ES2987601T3 - Polisacáridos pécticos hidrolizados enzimáticamente para el tratamiento o la prevención de infecciones - Google Patents
Polisacáridos pécticos hidrolizados enzimáticamente para el tratamiento o la prevención de infecciones Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a un producto para su uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones, comprendiendo dicho tratamiento la administración oral del producto, en donde el producto se selecciona de una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida y un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto polisacáridos RG-I de zanahoria que tienen las siguientes características de combinación: - un peso molecular en el intervalo de 10-300 kDa; - una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos alfa(1→4)-galacturónico-alfa(1→2)-ramnosa; - la siguiente composición de monosacáridos: 20-60 % en moles de residuos de ácido galacturónico, en donde los ácidos galacturónicos individuales pueden estar metilados y/o acetil-esterificados; 8-50 % en moles de residuos de ramnosa; 0-40 % en moles de residuos de arabinosa; 0-40% en moles de residuos de galactosa; relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en el intervalo de 5:1 a 1:1; los residuos de ácido galacturónico, residuos de ramnosa, residuos de arabinosa y residuos de galactosa juntos constituyen al menos el 85% en moles de los residuos de monosacáridos en los polisacáridos RG-I de zanahoria. Estos polisacáridos RG-I de zanahoria se pueden producir hidrolizando parcialmente los polisacáridos pécticos presentes en un aislado de pectina de zanahoria. La eficacia de los polisacáridos RG-I de zanahoria contra las infecciones se mejora sustancialmente hidrolizando enzimáticamente los polisacáridos RG-I para eliminar al menos parte del componente de homogalacturonano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Polisacáridos pécticos hidrolizados enzimáticamente para el tratamiento o la prevención de infeccionesCAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere al uso de polisacáridos pécticos hidrolizados enzimáticamente en el tratamiento profiláctico o terapéutico de infecciones, tales como infecciones del tracto respiratorio superior. Los polisacáridos pécticos hidrolizados enzimáticamente provienen de la zanahoria y se caracterizan por un contenido muy alto de ramnogalacturonano I (RG-I).
[0002] Más particularmente, la invención proporciona un producto seleccionado a partir de una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida o un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto los polisacáridos RG-I de zanahoria hidrolizados enzimáticamente mencionados anteriormente. La invención se refiere además al uso del producto mencionado anteriormente en el tratamiento de infecciones y a un proceso de preparación de polisacáridos RG-I de zanahoria hidrolizados enzimáticamente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La infección es la invasión de los tejidos corporales de un organismo por agentes causantes de enfermedades, su multiplicación y la reacción de los tejidos del huésped ante estos organismos y las toxinas que producen. Los organismos pueden combatir infecciones utilizando su sistema inmunitario. El sistema inmunitario es un sistema de defensa del huésped que comprende muchas estructuras y procesos biológicos dentro de un organismo que protege contra las enfermedades. La nutrición es un modulador crítico de la función inmunitaria. Las fibras dietéticas, por ejemplo, pueden modular diversas propiedades del sistema inmunitario y, por tanto, modificar la resistencia a las infecciones. Estimular o apoyar el sistema inmunitario da como resultado respuestas inmunitarias más efectivas a los organismos que causan enfermedades. Esto puede dar como resultado la prevención de infecciones sintomáticas o conducir a una recuperación más rápida de las infecciones.
[0004] Las infecciones del tracto respiratorio superior son enfermedades causadas por una infección aguda que afecta al tracto respiratorio superior, incluyendo la nariz, los senos paranasales, la faringe o la laringe. Esto comúnmente incluye obstrucción nasal, dolor de garganta, amigdalitis, faringitis, laringitis, sinusitis, otitis media, ciertos tipos de influenza y resfriado común. La mayoría de las infecciones son de naturaleza viral y en otros casos la causa es bacteriana. Las infecciones del tracto respiratorio superior también pueden tener un origen fúngico o helminto, pero son mucho menos comunes. Las infecciones del tracto respiratorio inferior son generalmente más graves que las infecciones del tracto respiratorio superior y son la principal causa de muerte entre todas las enfermedades infecciosas.
[0005] Los virus que pueden causar infecciones agudas del tracto respiratorio incluyen los rinovirus, los virus de la influenza, los adenovirus, el virus coxsackie, los virus parainfluenza, el virus respiratorio sincitial y el metapneumovirus humano. Las bacterias que pueden causar infecciones respiratorias superiores incluyen los estreptococos beta-hemolíticos del grupo A, la corynebacterium diphtheriae, la neisseria gonorrhoeae, la chlamydia pneumoniae y los estreptococos beta-hemolíticos del grupo C.
[0006] Los niños padecen entre 2 y 9 enfermedades respiratorias virales al año. Las infecciones del tracto respiratorio superior son las principales razones por las que las personas faltan al trabajo y al colegio. La vacunación contra los virus de la influenza, adenovirus, sarampión, rubéola,Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae,difteria,Bacillus anthracis,yBordetella pertussispuede evitar que infecten el TRS o reducir la gravedad de la infección.
[0007] Otras infecciones para las cuales el sistema inmunitario brinda protección incluyen las infecciones intestinales. Las enfermedades infecciosas intestinales incluyen el cólera, la fiebre tifoidea, la fiebre paratifoidea, otros tipos de infecciones por salmonella, la shigelosis, el botulismo, la gastroenteritis y la amebiasis, entre otras. La gastroenteritis, también conocida como diarrea infecciosa, es una inflamación del tracto gastrointestinal que afecta al estómago y al intestino delgado. Los signos y síntomas incluyen alguna combinación de diarrea, vómitos y dolor abdominal. También puede producirse fiebre, falta de energía y deshidratación. La gastroenteritis puede deberse a infecciones por virus, bacterias, parásitos y hongos. Se conoce que los rotavirus, norovirus, adenovirus y astrovirus causan gastroenteritis viral. El rotavirus es la causa más común de gastroenteritis en niños.
[0008] En el mundo desarrollado,Campylobacter jejunies la causa principal de gastroenteritis bacteriana. Otras bacterias que pueden causar gastroenteritis incluyen especies deEscherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureusyCampylobacter. ElClostridium difficiletoxigénico es una causa importante de diarrea que ocurre con mayor frecuencia en los ancianos. Varios protozoos también pueden causar gastroenteritis, sobre todoGiardia lamblia,pero también se han implicadoEntamoeba histolytica, Cryptosporidiumspp., y otras especies.
[0009] El documento US 2004/072791 describe el uso de productos de hidrólisis de pectina para bloquear la unión de sustancias u organismos nocivos a células de mamíferos, en particular para combatir infecciones. La pectina se puede obtener de cítricos, manzanas o remolacha azucarera.
[0010] El documento US 2002/0022601 describe un método para prevenir o tratar el resfriado común, que comprende la administración de un agente que comprende al menos un componente seleccionado entre oligosacárido de quitina, oligosacárido de quitosano y oligosacárido de quitina parcialmente desacetilado.
