ES2987381T3 - Dispositivo y procedimiento para la detección de aeropatógenos en tiempo real - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona un dispositivo y un método para la detección en tiempo real de aeropatógenos. El dispositivo incluye un aeromuestreador que tiene una entrada de aire y al menos un tubo colector, un sistema microfluídico que incluye un recipiente, tuberías, una microbomba para hacer fluir un líquido y una cámara de detección viral. La cámara de detección viral tiene un electrodo que puede estar equipado con biosensores funcionalizados, un contraelectrodo, un sistema de detección electrónico conectable a los electrodos de la cámara de detección viral y un sistema de procesamiento electrónico integrado para procesar datos del sistema de detección electrónico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo y procedimiento para la detección de aeropatógenos en tiempo real
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la detección de patógenos, incluidos aerovirus y aerobacterias, tales como SIV (virus de la influenza porcina) y/o PRRSV (virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino), y/o MH (Mycoplasma Hyopneumoniae) en cualquier entorno donde los rebaños porcinos puedan estar expuestos, u otros aeropatógenos que afecten a las poblaciones humanas y/o diversas industrias de granjas animales, incluidas las aves de corral.
Antecedentes
En pocas palabras, las pequeñas gotas suspendidas en el aire y que contienen materiales biológicos como virus, bacterias y hongos se denominan «bioaerosoles». En la mayoría de las especies animales, el órgano más sensible a la exposición al bioaerosol es el sistema del tracto respiratorio. Nuestro sistema respiratorio es eficiente en la eliminación de aerosoles, pero si el tamaño de partícula cae por debajo de un rango particular o las partículas están altamente concentradas, pueden causar efectos en la salud. De hecho, las partículas muy pequeñas (< 5 pm) pueden llegar al alveolo pulmonar y causar enfermedades respiratorias graves en humanos y animales.
Además, recientemente se ha demostrado que la transmisión de SIV, PRRSV y MH a través de bioaerosoles es más eficiente que la propagación a través de superficies/fomitos ambientales contaminados, y que la transmisión a través de aerosoles ahora representa más del 53 % de todas las infecciones. Dadas las condiciones atmosféricas adecuadas, se ha demostrado que los aeropatógenos como los bioaerosoles SIV, PRRSV y MH viajan hasta 9,2 km y 4,7 km, respectivamente, lo que demuestra que se produce el transporte aéreo de larga distancia de aeropatógenos.
Actualmente, todos los sistemas de detección de aeropatógenos existentes requieren más de 16 horas para recolectar y analizar muestras y, por lo tanto, no son adecuados para detectar posibles portadores de patógenos. Además, no existe ningún instrumento disponible en el mercado capaz de medir en tiempo real el tipo y la concentración de virus 0 bacterias en el aire. El documento US 2007/186696 A1 describe un aparato autohumectante para recolectar materia particulada del aire. Se refiere solamente a un colector de aire, no a la detección de aeropatógenos. Brockman: University of Arkansas, Fayetteville QCM Aptasensor for Rapid and Specific Detection of Avian Influenza Virus Recommended Citation Brockman, Luke, “QCM Aptasensor for Rapid and Specific Detection of Avian Influenza Virus”, 1 de enero de 2013, XP055680024 describe un sistema capaz de detectar virus en un fluido con el uso de aptámeros.
Objetos
Un objeto es proporcionar un dispositivo y un procedimiento para la detección de aeropatógenos en tiempo real. En tiempo real, dentro del significado de la presente descripción, significa que un resultado de detección estará disponible en media hora, preferentemente en 15 minutos, más preferentemente en 5 minutos, desde el inicio del procedimiento de detección, es decir, el primer aire introducido en el aeromuestreador como se explica a continuación.
Otro objeto es proporcionar un dispositivo y un procedimiento para identificar aeropatógenos específicos. Otro objeto es proporcionar un dispositivo y un procedimiento para identificar cuantitativamente la concentración de aeropatógenos específicos presentes en el aire.
Otro objeto más es detectar diferentes aeropatógenos simultáneamente.
Otro objeto más es proporcionar un dispositivo para detectar aeropatógenos cuyo dispositivo pueda usarse varias veces mediante un sistema automático de limpieza y actualización.
