ES2987765T3 - Suministro dirigido de sustancias farmacéuticas que contienen amina terciaria - Google Patents

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Abstract

Se describen compuestos y composiciones de conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) en los que una unidad de fármaco cuaternizado está unida a una unidad de ligando de orientación desde la que se libera un fármaco que contiene amina terciaria en el sitio de acción objetivo. La invención se refiere a dichos compuestos y composiciones para su uso en métodos para tratar enfermedades caracterizadas por las células anormales objetivo seleccionadas entre cáncer y enfermedades autoinmunes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION
Suministro dirigido de sustancias farmacéuticas que contienen amina terciaria
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a conjugados ligando-fármaco (LDC) para el suministro dirigido de fármacos que contienen amina terciaria a células anómalas asociadas con un estado patológico dado o en las proximidades de tales células, como se define en las reivindicaciones. El ligando de direccionamiento de tal un LDC expone selectivamente las células anómalas, en contraste con las células normales distantes de las células anómalas, a un fármaco que contiene amina terciaria. Esa exposición selectiva se logra al concentrar el fármaco en el sitio de acción deseado mediante la unión del ligando de direccionamiento del LDC sobre las células anómalas o en sus proximidades. Como resultado, se reduce la exposición de células normales distantes al fármaco, reduciendo así los efectos secundarios no deseados al tiempo que se reduce la contribución de las células anómalas al estado patológico. En general, el diseño de un LDC implica la consideración de una variedad de factores, que incluye el requisito de que el fármaco tenga un sitio para unirse a un resto enlazador que une el fármaco al ligando de direccionamiento y sea capaz de liberar el fármaco en el sitio diana. Un compuesto que contiene amina terciaria puede no tener un sitio de unión adecuado, por lo que se necesita la modificación de un fármaco parental para la unión al resto enlazador de un LDC. En esos casos, el fármaco liberado no es el fármaco parental, sino el fármaco modificado. Por ejemplo, un fármaco que contiene una amina terciaria puede modificarse al eliminar uno de sus sustituyentes de amina para proporcionar una amina secundaria, que luego podría incorporarse en un LDC a través de un grupo funcional que contiene carbonilo. Sin embargo, a menudo el fármaco modificado tendrá una actividad biológica significativamente reducida o cambios no deseados en otras propiedades farmacológicas, en comparación con el fármaco parental que contiene amina terciaria.
Debido a la dificultad de proporcionar un sitio alternativo de conjugación y al deseo de retener la máxima actividad biológica de un fármaco que contiene amina terciaria, existe una necesidad en la técnica para los LDC que usen el nitrógeno de la amina terciaria como el sitio de conjugación con el fin de permitir la liberación del fármaco que contiene amina terciaria completamente activo en el sitio de acción diana. Incluso si la actividad biológica reducida o los cambios en otras propiedades farmacológicas son tolerables a través de la alteración de un fármaco que contiene una amina terciaria mediante la eliminación de uno de sus sustituyentes de nitrógeno, o cuando un sitio alternativo de conjugación está disponible o puede introducirse sin consecuencias graves para la actividad biológica deseada, sigue existiendo una necesidad en la técnica del uso del nitrógeno de amina terciaria como sitio de conjugación. Esa necesidad existe ya que es impredecible cuál de los posibles sitios de conjugación que podría presentar un fármaco que contiene amina terciaria proporcionará la liberación más eficiente del fármaco activo y, por tanto, el LDC más activa.
El documento WO 2013/173337 describe conjugados ligando-fármaco, enlazadores-fármaco, enlazadores y conjugados ligando-enlazador que comprenden un componente de ensamblaje enlazador autoestabilizante. El documento EP2461830 describe compuestos antiproliferativos para uso en el tratamiento de tumores. Jeffrey, SC y otros (2006), Development and Properties of p-Glucuronide Linkers for Monoclonal Antibody-Drug Conjugates, Bioconjugate Chem., 17, 831-840 describe un enlazador basado en jS-glucurónido para unir agentes citotóxicos a anticuerpos monoclonales.Doronina, SO y otros (2003), Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy, Nature Biotechnology, 21(7), 778-784 describe auristatina E y conjugados anticuerpofármaco MMAE.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención es una composición de Conjugado de fármaco y ligando (LDC), como se define en las reivindicaciones anexas 1 a 24, en donde la composición de LDC está representada por la estructura de la Fórmula 1
donde: "Ligando" es una Unidad Ligando (L), en la que L es capaz de unirse selectivamente a una fracción diana, y L es un anticuerpo o fragmento del mismo para definir un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), en el que la fracción diana es un antígeno capaz de unirse selectivamente al ADC, y en el que el antígeno es una proteína, glicoproteína o carbohidrato de la superficie celular accesible extracelularmente que se muestra preferentemente en células anormales en comparación con células normales, en el que las células anormales y normales son células de un mamífero, en el que las células anormales son hiperproliferantes. Lb es un enlazador primario; Q1 es Aa-Ww, en el que A es una unidad de extensión opcional, de modo que el subíndice a es 0 cuando A está ausente o a es 1 cuando A está presente y comprende dos, tres o cuatro subunidades; Q2 es W'w -E-, en la que Q2, cuando está presente, está unida a V, Z1, Z2 o Z3; Wwy W'w son unidades escindibles; en la que Ww de Q1 es capaz de ser escindida selectivamente por una proteasa reguladora o intracelular en comparación con las proteasas del suero, o es capaz de ser escindida por el glutatión mediante intercambio de disulfuro, o es más reactiva a la hidrólisis en condiciones de pH más bajo presentes en los lisosomas en comparación con el pH fisiológico del suero, y W'w -E de Q2 proporciona un enlace glicosídico escindible por una glicosidasa localizada intracelularmente, en el que el subíndice w es 0 o 1 de modo que W está ausente cuando w es 0 o W está presente cuando w es 1, y w' es 0 o 1, donde W'w-E está ausente cuando w' es 0 o W'w-E está presente cuando w' es 1, y donde w w' es 1 (es decir.e., uno y sólo uno de W, W' está presente); V, Z1, Z2 and Z3 son =N- o =C(R24)-, donde R24 es hidrógeno o alquilo, alquenilo o alquinilo, opcionalmente sustituido, o halógeno, - NO<2>, -CN u otro grupo de retirada de electrones, un grupo donador de electrones, -Q2, o - C(R8)(R9)-D+, donde al menos uno de V, Z1, Z2, y Z3 es =C(R24)- cuando w es 1 y al menos dos de V, Z1, Z2 y Z3 son =C(R24)- cuando w' es 1,
siempre que cuando w sea 1, Q2 esté ausente y uno y sólo un R24 sea -C(R8)(R9)-D+ de modo que - C(R8)(R9)-D+ esté enlazado a uno de V, Z1, Z2, Z3 cuando ese grupo variable sea =C(R24)- y los sustituyentes Q1-J- and -C(R8)(R9)-D+ seanortooparaentre sí,
siempre que cuando w' sea 1, uno y sólo un R24 sea -C(R8)(R9)-D+ de modo que - C(R8)(R9)-D+ esté enlazado a uno de V, Z1, Z2, Z3 cuando dicho grupo variable sea =C(R24)- y uno y sólo otro R24 sea Q2 de modo que Q2 esté enlazado a otro de V, Z1, Z2, Z3 cuando dicho grupo variable es =C(R24)-, y los sustituyentes Q2 and -C(R8)(R9)-D+ sonortooparaentre sí;
R8 y R9 independientemente son hidrógeno, alquilo, alquenilo o alquinilo, opcionalmente sustituido, o arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido; E y J independientemente son -O-, -S-o -N(R33)-, donde R33 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; R' es hidrógeno o es halógeno, -NO<2>, -CN u otro grupo de retirada de electrones, o es un grupo donador de electrones; D+ representa una estructura de un fármaco D cuaternizado que contiene amina terciaria; y p es una carga media de fármaco con un número que oscila entre 1 y 24; en el que dicha escisión por una proteasa intracelular o reguladora, por glutatión mediante intercambio de disulfuro, por hidrólisis ácida o por una glucosidasa da lugar a la liberación de D de un LDC de la composición de LDC.
En algunos aspectos, W de Q1 está compuesto por un resto peptídico que tiene un enlace peptídico a J que se puede escindir selectivamente mediante una proteasa intracelular en comparación con las proteasas séricas, en donde la proteasa intracelular puede o no ser más específica para las células anómalas diana u otras células no deseadas en comparación con las células normales, y en donde la acción de la proteasa intracelular sobre W provocará la liberación de un fármaco que contiene amina terciaria (D) del LDC. En otros aspectos, el enlace peptídico se puede escindir mediante una proteasa que las células anómalas excretan en mayor medida que las células normales.
En otros aspectos, W' de Q2 es un carbohidrato unido por enlace glicosídico, en donde el enlace glicosídico en W'w-E de Q2 proporciona un sitio de escisión para una glicosidasa intracelular, en donde la acción de la glicosidasa sobre W 'w -E provoca la liberación del fármaco (D) que contiene amina terciaria del LDC, en donde la glicosidasa puede o no ser más específica para las células anómalas u otras células no deseadas diana en comparación con las células normales, o es capaz de escisión selectiva por una glicosidasa excretada en mayores cantidades por las células anómalas u otras células no deseadas diana en comparación con las células normales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Tratamiento de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy con un conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo auristatina unido cuaternizado (cAC10-14) que tiene una unidad escindible por catepsina que libera fármaco que contiene amina terciaria libre (auristatina E) en comparación con el correspondiente conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo unido a carbamato (cAC10-C) que libera fármaco desmetil (MMAE) contra sus respectivos conjugados de control no dirigidos h00-14y h00-C.
Figura 2. Tratamiento de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy con un conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo auristatina unido cuaternizado (cAC10-8) que tiene una unidad escindible por glucoronidasa que libera fármaco que contiene amina terciaria libre (auristatina E) en comparación con el correspondiente conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo unido a carbamato (cAC10-B) que libera fármaco desmetil (MMAE) contra sus respectivos conjugados de control no dirigidos h00-8y h00-B.
Figura 3. Estabilidades plasmáticasex vivopara LDC de auristatina unida cuaternizado que tienen una unidad escindible por catepsina o una unidad escindible por glucuronidasa.
Figura 4. Cinética de la liberación de fármaco libre que contiene amina terciaria (auristatina E) de un sistema modelo de LDC cuaternizado
Figura 5. Tratamiento de un modelo de xenoinjerto Karpas299 ALCL con conjugado de fármaco y ligando de tubulisina M cuaternizado, en donde la unidad de ligando de anticuerpo cAC10 se dirige al antígeno CD30, a DAR de 4 unidades de fármaco D+/mAb, dosis única i.p. a 0,3 mg/kg y 1 mg/kg frente a un conjugado de control no dirigido de un enlazador-fármaco cuaternizado idéntico y una carga equivalente.
Figura 6. Tratamiento del modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy con conjugado de fármaco y ligando de tubulisina M cuaternizado preparado a partir de Fármaco-Enlazador32, en donde la unidad de ligando de anticuerpo cAC10 se dirige al antígeno CD30 a DAR de 6 unidades de fármaco D+/mAb, dosis única i.p. a 0,3 mg/kg y 1 mg/kg frente a tratamiento simulado.
Figura 7. Evaluación de la pérdida de acetato del componente tubuvalina de un conjugado de fármaco y ligando de tubulisina M preparado a partir de Fármaco-Enlazador32cuaternizado, que tiene la unidad escindible -Val-Ala-, a DAR de 6 unidades de fármaco D+/mAb administrado en dosis única i.p. a 0,3 mg/kg, 1 mg/kg y 3,0 mg/kg a un xenoinjerto L540cy, en donde la unidad de ligando de anticuerpo cAC10 del conjugado se dirige al antígeno CD30, frente a un conjugado de control de la extracción de sangre 4 días después de la dosificación el día 17 del estudio.
Figura 8. Evaluación de la pérdida de acetato del componente tubuvalina de un conjugado de fármaco y ligando de tubulisina M preparado a partir de Fármaco-Enlazador32cuaternizado, a DAR de 6 unidades de fármaco D+/mAb administrado en dosis única i.p. a 0,3 mg/kg, 1 mg/kg y 3,0 mg/kg a un xenoinjerto L540cy, en donde la unidad de ligando de anticuerpo cAC10 del conjugado se dirige al antígeno CD30, frente a un conjugado de control de la extracción de sangre 10 días después de la dosificación el día 11 del estudio.
Figura 9. Comparaciones de tratamientos del modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy a 0,6 mg/kg y 2 mg/kg, dosis única i.p., con conjugados de fármaco ligando, en donde la unidad de ligando de anticuerpo cAC10 del conjugado se dirige al antígeno CD30, que tiene 4 unidades de fármaco de tubulisina cuaternizada/Unidad de ligando de anticuerpo cAC10 en donde los conjugados se prepararon a partir del compuesto fármaco-enlazador32, que ha cuaternizado la tubulisina M con la unidad escindible -Val-Ala-, y de los compuestos Fármaco Enlazador79, 80y104,que han cuaternizado Tubu(OEt), Tubu(O-Pr) y unidades de fármaco de tubulisina M, respectivamente, y unidades enlazadoras de liberación condicional por glucuronidasa idénticas.
Figura 10. Comparaciones de tratamientos de modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy a 0,5 mg/kg o 0,6 mg/kg y 2 mg/kg, dosis única i.p., con conjugados de fármaco y ligando cAC10, en donde la unidad de ligando de anticuerpo se dirige al antígeno CD30, en donde un conjugado tiene 8 Unidades de fármaco de auristatina F cuaternizado/Unidad de ligando y se prepara a partir del compuesto fármaco-enlazador189frente a otro conjugado que tiene 4 unidades de fármaco de Tubu(O-CH3) cuaternizadas por unidad de ligando de anticuerpo cAC10 preparada a partir del compuesto fármaco-enlazador78,con ambos conjugados que tienen unidades enlazadoras de liberación condicional por glucuronidasa idénticas.
Figura 11. Comparaciones de tratamientos del modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy a 0,4 mg/kg y 0,8 mg/kg, dosis única i.p., con conjugados de fármaco ligando cAC10 que tienen 4 restos de enlazadorfármaco, en donde la unidad de ligando de anticuerpo se dirige al antígeno CD30, en donde un conjugado tiene Dolastatina 10 cuaternizado y se prepara a partir de Fármaco-Enlazador177frente a un conjugado de Dolastatina 10 no cuaternizado preparado a partir de Fármaco Enlazador183,en donde ambos conjugados tienen unidades de enlace de liberación condicional por glucuronidasa.
Figura 12. Perfil farmacocinético de conjugados de fármaco y ligando de 4 vs. 8 unidades de fármaco cuaternizadas que cargan y tienen unidades de ligando de IgG humanas en comparación con el anticuerpo no conjugado dosificado por vía intravenosa 1 mg/kg en ratas en donde los conjugados se preparan a partir de Fármaco Enlazador32que tiene unidades de fármaco de tubulisina M cuaternizadas y unidad de Enlazador de liberación condicional por catepsina y se preparan a partir de Fármaco Enlazador113que también tienen unidades de fármaco de tubulisina M, pero que tienen unidades enlazadoras de liberación condicional por glucuronidasa.
Figura 13. Perfil farmacocinético de un conjugado de fármaco y ligando con 8 unidades de fármaco cuaternizadas que cargan y tienen unidades de ligando de anticuerpo no dirigidos a dosis de 1 mg/kg i.v. en rata, en donde el conjugado se preparó a partir del compuesto 80 fármaco-enlazador, cuya unidad de fármaco cuaternizada es una variante de éter de tubulisina M en la que el resto acetato unido a O del componente de tubuvaleno se ha reemplazado con propoxi y que tiene una unidad enlazadora de liberación condicional de glucuronidasa.
Figura 14 Perfil farmacocinético de conjugados de fármaco ligando con carga de 8 unidades de fármaco cuaternizado en donde los conjugados se preparan a partir del compuesto8fármaco enlazador que tiene unidades de fármaco de auristatina E cuaternizadas y unidades enlazadoras de liberación condicional por catepsina, fármaco enlazador177que tiene una unidad de fármaco de Dolastatina 10 cuaternizado y unidad enlazadora de liberación condicional por glucuronidasa y el compuesto fármaco-enlazador183que tiene un conjugado de Dolastatina 10 no cuaternizado y que también tiene una unidad enlazadora de liberación condicional por glucuronidasa frente a un anticuerpo no dirigido no conjugado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Como se usa en la presente descripción y a menos que se indique o se implique de otra manera por el contexto, los términos que se usan en la presente descripción tienen los significados definidos a continuación. A menos que esté contraindicado o implícito, por ejemplo, al incluir elementos u opciones mutuamente excluyentes, en estas definiciones y a lo largo de esta especificación, los términos "un" y "una" significan uno o más y el término "o" significa y/o cuando lo permite contexto. Como se usa en la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/uno", "una" y "el/la" incluyen variaciones en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
En varios lugares de la presente descripción, por ejemplo, en cualquier modalidad descrita o en las reivindicaciones, se hace referencia a compuestos, composiciones o métodos que "comprenden" uno o más componentes, elementos o etapas especificados. Las modalidades de la invención también incluyen específicamente aquellos compuestos, composiciones, composiciones o métodos que son o que consisten en o que consisten esencialmente en esos componentes, elementos o etapas especificados. El término "compuesto de" se usa indistintamente con el término "que comprende" y se expresan como términos equivalentes. Por ejemplo, las composiciones, dispositivos, artículos de fabricación o métodos descritos que "comprenden" un componente o paso están abiertos e incluyen o leen esas composiciones o métodos más un componente(s) o etapa(s) adicional(es). Sin embargo, esos términos no abarcan elementos no citados que destruirían la funcionalidad de las composiciones, dispositivos, artículos de fabricación o métodos descritos para su propósito previsto. De manera similar, las composiciones, dispositivos, artículos de fabricación o métodos descritos que "consisten en" un componente o etapa están cerrados y no incluirían ni leerían sobre aquellas composiciones o métodos que tengan cantidades apreciables de un componente(s) adicional(es) o una etapa(s) adicional(es). Además, el uso del término "que incluye", así como también otras formas, tales como "incluye", "incluyen" e "incluido", no es limitante. Finalmente, el término "que consiste esencialmente en" admite la inclusión de elementos no citados que no tienen ningún efecto material sobre la funcionalidad de las composiciones, dispositivos, artículos de fabricación o métodos descritos para su propósito previsto y se define adicionalmente en la presente descripción. Los títulos de las secciones que se usan en la presente descripción son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita. A menos que se indique lo contrario, se emplean métodos convencionales de espectroscopía de masas, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología.
"Aproximadamente", como se usa en la presente descripción, cuando se usa en relación con un valor numérico o intervalo de valores proporcionado para describir una propiedad particular de un compuesto o composición, indica que el valor o intervalo de valores puede desviarse en un grado considerado razonable para un experto en la técnica sin dejar de describir la propiedad particular. Las desviaciones razonables incluyen aquellas que están dentro de la exactitud o precisión de los instrumentos utilizados para medir, determinar o derivar la propiedad en particular. Específicamente, el término "aproximadamente" cuando se usa en este contexto, indica que el valor numérico o intervalo de valores puede variar en un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 % o 0,01 % del valor indicado o intervalo de valores, normalmente entre el 10 % y el 0,5 %, más típicamente del 5 % al 1 %, sin dejar de describir la propiedad particular.
"Retiene esencialmente", "que retiene esencialmente y términos similares como se usan en la presente descripción se refieren a una propiedad, característica o actividad de un compuesto o composición o fracción del mismo que no ha cambiado detectablemente o está dentro del error experimental de determinación de esa misma actividad, característica o propiedad de otro compuesto o composición o resto del que se derivó.
"Insignificantemente" o "insignificante", como se usa en la presente descripción, es una cantidad de una impureza por debajo del nivel de cuantificación por análisis de HPLC y, si está presente, representa de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 0,1 % p/p de la composición que contamina. En dependencia del contexto, esos términos también pueden significar que no se observa una diferencia estadísticamente significativa entre los valores medidos o los resultados o dentro del error experimental de la instrumentación utilizada para obtener esos valores. Las diferencias insignificantes en los valores de un parámetro determinado experimentalmente no implican que una impureza caracterizada por ese parámetro esté presente en una cantidad insignificante.
"Retiene sustancialmente", como se usa en la presente descripción, se refiere a un valor medido de una propiedad física de un compuesto o composición o fracción del mismo que es estadísticamente diferente de la determinación de esa misma propiedad física de otro compuesto o composición o fracción de la que se derivó, pero cuya diferencia no se traduce en una diferencia estadísticamente significativa en la actividad biológica en un sistema de prueba biológico adecuado para evaluar esa actividad (es decir, la actividad biológica se retiene esencialmente). Por tanto, la frase "retiene sustancialmente" se hace en referencia al efecto que tiene una propiedad física de un compuesto o composición sobre una actividad biológica que está explícitamente asociada con esa propiedad.
"Que contiene predominantemente", "que tiene predominantemente" y términos similares se refieren al componente principal de una mezcla. Cuando la mezcla es de dos componentes, entonces el componente principal representa más del 50 % en peso de la mezcla. Con una mezcla de tres o más componentes, el componente predominante es el que está presente en mayor cantidad en la mezcla y puede representar o no la mayoría de la masa de la mezcla. El término "grupo aceptor de electrones" se refiere a un grupo funcional o átomo electronegativo que aleja la densidad de electrones de un átomo al que está unido de forma inductiva y/o mediante resonancia, lo que sea más dominante (es decir, un grupo funcional o átomo puede ser electrón que se retira de forma inductiva, pero en general puede ser una donación de electrones a través de resonancia), y tiende a estabilizar aniones o restos ricos en electrones. El efecto de extracción de electrones se transmite típicamente de manera inductiva, aunque en forma atenuada, a otros átomos unidos al átomo enlazado que se ha vuelto deficiente en electrones por el grupo de extracción de electrones (EWG), lo que afecta la electrofilia de un centro reactivo más remoto. Los grupos aceptores de electrones ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, -C(=O), -CN, -NO<2>, -CX<3>, -X, -C(=O)OR, -C(=O)NR<2>, -C(=O)R, -C(=O)X, -S(=O)<2>R, -S(=O)<2>OR, -S(=O)<2>NHR, -S(=O)<2>NR<2>, -P(=O)(OR)<2>, -P(=O)(CH<3>)NHR, -NO, y -NR<3>+, en donde X es -F, -Br, -Cl o -I y R se selecciona, en cada caso, independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1-6>. Los EWG ilustrativos también pueden incluir grupos arilo (por ejemplo, fenilo) dependiendo de la sustitución y ciertos grupos heteroarilo (por ejemplo, piridina). Por tanto, el término "grupos aceptores de electrones" también incluye arilos o heteroarilos que están además sustituidos con grupos aceptores de electrones. Típicamente, los grupos aceptores de electrones son -C(=O), -CN, -NO<2>, -CX<3>, y -X, en donde X es halógeno. En dependencia de sus sustituyentes, un resto alquilo insaturado también puede ser un grupo aceptor de electrones.
El término "grupo donante de electrones" se refiere a un grupo funcional o átomo electropositivo que aumenta la densidad de electrones de un átomo al que está unido inductivamente y/o mediante resonancia, lo que sea más dominante (es decir, un grupo funcional o un átomo puede ser un mediante resonancia, pero en general puede ser una extracción de electrones inductiva) y tiende a estabilizar cationes o sistemas pobres en electrones. El efecto de donación de electrones se transmite típicamente a través de resonancia a otros átomos unidos al átomo enlazado que ha sido enriquecido en electrones por el grupo donante de electrones (EWG), lo que afecta la nucleofilia de un centro reactivo más remoto. Los grupos donantes de electrones ejemplares incluyen, pero no se limitan a -OH y -NH<2>. En dependencia de sus sustituyentes, un resto arilo, heteroarilo o alquilo insaturado también puede ser un grupo donante de electrones.
"Resto", como se usa en la presente descripción, significa un segmento, fragmento o grupo funcional específico de una molécula o compuesto. Los restos químicos a veces se indican como entidades químicas que están embebidas o adjuntas (es decir, un sustituyente o grupo variable) a una molécula, compuesto o fórmula química.
Para cualquier grupo sustituyente o resto descrito en la presente descripción por un intervalo dado de átomos de carbono, el intervalo designado significa que se describe cualquier número individual de átomos de carbono. Por tanto, la referencia a, por ejemplo, "alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido", "alquenilo C<2>-<6>alquenilo opcionalmente sustituido", "heterociclo C<3>-C<8>opcionalmente sustituido" significa específicamente que un resto alquilo opcionalmente sustituido de 1, 2, 3 o 4 carbonos está presente como se define en la presente descripción, o un alquenilo de 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos, o un resto de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 carbonos que comprende un heterociclo o resto alquenilo opcionalmente sustituido como se define en la presente descripción está presente. Todas estas designaciones numéricas están destinadas expresamente a revelar todos los grupos de átomos de carbono individuales; y por lo tanto "alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido" incluye, metilo, etilo, alquilos de 3 carbonos, y alquilos de 4 carbonos, que incluyen todos sus isómeros de posición, ya sea sustituido o no sustituido. Por tanto, cuando un resto alquilo está sustituido, las designaciones numéricas se refieren a un resto de base no sustituido y no pretenden incluir átomos de carbono que pueden estar presentes en los sustituyentes de ese resto de base. Para ésteres, carbonatos, carbamatos y ureas como se definen en la presente descripción que se identifican por un intervalo dado de átomos de carbono, el intervalo designado incluye el carbono carbonilo del grupo funcional respectivo. Por tanto, un éster C<1>se refiere a un éster de formato, un éster C<2>se refiere a un éster acetato y una urea C<1>no sustituida se refiere a NH<2>(C=O)NH<2>.
Los sustituyentes, restos y grupos orgánicos descritos en la presente descripción, y para cualquier otro resto descrito en la presente descripción, normalmente excluirán los restos inestables excepto cuando dichos restos inestables sean especies transitorias que se pueden utilizar para preparar un compuesto con suficiente estabilidad química para uno o más de los usos descritos en la presente descripción. Se excluyen específicamente los sustituyentes, restos o grupos mediante la operación de las definiciones proporcionadas en la presente descripción que dan como resultado aquellos que tienen un carbono pentavalente.
"Alquilo" como se usa en la presente descripción por sí mismo o como parte de otro término se refiere a metilo o una colección de átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono está saturado (es decir, está compuesto por uno o más carbonos sp3) que están covalentemente unidos entre sí en disposiciones normales, secundarias, terciarias o cíclicas, es decir, en una disposición cíclica, ramificada, lineal o alguna combinación de los mismos. Cuando los átomos de carbono saturados contiguos están en una disposición cíclica, tales restos alquilo se denominan a veces cicloalquilo como se define en la presente descripción. Los sustituyentes de alquilo saturados contienen átomos de carbono saturados (es decir, carbonos sp3) y ningún átomo de carbono aromático sp2 o sp (es decir, no está sustituido con restos insaturados, aromáticos y heteroaromáticos). Los sustituyentes alquilo insaturados son restos alquilo sustituidos con restos como se describe en la presente descripción para restos alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo.
Por tanto, a menos que se indique lo contrario, el término "alquilo" indicará un radical hidrocarbonado no cíclico saturado, opcionalmente sustituido con uno o más restos cicloalquilo o insaturados, aromáticos o heteroaromáticos o alguna combinación de los mismos, en donde el radical hidrocarbonado saturado tiene el número indicado de átomos de carbono saturados unidos covalentemente(por ejemplo,"alquilo C<1>-C<6>" o "alquilo C1-C6" significa un resto alquilo o grupo que contiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 contiguos no cíclicos átomos de carbono saturados y "alquilo C<1>C8" se refiere a un resto o grupo alquilo que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono no cíclicos saturados contiguos). El número de átomos de carbono saturados en un resto o grupo alquilo puede variar y típicamente es 1 50, 1-30 o 1-20, y más típicamente es 1-8 o 1-6. Típicamente, un sustituyente alquilo es un resto alquilo C<1>-C<8>saturado, o más típicamente es un resto alquilo C<1>-C<6>o C<1>-C<4>, al que a veces se hace referencia a este último como alquilo inferior. Cuando no se indica el número de átomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono.
Cuando se hace referencia a un resto o grupo alquilo como sustituyente alquilo, ese sustituyente alquilo de una estructura de Markush u otro resto orgánico con el que está asociado es la cadena de átomos de carbono saturados contiguos unidos covalentemente a la estructura o resto a través de un carbono sp3 del sustituyente alquilo. Un sustituyente alquilo, como se usa en la presente descripción, contiene por lo menos un resto saturado y también puede contener (es decir, estar sustituido con) restos o grupos cicloalquilo, alquilo insaturado, aromáticos o heteroaromáticos. Por tanto, un sustituyente de alquilo puede comprender adicionalmente uno, dos, tres o más dobles enlaces, triples enlaces o cicloalquilo, restos aromáticos o heteroaromáticos o alguna combinación de los mismos seleccionados independientemente, típicamente un doble enlace, un triple enlace (es decir, está sustituido un alquenilo o resto alquinilo) o está sustituido con un resto cicloalquilo, aromático o heteroaromático. Cuando se especifica un sustituyente, resto o grupo alquilo, las especies incluyen las derivadas de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un alcano parental (es decir, es monovalente) y pueden incluir metilo, etilo, 1 -propilo (n-propilo), 2-propilo (/sopropilo, -CH(CH<3>)<2>), 1 -butilo (n-butilo), 2-metil-1 -propilo (/so-butilo, -CH<2>CH(CH<3>)<2>), 2-butilo (sec-butilo, -CH(CH<3>)CH<2>CH<3>), 2-metil-2-propilo (f-butilo, -C(CH<3>)<3>), amilo, isoamilo, sec-amilo y otros restos alquilo de cadena lineal, cíclica y ramificada.
"Alquileno", como se usa en la presente descripción por sí mismo como parte de otro término, se refiere a un dirradical de hidrocarburo saturado, ramificado, cíclico o de cadena lineal, sustituido o no sustituido, en donde uno o más de los átomos de carbono está insaturado (es decir, está compuesto de uno o más carbonos sp3), del número indicado de átomos de carbono, típicamente de 1 a 10 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales (es decir, es divalente) derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono saturado o dos diferentes (es decir, sp3) de un alcano parental. Los restos alquileno incluyen además radicales alquilo como se describe en la presente descripción en los que se ha eliminado un átomo de hidrógeno de un resto saturado o del radical carbono de un radical alquilo para formar un dirradical. Típicamente, los restos alquileno incluyen restos divalentes derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno del átomo de carbono saturado de un resto alquilo parental, pero no se limitan a: metileno (-CH<2>-), 1,2-etileno (-CH<2>CH<2>-), 1,3-propileno (-CH<2>CH<2>CH<2>-), 1,4-butileno (-CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>-) y dirradicales similares. Típicamente, un alquileno es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que normalmente contiene solo carbonos sp3 (es decir, está completamente saturado a pesar de los átomos de carbono del radical).
"Cicloalquilo", como se usa en la presente descripción, es un radical de un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico, en donde cada uno de los átomos que forman el sistema de anillo (es decir, átomos del esqueleto) es un átomo de carbono y en donde uno o más de estos átomos de carbono en cada anillo del sistema de anillo cíclico está saturado (es decir, está compuesto por uno o más carbonos sp3). Por lo tanto, un cicloalquilo es una disposición cíclica de carbonos saturados pero también puede contener átomos de carbono insaturados y, por lo tanto, su anillo carbocíclico puede estar saturado o parcialmente insaturado o puede estar fusionado con un anillo aromático, donde los puntos de fusión a un cicloalquilo y anillo aromático son carbonos insaturados adyacentes del resto cicloalquilo o grupo o sustituyente y carbono aromático adyacente del anillo aromático.