[0011] El documento US 2011/0112048 describe un método para reducir los síntomas de infección del tracto respiratorio superior en sujetos estresados, comprendiendo el método: administrar una cantidad eficaz de betaglucano.
[0012] El documento US 2013/0137757 describe un método para inhibir la infección por el virus de la influenza, comprendiendo el método: tratar una composición que contiene principalmente pectina y polinucleótido a una membrana mucosa del sujeto para inhibir la adhesión entre la hemaglutinina del virus de la influenza y el ácido siálico.
[0013] El documento US 2014/0288021 describe el uso de arabinogalactano y polifenoles de alerce en el tratamiento profiláctico de infecciones del tracto respiratorio superior.
[0014] El documento US 2016/0250625 describe un método para el tratamiento de una infección del tracto respiratorio superior, comprendiendo el método administrar una composición que comprende microorganismos probióticos no replicantes seleccionados del grupo que consiste en Bifidobacterias, Lactobacilos, Propionibacterias, y combinaciones de los mismos.
[0015] La pectina es un heteropolisacárido estructural que está presente en las paredes celulares primarias de las plantas terrestres.
[0016] Los polisacáridos pécticos son un grupo heterogéneo de polisacáridos que comprenden cantidades variables de los siguientes componentes polisacáridos:
(i) homogalacturonano (HG),
(ii) xilogalacturonano (XG),
(iii) apiogalacturonano (AG)
(iv) ramnogalacturonano-I (RG-I), y
(v) ramnogalacturonano-II (RG-II).
[0017] La Figura 1 proporciona una representación esquemática de la estructura de los polisacáridos pécticos, incluyendo los 5 componentes de polisacáridos mencionados anteriormente. Cabe señalar que los componentes polisacáridos AG, XG y RG-II normalmente representan sólo una fracción menor de los polisacáridos pécticos.
[0018] Los componentes polisacáridos HG, AG, XG y RG-II comprenden cada uno una cadena principal que consta de una cadena lineal de unidades monosacáridas de ácido D-galacturónico con enlaces a-(1-4).
[0019] Solamente RG-I comprende una cadena principal que consiste en una cadena lineal de las unidades disacáridas repetidas: ácido 4)-a-D-galacturónico-(1,2)-a-L-ramnosa-(1. En la Figura 2 se muestra una representación esquemática de la estructura de RG-I.
[0020] La composición y la estructura fina del polisacárido péctico varían ampliamente según la fuente vegetal y las condiciones de extracción aplicadas. El dominio homogalacturonano puede tener una longitud de hasta aproximadamente 100 residuos de D-GalA consecutivos. El dominio RG-I que contiene las cadenas laterales suele denominarse "región ramificada" o "región peluda", mientras que el dominio homogalacturonano (conectado a los dominios RG-I) no suele estar sustituido por glucósidos o cadenas laterales glucosídicas.
[0021] Los residuos de GalA en RG-I están unidos a los residuos de Rha a través de las posiciones 1 y 4, mientras que el residuo de Rha está unido al residuo de GalA a través de las posiciones anomérica y 2-OH. En general, alrededor del 20-80 % de los residuos de Rha están ramificados en la posición 4-OH (dependiendo de la fuente vegetal y del método de aislamiento), con cadenas laterales neutras y ácidas. Estas cadenas laterales constan principalmente de residuos Ara y Gal unidos de varias maneras, constituyendo polímeros conocidos como arabinanos, arabinogalactano I (AG-I) y/o AG-II. AG I está compuesto por una cadena principal de D-Gal con enlace beta-(1,4) con sustituciones en 3-OH de grupos alfa-L-arabinosilo; la cadena principal de Gal puede tener unidades alfa(1,5) -L-Ara interespaciadas. AG-II consiste en galactano altamente ramificado con D-Gal con enlaces beta(1,3) predominantemente interior con sustituciones de cadenas cortas con enlaces (1,6) en el exterior. Este último tiene más uniones de L-Ara con enlaces (1,3) y/o alfa(1,5). Las cadenas laterales de oligosacáridos pueden ser lineales o ramificadas, y algunas de estas cadenas laterales pueden terminar con residuos de alfa-L-fucósidos, beta-D-glucurónidos y 4-O-metil beta-D-glucuronilo.
[0022] El documento WO 2011/069781 describe productos comestibles que comprenden un polisacárido obtenido de plantas de la especieCamellia sinensis,donde la cadena principal del polisacárido comprende núcleos alternantes de ramnogalacturonano-I y ácido poligalacturónico con enlaces alfa(1,4) o núcleos de ácido oligogalacturónico con enlaces alfa(1,4), donde la relación molar de residuos de ácido galacturonilo a residuos de ramnosil en la cadena principal del polisacárido varía de 2,5:1 a 1:1, y donde el polisacárido tiene un peso molecular de al menos 70 kDa. Los productos comestibles pueden contener además polisacáridos que se pueden obtener de una o más plantas pertenecientes a la familia Apiaceae, preferiblemente de plantas de la especieDaucus carota(zanahoria). La Tabla 1 describe una fracción de polisacárido péctico aislada de zanahoria que tiene un peso molecular de más de 110 kDa. La Tabla 2 muestra que esta fracción de polisacárido tenía actividad inmunomoduladorain vitro.
[0023] El documento WO 2012/148277 describe una preparación que tiene un contenido de materia seca de al menos 20 % en peso, conteniendo dicha preparación al menos 50 % en peso de materia seca de una mezcla de polisacáridos pécticos, incluyendo al menos 20 %, calculado en peso de los polisacáridos pécticos, de pectinas de ramnogalacturonano-I que tienen un peso molecular superior a 40 kDa, caracterizándose dicha mezcla de polisacáridos pécticos por:
- un grado de metilación de los residuos de ácido galacturonilo no superior al 20 %;
- un grado de acetilación de los residuos de ácido galacturonilo no superior al 20 %;
donde la preparación no forma un gel cuando se diluye con una solución acuosa de bicarbonato de amonio 50 mM hasta un contenido de sólidos del 2,5 % en peso. Los ejemplos describen fracciones de polisacáridos pécticos que se aislaron de zanahoria, mediante diferentes procedimientos de extracción. Se encontró que algunas de estas fracciones tenían actividad inmunomoduladora.
[0024] El documento WO 2004/084652 describe un proceso para producir un puré de verduras, que comprende los pasos secuenciales de:
a) triturar, picar o cortar la verdura en trozos de 1 a 30 mm;
b) escaldar los trozos de verdura a una temperatura de 60 a 90 °C;
c) poner en contacto los trozos de verdura escaldados con una actividad enzimática de maceración; d) licuar los trozos de verdura macerados y obtener un puré. Los ejemplos de la solicitud de patente internacional describen la preparación de puré de zanahoria utilizando esta metodología.
