ES2987333T3 - Regiones bisagra de inmunoglobulina modificadas para reducir la hemaglutinación - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones polipeptídicas que comprenden una región constante de inmunoglobulina humana con una región bisagra de IgG4 modificada que tiene una deleción N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5 aminoácidos, en relación con una secuencia bisagra de IgG4 humana nativa. En algunas realizaciones, la secuencia bisagra comprende además la sustitución de aminoácidos S228P (numeración Eu). Los polipéptidos que comprenden la secuencia modificada comprenden opcionalmente una fracción de unión específica para un epítopo que está presente en los glóbulos rojos; y pueden proporcionar una aglutinación reducida de células hematopoyéticas en comparación con un polipéptido comparable con una región bisagra nativa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Regiones bisagra de inmunoglobulina modificadas para reducir la hemaglutinación

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] El desarrollo de mAbs terapéuticos ha tenido un impacto sustancial en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Convencionalmente, estas proteínas recombinantes se unen específicamente a las células cancerosas y bloquean las vías de señalización o las marcan para su destrucción por el sistema inmunitario. Sin embargo, sólo existen mAbs dirigidos para unos pocos tipos de cáncer, incluso los mAbs más eficaces pueden requerir una terapia combinada con quimioterapia convencional, y a menudo producen una respuesta terapéutica incompleta. En muchos pacientes, la enfermedad se vuelve resistente al tratamiento con mAb por pérdida de la diana del anticuerpo (cuando la molécula no es esencial para la supervivencia de las células tumorales) o por el desarrollo de resistencia a la destrucción del tumor. Por lo general, los pacientes experimentan una recaída de su enfermedad.

[0002] CD47 se ha identificado como una molécula clave que media en la evasión de las células cancerosas de la fagocitosis por parte del sistema inmunitario innato. CD47 parece ser un medio indispensable por el que las células cancerosas, incluidas las células madre cancerosas, superan la expresión intrínseca de sus señales profagocíticas, "cómeme". La progresión de célula normal a célula cancerosa implica cambios en los genes y/o en la expresión génica que desencadenan la muerte celular programada (PCD) y la eliminación celular programada (PCR). Muchos de los pasos en la progresión del cáncer subvierten los múltiples mecanismos de la PCD, y la expresión de la señal antifagocítica dominante, CD47, puede representar un importante punto de control.

[0003] La expresión de CD47 aumenta en la superficie de las células cancerosas de un gran número de diversos tipos de tumores humanos, incluidos los siguientes tumores malignos primarios: cabeza y cuello, melanoma, mama, pulmón, ovario, páncreas, colon, vejiga, próstata, leiomiosarcoma, glioblastoma, meduloblastoma, oligodendroglioma, glioma, linfoma, leucemia, y mieloma múltiple. En estudios de xenoinjertos murinos, se ha demostrado que los anticuerpos bloqueantes de CD47 inhiben el crecimiento y la metástasis del cáncer humano al permitir la fagocitosis y eliminación de células madre cancerosas y células cancerosas de diversas neoplasias hematológicas y varios tumores sólidos.

[0004] Sin embargo, los eritrocitos también expresan CD47 en la superficie celular. La pérdida o el bloqueo de CD47 en la superficie celular junto con la ganancia de señales profagocíticas conduce a la eliminación fagocítica de los eritrocitos. La administración del anticuerpo anti-CD47 puede provocar una anemia transitoria inicial al eliminar los eritrocitos envejecidos e inducir la reticulocitosis. La población sanguínea de glóbulos rojos se desplaza entonces hacia células más jóvenes que expresan CD47 pero no tienen señales profagocíticas. Además del efecto prolongado de anemia y compensación, puede producirse un efecto agudo de hemaglutinación inmediatamente después de la administración de un anticuerpo anti-CD47. Por lo tanto, para reducir la hemaglutinación aguda es deseable proporcionar un anticuerpo de manera que reduzca la hemaglutinación indeseable.

[0005] La presente divulgación proporciona anticuerpos con hemaglutinación reducida en humanos. Publicaciones.

[0006] La solicitud de patente de los Estados Unidos 20150239958, se refiere a un proceso para la modulación de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal". Las solicitudes de patente de los Estados Unidos 20150018529, 20130323236 y 20150017169 se refieren a anticuerpos lgG4 modificados biespecíficos. La solicitud de patente de los Estados Unidos 20120238729 se refiere a regiones constantes de anticuerpos modificados. La solicitud de patente de Estados Unidos 20110077383 se refiere a la ingeniería del dominio de bisagra.

[0007] Las modificaciones de la región bisagra de lgG4 humana para bloquear el intercambio de media molécula, específicamente la sustitución S228P (numeración de Kabat) se han descrito en la técnica, p. ej. Yang et al. (2015) J. Pharm. Sci. doi: 10.1002/jps.24620; Silva et al. (2015) J. Biol. Chem. 290(9):5462-9.

[0008] Las publicaciones relacionadas con el uso de agentes anti-CD47 se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional publicada con los números de serie. US2009/000319; US2009/000224; US2010/048992; US2011/036535; US2013/021937; US2014/038485; US2014/014905; US2014/018743; US2014/035167; US2014/055680; US2016/019633; US2015/010650; US2015/049150; US2016/014334; US2016/049016.

[0009] El documento WO 2016/191305 describe proteínas Btn3a ectodmain y métodos de uso. El documento WO 2014/102179 describe polipéptidos de fusión y sus usos. El documento WO 2015/022420 describe agonistas duales de los receptores GIP y GLP-1 para el tratamiento de la diabetes. CN 104327187 describe un tipo de proteínas de fusión GLP-1-Fc humanas recombinadas. El documento WO 2008/085878 describe anticuerpos de alta afinidad que neutralizan la enterotoxina B de Staphylococcus. El documento WO 2014/055515 describe el uso de P3 de proteínas de fusión de bacteriófagos como agentes de unión amiloide. El documento WO 2012/151468 describe análogos del factor B del complemento y sus usos. En el documento WO 2012/075184 se describen líneas celulares que secretan anticuerpos atiangiogénicos y receptores solubles, así como sus usos. El documento WO 2014/031687 describe un método y composiciones para inmunoterapia celular. El documento WO 2013/181253 describe potenciadores de líneas celulares de producción. El documento WO 2011/066501 describe mutantes Fc de anticuerpos con funciones efectoras anuladas.