A menos que se especifique lo contrario, un resto cicloalquilo, grupo o sustituyente puede estar sustituido con restos descritos para alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo y similares o puede estar sustituido con otros restos cicloalquilo. Los restos, grupos o sustituyentes cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, adamantilo u otros restos cíclicos que tienen solo átomos de carbono. Los cicloalquilos incluyen además ciclobutilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo. En dependencia de su estructura, un sustituyente cicloalquilo puede ser un monorradical como se describió anteriormente para restos o grupos cicloalquilo o un dirradical (es decir, un cicloalquileno, tal como, pero no limitado a, ciclopropan-1,1-diilo, ciclobutan-1,1-diilo, ciclopentan-1,1-diilo, ciclohexan-1,1-diilo, ciclohexan-1,4-diilo, cicloheptan-1,1-diilo y similares).
Cuando se usa cicloalquilo como un grupo Markush (es decir, un sustituyente), el cicloalquilo se une a una fórmula de Markush u otro resto orgánico con el que está asociado a través de un carbono que está involucrado en el sistema de anillo carbocíclico del grupo cicloalquilo siempre que el carbono no sea un carbono aromático. Cuando un carbono insaturado de un resto alqueno que comprende el sustituyente cicloalquilo se une a una fórmula de Markush con la que está asociado, a veces se hace referencia al cicloalquilo como un sustituyente cicloalquenilo. El número de átomos de carbono en un sustituyente cicloalquilo se define por el número total de átomos del esqueleto del sistema de anillo. Ese número puede variar y típicamente varía de 3 a 50, 1-30 o 1-20, y más típicamente 3-8 o 3-6 a menos que se especifique lo contrario, por ejemplo, cicloalquilo C<3-8>significa un sustituyente, resto o grupo cicloalquilo que contiene 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono carbocíclicos y cicloalquilo C<3-6>significa un sustituyente, resto o grupo cicloalquilo que contiene 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono carbocíclicos. Por lo tanto sustituyentes cicloalquilo, restos o grupos por lo general tienen 3, 4, 5, 6, 7, 8 átomos de carbono en su sistema de anillo carbocíclico y pueden contener dobles enlacesexooendocíclicos o triples enlacesendocíclicos o una combinación de ambos en donde los enlaces dobles o triples endocíclicos, o la combinación de ambos, no forman un sistema conjugado cíclico de 4n 2 electrones. Un sistema de anillo bicíclico puede compartir uno (es decir, es un sistema de anillo espiro) o dos átomos de carbono y un sistema de anillo tricíclico puede compartir un total de 2, 3 o 4 átomos de carbono, típicamente 2 o 3.
"Alquenilo", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo que comprende uno o más restos con doble enlace (por ejemplo, un grupo funcional -CH=CH- o =CH<2>para dobles enlacesendoy exo, respectivamente) o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 o más, típicamente 1, 2 o 3 de tales restos y pueden estar sustituidos con un resto o grupo arilo tal como benceno, o átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos enlazados, es decir, lineales, ramificados, cíclico o cualquier combinación de los mismos a menos que el sustituyente alquenilo, resto o grupo es un resto vinilo (por ejemplo, un grupo -CH=CH<2>grupo funcional). Un resto grupo o sustituyente alquenilo, que tiene múltiples dobles enlaces puede tener los dobles enlaces dispuestos contiguamente (es decir, un resto 1,3 butadienilo) o no contiguos con uno o más átomos de carbono saturados intermedios o una combinación de los mismos, siempre que un cíclico, la disposición contigua de dobles enlaces no forma un sistema conjugado cíclico de 4n 2 electrones (es decir, no es aromático).
Cuando se especifica un resto, grupo o sustituyente alquenilo, las especies incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, cualquiera de los restos o sustituyentes de grupos alquilo o cicloalquilo descritos en la presente descripción que tienen unexoo uno o más dobles enlacesendo,incluido el metileno (=CH<2>), metilmetileno (=CH-CH<3>), etilmetileno (=CH-CH<2>-CH<3>), =CH-CH<2>-CH<2>-CH<3>, y restos monovalentes derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un carbono sp2 de un compuesto de alqueno parental. Tales restos monovalentes incluyen típicamente vinilo (-CH=CH<2>), alilo, 1 -metilvinilo, butenilo, isobutenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-pentenilo, ciclopentenilo, 1- metilciclopentenilo, 1-hexenilo, 3-hexenilo, ciclohexenilo y otros radicales lineales, cíclicos y ramificados, todos los que contienen carbono contienen al menos un doble enlace. Cuando se usa alquenilo como un grupo Markush (es decir, es un sustituyente), el alquenilo se une a una fórmula de Markush u otro resto orgánico con el que está asociado a través de un carbono de doble enlace (es decir, un carbono sp2) del resto o grupo alquenilo. El número de átomos de carbono en un sustituyente alquenilo se define por el número de átomos de carbono sp2 del grupo funcional alqueno que lo define como un sustituyente alquenilo y el número total de átomos de carbono no aromáticos contiguos añadidos a cada uno de estos carbonos sp2. Ese número puede variar y, a menos que se especifique lo contrario, varía de 1 a 50, por ejemplo, típicamente 1-30 o 1-20, más típicamente 1-8 o 1-6, cuando el grupo funcional de doble enlace esexoen una estructura Markush, o puede varían y varían de 2 a 50, típicamente 2- 30 o 2-20, más típicamente 2 a 8 o 2-6, cuando el grupo funcional de doble enlace esendoa la estructura de Markush. Por ejemplo, alquenilo C<2-8>o alquenilo C2-8 significa un resto alquenilo que contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono en los que al menos dos son carbonos sp2 en conjugación entre sí y alquenilo C<2>-6 o alquenilo C2-6 significa un resto alquenilo que contiene 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono en el que al menos dos son carbonos sp2 que están en conjugación entre sí. Típicamente, un sustituyente alquenilo es un resto alquenilo C<2>-C<6>o C<2>-C<4>que tiene dos carbonos sp2 que están en conjugación entre sí.
"Alquenileno", como se usa en la presente descripción por sí mismo como parte de otro término, se refiere a un sustituyente, resto o grupo que comprende uno o más restos de doble enlace, como se describió previamente para alquenilo, del número indicado de átomos de carbono, típicamente 1-10 átomos de carbono cuando el grupo funcional de doble enlace esexoa un resto más grande o 2-10, cuando el grupo funcional de doble enlace esendoen el resto de alquenileno, y tiene dos centros radicales derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos diferentes átomos de carbono sp2 de un resto de doble enlace en un alqueno parental. Los restos alquenileno incluyen además radicales alquenilo como se describe en la presente descripción en los que un átomo de hidrógeno se ha eliminado del mismo o diferente átomo de carbono sp2 de un resto de doble enlace de un radical alquenilo para formar un dirradical, o de un carbono sp2 de un resto de doble enlace diferente unido para proporcionar otro radical de carbono. Típicamente, los restos alquenileno incluyen dirradicales que tienen la estructura de -C=C- o -C=C-X1-C=C- en donde X1 está ausente o es un alquileno como se define en la presente descripción.
"Alquinilo", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo que comprende uno o más restos de triple enlace (es decir, un grupo funcional -CEC-), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más, típicamente 1 o 2 triples enlaces, que comprenden opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más dobles enlaces (es decir, opcionalmente sustituidos con un resto alquenilo), siendo los enlaces restantes (si están presentes) enlaces simples y pueden ser más compuesto por átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos enlazados, es decir, lineales, ramificados, cíclicos o cualquier combinación de los mismos, a menos que el resto alquinilo sea etinilo.
Cuando se especifica un resto o grupo alquinilo, las especies incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, cualquiera de los restos, grupos o sustituyentes alquilo descritos en la presente descripción que tenga uno o más dobles enlaces, etinilo, propinilo, butinilo, isobutinilo, 3-metil-2-butinilo, 1 -pentinilo, ciclopentinilo, 1 -metil-ciclopentinilo, 1-hexinilo, 3-hexinilo, ciclohexinilo y otros restos lineales, cíclicos y ramificados que contienen todos los carbonos que contienen al menos un triple enlace. Cuando se usa un alquinilo como grupo Markush (es decir, un sustituyente), el alquinilo se une a una fórmula de Markush con la que está asociado a través de uno de los carbonos sp del grupo funcional alquinilo. El número de átomos de carbono en un sustituyente alquinilo se define por los dos átomos de carbono sp del grupo funcional alquino que lo define como un sustituyente alquinilo y el número total de átomos de carbono contiguos no cíclicos, no aromáticos añadidos al carbono sp no sustituido por la estructura Markush. Ese número puede variar y varía de 2 a aproximadamente 50, típicamente 2-30 o 2-20 o más típicamente 2-8, a menos que se especifique lo contrario, por ejemplo, alquinilo C<2-8>significa un resto alquinilo que contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono. Los grupos alquinilo tendrán típicamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 átomos de carbono.
"Alquinileno", como se usa en la presente descripción por sí mismo como parte de otro término, se refiere a un sustituyente, resto o grupo que comprende uno o más restos de triple enlace, como se describió previamente para alquinilo, del número indicado de átomos de carbono, típicamente 2-10 átomos de carbono, y que tienen dos centros radicales derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno de dos átomos de carbono sp diferentes de un resto de triple enlace en un alquino parental. Los restos alquinileno incluyen además radicales alquinilo como se describe en la presente descripción en los que se han eliminado dos átomos de hidrógeno de acetileno o de dos átomos de carbono sp de dos restos de triple enlace para formar un dirradical. Típicamente, los restos alquinileno incluyen dirradicales que tienen la estructura de -C<e>C- o -C<e>CXC<e>C- en donde X es un resto alquileno, alquenileno o arileno como se define en la presente descripción.
"Aromático", "sistema de anillo aromático" o términos similares como se usan en la presente descripción se refieren a un anillo plano que tiene un sistema de electrones pi deslocalizado que contiene electrones 4n+2 pi, donde n es un número entero positivo. Los anillos aromáticos se pueden formar a partir de cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez átomos. Los aromáticos están opcionalmente sustituidos. El término "aromático" incluye grupos arilo carboxíclico ("arilo",por ejemplo,fenilo) y arilo heterocíclico (o "heteroarilo" o "heteroaromático") (por ejemplo, piridina). El término incluye grupos monocíclicos o policíclicos de anillo condensado (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono).
"Arilo" como se usa aquí significa un resto, sustituyente o grupo orgánico definido por un sistema de anillo aromático o un sistema de anillo condensado sin heteroátomos de anillo que comprenden 1, 2, 3 o 4 a 6 anillos, típicamente 1 a 3 anillos, donde los anillos están compuestos únicamente por átomos de carbono que participan en un sistema conjugado cíclicamente de 4n 2 electrones (regla de Hückel), típicamente 6, 10 o 14 electrones, algunos de los cuales pueden participar adicionalmente en la conjugación exocíclica con un heteroátomo (conjugado cruzado (por ejemplo, quinona). Los sustituyentes, restos o grupos arilo están formados típicamente por seis, ocho, diez o más átomos de carbono aromáticos. Los sustituyentes, restos o grupos arilo están opcionalmente sustituidos. Arilos ilustrativos incluyen C<6>-C<10>arilos tales como fenilo y naftalenilo y fenantrilo. Como la aromaticidad en un resto arilo neutro requiere un número par o elecciones, se entenderá que un intervalo dado para ese resto no abarcará especies con un número impar de carbonos aromáticos. Cuando se usa arilo como un grupo Markush (es decir, un sustituyente), el arilo se une a una fórmula de Markush u otro resto orgánico con el que está asociado a través de un carbono aromático del grupo arilo.
En dependencia de la estructura, un grupo arilo puede ser monorradical (es decir, monovalente) o dirradical (es decir, un grupo arileno como se describe en la presente descripción, que es divalente).
"Arileno" o "heteroarileno" como se usa en la presente descripción por sí mismo o como parte de otro término, es un resto arilo o heteroarilo, grupo o sustituyente como se define en la presente descripción que forma dos enlaces covalentes (es decir, es divalente) dentro de un resto más grande, que puede estar en las configuraciones orto, meta o para o un resto dirradical aromático. Los arilenos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, fenil-1,2-eno, fenil-1,3-eno y fenil-1,4-eno como se muestra en las siguientes estructuras:
"Arilalquilo", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo donde un resto arilo está unido a un resto alquilo, es decir, -alquil-arilo, donde los grupos alquilo y arilo son como se describieron anteriormente, por ejemplo, -CH<2>-C<6>H<5>o -CH<2>CH(CH<3>)-C<6>H<5>. Cuando arilalquilo se usa como un grupo Markush (es decir, un sustituyente) el resto alquilo del arilalquilo está unido a una fórmula Markush con el que está asociado a través de un carbono sp3 del resto alquilo.
"Alquilarilo", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo en el que un resto alquilo está unido a un resto arilo, es decir, -aril-alquilo, donde los grupos arilo y alquilo son como se describieron anteriormente, por ejemplo, -C<6>H<4>-CH<3>o -C<6>H<4>-CH<2>CH(CH<3>). Cuando se usa alquilarilo como un grupo Markush (es decir, un sustituyente), el resto arilo del alquilarilo se une a una fórmula de Markush con la que está asociado a través de un carbono sp<2>del resto arilo.
"Alquilo opcionalmente sustituido", "alquenilo opcionalmente sustituido", "alquinilo opcionalmente sustituido", "alquilarilo opcionalmente sustituido", "arilalquilo opcionalmente sustituido", "heterociclo opcionalmente sustituido", "arilo opcionalmente sustituido", "heteroarilo opcionalmente sustituido", "opcionalmente alquilheteroarilo sustituido"," heteroarilalquilo opcionalmente sustituido "y términos similares se refieren a un alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilarilo, arilalquilo heterociclo, arilo, heteroarilo, alquilheteroarilo, heteroarilalquilo u otro sustituyente, resto o grupo como se define o describe en la presente descripción en donde el(los) átomo(s) de hidrógeno de ese sustituyente, resto o grupo se ha(n) reemplazado opcionalmente con diferente(s) resto(s) o grupo(s) o en donde una cadena de carbono alicíclico que comprende uno de esos sustituyentes, resto o grupo se interrumpe reemplazando átomo(s) de carbono de esa cadena con diferentes restos o grupos.
Los sustituyentes opcionales que reemplazan el(los) hidrógeno(s) en uno cualquiera de los anteriores sustituyentes, restos o grupos incluyen los seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, -CN, -NH<2>, -OH, -N(CH<3>)<2>, alquilo, fluoroalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, alquilsulfóxido, arilsulfóxido, alquilsulfona y arilsulfona o los seleccionados del grupo que consiste en halógeno, -CN, -NH<2>, -OH, -NH(CH<3>), -N(CH<3>)<2>, -C(=O)OH (es decir, CO<2>H), -C(=O)O-alquilo(i.e., CO<2>-alquilo), -C(=O)NH<2>, -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)<2>, -S(=O)<2>NH<2>, -S(=O)<2>NH(alquilo), -S(=O)<2>N(alquilo)<2>, alquilo, cicloalquilo, fluoroalquilo, heteroalquilo, alcoxi, fluoroalcoxi, -S-alquilo y -S(=O)<2>alquilo.
Típicamente, un sustituyente opcional que reemplaza hidrógeno(s) en cualquiera de los sustituyentes, restos o grupos anteriores se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, ciano, halógeno, nitro, haloalquilo, fluoroalquilo, y amino, incluyendo mono-, di- y tri-sustituidos grupos aminos, y los derivados de fluoralcoxi protegidos de los mismos, o se selecciona del grupo que consiste en halógeno, -CN, -NH<2>, -OH, -NH(CH<3>), -N(CH<3>)<2>, -CH<3>, -CH<2>CH<3>, -CF<3>, -OCH<3>, y -OCF<3>. Típicamente, cualquiera de los sustituyentes, restos o grupos anteriores que está opcionalmente sustituido mediante la sustitución de uno o más de sus hidrógenos tiene su(s) hidrógeno(s) sustituido(s) con uno o dos de los sustituyentes opcionales anteriores, o más típicamente con uno de los sustituyentes opcionales anteriores. Un sustituyente opcional en un átomo de carbono alifático saturado dentro de un sistema de anillo acíclico o cíclico incluye además oxo (=O). Para un resto fenilo o heteroarilo de 6 miembros, la disposición de dos sustituyentes cualesquiera presentes en el anillo aromático o heteroaromático puede ser orto (o), meta (m) o para (p).
Típicamente, un sustituyente opcional que reemplaza al carbono en una cadena de carbono acíclico se selecciona del grupo que consiste en -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)<2>-, -NH-, -NHC(=O)-, -C(=O)NH-, S(=O)<2>NH-, -NHS(=O)<2>, -OC(=O)NH-, y -NHC(=O)O-.
Típicamente, cualquiera de los sustituyentes, restos o grupos anteriores que está opcionalmente sustituido por reemplazo de uno o más átomos de carbono alicíclicos tiene el(los) átomo(s) de carbono reemplazado(s) con uno o dos de los sustituyentes opcionales anteriores, o más típicamente con uno de los sustituyentes opcionales anteriores.
"Heterociclilo", como se usa en la presente descripción, significa un resto, sustituyente o grupo carbocíclico monovalente parental que incluye cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo o una combinación fusionada de los mismos, en donde uno o más, pero no todos los átomos de carbono del esqueleto dentro de un anillo del resto carbocíclico parental se reemplaza independientemente por un heteroátomo, opcionalmente sustituido cuando se permite, incluyendo N, O, S, Se, B, Si, P, en donde dos o más heteroátomos pueden ser adyacentes entre sí o separados por uno o más átomos de carbono dentro del mismo sistema de anillo, típicamente por 1-3 átomos. Esos heteroátomos típicamente incluyen N, O o S. Por lo tanto, los heterociclos incluyen aquellos que tienen un anillo heteroaromático (también conocido como heteroarilo) o un anillo heterocicloalquilo, cualquiera de los cuales puede estar fusionado con un resto carbocíclico, arilo o heteroarilo e incluye restos heterocicloalquilo y heteroarilo fusionados con fenilo (es decir, benzo), siempre que cuando un resto heteroarilo se fusiona con un resto heterocicloalquilo o carbocíclico (es decir, cuando la parte heterocíclica del sistema de anillo condensado es monovalente), el sistema de anillo condensado resultante se clasifica como un heteroarilo y cuando un resto heterocicloalquilo se fusiona con un resto carbocíclico (es decir, cuando la porción carbocíclica del sistema de anillo condensado es monovalente), el sistema de anillo condensado resultante se clasifica como heterocicloalquilo.
Los heterociclos contienen típicamente un total de uno a cuatro heteroátomos en el(los) anillo(s), siempre que no todos los átomos del esqueleto de cualquier sistema de anillo en el resto heterocíclico sean heteroátomos, en donde cada heteroátomo en el(los) anillo(s), opcionalmente sustituido donde está permitido, se selecciona independientemente de O, S y N, en donde el grupo heterocíclico tiene un total de 4 a 10 átomos en su sistema de anillo monocíclico o condensado, y con la condición de que un anillo cualquiera no contenga dos átomos de O o S adyacentes. Los heterocicloalquilos tienen al menos 3 átomos en su sistema de anillo y los grupos heteroarilo tienen al menos 5 átomos en su sistema de anillo. Los heterociclos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, heterociclos y heteroarilos, que son heterociclos aromatizados, según lo proporcionado por Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs "(John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular los volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. 1960, 82:5545-5473 particularmente 5566-5573).
Los heteroarilos contienen típicamente un total de uno a cuatro heteroátomos en el(los) anillo(s) del sistema de anillo heteroarilo, siempre que no todos los átomos del esqueleto de cualquier sistema de anillo en el resto heterocíclico sean heteroátomos, opcionalmente sustituidos donde se permita, y tengan 0-3 átomos N, 1-3 átomos N o 0-3 átomos N con 0-1 átomos O o 0-1 átomos S, siempre que esté presente al menos un heteroátomo. Un heteroarilo puede ser monocíclico o bicíclico. El sistema de anillo de un anillo heteroarilo contiene típicamente de 1 a 9 carbonos (es decir, heteroarilo C<1>-C<9>). Los heteroarilos monocíclicos incluyen heteroarilos C<1>-C<5>. Los heteroarilos monocíclicos incluyen aquellos que tienen sistemas de anillo de 5 o 6 miembros. Un heteroarilo de 5 miembros es un heteroarilo C<1>-C<4>que contiene de 1 a 4 átomos de carbono y el número requerido de heteroátomos dentro de un sistema de anillo heteroaromático. Un heteroarilo de 6 miembros es un heteroarilo C<1>-C<5>que contiene de 1 a 5 átomos de carbono y el número requerido de heteroátomos dentro de un sistema de anillo heteroaromático. Los heteroarilos de 5 miembros incluyen heteroarilos C<1>, C<2>, C<3>y C<4>que tienen cuatro, tres, dos o un heteroátomo aromático, respectivamente, y los heteroarilos de 6 miembros incluyen heteroarilos C<2>, C<3>, C<4>y C<5>que tienen cuatro, tres, dos o un heteroátomo(s) aromático, respectivamente. Los heteroarilos C<1>-C<4>de 5 miembros se ejemplifican mediante restos monovalentes derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un carbono aromático o un electrón de un heteroátomo aromático, cuando se permite, de los siguientes compuestos de heterociclo parentales: pirrol, furano, tiofeno, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, imidazol, pirazol, triazol y tetrazol. Los heteroarilos C<2>-C<4>que tienen 6 miembros se ejemplifican por restos monovalentes derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un carbono aromático o un electrón de un heteroátomo aromático, cuando se permite, de los siguientes compuestos de heterociclo parentales: piridina, piridazina, pirimidina y triazina. Heteroarilos bicíclicos (es decir, heteroarilos que han fusionados anillos aromáticos en los que al menos uno es heteroaromático) incluyen heteroarilos C<6>-C<9>(es decir, restos heteroaromáticos que contienen un total de 6-9 átomos de carbono aromático y al menos un heteroátomo aromático). Algunos heteroarilos bicíclicos se ejemplifican mediante restos monovalentes derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un carbono aromático o un electrón de un heteroátomo aromático, cuando se permite, de un anillo heteroaromático de los siguientes compuestos parentales de heterociclo 6,5-bicíclico: benzofurano (O1), isobenzofurano (O1), indol (N1), isoindol (N1), indolizina (N1), indolina (N1), isoindolina (N1), purina (N4), bencimidazol (n2), indazol (n2), benzoxazol (N1O1), benzisoxazol (N1O1), benzodioxol (O2), benzofurazán (N2O1), benzotriazol (N3), benzotiofurano (S1), benzotiazol (NISI), benzotiadiazol (N2S). Otros heteroarilos bicíclicos se ejemplifican por restos monovalentes derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un carbono aromático o un electrón de un heteroátomo aromático, cuando se permite, de un anillo heteroaromático de los siguientes compuestos parentales de heterociclo 6,6-bicíclico: cromeno (O1), isocromo (O1), cromano (O1), isocromano (O1), benzodioxano (O2), quinolina (N1), isoquinolina (N1), quinolizina (N1), benzoxazina (N1O1), benzodiazina (N2), piridopiridina (N2), quinoxalina (N<2>), quinazolina (N2), cinolina (n2), ftalazina (N2), naftiridina (N2), pteridina (N4). Para los compuestos heteroaromáticos 5,6- y 6,6-bicíclicos anteriores, las expresiones entre paréntesis indican la composición de heteroátomos del sistema de anillo aromático condensado. En dependencia de la estructura, un grupo heteroarilo puede ser monorradical o dirradical (es decir, un grupo heteroarileno).
Más típicamente, un heteroarilo es un resto arilo en donde 1, 2 o 3 de los átomos de carbono del(de los) anillo(s) aromático(s) de un resto arilo parental están reemplazados por un heteroátomo, opcionalmente sustituido cuando se permite, incluidos N, O y S, siempre que expresiones no todos los átomos del esqueleto de cualquier sistema de anillo aromático en el resto arilo son reemplazados por heteroátomos y más típicamente son reemplazados por oxígeno (-O-), azufre (-S-) nitrógeno (=N-) o -NR- en donde R es -H, un grupo protector o alquilo, arilo o nitrógeno sustituido con otro resto orgánico de una manera que retiene el sistema cíclico conjugado, en donde el heteroátomo de nitrógeno, azufre u oxígeno participa en el sistema conjugado a través de enlaces pi con un átomo adyacente en el sistema de anillos o a través de un solo par de electrones en el heteroátomo.
Los ejemplos no limitantes de heteroarilos incluyen piridilo, tiazolilo, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, purinilo, imidazolilo, benzofuranilo, indolilo, isoindoilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piridazinilo, pirazinilo, bencilo-pirazinilo, benzotiopirano, benzotriazina, isoxazolilo, pirazolopirimidinilo, quinoxalinilo, tiadiazolilo, triazolilo y similares. Los heteroarilos monocíclicos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, piridinilo, imidazolilo, pirimidinilo, pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, piridazilinilo, triazinilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo y furazanilo.
Los ejemplos no limitativos de heterociclos que no son heteroarilos incluyen tetrahidrotiofenilo, tetrahidrofuranilo, indolinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, 2H-pirrolilo, 3H-indolilo, 4H-quinolizinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, piperazinilo, quinuclidinilo, morfolinilo y oxazolidinilo.
Típicamente, un heterocicloalquilo es un grupo cicloalquilo, resto o sustituyente en donde 1, 2 o 3 carbonos de la cadena cicloalquilo se reemplazan con un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y es un heterocicloalquilo C<2>-C<10>, más típicamente un heterocicloalquilo C<4>-C<10>. Los heterocicloalquilos no limitantes pueden contener 0-2 átomos de N, 0-2 átomos de O o 0-1 átomos de S o alguna combinación de los mismos, siempre que al menos uno de dichos heteroátomos esté presente en el sistema de anillo cíclico y pueda estar sustituido con uno o dos restos oxo (=O), como en pirrolidin-2-ona. Más típicamente, los heterocicloalquilos incluyen pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolinilo y monosacáridos.
Los heterocicloalquilos incluyen, a modo de ejemplo, pero no de forma limitativa, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, oxazolidinonilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, homopiridinxanil, tiomorfolinilo, oxazolidinxanil, tioxanil, oxazolidinxanil, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, pirrolin-2-ilo, pirrolin-3-ilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3azabiciclo[4.1.0]heptanilo, 3H-indolilo y quinolizinilo. Los heterocicloalquilos incluyen además todas las formas de anillo de carbohidratos, incluidos, entre otros, monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos.
Cuando se usa heterociclo como un grupo de Markush (es decir, un sustituyente), el heterociclo se une a una fórmula de Markush con la que está asociado a través de un carbono o un heteroátomo del heterociclo, donde tal unión no da como resultado un estado de oxidación de ese carbono o heteroátomo formal inestable o no permitida. Un heterociclo que está unido a C está unido a una molécula a través de un átomo de carbono que a veces se describe como -C <heterociclo, donde C <representa un átomo de carbono en un anillo de heterociclo. Un heterociclo que está unido a N es un heterociclo que contiene nitrógeno que está unido a un anillo de heterociclo de nitrógeno a veces descrito como -N<heterociclo donde N< representa un átomo de nitrógeno en un anillo heterocíclico. Por tanto, los heterociclos que contienen nitrógeno pueden estar enlazados en C o enlazados en N e incluyen sustituyentes pirrol, que pueden ser pirrol-1-ilo (enlazado a N) o pirrol-3-ilo (enlazado a C), sustituyentes imidazol, que pueden ser imidazol-1-ilo o imidazol-3-ilo (ambos unidos a N) o imidazol-2-ilo, imidazol-4-ilo o imidazol-5-ilo (todos los cuales están unidos a C).
Un "heteroarilo de nitrógeno de 5 miembros" es un resto heteroaromático de 5 miembros que contiene al menos un átomo de nitrógeno en su sistema de anillo aromático y es un heteroarilo monocíclico o está fusionado con un arilo u otro sistema de anillo de heteroarilo y puede contener uno o más de otros heteroátomos independientemente seleccionados tales como N, O o S. Los heteroarilos de 5 miembros ilustrativos incluyen tiazol, imidazol, oxazol, triazol, pirrolopirimidinas, pirazolopirimidinas, indol e isoindol.
"Heteroarilalquilo", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo en el que un resto heteroarilo está unido a un resto alquilo, es decir, -alquil-heteroarilo, donde los grupos alquilo y heteroarilo son como se describieron anteriormente. Cuando heteroarilalquilo se utiliza como un grupo Markush (es decir, un sustituyente) el resto alquilo del heteroarilalquilo está unido a una fórmula de Markush con el que está asociado a través de un carbono sp3 del resto alquilo.
"Alquilheteroarilo", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo en el que un resto heteroarilo está unido a un resto alquilo, es decir, -heteroaril-alquilo, donde los grupos heteroarilo y alquilo son como se describieron anteriormente. Cuando heteroarilalquilo se utiliza como un grupo Markush (es decir, un sustituyente) el resto heteroarilo del heteroarilalquilo está unido a una fórmula de Markush con el que está asociado a través de un carbono sp2 o heteroátomo del resto alquilo.
"Resto unido a O", "sustituyente unido a O" y términos similares como se usan en la presente descripción se refieren a un grupo o sustituyente que está unido a un resto directamente a través de un átomo de oxígeno del grupo o sustituyente. Un grupo unido a O puede ser monovalente incluyendo grupos tales como -OH, acetoxi (es decir, -OC (=O)CH<3>), aciloxi (es decir, -OC(=O)Ra, en donde Ra es -H, opcionalmente alquilo sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido o heterociclo opcionalmente sustituido), y además incluyen grupos monovalentes tales como ariloxi (Aril-O-), fenoxi (Ph-O-), heteroariloxi (heteroaril-O-), sililoxi, (es decir, R<3>SO-, en donde R independientemente es alquilo o arilo, opcionalmente sustituido), y -ORPR, en donde RPR es un grupo protector como se ha definido previamente, o un grupo unido a O puede ser divalente, es decir, =O o -X-(CH<2>)n-Y-, en donde X e Y son independientemente S y O y n es 2 a 3, para formar un sistema de anillo espiro con el carbono al que X e Y están unidos.
"Halógeno" o "halo", como se usa en la presente descripción, significa flúor, cloro, bromo o yodo y es típicamente -F o -Cl.
"Grupo protector", como se usa aquí, significa un resto que previene o reduce la capacidad del átomo o grupo funcional al que está unido de participar en reacciones no deseadas. Los grupos protectores típicos para átomos o grupos funcionales se proporcionan en Greene (1999), "Protective groups in organic synthesis, 3ra ed.", Wiley Interscience. En ocasiones, se usan grupos protectores de heteroátomos como oxígeno, azufre y nitrógeno para minimizar o evitar sus reacciones no deseadas con compuestos electrofílicos. Otras veces, el grupo protector se usa para reducir o eliminar la nucleofilicidad y/o basicidad del heteroátomo desprotegido. Los ejemplos no limitantes de oxígeno protegido se dan por -ORPR, en donde RPR es un grupo protector para hidroxilo, en el que el hidroxilo está típicamente protegido como un éster (por ejemplo, acetato, propionato o benzoato). Otros grupos protectores para hidroxilo evitan interferir con la nucleofilia de los reactivos organometálicos u otros reactivos altamente básicos, donde el hidroxilo está típicamente protegido como un éter, incluyendo alquil o heterocicloalquil éteres (por ejemplo, metil o tetrahidropiranil éteres), alcoximetil éteres (por ejemplo, metoximetilo o etoximetil éteres), aril éteres opcionalmente sustituidos y silil éteres (por ejemplo, trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), terc-butildifenilsililo (TBDPS), terc-butildimetilsililo (TBS/TBDMS), triisopropilsililo (TIPS) y [2-(TIPS)trimetilsilil)etoxi]-metilsililo (SEM)). Los grupos protectores de nitrógeno incluyen aquellos para aminas primarias o secundarias como en -NHRPR o -N(Rpr)2-, en donde al menos uno de RPR es un grupo protector de átomo de nitrógeno o ambos RPR juntos comprenden un grupo protector.
Un grupo protector es un protector adecuado cuando es capaz de prevenir o evitar reacciones secundarias no deseadas o pérdida prematura del grupo protector bajo las condiciones de reacción requeridas para efectuar la transformación química deseada en otra parte de la molécula y durante la purificación de la molécula recién formada cuando se desee, y puede eliminarse en condiciones que no afecten negativamente a la estructura ni la integridad estereoquímica de esa molécula recién formada. A modo de ejemplo y no de limitación, un grupo protector adecuado puede incluir los descritos previamente para proteger grupos funcionales. Un grupo protector adecuado es típicamente un grupo protector usado en reacciones de acoplamiento de péptidos.