[0025] Broxtermanet al.(Pectinas acetiladas en zanahoria cruda y procesada térmicamente, Polímeros de carbohidrato 177 (2017) 58-66) describen un estudio en el que se estudió el efecto del procesamiento térmico sobre la pectina. Se extrajeron sólidos solubles en agua (WSS) de una fracción de sólidos insolubles en alcohol que se había aislado de zanahorias peladas o de cubos de zanahoria tratados térmicamente. Para estudiar la estructura química fina de la pectina, se realizó una degradación controlada mediante enzimas pectolíticas. El WSS fue degradado por poligalacturonasa (endo-PG) deA. aculeatusy pectina liasa (PL) deA. niger_SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0026] Los inventores han descubierto que la eficacia de los polisacáridos RG-I de zanahoria contra infecciones se puede mejorar sustancialmente hidrolizando enzimáticamente los polisacáridos RG-I para eliminar al menos parte del componente homogalacturonano. Los polisacáridos RG-I de zanahoria hidrolizados enzimáticamente de la presente invención se caracterizan por la siguiente combinación de características:
• un peso molecular en el intervalo de 10 a 300 kDa;
• una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa; • la siguiente composición de monosacáridos:
- 20-60%en moles de residuos de ácido galacturónico, donde los ácidos galacturónicos individuales pueden estar metilados y/o acetil-esterificados;
- 8-50 % en moles de residuos de ramnosa;
- 0-40 % en moles de residuos de arabinosa;
- 0-40 % en moles de residuos de galactosa;
- relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en el intervalo de 5:1 a 1:1; - los residuos de ácido galacturónico, los residuos de ramnosa, los residuos de arabinosa y los residuos de galactosa juntos constituyen al menos el 85 % en moles de los residuos de monosacáridos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0027] Un aspecto de la invención se refiere al uso de un producto que contiene los polisacáridos RG-I de zanahoria mencionados anteriormente en el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones.
[0028] Aunque los inventores no desean ceñirse a la teoría, se cree que la eliminación del componente homogalacturonano (disminuyendo la relación [GalA]:[Rha]) altera las propiedades fisicoquímicas del polisacárido RG-I, dando como resultado configuraciones tridimensionales de la molécula que interactúan más eficazmente con los llamados receptores de reconocimiento de patrones en el tracto intestinal y en células mononucleares de sangre periférica humana. Se cree que la interacción del polisacárido RG-I con receptores de reconocimiento de patrones expresados en células epiteliales y otras células inmunológicamente activas puede modular su capacidad de respuesta funcional, lo que a través de la producción de mediadores y la recirculación de células inmunológicamente activas puede mejorar la resistencia a las infecciones en el tracto intestinal, así como en otros sitios del cuerpo, incluida la cavidad oral, el tracto respiratorio, el tracto urinario, la vagina y la piel.
[0029] El uso de enzimas pectolíticas para eliminar elementos homogalacturonanos ofrece la ventaja de que proporciona una forma rentable de aumentar el rendimiento del polisacárido RG-I inmunomodulador.
[0030] Otro aspecto de la invención se refiere a un producto seleccionado entre una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida y un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto al menos 0,1 % en peso de materia seca de los polisacáridos RG-I de zanahoria como se ha descrito anteriormente, y donde los polisacáridos RG-I de zanahoria representan al menos el 20 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en el producto, definiéndose dichos polisacáridos pécticos como polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular superior a 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^-2)-ramnosa.
[0031] La invención proporciona además un proceso para producir polisacáridos RG-I de zanahoria hidrolizados enzimáticamente, comprendiendo dicho proceso:
• proporcionar un aislado de pectina de zanahoria (por ejemplo, hollejo de zanahoria), comprendiendo dicho aislado al menos un 5 % en peso de materia seca de polisacáridos pécticos con un peso molecular de al menos 15 kDa y con una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, dichos residuos de ramnosa estando contenidos en residuos de alfa(1^4)-galacturónicoalfa(1^-2)-ramnosa;
• hidrolizar parcialmente dichos polisacáridos pécticos usando una o más galacturonasas seleccionadas de entre pectina liasa (EC4.2.2.10), pectato liasa (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67 y EC 3.2.1.82); y
• someter los polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados a una técnica de separación sólido-líquido seleccionada entre centrifugación, decantación, filtración y combinaciones de las mismas para producir una fracción líquida que contiene polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados;
• someter la fracción líquida a ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un peso molecular de corte en el intervalo de 10 a 100 kDa; y
• recuperar un retenido que contiene los polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0032] Por consiguiente, un primer aspecto de la invención se refiere a un producto para uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones, comprendiendo dicho tratamiento la administración oral del producto, donde el producto se selecciona de una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida y un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto al menos 0,1 % en peso de materia seca de polisacáridos RG-I de zanahoria que tienen la siguiente combinación de características:
• un peso molecular en el intervalo de 10 a 300 kDa;
• una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa; • la siguiente composición de monosacáridos:
- 20-60 % en moles de residuos de ácido galacturónico, donde los ácidos galacturónicos individuales pueden estar metilados en la posición C-6 y/o acetilados en la posición O-2 y/o O-3;
- 8-50 % en moles de residuos de ramnosa;
- 0-40 % en moles de residuos de arabinosa;
- 0-40 % en moles de residuos de galactosa;
- relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en el intervalo de 5:1 a 1:1; - los residuos de ácido galacturónico, los residuos de ramnosa, los residuos de arabinosa y los residuos de galactosa juntos constituyen al menos el 85 % en moles de los residuos de monosacáridos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0033] El término "polisacárido ramificado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polisacárido que comprende una cadena troncal lineal de unidades de monosacárido unidas entre sí mediante enlaces glicosídicos, donde al menos una de las unidades de monosacárido dentro de la cadena troncal lleva una cadena lateral de una o más unidades de monosacárido unidas glicosídicamente.
[0034] Los términos "cadena troncal" y "cadena principal" son sinónimos.
[0035] El término "polisacárido péctico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular superior a 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa.
[0036] El término "tramo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de dos unidades de monosacárido unidas glicosídicamente dentro de la cadena principal de un polisacárido, excluyendo cualquier cadena lateral que esté unida a la misma.
[0037] El término "dominio", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un tramo más cualquier cadena lateral que esté unida a dicho tramo.
[0038] El término "tramo ramnogalacturonano-I" o "tramo RG-I" se refiere a un tramo que consiste en pares de ácido galacturónico (GalA) y ramnosa (Rha), donde los residuos de GalA están unidos a los residuos de Rha a través de las posiciones 1 y 4, mientras que los residuos Rha están unidos al residuo GalA a través de las posiciones anomérica y 2-Oh , es decir, alternando residuos alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa. El dominio RG-I puede comprender cadenas laterales tales como, por ejemplo, cadenas laterales de galactano, arabinano y arabinogalactano.
