ES2987290T3

ES2987290T3 - Modelo de tejido cardiaco

Info

Publication number: ES2987290T3
Application number: ES21712188T
Authority: ES
Inventors: Sasha Mendjan; Stefan Jahnel; Pablo Hofbauer; Nora Papai
Original assignee: IMBA Institut fur Molekulare Biotechonologie GmbH
Current assignee: IMBA Institut fur Molekulare Biotechonologie GmbH
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2024-11-14
Anticipated expiration: 2041-03-19
Also published as: EP4483888A2; KR20220156841A; PT4121512T; EP3882341A1; AU2021236928B2; FI4121512T3; EP4121512A1; EP4121512B1; AU2021236928A1; JP2023518255A; US20230314413A1; US20250321226A1; WO2021186044A1; DK4121512T3; CA3171641A1; CN115380106A; EP4483888A3

Abstract

La presente invención proporciona un modelo de tejido cardíaco de al menos un 60% de células cardíacas, en donde las células cardíacas rodean una cavidad interna, en donde las células cardíacas se seleccionan entre cardiomiocitos, células endocárdicas y células epicárdicas; un método para la generación de dicho modelo de tejido y sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Modelo de tejido cardiaco

La presente invención se refiere al campo de la generación de modelos de tejido cardíaco.

Antecedentes de la invención

El corazón es el primer órgano funcional que se forma en el embrión humano en desarrollo. La supervivencia del embrión depende de la autoorganización de los progenitores cardíacos en las cuatro cámaras del corazón y su posterior maduración. En biología, la autoorganización es la capacidad de las células para autoensamblarse a medida que se diferencian en estructuras organizadas de tipo orgánico o tisular, ya seain vivooin vitroen condiciones permisivas similares a lasin vivo.Esta capacidad de las células para autoorganizarse en las condiciones adecuadas es crucial para que el tejido y el órgano funcionen. Falta de autoorganización y modelos fisiológicos tienen un impacto masivo al obstaculizar el progreso para comprender el desarrollo y la regeneración cardíaca humana, la etiología de los defectos congénitos y las enfermedades cardiovasculares, y el efecto fisiológico y toxicológico real de los medicamentos.

Las estructuras tisulares autoorganizadas derivadas de células madre denominadas organoides están revolucionando la investigación biomédica, ya que recapitulan aspectos clave del desarrollo de los órganos, fisiología y enfermedad. Se han obtenido organoides a partir de células madre que imitan aspectos de la formación de estructuras de tejidos fisiológicos en intestino delgado y grueso, estómago, hígado, pulmón, cerebro, epidermis, riñón, retina, esófago, vejiga y placenta. Sin embargo, hay importantes retos que superar en este campo: i) la complejidad, estructura y forma de los organoides es a menudo difícil de controlar; y ii) la reproducibilidad de los organoides individuales está aún lejos de la robustez del desarrolloin vivo.

El documento WO 2019/174879 A1 describe un organoide de tejido cardíaco artificial que se cultiva en un agregado multicapa que contiene grandes cantidades de células no cardíacas, como células del endodermo del intestino anterior. En este modelo, se desarrollan varias pequeñas cavidades endodérmicas intenas que no recapitulan las grandes cavidades que se desarrollan en las cuatro grandes cámaras que se encuentran en un corazón natural. Además, no hay separación e intersticio (gelatina cardíaca) entre los cardiomiocitos y el endocardio (endotelio cardíaco) que se encuentra en el tubo cardíaco de un vertebrado. Por lo tanto, un organoide de este tipo no recapitula este aspecto clave de la situaciónin vivodel corazón en desarrollo, que consiste esencialmente de células cardíacas. Desarrollo a largo plazo y maduración de este modelo de tejido probablemente no será posible ya que las células no cardiacas se acumularán e impedirán la formación de estructuras in vivo con al menos una gran cavidad que se desarrollarán en cámaras cardíacas.

Mendjan et al., Cell Stem Cell (2014) Vol. 15, p. 310-325 divulga estudios de diferenciación del mesodermo temprano en cultivos 2D. No se obtuvo ningún organoide cardíaco con cavidades internas.

Halloin et al., Stem Cell Reports (2019) Vol. 13, p. 366-379 divulga un cultivo cardíaco en suspensión de cardiomiocitos de tipo ventricular con alta pureza de linaje. No se describe ninguna cavidad interior.

Ma et al., Nature Communications (2015) Vol. 6, p. 7413 describe un tejido formado con microcámaras cardíacas utilizando una microestructura de poliestireno con patrón de PEG para confinar el crecimiento celular. Estas microcámaras son, por tanto, un artefacto de interferencia en el crecimiento de la célula artificial y no recapitulan la formación natural de cavidades por autoorganización en el desarrollo temprano del corazón como ocurrein vivo. Por ejemplo, falta una capa endocárdica separada, así como el intersticio (gelatina cardíaca) entre los cardiomiocitos y endocardio. Hoang et al., Nature Protocols 13(4) (2018):735 describe desarrollo temprano de organoides cardíacos mediante un enfoque de patrón de superficie.

Sigue siendo necesario proporcionar un modelo de tejido, como un organoide, que se asemeje a la autoorganizaciónin vivoy recapitule el desarrollo temprano del corazón, en particular el de las cámaras del corazón. La presente invención proporciona un modelo de tejido de este tipo y procedimientos para generarlo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un organoide cardíaco con al menos un 60% de células cardíacas, independientemente de la presencia de células adicionales opcionales de un sistema vascular del organoide, o que comprend al menos el 50% de células cardíacas; en el que las células cardíacas rodean una cavidad interna, en la que las células cardiacas se seleccionan entre cardiomiocitos, células endocárdicas (o también denominadas células endoteliales cardíacas) y células epicárdicas, y en el que el organoide cardíaco comprende cardiomiocitos o células endocárdicas orientadas directamente a la cavidad interior, en la que el organoide se obtiene diferenciando células pluripotentes a células cardiacas y cultivándolas en cultivo 3D.

La invención proporciona además un procedimiento para generar un organoide cardíaco que comprende las etapas de: a) proporcionar células madre pluripotentes, preferentemente en cultivo 2D; b1) inducir la diferenciación del mesodermo en presencia de un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta, en el que el activador de WNT y/o el inhibidor de GSK3-beta y/o un inhibidor de PI3 quinasa opcional en un cultivo 2D, y/o uno cualquiera de FGF2, Activina A, BMP4 o una combinación de los mismos, están en una cantidad suficiente para diferenciar las células madre pluripotentes para salir de la pluripotencia en una cantidad de al menos el 90% de las células madre pluripotentes en las 40 horas siguientes al inicio de la inducción, produciendo así un agregado de células mesodérmicas, o b2) inducir la diferenciación mesodérmica en presencia de un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta, y además en presencia de un inhibidor de PI3 cinasa y/o uno cualquiera de FGF2, Activina A, BMP4 o una combinación de los mismos, en un cultivo 3D en cultivo de baja fijación, en el que las células se agregan en lugar de unirse a un recipiente de cultivo, produciendo así un agregado de células mesodérmicas; c) diferenciación de las células mesodérmicas de la etapa b) en células mesodérmicas cardíacas en un cultivo tridimensional de baja fijación,en el que las células se unen entre sí en lugar de a un recipiente de cultivo para formar agregados de las células, en presencia de factores de diferenciación (preferiblemente BMP4, FGF2, Insulina) y en la ausencia de un activador WNT y/o en presencia de un antagonista WNT, durante al menos 3 días para la formación del mesodermo cardíaco y formación de una cavidad interior. Los índices "b1" y "b2" son denominados conjuntamente "b".

La invención proporciona además un organoide cardíaco obtenible por el procedimiento inventivo.

La presente invención proporciona además un procedimiento de detección y pruebas de utilización del organoide inventivo o de los procedimientos para observar losefectos de los compuestos ensayados o cribados o de los genes sobreexpresados o subexpresados.

La invención proporciona además un kit para realizar el procedimiento inventivo. El kit puede comprender i) un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta, ii) un inhibidor de PI3 quinasa, iii) un recipiente de cultivo celular de baja adhesión, iv) albúmina.

La invención también proporciona una placa de recipiente que comprende al menos 10 compartimentos, en los que en cada compartimento está presente un organoide según la invención. Los modelos tisulares pueden encontrarse sustancialmente en la misma fase de desarrollo.

Todas las realizaciones de la invención se describen conjuntamente en la siguiente descripción detallada y todas las realizaciones preferentes se refieren a todas las realizaciones, aspectos, procedimientos, modelos de tejido cardíaco, organoides, usos y kits por igual. Por ejemplo, los kits o sus componentes pueden utilizarse o ser adecuados para los procedimientos inventivos. Cualquier componente utilizado en los procedimientos descritos puede formar parte del kit.

Los organoides inventivos (también denominados modelos tisulares) son los resultados de procedimientos inventivos o pueden utilizarse en procedimientos inventivos y sus usos. Las descripciones preferidas y detalladas de los procedimientos inventivos se leen igualmente sobre la idoneidad de los organoides resultantes o utilizados (modelos de tejido) de la invención. Todas las realizaciones pueden combinarse entre sí, salvo que se indique lo contrario.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un modelo de tejido u organoide cardíaco autoorganizado que puede desarrollar una gran cavidad interna reminiscencia del desarrollo temprano del corazón izquierdo animal y humano, por ejemplo, de las cámaras ventricular y auricular. Dicho tejido se muestra por ejemplo, en las figuras 1, 2 y 14. El procedimiento inventivo para generar el organoide, también denominado modelo de tejido en el presente documento, utiliza factores naturales de crecimiento y señalización. Este desarrollo no requiere un andamiaje de matriz exógena.

En consecuencia, la invención proporciona un organoide cardíaco de al al menos el 60%, preferiblemente al menos el 80%, de células cardiacas independientemente de células adicionales opcionales de un sistema vascular del organoide, en el que las células cardíacas rodean una cavidad interior, en la que las células cardíacas se seleccionan entre cardiomiocitos, células endocárdicas (o también denominadas células endoteliales cardíacas) y células epicárdicas, y en la que el organoide cardíaco comprende cardiomiocitos o células endocárdicas que se orientan directamente a la cavidad interna, en el que el organoide se obtiene diferenciando células pluripotentes a células cardíacas y cultivando en 3D (por ejemplo, Figura 6, 11G). "Seleccionado de" significa que la especie seleccionada puede ser de cualquiera de los miembros que se agrupan como especies seleccionables. El modelo de tejido cardíaco puede tener al menos un 60%, preferentemente al menos el 80%, células cardíacas, especialmente al finalizar la etapa c) del procedimiento inventivo. Es posible añadir células adicionales que luego se infiltran en el modelo de tejido, especialmente las células de un sistema vascular, que deben por lo tanto no contabilizarse cuando se considera la cifra de al menos un 60%, preferiblemente al menos un 80%, de células cardiacas. Las características inventivas siguen siendo las mismas, independientemente de estas células infiltrantes - siempre que las células infiltrantes no sustituyan a las células cardíacas en la medida en que su función, como modelo de latido cardíaco, se deteriora o se suprime. En una realización preferente, el modelo de tejido cardíaco comprende al menos el 50%, preferiblemente al menos el60%, las células cardíacas se seleccionan entre cardiomiocitos, células del endocardio y células epicárdicas (recuento absoluto de células, contando también cualquier otra célula infiltrante).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "que comprende" está abierto a la presencia de cualquier otro componente, a menos que se especifique lo contrario. Una composición, como el tejido inventivo, que se especifica para comprender un componente, como las células, en una cantidad definida por un intervalo de valores numéricos, está sujeta a la condición de excluir la presencia de dicho componente en una cantidad fuera de dicho intervalo de valores numéricos.

En particular, el modelo de tejido inventivo contiene principalmente células de linaje cardíaco, tal que comprenda al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, especialmente preferido al menos un 80%, aún más preferido al menos un 90%, de células de linaje cardíaco. El modelo de tejido puede contener también células de mesodermo de placa lateral (HAND1+) que son precursoras de los tres linajes cardíacos principales. Por ejemplo, el modelo de tejido puede comprender al menos un 0,5% de células de mesodermo de placa lateral y/o hasta un 30% de células de mesodermo de placa lateral, por ejemplo, entre un 1% y un 20% de células de mesodermo de placa lateral. En particular, el modelo de tejido no contiene células de endodermo del intestino anterioro como máximo un 5% o menos, como por ejemplo como máximo un 3%, como máximo un 1% o como máximo un 0,1%, células de células de endodermo del intestino anterior. Preferentemente, el modelo de tejido cardiaco de la invención comprende como máximo un 3% o ninguna células derivada del endodermo del intestino anterior (por ejemplo, que expresen SOX17+ y/o EOMES+) y/o como máximo un 3% o ninguna célula hemogénica, preferentemente como máximo un 1% de células hemogénicas, y/o como máximo un 3% o ninguna célula derivada ectodérmica (SOX2+) (por ejemplo, figuras 2 y 3).

Es otro rasgo distintivo del modelo inventivo de tejido cardíaco que tenga una actividad de latido rítmico, por ejemplo, como un corazón crecido de forma natural en el desarrollo temprano.

Las células cardíacas pueden seleccionarse entre varios tipos de células cardíacas, como los cardiomiocitos, las células endocárdicas y las células epicárdicas. El contenido de estos tipos celulares puede diferir en función de las distintas opciones de tratamiento aquí descritas. Según la mayoría de las opciones, el modelo de tejido cardiaco comprende al menos un 40% de cardiomiocitos. En realizaciones particularmente preferentes, el modelo de tejido cardíaco al menos el 50%, más preferido al menos el 60%, o particularmente preferido al menos el 80%, de cardiomiocitos. En realizaciones especiales, el número puede incluso alcanzar al menos el 90% de cardiomiocitos (por ejemplo, figuras 4, 6, 10).

En otras realizaciones preferente de la invención, el modelo de tejido cardíaco que comprende al menos un 2%, preferiblemente al menos un 5%, aún más preferentemente al menos el 8%, células endocárdicas. Las células endocárdicas son células endoteliales cardíacas que forman el endocardioin vivo.Son esencialmente células endoteliales de linaje cardíaco. Las células endocárdicas forman un interior (frente a la cavidad interna)o, en algunos casos, un compartimento/forro exterior del modelo de tejido inventivo. Tales células pueden identificarse mediante marcadores de expresión NPR3, NFATC1, HOX1, HOX2, HOX3, HOX4, HOX5. Una cuestión importante es que estas células endoteliales (CE) son muy similares al endocardioin vivo(es decir, las CE reales del corazón) (por ejemplo, la figura 4). Expresan niveles más altos de NPR3 y NFATC1 en comparación con las CE de control de origen no cardíaco. Todas las comparaciones de células en el presente documento se realizan en condiciones estándar de cultivos celulares para mantener células que expresan marcadores distintivos relevantes o expresión de marcadores distintivos, en particular para que los marcadores o la expresión del marcador puede determinarse como una propiedad intrínseca de la célula; tales condiciones suelen comprender un medio compuesto por todos los nutrientes necesarios para el mantenimiento a presión ambiente y a la temperatura fisiológica de las células. Las CE del modelo de tejido de la invención también expresan los genes HOX correctos típicos del corazón (HOX1-5) (por ejemplo, Figura 4). Otra característica de estas células es que muestran activación de genes mecanosensores (SOX18, KLF2, CDH5, FOS, TEK, FOXO1) (por ejemplo, Figura 4, Figura 19).

Esto se considera una diferencia con respecto a las CE de otros organoides no autoorganizados en los que las CE se mezclan con los cardiomiocitos. La expresión de genes mecanosensores es un importante sello biológico de las CE más funcionales. En consecuencia, las células endocárdicas de la invención son más funcionales que las CE en modelos 2D y 3D anteriores.

Según la invención, la cantidad de células endocárdicas puede controlarse durante el crecimiento del modelo de tejido. El modelo de tejido puede tener cantidades variables de células endocárdicas, tales como al menos 2%, preferiblemente al menos 4%, o al menos 8%, incluso más preferido al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, de células endocárdicas. Una opción para controlar la formación de células endocárdicas es utilizar VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) durante la generación del modelo tisular.

Si no se utiliza VEGF, normalmente se obtienen cantidades bajas de células endocárdicas, como por ejemplo menos del 10%, en particular como capa interna. Estas CE autodesarrolladas expresan los marcadores endoteliales CD31 y CDH5 (por ejemplo, Figura 8, Figura 19).

El modelo de tejido inventivo tiene esencialmente una forma hueca, preferiblemente con una capa continua de células endocárdicas que rodean la cavidad interna y preferiblemente también orientadas hacia la cavidad interna(por ejemplo, Figura 2, 8, 11G). La capa continua preferentemente no tiene agujeros y rodea completamente la cavidad interior en todas direcciones vistas desde el centro de la cavidad interior.

El modelo de tejido inventivo tiene una composición estructurada y las células de un tipo específico suelen encontrarse en compartimentos concretos. Estos compartimentos suelen ser capas. Preferiblemente el modelo inventivo de tejido cardíaco comprende cardiomiocitos y células endocárdicas en diferentes capas de tejido. Las células endocárdicas pueden estar en una capa de tejido separada, preferiblemente una capa interna y/o externa (por ejemplo, Figura 4, 7, 8).

En realizaciones preferentes de la invención hay un espacio intermedio entre un compartimento, preferiblemente capa, de células endotelialesy un compartimento, preferiblemente capa, de cardiomiocitos como se observain vivo(gelatina cardíaca del tubo cardíaco) en esta fase de desarrollo(por ejemplo, figura 7).

En otra realización preferente, el modelo de tejido cardíaco de la invención comprende al menos el 50%, aún más preferido al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95%, de los cardiomiocitos (por ejemplo, Figura 4, 6).

Los cardiomiocitos son células del músculo cardíaco y son los principales responsables de la actividad latiente del modelo tisular. Son el componente principal del modelo tisular inventivo y forman una capa en el modelo de tejido que rodea la cavidad interior. En tejidos de desarrollo temprano, pueden orientarse directamente a la cavidad interna pero en los tejidos posteriores y más desarrollados, la capa interna está formada por células endocárdicas (por ejemplo, Figura 2, 8).

El modelo de tejido inventivo tiene esencialmente una forma hueca, preferentemente con una capa continua de cardiomiocitos rodeando la cavidad interna. La capa continua preferiblemente no tiene agujeros y rodea completamente la cavidad interior en todas las direcciones visto desde el centro de la cavidad interior.

Un aspecto importante del modelo tisular inventivo es que se desarrolla con gran pureza de células cardiacas. Las células no cardíacas, como las células ectodérmicas, endodérmicas y endoteliales hemogénicas, no deben estar presentes (por ejemplo, Figura 2,3), o en cantidades muy bajas, como cuando se han añadido al modelo tisular más tarde tras el desarrollo inventivo hasta la etapa de diferenciación de las células mesodérmicas en células cardíacas. En consecuencia, en realizaciones preferentes el modelo de tejido de la presente invención no comprende células endodérmicas o como máximo un 5%, preferiblemente como máximo un 2% o como máximo un 1% de células endodérmicas. También, o en combinación con ello, en realizaciones preferentes el modelo de tejido de la presente invención no comprende células endoteliales hemogénicas o como máximo un 5%, preferiblemente como máximo un 2% o como máximo un 1% de células endoteliales hemogénicas.

Un tipo de célula que preferiblemente se añade más tarde al modelo de tejido son células epicárdicas. Estas células pueden formar una capa que rodee el modelo de tejido inventivo. Las células epicárdicas preferentemente expresan los marcadores celulares WT1 y TCF21 (por ejemplo, Figura 10). El modelo de tejido inventivo puede tener al menos 0,5%, preferiblemente al menos 5% o al menos 10%, de células epicárdicas, por ejemplo, 0,5% a 30% de células epicárdicas (por ejemplo, la figura 11).

En realizaciones preferente de la invención, el modelo de tejido cardíaco comprende células del músculo liso derivadas del epicardio (también denominadas células del músculo liso cardíacas) y/o fibroblastos cardíacos derivados del epicardio (también denominados "fibroblastos derivados del endocardio" o simplemente fibroblastos cardíacos).

Este tipo de células del músculo liso (SMC) y fibroblastos se desarrollan del epicardio y no son de linaje no cardíaco como tal.

El linaje cardíaco de estos tipos celulares provoca un patrón particular en su distribución en el organoide y un patrón de marcadores de expresión diferente, como en el caso de los marcadores de células del músculo liso SM22 y/o Calponina y para los marcadores de fibroblastos cardíacos DDR2 y/o Vimentina. Estas células (SMC y fibroblastos, ambos de linaje cardiaco) migran al tejido o capa de cardiomiocitos (por ejemplo, figuras 10,11).

En determinadas realizaciones, el modelo de tejido cardíaco comprende como máximo un 3%, preferiblemente como máximo un 1%, o ninguna célula del músculo liso no epicárdico y/o como máximo un 3%, preferiblemente como máximo un 1%, o ningún fibroblasto no epicárdico, es decir, SMC y fibroblastos no de linaje cardíaco/que no se desarrollan a partir del epicardio. Las células no cardiacas pueden perturbar las investigaciones sobre el comportamiento natural de los modelos de corazón y, por lo tanto, es preferible que no estén presentes o que lo estén en cantidades bajas para que no se alteren las investigaciones cardíacas.

El modelo inventivo de tejido es artificial y se cultiva utilizando principios naturales de desarrollo, pero no es un corazón cultivadoin vivoen cualquier momento del desarrollo de un corazónin vivo.Debido al proceso de cultivo, normalmente el tamaño es limitado. En realizaciones preferentes de la invención, el modelo de tejido cardíaco tiene un tamaño en su mayor dimensión de 0,3 mm a 15 mm, como por ejemplo de 0,5 mm a 1 mm. El modelo de tejido suele ser una forma hueca que tiene esencialmente una forma esférica, pero puede presentar irregularidades. Por consiguiente, como referencia se utiliza la mayor dimensión de esa forma para determinar su tamaño (por ejemplo, figuras 1 y 2).

Este tamaño se aplica generalmente a los organoides obtenidos por el procedimiento inventivo después de las etapas a) a c) que desarrolla una cavidad.

Es posible fusionar los modelos inventivos de tejido cardíaco, por lo que se pueden generar estructuras con más de una cavidad interior que también son mayores. Los tamaños preferidos se aplican entonces a una cámara de ese modelo de tejido fusionado, es decir, una cavidad interior con el tejido circundante, sin extenderse a las capas de tejido que rodean otra cavidad interior.

La cavidad interior es bastante grande (en comparación con anteriores modelos de tejido cardíaco) y ocupa una parte importante del volumen del modelo de tejido (tanto para los organoides de cavidad única como para los organoides fusionados). Preferiblemente, el tamaño de la cavidad interior en su mayor dimensión es al menos el 60% del tamaño del modelo de tejido cardíaco en su mayor dimensión. Como en el caso anterior, en el caso de organoides fusionados con más de una cavidad interior, esto se aplica sólo a una cavidad (y el tejido circundante, sin extenderse a las capas de tejido que rodean otra cavidad interior) (por ejemplo, las figuras 1, 2).

Preferiblemente el modelo de tejido es de células de mamífero, preferiblemente células humanas o de primates no humanos, o de roedores, ratones, hámsters, cerdos, gatos, perros, caballos o vacas.

La invención proporciona además un procedimiento para generar un modelo de tejido cardíaco que comprende las etapas de a) proporcionar células madre pluripotentes, b) inducir la diferenciación mesodérmica enpresencia de un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta, y además en presencia de un inhibidor de PI3 quinasa, en un cultivo 3D en un cultivo de baja fijación, en el que las células se unen entre síen lugar de un recipiente de cultivo para formar agregados de las células, produciendo así un agregado de células mesodérmicas, c) diferenciar las células mesodérmicas de la etapa b) en células cardíacas en un cultivo 3D en un cultivo de baja fijación, en presencia de factores de diferenciación cardíaca y en ausencia de un activador de WNT y/o en presencia de un antagonista de WNT, durante almenos 3 días, preferiblemente de 3 a 7 días, para la formación del mesodermo cardíaco y la formación de una cavidad interna (por ejemplo, Figura 1).

La etapa b) puede variarse con efectos similares, como b) inducir la diferenciación del mesodermo en presencia de un activador WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta en un cultivo 2D, en el que el activador WNT y/o inhibidor GSK3-beta y/o un inhibidor opcional PI3 quinasa en una cantidad suficiente para diferenciar células madre pluripotentes para salir de la pluripotencia en una cantidad de al menos el 90 % de células madre pluripotentes dentro de las 40 horas del inicio de la inducción produciendo así un agregado de células del mesodermo, en el que las células se tratan con Activina A, proteína morfogenética ósea, factor de crecimiento de fibroblastos y/o albúmina. En este caso no se requiere un inhibidor de PI3 quinasa, pero esto sigue siendo preferible.

En realizaciones particularmente preferentes, el tratamiento con el activador de WNT y/o el inhibidor de GSK3-beta en la etapa b) se combina con un tratamiento con una proteína morfogenética ósea, especialmente BMP4, en la etapa c). Preferiblemente, la proteína morfogenética ósea, especialmente la BMP4, puede utilizarse ya en el tratamiento de las células en la etapa b). El uso de la proteína morfogenética ósea es particularmente ventajoso para la formación de cavidades robustas y, en consecuencia la generación de modelos de latido cardíaco.

