un laboratorio u otro centro de pruebas.
Ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en el presente documento pueden utilizarse en métodos y kits de la presente divulgación. Los aptámeros que se unen específicamente a los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en el presente documento pueden utilizarse en los métodos y kits de la presente divulgación. Tal como se utiliza en el presente documento, un ácido nucleico puede comprender un desoxirribonucleótido (ADN) o un ribonucleótido (ARN), ya sea singular o en polímeros, de origen natural o no natural, de doble cadena o de cadena sencilla, codificante, p. ej., un gen traducido, o no codificante, p. ej., una región reguladora, o cualquier fragmento, derivado, mimético o complemento de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender oligonucleótidos, nucleótidos, polinucleótidos, secuencias de ácidos nucleicos, secuencias genómicas, ADN complementario (ADNc), ácidos nucleicos antisentido, regiones de ADN, sondas, cebadores, genes, regiones reguladoras, intrones, exones, marcos de lectura abierta, sitios de unión, ácidos nucleicos diana y ácidos nucleicos específicos de alelo.
Una "sonda", tal como se usa en el presente documento, incluye un fragmento de ácido nucleico para examinar un ácido nucleico en un espécimen usando la reacción de hibridación basada en la complementariedad del ácido nucleico.
Un "híbrido", tal como se utiliza en el presente documento, incluye una doble cadena formada entre cualquiera de los ácidos nucleicos antes mencionados, dentro del mismo tipo, o a través de diferentes tipos, incluyendo, ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN o similares.
Los ácidos nucleicos "aislados", tal y como se utilizan en el presente documento, están separados de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean el gen o la secuencia de nucleótidos (como en las secuencias genómicas) y/o han sido total o parcialmente purificados de otras secuencias transcritas (p. ej., tal como en una biblioteca de ARN). Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados de la divulgación pueden estar sustancialmente aislados con respecto al medio celular complejo en el que se encuentran de forma natural, o al medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o a precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. En algunos casos, el material aislado puede formar parte de una composición, p. ej., un extracto crudo que contenga otras sustancias, un sistema tampón o una mezcla de reactivos. El material puede purificarse hasta alcanzar la homogeneidad esencial utilizando métodos conocidos en la técnica, p. ej., mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) o cromatografía en columna (p. ej., HPLC). Con respecto al ADN genómico (ADNg), el término "aislado" también puede referirse a los ácidos nucleicos que están separados del cromosoma con el que el ADN genómico está asociado de forma natural. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de los nucleótidos que flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADNg de la célula de la que se deriva la molécula de ácido nucleico.
Los ácidos nucleicos que pueden fusionarse a otras secuencias codificantes o reguladoras pueden considerarse aislados. Por ejemplo, el ADN recombinante contenido en un vector se incluye en la definición de "aislado" usado en el presente documento. Los ácidos nucleicos aislados pueden incluir moléculas de ADN recombinante en células huésped heterólogas u organismos heterólogos, así como moléculas de ADN parcial o sustancialmente purificadas en solución. Los ácidos nucleicos aislados también abarcan los transcripciones de ARNin vivoein vitrode las moléculas de ADN de la presente divulgación. Una molécula aislada de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos puede sintetizarse químicamente o por medios recombinantes. Tales secuencias nucleotídicas aisladas pueden ser útiles, p. ej., en la fabricación del polipéptido codificado, tal como sondas para aislar secuencias homólogas (p. ej., de otras especies de mamíferos), para el mapeo de genes (p. ej., por hibridaciónin situcon cromosomas), o para detectar la expresión del gen, en tejido (p. ej., tejido humano), tal como por análisis de transferencia Northern u otras técnicas de hibridación divulgadas en el presente documento. La divulgación también se refiere a secuencias de ácido nucleico que hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, tal como para hibridación selectiva, a una secuencia nucleotídica descrita en el presente documento. Tales secuencias de ácido nucleico pueden detectarse y/o aislarse mediante hibridación específica de alelo o secuencia (p. ej., en condiciones de alta rigurosidad). Las condiciones de rigurosidad y los métodos para las hibridaciones de ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., John Wiley & Sons, (1998), y Kraus, M. y Aaronson, S., Methods Enzymol, 200: 546-556 (1991).
Los cálculos de "identidad" o "porcentaje de identidad" entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden determinarse alineando las secuencias con fines de comparación óptima (p. ej., pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia). A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones correspondientes, y el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100). Por ejemplo, si una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias.
La longitud de una secuencia alineada con fines de comparación puede ser de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, de la longitud de la secuencia de referencia. La comparación real de las dos secuencias puede realizarse por métodos bien conocidos, p. ej., utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de dicho algoritmo matemático se describe en Karlin, S. y Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90-5873-5877 (1993). Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0), tal y como se describe en Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se puede utilizar cualquier parámetro relevante de los respectivos programas (p. ej., NBLAST). Por ejemplo, los parámetros para la comparación de secuencias pueden establecerse en puntuación = 100, longitud de palabra = 12, o pueden variarse (p. ej., W=5 o W=20). Otros ejemplos son el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989), ADVANCE, ADAM,<b>L<a>T y FASTA. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede obtenerse utilizando, p. ej., el programa GAP del paquete de software GCG (Accelrys, Cambridge, Reino Unido).
Las "sondas" o "cebadores" pueden ser oligonucleótidos que se hibridan de forma específica de la base con una cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico. Las sondas pueden incluir cebadores, que pueden ser una sonda oligonucleotídica monocatenaria que puede actuar como punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida por molde utilizando métodos que incluyen, entre otros, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (CSF) para la amplificación de una secuencia diana. Los oligonucleótidos, tal como se describen en el presente documento, pueden incluir segmentos o fragmentos de secuencias de ácido nucleico, o sus complementos. Los segmentos de ADN pueden tener entre 5 y 10,000 bases contiguas, y pueden oscilar entre 5, 10, 12, 15, 20 o 25 nucleótidos y 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 o 10,000 nucleótidos. Además de ADN y ARN, las sondas y los cebadores pueden incluir ácidos nucleicos polipeptídicos (PNA), tal como se describe en Nielsen, P et al., Science 254: 1497-1500 (1991). Una sonda o cebador puede comprender una región de secuencia nucleotídica que hibrida con al menos aproximadamente 15, típicamente aproximadamente 20-25, o aproximadamente 40, 50, 60 o 75, nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico.
La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados, p. ej., sondas o cebadores, que contienen un fragmento o porción que puede hibridar selectivamente con un ácido nucleico que comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos, en la que la secuencia de nucleótidos puede comprender al menos un polimorfismo o alelo polimórfico contenido en las variaciones genéticas descritas en el presente documento o el nucleótido de tipo silvestre que se encuentra en la misma posición, o los complementos de los mismos. La sonda o el cebador pueden ser al menos un 70 % idénticos, al menos un 80 % idénticos, al menos un 85 % idénticos, al menos un 90 % idénticos, o al menos un 95 % idénticos, a la secuencia contigua de nucleótidos o al complemento de la secuencia contigua de nucleótidos.
Una sonda de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido capaz de hibridar con una región complementaria de un gen asociado con una afección (p. ej., PML) que contiene una variación genética descrita en el presente documento. Los fragmentos de ácido nucleico de la divulgación pueden utilizarse como sondas o cebadores en ensayos como los descritos en el presente documento.
Los ácidos nucleicos de la divulgación, tal como los descritos anteriormente, pueden identificarse y aislarse utilizando técnicas de biología molecular estándar bien conocidas por el experto. El ADN puede amplificarse y/o marcarse (p. ej., radiomarcado, marcado con fluorescencia) y utilizarse como sonda para la detección, p. ej., de una biblioteca de ADNc derivada de un organismo. El ADNc puede derivarse del ARNm y puede estar contenido en un vector adecuado. Por ejemplo, se pueden aislar los clones correspondientes, obtener ADN tras la escisiónin vivoy secuenciar el inserto clonado en una o ambas orientaciones mediante métodos reconocidos en la técnica para identificar el marco de lectura correcto que codifica un polipéptido del peso molecular adecuado. Utilizando estos métodos u otros similares, el polipéptido y el ADN que codifica el polipéptido pueden aislarse, secuenciarse y caracterizarse adicionalmente.
El ácido nucleico puede comprender uno o más polimorfismos, variaciones o mutaciones, p. ej., polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variaciones de un solo nucleótido (SNV), variaciones del número de copias (CNV), p. ej., inserciones, eliminaciones, inversiones y translocaciones. Los ácidos nucleicos pueden comprender análogos, p. ej., fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonato de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos 2-0-metilo, o ácidos nucleicos modificados, p. ej., residuos o enlaces de cadenas modificadas, o ácidos nucleicos combinados con carbohidratos, lípidos, polipéptidos u otros materiales, o ácidos nucleicos peptídicos (PNA), p. ej., cromatina, ribosomas y transcriptosomas. Los ácidos nucleicos pueden comprender ácidos nucleicos en diversas estructuras, p. ej., ADN A, ADN B, ADN en forma de Z, ARNip, ARNt y ribozimas. El ácido nucleico puede ser natural o no naturalmente polimórfico, p. ej., tener una o más diferencias de secuencia, p. ej., adiciones, supresiones y/o sustituciones, en comparación con una secuencia de referencia. Una secuencia de referencia puede basarse en información disponible públicamente, p. ej., la U.C. Santa Cruz Human Genome Browser Gateway (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) o el sitio web del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Un practicante de la presente divulgación puede determinar una secuencia de referencia utilizando métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., secuenciando un ácido nucleico de referencia.
Una sonda puede hibridar con un alelo, SNP, SNV, o CNV como se describe en el presente documento. La sonda puede unirse a otra secuencia marcadora asociada a PML como se describe en el presente documento.
Un experto en la materia sabría cómo diseñar una sonda de modo que la hibridación específica de secuencia pueda ocurrir sólo si un alelo particular está presente en una secuencia genómica de una muestra de ácido nucleico de prueba. La divulgación también puede reducirse a la práctica utilizando cualquier método de genotipado conveniente, incluidas las tecnologías y métodos disponibles en el mercado para el genotipado de variaciones genéticas concretas.
También pueden usarse sondas de control, p. ej., una sonda que se une a una secuencia menos variable, p. ej., un a Dn repetitivo asociado a un centrómero de un cromosoma, puede usarse como control. Las sondas pueden obtenerse de fuentes comerciales. Las sondas pueden sintetizarse, p. ej., químicamente oin vitro,o fabricarse a partir de ADN cromosómico o genómico mediante técnicas estándar. Las fuentes de ADN que pueden utilizarse incluyen el ADN genómico, secuencias de ADN clonadas, híbridos de células somáticas que contienen un cromosoma humano, o parte de él, junto con el complemento cromosómico normal del huésped, y cromosomas purificados por citometría de flujo o microdisección. La región de interés puede aislarse mediante clonación o mediante amplificación específica del sitio utilizando PCR.
Uno o más ácidos nucleicos, p. ej., una sonda o cebador, también pueden ser marcados, p. ej., por marcaje directo, para comprender un marcador detectable. Un marcador detectable puede comprender cualquier marcador capaz de detección mediante un proceso físico, químico o biológico, p. ej., un marcador radiactivo, tal como 32P o 3H, un marcador fluorescente, tal como FITC, un marcador cromóforo, un marcador de ligando de afinidad, un marcador enzimático, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante o galactosidasa I2, un marcador de cofactor enzimático, un marcador de conjugado de hapteno, tal como digoxigenina o dinitrofenilo, un marcador generador de señal Raman, un marcador magnético, un marcador de espín, un marcador de epítopo, tal como el epítopo FLAG o HA, un marcador luminiscente, un marcador de átomo pesado, un marcador de nanopartícula, un marcador electroquímico, un marcador de dispersión de luz, un marcador de concha esférica, un marcador de nanocristal semiconductor, tal como los puntos cuánticos (descritos en la patente de los Estados Unidos No. 6,207,392), y sondas marcadoras con cualquier otro marcador generador de señal conocida por los expertos en la materia, en las que un marcador puede permitir que la sonda se visualice con o sin una molécula de detección secundaria. Un nucleótido puede incorporarse directamente a una sonda con técnicas estándar, p. ej., traducción de muesca, cebado aleatorio y marcaje por PCR. Una "señal", tal como se utiliza en el presente documento, incluye una señal detectable y medible por medios apropiados, incluyendo, fluorescencia, radiactividad, quimioluminiscencia y similares.
Ejemplos no limitativos de fracciones de marcaje útiles para la detección incluyen, sin limitación, enzimas adecuadas como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; miembros de un par de unión que son capaces de formar complejos como estreptavidina/biotina, avidina/biotina o un complejo antígeno/anticuerpo que incluye, p. ej., IgG de conejo e IgG anti-conejo; fluoróforos como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametil rodamina, eosina, proteína verde fluorescente, eritrosina, cumarina, metil cumarina, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarillo lucifer, Cascade Blue, Texas Red, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo, ficoeritrina, complejos fluorescentes de lantánidos como los que incluyen el europio y el terbio, miembros de la familia de los colorantes de cianina, tal como Cy3 y Cy5, balizas moleculares y sus derivados fluorescentes, así como otros conocidos en la técnica descritos, p. ej., en Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz (Editor), Plenum Pub Corp, 2a edición (julio de 1999) y la 6a edición del Molecular Probes Handbook de Richard P Hoagland; un material luminiscente, tal como el luminol; materiales de dispersión de la luz o resonantes de plasmón, tal como partículas de oro o plata o puntos cuánticos; o material radiactivo, tal como 14C, 123I, 124I, 125I, Tc99m, 32P, 33P, 35S o 3H.
También pueden utilizarse otros marcadores en los métodos de la presente divulgación, p. ej., marcadores de cadena. Los marcadores de cadena comprenden tintes de ácidos nucleicos que se unen a los ácidos nucleicos de forma independiente de la secuencia. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen colorantes intercalantes como las fenantridinas y las acridinas (p. ej., bromuro de etidio, yoduro de propidio, yoduro de hexidio, dihidroetidio, homodímero-1 y -2 de etidio, monoazida de etidio y ACMA); algunos aglutinantes de surco menor como los indoles y los imidazoles (p. ej., Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 y DAPI); y diversas tinciones de ácidos nucleicos como naranja de acridina (también capaz de intercalarse), 7-AAD, actinomicina D, LDS751 e hidroxiestilbamidina. Todas las tinciones de ácidos nucleicos mencionadas están disponibles comercialmente a través de proveedores tales como Molecular Probes, Inc. Otros ejemplos de tinciones de ácidos nucleicos incluyen los siguientes colorantes de Molecular Probes: colorantes de cianina como SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO-3, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, SYBR Gold, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR DX, SYTO-40, -41, -42, -43, -44, -45 (azul), SYTO-13, -16, -24, -21, -23, -12, -11, -20, -22, -15, -14, -25 (verde), SYTO-81, -80, -82, -83, -84, -85 (naranja), SYTO-64, -17, -59, -61, -62, -60, -63 (rojo).
Pueden elegirse fluoróforos de diferentes colores, p. ej., ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético (AMCA), 5-(y -6)-carboxi-X-rodamina, lisamina-rodamina B, 5-(y -6)-carboxifluoresceína, fluoresceína-5-isotiocianato (FITC), ácido 7-dietilaminocumarina-3-carboxílico, tetrametilrodamina-5-(y -6)-isotiocianato, 5-(y -6)-carboxitetrametilrodamina, ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico, ácido 6-[fluoresceína 5-(y -6)-carboxamido]hexanoico, ácido N-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a diaza-3-indacenopropiónico, eosina-5-isotiocianato, eritrosina-5-isotiocianato, TRITC, rodamina, tetrametilrodamina, R-ficoeritrina, Cy-3, Cy-5, Cy-7, Texas Red, Phar-Red, aloficocianina (APC) y acetilazida azul CASCADE™, de forma que cada sonda de un conjunto o no pueda visualizarse claramente. Las sondas marcadas con fluorescencia pueden visualizarse con un microscopio de fluorescencia y un filtro adecuado para cada fluoróforo, o utilizando conjuntos de filtros de paso de banda doble o triple para observar múltiples fluoróforos. Pueden utilizarse técnicas como la citometría de flujo para examinar el patrón de hibridación de las sondas.
Las sondas pueden marcarse indirectamente, p. ej., con biotina o digoxigenina, o marcarse con isótopos radiactivos como 32Py/o 3H. Como ejemplo no limitativo, una sonda marcada indirectamente con biotina puede detectarse mediante avidina conjugada con un marcador detectable. Por ejemplo, la avidina puede conjugarse con un marcador enzimático como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante. Los marcadores enzimáticos pueden detectarse mediante reacciones colorimétricas utilizando un sustrato y/o un catalizador para la enzima. Pueden utilizarse catalizadores de la fosfatasa alcalina, p. ej., 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y azul nitro de tetrazolio. Puede utilizarse un catalizador para la peroxidasa de rábano picante, p. ej., diaminobenzoato.
Uno o más genes divulgados en el presente documento pueden estar en condiciones o vías moleculares relacionadas con diversos aspectos de la función inmune, incluyendo, pero no limitado a, la respuesta de interferón tipo I (p. ej., PMID 26052098), la vía del receptor de células B (p. ej., Wikipathways<w>P23; PMID 22566564), la vía de señalización RANKL/RANK (p. ej., Wikipathways WP2018), la vía de señalización TCR (p. ej., Wikipathways WP69), la vía de señalización NF-kB (p. ej., PMID 28362430), la vía JAK-STAT(p. ej., PMID 28255960), biología de modificaciones postraduccionales como la ubiquitinación vía LUBAC (p. ej., PMID 23104095, 24958845, 25086647, 26085218, 26111062, 26525107, 26848516, 26877205, 27178468, 27786304, 27892465), síndrome de Aicardi-Goutieres (p. ej., PMID 26052098), eosinofilia (por ejemplo, PMID 27222657), neutropenia congénita (p. ej., PMID 24753205), defectos del receptor de células T (p. ej., PMID 25452106, 25636200, 26246585, 26379669, 26453379, 28400082) y defectos de autofagia (p. ej., 19229298, 22984599, 23222957, 26917586, 26953272, 27588602). Uno o más genes divulgados en el presente documento pueden estar relacionados con la biología del virus de JC (p. ej., PMID 15327898, 19282432, 19903823, 22984599, 25910481). Uno o más genes divulgados en el presente documento pueden ser genes de respuesta inmune antiviral.
La Tabla 27 contiene un conjunto de vías y biología ejemplares para genes de riesgo de PML basados en el panel de 96 genes listado en la Tabla 19. Los genes divulgados en el presente documento, tal como los genes del panel de 96 genes, pueden agruparse en función de la vía o los procesos biológicos en los que participan.
Métodos de detección
La presente invención consiste en determinar la ausencia o presencia de una variación genómica seleccionada de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4: 103522150, G>A. A continuación se ofrece una explicación general de los métodos de detección que pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de las variaciones genómicas de las reivindicaciones, y se incluyen ejemplos que no forman parte de la materia reivindicada en el presente documento, en la medida en que se refieren a variaciones distintas de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. Como se usa en el presente documento, la detección de un sujeto comprende el diagnóstico o determinación, teranosis o determinación de la susceptibilidad a desarrollar (pronosticar) una enfermedad, p. ej., PML. En particular, la divulgación proporciona un método para determinar una presencia de, o una susceptibilidad a, PML, mediante la detección de al menos una variación genética en una muestra de un sujeto como se describe en el presente documento. La detección de determinados alelos, marcadores, variaciones o haplotipos puede ser indicativa de la presencia o susceptibilidad a una enfermedad (p. ej., PML).
Si bien existen medios para la detección de PML mediante una prueba de anticuerpos contra el JCV, el riesgo de PML no se evalúa adecuadamente mediante la prueba de anticuerpos contra el JCV por sí sola. Por lo tanto, existe la necesidad de una prueba de detección mejorada para evaluar el riesgo de desarrollar PML. En el presente documento se describen métodos de detección de un individuo para detectar el riesgo de desarrollar PML, incluyendo, entre otros, la determinación de la identidad y localización de variaciones genéticas, tal como variaciones en la secuencia de nucleótidos y en el número de copias, y la presencia o ausencia de alelos o genotipos en una o más muestras de uno o más sujetos utilizando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. La determinación de una asociación a padecer o desarrollar PML puede realizarse detectando variaciones particulares que aparecen con mayor frecuencia en los sujetos de prueba en comparación con los sujetos de referencia y analizando las vías moleculares y fisiológicas a las que estas variaciones pueden afectar.
Dentro de cualquier población dada, puede haber una susceptibilidad absoluta de desarrollar una enfermedad o rasgo, definida como la probabilidad de que una persona desarrolle la enfermedad o rasgo específico durante un periodo de tiempo específico. La susceptibilidad (p. ej., estar en situación de riesgo) suele medirse observando a un gran número de personas, en lugar de a un individuo concreto. Como se describe en el presente documento, ciertas variaciones en el número de copias (variaciones genéticas) y/o variaciones de nucleótido único se consideran útiles para la evaluación de la susceptibilidad a la PML. La evaluación de la susceptibilidad puede implicar la detección de determinadas variaciones genéticas en el genoma de los individuos sometidos a evaluación. Variaciones genéticas particulares se encuentran con mayor frecuencia en individuos con PML, que en individuos sin PML. Por lo tanto, estas variaciones genéticas tienen valor predictivo para detectar la PML, o una susceptibilidad a la PML, en un individuo. Sin pretender estar limitados por la teoría, se cree que las variaciones genéticas descritas en el presente documento que se asocian con la susceptibilidad de la PML representan variantes funcionales que predisponen a la enfermedad. Una variación genética puede conferir una susceptibilidad a la enfermedad, p. ej., los vehículos de la variación genética tienen un riesgo diferente de padecer la enfermedad que los no vehículos. La presencia de una variación genética puede ser indicativa de una mayor susceptibilidad a la PML.
La detección puede realizarse utilizando cualquiera de los métodos divulgados, solos o en combinación. La detección puede realizarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La detección puede realizarse mediante hibridación genómica comparativa de arreglos (aCGH) para detectar CNV. La detección puede realizarse mediante secuenciación del exoma para detectar SNV, indel y, en algunos casos, CNV utilizando algoritmos de análisis adecuados. La detección puede realizarse utilizando métodos de secuenciación del genoma completo de alto rendimiento (también conocidos como de próxima generación) y algoritmos adecuados para detectar todas o casi todas las variaciones genéticas presentes en una muestra de ADN genómico. La información sobre la variación genética, tal y como se relaciona con la presente divulgación, puede utilizarse junto con cualquiera de las pruebas de detección sintomáticas mencionadas anteriormente para detección de PML en un sujeto, p. ej., utilizando una combinación de aCGH y/o secuenciación con una prueba de detección del JCV, tal como la prueba de anticuerpos contra el JCV, la prueba de CD62L o la prueba de banda oligoclonal de IgM del CSF. La L-selectina (CD62L) expresada por las células TCD3+CD4+ en, p. ej., células mononucleares de sangre periférica (PBMC) crioconservadas, puede ser un biomarcador para la detección del JCV. La expresión de CD62L puede correlacionarse con el riesgo de PML.
La información de cualquiera de los métodos de detección anteriores (p. ej., síntomas específicos, matriz de puntuación o datos de variación genética) puede utilizarse para definir a un sujeto como sujeto de prueba o sujeto de referencia. La información de cualquiera de los métodos de detección anteriores puede utilizarse para asociar un sujeto con una población de prueba o de referencia, p. ej., un sujeto de una población.
Una asociación con PML puede ser determinada por la probabilidad estadística de la presencia de una variación genética en un sujeto con PML, p. ej., un individuo no relacionado o un pariente de primer o segundo grado del sujeto. Una asociación con la<p>M<l>puede decidirse determinando la probabilidad estadística de la ausencia de una variación genética en un sujeto de referencia no afectado, p. ej., un individuo no emparentado o un pariente de primer o segundo grado del sujeto. Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir la obtención y el análisis de una muestra de ácido nucleico de uno o más sujetos de referencia adecuados.
En el presente contexto, el término detección comprende el diagnóstico, el pronóstico y la teranosis. La detección puede referirse a cualquier método de detección disponible, incluidos los mencionados en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, la susceptibilidad puede ser la propensión de un sujeto hacia el desarrollo de la PML, o hacia ser menos capaz de resistir la PML que uno o más sujetos de control. La susceptibilidad puede abarcar el aumento de la susceptibilidad. Por ejemplo, variaciones particulares de ácido nucleico de la divulgación como se describe en el presente documento pueden ser características de una mayor susceptibilidad a PML. Variaciones particulares de ácido nucleico pueden conferir susceptibilidad disminuida, p. ej., variaciones nucleicas particulares de la divulgación como se describe en el presente documento pueden ser características de susceptibilidad disminuida al desarrollo de PML.
Como se describe en el presente documento, una variación genética predictiva de susceptibilidad a o presencia de PML puede ser aquella en la que la variación genética particular está presente con mayor frecuencia en un grupo de sujetos con la enfermedad (afectados), en comparación con la frecuencia de su presencia en un grupo de referencia (control), de tal manera que la presencia de la variación genética es indicativa de susceptibilidad a o presencia de PML. El grupo de referencia puede ser una muestra de ácido nucleico de la población, p. ej., una muestra aleatoria de ácido nucleico de la población general o una mezcla de dos o más muestras de ácido nucleico de una población. Los controles libres de enfermedad pueden caracterizarse por la ausencia de uno o más síntomas específicos asociados a la enfermedad, p. ej., individuos que no han experimentado síntomas asociados a la PML. El grupo de control libre de enfermedad puede caracterizarse por la ausencia de uno o más factores de riesgo específicos de la enfermedad, p. ej., al menos un factor de riesgo genético y/o ambiental. Se puede hacer referencia a una secuencia de referencia para un lugar concreto de variación genética. Un alelo de referencia puede ser un alelo de tipo silvestre y puede elegirse como el primer alelo secuenciado o como el alelo de un individuo de control. Uno o más sujetos de referencia pueden ser emparejados característicamente con uno o más sujetos afectados, p. ej., con edad, sexo o etnia emparejados.
Un experto en la materia puede apreciar que, para variaciones genéticas con dos o más alelos presentes en la población estudiada, y en las que un alelo puede encontrarse con mayor frecuencia en un grupo de individuos con PML en la población, en comparación con los controles, el otro alelo del marcador puede encontrarse con menor frecuencia en el grupo de individuos con el rasgo o enfermedad, en comparación con los controles. En tal caso, un alelo del marcador, p. ej., el alelo encontrado con mayor frecuencia en individuos con PML, puede ser el alelo de riesgo, mientras que el otro alelo o alelos pueden ser un alelo neutro o protector.
Una variante genética asociada con PML puede ser usada para predecir la susceptibilidad de la enfermedad para un genotipo dado. Para cualquier variación genética, puede haber uno o más genotipos posibles, p. ej., homocigoto para la variante de riesgo (p. ej., en trastornos autosómicos recesivos), heterocigoto y no vehículo de la variante de riesgo. Los trastornos autosómicos recesivos también pueden ser el resultado de dos variantes genéticas distintas que afectan al mismo gen, de forma que el individuo es un heterocigoto compuesto (p. ej., el alelo materno contiene una mutación diferente del alelo paterno). La heterocigosidad compuesta puede ser el resultado de dos SNV diferentes, dos CNV diferentes, una SNV y una CNV, o cualquier combinación de dos variantes genéticas diferentes pero cada una presente en un alelo diferente del gen. En el caso de los genes ligados al cromosoma X, los varones que poseen una copia de un gen con una variante pueden verse afectados, mientras que las mujeres portadoras, que también poseen un gen de tipo silvestre, pueden no verse afectadas. La susceptibilidad asociada a variantes en múltiples loci puede utilizarse para estimar la susceptibilidad global. Para múltiples variantes genéticas, puede haber k (k = 3An * 2AP) genotipos posibles; donde n puede ser el número de loci autosómicos y p puede ser el número de loci gonosómicos (cromosomas sexuales). Los cálculos de evaluación de la susceptibilidad global pueden suponer que las susceptibilidades relativas de las distintas variantes genéticas se multiplican; p. ej., la susceptibilidad global asociada a una determinada combinación de genotipos puede ser el producto de los valores de susceptibilidad del genotipo en cada locus. Si la susceptibilidad presentada es la susceptibilidad relativa para una persona, o un genotipo específico para una persona, en comparación con una población de referencia, entonces la susceptibilidad combinada puede ser el producto de los valores de susceptibilidad específicos del locus y puede corresponder a una estimación de susceptibilidad global en comparación con una población. Si la susceptibilidad de una persona se basa en una comparación con los no vehículos del alelo de riesgo, entonces la susceptibilidad combinada puede corresponder a una estimación que compara a la persona con una combinación dada de genotipos en todos los loci con un grupo de individuos que no son vehículos de variantes de riesgo en ninguno de esos loci. El grupo de no vehículos de cualquier variante de riesgo puede tener la susceptibilidad estimada más baja y puede tener una susceptibilidad combinada, comparada consigo mismo, p. ej., con los no vehículos, de 1.0 , pero puede tener una susceptibilidad global, comparada con la población, de menos de 1.0.
El riesgo global para múltiples variantes de riesgo puede realizarse utilizando una metodología estándar. Las variaciones genéticas descritas en el presente documento pueden constituir la base de un análisis de riesgo que combine otras variaciones genéticas de las que se sabe que aumentan el riesgo de PML, u otras variantes genéticas de riesgo de PML. Se puede utilizar una pluralidad de variantes (variaciones genéticas, alelos variantes y/o haplotipos) para la evaluación global del riesgo. Estas variantes pueden seleccionarse de entre las variaciones genéticas divulgadas en el presente documento. Las variantes de la presente divulgación pueden utilizarse en combinación con otras variantes que se sabe que son útiles para detectar una susceptibilidad a PML. El estado genotípico de una pluralidad de variaciones genéticas, marcadores y/o haplotipos puede determinarse en un individuo, y el estado del individuo puede compararse con la frecuencia poblacional de las variantes asociadas, o con la frecuencia de las variantes en sujetos clínicamente sanos, tal como sujetos emparejados por edad y sexo.
Métodos tales como el uso de algoritmos y software disponibles pueden ser utilizados para identificar, o llamar, variaciones genéticas significativas, incluyendo, pero no limitado a, algoritmos de DNA Analytics o DNAcopy, iPattern y/o QuantiSNP. Para determinar las pérdidas y las ganancias puede utilizarse un valor de umbral de relación logarítmica para determinar pérdidas y ganancias. Por ejemplo, utilizando DNA Analytics, se puede utilizar un corte de relación log2 de >0.5 y <0.5 para clasificar las ganancias y pérdidas de CNV respectivamente. Por ejemplo, utilizando DNA Analytics, se puede utilizar un corte de relación log2 de >0.25 y <0.25 para clasificar las ganancias y pérdidas de CNV respectivamente. Como ejemplo adicional, utilizando DNAcopy, se puede utilizar un corte de relación log2 de >0.35 y <0.35 para clasificar las ganancias y pérdidas de CNV respectivamente. Por ejemplo, se puede utilizar un algoritmo de módulo de detección de aberraciones 2 (ADM2), tal como aquel de DNA Analytics 4.0.85, para identificar, o llamarse, variaciones genéticas significativas. Se pueden utilizar dos o más algoritmos para identificar, o llamarse, variaciones genéticas significativas. Por ejemplo, pueden utilizarse 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, o 10 o más algoritmos para identificar, o llamarse, variaciones genéticas significativas. La relación log2 de una o más sondas individuales de una micromatriz puede utilizarse para identificar variaciones genéticas significativas, tal como la presencia de regiones homocigóticamente eliminadas en el genoma de un sujeto. Las variaciones genéticas significativas pueden ser CNV.