El documento WO 2013/109752 describe reactivos SIRPa de alta afinidad. El documento WO 2014/094122 describe el tratamiento de células enfermas CD47+ con fusiones SIRPa-Fc. Liu et ai., (2015) PLOS ONE, vol. 10, n° 9, páginas 1-23 describe el desarrollo preclínico de un anticuerpo humanizado anti-CD47 con potencial terapéutico anticancerígeno. El documento US 2004/175824 describe proteínas de fusión Fc de eritropoyetina humana con elevadas actividades biológicas. El documento WO 2014/123580 describe anticuerpos CD47 no deplecionantes de plaquetas y no deplecionantes de glóbulos rojos y métodos de uso de los mismos. Horgan et al, (1993) The Journal of lmmunology, American Association of lmmunologists, vol. 150, no, 12, páginas 5400-5407, describe estudios sobre la unión de antígenos por anticuerpos quiméricos intactos y con bisagras suprimidas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0010] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Los aspectos, formas de realización y ejemplos de la presente divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente a título ilustrativo.

[0011] La invención proporciona un polipéptido de región constante de inmunoglobulina que comprende una región bisagra lgG4 modificada con una deleción de 5 aminoácidos en la región bisagra correspondiente a los residuos 226, 227, 228, 229, y 230 de IGHG4 según la numeración de Kabat,

en el que la bisagra lgG4 modificada consiste en SEQ 10 NO:5, P PC P 8/p C P,

y en la que la región constante comprende además una secuencia CH2-CH3 humana unida a la región bisagra lgG4 modificada,

y una fracción de unión se fusiona directamente al extremo amino de la bisagra lgG4 modificada, en la que la fracción de unión se une específicamente a un epítopo presente en los glóbulos rojos, en la que el epítopo es un epítopo de CD47, y en la que la fracción de unión es un dominio de región variable de inmunoglobulina.

[0012] La invención proporciona además un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención.

[0013] La invención proporciona además una célula que produce un polipéptido de la invención, en la que la célula no se encuentra en un cuerpo humano o animal.

[0014] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención.

[0015] La invención proporciona además un polipéptido de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer.

[0016] Se proporcionan composiciones polipeptídicas, incluidas composiciones de anticuerpos, y métodos de uso de las mismas. Los polipéptidos de la divulgación comprenden una región constante de inmunoglobulina humana con una región bisagra lgG4 modificada que tiene una deleción N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5 aminoácidos, en relación con una secuencia bisagra lgG4 humana nativa. En algunos casos, la secuencia bisagra comprende además la sustitución de aminoácidos S228P (numeración de Kabat). La secuencia de bisagra modificada puede denominarse en el presente documento "G4H modificada". Los polipéptidos que comprenden una G4H modificada, en lo sucesivo denominados "polipéptidos G4H modificados", comprenden opcionalmente una fracción de unión específica para un epítopo presente en células hematopoyéticas; y pueden reducir la aglutinación de células hematopoyéticas, por ejemplo, la hemaglutinación, en comparación con un polipéptido comparable con una región bisagra nativa.

[0017] El epítopo presente en las células hematopoyéticas incluye, sin limitación, una proteína CD47, por ejemplo CD47 humana. La fracción de unión específica puede ser, sin limitación, una secuencia VL que se une específicamente a CD47, una secuencia VH que se une específicamente a CD47, una secuencia VH-VL que se une específicamente a CD47, una secuencia SIRPa soluble que se une específicamente a CD47, una secuencia SIRPa soluble madurada por afinidad que se une específicamente a CD47, y similares. Los elementos de unión adecuados incluyen, sin limitación, la región variable de Hu5F9, CC-9002; TTI-621 y polipéptidos SIRPa bivalentes, tetravalentes, etc. de alta afinidad.

[0018] En algunos casos, el G4H modificado se fusiona directamente a uno o más dominios de región constante de inmunoglobulina. Las secuencias de dominio de región constante pueden ser cualquiera de las secuencias de región constante conocidas, incluyendo sin limitación los dominios de región constante IgA, IgD, IgE, IgG, IgM humanos. En algunas realizaciones, la secuencia de dominio de región constante es una secuencia IgG humana, por ejemplo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, etc. En algunas realizaciones es una secuencia lgG4 humana. La G4H modificada puede fusionarse directamente a uno o ambos dominios CH2 y CH1, por ejemplo cuando la secuencia CH1 se fusiona al extremo amino y la secuencia CH2 se fusiona al extremo carboxi de la bisagra. El G4H modificado puede fusionarse directamente a un dominio CH3, por ejemplo para generar un minicuerpo.

[0019] En algunas realizaciones, el G4H modificado se incorpora a una cadena pesada intacta, por ejemplo, sustituyendo la región bisagra nativa en una cadena polipeptídica que comprende una región VH fusionada a una región constante CH1- H-CH2-CH3. En algunas realizaciones, la cadena pesada así formada se empareja con una cadena ligera adecuada. En algunas realizaciones, las cadenas pesada y ligera forman una proteína dimérica o tetramérica, en la que la fracción de unión formada por los dominios VH y VL puede proporcionar una fracción de unión específica para un epítopo presente en los glóbulos rojos. Un anticuerpo también puede proporcionarse como un anticuerpo biespecífico o multiespecífico reactivo con un segundo antígeno, incluyendo particularmente antígenos cancerígenos.

[0020] En algunas realizaciones, el G4H modificado se fusiona directamente a una región CH2 o CH3 en su extremo carboxilo, y se fusiona directamente a una fracción de unión en el extremo amino. Dicho polipéptido G4H modificado puede comprender además un dominio constante CH3 de anticuerpo unido al dominio CH2, por ejemplo en una configuración de B-H-CH2-CH3, donde B designa el dominio de unión específico. La fracción de unión puede ser específica para un epítopo presente en las células hematopoyéticas, incluyendo sin limitación CD47. La fracción de unión puede incluir, sin limitación, una secuencia SIRPa soluble que se une específicamente a CD47.