Durante el desarrollo embrionarioin vivo, el corazón es el primer órgano funcional que se forma en el embrión humano en desarrollo. La supervivencia del embrión depende de la autoorganización de los progenitores cardiacos en el corazón de cuatro cámaras y su posterior maduración. La autoorganización en biología es la capacidad de las células para autoensamblarse a medida que se diferencian en tejidos organizados/ estructuras similares a órganos tantoin vivocomoin vitropermisivas en condiciones similares a la vida. Esta capacidad de las células para autoorganizarse en condiciones adecuadas es crucial para que los tejidos y órganos funcionen. El procedimiento inventivo proporciona las condiciones para permitir la autoorganización en los organoides de la invención, que incluye la formación autoorganizada de una gran cavidad central, sin ayuda de ningún andamiaje artificial. Es un sello distintivo de la invención que un andamio, como un andamio polimérico no es necesario y que tampoco está presente en el modelo tisular final de la invención. Tales andamios que pueden evitarse según la invención son, por ejemplo, los descritos en Ma et al.(supra,sección de antecedentes) e incluyen, por ejemplo, polímeros que alcanzarían la mayor parte del modelo de tejido, como extendiéndose a través de al menos el 75% del tamaño del modelo de tejido en su mayor dimensión. También se evitan preferentemente los andamiajes poliméricos macromoleculares de, por ejemplo, polímeros con un peso molecular de al menos 1 Mio Da.

Según el procedimiento inventivo, la autoorganización es impulsada por la señalización del factor de crecimiento y no requiere un andamiaje polimérico (Ma et al.,supra)ni matriz extracelular exógena como Matrigel (WO 2019/174879 A1), aunque Matrigel todavía se puede utilizar ya que no es un obstáculo como un andamiaje polimérico. Sigue siendo preferible evitar la adición de matriz extracelular porque aumenta la variabilidad en la formación de organoides.

El procedimiento inventivo se basa en el uso de células pluripotentes diferenciadas a mesodermo y células cardíacas. Inicialmente, las células pluripotentes pueden ser cultivos en un cultivo 2D común, pero al menos a partir de la etapa c), el cultivo debe ser un cultivo en 3D, como es posible en los recipientes de cultivo de baja fijación. La etapa b) puede realizarse en 2D o, preferiblemente, también en 3D (como la etapa c)).

Las células proporcionadas en la etapa a) son pluripotentes. No son células totipotentes humanas.

Las células pluripotentes proceden preferentemente de un mamífero, preferentemente células humanas o de primates no humanos, o de roedores, ratones, hámsters, cerdos, gatos, perros, caballos o vacas.

Las células pluripotentes pueden proceder de una línea celular o de un cultivo celular. Pueden ser células madre pluripotentes o células pluripotentes inducidas, es decir, procedentes de células diferenciadas que se convirtieron de nuevo en pluripotentes, por ejemplo mediante el tratamiento con los factores Yamanaka. El uso de células pluripotentes inducidas permite investigar el desarrollo cardíaco de individuos específicos, que puedan tener o no aberraciones genéticas que pueden afectar al desarrollo del corazón. En tales realizaciones las células pueden ser células pluripotentes inducidas que se originan de un paciente que sufre de una cardiopatía, en particular una cardiopatía genética.

En realizaciones preferentes, las células madre pluripotentes son cultivadas en un medio antes de ser suministrados para las etapas posteriores del procedimiento inventivo. Esto puede cebar y activar las células para la posterior diferenciación en el procedimiento inventivo. Las células pluripotentes son preferiblemente transitadas y/o pueden haber sido cultivadas, crecidas o mantenidas en un medio que comprenda albúmina y/o un factor de crecimiento de fibroblastos. Estos componentes, preferiblemente ambos, han demostrado cebar excepcionalmente las células para el desarrollo deseado de la invención. La albúmina puede ser, por ejemplo una seroalbúmina, por ejemplo una seroalbúmina bovina (BSA). El factor de crecimiento de fibroblastos es preferentemente FGF2, especialmente FGF2 humano.

Preferiblemente, las células madre pluripotentes se han cultivado en un medio que comprende al menos 1,5% (p/v) (al menos 1,5 g/l), albúmina, preferiblemente BSA, y/o al menos 100 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos, preferiblemente FGF2.

Preferiblemente se utiliza un medio de cultivo celular, como el medio E8.

Comprende preferentemente aminoácidos necesarios para el crecimiento celular y una fuente de energía, como un hidrato de carbono, especialmente preferido glucosa. Comprenderá además sales e iones necesarios para crecimiento celular, como iones Ca, Fe, Mg, K, Na, Zn, Cl, SO4, NO3, PO4. Otros componentes preferidos del medio son las vitaminas, como vitamina B-12, biotina, colina, ácido fólico, inositol, niacinamida, ácido pantoténico, piridoxina, riboflavina, tiamina.

Los aminoácidos preferidos incluyen los aminoácidos esenciales, preferiblemente también cualquiera de los siguientes aminoácidos: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

Un cultivo 2D puede incluir el cultivo o mantenimiento de las células en una superficie, como una placa de cultivo de tejidos.

Dicha superficie puede ser recubierta con sustratos de cultivo adecuados, como la vitronectina.

A continuación, las células pueden disociarse o utilizarse como agregados para su uso en la etapa b). Si se utilizan uno o más etapas de tránsito antes de proporcionar las células para la etapa b), entonces las células pueden volver a sembrarse.

En realizaciones preferentes, las células han sido cultivadas o tratadas en/con un medio de este tipo, especialmente uno que comprenda albúmina y/o un factor de crecimiento de fibroblastos, durante al menos 1 día, preferiblemente al menos 2 días, por ejemplo de 1 a 30 días, tal como de 2 a 20 días, manteniendo la pluripotencia, por supuesto.

En la etapa b) preferiblemente se proporcionan de 100 a 1 millón de células pluripotentes (dependiendo del recipiente de cultivo) para su cultivo en un reciente de cultivo. El recipiente de cultivo puede ser para cultivo 2D, como en la etapa a), por ejemplo, una placa de cultivo, o para el cultivo en 3D, por ejemplo, como se describirá más adelante para la etapa c), donde el cultivo en 3D es obligatorio.

En la etapa b) las células forman agregados que ya no son divididos o disociados, sino que se mantienen enteros. Las células pluripotentes, bien como tales o durante las primeras fases de diferenciación, forman agregados aglutinándose. El número de celdas para hacerlo tendrá un efecto sobre la morfología del futuro modelo de tejido, ya que los modelos de tejido cultivados a partir de menos células suelen ser más homogéneos, en consecuencia, se prefiere utilizar de 100 a 10000, por ejemplo de 200 a 6000, células pluripotentes. La pluripotencia puede controlarse mediante la determinación de los marcadores SOX2, OCT4 y/o nA n OG, por ejemplo.

El medio utilizado en la etapa b) para cultivar las células (que forman agregados, normalmente un agregado principal que persiste para formar el modelo tisular final por recipiente de cultivo) puede tener los mismos componentes que los descritos anteriormente para la etapa a), como que comprende preferentemente aminoácidos necesarios para el crecimiento celular y una fuente de energía, como un hidrato de carbono, preferida especialmente glucosa. El medio en la etapa b) comprende además factores de señalización o moduladores y factores de apoyo opcionales que modulan la señalización.

Uno de estos moduladores de la señalización es un inhibidor de la PI3 cinasa. Un ejemplo de inhibidor de PI3 quinasa es el LY294002, pero otros funcionan también. El uso del inhibidor de PI3 quinasa es particularmente preferido ya que da como resultado modelos de tejidos más limpios y homogéneos. Existen alternativas al uso de un inhibidor de la PI3 cinasa sin embargo, como el uso de una alta cantidad de un activador WNT. Un inhibidor de PI3 quinasa tiene como efecto que muchas células pluripotentes abandonen la pluripotencia y se diferencien hacia el linaje mesodérmico, lo que determina el futuro modelo de tejido cardíaco altamente homólogo (sin endodermo, intestino anterior u otras células no cardíacas, o con un número reducido de ellas).

El LY294002 se utiliza preferentemente en una concentración de 3 pm a 15 pm.

Un factor de señalización importante para la etapa b) es un activador WNT. Un activador WNT para la etapa b) puede ser un ligando WNT, como por ejemplo WNT-3a, o CHIR99021. Otros activadores WNT son para el Homo sapiens: WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16. Éstos están muy conservados y existen homólogos en otros organismos. Otro posible activador de WNT es la R-espondina 1, que actúa de forma sinérgica con WNT4. WNT4 puede ser intrínseco a las células o puede administrarse a las células extrínsecamente.

La activación inventiva de WNT impulsa a las células hacia diferenciación mesodérmica. Esto resulta especialmente eficaz cuando se combina con el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), la proteína morfogenética ósea (BMP, preferiblemente BMP4), la activina A y/o la albúmina, preferiblemente con los cuatro. En tal caso puede que ni siquiera sea necesario utilizar un inhibidor de la PI3 quinasa, especialmente cuando se utilizan altos niveles de activación WNT. De hecho, de estos factores, la combinación de activación WNT y albúmina basta para producir modelos tisulares robustos y reproducibles de la invención. Como tal es posible en una alternativa para la etapa b) utilizar la activación WNT y albúmina para que la cantidad deseada de células madre pluripotentes abandonen la pluripotencia (y se diferencien hacia el linaje mesodérmico) a las 24-40 horas de cultivo según la etapa b).

Esto funciona mejor con cantidades superiores a las habituales de activación WNT. En una alternativa (por supuesto también combinable) a (con) albúmina FGF se utiliza en combinación con BMP y / o activina A.

Preferiblemente, en caso de que el activador WNT esté en una cantidad suficiente para diferenciar las células madre pluripotentes para salir de la pluripotencia en una cantidad al menos del 90% de las células madre pluripotentes dentro de 40 horas de iniciar la inducción, entonces la cantidad de CHIR99021 como activador WNT está en una concentración de al menos 6 pm, preferiblemente al menos 9 pm, tal como 12pm.

Si se utiliza un inhibidor de PI3 quinasa, la activación de WNT puede estar en niveles bajos habituales, por ejemplo, en los que CHIR99021 como activador de WNT está en una concentración de al menos, 0,5 pm, preferiblemente 0,5 pm a 12 pm.

Preferiblemente, la diferenciación del mesodermo (paso b)) se induce en un medio que comprende activina A y/o proteína morfogenética ósea, preferiblemente además factor de crecimiento de fibroblastos. Una proteína morfogenética ósea (BMP) preferida es la BMP4, en particular la BMP4 humana. Preferiblemente, la diferenciación del mesodermo se induce en un medio que contiene al menos 8 ng/ml de proteína morfogenética ósea, preferiblemente BMP4. Además, alternativamente o en combinación, la diferenciación mesodérmica se induce en un medio que comprende factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y/o albúmina, preferentemente BSA. Las concentraciones preferidas para el FGF son de al menos 10 ng/ml dependiendo de la actividad del lote, preferiblemente al menos 50 ng/ml, como 150 ng/ml o más; y para la albúmina se prefieren concentraciones del 0,2%(p/v) o más, como el 0,4% (p/v) o más, preferiblemente de BSA.

Especialmente la albúmina, como la albúmina sérica y/o el FGF son medios aditivos preferidos, ya que estos compuestos ayudan a promover la diferenciación uniforme y robusta de la formación de agregados celulares hacia un destino mesodérmico (y posteriormente cardíaco) utilizando diferentes pluripotentes líneas celulares.

La activina, por ejemplo la activina A, puede utilizarse para especificar el modelo de tejido hacia un destino ventricular o auricular. Por lo general, la Activina (por ejemplo, 10 ng/ml o más) orienta el modelo tisular hacia un destino auricular, una activina más baja (por ejemplo, inferior a 10 ng/ml) orienta el modelo tisular hacia un destino ventricular. Estas concentraciones de ejemplo pueden variar en función del tipo de célula utilizado.

El cultivo de la etapa b) en el medio especificado es preferiblemente de 18 a 40 horas, preferiblemente de 24 a 39 horas, en particular de 30 a 38 horas, tal como 36 horas. La diferenciación del mesodermo se puede controlar determinando las células del mesodermo que expresan los marcadores BRA/T (por ejemplo, Figura 2), MIXL1, TBX6 y/o GSC. La mayoría de las células, como por ejemplo al menos el 90 % de las células deseadas deben expulsar estos marcadores al final de la etapa b).

La etapa b) (opcional) y la etapa c) (y otras etapas opcionales, como d) y una maduración) contienen el cultivo en 3D, que significa que los agregados no están adheridos a una superficie sino que permanecen flotando libremente en estado de suspensión, de modo que la expansión en todas las direcciones 3D es uniformemente posible. Este cultivo se realiza en un cultivo de baja adhesión para que los agregados no se adhieran a paredes de los recipientes de cultivo. Preferentemente, el cultivo de baja adhesión comprende el cultivo de las células en un recipiente con una superficie de baja adhesión que inhibe la adherencia de las células a la superficie. Las superficies de baja adhesión son preferentemente hidrófilas, con carga neutra o no iónicas. Pueden tener una capa o revestimiento de hidrogel que repele la adhesión celular, forzando a las células a un estado de suspensión.

Tales recipientes de cultivo de baja fijación son conocidos en la técnica, por ejemplo, descritos en el documento WO 2019/014635 o el documento WO 2019/014636.

Preferiblemente, el fondo del recipiente de cultivo es redondo, especialmente cóncavo. También puede ser plano o tener forma de V.

La etapa c), de diferenciación de las células mesodérmicas en células cardíacas, comprende la diferenciación de las células mesodérmicas de la etapa b)en células cardíacas en un cultivo 3D de baja fijación, en el que las células se unen entre sí en lugar de a un recipiente de cultivo para formar agregados de las células, en presencia de factores de diferenciación de células cardiacas y en ausencia de un activador WNT y/o en presencia de un antagonista de WNT, durante al menos 2 días, preferentemente durante 3-7, por ejemplo hasta 5, días, para la formación del mesodermo cardíaco y formación de una cavidad interior. Es preferible no utilizar un antagonista de WNT durante toda la duración de la etapa c). Preferiblemente se utiliza un antagonista de WNT de 12 horas a 72 horas, preferiblemente de 24 a 60 horas. La etapa c) se realiza preferentemente hasta que al menos el 80% de las células del cultivo tisular hayan salido de un estadio pluripotente y de mesodermo no cardíaco. Un "estadio de mesodermo no cardiaco" es un estadio multipotente y precursor de un estadio de diferenciación cardiaca en el que las células aún no se han diferenciado hacia el linaje cardiaco. Tal tratamiento según la etapa es preferiblemente durante al menos 2,3,4,5 días y preferiblemente hasta 7 o 5 días.

La formación del mesodermo cardíaco y la diferenciación de los progenitores cardíacos pueden controlarse determinando las células cardíacas que expresan los marcadores NKX2-5, HAND1, HAND2, TBX5, MYH6, MYH7, MYL7, roponina T, troponina I y/o a-actinina (por ejemplo, Figura 2,4,5,6,7).

Preferiblemente, la etapa c) comprende el cultivo en un medio con factor de crecimiento de fibroblastos, proteína morfogenética ósea o una combinación de los mismos. Estos compuestos diferencian aún más las células mesodérmicas obtenidas en la etapa b) en células cardíacas, es decir, actúan como factores de diferenciación cardíaca. El medio comprende preferentemente insulina, que favorece el crecimiento, la proliferación y la supervivencia de las células, especialmente cuando el medio contiene glucosa como fuente de energía.

En las preferencias de todas las realizaciones de la invención, las células se tratan con Activina A, proteína morfogenética ósea (BMP, preferentemente BMP4) y/o factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, preferiblemente FGF2) en la etapa c), especialmente preferidos todos estos compuestos. Estos compuestos y factores aumentan la robustez y formación de cavidades del modelo tisular inventivo. Preferiblemente y/o albúmina se utiliza también, opcionalmente en combinación con Activina A, BMP y/o FGF. La albúmina protege a las células de la toxicidad de pequeñas moléculas como los activadores/inhibidores WNT y, por lo tanto, es muy recomendable en la etapa c), pero también o alternativamente en la etapa b).

Los antagonistas de WNT son conocidos en la técnica. También se denominan inhibidores de WNT e inhiben la actividad de la vía WNT. El antagonista de WNT se selecciona preferentemente entre Wnt-C59, IWR-1, XAV939, IWP-2, IWP-4, DKK1 o una combinación de los mismos (por ejemplo, Figura 9). Los antagonistas de WNT particularmente preferidos son IWP2 y XAV, por ejemplo a una concentración de al menos 1 pm, preferiblemente al menos 5 pm. El antagonista de WNT puede no utilizarse durante toda la duración de la etapa c) (al menos 3 días), sino que puede, por ejemplo, utilizarse sólo de 12h a 48h, preferiblemente de 18h a 36h, especialmente al inicio de la etapa c) o su inicio del tratamiento dentro de las 12h siguientes al inicio de la etapa c). Preferiblemente el antagonista WNT se utiliza al menos 3 días o durante toda la etapa c). El medio utilizado en la etapa c) puede ser similar al de la etapa b), y comprende preferentemente los aminoácidos necesarios para el crecimiento celular y una fuente de energía, como un hidrato de carbono, preferentemente glucosa. Se prefieren además vitaminas y/o sales como se ha descrito anteriormente.

El medio comprende preferentemente factor de crecimiento de fibroblastos, preferiblemente FGF2, a una concentración preferida de al menos 6 ng/ml. El medio comprende preferiblemente proteína morfogenética ósea, preferiblemente BMP4, a una concentración preferida de al menos 8 ng/ml.

Después de la etapa c) las células, que forman agregados con cavidades en este punto, se dejan diferenciar más en un medio apropiado. Esto se hace en un paso opcional d). En consecuencia, el procedimiento inventivo comprende la etapa d), diferenciando además el agregado con mesodermo cardíaco en un tejido con una capa de cardiomiocitos con factores de diferenciación cardíaca para un día o más, por ejemplo de 1 a 3 días, preferiblemente 2 días. Medio, recipientes de cultivo y los factores de diferenciación pueden ser los mismos que para la etapa c). La inhibición de WNT ya no se utiliza en este punto.

El medio para la etapa d) comprende preferiblemente factor de crecimiento de fibroblastos, preferiblemente FGF2, a una concentración preferida de almenos 6 ng/ml. El medio comprende preferiblemente proteína morfogenética ósea, preferiblemente BMP4, a una concentración preferida de al menos 8 ng/ml. Preferiblemente también se utiliza insulina. El ácido retinoico puede utilizarse además durante este paso, que impulsa aún más la diferenciación para una diferenciación completa.

Preferiblemente los medios en cada etapa a), b) y o c) y/o d) se cambian cada día o cada 2 días o cualquier intervalo entre estos valores.

El procedimiento inventivo puede comprender además la maduración de las células en un medio con nutrientes, preferiblemente al menos hasta que se forma una capa interna de células endoteliales cardíacas que recubren la cavidad interior. No es necesario seguir induciendo la diferenciación para dicha etapa de maduración. Tras las etapas c) o d), los modelos de tejido son estables y pueden mantenerse. Durante dicho mantenimiento las células pueden madurar más, manteniendo el sello distintivo de la invención, la gran cavidad interior. La maduración puede conducir a la formación de una capa interna de células endoteliales cardíacas, por ejemplo, que se asemeja al revestimiento endocárdicoin vivo(por ejemplo, Figura 8).

La diferenciación de las células endoteliales cardíacas puede prevenirse mediante el uso de un inhibidor de la señalización del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular). Según una opción de la invención, se aplica un inhibidor de VEGF en los pasos b) y/o c), y/o en la etapa opcional d), para evitar la diferenciación de las células endoteliales cardíacas. Un ejemplo de inhibidor de VEGF es el inhibidor de VEGFR Sunitinib o un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, Figura 5, 6).

Por otra parte, es posible cultivar las células con VEGF para aumentar la formación de células endoteliales cardíacas. Un Ejemplo de VEGF es VEGF-A. Esto dará lugar a modelos de tejidos con mayor contenido de células endoteliales como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, 40% o más células endoteliales cardíacas. El VEGF se aplica preferiblemente en la etapa b), opcionalmente también en la etapa c) o no en la etapa c)(por ejemplo, las figuras 4 y 7).

Cuando se utiliza el VEGF, sorprendentemente se observó que la activación de WNT (en la etapa b) puede utilizarse para controlar la ubicación de la formación de células endoteliales, es decir, dentro (mirando hacia la cavidad interna) o en el exterior del modelo de tejido. Dicho procedimiento puede comprender la adición de activador de WNT, preferiblemente CHIR99021, en una cantidad suficiente para inducir la formación de células endoteliales cardíacas en el exterior del modelo de tejido cardíaco, preferiblemente 1UM-10 pm CHIR99021, durante la etapa b). Una menor cantidad de WNT puede conducir a la formación de una capa interna de células endoteliales, como no CHIR a 5 pm CHIR99021 dependiendo de la línea celular (por ejemplo, Figura 4, 7, 8).

La adición de VEGF ayuda a desarrollar modelos de tejido con tres capas separadas, como en la orientación siguiente, desde el interior al exterior: cavidad - cardiomiocitos, fibroblastos derivados del endocardio y células endoteliales cardiacas (Figuras 18 F, F', F" y 19A). El modelo de tejido inventivo puede tener esta orientación. También es posible estimular el desarrollo de un revestimiento endotelial interno sin VEGF, por ejemplo, en condiciones de baja activina, por ejemplo, activina A baja, como 5ng/ml o menos. Estas cifras pueden variar en función de los tipos de células utilizados. El modelo de tejido puede tener un revestimiento endotelial interno.

El procedimiento inventivo puede comprender además, opcionalmente, la etapa de añadir células epicárdicas al modelo tisular (por ejemplo, Figura 11). Este paso puede realizarse directamente después de los pasos c), d) o en cualquier momento durante la maduración. La adición de células epicárdicas conduce a la formación de una capa epicárdica en el exterior del modelo de tejido. Tras una maduración aún mayor, esta capa epicárdica puede dar lugar a SMC cardíacas y/o fibroblastos, como se ha señalado anteriormente. Las células epicárdicas pueden añadirse simplemente al cultivo de los modelos de tejido y pueden adherirse a los modelos y extenderse/migrar de los mismos para proporcionar la capa exterior.

El tejido cardiaco inventivo puede utilizarse para recapitular condiciones específicas normales o anormales del corazón, como enfermedades, dolencias o lesiones, así como la recuperación de dichas condiciones. El modelo inventivo de tejido cardíaco puede comprender una lesión o una lesión cicatrizada. El procedimiento inventivo puede comprender provocar una lesión en el modelo de tejido y, opcionalmente, una recuperación posterior de dicha lesión. Los agentes, como los compuestos de prueba, pueden ser probados para causar tal condición o para probar los efectos del compuesto durante una lesión, así como para o durante los procesos de recuperación y/o curación.

La lesión o lesión cicatrizada del modelo de tejido puede comprender cantidades elevadas de fibroblastos y/o colágeno y fibronectina en comparación con las partes no lesionadas del modelo de tejido cardíaco. Por ejemplo las cantidades elevadas de fibroblastos en la lesión o lesión cicatrizada son al menos 2 veces, preferiblemente al menos 3 veces, especialmente de forma preferente de 3 a 25 veces, como de 3,3 a 21,7 veces, como en comparación con las partes no lesionadas del modelo de tejido cardiaco. Las cantidades elevadas de colágeno y/o fibronectina en la lesión o lesión cicatrizada puede ser al menos 1,1 veces, preferiblemente al menos 1,25 veces, especialmente preferido 1,3 veces a 3 veces, tal como 1,33 veces a 2,13 veces, en comparación con las partes no lesionadas del modelo de tejido cardíaco.

La lesión o lesión cicatrizada puede ser por congelación, por ejemplo, una crio-lesión. Una crio-lesión es un modelo de lesión reproducible y es preferentemente utilizada para estudios normalizados, como los de los compuestos de ensayo mencionados anteriormente.

La parte de la lesión o de la lesión cicatrizada del modelo de tejido cardíaco es preferiblemente del 1% al 30%, preferiblemente del 4% al 20%, del volumen del modelo de tejido cardíaco. Dado que las células, por ejemplo los fibroblastos, migran del tejido sano al tejido lesionado, se prefiere que quede suficiente tejido sano. En otras realizaciones, los fibroblastos también pueden migrar desde tejidos adyacentes y su migración no depende de los volúmenes sanos. Como tal también herido o las partes lesionadas cicatrizadas de mayor tamaño son posibles, por ejemplo, del 1% al 80% del volumen del modelo de tejido, preferiblemente del 10% al 60% del volumen del modelo de tejido.

La lesión o lesión cicatrizada puede comprender cantidades aumentadas de colágeno en comparación con una parte no lesionada del modelo de tejido o un depósito de colágeno. Dicho aumento puede ser, por ejemplo, de al menos 1,5 veces, o al menos 2 veces.

La invención proporciona además un modelo de tejido cardiaco obtenible por cualquier procedimiento de la invención. El modelo de tejido cardiaco obtenido puede tener cualquiera de los elementos estructurales descritos anteriormente.

La presente invención comprende además un kit para realizar un procedimiento de la invención. Dicho kit puede comprender un i) activador de WNT y/o inhibidor de GSK3-beta, ii)un inhibidor de PI3 quinasa, iii) un recipiente de cultivo celular de baja adherencia, iv) albúmina. Todos estos, en particular ejemplos preferidos de los mismos, se describen arriba. El kit puede incluir cualquier otro componente utilizado en el medio como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, puede comprender además un Inhibidor de WNT, BMP, FGF, insulina, albúmina, etc. En particulare se prefiere una combinación con BMP, o cualquier otro compuesto adicional o alternativo por las razones mencionadas anteriormente. El kit puede utilizarse en un procedimiento de utilización de los procedimientos inventivos descritos arriba.

El kit puede incluir además instrucciones para llevar a cabo el procedimiento inventivo. Dichas instrucciones pueden estar impresas o en un formato legible por ordenador en un soporte de datos adecuado.