"Ester", como se usa en la presente descripción, significa un sustituyente, resto o grupo que contiene una estructura -C(=O)-O- (es decir, grupo funcional éster) en donde el átomo de carbono de la estructura no está conectado directamente a otro heteroátomo y está conectado a -H u otro átomo de carbono de un resto orgánico, y el átomo de oxígeno monovalente está unido al mismo resto orgánico para proporcionar una lactona o un resto orgánico diferente. Típicamente, los ésteres comprenden o consisten en restos orgánicos que contienen de 1 a 50 átomos de carbono, normalmente de 1 a 20 átomos de carbono o más típicamente de 1 a 8 átomos de carbono y de 0 a 10 heteroátomos seleccionados independientemente (por ejemplo, O, S, N, P, Si, pero normalmente O, S y N), típicamente 0-2 donde los restos orgánicos están unidos a través de la estructura -C(O)-O- (es decir, a través del grupo funcional éster). Cuando un éster es un sustituyente o un grupo variable de una estructura de Markush, ese sustituyente está unido a la estructura a través del átomo de oxígeno monovalente del grupo funcional éster. En esos casos el resto orgánico unido al carbono carbonilo del grupo funcional éster comprende uno cualquiera de los grupos orgánicos descritos en la presente descripción, por ejemplo, restos alquilo C1-20, restos alquenilo C2-20, alquinilo C2-20, restos arilo C6-C10, heterociclos C4-8 o derivados sustituidos de cualquiera de estos, por ejemplo, que comprenden 1, 2, 3, 4 o más sustituyentes, donde cada sustituyente se elige independientemente. Los ésteres ilustrativos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, ésteres de acetato, propionato, isopropionato, isobutirato, butirato, tasa de valor, isovalerato, caproato, isocaproato, hexanoato, heptanoato, octanoato, fenilacetato o ésteres de benzoato.
"Éter", como se usa en la presente descripción, significa un resto orgánico, grupo o sustituyente que comprende 1, 2, 3, 4 o más restos -O- (es decir, oxi) que no están unidos a resto(s) carbonilo, usualmente 1 o 2, en donde no hay dos restos -O- inmediatamente adyacentes (es decir, unidos directamente) entre sí. Típicamente, una estructura de éter está compuesta por o consiste en la fórmula resto orgánico -O- en donde el resto orgánico es como se describe para un resto orgánico unido a un grupo funcional éster. Más típicamente, un resto, grupo o sustituyente éter tiene la fórmula de resto orgánico -O- en donde el resto orgánico es como se describe en la presente descripción para un grupo alquilo opcionalmente sustituido. Cuando se usa éter como grupo Markush (es decir, un sustituyente éter), el oxígeno del grupo funcional éter se une a una fórmula Markush con la que está asociado. Cuando se usa éter como sustituyente en un grupo Markush, a veces se denomina grupo "alcoxi". Alcoxi incluye sustituyentes éter C1-C4 tales como, a modo de ejemplo y sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi y butoxi.
"Amida" o "carboxamida", como se usa aquí, significa un resto que contiene una estructura -C(=O)N(R)2 o R-C(=O)N(R)- (es decir, grupo funcional carboxamida o amida, respectivamente) sin ningún otro heteroátomo unido directamente al carbono carbonilo de la estructura y donde R, seleccionado independientemente, es hidrógeno, un grupo protector o un resto orgánico en donde el resto orgánico es como se describe en la presente descripción para un resto orgánico unido a un grupo funcional éster y es típicamente un grupo alquilo opcionalmente sustituido. Típicamente, el hidrógeno o un resto orgánico, seleccionado independientemente de R, está unido al grupo funcional carboxamida o amida, en donde el resto orgánico también es como se describe en la presente descripción para un resto orgánico unido a un grupo funcional éster. Cuando se une a un resto orgánico, la estructura resultante está representada por el resto orgánico -C(=O)N(R)2, o resto orgánico R-C(=O)N(R)-. Cuando se menciona una amida como variable para una estructura de Markush, el nitrógeno de la amida se une a esa estructura. Para los sustituyentes carboxamida, el carbono carbonilo del grupo funcional amida está unido a la estructura Markush. Las amidas y carboxamidas se preparan típicamente condensando un haluro de ácido, tal como un cloruro de ácido, con una molécula que contiene una amina primaria o secundaria. Alternativamente, se usan reacciones de acoplamiento de amidas bien conocidas en la técnica de la síntesis de péptidos, que a menudo transcurren a través de un éster activado de una molécula que contiene ácido carboxílico. Se proporcionan preparaciones ilustrativas de enlaces amida a través de métodos de acoplamiento de péptidos en Benoiton (2006) Chemistry of peptide synthesis CRC Press, Bodansky "Peptide synthesis: A practical textbook" (1988) Springer-Verlag; Frinkin, M. y otros, "Peptide Synthesis" Ann. Rev. Biochem. (1974) 43: 419-443. Los reactivos usados en la preparación de ácidos carboxílicos activados se proporcionan en Han y otros, "Recent development of peptide coupling agents in organic synthesis" Tet. (2004) 60: 2447-2476.
"Carbonato" como se usa aquí, significa un sustituyente, resto o grupo que contiene una estructura -O-C (=O)-O- (es decir, grupo funcional carbonato). Típicamente, los grupos carbonato como se usan aquí comprenden o consisten en un resto orgánico, en donde el resto orgánico es como se describe en la presente descripción para un resto orgánico unido a un grupo funcional éster, unido a través de la estructura -O-C(=O)-O-, por ejemplo, resto orgánico -O-C(=O)-O-. Cuando se usa carbonato como grupo Markush (es decir, un sustituyente), uno de los átomos de oxígeno unidos por enlaces sencillos del grupo funcional carbonato se une a una fórmula de Markush con la que está asociado y el otro está unido a un átomo de carbono de un resto orgánico como se describió previamente para un resto orgánico unido a un grupo funcional éster.
"Carbamato" o "uretano" tal como se usa aquí significa un sustituyente, resto o grupo que contiene una estructura representada por -O-C(=O)N(Ra)- (es decir, grupo funcional carbamato) o -O-C(=O)N(Ra)<2>, -O-C(=O)NH(alquilo opcionalmente sustituido) o -O-C(=O)N(alquilo opcionalmente sustituido^ (es decir, sustituyentes carbamato ilustrativos) en donde Ra y alquilo opcionalmente sustituido se seleccionan independientemente en donde Ra, seleccionado independientemente, es hidrógeno, un grupo protector o un resto orgánico, en donde el resto orgánico es como se describe en la presente descripción para un resto orgánico unido a un grupo funcional éster y es típicamente un grupo alquilo opcionalmente sustituido. Típicamente, grupos carbamato como se usa en la presente invención comprenden o consisten en un resto orgánico, seleccionado independientemente de Ra, en donde el resto orgánico es como se describe en la presente descripción para un resto orgánico unido a un grupo éster funcional, unido a través de la estructura -O-C(=O)-N(Ra)-, en donde la estructura resultante tiene la fórmula del resto orgánico -O-C(=O)-N(Ra)- o resto orgánico -O-C(=O)-N(Ra)-. Cuando se usa carbamato como grupo de Markush (es decir, un sustituyente), el oxígeno (unido a O) o nitrógeno (unido a N) con enlaces sencillos del grupo funcional carbamato se une a una fórmula de Markush con la que está asociado. El enlace del sustituyente carbamato se indica explícitamente (unido a N o a O) o está implícito en el contexto al que se refiere este sustituyente.
"Urea" tal como se usa aquí significa un sustituyente, resto o grupo que contiene una estructura representada por -N(Ra)-C(=O)N(Ra)- (es decir, grupo funcional urea) y por lo general está representado por -NH-C(=O)NH (alquilo opcionalmente sustituido) o -NH-C(=O)N(alquilo opcionalmente sustituido)<2>-(es decir, alquilo opcionalmente sustituido son sustituyentes ilustrativos de urea), en donde Ra y alquilo opcionalmente sustituidos son seleccionado de forma independiente con cada Ra es independientemente -H, un grupo protector o un resto orgánico como se describe para un resto orgánico unido a un grupo éster funcional. Cuando un resto orgánico está unido a través de un grupo funcional urea la estructura resultante se representa por el resto orgánico -N(Ra)-C(=O)-N(Ra)- o el resto orgánico -N(Ra)-C(=O)-N(Ra)-. Cuando se usa urea como grupo Markush (es decir, como sustituyente), un nitrógeno de enlace simple del grupo funcional urea se une a una fórmula de Markush con la que está asociado, mientras que el otro nitrógeno de enlace simple no está sustituido o es mono o disustituido con uno o dos otros restos orgánicos seleccionados independientemente, en donde el(los) resto(s) orgánico(s) son como se describe en la presente descripción para un resto orgánico unido a un éster de grupo funcional éster.
"Anticuerpo", como se usa en este documento, se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos que muestran la actividad biológica deseada siempre que el fragmento de anticuerpo tenga el número necesario de sitios de unión para un enlazador-fármaco. La forma nativa de un anticuerpo es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de la cadena ligera y pesada (VL y VH) juntas son responsables principalmente de la unión a un antígeno. Los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada consisten en una región marco interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones constantes pueden ser reconocidas e interactuar con el sistema inmunitario(ver, por ejemplo,Janeway y otros, 2001, Immunol. Biology, 5ta Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. El anticuerpo puede derivarse de cualquier especie adecuada. En algunas modalidades, el anticuerpo es de origen humano o murino. Un anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano, humanizado o quimérico. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo es un resto de direccionamiento de ligando ilustrativo que se incorpora en un LDC de la presente invención.
En algunos aspectos, un anticuerpo se une selectiva y específicamente a un epítopo en células hiperproliferativas o células de mamíferos hiperestimuladas (es decir, células anómalas), en donde el epítopo se presenta preferentemente por o es más característico de las células anómalas en contraste con las células normales, o se presenta preferentemente por o es más característico de las células normales en la vecindad de las células anómalas en contraste con las células normales no localizadas en las células anómalas. En esos aspectos, las células de mamífero son típicamente células humanas.
"Anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por algún método en particular.
"Actividad citotóxica" se refiere a un efecto de destrucción celular de un fármaco o conjugado ligando-fármaco o un metabolito intracelular de un conjugado ligando-fármaco. La actividad citotóxica puede expresarse como el valor de IC<50>, que es la concentración (molar o en masa) por unidad de volumen a la que la mitad de las células sobreviven.
"Actividad citostática", como se usa en la presente descripción, se refiere a un efecto antiproliferativo de un fármaco, conjugado ligando-fármaco o un metabolito intracelular de un conjugado ligando-fármaco que no depende de la muerte celular pero cuyo efecto se debe a la inhibición de la división celular de células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperestimuladas u otras células anómalas o no deseadas.
Los términos "unión específica" y "se une específicamente" significan que un anticuerpo o anticuerpo en un LDC como el resto de direccionamiento es capaz de unirse, de una manera altamente selectiva, con su antígeno diana correspondiente y no con una multitud de otros antígenos. Típicamente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1 x 10'7 M, y preferentemente 10'8 M a 10'9 M, 10'1° M, 10'11 M o 10-12 M y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto de un antígeno estrechamente relacionado.
"Conjugado ligando-fármaco" o "LDC", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a una construcción compuesta por una unidad de ligando de un resto de direccionamiento y una unidad de fármaco que contiene amina terciaria cuaternizada (D+) correspondiente en estructura a una amina terciaria que contienen fármaco que se unen entre sí a través de una unidad de enlace, en donde el LDC se une selectivamente a un resto diana a través de su unidad de ligando. En algunos casos, el término LDC es una pluralidad (es decir, composición) de compuestos LDC individuales que se diferencian principalmente por el número de unidades D+ unidas a cada Unidad de Ligando o la ubicación en la Unidad de Ligando en la que se unen las unidades D+. En otros casos, el término LDC se aplica a un miembro individual de la composición.
"Resto de direccionamiento", como se usa el término en la presente descripción, es un resto incorporado como una unidad de ligando en un LDC que se une selectivamente a un resto diana típicamente presente en, dentro o en las proximidades de células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperestimuladas u otras células anómalas o no deseadas en comparación con otros restos presentes en, dentro o en las proximidades de las células normales donde estas células anómalas o no deseadas típicamente no están presentes. A veces, un resto diana está presente en, dentro o en las proximidades de anómalas en mayor abundancia en comparación con las células normales o el entorno de células normales donde las células anómalas normalmente no están presentes. En algunos casos, el resto de direccionamiento es un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno accesible característico de una célula anómala o es un antígeno accesible que es particular del entorno circundante en el que se encuentran estas células. En otros casos, el resto de direccionamiento es un ligando que se une específicamente a un receptor accesible característico de, o en mayor abundancia en, células anómalas u otras células no deseadas, o es un receptor accesible que es particular para las células del entorno circundante en el que las células anómalas se encuentran. Típicamente, un resto de direccionamiento es un anticuerpo como se define en la presente descripción que se une selectivamente a un resto diana de una célula de mamífero anómala o no deseada, más típicamente un resto diana de una célula humana anómala o no deseada.
"Células diana", como se usa el término en la presente descripción, son las células deseadas (es decir, células anómalas u otras células no deseadas) con las que un LDC está diseñada para interactuar con el fin de inhibir la proliferación u otra actividad no deseada de las células deseadas. En algunos casos, las células diana son células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperactivas, que son células anómalas ilustrativas. Típicamente, esas células anómalas son células de mamífero y más típicamente son células humanas. En otros casos, las células diana están cerca de células anómalas o no deseadas, de manera que la acción del LDC sobre las células cercanas tiene un efecto deseado sobre las células anómalas o no deseadas. Por ejemplo, las células cercanas pueden ser células epiteliales que son características de la vasculatura anómala de un tumor. La selección de esas células vasculares por un LDC tendrá un efecto citotóxico o citostático sobre estas células, lo que inhibe la entrega de nutrientes a las células anómalas del tumor para tener indirectamente un efecto citotóxico o citostático sobre las células anómalas, y/o tener un efecto directo efecto citotóxico o citostático sobre las células anómalas al liberar un resto de fármaco activo en las proximidades de estas células.
"Resto diana", como se usa el término en la presente descripción, es un resto reconocido preferentemente por un resto de direccionamiento o unidad de ligando de un conjugado ligando-fármaco de ese resto de direccionamiento (es decir, está unido selectivamente por la unidad de ligando) y está presente en, dentro o en las proximidades de las células diana. A veces, el resto diana es un antígeno accesible para la unión selectiva por un anticuerpo, que es una fracción diana ilustrativa que se incorpora en un LDC como una unidad de ligando. En esos casos, tal un antígeno es una proteína de la superficie celular presente en células anómalas u otras células no deseadas, o está presente en células que son particulares del entorno circundante en el que se encuentran las células anómalas o no deseadas, como las células vasculares que son característica del entorno de células hiperproliferativas en un tumor. Más típicamente, el antígeno es una proteína de la superficie celular de una célula anómala u otra célula no deseada que es capaz de internalizarse al unirse con su ligando diana afín. En otros casos, el resto de direccionamiento es un ligando para un receptor de membrana celular accesible extracelularmente que puede internalizarse tras la unión del resto de direccionamiento o es capaz de un transporte pasivo o facilitador del LDC que se dirige al receptor de superficie celular. En algunos aspectos, el resto diana está presente en células de mamíferos anómalas o en células de mamíferos características del entorno de tales células anómalas.
"Conjugado anticuerpo-fármaco" o "ADC", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a un LDC en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo, en donde el anticuerpo está unido covalentemente a una unidad de fármaco cuaternizada (D+), típicamente a través de una unidad enlazadora intermedia. A menudo, el término se refiere a una colección (es decir, población o pluralidad) de conjugados que tienen el mismo anticuerpo, unidad de fármaco y unidad enlazadora, pero que tienen una carga o distribución variable del resto enlazadorfármaco para cada anticuerpo (como por ejemplo cuando el número de D+ dos ADC cualesquiera en una pluralidad de tales construcciones es la misma, pero la ubicación de sus sitios de unión al resto de direccionamiento difiere). En esos casos, un ADC se describe mediante la carga de fármaco promedio de los conjugados. Un ADC obtenido a partir de los métodos descritos en la presente descripción tiene la estructura general de Ab-Lb-Lo-D+ en donde Lb-Lo define la unidad enlazadora en donde Lb es un resto de unión covalente de ligando a veces denominado enlazador primario (Lr) enlazador, llamada así porque ese resto es necesario para estar presente en una unidad de ligando de un ADC, Lo es un enlazador secundario susceptible a escisión enzimática (por ejemplo, proteasa o glicosidasa) o no enzimática (por ejemplo, reductiva o hidrolítica). En algunos casos, la escisión aumenta en el entorno de lo anómalo o se produce después de la internalización intracelular del ADC posterior a la unión del anticuerpo de dirección del ADC a su antígeno afín. D+ es una amina terciaria cuaternizada que contiene la unidad de fármaco D en donde D se libera como resultado de esa acción enzimática o no enzimática sobre Lo.
El número promedio de unidades de ligando por anticuerpo, o fragmento del mismo, en una composición de ADC (es decir, un número promedio para una población de conjugados de ADC que difieren por el número de unidades de fármaco conjugado o su ubicación en cada uno de los ADC que están presentes en esa población) se designa como p o cuando los enlazadores no están ramificados, p es el número medio de restos de fármaco enlazador. En ese contexto, p es un número que varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 y típicamente es aproximadamente 2, aproximadamente 4 o aproximadamente 8. En otros contextos, p representa el número de unidades de fármaco, o unidades enlazador-fármaco cuando los enlazadores no están ramificados, que están unidos covalentemente a un solo anticuerpo de un ADC dentro de una población de conjugados anticuerpo-fármaco que difieren en el número o ubicación de unidades conjugadas enlazador-fármaco en cada uno de los ADC, y se designa como p'. En ese contenido, p' es un número entero que varía de 1 a 20, típicamente de 1 a 12, de 1 a 10 y más típicamente de 1 a 8.
El número promedio de unidades de fármacos por unidad de ligando en una preparación a partir de una reacción de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA, HIC y/o HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los conjugados fármaco-enlazadorligando en términos de p. En algunos casos, la separación, la purificación y la caracterización de los conjugados ligando-fármaco homogéneos, en donde p es un cierto valor del conjugado ligando-fármaco con otras cargas de fármaco, puede lograrse por medios como HPLC de fase inversa o electroforesis.
"Antígeno" es una entidad que es capaz de unirse selectivamente a un anticuerpo no conjugado o un fragmento del mismo o a un ADC que comprende una Unidad de Ligando de un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunos aspectos, el antígeno es una proteína, glicoproteína o carbohidrato de la superficie celular accesible extracelularmente que se presenta preferentemente por células anómalas u otras células no deseadas en comparación con las células normales. En algunos casos, las células no deseadas que tienen el antígeno son células hiperproliferativas en un mamífero. En otros casos, las células no deseadas que tienen el antígeno son células inmunitarias hiperactivas en un mamífero. En otros aspectos, el antígeno unido específicamente está presente en el entorno particular de células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperactivas en un mamífero en contraste con el entorno que experimentan típicamente las células normales en ausencia de tales células anómalas. En otros aspectos más, el antígeno de la superficie celular es capaz de internalizarse tras la unión selectiva de un ADC asociado con células que son particulares del entorno en el que se encuentran células inmunitarias hiperproliferativas o hiperestimuladas en ausencia de tales células anómalas. Un antígeno es una fracción diana ilustrativa de un LDC en la que su unidad de ligando del resto diana es un anticuerpo que reconoce preferentemente ese antígeno a través de la unión selectiva.
Los antígenos asociados con células hiperproliferativas que son accesibles en la superficie celular a un ADC incluyen a modo de ejemplo y no de limitación CD19, CD70, CD30, CD33, NTB-A, avp6 y CD123.
"Fracción de unión covalente del ligando" es una fracción que comprende un LCD que se une selectivamente a su fracción diana afín y que a veces se denomina fracción diana. Una fracción de unión covalente ligando incluye, sin limitación, ligandos receptores, anticuerpos contra antígenos de la superficie celular y sustratos transportadores. A veces, el receptor, el antígeno o el transportador que debe unir un LDC está presente en mayor abundancia en las células anormales en contraste con las células normales. Otras veces, el receptor, antígeno o transportador que debe unirse a un LDC está presente en mayor abundancia en las células anormales en contraste con las células normales.
"Precursor del resto de unión covalente de ligando" es un resto de una unidad de enlazador, o una subestructura de la misma utilizada en la preparación de una unidad de enlazador, que es capaz de unirse covalentemente a un resto de direccionamiento durante la preparación de un LDC con lo cual el precursor de la mitad de unión al ligando Lb') se convierte en un resto de unión covalente de ligando (Lb). En algunos aspectos, un resto Lb' típicamente tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con un nucleófilo o electrófilo nativo de un anticuerpo o fragmento del mismo o se introduce en un anticuerpo mediante transformación química o ingeniería genética. En algún aspecto, el nucleófilo es un grupo amino N-terminal de un péptido que comprende un anticuerpo o el grupo amino épsilon de un residuo de lisina. En otros aspectos, el nucleófilo es un grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína introducido por ingeniería genética o por reducción química de un disulfuro intercatenario de un anticuerpo. En algunos aspectos, el electrófilo es un aldehído introducido por oxidación selectiva del resto carbohidrato de un anticuerpo o es una cetona de un aminoácido no natural introducido en un anticuerpo usando un par de ARNt/ARNt sintetasa genéticamente modificado. Estos y otros métodos son revisados por Behrens y Liu "Methods for site-specific drug conjugation to antibodies" mAB (2014) 6(1): 46-53.
"Fracción de unión covalente de ligando" es una fracción de una unidad de ligando en un LDC que se une covalentemente al resto de la unidad de ligando que se dirige a las células anormales o no deseadas o a su entorno y se deriva de la reacción del Lb' correspondiente en un precursor de unidad de ligando con la fracción de direccionamiento. Por ejemplo, cuando Lb' está compuesto por un resto maleimida, la reacción de ese resto con un grupo sulfhidrilo reactivo de un resto dirigido convierte Lb' en Lb que está compuesto por un resto succinimida tio sustituido. En otro ejemplo, cuando Lb' está compuesto por un grupo funcional de ácido carboxílico activado, la reacción de ese grupo funcional con un grupo amino épsilon de una lisina en un resto de direccionamiento convierte el grupo funcional en una amida, en donde esa amida comprende el Lb resto de la unidad ligando adjunta. Otros restos Lb y su conversión de Lb' restos que contiene se describen en las modalidades de la invención. En algunos casos, un resto de direccionamiento se deriva con una molécula bifuncional para proporcionar un intermedio que se condensa con un resto precursor de unión covalente de ligando. Como resultado de esa condensación, el resto Lb así formado tiene átomos atribuibles a la molécula bifuncional y Lb'.
"Unidad enlazadora", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a un resto orgánico en un conjugado de fármaco y ligando (LDC) intermedio entre una unidad de fármaco cuaternizada (D+) y una unidad de ligando de un resto de direccionamiento y unida covalentemente a una unidad de fármaco cuaternizada. Típicamente, una unidad enlazadora (L) está compuesta por un resto de unión covalente de ligando (Lb) o un resto precursor de unión covalente de ligando (Lb') y un resto enlazador secundario como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos, el precursor de unión covalente del ligando contiene un resto maleimida (M1). La unión del resto de direccionamiento a través de M1se produce a través de un grupo sulfhidrilo de cisteína del resto de direccionamiento mediante la adición de Michael del grupo sulfhidrilo al sistema de anillo de maleimida de M1. Como resultado de esa adición, se obtiene un resto de succinimida (M2) que tiene un sistema de anillo de succinimida sustituido con azufre. La hidrólisis posterior de ese sistema de anillo, ya sea espontáneamente o en condiciones controladas, como cuando ese sistema es parte de un resto enlazador autoestabilizante (L<ss>), da como resultado un resto ácido succínico-amida (M3), que es un resto estabilizado (Ls) ilustrativo, como se describe adicionalmente en la presente descripción. También unido covalentemente a Lb o Lb', que son enlazadores primarios (restos Lr), hay un resto enlazador secundario (Lo), que además interviene entre el resto de direccionamiento y la unidad de fármaco cuaternizada en un LDC y está enlazado covalentemente a Lr a través de intermediación de un éter, éster, carbonato, urea, disulfuro, amida o grupo funcional carbamato, más típicamente a través de un éter, amida o grupo funcional carbamato.
"Enlazador primario", como se usa, es un resto de unión covalente de ligando (Lb) o un precursor de resto de unión covalente de ligando (Lb') y está presente como un componente de una unidad de Enlazador de un LDC o como un componente de un resto que contiene Lb' tal como Lb'-Lo o Lb'-Lo-D+. El enlazador primario A Lb' está compuesto por un grupo funcional reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional electrófilo o nucleófilo de un resto de direccionamiento. Como resultado de esa reacción, el resto de direccionamiento se une covalentemente como una unidad de ligando a un enlazador primario Lb a través de un grupo funcional derivado del grupo funcional reactivo de Lb'.
El resto "enlazador secundario", como se usa en la presente descripción, se refiere a un resto orgánico en una unidad enlazadora en donde el enlazador secundario (Lo) está unido covalentemente a un resto Lb o Lb' (es decir, una unidad enlazadora primaria) a través de un grupo funcional entre el resto Lb o Lb' y el resto de la unidad enlazadora al que se puede unir covalentemente una unidad de fármaco cuaternizada. En un LDC, el enlazador secundario también se une covalentemente a una unidad de fármaco cuaternizada (D+) a través de la posición bencílica de un resto autodestructivo de tipo PAB o PAB que comprende una unidad espaciadora. Además de una unidad espaciadora (Y), los conectores secundarios se componen de un divisible (W) en el que W, Y y D+ están dispuestos en una relación lineal u ortogonal y pueden estar compuestos además por una unidad de extensión (A). Cuando está presente, A a veces comprende una subunidad A1, que es un resto de armazón que interconecta el grupo funcional reactivo de Lb', o el grupo funcional de Lb derivado del mismo, con el resto del enlazador secundario.
En un LDC, Lo se compone de una unidad espaciadora (Y) que contiene un resto autodestructivo (SI) unido covalentemente a una unidad de resto escindible (W) de manera que la escisión de W en condiciones más probables experimentadas por o en las proximidades de células anómalas en comparación con las células normales o su entorno normal da como resultado la autodestrucción del resto autoemolizante con la liberación concomitante de D. Por lo general, esa autodestrucción ocurre a través de una eliminación 1,6 en un resto SI como se describe en la presente descripción. En esos casos, el SI se une a un fármaco que contiene una amina terciaria mediante la cuaternización del nitrógeno de la amina terciaria de ese fármaco.
Un enlazador secundario (Lo) cuando se une a D+ se representa típicamente por la estructura de (1) o (2):
en donde Aa es una unidad extensora; Wwy Ww' son unidades divisibles; e Yy es una unidad espaciadora, en donde a es 0 o 1, w o w' es 1 e y es 1. Cuando a es 1, la línea ondulada antes de Aa indica un enlace covalente de esa subunidad Lo con Lb' o Lb (resultante de Lb' después de su incorporación en un LDC). Cuando a es 0, esa línea ondulada indica la unión covalente de Lb' o Lb a una unidad Escindible W en la estructura (1) o Y en la estructura (2).
En algunos aspectos de la invención, Y en la estructura (1) está compuesta por o consiste en un resto autodestructivo (SI) como se describe en la presente descripción sustituido con W y D+. En otros aspectos de la invención, Y en la estructura (2) está compuesta por o consiste en un resto autodestructivo como se describe en la presente descripción sustituido con D+ a través de un nitrógeno de amina cuaternaria y además está sustituido con W y Ligando-Lb-A- o Lb'-A-, en donde A está opcionalmente presente (es decir, A está unido al SI de Y cuando A está presente o Lb o Lb' está unido al SI de Y cuando A está ausente).
Típicamente, los enlazadores secundarios con estructura (1) están representados por
y los enlazadores secundarios con estructura (2) están representados por
en donde Y consiste en SI y E, J, V, Z1, Z2, Z3, R', R8 y R9 son como se definen en modalidades para PAB o unidades autodestructivas de tipo PAB.
"Resto de maleimida", como se usa en la presente descripción, es un resto precursor de unión covalente de ligando que tiene un sistema de anillo de maleimida. Un resto de maleimida (M1) es capaz de participar en la adición de Michael (es decir, adición de 1,4-conjugado) de un grupo sulfhidrilo derivado del resto de direccionamiento para proporcionar un resto de succinimida (M2) tio-sustituido, como se describe en la presente descripción, que estará presente en una unidad Enlazadora en un LDC. Un resto M1 está unido a lo que resta de la unidad de enlazador, a través de su nitrógeno de imida antes de su conversión a un resto de succinimida tio-sustituido. Aparte del nitrógeno de imida, un resto M1está típicamente no sustituido, pero puede ser sustituido asimétricamente en el doble enlace cíclico de su sistema de anillo de maleimida. Tal sustitución típicamente da como resultado la adición regioquímicamente preferida de un grupo sulfhidrilo al carbono de doble enlace menos impedido o más electrónicamente deficiente (que depende de la contribución más dominante) del sistema de anillo de maleimida. Cuando está presente en un resto enlazador autoestabilizante (Lss), se espera que la hidrólisis controlada del sistema de anillo succinimida del resto succinimida tio-sustituido M2derivado de dicho resto M1sustituido proporcione isómeros regioquímicos de restos de ácido succínico-amida (M3) en un resto enlazador autoestabilizado (Ls) que se deben a diferencias en la reactividad de los dos carbonilos de M2atribuibles al sustituyente o sustituyentes que estaban presentes en el precursor M1.
"Resto de succinimida", como se usa en la presente descripción, es un resto orgánico del cual una unidad enlazadora está comprendida en un ADC y resulta de la adición de Michael de un grupo sulfhidrilo derivado de anticuerpo al sistema de anillo maleimida de un resto maleimida (M1). Por tanto, un resto de succinimida (M2) está compuesto por un sistema de anillo de succinimida tio-sustituido y tiene su nitrógeno de imida sustituido con el resto de la unidad enlazadora y está opcionalmente sustituido con sustituyente(s) que estaban presentes en el precursor M1. Típicamente, cuando A está presente el nitrógeno de imida se une covalentemente a un resto extensor (A) o subunidad del mismo (es decir, A1) como se describe en la presente descripción. A veces, M2-A (o M2-A1) proporciona un resto enlazador autoestabilizante (Lss) como se describe en la presente descripción.
"Resto de ácido succínico-amida", como se usa en la presente descripción, se refiere a ácido succínico que tiene un sustituyente amida que resulta del sistema de anillo succinimida tio-sustituido de un resto succinimida M2que ha sufrido la rotura de uno de sus enlaces carbonil-nitrógeno por hidrólisis. La hidrólisis que da como resultado un resto de ácido succínico-amida (M3) proporciona una unidad enlazadora con menos probabilidades de sufrir una pérdida prematura de un anticuerpo en un LDC que tiene ese resto M3a través de la eliminación del sustituyente tioanticuerpo. Cuando está presente en un resto enlazador autoestabilizante (Lss), se espera que la hidrólisis controlada del sistema de anillo succinimida del resto succinimida sustituido con tio M2derivado de tal un resto M1sustituido proporcione isómeros regioquímicos de restos M3(individualmente denominados M3A y M3B) que se deben a diferencias en la reactividad de los dos carbonilos de carbono de M2atribuibles al sustituyente o sustituyentes que estaban presentes en el precursor M1
"Enlazador autoestibilizante", como se usa en la presente descripción es un Lb que contiene resto de la unidad de Enlazador de un LDC, o precursor del mismo (es decir, un resto que contiene Lb') que bajo condiciones controladas es capaz de experimentar una transformación química a una resto enlazador autoestabilizado (Ls), de manera que un LDC inicialmente compuesto por un resto autoestabilizante (L<ss>) se vuelve más resistente a la pérdida prematura del resto de direccionamiento del LDC. Típicamente, un resto Lss además de un resto Lb o Lb' está compuesto por una unidad de extensión o una subunidad de la misma. En algunos casos que tienen Lss, W e Y en una disposición lineal, Lss se une covalentemente a través de una unidad de extensión u otra subunidad de la misma a una unidad escindible (W). En otros de esos casos que tienen W ortogonal a Lss-Y, Lss se une covalentemente a Y a través de una unidad de extensión u otra subunidad de la misma. Sin embargo, a veces no hay A intermedio presente y L<ss>se une covalentemente directamente a W o Y en dependencia de la disposición relativa de los componentes del enlazador L<ss>, W e Y. En algunos aspectos, un L<ss>antes de su incorporación en un LDC contiene un resto maleimida (M1) como el resto Lb' (a través del cual se unirá un resto de direccionamiento) y una unidad de extensión (A) o subunidad de la misma (es decir, A1) y está representado por la fórmula de M1-A o M1-A1. Después de la incorporación en un LDC (es decir, después de la unión del resto de direccionamiento a través de la adición de Michael al resto maleimida) el resto M1-A (o M1-A1) de un Lss se convierte en su resto succinimida sustituido con tio correspondiente M2-A (<o>M2-A1). Usualmente, L<ss>también comprende una unidad básica (BU) como se describe en la presente descripción como un sustituyente de una unidad de extensión unida a M2o su precursor M1. En esos aspectos, BU ayuda en la hidrólisis del resto succinimida de M2a su correspondiente forma de anillo abierto M3[es decir, M2-A(BU)- o M2-A1(BU) - se convierte en M3-A(BU) o M3-A1(BU)].