Las CNV detectadas por dos o más algoritmos pueden definirse como estrictas y pueden utilizarse para análisis posteriores. La información y las llamadas de dos o más de los métodos descritos en el presente documento pueden compararse entre sí para identificar variaciones genéticas significativas con mayor o menor rigor. Por ejemplo, las llamadas de CNV generadas por dos o más de los algoritmos DNA Analytics, módulo de detección de aberración 2 (ADM2) y DNAcopy pueden definirse como CNV estrictas. Las variaciones genéticas significativas o estrictas se pueden marcar como identificados o denominados si se puede encontrar que tienen un solapamiento recíproco mínimo con una variación genética detectada por una o más plataformas y/o métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede utilizar un solapamiento recíproco mínimo del 50 % para marcar las CNV como identificadas o denominadas. Por ejemplo, las variaciones genéticas significativas o estrictas se pueden marcar como identificadas o llamadas si se puede encontrar que tienen un solapamiento recíproco de más de aproximadamente 50 %, 55 % 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, 99 %, o igual a 100 %, a una variación genética detectada por una o más plataformas y/o métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, las variaciones genéticas significativas o estrictas se pueden marcar como identificadas o denominadas si se puede encontrar que tienen un solapamiento recíproco de más de aproximadamente el 50 % de solapamiento recíproco con una variación genética detectada por una o más plataformas y/o métodos descritos en el presente documento. Las variaciones genéticas pueden detectarse a partir de los valores de relación log2 calculados para sondas individuales presentes en un microarreglo aCGH mediante una comparación estadística del valor de relación log2 de la sonda en una cohorte de sujetos con PML con el valor de relación log2 de la sonda en una cohorte de sujetos sin PML.
Se puede utilizar un valor umbral de relación logarítmica para determinar las pérdidas y ganancias. Un valor de relación logarítmica puede ser cualquier valor de relación logarítmica; p. ej., un valor de relación logarítmica puede ser una relación log2 o una relación log10. Un segmento de CNV cuya mediana de la relación log2 sea inferior o igual a un valor umbral de la relación log2 puede clasificarse como pérdida. Por ejemplo, cualquier segmento cuya mediana de la relación log2 sea inferior o igual a -0.1, -0.11, -0.12, -0.13, -0.14, -0.15, -0.16, -0.17, -0.18, -0.19, -0,2, -0,21, -0,22, -0,23, -0,24, -0,25, -0,26, -0.27, -0.28, -0.29, -0.3, -0.31, -0.32, -0.33, -0.34, -0.35, -0.36, -0.37, -0.38, -0.39, -0.4, -0.41, -0.42, -0.43, -0.44, -0.45, -0.46, -0.47, -0.48, -0.49, -0.5, -0.55, -0.6, -0.65, -0.7, -0.75, -0.8, -0.85, -0.9, -0.95, -1, -1.1, -1.2, -1.3, -1.4, -1.5, -1.6, - 1.7, -1.8, -1.9, -2, -2.1, -2.2, -2.3, -2.4, -2.5, -2.6, -2.7, -2.8, -2.9, -3, -3.1, -3.2, -3.3, -3.4, -3.5, -3.6, -3.7, - 3.8, -3.9, -4, -4.1, -4.2, -4.3, -4.4, -4.5, -4.6 , -4.7, -4.8, -4.9, -5, -5.5, -6 , -6.5, -7, -7.5, -8 , -8.5, -9, -9.5, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20 o menos, puede clasificarse como pérdida.
Un algoritmo puede utilizarse para llamar o identificar variaciones genéticas significativas, en las que cualquier segmento cuya mediana de la relación log2 fuera menor o igual a -0.1, -0.11, -0.12, -0.13, -0.14, -0.15, -0.16, 0.17, -0.18, -0.19, -0.2, -0.21, -0.22, -0.23, -0.24, -0.25, -0.26, -0.27, -0.28, -0.29, -0.3, -0.31, -0.32, -0.33, -0.34,
-0.35, -0.36, -0.37, -0.38, -0.39, -0.4, -0.41, -0.42, -0.43, -0.44, -0.45, -0.46, -0.47, -0.48, -0.49, -0.5, -0.55, -0.6,
-0.65, -0.7, -0.75, -0.8, -0.85, -0.9, -0.95, -1, -1.1, -1.2, -1.3, -1.4, -1.5, -1.6, -1.7, -1.8, -1.9, -2, -2.1, -2.2, -2.3, -2.4, -2.5, -2.6, -2.7, -2.8, -2.9, -3, -3.1, -3.2, -3.3, -3.4, -3.5, -3.6, -3.7, -3.8, -3.9, -4, -4.1, -4.2, -4.3, -4.4, -4.5, -4.6, -4.7, -4.8, -4.9, -5, -5.5, -6 , -6.5, -7, -7.5, -8 , -8.5, -9, -9.5, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20
o menos, puede clasificarse como pérdida. Por ejemplo, cualquier segmento de CNV cuya mediana de la
relación log2 sea inferior a -0.35, de acuerdo con lo determinado por DNAcopy, puede clasificarse como
pérdida. Por ejemplo, las pérdidas pueden determinarse en función de una relación log2 umbral, que puede
fijarse en -0.35. Las pérdidas pueden determinarse en función de una relación log2 umbral, que puede fijarse
en -0.5.
Pueden utilizarse dos algoritmos para llamar o identificar variaciones genéticas significativas, en las que
cualquier segmento cuya mediana de la relación log2 sea inferior o igual a -0.1, -0.11, -0.12, -0.13, -0.14, -0.15,
-0.16, -0.17, -0.18, - 0.19, -0.2, -0.21, -0.22, -0.23, -0.24, -0.25, -0.26, -0.27, -0.28, -0.29, -0.3, -0.31, -0.32, -0.33, -0.34, -0.35, -0.36, -0.37, -0.38, -0.39, -0.4, -0.41, -0.42, -0.43, -0.44, -0.45, -0.46, -0.47, -0.48, -0.49, -0.5,
-0.55, -0.6, -0.65, -0.7, -0.75, -0.8, -0.85, -0.9, -0.95, -1, -1.1, -1.2, -1.3, -1.4, -1.5, -1.6, -1.7, -1.8, -1.9, -2, -2.1,
-2.2, -2.3, -2.4, -2.5, -2.6, -2.7, -2.8, -2.9, -3, -3.1, -3.2, -3.3, -3.4, -3.5, -3.6, -3.7, -3.8, -3.9, -4, -4.1, -4.2, -4.3,
- 4.4 , -4.5 , -4.6 , -4.7, -4.8, -4.9, -5, -5.5, -6 , -6.5, -7, -7.5, -8 , -8.5, -9, -9.5, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20 o menos, según lo determinado por un algoritmo, y en el que cualquier segmento cuya mediana de
la relación log2 sea menor o igual que -0.1, -0.11, -0.12, -0.13, -0.14, -0.15, -0.16, -0.17, -0.18, -0.19, -0.2, -0.21, - 0.22, -0.23, -0.24, -0.25, -0.26, -0.27, -0.28, -0.29, -0.3, -0.31, -0.32, -0.33, -0.34, -0.35, -0.36, -0.37, -0.38, -0.39, -0.4, -0.41, -0.42, -0.43, -0.44, -0.45, -0.46, -0.47, -0.48, -0.49, -0.5, -0.55, -0.6, -0.65, -0.7, - 0.75,
-0.8, -0.85, -0.9, -0.95, -1, -1.1, -1.2, -1.3, -1.4, -1.5, -1.6, -1.7, -1.8, -1.9, -2, -2.1, -2.2, -2.3, -2.4, - 2.5, -2.6, -2.7, -2.8, -2.9, -3, -3.1, -3.2, -3.3, -3.4, -3.5, -3.6, -3.7, -3.8, -3.9, -4, -4.1, -4.2, -4.3, -4.4, -4.5, -4.6, -4.7, -4.8, -4.9, -5, -5.5, -6 , -6.5, -7, -7.5, -8 , -8.5, -9, -9.5, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, o menos, según
lo determinado por el otro algoritmo puede clasificarse como pérdida. Por ejemplo, la denominación de CNV
puede comprender el uso del algoritmo del módulo de detección de aberraciones 2 (ADM2) y el algoritmo de
DNAcopy, en el que las pérdidas pueden determinarse de acuerdo con dos relaciones log2 umbral, en las que
la relación log2 del algoritmo del módulo de detección de aberraciones 2 (ADM2) puede ser -0.25 y la relación
log2 del algoritmo de DNAcopy puede ser -0.41.
El uso de dos algoritmos para llamar o identificar variaciones genéticas significativas puede ser un método
riguroso. El uso de dos algoritmos para llamar o identificar variaciones genéticas significativas puede ser un
método más estricto en comparación con el uso de un algoritmo para llamar o identificar variaciones genéticas significativas.
Cualquier segmento de CNV cuya mediana de relación log2 sea mayor que un valor umbral de relación log2
puede clasificarse como ganancia. Por ejemplo, cualquier segmento cuya mediana de la relación log2 sea
superior a 0.1, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.2, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27,
0.28, 0.29, 0.3, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0 0.48, 0.49, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1,
2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3 o más pueden clasificarse como ganancia.
Puede utilizarse un algoritmo para llamar o identificar variaciones genéticas significativas, en el que cualquier
segmento cuya mediana de la relación log2 sea mayor o igual a 0.1 , 0.11, 0.12 , 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17,
0.18, 0.19, 0,2, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,3, 0,31, 0.32, 0.33, 0 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.95, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3 o más pueden clasificarse como ganancia. Por ejemplo, cualquier segmento de CNV cuya mediana de la relación log2 sea
superior a 0.35 de acuerdo con la DNAcopy puede clasificarse como ganancia. Por ejemplo, las ganancias
pueden determinarse en función de una relación log2 umbral, que puede fijarse en 0.35. Las ganancias pueden determinarse en función de una relación log2 umbral, que puede fijarse en 0.5.
Pueden utilizarse dos algoritmos para llamar o identificar variaciones genéticas significativas, en las que
cualquier segmento cuya mediana de la relación log2 sea mayor o igual a 0.1, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16,
0.17, 0.18, 0.19, 0,2, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0.29, 0.3, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36,
0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85,
0.9, 0.95, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3 o más, según
lo determinado por un algoritmo, y en el que cualquier segmento cuya mediana de la relación log2 sea mayor
o igual que 0.1, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.2, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27,
0.28, 0.29, 0.3, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47,
0.48, 0.49, o 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2,
2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, o más, según lo determinado por el otro algoritmo puede clasificarse
como ganancia. Por ejemplo, la llamada de CNV puede comprender el uso del algoritmo del módulo de
detección de aberraciones 2 (ADM2) y el algoritmo de DNAcopy, en el que las ganancias pueden determinarse
de acuerdo con dos relaciones log2 de umbral, en el que la relación log2 del algoritmo del módulo de detección
de aberraciones 2 (ADM2) puede ser 0.25 y la relación log2 del algoritmo de DNAcopy puede ser 0.32.
Cualquier segmento CNV cuyo valor absoluto (mediana de la relación log-ratio/mad) sea inferior a 2 puede ser excluido (no identificado como una variación genética significativa). Por ejemplo, puede excluirse cualquier segmento de CNV cuyo valor absoluto (mediana de la relación log-ratio/mad) sea inferior a 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6 o 0.5 o menos.
Los análisis multivariantes o los análisis de riesgo conjuntos, incluido el uso de un modelo multiplicativo para la evaluación del riesgo global, pueden utilizarse posteriormente para determinar el riesgo global conferido en función del estado del genotipo en los loci múltiples. El uso de un modelo multiplicativo, p. ej., asumiendo que el riesgo de las variantes de riesgo individuales se multiplica para establecer el efecto global, permite un cálculo directo del riesgo global para múltiples marcadores. El modelo multiplicativo es un modelo parsimonioso que suele ajustarse razonablemente bien a los datos de rasgos complejos. Las desviaciones de la multiplicidad se han descrito raramente en el contexto de variantes comunes para enfermedades comunes, y si se comunican suelen ser sólo sugestivas, ya que pueden requerirse tamaños de muestra muy grandes para poder demostrar interacciones estadísticas entre loci. La evaluación del riesgo basada en dicho análisis puede utilizarse posteriormente en los métodos, usos y kits de la divulgación, tal como se describe en el presente documento.
La importancia del aumento o disminución de la susceptibilidad puede medirse mediante un porcentaje. Un aumento significativo de la susceptibilidad puede medirse como una susceptibilidad relativa de al menos 1.2 , incluyendo, pero no limitándose a: al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0, al menos 2.5, al menos 3.0, al menos 4.0, al menos 5.0, al menos 6.0, al menos 7.0, al menos 8.0, al menos 9.0, al menos 10.0 y al menos 15.0. Una susceptibilidad relativa de al menos 2.0, al menos 3.0, al menos 4.0, al menos 5.0, al menos 6.0 o al menos 10.0 es significativa. También se contemplan otros valores para la susceptibilidad significativa, p. ej., al menos 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, o cualquier otro valor numérico adecuado, donde los valores también están dentro del alcance de la presente divulgación. Un aumento significativo de la susceptibilidad puede ser de al menos un 20 %, incluyendo, pero sin limitarse a aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % y 1500 %. Un aumento significativo de la susceptibilidad puede ser de al menos el 100 %. Un aumento significativo de la susceptibilidad puede ser de al menos 200 %, al menos 300 %, al menos 400 %, al menos 500 %, al menos 700 %, al menos 800 %, al menos 900 % y al menos 1000 %. También se contemplan otros límites o intervalos que el experto en la materia considere adecuados para caracterizar la divulgación, y que también están dentro del alcance de la presente divulgación. Un aumento significativo de la susceptibilidad puede caracterizarse por un valor p, tal como un valor p inferior a 0.5, inferior a 0.4, inferior a 0.3, inferior a 0.2, inferior a 0.1, inferior a 0.05, inferior a 0.01 , inferior a 0.001 , inferior a 0.0001 , inferior a 0.00001 , inferior a 0.000001 , inferior a 0.0000001 , inferior a 0.00000001 o inferior a 0.000000001.
Un individuo que tiene una susceptibilidad disminuida o la ausencia de presencia de una afección (p. ej., PML) puede ser un individuo en el que se identifica al menos una variación genética que confiere una susceptibilidad disminuida o la ausencia de presencia de la afección. Las variaciones genéticas que confieren una menor susceptibilidad también pueden ser protectoras. En un aspecto, las variaciones genéticas pueden conferir una disminución significativa de la susceptibilidad o la ausencia de presencia de PML.
La disminución significativa de la susceptibilidad puede medirse como una susceptibilidad relativa de menos de 0.9, incluyendo, pero no limitado a menos de 0.9, menos de 0.8, menos de 0.7, menos de 0.6, menos de 0.5, menos de 0.4, menos de 0.3, menos de 0.2 y menos de 0.1. La disminución de la susceptibilidad puede ser de al menos un 20 %, incluyendo, pero no limitándose a al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % y al menos un 98 %. Sin embargo, también se contemplan otros límites o intervalos que el experto en la materia considere adecuados para caracterizar la divulgación, y que también están dentro del alcance de la presente divulgación. Una disminución significativa de la susceptibilidad puede caracterizarse por un valor p, tal como un valor p inferior a 0.05, inferior a 0.01, inferior a 0.001, inferior a 0.0001, inferior a 0.00001, inferior a 0.000001, inferior a 0.0000001, inferior a 0.00000001 o inferior a 0.000000001. Pueden utilizarse otras pruebas de significancia, p. ej., una prueba exacta de Fisher. También se contemplan otras pruebas estadísticas de significancia conocidas por el experto y que también están dentro del alcance de la divulgación.
La importancia de la susceptibilidad aumentada o disminuida puede determinarse en función de la relación entre las mediciones de un sujeto de prueba y un sujeto de referencia. Las pérdidas o ganancias de uno o más CNV pueden determinarse de acuerdo con una relación log2 umbral determinado por estas mediciones. Un valor de relación log2 superior a 0.35, o 0.5, puede ser indicativo de una ganancia de una o más CNV. Un valor de la relación log2 inferior a -0.35, o -0.5, puede ser indicativo de una pérdida de una o más CNV. La relación entre las mediciones de un sujeto de prueba y un sujeto de referencia puede invertirse de forma que las relaciones log2 de las ganancias de número de copias sean negativas y las relaciones log2 de las pérdidas de número de copias sean positivas.
La susceptibilidad combinada o global asociada con una pluralidad de variantes asociadas con la PML también puede ser evaluada; p. ej., las variaciones genéticas descritas en el presente documento para ser asociadas con la susceptibilidad a la PML pueden ser combinadas con otros factores de riesgo genéticos comunes. El riesgo combinado de dichas variantes genéticas puede estimarse de forma análoga a los métodos descritos en el presente documento.
El cálculo del riesgo conferido por un genotipo particular para el individuo puede basarse en la comparación del genotipo del individuo con el riesgo previamente determinado expresado, p. ej., tal como un riesgo relativo (RR) o una razón de probabilidades (OR), para el genotipo, p. ej., para un vehículo heterocigoto de una variante de riesgo para PML. Una razón de probabilidades puede ser una medida estadística utilizada como indicador de causalidad. Por ejemplo, en la investigación de enfermedades genéticas puede utilizarse para transmitir la importancia de una variante en una cohorte de enfermedad en relación con una cohorte no afectada/normal. El riesgo calculado para el individuo puede ser el riesgo relativo para un sujeto, o para un genotipo específico de un sujeto, en comparación con la media de la población. El riesgo medio de la población puede expresarse como una media ponderada de los riesgos de los diferentes genotipos, utilizando los resultados de una población de referencia, y a continuación pueden realizarse los cálculos apropiados para calcular el riesgo de un grupo de genotipos en relación con la población. Alternativamente, el riesgo para un individuo puede basarse en una comparación de genotipos particulares, p. ej., vehículos heterocigotos y/u homocigotos de un alelo de riesgo de un marcador comparados con no vehículos del alelo de riesgo (o par de alelos en el caso de variantes heterocigotas compuestas, en las que una variante afecta al alelo heredado por vía materna y la otra afecta al alelo heredado por vía paterna). Utilizar la media de la población puede ser más conveniente, ya que proporciona una medida que puede ser fácil de interpretar para el usuario, p. ej., una medida que da el riesgo para el individuo, basado en su genotipo, comparado con la media de la población.
El valor OR puede calcularse como sigue: OR = (A/(N1-A))/(U/(N2-U)), donde A = número de casos afectados con variante, N1 = número total de casos afectados, U = número de casos no afectados con variante y N2 = número total de casos no afectados. En circunstancias en las que U = 0, es convencional fijar U=1, para evitar infinitos. La OR puede calcularse esencialmente como en el caso anterior, salvo que cuando U o A = 0, se añade 0.5 a todos los valores de A, N1, U, N2. La prueba exacta de Fisher (FET) puede calcularse utilizando métodos estándar. Los valores p pueden corregirse en función de la tasa de falsos descubrimientos (FDR) mediante el método de Benjamini-Hochberg (Benjamini Y. y Hochberg Y., J. Royal Statistical Society 57:289 (1995); Osborne J. A. y Barker C. A. (2007)).
Una variación genética puede correlacionarse con PML referenciando los datos de la variación genética a una tabla de búsqueda que comprende correlaciones entre la variación genética y PML. La variación genética puede comprender al menos una indicación de la variación genética. La tabla puede incluir una correlación para una variación genética. La tabla puede comprender una correlación para una pluralidad de variaciones genéticas en ambos escenarios, haciendo referencia a una tabla de búsqueda que da una indicación de una correlación entre una variación genética y la PML, se puede identificar un riesgo de PML, o una susceptibilidad a la PML, en el individuo del que se deriva la muestra de ácido nucleico.
La presente divulgación también se refiere a métodos de detección clínicos, p. ej., diagnóstico, pronóstico o teranosis de un sujeto realizados por un profesional médico utilizando los métodos divulgados en el presente documento. La divulgación puede referirse a métodos de detección realizados por un profano. El profano puede ser cliente de un proveedor de servicios de genotipado, micromatrices, secuenciación del exoma o secuenciación del genoma completo. El profano también puede ser un proveedor de servicios de genotipado, microarreglos, secuenciación del exoma o secuenciación del genoma completo, que realiza análisis genéticos de una muestra de ADN de un individuo, con el fin de prestar un servicio relacionado con los factores de riesgo genético de rasgos o enfermedades particulares, basándose en el estado genotípico del sujeto obtenido a partir del uso de los métodos descritos en el presente documento. El genotipo resultante o la información genética puede ponerse a disposición del individuo y puede compararse con la información sobre la PML o el riesgo de desarrollar PML asociada a una o varias variaciones genéticas, incluyendo, pero no limitándose a, información de bases de datos públicas o privadas de variaciones genéticas o literatura y publicaciones científicas. Las aplicaciones de detección de las variaciones genéticas asociadas a la PML, tal y como se describen en el presente documento, pueden ser realizadas, p. ej., por un individuo, un profesional sanitario o un tercero, p. ej., un proveedor de servicios que interprete la información del genotipo del sujeto. El análisis genético puede realizarse en un laboratorio con certificación CLIA (es decir, las normas reguladoras federales de EE.UU. que se especifican en las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos, administradas por los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid) o en laboratorios equivalentes de Europa y otras partes del mundo.
La información derivada del análisis de los datos de secuencia puede comunicarse a cualquier organismo en particular, incluido el individuo del que se deriva la muestra de ácido nucleico o los datos de secuencia, un tutor o representante del individuo, un clínico, un profesional de la investigación, un profesional médico, un proveedor de servicios y un asegurador médico o una compañía de seguros. Los profesionales médicos pueden ser, p. ej., médicos, enfermeros, técnicos de laboratorio médico y farmaceutas. Los profesionales de la investigación pueden ser, p. ej., investigadores principales, técnicos de investigación, becarios posdoctorales y estudiantes de posgrado.
Un profesional puede ser asistido determinando si variantes genéticas específicas están presentes en una muestra de ácido nucleico de un sujeto, y comunicando información sobre variantes genéticas a un profesional. Una vez comunicada la información sobre variantes genéticas específicas, un profesional médico puede tomar una o varias medidas que pueden afectar a la atención del sujeto. Por ejemplo, un profesional médico puede registrar información en la historia clínica del sujeto (p. ej., registros de salud electrónicos o registros médicos electrónicos, incluidos, entre otros, los servicios sanitarios a escala nacional, tal como el Servicio Nacional de Salud del Reino Unido) sobre el riesgo del sujeto de desarrollar PML. Un profesional médico puede registrar información relativa a la evaluación de riesgos, o transformar de otro modo la historia clínica del sujeto, para reflejar su estado de salud actual. Un profesional médico puede revisar y evaluar el historial médico completo de un sujeto y valorar múltiples estrategias de tratamiento para la intervención clínica de la enfermedad de un sujeto. La información puede registrarse en el contexto del sistema desarrollado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Clasificación Estadística Internacional de Enfermedades y Problemas Relacionados con la Salud (ICD), que actualmente utiliza la 10' revisión (códigos ICD-10). Por ejemplo, el código ICD-10 para la PML es A81.2, mientras que el código ICD-10 para la esclerosis múltiple es G35.
Un profesional médico puede iniciar o modificar el tratamiento tras recibir información sobre la detección de PML en un sujeto, por ejemplo. Un profesional médico puede recomendar un cambio de terapia o excluir una terapia. Un profesional médico puede inscribir a un sujeto en un ensayo clínico para, a modo de ejemplo, detectar correlaciones entre un haplotipo como el descrito en el presente documento y cualquier parámetro medible o cuantificable relacionado con el resultado del tratamiento como el descrito anteriormente.
Un profesional médico puede comunicar al sujeto o a su familia información relativa a la probabilidad de un sujeto de desarrollar p Ml . Un profesional médico puede proporcionar a un sujeto y/o a su familia información respecto a la PML y la información sobre la evaluación de riesgos, incluyendo, opciones de tratamiento y derivaciones a especialistas. Un profesional médico puede facilitar una copia del historial médico de un sujeto a un especialista. Un profesional de la investigación puede aplicar la información relativa al riesgo de un sujeto de desarrollar PML para avanzar en la investigación científica. Un profesional de la investigación puede obtener el haplotipo de un sujeto tal y como se describe en el presente documento para evaluar su inscripción, o su participación continuada, en un estudio de investigación o ensayo clínico. Un profesional de la investigación puede comunicar la información relativa a la detección de PML en un sujeto a un profesional médico. Un profesional de la investigación puede remitir a un sujeto a un profesional médico.
Se puede utilizar cualquier método apropiado para comunicar información a otra persona. Por ejemplo, la información puede facilitarse directa o indirectamente a un profesional y un técnico de laboratorio puede introducir la variación genética de un sujeto, tal como se describe en el presente documento, en un registro informático. Se puede comunicar información alterando físicamente los historiales médicos o de investigación. Por ejemplo, un profesional médico puede hacer una anotación permanente o marcar un historial médico para comunicar la evaluación de riesgos a otros profesionales médicos que revisen el historial. Además, se puede utilizar cualquier tipo de comunicación para transmitir la información de la evaluación de riesgos. Por ejemplo, se puede utilizar el correo postal, el correo electrónico, el teléfono y las interacciones cara a cara. La información también puede comunicarse a un profesional poniéndola a su disposición por vía electrónica. Por ejemplo, la información puede comunicarse a un profesional colocándola en una base de datos informática de forma que el profesional pueda acceder a ella. Además, la información puede comunicarse a un hospital, clínica o centro de investigación que actúe como agente del profesional.
Los resultados de estas pruebas, y opcionalmente la información interpretativa, pueden ser devueltos al sujeto, al proveedor de atención médica o a un tercero. Los resultados pueden comunicarse al sujeto sometido a la prueba, p. ej., con un pronóstico y, opcionalmente, con materiales interpretativos que pueden ayudar al sujeto a comprender los resultados de la prueba y el pronóstico; utilizados por un proveedor de asistencia sanitaria, p. ej., para determinar si debe administrar un fármaco específico, o si un sujeto debe ser asignado a una categoría específica, p. ej., una categoría asociada con un endofenotipo de enfermedad específico, o con la respuesta o no respuesta al fármaco; utilizado por un tercero, tal como un pagador de asistencia sanitaria, p. ej., una compañía de seguros o una HMO, u otro organismo, para determinar si debe o no reembolsar a un proveedor de asistencia sanitaria los servicios prestados al sujeto, o si debe aprobar la prestación de servicios al sujeto. Por ejemplo, el pagador de la asistencia sanitaria puede decidir reembolsar a un proveedor de asistencia sanitaria los tratamientos para la PML si el sujeto padece PML o tiene un mayor riesgo de desarrollarla.
También se proporcionan en el presente documento bases de datos que incluyen una lista de variaciones genéticas como se describe en el presente documento, y en el que la lista puede ser en gran parte o totalmente limitada a variaciones genéticas identificadas como útiles para la detección de PML como se describe en el presente documento. La lista puede almacenarse, p. ej., en un archivo plano o en un vehículo legible por ordenador. Las bases de datos pueden incluir además información relativa a uno o más sujetos, p. ej., si un sujeto está afectado o no, información clínica como el endofenotipo, la edad de inicio de los síntomas, cualquier tratamiento administrado y los resultados, p. ej., datos relevantes para la farmacogenómica, el diagnóstico, el pronóstico o la teranóstica, y otros detalles, p. ej., datos sobre el trastorno en el sujeto, o factores ambientales (p. ej., incluyendo, entre otros, la infección o un historial de infección por VIH o JCV) u otros factores genéticos.
Las bases de datos pueden utilizarse para detectar correlaciones entre un haplotipo concreto y la información relativa al sujeto.
Los métodos descritos en el presente documento también pueden incluir la generación de informes para su uso, p. ej., por un sujeto, un cuidador o un investigador, que incluyan información relativa a las variaciones genéticas de un sujeto y, opcionalmente, información adicional como los tratamientos administrados, el historial de tratamientos, el historial médico, la respuesta prevista y la respuesta real. Los informes pueden grabarse en un medio tangible, p. ej., un disco legible por ordenador, un dispositivo de memoria de estado sólido o un dispositivo de almacenamiento óptico.
Métodos de detección mediante variaciones de ARN y/o polipéptidos
La presente invención consiste en determinar la ausencia o presencia de una variación genómica seleccionada de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. A continuación se ofrece una explicación general de los métodos de detección que pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de las variaciones genómicas de las reivindicaciones, y se incluyen ejemplos que no forman parte de la materia reivindicada en el presente documento, en la medida en que se refieren a variaciones distintas de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. La detección de PML puede realizarse examinando o comparando cambios en la expresión, localización, compañeros de unión y composición de un polipéptido codificado por una variante de ácido nucleico asociada con PML, p. ej., en aquellos casos en los que las variaciones genéticas de la presente divulgación den lugar a un cambio en la composición o expresión del polipéptido y/o ARN, p. ej., ARNm, microARN (miARN) y otros ARN no codificantes (ARNnc). De este modo, la detección de PML puede hacerse examinando la expresión y/o composición de uno de estos polipéptidos y/o ARN, u otro polipéptido y/o ARN codificado por un ácido nucleico asociado con PML, en aquellos casos en los que la variación genética de la presente divulgación resulte en un cambio en la expresión, localización, compañeros de unión, y/o composición del polipéptido y/o ARN. La detección puede comprender el diagnóstico de un sujeto. La detección puede comprender la determinación del pronóstico de un sujeto, p. ej., la determinación de la susceptibilidad de desarrollar PML. La detección puede comprender la teranosis de un sujeto.
Las variaciones genéticas descritas en el presente documento que muestran asociación a PML pueden jugar un papel a través de su efecto en uno o más de estos genes, ya sea impactando directamente uno o más genes o influenciando la expresión de uno o más genes cercanos. Por ejemplo, sin pretender estar limitado por la teoría, generalmente se espera que la eliminación de un segmento cromosómico que comprende un gen particular, o un fragmento de un gen, pueda dar lugar a una composición o expresión alterada, o ambas, del polipéptido y/o ARNm codificado. Del mismo modo, se espera que las duplicaciones, o las variaciones en el número de copias con un número elevado, den lugar en general a un aumento de la expresión del polipéptido y/o ARN codificado si el gen del que se expresan está totalmente englobado dentro del segmento genómico duplicado (o triplicado, o incluso con ganancias en el número de copias superiores), o por el contrario pueden dar lugar a una disminución de la expresión o a un ARN o polipéptido alterado si uno o ambos puntos de rotura de la ganancia en el número de copias alteran un gen determinado. Otros posibles mecanismos que afectan a los genes dentro de una región de variación genética incluyen, p. ej., efectos sobre la transcripción, efectos sobre el empalme del ARN, alteraciones en las cantidades relativas de formas alternativas de empalme del ARNm, efectos sobre la estabilidad del ARN, efectos sobre el transporte del núcleo al citoplasma y efectos sobre la eficacia y precisión de la traducción. De este modo, las variaciones de ADN pueden detectarse directamente, utilizando el ADN genómico amplificado o no amplificado de los sujetos, o indirectamente, utilizando ARN o ADN obtenido del tejido o tejidos del sujeto que estén presentes en una forma o nivel de expresión aberrante como resultado de las variaciones genéticas de la divulgación que muestran asociación con la PML. Las variaciones en el ADN pueden detectarse indirectamente utilizando un polipéptido o proteína obtenido del tejido o tejidos del sujeto que esté presente en una forma o nivel de expresión aberrante como resultado de las variaciones genéticas de la divulgación que muestren asociación con la PML. Una forma aberrante o nivel de expresión de un polipéptido o proteína que resulta de una o más variaciones genéticas de la divulgación que muestra asociación a PML puede detectarse indirectamente a través de otro polipéptido o proteína presente en la misma vía biológica/celular que se modula o interactúa con dicho polipéptido o proteína que resulta de una o más variaciones genéticas de la divulgación. Las variaciones genéticas de la divulgación que muestran asociación con la PML pueden afectar a la expresión de un gen dentro de la región de variación genética. Una variación genética que afecte a una región exónica de un gen puede afectar, alterar o modular la expresión del gen. Una variación genética que afecte a una región intrónica o intergénica de un gen puede afectar, alterar o modular la expresión del gen.