[0039] El término "polisacárido ramnogalacturonano-I" o "polisacárido RG-I" se refiere a polisacáridos pécticos opcionalmente ramificados que comprenden una cadena principal que contiene uno o más tramos ramnogalacturonano-I.
[0040] El término "tramo ácido galacturónico con enlace alfa(1,4)" se refiere a un tramo que consta de residuos alfa(1^4)-galacturónicos.
[0041] Además de los dominios RG-I, los polisacáridos RG-I de zanahoria de la presente invención pueden contener uno o más de los siguientes dominios:
• homogalacturonano (HG),
• xilogalacturonano (XG),
• apiogalacturonano (AG)
• ramnogalacturonano-II (RG-II).
[0042] Los dominios XG, AG y RG-II normalmente representan sólo una fracción menor de los polisacáridos RG-
[0043] Los dominios HG, los dominios XG, los dominios AG y RG-II que están opcionalmente presentes en los polisacáridos RG-I de la presente invención comprenden una cadena principal que consiste en una cadena lineal de dos o más ácidos D-galacturónicos con enlaces a-(1-4).
[0044] Los dominios HG no contienen cadenas laterales. Los grupos carboxilo de los residuos de ácido galacturónico dentro de la cadena principal de los dominios hG pueden estar esterificados. El ácido galacturónico esterificado puede presentarse en forma de éster metílico o éster acetílico.
[0045] La cadena principal de los dominios XG contiene una o más cadenas laterales en forma de D-xilosa.
[0046] La cadena principal de los dominios AG contiene una o más cadenas laterales que están compuestas por uno o más residuos de D-apiosa.
[0047] La cadena principal de RG-II contiene una o más cadenas laterales que no están compuestas exclusivamente de D-xilosa o D-apiosa. Los grupos carboxilo de los residuos de ácido galacturónico dentro de la cadena principal de los dominios RG-II pueden estar esterificados. El ácido galacturónico puede esterificarse mediante grupos metilo o acetilo, formando ésteres metílicos o acetílicos, respectivamente.
[0048] La terminología "grado de acetilación" se refiere al número de residuos de acetilo por residuo de ácido galacturónico, expresado como porcentaje.
[0049] La terminología "grado de metilación" se refiere al número de residuos de metilo por residuo de ácido galacturónico, expresado como porcentaje.
[0050] La concentración de diferentes polisacáridos y su composición de monosacáridos se puede determinar mediante técnicas analíticas conocidas por el experto. Después de la hidrólisis ácida (metanólisis), la composición de monosacáridos de los azúcares neutros se puede determinar adecuadamente mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento combinada con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD).
[0051] Los ácidos urónicos (siendo el ácido galacturónico la forma dominante de ácidos urónicos) se pueden determinar mediante el ensayo colorimétrico de m-hidroxidifenilo.
[0052] La distribución de tamaño molecular se puede determinar mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento utilizando la detección (concentración) del índice de refracción (RI).
[0053] Los métodos analíticos mencionados anteriormente se describen en: Analytical Biochemistry Vol. 207, Número 1, 1992, p. 176 (para análisis de azúcar neutro) y en Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Número 1, 2017, 1600243 (para el análisis de ácido urónico y la distribución de tamaño molecular).
[0054] Todos los porcentajes mencionados en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, se refieren al porcentaje en peso.
[0055] La administración oral dentro del contexto del presente tratamiento abarca la autoadministración.
[0056] El uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico según la invención comprende preferiblemente la administración oral del producto en una dosis que proporcione al menos 100 mg, más preferiblemente al menos 350 mg y de la manera más preferible 350-5000 mg de los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0057] En otra forma de realización preferida, el tratamiento comprende la administración oral del producto en una dosis diaria que proporcione al menos 100 mg, más preferiblemente al menos 350 mg y de la manera más preferible 350-5000 mg de los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0058] Según una forma de realización particularmente preferida, el producto se utiliza para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones del tracto respiratorio superior, como, por ejemplo, un resfriado o una gripe.
[0059] Según otra forma de realización preferida, el producto se utiliza para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones del tracto intestinal, tales como gastroenteritis.
[0060] El sujeto al que se administra por vía oral la composición que contiene polisacáridos RG-I de la presente invención es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un sujeto humano.
[0061] El producto de la presente invención es preferiblemente una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético o una bebida.
[0062] El producto contiene preferiblemente al menos 0,2 % en peso de materia seca, más preferiblemente 0,3 -10 % en peso de materia seca y de la manera más preferible 0,4 - 5 % en peso de materia seca de los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0063] Los polisacáridos RG-I de zanahoria se incorporan preferiblemente en el producto de la presente invención en forma de un aislado de polisacárido péctico que está enriquecido en polisacáridos RG-I. Por consiguiente, en una forma de realización particularmente preferida, los polisacáridos RG-I de zanahoria representan al menos el 20 % en peso, más preferiblemente al menos el 30 % en peso, incluso más preferiblemente el 60 % en peso y de la manera más preferible al menos el 80% en peso de los polisacáridos pécticos presentes en el producto, definiéndose dichos polisacáridos pécticos como polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular superior a 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^-2)-ramnosa.
[0064] Los polisacáridos RG-I de zanahoria que se emplean de acuerdo con la presente invención tienen una cadena principal que comprende tramos de ramnogalacturonano-I y, opcionalmente, tramos de ácido homogalacturónico con enlaces alfa(1,4). La relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos RG-I de zanahoria está dentro del intervalo de 5:1 a 1:1. Preferiblemente, la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos RG-I de zanahoria varía de 4,8:1 a 1:1, más preferiblemente de 4,5:1 a 1:1, incluso más preferiblemente de 4,2:1 a 1:1., de la manera más preferible de 4:1 a 1,1:1.
[0065] Los residuos de ramnosa normalmente representan del 9 al 45 %, más preferiblemente del 10 al 40 % y de la manera más preferible del 11 al 35 % de todos los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos RG-I de zanahoria, es decir, incluyendo los residuos de monosacáridos que están contenidos en las cadenas laterales.
[0066] Los residuos de ácido galacturónico normalmente representan del 21 al 55 %, más preferiblemente del 22 al 50 % y de la manera más preferible del 23 al 45 % de todos los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos RG-I de zanahoria, es decir, incluyendo los residuos de monosacáridos que están contenidos en las cadenas laterales.