[0021] Las realizaciones incluyen polipéptidos aislados que comprenden una G4H modificada y derivados y fragmentos de la misma, incluyendo derivados marcados; formulaciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los polipéptidos que comprenden G4H modificada; y líneas celulares que producen estos polipéptidos. Los G4H modificados que comprenden polipéptidos pueden marcarse con una etiqueta detectable, inmovilizarse en una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo. También se proporcionan secuencias de aminoácidos de los polipéptidos. Cuando el polipéptido G4H modificado es un anticuerpo, el anticuerpo puede ser humano, humanizado o quimérico, donde las secuencias de la región constante, es decir, las secuencias CH1, CH2, CH3, son de origen humano, incluyendo sin limitación las secuencias lgG4.

[0022] Los polipéptidos G4H modificados descritos en el presente documento pueden utilizarse para cualquier fin terapéutico adecuado para la fracción de unión del polipéptido. En algunas realizaciones, cuando la fracción de unión es específica para CD47, las composiciones se utilizan en modalidades terapéuticas conocidas en la técnica en relación con el bloqueo o la activación de CD47. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para mejorar la fagocitosis de células que expresan CD47 mediante el bloqueo de la interacción entre CD47 expresado en una célula diana de fagocitosis y SIRPa expresado en una célula fagocítica. Dichos métodos pueden comprender el contacto de una célula diana con una dosis eficaz del polipéptido G4H modificado que comprende una fracción de unión a CD47. Las células objetivo pueden ser, sin limitación, células cancerosas, células infectadas por virus, etc. El tratamiento puede ser sistémico o localizado, por ejemplo, mediante inyección intratumoral,etc.

[0023] La divulgación describe además: ácido nucleico aislado que codifica los polipéptidos G4H modificados y variantes de los mismos; un vector que comprende dicho ácido nucleico, opcionalmente unido de forma operable a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped que comprende dicho vector; un proceso para producir el polipéptido que comprende cultivar la célula huésped de forma que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped (por ejemplo, del medio de cultivo de la célula huésped). La divulgación también describe una composición que comprende uno o más de los polipéptidos G4H modificados y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición para uso terapéutico es estéril y puede ser liofilizada, por ejemplo , suministrada como preenvasado en una dosis unitaria con diluyente y dispositivo de administración, porejemplo,inhalador, jeringa,etc.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0024] La invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Se subraya que, según la práctica habitual, las distintas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las distintas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. Los dibujos incluyen las siguientes figuras.

Figura 1. La unión del Ab anti-CD47 Hu5F9-G4 con región bisagra modificada/truncada (TR) a CD47 no se redujo en comparación con el Ab Hu5F9-G4 parental con región bisagra no modificada. El ensayo de unión a CD47 se realizó recubriendo una placa de 96 pocillos con 1 pg/ml de proteína de fusión huCD47/mFc en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 h a 4 °C. Tras bloquear durante 1 h con BSA al 0,4% en PBS a temperatura ambiente, se añadieron 10 pg/ml de Hu5F9-G4 o Hu5F9-G4 con bisagra truncada y en diluciones secuenciales de 1/3, y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con un anticuerpo específico kappa antihumano de cabra conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el lavado, las placas se revelaron con OPT. La reacción se detuvo con 2N H<2>SO<4>y la OD se midió a 490 nM.

Figura 2. La modificación/truncamiento de la región bisagra (TR) reduce la aglutinación de glóbulos rojos humanos por el anticuerpo de unión a CD47 Hu5F9-G4 en comparación con Hu5F9-G4 con región bisagra no modificada. Se obtuvo sangre humana de dos donantes sanos. Incubar 100 ul de la sangre con 10 ug/ml de anticuerpos como se ha indicado anteriormente a 37°C durante 2hr. Se realizó un frotis sanguíneo utilizando 5 ul de la mezcla de sangre y anticuerpos y se tiñó con Giemsa. La aglutinación de glóbulos rojos se examinó al microscopio.

Figura 3. La modificación/truncamiento de la región bisagra (TR) no afecta a la eficacia terapéutica del anticuerpo de unión a CD47 Hu5F9-G4 en comparación con Hu5F9-G4 con región bisagra no modificada. Las células DLD1, SW620 y Raji fueron marcadas con Calceína e incubadas con macrófagos humanos derivados de sangre periférica en presencia de 10 ug/ml de Hu5F9-G4, Hu5F9-G4 con bisagra truncada o un anticuerpo de control del isotipo durante 2 h a 37°C. A continuación, los macrófagos se marcaron con AlexaFluor 847 anti CD206 humano. Las células se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de fagocitosis se calculó como el porcentaje de FITC células diana dentro de AlexaFluor 647 macrófagos.

Figura 4. Secuencias de las regiones constantes nativas de lgG4 humano, y secuencia de la secuencia bisagra de G4 modificada.

Figura 5. (A-B) Secuencias de las construcciones de la región variable 5F9.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0025] La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia bisagra lgG4 modificada, que puede proporcionar una reducción inesperada de la hemaglutinación, por ejemplo cuando el anticuerpo se une a una proteína presente en los glóbulos rojos. La bisagra modificada puede utilizarse en el contexto de un anticuerpo intacto, o fragmentos del mismo, por ejemplo, secuencias de la región Fc para la fusión con una fracción de unión de interés. También se divulgan el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos de dichos polipéptidos.

[0026] Los "anticuerpos e inmunoglobulinas nativos" son típicamente glicoproteínas heterotetraméricas de unos 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas pesadas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes, en la configuración V<h>- C<h1>-H-C<h2>-C<h3>. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V<l>) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (véase, por ejemplo, Clothia et al., J. Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985)).