El "enlazador autoestabilizado" es un resto orgánico derivado de un resto Lss, ambos restos que contienen Lb, de un LDC que se ha sometido a hidrólisis, normalmente en condiciones controladas, para proporcionar un nuevo resto que contiene Lb que es menos probable que revertir la reacción de condensación de un resto de direccionamiento con un Lb' que contiene resto que proporciona el resto que contiene el Lb original. Por lo general, un enlazador autoestabilizado (Ls) está compuesto por una unidad de extensión o subunidad de la misma unida covalentemente a un resto obtenido a partir de la conversión de un resto succinimida (M2), que tiene un sistema de anillo succinimida tio-sustituido resultante de la adición de Michael de un grupo sulfhidrilo de un resto dirigido al sistema de anillo maleimida de M1, a otro resto en el que ese resto derivado de M2tiene una reactividad reducida para la eliminación de su sustituyente tio en comparación con el sustituyente correspondiente en M2. En esos aspectos, el resto derivado de M2tiene la estructura de un resto ácido succínico-amida (M3) correspondiente a M2en donde M2ha sufrido la hidrólisis de uno de sus enlaces carbonil-nitrógeno de su sistema de anillo succinimida. Esa hidrólisis puede ocurrir espontáneamente o más típicamente es catalizada por el grupo funcional básico de BU que está unido covalentemente a una unidad de extensión unida a M2y está en la proximidad apropiada como resultado de esa unión para ayudar en la ruptura del nitrógeno carbonilo. El producto de esa hidrólisis tiene por tanto una función ácido carboxílico y una función amida sustituida en su nitrógeno amida, que corresponde al nitrógeno imida en el precursor L<ss>que contiene M2, por la estructura de la unidad de extensión antes mencionada. Normalmente, ese grupo funcional básico es un grupo amino cuya reactividad para la hidrólisis catalizada por bases está controlada por el pH. Por lo tanto, un enlazador autoestabilizado (Ls ) típicamente tiene la estructura de M3enlazado covalentemente a una unidad de armazón o subunidad de la misma que a su vez está enlazado covalentemente a lo que resta del enlazador secundario Lo (L<o>') en una disposición lineal y con la unidad básica unida covalentemente a la unidad de extensión unida a M3ortogonal a Lo. L<s>con M3, A, BU y Lo dispuestos de la manera indicada se representa mediante la fórmula de M3-A (BU)-Lo' o M3-A-i(BU)-Lo'.
Después de la hidrólisis, el enlazador autoestabilizado resultante (Ls) típicamente tiene la estructura de M3enlazado covalentemente a la unidad de extensión sustituida con (M3-A(B<u>)- o M3A-<i>(BU)-). Esa unidad de extensión, a su vez, está unida covalentemente a lo que resta de L<o>(L<o>') en una disposición lineal con la unidad básica dispuesta ortogonalmente con respecto a M3y las otras unidades componentes Lo. Las estructuras ilustrativas de restos L<ss>y Ls con M2o M3, A(BU) [o A-i(BU)] y Lo' dispuestos de la manera indicada se muestran a modo de ejemplo pero sin limitación por:
en donde el resto CH(CH<2>NH<2>)C(=O) indicado es la estructura de la unidad de extensión, o subunidad de la misma, unida covalentemente a la imida del nitrógeno amídico de M2 o M3 donde el resto -CH2NH2 es el sustituyente BU de esa unidad de extensión. El resto de las estructuras representa el resto succinimida M2 o el resto ácido succínicoamida M3 de la hidrólisis del anillo succinimida de M2, que están sustituidos en la imida o el nitrógeno amida correspondiente con un carbono sp3 de la unidad de extensión. La línea ondulada indica la unión de un grupo sulfhidrilo derivado de una fracción diana resultante de la adición de Michael de ese grupo al sistema de anillo de maleimida de M1. Dado que el sistema de anillo de succinimida de M2 está asimétricamente sustituido debido a su sustituyente tio derivado del resto de direccionamiento, los isómeros regioquímicos de los restos de ácido succínicoamida (M3) como se definen en la presente descripción que difieren en posición con respecto al grupo de ácido carboxílico liberado típicamente resultarán de la hidrólisis de M2. En la estructura anterior, el carbonilo de la unidad de extensión indicada ejemplifica un potenciador de la hidrólisis (HE) como se define en la presente descripción que se incorpora en la estructura de tal una unidad.
M3-A(BU) representa estructuras ilustrativas de restos de enlazador autoestabilizados (L<s>), ya que es menos probable que estas estructuras eliminen el sustituyente tio del resto de direccionamiento y, por lo tanto, provoquen la pérdida de ese resto, en comparación con el correspondiente Estructura M2-A(BU) de un resto L<ss>. Esa estabilidad aumentada resulta de la mayor flexibilidad conformacional en M3 en comparación con M2, que ya no limita al sustituyente tio en una conformación favorable para la eliminación de E2.
"Unidad básica", como se usa en la presente descripción, es un resto orgánico dentro de un resto enlazador autoestabilizante (L<ss>), como se describe en la presente descripción, que se puede llevar a un resto L<s>correspondiente al participar en la hidrólisis asistida por bases del sistema de anillo de succinimida dentro de un resto M2 que comprende Lss (es decir, cataliza la adición de agua de una molécula de agua a uno de los enlaces carbonil-nitrógeno de succinimida) y puede iniciarse en condiciones controladas tolerables por el resto de direccionamiento unido a Lss. Para ese propósito, el grupo funcional básico de la unidad básica (BU) y su posición relativa en Lss con respecto a su componente M2 se selecciona por su capacidad de enlace de hidrógeno a un grupo carbonilo de M2 que efectivamente aumenta su electrofilicidad y de ahí su susceptibilidad al ataque del agua. Alternativamente, esas variables se seleccionan de manera que una molécula de agua, cuya nucleofilicidad aumenta por la unión de hidrógeno al grupo funcional básico de BU, se dirija a un grupo carbonilo M2. Típicamente, BU, que actúa a través de cualquiera de los mecanismos, se compone de 1-6 átomos de carbono contiguos que conectan su grupo amino básico al resto L<ss>al que está unido. Para aumentar la electrofilicidad de un carbonilo de M2 mediante enlaces de hidrógeno, se requiere que BU tenga una amina primaria o secundaria como su grupo funcional básico, mientras que el aumento de la nucleofilia del agua de la manera descrita anteriormente se puede hacer con una amina primaria, secundaria o terciaria como el grupo funcional básico. Con el fin de que una amina básica esté en la proximidad requerida para ayudar en la hidrólisis de un resto succinimida de M2 a su correspondiente amida de ácido carboxílico abierto de anillo M3 por cualquier mecanismo, la cadena de carbono que contiene amina de BU está típicamente unida a una extensión resto de Lss en el carbono alfa de ese resto en relación con el punto de unión de A (o Ai ) al nitrógeno succinimida de M2(y por lo tanto al nitrógeno maleimida de su correspondiente estructura M1-A o M1-A1). Típicamente, ese carbono alfa tiene la configuración estereoquímica (S).
"Unidad potenciadora de la hidrólisis", como se usa en la presente descripción, es un grupo o resto de extracción de electrones que es un sustituyente opcional de una unidad de extensión que comprende un resto L<ss>. Cuando está presente, normalmente se incorpora una unidad potenciadora de hidrólisis (HE) en una unidad de extensión unida al nitrógeno imida de un resto M2de manera que sus efectos de extracción de electrones aumentan la electrofilicidad de los grupos carbonilo succinimida en ese resto. Cuando la unidad de extensión también tiene un sustituyente BU, el efecto de HE sobre los grupos carbonilo junto con el efecto de BU, que depende de la basicidad del grupo funcional básico BU y la distancia de ese grupo funcional en relación con los carbonilo, están equilibrados para que la hidrólisis prematura de M1o de M2a M3no ocurra o sea insignificante durante la preparación de un LDC a partir de un precursor de L<ss>que tiene la estructura de M1-A(BU)-, pero permite la hidrólisis (es decir, la conversión de un resto -M2-A(BU)- que contiene LDC en su resto -M3-A(BU)- correspondiente) en condiciones controladas (como cuando el pH se aumenta intencionalmente) que son tolerables por la orientación adjunta mitad. Típicamente, la unidad HE es un resto carbonilo (es decir, cetona o -C(=O)-) o grupo funcional que contiene carbonilo localizado distal al extremo de la unidad de extensión que está unido a M2, o M3derivado de él, y que también une covalentemente esa unidad de ensanchamiento a lo que resta del enlazador secundario. Los grupos funcionales que contienen carbonilo distintos de la cetona incluyen ésteres, carbamatos, carbonatos y ureas. Cuando HE es un grupo funcional que contiene carbonilo diferente a la cetona, el resto carbonilo de ese grupo funcional está típicamente unido a A. En algunos aspectos, como cuando no hay un sustituyente BU presente, la unidad HE puede estar lo suficientemente distante dentro de una unidad extensora del nitrógeno de la imida. al que la unidad de extensión está unida covalentemente de manera que no se observa ningún efecto discernible sobre la sensibilidad hidrolítica de los enlaces succinimida carbonil-nitrógeno de un resto que contiene M2.
"Unidad de extensión", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a un resto orgánico en un enlazador secundario que separa físicamente el resto de direccionamiento de otros componentes intermedios de una unidad de enlazador que están distal a la unidad de extensión, como una unidad escindible y/o un unidad espaciadora. Las unidades de extensión se requieren normalmente cuando un resto Lb de un LDC no proporciona suficiente alivio estérico para permitir el procesamiento de la unidad de enlace en W de manera que pueda liberarse un fármaco que contiene amina terciaria incorporado en D+. Una unidad de extensión (A) puede comprender uno o múltiples grupos o subunidades de extensión como se describe en la presente descripción. Antes de la incorporación en un LDC, A tiene grupos funcionales capaces de unir covalentemente un Lb' a una unidad Escindible (W) en ciertas construcciones enlazadoras (como cuando A, W e Y están en una disposición lineal) o a una unidad espaciadora (Y) en otras construcciones de enlazador (como cuando W es ortogonal a A-Y). En algunos aspectos de la invención, una unidad de extensión es capaz de unirse a más de una unidad escindible, unidad espaciadora y/o unidad de fármaco como, por ejemplo, cuando A representa un dendrímero u otra estructura ramificada multifuncional. En algunos aspectos de la invención, el enlazador secundario se une a un resto Lb o Lb' a través de una de sus subunidades de extensión mientras que otra o sus subunidades se enlazan covalentemente a lo que resta del enlazador secundario.
Una unidad de extensión (A), cuando está presente en un LDC, es una fracción orgánica unida covalentemente a una fracción de unión covalente de ligando o un precursor de fracción de unión covalente de ligando y a otra unidad de unión secundaria y puede comprender o consistir en dos, tres o más subunidades. Típicamente, A es una unidad distinta o tiene dos subunidades distintas denominadas A1 y Ao. En aquellos aspectos en los que A tiene dos subunidades, el subíndice a es 2 en conjugados Fármaco enlazador o Ligando Fármaco que se componen de restos como -Aa-Ww-Yy- o Aa-Yy(Ww)- y Aa como -A1-A2- a veces se denomina -A1-AO-. El número de átomos contiguos en una unidad de extensión se elige para aliviar la interferencia estérica del resto del ligando no dirigido por el resto de unión covalente del ligando que impediría la liberación del fármaco libre que contiene amina terciaria resultante del procesamiento dentro o en el sitio de células anómalas de W de un LDC compuesta por ese resto de unión de ligando covalente, unidad de extensión y unidad escindible. Normalmente, la unidad de extensión o una subunidad de la misma tiene de uno a seis átomos de carbono contiguos que se encuentran entre el resto de unión covalente del ligando o el precursor del resto de unión covalente del ligando y el grupo funcional que une covalentemente la unidad de extensión A a un espaciador o divisible (W). (Y) unidad del enlazador secundario o a otra subunidad de A. En algunos aspectos, ese grupo funcional también puede servir como unidad potenciadora de la hidrólisis (HE).
"Unidad de ramificación", como se usa en la presente descripción, se refiere a un resto orgánico trifuncional que es una subunidad opcional de una unidad de extensión (A). A veces A1 o A<o>, que son subunidades de A, actúan como una unidad de ramificación y otras veces la unidad de ramificación es una subunidad adicional de A. Cuando A1 Ao y B están presentes como subunidades de A, B puede ser la unidad proximal subunidad a un resto de unión covalente de ligando (Lb) o su precursor Lb' (es decir, está antes de -A1-A0-) o la subunidad distal de A (es decir, está después de -A1-A0-). La unidad de ramificación es trifuncional para ser incorporada a una unidad de enlace secundaria (L<o>) o para conectar Lo a una unidad de enlace primaria (L<r>) y para conectarse adicionalmente a una Unidad de solubilización (S) cuando esa unidad está presente componente de una unidad de enlace (LU). En aquellos aspectos en los que A tiene dos subunidades en las que una subunidad es una unidad de ramificación, el subíndice a es 2 en el fármaco enlazador o los conjugados de fármaco ligando que se componen de restos como -Aa-Ww-Yy - o Aa-Yy (Ww)- y en estos casos Aa como -A1-A2- a veces se denomina -A-B- o -B-A-. En aquellos aspectos en los que A tiene tres dos subunidades en las que una subunidad es una unidad de ramificación, el subíndice a es 3 en Fármaco enlazador o ligando Fármaco conjugados que se componen de restos como -Aa-Ww-Yy - o Aa-Yy (Ww) - y en estos casos Aa como -A1-A2-A3- a veces se denomina -Ai -B-Ao o -B-Ai -Ao- o -A1-AO-B- en dependencia del orden relativo de A1, Ao y B en la unidad de enlace del compuesto de enlace de fármaco o conjugado de fármaco y ligando.
En algunos aspectos, un aminoácido natural o no natural u otro compuesto ácido que contiene amina que tiene una cadena lateral funcionalizada sirve como unidad de ramificación. Normalmente, cuando una unidad de ramificación (B) y una unidad de solubilización (S) son componentes de una unidad de enlace, la cadena lateral funcionalizada de B conecta S a lo que resta de LU. Las estructuras ilustrativas para B son las descritas en la presente descripción para otras subunidades de A (por ejemplo, Ai , A<o>) siempre que la estructura tenga la triple funcionalidad requerida antes mencionada. En algunos aspectos, B es un resto de lisina, ácido glutámico o ácido aspártico en la configuración L o D en la que el grupo funcional épsilon-amino, ácido gamma-carboxílico o ácido beta-carboxílico, respectivamente, conecta la unidad solubilizante a lo que resta de LU.
"Unidad de solubilización", como se usa en la presente descripción, se refiere a un resto orgánico que es hidrófilo. Una unidad de solubilización (S), cuando está presente, se une covalentemente a una unidad de ramificación y sirve para contrarrestar, al menos en parte, la hidrofobicidad de una unidad de fármaco cuando la hidrofobicidad de una unidad de fármaco limita la carga media de fármaco de su conjugado de fármaco y ligando (LDC). Esa limitación en la conjugación de fármacos hidrófobos resulta típicamente de la agregación mediada por hidrófobos de compuestos de ADC individuales en una composición de<a>D<c>. La incorporación de un agente solubilizante apropiado da como resultado una reducción detectable de especies agregadas según lo medido por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en comparación con un ADC de control apropiado que carece de la unidad solubilizante.
La "unidad escindible", como se define, proporciona un sitio reactivo en el que la reactividad a ese sitio es mayor dentro o alrededor de una célula hiperproliferante o una célula inmunitaria hiperestimulada (es decir, una célula anómala) en comparación con una célula normal, de manera que la acción sobre ese sitio da como resultado una exposición preferencial a la célula anómala de un fármaco que contiene amina terciaria. Esa exposición resulta de la eventual liberación de fármaco libre de un LDC que tiene esa unidad escindible. En algunos aspectos de la invención, W está compuesto por un sitio reactivo escindible por una enzima (es decir, W está compuesto por un sustrato enzimático) cuya actividad o abundancia es mayor dentro o alrededor de la hiperproliferación, inmunoestimulante u otra anomalía o celda no deseada. En otros aspectos, W se compone de un sitio reactivo escindible por otros mecanismos (es decir, no enzimáticos) más probablemente operable en el entorno dentro o alrededor de las células anómalas del sitio objetivo en comparación con el entorno de las células normales en las que se encuentran las células anómalas. normalmente no está presente. En otros aspectos más de la invención, es más probable que el sitio reactivo opere después de la internalización celular del LDC en una célula anómala. Es más probable que la internalización se produzca en esas células en comparación con las células normales debido a una mayor presentación del resto diana que es reconocida por el resto diana del LDC en la membrana celular de las células anómalas o no deseadas. Por lo tanto, es más probable que las células diana se expongan intracelularmente al resto de fármaco activo liberado de su LDC. La unidad escindible puede comprender uno o varios sitios susceptibles de escisión en esas condiciones del sitio objetivo, pero típicamente solo tiene uno de esos sitios.
En algunos aspectos de la invención, la unidad escindible es un sustrato para una proteasa reguladora, hidrolasa o glicosidasa localizada intracelularmente en las células diana (es decir, el sitio reactivo de W es un enlace peptídico o un enlace glicosídico escindible por la proteasa reguladora, hidrolasa o glicosidasa) donde el péptido o enlace glicosídico es capaz de escisión selectiva por la proteasa reguladora, hidrolasa o glicosidasa en comparación con proteasas, hidrolasas o glicosidasas de suero, donde la proteasa reguladora, hidrolasa o glicosidasa puede o no ser más específica de la células anómalas u otras no deseadas dirigidas en comparación con las células normales, o es capaz de escisión selectiva por una proteasa, hidrolasa o glicosidasa excretada en mayores cantidades por las células anómalas u otras no deseadas dirigidas en comparación con las células normales. Alternativamente, W proporciona un grupo funcional que cuando se incorpora a un LDC es susceptible al ambiente ácido de las lisozimas cuando la LDC se internaliza preferentemente en una célula anómala, o al mayor ambiente reductor en o alrededor de estas células en comparación con el ambiente de células normales en las que las células anómalas no suelen estar presentes, de manera que la liberación del fármaco libre que contiene amina terciaria expone preferentemente a las células anómalas a ese fármaco en comparación con las células normales.
La unidad escindible (W), antes de su incorporación a un LDC, es capaz de enlazarse con la unidad espaciadora (Y). Después de la incorporación en un LDC, W proporciona un enlace escindible (es decir, un sitio reactivo) que tras la acción de una enzima presente dentro de una célula hiperproliferante o células inmunitarias hiperactivadas o característica del entorno inmediato de estas células anómalas o no deseadas., o por acción no enzimática debido a condiciones experimentadas más probablemente por las células hiperproliferativas en comparación con las células normales, libera el fármaco libre que contiene amina terciaria. Alternativamente, W proporciona un enlace escindible sobre el que es más probable actuar intracelularmente en una célula hiperproliferante o una célula inmunitaria hiperactivada debido a la entrada preferencial en dichas células en comparación con las células normales. Típicamente, W en un ADC se une covalentemente a una unidad espaciadora (Y) que está compuesta por o consiste en un resto autodestructivo de manera que la acción enzimática sobre W desencadena la autodestrucción de ese resto dentro de YD para liberar D.
Los grupos funcionales que proporcionan enlaces escindibles incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, (a) grupos sulfhidrilo que forman un enlace disulfuro, que son susceptibles a las mayores condiciones reductoras de las células anómalas en comparación con las células normales o el exceso de glutatión producido en condiciones hipóxicas, condiciones experimentadas por tales células, (b) grupos aldehído, cetona o hidrazina que forman una base de Schiff o grupos funcionales hidrazona, que son susceptibles a las condiciones ácidas de las lisozimas tras la internalización selectiva de un LDC que tiene una unidad enlazadora con ese enlace escindible en una célula anómala en comparación con la internalización en células normales, (c) grupos carboxílicos o amino que forman un enlace amida, como en los enlaces peptídicos, que son susceptibles de escisión enzimática por proteasas producidas o excretadas preferentemente por células anómalas en comparación con las células normales o por una proteasa reguladora dentro de una célula diana (d) grupos amino o hidroxilo que forman ciertos grupos urea o carbamato o grupos carboxílicos o hidroxi que forman grupos éster o carbonato que son susceptibles de escisión enzimática por hidrolasas o esterasas que son producidas o excretadas preferentemente por células anómalas en comparación con las células normales.
Aún otros grupos funcionales que proporcionan enlaces escindibles se encuentran en azúcares o carbohidratos que tienen un enlace glicosídico que son sustratos para glicósidos que a veces pueden ser producidos preferentemente por células anómalas en comparación con células normales. Alternativamente, la enzima proteasa, hidrolasa o glicosidasa requerida para el procesamiento de la unidad enlazadora para liberar un fármaco activo que contiene amina terciaria no necesita ser producida preferentemente por células anómalas en comparación con células normales, siempre que la enzima de procesamiento no sea excretada por células normales a una extensión que provocaría efectos secundarios no deseados por la liberación prematura del fármaco libre. En otros casos, la enzima proteasa, hidrolasa o glicosidasa requerida puede excretarse, pero para evitar una liberación prematura no deseada del fármaco, se prefiere que la enzima de procesamiento se excrete en las proximidades de las células anómalas y permanezca localizada en ese entorno, ya sea producido por células anómalas. o células normales cercanas en respuesta al entorno anormal provocado por las células anómalas. A ese respecto, W se selecciona para que actúe preferentemente sobre él una proteasa, hidrolasa o glicosidasa en o dentro del entorno de las células anómalas en contraste con las enzimas que circulan libremente. En esos casos, es menos probable que un LDC libere el fármaco que contiene amina terciaria en la vecindad de las células normales ni se internalizaría en las células normales que producen pero no excretan la enzima seleccionada, ya que es menos probable que dichas células muestren una fracción diana. requerido para la entrada por la LDC.
En algunos aspectos, W está compuesto por un aminoácido o está compuesto por o consiste en una o más secuencias de aminoácidos que proporcionan un sustrato para una proteasa presente dentro de las células anómalas o localizada en el entorno de estas células anómalas. Por lo tanto, W puede comprender o consistir en un resto dipeptídico, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido incorporado en una unidad enlazadora a través de un enlace amida al SI de Y en el que ese resto es una secuencia de reconocimiento para esa proteasa. En otros aspectos, W está compuesto por o consiste en un resto carbohidrato unido al SI de Y por un enlace glicosídico que es escindible por una glicosidasa producida preferentemente por células anómalas, o se encuentra en tales células a las que un lDc , que está compuesto por ese SI y los restos carbohidrato tienen una entrada selectiva debido a la presencia del resto diana en las células anómalas.
"Unidad espadadora" como se usa en la presente descripción es un resto orgánico en un enlazador secundario (Lo) dentro de una unidad enlazadora que está unido covalentemente a una unidad escindible (W) o unidad extensora (A) (o a Lb o Lb' cuando A está ausente) dependiendo de su configuración entre sí. Por lo general, en una configuración, una unidad de fármaco cuaternizada (D+) y W están unidos covalentemente a Y, que a su vez está unido a A (o Lb o Lb' cuando A está ausente) de manera que W es ortogonal a lo que resta de Lo, mientras que en otra configuración W, Y, D+ están dispuestos en una configuración lineal con D+ unido a Y. En cualquier disposición, Y sirve para separar el sitio de escisión W de D+ para evitar interacciones estéricas de esa unidad que interferiría con la escisión de W siempre que esa escisión se realice mediante acción enzimática.
Por lo general, una unidad espaciadora está compuesta por o consiste en un resto autodestructivo (SI) como se define en la presente descripción en el que ese resto se une covalentemente a una unidad de escisión (W) de manera que el procesamientoin vivode W activa el SI para que se autodestruya, liberando así el fármaco que contiene aminas terciarias libre. A menudo, SI de Y se une a W a través de un grupo funcional amida (o anilida) con Y también unido covalentemente al nitrógeno de amina cuaternaria de D+ a través de SI, de manera que la autodestrucción de SI da como resultado la liberación de fármaco que contiene amina terciaria libre.
"Resto autodestructivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a un resto bifuncional dentro de una unidad espaciadora (Y) que tiene un resto orgánico que interviene entre el primer y segundo resto de grupo funcional e incorpora covalentemente estos restos en una molécula tripartita normalmente estable a menos que se active. En la activación, cuando se escinde el enlace covalente al primer resto del grupo funcional, el segundo resto del grupo funcional se separa espontáneamente de la molécula tripartita por autodestrucción del resto del resto SI. Esa autodestrucción en la activación libera el fármaco libre que contiene aminas terciarias (D). En algunos aspectos, la autodestrucción se produce después de la internalización celular de un LDC que comprende D+ y una unidad enlazadora que tiene un resto de autodestrucción (SI) en Y de la unidad enlazadora. El resto orgánico intermedio entre los restos de grupo funcional de un resto autodestructivo (SI) es a veces un resto de arileno o heteroarileno capaz de sufrir fragmentación para formar un meturo de quinona o estructura relacionada mediante eliminación 1,4 o 1,6 con concomitante liberación de fármaco libre que contiene aminas terciarias. Tales restos SI se ejemplifican mediante restos de alcohol p-aminobencílico (PAB) opcionalmente sustituidos, orto o para-aminobencilacetales, o compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB (es decir, tipo PAB) tales como 2-aminoimidazol-5-metanol derivados(ver, por ejemplo,Hay y otros, 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y otros heteroarilos como se describe en la presente descripción.
Típicamente, para uno de los restos de grupo funcional en un resto SI, un carbono aromático de un grupo arileno o heteroarileno de un resto SI de tipo PAB o PAB incorporado en una unidad enlazadora se sustituye con un heteroátomo donante de electrones (EDG) unido a el sitio de escisión de W a través de un grupo funcional que comprende el heteroátomo en el que ese heteroátomo está funcionalizado de manera que su capacidad de donación de electrones se atenúa (es decir, el EDG está enmascarado por la incorporación de SI de Y en una unidad de enlace). El otro sustituyente que proporciona el segundo grupo funcional es un carbono bencílico que tiene un sustituyente de amina cuaternaria, en el que la amina cuaternaria, que comprende el fármaco que contiene amina terciaria, está unida a través del carbono bencílico unido a otro átomo de carbono aromático del arileno central o heteroarileno. grupo, en el que el carbono aromático que lleva el heteroátomo donante de electrones atenuado es adyacente (es decir, relación 1,2), o dos posiciones adicionales eliminadas (es decir, relación 1,4) de ese átomo de carbono bencílico. El EDG se elige de manera que el procesamiento del sitio de escisión de W restablezca la capacidad de donación de electrones del EDG enmascarado, lo que desencadena una eliminación 1,4 o 1,6 para expulsar el fármaco que contiene amina terciaria del sustituyente de amina cuaternaria bencílica.
Los restos SI relacionados con PAB o PAB cuando están presentes en un resto de enlazador secundario-D+ de estructura (1) que tiene un arileno o heteroarileno con los patrones de sustitución requeridos 1,2 o 1,4 que permiten la fragmentación 1,4- o 1,6 para liberar D de un resto de fármaco cuaternizado está representada por
en donde D+ está unido en -C(R8)(R9)-D+ a través de un nitrógeno de la amina cuaternaria unido covalentemente al carbono bencílico mencionado anteriormente y J es el EDG enmascarado, en donde J, que está unido a W a través de la atenuación funcional grupo que comprende J, es -O-, -N(R33)-, o -S-, y R8, R9, R33, R', V, Z1, Z2, Z3 se definen en modalidades de unidades SI tipo PAB y PAB. Estas variables se seleccionan de manera que la reactividad de J cuando se libera del procesamiento de W en el sitio diana se equilibra con la reactividad de la amina terciaria eliminada de SI y la estabilidad del intermedio de tipo quinona-metida resultante de esa eliminación.
En algunos aspectos para un resto secundario de enlazador-D+ de estructura (1), el resto SI de tipo PAB o PAB unido a D+ tiene la estructura de
Las modalidades proporcionan otras estructuras y sus definiciones de grupos variables que incorporan un resto SI en un resto de enlazador secundario-D+ de estructura (1).
En algunos aspectos para un enlazador secundario de estructura (2), un resto SI de tipo PAB o PAB cuando está presente en un enlazador secundario de estructura (2) tiene la estructura de
en donde la línea ondulada a J indica unión covalente estable covalente (es decir, no procesada en el sitio diana) al Ligando-Lb - o Lb'- cuando a es 0 o a través de A o subunidad del mismo cuando a es 1, donde J es -O-, -N(R33) -, o -S- unido directamente a Lb, Lb', A o una subunidad de A o a través de un grupo funcional que comprende J, y donde R', R8, R9, V, Z1, Z2 y Z3 son como se definen en la Fórmula 1 y E, seleccionado independientemente de J, es un grupo donante de electrones tal como -O-, -N(R33)-, o -S-, en donde la capacidad donante del electrón de E es atenuada por la unión a W', en donde W”-E proporciona un sitio de escisión para una glicosidasa, y E y el carbono bencílico del grupo -C(R8)(R9)-D+ están unidos al grupo arileno o heteroarileno en las posiciones definidas por V, Z1, Z2 o Z3, de manera que E y el resto -C (R8)(R9)-D+ están en un 1,2 o 1,4 para permitir la fragmentación 1,4 o 1,6 que da como resultado la liberación del fármaco que contiene amina terciaria.
En algunos aspectos de un resto secundario de enlazador-D+ de estructura (2), el resto SI de tipo PAB o PAB unido a D tiene la estructura de
Las modalidades proporcionan otras estructuras y sus definiciones de grupos variables que incorporan un resto SI en un resto de enlazador secundario-D+ de estructura (2).
El arileno o heteroarileno de un resto SI puede sustituirse adicionalmente para afectar la cinética de la eliminación 1,2 o 1,4 con el fin de modular la liberación de D o mejorar las propiedades fisicoquímicas del conjugado de ligando fármaco (por ejemplo, reducir la hidrofobicidad) en el que se incorpora.
Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de estructuras SI que se modifican para acomodar sustituyentes de amina cuaternaria bencílica son proporcionados por Blencowe y otros "Self-immolative linkers in polymeric delivery systems" Polym. Chem. (2011) 2: 773-790; Greenwald y otros "Drug delivery systems employing 1,4- or 1,6-elimination: poly(ethylene glycol) prodrugs of amine-containing compounds" J. Med. Chem. (1999) 42: 3657-3667; y en las patentes de EE. UU. núms. 7,091,186; 7,754,681; 7,553,816; y 7,989,434.