La presente invención proporciona además un plato de recipiente que comprende al menos 10 compartimentos. El procedimiento inventivo proporciona resultados homogéneos y reproducibles de modo que en cada compartimento un modelo de tejido según la invención, preferiblemente en la misma fase de desarrollo. La alta reproducibilidad y robustez del procedimiento es una ventaja especialmente cuando se realizan pruebas comparativas paralelas, como cribados genéticos o pruebas de compuestos (por ejemplo, figuras 9, 12).

El procedimiento inventivo puede utilizarse para la detección o el ensayo de un compuesto candidato en función de sus efectos sobre el desarrollo y la función del corazón (por ejemplo, Figura 9). Dicho procedimiento puede comprender la generación de un modelo de tejido cardiaco según la invención mientras se tratan las células (en cualquier fase del desarrollo, por ejemplo, fase a), b) y/o c) y/o d), con el compuesto candidato. Además, el modelo tisular final puede utilizarse para probar el compuesto candidato. El procedimiento puede comprender la comparación del desarrollo o la funcionalidad del modelo de tejido cardíaco con el desarrollo o funcionalidad de un modelo de tejido cardíaco que no fue tratado con el compuesto candidato. Para la comparación, todos los pasos del tratamiento deben ser los mismos, excepto, por supuesto, el tratamiento con el compuesto candidato. Una función de ejemplo es, por ejemplo, cualquier función del corazón, como el comportamiento de los latidos (intensidad y/o ritmo, por ejemplo, arritmias) o el recambio metabólico o la expresión genética de genes de interés que puedan verse influidos por el compuesto candidato. El desarrollo de la función puede ser un desarrollo o función tóxica que pueda ser causada por el compuesto candidato. Como tal, el procedimiento inventivo o modelo de tejido puede utilizarse para pruebas de toxicidad o cribado.

De forma similar a los compuestos candidatos, puede probarse una alteración genética. Por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento de observación de los efectos de genes mutados (por ejemplo, relacionados con enfermedades), suprimidos o sobreexpresados durante el desarrollo del corazón que comprenden la generación de un modelo de tejido cardíaco según la invención en el que las células tienen un gen candidato suprimido o sobreexpresan un gen candidato y comparando el desarrollo del modelo de tejido cardíaco con el desarrollo de un modelo de tejido cardíaco que no se generó con un gen sobreexpresado (por ejemplo, Figura 12). La mutación, sobreexpresión o supresión de la expresión puede realizarse con cualquier procedimiento conocido en la técnica, como la supresión por knock out génico, inhibición por siARN o inactivación basada en CRISPR/Cas. La sobreexpresión puede realizarse mediante la introducción de un transgén o la aplicación de un activador génico que conduce a la regulación al alza de la expresión de un gen. Dichos tejidos mutados o procedimiento que utiliza la mutación en las células y que genera tejidos cardíacos inventivos con estas células también puede utilizarse para seleccionar o probar un compuesto candidato como se ha discutido anteriormente. Como tal, la invención proporciona el uso de los tejidos cardíacos inventivos o los procedimientos como modelos de enfermedad, por ejemplo modelos de cardiopatías, en particular para estudiar las funcionalidades del corazón. En consecuencia, el procedimiento de cribado o ensayo de un compuesto candidato también puede combinarse con la observación de los efectos de genes suprimidos o sobreexpresados. En el procedimiento combinado, pueden hacerse comparaciones entre las variantes del tejido o procedimiento con ("drogado") o sin ("no drogado") tratamiento candidato, ambos con la mutación o entre las variantes mutada y no mutada, ambos en configuración drogada, o una comparación entre los cuatro estados (mutado drogado, mutado no drogado, no mutado drogado, no mutado no drogado).

Se proporciona el siguiente esquema experimental, que resalta algunos elementos preferidos que pueden seleccionarse según la invención. En el se dan aún más elementos preferentes entre paréntesis.

Un primer medio pluripotente para el cultivo de células madre pluripotentes que puede proporcionarse en la etapa a) se basa preferentemente en el medio E8. Este medio se modifica incluyendo BSA (2,5 pg/ml) y aumentando la dosis de FGF2 humano a 200ng/ml. Las células son pasadas en placas de 12 pocillos, ya sea por TrypLE como células individuales o por EDTA en forma de pequeños grumos, pero esto no afecta a la generación de organoides. Cuando las células pluripotentes se cultivan en condiciones comerciales estándar sin las combinaciones anteriores, el protocolo no funcionó tan bien. El estadio de pluripotencia se caracteriza por la expresión de SOX2, OCT4 y NANOG como principales marcadores celulares.

La siguiente etapa del protocolo es la inducción de mesodermo en diferenciación (Etapa b)). Se utiliza el medio de diferenciación de base CDM (Johansson & Wiles Molecular and Cellular Biology, 1995, p. 141-151). Contiene BSA como adición destacable. El medio de diferenciación CDM contiene los ligandos de señalización FGF2 (200ng/ml), Activina A (50ng/ml), BMP4 (10ng/ml) y CHIR99021 (activador de la señalización WNT) a concentraciones variables. Como aspecto único se utiliza el inhibidor de PI3-quinasa LY294002 (a 5-10|jm). El objetivo es garantizar que todas las células salgan de la pluripotencia en 24h, para que la diferenciación sea más homogénea posteriormente. Sin embargo, la adición de Activin, FGF2 y BMP4 no son esenciales, ya que es posible obtener inducción del mesodermo sólo con CHIR99021 (también abreviado "CHIR") en CDM, pero en este caso los resultados podrían ser más variables. La dosis de CHIR se optimiza para diferentes líneas y varía de 1 jm a unos 10jm. Marcadores mesodérmicos típicos expresados en esta etapa son: BRA, EOMES, MIXL1, TBX6, GSC.

Un punto sobre la inducción del mesodermo es el momento en que se induce la diferenciación. Se han probado y trabajado tres opciones: las células pluripotentes de una placa 2D de 12 pocillos se dividen y se sembraron en una placa ULA (fijación ultra baja) de 96 pocillos, se dejaron durante otras 18-36h en medio de pluripotencia E8 y luego se indujo el mesodermo. La segunda posibilidad es sembrar las células pluripotentes e iniciar la inducción del mesodermo en CDM inmediatamente, y la tercera opción es iniciar la inducción del mesodermo en cultivo 2D y después de la primera etapa de 36h, dividir las células en placas de 96 pocillos de baja fijación para cultivo en 3D. La segunda y la tercera opción tienden a dar diferenciaciones más limpias y homogéneas con mayor número de células (por ejemplo, >2000 células/agregado, sin embargo la primera opción funciona como homogénea con <2500 células).

La siguiente etapa es la diferenciación del mesodermo cardíaco (Paso c)), que se continúa en las placas ULA de 96 pocillos, dura 4 días y es el momento en que aparecen las cavidades internas. Se realizó en medios CDM con inhibición de FGF2, insulina, BMP4 e inhibidores de WNT por los inhibidores IWR-1, XAV939 o IWP-2 (también funcionan otros). Se comprobó que la inhibición externa de WNT por sí sola es suficiente para inducir las cavidades en medio CDM. Sin embargo, la actividad endógena de otras vías como la BMP, que se encuentra aguas abajo de la WNT, también es beneficiosa. Esta etapa es donde se activa el programa cardiaco-específico incluyendo algunos marcadores estructurales que seguirán aumentando hasta el día 7 del protocolo. Los marcadores estructurales observados son: MYH6, 7, MYL7, Troponina T, a-Actinina; los factores de transcripción que impulsan este programa aguas arriba son: NKX2-5, HAND1, TBX5, ISL1, GATA4/6.

Una etapa final de maduración con diferenciación adicional utiliza FGF2 y BMP4 durante 2 días y esto impulsa con fuerza la diferenciación final en cardiomiocitos latientes comoin vivo.Esta etapa de nuevo no es esencial porque dejar las células sólo en CDM más la insulina puede ser suficiente, pero será variable. Las células en esta etapa siguen expresando marcadores estructurales y factor de transcripción mencionados para el estadio de mesodermo cardíaco. En la etapa final es la maduración en CDM insulina solamente, entonces los organoides de cardiomiocitos tienden a madurar más después de aproximadamente un mes, como se observa por la regulación al alza del marcador ventricular MYL2. En general, estos cardiomiocitos en organoides 3D tienen mayores niveles de expresión génica cardiaca en comparación con los cardiomiocitos en 2D. Con este protocolo las células endoteliales cardíacas (CEs, CD31+, CDH5+) aparecen con el tiempo son detectables ya alrededor del día 4-5, pero aumentan en número después de un mes y forman un bonito revestimiento de la cavidad interior. Sin embargo, la gran mayoría de las células en este protocolo básico siguen siendo cardiomiocitos (alrededor del 80-90%), mientras que las células endoteliales cardiacas son esencialmente el resto. No se detectaron otros tipos de células, ni endodermo ni ectodermo derivativos.

Si se desea producir organoides con más cardiomiocitos (más del 95%) sin ni siquiera células endoteliales, se puede utilizar un inhibidor de VEGF, como Sunitinib (100nM, un inhibidor de la vía de VEGF) en los primeros 10 días de diferenciación o durante más tiempo (p.ej. Figura 6). Ventajosamente, ambos protocolos (sin y con VEGF) permiten el mantenimiento de estas estructuras durante meses, lo que de nuevo es muy importante para aplicaciones y pruebas de cribado.

Es posible controlar las proporciones de células. Por ejemplo es posible modificar el estadio del mesodermo cardíaco añadiendo VEGF (200ng/ml) para inducir también el destino de las células endoteliales. Con 200ng/ml de VEGF la relación cardiomiocitos/células endoteliales es típicamente alrededor de un 53% de células endoteliales y un 41% de cardiomiocitos con alrededor de 5% de variación (otras proporciones son posibles cambiando la concentración de VEGF) (por ejemplo, la figura 4). Las células endoteliales forman un compartimento/revestimiento alrededor de los cardiomiocitos en condiciones con alta actividad WNT (5-8jm CHIR) durante la inducción del mesodermo frente al revestimiento interior orientado hacia la cavidad en los organoides inducidos con menor actividad WNT (1-4jm CHIR). Así, es posible controlar las proporciones de células, pero también si el revestimiento endotelial está dentro o fuera. Este control es un aspecto importante porque diferentes aplicaciones pueden depender de ello. Además, existe un espacio entre los compartimentos endotelial y cardiomiocitario, como se observain vivodurante la fase de tubo cardíaco. Podemos observar la expresión de fibronectina en los cardiomiocitos frente a ese espacio que es coherente con la situaciónin vivo.Se trata de un componente fundamental para la gelatina cardiaca que se forma entre las células endoteliales y cardiomiocitos.

Un punto importante aquí es también que estas células endoteliales son más parecidas al endocardio (por lo que son verdaderas células endoteliales cardíacas del corazón) ya que expresan niveles más altos de NPR3 y NFATC1 en comparación con las células endoteliales no cardiacas de control (por ejemplo, Figura 4E). También expresan los genes HOX correctos típicos para el corazón (gama HOX1-5).

Otro punto importante es que la activación de los genes mecanosensores (SOX18, KLF2, CDH5, FOS, TEK, FOXO1) en las células endoteliales de organoides se observa lo contrario que cuando las células endoteliales son sólo cultivadas en 2D. Se trata de una característica biológica muy importante de las células endoteliales cardíacas verdaderas más funcionales (por ejemplo, la figura 4).

Un tercer linaje que se añade preferentemente es el epicardio (WT1+, TCF21+, TBX18+) para el que se aplican pasos adicionales. Una vez más, el CDM se utiliza preferentemente en cultivo 3D (por ejemplo, figuras 10, 11). Se añaden células epicárdicas a los organoides cardíacos, lo que produce un epicardio que envuelve los organoides desde el exterior en cuestión de días (comoin vivo,y posteriormente las células del epicardio se diferencian en células de músculo liso (SM22+, Calponina+) y fibroblastos cardíacos (DDR2+, Vimentina+) que migran al tejido de cardiomiocitos (por ejemplo, Figura 11). Esto es lo que ocurre también in vivo. Las células del músculo liso y los fibroblastos no son simplemente añadidos sino que se desarrollan de forma natural, lo que es importante para su correcta función. El desarrollo natural del sistema es importante para la funcionalidad del producto final.

En general, hay varios productos finales posibles. Modelos de tejido u organoides preferidos son con: a) más del 95% de organoides puros de cardiomiocitos, b) 90% de cardiomiocitos y 10% de células endoteliales con revestimiento interno; c) 45% de cardiomiocitos y 55% de células endoteliales (o alguna otra proporción que pueda manipularse con VEGF), d) cardiomiocitos y epicardio solos, f) los tres linajes principales juntos (por ejemplo, Figura 11G), g) y finalmente si el epicardio se diferencia en células de músculo liso cardiaco y fibroblastos cardiacos, habrá cinco tipos celulares, todos esenciales para la función cardiaca y todos son tipos de células cardiacas comoin vivo(por ejemplo, la figura 11). No se detectan tipos celulares que no pertenezcan al corazón (como endodermo, endotelio hemogénico, células del músculo liso no cardiacas y fibroblastos no cardiacos que no deriven del epicardio, etc.). Preferentemente, el modelo tisular comprende fibroblastos derivados del endocardio, tales como 0,1% a 40%, preferentemente 1% a 35%, especialmente preferido 10% a 30%, fibroblastos derivados del endocardio. Preferiblemente, el modelo de tejido comprende al menos un 1%, preferiblemente al menos un 5%, de fibroblastos derivados del endocardio.

Un rasgo distintivo del invento es su arquitectura, por lo que los cardiomiocitos y células endoteliales orientadas hacia una cavidad interna, células epicárdicas alrededor de la estructura y células cardiacas del músculo liso migratorias y los fibroblastos cardíacos migran al miocardio. Así es como se forman las cavidades/cámaras cardíacas también in vivo y esta arquitectura específica con todas sus variaciones es muy importante para la funcionalidad y aplicabilidad para modelar y probarin vivoel desarrollo y el comportamiento fisiológico.

La presente invención se ilustra además mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin limitarse a estas realizaciones de la invención.

Figuras

Figura 1:Descripción general del protocolo básico de organoides cardíacos a partir de células madre pluripotentes, agregación en placa de 96 pocillos, formación de cavidad cardiaca hasta la etapa de cardiomiocitos latiendo. A continuación se muestra un curso de tiempo real con sección.

Figura 2:Un organoide cardíaco en d7.5 derivado de hPSCs (WTC MYL7-GFP) utilizando una concentración de 8|jM CHIR99021 durante la inducción. Izquierda: imagen de campo claro de montaje completo que muestra el tamaño del organoide. Derecha: Criosección teñida con DAPI que muestra la relación del organoide con el tamaño de la cavidad. B Agregado de células mesodérmicas derivadas de 1000 hPSCs (WTC MYH10-GFP) mostrando que las hPSCs salieron eficientemente de la pluripotencia después de 40h de inducción mesodérmica (usando 8j M CHIR99021) mediante la regulación al alza del marcador de estría primitiva T y la regulación a la baja del marcador de pluripotencia SOX2. C Organoide cardíaco (WTC MYL7-GFP tras 10 días en cultivo que muestra la expresión endógena del marcador MYL7 específico de los cardiomiocitos.

Figura 3: A: Sección de un organoide en el día 3,5 que muestra la ausencia de los marcadores endodérmicos SOX17y EOMES. Scalebar 200 jm .

Figura 4: A: Imágenes esquemáticas y de campo claro del protocolo para generar organoides cardíacos que contienen cardiomiocitos (CM) y células endoteliales (CE) en capas separadas. Las flechas indican la cavidad formada.B: Múltiples organoides cardíacos que muestran la expresión de MYL7-GFP (verde) y CDH5-Tomate (rojo) en distintas capas.C:Cuantificación de los resultados de la citometría de flujo que muestran lacomposición media de los organoides es de un 53% de CE y un 41% de CM.D: Sección a través de un organoide mostrando la presencia de una caviada interior rodeada por un anillo de CM que expresan MYL7-GFP y HAND1, que a su vez están rodeados por una capa de CE que expresan CD31.E:Mapa de calor de los recuentos vst (transformación de varianza estabilizada) de diferentes CE y células madre pluripotentes que muestran la expresión de genes HOX. Las CE analizadas son: células endoteliales microvasculares cardíacas humanas 2D (HCMEC), CE 2D diferenciadas con el protocolo de diferenciación anterior, CE 3D CDH5-Tomate positivas procedentes de organoides cardíacos, células endoteliales de vena umbilical humana 2D (HUVEC), CE 2D diferenciadas con el protocolo de Patsch et al. (ejemplo 3), CE 3D procedentes de organoides vasculares (Wimmer et al., véase el ejemplo 3). La expresión génica HOX de las CE procedentes de organoides cardíacos muestra una firma muy similar en comparación con las HCMEC. F: Secciones de 6 pm y 4 pm CHIR99021 (CHIR) que muestran un anillo interior de CE que expresan CD31 en la condición CHIR inferior (4pm). La tinción con caspasa 3 escindida indicó niveles bajos de apoptosis en la condición CHIR 6 pm, pero niveles elevados en el interior del anillo CE (CD31+) en la condición CHIR 4 pm VST=transformación de varianza estabilizada.

Figura 5: A: Imágenes de campo claro (BF), MYL7-GFP, CDH5-Tomate y fusionadas de organoides tratados con sunitinib (100 nM) designados como "+Sunitinib" o diferenciados con el protocolo estándar ("Normal"). Las imágenes muestran una expresión más homogénea de MYL7-GFP en la condición "+Sunitinib" y una ausencia de expresión de CDH5-Tomate en ambas condiciones. Cada imagen de organoide mide 2500x2500 pm

Figura 6: A: Imágenes representativas de la estrategia de cuantificación realizada sobre los datos de citometría de flujo al final de la diferenciación (día 7,5). "WT CTRL" designa las células silvestres de organoides que no expresan ningún fluoróforo, "Normal" designa el protocolo de diferenciación estándar, y "+Sunitinib" designa los organoides que fueron tratados con sunitinib (100 pm).

B: La cuantificación de los datos de citometría de flujo muestra alrededor de un 60% de Cardiomiocitos que expresan MYL7-GFP en el protocolo estándar que pueden aumentar al 96% con el tratamiento con sunitinib. La cuantificación también muestra aproximadamente un 2% de células que expresan el endotelio marcador CDH5-Tomate en el protocolo estándar y un nivel similarmente bajo de 3% en la condición "+Sunitinib".

Figura 7: A: Imágenes representativas de secciones de organoides que contienen cardiomiocitos (CM) y células endoteliales (CE) en capas separadas. Una imagen de campo claro (BF) muestra la organización celular y las imágenes para MYL7-GFP (CM) y CD31 (CE) muestran una cavidad interior rodeada por una capa de CM que a su vez está separada de la capa CE por otra cavidad.B: Imágenes representativas de secciones de organoides que contienen cardiomiocitos (CM) y células endoteliales (CE) en capas separadas. Una imagen BF muestra la organización celular y una tinción para el marcador CM TN NT2 muestra su solapamiento con el otro marcador CM MYL7. Barra de escala = 200pm.

Figura 8:Organoide cardíaco en d27 derivado de hPSCs (WTCMYL7-GFP) utilizando una concentración de 4pM de CHIR99021 durante la inducción mostrando el revestimiento de las cavidades internas por células (CD31+) endoteliales.

Figura 9: A: Imagen fusionada de imágenes de campo claro (BF), MYL7-GFP y CDH5-Tomate que muestra la organización en dos capas de los cardiomiocitos (MYL7-GFP) y las células endoteliales (CE, CDH5-Tomate) cuando se utilizan diferentes inhibidores de Wnt (IWR-1 (IWR), XAV939 (XAV) e IWP2 (IWP)) durante la diferenciación con dos concentraciones de CHIR99021 (5 pm (CHIr 5) y 6 pm (CHIr 6)). También se incluye una condición "IWP -VEGF" que muestra la ausencia de CE. Cada imagen de organoide mide 2000x2000 pm.

Figura 10: A.Representación esquemática de la diferenciación epicárdica.B.Mapa de calor de los recuentos vst (transformación estabilizada por varianza) de las distintas fases de diferenciación epicárdica. Los marcadores de pluripotencia se autorregulan tras la inducción del mesodermo, mientras que, con el tiempo, aumenta la expresión de marcadores específicos del mesodermo cardíaco. Durante la especificación epicárdica y el mantenimiento se puede observar la expresión de marcadores específicos del epicardio.C.Expresión de los marcadores epicárdicos TCF21 y TBX18 del epicardio y del epicardio replicado con fibronectina en comparación con la pluripotencia observada por qPCR.D.Las células epicárdicas al final de la diferenciación (día 8,5) y después de la relación son altamente positivas para el marcador epicárdico WT1 (proteína del tumor de Wilms), como se observa mediante tinción con anticuerpos. Barra de escala: l00 pmE.Tras l2 días de diferenciación de SMC (células del músculo liso) del epicardio replicado en presencia de TGF-beta, insulina, ácido L-ascórbico y PDGF-BB, las células obtenidas son altamente positivas para los marcadores SMC a-SMA (actina muscular lisa alfa) y calponina. Barra de escala: 1 mm, la imagen combinada y ampliada es de 1 mm x 1 mm.F.Tras 12 días de diferenciación de CF (células similares a fibroblastos cardíacos) del epicardio replicado en presencia de TGF-beta, insulina, ácido L-ascórbico y FGF, las células obtenidas son altamente positivas para los marcadores de CF DDR2 (Dis- coidin Domain Receptor Tyrosine Kinase 2) y vimentina. Barra de escala: 1 mm, la imagen fusionada y ampliada es de 1 mm x 1 mm.

Figura 11: A.Representación esquemática del sistema de co-cultivo epicárdico con diferenciación de organoides cardíacos. (dpf: días post fusión)B.Organoide cardíaco co-cultivado junto con epicardio, 2 días post fusión. El epicardio sigue expresando el marcador epicárdico WT1 (proteína del tumor de Wilms), mientras que el organoide cardíaco es altamente positivo para la cTNT (troponina-T cardíaca). Barra de escala: 100pM(b') y 50 pM (b'').C.Células epicárdicas (marcadas por la expresión de TdTomate) migran a la capa de cardiomiocitos (marcada por flechas), y sufren la subsiguiente diferenciación marcados por SM22 (Taglin) y VIM (vimentina). Especimen fijo 24 dpf. Barra de escala:20 pM.D.Las células epicárdicas forman la capa externa de los organoides cardíacos y también migran a la capa cardíaca (el epicardio está marcado por la expresión de TdTomate). Las células son positivas para el Col1A2, específico de fibroblastos. Especimen fijo 8 dpf. Barra de escala: 50pm.E.Las células epicárdicas migran a la capa cardíaca (el epicardio está marcado por la expresión de TdTomate). Las células son positivas para el DDR2 (Discoidin Domain ReceptorTyrosine Kinase 2) específico de fibroblastos. Espécimen fijo 7 dpf. Barra de escala: 20 |jm.F.Las células epicárdicas forman la capa externa de los organoides cardíacos y también migran a la capa cardíaca (el epicardio está marcado por la expresión de TdTomate). Las células son positivas para la decorina específica de fibroblastos. Especimen fijo 16 dpf. Barra de escala: 50 jm .G:Esquema del modelo cardiaco trilnaje con células epicárdicas externas, capa cardiomiocítica media y capa endocárdica interna (células endoteliales cardiacas).

Figura 12: A: Organoides (células iPS WTC) en el día 3,5 tratados con los inhibidores de BMP Noggin y LDN193189 seguidos de la cuantificación del diámetro que muestra una disminución significativa del diámetro con los tratamientos inhibidores. B: Organoides (células madre embrionarias H9) en el día 3,5 de células de control de tipo salvaje (WT) comparadas con células inactivas (KO) de HAND1. La cuantificación muestra una reducción significativa del tamaño del diámetro en los organoides KO.

Figura 13: Ilustración de organoides cardíacos ("cardioides") y algunos usos de los mismos.Izquierda: producto de cardioides y uso en procedimientos de alto rendimiento. Centro: diferentes cardioides en diferentes estadios, con revestimiento interno de cardiomiocitos o epicardio, con y sin células epicárdicas en el exterior. El uso como modelo de lesión, por ejemplo mediante crio-lesión, se ilustra en la parte inferior con fibroblastos infiltrados en la zona lesionada. Derecha: modelización de una cámara cardíaca.

Figura 14: Formación de estructuras similares a cámaras cardíacasin vitro(A)Protocolo de diferenciación cardíaca. Activación de la señalización WNT (mediante CHIR99021), inhibición de la señalización WNT (mediante IWP-2/IWR- 1/XAV-939), inhibición de la señalización PI3K (mediante LY294002).(B)Imagen representativa de montaje completo (día 5,5) de un enfoque de diferenciación de alto rendimiento que muestra una sólida generación de estructuras latientes con cavidades en tres réplicas biológicas (línea iPSC WTC).(C)Crio-sección de una cardioide en d7.5 mostrando la cavidad y la expresión del marcador específico del CM TNNT2. Barra de escala: 200 jm .(D)Cuantificación de células TNNI1-GFP+ en cardioides a d7.5 mediante citometría de flujo.(E)Mapa de calor que muestra la transcripción de cambio de genes cardíacos clave, incluidos los marcadores del mesodermo cardíaco entre d1,5 y d5,5, durante la especificación y el mantenimiento del CM. VST: recuentos transformados con varianza estabilizada. (F) Resultados de RT-qPCR de organoides de día 14 con Activina y CHIR99021 variables en la etapa de inducción y variando la concentración de ácido retinoide en la etapa de mesodermo cardíaco con la presencia o ausencia del SB 43154. La barra de escala muestra el cambio de pliegues con respecto al gen de referencia, PBGD y células madre pluripotentes normales con normalización min-max. (G) Inmunotinción para CMs ventriculares (IRX4) y auriculares (NR2F2) de un cardioide (d10) mostrando las condiciones optimizadas del ventrículo izquierdo (A4CH4 RA50) frente a la condición no optimizada (A50CH4 RA500). A, Activina; CHIR, CHIR99021, RA, ácido retinoico; SB, SB 43154. Barra de escala: 100 jm . (H) Análisis de scARN-seq del porcentaje de CMs en las células intermedias de WNT(CHIR6)/Activina alta (A50)/RA500 (N=2, n=1717) frente a baja WNT(CH4)/Baja Activina(A4)/RA50 (N=2, n=5097) condiciones que expresan más marcadores auriculares frente a más marcadores ventriculares. TNNT2 se expresa en todos los CM. Líneas celulares utilizadas en esta figura: WTC.