[0067] Los residuos de arabinosa normalmente representan del 4 al 38 %, más preferiblemente del 6 al 36 % y de la manera más preferible del 8 al 34 % de todos los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0068] Los residuos de galactosa normalmente representan del 4 al 42 %, más preferiblemente del 8 al 40 % y de la manera más preferible del 10 al 38 % de todos los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0069] La combinación de residuos de ácido galacturónico, residuos de ramnosa, residuos de arabinosa y residuos de galactosa juntos constituye preferiblemente al menos el 88 % en moles, más preferiblemente al menos el 90 % en moles y de la manera más preferible al menos el 92 % en moles de los residuos de monosacáridos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0070] Los polisacáridos RG-I de zanahoria suelen tener un peso molecular de al menos 10 kDa. Más preferiblemente, uno o más polisacáridos RG-I tienen un peso molecular entre 20 kDa y 300 kDa, de la manera más preferible entre 40 kDa y 300 kDa.
[0071] Los polisacáridos RG-I de zanahoria de la presente invención pueden producirse adecuadamente mediante hidrólisis enzimática de polisacáridos pécticos que se encuentran en la zanahoria. Los polisacáridos pécticos que se encuentran en la zanahoria suelen tener un grado de acetilación del 30 al 50 % y un grado de metilación del 60 al 80 %. La eliminación de los dominios de homogalacturonano (HG) de estos polisacáridos pécticos mediante hidrólisis enzimática normalmente produce un polisacárido enriquecido con RG-I con un grado de metilación reducido y un grado de acetilación aumentado.
[0072] Los inventores han descubierto que la hidrólisis enzimática que se emplea de acuerdo con la presente invención normalmente produce polisacáridos RG-I de zanahoria que tienen un grado de acetilación de al menos 20 %, más preferiblemente de 30-110 %, incluso preferiblemente de 35-90 % y de la manera más preferible de 40-70 %.
[0073] Según una forma de realización preferida de la presente invención, la preparación enzimática de los polisacáridos RG-I de zanahoria da como resultado una reducción sustancial del grado de metilación, por ejemplo, debido a la actividad pectinesterasa. Preferiblemente, los polisacáridos RG-I de zanahoria tienen un grado de metilación de no más del 50 %, más preferiblemente de no más del 40 % y de la manera más preferible de 10-30 %.
[0074] Según otra forma de realización preferida, la relación entre el grado de acetilación (DA) de los polisacáridos RG-I de zanahoria y el grado de metilación (DM) de los polisacáridos RG-I de zanahoria es preferiblemente 1 o más, más preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 3 o más, y de la manera más preferible 5 o más. Dado que la actividad pectinesterasa no tiene un impacto significativo en el grado de acetilación de los polisacáridos RG-I de zanahoria preparados enzimáticamente, se pueden obtener polisacáridos RG-I que tienen una relación DA:DM muy alta hidrolizando parcialmente polisacáridos pécticos de zanahoria usando una combinación de pectinasa (poligalacturonasa y/o liasa) y pectinesterasa.
[0075] De acuerdo con otra forma de realización preferida, la preparación enzimática de los polisacáridos RG-I de zanahoria a partir de polisacáridos pécticos produce polisacáridos RG-I de zanahoria que contienen un residuo de ácido galacturónico insaturado en el extremo. Los polisacáridos pécticos que se encuentran en la zanahoria normalmente no contienen residuos de ácido galacturónico insaturado. Sin embargo, la hidrólisis de estos polisacáridos pécticos por pectina liasa y/o pectato liasa produce inevitablemente fragmentos de polisacárido que contienen un residuo de ácido galacturónico terminal, insaturado, no reductor. Preferiblemente, al menos el 10 %, más preferiblemente al menos el 25 % y de la manera más preferible al menos el 50 % de los residuos terminales de ácido galacturónico no reductores en los polisacáridos RG-I son residuos de ácido galacturónico insaturado. Los ácidos galacturónicos insaturados se pueden identificar fácilmente, por ejemplo, midiendo la absorción de UV a 235 nm.
[0076] La cadena principal de los polisacáridos RG-I de zanahoria puede comprender una o más cadenas laterales. Estas cadenas laterales pueden contener residuos de arabinosa y/o galactosa, y cantidades menores de residuos de los monómeros fucosa, glucosa, ácido glucurónico, xilosa y/o ácido urónico. La una o más cadenas laterales se seleccionan preferiblemente entre cadenas laterales de galactano, cadenas laterales de arabinano y cadenas laterales de arabinogalactano.
[0077] La cadena lateral de arabinano comprende al menos uno o más residuos de arabinosa con enlace alfa(1,5) y está sustituida en la posición 4-OH de un residuo de ramnosa en el dominio RG-I. La cadena lateral de arabinano puede ser lineal o ramificada. En caso de que la cadena lateral sea lineal, la cadena lateral consta de residuos de arabinosa con enlace alfa(1,5). En caso de que la cadena lateral de arabinano sea una cadena lateral ramificada, uno o más residuos de alfa-arabinosa están unidos al O-2 y/o al O-3 de arabinosas con enlace alfa(1,5).
[0078] La cadena lateral de galactano comprende al menos uno o más residuos de galactosa con enlace beta(1,4) y está sustituida en la posición O-4 de un residuo de ramnosa en el dominio RG-I.
[0079] La cadena lateral de arabinogalactano está sustituida en la posición O-4 de un residuo de ramnosa en el dominio RG-I y puede ser un arabinogalactano de tipo I (AGI) o un arabinogalactano de tipo II (AGII). AGI se compone de una cadena principal (1^4)-p-D-Galp en la que pueden ocurrir sustituciones por unidades monoméricas Galp en la posición O-6 o en la posición O-3. AGI se sustituye además con residuos a-L-Araf-p y/o con cadenas laterales cortas (1^5)-a-L-Araf. AGII está compuesto de la cadena principal a(1^-3)-p-D-Galp decorada con cadenas secundarias (1^-6)-p-D-Galp, que están arabinosiladas.
[0080] Preferiblemente, los residuos de arabinosa y los residuos de ramnosa están presentes en los polisacáridos RG-I de zanahoria en una relación molar de menos de 4:1, más preferiblemente de menos de 3:1, de la manera más preferible de menos de 2:1.
[0081] Los residuos de galactosa y los residuos de ramnosa están presentes preferiblemente en los polisacáridos RG-I de zanahoria en una relación molar de menos de 4:1, más preferiblemente de menos de 3,2:1, de la manera más preferible de menos de 2,5:1.
[0082] La relación molar de la combinación de residuos de arabinosa y residuos de galactosa con respecto a residuos de ramnosa en los polisacáridos RG-I de zanahoria es preferiblemente inferior a 7:1, más preferiblemente inferior a 5:1 y de la manera más preferible inferior a 4:1.
[0083] La combinación de residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa constituye preferiblemente al menos un 30 % en moles, más preferiblemente un 35-90 % en moles y de la manera más preferible un 40-75 % en moles de los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0084] Según una forma de realización particularmente preferida, los polisacáridos RG-I de zanahoria tienen la siguiente composición de monosacáridos:
• 21-55 % en moles de residuos de ácido galacturónico, donde los ácidos galacturónicos individuales pueden estar metilados y/o acetil-esterificados;
• 9-35 % en moles de residuos de ramnosa;
• 5-35 % en moles de residuos de arabinosa;
• 5-40 % en moles de residuos de galactosa.