"Fármaco citotóxico", como se usa en la presente descripción, se refiere a un compuesto o un metabolito derivado de un LDC que ejerce un efecto anti-supervivencia sobre células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperactivas u otras células anómalas o no deseadas. En algunos aspectos, el fármaco citotóxico actúa directamente sobre esas células o indirectamente actuando sobre la vasculatura anormal que respalda la supervivencia y/o el crecimiento de las células hiperproliferativas u otras células anómalas o no deseadas, o el fármaco citotóxico actúa dentro de los sitios de células inmunitarias hiperactivadas. Típicamente, las células anómalas o no deseadas sobre las que actúa el fármaco citotóxico son células de mamífero, más típicamente células humanas. La actividad citotóxica de un fármaco citotóxico puede ser expresada como un valor IC<50>, que es la concentración eficaz, cantidad típicamente molar por unidad de volumen, en el que la mitad de las células cancerosas en un sistema de modeloin vitrode células sobrevivir a la exposición al agente citotóxico. Por lo tanto, un valor de IC<50>es dependiente del modelo. Típicamente, un agente citotóxico incorporado en un LDC tendrá un valor de IC<50>en un modeloin vitro decélulas compuesto de células hiperproliferación de entre 100 nM a 0,1 pM o más típicamente de aproximadamente 10 nM a 1 pM. Un fármaco citotóxico altamente toxico tiene típicamente un valor de IC<50>en tales modelos de aproximadamente 100 pM o inferior. Aunque los inhibidores resistentes a múltiples fármacos que revierten la resistencia a los fármacos citotóxicos no son citotóxicos por derecho propio, a veces se incluyen como fármacos citotóxicos.
"Fármaco citostático", como se usa en la presente descripción, se refiere a un compuesto o un metabolito derivado de un LDC que ejerce un efecto inhibidor sobre el crecimiento y la proliferación de células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperactivas u otras células anómalas o no deseadas. En algunos aspectos, el fármaco citostático actúa directamente sobre esas células o indirectamente actuando sobre la vasculatura anormal que apoya la supervivencia y/o el crecimiento de las células hiperproliferativas u otras células anómalas o no deseadas, o el fármaco citotóxico actúa dentro de los sitios de células inmunitarias hiperactivadas infiltrantes. Típicamente, las células anómalas o no deseadas sobre las que actúa el fármaco citotóxico son células de mamífero, más típicamente células humanas. Aunque los inhibidores resistentes a múltiples fármacos que revierten la resistencia a los fármacos citostáticos no son citostáticos por derecho propio, a veces se incluyen como fármacos citostáticos.
"Malignidad hematológica", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a un tumor de células sanguíneas que se origina a partir de células de origen linfoide o mieloide y es sinónimo del término "tumor líquido". Las neoplasias hematológicas pueden clasificarse como indolentes, moderadamente agresivas o muy agresivas.
"Linfoma", como se usa en la presente descripción, es una neoplasia maligna hematológica que usualmente se desarrolla a partir de células hiperproliferativas de origen linfoide. Los linfomas a veces se clasifican en dos tipos principales: linfoma de Hodgkin (LH) y linfoma no Hodgkin (LNH). Los linfomas también pueden clasificarse según el tipo de célula normal que más se asemeja a las células cancerosas de acuerdo con marcadores fenotípicos, moleculares o citogénicos. Los subtipos de linfoma bajo esa clasificación incluyen, sin limitación, neoplasias de células B maduras, neoplasias de células T maduras y células asesinas naturales (NK), linfoma de Hodgkin y trastornos linfoproliferativos asociados a inmunodeficiencia. Los subtipos de linfoma incluyen linfoma linfoblástico de células T precursoras (a veces denominado leucemia linfoblástica ya que los linfoblastos de células T se producen en la médula ósea), linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células del manto, linfoma linfocítico crónico de células B (a veces denominada leucemia debido a afectación de sangre periférica), linfoma MALT, linfoma de Burkitt, micosis fungoide y su variante más agresiva, enfermedad de Sézary, linfomas periféricos de células T no especificados de otra manera, esclerosis nodular del linfoma de Hodgkin y subtipo de celularidad mixta del linfoma de Hodgkin.
"Leucemia", como se usa el término en la presente descripción, es una neoplasia maligna hematológica que generalmente se desarrolla a partir de células hiperproliferativas de origen mieloide e incluye, sin limitación, leucemia linfoblástica aguda (a Ll ), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia monocítica aguda (AMoL). Otras leucemias incluyen leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfática de células T (T-PLL), leucemia linfocítica granular grande y leucemia de células T adultas.
"Unidad de fármaco cuaternizada", como se usa en la presente descripción, puede ser cualquier compuesto (D) que contenga amina terciaria que tenga una propiedad citotóxica, citostática, inmunosupresora o antiinflamatoria, típicamente contra células de mamíferos, que se haya incorporado en un LDC como su sal de amina cuaternaria correspondiente. (D+). El término "fármaco" no implica un compuesto que solo esté aprobado por una agencia reguladora para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección hiperproliferativa o hiperinmune estimulada o que sería adecuado para tal propósito fuera del contexto de un LDC. Por tanto, D+ también incluye compuestos cuaternizados que en forma no conjugada (es decir, en forma "libre" que contiene amina terciaria y, por lo tanto, no están presentes en un LDC) serían inadecuados para la administración a un sujeto. Por ejemplo, un fármaco que contiene amina terciaria (D) cuando se incorpora en un LDC como D+ puede ser un compuesto citotóxico inapropiado para tratar un cáncer en un sujeto debido a una toxicidad sistémica intolerable a la dosis terapéutica requerida. En algunos aspectos, se obtiene un fármaco cuaternizado condensando el nitrógeno de amina terciaria de un fármaco que contiene amina terciaria con un enlazador secundario Lo que tiene un grupo saliente adecuado. En algunos aspectos, el fármaco que contiene amina terciaria incorporado en D+ será adecuado para su uso en el tratamiento del cáncer. En otros aspectos, el fármaco que contiene amina terciaria incorporado en D+ será adecuado para su uso en el tratamiento del cáncer. En algunos aspectos, un fármaco que contiene amina terciaria incorporado en D+ de un LDC será un compuesto citotóxico o citostático. En otros aspectos, un fármaco que contiene amina terciaria incorporado en D+ de un LDC será un compuesto antiinflamatorio o inmunosupresor. En otros aspectos más, el fármaco que contiene amina terciaria incorporado en D+ de un LDC será un inhibidor de resistencia a múltiples fármacos. Otros fármacos que contienen amina terciaria que pueden incorporarse en D+ se proporcionan adicionalmente mediante la definición de fármaco que contiene aminas terciarias.
"Fármaco que contiene amina terciaria", como se usa en la presente descripción, son aquellos compuestos que tienen actividades citotóxicas, citostáticas o antiinflamatorias y se caracterizan por un resto de amina terciaria alifática (D) que es capaz de liberarse de su resto de amina cuaternaria (D+) correspondiente. de un LDC posterior a la unión del resto diana del LDC a su fracción diana afín. A menudo, el compuesto que contiene amina terciaria se convierte en su forma cuaternizado cuando se incorpora por primera vez en un resto que contiene Lb o Lb'. Sin embargo, a veces se incorpora un precursor que contiene una amina secundaria o una amina primaria en el resto que contiene Lb o Lb', que luego se cuaterniza para formar el resto D+ del que es capaz de liberarse el fármaco que contiene amina terciaria. Por lo tanto, estructuras como L-Lb-Lo-D+ y Lb'-Lo-D+ no implican un método particular en el que se formó D+ y no requieren que un reactivo usado en su formación sea una amina terciaria que contiene fármaco.
Las clases de fármacos que contienen amina terciaria liberados de un LDC de la presente invención incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, compuestos que tienen un grupo funcional de amina terciaria que son útiles en el tratamiento del cáncer o una enfermedad autoinmune. Esos compuestos incluyen agentes disruptores de microtúbulos, agentes de unión al surco menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes del ADN, sensibilizadores de quimioterapia e inhibidores de la topoisomerasa como tubulisinas, auristatinas, dímeros de fenazina, ciertos inhibidores resistentes a múltiples fármacos (MDR) e inhibidores de nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT).
"Células hiperproliferativas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que se caracterizan por una proliferación celular no deseada o una tasa anormalmente alta o un estado persistente de división celular que no está relacionada o no está coordinada con la de los tejidos normales circundantes. Típicamente, las células hiperproliferativas son células de mamífero. En algunos aspectos, las células hiperproliferativas son células inmunitarias hiperestimuladas como se definen en la presente descripción, cuyo estado persistente de división celular se produce después del cese del estímulo que puede haber provocado inicialmente el cambio en su división celular. En otros aspectos, las células hiperproliferativas son células normales transformadas o células cancerosas y su estado descontrolado y progresivo de proliferación celular puede resultar en un tumor que es benigno, potencialmente maligno (premaligno) o francamente maligno. Las afecciones de hiperproliferación que resultan de células normales transformadas o células cancerosas incluyen, pero no se limitan a, aquellas caracterizadas como precáncer, hiperplasia, displasia, adenoma, sarcoma, blastoma, carcinoma, linfoma, leucemia o papiloma. Los precancerosos generalmente se definen como lesiones que exhiben cambios histológicos que están asociados con un mayor riesgo de desarrollo de cáncer y, a veces, tienen algunas, pero no todas, las propiedades moleculares y fenotípicas que caracterizan al cáncer. Los precánceres hormonales asociados o sensibles a hormonas incluyen neoplasia intraepitelial prostática (PIN), particularmente PIN de alto grado (HGPIN), proliferación acinar pequeña atípica (ASAP), displasia cervical y carcinoma ductal in situ. Las hiperplasias generalmente se refieren a la proliferación de células dentro de un órgano o tejido más allá de lo que normalmente se ve que puede resultar en el agrandamiento de un órgano o en la formación de un tumor o crecimiento benigno. Las hiperplasias incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia endometrial (endometriosis), hiperplasia prostática benigna e hiperplasia ductal.
"Células normales", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que experimentan una división celular coordinada relacionada con el mantenimiento de la integridad celular del tejido normal o la reposición de las células sanguíneas o linfáticas circulantes que se requiere por el recambio celular regulado, o la reparación del tejido necesaria por una lesión, o por una respuesta inmune o inflamatoria resultante de la exposición a patógenos u otra agresión celular, donde la división celular provocada o la respuesta inmune termina al completar el mantenimiento, reposición o eliminación de patógenos necesarios. Las células normales incluyen células que proliferan normalmente, células inactivas normales y células inmunitarias normalmente activadas.
Las "células inactivas normales" son células no cancerosas en su estado de reposo Go y no han sido estimuladas por el estrés o un mitógeno o son células inmunitarias que normalmente están inactivas o no han sido activadas por la exposición a citoquinas proinflamatorias.
"Células inmunitarias hiperestimuladas", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a células involucradas en la inmunidad innata o adaptativa caracterizadas por una proliferación anómalamente persistente o un estado de estimulación inapropiado que ocurre después del cese del estímulo que inicialmente puede haber evocado el cambio en la proliferación o estimulación o que se produzca en ausencia de algún estímulo externo. A menudo, la proliferación persistente o el estado inadecuado de estimulación da como resultado un estado crónico de inflamación característico de un estado o afección patológica. En algunos casos, el estímulo que puede haber evocado inicialmente el cambio en la proliferación o estimulación no es atribuible a una agresión externa, sino que se deriva internamente como en una enfermedad autoinmune. En algunos aspectos, una célula inmunitaria hiperestimulada es una célula inmunitaria proinflamatoria que ha sido hiperactivada a través de la exposición crónica a citocinas proinflamatorias.
En algunos aspectos de la invención, un LDC se une a un antígeno presentado preferentemente por células inmunitarias proinflamatorias que proliferan de forma anormal o se activan de forma inapropiada. Esas células inmunitarias incluyen macrófagos activados clásicamente o células auxiliares T tipo 1 (Th1), que producen interferón-gamma (INF-y), interleucina-2 (IL-2), interleucina-10 (IL-10) y factor de necrosis tumoral. -beta (TNF-p), que son citocinas que participan en la activación de macrófagos y células T CD8+.
"Glicosidasa", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína capaz de escindir enzimáticamente un enlace glicosídico. Típicamente, el enlace glicosídico a escindir está presente en una unidad escindible (W) de un LDC. A veces, la glicosidasa que actúa sobre un LDC está presente intracelularmente en células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperactivas u otras células anómalas o no deseadas a las que el LDC tiene acceso preferencial en comparación con las células normales, lo que se atribuye a la capacidad de direccionamiento del componente de unión a ligando (es decir, la unidad de ligando). A veces, el glucósido es más específico para las células anómalas o no deseadas o se excreta preferentemente por células anómalas o no deseadas en comparación con las células normales o está presente en mayor cantidad en las proximidades de las anormales o no deseadas en comparación con las cantidades de suero. A menudo, el enlace glucosídico en W sobre el que actúa una glicosidasa une el carbono anomérico de un resto carbohidrato (Su) a un oxígeno fenólico de un resto autodestructivo (SI) que comprende una unidad de extensión (Y) de manera que la escisión glicosídica de ese enlace desencadena la eliminación 1,4 o 1,6 de un fármaco que contiene amina terciaria del resto de amina cuaternaria unido a la posición bencílica de SI.
En los compuestos de enlace de fármacos o conjugados de fármaco ligando compuestos por restos como -Aa-Yy (Ww)-D+ en los que los subíndices w e y son cada uno de los -Y(W)- es típicamente un resto Su-O'-SI como se define en la presente descripción con A, W y D unidos a SI de una manera que permite la liberación autodestructiva del fármaco que contiene amina terciaria libre tras la acción de una glicosidasa. Tales restos -Y(W)- se denominan a veces una unidad de glucurónido en la que Su no se limita al ácido glucurónico.
Típicamente, un resto Su-O'-SI (donde -O'- representa el oxígeno del enlace glicosídico y Su es un resto carbohidrato) está representado por la estructura descrita para restos autoemolizantes donde E se une al resto arilo de SI es oxígeno con ese heteroátomo sustituido con un resto carbohidrato a través del átomo de carbono anomérico de ese resto. Más típicamente, Su-O'-SI tiene la estructura de:
en donde R24A, R24B y R24C, es como se define para R24 en el resumen de la invención y se selecciona de manera que la capacidad de donación de electrones del -OH fenólico liberado del enlace glicosídico, la sensibilidad a la escisión selectiva por un glicosidasa del enlace glicosídico al resto carbohidrato Su, y la estabilidad del intermedio de metido de quinona tras la fragmentación se equilibra con la capacidad de salida de la amina terciaria de manera que la liberación eficiente de D de D+ a través de la eliminación de 1,4- o 1,6-. Esas estructuras Su-O'-SI son unidades de glucurónido representativas. Cuando el enlace glicosídico es a un ácido glucurónico, la glicosidasa capaz de la escisión enzimática de ese enlace glicosídico es una glucuronidasa. "Resto carbohidrato", como se usa en la presente descripción, se refiere a un monosacárido que tiene la fórmula empírica de Cm(H<2>O)n, en donde n es igual a m, que contiene un resto aldehído en su forma hemiacetal o un derivado del mismo en donde un resto CH<2>OH dentro de esa fórmula se ha oxidado a un ácido carboxílico (por ejemplo, ácido glucurónico por oxidación del grupo CH<2>OH en glucosa). Típicamente, un resto carbohidrato (Su) es una hexosa cíclica, como una piranosa, o una pentosa cíclica, como una furanosa. Por lo general, la piranosa es un glucurónido o hexosa en la conformación p-D. En algunos casos, la piranosa es un resto p-D-glucurónido(es decir,ácido p-D-glucurónico unido al resto autodestructivo -SI- mediante un enlace glicosídico que se puede escindir mediante p-glucuronidasa). A menudo, el resto carbohidrato no está sustituido(por ejemplo,es una hexosa cíclica o pentosa cíclica de origen natural). Otras veces, el resto carbohidrato puede ser un p-D-glucurónido sustituido(es decir,ácido glucurónico sustituido con uno o más grupos, tales como hidrógeno, hidroxilo, halógeno, azufre, nitrógeno o alquilo inferior).
"Aminoácido" como se usa en la presente descripción es un resto orgánico que contiene un ácido carboxílico y un grupo funcional amina alifática, típicamente un grupo funcional amino primario o secundario capaz de formar un enlace amida con otro resto orgánico a través de reacciones de formación de enlaces peptídicos estándar bien conocidas en el arte de la síntesis de péptidos. El aminoácido incluye aminoácidos naturales, no naturales y no clásicos como se define en la presente descripción. Un aminoácido hidrófobo contiene un sustituyente hidrófobo, típicamente un grupo alquilo C<1>-C<6>unido a un átomo de carbono dentro de la cadena de átomos intermedios entre el ácido carboxílico y grupos funcionales amina y es típicamente en el átomo de carbono alfa en la amina o grupo funcional ácido carboxílico. Para un aminoácido natural hidrófobo, el sustituyente hidrófobo del carbono alfa es valina, alanina, leucina o isoleucina.
"Aminoácido natural" se refiere a los aminoácidos naturales arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptófano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutámico, ácido aspártico, treonina, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina y valina, en la configuración L o D, a menos que el contexto indique lo contrario. "Aminoácidos no naturales", como se usa en la presente descripción, son compuestos ácidos que contienen aminas que tienen la estructura básica de los aminoácidos naturales (es decir, son ácidos que contienen alfa-amino, pero tienen grupos R unidos al carbono alfa que no están presentes aminoácidos naturales.
"Aminoácidos no clásicos", como se usa en la presente descripción, son compuestos ácidos que contienen amina que no tienen su sustituyente amina unido al carbono alfa del ácido carboxílico (es decir, no es un alfa-aminoácido). Los aminoácidos no clásicos incluyen p-aminoácidos en los que se inserta un metileno entre el ácido carboxílico y los grupos funcionales amino en un aminoácido natural o un aminoácido no natural.
"Péptido", como se usa en la presente descripción, se refiere a un polímero de dos o más aminoácidos en donde el grupo ácido carboxílico de un aminoácido forma un enlace amida con el grupo alfa-amino del siguiente aminoácido en la secuencia peptídica. Los métodos para preparar enlaces amida en polipéptidos se proporcionan adicionalmente en la definición de amida.
Los péptidos pueden estar compuestos de aminoácidos naturales en la configuración L o D o aminoácidos no naturales o no clásicos, que incluyen, pero no se limitan a, ornitina, citrulina, ácido diaminobutírico, norleucina, pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina. Otros ejemplos de aminoácidos no naturales y no clásicos son los aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos*, N-alquil aminoácidos*, ácido láctico*, derivados de haluros de aminoácidos naturales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-F-fenilalanina*,L-alil-glicina*, beta-alanina*, ácidoL-alfa-amino butírico*, ácidoL-gamma-amino butírico*, ácidoL-alfa-amino isobutírico*, ácidoL-épsilon-aminocaproico #, ácido 7-amino heptanoico*,L-metionina sulfona*,L-norleucina*,L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*,L-hidroxiprolina#,L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina (Phe) tal como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*,L-Phe (4-amino)#,L-Tyr (metil)*,L-Phe(4-isopropil)*,L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico)*, ácidoL-diaminopropiónico,L-Phe (4-bencil)*, ácido 2,4-diaminobutírico, 4-aminobutírico ácido (gamma-Abu), ácido 2-amino butírico (alfa-Abu), ácido 6-amino hexanoico (épsilon-Ahx), ácido 2-amino isobutírico (Aib), 3-ácido aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, fluoroaminoácidos, beta-metil aminoácidos, Calfa metil aminoácidos, N-metil-aminoácidos, naftil alanina y similares. La notación * indica un derivado que tiene características hidrófobas, # indica un derivado que tiene características hidrófilas y #* indica un derivado que tiene características anfipáticas.
Las secuencias de aminoácidos variantes en un péptido pueden incluir a veces grupos espaciadores adecuados insertados entre dos residuos de aminoácidos cualesquiera de la secuencia, incluidos grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos de glicina o p-alanina. Además, un péptido puede comprender o consistir en peptoides. El término "peptoides" se refiere a estructuras de aminoácidos variantes donde el grupo sustituyente de carbono alfa está en el átomo de nitrógeno de la cadena principal en lugar del carbono alfa. Los procesos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Simon y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (Estados Unidos) (1992) 89(20): 9367-9371; y Norwell, Trends Biotechnol. 13(4): 132-134 (1995)).
"Proteasa", como se define en la presente descripción, se refiere a una proteína capaz de escisión enzimática de un enlace carbonilo-nitrógeno tal como un enlace amida que se encuentra típicamente en un péptido. Las proteasas se clasifican en seis clases principales: serina proteasas, treonina proteasas, cisteína proteasas, proteasas de ácido glutámico, proteasas de ácido aspártico y metaloproteasas llamadas así por el residuo catalítico en el sitio activo que es principalmente responsable de escindir el enlace carbonil-nitrógeno de su sustrato. Las proteasas se caracterizan por diversas especificidades, que dependen de las identidades de los residuos en el lado N-terminal y/o C-terminal del enlace carbonilo-nitrógeno y diversas distribuciones.
Cuando W se compone de amida u otro grupo funcional que contiene nitrógeno-carbonilo que se puede escindir por una proteasa, ese sitio de escisión a menudo se limita a las reconocidas por las proteasas que se encuentran en células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperestimuladas o dentro de células específicas del medio ambiente. en el que están presentes células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperestimuladas. En esos casos, no se requiere necesariamente que la proteasa esté presente de manera preferencial o se encuentre en mayor abundancia en las células diana por la LDC ya que un LDC tendrá un acceso más pobre a aquellas células que no tienen preferencialmente la porción diana. Otras veces, la proteasa se excreta preferentemente por células anómalas o por células en el entorno en el que se encuentran esas células anómalas en comparación con las células normales o los entornos típicos en los que se encuentran esas células normales en ausencia de células anómalas. Por tanto, en aquellos casos en los que se excreta la proteasa, es necesario que la proteasa esté presente preferentemente o que se encuentre en mayor abundancia en las proximidades de las células diana de los LDC en comparación con las células normales.
Cuando se incorpora a un LDC, un péptido que comprende W presentará una secuencia de reconocimiento a una proteasa que escinde un enlace carbonilo-nitrógeno en W dando como resultado la fragmentación de la unidad enlazadora para provocar la liberación de un fármaco que contiene amina terciaria de D+. A veces, la secuencia de reconocimiento es reconocida selectivamente por una proteasa intracelular presente en las células anómalas a las que el LDC tiene acceso preferido en comparación con las células normales debido a que se dirigen a las células anómalas, o es producida preferentemente por células anómalas en comparación con las células normales, por el propósito de administrar apropiadamente el fármaco al sitio de acción deseado. Usualmente, el péptido es resistente a las proteasas circulantes con el fin de minimizar la expulsión prematura del fármaco que contiene amina terciaria y así minimizar la exposición sistémica no deseada al fármaco. Típicamente, el péptido tendrá uno o más aminoácidos no naturales o no clásicos en su orden de secuencia para tener esa resistencia. A menudo, el enlace amida que se escinde específicamente por una proteasa producida por una célula anómala es una anilida en la que el nitrógeno de esa anilida es un heteroátomo electrondonante naciente (es decir, J) de un resto SI que tiene las estructuras previamente definidas. Por tanto, la acción de la proteasa sobre dicha secuencia de péptidos en W da como resultado la liberación del fármaco del fragmento enlazador mediante eliminación 1,4 o 1,6 a través del resto arileno de SI.
Las proteasas reguladoras se localizan típicamente intracelularmente y son necesarias para la regulación de las actividades celulares que a veces se vuelven aberrantes o desreguladas en células anómalas u otras células no deseadas y lo son más. En algunos casos, cuando W se dirige a una proteasa que tiene distribución preferencial intracelularmente, esa proteasa es una proteasa reguladora, que participa en el mantenimiento o la proliferación celular. En algunos casos, esas proteasas incluyen catepsinas. Las catepsinas incluyen las serina proteasas, catepsina A, catepsina G, proteasas del ácido aspártico catepsina D, catepsina E y las cisteína proteasas, catepsina B, catepsina C, catepsina F, catepsina H, catepsina K, catepsina L1, catepsina L2, catepsina O, catepsina S, catepsina W y catepsina Z.
En otros casos, cuando W se dirige a una proteasa que se distribuye preferentemente extracelularmente en la vecindad de células inmunitarias hiperproliferativas o hiperestimuladas debido a la excreción preferencial por dichas células o por células vecinas cuya excreción es peculiar del entorno de células inmunitarias hiperproliferativas o hiperestimuladas, esa proteasa suele ser una metaloproteasa. Típicamente, esas proteasas están implicadas en la remodelación tisular, lo que ayuda a la invasividad de las células hiperproliferativas o la acumulación no deseada de células inmunitarias hiperactivas que da como resultado un mayor reclutamiento de tales células.
"Agente disruptor de tubulina'' como se usa en la presente descripción se refiere a un compuesto citotóxico o citostático que se une a la tubulina o una subunidad de la misma y como resultado inhibe la elongación de tubulina o la polimerización de tubulina para afectar negativamente la dinámica de la tubulina, particularmente en células inmunitarias hiperproliferativas o hiperestimuladas. Los ejemplos de agentes anti-tubulina (es decir, agentes disruptores de tubulina) incluyen, pero no se limitan a, taxanos, alcaloides de la vinca, maitansina y maitansinoides, dolastatinas y auristatinas. Un agente disruptor de tubulina que contiene amina terciaria es un agente disruptor de tubulina como se define en la presente descripción que contiene o puede modificarse para contener un grupo funcional amina terciaria.
"Fármaco de dolastatina", como se usa el término en la presente descripción, son pentapéptidos aislados de fuentes marinas que tienen actividad citotóxica como agentes disruptores de tubulina. Dolastatina 10 y Dolastatina 15 son ejemplos de dolastatinas que contienen aminas terciarias y tienen las siguientes estructuras:
Algunas dolastatinas ilustrativas están relacionadas con la dolastatina 10 en donde los sustituyentes fenilo y tiazol se reemplazan con restos arilo o heteroarilo seleccionados independientemente. Otras dolastatinas ilustrativas están relacionadas con la dolastatina 15 en donde el resto éster C-terminal se reemplaza por una amida en donde el nitrógeno amida está sustituido con un resto arilalquilo o heteroarilalquilo. Sus estructuras y estructuras de otras dolastatinas que contienen aminas terciarias ilustrativas y la forma de su incorporación en un LDC se proporcionan en las modalidades de unidades de fármaco cuaternizados.
"Fármaco de auristatina", como se usa el término en la presente descripción, es un agente disruptor de tubulina basado en peptidilo relacionado con la dolastatina 10. Algunas auristatinas que contienen aminas terciarias tienen la estructura de DE o DF:
en donde Z es -O-, -S - o -N (R19) -, y donde R10-R21son como se definen en modalidades para fármacos auristatina que contienen amina terciaria cuaternizada. Cuando se incorpora en un LDC o un precursor de la misma, el nitrógeno indicado (|) del resto de amina terciaria se cuaterniza mediante unión covalente a Lo o Lo de un resto que contiene Lb o Lb' que comprende Lo. Típicamente, ese resto cuaternizado de D+ resulta del enlace covalente del resto de amina terciaria con el carbono bencílico de un resto PAB o de tipo PAB del que comprende o consiste una unidad de unidad espaciadora (Y) autodestructiva en L0. Las estructuras de otras auristatinas que contienen amina terciaria ilustrativas y la forma de su incorporación de tales fármacos en un LDC se proporcionan en las modalidades de unidades de fármaco cuaternizados basadas en auristatina e incluyen Auristatina E y Auristatina F.
"Fármaco de tubulisina", como se usa, es un agente disruptor de tubulina basado en péptidos que tiene actividad citotóxica, y está compuesto por un componente de aminoácido natural o no natural y otros tres componentes de aminoácido no naturales en los que uno de esos componentes se caracteriza por un resto heteroarileno de5o6miembros y otro proporciona una amina terciaria para su incorporación en una unidad de fármaco cuaternizada.
Algunas tubulisinas que contienen aminas terciarias tienen la estructura de D<g>o D<h>:
Otras tubulisinas que contienen aminas terciarias tienen la estructura de Dg-1 o Dh-i :
en donde el círculo representa un heteroarilo nitrogenado de5o6miembros, en donde los sustituyentes requeridos indicados para ese heteroarilo están en una relación1,3ometaentre sí con sustitución opcional en las posiciones restantes; R4, R4A, R4B, R8A son cada uno un alquilo opcionalmente sustituido, seleccionado independientemente; R7es un arilalquilo opcionalmente sustituido o un heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R7A es un arilo opcionalmente sustituido o un heteroarilo opcionalmente; R2es un sustituyente unido a O divalente (es decir, el doble enlace está presente o el carbono que tiene el grupo variable está disustituido por una sola instancia de R2), o el doble enlace está ausente (es decir, R<2>está unido con enlace sencillo al carbono que tiene ese grupo variable) o R<2>es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, o un sustituyente unido a O monovalente; m es 0 o 1; y R2A, R3, R<5>y R<6>son como se definen en modalidades para fármacos que contienen amina terciaria cuaternizada basados en tubulisina.
Las tubulisinas naturales tienen la estructura de
y se dividen convenientemente en cuatro subunidades de aminoácidos, como lo indican las líneas verticales discontinuas, denominadas ácido N-metil-pipecolínico (Mep), isoleucina (Ile), tubuvalina (Tuv) y tubofenilalanina (Tup, cuando R7A es hidrógeno) o tubutirosina (Tut, cuando R7A es -OH). Hay aproximadamente una docena de tubulisinas de origen natural actualmente conocidas denominadas Tubulisina AI, Tubulisina U, Tubulisina V y Tubulisina Z, cuyas estructuras están indicadas por grupos variables para la estructura D<g>-6definida en modalidades de unidades de fármaco cuaternizado basadas en tubulisina.
Las pretubulisinas tienen la estructura Dg o Dh, en donde R<3>es -CH<3>y R<2>es hidrógeno, y las desmetil tubulisinas tienen la estructura de Dg , Dg-1, Dg-6, Dh, Dh-1 y otras estructuras de tubulisina dadas por las modalidades de unidades de fármaco cuaternizado a base de tubulisina, en donde R<3>es hidrógeno, y en donde los otros grupos variables como se describen para tubulisinas. Pretubulisinas y desmetil tubulisinas y opcionalmente se incluyen en la definición de tubulisinas.
En las estructuras Dg , Dg-i , Dg-6, Dh, Dh-i y otras estructuras de tubulisina descritas en la presente descripción en modalidades de unidades de fármaco cuaternizado basadas en tubulisina, el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando tales estructuras se incorporan en un LDC o un precursor del mismo. Cuando se incorpora a un LDC o un precursor del mismo, ese nitrógeno se cuaterniza por unión covalente a Lo o Lo de un resto que contiene Lb o Lb' compuesto por Lo. Típicamente, ese resto cuaternizado de D+ resulta de la unión covalente del resto de amina terciaria al carbono bencílico de un resto PAB o de tipo PAB del que comprende o consiste una unidad Y en Lo. Las estructuras de otras tubulisinas y pretubulisinas que contienen amina terciaria ilustrativas y la forma de su incorporación en un LDC se proporcionan en modalidades de unidades de fármaco cuaternizado basadas en tubulisina.
Los métodos ilustrativos de preparación de fármacos de tubulisina y las relaciones estructura-actividad se proporcionan por Shankar y otros "Synthesis and structure-activity relationship studies of novel tubulysin U analogseffect on cytotoxicity of structural variations in the tubuvaline fragment" Org. Biomol. Chem. (2013) 11: 2273-2287; Xiangming y otros, "Recent advances in the synthesis of tubulysins" Mini-Rev. Med. Chem. (20l3) 13: 1572-8; Shankar y otros, "Synthesis and cytotoxic evaluation of diastereomers and N-terminal analogs of Tubulysin-U" Tet. Lett. (2013) 54: 6137-6141; Shankar y otros, "Total synthesis and cytotoxicity evaluation of an oxazole analogue of Tubulysin U" Synlett (2011) 2011(12): 1673-6; Raghavan y otros, J. Med. Chem. (2008) 51: 1530-3; Balasubramanian, R. y otros, "Tubulysin analogs incorporating desmethyl and dimethyl tubuphenylalanine derivatives" Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008) 18: 2996-9; y Raghavan y otros, "Cytotoxic simplified tubulysin analogues" J. Med. Chem. (2008) 51: 1530-3.