Figura 15: El mesodermo cardíaco se autoorganiza formando una cavidadin vitroyex vivo.(A)Evolución temporal de la formación de cardioides.

Arriba: Cuantificación del cambio de tamaño en el curso de la diferenciación. Abajo: Imágenes de campo claro de montaje completo e inmunotinción de criosecciones que muestran el aumento de tamaño y la formación de cavidades a lo largo del tiempo. Las cavidades se observan por primera vez en d2.5 y no se forman por diferencias de apoptosis (Casp3 negativo) o proliferación regional (KI67+). Barra de escala: 500jm (imágenes de campo claro), 50jm (secciones).(B)Los explantes de mesodermo cardíaco de embriones de pollo en condiciones de mesodermo cardíaco humano forman estructuras de CM similares a cámaras con cavidades. Barra de escala: 200 jm .(C)Imágenes detalladas de organoides (desde la periferia hasta el centro) entre d1,5 y d2,5 que muestran la formación de compartimentos mesodérmicos sueltos y densos al inicio de la fase de mesodermo cardíaco mediante la expresión diferencial de F-actina (faloidina),beta-catenina unida a membrana (PY-654-beta-catenina) y N-cadherina.(D)Imagen representativa y cuantificación del número de núcleos en un cuadrado de 65 jm 2 en capa suelta (central) frente a capa densa (periférica) del mesodermo cardíaco (N=3, n=14). Líneas celulares utilizadas en esta figura: WTC.

Figura 16: WNT y BMP Controlan la Auto-Organización y Especificación Cardioide. (A)El rango de concentraciones de CHIR99021 durante la inducción del mesodermo muestra efectos dramáticos en el diámetro cardioide (día 3,5) y especificación CM (día 7,5). Protocolo a partir de 2500 hPSC. Barra de escala: 2500 jm .(B)Cuantificación de los diámetros cardioides en el día 3,5 durante la especificación del mesodermo cardíaco.(C)Los genes diana de BMP (HAND1, IRX3, BMP4, BMP2, BMPR2) se elevan en condiciones de formación de cavidades (8 jm CHIR99201), mientras que CE (PECAM1, CDH5, VEGFA) aumentan cuando se utiliza CHIR99021 4 jm .(D)La inhibición de BMP con Noggin (100 ng/ml) o LDN193189 (0,2 jm ) reduce el diámetro cardioide. Inicio del protocolo con 7500 hPSCs. Barra de escala: 1958 jm .(E)Cuantificación de los diámetros cardioides en el día 3,5 con o sin inhibición de BMP.(F) El recuento de células/organoide revela que el diámetro reducido no es función de un menor número de células.(G)Los tratamientos con Noggin y LDN193189 interfieren con la expansión de la cavidad. Barra de escala: 200 jm(H) La activación de Wnt durante la etapa de mesodermo cardíaco inhibe la diferenciación CM pero no expansión de la cavidad. Barra de escala: 200 jm . Todos los gráficos de barras muestran: Media /- DE. Líneas celulares utilizadas en esta figura: H9, WTC.

Figura 17: HAND1 es necesaria para la autoorganización del mesodermo cardíaco (d3.5) (A)Cardioide KO de HAND1 que muestra una regulación a la baja de NKX2-5. Barra de escala: 200|jm.(B)Los cardioides WT muestran un aumento del número de cavidades (flechas) y diámetro en comparación con los cardioides HAND1 KO. Barra de escala: 2000 jm .(C) Los cardioides HAND1 KO muestran un número menor y más reducido de cavidades. Barra de escala: 2000 jm .(c')y(c"), Detalle deCy confirmación de HAND1 KO mediante tinción de HAND1. Barra de escala: 200 jm .(D)Cuantificación de la expansión de la cavidad cardioide en función del diámetro en cardioides HAND1 KO y WT.(E)Porcentaje del área cardioide cubierta por cavidades en cardioides WT y KO.(F)Cronología de la formación de organoides hasta el día 3,5 (estadio de mesodermo cardíaco), punto de análisis. Aumento de señalización WNT (CHIR99021) durante la inducción del mesodermo rescata el defecto de cavidad en los organoides HAND1 KO (flechas). Barra de escala: 2500 jm .(G)La cuantificación del diámetro cardioide muestra que el aumento de activación WNT rescata el defecto de cavidad de HAND1 KO. Todos los gráficos de barras muestran: Media /-DS. Todos los datos de esta figura proceden de cardioides en d3.5. Líneas celulares utilizadas en estas figuras HAND1 KO (H9), NKX2-5 KO (H9).

Figura 18: WNT,ACTIVIN y VEGF coordinan las actividades endoteliales y Autoorganización miocárdica. (A) Una dosis baja de WNT (CHIR99021, 4 jm ) durante la inducción del mesodermo resulta en una mayor expresión de Genes especificadores deCE(VEGFA, TAL1, LMO2, ETV2, PECAM1)en comparación con WNT alto (CHIR99021,8jm).(A')Cronología de las diferenciaciones realizadas sin adición de VEGF y con dosis bajas o altas de WNT y Ac- tivina.(B)El porcentaje de CM que expresan VEGF (secuenciado unicelular) aumenta en las CM optimizadas de tipo ventricular (bajo WNT (CHIR: 4jm)/Activina baja (4 ng/ml), N=2,n=1717) en comparación con el WNT intermedio (CHIR: 6jm)/condición de Activina alta (50 ng/ml) (N=2,n=5097).(C)Imágenes de ejemplo de la aparición de revestimiento parcial de CE en la condición "Sin Activina". Barra de escala: 200 jm .(D)Cuantificación de las diferentes apariciones de formación y revestimiento de CE. N=4,n=29.(E)Imágenes de ejemplo para las categorías 1 y 2. Barra de escala: 200 jm .(F)Cronología de las diferenciaciones realizadas con VEGF añadido y WNT intermedio (CHIR: 6jm)/Alta Activina (50 ng/ml) así como la inhibición de WNT.(F')Cuantificación de los datos FACS que muestran una proporción robusta de CMs y CEs en cardioides. Media /-<d>E.(F")Los cardioides muestran la separación de las capas CM y CE, así como la aparición de una capa de células similares a fibroblastos (COL1A1+). Barra de escala: 200 jm .(G)Cronología de las diferenciaciones realizadas con VEGF añadido y WNT intermedio (CHIR: 6jm)/Alta Activina (50 ng/ml), así como la falta de inhibición de WNT.(G')Crio-sección de cardioides conteniendo sólo CEs y células fibroblásticas sin CM cuando no se inhibe el WNT durante la fase de mesodermo cardíaco y se añade VEGF. Líneas celulares usadas en esta figura: WTC.

Figura 19: Identidades celulares de las células cardioides tras el tratamiento con VEGF. (A)Clasificación de células de cardioides suplementadas con VEGF basada en marcadores determinados por(Cui et al., 2019) (corazones fetales humanos). CM: cardiomiocitos, CE: células endoteliales cardiacas, EP: células epicárdicas. Se muestran marcadores seleccionados de células endoteliales cardiacas (PECAM1, CDH5, NPR3), cardiomiocitos (TNNT2, MYL7) y células similares a fibroblastos (COL1A1, COL3A1).(B, B',B")Las células endoteliales cardíacas en cardioides expresan genes mecanosensores (por ejemplo, KLF2, SOX18). Barra de escala: 200 jm .(C)PCA de: cE derivadas en 2D (Anterior, Patsch et al., Microvascular Cardíaca Humana (HCMEC), Vena Umbilical Humana (HUVEC)), hPSC y CE derivadas en 3D de Cardioides (día 7,5, dosis intermedia de WNT) y Organoides Vasculares ((Wimmer et al., 2019)Día>18)). CEs anteriores: línea H9, Patsch et al., Vascular Organoid CEs como se indica en (Wimmer et al., 2019).(D)Expresión diferencial de genes mecanosensores y de maduración, factores de transcripción cardíacos, factores de descripción CE, genes endocardiales y genes generales de las CE en las CE clasificadas por FACS. Líneas celulares utilizadas en esta figura (a menos que se indique lo contrario): WTC.

Figura 20: El epicardio interactúa con los cardioides y los fibroblastos derivados del cardias o del endocardio reaccionan a la criolesión. (A)Esquema del co-cultivo epicárdico y crio-lesión.(B)Imágenes confocales de derivados epicárdicos marcados con fluorescencia después de 7 días de co-cultivo con cardioides (TNNT2+) que engloban CE (PECAM1+) de revestimiento interno en presencia de 100 ng/ml de VEGF-A. Barra de escala: 200 jm .(C-D)Imágenes confocales de derivados epicárdicos COL1A1+(C)y ACTA2+(D)tras 7 días de co-cultivo con cardioides que contienen CEs (PECAM1+). Barra de escala: 50 jm .(E-F)Imágenes confocales de la respuesta a la crio-lesión (1 hora y 3 días después de la lesión) tinción de fibronectina (FN1) y células COL1A1+ en cardioides en presencia(E)o ausencia(F) de epicardio. Barra de escala: 200 jm(E, F)y 50 jm(e'-detalle deE).(G)tinción Tricrómico de Masson (Azul: Tejido conectivo, Rojo: Muscle) de cardioides crio-lesionados en presencia o ausencia de epicardio 1 hora y 3 días después de la lesión. Barra de escala: 200 jm .(H)Imágenes confocales de cardioides codiferenciados CM+EC+Fibroblastos 3 días después de la lesión marcando las células FN1 y COL1A1+. Barra de escala: 200 jm .(I)Cuantificación de células COL1A1+ en la zona lesionada (púrpura) frente a la área sana (azul) de cardioides codiferenciados CM+CE+Fibroblastos 3 días después de la lesión. El número de células COL1A1+ se normalizó con respecto al área lesionada/superficie total. Las líneas discontinuas marcan la zona de la lesión en las figuras. Líneas celulares utilizadas en las figuras epicárdicas: H9, experimentos también repetidos con líneas WTC. Líneas celulares utilizadas para la co-diferenciación CM/CE/Fibroblastos: WTC.

Figura 21: Generación y caracterización funcional de estructuras similares a cámaras cardíacas. En relación con la figura 1. (A)Ejemplo de una estructura similar a una cámara de latido (día 8.5) que contiene una gran cavidad derivada de la adición de laminina LN511 (0,1 jg/m l) a la suspensión de células durante la siembra antes de la diferenciación en un pocillo de fondo plano 2D. Barra de escala: 100jm.(B)Diferenciación CM en las placas de fijación ultrabajas dan lugar a la formación de estructuras 3D latentes que contienen cavidades incluso en ausencia de moléculas MEC extrínsecas (columna "sin MEC"). Momento: día 8,5. Barra de escala:500 |jm. (C) Expresión de varios marcadores específicos de C<m>en cardioides (d7.5). Barra de escala:200 jm . (C') Detalle de (C) (TTN-GFP/ACTN2) que muestra la organización sarcomérica dentro de los CM cardioides. Barra de escala: 6 jm (D) Micrografía electrónica de un cardioide d7,5. S: sarcómero; ID: disco intercalado; Z: línea Z; D: desmosoma. Barra de escala:13h. (E) Inmunotinción con marcadores CM que muestra una sólida generación de cardioides utilizando varias líneas de hPSC (hESC H7) (hiPSC 176/177/178). Barra de escala: 200jm.(E') Imágenes de campo claro de montaje completo de varias réplicas técnicas de cardioides mostradas en (E). Barra de escala: 200jm (F) Cuantificación del solapamiento entre el área DAPI yTNNI1+en secciones ópticas que capturan 500jm de organoides. N=3,n=8. Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: WTC (si no se indica lo contrario).

Figura 22: Generación y caracterización funcional de estructuras sim ilares a cámaras cardíacas. En relación con la figura 1. (A) Mapa de calor que muestra la expresión génica de los genes estructurales cardíacos/ canal iónico en cardioides d7/d1o/d27. (B) Comparación de las firmas de expresión génica entre cardioides, CMs ensamblados en 3D, CMs en 2D y hPSC en diferentes momentos. Líneas celulares utilizadas: H9, WTC. (C) GO términos regulados al alza en cardioides de día 7 en comparación con CMs de día 7 en 2D. Líneas celulares utilizadas: H9, WTC. (D) Términos GO regulados al alza entre día 7 en cardioides y día 27 en CM agregados 3D. Líneas celulares utilizadas: H9, WTC. (E) Las estructuras tipo cámara y las CM 2D muestran transitorios de calcio similares. Los transitorios de calcio fueron analizados cargando las células con Fluo-4-AM y analizando la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. F/F0: Intensidad de fluorescencia sobre el fondo. ISI: intervalo entre picos. (F) Análisis de parámetros de latido utilizando un algoritmo publicado (Huebsch et al., 2015, Ingeniería de tejidos Parte C: Methods 21, 467-479). (G) Trazado representativo del potencial de acción medio del cardioide ventricular (d10), con APD30, APD50 y APD90 indicados. Los organoides se contrajeron con una frecuencia media (dT) de 7,33 segundos. Se tomó el promedio sobre 14 potenciales de acción de un organoide utilizando el Sistema FluoVolt. Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: WTC (si no se indica lo contrario).

Figura 23: Caracterización de Cardioides y Explantes de Mesodermo Cardíaco de Pollito. En relación con la figura 2. (A) Mesodermo cardíaco autoorganizado en d2.5 mostrando ausencia de endodermo SOX17+ y EOMES+. Barra de escala: 200 jm . (B) Formación de cavidades en cardioides (d7.5) ocurre en ausencia de células endoteliales (PECAM1+) tras el tratamiento con Sunitinib (100nM). Barra de escala: 200 jm . (C) Los explantes de mesodermo cardiaco de pollo forman una estructura esférica con cavidadesin vtrotras el cultivo en medios de mesodermo cardíaco. Barra de escala: 200 jm . (D) La sección de explantes de mesodermo cardíaco de pollitos de control (misma estructura que la mostrada en la Figura 2B) muestra una ausencia casi total del marcador SOX2 del intestino anterior. Barra de escala: 200 jm . Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: WTC (si no se indica lo contrario).

Figura 24: NKX2-5 y HAND1 KO hPSC y Caracterización Cardioide. En relación con la figura 4. (A ) Los cardioides NKX2-5 Ko no muestran deterioro de la expansión de la cavidad. Barra de escala: 200 jm . (B) Cuantificación del diámetro de los cardioides confirma la ausencia de reducción de los cardioides NKX2-5 K<o>en el día 3,5. (C) Inmunotinción de HAND1, NKX2-5 y TNNT2 en cardioides WT y NKX2-5 KO en d3.5 y d7.5. (D) Inmunotinción de NKX2-5 en organoides WT y HAND1 KO en d3.5. (E) Detalle de la inmunotinción de cardioides d7.5 que muestra la presencia de CMs (NKX2-5+/TNNT2+) en cardioides HAND1 KO. (F) Cuantificación del número de células/cardioide que no muestra cambios significativos entre WT (N=3) y HAND1 KO (N=3). (G) Inmunotinción de secciones (48 WT/47 HAND1 KO) de cardioides (d3.5) mostrando un defecto en la formación de cavidades así como la falta de expresión de la proteína HAND1 en cardioides HAND1 KO. Barra de escala: 2000jm. Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: MANO1 KO (H9), WT (H9), NKX2-5 KO (H9).

Figura 25: Otros ejemplos de la gama de autoorganización de la CE. (A) Cronología de las diferenciaciones realizadas sin adición de VEGF y en condiciones bajas de WNT y sin Activina o con Activina baja. (A') Imágenes de ejemplo de las Categorías 1 y 2 en condiciones WNT bajo/Activina baja. Barra de escala: 200 jm . (B) Cronología de las diferenciaciones realizadas con VEGF añadido después de la especificación del CM en condiciones de bajo WNT y Alto/Sin Activina. (C) y (D) La adición de VEGF tras la especificación del CM dio lugar ocasionalmente a un revestimiento parcial de las cavidades por CE, pero a menudo también a CE que formaban una capa externa parcial. Barra de escala: 200 jm . Línea celular utilizada en (D): H9. Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: WTC (si no se indica lo contrario).

Figura 26: Caracterización de cardioides con endotelio y capas celulares similares a fibroblastos. (A) Tres réplicas biológicas que muestran la generación reproducible de cardioides con capas separadas de CM y CE utilizando una dosis intermedia de WNT (CHIR99021,6 jm ). Barra de escala: 2000 jm . (B) Las CE en microtejidos de CM agregados forman una red rudimentaria dentro de los cardiomiocitos, no una capa separada.Scalebar: 400 jm . Línea celular utilizada: H9.(C) Los CE construyen una capa de red que rodea al cardioide. Max. Int. Proyecciones. Las criosecciones muestran que FN1 se expresa en los tres tipos celulares, mientras que VIM se expresa principalmente en las CE y en las células de tipo fibroblasto. Barra de escala: 200 jm . (D) Ejemplo de gráficos FACS que muestran la distribución de cardiomiocitos (CM) y (CE) en cardioides codiferenciados en el día 7,5 utilizando la línea MYL7-GFP/CDH5-To- mato iPSC (WTc ). c TRl : Línea WT WTC. (E) Mapa de calor de los datos de Smart-Seq2 de células hPSC, CM, CE y no CE/no CM (fibroblastos) seleccionadas que muestra la expresión de los genes clave respectivos. Las células similares a fibroblastos (ninguna) expresan genes relacionados con las células similares a fibroblastos putativamente derivadas de CE y confirman las tinciones de (C). (F) Tres réplicas biológicas que muestran la reproducibilidad de formación cardioide sin contribución del CM (MYL7-, CDH5+). Barra de escala: 500 |jm. Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: WTC (si no se indica lo contrario).

Figura 27: Caracterización adicional de la identidad celular cardioide. (A)Deconvolución MuSiC (Wang et al., 2019, Nature Communications 10, 380-389) de datos de ARN-seq a granel de organoides cardíacos que muestran contribuciones CM/CE similares a la cuantificación FACS y ausencia de CEs en cardioides solo CM. Conjunto de datos de referencia: ARN-seq unicelular de la trayectoria de desarrollo del corazón humano(Cui et al., 20l9, Cell Rep 26,1934-950.e1935). Líneas celulares utilizadas: H9, WTC.(B)El análisis proteómico de cardioides muestra que se detectan marcadores clave de CMs y CEs a nivel proteico.(C)El análisis de la expresión génica HOX de las CE cardioides, HCMEC y CE anteriores muestra la expresión de genes HOX anteriores, mientras que todas las demás CE muestran también la expresión de genes HOX posteriores. VST: recuentos transformados estabilizados por la varianza. CEs anteriores: Línea H9, Vascular Organoid CEs según lo indicado por Wimmer et al., 2019, Nature 565,505-510.(D)Los términos GO de genes regulados al alza en CMs muestran términos relacionados con el desarrollo del músculo cardíaco.(E)Términos GO de genes regulados al alza en las CE cardiacas.(F)Los términos GO de genes regulados al alza en células similares a fibroblastos (GFP-/Tomate-) muestran términos relacionados con el desarrollo del tejido conectivo y la organización de la MEC. Línea celular utilizada en todos los experimentos de esta figura: WTC (si no se indica lo contrario).

Figura 28: El epicardio interactúa con los cardioides y los fibroblastos derivados del epicardio o del endocardio reaccionan a la criolesión. (A)Esquema del protocolo alineado con el desarrollo.(B)Expresión diferencial de genes específicos de pluripotencia, especificación de mesodermo, mesodermo cardíaco y epicardio, comparando el día 8.5 (final de diferenciación), epicardio reimplantado en 2D y agregado en 3D. Línea celular utilizada: H9.(C)Inmunotinción de WT1 en todo el pocillo del epicardio replicado en 2D. Barra de escala: 1mm. c' es un detalle de 1x1mm de la línea celular C. Used: H9(D)Expresión diferencial de factores de crecimiento implicados en la especificación del sublinaje epicárdico en cardioides de pluripotencia y de 7/10/27 días sin co-cultivo. Línea celular utilizada: WTC.(E)Agregados 3D marcados con fluorescencia de diferenciaciones epicárdicas 2D co-cultivadas con cardioides emparejadas en el tiempo. Las flechas indican los cambios morfológicos y la propagación a lo largo del tiempo. Barra de escala: 200 jm .(F-G)Imágenes confocales de TNNT2 (CMs) y WT1 (epicardio) de co-cultivos de 2 y 7 días de epicardio y cardioides. Barra de escala: 200 jm .(H-I)Imágenes cardioides enteras de detalles de la Figura 7C-D, Barra de escala: 200 jm .(J-K)Imágenes confocales de cardioides codiferenciados CM+CE+Fibroblastos que marcan la muerte celular (<t>U<n e>L, Caspasa 3 clivada) y la ausencia de proliferación celular (MKI67) 3 días después de la criolesión. Barra de escala: 200 jm .(L)Ejemplos de áreas utilizadas para la normalización de sano frente a lesionado para la cuantificación mostrada en la Figura 7I. Las líneas discontinuas indican las áreas de lesión en las figuras. Líneas celulares utilizadas para las figuras epicárdicas: H9, experimentos repetidos también con WTC. Línea celular utilizada para la codiferenciación de CM+CE+Fibroblastos: WTC.

Figura 29:Los cardioides crio-lesionados recapitulan aspectos de larespuesta a las lesiones.

Figura 30:Necrosis en cardioides crio-lesionados como se muestra por la tinción TUNEL recapitula aspectos de la respuesta a la lesión.

Figura 31:No hay aumento de la proliferación en el lugar de la lesión - Células endoteliales fuera/parte de la zona lesionada.

Figura 32:Aumento del número de fibroblastos en la zona lesionada

Figura 33:Acumulación de FN1 en la zona lesionada.

Figura 34:Cuantificación del valor medio de intensidad de la fibronectina.

Ejemplos

Ejemplo de referencia 1: Materiales y procedimientos

Cultivo general de células madre pluripotentes humanas- Las líneas de células madre pluripotentes humanas (H9, WiCell; WT y WTC modificadas, Allen Institute for Cell Science) se cultivaron en un medio propio modificado basado en el sistema de cultivo E8. La receta E8 se complementó con 0,5% de BSA (Europa Biosciences) y FGF2 de producción propia. Las células se cultivaron en placas de cultivo tisular Corning o Eppendorf recubiertas con Vitronectina (Stem Cell Technologies) y se pasaron utilizando la enzima TrypLE Express (Gibco) o PBS-EDTA cada 3-4 días.

Diferenciación de hPSCs en cardiomiocitos en agregados 2D y 3D -Las hPSCs se sembraron a 160-175.000 células/24 pocillos de placa en E8 ROCKi (Y-27632, Tocris) durante 24h. A continuación, las células se indujeron durante 36h-40h con medio CDM (Mendjan et al. Cell Stem Cell (2014) Vol. 15, p. 310-325) que contiene FG<f>2 (30 ng/ml, Cambridge University), LY294002 (5 jm , Tocris), Activina A (50 ng/ml, Cambridge University), BMP4 (10 ng/ml, R&D Systems), CHIR99021 (11,5 jm para H9,3-4 jm para WTC, Tocris). 1 jg/m l de insulina (Roche) para aumentar la viabilidad celular durante esta fase. Este medio se denominó FLyABCH(Ins). Después de 36h

40h, las células fueron inducidas con medio CDM conteniendo BMP4(10ng/ml), FGF2 (8 ng/ml), Insulina (10 |jg/ml), IWP2 (5jm , Tocris) y Ácido Retinoico (0,5 jm , Sigma Aldrich) durante 4 días con cambio de medio cada día. Este medio se denominó BFIIWPRa. Posteriormente, el medio se cambió a medio CDM que contenía BMP4 (10ng/ml), FGF2 (8 ng/ml) e Insulina (10 jg/m l) durante 2 días con cambio de medio cada día. Este medio se denominó BFI. Para el mantenimiento de los cardiomiocitos obtenidos, se cambió el medio a medio CDM con Insulina (10 jg/m l) y se cambió la mitad del medio cada día. Este medio se denominó CDM-I. Para la generación de cardiomiocitos ensamblados/agregados, los cardiomiocitos mantenidos hasta el día 21 se disociaron utilizando el kit de disociación de cardiomiocitos StemDiff (Stem Cell Technologies) y se resembraron como agregados en placas AggreWell400 (Stem Cell Technologies) a 1000 células/pocillo en CDM-I y 5% FBS (PAA). Al cabo de 2 días, los agregados formados se transfirieron a placas de 96 pocillos de agrupación ultrabaja (Corning) en CDM-I y se colocaron en un agitador a 58 rpm, 37C y 5% de CO2. Después de 4 días, con un cambio de medio después de 2 días, los agregados se utilizaron para el análisis.