[0027] El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en la cadena ligera como en los dominios variables de la cadena pesada. Las partes más conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina p. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no intervienen directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

[0028] La inmunoglobulina G (IgG) es una de las proteínas más abundantes en el suero humano, representando alrededor del 10-20% de las proteínas plasmáticas. Es la principal de las cinco clases de inmunoglobulinas del ser humano: IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE. La IgG puede dividirse a su vez en cuatro subclases, denominadas, por orden de abundancia decreciente lgGI, lgG2, lgG3, y lgG4. Aunque son idénticas en más de un 90% a nivel de aminoácidos, cada subclase tiene un perfil único con respecto a la unión al antígeno, la formación de inmunocomplejos, la activación del complemento, la activación de células efectoras, la semivida, y el transporte placentario.

[0029] De forma similar a los otros isotipos, la cadena IgG 50 kDa<y>pesada (H) consta de un dominio variable N-terminal (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2, CH3), con una "región bisagra" adicional entre CH1 y CH2. Los residuos más próximos a la región bisagra en el dominio CH2 de la parte Fc son responsables de las funciones efectoras de los anticuerpos, ya que contiene un sitio de unión que se solapa en gran medida para los receptores C lq (complemento) e IgG-Fc (FcyR) en las células efectoras del sistema inmunitario innato. En la interfaz entre los dos CH2/CH3 se encuentra un sitio de glicosilación ligado a N altamente conservado en la posición 297. La interfaz entre los dominios CH2-CH3 también contiene el sitio de unión para el receptor Fc neonatal (FcRn), responsable de la semivida prolongada de la IgG, el paso placentario y el transporte de IgG hacia y desde las superficies mucosas.

[0030] La región bisagra forma un enlace flexible entre los brazos Fab y la región Fc. La longitud y flexibilidad de la región bisagra varía ampliamente entre las subclases de IgG. A efectos de la presente invención, la bisagra se define como la "bisagra genética", es decir, la secuencia codificada por los exones de la bisagra. El extremo N-terminal del dominio CH2 puede denominarse "CH2 genético, bisagra inferior".

[0031] La secuencia nativa de bisagra de lgGI abarca 15 aminoácidos y es muy flexible. lgG2 tiene una bisagra más corta que lgGI, con 12 residuos de aminoácidos, y las bisagras de lgG2 son más rígidas debido a una hélice de poliprolina, estabilizada por puentes disulfuro entre cadenas pesadas. La región bisagra nativa de lgG4 también contiene 12 aminoácidos y es, por tanto, más corta que la de lgGI. Su flexibilidad es intermedia entre la de lgGI y lgG2.

[0032] La secuencia de bisagra nativa de lgG4 es la siguiente: (SEQ ID NO:2) ESKYGPPCPSCP. Coexisten dos isómeros de lgG4 que difieren en la unión disulfuro de las cisteínas bisagra. La bisagra central de la IgG está formada por un motivo CXXC, que también se encuentra en proteínas redox-reactivas como las tiorredoxinas. En comparación con lgG1, con un motivo CPPC relativamente rígido, los enlaces disulfuro intracadena se forman más fácilmente entre estas cisteínas que se encuentran en las posiciones 226 y 229 en lgG4, que posee una bisagra de núcleo CPSC. El resultado es una cantidad observable de semimoléculas unidas de forma no covalente (formadas por una cadena pesada y otra ligera, HL, frente a la configuración clásica de H<2>L<2>), además de isómeros entre cadenas unidos de forma covalente. Un mutante S228P de lgG4, por tanto con una bisagra de núcleo lgG1, no forma semimoléculas, lo que concuerda con el hallazgo de que esta especie no se da en lgG1. El proceso es reversible pero depende de las condiciones redox. La formación del isómero intracadena (semimoléculas) es un paso importante en el "intercambio del brazo Fab". Así, la bisagra de G4 puede definirse como:

(SEQ ID NO:8) E S K Y G P P C P<s>/<p>C P

[0033] La bisagra modificada proporcionada en el presente documento tiene una deleción de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en el extremo amino de la bisagra G4 (SEQ ID NO:8). En algunas realizaciones, la bisagra modificada tiene una secuencia: (SEQ ID NO:5) P P C P<s>/<p>C P

[0034] Los aminoácidos eliminados corresponden a los residuos 226, 227, 228, 229, y 230 de IGHG4 (numeración de Kabat).

[0035] La G4H modificada suele fusionarse directamente a un dominio de región constante CH2 en el extremo carboxi, incluyendo sin limitación un dominio CH2 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 humano. Por fusión directa se entiende que la prolina amino terminal de la G4H modificada forma un enlace con el residuo amino terminal del dominio CH2. El G4H modificado también puede fusionarse con CH3, por ejemplo, para hacer un minicuerpo. Alternativamente, un dominio CH2 puede fusionarse directamente a un dominio CH3, como en una configuración Fc nativa. El dominio CH3 puede proceder de la misma fuente que el dominio CH2, o puede ser heterólogo. En algunas realizaciones, los dominios CH2 y CH3 son una secuencia IgG humana.

[0036] "Molécula de unión específica", como se usa aquí, se refiere a un agente, generalmente un polipéptido, que interactúa específicamente para asociarse con un compañero de enlace de interés donde la constante de enlace relativa (Kd) es suficientemente fuerte para permitir, por ejemplo, la detección de enlace a la proteína por un medio de detección; asociación fisiológicamente relevante, etc. En algunas realizaciones, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una K<d>(constante de disociación) de 10-5 M o menos (p. ej., 10-6 M o menos, 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos, o 10-16 M o menos). "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión, una mayor afinidad de unión se correlaciona con una Kd menor.

[0037] El término "miembro de unión específica", tal como se utiliza aquí, se refiere a un miembro de un par de unión específica (es decir, dos moléculas, normalmente dos moléculas diferentes, en las que una de las moléculas, p. ej., un primer miembro de unión específica, a través de medios no covalentes se une específicamente a la otra molécula, p. ej., un segundo miembro de unión específica). Los miembros de unión específicos adecuados incluyen agentes que se unen específicamente a CD47 y/o SIRPa (es decir, agentes anti-CD47), o que bloquean de otro modo la interacción entre CD47 y SIRPa.