[0085] Los polisacáridos RG-I de zanahoria en el producto de la presente invención se obtienen preferiblemente mediante hidrólisis enzimática parcial de pectina de zanahoria. Según una forma de realización particularmente preferida, los polisacáridos RG-I de zanahoria se obtienen mediante hidrólisis enzimática de pectina de zanahoria usando una o más pectinasas seleccionadas entre pectina liasa (EC 4.2.2.10), pectato liasa (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67 y EC 3.2.1.82). De la manera más preferible, los polisacáridos RG-I de zanahoria se obtienen mediante hidrólisis enzimática de pectina de zanahoria usando una o más pectinasas seleccionadas entre pectina liasa (EC 4.2.2.10) y endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15).
[0086] El producto de la presente invención contiene preferiblemente trazas de una o más de las pectinasas mencionadas anteriormente. Estas pectinasas pueden estar presentes en el producto en forma activa y/o inactiva.
[0087] Según una forma de realización preferida, los polisacáridos RG-I de zanahoria se obtienen mediante hidrólisis enzimática de pectina de zanahoria usando endopoligalacturonasa y/o exopoligalacturonasa en combinación con pectinesterasa (EC 3.1.1.11).
[0088] Según otra forma de realización preferida, los polisacáridos RG-I de zanahoria se obtienen mediante hidrólisis enzimática de pectina de zanahoria utilizando pectina liasa y/o pectato liasa.
[0089] Además de los polisacáridos RG-I de zanahoria, el producto de la presente invención contiene preferiblemente al menos 1 % en peso de materia seca, más preferiblemente al menos 3 % en peso de materia seca de uno o más prebióticos seleccionados entre lactulosa, inulina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, oligosacáridos de la leche, goma guar y goma arábiga. Aún más preferiblemente, el producto contiene al menos un 1 % en peso de materia seca, más preferiblemente al menos un 3 % en peso de materia seca de uno o más prebióticos seleccionados entre lactulosa, inulina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos y oligosacáridos de la leche.
[0090] Otro aspecto de la invención se refiere a un producto seleccionado entre una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida y un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto al menos 0,1 % en peso de materia seca de polisacáridos RG-I de zanahoria como se ha descrito anteriormente; donde los polisacáridos RG-I de zanahoria representan al menos el 20 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en el producto, definiéndose dichos polisacáridos pécticos como polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular superior a 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa.
[0091] Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de polisacáridos RG-I de zanahoria, comprendiendo dicho proceso:
• proporcionar un aislado de pectina de zanahoria, comprendiendo dicho aislado al menos 5 % en peso de materia seca, preferiblemente al menos 10 % en peso de materia seca, más preferiblemente al menos 25 % en peso de materia seca de polisacáridos pécticos que tienen un peso molecular de al menos 15 kDa y que tienen una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^-2)-ramnosa;
• hidrolizar parcialmente dichos polisacáridos pécticos usando una o más pectinasas seleccionadas de pectina liasa (EC 4.2.2.10), pectato liasa (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67 y EC 3.2.1.82),
• someter los polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados a una técnica de separación sólido-líquido seleccionada entre centrifugación, decantación, filtración y combinaciones de las mismas para producir una fracción líquida que contiene polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados;
• someter la fracción líquida a ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular en el intervalo de 10 a 100 kDa; y
• recuperar un retenido que contiene los polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados.
[0092] Según una forma de realización preferida, los polisacáridos pécticos se hidrolizan parcialmente utilizando una o más pectinasas seleccionadas entre endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15) y exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67 y EC 3.2.1.82).
[0093] Según otra forma de realización preferida, los polisacáridos pécticos se hidrolizan parcialmente utilizando una o más pectinasas seleccionadas entre pectina liasa (EC 4.2.2.10) y pectato liasa (EC 4.2.2.2). Como se ha explicado anteriormente en el presente documento, la hidrólisis de polisacáridos pécticos por estas liasas produce inevitablemente fragmentos de polisacáridos que contienen un residuo de ácido galacturónico no reductor, insaturado y terminal.
[0094] Los polisacáridos pécticos se hidrolizan preferiblemente en el presente proceso usando una combinación de las una o más pectinasas mencionadas anteriormente y una o más pectinesterasas (EC 3.1.1.11). La una o más pectinesterasas se pueden emplear antes o simultáneamente con la una o más pectinasas. El uso combinado de pectinasas y pectinesterasas es particularmente ventajoso en el caso de que la pectinasa empleada se seleccione entre endopoligalacturonasa, exopoligalacturonasa y combinaciones de las mismas. El uso combinado de pecintasas y pectinesterasas normalmente produce polisacáridos pécticos de zanahoria parcialmente hidrolizados que tienen un grado reducido de metilación y una relación acetilación/metilación aumentada.
[0095] La hidrólisis parcial de los polisacáridos pécticos se lleva a cabo preferiblemente manteniendo una solución acuosa de los polisacáridos pécticos y la pectinasa a una temperatura en el intervalo de 15 a 70 °C durante al menos 10 minutos, preferiblemente durante 15-300 minutos.
[0096] El aislado de pectina de zanahoria que se emplea en el presente proceso es preferiblemente pulpa de zanahoria obtenida de la producción de jugo de zanahoria o una fracción de dicha pulpa de zanahoria.
[0097] Como se usa en el presente documento, el término "ultrafiltración" también abarca diálisis usando una membrana de ultrafiltración. En una forma de realización particularmente preferida del presente proceso, la fracción líquida que se obtiene de la separación sólido-líquido se somete a ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular en el intervalo de 12 a 80 kDa. Más preferiblemente, dicha membrana de ultrafiltración tiene un corte de peso molecular en el intervalo de 10 a 60 kDa, de la manera más preferible en el intervalo de 20 a 45 kDa.
[0098] Según una forma de realización particularmente preferida, el retenido que se obtiene en el paso de ultrafiltración se concentra hasta un contenido de agua de menos del 50 % en peso. Aún más preferiblemente, el retenido se seca hasta un contenido de agua de menos del 15 % en peso, de la manera más preferible de menos del 12 % en peso.
[0099] El retenido mencionado anteriormente se seca preferiblemente usando una técnica de secado seleccionada entre secado por pulverización, secado en tambor y liofilización. Más preferiblemente, la técnica de secado utilizada es el secado por pulverización o el secado en tambor. De la manera más preferible, el retenido se seca mediante secado por pulverización.
[0100] El presente proceso preferiblemente no emplea disolventes orgánicos.