Ciertas regiones de variación genética pueden tener segmentos duplicados flanqueantes, y los genes dentro de tales segmentos pueden tener una expresión y/o composición alterada como resultado de tales alteraciones genómicas. Los elementos reguladores que afectan a la expresión génica pueden estar situados lejos, incluso a decenas o centenares de kilobases de distancia, del gen regulado por dichos elementos reguladores. Por lo tanto, los elementos reguladores de los genes que se encuentran fuera del gen (p. ej., secuencia arriba o secuencia abajo del gen) pueden estar ubicados dentro de la variación genética y, por lo tanto, verse afectados por la variación genética. Por lo tanto, se contempla que la detección de las variaciones genéticas descritas en el presente documento puede utilizarse para evaluar la expresión de uno o más genes asociados no afectados directamente por las variaciones genéticas. Una variación genética que afecte a una región intergénica de un gen puede afectar, alterar o modular la expresión de un gen situado en otra parte del genoma, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, una variación genética que afecte a una región intergénica de un gen puede afectar, interrumpir o modular la expresión de un factor de transcripción, situado en otra parte del genoma, que regula el gen. Los elementos reguladores también pueden localizarse dentro de un gen, tal como en las regiones intrónicas, y afectar de forma similar al nivel de expresión del gen y, en última instancia, al nivel de expresión de la proteína sin cambiar la estructura de la proteína. Los efectos de las variantes genéticas sobre los elementos reguladores pueden manifestarse de forma específica para cada tejido; p. ej., uno o más factores de transcripción que se unen al elemento regulador afectado por una o más variaciones genéticas pueden expresarse en mayor concentración en las neuronas que en las células de la piel (es decir, el impacto de una o más variaciones genéticas puede ser evidente principalmente en las células neuronales).
Las variaciones genéticas de la divulgación que muestran asociación a PML pueden afectar la expresión de la proteína a nivel traslacional. Los expertos en la materia pueden apreciar que esto puede ocurrir por el aumento o la disminución de la expresión de uno o más microARN (miARN) que regula la expresión de una proteína que se sabe que es importante, o está implicada, en la causa, aparición o progresión de la PML. El aumento o disminución de la expresión de uno o más miARN puede ser el resultado de la ganancia o pérdida de todo el gen de miARN, la interrupción o deterioro de una porción del gen (p. ej., por un indel o CNV), o incluso un cambio de una sola base (SNP o SNV) que produce una secuencia de miARN alterada, no funcional o de funcionamiento aberrante. También puede ser apreciado por los expertos en la materia que la expresión de la proteína, p. ej., una conocida por causar PML por aumento o disminución de la expresión, puede resultar debido a una variación genética que resulta en la alteración de un sitio de unión de miARN existente dentro de la transcripción de ARNm del polipéptido, o incluso crea un nuevo sitio de unión de miARN que conduce a la expresión aberrante del polipéptido.
Se puede utilizar una variedad de métodos para detectar la composición y/o los niveles de expresión de polipéptidos, incluyendo, pero sin limitarse a ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, espectroscopia, espectrometría de masas, matrices peptídicas, colorimetría, electroforesis, enfoque isoeléctrico, inmunoprecipitaciones, inmunoensayos e inmunofluorescencia y otros métodos bien conocidos en la técnica. Una muestra de ácido nucleico de prueba de un sujeto puede evaluarse para detectar la presencia de una alteración en la expresión y/o una alteración en la composición del polipéptido codificado por un ácido nucleico asociado a PML. Una "alteración" en la expresión o composición del polipéptido, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una alteración en la expresión o composición en una muestra de ácido nucleico de prueba, en comparación con la expresión o composición del polipéptido en una muestra de ácido nucleico de control. Dicha alteración puede ser, p. ej., una alteración en la expresión cuantitativa del polipéptido o puede ser una alteración en la expresión cualitativa del polipéptido, p. ej., la expresión de un polipéptido mutante o de una variante de empalme diferente, o una combinación de las mismas. La detección de PML puede realizarse detectando una variante de empalme particular codificada por un ácido nucleico asociado con PML, o un patrón particular de variantes de empalme.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden estar marcados o no. Puede utilizarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo. El término "marcado", en relación con la sonda o el anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o el anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo marcado directamente como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Otros ejemplos no limitantes de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado, p. ej., un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcaje final de una sonda de ADN con biotina de forma que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia.
Métodos de detección de variaciones genéticas
La presente invención consiste en determinar la ausencia o presencia de una variación genómica seleccionada de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4: 103522150, G>A. A continuación se ofrece una explicación general de los métodos de detección que pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de las variaciones genómicas de las reivindicaciones, y se incluyen ejemplos que no forman parte de la materia reivindicada en el presente documento, en la medida en que se refieren a variaciones distintas de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. Pueden utilizarse técnicas estándar de genotipado para detectar la presencia de variaciones genéticas, p. ej., la amplificación. La amplificación de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Generalmente, la información de la secuencia de la región de interés puede utilizarse para diseñar cebadores oligonucleotídicos que pueden ser idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas de un molde a amplificar. Los métodos de amplificación pueden incluir, entre otros, técnicas basadas en la fluorescencia que utilizan la PCR, p. ej., la reacción en cadena de la ligasa (CSF), la PCR anidada, la amplificación por transcripción, la replicación de secuencias autosostenida, la amplificación de secuencias basada en ácidos nucleicos (NASBA) y la amplificación de sondas dependiente de ligadura múltiple (MLPA). Las directrices para la selección de cebadores para la amplificación por PCR son bien conocidas en la técnica. Se puede utilizar un programa informático para diseñar los cebadores, p. ej., Oligo (National Biosciences, Inc., Plymouth Minn), MacVector (Kodak/IBI) y suite GCG de programas de análisis de secuencias.
Se pueden utilizar metodologías comerciales disponibles para el genotipado, p. ej., genotipado SNP, pero no se limitan a, ensayos de genotipado TaqMan (Applied Biosystems), plataformas SNPlex (Applied Biosystems), electroforesis en gel, electroforesis capilar, cromatografía de exclusión por tamaño, espectrometría de masas, p. ej., sistema MassARRAY (Sequenom), métodos de minisecuenciación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, sistema Bio-Plex (BioRad), sistemas CEQ y SNPstream (Beckman), tecnología de hibridación de arreglos, p. ej., Affymetrix GeneChip (Perlegen), BeadArray Technologies, p. ej., ensayos Illumina GoldenGate e Infinium, tecnología de marcadores de arreglos, amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple (MLPA), y tecnología de hibridación por fluorescencia basada en endonucleasas (ensayo Invader, utilizando ADN genómico amplificado o no amplificado, o ARN total no amplificado, o ADNc amplificado o no amplificado; Third Wave/Hologic). La PCR puede ser un procedimiento en el que el ácido nucleico diana se amplifica de forma similar a la descrita en la patente de los Estados Unidos No. 4,683,195 y modificaciones posteriores del procedimiento descrito en la misma. La PCR puede incluir un ciclo de tres fases de temperatura de desnaturalización del ADN en cadenas simples, hibridación de los cebadores con las cadenas desnaturalizadas y extensión de los cebadores por una enzima ADN polimerasa termoestable. Este ciclo puede repetirse hasta que haya suficientes copias para ser detectadas y analizadas. La PCR cuantitativa en tiempo real puede utilizarse para determinar variaciones genéticas, en las que la PCR cuantitativa puede permitir tanto la detección como la cuantificación de una secuencia de ADN en una muestra de ácido nucleico, p. ej., tal como un número absoluto de copias o como una cantidad relativa cuando se normaliza con respecto a la entrada de ADN u otros genes normalizadores. Los métodos de cuantificación pueden incluir el uso de tintes fluorescentes que pueden intercalarse con ADN de doble cadena, y sondas de oligonucleótidos de ADN modificados que pueden emitir fluorescencia cuando se hibridan con un ADN complementario.
Una muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto puede ser recogida y la PCR puede ser usada para amplificar un fragmento de ácido nucleico que comprende una o más variaciones genéticas que pueden ser indicativas de una susceptibilidad a PML. La detección de variaciones genéticas puede realizarse mediante análisis de expresión, p. ej., utilizando la PCR cuantitativa. Esta técnica puede evaluar la presencia o ausencia de una alteración genética en la expresión o composición de uno o más polipéptidos o variantes de empalme codificados por un ácido nucleico asociado a PML.
La muestra de ácido nucleico de un sujeto que contiene un SNP puede amplificarse por PCR antes de la detección con una sonda. El ADN amplificado puede servir de molde para una sonda de detección y, en algunos casos, para una sonda potenciadora. La sonda de detección, la sonda potenciadora y/o los cebadores utilizados para la amplificación del molde por PCR pueden comprender el uso de bases modificadas, p. ej., A, T, C, G y U modificadas, en las que el uso de bases modificadas puede ser útil para ajustar la temperatura de fusión de la sonda de nucleótidos y/o el cebador al ADN molde. Las bases modificadas pueden utilizarse en el diseño de la sonda de nucleótidos de detección. En estos métodos puede seleccionarse cualquier base modificada conocida por el experto, y la selección de bases adecuadas está dentro del alcance del experto basándose en las enseñanzas del presente documento y en las bases conocidas disponibles en fuentes comerciales conocidas por el experto.
La identificación de variaciones genéticas puede lograrse utilizando métodos de hibridación. La presencia de un alelo marcador específico o de un segmento genómico particular que comprende una variación genética, o representativo de una variación genética, puede indicarse mediante la hibridación específica de secuencia de una sonda de ácido nucleico específica para el alelo particular o la variación genética en una muestra de ácido nucleico que ha sido o no amplificada, por métodos descritos en el presente documento. La presencia de más de un alelo marcador específico o de varias variaciones genéticas puede indicarse utilizando dos o más sondas de ácido nucleico de secuencia específica, en las que cada una es específica para un alelo y/o variación genética particular.
La hibridación puede realizarse por métodos bien conocidos por el experto en la materia, p. ej., técnicas de hibridación como la hibridación fluorescentein situ(FISH), el análisis Southern, el análisis Northern o la hibridaciónin situ.La hibridación puede referirse a la hibridación específica, en la que la hibridación puede realizarse sin discordancias. La hibridación específica, si existe, puede realizarse mediante métodos estándar. Si se produce hibridación específica entre una sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico, la muestra de ácido nucleico puede contener una secuencia que puede ser complementaria a un nucleótido presente en la sonda de ácido nucleico. Si una sonda de ácido nucleico puede contener un alelo particular de un marcador polimórfico, o alelos particulares para una pluralidad de marcadores, la hibridación específica puede ser indicativa de que el ácido nucleico es completamente complementario a la sonda de ácido nucleico, incluyendo, los alelos particulares en los marcadores polimórficos dentro de la sonda. Una sonda puede contener más de un alelo marcador de un haplotipo particular, p. ej., una sonda puede contener alelos complementarios a 2, 3, 4, 5 o todos los marcadores que componen un haplotipo particular. La detección de uno o más marcadores particulares del haplotipo en la muestra de ácido nucleico puede ser indicativa de que la fuente de la muestra de ácido nucleico tiene el haplotipo particular.
Se pueden desarrollar condiciones de PCR y cebadores que amplifiquen un producto sólo cuando el alelo variante está presente o sólo cuando el alelo de tipo silvestre está presente, p. ej., PCR específica de alelo. Con la PCR específica de alelo, se puede emplear un método que utiliza una sonda de oligonucleótido de detección que comprende una fracción o grupo fluorescente en su terminal 3' y un inactivador en su terminal 5', y un oligonucleótido potenciadorfvéase, p. ej., Kutyavin et al., Nucleic Acid Res. 34:Pe128 (2006)).
Un cebador/sonda específico de alelo puede ser un oligonucleótido que es específico para un polimorfismo particular puede ser preparado usando métodos estándar. Las sondas oligonucleótidas específicas de alelo pueden hibridarse específicamente con una región de ácido nucleico que contenga una variación genética. Las condiciones de hibridación pueden seleccionarse de forma que una sonda de ácido nucleico pueda unirse específicamente a la secuencia de interés, p. ej., la secuencia de ácido nucleico variante.
El análisis de digestión de restricción específico de alelo puede ser usado para detectar la existencia de una variante polimórfica de un polimorfismo, si variantes polimórficas alternas del polimorfismo pueden resultar en la creación o eliminación de un sitio de restricción. Las digestiones de restricción específicas de alelo pueden realizarse, p. ej., con la enzima de restricción particular que pueda diferenciar los alelos. La PCR puede utilizarse para amplificar una región que comprenda el sitio polimórfico, y puede realizarse un análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. Para las variantes de secuencia que no alteran un sitio de restricción común, se pueden diseñar cebadores mutagénicos que pueden introducir uno o más sitios de restricción cuando el alelo variante está presente o cuando el alelo de tipo silvestre está presente.
La incorporación de colorante-terminador dirigida por molde de polarización de fluorescencia (FP-TDI) puede utilizarse para determinar cuál de las múltiples variantes polimórficas de un polimorfismo puede estar presente en un sujeto. A diferencia del uso de sondas o cebadores específicos de alelos, este método puede emplear cebadores que pueden terminar adyacentes a un sitio polimórfico, de modo que la extensión del cebador por un solo nucleótido puede resultar en la incorporación de un nucleótido complementario a la variante polimórfica en el sitio polimórfico.
ElADN que contiene una porción amplificada puede ser sometido a transferencia de puntos, utilizando métodos estándar y poniendo en contacto la transferencia con la sonda de oligonucleótidos. A continuación, puede detectarse la presencia de hibridación específica de la sonda con el ADN. Los métodos pueden incluir la determinación del genotipo de un sujeto con respecto a ambas copias del sitio polimórfico presente en el genoma, en el que, si existen múltiples variantes polimórficas en un sitio, esto puede indicarse adecuadamente especificando qué variantes están presentes en un sujeto. Cualquiera de los medios de detección descritos en el presente documento puede utilizarse para determinar el genotipo de un sujeto con respecto a una o ambas copias del polimorfismo presente en el genoma del sujeto.
Se puede utilizar una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) además de, o en lugar de, una sonda de ácido nucleico en los métodos descritos en el presente documento. Un PNA puede ser un imitador del ADN que tiene una cadena inorgánica similar a un péptido, p. ej., unidades de N-(2-aminoetil) glicina con una base orgánica (A, G, C, T o U) unida al nitrógeno de la glicina mediante un enlazador de metileno carbonilo.
El análisis de la secuencia del ácido nucleico también puede utilizarse para detectar variaciones genéticas, p. ej., las variaciones genéticas pueden detectarse secuenciando exones, intrones, secuencias no traducidas 5' o secuencias no traducidas 3'. Para detectar variaciones genéticas, pueden utilizarse uno o varios métodos de análisis de ácidos nucleicos conocidos por los expertos en la materia, tal como la secuenciación manual directa, la secuenciación fluorescente automatizada, los ensayos de polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP), la electroforesis en gel desnaturalizante con pinzas (CDGE), la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), la electroforesis en gel bidimensional (2DGE o TDGE), la electroforesis en gel sensible a la conformación (CSGE); cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC), espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz de infrarrojos (IR-MALDI), análisis de desplazamiento de movilidad, PCR cuantitativa en tiempo real, análisis de enzimas de restricción, análisis de heterodúplex; escisión química de desajustes (CMC), ensayos de protección de RNasa, uso de polipéptidos que reconocen desajustes de nucleótidos, PCR específica de alelo, secuenciación de ADN con pirofosfato en tiempo real, amplificación de PCR en combinación con cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (dHPLC) y combinaciones de dichos métodos.
La secuenciación puede realizarse mediante métodos clásicos de secuenciación de Sanger, conocidos en la técnica. La secuenciación puede realizarse utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento, algunos de los cuales permiten la detección de un nucleótido secuenciado inmediatamente después o en el momento de su incorporación a una cadena en crecimiento, p. ej., la detección de la secuencia en tiempo sustancialmente real o en tiempo real. En algunos casos, la secuenciación de alto rendimiento genera al menos 1,000, al menos 5,000, al menos 10,000, al menos 20,000, al menos 30,000, al menos 40,000, al menos 50,000, al menos 100,000 o al menos 500,000 lecturas de secuencias por hora; siendo cada lectura de al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 120 o al menos 150 bases por lectura (o 500 - 1,000 bases por lectura para 454).
Los métodos de secuenciación de alto rendimiento pueden incluir, entre otros, la secuenciación de firmas en paralelo masivo (MPSS, Lynx Therapeutics), la secuenciación Polony, la pirosecuenciación 454, la secuenciación Illumina (Solexa), la secuenciación Illumina (Solexa) utilizando la preparación de bibliotecas Genomics 10X, la secuenciación SOLiD, la secuenciación en semiconductor, Secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de molécula única Helioscope™, secuenciación de molécula única SMRT™, secuenciación de molécula única en tiempo real (RNAP), secuenciación de ADN Nanopore, y/o secuenciación por hibridación, p. ej., un método no enzimático que utiliza una micromatriz de ADN, o secuenciación de Sanger de microfluidos.
La secuenciación de alto rendimiento puede implicar el uso de tecnología disponible por Helicos BioSciences Corporation (Cambridge, Mass.) como el método de secuenciación de molécula única por síntesis (SMSS). El SMSS es única porque permite secuenciar todo el genoma humano en un máximo de 24 horas. Este método de secuenciación rápida también permite detectar un SNP/nucleótido en una secuencia en tiempo sustancialmente real o en tiempo real. Por último, el SMSS es potente porque, al igual que la tecnología MIP, no utiliza una etapa de preamplificación previa a la hibridación. El SMSS no utiliza ningún tipo de amplificación. El SMSS se describe en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. 20060024711; 20060024678; 20060012793; 20060012784 y 20050100932. La secuenciación de alto rendimiento puede implicar el uso de la tecnología disponible por 454 Life Sciences, Inc. (una empresa de Roche, Branford, Conn.) tal como el dispositivo PicoTiterPlate que incluye una placa de fibra óptica que transmite la señal quimioluminiscente generada por la reacción de secuenciación para ser registrada por una cámara CCD en el instrumento. Este uso de la fibra óptica permite detectar un mínimo de 20 millones de pares de bases en 4.5 horas.
El ácido nucleico monocatenario amplificado por PCR puede hibridarse con un cebador e incubarse con una polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa, apirasa y los sustratos luciferina y adenosina 5' fosfosulfato. A continuación, pueden añadirse secuencialmente trifosfatos de desoxinucleótidos correspondientes a las bases A, C, G y T (U). La incorporación de una base puede ir acompañada de la liberación de pirofosfato, que puede ser convertido en ATP por la sulfurilasa, lo que puede impulsar la síntesis de oxiluciferina y la liberación de luz visible. Dado que la liberación de pirofosfato puede ser equimolar con el número de bases incorporadas, la luz emitida puede ser proporcional al número de nucleótidos añadidos en cualquier etapa. El proceso puede repetirse hasta que pueda determinarse la secuencia completa. La pirosecuenciación puede utilizarse para analizar los amplicones para determinar si existen puntos de rotura. La pirosecuenciación puede mapear secuencias circundantes como control de calidad interno.
Los métodos de análisis de pirosecuenciación son conocidos en la técnica. El análisis de secuencias puede incluir un esquema de secuenciación por ligadura de cuatro colores (ligadura degenerada), que consiste en hibridar un cebador de anclaje en una de las cuatro posiciones. A continuación, se puede llevar a cabo una reacción de ligación enzimática del cebador de anclaje con una población de nonámeros degenerados marcados con colorantes fluorescentes. En cualquier ciclo dado, la población de nonámeros que se utiliza puede estructurarse de tal forma que la identidad de una de sus posiciones pueda correlacionarse con la identidad del fluoróforo unido a ese nonámero. En la medida en que la ligasa discrimina por complementariedad en esa posición consultada, la señal fluorescente puede permitir inferir la identidad de la base. Después de realizar la ligadura y la obtención de imágenes de cuatro colores, los complejos cebador de anclaje: nonámero pueden despojarse y comienza un nuevo ciclo. Los métodos para obtener imágenes de la información de la secuencia después de realizar la ligadura son conocidos en la técnica.
El análisis por digestión de enzimas de restricción puede utilizarse para detectar una variación genética particular si la variación genética resulta en la creación o eliminación de uno o más sitios de restricción en relación con una secuencia de referencia. Puede realizarse un análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), en el que el patrón de digestión del fragmento de ADN pertinente indica la presencia o ausencia de la variación genética concreta en la muestra de ácido nucleico.
Las matrices de sondas de oligonucleótidos que pueden ser complementarias a segmentos de secuencia de ácido nucleico diana de un sujeto pueden utilizarse para identificar variaciones genéticas. Un arreglo de sondas de oligonucleótidos puede comprender una matriz de oligonucleótidos, p. ej., una micromatriz. La presente divulgación presenta matrices que incluyen un sustrato que tiene una pluralidad de áreas direccionables, y métodos para utilizarlas. Al menos una zona de la pluralidad incluye una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia que comprende una variación genética, y puede utilizarse para detectar la ausencia o presencia de la variación genética, p. ej., uno o más SNP, microsatélites o CNV, tal como se describe en el presente documento, para determinar o identificar un alelo o genotipo. Por ejemplo, el arreglo puede incluir una o más sondas de ácido nucleico que pueden utilizarse para detectar una variación genética asociada a un gen y/o producto génico. La matriz puede comprender además al menos un área que incluya una sonda de ácido nucleico que puede utilizarse para detectar específicamente otro marcador asociado con PML como se describe en el presente documento.
La hibridación de microarreglos puede realizarse hibridando un ácido nucleico de interés, p. ej., un ácido nucleico que engloba una variación genética, con el arreglo y detectando la hibridación utilizando sondas de ácido nucleico. El ácido nucleico de interés puede amplificarse antes de la hibridación. La hibridación y la detección pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos estándar descritos en las solicitudes PCT publicadas: WO 92/10092 y WO 95/11995 y la patente de los Estados Unidos No. 5,424,186. Por ejemplo, se puede escanear una matriz para determinar la posición en la matriz con la que se hibrida el ácido nucleico. Los datos de hibridación obtenidos del escaneo pueden ser, p. ej., en forma de intensidades de fluorescencia en función de la localización en la matriz.
Las matrices pueden formarse sobre sustratos fabricados con materiales como papel; vidrio; plástico, p. ej., polipropileno, nailon o poliestireno; poliacrilamida; nitrocelulosa; silicio; fibra óptica; o cualquier otro vehículo sólido o semisólido adecuado; y pueden configurarse en una configuración plana, p. ej., placas de vidrio o chips de silicio); o tridimensional, p. ej., alfileres, fibras, cuentas, partículas, pocillos de microtitulación y capilares.
Los métodos para generar matrices son conocidos en la técnica y pueden incluir, p. ej., métodos fotolitográficos (patentes de los Estados Unidos Nos. 5,143,854, 5,510,270 y 5,527,681); métodos mecánicos, p. ej., métodos de flujo dirigido (patente de los Estados Unidos No. 5,384,261); métodos basados en pasadores (patente de los Estados Unidos No. 5,288,514); técnicas basadas en cuentas (PCT US/93/04145); métodos de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida; o mediante otros métodos conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo Bier, F.F., et al., Adv Biochem Eng Biotechnol 109: 433-53 (2008); Hoheisel, J. D., Nat Rev Genet 7: 200-10 (2006); Fan, J. B., et al., Methods Enzymol 410: 57-73 (2006); Raqoussis, J. & Elvidge, G., Expert Rev Mol Design 6: 145-52 (2006); Mockler, T.C., et al., Genomics 85: 1-15 (2005), y las referencias citadas). Pueden encontrarse muchas descripciones adicionales de la preparación y uso de arreglos de oligonucleótidos para la detección de polimorfismos, p. ej., en los documentos US 6,858,394, US 6,429,027, US 5,445,934, US 5,700,637, US 5,744,305, US 5,945,334, US 6,054,270, US 6,300,063, US 6,733,977, US 7,364,858, EP 619 321 y EP 373 203. Los métodos de producción, hibridación y análisis de arreglos también se describen en Snijders et al. Genetics 29: 263-264 (2001); Klein et al. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4494-4499 (1999); Albertson et al., Breast Cancer Research and Treatment 78: 289-298 (2003); y Snijders et al., "BAC microarray based comparative genomic hybridization", en: Zhao et al., (eds), Bacterial Artificial Chromosomes: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press (2002).
Las sondas de oligonucleótidos que forman una matriz pueden fijarse a un sustrato por cualquier cantidad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, síntesisin situ,p. ej., matrices de oligonucleótidos de alta densidad, utilizando técnicas fotolitográficas; manchado/impresión de una densidad media a baja sobre vidrio, nylon o nitrocelulosa; por enmascaramiento; y por transferencia de puntos sobre una membrana de hibridación de nylon o nitrocelulosa. Los oligonucleótidos pueden inmovilizarse mediante un enlazador, entre otros, por enlace covalente, iónico o físico. Los enlazadores para inmovilizar ácidos nucleicos y polipéptidos, incluidos los enlazadores reversibles o escindibles, son conocidos en la técnica (patente de los Estados Unidos No.
5,451,683 y el documento WO98/20019). Los oligonucleótidos pueden inmovilizarse de forma no covalente en un sustrato por hibridación con anclajes, mediante perlas magnéticas, o en una fase fluida, p. ej., en pocillos o capilares.
Una matriz puede comprender sondas de hibridación de oligonucleótidos capaces de hibridarse específicamente con diferentes variaciones genéticas. Las matrices de oligonucleótidos pueden comprender una pluralidad de sondas de oligonucleótidos diferentes acopladas a una superficie de un sustrato en diferentes ubicaciones conocidas. Las sondas de oligonucleótidos pueden presentar una unión diferencial o selectiva a sitios polimórficos, y pueden ser diseñadas fácilmente por un experto en la materia, p. ej., un oligonucleótido que sea perfectamente complementario a una secuencia que abarque un sitio polimórfico, p. ej., una secuencia que incluya el sitio polimórfico, dentro de ella, o en un extremo, puede hibridar preferentemente con un ácido nucleico que comprenda esa secuencia, frente a un ácido nucleico que comprenda una variante polimórfica alternativa.
Las matrices pueden incluir múltiples bloques de detección, p. ej., múltiples grupos de sondas diseñadas para la detección de polimorfismos particulares. Estas matrices pueden utilizarse para analizar múltiples polimorfismos diferentes. Los bloques de detección pueden agruparse en una única matriz o en múltiples matrices separadas, en las que pueden utilizarse condiciones variables, p. ej., condiciones optimizadas para polimorfismos concretos, durante la hibridación. Pueden encontrarse descripciones generales del uso de arreglos de oligonucleótidos para la detección de polimorfismos, p. ej., en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,858,659 y 5,837,832. Además de las matrices de oligonucleótidos, también pueden utilizarse matrices de ADNc.
Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir, entre otros, proporcionar una matriz como la descrita en el presente documento; poner en contacto la matriz con una muestra de ácido nucleico y detectar la unión de un ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico a la matriz. El método puede comprender amplificar ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico, p. ej., una región asociada con PML o una región que incluye otra región asociada con PML. Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir el uso de una matriz que puede identificar patrones de expresión diferencial o números de copias de uno o más genes en muestras de ácido nucleico de individuos de control y afectados. Por ejemplo, las matrices de sondas a un marcador descrito en el presente documento pueden utilizarse para identificar variaciones genéticas entre el ADN de un sujeto afectado y el ADN de control obtenido de un individuo que no tiene PML. Dado que los nucleótidos de la matriz pueden contener marcadores de secuencia, sus posiciones en la matriz pueden conocerse con precisión en relación con la secuencia genómica.
Puede ser deseable emplear métodos que puedan detectar la presencia de múltiples variaciones genéticas, p. ej., variantes polimórficas en una pluralidad de sitios polimórficos, en paralelo o sustancialmente simultáneamente. Estos métodos pueden comprender matrices de oligonucleótidos y otros métodos, incluyendo, métodos en los que las reacciones, p. ej., amplificación e hibridación, pueden realizarse en recipientes individuales, p. ej., dentro de pocillos individuales de una placa de pocillos múltiples u otro recipiente.
Determinar la identidad de una variación genética también puede incluir o consistir en revisar el historial médico de un sujeto, donde el historial médico incluye información relativa a la identidad, número de copias, presencia o ausencia de uno o más alelos o SNP en el sujeto, p. ej., resultados de una prueba genética.
Los recorridos de homocigosidad extendidos (ROH) pueden ser útiles para mapear genes de enfermedades recesivas en poblaciones exógenas. Además, incluso en trastornos complejos, un elevado número de individuos afectados puede tener el mismo haplotipo en la región que rodea a la mutación de una enfermedad. Por lo tanto, una variante patogénica rara y el haplotipo circundante pueden estar enriquecidos en frecuencia en un grupo de individuos afectados en comparación con la frecuencia del haplotipo en una cohorte de controles no afectados. Los haplotipos homocigotos (HH) compartidos por múltiples individuos afectados pueden ser importantes para el descubrimiento de genes recesivos de la enfermedad en una afección como la PML. El método tradicional de mapeo de homocigosidad puede ampliarse analizando el haplotipo dentro de las regiones ROH compartidas para identificar segmentos homocigotos de haplotipo idéntico que estén presentes de forma única o con una mayor frecuencia en los probandos de PML en comparación con los controles parentales. Tales regiones se denominan haplotipos homocigotos de riesgo (rHH), que pueden contener variantes recesivas de baja frecuencia que contribuyen al riesgo de PML en un subconjunto de pacientes con PML.
Las variaciones genéticas también pueden identificarse utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse variaciones genéticas disponibles en bases de datos públicas, que pueden buscarse utilizando métodos y algoritmos personalizados o algoritmos conocidos en la técnica. Una secuencia de referencia puede proceder, p. ej., del borrador de la secuencia del genoma humano, disponible públicamente en varias bases de datos, o de una secuencia depositada en una base de datos como GenBank.
Una comparación de uno o más genomas en relación con otro u otros genomas con matriz CGH, o una variedad de otros métodos de detección de variaciones genéticas, puede revelar el conjunto de variaciones genéticas entre dos genomas, entre un genoma en comparación con múltiples genomas, o entre un conjunto de genomas en comparación con otro conjunto de genomas. Un experimento con una matriz CGH puede realizarse hibridando un único genoma de prueba contra una muestra de ácido nucleico agrupada de dos o más genomas, lo que puede resultar en minimizar la detección de variantes de mayor frecuencia en el experimento. Un genoma de prueba puede hibridarse solo (es decir, detección de un solo color) con una micromatriz, p. ej., utilizando métodos de genotipado con la matriz CGH o SNP, y la etapa de comparación con uno o más genomas de referencia puede realizarsein silicopara revelar el conjunto de variaciones genéticas en el genoma de prueba en relación con uno o más genomas de referencia. Un único genoma de prueba puede compararse con un único genoma de referencia en un experimento de 2 colores en el que ambos genomas se hibridan juntamente con la micromatriz, puede analizarse el genoma completo o el exoma completo de uno o más sujetos. La información sobre ácidos nucleicos ya se ha obtenido para el genoma completo o el exoma completo de uno o más individuos y la información sobre ácidos nucleicos puede obtenerse a partir de un análisisin silico.
Cualquiera de los polinucleótidos descritos, incluidos los polinucleótidos que comprenden una variación genética, puede fabricarse sintéticamente utilizando métodos conocidos en la técnica.