[0038] La "afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo u otra molécula de unión) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno o receptor). La afinidad de una molécula X por su compañera Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad se unen al antígeno (o receptor) débilmente y tienden a disociarse con facilidad, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen al antígeno (o receptor) más fuertemente y permanecen unidos más tiempo.

[0039] Las partes de unión específicas de interés incluyen un dominio de región variable de inmunoglobulina. Una región variable nativa comprende un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Sin embargo, una fracción de unión en un polipéptido de la invención puede comprender un VH en ausencia de una secuencia VL, o un VL en ausencia de un VH. Incluso un solo dominio variable (es decir, la mitad de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque la afinidad puede ser inferior a la de un sitio de unión de dos dominios.

[0040] Como es conocido en la técnica, las regiones variables se componen de secuencias marco e hipervariables. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en la cadena ligera como en los dominios variables de la cadena pesada. Las partes más conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por los FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.).

[0041] Otras moléculas de unión específicas de interés incluyen, por ejemplo, ligando/receptor, o moléculas de unión de receptor y contrarreceptor, donde la molécula de unión puede ser una molécula de unión nativa, una molécula de unión madurada por afinidad, etc.

[0042] En algunas realizaciones, la fracción de unión se une específicamente a un epítopo presente en los glóbulos rojos. Tal como se utiliza en esta divulgación, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico de un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo, o una fracción de unión específica. Los determinantes epitópicos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

[0043] En algunas realizaciones, el epítopo presente en los glóbulos rojos es un epítopo de CD47. CD47 es una glicoproteína transmembrana expresada ampliamente con un solo dominio similar a Ig y cinco regiones que abarcan la membrana, que funciona como un ligando celular para SIRPa con la unión mediada por el dominio de terminal NH2 de tipo V de SIRPa. La SIRPa se expresa principalmente en células mieloides, como macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides (DC), mastocitos y sus precursores, incluidas las células madre hematopoyéticas. Los determinantes estructurales de la SIRPa que median la unión a CD47 son analizados por Lee et al. (2007) J. Immunol. 179:7741-7750; Hatherley et al. (2007) J. B.C. 282: 14567-75; y el papel de la dimerización cis de SIRPa en la unión a CD47 se discute en Lee et al. (2010) J. B.C. 285:37953-63. En consonancia con la función de CD47 de inhibir la fagocitosis de células normales, existen pruebas de que se regula positivamente de modo transitorio en las células madre hematopoyéticas (HSC) y progenitoras justo antes y durante su fase migratoria, y que el nivel de CD47 en estas células determina la probabilidad de que sean engullidas in vivo. CD47 también se expresa en los glóbulos rojos, sobre todo en los envejecidos; en las células tumorales, en las células infectadas por virus, etc.

[0044] Ciertas moléculas de unión específicas para CD47, y los polipéptidos G4H modificados que comprenden tales moléculas de unión pueden denominarse en el presente documento "agente anti-CD47", que se refiere a un agente que se une a CD47 y al hacerlo reduce la unión de CD47 a SIRPa. Ejemplos no limitantes de reactivos anti-CD47 adecuados incluyen reactivos SIRPa, incluyendo sin limitación polipéptidos SIRPa de alta afinidad y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD47. Dicho agente puede aumentar la fagocitosis en al menos un 10% (p. ej., al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100%, al menos un 120%, al menos un 140%, al menos un 160%, al menos un 180% o al menos un 200%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente. En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no activa CD47 tras la unión. Cuando CD47 se activa, puede producirse un proceso similar a la apoptosis (es decir, la muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, 1 de febrero de 2004). Así, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47.

[0045] Un agente anti-CD47 G4H modificado, al entrar en contacto con glóbulos rojos, producirá una aglutinación reducida en relación con un agente comparable que comprenda una secuencia de bisagra nativa, por ejemplo, reduciendo la hemaglutinación. La reducción de la hemaglutinación puede ser de al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, o más.

[0046]Anticuerpos anti-CD47.En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (p. ej., una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 al unirse. Ejemplos no limitantes de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6, y C3 (por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 2011/143624). El clon CC-9002 se describe en el documento WO2013119714. Los anticuerpos anti-CD47 adecuados incluyen versiones totalmente humanas, humanizadas o quiméricas de dichos anticuerpos. Los anticuerpos humanizados (p. ej., hu5F9) son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. Del mismo modo, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados, o caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y sus variantes.

[0047] En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 comprende una secuencia de cadena pesada como se establece en SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, que puede combinarse con una secuencia de cadena ligera adecuada.

[0048]Reactivo SIRPa.Un reactivo SIRPa comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que conserva la actividad de unión. Un reactivo SIRPa adecuado reduce (p. ej., bloquea, impide, etc.) la interacción entre las proteínas nativas SIRPa y CD47. El reactivo SIRPa comprenderá normalmente al menos el dominio d i de SIRPa. Un reactivo SIRPa es una proteína de fusión, por ejemplo, directamente fusionada a una secuencia G4H modificada proporcionada en el presente documento. Por fusión directa se entiende que el residuo amino terminal del péptido G4H modificado se une al extremo carboxi de la secuencia SIRPa, por ejemplo, en ausencia de un enlazador. La G4H modificada puede fusionarse directamente a una secuencia CH2 de una inmunoglobulina, como se describe en el presente documento, para proporcionar parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. Un ejemplo de agente SIRPa es TTI-621, divulgado para su uso en el ensayo clínico NCT02663518, que puede alterarse para utilizar una secuencia G4H modificada.

[0049] En algunos casos, un agente anti-CD47 sujeto es un "reactivo SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos SIRPa de alta afinidad se describen en la solicitud internacional PCT/USÍ3/21937. Los reactivos SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína SIRPa nativa. En algunos casos, un reactivo SIRPa de alta afinidad es soluble, en el que el polipéptido carece del dominio transmembrana SIRPa y comprende al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia SIRPa de tipo salvaje, y en el que el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47, por ejemplo disminuyendo la tasa de desactivación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, o más.