Otro objeto más es proporcionar un dispositivo y procedimiento para detectar aeropatógenos que sea fácil de manejar por profesionales no sanitarios, como agricultores y administrativos de aduanas.
Resumen
Se describe un dispositivo para la detección de aeropatógenos en tiempo real según la reivindicación 1 adjunta a la presente; el dispositivo comprende un inyector de aire que tiene una entrada de aire, al menos un tubo colector de aire, un sistema microfluídico que comprende al menos un contenedor para recibir un líquido humectante, tuberías desde el contenedor hasta el al menos un tubo colector de aire y, al menos, una microbomba para crear un flujo de fluido a través de la tubería; el al menos un contenedor está configurado para suministrar líquido humectante a una pared interna del al menos un tubo colector; la entrada de aire está configurada para inyectar aire en el al menos un tubo colector de forma excéntrica y oblicua a un fondo del tubo, creando así una fuerza centrífuga; el dispositivo comprende al menos una cámara de detección de aeropatógenos y tuberías desde el sistema microfluídico a la al menos una cámara detectora de aeropatógenos; cada una de las al menos una cámaras de detección de aeropatógenos tiene al menos un electrodo de trabajo equipado con un aptámero funcionalizado para unirse a un aeropatógeno al menos un contador y al menos un electrodo de referencia; al menos un sistema de detección electrónico conectable a los electrodos de la al menos una cámara de detección de aeropatógenos y un sistema de procesamiento electrónico que procesa los datos que se pueden recibir del al menos un sistema de detección electrónico.
En una realización, el inyector comprende un colector de polvo opcional, un primer tubo colector de aeropatógeno, un segundo tubo colector y una bomba de aire que transporta el aire ambiente primero a través del colector de polvo, si lo hay, y a continuación a través del primer y el segundo tubo colector. El primer tubo colector está adaptado para recoger partículas de aerosol más grandes, preferentemente con un diámetro de aproximadamente 2 p m a aproximadamente 10 pm, y el segundo tubo colector está adaptado para recoger partículas de aerosol más pequeñas, preferentemente con un diámetro de hasta 5 pm. La entrada a los tubos colectores es excéntrica con respecto al eje del tubo y oblicua con respecto al fondo de los tubos, de modo que el aire inyectado se mueve centrífugamente a lo largo de las paredes de los tubos colectores y, por tanto, lanza las partículas de aerosol arrastradas contra la pared de los tubos. Dichos colectores de partículas pequeñas se conocen en la técnica como «ciclones de flujo inverso», por ejemplo, de US 4,941,899 y US 8,205,511. El colector de polvo también funciona preferentemente con fuerzas centrífugas.
Durante la recolección de partículas de aerosol, las paredes de los tubos colectores se humedecen preferentemente de forma continua desde el al menos un contenedor de líquido. El líquido humectante (un líquido tampón adecuado) recogido en el tubo colector se transporta de forma continua o discontinua a la cámara de detección viral.
Los electrodos de la cámara de detección viral son de metal noble, por ejemplo, Ag, Au, Pt, Ru o sus aleaciones, preferentemente Au. La superficie de los electrodos se cubre preferentemente con un aglutinante adecuado para el aeropatógeno objeto de detección, preferentemente con una monocapa autoensamblada de aptámeros específicos para el aeropatógeno objeto de detección.
Los electrodos de la cámara de detección viral están polarizados con un voltaje adecuado, preferentemente de entre -300 mV y 50 mV y la respuesta del sistema en el intervalo de 20 pA y 20 pA se mide mediante un circuito de amplificación de fase de bloqueo que funciona a baja frecuencia, preferentemente por debajo de 400 Hz. Alternativamente, se pueden usar amplificadores de corriente CC de ruido ultrabajo, aunque más caros que los amplificadores de bloqueo que funcionan en el mismo intervalo de corriente.
Preferentemente, varias cámaras de detección viral están presentes en paralelo, detectando el mismo aeropatógeno y promediando el resultado, o detectando diferentes patógenos. Cada cámara de detección viral tiene un circuito de amplificación de fase de bloqueo independiente. Preferentemente, los diversos circuitos de amplificación de fase de bloqueo utilizan un oscilador común. Los datos medidos se almacenan y procesan en un ordenador, por ejemplo, en comparación con los datos de calibración almacenados previamente para identificar la presencia y la concentración de aeropatógenos en el aire introducido en el aeromuestreador.