[0101] La presente invención también proporciona un método para preparar un producto seleccionado entre una formulación nutricional, un producto alimenticio, una bebida, un suplemento dietético y un producto farmacéutico, comprendiendo dicho método incorporar en el mismo 0,1-50 % en peso de materia seca de los polisacáridos RG-I de zanahoria como se ha descrito anteriormente en el presente documento. El producto se prepara preferiblemente combinando los polisacáridos RG-I de zanahoria con uno o más ingredientes comestibles.
[0102] Una forma de realización del presente método se refiere a la preparación de un producto seleccionado entre una formulación nutricional, un producto alimenticio y una bebida, comprendiendo dicho método incorporar en el mismo entre un 0,5 y un 40%en peso de materia seca, más preferiblemente entre un 1 y un 30%en peso de materia seca de los polisacáridos rG-I de zanahoria.
[0103] En otra forma de realización, el presente método se usa para preparar un producto seleccionado entre un suplemento dietético y un producto farmacéutico, comprendiendo dicho método incorporar en el mismo 10-90 % en peso de materia seca, preferiblemente 20-80 % en peso de materia seca y de la manera más preferible 30 60 % en peso de materia seca de polisacáridos RG-I de zanahoria.
[0104] Los polisacáridos RG-I de zanahoria se incorporan preferiblemente al producto en forma de un aislado que contiene al menos un 5 %, más preferiblemente al menos un 10 %, incluso más preferiblemente al menos un 20 % y de la manera más preferible al menos un 30 % de los polisacáridos RG-I de zanahoria en peso de materia seca.
[0105] Según otra forma de realización preferida, los polisacáridos RG-I de zanahoria se incorporan al producto en forma de polvo, preferiblemente en forma de polvo que tiene un contenido de agua inferior al 15 % en peso, más preferiblemente inferior al 12 % en peso.
[0106] Preferiblemente, el polvo mencionado anteriormente contiene menos del 30 % en peso, más preferiblemente menos del 20 % en peso y de la manera más preferible menos del 10 % en peso de material que tiene un peso molecular inferior a 10 kDa.
[0107] Los polisacáridos RG-I de zanahoria se incorporan preferiblemente al producto en forma de un aislado, representando los polisacáridos RG-I de zanahoria al menos el 20 % en peso, más preferiblemente al menos el 30 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 60 % en peso y de la manera más preferible al menos el 80 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en el aislado, definiéndose dichos polisacáridos pécticos como polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular mayor que 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^-2)-ramnosa.
[0108] La invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
[0109] El hollejo de zanahoria seco (polvo de fibra de zanahoria, GreendFields, Polonia), el residuo de la producción de jugo de zanahoria, se dispersó en agua desmineralizada (100 g/l) y se sometió a hidrólisis enzimática a escala de laboratorio usando 3 enzimas comerciales diferentes (condiciones de enzimólisis: 45 °C, 120 minutos):
1. Pectinex® Yield Mash ex Novozymes (0,02 % de dispersión total)
2. Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes (0,02 % de dispersión total)
3. Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes (0,05 % de dispersión total)
[0110] La enzimólisis se terminó calentando a 90 °C durante 10 minutos, seguido de centrifugación y diálisis del sobrenadante usando una membrana con un corte de 10 kDa (Microdyn Nadir; UP010).
[0111] Se produjo un aislado de referencia introduciendo el hollejo de zanahoria seco en agua (100 g/l), manteniendo la solución durante 120 minutos a una temperatura de 90 °C, centrifugado y dializando el sobrenadante mediante diálisis de la misma manera que las dispersiones enzimolizadas.
Ejemplo 2
[0112] La composición de monosacáridos del polisacárido RG-I de zanahoria no hidrolizado del Ejemplo 1 (Referencia) y del polisacárido RG-I de zanahoria enzimáticamente hidrolizado del Ejemplo 1 (Muestras 1 a 3) se determinó de la siguiente manera:
La concentración de diferentes polisacáridos y su composición de monosacáridos se determinaron utilizando los métodos analíticos descritos en: Analytical Biochemistry Vol. 207, Número 1, 1992, pág 176 (análisis de azúcar neutro) y en Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Número 1, 2017, 1600243 (análisis de ácido urónico y distribución de tamaños moleculares).
[0113] Los resultados del análisis de monosacáridos se muestran en la Tabla 1 (Rha = ramnosa; GalA = ácido galacturónico; Ara = arabinosa; Gal = galactosa.
Tabla 1
Ejemplo 3
[0114] La actividad inmunomoduladora de los polisacáridos RG-I de zanahoria no hidrolizados del Ejemplo 1 (Referencia) y de los polisacáridos RG-I de zanahoria enzimáticamente hidrolizados del Ejemplo 1 (Muestras 1 a 3) se determinó utilizando un ensayo de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).
Ensayo de inmunomodulación.
[0115] Para evaluar el efecto de los materiales polisacáridos sobre la función inmune, se incubaron con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas. En resumen, se aislaron PBMC a partir de capas leucocitarias de sangre utilizando Ficoll-plaque (Amersham). Se incubaron PBMC (2*10E6 células/ml) en medio RPMI (medio RPMI Gibco™ 1640) con 300 pg de polisacáridos RG-I durante 20 horas (5 % CO2, 37 °C). Posteriormente, se recogieron los sobrenadantes y se midieron las citoquinas utilizando una matriz de microesferas (kit de inflamación humana CBA, BD-Bioscience) medidas en un citómetro de flujo (BD FACSCANTO II) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó RPMI como control negativo y LPS (deE. coli- Sigma L3012-5mG) como referencia para la cual los resultados se normalizaron con LPS como 100 %. Los datos se expresan como % normalizado con respecto a la respuesta inducida por LPS, promediados sobre 3 donantes diferentes para 4 citoquinas diferentes y su suma.
[0116] La Tabla 2 muestra los resultados del ensayo de inmunomodulación.
Tabla 2
Ejemplo 4
[0117] El ejemplo 1 se repitió en diferentes escalas, es decir, a 20 litros (muestra 1), 5000 litros (muestra 2) y 10 000 litros (muestra 3), utilizando la enzima Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes (condiciones: 0,1 % p/p de dispersión total, 45 °C, 2 h, inactivación enzimática: 90 °C durante 10 min). En las muestras 2 y 3, en lugar de centrifugación, se utilizó decantación para separar los sólidos del líquido. El sobrenadante se sometió a ultrafiltración, utilizando una membrana de 10 kDa, para eliminar los componentes moleculares pequeños.
[0118] La composición de monosacáridos de los materiales de polisacáridos hidrolizados se analizó siguiendo los métodos descritos en el Ejemplo 2.