[0050] Un reactivo SIRPa de alta afinidad comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, p. ej., alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. El reactivo SIRPa de alta afinidad comprenderá normalmente al menos el dominio d1 de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. Un reactivo SIRPa es una proteína de fusión, por ejemplo, directamente fusionada a una secuencia G4H modificada proporcionada en el presente documento. Por fusión directa se entiende que el residuo amino terminal del péptido G4H modificado se une al extremo carboxi de la secuencia SIRPa, por ejemplo, en ausencia de un enlazador. La G4H modificada puede fusionarse directamente a una secuencia CH2 de una inmunoglobulina, como se describe en el presente documento, para proporcionar parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina.

[0051] El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Cada mAb se dirige contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales presentan la ventaja de que pueden sintetizarse mediante cultivo de hibridomas, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse en el sentido de que requiera la producción del anticuerpo mediante un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden fabricarse en una célula B inmortalizada o hibridoma de la misma, o pueden fabricarse mediante métodos de DNA recombinante.

[0052] Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por empalme de un dominio variable (incluida la hipervariable) de un anticuerpo anti-CD47 con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o la designación de la clase o subclase de inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')<2>y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada.

[0053] Los anticuerpos monoclonales aquí descritos incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

[0054] Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purificará (1) a más del 75% en peso de anticuerpo según lo determinado por el método de Lowry, y más preferiblemente a más del 80%, 90% o 99% en peso, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.

[0055] El término "marcado con epítopo" cuando se usa aquí se refiere a un anticuerpo anti-CD47 fusionado a un "marcado con epítopo". El polipéptido marcador del epítopo tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que pueda fabricarse un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para no interferir con la actividad del anticuerpo CD47. Es preferible que la etiqueta del epítopo sea suficientemente única para que el anticuerpo específico del epítopo no presente una reacción cruzada sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos marcadores adecuados suelen tener al menos 6 residuos de aminoácidos y, por lo general, entre unos 8-50 residuos de aminoácidos (preferiblemente entre unos 9-30 residuos). Algunos ejemplos son la etiqueta c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); y la glicoproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)).

[0056] La palabra "etiqueta" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo. La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, etiquetas radioisotópicas o fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que sea detectable.

[0057] Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Entre los ejemplos de fases sólidas comprendidas en el presente documento se incluyen las formadas parcial o totalmente por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, como las descritas en U.S. Pat. N.° 4,275,149.

[0058] Los términos "tratamiento", "en tratamiento", "tratar" y similares se utilizan aquí para referirse en general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención completa o parcial de una enfermedad o síntoma(s) de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización parcial o completa o curación de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento" abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad y/o síntoma(s) en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que aún no ha sido diagnosticado de padecerla; (b) inhibir la enfermedad y/o síntoma(s), es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma(s) de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o síntoma(s). Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen las que ya lo padecen (por ejemplo, las que padecen cáncer, las que tienen una infección, etc.), así como aquellas en las que se desea la prevención (por ejemplo, las que tienen una mayor susceptibilidad al cáncer, las que tienen una mayor probabilidad de infección, las que se sospecha que tienen cáncer, las que se sospecha que albergan una infección, etc.).

[0059] Tal como se utiliza en el presente documento, una "célula diana" es una célula que expresa CD47 en la superficie, en la que el enmascaramiento o la alteración de otro modo del fenotipo CD47 positivo (p. ej., mediante la administración de un agente anti-CD47) produce un aumento de la fagocitosis. Por lo general, una célula diana es una célula de mamífero, por ejemplo una célula humana.

[0060] Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desee un diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular los seres humanos. "Mamífero" a efectos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

[0061] Una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" es una cantidad suficiente para obtener los resultados clínicos deseados (es decir, lograr la eficacia terapéutica). Una dosis terapéuticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones. A efectos de esta invención, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado de la enfermedad (por ejemplo, cáncer) mediante el aumento de la fagocitosis de una célula diana (por ejemplo, una célula diana). Así, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 reduce la unión de CD47 en una célula diana, a SIRPa en una célula fagocítica, a una dosis eficaz para aumentar la fagocitosis de la célula diana.

[0062] Una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 puede depender del agente específico utilizado, pero por lo general es de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o más (por ejemplo, unos 8 mg/kg o más, unos 10 mg/kg o más, unos 15 mg/kg o más, unos 20 mg/kg o más, unos 25 mg/kg o más, unos 30 mg/kg o más, unos 35 mg/kg o más, o unos 40 mg/kg o más), o de unos 10 mg/kg a unos 40 mg/kg (por ejemplo, de unos 10 mg/kg a unos 35 mg/kg, o de unos 10 mg/kg a unos 30 mg/kg). La dosis necesaria para alcanzar y/o mantener un determinad nivel sérico es proporcional al tiempo transcurrido entre las dosis e inversamente proporcional al número de dosis administradas. Así, a medida que aumenta la frecuencia de dosificación, disminuye la dosis necesaria. La optimización de las estrategias de dosificación será fácilmente comprendida y practicada por un experto en la materia.

[0063] En algunas realizaciones, una dosis de cebado se define como una dosis (es decir, una cantidad) que es suficiente para causar reticulocitosis compensatoria, sin anemia indebida, y se administra antes de una dosis terapéuticamente eficaz. En algunas realizaciones, una dosis de cebado se define como una dosis que provoca una anemia que no empeora con dosis posteriores.

[0064] La dosis de cebado específica adecuada de un agente anti-CD47 puede variar en función de la naturaleza del agente utilizado y de numerosos factores específicos del sujeto (por ejemplo, edad, peso, etc.). Ejemplos de dosis de cebado adecuadas de un agente anti-CD47 incluyen de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg.