"Fármaco de dímero de fenazina", como se usa en la presente descripción, es un compuesto que contiene amina terciaria que tiene dos sistemas de anillos de fenazina fusionados con arilo unidos entre sí a través de grupos funcionales carboxamida en sus posiciones C-1 en donde el resto de unión está compuesto por un resto que contiene amina terciaria que está cuaternizado cuando se incorpora como D+ en un LDC de la presente invención. Algunos dímeros de fenazina que contienen aminas terciarias tienen la estructura de Di:
en donde el Anillo A y el Anillo B se seleccionan independientemente de arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido fusionado a un sistema de anillo de fenazina opcionalmente sustituido con uno dos o tres sustituyentes RAy/o RB seleccionados independientemente, R9Ay R9B se seleccionan independientemente de alquilo sustituidos opcionales o tomados junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos y los átomos de carbono intermedios entre estos átomos de nitrógeno comprenden un sistema de anillo heterocicloalquilo y en donde RA, RB, R11A, R11B, n, s y o se definen en modalidades para fármacos cuaternizados que contienen aminas terciarias.
Algunos dímeros de fenazina que contienen amina terciaria ilustrativos o fenazinas que tienen un arilo o heteroarilo fusionado que comprenden un dímero de fenazina de estructura D i se proporcionan por Moorthy y otros "Fused arylphenazines: scaffold for the development of bioactive molecules" Curr. Drug Targets (2014) 15(7): 681-8; Zhuo y otros, "Synthesis and biological evaluation of benzo[a]phenazine derivatives as a dual inhibitor of topoisomerase I and II" Org. Biomol. Chem. (2013) 11(24): 3989-4005; Kondratyuk y otros, "Novel marine phenazines as potential cancer chemopreventive and anti-inflammatory agents" Marine Drugs (2012) 10(2):451-64; Gamage y otros, "Phenazine-1-carboxamides: structure-cytotoxicity relationships for 9-substituents and changes in the H-bonding pattern of the cationic side chain" Bioorg. Med. Chem. (2006) 14(4): 1160-8; Yang y otros, "Novel synthetic isoquinolino[5,4-ab]phenazines: inhibition toward topoisomerase I, antitumor and DNA photo-cleaving activities" Bioorg. Med. Chem. (2005) 13(21): 5909-14. Gamage y otros, "Structure-activity relationships for pyrido-, imidazo-, pyrazolo-, pyrazino-, and pyrrolophenazinecarboxamides as topoisomerase-targeted anticancer agents" J. Med. Chem. (2002) 45(3): 740-3; Vicker y otros, "Novel angular benzophenazines: dual topoisomerase I and topoisomerase II inhibitors as potential anticancer agents" J. Med. Chem. (2002) 45(3):721-39; Mekapati y otros, "QSAR of anticancer compounds: bis(11-oxo-11H-indeno[1,2-b]quinoline-6-carboxamides), bis(phenazine-1-carboxamides), and bis(naphthalimides)" Bioorg. Med. Chem. (2001) 9(11):2757-62; Gamange y otros, "Dicationic bis(9-methylphenazine-1-carboxamides): relationship between biological activity and linker chain structure for a series of potent topoisomerase targeted anticancer agents" J. Med Chem. (2001) 44: 1407-1415; y Spicer y otros, "Bis(phenazine-l-carboxamides): structure-activity relationships for a new class of dual topoisomerase I/II-directed anticancer drugs" J. Med. Chem. (2000) 43(7): 1350-8.
"Fármacos inhibidores de MDR", como se usa en la presente descripción, son compuestos que contienen aminas terciarias que revierten o atenúan la resistencia a múltiples fármacos debido al eflujo mediado por transportadores de fármacos citotóxicos hidrófobos, citostáticos o antiinflamatorios, que confieren resistencia a células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperactivadas a la acción de estos compuestos. Esos transportadores pertenecen típicamente a la familia de transportadores del casete de unión a ATP (ABC) e incluyen la glicoproteína P, la proteína resistente al cáncer de mama y la proteína 1 asociada a la resistencia a múltiples fármacos. Otros transportadores A BC que confieren MDR se describen en Xia y Smith "Drug efflux and multidrug resistance in acute leukemia: therapeutic impact and novel approaches to mediation" Mol. Pharmacol. (2012) 82(6): 1008-1021. Los fármacos inhibidores de MDR que contienen amina terciaria ilustrativos se proporcionan por Zinzi y otros "Small and innovative molecules as new strategy to revert MDR" Front. Oncol. (2014) doi: 10.3389/onc.2014.00002 e incluyen Tariquidar™ y Elacridar™ y sus derivados según lo proporcionado por Paleva y otros "Interactions of the multidrug resistance modulators Tariquidar and Elacridar and their analogues with p-glycoprotein" Chem. Med. Chem. (2013) doi: 10.1002/cmdc.201300233. Aunque los fármacos inhibidores de MDR que contienen aminas terciarias no son citotóxicos o citostáticos por derecho propio, se clasifican como tales para su inclusión en fármacos citotóxicos o citostáticos que contienen aminas terciarias que se liberan de un LDC de la presente invención.
Se proporcionan fármacos inhibidores de MDR ilustrativos que tienen una amina terciaria que se incorporan en una unidad de fármaco cuaternizada en modalidades para fármacos que contienen aminas terciarias cuaternizados. Normalmente, esos fármacos se caracterizan por una subestructura de isoquinolina cuyo nitrógeno es el sitio de cuaternización cuando se incorpora a un LDC. Por tanto, algunos inhibidores de MDR ilustrativos tienen la estructura de:
en donde Ar es un arilo opcionalmente sustituido e incluyen Tariquidar™ y Elacridar™.
"Prevenir", "que previene" y términos similares, tal como se usan en la presente descripción, adquieren su significado normal y habitual en las técnicas médicas y, por tanto, no requieren que se evite con certeza cada caso al que se refiere el término.
"Metabolito ¡ntracelular", como se usa en la presente descripción, se refiere a un compuesto resultante de un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un<l>D<c>. El proceso o reacción metabólica puede ser un proceso enzimático tal como la escisión proteolítica de un enlazador peptídico de un LDC. Los metabolitos intracelulares incluyen, pero no se limitan a, el resto de direccionamiento y el fármaco libre que han sufrido escisión intracelular después de la entrada, difusión, captación o transporte hacia una célula diana.
"Escindido intracelularmente", "escisión intracelular" y términos similares usados en la presente descripción se refieren a un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un LDC o similar, mediante el cual se rompe la unión covalente, por ejemplo, el enlazador, entre la amina cuaternaria y el anticuerpo, dando como resultado el fármaco libre que contiene amina terciaria, u otro metabolito del conjugado disociado del resto de direccionamiento dentro de la célula. Los restos escindidos de los LDC son, por tanto, metabolitos intracelulares.
"Biodisponibilidad", como se usa en la presente descripción, se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad determinada de un fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición tanto del tiempo (velocidad) como de la cantidad total (extensión) del fármaco que llega a la circulación general a partir de una forma de dosificación administrada.
"Sujeto", como se usa en la presente descripción, se refiere a un primate o mamífero humano, no humano que tiene un trastorno de hiperproliferación, inflamatorio o inmunológico o propenso a tal un trastorno que se beneficiaría de la administración de una cantidad efectiva de un LDC. Los ejemplos no limitantes de un sujeto incluyen humano, rata, ratón, cobaya, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, pájaro y ave. Típicamente, el sujeto es un humano, primate no humano, rata, ratón o perro.
El término "inhibir" o "inhibición de" significa reducir en una cantidad medible o prevenir por completo. La inhibición de la proliferación de células hiperproliferativas para un ADC se determina típicamente en relación con las células no tratadas (tratadas simuladamente con vehículo) en un sistema de prueba adecuado como en cultivo celular(in vitro)o en un modelo de xenoinjerto(in vivo).Típicamente, se usa como control negativo un LDC compuesto por un resto dirigido a un antígeno que no está presente en las células hiperproliferativas o en las células inmunoestimulantes activadas de interés.
El término "cantidad con eficacia terapéutica" se refiere a una cantidad de un fármaco que es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad con eficacia terapéutica del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, desacelerar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, desacelerar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar, hasta cierto punto, uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco pueda inhibir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
En el caso de trastornos inmunitarios resultantes de células inmunitarias hiperestimuladas, una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células inmunitarias hiperestimuladas, el grado de su estimulación y/o infiltración en tejido por lo demás normal y/o aliviar a en cierta medida, uno o más de los síntomas asociados con un sistema inmunológico desregulado debido a células inmunitarias hiperestimuladas. Para los trastornos inmunitarios debidos a células inmunitarias hiperestimuladas, la eficacia se puede medir, por ejemplo, evaluando uno o más sustitutos inflamatorios, incluidos uno o más niveles de citocinas como los de IL-1p, TNFa, INFy y M CP-1, o números de macrófagos activados clásicamente.
En algunos aspectos de la invención, el conjugado ligando-fármaco se asocia con un antígeno en la superficie de una célula diana (es decir, una célula hiperproliferante o una célula inmune hiperestimulada), y el conjugado ligandofármaco se absorbe dentro de una célula diana a través de endocitosis mediada por receptores. Una vez dentro de la célula, se escinden una o más unidades de escisión dentro de la unidad enlazadora, lo que da como resultado la liberación del fármaco que contiene amina terciaria. El fármaco que contiene amina terciaria liberado queda libre para migrar en el citosol e inducir actividades citotóxicas o citostáticas o, en el caso de células inmunitarias hiperestimuladas, puede inhibir alternativamente la transducción de señales proinflamatorias. En otro aspecto de la invención, el fármaco se escinde del conjugado ligando-fármaco fuera de la célula diana pero dentro de la vecindad de la célula diana de manera que la unidad que contiene amina terciaria liberada penetra posteriormente en la célula en lugar de liberarse en sitios distales.
El término "portador" como se usa el término en la presente descripción se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra un compuesto. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo. Los portadores pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En una modalidad, cuando se administra a un paciente, el compuesto o las composiciones y los vehículos farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un portador ilustrativo cuando los compuestos se administran por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados incluyen, además, excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
"Tratar" o "tratamiento", y términos similares, a menos que el contexto indique lo contrario, se refieren a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas para evitar recaídas, en donde el objetivo es inhibir o desacelerar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, como el desarrollo o la propagación del cáncer o el daño tisular por inflamación crónica. Típicamente, los resultados clínicos beneficiosos o deseados de tales tratamientos terapéuticos, incluyen, entre otros, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, retraso o enlentecimiento de la evolución de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia o la calidad similar en comparación con la supervivencia esperada o la calidad de vida si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen la afección o trastorno, así como los propensos a tener la afección o trastorno.
En el contexto del cáncer o una enfermedad relacionada con la inflamación crónica, el término "que trata" incluye cualquiera o todo el crecimiento inhibidor de células tumorales, células cancerosas o de un tumor; inhibir la replicación de células tumorales o células cancerosas, inhibir la diseminación de células tumorales o células cancerosas, disminuir la carga tumoral general o disminuir el número de células cancerosas, inhibir la replicación o estimulación de células inmunitarias proinflamatorias, inhibir o disminuir el estado inflamatorio crónico de un sistema inmunológico desregulado o disminuir la frecuencia y/o intensidad de los brotes experimentados por sujetos que tienen una afección o enfermedad autoinmune o mejorar uno o más síntomas asociados con el cáncer o una enfermedad o afección estimulada por hiperinmunidad.
"Sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente descripción, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto. El compuesto típicamente contiene al menos un grupo amino y, por consiguiente, se pueden formar sales de adición de ácido con el grupo amino. Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilenbis-(2-hidroxi-3-naftoato)).
Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula, como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica que estabilice la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los ejemplos donde múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
Típicamente, una sal farmacéuticamente aceptable se selecciona de las descritas en PH Stahl y C G Wermuth, editores, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, Weinheim/Zürich:Wiley-VCH/VHCA, 2002. La selección de la sal depende de las propiedades que debe exhibir el fármaco, incluida la solubilidad acuosa adecuada a varios valores de pH, según la vía de administración prevista, la cristalinidad con características de flujo y baja higroscopicidad (es decir, absorción de agua frente a humedad relativa) adecuada para manipulación y vida útil requerida mediante la determinación de la estabilidad química y del estado sólido en condiciones aceleradas (es decir, para determinar la degradación o cambios de estado sólido cuando se almacena a 40 °C y 75 % de humedad relativa).
"Carga", "carga de fármaco", "carga de carga útil" o términos similares representan o se refieren al número medio de cargas útiles ("carga útil" y "cargas útiles" se usan en la presente descripción indistintamente con "fármaco" y "fármacos") en una población de LDC (es decir, una composición de LDC que difiere en el número de unidades D+ unidas que tienen la misma ubicación o ubicaciones de conexión diferentes, pero por lo demás esencialmente idénticas en estructura). La carga de fármaco puede variar de 1 a 24 fármacos por resto de direccionamiento. Esto a veces se denomina DAR, o relación entre fármaco y resto de direccionamiento. Las composiciones de LDC descritas en la presente descripción típicamente tienen DAR de 1 a 24 y, en algunos aspectos, de 1 a 8, de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 5 y de 2 a 4. Los valores típicos de DAR son aproximadamente 2, aproximadamente 4, aproximadamente 6 y aproximadamente 8. El número medio de fármacos por anticuerpo, o valor DAR, puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía UV/visible, espectrometría de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar un valor DAR cuantitativo. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de LDC homogéneos que tienen un valor de DAR particular se puede lograr por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis. La DAR puede estar limitado por el número de sitios de unión en el resto de direccionamiento.
Por ejemplo, cuando el resto de direccionamiento es un anticuerpo y el sitio de unión es un tiol de cisteína, un anticuerpo puede tener solo uno o varios suficientemente reactivo tiol grupos que reaccionan con una Lb que contiene resto. A veces, el tiol de cisteína es un grupo tiol derivado de un residuo de cisteína que participo en un enlace disulfuro entre cadenas. Otras veces, el tiol de cisteína es un grupo tiol de un residuo de cisteína que no participo en un enlace disulfuro entre cadenas, pero que se introdujo mediante ingeniería genética. Típicamente, menos del máximo teórico de restos D+ se conjuga con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Por ejemplo, un anticuerpo puede contener muchos residuos de lisina que no reaccionan con una Lb que contiene resto, ya que solo los mayoría de los grupos de lisina reactivos pueden reaccionar con ese resto.
"Antibiótico", como se define en la presente descripción, significa un compuesto de origen natural, semisintético o sintético que ejerce principal o selectivamente un efecto sobre las células procariotas (por ejemplo, bacterias) en comparación con las células de mamífero. Un antibiótico inhibe típicamente el crecimiento de microorganismos sin una toxicidad significativa para el ser humano o animal al que se le administra el antibiótico. Los antibióticos incluyen, por ejemplo, penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y ansamisinas. Los antibióticos se usan principalmente en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Los fármacos contemplados para la presente invención no son antibióticos.
I. Aspectos
En la presente descripción se proporcionan conjugados ligando-fármaco (LDC) capaces de suministrar preferentemente un fármaco que contiene una amina terciaria a células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperactivas o en las proximidades de tales células anómalas en comparación con las células normales o el entorno de las células normales donde las células anómalas típicamente no están presentes que son útiles para tratar enfermedades y afecciones caracterizadas por estas células anómalas.
1.1 General:
Un LDC tiene tres componentes principales: (1) una unidad de ligando de un resto de direccionamiento que se une selectivamente a un resto diana presente en, dentro o en las proximidades de células anómalas u otras células no deseadas en comparación con otros restos presentes en, dentro o en las proximidades de células normales donde estas células anómalas o no deseadas normalmente no están presentes, o están presentes en, dentro o en las proximidades de células anómalas u otras células no deseadas en mayor abundancia en comparación con las células normales o el entorno de las células normales donde las anómalas o células no deseadas típicamente no están presentes, (2) una unidad de fármaco cuaternizada que incorpora la estructura correspondiente a un fármaco que contiene una amina terciaria y (3) una Unidad Enlazadora que conecta D+ a la Unidad de Ligando y es capaz de liberar condicionalmente fármaco que contiene la amina terciaria libre dentro o cerca de células anómalas o no deseadas que son la diana de la unidad de ligando.
Un fármaco que contiene amina terciaria a usar en la presente invención es uno que ejerce su efecto principal o selectivamente (por ejemplo, efecto citotóxico, citostático) sobre células de mamífero en comparación con células procariotas. En algunos aspectos, el resto diana es un epítopo de una proteína de membrana de presentación extracelular que se encuentra preferentemente en células anómalas o no deseadas en comparación con las células normales.
En algunos aspectos, una unidad de fármaco citotóxico, citostático, inmunosupresor o antiinflamatorio (D) que tiene un grupo amino terciario se incorpora a un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+) y tiene actividad intracelular hacia células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperactivadas u otras células anómalas o no deseadas que en forma "libre" (es decir, D se libera de D+) pueden o no ser específicas de estas células. Por lo tanto, D puede tener actividad citotóxica, citostática, inmunosupresora o antiinflamatoria selectiva o inespecífica hacia células anómalas o no deseadas en comparación con las células normales que no están asociadas con las células anómalas o no deseadas. La especificidad hacia las células anómalas o no deseadas (es decir, las células diana) en cualquier situación resulta de la Unidad de Ligando (L) del LDC en la que se incorpora D. Además de L y D+, un LDC que se dirige a células anómalas o no deseadas normalmente tiene una unidad enlazadora que une covalentemente la unidad de fármaco cuaternizada a la unidad de ligando. En algunos aspectos, la Unidad de Ligando es de un anticuerpo, que es un resto de direccionamiento ejemplar, que reconoce células de mamíferos anormales que son células hiperproliferativas.
En algunos aspectos, l resto diana reconocido por la unidad de ligando es un epítopo de una proteína de membrana de presentación extracelular que se encuentra preferentemente en células anómalas o no deseadas en comparación con las células normales. En algunos de esos aspectos, como requisito adicional, la proteína de membrana a la que se dirige la unidad de ligando debe tener un número de copias suficiente y ser internalizada tras la unión del LDC para administrar intracelularmente una cantidad eficaz de citotóxico, citostático e inmunosupresor unido. o fármaco antiinflamatorio preferentemente a las células anómalas. Debido a esas restricciones, el fármaco liberado de D+ es típicamente un compuesto altamente activo que, como fármaco independiente, normalmente no se puede administrar a un sujeto debido a los efectos secundarios intolerables de destrucción, daño o inhibición no deseada de células normales distantes o periféricas al deseado sitio de acción.
Dado que un fármaco que contiene una amina terciaria que tiene efectos periféricos adversos debe ser administrado selectivamente por su LDC, la unidad Enlazadora de un LDC no es simplemente una estructura pasiva que sirve como un puente entre un resto de direccionamiento y D+ a partir del cual el fármaco que contiene amina terciaria se libera, pero debe diseñarse cuidadosamente para que tenga estabilidad desde el sitio de administración del LDC hasta su administración al sitio objetivo y luego debe liberar de manera eficiente un resto de fármaco activo. Para llevar a cabo esta tarea un resto de direccionamiento se hace reaccionar con un Lb' que contiene resto para formar una Lb que contiene resto. Cuando así se formó el resto Lb que contiene es un LDC tales compuestos son típicamente compuestos por el resto de direccionamiento en la forma de una unidad de ligando, un resto de unión a ligando (Lb) también se conoce como un enlazador primario (LR), un fármaco que contiene amina terciaria cuaternizada (D+) y un enlazador secundario (Lo) intermedio entre Lb y D+.
1.1 Enlazador primario (LR):
Un enlazador primario (Lr) es un resto de unión de ligando (Lb) o un precursor del resto de unión de ligando (Lb') y típicamente está presente como un componente de una unidad enlazadora de un LDC o un resto que contiene Lb' tal como Lb'-Lo o Lb'-Lo-D+. El enlazador primario de un Lb' que contiene resto se compone de un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo funcional electrófilo o nucleófilo de un resto de direccionamiento. Como resultado de esa reacción, el resto de direccionamiento se une covalentemente a un enlazador primario a través de Lb, en donde el enlazador primario es ahora Lb que tiene un grupo funcional derivado de Lb'.
En algunas modalidades, Lb' en un resto que contiene Lb' tiene la estructura de uno de
en donde R es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido; _T es -Cl, -Br, -I, -O-mesilo, -O-tosilo u otro grupo saliente sulfonato; U es -F, -Cl, -Br, -I, -ON-succinimida, -O-(4-nitrofenil), -O-pentafluorofenilo, tetrafluorofenilo u -O-C(=O)-OR57; _X2 es alquileno C 1-10, carbociclo C 3-C 8, -O-(alquilo C 1-C 6), -arileno-, alquileno C 1-C 10-arileno, -arileno-C<1>-C<10>alquileno, alquileno-C<1>-C<10>-(carbociclo C<3>-C<6>)-, -(carbociclo C<3>-C<8>)-alquileno C<1>-C<10>, heterociclo C<3>-C<8>, alquileno-C<1>-C<10>-(heterociclo C<3>-C<8>)-, heterociclo-C<3>-C<8>)-alquileno C<1>-C<10>, -(CH<2>CH<2>O V o - CH<2>CH<2>O V C H<2>-, en donde u es un número entero que varía de 1 a 10 y R57 es alquilo o arilo C 1-C 6; y en donde la línea ondulada indica unión covalente a una subunidad de Lo.
En la interacción con un electrófilo o nucleófilo de un resto de direccionamiento, Lb' se convierte en un resto Ligando-Lb como se ejemplifica a continuación, donde ha tenido lugar una de tales interacciones:
en donde el átomo indicado (#) se deriva del resto reactivo del ligando y X 2 es como se define.
1.2 Enlazadores secundarios (Lo):
Los enlazadores secundarios en un LDC o un precursor que contiene Lb del mismo, es un resto orgánico situado entre el enlazador primario (Lr) y la unidad de fármaco cuaternizada (D+) que proporciona el procesamiento de una unidad escindible dentro de la unidad enlazadora del LDC. después de la unión selectiva del resto de diana de LDC a su resto de diana afín presente en, dentro o en las proximidades de células hiperproliferativas, células inmunitarias hiperactivas u otras células anómalas o no deseadas dirigidas por LDC. En algunas modalidades, W proporciona un sustrato para una proteasa que está presente dentro de células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperactivas. Se prefieren aquellas unidades de escisión que no son reconocidas por proteasas excretadas por células normales que no están típicamente en presencia de células hiperproliferativas o células inmunitarias hiperactivas o sustratos de proteasas que tienen circulación sistémica para minimizar la liberación de fármacos no dirigida. o exposición sistémica al fármaco que contiene amina terciaria debido a su liberación prematura de su LDC. Más preferidas son aquellas proteasas que son proteasas reguladoras o proteasas que se encuentran en los lisosomas, que son compartimentos celulares a los que se administra un LDC tras la internalización de un receptor de la superficie de la membrana al que la LDC se ha unido específicamente. Las proteasas reguladoras y lisosomales son proteasas intracelulares ilustrativas.
En una modalidad, W dentro de un enlazador secundario está compuesto por o consiste en un resto dipeptídico que tiene la estructura de:
en donde R29 es bencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, -CH(OH)CH<3>o tiene la estructura de
y R30 es metilo, -(CH<2>)<4>-NH<2>, -(CH<2>)<3>NH(C=O)NH<2>, - (CH<2>)<3>NH(C=NH)NH<2>, o, -(CH<2>)<2>CO<2>H, en donde el resto dipeptídico proporciona un sitio de reconocimiento para una proteasa reguladora o lisosómica.
En modalidades preferidas, el dipéptido es valina-alanina (val-ala). En otra modalidad, W está compuesto por o consiste en el dipéptido valina-citrulina (val-cit). En otra modalidad, W está compuesto por o consiste en el dipéptido treonina-ácido glutámico (thr-glu). En algunas de esas modalidades, el resto dipeptídico se une covalentemente a una unidad SI de Y a través de un enlace amida formado entre el grupo funcional de ácido carboxílico alanina o citrulina o el grupo funcional ácido alfa carboxílico de glutamato y un grupo amino arilo o heteroarilo del SI. Por tanto, en esas modalidades, SI está compuesto por un resto arilamina o heteroarilamina y el grupo funcional ácido carboxílico mencionado anteriormente de un resto dipeptídico forma un enlace anilida con el nitrógeno amínico ese resto arilamina.
En otra modalidad, W dentro de un enlazador secundario está compuesto por un resto carbohidrato unido por enlace glicosídico que tiene un sitio de reconocimiento para una glicosidasa localizada intracelularmente. En esas modalidades, W es un resto carbohidrato unido a E en donde W -E proporciona el sitio de reconocimiento para la escisión de W de E y el enlace entre W y E es un enlace glicosídico. En esas modalidades, W -E típicamente tenemos la estructura de
donde R45 es -C H<2>OH o -C O<2>H y E es un resto heteroátomo tal como -O-, -S - o -NH- unido al resto carbohidrato y a un resto autodestructivo de Y (como se indica mediante la línea ondulada) donde el enlace al resto carbohidrato proporciona un sitio de reconocimiento para una glicosidasa. Preferentemente, ese sitio es reconocido por una glicosidasa de lisosoma. En algunas modalidades, la glicosidasa es una glucuronidasa como cuando R43 es -C O<2>H.
Los enlazadores secundarios además de W también están compuestos por una unidad espaciadora (Y) y pueden estar compuestos adicionalmente por una unidad de extensión (A) dispuesta con respecto a W en una relación lineal u ortogonal representada por
respectivamente, en donde el subíndice w es 1, y es 1 y el subíndice a es 0 o 1;
en donde la línea ondulada a Y indica unión covalente de Y a D+ y la línea ondulada a A cuando a es 1 en ambas estructuras, o a W cuando está en disposición lineal con Y-D+ o a Y cuando W está en disposición ortogonal con Y-D+ cuando a es 0, indica unión covalente de A, W o Y, respectivamente, a Sc de Lb o Lb'. En modalidades preferidas, a, w e y son cada uno.
Las estructuras de algunos restos A, W e Y en Lo ilustrativos y sus sustituyentes se describen en los documentos WO 2004/010957, WO 2007/038658, patente de EE. UU. núm. 6,214,345, 7,498,298, 7,968,687 y 8,163,888, y US Pat. Publ. Nos. 2009-0111756, 2009-0018086 y 2009-0274713.
En algunas modalidades, los restos A o sus subunidades (por ejemplo, A<1>, Ao) tienen la estructura de
en donde la línea ondulada al resto carbonilo de cualquier estructura representa el punto de unión al extremo amino terminal de un resto dipeptídico que comprende W dispuesto linealmente con respecto a A o al resto autodestructivo de SI en Y descrito en la presente descripción al que W está unido a Y y está dispuesto ortogonal a A y en donde la línea ondulada al resto amino de cualquiera de las estructuras representa el punto de unión a un grupo funcional que contiene carbonilo de Sc en Lb o Lb';
en donde K y L son independientemente C, N, O o S, siempre que cuando K o L es O o S, R41 y R42 a K o R43 y R44 a L están ausentes, y cuando K o L son N, uno de R41, R42 a K o uno de R42, R43 a L están ausentes, y siempre que no se seleccionen dos L adyacentes independientemente como N, O o S;
en donde q es un número entero que varía de 0 a 12, y r es un número entero que varía de 1 a 12:
en donde G es hidrógeno, alquilo C 1-C 6 opcionalmente sustituido, -OH, -O R PR, -C O 2H, C O 2RPR, en donde RPR es un protector adecuado, -N(Rpr)(Rpr), en donde RPR son independientemente un grupo protector o RPR juntos forman un grupo protector adecuado, o -N(R45)(R46), en donde uno de R45, R46 es hidrógeno o RPR, en donde RPR es un grupo protector adecuado grupo protector, y el otro es hidrógeno u alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido; en donde R38 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido; R39-R 44 son independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, o ambos R39, R40 junto con el carbono al que están unidos comprenden un cicloalquilo C 3-C 6, o R41, R42 junto con K al que están unidos cuando K es C, o R43, R44 junto con L al que están unidos cuando L es C comprenden un cicloalquilo C<3>-C<6>, o R40 y R41, o R40 y R43, o R41 y R43 junto con el carbono o heteroátomo al que están unidos y los átomos intermedios entre esos carbono y/o heteroátomos comprenden un cicloalquilo o heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros, siempre que cuando K es O o S, R41 y R42 están ausentes, cuando K es N, uno de R41, R42 está ausente, cuando L es O o S, R43 y R44 están ausentes, y cuando L es N, uno de R43, R44 está ausente.
En algunas modalidades, R38 es hidrógeno. En otras modalidades, -K(R41)(R42) es -(CH<2>)-. En otras modalidades, cuando p no es 0, R39 y R40 son hidrógeno en cada caso. En otras modalidades, cuando q no es 0, -L(R43)(R44)- es -CH<2>- en cada caso.
En modalidades preferidas, G es -C O<2>H. En otras modalidades preferidas, K y/o L son C. En otras modalidades preferidas, q o p es 0. En otras modalidades preferidas, p q es un número entero que varía de 1 a 4.
En algunas modalidades, A o una subunidad de la misma tiene la estructura de -NH-alquileno C<1>-C<10>-C(=O)-, -NH-alquileno C<1>-C<10>-NH-C(=O)-alquileno C<1>-C<10>-C(=O)-, -NH-alquileno C r C<10>-C(=O)-NH-alquileno C<1>-C<10>(C=O)-, -NH-(CH<2>CH<2>O)s-CH<2>(C=O)-, -NH-(carbociclo C<3>-C<8>)(C=O)-, -NH-(arileno-)-C(=O)-, y -NH-(heterociclo C<3>-C<8>-)C(=O).
En otras modalidades, A o una subunidad del mismo tiene la estructura de
en donde R13 es -alquileno C 1-C 10-, -carbociclo C 3-C 8-, -arileno-, -heteroalquileno C 1-C 30-, -heterociclo C 3-C 8-, -alquileno-arileno C<1>-C<10>-, -arileno-alquileno C<1>-C<10>-, -alquileno C<1>-C<10>-(carbociclo C<3>-C<8>)-, -(carbociclo C<3>-C<8>)-alquileno C<1>-C<10>-, -alquileno C r C<10>-(heterociclo C<3>-C<8>)-, -(heterociclo C<3>-C<8>)-alquileno C<1>-C<10>-, -(CH<2>CH<2>O)<m 0>(-CH<2>)<1-3>-, o -(CH<2>CH<2>NH)<1-10>(-CH<2>)<1-3>-. En algunas modalidades, R 13 es -alquileno C<1>-C<10>o -heteroalquileno C<1>-C<30>. En algunas modalidades, R13 es -alquileno C<1>-C<10>, -(CH<2>CH<2>O)<m 0>(-CH<2>)<1-3>-, o -(CH<2>CH<2>NH)<m 0>(-CH<2>)<1-3>-. En algunas modalidades, R 13 es -alquileno C<1>-C<10>-polietilenglicol, o polietilenimina.
En modalidades más preferidas, A o una subunidad del mismo corresponde en estructura a un alfa-aminoácido, un resto beta-aminoácido u otro ácido que contiene amina. Otras modalidades de A y las subunidades A<1>y Ao se describen en modalidades para Lr-L o como unidades enlazadoras.