Preferentemente, el dispositivo comprende una serie de contenedores para almacenar y proporcionar diferentes líquidos, tales como el líquido humectante para los tubos colectores, diversos líquidos de limpieza que incluyen agua desionizada, ácidos tales como H2S04 concentrado, para limpiar la cámara de detección viral, las tuberías y los tubos colectores, etc., y líquidos para refrescar las superficies de los electrodos. El líquido de los contenedores puede transportarse mediante una microbomba común y un tubo común conectado mediante una válvula de tres vías al tubo que conecta los tubos colectores con la cámara de detección viral, si los contenedores, cada uno de ellos, están provistos de válvulas de cierre. Preferentemente, el dispositivo comprende un contenedor adicional en el lado de salida de la cámara de detección viral para recolectar desechos, más precisamente líquidos usados. Los líquidos residuales se transportan al contenedor de residuos mediante una microbomba adicional.
Preferentemente, las bombas, válvulas, las tasas de flujo y los sistemas de detección electrónica se controlan mediante un sistema electrónico integrado (sistema de procesamiento electrónico) programado para hacer que los diferentes elementos actúen según un esquema preseleccionado.
La invención también comprende un procedimiento para la detección de aeropatógenos en tiempo real como se define en la reivindicación independiente 9.
Aptámeros
Los aptámeros son oligonucleótidos específicos compuestos por ADN monocatenario (ADNmc) o ARN que se unen a un amplio intervalo de dianas específicamente. Los aptámeros se pueden obtener utilizando un procedimiento de selección in vitro llamado Evolución Sistemática de Ligandos por
Enriquecimiento exponencial (SELEX), que comienza con la incubación de bibliotecas de oligonucleótidos aleatorios con las moléculas diana deseadas, seguido de la separación y amplificación de oligonucleótidos unidos. Al repetir este proceso se obtiene un grupo enriquecido que se puede utilizar como biblioteca de partida para la siguiente ronda de selección para lograr una alta especificidad y afinidad por las moléculas diana. En principio, los aptámeros se pueden seleccionar para cualquier diana dada, que varía de moléculas pequeñas a proteínas grandes e incluso células. Cuando los aptámeros se unen a dianas moleculares pequeñas, estos se incorporan en la estructura de ácido nucleico, enterrados dentro de las cavidades de unión de las estructuras de aptámeros. Por otro lado, las moléculas grandes (por ejemplo, proteínas) son estructuralmente más complicadas, lo que permite interacciones de aptámeros en varios sitios a través de enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas y complementariedad de formas. La producción de aptámeros no es costosa y su variación entre lotes es muy baja en comparación con los anticuerpos producidos in vivo. Además, los aptámeros se pueden sintetizar químicamente y son térmicamente estables y adecuados para el almacenamiento a largo plazo. Con estas ventajas se han desarrollado aptámeros con alta especificidad y afinidad para una variedad de dianas que incluyen proteínas, moléculas pequeñas, células completas y virus. Ahora, los aptámeros se utilizan ampliamente en diversos campos, como el diagnóstico, la terapéutica y los biosensores. Si bien los aptasensores surgieron hace solamente unos 10 años, ya han encontrado amplias aplicaciones tanto en investigación básica como en diagnóstico biomédico.
Los biosensores basados en aptámeros poseen ventajas sin precedentes en comparación con los biosensores que utilizan receptores naturales como anticuerpos y enzimas:
-En primer lugar, los aptámeros con alta especificidad y afinidad pueden seleccionarse in vitro para cualquier diana dada, desde moléculas pequeñas hasta proteínas grandes e incluso células, lo que permite desarrollar una amplia gama de biosensores basados en aptámeros.
-En segundo lugar, los aptámeros, una vez seleccionados, se pueden sintetizar con alta reproducibilidad y pureza a partir de fuentes comerciales. Además, en contraste con los anticuerpos o enzimas basados en proteínas, los aptámeros de ADN suelen ser altamente estables químicamente.
-En tercer lugar, los aptámeros experimentan a menudo cambios conformacionales significativos tras la unión a la diana. Esto ofrece una gran flexibilidad en el diseño de nuevos biosensores con alta sensibilidad y selectividad de detección.