Generación de organoides cardíacos -Las hPSC se recolectaron en torno al 70% de confluencia. posteriormente, se sembraron 5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fijación ultrabaja (Corning) que contenían E8 ROCKi (Y-27632, Tocris) y se recogieron mediante centrifugación durante 5 minutos a 200G. Después de 24h, los agregados formados se indujeron con FLyAB(Ins) que contenía 4-8 jm CHIR99021. Se procedió a la diferenciación cardíaca como se describe para los cultivos 2D. Para el mantenimiento de los organoides cardíacos obtenidos, se cambió el medio a medio CDM que contenía insulina (10 jg/m l) y se intercambiaron cada dos días.

Generación de organoides cardíacos con revestimiento endotelial -El medio de mantenimiento de la pluripotencia se renovó 6 h antes de sembrar las células. A continuación, se sembraron 2500-3000 hPSC en placas de 96 pocillos ultra-low cluster (Corning)en medio FLyAB(Ins) con CHIR(5-6 jm ) y ROCKi (5 jm ) durante 36h-40h. A continuación, se cambió el medio a BFIIWPRa con la adición de VEGF-A (200 ng/ml, Peprotech) durante 4 días, cambiando el medio cada día. Posteriormente, se cambió el medio a BFI VEGF-A (100 ng/ml) durante 2 días con cambio de medio al cabo de 1 día. Para el mantenimiento, se utilizó medio CDM con 100 ng/ml de VEGF-A y se cambió cada dos días.

Englobamiento epicárdico de organoides cardíacos- Para diferenciación del epicardio, se sembraron hPSC confluentes al ~70% a 55.000 células/24 pocillos en placa E8 ROCKi (Y-27632, Tocris) 24h antes de la diferenciación. Las células se indujeron con medio CDM (Mendjan et al. 2014, supra) que contenía FGF2 (30 ng/ml, Cambridge University), LY294002 (7,5 jm , Tocris), BM<p>4 (10 ng/ml, R&D Systems) y CHIR99021 (1,5 jm , Tocris). Tras 36h-40h, se cambió el medio de diferenciación de cultivo por medio CDM que contenía BMP4 (10ng/ml), FGF2 (8 ng/ml), Insulina (10 jg/ml), IWR-1 (1jm , Tocris) y Ácido Retinoico (1 jm , Sigma Aldrich) durante 2 días con cambio de medio cada día. Posteriormente, el medio se cambió a Medio CDM conteniendo BMP4 (10 ng/ml), Insulina (10 jg/m l) y Ácido Retinoico (1 jm ) durante 5 días con un cambio de medio entre medias. Para el mantenimiento del epicardio obtenido, las células se sembraron al final de la diferenciación en fibronectina bovina (2 jg/ml, Sigma) en medio CDM con Insulina (10 jg/m l) y SB431542 (10 jm , Tocris) suplementado con ROCKi para el primer día de siembra. Este medio se denominó CDM-SBI. El epicardio replicado se pasó rutinariamente a una confluencia del 80-90% cada 3-5 días a razón de 13 proporción; o posteriormente se diferenció en células de fibroblastos cardíacos (FC) o de músculo liso (SMC) durante 12 días, utilizando un medio CDM que contenía FGF2 (30 ng/ml, Cambridge University), TGFb2 (2 ng/ml, R&D Systems), ácido L-ascórbico (100 jg/ml, Sigma), Insulina (10 jg/m l) o medio CDM con PDGF- BB (10 ng/ml, R&D Systems), ácido L-ascórbico (100 jg/ml, Sigma), Insulina (10 jg/m l) suplementado con TGFb2 (2 ng/ml, R&D Systems) durante los 2 primeros días de diferenciación, respectivamente.

Para la generación del epicardio agregado utilizado en el ensayo de en- gulfamiento, las células epicárdicas del día 8,5 se disociaron utilizando la enzima TrypLE Express (Gibco) y se resembraron como agregados en placas AggreWell400 (Stem Cell Technologies) a 1000 células/pocillo en C<d>M-SBI y 5% FBS (PAA). Después de 2 días, se transfirieron una media de 8-12 agregados formados/pocillo a placas de 96 pocillos de agrupación ultrabaja (Corning) que contenían organoides cardíacos diferenciados en CDM-I, se colocaron en un agitador a 58 rpm, 37C y 5% deCO2, y se co-cultivaron juntos durante 1 semana con medio CDM-I refrescado cada dos días.

Ejemplo de referencia 2: Mesodermo cardíaco con cavidades formadas in vitro

El sello morfológico central del corazón es una cavidad rodeada de cardiomiocitos (CM), con potencial para convertirse en CM latientes, y con un revestimiento endotelial (endocárdico).In vivo,esta cavidad se forma a través de un complejo proceso de migración de mesodermo cardíaco y fusión de tubos endocárdicos que son asistidos por la constricción del endodermo del intestino anterior. El tubo cardíaco resultante se convierte en un corazón multicameral. Sin embargo, los tubos y cámaras cardíacos pueden formarsein vivoen ausencia de endocardio y constricción del endodermo del intestino anterior.

Probamos si el mesodermo cardíaco podría ser suficiente para formar una cavidad en condiciones permisivasin vitro.Para ello, aplicamos un enfoque de diferenciación de alto rendimiento en placas adherentes de 96 pocillos basado en el control temporal de las vías de señalización cardiogénica mientras probábamos Activina, BMP, FGF, ácido retinoico y WNT para conocer sus efectos sobre la diferenciación mientras diferenciábamos las hPSC en mesodermo, mesodermo cardíaco y progenitores cardiomiocitos (latiendo) (Fig. 1). Para buscar factores que pudieran mediar en la formación de cavidadesin vitro,suplementamos los medios con proteínas seleccionadas de la matriz extracelular (MEC) que intervienen en la cardiogénesis temprana. Por ejemplo, la adición de Lamininas 521/511 antes de la inducción del mesodermo dio lugar a una autoagregación rápida y dependiente de la dosis en diferentes etapas de especificación, desde una capa 2D a estructuras esféricas 3D que latían en el día 7 de diferenciación (Fig.1). Sorprendentemente, estas estructuras eran huecas, como lo confirma la presencia de una cavidad en la sección confocal e histológica (Fig. 1,2). El análisis de un reportero MYL7-GFP y la tinción para los marcadores CM TROPO-T/MYL7 confirmaron que las estructuras estaban formadas principalmente por cardiomiocitos.

A continuación comprobamos si la MEC exógena era necesaria para la autoagregación del mesodermo o si participaba directamente en la formación de cavidades.Cuando realizamos la diferenciación cardíaca en 3D en placas de 96 pocillos no adherentes, observamos que la MEC exógena no era necesaria para la autoagregación rápida, la autoorganización robusta y la diferenciación en estructuras TROPO-T+/MYL7+ latientes que contenían una cavidad (Fig. 2), imágenes HT, imágenesin vivo& secciones). Este enfoque de alto rendimiento nos ha permitido optimizar el tiempo, el número de células y las condiciones de los medios para lograr un modelo cardíaco autoorganizadoin vitroaltamente reproducible.

Para determinar el momento de la formación de la cavidad cardiaca, realizamos imágenesin vivoy análisis del curso temporal de la criosección que revelaron que las cavidades aparecen durante la etapa del mesodermo cardiaco antes de la expresión de marcadores estructurales cardíacos clave (Fig. 1,2). Estas cavidades suelen unirse en una cavidad principal. La formación del lumen no fue mediada por las CE, ya que la formación de la cavidad cardíaca se produjo en ausencia de señalización de VEGF y sin marcadores endoteliales detectables CD31 y VE-Cad (Fig. 1, secciones ICC (Fig. 5). Es importante destacar que el endodermo SOX17+ y EOMES+ también estuvo ausente durante la diferenciación, lo que indica que estas cavidades del mesodermo cardíaco no se generaron por constricción del endodermo del intestino anterior (Fig. 3). En contracción, el mesodermo cardíaco mostró fuerte expresión del marcador de mesodermo cardíaco HAND1 y regulación al alza de marcadores estructurales específicos (MYL7,TROPO-T). Para el día 7,5, estas estructuras eran >90% positivas para MYL7 cuando se inhibió la señalización VEGF (Fig. 6). En conclusión, una combinación de señalización y diferenciación de alto rendimiento en 3D revela que el mesodermo cardíaco puede especificarse y autoorganizarse en una cavidad hecha de CM, una característica clave del corazón.

El estado actual de la técnica para diferenciación de CM incluye enfoques 2D o 3D. Por lo tanto, intentamos comparar las estructuras que contienen cavidades en 3D con las CM diferenciadas en 2D. Típicamente, en el día 7 de diferenciación, las estructuras empezaron a latir a un ritmo y frecuencia similares de transitorios de Ca2+ en comparación con los CM diferenciados en 2D. Las estructuras pudieron mantenerse latiendo durante meses en cultivo sin que aparecieran tipos celulares contaminantes no cardíacos.Una comparación a nivel molecular mediante el análisis del curso temporal de ARNseq reveló una firma de expresión muy similar a la del primer sublinaje del campo cardíaco de mesodermo cardíaco (HAND1+, TBX5+, NKX2-5+, TBX1-, HOXB1-), quein vivodalugar al tubo cardíaco y más tarde a la cámara izquierda y una porción de ambas aurículas. En general, observamos una mayor expresión de genes cardíacos en estructuras que forman cavidades y agregados 3D en comparación con CMs en 2D (PCA & heatmap). Genes que codifican canales iónicos, proteínas estructurales, factores de transcripción cardíacos y proteínas del retículo sarcoplásmico mostraron niveles de expresión significativamente superiores (). Este efecto también fue visible a nivel de las proteínas, como se observa en el análisis del proteoma completo. Así pues, el mesodermo cardiaco derivado de hPSC es suficiente para formar sólidamente estructuras de CM que contienen cavidades, que son funcionales, reproducibles y que pueden mantenerse en cultivo a largo plazo.

Ejemplo de referencia 3: Las células endoteliales recubren la cavidad de organoides cardiácos

In vivo,antes del ensamblaje del tubo cardíaco, el mesodermo cardíaco codefine con los progenitores endocárdicos que forman los tubos endocárdicos bilaterales, un compartimento separado con un lumen. Probamos si esta compartimentación puede reconstituirsein vitropor codiferenciación del mesodermo cardíaco tanto en endocardio como las CE y los Cm (Fig. 4). Para promover la codiferenciación, incluimos VEGF-A, el inductor embrionario de la identidad de las células endoteliales, en el estadio de mesodermo cardíaco y buscamos las condiciones óptimas utilizando una línea de hPSC con doble marcador para un marcador de CM (MYL7-GFP+) y un marcador de células endoteliales (CE) (Fig. 4). Sorprendentemente, cuando las CMs y las CEs se codiferencian a partir del mesodermo cardíaco en estructuras que contienen cavidades en presencia de VEGF, éstas se separan en una capa CM y una capa CE con un espacio entre ellas que recuerda a la situaciónin vivo(Fig. 4). Podríamos controlar si la capa de CE rodeaba los CM o se enfrentaba a la cavidad en función de la dosis de activación de la señalización WNT durante la inducción del mesodermo (Fig. 2,7,8). La proporción entre CM y CE se mantuvo notablemente estable entre el 41% (MYL7+) y el 53% (CHD5+). Sin VEGF exógeno, los organoides cardíacos contenían una menor proporción de CEs y con el tiempo (día 10 a día 27) formaron un revestimiento endotelial que miraba exclusivamente a la cavidad cardíaca (Fig. 8), como ocurrein vivo.

Las CE dentro de la capa tenían el potencial de formar rápidamente redes CD31+ extendidas dentro de su compartimento, que también se extendían a la capa CM (Fig. 4,7). Para determinar si la codiferenciación es necesaria para la compartimentación, desarrollamos microtejidos cardíacos 3D de control en los que las CM y las CE se diferenciaron primero por separado del mesodermo cardíaco y luego se agregaron en 3D. En estos microtejidos cardíacos, las CE sólo formaron redes y no se compartimentaron para formar una capa sepatada. En conclusión, al igual quein vivo,sólo las CMs y CEs que co-dif-ferencian en 3D a partir del mesodermo cardíaco se autoorganizan para formar capas distintas que contienen una cavidad, un revestimiento endotelial y redes endoteliales extendidas. Denominamos a estas estructuras organoides cardíacos a medida que emergen de una población homogénea de hPSC y se autoorganizan en una cavidad, compartimentos y revestimiento CE, mientras que dan lugar a los dos primeros tipos de células cardíacas.

En general, las CE se caracterizan por la expresión de marcadores como CD31 y CDH5, pero las CE cardíacas tempranas (endocardio) tienen firmas específicas adicionales. Para comparar estas características moleculares de las CE organoides cardíacas, realizamos un análisis SMART-seq2 en células CDH5+ seleccionadas (Fig. 4). En comparación con los generados mediante un protocolo bien establecido de diferenciación de CE hPSC en 2D (Patsch et al. Nature Cell Biology 17, 994-1003 (2015)), CEs de organoides vasculares 3D, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y células endoteliales microvasculares cardíacas humanas (HCMECs), las CE derivadas de organoides cardíacos CHD5+ fueron las más similares a las de organoides vasculares 3D (Wimmer et al., Nature 565, 505-510(2019)(Fig.4E). Es importante destacar que las CE de organoides cardíacos regulan al alza los factores de transcripción cardíacos, como GATA4/5 y genes asociados al endocardio (NFATC1, NPR3). Su perfil de expresión génica HOX anterior, que coincide con el de las HCMEC (Fig. 4E) es consistente con CEs derivadas de mesodermo cardiaco en 2D pero no con otros subtipos de CE. Por otra parte, el análisis SMART-seq2 de CMs MYL7+ seleccionadas de organoides cardíacos mostró que las células que no eran ni MYL7+ ni CDH5+ regulaban al alza los genes asociados con el mesodermo de la placa lateral y los genes MEC. Así, la firma molecular de las CE derivadas de organoides cardíacos es coherente con una identidad de tipo endocárdico.

La capacidad del endotelio para percibir el flujo de fluidos, la presión y el estiramiento mecánico desempeña funciones fisiológicas y de desarrollo cruciales. Como cabría esperar de un modelo fiel de desarrollo cardiaco, análisis ARNseq de organoides cardiacos a granel revelaron una regulación al alza de genes mecanosensibles clave (SOX18, KLF2, CHD5) en comparación con microtejidos cardíacos en 3D, y CMs y CEs en 2D (Fig. 4E). Esto fue corroborado por un análisis SMART-seq2 de CE seleccionadas a partir de organoides cardíacos que mostró la inducción de genes de estrés mecanosensibles (KLF2, FOXO1, TEK, FOS) y tinción inmu- nofluorescente de organoides cardíacos para CDH5, SOX18 y KLF2 (Fig. 4E). En general, estos resultados sugieren que la codiferenciación, la autoorganización y la compartimentación de CMs y CEs son cruciales para lograr la activación de la identidad cardiaca clave y genes mecanosensores, ambos aspectos esenciales de la fisiología cardíaca.

Ejemplo de referencia 4: El epicardio engloba los organoides cardíacos

Tras la formación de la cavidad y el establecimiento de una capa y revestimiento endotelial, el englobamiento epicárdico de las cámaras del miocardio temprano es el tercer gran acontecimiento de autoorganización cardíaca.In vivo,el epicardio envuelve al miocardio a partir de un pequeño grupo de células llamado órgano pro-epicárdico. Después del envolvimiento, las señales de los CM impulsan la diferenciación celular epicárdica en células del músculo liso (CML) y fibroblastos cardíacos (FC), que son tipos celulares cruciales para el posterior desarrollo y maduración del corazón. Para imitar esta característica crítica de la cardiogénesis temprana, desarrollamos un protocolo de diferenciación epicárdica en2D y 3D que se corresponde con el calendario estimado de las etapas de desarrollo epicárdico humano y la señalización conocida para especificar el órgano pro-epicárdico en vertebrados. Es importante destacar que este protocolo era compatible con el enfoque de organoides cardíacos en cuanto a las condiciones básicas de los medios (Fig. 10, general). Los análisis de ARNseq y citometría de flujo a lo largo del tiempo confirmaron una diferenciación epicárdica eficiente, como se observa por la expresión generalizada de los marcadores WT1, TCF21 y TBX18 (%) (Fig. 10). Al igual quein vivo,dependiendo de la activación de la señalización de TGF-b, FGFy PDGF, las células epicárdicas tenían el potencial de diferenciarse en 2D en SMCs que expresaban Calponina, a-SMA y SM22, y CFs que expresaban DDR2 y Vimentina (Fig. 10).

Para imitar el proceso de englobamiento epicárdico, cocultivamos organoides cardíacos con agregados epicárdicos en condiciones de medio básico sin factores de crecimiento adicionales (Fig. 11). Observamos una propagación eficaz de las células epicárdicas por encima de los organoides cardíacos en 4 días (Fig. 11). Es importante destacar que cuando incubamos estas estructuras en las mismas condiciones sin factores de crecimiento adicionales, observamos migración de células epicárdicas al compartimento de cardiomiocitos y diferenciación en SMCs (Calponin+, SM22+) y CFs (DDR2, Vimentina, Decorina) (Fig. 11). Concluimos que el englobamiento epicárdico de los organoides cardíacos y el co-cultivo sin manipulación externa de la señalización es suficiente para estimular el englobamiento de los organoides cardíacos por el epicardio, la migración del epicardio al compartimento CM y la diferenciación en SMCs y CFs. En general, nuestro procedimiento de diferenciación 3D de alto rendimiento puede utilizarse para establecer una plataforma de organoides cardíacos autoorganizada y controlada por linajes que imita aspectos clave de la cardiogénesis humana.

Ejemplo de referencia 5: Mecanismos de formación de cavidades cardíacas

Aunque los modelosin vitromoleculares y celulares reduccionistas no pueden recapitular toda la complejidad de los modelosin vivo, han demostrado ser complementarios y útiles para abordar cuestiones mecanicistas. Nuestra plataforma de organoides nos ha permitido desarrollar procesos semiautomatizados de análisis de imágenes para cuantificar fenotipos con alta potencia estadística. Empleamos esta plataforma para abordar cómo las vías de señalización controlan la formación de cavidades cardíacas, que incluye varias posibilidades: i) la señalización durante la fase del mesodermo podría afectar a la formación del lumen durante la fase del mesodermo cardíaco, ii) la señalización del mesodermo cardíaco podría ser decisiva, o iii) podría ser una combinación de ambas. Dado que la plataforma de organoides cardíacos de alto rendimiento está controlada por estadios y linajes, hemos comprobado sistemáticamente los efectos de las dosis clave de las vías de señalización del mesodermo y del mesodermo cardíaco (por ejemplo, WNT, BMP) en la formación de cavidades cardíacas. Sorprendentemente, descubrimos que la dosificación de la activación de la señalización canónica WNT (por ejemplo, mediante CHIR99021) durante la inducción del mesodermo tenía efectos sorprendentes sobre la expansión del lumen durante la fase de mesodermo cardíaco (Fig. 4F). Este espectacular efecto no dependía de la proliferación celular. Existía una dosis intermedia óptima de activación de WNT que promovía tanto la formación de cavidades como la diferenciación de CM. Observamos la formación de cavidades dependientes de WNT tanto en organoides diferenciados en presencia de VEGF que contenían un revestimiento de CE como en organoides sin CE (Fig. 4,5). El nivel óptimo de activación de WNT variaba en función de la línea de hPSC, lo que puede determinarse de forma mensurable con el sistema de cultivo celular aquí descrito, por ejemplo, utilizando aproximaciones paralelas en una placa de pocillos.

Para identificar los mediadores aguas abajo de WNT que controlan la formación de la cavidad cardíaca, realizamos un análisis de ARN-seq y comparamos los perfiles de expresión génica del mesodermo inducido por un mayor (gran cavidad) o menor (cavidad pequeña) dosis de señalización WNT. Entre los genes expresados diferencialmente al inicio de la etapa de mesodermo cardíaco, encontramos múltiples componentes de la señalización BMP (BMP4, BMP2, BMPR) y de sus dianas. BMP es un conocido de la especificación cardiaca en múltiples etapas, pero no se ha demostrado su papel en la formación de cavidades cardíacas. Por lo tanto, probamos si los diferentes niveles de señalización de<b>M<p>en el estadio de mesodermo cardíaco impulsan la formación de la cavidad cardíaca. Inhibición de la señalización de BMP utilizando su inhibidor natural Noggin durante los dos días iniciales de la etapa de mesodermo cardíaco en gran medida deterioró la expansión de la cavidad (Fig. 12). Observamos un claro efecto de dosificación de señalización de BMP en el que niveles más altos de BMP4 impulsaron la expansión de la cavidad (Fig. 12). En conclusión, nuestros datos muestran que un eje de señalización WNT-BMP controla la expansión de la cavidad en los organoides cardíacod.

In vivo,existen varios mecanismos celulares y biológicos bien conocidos de formación del lumen embrionario aguas abajo del control de señalización. Sin embargo, dado que las fuerzas impulsoras de la expansión de la cavidad cardiaca están menos claras, especialmente en mamíferos y humanos, nosotros utilizamos la plataforma de organoides cardíacos para sondear los mecanismos subyacentes de la formación del lumen. La expansión de la cavidad bajo dosis óptimas de activación de WNT y BMP no fue impulsada ni por apoptosis ni por diferencias de proliferación regional, como se observó mediante tinción de Caspasa 3 y Ki67 (Fig. 2). En su lugar, observamos una compactación en la periferia de la capa de mesodermo cardíaco caracterizada por una mayor densidad/localización de N-Cadherina/Actina/MYH10/DAPI y una ausencia de E-Cadherina, mientras que la capa interna donde aparecieron por primera vez las cavidades mesenquimales Fig. 2). Es importante destacar que la compactación de la capa externa sólo era visible en condiciones de alta activación de WNT y BMP que promovían la cavidad, y no con baja activación de WNT y BMP sin cavidad. Estas observaciones concuerdan con el patrón de localización de N- cadherina en las regiones compactadas de las células cardiacas y mesodermo esplácnico de los embriones de vertebrados, mientras que la región que da a los tubos endocárdicos es mesenquimatosa. En apoyo de una barrera de tipo epitelial compactada, las estructuras cavitarias del mesodermo cardíaco no eran permeables a los dextranos de bajo peso molecular (4KDa). Dado que la expansión del lumen a través de los epitelios depende típicamente de un gradiente osmótico impulsado por bombas iónicas, comprobamos a continuación la implicación del bombeo de iones cloruro y sodio/potasio en organoides cardíacos. Concluimos que un proceso impulsado por WNT-BMP de compactación diferencial del mesodermo cardíaco acompaña la formación de cavidad parain vitro.

Ejemplo de referencia 6: Modelización de defectos cardíacos

Las mutaciones en los factores de transcripción (TF) son las causas subyacentes más conocidas de los defectos de la cavidad cardíaca que afectan al desarrollo del tubo y la cámara cardíaca y causan graves defectos de nacimiento en humanos. Por ejemplo, la alteración de NKX2-5 y HAND1 aguas abajo de BMP provoca graves defectos de la cavidad cardíaca en vertebrados, incluyendo la malformación cardíaca más grave en humanos. Sin embargo, dado que estos factores están presentes durante toda la cardiogénesis y en múltiples tipos celulares, es difícil discernir un mecanismo subyacente. Nuestra hipótesis es que aguas abajo del eje WNT- BMP uno o más de estos TFs son críticos para la formación de la cavidad en organoides cardíacos. Por tanto, generamos líneas hPSC con deleciones heterocigóticas y homocigóticas de los genes HAND1 y NKX2-5. Sorprendentemente, no se detectaron defectos de formación de cavidades en la fase de mesodermo cardíaco en las líneas mutantes NKX2-5. Por el contrario, las líneas KO homocigotas HAND1 mostraron un claro defecto en la formación de cavidades cardíacas en los estadios de mesodermo cardíaco y CM (Fig. 12B). La localización de N-Cadherina en estos organoides KO también se vio afectada. Es importante destacar que el aumento de la dosis de señalización WNT durante la inducción del mesodermo podría rescatar parcialmente este efecto, confirmando su papel en la expansión de la cavidad. En consonancia con esta observación, los niveles de expresión de HAND1 eran mayores en condiciones de dosificación de la señalización WNT que promovían la formación de cavidades. En conjunto, nuestra plataforma de organoides cardíacos de alto rendimiento y linaje controlado puede emplearse para descifrar cuantitativamente los mecanismos de formación cardíaca y los defectos genéticos.

Ejemplo de referencia 7: Materiales y procedimientos ampliados

Cultivo general de células madre pluripotentes humanas- Las líneas de células madre pluripotentes humanas (WT H9, WiCell y clones H9 constitutivamente fluorescentes (Wimmer et al., 2019, Nature 29, 40) WT y WTC modificado, Allen Institute for Cell Science) se cultivaron en un medio propio modificado basado en el sistema de cultivo E8 (Chen et al., 2011, Nature Methods 8, 424-429). La receta original del E8 se complementó con 0,5% de BSA (Europa Biosciences, # EQBAH70), FGF2 de producción propia y 1,8 ng/ml de TGFpl (R&D RD-240-B-010). Las células se cultivaron en placas de cultivo de tejidos Corning o Eppendorf tratadas recubiertas con Vitronectina XF (Stem Cell Technologies #7180) y se pasaron utilizando la enzima TrypLE Express (Gibco, #12605010) o PBS-EDTA (Biological Industries, 01-8621B) cada 2-4 días a una confluencia del ~70%. Las células se sometieron a pruebas rutinarias de Mycoplasma.