Medicamento inmunosupresor para uso terapéutico
En un aspecto la invención proporciona un medicamento inmunosupresor para uso en el tratamiento de una condición en un sujeto que necesita terapia con medicamentos inmunosupresores. El medicamento inmunosupresor para uso de la presente invención implica determinar la ausencia de una variación genómica seleccionada de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. A continuación se ofrece una explicación general del uso de un medicamento inmunosupresor, y se incluyen ejemplos que no forman parte de la materia reivindicada en el presente documento, en la medida en que se refieren a variaciones distintas de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. También se describen en el presente documento métodos, composiciones farmacéuticas y kits para el tratamiento de una afección en sujetos animales. La afección puede ser VIH/SIDA, cáncer o una enfermedad autoinmune. La afección puede ser PML. Por ejemplo, puede tratarse de esclerosis múltiple. Los métodos pueden comprender la administración de uno o más medicamentos inmunosupresores. Las composiciones farmacéuticas y los kits pueden comprender uno o más medicamentos inmunosupresores. El uno o más medicamentos inmunosupresores pueden ser adalimumab (p. ej., HUMIRA), alemtuzumab (p. ej., LEMTRADA), alentuzumab (p. ej.,<c>A<m>PATH), azatioprina (p. ej., IM<u>R<a>N), belimumab (p. ej., BENLYSTA), bevacizumab (p. ej., AVA<s>T<a>TIN), bortezomib (p. ej., V<e>L<c>ADE), eculizumab (p. ej., SOLIRIS), leflunomida, brentuximab vedotina (p. ej., ADCETRIS), cetuximab (p. ej., ERBITUX), ciclofosfamida, fumarato de dimetilo (p. ej., TECFIDERA), efalizumab (p. ej., RAPTIVA), fingolimod (p. ej., GILENYA), fludarabina (p. ej., FLUDARA), ácido fumárico, imatinib (p. ej., GLEEVEC, GLIVEC), infliximab (p. ej., REMICADE), metotrexato (p. ej., TREXALL, RHEUMATREX), micofenolato de mofetilo (p. ej., CELLCEPT), natalizumab (p. ej., TYS<a>B<r>I), rituximab (p. ej., RITUXIN), daclizumab (p. ej., ZIN<b>R<y>TA), vedolizumab (ENTYVIO), ruxolitinib (p. ej., JAKAFI, JAKAVI), ocrelizumab (p. ej., OCReVu S), o cualquier combinación de los mismos. El término "sujeto animal", tal y como se utiliza en el presente documento, incluye tanto a los seres humanos como a otros mamíferos. El término "tratar", tal y como se utiliza en el presente documento, incluye lograr un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o mejora de la infección viral subyacente (p. ej., el VIH), el cáncer o la enfermedad autoinmune.
Un sujeto puede ser tratado actualmente con un medicamento antirretroviral. Un sujeto puede ser tratado previamente con un medicamento antirretroviral. Un sujeto puede no estar aún tratado con un medicamento antirretroviral. El medicamento antirretroviral puede incluir, entre otros, inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI), inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI), inhibidores de la proteasa (PI), inhibidores de la fusión, inhibidores de la entrada, inhibidores de la integrasa, potenciadores farmacocinéticos y medicamentos combinados contra el VIH. En algunos casos, los Inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa pueden incluir, entre otros, abacavir, didanosina, emtricitabina, lamivudina, estavudina, tenofovir disoproxil fumarato y zidovudina. En algunos casos, los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa pueden incluir, entre otros, efavirenz, etravirina, nevirapina y rilpivirina. En algunos casos, los inhibidores de la proteasa pueden incluir, entre otros, atazanavir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir y tipranavir. En algunos casos, los inhibidores de la fusión pueden incluir, entre otros, la enfuvirtida. En algunos casos, los inhibidores de entrada pueden incluir, pero no limitarse a maraviroc. En algunos casos, los inhibidores de la integrasa pueden incluir, entre otros, dolutegravir, elvitegravir y raltegravir. En algunos casos, los potenciadores farmacocinéticos pueden incluir, entre otros, cobicistat. En algunos casos, los medicamentos combinados contra el VIH pueden incluir, entre otros, abacavir y lamivudina, abacavir, dolutegravir y lamivudina, abacavir, lamivudina y zidovudina, atazanavir y cobicistat, darunavir y cobicistat, efavirenz, emtricitabina y tenofovir disoproxil fumarato, elvitegravir, cobicistat, emtricitabina y tenofovir alafenamida fumarato, elvitegravir, cobicistat, emtricitabina y tenofovir disoproxil fumarato, emtricitabina, rilpivirina y tenofovir alafenamida, emtricitabina, rilpivirina y tenofovir disoproxil fumarato, emtricitabina y tenofovir alafenamida, emtricitabina y tenofovir disoproxil fumarato, lamivudina y zidovudina, lopinavir y ritonavir, y cualquier combinación de medicamentos antirretrovirales enumerados anteriormente.
Cuando se identifica que un sujeto tiene al menos una de las variantes genéticas descritas en el presente documento, se puede administrar al sujeto un agente dirigido contra el virus JC. Puede administrarse a un sujeto un medicamento que impida el desarrollo de la PML, o que reduzca, disminuya, acorte y/o mejore de otro modo la progresión de la PML, o los síntomas que se desarrollen. La composición farmacéutica puede modular o dirigirse contra el virus de JC. A un sujeto identificado con PML se le puede administrar un agente que reduzca la carga viral en el sujeto. Puede administrarse un agente inmunosupresor antes o junto con un agente que reduzca la carga viral en el sujeto. A un sujeto identificado con riesgo de desarrollar PML se le puede administrar un agente que impida el aumento de la carga viral en el sujeto. A un sujeto identificado como de alto riesgo de desarrollar PML se le puede administrar un agente que prevenga el aumento de la carga viral en el sujeto. Puede administrarse un agente inmunosupresor antes o junto con un agente que impida el aumento de la carga viral en el sujeto. El agente que reduce la carga viral en el sujeto o que previene el aumento de la carga viral en el sujeto puede ser, p. ej., un agente dirigido contra el virus de JC. Los agentes ejemplares incluyen anticuerpos, tal como los anticuerpos ampliamente neutralizantes del JCV. Por ejemplo, un agente puede ser un anticuerpo monoclonal humano ampliamente neutralizante VP-1 específico del poliomavirus de JC (véase, p. ej., Jelcic et al., Science Translational Medicine, vol. 7, número 306, pp. 306ral50 (2015) y Ray et al., Science Translational Medicine, vol. 7, número 306, pp 306ra151 (2015)). Otros agentes ejemplares son los antirretrovirales, el cidofovir, el hexadeciloxipropil-cidofovir (un derivado de éster lipídico), la citarabina (p. ej., arabinósido de citosina), los agentes que bloquean el receptor 5HT2a (p. ej., olanzapina, zisprasidona, mirtazapina, ciproheptadina y risperidona), los inhibidores de la topoisomerasa (p. ej., topotecano) y la mefloquina.
Una composición farmacéutica de la divulgación puede ser administrada a un sujeto en riesgo de desarrollar PML, o a un sujeto que reporte uno o más de los síntomas fisiológicos de PML, aun cuando no pueda haberse hecho una detección de la condición. Una composición farmacéutica de la divulgación puede ser administrada a un sujeto no identificado por tener un riesgo de desarrollar PML, o a un sujeto no identificado por tener uno o más de los síntomas fisiológicos de PML, aunque una detección de la condición no pueda haber sido hecha.
La presente divulgación también incluye kits que pueden utilizarse para tratar una afección en sujetos animales. Estos kits comprenden uno o más medicamentos inmunosupresores y, opcionalmente, instrucciones que enseñan el uso del kit de acuerdo con los diversos métodos y enfoques descritos en el presente documento. Dichos kits también pueden incluir información, tal como referencias bibliográficas científicas, prospectos, resultados de ensayos clínicos y/o resúmenes de éstos y similares, que indiquen o establezcan las actividades y/o ventajas (o riesgos y/o desventajas) del agente. Dicha información puede basarse en los resultados de diversos estudios, p. ej., estudios con animales de experimentación con modelosin vivoy estudios basados en ensayos clínicos con seres humanos. Los kits descritos en el presente documento pueden proporcionarse, comercializarse y/o promocionarse a proveedores de servicios sanitarios, incluidos médicos, enfermeros, farmacéuticos, responsables de formularios y similares.
En algunos aspectos, una célula huésped puede utilizarse para probar o administrar compuestos terapéuticos. Una célula huésped puede comprender un ácido nucleico que comprenda secuencias de control de expresión enlazadas operablemente a una región codificante. La célula huésped puede ser natural o no natural. El hospedador no natural utilizado en aspectos del método puede ser cualquier célula capaz de expresar un ácido nucleico de la divulgación, incluyendo, células bacterianas, células fúngicas, células de insectos, células de mamíferos y células vegetales. En algunos aspectos, el hospedador natural es una célula de tejido de mamífero y el hospedador no natural es una célula de tejido de mamífero diferente. Otros aspectos del método incluyen un hospedador natural que es una primera célula que reside normalmente en una primera especie de mamífero y el hospedador no natural es una segunda célula que reside normalmente en una segunda especie de mamífero. En otro aspecto alternativo, el método utiliza una primera célula y una segunda célula que proceden del mismo tipo de tejido. En aquellos aspectos del método en los que la región codificante codifica un polipéptido de mamífero, el polipéptido de mamífero puede ser una hormona. En otros aspectos, la región codificante puede codificar un neuropéptido, un anticuerpo, un antimetabolito o un polipéptido o nucleótido terapéutico.
Las secuencias de control de expresión pueden ser aquellas secuencias de nucleótidos, tanto 5' como 3' a una región codificante, que se requieren para la transcripción y traducción de la región codificante en un organismo huésped. Las secuencias reguladoras incluyen un promotor, un sitio de unión al ribosoma, elementos inducibles opcionales y elementos de secuencia necesarios para un procesamiento en 3' eficaz, incluida la poliadenilación. Cuando el gen estructural se ha aislado del ADN genómico, las secuencias reguladoras también incluyen las secuencias intrónicas necesarias para el empalme de los intrones como parte de la formación del ARNm en el huésped diana.
Formulaciones, vías de administración y dosis eficaces
En un aspecto la invención proporciona un medicamento inmunosupresor para uso en el tratamiento de una condición en un sujeto que necesita terapia con medicamentos inmunosupresores. A continuación, se ofrece una explicación general de las composiciones, formulaciones, vías de administración y dosis eficaces útiles para un medicamento inmunosupresor de este tipo, pero que no forma parte de la materia que se reivindica en el presente documento. Además, el medicamento inmunosupresor para uso de la presente invención implica determinar la ausencia de una variación genómica seleccionada de la chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. A continuación se ofrece una explicación general de las variaciones y, por lo tanto, se incluyen ejemplos que no forman parte de la materia reivindicada en el presente documento, en la medida en que se refieren a variaciones distintas de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a formulaciones, vías de administración y dosis eficaces para composiciones farmacéuticas que comprenden un agente o combinación de agentes de la presente divulgación. Dichas composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para tratar una afección (p. ej., esclerosis múltiple) como se ha descrito anteriormente.
Los compuestos de la divulgación pueden administrarse como formulaciones farmacéuticas, incluyendo, aquellas adecuadas para administración oral (incluyendo, bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica, parche transdérmico, pulmonar, vaginal, supositorio o parenteral (incluyendo, intramuscular, intraarterial, intratecal, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para administración por mediante aerosol, inhalación o insuflación. Puede encontrarse información general sobre los sistemas de administración de fármacos en Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)).
La composición farmacéutica puede incluir vehículos y excipientes (incluidos, entre otros, tampones, carbohidratos, manitol, polipéptidos, aminoácidos, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes), agua, aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, soluciones salinas, soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, agentes saborizantes, colorantes, separadores y otros aditivos, adyuvantes o aglutinantes aceptables, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, soluciones salinas, soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, agentes saborizantes, colorantes, separadores y otros aditivos, adyuvantes o aglutinantes aceptables, otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tal como agentes tamponadores del pH, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes emulsionantes, agentes humectantes y similares. Algunos ejemplos de excipientes son almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La preparación farmacéutica puede estar sustancialmente exenta de conservantes. La preparación farmacéutica puede contener al menos un conservante. La metodología general sobre formas farmacéuticas se encuentra en Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott, Williams, & Wilkins, Baltimore Md. (1999)). Puede reconocerse que, si bien puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la materia para administrar las composiciones de la presente divulgación, el tipo de vehículo puede variar en función del modo de administración.
Los compuestos también pueden encapsularse dentro de liposomas utilizando una tecnología bien conocida. Las microesferas biodegradables también pueden emplearse como vehículos de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación. Las microesferas biodegradables adecuadas se divulgan, p. ej., en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,897,268, 5,075,109, 5,928,647, 5,811,128, 5,820,883, 5,853,763, 5,814,344 y 5,942,252.
El compuesto puede administrarse en liposomas o microesferas (o micropartículas). Los métodos de preparación de liposomas y microesferas para su administración a un sujeto son bien conocidos por los expertos en la materia. La patente de los Estados Unidos No. 4,789,734, describe métodos para encapsular materiales biológicos en liposomas. Esencialmente, el material se disuelve en una solución acuosa, se añaden los fosfolípidos y lípidos adecuados, junto con tensioactivos si es necesario, y el material se dializa o se somete a ultrasonido, según sea necesario. Una revisión de métodos conocidos es proporcionada por G. Gregoriadis, Capítulo 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 2.sup. 87-341 (Academic Press, 1979).
Las microesferas formadas por polímeros o polipéptidos son bien conocidas por los expertos en la materia, y pueden adaptarse para su paso a través del tracto gastrointestinal directamente al torrente sanguíneo. Alternativamente, el compuesto puede incorporarse y las microesferas, o el compuesto de microesferas, implantarse para una liberación lenta durante un periodo de tiempo que puede variar de días a meses. Véase, p. ej., las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,906,474, 4,925,673 y 3,625,214 y Jein, TIPS 19:155-157 (1998).
La concentración del fármaco puede ajustarse, el pH de la solución puede tamponarse y la isotonicidad puede ajustarse para que sea compatible con la inyección intravenosa, tal como es bien sabido en la técnica.
Los compuestos de la divulgación pueden formularse como una solución o suspensión estéril, en vehículos adecuados, bien conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden filtrarse de forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de su administración. Las formulaciones adecuadas y los vehículos adicionales se describen en Remington "The Science and Practice of Pharmacy" (20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD).
Los agentes o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden proporcionarse solos o en combinación con uno o más agentes o con una o más formas. Por ejemplo, una formulación puede comprender uno o más agentes en proporciones particulares, dependiendo de las potencias relativas de cada agente y de la indicación prevista. Por ejemplo, en composiciones dirigidas a dos dianas hospedadoras diferentes, y en las que las potencias son similares, puede utilizarse aproximadamente una proporción 1:1 de agentes. Las dos formas pueden formularse juntas, en la misma unidad de dosificación, p. ej., en una crema, supositorio, comprimido, cápsula, aerosol o paquete de polvo para disolver en una bebida; o cada forma puede formularse en una unidad separada, p. ej., dos cremas, dos supositorios, dos comprimidos, dos cápsulas, un comprimido y un líquido para disolver el comprimido, dos aerosoles, o un paquete de polvo y un líquido para disolver el polvo, etc.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa aquellas sales que retienen la eficacia biológica y las propiedades de los agentes utilizados en la presente divulgación, y que no son biológicamente o de otro modo indeseables.
Las sales típicas son las de los iones inorgánicos, tales como, p. ej., iones de sodio, potasio, calcio, magnesio y similares. Tales sales incluyen sales con ácidos inorgánicos u orgánicos, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido p toluenosulfónico, ácido acético, ácido fumárico, ácido succínico, ácido láctico, ácido mandélico, ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico o ácido maleico. Además, si el agente o agentes contienen un grupo carboxilo u otro grupo ácido, puede convertirse en una sal de adición farmacéuticamente aceptable con bases inorgánicas u orgánicas. Ejemplos de bases adecuadas incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco, ciclohexilamina, diciclohexilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina y similares.
Un éster o amida farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellos que retienen la eficacia biológica y las propiedades de los agentes utilizados en la presente divulgación, y que no son biológicamente o de otro modo indeseables. Los ésteres típicos incluyen etilo, metilo, isobutilo, etilenglicol y similares. Las amidas típicas incluyen amidas no sustituidas, alquilamidas, dialquilamidas y similares.
Un agente puede administrarse en combinación con uno o más compuestos, formas y/o agentes, p. ej., tal como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas con otro u otros agentes activos pueden formularse para comprender determinadas proporciones molares. Por ejemplo, pueden utilizarse proporciones molares de aproximadamente 99:1 a aproximadamente 1:99 de un primer agente activo con respecto al otro agente activo. El intervalo de proporciones molares de un primer agente activo: otros agentes activos puede seleccionarse entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 20:80; aproximadamente 75:25 y a aproximadamente 25:75, a aproximadamente 70:30 y aproximadamente 30:70, a aproximadamente 66:33 y aproximadamente 33:66, aproximadamente 60:40 y aproximadamente 40:60; aproximadamente 50:50 y aproximadamente 90: 10 a aproximadamente 10:90. La proporción molar de un primer activo: otros agentes activos puede ser de aproximadamente 1:9, o puede ser de aproximadamente 1:1. Los dos agentes, formas y/o compuestos pueden formularse juntos, en la misma unidad de dosificación, p. ej., en una crema, supositorio, comprimido, cápsula o paquete de polvo para disolver en una bebida; o cada agente, forma y/o compuesto puede formularse en unidades separadas, p. ej., dos cremas, supositorios, comprimidos, dos cápsulas, un comprimido y un líquido para disolver el comprimido, un aerosol, un paquete de polvo y un líquido para disolver el polvo, etc.
Si es necesario o deseable, los agentes y/o combinaciones de agentes pueden administrarse con aún otros agentes. La elección de los agentes que pueden coadministrarse con los agentes y/o combinaciones de los agentes de la presente divulgación puede depender, al menos en parte, de la afección que se esté tratando. Los agentes de uso particular en las formulaciones de la presente divulgación incluyen, p. ej., cualquier agente que tenga un efecto terapéutico para una infección viral, incluyendo, p. ej., fármacos utilizados para tratar afecciones inflamatorias. Por ejemplo, en tratamientos para la gripe, las formulaciones de la presente divulgación pueden contener adicionalmente uno o más fármacos antiinflamatorios convencionales, tal como un NSAID, p. ej., ibuprofeno, naproxeno, acetaminofén, ketoprofeno o aspirina. Alternativamente, para el tratamiento de la gripe, las formulaciones de la presente divulgación pueden contener adicionalmente uno o más agentes antivirales de la gripe convencionales, tal como amantadina, rimantadina, zanamivir y oseltamivir. En los tratamientos de infecciones retrovirales, tal como el VIH, las formulaciones de la presente divulgación pueden contener además uno o más fármacos antivirales convencionales, tal como los inhibidores de la proteasa (lopinavir/ritonavir {p. ej., KALETRA}, indinavir {p. ej., CRIXIVAN}, ritonavir {p. ej., NORVIR}, nelfinavir {p. ej., VIRACEPT}, saquinavir en cápsulas de gelatina dura {p. ej., INVIRASE}, atazanavir {p. ej., REYATAZ}, amprenavir {p. ej., AGENERASE}, fosamprenavir {p. ej., TELZIR}, tipranavir {p. ej., AITPVUS}), inhibidores de la transcriptasa inversa, incluidos los inhibidores no nucleósidos y nucleósidos/nucleótidos (AZT {zidovudina, p. ej., Retrovir}, ddI {didanosina, p. ej., VIDEX}, 3TC {lamivudina, p. ej., EPIVIR}, d4T {stavudina, p. ej., ZERIT}, abacavir {p. ej., ZIAGEN}, FTC {emtricitabina, p. ej., EMTRIVA}, tenofovir {p. ej., VIREAD}, efavirenz {p.ej., SUSTIVA} y nevirapina {p. ej., VIRAMUNE}), inhibidores de la fusión T20 {enfuvirtida, p. ej., FUZEON}, inhibidores de la integrasa (Raltegravir, p. ej., ISENTRESS, MK-0518; y elvitegravir, p. ej., VITE<k>T<a>, GS-9137), e inhibidores de la maduración (bevirimat {PA-457}). Como otro ejemplo, las formulaciones pueden contener adicionalmente uno o más suplementos, tal como vitamina C, E u otros antioxidantes.
El(los) agente(s) (o sales, ésteres o amidas farmacéuticamente aceptables de los mismos) puede(n) administrarse per se o en forma de una composición farmacéutica en la que el(los) agente(s) activo(s) se encuentra(n) en una mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Una composición farmacéutica, tal como se utiliza en el presente documento, puede ser cualquier composición preparada para su administración a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente divulgación pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables, que comprenden excipientes, diluyentes y/o auxiliares, p. ej., que facilitan la transformación de los agentes activos en preparaciones que pueden administrarse. Una formulación adecuada puede depender, al menos en parte, de la vía de administración elegida. El (los) agente(s) útil(es) en la presente divulgación, o las sales, ésteres o amidas farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden administrarse a un sujeto utilizando diversas vías o modos de administración, incluyendo, aplicaciones orales, bucales, tópicas, rectales, transdérmicas, transmucosas, subcutáneas, intravenosas e intramusculares, así como por inhalación.
Para administración oral, los agentes pueden formularse fácilmente combinando el(los) agente(s) activo(s) con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los agentes de la divulgación se formulen como comprimidos, incluidos comprimidos masticables, píldoras, grageas, cápsulas, pastillas, caramelos duros, líquidos, geles, jarabes, lechadas, polvos, suspensiones, elixires, obleas y similares, para su ingestión oral por un sujeto a tratar. Tales formulaciones pueden comprender vehículos farmacéuticamente aceptables, incluidos diluyentes sólidos o rellenos, medios acuosos estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes saborizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes desintegradores de comprimidos o un material encapsulante. En los polvos, el vehículo suele ser un sólido finamente dividido que se mezcla con el componente activo finamente dividido. En los comprimidos, el componente activo se mezcla generalmente con el vehículo que tiene la capacidad aglutinante necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferentemente entre aproximadamente uno (1) y aproximadamente setenta (70) por ciento del compuesto activo. Los vehículos adecuados incluyen, entre otros, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, cera de baja fusión, manteca de cacao y similares. Generalmente, los agentes de la divulgación pueden incluirse en niveles de concentración que van desde aproximadamente 0.5 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 % o aproximadamente 30 % hasta aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 % o aproximadamente 90 % en peso de la composición total de las formas de dosificación oral, en una cantidad suficiente para proporcionar una unidad de dosificación deseada.
Las suspensiones acuosas para uso oral pueden contener agente(s) de esta divulgación con excipientes farmacéuticamente aceptables, tal como un agente de suspensión (p. ej., metilcelulosa), un agente humectante (p. ej., lecitina, lisolecitina y/o un alcohol graso de cadena larga), así como agentes colorantes, conservantes, agentes saborizantes y similares.
Pueden utilizarse aceites o disolventes no acuosos para disolver los agentes, debido, p. ej., a la presencia de grandes moléculas lipofílicas. Como alternativa, pueden utilizarse emulsiones, suspensiones u otros preparados, p. ej., preparados liposomales. Con respecto a las preparaciones liposomales, puede utilizarse cualquier método conocido para preparar liposomas para el tratamiento de una afección. Véase, p. ej., Bangham et al., J. Mol. Biol. 23: 238-252 (1965) y Szoka et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 4194-4198 (1978). También se pueden unir ligandos a los liposomas para dirigir estas composiciones a determinados lugares de acción. Los agentes de esta divulgación también pueden integrarse en productos alimenticios, p. ej., queso crema, mantequilla, aderezo para ensaladas o helado para facilitar la solubilización, administración y/o cumplimiento en ciertas poblaciones de sujetos.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse como excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos como azúcares, incluyendo, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; elementos saborizantes, preparados de celulosa como, p. ej., almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tal como la polivinilpirrolidona reticulada, el agar o el ácido algínico o una sal del mismo, tal como el alginato sódico. Los agentes también pueden formularse como preparados de liberación sostenida.
Los núcleos de grageas pueden estar provistos de revestimientos adecuados. Para ello, pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de agentes activos.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas de gelatina con cierre a presión, así como cápsulas blandas y selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas encajables pueden contener los principios activos mezclados con rellenos como lactosa, aglutinantes como almidón y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes.
En las cápsulas blandas, los agentes activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tal como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para su administración.
Otras formas adecuadas para la administración oral incluyen preparaciones en forma líquida incluyendo, emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas, suspensiones acuosas, o preparaciones en forma sólida que están destinadas a ser convertidas poco antes de su uso en preparaciones en forma líquida. Las emulsiones pueden prepararse en soluciones, p. ej., en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, p. ej., tal como lecitina, monooleato de sorbitán o acacia. Las soluciones acuosas pueden prepararse disolviendo el componente activo en agua y añadiendo colorantes, saborizantes, estabilizantes y espesantes adecuados. Las suspensiones acuosas pueden prepararse dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y otros agentes de suspensión bien conocidos. Los rellenos o vehículos adecuados con los que pueden administrarse las composiciones incluyen agar, alcohol, grasas, lactosa, almidón, derivados de la celulosa, polisacáridos, polivinilpirrolidona, sílice, solución salina estéril y similares, o mezclas de los mismos utilizadas en cantidades adecuadas. Los preparados en forma sólida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, y pueden contener, además del componente activo, colorantes, saborizantes, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.
Se puede elaborar un jarabe o suspensión añadiendo el compuesto activo a una solución acuosa concentrada de un azúcar, p. ej., sacarosa, a la que también se puede añadir cualquier ingrediente accesorio. Tales ingredientes accesorios pueden incluir saborizantes, un agente para retardar la cristalización del azúcar o un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, p. ej., tal como un alcohol polihídrico, p. ej., glicerol o sorbitol.
Cuando se formulan compuestos de la divulgación para administración oral, puede ser deseable utilizar formulaciones retenedoras en el sistema gástrico para mejorar la absorción desde el tracto gastrointestinal (GI). Una formulación que se retiene en el estómago durante varias horas puede liberar los compuestos de la divulgación lentamente y proporcionar una liberación sostenida que puede ser preferible en algunos casos. La divulgación de tales formulaciones retenedoras en el sistema gástrico se encuentra en Klausner E.A., et al., Pharm. Res. 20, 1466-73 (2003); Hoffman, A. et al., Int. J. Pharm. 11, 141-53 (2004), Streubel, A., et al. Expert Opin. Drug Deliver. 3, 217-3 y Chavanpatil, M.D. et al., Int. J. Pharm. (2006). Pueden utilizarse técnicas expandibles, flotantes y bioadhesivas para maximizar la absorción de los compuestos de la divulgación.
Los compuestos de la divulgación pueden formularse para administración parenteral (p. ej., mediante inyección, p. ej., inyección en bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en envases multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, p. ej., soluciones en polietilenglicol acuoso.
Para formulaciones inyectables, el vehículo puede elegirse entre los conocidos en el arte por ser adecuados, incluyendo, soluciones acuosas o suspensiones oleosas, o emulsiones, con aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, o aceite de cacahuete, así como elixires, manitol, dextrosa, o una solución acuosa estéril, y vehículos farmacéuticos similares. La formulación también puede incluir composiciones poliméricas biocompatibles y biodegradables, tal como el ácido poli(láctico-co-glicólico). Estos materiales pueden fabricarse en microesferas o nanoesferas, cargarse con el fármaco y recubrirse o derivatizarse para proporcionar un rendimiento superior de liberación sostenida. Los vehículos adecuados para la inyección periocular o intraocular incluyen, p. ej., suspensiones del agente terapéutico en agua para inyección, liposomas y vehículos adecuados para sustancias lipofílicas. Otros vehículos para la inyección periocular o intraocular son bien conocidos en la técnica.
La composición puede formularse de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como la lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Por lo general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados entre sí en forma de dosificación unitaria, p. ej., tal como polvo seco liofilizado o concentrado sin agua en un envase herméticamente cerrado, tal como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición vaya a administrarse por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
Cuando la administración es por inyección, el compuesto activo puede formularse en soluciones acuosas, específicamente en tampones fisiológicamente compatibles como la solución de Hank, la solución de Ringer o el tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes formuladores tal como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el compuesto activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. La composición farmacéutica puede no comprender un adyuvante o cualquier otra sustancia añadida para potenciar la respuesta inmunitaria estimulada por el péptido. La composición farmacéutica puede comprender una sustancia que inhiba una respuesta inmunitaria al péptido. Los métodos de formulación son conocidos en la técnica, p. ej., los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Co., Easton P
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los agentes también pueden formularse como una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación o administración transcutánea (p. ej., subcutánea o intramuscular), inyección intramuscular o uso de un parche transdérmico. De este modo, p. ej., los agentes pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (p. ej., tal como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, p. ej., tal como una sal poco soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes de la presente divulgación pueden ejercer efectos locales y regionales cuando se administran tópicamente o se inyectan en o cerca de sitios particulares de infección. La aplicación tópica directa, p. ej., de un líquido viscoso, solución, suspensión, soluciones a base de dimetilsulfóxido (DMSO), formulaciones liposomales, gel, jalea, crema, loción, pomada, supositorio, espuma o aerosol, puede utilizarse para la administración local, para producir, p. ej., efectos locales y/o regionales. Los vehículos farmacéuticamente apropiados para dicha formulación incluyen, p. ej., alcoholes alifáticos inferiores, poliglicoles (p. ej., glicerol o polietilenglicol), ésteres de ácidos grasos, aceites, grasas, siliconas y similares. Dichos preparados también pueden incluir conservantes (p. ej., ésteres del ácido phidroxibenzoico) y/o antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico y tocoferol). Véase también Dermatological Formulations: Percutaneous absortion, Barry (Ed.), Marcel Dekker Inc., 1983.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden contener un vehículo cosmético o dermatológicamente aceptable. Dichos vehículos son compatibles con la piel, las uñas, las membranas mucosas, los tejidos y/o el cabello, y pueden incluir cualquier vehículo cosmético o dermatológico de uso convencional que cumpla estos requisitos. Tales vehículos pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. En la formulación de ungüentos para la piel, un agente o combinación de agentes de la presente divulgación puede formularse en una base de hidrocarburo oleaginoso, una base de absorción anhidra, una base de absorción de agua en aceite, una base de aceite en agua removible en agua y/o una base soluble en agua. Ejemplos de tales vehículos y excipientes incluyen, pero no se limitan a, humectantes (p. ej., urea), glicoles (p. ej., propilenglicol), alcoholes (p. ej., etanol), ácidos grasos (p. ej., ácido oleico), tensioactivos (p. ej., miristato de isopropilo y lauril sulfato de sodio), pirrolidonas, monolaurato de glicerol, sulfóxidos, terpenos (p. ej., mentol), aminas, amidas, alcanos, alcanoles, agua, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de la celulosa, gelatina y polímeros como los polietilenglicoles.
Las pomadas y cremas pueden, p. ej., formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y, en general, también pueden contener uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. La construcción y el uso de parches transdérmicos para la administración de agentes farmacéuticos son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,023,252, 4,992,445 y 5,001,139. Dichos parches pueden fabricarse para la administración continua, pulsátil o por demanda de agentes farmacéuticos.
Los lubricantes que pueden usarse para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol, otros glicoles, ácido esteárico, lauril sulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (p. ej., aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja), estearato de zinc, oleato de etilo, laurato de etilo, agar o mezclas de los mismos. Entre los lubricantes adicionales se incluyen, p. ej., un gel de sílice siloide, un aerosol coagulado de sílice sintética o mezclas de los mismos. Opcionalmente, puede añadirse un lubricante, en una cantidad inferior a aproximadamente el 1 por ciento en peso de la composición farmacéutica.
Las composiciones de acuerdo con la presente divulgación pueden presentarse en cualquier forma adecuada para la aplicación tópica, incluyendo, soluciones acuosas, acuosas-alcohólicas u oleosas, dispersiones en loción o suero, geles acuosos, anhidros u oleosos, emulsiones obtenidas por dispersión de una fase grasa en una fase acuosa (O/W o aceite en agua) o, a la inversa, (W/O o agua en aceite), microemulsiones o alternativamente microcápsulas, micropartículas o dispersiones de vesículas lipídicas de tipo iónico y/o no iónico. Estas composiciones pueden prepararse de acuerdo con métodos convencionales. Aparte de los agentes de la divulgación, las cantidades de los diversos constituyentes de las composiciones de acuerdo con la divulgación son las utilizadas convencionalmente en la técnica. Estas composiciones constituyen, en particular, cremas, leches, lociones, geles o espumas de protección, tratamiento o cuidado para la cara, las manos, el cuerpo y/o las mucosas, o para la limpieza de la piel. Las composiciones también pueden consistir en preparados sólidos que constituyen jabones o barras limpiadoras.