[0119] Los resultados de los análisis se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
[0120] El grado de acetilación y metilación se determinó como sigue: Se trataron muestras de polisacárido (2-5 mg) con hidróxido de sodio (0,1 M, durante la noche, 20 °C). El metanol liberado se midió utilizando GC de espacio de cabeza equipado con una columna DB-WAX ETR, trampa fría Cryo Focus-4 y detección FID (adaptado de Huismanet al.,Food Hydrocolloids, 18, 4, 2004, 665-668)
[0121] Las muestras se neutralizaron (HCl 1 M) y luego se cuantificó el acetilo liberado usando HPLC equipada con una columna Aminex HPX 87H con precolumna y detección RI (adaptada de Voragenet al.Food Hydrocolloids, 1, 1, 1986, 65-70). El grado de esterificación se expresa como cantidad molar de metanol y ácido acético liberado como porcentaje de la cantidad de ácido urónico.
[0122] Los resultados de los análisis del grado de esterificación se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Ejemplo 5
[0123] La actividad inmunomoduladora de los polisacáridos RG-I de zanahoria hidrolizados enzimáticamente del Ejemplo 4 (Muestras 1 a 3) se determinó usando un ensayo de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como se describe para el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la tabla 5.
Tabla 5
Ejemplo 6
[0124] El material polisacárido hidrolizado de la muestra 2 del Ejemplo 4 se hidrolizó adicionalmente, seguido del aislamiento de una fracción de alto peso molecular. El material polisacárido se disolvió en agua desmineralizada (100 g/l) y se sometió a hidrólisis enzimática adicional (Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes, 45 °C, 14 horas). La enzimólisis se terminó calentando a 90 °C durante 10 min.
[0125] Una porción de las soluciones de polisacáridos enzimolizados se sometió a fraccionamiento usando cromatografía semipreparativa de exclusión por tamaño para producir una fracción que contenía polisacáridos que tenían un peso molecular de más de 70 kDa.
[0126] La composición de monosacáridos del polisacárido hidrolizado no fraccionado y de la fracción de alto peso molecular aislada se analizó utilizando la metodología descrita para el Ejemplo 2.
[0127] Los resultados de los análisis se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6
[0128] La actividad inmunomoduladora del polisacárido enzimolizado y su fracción de alto peso molecular se determinó usando la metodología descrita en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
Claims (14)
1. Producto para uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones, comprendiendo dicho tratamiento la administración oral del producto, donde el producto se selecciona de una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida y un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto al menos un 0,1 % en peso de materia seca de polisacáridos RG-I de zanahoria con la siguiente combinación de características:
• un peso molecular en el intervalo de 10 a 300 kDa;
• una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^-2)-ramnosa; • la siguiente composición de monosacáridos:
- 20-60 % en moles de residuos de ácido galacturónico, donde los ácidos galacturónicos individuales pueden metilarse en la posición C-6 y/o acetilarse en la posición O-2 y/o O-3;
- 8-50 % en moles de residuos de ramnosa;
- 0-40 % en moles de residuos de arabinosa;
- 0-45 % en moles de residuos de galactosa;
- relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en el intervalo de 5:1 a 1:1;
- los residuos de ácido galacturónico, los residuos de ramnosa, los residuos de arabinosa y los residuos de galactosa juntos constituyen al menos el 85 % en moles de los residuos de monosacáridos en los polisacáridos RG-I de zanahoria.
2. Producto para uso según la reivindicación 1, donde los polisacáridos RG-I de zanahoria tienen un grado de metilación no superior al 50 %.
3. Producto para uso según la reivindicación 1 o 2, donde la relación entre el grado de acetilación de los polisacáridos RG-I de zanahoria y el grado de metilación de los polisacáridos RG-I de zanahoria es 1 o más.
4. Producto para uso según la reivindicación 1, donde al menos el 10 % de los residuos terminales de ácido galacturónico no reductores en los polisacáridos RG-I son residuos de ácido galacturónico insaturado.
5. Producto para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los polisacáridos RG-I de zanahoria representan al menos el 20 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en el producto, definiéndose dichos polisacáridos pécticos como polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular mayor que 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa.
6. Producto para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relación molar de la combinación de residuos de arabinosa y residuos de galactosa con respecto a residuos de ramnosa en los polisacáridos RG-I de zanahoria es inferior a 5:1, preferiblemente inferior a 4,5:1.
7. Producto para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los polisacáridos RG-I de zanahoria tienen la siguiente composición de monosacáridos:
• 21-55 % en moles de residuos de ácido galacturónico, donde los ácidos galacturónicos individuales pueden estar metilados y/o acetil-esterificados;
• 9-35 % en moles de residuos de ramnosa;
• 5-40 % en moles de residuos de arabinosa;
• 5-40 % en moles de residuos de galactosa.
8. Producto para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los polisacáridos RG-I de zanahoria se han obtenido mediante hidrólisis enzimática parcial de pectina de zanahoria.
9. Producto para uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico según la reivindicación 8, comprendiendo dicho uso la administración oral del producto en una dosis que proporcione al menos 200 mg de los polisacáridos RG-I de zanahoria.
10. Producto seleccionado entre una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida y un producto farmacéutico, conteniendo dicho producto al menos 0,1 % en peso de materia seca de polisacáridos RG-I de zanahoria como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-8; donde los polisacáridos RG-I de zanahoria representan al menos el 20 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en el producto, definiéndose dichos polisacáridos pécticos como polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular superior a 10 kDa y que comprenden una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^-2)-ramnosa.
11. Proceso de preparación de polisacáridos RG-I de zanahoria, comprendiendo dicho proceso:
• proporcionar un aislado de pectina de zanahoria, comprendiendo dicho aislado al menos 5 % en peso de materia seca de polisacáridos pécticos que tienen un peso molecular de al menos 15 kDa y que tienen una cadena principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando contenidos dichos residuos de ramnosa en residuos de alfa(1^4)-galacturónico-alfa(1^2)-ramnosa; • hidrolizar parcialmente dichos polisacáridos pécticos usando una o más pectinasas seleccionadas entre pectina liasa (EC 4.2.2.10), pectato liasa (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67 y EC 3.2.1.82), y
• someter los polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados a una técnica de separación sólido-líquido seleccionada entre centrifugación, decantación, filtración y combinaciones de las mismas para producir una fracción líquida que contiene polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados;
• someter la fracción líquida a ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular en el intervalo de 10 a 100 kDa; y
• recuperar un retenido que contiene los polisacáridos pécticos parcialmente hidrolizados.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, donde los polisacáridos pécticos se hidrolizan usando una o más pectinesterasas (EC 3.1.1.11) antes o simultáneamente con la hidrólisis parcial usando endopoligalacturonasa y/o exopoligalacturonasa.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 o 12, donde el retenido recuperado se seca hasta un contenido de agua inferior al 15 % en peso.
14. Método para preparar un producto seleccionado de una formulación nutricional, un producto alimenticio, un suplemento dietético, una bebida o un producto farmacéutico, comprendiendo dicho método incorporar en el mismo 0,1-50 % en peso de materia seca de los polisacáridos RG-I de zanahoria como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
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