[0065] Una "dosis de mantenimiento" es una dosis destinada a ser una dosis terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, en experimentos para determinar la dosis terapéuticamente eficaz, pueden administrarse múltiples dosis de mantenimiento diferentes a distintos sujetos. Así, algunas de las dosis de mantenimiento pueden ser dosis terapéuticamente eficaces y otras pueden ser dosis subterapéuticas.

[0066] Se puede utilizar una "dosis de carga" para alcanzar un nivel terapéutico de anticuerpo antes de pasar a una dosis de mantenimiento. Una dosis de carga puede ser la misma, mayor o menor que la dosis de mantenimiento, pero generalmente proporcionará una mayor administración total del agente durante un periodo de tiempo determinado. Por ejemplo, una dosis de carga puede ser igual o inferior a una dosis de mantenimiento, pero administrada con mayor frecuencia, por ejemplo, diariamente, cada dos días, cada tres días, dos veces por semana, semanalmente, y similares. Alternativamente, una dosis de carga puede ser una dosis más alta que una dosis de mantenimiento, y administrada con la misma periodicidad, o con más frecuencia, por ejemplo, diariamente, cada dos días, cada tres días, dos veces por semana, semanalmente, y similares.

[0067] Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a una célula capaz de fagocitosis. Existen tres categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.

[0068] El término "muestra" con respecto a un paciente abarca la sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas o aisladas de los mismos y su progenie. La definición también incluye las muestras que han sido manipuladas de algún modo tras su obtención, como por ejemplo mediante tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para determinadas poblaciones celulares, como las células cancerosas. La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas para tipos particulares de moléculas, p. ej, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

[0069] El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra que comprende células diana o células normales de control o que se sospecha que comprende dichas células o fluidos biológicos derivados de las mismas (p. ej., células cancerosas, células infectadas, etc.), p. ej., una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene a partir de dichas células (p. ej., un lisado celular u otro extracto celular que comprenda polinucleótidos y/o polipéptidos). Una muestra biológica que comprende una célula infectada de un paciente también puede incluir células no infectadas.

Composiciones

[0070] En un aspecto, la presente divulgación está dirigida a polipéptidos, incluyendo sin limitación anticuerpos y moléculas de unión específicas fusionadas a una secuencia Fc de anticuerpo, que comprenden una secuencia G4H modificada como se ha descrito anteriormente. Además de anticuerpos intactos y construcciones Fc, los polipéptidos también pueden incluir, por ejemplo, cadenas pesadas simples y fragmentos de las mismas, siempre que se incluya una secuencia G4H modificada.

[0071] La divulgación también describe ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos G4H modificados, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción de los polipéptidos. Los ácidos nucleicos de interés pueden ser al menos un 80% idénticos a las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99%, o idénticos.

[0072] Para la producción recombinante del polipéptido, el ácido nucleico que lo codifica se inserta en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del DNA) o para su expresión. El DNA que codifica el polipéptido se aísla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las regiones constantes de la cadena pesada). Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, entre otros, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

[0073] Los polipéptidos pueden producirse recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo u homólogo, que incluya una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el N-terminal de la proteína o polipéptido maduro, una secuencia de región constante de inmunoglobulina, y similares. Una secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente puede ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal nativa del anticuerpo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada.

[0074] Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia normalmente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada no tiene la forma o el entorno en que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal y como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente a la de las células naturales.

[0075] Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el DNA son las procariotas, las levaduras, o las células eucariotas superiores. Ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (M<d>C<k>, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfala (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1.982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de polipéptidos y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según convenga para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

[0076] La composición polipeptídica preparada a partir de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos basados en cadenas pesadas<y>1,<y>2, o<y>4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1 13 (1983)). Se recomienda la proteína G para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero existen otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenedivinil)benceno, permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH<3>, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. También se dispone de otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía sobre sílice, la cromatografía sobre heparina SEPHA<r o>S<e>™, la cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, el SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato de amonio, en función del anticuerpo que se desee recuperar.

[0077] Después de cualquier paso(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el polipéptido de interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25M de sal).

Métodos de Uso

[0078] Los polipéptidos G4H modificados pueden utilizarse para cualquier fin adecuado para la molécula de unión específica. Cuando la molécula de unión es específica para CD47, por ejemplo, un polipéptido SIRP, y una región variable anti-CD47, la composición puede utilizarse en la modulación de la fagocitosis, incluidos los métodos expuestos en la solicitud internacional US2009/000319. Son interesantes las realizaciones en las que se desea disminuir la hemaglutinación. Por ejemplo, las composiciones polipeptídicas pueden administrarse in vivo para aumentar la fagocitosis de las células cancerosas que expresan CD47.

[0079] En algunos casos, se proporciona una dosis de cebado eficaz de un agente anti-CD47. Una dosis inicial de un agente de unión a CD47, incluida pero no limitada a una dosis de cebado, también puede provocar hemaglutinación durante un periodo de tiempo inmediatamente posterior a la infusión. Sin estar limitado por la teoría, se cree que la dosis inicial de un agente de unión a CD47 multivalente puede causar la reticulación de los glóbulos rojos unidos al agente. El uso del G4H modificado reduce la hemaglutinación.

[0080] Los polipéptidos G4H modificados pueden utilizarse in vitro e in vivo como agentes terapéuticos, para monitorizar el curso de la terapia de enfermedades, etc. Así, por ejemplo, midiendo el aumento o la disminución del número de células que expresan CD47, en particular células cancerosas que expresan CD47, se puede determinar si un régimen terapéutico concreto destinado a mejorar la enfermedad es eficaz.

[0081] Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse in vitro en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidos a un portador en fase sólida. Además, los polipéptidos de estos inmunoensayos pueden marcarse de diversas maneras. Ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos monoclonales de la invención son la citometría de flujo, por ejemplo FACS, MACS, inmunohistoquímica, inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto; y similares. La detección de los antígenos utilizando los anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse utilizando inmunoensayos que se ejecutan en los modos directo, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos en muestras fisiológicas. Los expertos en la técnica conocerán, o podrán discernir fácilmente, otros formatos de inmunoensayo sin necesidad de experimentos excesivos.