Las composiciones de la presente divulgación también pueden contener adyuvantes comunes en los campos cosmético y dermatológico, tales como agentes gelificantes hidrofílicos o lipofílicos, agentes activos hidrofílicos o lipofílicos, agentes conservantes, antioxidantes, disolventes, fragancias, rellenos, filtros solares, absorbentes de olores y colorantes. Las cantidades de estos diversos adyuvantes son las utilizadas convencionalmente en los campos considerados y, p. ej., oscilan entre aproximadamente el 0.01 % y aproximadamente el 20 % del peso total de la composición. Según su naturaleza, estos adyuvantes pueden introducirse en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las vesículas lipídicas.
Las infecciones virales oculares pueden tratarse eficazmente con soluciones oftálmicas, suspensiones, ungüentos o insertos que comprenden un agente o combinación de agentes de la presente divulgación. Los colirios pueden prepararse disolviendo el principio activo en una solución acuosa estéril, tal como solución salina fisiológica, solución amortiguadora, etc., o combinando composiciones en polvo que se disolverán antes de su uso. Pueden elegirse otros vehículos, tal como es conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a: solución salina de equilibrio, solución salina, poliéteres solubles en agua como el polietilenglicol, polivinilos, tal como el alcohol polivinílico y la povidona, derivados de la celulosa como la metilcelulosa y la hidroxipropilmetilcelulosa, derivados del petróleo, tal como el aceite mineral y la vaselina blanca, grasas animales, tal como la lanolina, polímeros de ácido acrílico, tal como el gel de carboxipolimetileno, grasas vegetales, tal como el aceite de cacahuete, y polisacáridos, tal como los dextranos, y glicosaminoglicanos, tal como el hialuronato sódico. Si se desea, pueden añadirse aditivos utilizados habitualmente en los colirios. Dichos aditivos incluyen agentes isotonizantes (p. ej., cloruro de sodio, etc.), agente tampón (p. ej., ácido bórico, monohidrógeno fosfato de sodio, dihidrógeno fosfato de sodio, etc.), conservantes (p. ej., cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, etc.), espesantes (p. ej., sacárido como lactosa, manitol, maltosa, etc.; p. ej., ácido hialurónico o su sal tal como hialuronato sódico, hialuronato potásico, etc.; p. ej., mucopolisacárido tal como el sulfato de condroitina, etc.; p. ej., poliacrilato sódico, polímero de carboxivinilo, poliacrilato reticulado, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa u otros agentes conocidos por los expertos en la materia).
La solubilidad de los componentes de las presentes composiciones puede mejorarse mediante un tensioactivo u otro cosolvente apropiado en la composición. Tales cosolventes incluyen polisorbato 20, 60 y 80, Pluronic F68, F-84 y P-103, ciclodextrina u otros agentes conocidos por los expertos en la materia. Tales cosolventes pueden emplearse a un nivel de aproximadamente 0.01 % a 2 % en peso.
Las composiciones de la divulgación pueden envasarse en forma multidosis. Pueden preferirse conservantes para evitar la contaminación microbiana durante el uso. Entre los conservantes adecuados se incluyen: cloruro de benzalconio, timerosal, clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico, Onamer M u otros agentes conocidos por los expertos en la materia. En los productos oftálmicos de la técnica anterior, dichos conservantes pueden emplearse a un nivel del 0.004 % al 0.02 %. En las composiciones de la presente solicitud, el conservante, preferentemente cloruro de benzalconio, puede emplearse a un nivel del 0.001 % a menos del 0.01 %, p. ej., del 0.001 % al 0.008 %, preferentemente aproximadamente del 0.005 % en peso. Se ha descubierto que una concentración de cloruro de benzalconio del 0.005 % puede ser suficiente para preservar las composiciones de la presente divulgación del ataque microbiano.
Los agentes de la presente divulgación pueden administrarse en forma soluble en lugar de suspensión, lo que permite una absorción más rápida y cuantitativa a los sitios de acción. En general, las formulaciones como jaleas, cremas, lociones, supositorios y ungüentos pueden proporcionar un área con una exposición más prolongada a los agentes de la presente divulgación, mientras que las formulaciones en solución, p. ej., aerosoles, proporcionan una exposición más inmediata y a corto plazo.
Cuando se relacionan con la aplicación tópica/local, las composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más potenciadores de la penetración. Por ejemplo, las formulaciones pueden comprender vehículos o excipientes adecuados en fase sólida o gel que aumenten la penetración o ayuden al suministro de agentes o combinaciones de agentes de la divulgación a través de una barrera de permeabilidad, p. ej., la piel. Muchos de estos compuestos potenciadores de la penetración son conocidos en la técnica de la formulación tópica, e incluyen, p. ej., agua, alcoholes (p. ej., terpenos como metanol, etanol, 2-propanol), sulfóxidos (p. ej., dimetilsulfóxido, decilmetilsulfóxido, tetradecilmetilsulfóxido), pirrolidonas (p. ej., 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, N-(2-hidroxietil)pirrolidona), laurocapram, acetona, dimetilacetamida, dimetilformamida, alcohol tetrahidrofurfurílico, L-a-aminoácidos, tensioactivos aniónicos, catiónicos, anfóteros o no iónicos (p. ej., miristato de isopropilo y lauril sulfato de sodio), ácidos grasos, alcoholes grasos (p. ej., ácido oleico), aminas, amidas, amidas de ácido clofíbrico, lauramida de hexametileno, enzimas proteolíticas, a-bisabolol, d-limoneno, urea y N,N-dietil-m-toluamida, y similares. Otros ejemplos incluyen humectantes (p. ej., urea), glicoles (p. ej., propilenglicol y polietilenglicol), monolaurato de glicerol, alcanos, alcanoles, ORGELASA, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de la celulosa, gelatina y/u otros polímeros. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más de estos potenciadores de la penetración.
Las composiciones farmacéuticas para aplicación local/tópica pueden incluir uno o más conservantes antimicrobianos como compuestos de amonio cuaternario, mercuriales orgánicos, p-hidroxi benzoatos, alcoholes aromáticos, clorobutanol y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser soluciones, suspensiones, ungüentos, enemas y/o supositorios administrados por vía oral o rectal que comprenden un agente o combinación de agentes de la presente divulgación.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser soluciones en aerosol, suspensiones o polvos secos que comprenden un agente o combinación de agentes de la presente divulgación. El aerosol puede administrarse a través del sistema respiratorio o los pasajes nasales. Por ejemplo, un experto en la materia puede reconocer que una composición de la presente divulgación puede suspenderse o disolverse en un vehículo apropiado, p. ej., un propelente farmacéuticamente aceptable, y administrarse directamente en los pulmones mediante un aerosol nasal o inhalante. Por ejemplo, una formulación en aerosol que comprende un agente puede disolverse, suspenderse o emulsionarse en un propelente o una mezcla de disolvente y propelente, p. ej., para su administración como aerosol nasal o inhalante. Las formulaciones en aerosol pueden contener cualquier propelente aceptable bajo presión, tal como un propelente cosmético o dermatológico o farmacéuticamente aceptable, tal como se utiliza convencionalmente en la técnica.
Una formulación en aerosol para administración nasal es generalmente una solución acuosa diseñada para ser administrada a los conductos nasales en gotas o aerosoles. Las soluciones nasales pueden ser similares a las secreciones nasales en el sentido de que generalmente son isotónicas y están ligeramente tamponadas para mantener un pH de entre 5.5 y aproximadamente 6.5, aunque también pueden utilizarse valores de pH fuera de este intervalo. También pueden incluirse en la formulación agentes antimicrobianos o conservantes.
Una formulación en aerosol para inhalaciones e inhalantes puede diseñarse de modo que el agente o la combinación de agentes de la presente divulgación sea transportado al árbol respiratorio del sujeto cuando se administra por vía respiratoria nasal u oral. Las soluciones para inhalación pueden administrarse, p. ej., mediante un nebulizador. Las inhalaciones o insuflaciones, que comprenden fármacos finamente pulverizados o líquidos, pueden administrarse al sistema respiratorio como un aerosol farmacéutico de una solución o suspensión del agente o combinación de agentes en un propelente, p. ej., para ayudar a su disposición. Los propelentes pueden ser gases licuados, incluidos los compuestos halocarbonados, p. ej., los fluorocarbonados, tal como los hidrocarburos clorados fluorados, los hidroclorofluorocarbonados y los hidroclorocarbonados, así como los hidrocarburos y los éteres de hidrocarburos.
Los propelentes halocarbonados útiles en la presente divulgación incluyen propelentes fluorocarbonados en los que todos los hidrógenos se sustituyen por flúor, propelentes clorofluorocarbonados en los que todos los hidrógenos se sustituyen por cloro y al menos un flúor, propelentes fluorocarbonados que contienen hidrógeno y propelentes clorofluorocarbonados que contienen hidrógeno. Los propelentes de halocarbonados se describen en Johnson, patentes de los Estados Unidos No. 5,376,359; Byron et al., patente de los Estados Unidos No. 5,190,029 y Purewal et al., patente de los Estados Unidos No. 5,776,434. Los propelentes de hidrocarburos útiles en la divulgación incluyen, p. ej., propano, isobutano, n-butano, pentano, isopentano y neopentano. También puede utilizarse una mezcla de hidrocarburos como propelente. Los propelentes de éter incluyen, p. ej., el dimetil éter, así como los éteres. Una formulación en aerosol de la divulgación también puede comprender más de un propelente. Por ejemplo, la formulación del aerosol puede comprender más de un propelente de la misma clase, tal como dos o más fluorocarbonados; o más de uno, más de dos, más de tres propelentes de clases diferentes, tal como un fluorohidrocarbonados y un compuesto hidrocarbonado. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden dispensarse con un gas comprimido, p. ej., un gas inerte como el dióxido de carbono, el óxido nitroso o el nitrógeno.
Las formulaciones en aerosol también pueden incluir otros componentes, p. ej., etanol, isopropanol, propilenglicol, así como tensioactivos u otros componentes como aceites y detergentes. Estos componentes pueden servir para estabilizar la formulación y/o lubricar los componentes de la válvula.
La formulación en aerosol puede envasarse a presión y puede formularse como aerosol utilizando soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos y preparaciones semisólidas. Por ejemplo, una formulación de aerosol en solución puede comprender una solución de un agente de la divulgación en propelente (sustancialmente) puro o como mezcla de propelente y disolvente. El disolvente puede utilizarse para disolver el agente y/o retardar la evaporación del propelente. Los disolventes útiles en la divulgación incluyen, p. ej., agua, etanol y glicoles. Puede utilizarse cualquier combinación de disolventes adecuados, opcionalmente combinados con conservantes, antioxidantes y/u otros componentes del aerosol.
Una formulación en aerosol también puede ser una dispersión o suspensión. Una formulación de aerosol en suspensión puede comprender una suspensión de un agente o combinación de agentes de la presente divulgación. Los agentes dispersantes útiles en la divulgación incluyen, p. ej., trioleato de sorbitán, alcohol oleílico, ácido oleico, lecitina y aceite de maíz. Una formulación de aerosol en suspensión también puede incluir lubricantes, conservantes, antioxidantes y/u otros componentes del aerosol.
Una formulación en aerosol puede formularse de forma similar como una emulsión. Una formulación de emulsión en aerosol puede incluir, p. ej., un alcohol como el etanol, un tensioactivo, agua y un propelente, así como un agente o combinación de agentes de la divulgación. El tensioactivo utilizado puede ser no iónico, aniónico o catiónico. Un ejemplo de formulación de aerosol en emulsión comprende, p. ej., etanol, tensioactivo, agua y propelente. Otro ejemplo de formulación de aerosol en emulsión comprende, p. ej., aceite vegetal, monoestearato de glicerilo y propano.
Los compuestos de la divulgación pueden formularse para su administración como supositorios. Primero se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de triglicéridos, glicéridos de ácidos grasos, Witepsol S55 (marca comercial de Dynamite Nobel Chemical, Alemania) o manteca de cacao, y el componente activo se dispersa homogéneamente, p. ej., mediante agitación. A continuación, la mezcla homogénea fundida se vierte en moldes de tamaño adecuado, se deja enfriar y se solidifica.
Los compuestos de la divulgación pueden formularse para administración vaginal. Pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o aerosoles que contengan, además del ingrediente activo, vehículos conocidos en la técnica.
Se prevé adicionalmente, que los compuestos de la divulgación se puedan unir de forma liberable a polímeros biocompatibles para su uso en formulaciones de liberación sostenida sobre, en o unidas a insertos para administración tópica, intraocular, periocular o sistémica. La liberación controlada de un polímero biocompatible puede utilizarse también con un polímero soluble en agua para formar una formulación instilable. La liberación controlada a partir de un polímero biocompatible, tal como p. ej., microesferas o nanoesferas de PLGA, puede utilizarse en una formulación adecuada para la implantación o inyección intraocular para la administración de liberación sostenida, así como cualquier polímero biodegradable y biocompatible adecuado.
En un aspecto de la divulgación, el estado de vehículo del sujeto de cualquiera de las variantes genéticas de riesgo de variación descritas en el presente documento, o las variantes genéticas identificadas mediante otros métodos de análisis dentro de los genes o loci reguladores que son identificados por las CNV o SNV descritas en el presente documento, pueden utilizarse para ayudar a determinar si debe administrarse una modalidad de tratamiento particular, tal como cualquiera de las anteriores, o una combinación de las mismas. La administración de una opción de tratamiento, tal como cualquiera de las opciones de tratamiento mencionadas anteriormente, puede determinarse en función de la presencia o ausencia de una variante de riesgo de variación genética particular en el individuo, o mediante la monitorización de la expresión de genes que están asociados con las variantes de la presente divulgación. Los niveles de expresión y/o los niveles de ARNm pueden así determinarse antes y durante el tratamiento para controlar su eficacia. Alternativamente, o de forma concomitante, el estado con respecto a una variación genética, y o el genotipo y/o el estado del haplotipo de al menos una variante de riesgo para la PML presentada en el presente documento puede determinarse antes y durante el tratamiento para monitorizar su eficacia. Los expertos en la materia también pueden apreciar que los niveles de expresión aberrante de un gen afectado por una CNV u otras mutaciones encontradas como consecuencia de la secuenciación dirigida del gen identificado por la CNV pueden ensayarse o probarse diagnósticamente midiendo el nivel de expresión polipeptídica de dicho gen expresado aberrantemente. Los niveles de expresión aberrantes de un gen pueden ser el resultado de una CNV que afecte a una secuencia de ADN (p. ej., un sitio de unión a un factor de transcripción) que regule un gen cuyo nivel de expresión aberrante esté implicado en la PML o la provoque, o de otras mutaciones encontradas como consecuencia de la secuenciación dirigida de la secuencia reguladora del gen identificada por la CNV, que pueden analizarse o someterse a pruebas diagnósticas midiendo el nivel de expresión polipeptídica del gen implicado en la PML o la provoque. Una mutación específica de la CNV dentro de un gen, u otras mutaciones específicas encontradas en la secuenciación dirigida de un gen identificado por las CNV que se ha descubierto que está implicado o es causante de PML, puede causar un cambio estructural aberrante en el polipéptido expresado que resulta de dichas mutaciones genéticas, y la(s) estructura(s) polipeptídica(s) alterada(s) puede(n) analizarse mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la materia.
Alternativamente, las redes biológicas o vías metabólicas relacionadas con los genes dentro de, o asociadas con, las variaciones genéticas descritas en el presente documento pueden ser monitorizadas determinando los niveles de ARNm y/o polipéptidos. Esto puede hacerse, p. ej., controlando los niveles de expresión de los polipéptidos de varios genes pertenecientes a la red y/o vía en muestras de ácido nucleico tomadas antes y durante el tratamiento. Alternativamente, los metabolitos pertenecientes a la red biológica o a la vía metabólica pueden determinarse antes y durante el tratamiento. La eficacia del tratamiento se determina comparando los cambios observados en los niveles de expresión/niveles de metabolitos durante el tratamiento con los datos correspondientes de sujetos sanos.
Las variaciones genéticas descritas en el presente documento y/o las encontradas posteriormente (p. ej., mediante otros métodos de análisis genético como la secuenciación) a través del análisis dirigido de aquellos genes identificados inicialmente por las variaciones genéticas descritas en el presente documento, pueden utilizarse para prevenir los efectos adversos asociados a un agente terapéutico, tal como durante los ensayos clínicos. Por ejemplo, los individuos que son portadores de al menos una variación genética de riesgo pueden tener más probabilidades de responder negativamente a un agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor. Por ejemplo, los portadores de determinadas variantes genéticas pueden ser más propensos a mostrar una respuesta adversa al agente terapéutico. Una o más de las variaciones genéticas empleadas durante los ensayos clínicos para un agente terapéutico dado pueden utilizarse en una prueba diagnóstica complementaria que se administra al paciente antes de la administración del agente terapéutico para determinar si es probable que el paciente tenga una respuesta favorable o adversa al agente terapéutico.
Las variaciones genéticas descritas en el presente documento pueden utilizarse para determinar si a un sujeto se le administra un agente farmacéutico, tal como un fármaco inmunosupresor. Ciertas combinaciones de variantes, incluyendo, las descritas en el presente documento, pero también combinaciones con otras variantes de riesgo de PML, pueden ser adecuadas para una selección de opciones de tratamiento, mientras que otras combinaciones de variantes pueden ser adecuadas para la selección de otras opciones de tratamiento. Dichas combinaciones de variantes pueden incluir una variante, dos variantes, tres variantes o cuatro o más variantes, según sea necesario para determinar con precisión clínicamente fiable la selección del módulo de tratamiento. La información de las pruebas para las variaciones genéticas descritas en el presente documento, u otras variaciones genéticas raras en o cerca de los genes descritos en el presente documento, puede combinarse con la información de otros tipos de pruebas (p. ej., una prueba de anticuerpos contra el j Cv , una prueba de CD62L o una prueba de bandas oligoclonales de IgM del CSF) para la selección de opciones de tratamiento.
Kits
La presente invención se refiere a un medicamento inmunosupresor para su uso o a métodos tal como se definen en las reivindicaciones, para los cuales lo que sigue proporciona una divulgación útil relativa a los kits (en el sentido de que, p. ej., el medicamento inmunosupresor para su uso puede estar comprendido en un kit, o los reactivos para llevar a cabo el método reivindicado pueden proporcionarse en un kit), pero tales kits no constituyen el objeto que se reivindica en el presente documento. Los kits útiles en los métodos de la divulgación comprenden componentes útiles en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, incluyendo, p. ej., cebadores para amplificación de ácido nucleico, sondas de hibridación para detectar variación genética, u otra detección de marcadores, enzimas de restricción, sondas de ácido nucleico, opcionalmente marcadas con marcadores adecuados, oligonucleótidos específicos de alelo, anticuerpos que se unen a un polipéptido alterado codificado por un ácido nucleico de la divulgación según se describe en el presente documento o a un polipéptido de tipo silvestre codificado por un ácido nucleico de la divulgación según se describe en el presente documento, medios para la amplificación de variaciones genéticas o fragmentos de las mismas, medios para analizar la secuencia de ácido nucleico de ácidos nucleicos que comprenden variaciones genéticas según se describe en el presente documento, medios para analizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por una variación genética, o un ácido nucleico asociado con una variación genética, etc. Los kits pueden incluir, p. ej., los tampones necesarios, cebadores de ácidos nucleicos para amplificar ácidos nucleicos, y reactivos para la detección específica de alelo de los fragmentos amplificados utilizando dichos cebadores y las enzimas necesarias (p. ej., ADN polimerasa). Además, los kits pueden proporcionar reactivos para ensayos que se utilizarán en combinación con los métodos de la presente divulgación, p. ej., reactivos para su uso con otros ensayos de detección de PML.
La divulgación puede pertenecer a un kit para ensayar una muestra de ácido nucleico de un sujeto para detectar la presencia de una variación genética, donde el kit comprende reactivos necesarios para detectar selectivamente al menos una variación genética particular en el genoma del individuo. La divulgación puede pertenecer a un kit para ensayar una muestra de ácido nucleico de un sujeto para detectar la presencia de al menos un alelo particular de al menos un polimorfismo asociado con una variación genética en el genoma del sujeto. Los reactivos pueden comprender al menos un oligonucleótido contiguo que se hibrida con un fragmento del genoma del individuo que comprende al menos la variación genética. Los reactivos pueden comprender al menos un par de oligonucleótidos que hibridan con cadenas opuestas de un segmento genómico obtenido de un sujeto, en el que cada par de cebadores oligonucleotídicos está diseñado para amplificar selectivamente un fragmento del genoma del individuo que incluye al menos una variación genética, o un fragmento de una variación genética. Dichos oligonucleótidos o ácidos nucleicos pueden diseñarse utilizando los métodos descritos en el presente documento. El kit puede comprender uno o más ácidos nucleicos marcados capaces de detección específica de alelo de uno o más marcadores polimórficos específicos o haplotipos con una variación genética, y reactivos para la detección del marcado. Un kit para detectar marcadores de SNP pueden comprender una sonda de oligonucleótido de detección, que se hibrida con un segmento de ADN molde que contiene un polimorfismo SNP que se va a detectar, una sonda de oligonucleótido potenciador, una sonda de detección, un cebador y/o una endonucleasa, p. ej., de acuerdo con lo descrito por Kutyavin et al., (Nucleic Acid Res. 34:el28 (2006)). El kit puede contener reactivos para detectar SNV y/o c Nv .
El molde de ADN puede ser amplificado por cualquier medio de la presente divulgación, antes de la evaluación de la presencia de variaciones genéticas específicas como se describe en el presente documento. Pueden utilizarse métodos estándar bien conocidos por el experto para llevar a cabo estos métodos, y están dentro del alcance de la divulgación. Los reactivos para llevar a cabo estos métodos pueden incluirse en el kit de reactivos.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un envase (kit) farmacéutico, que comprende un agente terapéutico y un conjunto de instrucciones para la administración del agente terapéutico a seres humanos sometidos a detección para una o más variantes de la presente divulgación, como se divulga en el presente documento. El agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo, un péptido, una molécula antisentido o ARNi, u otras moléculas terapéuticas como las descritas en el presente documento. A un individuo identificado como no portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome el agente terapéutico. A un individuo identificado como no portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome una dosis prescrita del agente terapéutico. A un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que no tome el agente terapéutico. Un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación puede recibir instrucciones de no tomar una dosis prescrita del agente terapéutico. A un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome un agente dirigido contra el virus de JC. Por ejemplo, a un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome un agente dirigido contra el virus de JC antes o junto con la toma de un agente inmunosupresor.
También se proporcionan en el presente documento artículos de fabricación, que comprenden una sonda que hibrida con una región del cromosoma humano como se describe en el presente documento y se puede utilizar para detectar un polimorfismo descrito en el presente documento. Por ejemplo, cualquiera de las sondas para detectar polimorfismos o variaciones genéticas descritas en el presente documento puede combinarse con material de envasado para generar artículos de fabricación o kits. El kit puede incluir uno o más elementos que incluyan: instrucciones de uso; y otros reactivos como un marcador o un agente útil para fijar un marcador a la sonda. Las instrucciones de uso pueden incluir instrucciones para aplicaciones de detección de la sonda para realizar un diagnóstico, pronóstico o teranosis a PML en un método descrito en el presente documento. Otras instrucciones pueden incluir instrucciones para adherir un marcador a la sonda, instrucciones para realizar un análisisin situcon la sonda, y/o instrucciones para obtener una muestra de ácido nucleico para ser analizada de un sujeto. En algunos casos, el kit puede incluir una sonda marcada que hibrida con una región del cromosoma humano como se describe en el presente documento.
El kit también puede incluir una o más sondas de referencia o control adicionales que hibridan con el mismo cromosoma u otro cromosoma o porción del mismo que puede tener una anomalía asociada con un endofenotipo particular. Un kit que incluye sondas adicionales puede incluir además marcadores, p. ej., una o más marcadores iguales o diferentes para las sondas. La sonda o sondas adicionales suministradas con el kit pueden ser una sonda o sondas marcadas. Cuando el kit incluye además una o más sondas adicionales, el kit puede proporcionar además instrucciones para el uso de la sonda o sondas adicionales. También pueden proporcionarse kits para autodiagnóstico. Dichos kits de prueba pueden incluir dispositivos e instrucciones que un sujeto puede utilizar para obtener una muestra de ácido nucleico (p. ej., células bucales, sangre) sin la ayuda de un profesional sanitario. Por ejemplo, las células bucales pueden obtenerse utilizando un hisopo o cepillo bucal, o utilizando enjuague bucal.
Los kits tal como se proporcionan en el presente documento también pueden incluir un remitente (p. ej., un sobre con franqueo pagado o un paquete postal) que se puede utilizar para devolver la muestra de ácido nucleico para su análisis, p. ej., a un laboratorio. El kit puede incluir uno o más contenedores para la muestra de ácido nucleico, o la muestra de ácido nucleico puede estar en un vial estándar de extracción de sangre. El kit también puede incluir uno o más de un formulario de consentimiento informado, un formulario de solicitud de prueba e instrucciones sobre cómo utilizar el kit en un método descrito en el presente documento. También se incluyen métodos para utilizar dichos kits. Uno o más de los formularios (p. ej., el formulario de solicitud de la prueba) y el recipiente que contiene la muestra de ácido nucleico pueden codificarse, p. ej., con un código de barras para identificar al sujeto que proporcionó la muestra de ácido nucleico.
Una prueba de detecciónin vitropuede comprender uno o más dispositivos, herramientas y equipos configurados para recoger una muestra de ácido nucleico de un individuo. Con una prueba de detecciónin vitro,las herramientas para recoger una muestra de ácido nucleico pueden incluir uno o más de un hisopo, un bisturí, una jeringa, un raspador, un recipiente y otros dispositivos y reactivos diseñados para facilitar la recogida, el almacenamiento y el transporte de una muestra de ácido nucleico. Una prueba de detecciónin vitropuede incluir reactivos o soluciones para recoger, estabilizar, almacenar y procesar una muestra de ácido nucleico.
Tales reactivos y soluciones para la recolección, estabilización, almacenamiento y procesamiento de nucleótidos son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden ser indicados por métodos específicos utilizados por una prueba de detecciónin vitrocomo se describe en el presente documento. Un ensayo de detecciónin vitro, tal como se describe en el presente documento, puede comprender un aparato de microarreglos y reactivos, un aparato de celdas de flujo y reactivos, un secuenciador multiplex de nucleótidos y reactivos, y el hardware y software adicionales necesarios para analizar una muestra de ácido nucleico en busca de determinados marcadores genéticos y para detectar y visualizar determinados marcadores genéticos.
La presente divulgación se refiere además a kits para utilizar anticuerpos en los métodos descritos en el presente documento. Esto incluye, entre otros, kits para detectar la presencia de un polipéptido variante en una muestra de ácido nucleico de prueba. Preferentemente se incluyen anticuerpos tales como un anticuerpo marcado o marcable y un compuesto o agente para detectar polipéptidos variantes en una muestra de ácido nucleico, medios para determinar la cantidad o la presencia y/o ausencia de polipéptido variante en la muestra de ácido nucleico, y medios para comparar la cantidad de polipéptido variante en la muestra de ácido nucleico con un estándar, así como instrucciones de uso del kit. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones para utilizar los reactivos que lo componen.
Aspectos informáticos
La presente invención se refiere a un medicamento inmunosupresor para su uso o a métodos como los definidos en las reivindicaciones, para los cuales lo que sigue proporciona una divulgación útil relativa a aspectos informáticos (que pueden, p. ej., utilizarse para determinar el riesgo de PML), pero tales aspectos informáticos no constituyen el objeto que se reivindica en el presente documento. Como comprenderán los expertos en la materia, los métodos y la información descritos en el presente documento (asociación de variación genética con PML) pueden implementarse, en todo o en parte, tal como instrucciones ejecutables por ordenador en medios legibles por ordenador conocidos. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden implementarse en hardware. Alternativamente, el método puede implementarse en software almacenado en, p. ej., una o más memorias u otro medio legible por ordenador e implementado en uno o más procesadores. Como es sabido, los procesadores pueden estar asociados a uno o más controladores, unidades de cálculo y/u otras unidades de un sistema informático, o implantados en firmware según se desee. Si se implementan en software, las rutinas pueden almacenarse en cualquier memoria legible por ordenador, tal como en RAM, ROM, memoria flash, un disco magnético, un disco láser u otro medio de almacenamiento, como también es conocido. Del mismo modo, este software puede suministrarse a un dispositivo informático a través de cualquier método de suministro conocido, incluyendo, p. ej., a través de un canal de comunicación como una línea telefónica, Internet, una conexión inalámbrica, etc., o a través de un medio transportable, tal como un disco legible por ordenador, una unidad flash, etc.
De manera más general, y tal como lo entienden aquellos con conocimientos ordinarios en la materia, los diversas etapas descritas anteriormente pueden implementarse como diversos bloques, operaciones, herramientas, módulos y técnicas que, a su vez, pueden implementarse en hardware, firmware, software o cualquier combinación de hardware, firmware y/o software. Cuando se implementan en hardware, algunos o todos los bloques, operaciones, técnicas, etc. pueden implementarse, p. ej., en un circuito integrado (IC) personalizado, un circuito integrado de aplicación específica (ASIC), una matriz lógica programable de campo (FPGA), una matriz lógica programable (PLA), etc.
Los resultados de dicho genotipado pueden almacenarse en una unidad de almacenamiento de datos, tal como un portador de datos, incluyendo, bases de datos informáticas, discos de almacenamiento de datos, o por otros medios convenientes de almacenamiento de datos. La base de datos informática puede ser una base de datos de objetos, una base de datos relacional o una base de datos posrelacional. Los datos pueden recuperarse de la unidad de almacenamiento de datos utilizando cualquier método de consulta de datos conveniente.
Cuando se implementa en software, el software puede almacenarse en cualquier medio legible por ordenador conocido, tal como en un disco magnético, un disco óptico u otro medio de almacenamiento, en una memoria RAM o ROM o flash de un ordenador, procesador, unidad de disco duro, unidad de disco óptico, unidad de cinta, etc. Del mismo modo, el software puede suministrarse a un usuario o a un sistema informático a través de cualquier método de suministro conocido, incluyendo, p. ej., en un disco legible por ordenador u otro mecanismo de almacenamiento informático transportable.
Las etapas de los métodos reivindicados pueden ser operativas con otros numerosos entornos o configuraciones de sistemas informáticos de propósito general o especial. Ejemplos de sistemas informáticos conocidos, entornos y/o configuraciones que pueden ser adecuados para su uso con los métodos o sistemas de las reivindicaciones incluyen, pero no se limitan a, ordenadores personales, ordenadores de servidor, dispositivos de mano o portátiles, sistemas multiprocesador, sistemas basados en microprocesador, decodificadores, electrónica de consumo programable, ordenadores personales en red, miniordenadores, ordenadores centrales, entornos informáticos distribuidos que incluyen cualquiera de los sistemas o dispositivos anteriores, y similares.
Las etapas del método y sistema reivindicados pueden describirse en el contexto general de instrucciones ejecutables por ordenador, tales como módulos de programa, que son ejecutados por un ordenador. Generalmente, los módulos de programa incluyen rutinas, programas, objetos, componentes y/o estructuras de datos que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. Los métodos y aparatos también pueden practicarse en entornos informáticos distribuidos en los que las tareas son realizadas por dispositivos de procesamiento remotos que están conectados a través de una red de comunicaciones. Tanto en entornos informáticos integrados como distribuidos, los módulos de programa pueden ubicarse en medios de almacenamiento informático locales y remotos, incluidos dispositivos de almacenamiento de memoria. Se contemplan numerosas implementaciones alternativas, utilizando tecnología actual o tecnología desarrollada después de la fecha de presentación de esta solicitud.
Aunque el sistema y el método de evaluación de riesgos, y otros elementos, se han descrito como preferiblemente implementados en software, pueden implementarse en hardware, firmware, etc., y pueden ser implementados por cualquier otro procesador. Así pues, los elementos descritos en el presente documento pueden implementarse en una CPU multipropósito estándar o en hardware o firmware diseñado específicamente, tal como un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) u otro dispositivo cableado, según se desee. Cuando se implementa en software, la rutina de software puede almacenarse en cualquier memoria legible por ordenador, tal como un disco magnético, un disco láser u otro medio de almacenamiento, en una RAM o ROM de un ordenador o procesador, en cualquier base de datos, etc. Asimismo, este software puede suministrarse a un usuario o a un sistema de detección a través de cualquier método de suministro conocido o deseado, incluyendo, p. ej., en un disco legible por ordenador u otro mecanismo de almacenamiento informático transportable o a través de un canal de comunicación, p. ej., una línea telefónica, Internet o una comunicación inalámbrica.