-En cuarto lugar, el pequeño tamaño de los aptámeros ofrece ventajas sobre los anticuerpos: (i) una mayor densidad superficial de receptores y (ii) unión múltiple a moléculas diana para ensayos de tipo sándwich.
Los aptámeros se pueden unir al soporte sólido en el extremo 5' o en el extremo 3'. En particular, el oro se utiliza ampliamente como diana. La unión directa de aptámeros a superficies de oro podría lograrse mediante el uso de un tiol-alcano unido a la secuencia de aptámeros. La superficie de oro también podría funcionalizarse y el tipo de química seleccionada depende de qué tipo de grupo funcional terminal está unido al aptámero (es decir, extremos amina, tiol o biotina).
Las superficies de oro funcionalizadas con monocapas autoensambladas (SAMs) pueden abordar la adsorción inespecífica de aptámero a la superficie. La tecnología de avidina-biotina también se ha explotado para la inmovilización de aptámeros. La estreptavidina puede adsorberse físicamente o inmovilizarse covalentemente en el soporte y el procedimiento requiere principalmente la incubación del aptámero unido a biotina con el sustrato modificado. Los estudios del aptámero antitrombina revelaron que este procedimiento de biorrecubrimiento da mejores resultados con respecto a la sensibilidad en comparación con otras estrategias de inmovilización.
La invención hace uso preferentemente de aptámeros para unir los patógenos en los electrodos de la cámara de detección viral.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un diagrama general de un diseño preferido del dispositivo;
La Fig. 2 muestra un diseño preferido del aeromuestreador;
Las Fig. 3a y 3b muestran los tubos colectores preferidos en detalle;
La Fig. 4 muestra la cámara de detección viral;
La Fig. 5 ilustra la construcción de la cámara de detección viral;
La Fig. 6 muestra el flujo del líquido humectante durante la medición de flujo continuo;
La Fig. 7 muestra el procedimiento de limpieza;
La Fig. 8 muestra esquemáticamente el mecanismo de unión de un virus a un electrodo de oro;
La Fig. 9 muestra una gráfica de un ciclo de detección típico obtenido mediante la presente invención;
La Fig. 10 muestra ejemplos de respuesta del sistema a diferentes concentraciones de un virus.
Los números iguales en diferentes dibujos designan los mismos elementos funcionales.
Descripción detallada
Con referencia a la Fig. 1, el número 1 designa el aeromuestreador. Una bomba de gas 13 aspira aire de la entrada de aire 11, preferentemente equipada con un colector de polvo 12. Dentro del aeromuestreador 1, las gotitas de partículas pequeñas arrastradas en el aire se separan y recogen como se explica con más detalle con referencia a las Figs. 2 y 3 a continuación. El líquido humectante (solución tampón) se transporta desde el contenedor 2 mediante una microbomba 21 al aeromuestreador. La solución tampón con las gotitas recogidas se transporta a la, al menos, una cámara de detección viral 4; se muestran cuatro cámaras de detección viral 4 en paralelo, lo que permite detectar cuatro aeropatógenos diferentes simultáneamente. A cada una de las cámaras de detección viral 4 se le asigna un sistema de detección electrónico 5 con un oscilador común 6. Las líneas discontinuas representan líneas de conexión eléctrica. Las señales medidas de la cámara de detección viral 4 se almacenan y procesan electrónicamente en un ordenador 7. En el circuito de líquido se puede incluir mediante la válvula de tres vías 31 un conjunto de contenedores de líquido 3 que contienen líquidos para limpiar, aclarar y refrescar. Estos líquidos se pueden transportar por una microbomba 91 (lado de succión de la bomba) a la cámara de detección viral 4 y después de su uso a un contenedor de residuos 9. La bomba 91 también ayuda a transportar la solución tampón desde el aeromuestreador 1 a la cámara de detección viral 4. La válvula 92 está abierta cuando el escaneo de detección se realiza con solución tampón que fluye continuamente a través de la cámara de detección viral 4 y está cerrada cuando el escaneo de detección se realiza por lotes, es decir, solución tampón que no fluye. Todas las funciones de las bombas, válvulas y sistemas de detección electrónica 5 se controlan a través de las líneas de control 82 al controlador (el sistema electrónico integrado) 8 según un procedimiento preseleccionado. Preferentemente, la bomba 92 proporciona una tasa de flujo variable de 15 nanolitros (nL) por minuto a 15 pl por minuto. Se pueden instalar dos bombas en paralelo, una que permita tasas de flujo altas y la otra tasas de flujo bajas, que pueden funcionar de forma alternativa.