[0082] Los polipéptidos G4H modificados pueden unirse a muchos portadores diferentes y utilizarse en ensayos de detección. Algunos ejemplos de soportes conocidos son el vidrio, el poliestireno, el polipropileno, el polietileno, el dextrano, el nailon, las amilasas, las celulosas naturales y modificadas, las poliacrilamidas, las agarosas y la magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble a efectos de la invención. Los expertos en la materia conocerán otros soportes adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales, o podrán determinarlos mediante experimentación rutinaria.

[0083] Las formulaciones terapéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. La composición se formulará, dosificará y administrará de acuerdo con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno concreto a tratar, el mamífero concreto a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el lugar de administración del agente, el método de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo a administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para lograr la terapia deseada.

[0084] Una dosis terapéutica puede ser de al menos aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,05 pg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,5 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2,5 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, y no más de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal. Se entenderá por un experto en la técnica que dichas directrices se ajustarán al peso molecular del agente activo, por ejemplo, en el uso de fragmentos de anticuerpos, o en el uso de conjugados de anticuerpos. La dosificación también puede variar para la administración localizada, p. ej, intranasal, por inhalación, etc., o para la administración sistémica,p. ej.,i.m., i.p., i.v., y similares.

[0085] No es necesario que el polipéptido sea, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes que potencian la actividad, o que de otro modo aumentan el efecto terapéutico. Por lo general, se utilizan en las mismas dosis y con las mismas vías de administración que en el presente documento o en un porcentaje comprendido entre el 1 y el 99% de las dosis empleadas hasta ahora.

[0086] Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones que se utilicen para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0087] Los principios activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatina-microcápsula y poli(metilmetacilato) microcápsula, respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0088] El polipéptido se administra por cualquier medio adecuado, incluidos parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, y intranasal. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el polipéptido se administra adecuadamente mediante infusión en pulsos, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo.

[0089] Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de polipéptido dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se ha definido anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el polipéptido se administra con fines preventivos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al polipéptido, y la discreción del médico tratante. El polipéptido se administra al paciente de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

[0090] En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar hechos de diversos materiales, como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo de la composición es el polipéptido G4H modificado. La etiqueta del envase, o asociada al mismo, indica que la composición se utiliza para tratar la afección elegida. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que contenga un tampón farmacéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso.

EXPERIMENTAL

Ejemplo 1

Modificación de la región bisagra (bisagra truncada) de los agentes de unión a CD47 para mitigar la aglutinación celular

[0091] Los agentes de unión a CD47 pueden causar aglutinación de células que expresan CD47, siendo la aglutinación de glóbulos rojos el ejemplo más destacado. La terapia con tales agentes de unión a CD47, por ejemplo, anticuerpos de unión a CD47, puede potencialmente causar efectos secundarios significativos. Hu5F9-g4 también puede causar la muerte aguda en ratones injertados con AML, posiblemente debido a la aglutinación de las células de AML. Los datos preliminares mostraron que hu5f9-g4 con bisagra truncada reducía la muerte aguda de ratones con alta carga de la enfermedad.

[0092] La aglutinación de células hematopoyéticas puede limitar el uso terapéutico de tales agentes o requerir estrategias de dosificación específicas. Aquí se identifica una modificación de la región bisagra de los agentes de unión a CD47 que reduce la aglutinación de las células que expresan CD47. La región bisagra es una porción de la cadena pesada de la inmunoglobulina y conecta la Fab con la región Fc. Así, la región bisagra forma parte de los anticuerpos monoclonales, pero también puede diseñarse para conectar otras moléculas a las regiones Fc. Por lo tanto, esta invención se aplica a todas las moléculas relacionadas con anticuerpos que contienen una región bisagra, incluidos los agentes de unión a CD47.

[0093] Se probó el anticuerpo humanizado anti-CD47, Hu5F9-G4, para determinar sus efectos sobre la tipificación de la sangre previa a la transfusión y la prueba cruzada en preparación de estrategias para el manejo de pacientes que podrían necesitar transfusión durante el tratamiento con Hu5F9-G4. Hu5F9-G4 se incubó con glóbulos rojos de primates no humanos y de donantes humanos. Hu5F9-G4 no indujo hemólisis in vitro de glóbulos rojos humanos, ni siquiera en presencia de suero con complemento. El estudio no mostró indicios de hemaglutinación (HA) en siete especímenes de NHP. Sin embargo, se observó HA en las 14 muestras de sangre de donantes humanos en presencia de 10 microgramos/mL de Hu5F9- G4. A diferencia de la mayoría de los casos de anemia hemolítica autoinmune relacionada con la aglutinación, en los que la HA está causada por aglutininas IgM frías, la aglutinación causada por Hu5F9-G4, una lgG4, se produjo a 37°C pero no a 4°C. Aunque la aglutinación de glóbulos rojos puede observarse en varias afecciones (normalmente en asociación con agentes infecciosos, tanto con secuelas clínicas como sin ellas), el significado clínico de la aglutinación observada aquí es incierto.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de región constante de inmunoglobulina que comprende una región bisagra de IGHG4 modificada con una deleción de 1-5 aminoácidos en la región bisagra correspondiente a los residuos 226, 227, 228, 229, y 230 de IGHG4 según la numeración de Kabat,

en el que la bisagra lgG4 modificada consiste en SEQ ID NO:5, P PC P s/p C P,

y en la que la región constante comprende además una secuencia CH2-CH3 humana unida a la región bisagra lgG4 modificada,

y una molécula de unión se fusiona directamente al extremo amino de la bisagra lgG4 modificada, en la que la molécula de unión se une específicamente a CD47, y en la que la molécula de unión es una secuencia de región variable de inmunoglobulina.

2. El polipéptido de región constante de la reivindicación 1, en el que la secuencia CH2-CH3 humana es una secuencia lgG4.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que CD47 es CD47 humano.

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 comprende además una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina.

5. Un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una célula que produce un polipéptido descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la célula no se encuentra en un cuerpo humano o animal.

7. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

8. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un método de tratamiento del cáncer.