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Las siguientes referencias contienen ejemplos de los métodos y composiciones que pueden utilizarse en el presente documento: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th edition, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (<i>S<b>N 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los procedimientos estándar de la presente divulgación se describen, p. ej., en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, USA (1986); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger y A. R. Kimmerl (eds.), Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)). Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique por R. Ian Freshney, Editorial: Wiley-Liss; 5th edition (2005), y Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather y David Barnes editores, Academic Press, 1 st edition, 1998).
Debe entenderse que los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitativos de la metodología, protocolos y composiciones particulares, etc., descritos en el presente documento y, como tales, pueden variar. Los siguientes términos utilizados en el presente documento se utilizan únicamente para describir realizaciones concretas y no pretenden limitar el alcance de las realizaciones descritas en el presente documento.
Se divulgan en el presente documento moléculas, materiales, composiciones y componentes que pueden usarse para, pueden usarse en conjunción con, pueden usarse en preparación para, o son productos de métodos y composiciones divulgados en el presente documento.
Se entiende que los métodos y composiciones divulgados no se limitan a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente divulgación, que sólo puede limitarse mediante las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado que comúnmente entendería un experto en la materia en el contexto de la presente especificación.
Cabe señalar que, tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, p. ej., la referencia a "un nucleótido" incluye una pluralidad de tales nucleótidos; la referencia a "el nucleótido" es una referencia a uno o más nucleótidos, y así sucesivamente.
En el presente contexto, se entenderá que el término "y/o" indica que se trata de uno o de ambos elementos conectados por él. Aunque se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas de la presente divulgación, puede resultar obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan únicamente a modo de ejemplo. La invención puede modificarse dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
La presente invención implica una variación genómica seleccionada de chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A. Los siguientes Ejemplos, en la medida en que no están relacionados con las variaciones genómicas chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A, se incluyen como referencia.
Ejemplo 1 - Enfoque experimental
En el presente estudio, un conjunto de genes fue identificado, variantes deletéreas dentro de los cuales aumentan la susceptibilidad a PML. Los genes relevantes se descubrieron sobre la base de un enfoque combinado de CNV más análisis de secuencias. Se recopilaron dos conjuntos de genes (véase la Tabla 6 y la descripción correspondiente):
A. Un conjunto basado en una revisión bibliográfica detallada de genes implicados en el sistema inmunitario y la biología del virus de JC, junto con genes descritos en el contexto de la PML a través de informes de casos. B. Un conjunto basado en la observación de CNV raras dentro de la cohorte de PML.
Se generó una lista no redundante de 419 genes ((véase la Tabla 6), que contiene 245 curados de revisiones de deficiencia inmunitaria (inmunodeficiencia) (Tabla 6, 'Base de datos pública'), 169 identificados a través de CNV raras usando los métodos descritos en el presente documento (Tabla 6, 'PBio'), y 6 genes que fueron encontrados usando ambos métodos (Tabla 6, 'Ambos'). Para más información, véase la Tabla 6 y la descripción que figura a continuación).
Utilizando este conjunto de 419 genes, se determinó si:
• Se observaron CNV raras que podrían explicar la susceptibilidad a la PML;
• Se observaron variantes raras de la secuencia (determinadas mediante el análisis de secuenciación del exoma completo - WES) que podrían explicar la susceptibilidad a la PML;
• Las combinaciones de CNV, SNV y/o CNV y SNV podrían explicar la susceptibilidad;
• Las variantes individuales podrían estar presentes con mayor frecuencia en la cohorte de PML (análisis de la carga de variantes - Tablas 14, 15);
• El número total de variantes heterocigotas dañinas fue elevado para algunos genes específicos (análisis de la carga génica - Tabla 13).
En todos los casos, se tuvo debidamente en cuenta:
• Naturaleza patógena/deletérea de las variantes observadas (p. ej., si era muy probable que la función del gen se viera afectada);
• Rareza de las variantes o combinaciones de variantes (p. ej., se consideraron aquellas que se esperaría que estuvieran presentes en el 1 % o menos de la población normal);
• Origen étnico de los casos de PML para tener en cuenta las posibles diferencias de frecuencia en un subgrupo de población frente a otro. Las etnias (p. ej., ascendencia) de los pacientes con PML se indican en la Tabla 7. En el caso de los identificadores de las muestras que empezaban por 'MVGS', no se comunicaron las etnias, pero todos los pacientes procedían de EE.UU. y se asumió que sus etnias eran de ascendencia europea (EUR). Sin embargo, el caso de PML MVGS9 11-13a es potencialmente de ascendencia africana (AFR) sobre la base de SNV comunes que también se encuentran en casos de PML conocidos por ser de ascendencia AFR. En un caso, se utilizaron los datos de frecuencia específicos de la etnia de la base de datos del ExAC para evaluar las frecuencias relativas de las variantes encontradas en pacientes con PML frente a una población no seleccionada (sujetos del ExAC). Las etnias del ExAC se designaron de la siguiente manera: africanos/afroamericanos (AFR), latinos (LAT, también conocidos como AMR), asiáticos orientales (EAS), finlandeses (FIN), europeos no finlandeses (EUR, también conocidos como NFE), sudasiáticos (SAS) y otros (OTH). En algunos de los casos de PML recogidos en la Tabla 7, las etnias eran alternativamente subsahariana, norteafricana (MGB), caribeña (CAR) o hispana (HISP). Para la interpretación de las variantes encontradas en estos pacientes, las asignaciones de ascendencia utilizando las designaciones de las bases de datos del ExAC fueron las siguientes: AFR = MGB o Subsahariana; LAT = CAR o HISP. Se desconocía la ascendencia de dos casos de PML (PML02 y PML28) y, a efectos de interpretación de frecuencias (utilizando las bases de datos del ExAC), se asumió que eran de ascendencia europea (EUR).
Aunque el principal mecanismo genético que se consideró fue la herencia autosómica recesiva (AR), varias soluciones se basaron en la herencia autosómica dominante (AD), pero sólo en casos para los que se encontró evidencia previa de que las variantes heterocigotas en el gen relevante se habían asociado previamente con un síndrome de inmunodeficiencia. Los expertos en la materia pueden apreciar que algunos genes pueden contener variantes patogénicas tanto del modelo AR como del modelo AD (p. ej., véanse las entradas de la Tabla 6 marcadas como "AD_AR" en la columna "Modelo de Enfermedad").
Para la herencia AR (~40 % de los genes en la Tabla 6 caen en esta categoría, AR o AD_AR), se consideró lo siguiente:
• CNV disruptivas homocigotas o heterocigotas compuestas;
• Variantes de secuencia homocigotas o heterocigotas compuestas; es decir, variantes de un solo nucleótido (SNV). La heterocigosidad compuesta sólo se dedujo cuando se disponía de desfase o uno de los pares de SNV era homocigótico;
• Heterocigosidad compuesta para una CNV y una SNV. Tales llamadas sólo fueron posibles en los casos en los que el SNV estaba en trans para una eliminación (p. ej., el SNV DUSP16 en la Tabla 10 y el CNV en la Tabla 1).
Ejemplo 2 - Análisis de variantes del número de copias (CNV)
Los datos presentados en el presente documento se generaron a partir de una comparación de variantes en el número de copias (CNV) identificadas en 2 cohortes:
1) 1,005 individuos normales (motor de variación normal - NVE);
2) 71 casos de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) junto con 6 casos de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) sin diagnóstico de PML (para ayudar a distinguir las variantes de línea germinal frente a las variantes adquiridas que resultan de la infección por VIH). Tamaño total de la cohorte = 77.
Hibridación de muestras de ADN genómico - NVE y PML, cohortes de VIH
Muestras de ADN genómico de individuos dentro de la cohorte normal (sujetos de "prueba" NVE, también denominados como "casos NVE" en algunas tablas en el presente documento) y de la cohorte de PML, VIH (sujetos de "prueba" de PML, VIH) fueron hibridadas contra un solo individuo de referencia emparejado por sexo. Las muestras de ADN de referencia se marcaron con Cy5 y las muestras de ADN de los sujetos de prueba se marcaron con Cy3. Tras el marcaje, las muestras se combinaron e hibridaron juntamente con microarreglos de oligonucleótidos Agilent Feature 1m , ID de diseño 021529 (número de producto Agilent G4447A) utilizando condiciones estándar (hibridación genómica comparativa de arreglos - aCGH). Tras la hibridación, las matrices se escanearon con una resolución de 2 pm, utilizando el escáner de microarreglos de ADN de Agilent, generando imágenes tiff para su posterior análisis.
Todas las imágenes tiff fueron analizadas utilizando el software Feature Extraction (FE) de Agilent, con la siguiente configuración:
- Congelación del genoma humano: hg18:NCBI36:Mar2006
- Versión FE: 10.7.3.1
- Rejilla/archivo de diseño: 021529_D_F_20091001
- Protocolo: CGH_107_Sep09
Este procedimiento genera varios archivos de salida, uno de los cuales es un archivo de texto delimitado por pestañas, que contiene ~1,000,000 de filas de datos, cada una de las cuales corresponde a una característica específica de la matriz. Este archivo *.txt se utilizó para realizar llamadas de CNV utilizando DNAcopy, un paquete de software de código abierto implementado en R a través de BioConductor (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html). Las pérdidas heterocigotas (het_loss), las pérdidas homocigotas (hom_loss) o las ganancias se determinaron en función de una relación log2 de umbral, que se fijó en:
• hom_loss mínima = -1000;
• hom_loss máxima = -2;
• het_loss mínima = -2;
• het_loss máxima = -0.5;
• ganancia mínima = 0.5;
• ganancia máxima = 1000;
Con muy pocas excepciones, todas las CNV con un valor de relación log2 entre -0.5 y 0.5 no fueron consideradas. Todos los valores de relación log2 se determinaron de acuerdo con Cy3/Cy5 (Prueba/Referencia). Se fijó en 2 el umbral mínimo de sondas para la llamada de CNV (2 sondas consecutivas eran suficientes para llamar una CNV). Se generó una lista de CNV para cada individuo de las 3 cohortes (NVE, PML y VIH).
Usando guiones personalizados, las CNV identificadas en las cohortes NVE y PML (muchas de las cuales aparecieron en múltiples individuos) fueron (separadamente) 'fusionadas' en listas maestras de subregiones de CNV no redundantes, de acuerdo con la presencia o ausencia de la subregión de CNV en individuos dentro de la cohorte. Usando este enfoque, las listas maestras de NVE tienen:
- 7778 het_loss
- 653 hom_loss
- 4862 ganancia
distintas subregiones de CNV, respectivamente. La cohorte de PML VIH de 77 listas maestras de individuos contenía:
- 2523 het_loss
-314 hom_loss
- 1639 ganancia
distintas subregiones de CNV, respectivamente.
Los expertos en la materia pueden apreciar que se pueden adquirir CNV en el genoma de un individuo que no se heredan. Estas "CNV adquiridas" se producen a menudo en tejidos específicos, tal como los tumores sólidos, en comparación con el tejido normal del paciente. En las muestras de ADN genómico derivado de la sangre, que son las que se utilizaron para los sujetos con NVE y PML en los estudios descritos en el presente documento, las CNV adquiridas pueden ser el resultado de cánceres sanguíneos como la leucemia y el linfoma, pero también deberse a la infección por VIH. Muchos de los casos de PML de este estudio tenían el VIH como enfermedad primaria (véase la Tabla 7). Para ayudar en la interpretación de las CNV adquiridas frente a las de línea germinal, se incluyó una subcohorte de 6 casos de VIH en la comparación primaria de CNV de todo el genoma, pero las CNV raras en los 6 casos de VIH (no PML) no se consideraron relevantes para la susceptibilidad a la PML. El propósito de generar datos sobre los 6 casos de VIH era determinar si algunos cambios observados en pacientes con PML que desarrollaron el trastorno sobre un fondo de VIH (PML/VIH) estaban probablemente relacionados con el VIH subyacente y no con la propia susceptibilidad a la PML. En otras palabras, los casos de VIH sirvieron de control general para el gran número de casos de PML/VIH.
Por ejemplo, considere 3 individuos dentro de la cohorte de NVE con las siguientes CNV hipotéticas:
Chrl: 1-100,000; Chrl: 10,001-100,000; y Chrl: 1-89,999. En la lista maestra, éstas se fusionarían en 3 subregiones de CNV distintas, tal como sigue:
- subregión 1 de CNV Cr1:1-10,000 Sujetos A, C
- subregión 2 de CNV Cr1:10,001-89,999 Sujetos A, B, C
-subregión 3 de CNV Chr90,000:1-100,000 Sujetos A, B
Se realizó la comparación de las correspondientes listas maestras de NVE y PML de las subregiones de CNV (het_loss frente a het_loss, hom_loss frente a hom_loss y ganancia frente a ganancia), lo que dio como resultado un archivo combinado con los totales de NVE y PML para cada subregión distinta de CNV del estudio.
Los datos son subsecuentemente curados como sigue (el ejemplo de cálculo abajo fue basado en una cohorte original de PML de 80 casos, de los cuales 6 son controles de VIH no-PMLy 3 casos de PML que eran muestras duplicadas. En algunos casos, los valores OR y FET indicados en la Tabla 2 se utilizaron como directrices "relativas" a la hora de considerar la relevancia de una CNV. En casi todos los casos, una CNV se consideró como causa potencial o factor contribuyente a la PML si estaba ausente de la base de datos de NVE de CNV).
• Anotación mediante secuencias de comandos diseñadas a medida con el fin de adjuntar información relevante a cada región de CNV en relación con el solapamiento con genes y exones conocidos, el solapamiento con genes implicados en el sistema inmunitario y el solapamiento con regiones reguladoras, incluidos los sitios de unión de factores de transcripción.
• Un cálculo de la razón de probabilidades (OR) y de la prueba exacta de Fisher (FET) para cada subregión de CNV, de acuerdo con la siguiente fórmula:
OR = (PML/(77-PML))/(NVE/( 1005-NVE))
o donde:
° PML = número de individuos con PML con subregión de CNV de interés
° NVE = número de individuos con NVE con subregión de CNV de interés
Como un ejemplo ilustrativo, considere la ganancia de subregión de CNV que involucra chr2:55764753-55771586, que se encuentra en 3 individuos en la cohorte de PML y 1 individuo en la cohorte de NVE ((véase la Tabla 2). La OR es: (3/74)/(1/1004) = 40.7. Téngase en cuenta que, de acuerdo con una convención, si cualquiera de NVE o PML = 0, se añade un valor de 0.5 a las 4 entradas de la fórmula principal anterior, para evitar tratar con infinitos (véase Deeks y Higgins, Statistical algorithms in Review Manager 5, Statistical Methods Group of The Cochrane Collaboration, (2010)). Esto tiene el efecto de reducir artificialmente los valores de OR en los casos en los que ningún individuo dentro del NVE tiene la CNV. Este método es aplicable a todos los cálculos de la Tabla 2. Este método también se utiliza al calcular la prueba exacta de Fisher de 2 colas (FET) en caso de que alguna de las variables sea cero. Por conveniencia en el análisis, en la Tabla 2 se retuvo la subcohorte de 6 casos de VIH (no PML). Por lo tanto, los valores de OR indicados en la Tabla 2 son ligeramente diferentes de los cálculos de OR para el número real de casos de PML (n = 71). Utilizando el ejemplo anterior para una ganancia de la subregión de CNV que implica chr2:55764753-55771586, la OR real utilizando 71 casos de PML frente a 1005 sujetos de NVE fue: (3/68)/(1/(1004) = 44.29. En algunos casos, se encuentra que un control de VIH no-PML (véase la Tabla 11, identificado como 3280, 3281, 3283, 3284, 3285 y 3286) tiene una CNV de relevancia potencial en sujetos con PML. Esto también puede influir en el cálculo de OR. Por ejemplo, para la pérdida de la subregión de CNV chr19:55247874-55250186 la OR en la Tabla 2 aparece como 17.38 pero un caso es un control de VIH no-PML (Tabla 11, control de PML70 = 3280). Para este ejemplo, la OR real utilizando 71 casos de PML frente a 1005 sujetos de NVE, y excluyendo el caso de VIH sin PML, fue: (4/67)/(4/(1001) = 14.94.
Las subregiones de CNV/genes que se enumeran en el presente documento (p. ej., en una o más de las Tablas 1-4), cumplen uno de los siguientes criterios:
• Biología sólida que vincule el gen al que afecta o cerca del cual se encuentra la subregión de la CNV, con vías/mecanismos conocidos de inmunodeficiencia o biología en la PML (p. ej., biología relacionada con el virus de JC). Es decir, en algunos casos, faltan pruebas estadísticas, pero no excluyen la subregión de la CNV como candidata;
• Análisis estadístico combinado con biología media a fuerte (p. ej., vínculos en la literatura revisada por pares con PML, virus de JC, defensa del huésped, inmunodeficiencia o neuropatología) sin conexión biológica obvia (el mejor FET en esta categoría fue de 3.25E-10);
Puede ser apreciado por los expertos en la materia que el número de subregiones de CNV candidatas a PML, independientemente de la categoría, puede aumentar o disminuir a medida que se analizan cohortes de PML adicionales.
Ejemplo 3 - Secuenciación del exoma completo (WES) y análisis a nivel de caso.
Los datos de WES fueron obtenidos en un total de 70 casos de PML (los casos de VIH no-PML no fueron secuenciados - fueron usados simplemente para ayudar en la interpretación de CNV complejos observados en pacientes con PML que también tenían VIH).
Los informes de anotación de variantes se contrastaron además con el conjunto completo de genes detallados anteriormente. No se tuvieron en cuenta las variantes sinónimas ni las que se preveía que fueran modificadoras (fuera de las regiones codificantes). Para todas las demás variantes, se realizó un filtrado adicional, de modo que sólo se consideraron patogénicas para su posterior evaluación aquellas que al menos un algoritmo de predicciónin silico(p. ej., Polyphen2, SIFT, MutationTaster) predijo que lo eran. Por último, sólo se evaluaron para el análisis a nivel de caso las variantes o combinaciones de variantes que se esperaría que estuvieran presentes en el 1 % o menos de la población normal (Tablas 7-10). Se utilizaron datos del Exome Aggregation Consortium (ExAC) para obtener datos de frecuencia específicos de cada etnia para las variantes consideradas (véase, Lek et al., Nature, 17; 536(7616): 285-91) (2016)).
Ejemplo 4 - Descripción de los datos de secuencia
El archivo de secuencia 33655-710.601_ST25.txt contiene información de secuencia genómica para (en el siguiente orden):
A. Todas las CNV distintas enumeradas en la Tabla 1;
B. La extensión genómica completa de los transcripciones enumerados en la Tabla 4;
C. Variantes de secuencia detalladas en la Tabla 5.
D. La extensión genómica completa de los transcripciones enumerados en la Tabla 12
Téngase en cuenta que:
1. SEQ_ID 1-172 son las secuencias de CNV de la Tabla 1;
2. SEQ_ID 173-455 son las secuencias de transcripciones de la Tabla 4;
3. SEQ_ID 1000-1329 son las variantes de secuencia de la Tabla 5;
4. SEQ_ID 1500-2177 son las secuencias de transcripciones de la Tabla 12.
Ejemplos de secuencias presentadas:
Se inicia la entrada de secuencia:
Tabla 1: SEQ_ID 1 = CNV 49,653 pb (het loss) en chr1:1086119-1135772 involucrando los genes MIR200A,MIR200B,MIR429,TNFRSF18,TTLL10:
<210> 1
<211> 49654
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
cttctggggt ctaaggccag aagtgaectt tcttctcacg gaggcacecc cacatcacag 6Ü
gccccaagct occaccagga gtccccaggc agcaggtttt ccaccacagc cgggaagagc 120
ecegccttca ccacccacca ccagccaalc ccgagaccac cgaagcccec agaccgggoc 180
..........................................................(sequence trancated for bre\ ity)
gattcccgca cggccgggga oggccccagg gccttgggag cgtctgtgga cacctgtggt 49560
gtgggccgag gagctgggag clcatclgaa oacgcoagoa ctcgcgcatc cacgctgctg 49620
gcggatgcct gggtttctcc actgtggggc cacg 49654
Finaliza la entrada de secuencia.
Se inicia la entrada en secuencia:
Tabla 4: SEQ_ID 173 = MIR200B, transcripción NR_029639, que tiene 95 pb de longitud:
<210> 173
<211> 95
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 173
ccagctcggg cagccgtggc catcttactg ggcagcattg gatggagtca ggtctctaat 60
actgcctggt aatgatgacg gcggagccct gcacg 95
Finaliza la entrada de secuencia.
Se inicia la entrada en secuencia:
Tabla 5: SEQ_ID 1148 = alelo de referencia chr9:304628 = G; alelo alternativo = A
<210> 1148
<211> 40
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variante
<222> (20)..(20)
<223> G->A
<400> 1148
tttaaaaaga ctggatctcg aaaagatttt cacaagacgc 40
Finaliza la entrada de secuencia.
Se inicia la entrada en secuencia:
Tabla 12: SEQ_ID 1500 = ACADM, transcripción NM _000016, que tiene 39,313 pb de longitud:
<210> 1500
<211> 39313
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1500
cgcaagtccc cccaccgttc agcgcaaccg ggccctccca gccccgccgc cgtccccctc 60
ccccgccclg gclctctttc cgcgclgcgg Icagcclogg eglcccacag agagggccag 120
....................................................... (sequence truncated for brevity)
gtaataglgl ataltlcUg laUtaclat gatgaaaaaa ggtcgUUa allltgaall 39240
gaataaagtt acctgttcat tttttattag atattttaaa gacttcagaa aatataaata 39300
Igaaalaall laa 39313
Finaliza la entrada de secuencia.
Ejemplo 5
Los expertos en la materia pueden apreciar que los genes pueden verse afectados por variantes genéticas adquiridas o de línea germinal (p. ej., CNV), en las que cada gen tiene el potencial de contener variantes genéticas adquiridas (p. ej., a través de un proceso de enfermedad como la infección por VIH, o cánceres como la leucemia y el linfoma) o presentes en la línea germinal (p. ej., heredadas de un progenitor o de novo, es decir, no heredadas de un progenitor). En la Figura 1, el gen PRKCB estaba afectado por variantes de línea germinal en 2 casos de PML y por variantes adquiridas en 6 casos de PML. La invención descrita en el presente documento se centra en la detección de variantes de la línea germinal que están presentes en los genomas de pacientes con PML. Por lo tanto, ninguna solución/explicación para la PML de un paciente dado se basó en una CNV adquirida, aunque otro paciente con PML podría potencialmente ser "resuelto" por una o dos variantes raras de la línea germinal que afecten al gen.
Para este ejemplo PRKCB, no se encontraron soluciones basadas en CNV (se asumió un modelo AR), pero 1 solución de SNV se reporta en la Tabla 8 (SNV het, se asumió un modelo AD para este caso de PML). Se evaluaron más pruebas de apoyo para el gen PRKCB realizando un análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores; string-db.org; véase Szklarczyk et al., (2015), y sus referencias). El análisis String mostró que PRKCB interactúa con los genes de PML-419 CARD11, IKb Kb , y RBCK1 (véase la Tabla 6).
En la Figura 2, tanto TNFRSF13C como CENPM están interrumpidos y/o ganados por un conjunto de ganancias de CNV adquiridas. Las CNV adquiridas pueden ser muy complejas, tal como las elevadas ganancias en el número de copias que suelen identificarse en las muestras de<a>D<n>derivadas de tumores (en comparación con el genoma normal del paciente). En el descubrimiento del gen de PML descrito en el presente documento, el ADN genómico derivado de la sangre obtenido de varios pacientes con VIH diagnosticados con PML, o casos de PML con una enfermedad primaria de leucemia y linfoma (reportados como 'Otros' en la Tabla 7), mostraron cambios genómicos complejos (p. ej., ganancias que exhibían un patrón dup-trip-dup). En algunos casos de PML, las ganancias adquiridas superaron el punto de corte de la relación log2 (>0.5) que se seleccionó para este estudio, pero en otros casos de PML las relaciones log2 para las ganancias fueron <0.5 y estos datos se filtraron de los análisis principales que se realizaron para determinar las CNV de línea germinal rara.
En un caso, se utilizó un conjunto de 6 casos de VIH sin PML (3 de ascendencia africana, 3 de ascendencia europea) para ayudar en la interpretación de si una CNV era un evento adquirido o de línea germinal. Los "casos de PML" sin PML están marcados con "_control" en la Tabla 11 y corresponden a los números "ID del caso de PML" 3280, 3281, 3283, 3284, 3285 y 3286. Mientras que algunas CNV se reportan en las Tablas 1 y 2 para este conjunto de sujetos con VIH control sin PML, ninguno de estos hallazgos genéticos se utilizó para nominar un gen descubierto sobre la base de CNV raras (en comparación con la base de datos de NVE) como un gen potencial de PML (genes PBio reportados en la Tabla 6). En otras palabras, estas CNV raras sólo se utilizaron para ayudar a determinar si una región genómica concreta que contenía múltiples CNV superpuestas se debía potencialmente a un evento genético adquirido. Los expertos en la materia pueden apreciar que el conjunto de experimentos descritos en el presente documento no necesariamente descarta por completo que una región genómica dada contenga sólo CNV adquiridas frente a sólo CNV de línea germinal (es decir, es posible que la misma región pueda contener una<c>N<v>adquirida en un individuo y una CNV de línea germinal en otro).
Para los datos de CNV mostrados en la Figura 2, ambos genes TNFRSF13C y CENPM fueron incluidos en la lista de genes de PML-419 (Tabla 6) sobre la base de su biología inmune o neurológica relacionada reportada en la bibliografía. No se encontraron soluciones de PML para CNV o SNV para estos dos genes, pero el análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) muestra que TNFRSF13C interactúa con los genes de PML-419 TRAF3 (solución de la Tabla 7) y TNFRSF13b (solución de la Tabla 8), así como con BTK (un gen de PML conocido, véase la Tabla 6).
La Figura 3 muestra otro ejemplo de un gen que es afectado tanto por CNV de línea germinal como adquiridas. Mientras que ningún caso de PML fue resuelto sobre la base de las CNV adquiridas o de línea germinal que mostraron impactar el gen PKHD 1, la nominación de este gen a la Tabla 6 sobre la base de su biología resultó en el hallazgo de 3 potenciales soluciones alternativas (modelo AR) para otros 3 casos de PML (véase la Tabla 8). Sin embargo, el análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419 con PKHD1.
Ejemplo 6
Los expertos en la materia pueden apreciar que un modelo de enfermedad AR implicaría determinar si ambos alelos (para un gen o locus genético) están afectados por una variante genética en individuos afectados por el trastorno. Los tipos de variantes genéticas pueden ser SNV, CNV, indels, etc. En el estudio descrito en el presente documento, si se invocaba un modelo de enfermedad AR para un gen (véase la Tabla 6), evaluábamos los datos CGH del paciente con PML en busca de CNV (heterocigotos u homocigotos) y sus datos de exoma en busca de SNV (heterocigotos u homocigotos). De este modo, cada paciente puede ser resuelto para uno de los genes de PML-419 (Tabla 6) con uno de los siguientes escenarios: eliminación homocigota, duplicación homocigota (la relación log2 aparecerá comparable a la encontrada típicamente para triplicaciones), SNV homocigota, SNV heterocigota compuesta, CNV heterocigota compuesta, o SNV heterocigota compuesta y CNV. Los expertos en la materia saben que, para un mecanismo de enfermedad AR, una SNV o CNV patogénica puede tener una frecuencia apreciable en la población general (p. ej., hasta un 1 % de frecuencia) con poco o ningún impacto en la salud del individuo, pero cuando está presente con una segunda variante patogénica en el otro alelo, puede causar la enfermedad.
La Figura 4 muestra un ejemplo de una pérdida intrónica que afecta al gen BMPR2. Se descubrió que el paciente PML29 tenía una eliminación homocigota, mientras que los pacientes PML58 y MVGS811-13a tenían una eliminación heterocigota. Asumiendo un modelo de enfermedad A<r>, no se encontraron soluciones de SNV para este gen; sin embargo, PML29 está potencialmente resuelto debido a la eliminación homocigota que se detectó. Mientras que la biología relacionada con el sistema inmune es reportada para estudios sobre BMPR2 (véase la Tabla 6), el análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419 con BMPR2.
La Figura 5 muestra un ejemplo de una ganancia exónica que interrumpe el gen COMMD6. Se encontró que dos pacientes con PML tenían duplicaciones homocigotas de esta CNV. Curiosamente, mientras que el análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419 con COMMD6, estudios recientes (véase la Tabla 6, PMID 25355947 y 27441653) muestran un vínculo potencial entre COMMD6 y el conocido gen de PML WAS a través del gen Wa SH.
La Figura 6 muestra un ejemplo de una ganancia exónica que interrumpe el gen KCTD7 y su punto de ruptura derecho está secuencia arriba de RABGEF1 (es decir, uno o ambos genes pueden estar causando/contribuyendo a PML). Un ARN no codificante recientemente anotado (véase el ensamblaje hg19, LOC100996437) también puede estar afectado por esta CNV. Ambos genes tienen vínculos inmunológicos y neurológicos (véase la Tabla 6) y como el paciente PML29 tiene una duplicación homocigota, se añadió como solución de PML en la Tabla 7. El análisis String (confianza alta = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419 para ninguno de los dos genes, pero están vinculados en un análisis String conjunto.
La Figura 7 muestra un ejemplo de una ganancia que interrumpe FPR2 (punto de ruptura izquierdo) y ZNF616 (punto de ruptura derecho, gen no marcado), y otros genes son totalmente abarcados por esta CNV. Hay un fuerte apoyo biológico para el FPR2 (véase la Tabla 6) y está listado como una solución de PML en la Tabla 7. El análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419 para FPR2, pero un análisis conjunto de los genes de la Tabla 7 sí reveló una interacción (véase la Figura 13).
La Figura 8 muestra un ejemplo de una pérdida exónica que afecta a los genes PIK3CD y PIK3CD-AS 1. El paciente MVGS811-13a tiene una eliminación homocigota y se informa como solución en la Tabla 7 basándose en la fuerte biología relacionada con el sistema inmune para PIK3CD (véase la Tabla 6). El análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) revela interacciones del gen de PML-419 para PTEN y PIK3R1.
Ejemplo 7
Un subconjunto de las CNV raras encontradas en nuestro estudio de PML estaban localizadas en regiones intergénicas. Aunque los expertos en la materia pueden apreciar que las variantes intergénicas (CNV, SNV, etc.) pueden tener efectos de largo alcance sobre la expresión de los genes (p. ej., los elementos reguladores de los genes pueden estar localizados a varios kilobases de distancia de los genes bajo su influencia), en nuestro estudio asumimos que las CNV intergénicas tenían un impacto potencial sobre uno o ambos genes adyacentes si estaban localizadas a <~100 Kb de distancia, ya sea secuencia arriba o secuencia abajo. El proyecto ENCODE ha revelado una gran cantidad de información, tal como los sitios de unión a factores de transcripción, y las CNV raras que se identificaron en el presente estudio se comprobaron por su posible impacto en estos sitios (se comprobó la anotación ENCODE del ensamblaje hg19) y a menudo se encontró que afectaban a los sitios de unión a factores de transcripción y/o estaban localizadas en regiones de ADN conservadas.
La Figura 9 muestra una ganancia intergénica que se encuentra secuencia arriba de CD180. El paciente MVGS995-4a tiene una duplicación homocigota y, aunque no se considera como una solución de<p>M<l>en la Tabla 7, es potencialmente una solución alternativa que puede estar causando o contribuyendo a la PML del paciente basándose en la expresión alterada de CD180. El gen tiene una biología relacionada con la inmunidad (véase la Tabla 6) y el análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) revela una interacción del gen de PML-419 con PLCG2 (véase la Tabla 7, 2 casos de PML tienen una solución para este gen).