Diferenciación de hPSC en cardiomiocitos en agregados 2D y 3D- Las hPSC se sembraron a 160-175.000 células/24 pocillos de placa en E8 ROCKi (Y-27632, Tocris #1254) durante 24h. A continuación, las células se indujeron durante 36h-40h con medio CDM (Mendjan et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 310-325) que contiene FGF2 (30 ng/ml, Cambridge University), LY294002(5 pm, Tocris, #1130), Activin A (50 ng/ml, Cambridge University), BMP4 (10 ng/ml, R&D Systems RD-314-BP- 050) y CHIR99021 (R&D Systems RD-4423/50). 1 pg/ml de insulina (Roche, #11376497001) se añadió opcionalmente para aumentar la viabilidad de las células durante esta etapa. Este medio se denominó FLyABCH(Ins). Tras 36h-40h, las células se indujeron con medio CDM que contenía BMP4 (10ng/ml), FGF2 (8 ng/ml), insulina (10 pg/ml), IWP2 (5pm, Tocris, #3533) (opcionalmente también se puede hacer con IWR-1 (1pm, Tocris, #3532/10) o XAV-939 (5pm, SelleckChem, # S1180) y Ácido retinoico (0,5 pm, Sigma Aldrich, #R2625) durante 4 días con cambio de medio cada día. Este medio se denominó BFIIWPRa. Posteriormente, el medio se cambió a medio CDM que contenía BMP4 (10ng/ml), FGF2 (8 ng/ml) e insulina (10 pg/ml) durante 2 días con cambio de medio cada día. Este medio se denominó BFI. Para el mantenimiento de los cardiomiocitos obtenidos, se cambió el medio a medio CDM con insulina (10 pg/ml) y se cambió la mitad del medio cada día. Este medio se denominó CDM-I. Para la generación de cardiomiocitos ensamblados/agregados, los cardiomiocitos mantenidos hasta el Día 21 se disociaron utilizando el kit de disociación de diomiocitos STEMdiff (Stem Cell Technologies, n° 05025) y se resembraron como agregados en placas AggreWell400 (Stem Cell Technologies, n° 34425) a 1000 células/pocillo en CDM-I y FBS al 5% (PAA, #A15-108). Al cabo de 2 días, los agregados formados se transfirieron a placas de 96 pocillos de ultrabaja adherencia (Corning, n° 7007) en CDM-I y se colocan en un agitador a 58 rpm, 37°C y 5% de CO2. Después de 4 días, con un cambio de medio a los 2 días, se utilizaron los agregados para el análisis.

Moléculas MEC utilizadas- Vitronectina (10 pg/ml), Laminina-511 fragmento E8 (Takara Bio, #T303, 0,05 - 2 pg/ml) y Laminina-521 (Biolaminina, # LN521-02, 0,1 - 5 pg/ml) se utilizaron para prerecubrir los pocillos o añadirse a la suspensión celular antes de la siembra. La diferenciación posterior de los cardiomiocitos se llevó a cabo como se ha descrito arriba.

Generación de cardioides- Las hPSCs se cosecharon en torno al 70% de confluencia. Los cardioides se generaron sembrando 7500 células/pocillo para los experimentos KO y de inhibición de BMP y 5000 células/pocillo para el resto de los experimentos. Las células se sembraron en un volumen de 200 pl en placas de 96 pocillos de ultrabaja adherencia (Corning) conteniendo E8 ROCKi y recogidas por centrifugación durante 5 minutos a 200 g. Tras 24h, los agregados formados se indujeron con FLyAB(Ins) que contenía el activador WNT CHIR99021 (véase más abajo la concentración dependiente de la línea celular). La diferenciación cardíaca se realizó como se describe para los cultivos 2D. Para el mantenimiento de los cardioides obtenidos, se cambió el medio a CDM-I y se intercambió cada dos días. Para detener la diferenciación de las células endoteliales, se añadieron 100 nM de malato de sunitinib (Biovision, n° 1611) a partir del estadio de mesodermo cardíaco (BFIIWPRa). Para los experimentos de inhibición de BMP, se utilizaron 100 ng/ml de Noggin (R&D System, # RD-6057-NG- 025) o 0,2 pm de LDN-193189 (Stemgent, # 04-0074).

Para la generación optimizada de cardioides (más revestimiento ventricular/CE interna), las hPSCs se indujeron utilizando F, Ly, B, Activina inferior (4 ng/ml), Ins, y CHIR99021 (véase más abajo para concentración de líneas celulares específicas) en 2D. A continuación, se sembraron 15.000 células en un volumen de 200 pl en placas de 96 pocillos de ultrabaja adherencia (Corning) y se siguió el protocolo de diferenciación de CM descrito anteriormente.

Generación de cardioides que contienen CM, CE y células similares a fibroblastos en capas definidas- El medio de mantenimiento de la pluripotencia se actualizó 6 h antes de sembrar las células. A continuación, se sembraron 2500hPSCs directamente en placas de 96 pocillos de ultra-baja adherencia (Corning) en medio FLyAB(Ins) con CHIR99021 (véase más abajo la concentración de CHIR99021 específica de la línea celular) y ROCKi (5 pm) durante 36h- 40h. A continuación, se cambió el medio a BFIIWPRa añadiendo VEGF-A (200 ng/ml, Peprotech, #AF-100-20) durante 4 días con medio cambiado cada día. Posteriormente, se cambió el medio a BFI VEGF-A (100 ng/ml) durante 2 días con un cambio de medio después de 1 día. Para el mantenimiento se utilizó medio CDM con 100 ng/ml de VEGF-A y se intercambian cada dos días. Para generar cardioides que sólo contenían células CE y fibroblastos, se siguió el protocolo anterior con la excepción de la falta de adición de IWP2 y bajo WNT (CHIR99021: 4pm)/baja Activina (4 ng/ml) durante la inducción del mesodermo. Para el análisis Smart-Seq2, día 7.5 cardioides que contenían cardiomiocitos y células endoteliales se disociaron utilizando el kit de disociación de cardiomiocitos STEMdiff (STEMCELL Technologies, # 05025), y GFP+ CMs y Tomate+ CEs así como las células GFP-/Tomate- se clasificaron FACS en tampón de lisis casero.

Criolesión de cardioides- Los cardioides se transfirieron temporalmente a una placa de 10 cm sin medio y se observaron bajo un microscopio EVOS (Thermo Fisher) colocado dentro de la campana de flujo laminar. A continuación, se tocaron con una varilla de acero enfriada con N2 líquido hasta que el frente de onda del tejido/medio de congelación estuviera claramente dentro del cardioide. A continuación, los cardioides se transfirieron de nuevo a medio de mantenimiento que contenga pocillos para cultivos posteriores.

Concentración de CHIR99021 dependiente de la línea celular- Observamos que para una diferenciación óptima, las diferentes líneas de hPSC reaccionan a diferentes concentraciones de CHIR99021 (activación de Wnt). Esto coincide con informes anteriores (Strano et al., 2020, Cell Reports 31, 107732) y significó que determinamos empíricamente se determinaron las mejores concentraciones "altas" (cavidad grande) y "bajas" (cavidad pequeña) de CHIR99021 para las diferentes líneas de hPSC. En diferenciaciones 2D, las células H9 se indujeron con 1-2 pm de CHIR99021, mientras que las líneas WTC se indujeron con 3-4 pm de CHIR99021. En las diferenciaciones cardioides 3D, los cardioides sólo CM se generaron según el protocolo descrito en la sección "Generación de cardioides" con concentraciones "altas" y "bajas" de CHIR99021 siendo 8 pm y 4 pm para las células WTC. 1.para las células H9 se utilizaron 53 pm de CHIR99021. En las codiferenciaciones CM/CE/Células similares a fibroblastos según la sección "Generación de cardioides que contienen CMs, CEs y células similares a fibroblastos en capas definidas", se utilizó CHIR99021 de 4 pm como concentración "baja", 5-6 pm fueron óptimas para la diferenciación CM/CE y la expansión de la cavidad ("intermedia"), y 9 pm se utilizó como concentración "alta" de CHIR99021.

Co-cultivo epicárdico con cardioides- las hPSCs se sembraron a 55.000 células/24 pocillos en placa E8 ROCKi (5-10 pm) 24h antes de la diferenciación. Las células se indujeron con medio CDM (Mendjan et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 310-325) que contenía FGF2 (30 ng/ml, Universidad de Cambridge), LY294002 (7,5 pm), BMP4 (10 ng/ml) y CHIR99021 (1,5 pm) (lyer et al., 2015, Development 142, 1528-1541). Después de 36h-40h, el medio de diferenciación se cambió a medio<c>D<m>que contenía BMP4 (10 ng/ml), FGF2 (8 ng/ml), insulina (10 pg/ml), IWR-1 (1pm) y ácido retinoico (1 pm) durante 2 días con cambio de medio cada día. Posteriormente, el medio se cambió a medio<c>D<m>con BMP4 (10 ng/ml), insulina (10 pg/ml) y ácido retinoico (1 pm) durante 5 días con un cambio de medio entre medias (Guadix et al., 2017, Stem Cell Reports 9, 1754-1764). Para mantenimiento del epicardio obtenido, se sembraron células en el final de la diferenciación en fibronectina bovina (2 pg/ml, Sigma, # F1141) en medio CDM con insulina (10 pg/ml) y SB431542 (10 pm, Tocris, #1614) suplementado con ROCKi para el primer día de siembra. El epicardio replicado se pasó rutinariamente al 80-90% de confluencia cada 3-5 días en proporción 1:3.

Para la generación de epicardio agregado utilizado en el ensayo de englobamiento, las células epicárdicas del día 8,5 se disociaron utilizando la enzima TrypLE Express y se resembraron como agregados en placas Aggre-Well400 a 1000 células/pocillo en CDM-SBI y 5% FBS. Después de 2 días, se transfirieron una media de 8-12 agregados formados/pocillo a placas de 96 pocillos de ultrabaja adherencia (Corning) con cardioides diferenciados en CDM-I, colocadas en un agitador a 58 rpm, 37C y 5% de CO2, y co-cultivado junto con el medio CDM-I refrescado cada dos días. Los agregados de control (sólo epicárdicos) se mantuvieron en medio CDM-SBI en las placas de 96 pocillos de ultrabaja adherencia (Corning).

Diferenciación 2D de células endoteliales anteriores- Las células madre pluripotentes se sembraron a 100.000 células/24 pocillo recubiertas de vitronectina en medio E8 suplementado con 10 pm de inhibidor de ROCK. Enel día siguiente, las células se indujeron con FLyABCH (Ins), 1-3 pm (para H9), 3-6 pm (para WTC) CHIR99021, e incubado durante 36 - 40 horas. Durante los dos días siguientes, se cambió el medio a BFIIWPRa. Posteriormente, se suministró medio de diferenciación compuesto por CDM con 200 ng/ml de VEGF y 2 pm de forskolina (Sigma-Aldrich, #F3917) durante 2 días, seguido de 1 día de cultivo en CDM 100 ng/ml de VEGF. Las CE se mantuvieron en CDM suplementadas con 100 ng/ml de VEGF.

Cultivo de células endoteliales microvasculares cardiacas humanas- Las células endoteliales microvasculares cardiacas humanas (HCMEC) se obtuvieron de PromoCell (PC-C-12285 HCMEC-c) y se cultivaron según las instrucciones del fabricante utilizando Endothelial Cell Growth Medio MV (PromoCell, #PC-C-22020). Para el análisis Smart-Seq2, las HCMEC fueron disociadas con la enzima TrypLE Express y FACS-clasificadas en tampón de lisis casero.

Cultivo de explantes de mesodermo cardíaco de pollo- Se aislaron explantes de la región cardiogénica de embriones de pollo en desarrollo(Gallus gallus)en el estadio 7-8 de Hamburger y Hamilton y se cultivaron durante 24h a 37°C en medio de mesodermo cardíaco (BFIIWPRa). Posteriormente, los explantes se incrustaron, se crioseccionaron y se sometieron a inmunotinción para los análisis posteriores que se describen a continuación.

Criosección- La criosección se realizó basándose en {Bag-ley:2017ga}. Brevemente, los tejidos fijados con PFA al 4% se crioprotegieron con sacarosa al 30% en PBS durante una noche a 4°C y se incrustaron al día siguiente utilizando el medio de crioinmersión O.C.T. (Scigen, #4586K1). Los tejidos embebidos se congelaron utilizando una superficie metálica sumergida en nitrógeno líquido y se almacenaron en un congelador a -80 °C hasta su seccionamiento en un criostato Leica. Las secciones se recogieron en portaobjetos Ultra Plus y se conservaron a -20 °C o -80 °C hasta la inmunotinción. El O.C.T. se eliminó mediante lavado con PBS antes de continuar con el protocolo de inmunotinción.

Inmunotinción- Tras la fijación con PFA al 4% (Sigma-Aldrich, #16005), los especímenes se lavaron dos veces en 1x PBS y las construcciones 3D adicionalmente una vez en PBS/Tween20 (0,1%, Sigma-Aldrich, #P1379) durante al menos 15 minutos cada una. Los tejidos se incubaron en una solución de bloqueo consistente en PBS (Gibco, #14190094) con un 4% de suero de cabra (Bio-Rad Laboratories, #C07SA) o de burro (Bio-Rad Laboratories, #C06SB) y 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, #T8787) durante al menos 15 minutos. Posteriormente, el anticuerpo primario se aplicó en el tampón de bloqueo anterior durante 1-3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C en el caso de las muestras 2D y 2 días a 4°C en un agitador para las muestras 3D. Tras lavarlos dos veces con PBS/Tween20, los tejidos 3D se incubaron con la solución de anticuerpos secundarios a 4 °C en un agitador durante 2 días más, mientras que las muestras 2D se incubaron hasta 2 horas a temperatura ambiente. Tras estos pasos de lavado y un lavado adicional con PBS, los tejidos se prepararon para su análisis o almacenamiento a 4 °C en PBS, mientras que los portaobjetos se montaron utilizando un medio de montaje de fluorescencia (Dako Agilent Pathology Solutions, #S3023). los tejidos 3D se limpiaron con FocusClear (CellExplorer Labs, #FC-101) antes de la obtención de imágenes.

Tinción tricrómica -La tinción tricrómica de Masson (Bio Optica, n° 04-010802) se realizó en criosecciones de 20 pm siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Microscopía electrónica- Las muestras se fijaron con una mezcla de glutaraldehído al 2% (grado EM; Agar Scientific, Essex, Reino Unido) y paraformaldehído al 2% (grado EM; Electron Microscopy Services, Hat field, US) en tampón de cacodilato sódico 0,1 mol/L, pH 7,2 durante una noche a 4°C. A continuación, los organoides se enjuagaron con el mismo tampón y se posfijaron en tetróxido de osmio al 1% (Electron Microscopy Services, Hatfield, EE.UU.) en tampón sobre hielo durante 40 minutos. Después de 3 lavados, las muestras se deshidrataron en una serie graduada de acetona en hielo y se incrustaron en resina Agar 100 (Agar Scientific, Essex, Reino Unido). las secciones de 70 nm se recogieron con rejillas de 100 mesh Cu/Pd (Agar Scientific, Essex, Reino Unido), previamente recubiertas con una película de soporte de formvar y se teñieron posteriormente con acetato de uranilo al 2% (Merck) y citrato de plomo de Reynolds.

Ensayos de incorporación de dextrano y Fluo-4- Un dextrano de 4,4kDa conjugado con TAMRA (Sigma Aldrich, T1037) se añadió al cultivo cardioide entre 64h y 90h. Los cardioides se fotografiaronin vivocuando empezaron a formarse cavidades. Para obtener imágenes y analizar los transitorios de calcio, cardioides 3D y CM 2D se cargaron con Fluo-4 AM (Thermo Fisher Scientific, n° F14217). Tras una incubación de 15 minutos, los cardioides se incubaron durante otros 15 minutos en solución de sal de Tyrode (Sigma Aldrich, #T2397). Posteriormente, se obtuvieron imágenes de cardioides en directo y se analizaron los vídeos con el software FIJI (Schindelin et al., 2012, Nature Methods 9,676-682) para adquirir la intensidad de la señal (F) de las regiones de interés y el fondo (F0).

Mediciones de las características de contracción: se tomaron imágenesin vivode CM en 2D y cardioides en 3D y se analizaron los vídeos con un algoritmo publicado (Huebsch et al., 2015,Tissue Engineering Part C: Methods 21, 467-479) para determinar la velocidad de contracción y ritmo de latido.

Potenciales de acción ópticos- Los cardioides se incubaron a 37°C, 5% CO2 en medio CDM. Antes de los experimentos, los organoides se cargaron transitoriamente con el colorante sensible al voltaje (VSD) FluoVolt (x0,5, durante 30 min a temperatura ambiente). Después, el medio que contenía VSD se sustituyó por medio fresco sin suero (DMEM, Sigma-Aldrich). La placa de pocillos múltiples se colocó en una incubadora de etapas con control ambiental (37°C,5% CO2, atmósfera de aire saturada con agua, Okolab Inc, Burlingame, CA, EE.UU.). La señal de fluorescencia FluoVolt se registró en un área de 0,2 x 0,2 mm del organoide. La longitud de onda de excitación fue de 470 ± 10 nm utilizando un diodo emisor de luz (LED), y la luz emitida se recogió con un fotomultiplicador (MMT, Cairn Research Ltd. Kent, Reino Unido). Las señales de fluorescencia se digitalizaron a 10 kHz. las grabaciones de 120 s se analizaron posteriormente fuera de línea utilizando el software pClamp v.10.0 (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, EE.UU.). Las DPA se midieron al 30%, 50% y 90% de repolarización.

Adquisición y análisis de imágenes- Se tomaron imágenes de secciones y montajes completos fijos con microscopios confocales de barrido puntual (Zeiss LSM800 Axio Imager en posición vertical con una lente objetivo Apochromat 20x con un aumento de 1x) y de disco giratorio (sistema de disco giratorio Olympus basado en un microscopio invertido de la serie IX3 (IX83), equipado con un disco giratorio Yokogawa W1), o un microscopio de campo amplio (Zeiss Axio Imager 2, Axio Vert A1, Panoramic FLASH 250 II System). Los experimentos de imagenin vivose realizaron con un microscopio Zeiss Celldiscoverer7 o con el microscopio de disco giratorio antes mencionado. Para la obtención de imágenes y el análisis de alto rendimiento, se tomaron imágenes con un microscopio Celigo Imaging Cytometer (Nexcelom Biosciences, LLC) y se analizaron con secuencias de comandos personalizadas escritas para el software FIJI. Las secciones para microscopía electrónica de transmisión se examinaron con un TEM FEI Morgagni 268D (FEI, Eindhoven, Países Bajos) operado a 80 kV. Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD Morada de 11 megapíxeles (Olympus-SIS).

Estadísticas- Los datos se presentan como media /- DE. Para calcular diferencias significativas, se analizó la normalidad y lognormalidad de los datos mediante las pruebas de D'Agostino & Pearson y de Shapiro-Wilk en el software Prism 8 (GraphPad Software Inc.). Si la distribución es normal, utilizamos una prueba paramétrica (prueba t de dos colas, prueba unidireccional ANOVA) para determinar las diferencias significativas. Si la distribución no es normal, se realiza una prueba no paramétrica (Mann-Whitney, Kruskal-Wallis de dos colas) utilizando el programa Prism 8. Las correcciones de las comparaciones múltiples mediante pruebas estadísticas de hipótesis (prueba de Tukey para las paramétricas y prueba de Dunn para las no paramétricas) se realizaron con el programa Prism 8. Los valores -p de diferencias significativas se visualizan como: *: p<0.05, **: p<0,01, ***: p<0,001, ****: p<0,0001.

Citometría de flujo- Las células se disociaron utilizando el kit de disociación (Stem Cell Technologies, n° 05025). Tras centrifugación durante 3 min a 130g, las células se resuspendieron en 300 pl PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA (Biological Industries, #01-862-1B) y 10% FBS (PAA Laboratories, #A15-108). Las células se adquirieron con un FACS LSR Fortessa II (BD) y se analizaron con el software FlowJo V10 (FlowJo, LLC). La clasificación FACS se realizó utilizando un clasificador celular Sony SH800 (Sony Biotechnology).

Aislamiento de ARN y preparación de ARN-seq/Smart-Seq2/(sc)ARN-seq unicelular- El ARN se aisló con el RNeasy Mini Kit (Qiagen, #74104). La generación de las bibliotecas de ARN-seq a granel se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante con QuantSeq 3' mARN-Seq Library Prep Kit FWD (Lexogen GmbH, n°015). Tras la preparación de las bibliotecas, se comprobó que las muestras presentaban una distribución de tamaños adecuada con un analizador de fragmentos (Advanced Analytical Technologies, Inc) y se enviaron a las instalaciones de secuenciación de próxima generación (NGS) del Vienna Biocenter Core Facilities (VBCF) para su secuenciación. Para el análisis Smart-Seq2, se seleccionaron 400 células en tampón de lisis y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento. Las muestras se sometieron a control de calidad, se prepararon bibliotecas y se secuenciaron en las instalaciones de NGS de la VBCF utilizando un kit Smart-Seq2 de fabricación casera. Para scARN-seq, se disociaron los cardioides (dos réplicas biológicas, 3 cardioides cada una) en el día 7,5 de diferenciación y las células se enviaron a las instalaciones de NGS de la VBCF para la preparación de bibliotecas utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium (10x Genomics, CA, EE.UU.).

Análisis bioinformático- El recorte se realizó para experimentos Smart-Seq2 con trim-galore v0.5.0 y para experimentos QuantSeq 3' mARN-Seq con BBDuk v38.06 (ref=polyA.fa.gz,truseq.fa.gz k=13 ktrim=r useshortkmers=tmink=5 qtrim=r trimq=10 minlength=20). Lecturas asignadas a secuencias abundantes incluidas en la referencia iGenomes UCSC hg38 (ADNr humano, cromosoma mitocondrial humano, genoma phiX174, adaptador) se eliminaron utilizando la alineación bowtie2 v2.3.4.1. Las lecturas restantes se analizaron utilizando el genoma y la anotación genética de la UCSC proporcionado en el paquete iGenomes UCSC hg38 (support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html). Las lecturas se alinearon con el genoma hg38 utilizando star v2.6.0c y las lecturas en los genes se contaron con featureCounts (subread v1.6.2) utilizando el recuento de lecturas específico de la cadena para los experimentos QuantSeq (-s 1).

Se realizaron análisis de expresión génica diferencial en recuentos brutos y análisis de componentes principales en recuentos transformados y estabilizados en función de la varianza utilizando DESeq2 v1.18.1. El análisis de enriquecimiento de la anotación funcional de los genes expresados diferencialmente se realizó utilizando clusterprofiler v3.6.0 en R v3.4.1.

La deconvolución del tipo de célula de tejido a granel se realizó utilizando MuSiC v0.1.1 (Wang et al., 2019, Nature Communications 10, 1-9). Se utilizaron genes marcadores específicos del tipo celular y una referencia de expresión unicelular para el corazón humano en desarrollo (Cui et al., 2019, CellReports 26, 1934-1950.e5). Las muestras de cardioide a granel ARN-seq se procesaron con el procedimiento descrito anteriormente utilizando la referencia hg19 UCSC iGenomes para que coincida con los datos publicados. Se estimó la proporción de tipos celulares del corazón en desarrollo en muestras de ARN-seq cardioide a granel y las proporciones estimadas de MuSiC se visualizaron en un mapa de calor.

Las lecturas ARN-seq unicelulares se procesaron con cellranger count v4.0.0 utilizando la referencia GRCh38 preconstruida 10X refdata-gex-GRCh38-2020-A. Los datos de recuento se analizaron con Seuratv3.2.2. Se retuvieron células con más de 500 genes detectados y menos de un 15% de contenido mitocondrial. Se retuvieron dobletes detectados por scDblFinder v1.4.0. Esto condujo al análisis posterior de 9632 células para el análisis del tipo celular en cardioides. Para comparar las CMs con las CMs optimizadas de tipo ventricular, se analizaron 1717 CMs de la condición estándar (CHIR intermedio/Activina alta) junto a 5097 CMs de la condición optimizada de CHIR bajo/Activina baja. Los valores de expresión normalizados logarítmicamente se obtuvieron utilizando el procedimiento LogNormalize con el factor de escala predeterminado de 10000. Las réplicas se integraron mediante las funciones FindIntegrationAnchors e IntegrateData utilizando 15 dimensiones y los ajustes predeterminados. singleR v1.4.0 se utilizó para anotar células individuales utilizando la referencia de Cui et al. (supra). las representaciones bidimensionales se generaron mediante aproximación y proyección de colectores uniformes con uwot v0.1.9.

Proteómica- Las células se lisaron en tampón de ácido 4-(2-hidroxi-etil)-1-piperazinaetanosulfónico acid buffer (HEPES) urea 8M 100mM, reducido con 10 mM 1,4-ditioeritritol con 1U Benzonase (Merck KGaA, #1.01654.0001) y se alquiló con 2-yodoacetamida 20 mM. Se realizaron digestos en 4M urea 100mM HEPES con LysC (Wako, #121-05063, 1/100 (p/p) proteasa/substratos) durante 3 h a 37C y posterior digestión con tripsina (Promega, #V5280, 1/100 (p/p) proteasa/substratos) durante la noche a 37C. Los péptidos se desalaron utilizando cartuchos de extracción en fase sólida en fase inversa (Sep-Pak C-18, Waters, #186000308), secado al vacío, reconstituido en HEPES a un pH neutro y marcado con TMT10-plex (Thermo Fisher Scientific, #90110) según las instrucciones del fabricante. Los péptidos marcados con TMT se agruparon en cantidades iguales y se fraccionaron mediante cromatografía en fase inversa de alto pH (columna UPLC Peptide CSH C18, 130A, 1,7 pm, 1 mm x 150 mm, ACQUITY) para obtener 10 fracciones.