Con referencia a la Fig. 2, en una realización preferida de la invención, el aire se transporta por succión de la bomba 13 desde la entrada de aire 11 a través de las microcentrífugas 12, 15 y 16. El número 12 designa un filtro de polvo. Preferentemente, la bomba 13 se ajusta a una tasa de flujo de entre 3,5 y 7,5 litros por minuto (presión normal). La salida de polvo 17 puede estar equipada con un contenedor de polvo 18 para recoger partículas de polvo de un diámetro superior a aproximadamente 10 pm. Las paredes de los tubos colectores 15 y 16 se humedecen a través de la línea 22 desde el contenedor de líquido humectante 2 (Fig. 1). Preferentemente, el tubo colector 15 recoge principalmente partículas con un diámetro de 2 pm a 10 pm, mientras que el tubo colector 15 está adaptado para recoger partículas principalmente con un diámetro de hasta 5 pm. El líquido humectante que tiene partículas atrapadas del aire se acumula en la parte inferior de los tubos colectores 15 y 16 y se transporta a través de la línea 32 a la cámara de detección viral 4. Preferentemente, los tubos colectores tienen un volumen interior total de entre 1 ml y 2,5 ml.
La Fig. 3a muestra el flujo de aire a través de los tubos colectores 15 y 16. La Fig. 3b muestra el tubo colector 15 girado 90° alrededor de su eje en comparación con la Fig. 3a. El aire se inyecta en cada caso de forma excéntrica y oblicua a la parte inferior del tubo para crear una fuerza centrífuga para la separación de las partículas arrastradas en el aire.
La Fig. 4 muestra la cámara de detección viral en detalle. La Fig. 4a) muestra una vista superior, la Fig. 4b) muestra una vista lateral y la Fig. 4c) muestra una vista frontal. La designación de la vista superior, lateral o frontal es solo para definir la posición relativa de la Fig. 4 a), 4b) y 4c. La cámara de detección viral puede disponerse en cualquier posición, por ejemplo, la vista frontal puede ser la pared superior. La cámara de detección viral, generalmente designada con 4, comprende una cavidad interna 41 dentro de una carcasa 401, 402 con una entrada 42 y una salida 43. Las flechas indican la dirección de flujo del fluido recibido del aeromuestreador 1.
Preferentemente, la cavidad 41 tiene un volumen de entre 0,5 y 1,5 mm3. Se prefiere particularmente un volumen de entre 0,6 a 1 mm3. La cavidad 41 tiene paredes superiores e inferiores paralelas que llevan una serie de contraelectrodos 44 y electrodos de trabajo 45 opuestos entre sí. Preferentemente, los contraelectrodos 44 son más grandes que los electrodos de trabajo que transportan el agente de unión para los aeropatógenos. Los electrodos más pequeños son los electrodos de trabajo. Preferentemente, la distancia entre los electrodos de trabajo y el contraelectrodo opuesto está entre 30 pm y 50 pm. Preferentemente, el diámetro de los contraelectrodos 44 está entre 50 pm y hasta 100 pm.
Preferentemente, el diámetro de los electrodos de trabajo está entre 0,4 y 0,7 veces el diámetro de los contraelectrodos. Cada par de electrodos de trabajo y el contraelectrodo opuesto crean un campo eléctrico que es perpendicular a la dirección de flujo del líquido. La distancia de los contraelectrodos adyacentes es de 15 a 30 veces mayor que su diámetro. Los electrodos están conectados a los terminales del conector 47 y 48 como se explicará con referencia a la Fig. 5. Un electrodo adicional 46 con terminales de conector 49 sirve como electrodo de referencia. No hay ningún electrodo de trabajo opuesto al electrodo de referencia. Durante la detección, los electrodos de trabajo se encuentran bajo una tensión de polarización variable de -370 y 50 mV contra los contraelectrodos.
La carcasa de la detección viral está compuesta por dos placas de vidrio flotado preferentemente de borosilicato 401 y 402. Se perforan dos orificios 42 y 43 a través de una de las placas 402. A continuación, la cavidad se prepara mediante una técnica de grabado con plasma de iones CF4 reactivos. Puede ser suficiente proporcionar una cavidad solamente en una de las placas.