La Figura 10 muestra una pérdida intergénica que se encuentra secuencia arriba de VDAC1. El paciente PML30 tiene una eliminación homocigota y, aunque no se considera como una solución de PML en la Tabla 7, es potencialmente una solución alternativa que puede estar causando o contribuyendo a la PML del paciente basada en la expresión alterada de VDAC1. El análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419 para VDAC1.
La Figura 11 muestra una pérdida intergénica que está secuencia abajo de EGR1 y ETF1. El paciente PML69 tiene una eliminación homocigota y, basándose en los vínculos de EGR1 con los genes de p ML-419 (Tabla 6) y su proximidad a EGR1 (~4 Kb de distancia), se añadió como una posible solución de PML en la Tabla 7. El análisis String (confianza alta = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) revela interacciones del gen de PML-419 con JUN, PTEN y TP53), pero no se encontró nada digno de mención en el análisis String de ETF1.
La Figura 12 muestra una pérdida intergénica que está secuencia arriba de ITSN2. El paciente PML65 tiene una eliminación homocigota y, basándose en los enlaces de ITSN2 con un gen de PML conocido (WAS) en la lista de genes de PML-419 (Tabla 6), se añadió como una posible solución de PML en la Tabla 7. Curiosamente, se encontró que otro caso de PML tenía una rara SNV homocigota en ITSN2, por lo que este gen tiene 2 soluciones de PML reportadas en la Tabla 7. El análisis String (alta confianza = 0.7, 1a capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen de PML-419.
Ejemplo 8
Los análisis de rutas, tal como las interacciones proteína-proteína, están proporcionando información valiosa sobre la biología subyacente de enfermedades complejas. Mientras que la<p>M<l>es una enfermedad muy rara que requiere varios factores concurrentes (p. ej., la infección por el virus de JC), múltiples genes pueden estar causando o aumentando independientemente el riesgo de desarrollar este trastorno neurodegenerativo basado en la presencia de una variante genética en un gen dado (p. ej., una variante heterocigótica en la que una variante deletérea está presente en el alelo heredado maternal o paternalmente, una variante homocigótica en la que la misma variante deletérea está presente en ambos alelos, o variantes heterocigotas compuestas en las que un par de variantes deletéreas están presentes pero una se encuentra en el alelo heredado por vía materna y la otra en el alelo heredado por vía paterna). Según la hipótesis planteada, la presencia de un trastorno genético por inmunodeficiencia era otro requisito previo. De hecho, en el estudio de PML descrito en el presente documento, 43 genes fueron propuestos como soluciones para 61 de 71 casos de PML (véase la Tabla 7) que fueron evaluados usando arreglo CGH y secuenciación del exoma completo. Se han desarrollado numerosos algoritmos y bases de datos asociadas para investigar vías moleculares, tal como String (véase, Szklarczyk et al., (2015), y las referencias citadas allí).
La Figura 13 muestra un ejemplo de análisis String realizado en los 43 genes considerados como soluciones de PML sobre la base de un modelo de enfermedad AD o AR. Se encontró una serie de interacciones para 21 de 43 genes, y en varios casos esto incluyó interacciones para genes implicados en 2 o más casos de PML que se reportan en la Tabla 7 (9 casos para TNFRSF11A, 4 casos para PLCG2, 3 casos para ZAP70 y NOD2, y 2 casos de PML para TICAM1).
Ejemplo 9
Para determinar la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar albergara una de las variantes descritas en el presente documento, se realizó el siguiente análisis: para cada variante o combinación de variantes, se utilizó la frecuencia específica de la etnia citada en la Tabla 7 para determinar la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar de la misma etnia no albergara la variante o combinación de variantes. Se calculó el producto de todas esas probabilidades (p. ej., la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar no albergara ninguna de las variantes) y se restó de 1, obteniéndose la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar albergara al menos una de las variantes. Se descubrió que, para los casos de VIH, la probabilidad de que un individuo aleatorio albergara al menos una de las variantes era del -5 %, lo que concuerda con el riesgo de PML previo a la HAART en el contexto del VIH. En los casos no relacionados con el VIH (principalmente MS/NTZ), el riesgo fue de ~ 1 %, lo que, de nuevo, es coherente con el riesgo de PML en la MS/NTZ, especialmente tras una terapia a largo plazo.
Estos análisis apoyan la noción de que las frecuencias de las variantes identificadas como relevantes para el riesgo de PML son consistentes con los riesgos reales observados para individuos no seleccionados. Los análisis se basan en la suposición razonable de que no existe ninguna conexión relevante para la PML con el riesgo de desarrollar VIH (una infección adquirida) y/o MS (p. ej., esto implica que el tratamiento de individuos sanos con Natalizumab, p. ej., resultaría en riesgos similares de PML). Cualquier desviación (p. ej., variantes encontradas en un número ligeramente mayor de individuos normales de lo esperado de acuerdo con el número realmente observado de afectados por PML) puede deberse a: penetrancia (p. ej., no todas las personas con las variantes tendrán el máximo riesgo de PML); la suposición de que los individuos con MS, VIH y otras condiciones subyacentes representaban una sección transversal normal (p. ej., con respecto al riesgo de PML) de la población general, antes de desarrollar los trastornos subyacentes VIH, MS, etc.; y la infravaloración de la PML, incluso en pacientes con VIH, MS/NTZ.
Ejemplo 10 - Tablas referenciadas en este estudio
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La Tabla 1 enumera todas las CNV de interés, obtenidas como se describe en el texto, con la excepción de que, para cada entrada, se anotan las posiciones originales de inicio y parada de la CNV, junto con el tamaño original de la CNV, tipo (pérdida heterocigota, pérdida o ganancia homocigota), ID del caso y anotación del gen (para la subregión de CNV NO CNV original). La última columna contiene los números de la SEQ_ID. En la Tabla 1 se utiliza la numeración cromosómica estándar utilizada por los expertos en la materia para los cromosomas autosómicos (1-22) pero, por comodidad con los métodos de análisis, el cromosoma X se designa en el presente documento como cromosoma 23. Todas las coordenadas se basan en hg18.
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La Tabla 2 es idéntica a la Tabla 1, con algunas excepciones. En primer lugar, las coordenadas de las CNV enumeradas se refieren a las subregiones de CNV reales que resultaron ser únicas o significativamente diferentes entre las cohortes de enfermedad y normales, a diferencia de la Tabla 1, que enumera las CNV originales. En segundo lugar, una columna adicional detalla si las subregiones génicas de CNV de interés se solapan con un exón o no. En tercer y cuarto lugar, 2 columnas adicionales detallan el número de casos normales y el número de casos de enfermedad que albergan la subregión de CNV relevante. Por último, 2 columnas informan de la prueba exacta de Fisher de 2 colas (FET) y de la razón de probabilidades (OR). En la Tabla 2 se utiliza la numeración cromosómica estándar utilizada por los expertos en la materia para los cromosomas (1-22) autosómicos, pero, por conveniencia con los métodos de análisis, el cromosoma X se designa como el cromosoma 23 en el presente documento. Todas las coordenadas están en hg18.
Tabla 3: Una lista no redundante de los genes enumerados en la Tabla 2
Para todos los genes listados en la Tabla 2 (es decir, aquellos relevantes para las subregiones de CNV de interés), la Tabla 3 representa una lista no redundante.
Tabla 4: Una lista no redundante de variantes de transcripción que corresponden a los enes de la Tabla 3
Para todos los genes listados en la Tabla 2 (es decir, aquellos relevantes para las subregiones de CNV de interés), la Tabla 4 representa una lista no redundante.
Tabla 5: El conjunto de SNV reportados en las Tablas 7-10, 14, o 15 que se encontraron en los 70 casos de PML en este estudio para los que se generaron datos de WES.
La Tabla 5 enumera, en orden de coordenadas genómicas, todas las variantes de un solo nucleótido (SNV) que son relevantes para el presente estudio, ya sea como soluciones a nivel de caso (Tablas 7, 8) o soluciones potenciales (Tablas 9, 10), o a nivel de análisis de carga de variantes (Tablas 14, 15). Todas las coordenadas del genoma se basan en hg19.
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La Tabla 6 es una lista completa de 419 genes ejemplares (denominados en el presente documento como "genes de PML-419" o "lista de genes de PML-419") interrogados en el presente estudio, junto con información relacionada con el patrón de herencia asumido para el análisis y la razón para la inclusión del gen. Fuentes de genes para la Tabla 6 (encabezado de columna "Fuente del gen"): 1) nominados sobre la base de estar relacionados con la inmunodeficiencia, tal como curados de bases de datos públicas (indicadas por 'Base de datos pública') como PubMed y ClinVar, 2) genes identificados por CNV de PBio ('PBio', véase la Tabla 6 encabezado de columna 'Fuente del gen') de un estudio de descubrimiento de genes CGH de arreglo de genoma completo de 71 casos de PML, o 3) curados de bases de datos públicas e identificados en el estudio de descubrimiento de genes PML de PBio (indicados por 'Ambos'). Se propuso una predisposición genética a PML sobre la base del genoma del huésped; es decir, la(s) variante(s) genética(s) de la línea germinal en el genoma del paciente con PML, en lugar de las variantes genéticas que están presentes en el virus de JC, son la causa de la PML del paciente (Hatchwell, Front Immunol., 6: 216 (2015). Detalles sobre la fuente de los genes en la lista de genes de PML-419 pueden encontrarse en las siguientes fuentes de genes relacionados con inmunodeficiencia e inmunidad: Durandy et al., Nat Rev Immunol., 13(7): 519-33 (2013); Milner et al., Nat Rev Immunol., 13(9): 635-48 (2013); Paciolla et al., Genes Immun., 16(4): 239-46 (2015); Hatchwell, Front Immunol., 6: 216 (2015); Thijssen et al., Nat Commun., 6: 7870 (2015); Chinn et al., Immunol Allergy Clin North Am., 35(4): 671-94 (2015); Zhou et al., Nat Genet., 48(1): 67-73 (2015); Navabi et al., Allergy Asthma Clin Immunol., 12: 27 (2016); y Tsujita et al., J Allergy Clin Immunol. (2016). Los genes de 'MySql' proceden de la base de datos ClinVar. Se realizaron búsquedas en ClinVar utilizando los términos "inmuno deficiencia" e "inmunodeficiencia". Se excluyeron las entradas que describían grandes reordenamientos genómicos, que contenían múltiples genes. Se compiló una lista no redundante de 125 genes combinando el resultado de las dos búsquedas y se depositó en una base de datos MySQL. NOTA: Un subconjunto de estos genes no están marcados como 'MySql' si aparecieron en uno o más de los artículos de revisión de genes inmunes señalados anteriormente. van der Kolk et al., Ann Clin Transl Neurol.; 3(3): 226-32 (2016) fue la fuente del conocido gen de PML BAG3 (véase abajo) y de 28 genes de PML candidatos en base a su conexión con el JCV. Van der Kolk et al., citan un método como el siguiente: "esto último se realizó buscando JCV en NCBI, y seleccionando genes en humanos". Esto produjo 30 genes humanos, 5 de los cuales se solapaban con la lista de genes de PML y 2 genes (HLA-DQB1, HLA-DRB1) fueron excluidos porque los loci HLA son difíciles de interpretar. Los genes ADA, BAG3, BTK, CD40LG, DOCK8, STAT1, WAS y WIPF1 se derivaron de Hatchwell, Front Immunol., 6: 216 (2015) (véase la Tabla 1 para las referencias primarias); van der Kolk et al., Ann Clin Transl Neurol., 3(3): 226 32 (2016); y Zerbe et al., Clin Infect Dis., 62(8): 986-94 (2016). Los genes de PBio se basan en estudios de CNV y un subconjunto se solapa con las listas de genes de la revisión inmunológica (anotados como 'Ambos' en el encabezado de la columna 'Fuente del gen'). Los genes de nivel 1 se utilizaron como posibles soluciones para los casos de PML. La determinación del modelo de enfermedad autosómica dominante (AD), autosómica recesiva (AR), dominante ligada al cromosoma X (XLD) o ligada al cromosoma X (XLR) para cada gen se derivó de los artículos de revisión de inmunodeficiencias y/o de las anotaciones de OMIM. Las entradas marcadas con 'asociación' indican que las variantes se asociaron con una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario; 'desconocido' indica que no hay pruebas en la bibliografía de un modelo de AD o AR.
La Tabla 7 contiene una única solución/explicación genética que es la causa potencial de PML en cada paciente del estudio (71 casos fueron evaluados con CGH de arreglo de genoma completo y 71 también fueron evaluados por secuenciación de exorna completo), con la excepción de 19 casos "no resueltos". Las soluciones se basan en una combinación de variantes CNV y SNV, conectadas por las SEQ ID a las tablas 1, 4 y 5. Para las soluciones de variantes homocigotas o heterocigotas compuestas, las frecuencias poblacionales esperadas se calcularon del siguiente modo:
Frecuencia de población esperada para la variante a (frecuencia p) y la variante b (frecuencia q) = pq/4
Por ejemplo, PML09 tiene 2 variantes, SEQ ID 1221 y 1222, con frecuencias individuales en la población normal de 0.00399, 0.287. La frecuencia esperada en una población normal emparejada étnicamente para esta combinación es (0.00399*0.287)*0.25 = 0.000286283 = 1/3,497.
Los identificadores de Enfermedad primaria de la Tabla 7 son: VIH, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana; MS (NZ Rx), esclerosis múltiple tratada con natalizumab; Otras, que incluye una variedad de trastornos/afecciones (MVGS694-6a tenía anemia aplásica, PML02 y PML52 tenían linfoma, PML45 y PML 57 tenían leucemia linfocítica crónica, PML53 tenía sarcoidosis y PML69 es un paciente con trasplante de riñón que recibía belatacept).
Las soluciones se consideraron con base en la presencia de variantes raras (CNV y/o SNV) en o cerca de genes que se enumeran en la Tabla 6. Los modelos de enfermedad autosómica recesiva (AR) y autosómica dominante (AD) comprenden este conjunto de soluciones, basadas en la búsqueda de SNV homocigóticas, CNV homocigóticas, SNV heterocigóticas compuestas o SNV heterocigóticas. Nueve casos de PML de la Tabla 7 se consideraron 'no resueltos' sobre la base de analizar tanto los datos de CNV como los de SNV, y un caso (PML67) se evaluó sólo para CNV ya que los datos de WES no estaban disponibles. En algunos casos, se consideró que un caso no tenía solución óptima (Tabla 7), pero en el Tabla 8 se indicaron soluciones alternativas (véase más abajo).
Para los casos de PML que tenían más de una solución potencial. En estos casos, la 'mejor' solución (Tabla 7) se determinó en función de la rareza de la(s) variante(s) genética(s) y de la fuerza relativa de la biología de los genes de PML-419 (Tabla 6). En la Tabla 8 se presentan soluciones alternativas. Por ejemplo, para el caso de PML MVGS 1116-8a, se encontraron tres soluciones, que afectaban a los genes DOCK8, HIv Ep2 y RNF168. En este ejemplo, las SNV heterocigotas compuestas DOCK8 (Tabla 7, SNV hom:SNV het) fueron seleccionados como la mejor solución porque DOCK8 es un gen de PML conocido. En otro ejemplo, el caso de PML MVGS 1359 tiene IL17F (het s Nv ) listado como la mejor solución en la Tabla 7 porque es más raro que las soluciones alternativas para los genes ATR y STXBP2.
Mientras que algunos pacientes con PML pueden tener múltiples genes/variantes causando y/o contribuyendo a su PML, en muchos pacientes con PML sólo un único gen será la causa primaria análoga a los pacientes diagnosticados con trastornos de inmunodeficiencia primaria. Además de las soluciones alternativas de la Tabla 8, que se basan únicamente en los resultados genéticos de SNV, en la Tabla 1 se presentan otras soluciones alternativas basadas en los resultados genéticos de CNV.
Tabla 8: Soluciones/explicaciones enéticas alternativas como posible causa de la PML en el estudio
La Tabla 8 contiene información análoga a la de la Tabla 7, con la excepción de que Etnia, Sexo y Enfermedad primaria no se repiten. La Tabla 8 contiene soluciones/explicaciones genéticas alternativas como causa potencial de la PML para los pacientes del estudio (71 casos se evaluaron con CGH de arreglo de genoma completo y 70 se evaluaron también mediante secuenciación del exorna completo). Las soluciones de la Tabla 8 también se refieren a casos concretos y representan soluciones alternativas secundarias para los casos enumerados (utilizando los mismos criterios empleados para identificar posibles soluciones en la Tabla 7). En otras palabras, para algunos individuos se identificó más de una solución razonable y, aunque las de la Tabla 7 se consideran las más probables, las de la Tabla 8 también son soluciones potenciales. Los expertos en la materia pueden apreciar que los datos adicionales sobre nuevos casos de p Ml , pacientes con trastornos de inmunodeficiencia de base genética o estudios funcionales sobre un gen determinado pueden respaldar la selección de una solución de la Tabla 8 como la 'mejor' solución única (es decir, una solución actual de la Tabla 7 podría considerarse en su lugar como una solución de la Tabla 8, y viceversa).
La Tabla 9 enumera, para cada caso (en múltiples filas), las variantes para las que no fue posible, utilizando los datos de secuenciación del exorna completo (WES) disponibles, determinar la fase (es decir, si dos variantes están en cis - en el mismo cromosoma - o trans - en cromosomas opuestos). Determinar la fase es una consideración importante cuando se trata de trastornos que se evalúan sobre una base autosómica recesiva (AR). Si se sabe que están presentes dos variantes, pero es imposible determinar si están en cis o en trans, entonces es imposible concluir que ambas copias del gen están afectadas, a diferencia de sólo una (aunque con 2 variantes). Este problema no se plantea en el caso de las variantes homocigotas, para las que es obvio que las variantes deben estar en trans (es decir, sólo es un problema para las variantes no idénticas). Todas las coordenadas del genoma se basan en la construcción hg19.
En resumen, la Tabla 9 enumera todas las soluciones de SNV heterocigotas compuestas a nivel de caso sin desfasar, que podrían representar otras soluciones a nivel de caso, si desfasar hubiera sido posible. Además, puede ser apreciado por los expertos en la materia que las soluciones sin desfasar reportadas en la Tabla 9 (2 SNV het por gen) o la Tabla 10 (véase abajo, que reporta SNV het en pacientes que también tienen una CNV reportada en la Tabla 1) pueden potencialmente causar o contribuir a la PML del paciente si el análisis genético de seguimiento revela que el par de variantes están en diferentes alelos (es decir, cada copia del gen impactada por una variante). Las variantes reportadas en las Tablas 1, 9 o 10 también pueden resultar ser significativamente deletéreas por sí solas (p. ej., en estudios funcionales en células derivadas de pacientes, modelos animales, etc.) y constituir así una solución de modelo de AD (es decir, los genes actualmente enumerados como modelo 'AR' en la Tabla 6) pueden ser causales o contribuir a la enfermedad a través de un modelo AD o AR, al igual que varios genes ya conocidos como AD o AR (Tabla 6, modelo de enfermedad 'AD AR').
La Tabla 10 es una lista de todas las SNV heterocigotas que son potencialmente heterocigotas compuestas con una CNV en el alelo. Véase el texto para una explicación más completa. Todas las coordenadas del genoma se basan en la construcción hg19.
Tabla 11: Clave que relaciona la ID de la muestra para los casos de PML con los números de ID del caso de
PML
La Tabla 11 provee la ID de la muestra y la ID del caso de PML (ID experimental para datos de CGH) para 77 'casos de p Ml ' (incluye 6 casos de VIH sin PML listados como controles).
Tabla 12: Lista no redundante de variantes de transcripción que corresponden al conjunto de genes de los que no se han reportado 'soluciones' de CNV en los 71 casos de PML
La Tabla 12 enumera todas las variantes de transcripción para los genes de la Tabla 6 que no fueron 'descubiertas' por PBio sobre la base de aCGH (genes identificados por CNV). Las SEQ ID NOs corresponden a variantes de transcripción (a menudo más de una por gen).
Tabla 13: Genes para los que la carga total de variantes heterocigotas dañinas resultó ser estadísticamente mayor en los casos de PML frente a los controles del ExAC
La Tabla 13 enumera los genes para los cuales la carga total de variantes heterocigotas dañinas fue encontrada estadísticamente mayor en los casos de PML versus los controles del ExAC. El análisis de la carga génica se realizó tal y como se describe a continuación con valores de corte de la frecuencia alélica menor (MAF) de 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 y 0.05. No todos los genes sobrevivieron al análisis estadístico en todos los cortes de MAF. Para cada gen que sobrevivió a múltiples cortes de MAF, se calcularon los promedios de la prueba exacta de Fisher (FET), nominal y corregida, así como las demás métricas relevantes. Dos genes se solaparon entre los análisis de AFR y EUR. Las FET se corrigieron para pruebas múltiples con el número de genes utilizado en este estudio (419). Sólo se consideraron para su inclusión los genes para los que FET corregida era < 0.05 y en los que las variantes afectaban a > 10 % de los casos dentro de la etnia dada (>2 para AFR, >4 para EUR).
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La Tabla 14 enumera el nivel superior de variantes que se consideraron significativas sobre la base del análisis de carga de variantes, tal como se describe a continuación. Para cada variante (las coordenadas del genoma se basan en UCSC hg19), se presenta información detallada del número de casos EUR y AFR que portan la variante, junto con las métricas estadísticas agregadas y específicas de cada etnia.
La Tabla 15 enumera el segundo nivel de variantes que se encontraron sobre la base del análisis de carga de variantes, tal como se describe a continuación. Para cada variante (las coordenadas del genoma son UCSC hg19), se presenta información detallada del número de casos EUR y AFR que portan la variante, junto con las métricas estadísticas agregadas y específicas de la etnia.
Tabla 16: Posible escenario de pruebas, basado en los principales resultados de car a de variantes
La Tabla 16 enumera un escenario de prueba potencial, basado en los resultados de carga de variantes principales (reportados en la Tabla 14). El análisis es meramente ilustrativo, reconociéndose que pueden obtenerse mayores rendimientos diagnósticos ensayando un mayor número de variantes, incluidas las enumeradas en la Tabla 15. Se dan ejemplos de rendimiento diagnóstico utilizando variantes únicas, así como diversas combinaciones, incluido el uso de las 4 variantes principales. Para este conjunto de variantes, el método de prueba se describe como genotipado, a diferencia de la secuenciación de genes completos (es decir, la determinación del estado en cada una de las bases, que arroja un resultado binario, a diferencia de la identificación de variantes en otras partes de los genes relevantes).
Tabla 17: Posible escenario de pruebas utilizando genes identificados con una mayor carga de variantes heterocigotas perjudiciales en la cohorte de PML
La Tabla 17 enumera un escenario de prueba potencial usando genes identificados por tener una mayor carga de variantes dañinas heterocigotas en la cohorte de PML (véase la Tabla 13). La naturaleza del método de ensayo es la 'secuenciación de genes', ya que las variantes no se conocen de antemano - en un ensayo de este tipo deben tenerse en cuenta todas y cada una de las variantes potencialmente perjudiciales.
Tabla 18: Resumen de enes que sobreviven los análisis de casos, car a énica /o car a de variantes
La Tabla 18 representa un resumen de los genes que sobreviven a los análisis a nivel de caso (2 o más ejemplos en las Tablas 7, 8), de carga génica y/o de carga de variantes (basados en las Tablas 13 y 14). Cabe destacar que PLCG2 satisface los 3 criterios (2 o más ejemplos, en la Tabla 8, presencia en las Tablas 13, 14). Este resumen demuestra que muchos genes han sido identificados como significativos sobre la base de métodos de análisis independientes.
Ejemplo 11 - Figuras referenciadas en este estudio
Las Figuras 1-12 representan ejemplos de datos de CNV del estudio de descubrimiento del gen de PML (71 casos de PML, (véase la Tabla 7 para información de pacientes) usando arreglo de CGH (métodos descritos en el presente documento). En cada figura/dibujo: 1) las coordenadas del genoma se enumeran en la parte superior (ensamblaje hg18, número de cromosoma y posición representada); 2) la pista de datos 1 (marcada como 'Genes') representa la ubicación de los genes de RefSeq (los exones son porciones de color gris oscuro de las barras, los intrones son porciones de color gris claro de las barras); 3) la pista de datos 2 (marcada como 'Cohorte Normal') representa el tamaño y la ubicación de las CNV encontradas en la cohorte de NVE (base de datos de control propiedad de PBio que consiste en hallazgos de CNV en sujetos aparentemente sanos - es decir, normales, ver métodos en el presente documento) con el eje y correspondiente al número de sujetos de NVE que tienen la CNV; y 4) las pistas de datos restantes son datos de CNV encontrados en pacientes individuales de PML donde el eje y corresponde a la relación log2 (véanse los métodos en el presente documento), los puntos representan sondas individuales en el microarreglo, y los segmentos de línea están desplazados positivamente (ganancia de número de copias) o negativamente (pérdida de número de copias) basado en la salida de DNAcopy, el algoritmo de llamada de CNV. Las relaciones log2 típicas para ganancias y pérdidas en la micromatriz Agilent 1M (véanse los métodos en el presente documento) y nuestros protocolos experimentales son: 0.6 para las duplicaciones, 1.0 para las triplicaciones (o duplicaciones homocigotas), -1.0 para las eliminaciones heterocigotas y <-2 (a menudo de -4.0 a -6.0) para las eliminaciones homocigotas. Los genes relevantes se marcan en la pista de datos 'Genes'.
La Figura 1 representa un ejemplo de un gen afectado por CNV de línea germinal y adquiridas. Las CNV de línea germinal que afectan al gen PRKCB incluyen al paciente PML50 con una pérdida heterocigota intrónica de 4.8 Kb (también encontrada en 7 sujetos normales) y al paciente PML11 con una ganancia intrónica de 7.3 Kb (también encontrada en 1 sujeto normal). Se encontraron CNV adquiridas en 6 pacientes con PML, una serie de ganancias en ~23.9 Mb con relaciones log2 variables, sugestivas de una población celular mixta (los experimentos de arreglo CGH se realizaron en ADN genómico derivado de la sangre).
La Figura 2 representa un ejemplo de genes potencialmente relevantes para PML (TNFRSF13C y CENPM) afectados por CNV adquiridas. Se encontraron CNV adquiridas en 9 pacientes con PML, una serie de ganancias en ~40.6 Mb con relaciones log2 variables, sugestivas de una población celular mixta (los experimentos de arreglo CGH se realizaron en ADN genómico derivado de la sangre). Los 9 pacientes con PML (véase la Tabla 7 para la información sobre los pacientes) tenían un diagnóstico primario de VIH y eran de género (3 mujeres y 6 hombres) y etnia mixtos (4 de ascendencia africana y 5 de ascendencia europea).
La Figura 3 representa un ejemplo de un gen afectado por CNV. En el paciente PML26 se detectó una pérdida heterocigota intrónica de 7.2 Kb (no encontrada en sujetos normales, pero se encuentra una pérdida adyacente en 8 sujetos normales) que afecta al gen PKHD1. Se encontraron<c>N<v>en 3 pacientes con PML, una serie de ganancias en ~51.9 Mb con relaciones log2 variables, sugestivas de una población celular mixta (los experimentos de arreglo CGH se realizaron en ADN genómico derivado de la sangre).
La Figura 4 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV. La eliminación intrónica de 14.7 Kb afecta al gen BMPR2. Se detectaron eliminaciones heterocigotas en los pacientes PML58 y MVGS811-13a (también encontradas en 2 sujetos normales), y se detectó una eliminación homocigótica en el paciente PML29 (ninguna encontrada en sujetos normales). Los tres pacientes con PML son varones y su enfermedad primaria es el VIH (véase la Tabla 7).
La Figura 5 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV. La ganancia exónica de 10.2 Kb interrumpe el gen COMMD6. Dos pacientes con PML, PML29 y MVGS811-13a, tienen una duplicación homocigota (relación log2 comparable a triplicaciones) basada en la observación de que los sujetos de 1000 genomas se informa que tienen esta ganancia (véase la variante esv3632749 de DGV del ensamblaje hg19, que informa que 148 de 2504 sujetos tienen esta ganancia; no se encontraron normales en la base de datos de NVE de PBio). Ambos pacientes con PML son varones y su enfermedad primaria es el VIH (véase la Tabla 7).
La Figura 6 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV. La ganancia exónica de 27.4 Kb interrumpe el gen KCTD7 y el punto de rotura derecho está 16-90 Kb secuencia arriba de las variantes de transcripción RABGEF1 (RefSeq: NM_001287060, NR_104676, NM_014504, NM_001287062, NM_001287061). El paciente PML29 tiene una duplicación homocigota (relación log2 comparable a triplicaciones) basado en la observación de que los sujetos de 1000 genomas se informa que tienen esta ganancia (véase la variante esv3606925 de DGV del ensamblaje hg19, que informa que 28 de 2504 sujetos tienen esta ganancia; no se encontraron normales en la base de datos de NVE de PBio). El paciente PML63 tiene una duplicación. Ambos pacientes con PML son varones de ascendencia africana y su enfermedad primaria es el VIH (véase la Tabla 7).
La Figura 7 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV. La ganancia exónica de 344 Kb interrumpe los genes FPR2 y ZNF616 (a través de los puntos de ruptura izquierdo y derecho) y los genes adicionales totalmente englobados por esta CNV son: FPR3, ZNF350, Z<n>F350-<a>S1, ZNF432, ZNF577, ZNF613, ZNF614, ZNF615, ZNF649, ZNF649-AS1, ZNF841. El paciente PML03 tiene una duplicación homocigota (relación log2 comparable a triplicaciones) basada en la observación de que 3 sujetos normales (base de datos de NVE de PBio) se encuentran con una duplicación de esta región, junto con el paciente PML10. Ambos pacientes con PML son mujeres de ascendencia europea y sus enfermedades primarias son el VIH y la MS (véase la Tabla 7).
La Figura 8 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV. La eliminación exónica de 1.1 Kb afecta a los genes PIk 3c D y PIK3CD-AS1 (el símbolo del gen anterior era C1orf200). Se detectó una eliminación homocigota en el paciente MVGS811-13a y esta pérdida (heterocigota u homocigota) no se encontró en sujetos normales ni en la base de datos pública de<c>N<v>de DGV. El paciente con PML es un varón y su enfermedad primaria es el VIH (véase la Tabla 7). Se presume que es de ascendencia EUR (no se disponía de etnias para las muestras de MVGS).
La Figura 9 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV intergénica. La ganancia intergénica de 16.7 Kb tiene un punto de rotura a la izquierda que se encuentra 105 Kb secuencia arriba del gen CD180 (variante de transcripción de RefSeq NM_005582). El paciente MVGS995-4a tiene una duplicación homocigota (relación log2 comparable a triplicaciones) basado en la observación de que los sujetos de 1000 genomas se informa que tienen esta ganancia (véase la variante esv3605336 de DGV del ensamblaje hg19, que informa que 2 de 2504 sujetos tienen esta ganancia; no se encontraron normales en base de datos de NVE de PBio). El paciente con PML es un varón de ascendencia europea y su enfermedad primaria es la MS (véase la Tabla 7).
La Figura 10 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV intergénica. La eliminación homocigota intergénica de 7.7 Kb tiene un punto de rotura a la izquierda que se encuentra 3-4 Kb secuencia arriba de las variantes de transcripción VDAC1 (RefSeq: NM_003374, NR_036625, NR_036624). Esta pérdida (heterocigota u homocigota) no se encontró en sujetos normales ni en la base de datos pública de CNV de DGV. El paciente PML30 es un varón de ascendencia europea y su enfermedad primaria es el VIH (véase la Tabla 7).