Las muestras se separaron mediante cromatografía de fase inversa (75 um x 250 mm Pepmap C18, tamaño de partícula 5 um, Thermo Fisher Scientific), desarrollando un gradiente lineal del 2% al 80% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1% en 60 minutos (RSLC nano, Dionex - Thermo Fisher Scientific) y analizado por MS/MS, utilizando espectrometría de masas en tándem por ionización por electrospray (Orbitrap QExactive HFX, Thermo Fisher Scientific). El instrumento funcionó con los siguientes parámetros: Resolución MS1 120.000; objetivo MS1 AGC 3e6; tiempo máximo de inyección MS1 50ms; rango de barrido MS1 380 a 1650 m/z; Resolución MS2 45.000; Objetivo MS2 AGC 1e5; Tiempo máximo de inyección 250; TopN 10; Ventana de aislamiento 0,7 m/z; Primera masa fija 110 m/z; energía de colisión normalizada 35; Ojetivo mínimo de AGC 1e4; Se prefiere combinación de péptidos; Se excluye isótopo; Exclusion dunámica 30s.

Todos los datos MS/MS se procesaron y analizaron con Proteome Discoverer 2.3 (PD 2.3.0.484, Thermo Scientific), y se buscaron con MSAmanda v2.0.0.14114 en la base de datos de Homo sapiens (Swis- sProt TaxID=9606) (v2017-10-25). Máximas escisiones perdidas: 2, con derivado de yodoacetamida sobre la cisteína y etiqueta de masa en tándem ten-plex N-terminal del péptido (mod. fijo); oxidación sobre la metionina, etiqueta de masa en tándem ten-plex sobre la lisina (mod. variable). Tolerancia de la masa peptídica: ±5 ppm; tolerancia de masa de fragmentos: ±15 ppm. Filtrado al 1% FDR a nivel de proteína y péptido utilizando Percolator; se cuantificaron iones reporteros utilizando IMP Hyperplex (Doblmann et al., 2019, Journal of Proteome Research 18, 535-541) (ms.imp.ac.at/index.php?action=hyperplex).

Generación de la línea de doble reportero MYL7-GFP/CDH5-Tomate- La línea hPSC MYL7-GFP de WTC marcada endógenamente se obtuvo del Allen Institute for Cell Science (Cell Line ID: AICS-0052). Un gBlock de la secuencia promotora de CDH5 (-1135 a - 5 relativo a TSS) (Prandini et al., 2005) se encargó a Integrated DNA Technologies, Inc. y se clonó según Bagley et al., en una columna vertebral modificada de un vector que se integra en el locus AAVS1 con tecnología TALEN (Hockemeyer et al., 2009, Nature Biotechnology 27, 851-857). La columna vertebral modificada contenía flancos de repeticiones en tándem del núcleo del aislante HS4 de pollo (2xCHS4). Así, se insertó el siguiente casete de expresión reportero en el locus AAVS1: 2xCHS4-CDH5promotor-dTomate-WPRE-SV40-2xCHS4. La nucleofección y la recolección/validación de clones se realizaron como en (Bagley et al., 2017, Nature Methods 14,743 751).

Generación de líneas celulares inactivas de HAND1 y NKX2-5- Se inactivaron HAND1 y NKX2.5 en células H9 utilizando CRISPR/Cas9. Se identificaron los ARN-sg de los sitios objetivo utilizando la página web del Instituto SangerGenome Editing (WGE), así como la herramienta de diseño Benchling sgARN. (HAND1_sgRNA1: GAGCATTAACAGCGCATTCG (SEQ ID NO: 1); NKX2.5_sgRNA1: GACGCACACTTGGCCGGTGA (SEQ ID NO: 2); NKX2.5_sgRNA2: ACTTGGCCGGTGAAGGCG (SEQ ID NO: 3)). Los ARNsg se clonaron en pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 (Feng Zhang Lab; Addgene plasmid #62988; n2t.net/addgene:62988 ; RRID:Addgene_62988) según el protocolo general de clonación del laboratorio Zhang (Ran et al., 2013, Nature Protocols 8, 2281-2308).

Las células se transfectaron utilizando el P3 Primary Cell 4D-Nu- cleofector™ X Kit S (Lonza-BioResearch, Cat #:V4XP-3032) y Amaxa™ 4D-Nucleofector™ (Lonza-BioResearch). Tras la nucleofección, las células se incubaron en E8 suplementado con 10pm Y-27632 (Cat #72302) durante 24h. Tras ese periodo, las células se seleccionaron con puromicina (concentración 0,2ng/pL; (Sigma-Aldrich, Cat #P8833) durante 48h. Tras este tratamiento, el medio de cultivo celular se volvió a cambiar a E8 suplementado con 10pm Y-27632 (Cat #72302) para promover el rebrote. Una vez que las células formaron colonias, se recogieron y transfirieron a una placa de 96w (Corning, Cat #CLS3370).

El éxito de la edición se evaluó en primer lugar a nivel de grupo. Posteriormente, las colonias individuales se genotiparon dos veces de forma independiente para que se confirme el éxito de la inactivación. La edición del genoma a nivel de pool y clonal se evaluó mediante la herramienta en línea ICE de Synthego (ice.synthego.com/#/).

Cebadores:

HAND1_G1_forward 5'-CACCGAGCATTAACAGCGCATTCG-3' (SEQ ID NO: 4)

HAND1_G1_reverse 5'-AAACCGAATGCGCTGTTAATGCTCC-3' (SEQID NO: 5)

NKX2.5_G1_forward 5'-CACCGGACGCACACTTGGCCGGTGA-3' (SEQ ID NO: 6)

NKX2.5_G1_reverse 5'-AAACTCACCGGCCAAGTGTGCGTCC-3' (SEQ ID NO: 7)

NKX2.5_G2_forward 5'-CACCGACTTGGCCGGTGAAGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 8)

NKX2.5_G2_reverse 5'-AAACCGCGCCTTCACCGGCCAAGT-3' (SEQ ID NO: 9)

Ejemplo de referencia 8: Formación de estructuras similares a cámaras cardíacas in vitro

Para investigar si se puede crear intrínsecamente una estructura similar a una cámara 3Din vitro,desarrollamos un enfoque de diferenciación basado en el control temporal de las vías de señalización cardiogénicas clave: activina, BMP, FGF, ácido retinoico y WNT. Recapitulando la estadificación del desarrolloin vivo,especificamos secuencialmente hPSCs en mesodermo, mesodermo cardíaco y progenitores de cardiomiocitos latiendo con una eficiencia superior al 90% en cultivo 2D (Mendjan et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 310-325) (Figura 14A). Para buscar factores que sean suficientes para estimular la formación de estructuras cardíacas 3D intrínsecas en cultivo 2D, suplementamos los medios con proteínas MEC seleccionadas que están implicadas en el desarrollo del mesodermo (Yap et al., 2019, Trends in Cell Biology 29, 987-1000). La adición de lamininas 521/511 antes de la inducción del mesodermo dio lugar al autoensamblaje intrínseco de las células y a la sorprendente formación de estructuras 3D huecas y latientes que expresaban el marcador CM TNNT2 tras 7 días de diferenciación (Figura 21A). Cuando realizamos la diferenciación cardíaca íntegramente en cultivo 3D no adherente de alto rendimiento, descubrimos que la MEC exógena no era necesaria para el autoensamblaje rápido y reproducible en estructuras que contienen cavidades positivas para los marcadores CM ACTN2, TNNT2, Tn NI1, m Yl7, TTN, NPPA y ATP2A2 (Figuras 14B, 14C, 21B, 21C). A nivel ultraestructural, estos CMs contenían sarcómeros organizados y están interconectados a través de discos intercalados (Figuras 21C', 21D). El autoensamblaje fue robusto en la línea WTC hiPSC, incluida su vasta colección de recursos reporteros fluorescentesin vivo(Roberts et al., 2019, Stem Cell Reports 12, 1145-1158), las líneas hESC H9 y H7 ampliamente utilizadas, así como en tres líneas hiPSC utilizadas habitualmente para generar organoides cerebrales (Figuras 21E, 21E'). La eficacia de la diferenciación CM medida mediante citometría de flujo (N=3, n=5) y análisis de imágenes 3D Z-stack (N=3, n=8) alcanzó una media aproximada del 90% (Figura 14D, 21F). En lo sucesivo nos referiremos a estas estructuras cardíacas que contienen cavidades como cardioides.

A continuación intentamos caracterizar los cardioides a nivel molecular. Un análisis del curso temporal de ARN-seq de los cardioides reveló una firma de expresión muy similar al linaje del primer campo cardiaco (FHF) del mesodermo cardiaco (HAND1+,TBX5+,NKX2-5+,TBX1‘) (Figura 14E), quein vivoda lugar al tubo cardiaco -el precursor primario de la cámara ventricular izquierda y, en menor medida, de las aurículas. Durante la especificación y maduración cardioide, expresión génica estructural y de canales iónicos, así como la expresión de los receptores p-adrenérgicos 1 y 2, aumentó (Figura 22A). Cuando comparamos los perfiles de expresión de los cardioides en relación con los CM diferenciados en 2D, observamos que los genes que codifican canales iónicos (por ejemplo, el canal HERG KCNH2), proteínas estructurales (TNNI1,<t>T<n>, MYH6), factores de transcripción cardíacos (TBX5, MEF2C) y proteínas del retículo sarcoplásmico (RYR2, ATP2A2) mostraban niveles de expresión más elevados en las estructuras 3D formadoras de cavidades, lo que sugiere una mejora de la funcionalidad (Figura 22B). El análisis de términos GO mostró que los cardioides mostraban patrones de expresión génica de la morfogénesis y desarrollo cardíaco, que estaban significativamente regulados al alza en las CM en 2D (Figura 22C) y en los microtejidos agregados de CM en 3D (Figura 22D). En ambos modelos, el latido comenzó entre los días 5 y 7 de diferenciación, continuó a un ritmo y frecuencia similares (transitorios deCa2+ , frecuencia de latido) (Figura 22E,22F), y los cardioides pudieron mantenerse en cultivo durante al menos tres meses. En general, generamos con éxito cardioides funcionales derivados de hPSC que se autoensamblaron de forma reproducible y mantuvieron su identidad molecular CM.

Además, nos propusimos explorar el potencial del subtipo CM de los cardioides. El análisis inicial de ARN-seq de los cardioides indicó un perfil mixto ventricular (IRX4+,MYL2+) y auricular (NR2F2+,KCNJ3+) (Figura 22A, 22B) consistente con su origen FHF.

Teniendo en cuenta que la inducción del mesodermo y la baja dosis de señalización de AR son críticas para la especificación del tubo cardíaco posterior y de la cámara ventricular izquierda, optimizamos la dosis de WNT y ACTIVIN durante la inducción del mesodermo, y se redujo la dosis de AR durante la fase de mesodermo cardíaco. Estas optimizaciones dieron lugar a un aumento de la expresión de marcadores específicos ventriculares (IRX3, IRX4, HEY2, MYL2) y casi ausencia de expresión de marcadores auriculares específicos (NR2F2, HEY1) como se observa mediante RTqPCR, inmunocitoquímica y ARN-seq unicelular (scARN-seq) análisis de CMs (Figuras 14F, G, H). En consonancia con estos datos, las mediciones del potencial de acción utilizando un ensayo de colorante FluoVolt indicó un perfil principalmente de tipo ventricular (Figura 22G). En conclusión, los cardioides pueden orientarse hacia una identidad temprana similar a una cámara del ventrículo izquierdo.

Ejemplo de referencia 9: El mesodermo cardíaco se autoorganiza para formar una cavidad in vitro y ex vivo

A continuación empleamos este sistema para preguntar si la cavidad dentro de los cardioides se forma por una morfogénesis intrínseca. Al analizar el desarrollo temporal de la formación de cavidades, observamos que éstas se iniciaban y expandían con fuerza durante la fase de mesodermo cardíaco (HAND1+), precediendo a la expresión de marcadores estructurales cardíacos clave, como MYL7 (Figura 14E; Figura 15A). Los cardioides se expandieron rápida y reproduciblemente debido a la proliferación y formación de múltiples cavidades. La mayoría de las cavidades más pequeñas acabaron fusionándose en una cavidad mayor. La expansión de la cavidad no fue impulsada ni por la apoptosis ni por las diferencias de proliferación regional, como lo demuestran las tinciones de CASP3 escindido y MKI67 (Figura 15A). Es importante destacar que el endodermo SOX17+/EOMES+ estuvo ausente durante la diferenciación, lo que indica que las cavidades del mesodermo cardíaco no se generaron como resultado instrucción del endodermo (Figura 23A). Esto concuerda con los hallazgosin vivo, ya que aún pueden formarse corazones bilaterales cuando se interrumpe la morfogénesis del endodermo del intestino anterior. La formación de lumen también se produjo cuando se inhibió la diferenciación de células endoteliales (CE) impulsada por VEGF utilizando el potente inhibidor de VEGFR Sunitinib (Figura 23B), lo que sugiere un mecanismo independiente del endotelio. Llegamos a la conclusión de que el mesodermo cardíaco tiene una capacidad intrínseca para autoensamblarse en una estructura similar a una cámara hecha de CM.

In vivo,el mesodermo cardíaco no requiere endodermo del intestino anterior para la morfogénesis básica del corazón en el ratón (Li et al., 2004, Science 305, 1619-1622) y en el polluelo (DeHaan y DeHaan, 1959, Developmental Biology 1, 586-602). Por lo tanto nos preguntamos si el mesodermo disecadoex vivode embriones de pollitos en desarrollo también pueden formar estructuras similares a cámaras en condiciones desarrolladas para la autoorganización cardíaca humana. Sorprendentemente, en ausencia de SOX2+ en el intestino anterior, los explantes mesodérmicos de pollo se convirtieron en estructuras similares a cámaras latientesin vitroa las del mesodermo cardiaco humano, lo que demuestra una sólida conservación de la automorfogénesis cardiogénicain vitroen condiciones permisivas (Figura 15B, Figura 23C, 23D).

Además de la automorfogénesis durante la especificación, la automorfogénesis intrínseca de una población celular inicial homogénea es un sello distintivo clave de la autoorganización. Para ello, realizamos un análisis más detallado del mesodermo cardíaco para determinar cuándo se produce el primer evento de automodelado. Mientras que el mesodermo en la fase de inducción parecía homogéneo, observamos una mayor señal periférica de F-actina y betacatenina unida a la membrana al inicio de la fase de mesodermo cardíaco. La formación de cavidades posterior coincidió con mayor densidad de mesodermo en la periferia, reflejada por la acumulación de F-actina, N-cadherina y mayor densidad nuclear (Figura 15C, 15D). Es probable que esta capa de mesodermo cardíaco más densa actúe como barrera de permeabilidad, ya que las estructuras cavitarias eran impermeables al dextrano de bajo peso molecular (4kDa). Por el contrario, la parte central de las estructuras en desarrollo, donde aparecieron por primera vez las cavidades, tenía un aspecto más suelto con una disminución de N-cadherina y beta-catenina (Figura 15C). Estas observaciones concuerdan con el patrónin vivode N-cadherina y beta-catenina en la región dorsal más densa del mesodermo cardíaco y la región menos compacta frente a los tubos endocárdicos y el endodermo del intestino anterior (Linask, 2003, Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews 69, 14-24). Hasta ahora, hemos llegado a la conclusión de que los cardioides humanos presentan las características clave de la autoorganización, la especificación continua, la automodelación intrínseca en capas de mesodermo y la automorfogénesis para dar forma a una cavidad.

Ejemplo de referencia 10: WNT y BMP controlan la autoorganización cardioide

A continuación utilizamos cardioides para diseccionar cómo la señalización controla la morfogénesis intrínseca y el patrón durante la especificación cardioide. Para cuantificar los fenotipos con un alto poder estadístico, hemos combinado la plataforma cardioide de alto rendimiento con una línea de producción de imágenes y análisis semiautomatizada FIJI hecha a medida. Utilizando esta configuración, examinamos qué señales controlan la autoorganización cardioide y en qué fase de la especificación mesodérmica actúan. En primer lugar probamos sistemáticamente los efectos de las dosis clave de señalización del mesodermo y del mesodermo diádico (por ejemplo, WNT, BMP) en la automorfogénesis de la cavidad cardíaca. Sorprendentemente, encontramos que dosis más altas de señalización WNT durante la inducción del mesodermo impulsaron la expansión de la cavidad durante la etapa posterior del mesodermo cardíaco (Figura 16A, 16B), lo cual no se había reportado antes. Una dosis WNT intermedia promovió tanto la morfogénesis de la cavidad como la especificación del CM. El rango óptimo de activación de WNT fue consistente para cada línea hPSC pero diferían entre líneas, en consonancia con numerosos estudios que muestran respuestas de señalización específicas de cada línea. Es importante destacar que la dosis más alta de WNT promovió la formación de cavidades sin la especificación del CM (Figura 16A), lo que pone de relieve una sorprendente diferencia en el control de la señalización de la especificación del destino celular frente a la morfogénesis.

Para identificar los mediadores aguas abajo de WNT que controlan la morfogénesis de la cavidad, realizamos análisis de ARN-seq y comparamos perfiles de expresión génica del mesodermo inducidos por la mayor (cavidad grande) y menor (cavidad pequeña) dosis de señalización WNT. En genes expresados diferencialmente en la etapa mesodermo cardíaco tardío, identificamos mediadores cardiacos conocidos de la señalización BMP (BMP4, BMP2, BMPR2) y algunas de sus dianas mesodérmicas (HAND1, IRX3) (Figura 16C). Las BMP impulsan la especificación cardíaca en múltiples etapas, y nos preguntamos si las BMP pueden instruir patrones y para formar una cavidad cardíaca. Para responder a esta pregunta, bloqueamos la señalización de BMP utilizando el inhibidor natural Noggina o el compuesto LDN193189 durante los dos días iniciales de la etapa de mesodermo cardíaco. La inhibición de las BMP provocó un deterioro de la morfogénesis de la cavidad, un mesodermo cardíaco más denso y una disminución del tamaño del cardioide, mientras que el número de células por cardioide permaneció estable (Figura 16D, 16E, 16F, 16G). Por el contrario, la inhibición de WNT en la etapa de Mesodermo cardíaco no era necesaria para la formación de cavidades (Figura 16H). Estos hallazgos ponen de relieve que el control de la especificación frente al de la morfogénesis pueden ser procesos fundamentalmente diferentes, y que un eje de señalización mesodérmico WNT-BMP controla la autoespecificación y la automorfogénesis, ambos procesos clave de autoorganización.

Ejemplo de referencia 11: HAND1 actúa en la autoorganización cardioide

Mutaciones en los factores de señalización y de transcripción aguas abajo afectan al desarrollo del tubo y la cámara del corazón y causan graves malformaciones cardíacas. Por ejemplo, en el Síndrome del Corazón Izquierdo Hipoplásico, el defecto congénito más grave en humanos, los niveles alterados de los genes regulados por BMP NKX2-5 y HAND1 se asocian con una cavidad cardiaca severamente reducida dentro de la cámara ventricular izquierda. El fenotipo más temprano en ratones mutantes Nkx2-5 y Hand1 se manifiesta como defectos en la morfogénesis del tubo cardiaco y de la cámara ventricular izquierda temprana, respectivamente, pero la etiología de la enfermedad y el mecanismo morfogenético subyacente en humanos están menos claros. Aquí, generamos líneas de hPSC inactivos (KO) para HAND1 o NKX2-5 para evaluar si estos genes eran necesarios para lograr la autoorganización intrínseca en ausencia de tejidos no cardíacos. En las líneas KO de NKX2-5 no detectamos defectos de formación de cavidades en el estadio de mesodermo cardíaco y eventualmente se formaron cardioides TNNT2+ (Figura 24A,24B,24C). La expresión de HAND1 en el mesodermo cardíaco de NKX2-5 KO no se vio afectada, lo que concuerda con el retraso en la aparición de NKX2-5 en relación con la expresión de HAND1 en cardioides (Figura 24C, Figura 14E), así como en el mesodermo cardiaco FHF humano y de ratón. Sin embargo, la expresión de HAND1 parecía reducida en la fase de CM en los cardioides KO para NKX2-5 (Figura 24C), lo que concuerda con los hallazgos en CM de ratones y humanos donde NKX2-5 actúa corriente arriba de HAND1.

En HAND1 KOs, por otra parte, observamos una reducción de niveles de proteína NKX2-5 en el mesodermo cardíaco pero no en los CM (Figura 17A, Figura 17D, 24E). Estos resultados ponen de relieve la importancia de nuestros datos sugieren que HAND1 actúa antes que NKX2-5 en el mesodermo cardíaco, mientras que NKX2-5 actúa antes que HAND1 en los CMs de etapas posteriores. En consonancia con esta hipótesis, y a diferencia de los cardioides nulos en NKX2-5, los cardioides KO en HAND1 mostraron un claro defecto en la autoorganización de la cavidad cardiaca y tamaño en el estadio de mesodermo cardíaco. Este fenotipo se manifestó como cardioides de menor tamaño (N=9,n=246) que formaban cavidades más pequeñas (N=3,n=130) (Figura 17B-17E, Figura 24G). Estos defectos no fueron causados por una diferencia en el número de células por cardioide, ya que tanto KO como WT mostraron recuentos celulares similares (Figura 24F). Es importante destacar que, a pesar de estos defectos en el patrón y morfogénesis del mesodermo cardiaco, la posterior especificación del CM (TNNT2+) seguía siendo funcional en los cardioides HAND1 KO (Figura 24E). Estas observaciones subrayan aún más la distinción crucial entre el control de la especificación celular frente al modelado tisular y la morfogénesis de órganos que puede diseccionarse en el contexto de una malformación cardíaca en cardioides.

A continuación nos preguntamos si el fenotipo HAND1 KO podía ser rescatado por factores de señalización exógenos. El aumento de la dosis de señalización WNT durante la inducción del mesodermo rescató el fenotipo HAND1 KO, confirmando la implicación de WNT en la morfogénesis de la cavidad (Figura 17F, 17G). Consistentemente, HAND1, un FHF específico humano y marcador de la cámara ventricular temprana, fue regulado al alza en condiciones de WNT alto que también promovieron la expansión de la cavidad (Figura 16C). Además, los niveles de proteína HAND1 disminuyeron con la inhibición de BMP, lo que confirma que un eje WNT-BMP-HAND1 impulsa la autoorganización de la cavidad cardioide (Figura 16G). En conjunto, estos datos demuestran que la autoorganización y los defectos cardiacos genéticos pueden modelarse cuantitativamente en nuestra plataforma cardioide de alto rendimiento.

Ejemplo de referencia 12: WNT, ACTIVIN y VEGF coordinan la autoorganización el endotelio y del miocárdio

A continuación exploramos si los cardioides pueden utilizarse para diseccionar vías de señalización que dirigen el patrón y la separación del miocardio y endocardio para formar un revestimiento interior, un sello distintivo característico de la cámara cardíaca. Para sondear estas relaciones compararamos el curso temporal de ARN-seq de cardioides, que se generaron utilizando una dosis alta frente a una dosis baja de activación de WNT durante la inducción del mesodermo. Se observó que una menor activación de WNT provocaba un aumento de la regulación de VEGF-A, y otros factores especificadores de CE (ETV2, TAL1, LMO2, PECAM1) durante el estadio de mesodermo cardíaco (Figuras 18A, 18A'). Al mismo tiempo, el análisis de ARN-seq de células individuales de cardioides de tipo ventricular inducidas con condiciones de bajo WNT/bajo ACTIVIN reveló una mayor proporción de CMs que expresaban VEGF-A en comparación con los cardioides inducidos con WNT intermedios/AC-TIVIN altos (Figura 18B). Por lo tanto, nuestra hipótesis es que las dosis bajas de señalización de WNT y ACTIVIN coordinan la coespecificación de CM y CE mediante la inducción de VEGF-A en el mesodermo cardíaco y en los CM para estimular la diferenciación de la CE. De hecho, descubrimos que los niveles más bajos de señalización WNT en combinación con dosis bajas de señalización de ACTIVIN durante la inducción del mesodermo promovió la autoorganización posterior de las CE dentro de los cardioides (Figuras 18C, 18D). Esas CE suelen (55,2%, N=4, n=29) formar un revestimiento interno parcial de la cavidad cardioide (Figuras 18C, 18D, 18E, 25A, 25A') pero no en el exterior de cardioides, que se asemejan a la arquitectura tisularin vivo.En contraste, en condiciones de dosis más altas de WNT y ACTIVIN, no observamos autoorganización de CE en ausencia de VEGF exógeno (Figura 18C). En conclusión, las dosis de señalización óptima de WNT y ACTIVIN durante la inducción del mesodermo controlan la posterior autoorganización de las CE, lo que da lugar a un revestimiento parcial de la cavidad cardioide.

A continuación examinamos los efectos del VEGF exógeno sobre el CM y la coespecificación de CE en cardioides (Figura 18F). Cuando incluimos VEGF-A después de la etapa de especificación del CM, ocasionalmente observamos la formación de una capa de CE que recubre la cavidad cardioide, pero también alguna especificación de CE en la superficie de los cardioides (Figura 25B, 25C, 25D). Para dilucidar si podemos controlar la autoorganización temprana de las capas CM y CE en el mesodermo cardíaco, incluimos el VEGF-A en esta fase. Como las CM y las C<e>se codiferencian del mesodermo cardíaco en estructuras que contenian cavidades en presencia de VEGF-A, se separaron en capas CM y CE (Figura 18F, 18F', 18F"). En este caso, utilizando una activación óptima (intermedia) de WNT durante la inducción del mesodermo siempre dio lugar a una capa de CE que rodea la capa CM (Figura 18F", Figura 26A, 26C, 26D). Además, surgió una tercera capa de células COL1A1 junto a la capa de CE (Figura 18F"). A diferencia de los cardioides, los agregados de CEs y CMs diferenciados inicialmente en 2D formaron redes entrelazadas, pero no se agrupaban en capas (Figura 26B). Esto sugería que el VEGF estimula la separación temprana de las dos capas, que es un aspecto importante observado en el mesodermo cardíaco embrionario y en la fase de tubo cardíaco. Sin embargo, el VEGF exógeno no fue suficiente para controlar la correcta orientación exterior frente al revestimiento de CE. Así, la dosis de WNT/AC-TIVIN y la sincronización de la señalización del VEGF coordinan la especificación, morfogénesis de la cavidad y patrónin vivode linajes CM y CE.