En algunas modalidades, los restos Y son capaces de sufrir una reacción de eliminación 1,4 o 1,6 después del procesamiento enzimático de W unido covalentemente a Y (es decir, Y está compuesto por un SI). En algunas modalidades, SI de Y dispuesto linealmente en Lo tiene la estructura de:
en donde V, Z1, Z2 y Z3 son independientemente -C (R 24)= o -N=; U es -O-, -S - o -N(R25)-;
R24 son independientemente hidrógeno, halógeno, -NO<2>, -CN, -O R 25, -S R 26, -N(R27)(R2), alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, o -C (R 29)=C(R30)-R31, en donde R25 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, R26 es alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido u opcionalmente heteroarilo sustituido, R27 y R28 son independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido o ambos R27 y R28 junto con el nitrógeno al que están unidos comprende un heterociclo de 5 o 6 miembros, R29 y R30 son independientemente hidrógeno, o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, y R31 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, -C(=O)O<r>32 o -C(=O)NR32, en donde R32 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido; y R' es hidrógeno o es halógeno, -NO<2>, -C<n>u otro grupo aceptor de electrones o es un grupo donante de electrones,
con la condición de que no más de dos de los R24 sean distintos de hidrógeno;
en donde J es -O-, S - o -N(R33)-, en donde R33 es hidrógeno o metilo;
en donde la línea ondulada a E representa un enlace covalente de E a un grupo funcional de W que inhibe la capacidad de donación de electrones de E lo suficiente como para estabilizar el resto arileno de SI a eliminación 1,4 o 1,6 y en donde el procesamiento enzimático de W da como resultado la desinhibición de esa capacidad para desencadenar la eliminación que libera un resto de fármaco activo unido a Y (por ejemplo, cuando E está unido al resto carbonilo de un grupo funcional de W que contiene carbonilo);
en donde tras la eliminación 1,4 o 1,6 se libera un compuesto que contiene amina terciaria dentro de D+.
En modalidades preferidas cuando SI está dispuesto linealmente en Lo con respecto a W y D+ SI tiene la estructura de
En modalidades preferidas, -J - es -O - o -N H- y V, Z 1 o Z2 es =C(R24), en donde R24 es hidrógeno o un grupo donante de electrones. En otras modalidades preferidas, R8 y R9 son hidrógeno y V, Z 1 o Z2 es =CH-. En otras modalidades preferidas, -J - es -NH, V, Z 1 o Z2 es =CH - y R' es hidrógeno o un grupo donante de electrones.
En otras modalidades, W -Y está dispuesto ortogonalmente en Lo (es decir, es -Y(W)-dentro de la unidad enlazadora) donde SI de Y está unido a un resto carbohidrato unido por enlace glicosídico que tiene un sitio de reconocimiento para una glicosidasa donde la disposición ortogonal que implica SI está típicamente representado por la estructura de
en donde E está unido a uno de V, Z 1, Z3, siempre que el otro V, Z 1, Z2 (es decir, no unido a E) esté definido por =C(R24)- o =N-, o SI está representado por la estructura de
en donde V, Z 1 y Z3 son independientemente -C (R 24)= o -N=; R24 son independientemente hidrógeno, halógeno, -NO<2>, -CN , -O R 25, -S R 26, -N(R27)(R28), -C (R 29) =C(R30) -R 31 o C<1>-C<6>opcionalmente sustituido;
en donde R25 es hidrógeno, opcionalmente sustituido con alquilo C<1>-C<6>, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R26 es alquilo C 1-C 6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, y R27 y R28 son independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido o ambos R27 y R28 junto con el nitrógeno al que están unidos comprenden un heterociclo de 5 o 6 miembros, R29 y R30 son independientemente hidrógeno, o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, y R31 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, -CN, -C(=O)OR32 o -C(=O)NR32; en donde R32 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido; R' es hidrógeno o es halógeno, -NO<2>, -CN o de otro grupo aceptor de electrones, o es un grupo aceptor de electrones; R45 es -C H<2>OH, -C O<2>H; E es -O- o -NH-; J es -NH-; y D+ es como se define en las modalidades descritas para unidades de fármaco cuaternizados.
En modalidades preferidas cuando W -Y está dispuesto ortogonalmente en Lo SI de Y tiene la estructura de
En modalidades preferidas, -E - es -O - o -NH- y V o Z3 es =C(R24), en donde R24 es hidrógeno o un grupo aceptor de electrones. En otras modalidades preferidas, R8 y R9 son hidrógeno y V, Z 1 o Z2 es =CH-. En otras modalidades preferidas, -J - es -NH, V, Z 1 o Z2 es =CH - y R' es hidrógeno o un grupo aceptor de electrones.
1.3 Lr-L o como unidades enlazadoras
La unidad de fármaco cuaternario (D+) unida a cualquiera de los restos SI anteriores descritos en la presente descripción puede representar cualquier fármaco citotóxico, citostático, inmunosupresor o antiinflamatorio cuaternizado que tenga un resto de amina terciaria (es decir, D+ es un fármaco que contiene una amina terciaria cuaternizada) cuyo nitrógeno cuaternizado está unido a la posición bencílica de un resto SI.
En algunas modalidades -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de
en donde A es una unidad de extensión opcional, opcionalmente compuesta por dos, tres o cuatro subunidades y el subíndice a es 0 o 1; Q2 es W'<w>-E-, en donde Q2, cuando está presente, está unido a V, Z 1, Z2 o Z3; Ww y W'w son unidades escindibles; en donde Ww de Q1 es capaz de escisión selectiva por una proteasa producida por células anómalas dirigidas por el resto diana en comparación con las proteasas séricas circulantes, o por glutatión a través del intercambio de disulfuro, o es más reactivo a la hidrólisis en condiciones de pH más bajas presentes en lisosomas en comparación con el pH fisiológico del suero y W -E de Q2 es escindible por una glicosidasa, en donde el subíndice w es 0 o 1 y w' es 0 o 1, en donde w w' es 1 (es decir, uno y solo un W está presente); V, Z 1, Z2 y Z3 son =N- o =C (R24)-, en donde R24 es hidrógeno o alquilo, alquenilo o alquinilo, opcionalmente sustituido, o halógeno, -NO<2>, -CN, u otro grupo aceptor de electrones o es un grupo donante de electrones, -Q 2, o -C (R 8)(R9)-D+, siempre que cuando w' sea 1 Q2 esté ausente y uno y solo uno R24 sea -C(R8)(R9) D+ de manera que -C(R 8)(R9)-D+ está unido a uno de V, Z 1, Z2, Z3 y Q1-J - y los sustituyentes C(R8)(R9)-D+son ortooparaentre sí,
siempre que cuando w' es 1 uno cualquiera solo R24 es -C(R 8)(R9)-D+ de manera que -C (R 8)(R9)-D+ está unido a uno de V, Z 1, Z2, Z3 y uno y solo otro R24 es Q2 de manera que Q2 está unido a otro de V, Z1, Z2, Z3, y los sustituyentes Q2 y -C (r 8)(R9)-D+ sonorto o paraentre sí; R8 y R9 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo o alquinilo, opcionalmente sustituido, o arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido; E y J son independientemente -O-, -S - o -N(R33)-, en donde R33 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; D+ representa una estructura de un fármaco D que contiene una amina terciaria cuaternizada; y p es un número que varía de 1 a 24; en donde dicha escisión por proteasa, intercambio de disulfuro, hidrólisis o escisión por glicosidasa da como resultado la expulsión de D de D+.
En modalidades preferidas, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde V, Z 1 y Z2 son independientemente =N- o =C(R24)-, en donde R24, independientemente seleccionado, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, y R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior. En otras modalidades preferidas, -Lb-L6-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde V, Z2 y Z3 son independientemente =N- o =C(R24)-, en donde R24, independientemente seleccionado, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, y R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior. En otras modalidades preferidas, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde V es =N- o =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo aceptor de electrones, Z 1 es =N- o =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones y R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido y J es -O - o -N (R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior.
En modalidades más preferidas de la anteriormente de las estructuras -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ compuestas de Q2, V es =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno, halógeno o -NO<2>.
En otras modalidades preferidas, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde V y Z 1 son independientemente =N- o =C(R24)-, en donde R24, independientemente seleccionado, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones y R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior y R' es hidrógeno o un grupo aceptor de electrones.
En otras modalidades preferidas, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde Z 1 es =N- o =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, Z3 es =N- o =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo aceptor de electrones, y R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior, y R' es hidrógeno o un grupo donante de electrones.
En modalidades más preferidas de las estructuras anteriores -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ compuestas de Q2, Z3 es =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno, halógeno o -NO<2>.
En otras modalidades preferidas, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde V y Z3 son independientemente =N- o =C(R24)-, en donde R24, seleccionado independientemente, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior, y R' es hidrógeno o un grupo aceptor de electrones.
En algunas modalidades, L<r>-L<o>-D (es decir, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+) tiene la estructura de
en donde V, Z 1 y Z2 son independientemente =N- o =C(R24)-, en donde R24, seleccionado independientemente, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior, y R' es hidrógeno o un grupo donante de electrones.
En modalidades preferidas, al menos uno de V, Z1, Z2, Z3 en cualquiera de las estructuras anteriores Lr-L o-D+ (es decir, -Lb-Lo-D+ y Lb'-Lo-D+) es -CH = o no es = N-.
En modalidades más preferidas, L<r>-L<o>-D+ (es decir, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+) tiene la estructura de
en donde V, Z 1 o Z3 son =N- o =C(R24)-, en donde R24, seleccionado independientemente, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior, y R' es hidrógeno o un grupo aceptor de electrones.
En modalidades más preferidas de R8 y R9, en donde cualquiera de las estructuras anteriores Lr-L o compuestas de Q 1, son hidrógeno. En otras modalidades más preferidas en la una cualquiera de las estructuras anteriores Lr-L o compuestas de Q1, V, Z1 o Z2 es =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno o un grupo donante de electrones. Por tanto, algunas de esas modalidades más preferidas tienen la estructura de
En otras modalidades más preferidas, A en Q1, cuando A está presente (es decir, a es 1) en una cualquiera de las estructuras anteriores Lr-L o compuestas de Q1, corresponde en estructura a un ácido que contiene amina en donde el terminal ácido carboxílico del ácido que contiene amina está unido a J como un éster<o>amida y su N-terminal está unido a Lb o Lb' a través de un grupo funcional que contiene carbonilo.
En otras modalidades, Lr-L o-D (es decir, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+) tiene la estructura de
en donde V, Z 1 o Z3 son =N- o =C(R24)-, en donde R24, seleccionado independientemente, es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo donante de electrones, R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, y J es -O - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo inferior, y R' es hidrógeno o un grupo aceptor de electrones.
En modalidades más preferidas de R8 y R9, en donde cualquiera de las estructuras anteriores Lr-L o compuestas de Q2, son hidrógeno. En otras modalidades más preferidas, V o Z3 es =C(R24)-, en donde R24 es hidrógeno o un grupo donante de electrones. Por tanto, algunas de esas modalidades más preferidas tienen la estructura de
En otras modalidades más preferidas, A, cuando A está presente en una cualquiera de las estructuras anteriores Lr-L<o>compuestas de Q2, corresponde en estructura a un ácido que contiene amina en donde el terminal ácido carboxílico del ácido que contiene amina está unido a J como un éster o amida y su N-terminal está unido a Lb o Lb' a través de un grupo funcional que contiene carbonilo. En modalidades particularmente preferidas, -Lb-A- o Lb'-A en cualquiera de las modalidades anteriores -Lb-Lo-D+, Lb'-Lc-D+ o L<r>-L<o>-D+ tiene la estructura de M1-A, M1-A<1>-Ao-, M2-A o M2-A<1>-Ao- representada por:
en donde Ai y Ao son subunidades de A, Lb es un resto succinimida (M2) y Lb' es un resto maleimida (M1), en donde -[C(Rb1)(Rb1)]m-[HE]- es A o una subunidad (A<1>) de A; R y Ra2 son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; Ra1 es hidrógeno, alquilo inferior o BU; HE es una unidad potenciadora de hidrólisis (HE) opcional; m es un número entero que varía de 0 a 6; cada Rb1 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, o dos Rb1 junto con el(los) carbono(s) al(a los) que están unidos comprenden un cicloalquilo C<3>-C<6>o uno Rb1 y HE junto con el carbono al que están unidos comprenden un cicloalquilo de 5 o 6 miembros o un heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros y el otro Rb1 es hidrógeno, opcionalmente sustituido alquilo C<1>-C<6>, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; BU es una unidad básica que tiene la estructura de -[C(R1)(R1)]-[C(R2)(R2)]n-N(R22)(R23), en donde n es 0, 1, 2 o 3, R1 son independientemente hidrógeno o alquilo inferior o dos R1 junto con el carbono al que están unidos comprenden un cicloalquilo C<3>-C<6>, R2 son independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, o dos R2 junto con el(los) carbono(s) al(a los) que están unidos y cualquier carbono intermedio definen un cicloalquilo C<3>-C<6>, o un R1 y un R2 junto con los carbonos al que están unidos y cualquier carbono intermedio comprenden un cicloalquilo de 5 o 6 miembros y los R1 y R2 restantes son como se definen; R22 y R23 son independientemente hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido o R22 y R23 junto con el nitrógeno al que están unidos comprenden un heterocicloalquilo de 5 o 6 miembros; y en donde un resto sulfhidrilo de un resto de direccionamiento está unido a M2 como lo indica la línea ondulada al resto de succinimida y en donde la línea ondulada a HE (o a [C(Rb1)(Rb1)]m cuando HE no está presente) indica unión covalente a otra subunidad de A o W en aquellas modalidades donde Q<1>está presente o a V, Z 1, Z2 o Z3 de un resto SI en aquellas modalidades donde Q2 está presente.
En esas modalidades, -Lb y Lb' se denominan restos succinimida (M2) y -Lb-A-, Lb'-A, -Lb-A<1>- o Lb'-A<1>correspondientes a ellos se denominan restos que contienen succinimida, que son restos L<ss>representativos.
En otras modalidades particularmente preferidas, -Lb-A- o -Lb-A<1>-Ao en una cualquiera de las anteriores modalidades que contiene Lb tiene la estructura de M3-A o M3-A<1>-Ao representado por:
en donde Ai y Ao son subunidades de A, y M3A y M3B son regioisómeros de M3 y en donde los grupos variables y la conectividad a un grupo sulfhidrilo de un resto de direccionamiento y HE (o [C(Rb1)(Rb1)]m) son como se definen para los restos que contienen succinimida correspondientes mostrados inmediatamente arriba. En las presentes modalidades, Lb se denomina un resto de ácido succínico-amida (M3) y -Lb-A-, Lb'-A, -Lb-A<1>- o Lb'-A<1>se denominan como restos que contienen amida de ácido succínico, que son restos Ls representativos.
En cualquiera de esas modalidades -Lb-A-, Lb'-A, -Lb-A<1>- y Lb'-A<1>o M1-A, M1-A<1>-Ao-, M2-A, M2-A<1>-Ao-, M3-A y M3-A<1>-Ao cada R b es independientemente preferentemente hidrógeno o alquilo inferior y m es 0 o 1, Ra1 es preferentemente hidrógeno, alquilo inferior o BU o Ra2 es preferentemente hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores que comprenden Q 1 en la que Q 1 se compone de A o A<1>-Ao, las modalidades preferidas son aquellas donde W de Q 1 está unido a A o Ao a través de un grupo funcional amida. En aquellas modalidades de preferencia A, A<1>y Ao tener estructuras independientemente seleccionados correspondientes a los ácidos que contienen amina como se describe en la presente descripción para modalidades de unidad de extensión. En cualquiera de las modalidades anteriores de -Lb-A-, Lb'-A, -Lb-A<1>- y Lb'-A<1>que comprenden A o A<1>, A y A<1>tienen preferentemente estructuras correspondientes a amina que contiene ácidos como se describe en la presente descripción para modalidades unidad de extensión en donde a está unido a W o A<1>está unido a Ao a través de un grupo funcional amida. En cualquiera de las modalidades anteriores M1-A, M1-A<1>-Ao, M2-A, M2-A<1>-Ao-, M3-A y M3-A<1>-Ao, preferentemente A, A<1>y Ao tener estructuras independientemente seleccionados correspondientes a los ácidos que contienen amina como se describe en la presente descripción para la unidad de extensión A y las modalidades de la subunidad Ao. En cualquiera de las modalidades L<ss>o L<s>anteriores que comprenden restos -A(BU)- o -A<1>(BU)-, A y A<1>tienen preferentemente estructuras correspondientes a ácidos que contienen amina sustituidos con BU, y son, por lo tanto, ácidos que contienen diamino como se describe en la presente descripción para modalidades de unidades de extensión y unidades básicas. En los restos que contienen M1, M2 y M3 que tienen restos A o A<1>correspondientes en estructura a un ácido que contiene amina, el nitrógeno amínico del ácido que contiene amina se incorpora como el nitrógeno imínico del sistema de anillo de M1 o M2 o nitrógeno de la amida del resto M3. En los restos que contienen L<ss>o L<s>, el nitrógeno amínico N-terminal del ácido que contiene diamino se incorpora como el nitrógeno imínico del sistema de anillo de M1 o M2 o el nitrógeno amida del resto M3. Preferentemente, para cualquiera de los restos que contienen M1, M2 y M3 anteriores o restos que contienen L<ss>o L<s>, el ácido carboxílico del ácido que contiene amina o el ácido que contiene diamino se incorpora en un grupo funcional amida para Ao para los restos que comprenden A 1-Ao- o W para los restos que comprenden A cuando Ao no está presente.
En otras modalidades preferidas, W está compuesto por un dipéptido reconocido por una proteasa de catepsina, en donde el dipéptido está unido a J de SI a través de otro grupo funcional amida, en donde la catepsina es capaz de escindir el enlace amida de W a SI para provocar la fragmentación de SI para liberar D de D+ unido a SI.
En esas y en cualquiera de las modalidades anteriores que comprenden HE, HE es preferentemente -C(=O)-. En cualquiera de las modalidades anteriores donde W de Q 1 está compuesto por un dipéptido que es reconocido por una catepsina proteasa, los dipéptidos preferidos tienen la estructura de
en donde R34 es bencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, -CH(OH)CH<3>o tiene la estructura de
y R35 es metilo, -(CH<2>)<4>-NH<2>, -(CH<2>)aNH(C=O)NH<2>, (CH<2>)aNH(C=NH)NH<2>, o -(CH<2>)<2>CO<2>H, en donde la línea ondulada en el dipéptido N-terminal indica unión covalente a A o Lb o Lb y la línea ondulada en el dipéptido C -terminal indica unión covalente a J de un resto SI.
En modalidades preferidas compuestas por Q 1, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde A<1>y Ao son subunidades de A, en donde Ao es una subunidad opcional (es decir, A<1>se convierte en A cuando Ao está ausente), en donde R34 es metilo, isopropilo o -CH(OH)CH<3>y R35 es metilo, -(CH<2>)<3>NH(C=O)NH<2>o -(CH2)2CO 2H, en donde R', R8, R9, J, V, Z 1 y Z 2 son como se definieron previamente para la Fórmula I. En modalidades más preferidas, R8 y R9 son hidrógeno. En otras modalidades más preferidas, J es -NH-. En otras modalidades más preferidas, J, V, Z 1 y Z2 son cada uno -CH =. También son más preferidas aquellas modalidades en las que Lb' tiene la estructura de un resto maleimida (M1) o en donde Lb tiene la estructura de un resto succinimida (M2) o un resto ácido succínico-amida (M3).
En otras modalidades preferidas compuestas de Q 1 un conjugado ligando fármaco o un compuesto de Enlazador fármaco de fórmula LR-Lo-D+ tiene la estructura de
en donde el subíndice w es 1, 2, 3 o más, preferentemente 2, y donde W consiste o está compuesto por un dipéptido donde el dipéptido son subunidades secuenciales de aminoácidos de Ww donde la subunidad del dipéptido está en el extremo distal de Ww (es decir, el dipéptido tiene la fórmula -W<2>-W<1>-) y el enlace indicado es un enlace amida que se puede escindir específicamente mediante una proteasa intracelular en comparación con las proteasas séricas que circulan libremente. En algunas modalidades, cuando el subíndice a es 1, la unidad de extensión (A) es una unidad de ramificación. En otras modalidades, cuando Aa está compuesto por una Unidad de Ramificación (B) y el subíndice a es 2 o más, B está preferentemente en la subunidad distal de Aa. En otras modalidades, B está preferentemente conectado al extremo proximal de Ww y B está preferentemente en el extremo distal de Aa (por ejemplo, B es A<o>cuando Aa es -A-<i>-A<o>- o Aa es -A<1>-AO-B-) Para cualquiera de esas modalidades, la Unidad de Ramificación se sustituye por una Unidad de Solubilización.
En modalidades más preferidas, A o Ai y Ao en -A-i-AO- se representan independientemente por las estructuras (3) o (4):
en donde la línea ondulada al resto carbonilo de cualquier estructura representa el punto de unión de A o A0 a W o Ai a Ao preferentemente a través de un grupo funcional amida y en donde la línea ondulada al resto amino de cualquier estructura representa el punto de unión de A o Ai a Lb o Lb' o a un grupo funcional de Ai que contiene carbonilo formando preferentemente un grupo funcional amida; en donde los grupos variables son como se definieron previamente para las estructuras que representan A. En modalidades preferidas, L está ausente (es decir, q es 0) y G es hidrógeno, BU, -C O 2H o -NH2 o la cadena lateral de un amino natural ácido como ácido aspártico, ácido glutámico o lisina. En otras modalidades preferidas, L y K son carbono y R41, R42, R43 y R44 en cada caso es hidrógeno. En otras modalidades preferidas, R38-R 44 en cada caso es hidrógeno. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (3) en donde K es nitrógeno y uno de R41, R42 está ausente y el otro es hidrógeno. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (4) en donde r es 1, K es nitrógeno y uno de R41, R42 está ausente y el otro es hidrógeno. En otras modalidades preferidas, p y q de estructura (3) son 0 o q y r de estructura (4) son 0. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (3) en donde p y q son ambos 0 y K junto con R41 y R42 es -C(=O)-. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (4) en donde q es 1 y L junto con R43 y R44 es -C(=O)-.
La estructura (3) y (4) también representan modalidades preferidas para W2 en -W 3-W 2-W 1- y una unidad de ramificación proporcionada en el último caso G es-CO 2H o -NH2 o la cadena lateral de un aminoácido de origen natural como el ácido aspártico, el ácido glutámico o la lisina.
En modalidades más preferidas, A, Ai o Ao tiene la estructura de (3a) o (4a)
en donde p o q es 0 o 1.
Cuando un resto LSS o LS se compone de A o A1 las estructuras preferidas de A o A1 corresponden a las mostrados para (3), (3a), (4) y (4a) en donde R38 está ausente, G es una unidad básica (BU) y el nitrógeno N-terminal se incorporan en un resto M1 o M2 como el nitrógeno imínico de ese sistema de anillos de restos o se incorporan en un resto M3 como el nitrógeno amídico de la amida del ácido succínico.
En otras modalidades más preferidas, A o Ai y Ao de A corresponden independientemente en estructura a un alfaamino, beta-amino u otro ácido que contiene amina. Cuando un resto L<ss>o L<s>se compone de A o Ai, se prefieren restos A o Ai que corresponden en estructura a una alfa-amino, beta-amino u otro ácido que contiene amina sustituido con BU (es decir, es un ácido que contiene diamino), en donde el nitrógeno N-terminal del alfa-amino, beta-amino u otro ácido que contiene amina sustituido con BU, que está representado por A(BU) o A1(BU), se incorpora en un M1 o el resto M2 como el nitrógeno imínico del sistema de anillo de ese resto o se incorpora en M3 como el nitrógeno amídico del resto amida del ácido succínico.
En esas modalidades, A(BU) o Ai(BU) particularmente preferidos tienen la estructura de (3) o (3a) donde p es 0 y G es BU o tienen la estructura de (4) o (4a) donde q es 1 y G es BU. En modalidades compuestas por Q1 en donde Ao está presente, los ácidos que contienen amina particularmente preferidos que corresponden a Ao tienen la estructura de -NH2-X--C02H en donde X 1 es un alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, que incluye ácido e-aminocaproico y ácido p-amino-propiónico.
En modalidades preferidas de Unidades Enlazadoras de los LDC y sus precursores fármaco-enlazador se compone de Q<2>que proporciona un carbohidrato unido por enlace glicosídico que tiene un sitio de reconocimiento para una glicosidasa. En otras modalidades preferidas compuestas por Q<2>, -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde A<1>y Ao son subunidades de A donde Ao es una subunidad opcional (es decir, cuando Ao está ausente, A<1>se convierte en A), R45 es -C H<2>OH o -C O<2>H, y R8, R9, V, Z3, E y J son como se definieron previamente. En modalidades más preferidas, R8 y R9 son hidrógeno. En otras modalidades más preferidas, E es -O-. En otras modalidades más preferidas, J es -NH-. En otras modalidades más preferidas, uno o ambos de V y Z3 son -CH=. También son más preferidas aquellas modalidades en las que Lb' tiene la estructura de un resto maleimida (M1) o en las que Lb tiene la estructura de un resto succinimida (M2) o un resto ácido succínico-amida (M3). Son más preferidas aquellas modalidades en las que Lb'-A<1>tiene la estructura de M1-A<1>, o Lb-A<1>tiene la estructura dada anteriormente para M2-A<1>o M3-A<1>. En cualquiera de estas modalidades
En modalidades preferidas compuestas por Q2, Ao está presente y tiene la estructura previamente definida para (3), (3a), (4) o (4a), en donde la línea ondulada al resto carbonilo de cualquiera de las estructuras representa el punto de unión de Ao de J preferentemente a través de un grupo funcional amida y en donde la línea ondulada con el resto amino de cualquiera de estructura representa el punto de unión a un grupo funcional que contiene carbonilo de A<1>, formando preferentemente un grupo funcional amida; en donde los grupos variables son como se definieron previamente para las estructuras que representan A. En modalidades preferidas, L está ausente (es decir, q es 0) y G es hidrógeno, -C O<2>H o -NH<2>o la cadena lateral de un aminoácido natural tal como ácido aspártico, ácido glutámico o lisina. En otras modalidades preferidas, L y K son carbono y R41, R42, R43 y R44 en cada caso es hidrógeno. En otras modalidades preferidas, R38-R 44 en cada caso es hidrógeno. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (3) en donde K es nitrógeno y uno de R41, R42 está ausente y el otro es hidrógeno. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (4) en donde r es 1, K es nitrógeno y uno de R41, R42 está ausente y el otro es hidrógeno. En otras modalidades preferidas, p y q de estructura (3) son 0 o q y r de estructura (4) son 0. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (3) en donde p y q son ambos 0 y K junto con R41 y R42 es -C(=O)-. Otras modalidades preferidas tienen la estructura (4) en donde q es 1 y L junto con R43 y R44 es -C(=O)-.
En otras modalidades más preferidas, A o A<1>y Ao de A corresponden independientemente en estructura a un alfaamino, beta-amino u ácido que contiene amina. En otras modalidades más preferidas que tienen un resto L<ss>o L<s>, ese resto está compuesto por A o A<1>con estructuras preferidas correspondientes a las mostradas para (3), (3a), (4) y (4a) en donde R38 está ausente, G es una unidad básica (BU) y el nitrógeno N-terminal se incorpora en un resto M1 o M2 como el nitrógeno imínico de ese sistema de anillos de restos o se incorpora en un resto M3 como el nitrógeno amídico del ácido succínico amida. Otros restos preferidos A o A<1>para Lss o Ls corresponden en estructura a una alfa-amino, beta-amino u otro ácido que contiene amina sustituido con BU (es decir, es un ácido que contiene diamino), en donde el nitrógeno N-terminal del alfa-amino, beta-amino u otro ácido que contiene amina sustituido con BU, que está representado por A(BU) o A<1>(BU), se incorpora en un resto M1 o M2 como el nitrógeno imínico de que sistema de anillos de resto o se incorpora en M3 como el nitrógeno de la amida del resto amida de ácido succínico.
En modalidades compuestas por Q2 en donde Ao está presente, los ácidos que contienen amina particularmente preferidos que corresponden a Ao tienen la estructura de -NH<2>-X 1-C O<2>H en donde X 1 es un alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, que incluye ácido £-aminocaproico y ácido p-amino-propiónico.
Particularmente preferido son uno cualquiera de los anteriores Lb que contiene modalidades en donde el resto de direccionamiento unido a Lb es un anticuerpo.
1.4 Unidades de fármaco cuaternizados
Las clases útiles de fármacos que contienen aminas terciarias incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, aquellos que tienen actividad citostática o citotóxica sobre células anómalas o células normales en las proximidades de células anómalas (es decir, células asociadas a tumores). En algunas modalidades, el fármaco que contiene amina terciaria tiene actividad citostática o citotóxica sobre células inmunitarias hiperestimuladas. En otras modalidades, el fármaco que contiene amina terciaria tiene actividad citostática o citotóxica sobre células tumorales o células asociadas a tumores. Tales fármacos que contienen aminas terciarias incluyen tubulisinas, dolastatinas y auristatinas que tienen un resto de amina terciaria N-terminal, dímeros de fenazina e inhibidores de MDR basados en tetrahidroquinolina.
1.4.1 Dolastatinas y auristatinas cuaternizadas
En algunas modalidades, el fármaco antiproliferativo que contiene amina terciaria cuaternizada es una dolastatina que contiene amina terciaria, que incluye dolastatina 10, dolastatina 15 y compuestos relacionados, en donde el nitrógeno indicado (f) ejemplificado para dolastatina 10 y dolastatina 15 está cuaternizado por covalente unión a la posición bencílica de un resto autodestructivo de tipo PAB o PAB en Lo.
En esas modalidades, las dolastatinas ilustrativas, que están relacionadas con la dolastatina 10, son aquellas en las que los sustituyentes fenilo y tiazol de la dolastatina 10 se reemplazan con restos arilo o heteroarilo seleccionados independientemente. Otras dolastatinas ilustrativas están relacionadas con la dolastatina 15 en la que el resto éster C-terminal está reemplazado por un grupo funcional amida en el que el nitrógeno amida de ese grupo funcional está sustituido con un resto arilalquilo o heteroarilalquilo.
Las estructuras para otros agentes disruptores de tubulina a base de dolastatina son las siguientes, en donde el nitrógeno indicado (f) se cuaterniza mediante unión covalente a la posición bencílica de un resto autodestructivo de tipo PAB o PAB:
en donde cada R10, R11 y R 18 es un alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido seleccionado independientemente y Ar o Ari y Ar<2>, seleccionados independientemente, son arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. Otros miméticos peptoides de dolastatinas que tienen una amina terciaria capaz de cuaternización son proporcionados por Schmitt y otros "Synthesis of dolastatin 15 peptoids" Bioorg. Med. Chem. Lett. (1998) 8(4): 385-8. En modalidades preferidas, R 10 y R 11 son metilo. En otra modalidad preferida R 18 es t-butilo. En otras modalidades preferidas, Ar es un fenilo opcionalmente sustituido o Ar1 y/o Ar2, seleccionados independientemente, son fenilo opcionalmente sustituido. En otras modalidades preferidas más, Ar<1>es fenilo y Ar<2>es 2-tiazolilo.
En algunas modalidades, el fármaco cuaternizado es una auristatina que tiene una amina terciaria N-terminal cuyo nitrógeno está cuaternizado por su unión covalente a la posición bencílica de un resto autodestructivo de tipo PAB o PAB. Las síntesis y estructuras de las auristatinas que tienen una amina terciaria N-terminal se describen en Publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. núm. 2003-0083263, 2005-02386492005-0009751,2009-0111756, y 2011-0020343; Publicación de Patente Internacional núm. WO 04/010957, Publicación de Patente Internacional núm. WO 02/088172, y Patentes de EE. UU. núms. 7,659,241 y8,343,928. Las auristatinas que contienen amina terciaria ejemplares liberadas de los LDC de la presente invención se unen a la tubulina y ejercen un efecto citotóxico o citostático sobre las células deseadas (es decir, células diana) como resultado de esa unión.