Las Figuras 5 a) y b) muestran las dos placas 401 y 402 con sus cavidades parciales en la parte superior. Después de proporcionar la cavidad 41, los electrodos 44, 45 y 46, los terminales del conector 47, 48 y 49 y las líneas 441,451 y 461 se aplican a las placas mediante una técnica fotolitográfica conocida y la deposición de vapor de metal noble. Las líneas de conexión 441, 451 y 461 están aisladas por una capa de cubierta adecuada, por ejemplo, de SiO2. Después de retirar cualquier material orgánico de la superficie de las placas, las placas se alinean entre sí como lo indica la línea de puntos 403 de la Figura 4c). Las placas alineadas exactamente 401 y 402 se fusionan a continuación calentando a entre aproximadamente 500 °C y 650 °C a alta presión perpendicular a la línea de fusibles 403.
La Fig. 6 es un diagrama de flujo que muestra el flujo del líquido humectante desde el contenedor de humectación hasta el contenedor de residuos con los controladores de la tasa de flujo n. ° 1 y n.° 2 que cooperan con el controlador 8.
La Fig. 7 es un diagrama de flujo que muestra el procedimiento de limpieza/actualización. Primero (I) se transporta agua desionizada a través del dispositivo. A partir de entonces (II), el líquido de limpieza, por ejemplo, H2SO4 concentrado, se hace fluir a través de la cámara de detección viral 4 desde uno de los contenedores 3, seguido de un aclarado con agua desionizada desde otro contenedor 3. Esta acción puede repetirse varias veces hasta que se mida una corriente constante desde los electrodos de la cámara de detección viral 4. A continuación, el líquido refrescante se transporta desde otro contenedor 3. El líquido refrescante contiene los aptámeros funcionalizados (para un aeropatógeno dado) que formarán la monocapa autoensamblada en el electrodo de trabajo.
La Fig. 8 muestra un mecanismo de unión típico para aeropatógenos. En primer lugar, la monocapa autoensamblada en el electrodo de trabajo se produce según una técnica conocida. En nuestros experimentos iniciales utilizamos un aptámero modificado con amino y tiol que tenía un grupo indicador azul de metileno en una solución tampón acuosa de 0,5 a aproximadamente 1 pmolar a través de la cámara de detección viral. La fórmula de la monocapa autoensamblada de aptámeros fue
5’ -HS-(C H ^ l-G C A G T APTAÍvlERO ACTGCT- ÍCHa)r NH2-MB-3 ’ .
O
JT-MB-NH2-(CH7)7-TCGTC A-, APTÁMERO - TGACG-<CH2)6-HS-3T
La imagen de la izquierda en la Fig. 8 muestra un solo aptámero unido a una superficie de oro. La cámara de detección viral se aclara a continuación con agua desionizada para eliminar la solución tampón.
A continuación, el líquido de los tubos colectores se alimenta a la cámara de detección viral. Si los aeropatógenos están presentes en el líquido, lo que se indica mediante la flecha y el «virus» en el centro de la Fig. 8, los aeropatógenos se unen al aptámero emitiendo un electrón que causa una respuesta al sistema de detección electrónica. Una vez completada la medición, la cámara de detección viral se aclara con agua desionizada para eliminar todos los aeropatógenos.
La Fig. 9 muestra un ciclo típico de detección, donde el eje x representa la tensión de polarización y el eje y representa la corriente medida. La curva sólida superior obtenida sin virus en el aire es la curva de calibración tomada antes de cada detección de aire ambiente.
La curva inferior discontinua se obtiene con virus en el aire. A partir de la diferencia de áreas debajo de ambas curvas, es posible estimar la concentración de virus en el aire. Incluso si el aptámero no es específico del aeropatógeno, se puede obtener información sobre el tipo de aeropatógeno a partir de la posición del máximo de la curva superior en el eje x. La curva discontinua superior se obtiene después de eliminar los aeropatógenos de una detección anterior para calibrar el siguiente ciclo de detección.