La Figura 11 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida intergénica de CNV. La eliminación homocigota intergénica de 6.8 Kb tiene un punto de rotura a la izquierda que está 4 Kb secuencia abajo de la variante de transcripción EGR1 (RefSeq: NM_001964) y 26 Kb secuencia abajo de las variantes de transcripción ETF1 (RefSeq: NM_001256302, NM_004730, NM_001282185, NM_001291975, NM_001291974). Se encontró que esta pérdida era homocigota en 1 sujeto normal y también se informó de la pérdida en la base de datos pública de CNV de DGV (véase la variante esv3606925 de DGV del ensamblaje hg19, que informa de que 33 de 2504 sujetos tienen esta pérdida, se desconoce si los sujetos son homocigotos o heterocigotos). El paciente PML69 es un varón de ascendencia europea y su enfermedad (afección) principal es el trasplante de riñón (véase la Tabla 7, reportado como 'Otros'). El paciente PML69 fue tratado con CTLA4-Ig (belatacept, un bloqueador de la coestimulación de CD28-B7 e inductor de anergia de las células T). La vía CD28 incluye vínculos con el hallazgo genético del paciente (p. ej., eliminación homocigota adyacente al gen EGR1) y varios otros genes que pueden estar relacionados con la inmunodeficiencia (p. ej., CD40LG, ITK, LCK, LRBA, PIK3CD, PIK3R1, PLCG2, WAS y ZAP70) (Dekeyser M et al., Foro Abierto de Enfermedades Infecciosas, 2016 (Anergia de células T refractaria y leucoencefalopatía multifocal progresiva rápidamente mortal tras terapia prolongada con CTLA4).
La Figura 12 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV intergénica. La eliminación homocigota intergénica de 5.6 Kb tiene un punto de rotura a la izquierda que se encuentra 20 Kb secuencia arriba de las variantes de transcripción ITSN2 (RefSeq: NM _019595, NM_006277, NM_147152). Se encontraron pérdidas heterocigotas en 50 sujetos normales y también se informó de la pérdida en la base de datos pública de CNV de DGV (véase la variante esv3590068 de DGV del ensamblaje hg19, que informa de que 222 de 2504 sujetos tienen esta pérdida, se desconocen los sujetos homocigóticos frente a los heterocigóticos). El paciente PML65 es un varón de ascendencia africana y su enfermedad principal es el VIH (véase la Tabla 7).
La Figura 13 representa un ejemplo de interacciones proteicas conocidas y/o predichas utilizando la base de datos String (string-db.org; véase Szklarczyket al.,(2015) y las referencias citadas allí). Una lista no redundante de todos los genes reportados en la Tabla 7 (43 genes, que incluyen aquellos cuya expresión fue inferida para ser impactada por una CNV intergénica cercana) como mejores soluciones/explicaciones para 61 de 71 casos de PML (11 casos de PML son reportados como 'no resueltos', incluyendo, 1 caso para el cual sólo se obtuvieron datos de CGH) fue evaluada usando la base de datos String. La 'puntuación de interacción mínima requerida' se fijó en 'confianza alta (0.7)' y no se añadieron 'interactuadores' adicionales. De los 43 genes de entrada, se encontró que 21 tenían interacciones de alta confianza, tal como se muestra en la figura, junto con la anotación del número de casos de PML que tenían cada uno de estos genes como solución/explicación (p. ej., se encontró que 3 casos de PML en la Tabla 7 tenían una solución PLCG2).
Ejemplo 12 - Análisis de la carga génica
El análisis de la carga génica se realizó de la siguiente manera. Utilizando una serie de scripts propios y datos descargados del ExAC (exac.broadinstitute.org), se realizó un recuento de todas las variantes presentes en cada uno de los 419 genes enumerados en la Tabla 6. Cada variante se clasificó en función de si se consideraba perjudicial (sobre la base de al menos uno de los algoritmos de predicción SIFT, PolyPhen2 o MutationTaster) o no perjudicial, heterocigota u homocigota. Esto se realizó en paralelo para las variantes de PML y las encontradas en el ExAC. No se utilizaron los datos del ExAC cuya calidad/cobertura era < 80 % de lo esperado y, por lo tanto, no se pudo realizar el análisis de la carga génica.
A continuación, se realizó una comparación específica de cada etnia (EUR o AFR solamente, había muy pocos casos LAT para este tipo de análisis) para cada una de las 4 categorías:
• Homocigoto perjudicial
• Homocigoto no perjudicial
• Heterocigoto perjudicial
• Heterocigoto no perjudicial
Para las 4 categorías, variantes con cortes de frecuencia alélica menor (MAF) de 0.01, 0.02. 0.03. 0.04, 0.05 y 0.1.
Para cada comparación, razón de probabilidades (OR) y prueba exacta de Fisher (FET) fueron calculados para la comparación de números de casos de PML con al menos una variante del tipo en consideración y aquellos en el ExAC. La corrección por pruebas múltiples se realizó multiplicando la FET por el número de genes considerados (419). Sólo los genes para los que la FET corregida fue < 0.05 se incluyeron en la Tabla 13, que contiene datos sobre los valores promedio para un gen dado en todos los MAF que pasaron la corrección de FET. En la práctica, sólo la categoría de heterocigotos dañinos produjo genes significativos.
Ejemplo 13 - Análisis de carga de variantes
Para cada variante identificada en al menos un caso de PML, se realizó un recuento para obtener la frecuencia de la misma variante en el conjunto de la cohorte. Estos datos agregados se compararon con los recuentos de la misma variante notificados en el ExAC. Los datos del ExAC se filtraron por calidad/cobertura y el análisis de la carga de variantes no se realizó si la cobertura del ExAC era < 80 % de la esperada.
El análisis de la carga de variantes se realizó por separado para las cohortes EUR (n = 44 casos) y AFR (n = 21 casos) (la cohorte LAT era demasiado pequeña) y se calcularon los valores de OR y FET. A partir de este análisis, sólo se consideraron las variantes con OR>1 (es decir, potencialmente indicativas de un mayor riesgo de PML) para ambas etnias (AFR y EUR) y para las que la frecuencia del ExAC de la variante era <5 %. Además, sólo se consideraron de primer nivel aquellas variantes cuya frecuencia en la cohorte específica de la etnia era >10 % (5 o más casos EUR, 3 o más casos AFR) (Tabla 14), aunque otras variantes se han tabulado en la Tabla 15.
Ejemplo 14 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML
La Tabla 16 proporciona marcadores ejemplares para crear una prueba de predicción de riesgo de PML de bajo coste y simple (SNV específicas de genotipo). Se podrían idear otros ejemplos similares a partir de otras SNV reportadas en las Tablas 14 y 15. Se podrían utilizar diferentes combinaciones de SNV de las Tablas 14, 15 en pruebas de complejidad variable, para desarrollar una prueba que produjera mayores rendimientos de diagnóstico que el ejemplo superior de la Tabla 16 (es decir, 40 %).
La Tabla 17 proporciona genes ejemplares que podrían incluirse en una prueba de secuenciación de panel de genes para la predicción del riesgo de PML. Otros ejemplos podrían elaborarse de forma similar a partir de los genes descritos en la Tabla 13, o de otras tablas divulgadas en el presente documento.
La Tabla 9 contiene variantes de 'ejemplo' que pueden ser consideradas como causas de 'AD' de inmunodeficiencia (es decir, la presencia de sólo 1 de las 2 SNV het reportadas en un paciente dado puede estar causando inmunodeficiencia), lo que puede aumentar el riesgo de PML. Por ejemplo, esto puede ser un escenario más probable para SNV het que son 'novedosas' en la base de datos del ExAC (es decir, no se encuentran en la población general), y aún más probable si tales SNV novedosas se encuentran en >=2 casos de PML (independientemente del modelo de enfermedad invocado). Ejemplos de ello son los 3 genes siguientes:
- AK2, 2 casos (Tabla 9)
chr1:33476435, C>A, novedosos en el ExAC
PML20 y PML33, AFR y EUR, ambos con VIH
EPG5, 2 casos (Tabla 9)
cr18: 43445601, T>G, novedosos en el ExAC
PML25 y PML27, ambos EUR, ambos con VIH
- TNFRSF11A, 9 casos (Tabla 7)
cr18: 60052034, A>C, novedosos en el ExAC
véase la Tabla 7 para los ID de los casos, 2 AFR y 7 EUR, todos con VIH
Puede ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que los genes de inmunodeficiencia actualmente conocidos por causar la enfermedad AR pueden potencialmente causar la enfermedad AD. Numerosos ejemplos han sido reportados en la bibliografía, incluyendo, varios de los genes listados en la Tabla 6 (p. ej., Modelo de enfermedad se indica como AD_AR para 32 genes, tal como ADAR y TICAM1).
Ejemplo 15 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML con un panel de 96 genes
La Tabla 19 contiene un panel ejemplar de 96 genes basado en genes que fueron encontrados con al menos un caso de PML de las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos una solución 'a nivel de caso') indicados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basadas en valores de 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 19. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.
Tabla 19: panel eemplar de 96 enes
El número no redundante de casos de PML y el rendimiento diagnóstico están listados en las 2 últimas filas de la Tabla 19. En concreto, una prueba que incluyera los 96 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 95.7 % basado en los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.
Ejemplo 16 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML con un panel de 39 genes
La Tabla 20 contiene un panel ejemplar de 39 genes basado en genes que fueron encontrados con múltiples casos de PML de las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos dos soluciones 'a nivel de caso') reportados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basadas en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 20. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.
Tabla 20: panel eemplar de 39 enes
El número no redundante de casos de PML y el rendimiento diagnóstico están listados en las 2 últimas filas de la Tabla 20. En concreto, una prueba que incluyera los 39 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 81.4 % basado en los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.
Ejemplo 17 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML con un panel de 23 genes
La Tabla 21 contiene un panel ejemplar de 23 genes basado en genes que fueron encontrados con múltiples casos de PML de las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos tres soluciones 'a nivel de caso') de los que se informaba en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basadas en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 21. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.
Tabla 21: panel eemplar de 23 enes
El número no redundante de casos de PML y el rendimiento diagnóstico están listados en las 2 últimas filas de la Tabla 21. En concreto, una prueba que incluyera los 23 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 71.4 % basado en los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.
Ejemplo 18 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML con un panel de 15 genes
La Tabla 22 contiene un panel ejemplar de 15 genes basado en genes que fueron encontrados con múltiples casos de PML de las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos cuatro soluciones 'a nivel de caso') de los que se informaba en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basadas en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 22. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.
Tabla 22: panel eemplar de 15 enes
El número no redundante de casos de PML y el rendimiento diagnóstico están listados en las 2 últimas filas de la Tabla 22. En concreto, una prueba que incluyera los 15 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 55.7 % basado en los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.
Ejemplo 19 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML con un panel de 11 genes
La Tabla 23 contiene un panel ejemplar de 11 genes basado en genes que fueron encontrados con múltiples casos de PML de las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos cinco soluciones 'a nivel de caso') reportados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basados en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 23. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores 'PML_ALL_FET' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.
Tabla 23: panel eemplar de 11 enes
El número no redundante de casos de PML y el rendimiento diagnóstico están listados en las 2 últimas filas de la Tabla 23. En concreto, una prueba que incluyera los 11 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 47.1 % basado en los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.
Ejemplo 20 - Pruebas ejemplares de predicción del riesgo de PML con un panel de 10 genes
La Tabla 24 contiene un panel ejemplar de 10 SNV basado en los 7 SNV principales de la Tabla 14 y 3 SNV de la Tabla 15 (basado en genes solapados entre 14 y 15: IGLL1, MAVS, SHAr P iN). En concreto, utilizando los 10 SNV principales (7 de la Tabla 14, junto con 3 de la Tabla 15, que residen en genes ya seleccionados de la Tabla 14), se realizó un recuento aditivo (columna "Total aditivo de casos (no redundante)") para determinar cuántos casos de PML tenían al menos una de las variantes cuando éstas se consideraban en orden (p. ej., columna "Orden (FET)": '1', primero, seguido de '1' '2', seguido de '1' '2' '3', etc.). Dado que algunos individuos albergan más de una variante, el recuento aditivo no es igual a la suma simple de los números de casos de PML para cada variante (columna "Total de casos por SNV"). Todas las coordenadas del genoma se basan en la construcción hg19.
Se realizó un conteo aditivo para los sujetos del ExAC (columna "sujetos del ExAC totales aditivos (redundante)"), de la siguiente manera: i) Se calculó el tamaño promedio de la cohorte para el ExAC para todas las variantes; ii) Cada conteo total de sujetos (todas las etnias) fue normalizado a este tamaño promedio de cohorte. El recuento aditivo del ExAC representa una adición simple: marcado como "redundante" en la columna " sujetos del ExAC totales aditivos (redundante)", porque no se dispone de información relativa a la posible presencia de múltiples variantes en el mismo individuo; iii) se calcularon las razones de probabilidades (OR) y los valores de la prueba exacta de Fisher (FET) (columnas "PML ALL OR aditiva" y "PML ALL FET aditiva").
IJ 83 Puede ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que los paneles de genes arriba mencionados fueron seleccionados basados en los presentes hallazgos genéticos en 70 casos de PML. Además, puede añadirse al panel de genes un gen no seleccionado actualmente para ninguno de estos paneles de genes ejemplares. Por ejemplo, los genes en los que sólo se encontró 1 caso de PML con variantes que cumplían los criterios pueden añadirse al panel de genes si la validación genética en casos adicionales de PML muestra que un gen "n=1 caso" está afectado por más de 1 caso de PML cuando los datos se examinan para un nuevo conjunto de casos de PML. En algunos casos, pueden añadirse genes adicionales (p. ej., genes ligados a PML como DOCK8, BAG3, STAT1) al panel de genes.
Ejemplo 21 - Identificar variaciones genéticas adicionales
Los métodos y protocolos descritos en los ejemplos anteriores pueden utilizarse para identificar cualquier posible variación genética. Se pueden generar datos comparando las variaciones genéticas identificadas en 2 cohortes: 1) cohorte no enferma que incluye 1000 individuos no enfermos (p. ej., individuos sin PML); y 2) cohorte enferma que incluye 100 individuos enfermos (p. ej., individuos con PML). Los individuos de las cohortes pueden estar emparejados por sexo y/o etnia. Las variaciones genéticas presentes en la cohorte no enferma y en la cohorte enferma pueden identificarse utilizando el análisis de CNV (p. ej., descrito en el Ejemplo 2) o la secuenciación del exoma completo (p. ej., descrita en el Ejemplo 3). Se identifican dos nuevas variaciones genéticas, CNV_1 (localizada en el gen #1) y CNV_2 (localizada en el gen #2), p. ej., comparando los datos de la secuencia con una secuencia de referencia (p. ej., UCSC hg19). Los datos de una base de datos de CNV creada utilizando datos de CNV de todo el genoma en sujetos sanos (o individuos sin PML) como el motor de variación normal (NVE) descrito en el presente documento se pueden utilizar para determinar si una CNV encontrada en una cohorte de PML se produce con mayor frecuencia o no en comparación con el NVE. Del mismo modo, las SNV identificadas en una cohorte de PML pueden ser interpretadas por la relevancia potencial para PML utilizando los recursos disponibles públicamente del Exome Aggregation Consortium (ExAC) o la base de datos de agregación del genoma (gnomAD) [Lek M et al., Nature. Agosto de 2016 18; 536(7616):285-91]; es decir, obtener datos de frecuencia (p. ej., frecuencia específica de una etnia) para las variantes consideradas. En otros casos, se pueden crear bases de datos de CNV para la evaluación de CNV para una variedad de etnias (p. ej., sujetos de ascendencia africana y latina) para determinar la relevancia de una CNV en una cohorte de PML en comparación con una base de datos de CNV emparejada étnicamente en individuos sin PML y/o utilizando datos específicos étnicos de bases de datos de CNV disponibles públicamente como la Base de Datos de Variantes Genómicas [MacDonald J et al., Nucleic Acids Res. Enero de 2014; 42 (número de base de datos):D986-92]. En un ejemplo, 20 de los 100 individuos enfermos tienen CNV_1, y sólo 10 de los 1000 individuos no enfermos tienen CNV_1. En otro ejemplo, 10 de los 100 individuos enfermos tienen CNV_2, y sólo 5 de los 1000 individuos no enfermos tienen CNV_2. El valor p puede calcularse utilizando pruebas estándar, tal como la prueba exacta de Fisher (FET), y los datos pueden seleccionarse utilizando un determinado valor de significancia. Por ejemplo, se incluyen las variaciones genéticas con un valor p inferior a 0.05. Además, la frecuencia y la razón de probabilidades de las dos variaciones genéticas pueden calcularse y resumirse en una tabla ejemplar:
Un sujeto sin CNV_1, CNV_2, o ambos, puede tener un riesgo disminuido de PML debido a una infección del cerebro por el virus John Cunningham (JCV), y por lo tanto se le puede administrar un medicamento inmunosupresor, tal como natalizumab.
Otras variaciones genéticas como SNV pueden ser identificadas usando el mismo método descrito anteriormente.
Aunque se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas de la presente invención, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan únicamente a modo de ejemplo. La invención puede modificarse dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un medicamento inmunosupresor para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que necesita terapia con medicamentos inmunosupresores,
en el que el sujeto tiene un menor riesgo de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) debida a una infección del cerebro por el virus John Cunningham (JCV),
en el que la disminución del riesgo del sujeto se debe a la ausencia de una variación genómica seleccionada del grupo que consiste en: chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A, y en la que la posición cromosómica de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19.
2. Un medicamento inmunosupresor para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la afección es un cáncer, un trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune;
opcionalmente, en el que el sujeto es un sujeto humano.
3. Un medicamento inmunosupresor para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la afección es una enfermedad autoinmune,
que se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Addison, encefalitis por receptor anti-NMDA, síndrome anti sintetasa, anemia aplásica, anemias autoinmunes, anemia hemolítica autoinmune, pancreatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, trastornos ampollosos de la piel, enfermedad celíaca - esprúe (enteropatía sensible al gluten), síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucemia linfocítica crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, enfermedad de Devic, eritroblastopenia, síndrome de Evans, glomeruloesclerosis segmentaria focal, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedades autoinmunes mediadas por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, miastenia gravis, mieloma, linfoma no Hodgkin, síndrome opsoclono mioclono (OMS), penfigoide, penfigo, penfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, psoriasis, aplasia pura de eritrocitos, artritis reactiva, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, diabetes de tipo I, colitis ulcerosa, vasculitis, vitíligo y combinaciones de los mismos;
opcionalmente, en la que la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple o la enfermedad de Crohn; u opcionalmente, en donde la esclerosis múltiple es una forma recidivante de esclerosis múltiple.
4. Un medicamento inmunosupresor para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medicamento inmunosupresor comprende un glucocorticoide, un citostático, un anticuerpo, un fármaco que actúa sobre las inmunofilinas, un interferón, un opioide, una proteína de unión al<t>N<f>, un micofenolato, un agente biológico pequeño, una molécula pequeña, un compuesto orgánico o cualquier combinación de los mismos,
opcionalmente, el medicamento inmunosupresor comprende abatacept, adalimumab, alefacept, alemtuzumab, anakinra, azatioprina, belimumab, bendamustina, bevacizumab, bortezomib, brentuximab vedotina, capecitabina, carboplatino, cetuximab, clorambucilo, cladribina, ciclofosfamida, ciclosporina, daclizumab, doxorrubicina, eculizumab, efalizumab, etanercept, etopósido, everolimus, fludarabina, fluorouracilo, ácido fumárico, gemcitabina, ibritumomab tiuxetano, imatinib, infliximab, leflunomida, lenalidomida, metilprednisolona, metotrexato, micofenolato mofetilo, natalizumab, oxaliplatino, rituximab, tocilizumab, tofacitinib, ustekinumab, vedolizumab, vincristina, belatacept, quimioterapia citotóxica, corticosteroides, Ig antitimocítica, basiliximab, muromonab-CD3, ácido micofenólico, prednisona/prednisolona, sirolimus, tacrolimus, fumarato de dimetilo, fingolimod, ruxolitinib, interferón beta-la, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-la, teriflunomida, mitoxantrona, ocrelizumab, asparaginasa, bleomicina, busulfano, carmustina, certolizumab, ibrutinib, idarrubicina, idelalisib, hidrocortisona, ifosfamida, levamisol, mercaptopurina, mizoribina, obinutuzumab, ofatumumab, tegafur/gimeracilo/oteracilo, tiotepa, vinblastina, o cualquier combinación de los mismos,
opcionalmente, en el que el medicamento inmunosupresor comprende interferón beta-la, interferón beta-1b, acetato de glatiramero, peginterferón beta-la, teriflunomida, fingolimod, fumarato de dimetilo, alemtuzumab, mitoxantrona, natalizumab, daclizumab, ocrelizumab, o cualquier combinación de los mismos; u opcionalmente, en el que el medicamento inmunosupresor comprende natalizumab.
5. Un medicamento inmunosupresor para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medicamento inmunosupresor comprende una molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma,
opcionalmente en el que:
(i) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma es una molécula de anticuerpo recombinante humanizada o un fragmento de la misma,
(ii) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma es una molécula de anticuerpo monoclonal recombinante humanizada IgG4K o un fragmento de la misma;
(iii) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se produce en células de mieloma murino;
(iv) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se une a una integrina, en la que la integrina se expresa opcionalmente en la superficie de un leucocito, que opcionalmente no es un neutrófilo;
(v) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se une a la integrina a4p1, a la integrina a4p7 o a ambas;
(vi) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se une a la subunidad a4 de la integrina a4p1, a la integrina a4p7, o a ambas;
(vii) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma inhibe la adhesión mediada por a4 de un leucocito a su receptor;
(viii) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma comprende una secuencia que tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2178;
(ix) la molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma comprende una secuencia que tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2179; o
(x) la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende CDR no humanas en las posiciones 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) (numeración de Kabat) de un anticuerpo anti-a4 de ratón y que tiene residuos no humanos en las posiciones marco 27-30 (numeración de Kabat), en las que dichas posiciones 27-30 tienen la secuencia de aminoácidos Phe 27, Asn 28, Ile 29 y Lys 30,
opcionalmente en el que:
(a) la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2180 (KTSQDIn Ky MA), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2181 (YTSALQP), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2182 (LQYDNLWT),
(b) la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2183 (q As QDIiKy LN), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2184 (EASNLQA), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2185 (QQYQSLPYT),
(c) la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2186 (KASQSVTNDVA), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2187 (YASNRYT), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2188 (QQDYSSPYT),
(d) en el que la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende: una CDR1 de cadena pesada (HC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2189 (DTYIH), una CDR2 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2190 (RIDPANGYTKYDPKFQG), y una CDR3 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2191 (EGYYGNYGVYAMDY),
(e) en el que la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena pesada (HC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2192 (DTYM<h>), una CDR2 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2193 (RIDPASGDTKYDPKFQV), y una CDR3 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2194 (DGMWVSTGYALDF),
(f) en el que la molécula de anticuerpo o fragmento de la misma comprende una cadena pesada humanizada, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende: una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID NO.: 2195
(M D W TW RVFCLLAVAPG AH SQ VQ LQ ESG PG LVR PSQ TLSLTCTVSG FN IKD TYM H W VRQ PP
G RG LEW TG R ID PA SG D TK YD PK FQ V K ATITA D TSSN Q FSLR LSSVTA AD TAV YYCA D G M W V
STG YALD FW G Q G TTV TV SSG ES),
SEQ ID NO.: 2196
(Q V Q LQESGPGLVRP SQ TLSLTCTV SGFNIKDTYM EIW VRQPPGRGLEW IGRIDP A SGDTKYDP
K FQ V R V TM L V D TSSN Q FSL R LSSV T SE D T A V Y Y C A D G M W V STG YA L D FW G Q G TT V TV SSG ES),
SEQ ID NO.: 2197
(M D W TW RVFCLLAVAPG AH SQ VQ LQ ESG PG LVR PSQ TLSLTCTVSG FN IKD TYM H W VKQ RP
G R G L E W IG R ID PA SG D TK YD PK FQ V R VTM LVD TSSN Q FSLR LSSVTA A D TA V YYC A D G M W V STG YALD FW G Q G TTVTVSSG ES).
SEQ ID NO.: 2198
fM DW TW RVFCLLAVAPG AH SQ VQ LQESG PG LVR PSQTLSLTCTASG FN IKDTYM H W VRQ PP
G R G LE W IG R TD PA SG D TK YD PK FQ V R VTM LV D TSSN Q FSLR LSSVTAA D TA VYYCA D G M W V STG YALD FW G Q G TTVTVSSG ES),
y
SEQ ID NO.: 2199
(Q V Q LV Q SG A E V K K PG A SV K V SCK A SG FN IK D TYIH W V R Q A PG Q R LE W M G R 1D PA N G YTK Y DPKFQGRVTIT ADTS A ST A YM E L S SLRSEDTA V Y Y C A R E G Y Y G N Y G V Y A M D YW G Q G TLVT VSS),
o
(g) en el que la molécula de anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena ligera humanizada, o un fragmento de la misma de unión a a4, que comprende una región de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID NO.: 2200
(M G W SCIILFLV A TA TG V H SD IQ LTQ SPSSLSA SV G D R V TITCK A SQ SV TN D V A W YQ Q K PG K A PKLLFYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSPYTFGQGTKVETFCR
K ) ,
SEQ ID NO.: 2201
(M G W SCIILFLVATATG VH SSIVM TQ SPSSLSASVG D R VTITCíCASQ SVTN D VAW YQ Q KPG KA
PK L LrV Y A SN RYTG VPD RFSG SGY GTD FTFTT SSLQPEDTA T Y Y C Q Q D Y SSP Y TF G QGTK VEIK
RK),
SEQ ID NO.: 2202
(M G W SCIILFLV A TATG VH SD IQ M TQ SPSSLSA SV G D R V TITC K A SQ SV TN D V A W YQ Q K PG K
A PK LLIYYA SN R YTG V PD R FSG SG YG TD FTFTISSLQ PE D IA TYYC Q Q D YSSPYTFG Q G TK V E I KRK),
y
SEQ ID NO.: 2203
(DIQ M TQ SPSSLSASVGD RVTITCKTSQ D IN KYM AW YQ Q TPGKAPRLLIH YTSALQ PG IPSRFS
G SG SG R D YTFTISSLQ PE D IA TYYCLQ YD N LW TFG Q G TK V E IK R TV),
opcionalmente en el que el medicamento inmunosupresor comprende natalizumab, que se administra mediante infusión intravenosa,
opcionalmente en el que:
(i) se administrarán de 100 mg a 500 mg de natalizumab,
(ii) se administrarán de 100 mg a 500 mg de natalizumab en cuatro semanas, o
(ii) se administrarán de 100 mg a 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas.
6. Un medicamento inmunosupresor para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la ausencia de las variaciones genómicas se establece mediante una prueba genética para detectar las variaciones genómicas en una muestra de ácido polinucleico del sujeto,
opcionalmente, en el que el ácido polinucleico se ensaya mediante una prueba genética seleccionada entre análisis de microarreglos, PCR, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos o cualquier combinación de los mismos,
opcionalmente en el que:
(i) la prueba genética comprende un análisis de microarreglos seleccionado del grupo formado por un análisis de arreglos de hibridación genómica comparativa (CGH) y un análisis de arreglos de SNP, o
(ii) la prueba genética comprende secuenciación, en la que la secuenciación se selecciona del grupo que consiste en secuenciación de firmas masivas en paralelo (MPSS), secuenciación de Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación de Illumina, secuenciación de Illumina (Solexa) utilizando la preparación de bibliotecas Genomics 10X, secuenciación SOLiD, secuenciación por semiconductores iónicos, secuenciación por nanobolas de ADN, secuenciación heliscópica de moléculas individuales, secuenciación de moléculas individuales en tiempo real (SMRT), secuenciación RNAP, secuenciación de ADN Nanopore, secuenciación por hibridación y secuenciación microfluídica Sanger,
(iii) la prueba genética comprende el análisis de todo el genoma del sujeto,
(iv) la prueba genética comprende el análisis de un exoma completo del sujeto, o
(v) la prueba genética comprende el análisis de la información sobre ácidos nucleicos ya obtenida para un genoma completo o un exoma completo del sujeto,
opcionalmente, en la que la información sobre el ácido nucleico se obtiene a partir de un análisisin silico;o (vi) la muestra de ácido polinucleico comprende un ácido polinucleico de sangre, saliva, orina, suero, lágrimas, piel, tejido o pelo del sujeto.
7. Un medicamento inmunosupresor para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que debe administrarse con un agente que reduce una carga viral en el sujeto,
opcionalmente en el que:
(i) el medicamento inmunosupresor debe administrarse una vez reducida la carga viral;
(ii) la carga viral es una carga viral del JCV; o
(iii) el agente que reduce la carga viral es un agente dirigido contra el JCV.
8. Un medicamento inmunosupresor para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se va a analizar la presencia del JCV en una muestra biológica del sujeto,
opcionalmente, en el que el análisis para detectar la presencia del JCV comprende poner en contacto un reactivo de detección del JCV con la muestra biológica, u
opcionalmente, en el que el reactivo de detección del JCV se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-JCV, un cebador específico del JCV y combinaciones de los mismos.
9. Un método de detección de un biomarcador de PML que comprende
(a) detección de las muestras biológicas obtenidas de sujetos con PML para obtener información sobre ácidos nucleicos;
(b) detectar una variación genómica en un gen de la Tabla 19 en la información del ácido nucleico;
(c) determinar una frecuencia de la variación genómica en al menos 100 sujetos humanos sin PML; y (d) identificar la variación genómica como un biomarcador de PML si la variación genómica está presente a un nivel estadísticamente significativo en la información del ácido nucleico en comparación con la frecuencia de la variación genómica en los al menos 100 sujetos humanos sin PML,
que comprende opcionalmente:
(i) detectar la variación genómica en una muestra de ácido polinucleico de un sujeto sospechoso de padecer PML y utilizar dicha detección para predecir una respuesta adversa del sujeto sospechoso de padecer PML a la terapia, en la que la terapia es una terapia inmunosupresora que comprende uno o más medicamentos inmunosupresores;
(ii) confirmar que cada muestra biológica no es un duplicado de ninguna otra muestra biológica basándose en la información sobre el ácido nucleico;
(iii) determinar un genotipo de sexo para cada muestra biológica basándose en la información del ácido nucleico; o
(iv) confirmar que el genotipo del sexo de cada muestra coincide con el fenotipo del sexo del sujeto de los sujetos con PML.
10. El medicamento inmunosupresor para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un método de la reivindicación 9, que comprende además analizar al sujeto con una prueba de anticuerpos contra el JCV, una prueba de CD62L o una prueba de bandas oligoclonales de IgM del CSF,
opcionalmente comprende además probar al sujeto con la prueba de anticuerpos contra el JCV, en el que la prueba de anticuerpos contra el JCV no detecta la presencia del JCV,
opcionalmente en el que la prueba de anticuerpos contra el JCV comprende el contacto de un reactivo de detección del JCV con una muestra biológica del sujeto,
opcionalmente, en el que el reactivo de detección del JCV se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-JCV, un cebador específico del JCV y combinaciones de los mismos.
11. Un método para identificar a un sujeto con riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) que comprende
(a) analizar una muestra de ácido polinucleico del sujeto para detectar una variación genética, y establecer que la variación genética está presente en la muestra de ácido polinucleico;
(b) identificar al sujeto con riesgo de desarrollar PML;
en el que el sujeto está inmunodeprimido, y
en el que el riesgo del sujeto se debe a la presencia de una variación genómica seleccionada del grupo que consiste en chr19:7712287, G>C; chr16:81942175, A>G; chr2:163136505, C>G; chr1:92946625, G>C; chr9:446401, A>G; chr8:61732632, A>G; chr16:81939089, T>C; chr20:62309621, T>C; chr22:36661354, C>T; chr6:52101833, C>T; chr19:7705818, C>T; chr16:81902826, C>T; chr16:81946278, A>G; chr2:98351032, C>G; chr2:98351066, C>T; chr2:98351081, C>T y chr4:103522150, G>A, y
en el que la posición en el cromosoma de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19, opcionalmente, en el que el sujeto tiene una infección por VIH, o padece una enfermedad seleccionada entre un cáncer, una neoplasia hematológica, una enfermedad autoinmune o una linfocitopenia CD4+ idiopática, o ha recibido un trasplante de órganos.
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