Para diseccionar aún más el control de la señalización WNT y VEGF de la especificación del linaje y la morfogénesis en cardioides, nos preguntamos si se puede formar una capa de células CE sin codiferenciación de CM. En ausencia de inhibición de w Nt y en presencia de VEGF durante la etapa de mesodermo cardíaco, descubrimos que se pudieron formar de forma reproducible estructuras de tipo cardioide que contenían principalmente CE y células COL1A1+, sin CM (Figura 18G, G', Figura 26F). Esta observación subraya de nuevo cómo el control de la señalización de la morfogénesis podría separarse del control de la señalización de la especificación celular en cardioides. En conjunto, estos datos muestran que a medida que los cardioides se autoorganizan para dar lugar a los dos primeros linajes cardíacos, pueden utilizarse para diseccionar aspectos y etapas del codesarrollo del miocardio y el endocardio.

Ejemplo de referencia 13: Células endocárdicas y fibroblásticas en cardioides

Todos los organoides autoorganizados comparten procesos relacionados de especificación, patrón y morfogénesis similares a los de los tejidos, pero se distinguen por sus tipos celulares específicos de órgano. Por lo tanto, a continuación se investigó la heterogeneidad celular dentro de los cardioides. Cuando utilizamos la activación intermedia de WNT y VEGF, descubrimos que la relación de CMs a CEs se mantuvo estable entre el 41% (MYL7+) y el 53% (CDH5+) (Figura 18F'), lo que facilitó el análisis cuantitativo utilizando este modelo. Esta observación fue corroborada además por la deconvolución de datos de ARN-seq a granel (Wang et al., 2019, Nature Communications 10,1-9) y una célula única específica del tipo celular cardíaco expresión de referencia (Cui et al., 2019, CellReports 26, 1934-1950.e5) para el corazón humano en desarrollo (Figura 27A). Smart-seq2 de células clasificadas (Figura 26E) y análisis scARN-seq utilizados para categorizar las células basándose en los datos de corazón humanoin vivo(Cui et al., 2019) confirmaron además perfiles de marcadores clave de CM y CE y términos GO- (Figura 19A, Figura 27D, 27E), mientras que el resto de células (MYL7VCDH5') genes expresados (por ejemplo, SOX9, MSX1/2, COL1A1, COL3A1) relacionados con células putativas de tipo fibroblasto derivadas de CE (Figura 19A,26E,27F). Por último, el análisis proteómico a granel de los cardioides confirmaron sus firmas de expresión del proteoma CM y CE (Figura 27B).

Todos los tejidos y órganos vascularizados contienen subcélulas CE específicas y, en consecuencia, el endocardio tiene una firma de expresión génica de CE específica de cada identidad. Para determinar la identidad de los CE en cardioides, realizamos un análisis Smart-seq2 en CE cardioides CDH5+ clasificadas y las comparamos con CE generadas mediante un protocolo de diferenciación 2D bien establecido (Patsch et al., 2015, Nature Cell Biology 17, 994-1003), nuestro protocolo de diferenciación 2D utilizando condiciones de los medios similares a las de 3D, las CE de organoides vasculares (Wimmer et al., 2019, Nature 29, 40), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y células endoteliales microvasculares cardiacas humanas (HCMECs) (Figura 19C, 19D). Encontramos que las CE derivadas de cardioides eran más similares a las CE de organoides vasculares a pesar de su diferencia de edad (Día 7,5 vs. Día >18). Es importante destacar que las CE de cardioides mostraron mayores niveles de transcripción para factores de transcripción cardíacos, como GATA4/5, y genes asociados con una identidad de tipo endocárdico (NFATC1, NPR3) (Figura 19D). Es importante destacar que NFATC1 también se encontró en los datos proteómicos (Figura 27B) y NPR3 en los datos de scARN-seq (Figura 19A). Su perfil de expresión génica de HOX anterior coincidía con el de HCMECs de corazón humano adulto y el de las CE derivadas del mesodermo cardíaco en 2D (CE anteriores), pero no el de los otros subtipos de CE más posteriores analizados (Figura 27C). Así, la firma de CEs derivadas de cardioides es consistente con una identidad tipo endocardial.

La capacidad del endotelio de percibir el flujo de fluidos, la presión y el estiramiento mecánico es un requisito instrumental para sus funciones fisiológicas y de desarrollo, especialmente en el corazón. Como se esperaba para un modelo de buena fe del desarrollo cardíaco, un análisis Smart- seq2 de las CE seleccionadas de cardioides reveló una regulación al alza de los genes mecanosensibles (SOX18, KLF2, FOXO1, FOS) en comparación con las CE en 2D (Figura 19B, 19B',19B",19D), similar a las CE de organoides vasculares en 3D más maduras. Estas observaciones se confirmaron en el conjunto de datos scARN-seq y con tinción para SOX18. Los marcadores de maduración de las CE (VWF, TEK, TIE1) también se regularon al alza en las CE cardioides en comparación con las CE diferenciadas en 2D (Figura 19D). En conjunto, estos resultados indican que la autoorganización de CMs y CEs en 3D desencadena aspectos esenciales de la identidad endocárdica y la fisiología endotelial.

Ejemplo de referencia 14: Plataforma cardioide de tres linajes como modelo de lesión del desarrollo

Tras la formación del revestimiento endocárdico, el epicardio envuelve las primeras cámaras miocárdicas, añadiendo así el tercer gran linaje cardíaco al corazón. El epicardio se origina a partir de un pequeño conglomerado celular denominado órgano proepicárdico y continúa para cubrir la superficie externa del corazón. Tras el englobamiento, las señales procedentes de la capa CM (TGF-b, PDGF-b, FGFs) impulsan la diferenciación celular epicárdica en células del músculo liso (SMCs) y fibroblastos cardíacos (CFs) - ambos relevantes para el posterior desarrollo, maduración y regeneración del corazón tras la lesión. Para imitar este proceso de autoorganización en cardioides, desarrollamos unprotocolo de diferenciación epicárdica compatible con cardioides y basado en la secuencia de señalización conocida para especificar el órgano pro-epicárdico en vertebrados y hPSCs (Figura 20A, 28A, 28B, 28C). A continuación, co cultivamos cardioides con agregados epicárdicos en medios sin TGF-b, FGF y PDGF exógenos para comprobar si la expresión endógena de estos factores de señalización por los cardioides (Figura 28D) es suficiente para estimular las interacciones epicardio/cardioides. En un plazo de 2-7 días, observamos la propagación de células del epicardio encima de cardioides (Figura 28E, 28F, 28G). Después de 7 días y sin factores de crecimiento adicionales, las células epicárdicas interactuaron con la capa CM, migraron hacia ella y sufrieron diferenciación (Figura 20B, 20C,20D,28H,28I). Las células migratorias redujeron la regulación epicárdica de WT1 y aumentaron la regulación de los marcadores de SMC y FC ACTA2 (Figura 20D, 28I) y COL1A1 (Figura 20C, 28H), como se producein vivo.Sorprendentemente, algunas de las células migratorias derivadas del epicardio empezaron a interactuar con las CE cardioides (Figura 20B, 20D). Llegamos a la conclusión de que el co-cultivo en ausencia de señales externas desencadena la propagación intrínseca del epicardio en cardioides, su migración hacia el interior, su diferenciación y sus interacciones con las CM y CE.

Una supuesta ventaja de los modelos de organoides de desarrollo autoorganizados son sus respuestas de tipo fisiopatológico. Sin embargo, los modelos cardíacosin vitroactuales no recapitulan aspectos importantes de la regeneración miocárdica observada en el feto, modelos de lesionesin vivopostnatales tempranas y en adultos, o fibrosis observados en modelos de enfermedad y en pacientes. Por ejemplo, en tejidos anteriores, tras la criolesión de organoides cardíacos obtenidos por bioingeniería, sólo hay una proliferación limitada, pero no hay acumulación inicial de matriz extracelular (MEC) típica de las primeras fases tanto de la regeneración como de la fibrosis. Dado que los cardioides contienen los tres principales linajes cardíacos, basándose únicamente en mecanismos de desarrollo y sin requerir andamiajes MEC externos, razonamos que los cardioides probablemente producirían una respuesta más fisiológica tras la criolesión. Para probar el potencial de la plataforma cardioide como modelo de lesión del desarrollo, realizamos crio-lesiones en mono- (conteniendo sólo CM) y tri-linaje (conteniendo CMs (Figura 20G, 20F), o CEs (Figura 20H, 20I, 28J, 28K, 28L) o epicardio (Figura 20E, 20G) y células similares a fibroblastos asociadas) cardioides (Figuras 29-34). Los puntos de lesión se caracterizaban por señales DAPI intensas y compactas, necrosis grave detectada mediante tinción TUNEL (Figura 28J), apoptosis limitada y ausencia de respuesta proliferativa clara del CM (Figura 28K). En experimentos de curso temporal observamos tinción de tricromo en el lugar de la lesión, lo que indica una acumulación localizada de CEM (Figura 20G). Los cardioides monolinajes mostraron una menor acumulación de fibronectina y ausencia de células similares a los fibroblastos que expresaban COL1A1+ en la lesión (Figura 20G, 20F). En cambio, en los cardioides trilinaje, se observó un tropismo significativo de los fibroblastos COL1A1+ hacia el lugar de la lesión y una fuerte acumulación de fibronectina (Figura 20E, 20G). Este rápido reclutamiento de CE o de células similares a fibroblastos asociadas al epicardio (Figura 20E,20H,20I) es coherente con las observacionesinvivo durante las respuestas a las lesiones. Por lo tanto, pudimos diseccionar los procesos específicos de cada tipo celular tras una lesión cardiaca y concluir que los cardioides son capaces de imitar un importante aspecto temprano de las respuestas regenerativas y fibróticas.

Conclusiones

En conclusión, hemos establecido una plataforma cardioide humana de alto rendimiento con capacidad de autoorganización intrínseca en capas modeladas y estructuras tridimensionales que recuerdan a la primitiva cámara del ventrículo izquierdo del corazón humano. También demostramos que este recurso puede utilizarse para modelar los mecanismos subyacentes al desarrollo de los tres linajes cardíacos principales, incluida la formación de cavidades y la respuesta a lesiones.

Aunque los organoides imitan la autoorganización organotípicain vitro,su variabilidad y complejidad pueden dificultar la modelización precisa de los defectos morfogenéticos. Abordamos el desafío de la variabilidad dejando de lado el MEC exógeno y utilizando un enfoque de alto rendimiento para alcanzar las condiciones óptimas a partir de una gama optimizada de parámetros. Al controlar la incorporación de los tres linajes cardíacos principales en la plataforma organoide y gracias a su alta reproducibilidad, podemos diseccionar cuándo y dónde las mutaciones genéticas causan un defecto con un alto poder estadístico. Existen otros sublinajes cardíacos clave que podrían incorporarse a este sistema, incluido el segundo linaje del campo cardíaco y el sistema de conducción. Utilizando esta plataforma, demostramos que el mesodermo cardíacoin vitroes suficiente para formar una cavidad en ausencia de endotelio y endodermo a través de un mecanismo impulsado por WNT-BMP. En general, nuestro enfoque de reconstitución controladain vitrode la cardiogénesis tiene un amplio potencial para explorar los mecanismos de desarrollo y los defectos cardíacos, así como para la generación de modelos cardíacos humanos más maduros y complejos adecuados para el descubrimiento de fármacos y la medicina regenerativa. La variabilidad y la complejidad de los sistemas de organoides autoorganizados aún dificulta la modelización cuantitativa de los defectos morfogenéticos. En cardioides, abordamos este reto omitiendo la MEC exógena y utilizando un enfoque de alto rendimiento para alcanzar las condiciones óptimas de señalización. Aumentamos aún más la reproducibilidad mediante el control estricto de la autoorganización a través de la señalización y la incorporación gradual de los tres linajes cardíacos principales en cardioides. Este enfoque permite diseccionar, con gran potencia estadística, cuándo y dónde se requieren las funciones de factores específicos. La simplicidad del sistema, que puede contener uno, dos o tres linajes cardíacos, sin interferencia de tejidos no cardíacos, permite reducir la autoorganización y sus mecanismos moleculares y biológicos celulares subyacentes a lo esencial. Por tanto, la complejidad de los cardioides puede adaptarse a la cuestión biológica planteada. Es una ventaja importante para un modelo organoide, ya que los sistemas biológicos complejos suelen emplear mecanismos redundantes que, de otro modo, sería difícil de separar.

Los cardioides, como todos los demás sistemas organoides autoorganizados, recapitulan algunos aspectos del desarrollo pero también difieren de embriogénesis en otros. La autoorganización abarca sólo un subconjunto de mecanismos de desarrollo intrínsecos, que son suficientes para recapitular aspectos de la arquitecturain vivo.En consecuencia, utilizando cardioides, demostramos que el mesodermo cardíaco por sí solo, instruido por la señalización, es suficiente para formar una cavidad cameralin vitro. Proponemos que esta cavidad podría ser análoga a la cavidad del tubo cardíaco y cámara cardíaca del ventrículo izquierdo temprano.In vivo,la primera cavidad surge de la migración asistida por el endodermo del intestino anterior y fusión de mesodermo cardíaco bilateral y tubos endocárdicos en un único tubo cardíaco. Sin embargo, pueden formarse tubos y cámaras cardíacas bilaterales en ausencia de endocardio o de constricción del endodermo del intestino anterior, pero el mecanismo seguía siendo desconocido. Esto indica la capacidad inherente del mesodermo cardíaco para formar intrínsecamente cavidades y cámarasin vivo,lo que concuerda con la autoorganización que observamos en cardioides y explantes de embrión de polloin vitro.El mesodermo de placa lateral, un subtipo que comprende el mesodermo cardíaco, tiene un potencial similar para formar una cavidad: la cavidad corporal pericárdica. Así pues, la formación de cavidades es probablemente una característica más general del mesodermo a la que podría recurrirse en embriones con un defecto en el intestino anterior. Por último, el fenotipo de cavidad de HAND1 KO en cardioides es coherente con el fenotipo de cámara ventricular izquierda hipoplásica en ratones Hand1 KO, y con el fenotipo de cavidad de cámara del síndrome del corazón izquierdo hipoplásico en humanos, lo que demuestra el potencial de modelado de los cardioides.

Utilizamos la plataforma cardioide para demostrar que WNT y BMP impulsan la autoorganización tipo cámara. Se sabe que estas vías regulan la especificación cardiacain vivoein vitro,pero si controlan el patrón cardíaco y en qué fase lo hacen y la morfogénesis. El sorprendente hallazgo de que los primeros wNT mesodérmicos controlan la posterior autoorganización cardiaca es consistente con la diversificación temprana del linaje cardiaco durante la inducción del mesodermoin vivo.El patrón y la morfogénesis se producen en paralelo con la especificación, pero no están necesariamente vinculados. De acuerdo con esta idea, las cavidades pueden autoorganizarse en ausencia de especificación cardíaca y en los cardioides HAND1 KO hay un defecto en la autoorganización pero no en la especificación CM. Por el contrario, la inhibición de la señalización WNT en el estadio de mesodermo cardíaco es esencial para la especificación del CM, pero no regula la autoorganización cardioide. Los cardioides son, por tanto, un potente sistema para diseccionar intrínsecamente la regulación de la especificación y la morfogénesis. Al mismo tiempo, los cardioides son lo suficientemente sencillos como para determinar la suficiencia de un factor para uno de estos procesos y, por lo tanto, son complementarios de otros sistemas más complejos.

Descubrimos que WNT, ACTIVIN y VEGF controlan la autoorganización de CM y CE en cardioides.In vivo,las CE cardiacas forman primero tubos endocárdicos, más tarde se separan del tubo externo de CM mediante un intersticio relleno de MEC (gelatina cardiaca) y finalmente forman el revestimiento interno de las cámaras cardíacas. Cómo la señalización coordina estos patrones y procesos morfogenéticos con especificación no estaba clara. En los cardioides, el patrón y la morfogénesis de los linajes CM y CE están controlados por la dosis de WNT y ACTIVIN en la fase más temprana de la diferenciación mesodérmica, y por VEGF que dirige tanto la especificación como el patrón de las capas CE en el mesodermo cardíaco. Curiosamente, la misma gama de dosis más bajas de señalización de WNT y ACTIVIN estimularon la especificación ventricular y la formación del revestimiento del CE, lo que sugiere una posible coordinación entre estos procesos. Cuando las CE y las CM se agregan en microtejidos, no forman capas separadas y revestimiento. La generación de una capa/revestimkento de CE independiente es crucial para la activación de la mecanosensibilidad en el contexto de una cámarain vivo.La mecanobiología de la cámara cardiaca es necesaria para la interacción fisiológica entre el CE y el CM, impulsando las siguientes etapas del desarrollo cardiaco como la trabeculación, la compactación miocárdica y la interacción con epicardio. Los cardioides son, por tanto, un sistema prometedor para estudiar los mecanismos subyacentes de la formación de patrones y la diafonía de CM y CE en el contexto de una cámara latiente.

Durante el desarrollo, el (pro-)epicardio entra en contacto con las primeras cavidades cardíacas, las engulle y, al mismo tiempo, se diferencia y migra hacia el miocardio. Mediante el cocultivo de cardioides con epicardio, observamos propagación epicárdica, migración y diferenciación que recuerdan a estos procesosin vivo.Los cocultivos de epicardio y CM se han estudiado anteriormente utilizando microtejidos, pero no en el contexto de un modelo de cámara cardiaca. Este aspecto es importante porque la interacción entre los derivados de los linajes epicárdico, CE y CM depende de la mecanobiología de la cámara cardiaca. Por lo tanto, proponemos que la autoorganización de los tres linajes cardíacos en cardioides similares a cámaras será importante para reavivar la interacción entre desarrollo y regeneración que impulsa el crecimiento, la maduración y las respuestas fisiopatológicas del corazónin vivo. La sorprendente diferencia en la respuesta a la criolesión entre los organoides de bioingeniería y los cardioides autoorganizados, apoya el argumento de que los mecanismos del desarrollo influyen en la fisiopatología posterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un organoide cardíaco de al menos un 60% de células cardíacas, independientemente de las células adicionales opcionales de un sistema vascular del organoide; en el que las células cardíacas rodean una cavidad interior, en la que las células cardiacas se seleccionan del grupo de los cardiomiocitos, células endocárdicas y células epicárdicas, y en el que el organoide cardíaco comprende cardiomiocitos o células endocárdicas que miran directamente a la cavidad interna, en el que el organoide se puede obtener mediante la diferenciación de células pluripotentes a células cardíacas y cultivando en cultivo 3D.

2. Un organoide cardiaco que comprende al menos un 50% de células cardiacas; en el que las células cardiacas rodean una cavidad interna, en el que las células cardiacas se seleccionan del grupo de cardiomiocitos, células endocárdicas y células epicárdicas, y en el que el organoide cardiaco comprende cardiomiocitos o células endocárdicas que miran directamente a la cavidad interna, en el que el organoide se puede obtener diferenciando células pluripotentes a células cardiacas y cultivando en cultivo 3D.

3. El organoide cardíaco de la reivindicación 1 o 2 que comprende al menos un 30% de cardiomiocitos, y preferiblemente comprende además al menos un 2% de células endocárdicas.

4. El organoide cardíaco de la reivindicación 1 o 2 o 3 que comprende cardiomiocitos y células endocárdicas en diferentes capas de tejido.

5. El organoide cardíaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende como máximo un 5%, preferentemente como máximo un 3%, o ninguna célula endodérmica del intestino anterior y/o como máximo un 3% o ninguna célula hemogénica.

6. El organoide cardíaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende células del músculo liso del epicardio y/o fibroblastos cardiacos del epicardio; y/o que comprende como máximo un 3% o ninguna célula del músculo liso no derivada del epicardio y/o como máximo un 3% o ningún fibroblasto no derivado del epicardio.

7. El organoide cardíaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que tiene un tamaño en su dimensión mayor de 0,3 mm a 15 mm; y/o en el que el tamaño de la cavidad interior en su dimensión mayor es al menos el 30% del tamaño del organoide cardíaco en su dimensión mayor.

8. Un procedimiento para generar un organoide cardíaco que comprende los pasos de

a) proporcionar células madre pluripotentes,

b) inducir la diferenciación del mesodermo en presencia de un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta, y además en presencia de un inhibidor de PI3-quinasa, en un cultivo 3D en un cultivo de baja adhesión, en el que las células se unen entre sí en lugar de un recipiente de cultivo para formar agregados de las células, produciendo así un agregado de células del mesodermo,

c) diferenciar las células mesodérmicas de la etapa b) en células cardíacas en un cultivo tridimensional de baja adhesión, en el que las células se agregan entre sí en lugar de unirse a un recipiente de cultivo para formar agregados de células, en presencia de factores de diferenciación cardíaca y en ausencia de un activador de WNT y/o en presencia de un antagonista de WNT, durante al menos 3 días, preferiblemente durante 3-7 días, para la formación del mesodermo cardíaco y la formación de una cavidad interna.

9. Un procedimiento de generación de un organoide cardíaco que comprende las etapas de

a) proporcionar células madre pluripotentes,

b) inducir la diferenciación del mesodermo en presencia de un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta en un cultivo 2D, en el que el activador de WNT y/o el inhibidor de GSK3-beta y/o un Inhibidor opcional de PI3 quinasa están en una cantidad suficiente para diferenciar las células madre pluripotentes para salir de la pluripotencia en una cantidad de al menos el 90% de las células madre pluripotentes en las 40 horas siguientes al inicio de la inducción, produciendo así un agregado de células mesodérmicas, en el que las células se tratan con factor de crecimiento de fibroblastos y/o albúmina,

c) diferenciar las células mesodérmicas de la etapa b) en células cardíacas en un cultivo tridimensional en un cultivo de baja adhesión, en el que las células se agregan entre sí en lugar de unirse a un recipiente de cultivo para formar agregados de células, en presencia de factores de diferenciación cardíaca y en ausencia de un activador de WNT y/o en presencia de un antagonista de WNT, durante al menos 3 días, preferiblemente durante 3-7 días, para la formación del mesodermo cardíaco y la formación de una cavidad interna.

10. El procedimiento de la reivindicación 8 o 9, en el que el activador WNT de la etapa b) es un ligando WNT, tal como WNT-3a, o CHIR99021; preferentemente en el que en caso de que el activador de WNT esté en una cantidad suficiente para diferenciar las células madre pluripotentes para salir de la pluripotencia en una cantidad de al menos 90% de las células madre pluripotentes dentro de las 40 horas de iniciada la inducción según la reivindicación 9 entonces la cantidad de CHIR99021 como activador de WNT está en una concentración de al menos 1pm, preferiblemente al menos 6pm, o al menos 12pm; en caso de que el inhibidor de PI3quinasa esté presente entonces CHIR99021 como activador de WNT está en una concentración de al menos 0,5 pm, preferiblemente 0,5 |jm a 12|jm.

11. El procedimiento de la reivindicación 8 o 9 o 10, en el que las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas o células procedentes de una línea celular y/o en el que las células madre pluripotentes proporcionadas de la etapa a) han sido pasadas, preferentemente en un medio que contiene albúmina y/o un factor de crecimiento de fibroblastos, y preferiblemente comprende además BMP y/o insulina; y/o en el que las células madre pluripotentes de la etapa a) han sido cultivadas en un medio que contiene al menos un 1,5% (p/v) de albúmina, preferiblemente BSA, y/o al menos un 1,5% (p/v) de BSA al menos 100 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos, preferiblemente FGF2, más preferentemente que comprenda además BMP y/o insulina.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la diferenciación del mesodermo se induce en un medio que comprende activina A y/o proteína morfogenética ósea, preferiblemente además factor de crecimiento de fibroblastos, preferiblemente en el que la diferenciación del mesodermo es inducida en un medio que contiene al menos 1 ng/ml de proteína morfogenética ósea, preferentemente BMP4.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende además

d) diferenciar aún más el agregado con mesodermo cardíaco en un tejido con una capa de cardiomiocitos con factores de diferenciación cardíaca durante un día o más.

14. Un kit para realizar un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 que comprende i) un activador de WNT y/o un inhibidor de GSK3-beta, ii) un inhibidor de PI3 quinasa, iii) un recipiente de cultivo celular de baja adhesión, iv) albúmina, que comprende preferentemente además un inhibidor de WNT.

15. Una placa de recipiente que comprende al menos 10 compartimentos, en la que en cada compartimento un organoide según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 está presente prácticamente en la misma fase de desarrollo.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para detectar o probar los efectos de un compuesto candidato en el desarrollo del corazón o funcionalidad que comprende generar un organoide cardíaco según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 mientras se tratan las células con el compuesto candidato y comparar el desarrollo o funcionalidad del organoide cardíaco con el desarrollo de un organoide cardíaco que no fue tratado con el compuesto candidato.

17. El procedimiento de observación de los efectos de los genes suprimidos o sobreexpresados durante en el desarrollo del corazón que comprende generar un organoide cardíaco según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que las células tienen un gen candidato suprimido o sobreexpresan un gen candidato y comparar el desarrollo del organoide cardíaco con el desarrollo de un organoide cardíaco que no se generó con un gen suprimido o sobreexpresado.