La Fig. 10 muestra experimentos preliminares que muestran la respuesta electrónica del sistema según la concentración de virus. La cámara de detección se hace flotar primero con una solución que contiene aptámeros S1+H1N1 para cubrir los electrodos de trabajo con dichos aptámeros. A continuación, se alimenta agua desionizada desde uno de los contenedores 3 para eliminar cualquier solución tampón durante 5 min (tiempo 0-300 s del diagrama). A continuación, el voltaje de polarización se ajusta a 235 mV para una unión óptima y se introduce aire portador de virus a una concentración de 200 nMol/l (representada como la concentración de hemaglutinina medida por PCR = reacción en cadena de la polimerasa) en el aeromuestreador con humectación continua de las paredes de las microcentrífugas durante otros 5 min. La corriente cae a 7,5 nA, lo que corresponde a una respuesta de 1,8 nA. A continuación se detiene el suministro de aire, el voltaje de polarización se establece en 100 mV y se inyecta una solución de PBS (tampón fosfato salino) sin virus desde otro contenedor 3, por lo que las partículas virales se liberan desde los sensores («círculo de descarga») hasta que la corriente vuelve a 9,3 nA. En el momento de 900 s, la solución de PBS se detiene y se introduce aire con una concentración de virus de 400 nMol/l en el aeromuestreador. La corriente cae ahora a 5,4 nA, lo que corresponde a una respuesta de 3,9 nA. A continuación, se repite este ciclo de detección y aclarado. El último ciclo de detección se ejecuta con aire que contiene 800 nMol/l de virus. La corriente cae a 0,8 nA, lo que corresponde a una respuesta de 8,5 nA. En consecuencia, la respuesta es prácticamente lineal a la concentración de virus en el aire. Si después de una serie de ciclos de detección/aclarado, la corriente no vuelve al valor original (en el ejemplo, 9,3 nA), los aptámeros se eliminan de la cámara de detección haciendo fluir H2SO4 concentrado a través de la cámara de detección con la posterior eliminación del ácido con agua desionizada y renovando la cobertura de aptámeros de los electrodos de trabajo.
En esta realización preferida de la invención hay, al menos, cuatro contenedores 3 que contienen agua desionizada, solución de PBS, H2SO4 concentrado y una solución refrescante que proporciona aptámeros.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Dispositivo para la detección de aeropatógenos en tiempo real que comprende un aeromuestreador (1) que tiene una entrada de aire y al menos un tubo colector de aire (15, 16); un sistema microfluídico que comprende al menos un contenedor (2) para recibir un líquido humectante, una tubería (22) desde el contenedor hasta el al menos un tubo colector de aire y al menos una microbomba (21) para crear un flujo de fluido a través de la tubería (22); el al menos un contenedor (2) está configurado para suministrar líquido humectante a un pared del al menos un tubo colector (15, 16); y la entrada de aire está configurada para inyectar aire en el al menos un tubo colector de forma excéntrica y oblicua a una parte inferior del tubo, creando así una fuerza centrífuga; el dispositivo comprende, además, al menos una cámara de detección de aeropatógenos (4) y tuberías desde el sistema microfluídico hasta la al menos una cámara de detección de aeropatógenos (4), la cámara de detección tiene al menos un electrodo de trabajo (45) que está equipado con un aptámero funcionalizado para unirse a un aeropatógeno, al menos un contraelectrodo (44) y al menos un electrodo de referencia (46); al menos un sistema de detección electrónica (5) conectable a los electrodos de la al menos una cámara de detección de aeropatógenos; y un sistema de procesamiento electrónico integrado (8) que procesa los datos que se pueden recibir del al menos un sistema de detección electrónica.
  2. 2. El dispositivo según la reivindicación 1, donde el aeromuestreador (1) comprende al menos dos tubos colectores (15, 16) capaces de recoger simultáneamente dos distribuciones de tamaño de aeropatógenos y, opcionalmente, donde el sistema de procesamiento electrónico (8) realiza un análisis de señales y un reconocimiento de patrones para los patógenos seleccionados.
  3. 3. El dispositivo según la reivindicación 1 o 2, donde un número de 2 a 8 contenedores (3) son capaces de suministrar líquido directamente a la, al menos, una cámara de detección de aeropatógenos (4).
  4. 4. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un colector de polvo (12) y dos tubos colectores centrífugos (15, 16) posteriores en la dirección del flujo de aire capaces de recoger partículas de diferente tamaño.
  5. 5. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la cámara de detección de aeropatógenos (4) tiene una pared interior superior y una inferior paralelas entre sí, cada una de las cuales está provista de un número de 3 a 6 electrodos que se agrupan en pares de electrodos, uno en la pared superior y otro en la pared inferior con un eje común perpendicular a las paredes.
  6. 6. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, un sistema de control electrónico para controlar el funcionamiento de bombas, válvulas y el sistema de detección electrónico.
  7. 7. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un número de 2 a 6 cámaras de detección de aeropatógenos (4) a cada una de las cuales se le asigna un sistema de detección electrónico (5) con un sistema de procesamiento electrónico común (8).
  8. 8. El dispositivo según la reivindicación 7, que comprende 4 cámaras de detección de aeropatógenos (4) en paralelo, a cada una de las cuales se le asigna un sistema de detección electrónico (5) con un sistema de procesamiento electrónico común (8).
  9. 9. Un procedimiento para la detección de aeropatógenos en tiempo real al proporcionar un inyector de aire (1) que tiene una entrada de aire (11) y que comprende, al menos, un tubo colector de aire (15, 16); un sistema microfluídico que comprende, al menos, un contenedor (2) para recibir un líquido humectante, una tubería (22) desde el contenedor (2) hasta el, al menos, un tubo colector de aire (15, 16) y, al menos, una bomba (21) para crear un flujo de fluido a través de la tubería (22); y al menos una cámara detectora de aeropatógenos (4) y tuberías desde el sistema microfluídico hasta la, al menos, una cámara de detección de aeropatógenos; la entrada de aire (11) está configurada para inyectar aire en el, al menos, un tubo colector (15, 16) de forma excéntrica y oblicua a una parte inferior del tubo, creando así una fuerza centrífuga, la al menos una cámara de detección de aeropatógenos (4) tiene al menos un electrodo de trabajo (45) que está equipado con un aptámero funcionalizado para unirse a un aeropatógeno, al menos un contraelectrodo (44) y al menos un electrodo de referencia (46), al menos un sistema de detección electrónico (5) conectable a los electrodos de la, al menos, una cámara de detección de aeropatógenos, y un sistema de procesamiento electrónico (8) que procesa los datos que se pueden recibir del, al menos, un sistema de detección electrónico, el procedimiento comprende suministrar líquido humectante desde el contenedor (2) al, al menos, un tubo colector (15, 16) para humedecer las paredes del, al menos, un tubo colector, introducir aire en el interior del aeromuestreador, recoger aeropatógenos en las paredes húmedas del, al menos, un tubo colector, hacer fluir humedad desde las paredes del aeromuestreador a la, al menos, una cámara de detección de aeropatógenos (4), detectar la respuesta eléctrica entre los electrodos de la cámara de detección de aeropatógenos y procesar la respuesta eléctrica en el sistema de procesamiento electrónico para identificar la presencia de aeropatógenos en el aire.
  10. 10. El procedimiento según la reivindicación 9, que comprende, además, recoger simultáneamente dos distribuciones de tamaño de partículas y/o gotitas de aeropatógenos con el aeromuestreador, comprendiendo el procedimiento opcionalmente, además, humedecer continuamente las paredes internas del al menos un tubo colector (15, 16) con un biofluido adecuado para los aeropatógenos diana.
  11. 11. El procedimiento según la reivindicación 9 o 10, que comprende, además, limpiar repetidamente la cámara de detección de aeropatógenos (4) con ácido H2SO4 puro sin ningún daño o alteración después de completar la medición de detección.
  12. 12. El procedimiento según la reivindicación 9, 10 u 11, que comprende, además, controlar, usando un sistema de control electrónico, diversos procedimientos de limpieza del sistema microfluídico para la al menos una cámara de detección de aeropatógenos (4) y procedimientos de rejuvenecimiento de los aptámeros.
  13. 13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende, además, utilizar un campo eléctrico que es perpendicular al flujo de líquido a través de la al menos una cámara de detección de aeropatógenos (4).
  14. 14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende, además, hacer funcionar 2 a 6 cámaras de detección de aeropatógenos (4) en paralelo para detectar 2 a 6 aeropatógenos simultáneamente.
  15. 15. El procedimiento según la reivindicación 14, que comprende, además, hacer funcionar 4 cámaras de detección de aeropatógenos (4) en paralelo para detectar 4 aeropatógenos diferentes simultáneamente.
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