Las auristatinas ilustrativas que tienen una amina terciaria N-terminal están representadas por la siguiente fórmula en la que el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
en donde R10 y R11 son independientemente alquilo C<1>-C<8>; R12 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<8>, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo, -X 1-arilo, -X 1-(cicloalquilo C<3>-C<8>), heterociclo C<3>-C<8>o -X 1-(heterociclo C<3>-C<8>); R13 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<8>, cicloalquilo C 3-C 8, arilo, -X 1-arilo, -X 1-(cicloalquilo C 3-C 8), heterociclo C 3-C 8 y -X 1-(heterociclo C 3-C 8); R 14 es hidrógeno o metilo, o R 13 y R 14 tomados junto con el carbono al que están unidos comprenden un cicloalquilo C<3>-C<8>; R15 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<8>; R 16 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<8>, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo, -X 1-arilo, -X 1-(cicloalquilo C<3>-C<8>), heterociclo C<3>-C<8>y -X 1-(heterociclo C<3>-C<8>); R17 son independientemente hidrógeno, -OH, alquilo C<1>-C<8>, cicloalquiloC<3>-C<8>y O-(alquilo C<1>-C<8>); R 18 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<8>; R 19 es -C (R 19A)<2>-C (R 19A)<2>-arilo, -C (R 19A)<2>-C (R 19A)<2>-(heterociclo C<3>-C<8>) o -C (R 19A)<2>- C (R 19A)<2>-(cicloalquilo C<3>-C<8>), en donde cada R19A es independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<8>, -OH o -alquilo C<1>-C<8>;
R20 es hidrógeno, alquilo C 1-C 20, arilo, heterociclo C 3-C 8, -(R47O)m-R 48, y -(R47O)m-CH (R49)2; R21 es arilalquilo, que incluye -C H<2>Ph, hidroxilalquilo, que incluye -CH (CH<3>)-OH o heterociclo C<3>-C<8>; Z es O, S, NH o NR46, en donde R46 es alquilo C<1>-C<8>; m es un número entero que varía de 1 a 1000; R47 es alquilo C<2>-C<8>; R48 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<8>; R49 son independientemente -COOH, -(CH 2)n-N(R50)2, -(cH 2)n-S O 3H, o -(CH 2)n-S O 3-alquilo C 1-C 8; R50 son independientemente alquilo C i-C 8, o -(CH 2)n-CO O H; n es un número entero que varía de 0 a 6; y X 1 es alquileno C r C<10>.
Algunas auristatinas preferidas que tienen una amina terciaria N-terminal están representadas por la siguiente fórmula en la que el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
en donde R 10 y R 11 son independientemente alquilo C<1>-C<6>en las estructuras D<e>-<i>, D<e-2>y D<f>-<i>, Ar en D<e>-<i>o D<e-2>es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, y en D<f-1>Z es -O-, o -N H-R20 es hidrógeno, alquilo C<1>-C<6>, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, y R21 es alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido.
En modalidades más preferidas, R 10 y R11 es metilo. En otras modalidades más preferidas en De<-1>o De-<2>, Ar es fenilo opcionalmente sustituido o 2-piridilo opcionalmente sustituido. En otras modalidades más preferidas en D<f>-<1>, R21 es X 1-S R 21a o X 1-Ar, en donde X 1 es alquileno C<1>-C<6>, R21a es alquilo inferior y Ar es fenilo o heteroarilo opcionalmente sustituido. En otras modalidades preferidas -Z - es -O - y R20 es alquilo inferior. En otras modalidades preferidas Z es -NH- y R20 es fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. En otras modalidades, R21 es -X 1-Ar, X es -NH- y R20 es Ar, en donde X 1 y Ar seleccionados son independientemente como se definieron previamente para R21.
Algunas auristatinas preferidas que tienen una amina terciaria N-terminal están representadas por la siguiente fórmula en la que el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
D<f/e>-<3>
en donde R10 y R11 son metilo, R 13 es isopropilo o -C H<2>-CH (CH<s>)<2>, y R 19B es -CH(CH2Ph)-2-tiazol, -CH(CH2Ph)-2-piridil, -CH (CH<2>-p-Cl-Ph), -CH (CO<2>Me)-CH<2>Ph, -CH (CO<2>Me)-CH<2>CH<2>S C H<3>, CH(CH2CH2SCH3)C(=O)NH-3-quinolil, -CH(CH<2>Ph)C(=O)NH-p-Cl-Ph o R 19B tiene la estructura de
Las auristatinas que contienen amina terciaria particularmente preferidas incorporadas en una unidad de fármaco cuaternizada incluyen, pero no se limitan a, Auristatina E, Auristatina PE, Auristatina PHE, Auristatina PYE, Auristatina EFP, Auristatina EB y Auristatina EVB.
En algunas modalidades, un resto Lb'-Lo-D+ que incorpora una dolastatina o una auristatina que tiene una amina terciaria N-terminal tiene la estructura de
en donde Lb' es un resto maleimida (M1) y A, W, V, Z 1 y Z2 son como se definieron previamente para la Fórmula 1 y Ar, Ar<1>, Ar<2>y R 19 son como se definieron previamente en la presente descripción para terciario dolastatinas y auristatinas que contienen amina, en las que el nitrógeno de anilina de SI (del que consiste la unidad espadadora Y) está unido a W a través de un grupo funcional carbonilo de anilida. En modalidades preferidas, uno, dos o todos V, Z 1, Z2 son =CH-. En otras modalidades preferidas, Ar o Ar<1>y Ar<2>son independientemente fenilo opcionalmente sustituido. En modalidades más preferidas, Ar es fenilo o Ar1 y Ar2 son ambos fenilo y V, Z 1 y Z2 son =CH-.
En otras modalidades preferidas, un compuesto fármaco-enlazador de fórmula Lb'-Lo-D+ que tiene una unidad escindible con péptidos en la que D+ es una auristatina cuaternizada tiene la estructura de uno de:
En cualquiera de las modalidades anteriores compuesta de una modalidad preferida de unidad de fármaco de auristatina cuaternizado son aquellos donde Lb' (es decir, M1) se sustituye con un resto Lb que también está unido a un resto de direccionamiento para proporcionar un LDC en donde ese resto Lb es un resto M2 o M3 y/o A se reemplaza con -A<1>-Ao, en donde A<1>y Ao son subunidades de A.
En cualquiera de los restos que contienen Lb o Lb' anteriores, que comprenden una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado correspondiente en estructura a D<e>, D<f>, D<f-1>, D<e-1>, D<e-2>o D<f>/<e-3>, una unidad escindible preferida (W) está compuesta por un dipéptido reconocido por una proteasa de catepsina capaz de escindir el enlace anilida que une covalentemente W a SI. En modalidades más preferidas, W está compuesto por un dipéptido que tiene la estructura de
en donde R34 y R35 y las uniones indicadas por las líneas onduladas a A (o una subunidad de las mismas) y las unidades Y son como se definieron previamente. En modalidades particularmente preferidas, R34 es -CH (CH<3>)<2>y R35 es -(CH<2>)<3>-NH(=O)NH<2>, o R34 es -CH (CH<3>)<2>y R35 es -C H<3>; y en donde los carbonos alfa de R34 y R35 están en la misma configuración absoluta de un L-aminoácido.
En cualquiera de los restos que contienen Lb o Lb' anteriores que comprenden una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado, una unidad de extensión A preferida o una subunidad de la misma (es decir, A<1>) corresponden en estructura a un alfa aminoácido, un beta amino ácido u otro ácido que contiene amina tal como un ácido que contiene amina que tiene la fórmula de NH<2>-X 1-C O<2>H donde X 1 es un alquileno C<1>-C<6>, en donde el nitrógeno N-terminal del ácido que contiene la amina corresponde al nitrógeno de maleimida o succinimida imida de un resto M1 o M2 o el nitrógeno amídico de un resto ácido succínico-amida (M3), y el grupo carbonilo corresponde al extremo C terminal del ácido que contiene amina que está unido a W a través de un grupo funcional amida. Por tanto, los restos M1-A-, M2 -A o M3-A preferidos o los restos M1-A<1>-, M2-A<1>o M3-A<1>preferidos tienen la estructura de
Son más preferidas aquellas unidades A o subunidades de las mismas correspondientes o derivadas de ácido pamino propiónico, ácido Y-amino butírico o ácido £-amino caproico. Otros restos A o A<1>preferidos corresponden en estructura a, o se derivan de, ácidos que contienen diamino que tienen la fórmula NH<2>-C (R a1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb)]m-C(=O)OH, en donde Ra1 tiene la fórmula de -[C(R1)(R1)]-[C(R2)(R2)]n-N(R22)(R23), en donde los grupos variables son como se definieron previamente para los restos A(BU)- y A<1>(BU)-. Más preferidos son aquellos restos A o A<1>en donde Ra1 es -C H<2>NH<2>. Por tanto, un -A - o A<1>preferido tiene la estructura de -C (R a1)(Ra2)-[c(Rb1)(Rb1)]m-C(=O)-.
En modalidades más preferidas de fármacos enlazadores, los compuestos de fórmula Lb'-Lo-D+ que tienen una unidad de escisión peptídica W en la que D+ es una auristatina cuaternizado tienen las estructuras de:
En algunas modalidades, son más preferidos los compuestos fármaco-enlazador de fórmula Lb'-Lo-D+ que tienen una Unidad escindible de péptidos, en donde D+ es una auristatina cuaternizado y una Unidad de extensión compuesta por M1 y X 1, tienen las estructuras de
En cualquiera de los restos que contienen Lb o Lb' anteriores, que comprenden una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado correspondiente en estructura a DE, DF, Df-i , De-i , DE-2 o DF/E-3, A puede contener 2 subunidades donde
-A - en las estructuras anteriores se reemplaza por -ArAo-, en donde A<1>tiene la estructura definida anteriormente para A y donde Ao corresponde en estructura a otro ácido que contiene amina. Se prefieren los restos -ArAo- que tienen la fórmula -C (R a1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=0)-Ao-, en donde Ra1 tiene la fórmula de -[C(R1)(R1)]-[C(R2)(R2)]n-N(R22)(R23) en donde Ao está unido a W y A<1>está unido a Ao a través de grupos funcionales amida y en donde el carbono que tiene los sustituyentes RA1 y Ra2 está unido al nitrógeno de imida de un resto M1 o M2 o al nitrógeno de la amida de un resto amida-ácido M3. En modalidades más preferidas -ArAo- tiene la fórmula de-C(Ra1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH<2>)m-C(=O)-, -C (R a1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-CH(CO<2>H)-(CH<2>)m<-1>-C(=O)- o -C(Ra1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH<2>)m”-<1>-CH (CO<2>H)-C(=O)- en donde m es un número entero que varía de 0 a
5 y m' es un número entero que varía de 1 a 5 y en donde los otros grupos variables son como se definen para A. En uno cualquiera de los anteriores restos que contiene Lb-A- o Lb'-A- compuestos por una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado correspondiente en estructura a D<e>, D<f>, D<e-1>, D<e-2>o D<f>, D<f1>o D<f>/<e-3>, particularmente preferidos son aquellos en donde Lb' es M1, Lb es un M2 o Lb es M3A o M3B, en donde M3A del resto ácido succínico-amida M3 de la apertura del anillo hidrolítico de M2, en donde M1-A-, M2-A-, M3A-A-, M3B-A,
M1-A<1>-Ao, M2-A<1>-Ao, M3A-A<1>-Ao o M3B-ArAo tiene la estructura de:
en donde las líneas onduladas a los restos carbonilo indican un enlace covalente a W y la otra línea ondulada indica un enlace covalente a un grupo sulfhidrilo de un resto de direccionamiento.
Modalidades preferidas de compuestos de Fármaco Enlazador en donde Lb' es M1 y D+ es una auristatina cuaternizado y -A 1-Ao- tiene la estructura de -C(R a1)(Ra2H C (R b1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH2)m-C(=O)-, tienen las estructuras de:
En otras modalidades, un compuesto fármaco-enlazador de fórmula Lb'-Lo-D+ está compuesto por una unidad de fármaco de dolastatina o auristatina cuaternizado y una unidadWescindible por una glicosidasa en donde el resto Lb'-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde Lb es un resto maleimida (M1), A, V y Z3 son como se definieron previamente para la Fórmula 1 y modalidades de unidades SI, Ar, An, Ar<2>y R18 son como se definieron previamente para auristatina cuaternizado a base de unidades de fármaco y R45 es -C O 2H o CH 2OH, en donde el nitrógeno de anilina de SI de la unidad de espaciador y está unido a través de un carbonilo de un grupo funcional anilida. En modalidades preferidas uno o ambos de V, Z 3 es =CH-.
En cualquiera de los restos que contienen Lb o Lb' anteriores que comprenden un fármaco auristatina cuaternizado y W como una unidad escindible con glicosidasa (es decir, una unidad de glucurónido) A puede contener 2 subunidades en las que -A- en las estructuras anteriores es reemplazado por -Ai-Ao-, en donde Ai tiene la estructura definida anteriormente para A y en donde A0 corresponde en estructura a otro ácido que contiene amina. En modalidades más preferidas, un resto Lb'-Lo-D+ compuesto por una dolastatina cuaternizado o una unidad de fármaco de auristatina tiene la estructura de:
En otras modalidades preferidas, Lb' (es decir, M1) se reemplaza con un resto Lb que también está unido a un resto direccional para proporcionar un LDC en donde el resto Lb es un resto M2 o M3. En modalidades más preferidas, el resto carbohidrato unido covalentemente al SI a través de un enlace glicosídico tiene su carbono anomérico en la configuración p. En otras modalidades más preferidas R45 es -C O 2H.
En las modalidades que tienen una unidad de extensión y una unidad de glucurónido, son más preferidas aquellas que tienen las estructuras de:
En las modalidades que tienen una unidad de extensión compuesta por M1 y X 1 y una unidad de glucurónido, son más preferidas aquellas que tienen las estructuras de:
en donde R45 es preferentemente -C O<2>H y m subíndice es 4.
En otras modalidades preferidas, A en cualquiera de las modalidades anteriores se reemplaza por -A<1>-Ao- como se define en la presente descripción para restos que contienen Lb o Lb' compuestos por una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado y una unidad W escindible por proteasa con -A 1-Ao- que tiene la fórmula de -C (R a1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH<2>)m,-C(=O)-, -C (R a1)(Ra2)-[C(Rb)(Rb)]m-(C=O)-NH-CH(CO<2>H)-(CH<2>)m<-1>-C(=O)- o -C(Ra1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH<2>)m<-1>-CH (CO<2>H)-C(=O)-. Otros preferido restos -A<1>-Ao- son como se describen para las correspondientes unidades de fármacos tubulisina cuaternizado.
En esa modalidad, los compuestos enlazadores de fármacos preferidos tienen la estructura de
1.4.1 Tubulisinas cuaternizadas
En un grupo de modalidades, el fármaco cuaternizado corresponde en estructura a una tubulisina que tiene una amina terciaria en el N-terminal, en donde el nitrógeno de esa amina terciaria se incorpora a la unidad de fármaco cuaternizada.
En algunas modalidades, el fármaco cuaternizado es una tubulisina representada por estructuras de la siguiente fórmula en donde el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
en donde el círculo representa un heteroarilo de nitrógeno de 5 o 6 miembros en donde los sustituyentes requeridos indicados con respecto a ese heteroarilo están en una relación 1,3 ometaentre s í con sustitución opcional en las posiciones restantes; R2 es XA-R 2A, en donde Xa es -O-, -S -, -N(R2B)-, -C H<2>-, -(C=O)N(R2B)- o -O(C=O)N(R2B)- en donde R2B es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, R2A es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, o -C(=O)RC en donde RC es hidrógeno, opcionalmente alquilo sustituido, o arilo opcionalmente sustituido o R2 es un sustituyente unido a O; R3 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; R4, R4A, R4B, R5 y R6 son alquilo opcionalmente sustituido, seleccionados independientemente, un R7 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido y el otro R7 es arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, y m es 0 o 1. En otras modalidades, el fármaco cuaternizado es una tubulisina representada por la estructura D<g>en donde un R7 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, preferentemente alquilo inferior, y el otro R7 es un alquilo opcionalmente sustituido seleccionado independientemente, preferentemente alquilo C<1>-C6 y m es 0 o 1, preferentemente 1, en donde el otro grupo variable es como se definió previamente.
En algunos aspectos, R2 es XA-R 2A, en donde X<a>es -O-, -S -, -N(R2B)- -C H<2>-, o -O(C=O)N(R2B)- en donde R2B es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, R2A es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o -C(=O)RC, en donde RC es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido o R2 es un sustituyente unido a O.
En algunos aspectos, R 2 es XA-R 2A, en donde X<a>es -O-, -S -, -N(R2B)- o -(C=O)N(R2B)- en donde R2A y R2B son independientemente hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido, o R2 es un sustituyente unido a O.
En otros aspectos, -N(R7)(R7) en DG o DH se reemplaza por -N(R7)-CH(R10)(CH2R11) para definir los fármacos tubulisina cuaternizados de fórmula Dh y Dg':
en donde R 10 es alquilo C<1>-C<6>sustituido con -C O<2>H, o un éster del mismo, y R7 es hidrógeno o un alquilo C<1>-C<6>independientemente seleccionado de R 10, o R7 y R10 junto con los átomos al que están unidos definen un heterociclo de 5 o 6 miembros; y R 11 es arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros, opcionalmente sustituido con uno o más, preferentemente 1 o 2, con mayor preferencia 1, el(los) sustituyente(s) seleccionado independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo inferior, -OH y -O-alquilo C 1-C 6, preferentemente -F, -C H 3 y -O C H 3; y los grupos de variables restantes son como se definen para Dg y Dh.
En otros aspectos más, un R7 en -N(R7)(R7) en D<g>o D<h>es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>, y el otro R7 es un alquilo C<1>-C<6>seleccionado independientemente opcionalmente sustituido con -C O<2>H o un éster del mismo, o con un fenilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades de estructura DG y DH, un R7 es hidrógeno y el otro R7 es un arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene la estructura de:
en donde R7B es hidrógeno o un sustituyente unido a O, preferentemente hidrógeno u -OH en la posiciónpara,y R8A es hidrógeno o alquilo inferior, preferentemente metilo; y donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de Dg o Dh.
En modalidades preferidas de estructura Dg o Dh, un R7 es hidrógeno y el otro R7 es un arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene la estructura de
en donde R7B es -H u -OH; y donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de D<g>o D<h>.
En otras modalidades de estructura D<g>y D<h>, un R7 es hidrógeno o alquilo inferior, preferentemente hidrógeno o metilo, con mayor preferencia hidrógeno, y el otro R7 es arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene la estructura de uno de
un sustituyente unido a O, preferentemente hidrógeno u -OH en la posiciónpara,R8A es hidrógeno o alquilo inferior, preferentemente metilo, y el subíndice n es 0, 1 o 2, preferentemente 0 o 1; y donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de D<g>o D<h>. En otras modalidades más de la estructura D<g>y D<h>-N(R7)(R7) es -NH(alquilo C<1>-Ca) en donde el alquilo C<1>-C<6>está opcionalmente sustituido con -C O<2>H o un éster del mismo, o con un fenilo opcionalmente sustituido. En modalidades preferidas -N(R7)(R7) se selecciona del grupo que consiste en -NH(CH<3>), -CH<2>CH<2>Ph, and -C H<2>-C O<2>H, -C H<2>CH<2>CO<2>H y -C H<2>CH<2>CH<2>CO<2>H.
En algunas modalidades de estructura Dg' y Dh', R7 y R10 junto con los átomos a los que están unidos definen un heterociclo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido en donde -N(R7)-CH(R10)(CH<2>R11) tiene la estructura de:
en donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de D<g>' o D<h>'.
Algunas tubulisinas preferidas están representadas por la siguiente fórmula en donde el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
en donde el círculo representa un heteroarilo nitrogenado de 5 o 6 miembros en el que los sustituyentes requeridos indicados para ese heteroarilo están en una relación 1,3 ometaentre sí con sustitución opcional en las posiciones restantes; R2A es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido o R2A junto con el átomo de oxígeno al que está unido define un sustituyente unido a O; R3 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; R4, R4A, R4B, R5 y R6 son alquilo opcionalmente sustituido, seleccionados independientemente; R7A es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, R8A es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido y m es 0 o 1.
En algunas modalidades preferidas de estructura Dg , Dg<-1>, Dh o Dh<-1>, R4 es metilo o R4A y R4B son metilo. En otra modalidad preferida de estructura Dg' o Dh', R4 es metilo o R4A y R4B son metilo. En otras modalidades preferidas, R7A es fenilo opcionalmente sustituido. En otra modalidad preferida, R8A es metilo en la configuración (S). En aún otras modalidades preferidas, R2A junto con el átomo de oxígeno al que está unido define un sustituyente unido a O distinto de -OH, con mayor preferencia un éster, éter o un carbamato unido a O. En modalidades más preferidas, el círculo representa un nitrógeno-heteroarileno de 5 miembros con un resto oxazol o tiazol divalente particularmente preferido. En otras modalidades preferidas, R4 es metilo o R4A y R4B son metilo. En otras modalidades preferidas, R7 es arilalquilo opcionalmente sustituido, en donde arilo es fenilo y R7A es fenilo opcionalmente sustituido.
En otras modalidades de Dg , Dg', Dg-i , Dh, Dh' o Dh-i , el círculo representa un heteroarileno de nitrógeno de 5 miembros, preferentemente representado por la estructura
en donde X B es O, S o NRB donde RB es hidrógeno o alquilo inferior. Preferentemente, el fármaco cuaternizado es una tubulisina representada por la estructura D<g>, D<g>' o D<g>-<i>, en donde m es 1. Son más preferidas las tubulisinas representadas por la estructura D<g>, en donde m es 1 y el círculo representa un resto de tiazol divalente opcionalmente sustituido.
Otras tubulisinas preferidas están representadas por la siguiente fórmula en donde el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
en donde R2A junto con el átomo de oxígeno al que está unido define un sustituyente unido a O, preferentemente un éster, éter o carbamato de unido a O, R3 es alquilo inferior o -C H<2>OC(=O)R3A en donde R3A es alquilo inferior opcionalmente sustituido y R7B es hidrógeno o un sustituyente unido a O, preferentemente en la posiciónpara.En modalidades más preferidas, R3 es metilo o R3A es metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo o -C H 2C=(CH 3)2.
En otras modalidades preferidas, R2A es metilo, etilo, propilo (es decir, -O R 2A es un éter) o es -C(=O)R2B (es decir, -O R 2A es un éster) en donde R2B es alquilo inferior con R2B como metilo (es decir, -O R 2A es acetato) más preferido. Las tubulisinas más preferidas que tienen una amina terciaria N-terminal como sitio de conjugación tienen la estructura de una de las siguientes fórmulas:
en donde R7B es hidrógeno u -OH, R3 es alquilo inferior, preferentemente metilo o etilo, y R2B y R2C son independientemente hidrógeno o alquilo inferior. En algunas modalidades preferidas de cualquiera de las estructuras Dg , Dg<-1>, Dg<-2>, Dg<-3>, Dg<-4>, Dg<-5>, Dh, Dh<-1>y Dh<-2>, R3 es metilo o es -C h<2>OC(=O)R3A, en donde R3A es alquilo opcionalmente sustituido. En otras modalidades preferidas de cualquiera de las estructuras D<g>' y D<h>', R3 es metilo o es -C H<2>OC(=O)R3A, en donde R3A es alquilo opcionalmente sustituido. En otras modalidades preferidas de cualquiera de esas estructuras, R3 es -C(R 3A)(R3A)C(=O)-X<c>, en donde X C es -O R 3B o -N(R3C)(R3C), en donde cada R3A, R3B y R3C es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o cicloalquilo opcionalmente sustituido. Preferentemente, R3 es -C(R 3A)(R3A)C(=O)-N(R3C)(R3C), con cada R3A hidrógeno, un R3C hidrógeno y el otro R3C n-butilo o isopropilo como más preferido.
En otras modalidades preferidas de cualquiera de las estructuras Dg , Dg' Dg-i , Dg<-2>, Dg<-3>, Dg<-4>, Dg<-5>, Dh, Dh', Dh-i y D<h-2>, R3 es etilo o propilo
En otras modalidades preferidas de cualquiera de las estructuras Dg-1, Dg-2, Dg-3, Dg-4, Dg-5, Dg-6, Dh-1 y Dh-2, el heterociclo de núcleo de tiazol
es reemplazado por
En algunas modalidades preferidas de cualquiera de las estructuras D<g>, D<g>-<i>, D<g-2>, D<g>-3, D<g-4>, D<g-5>, D<h>, D<h>-<i>, D<h-2>, Dh<-3>y Dh<-4>, R3 es metilo o es -C H<2>OC(=O)R3A, en donde R3A está opcionalmente alquilo sustituido. En otras modalidades preferidas de cualquiera de esas estructuras, R3 es -C (R 3A)(r 3A)C(=O)-Xc, en donde X C es -O R 3B o -N(R3C)(R3C), en donde cada R3A, R3B y R3C es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o cicloalquilo opcionalmente sustituido. Preferentemente, R3 es -C(R 3A)(R3A)C(=O)-N(R3C)(R3C), con cada R3A es hidrógeno, un R3C es hidrógeno y el otro R3C es n-butilo o isopropilo más preferido.
En otras modalidades preferidas de cualquiera de las estructuras Dg<-3>, Dg<-4>, Dg<-5>, Dh<-3>y Dh<-4>, el heterociclo del núcleo de tiazol
es reemplazado por
En modalidades más preferidas, la tubulisina tiene una estructura Dg<-3>o Dg<-4>en donde m es 1, R3 está opcionalmente sustituido metilo, etilo o propilo, preferentemente metilo, etilo o propilo.
En modalidades particularmente preferidas, la tubulisina tiene la estructura D<g-3>, en donde m es 1, R3 es metilo, etilo o propilo, -OC(O)R2B es -O-C(O)H, O-C(O)-alquilo C<1>-C<6>o -Oalquenilo C<2>-C<6>, opcionalmente sustituido, preferentemente -OC(O)CH3, -OC(O)CH2CH3, -OC(O)CH(CH3)2, -OC(O)C(CH3)3, o -O C(O )CH=CH<2>.
En otras modalidades particularmente preferidas, la tubulisina tiene la estructura Dg<-4>, en donde m es 1, R3 es metilo, etilo o propilo y -O CH<2>R2B es -O CH<3>, -O C H<2>CH<3>, -O CH<2>CH<2>CH<3>o -O CH<2>O CH<3>.
Las tubulisinas especialmente preferidas que tienen una amina terciaria N-terminal como sitio de conjugación tienen la estructura de
en donde R2B es -C H<3>, -C H<2>CH<3>, -C H<2>CH<2>CH<3>, -CH (CH<3>)<2>, -C H<2>CH(CH<3>)<2>, -C H<2>C(CH<3>)<3>y el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+).
Otras tubulisinas especialmente preferidas que tienen una amina terciaria N-terminal como sitio de conjugación tienen la estructura de
en donde R2B es hidrógeno, metilo u -O CH<3>(es decir, -O C H<2>R2B es un sustituyente metil etil, metoximetil éter).
En otras modalidades preferidas, la tubulisina incorporada como D+ en un LDC es una tubulisina de origen natural que incluye tubulisina A, tubulisina B, tubulisina C, tubulisina D, tubulisina E, tubulisina F, tubulisina G, tubulisina H, tubulisina I, tubulisina U, tubulisina V, Tubulisina W, Tubulisina X o Tubulisina Z, cuyas estructuras vienen dadas por la siguiente estructura y definiciones de grupos variables en las que el nitrógeno indicado (f) es el sitio de cuaternización cuando dichos compuestos se incorporan en un LDC como una unidad de fármaco cuaternizada (D+):
TABLA 1. Algunas tubulisinas que se encuentran naturalmente
Tubulisina R7B R2A R3
En modalidades particularmente preferidas de estructura D<g>-6, la tubulisina cuaternizado es tubulisina M, en donde R3 es -C H<3>, R2 es C(=O)CH<3>y R7B es hidrógeno.
En algunas modalidades a Lb-, o su precursor que contiene Lb' compuesto por Lo y D+ incorpora un fármaco tubulisina en la unidad de amina cuaternaria en donde Lb-, o su precursor que contiene Lb'- tiene una estructura correspondiente a cualquiera de los restos -L r-D+, Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+, Lss-L o-D+, Ls-D+, M1-A, M2-A, M3-A, M1-A i -, M2-A 1, M3-A 1 M1-A(BU), M2-A(BU), M3-A(BU), M1-A 1(BU), M2-A 1(BU) o M3-A 1(BU) descritos en la presente descripción en donde D+ cuaterniza el fármaco auristatina. En modalidades preferidas, una tubulisina que tiene la estructura de Dg, Dg-i , Dg<-2>, Dg-3, Dg-4, Dg-5, Dg-6, Dh, Dh-i , Dh<-2>, Dh-3 o Dh-4 reemplaza De, De-i , De<-2>, Df, Df<-1>o Df/g-3 en cada modalidad que tenga esa estructura de auristatina en el nitrógeno de amina terciaria indicado (f).
Así, algunas modalidades preferidas de -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+tienen la estructura de:
en donde R2, R3, R4, R4A, R4B, R5, R6 y R7 son como se describe para fármacos tubulisina en forma libre por Dg y Dh, en donde Lb, Lb', Qi, V, Z 1 y Z2 son como se describieron previamente para modalidades de restos que contienen Lb y Lb' compuestos por una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado y Lo y Y unidades de los mismos comprenden o consisten en una unidad SI, y J es -O-, -S - o N(R33)-, en donde R33 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido.
Otras modalidades preferidas de -Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tienen la estructura de:
en donde R2A, R3, R4, R4A, R4B, R5, R6, R7A y R8A son como se describe para fármacos tubulisina en forma libre por D<g-1>y D<h>-<1>, en donde Lb, Lb', Qi, V, Z 1 y Z2 son como se describieron previamente para modalidades de restos que contienen Lb y Lb' compuestos por una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado y unidades Lo y Y de los mismos compuestas o que consisten en un Unidad SI, y J es -O-, -S - o N(R33)-, en donde R33 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido.
En modalidades más preferidas, R7A es fenilo, opcionalmente sustituido con -OH o R8A es metilo. En otras modalidades más preferidas, R4 o R4A y R4B son metilo. En otras modalidades preferidas, J es -O-.
En otras modalidades preferidas, -Lb-Lo-D+ o Lb'-L6-D+ tiene la estructura de:
En modalidades más preferidas, R7A es hidrógeno u -OH en la posiciónpara.
En cualquiera de los restos que contienen Lb o Lb anteriores compuestos por una unidad de fármaco tubulisina cuaternizado, Lb' es un resto maleimida (M1) o Lb es un resto succinimida (M2) o ácido succínico-amida (M3).
En modalidades preferidas de uno cualquiera de los restos anteriores que contiene Lb o Lb' compuestos de un fármaco tubulisina cuaternizado, R8 y R9 son hidrógeno. En otras modalidades preferidas, V, Z1 y Z2 son =CH-. En modalidades más preferidas -O R 2 es un éster o R3 es alquilo inferior. En otras modalidades más preferidas, J es -NH-. En modalidades aún más preferida Q 1 se compone de un dipéptido unido covalentemente a J a través de un grupo funcional amida que es escindible por una proteasa intracelular o de regulación así proteólisis de que los comunicados de grupo una SI capaces de 1,6-fragmentacion.
En cualquiera de las modalidades anteriores que comprenden una unidad de fármaco de tubulisina cuaternizada, las modalidades más preferidas son aquellas en las que Lb'(es decir, M1) se reemplaza con un resto Lb que también está unido a un resto de direccionamiento para proporcionar un LDC en la que ese resto Lb es un resto M2 o M3. En consecuencia, las modalidades más preferidas de Lb-Lo-D+ o Lb'-Lo-D+ tienen la estructura de una de las siguientes:
en donde la línea ondulada indica la unión covalente de un resto M2 o M3 a un grupo sulfhidrilo de un resto diana. En modalidades preferidas -O R 2A es un éster C<2>-C<6>o R3 es alquilo inferior y R7B es hidrógeno u -OH. En otras modalidades más preferidas, -R 2A es alquilo inferior opcionalmente sustituido, R3 es alquilo inferior, seleccionado independientemente de R2A, y R7B es hidrógeno u -OH. En modalidades particularmente preferidas, R3 es metilo, etilo o propilo y R2A es -C(O )CH<3>, metilo, etilo, propilo o -C H<2>O CH<3>.
En otras modalidades preferidas, Lb'-L6-D+ o Lb-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde R2, R2A, R3, R4, R4A, R4B, R5, R6, R7, R7A y R8A son como se describen para los fármacos de tubulisina en forma libre en la estructura DG, DG', D<g>-<i>, DH, DH' o D<h>-<i>, Lb, Lb', A, V y Z3 son como se describieron previamente para los restos que contienen Lb y Lb' correspondientes compuestos por un unidad de fármaco de auristatina cuaternizado y unidades Lo y Y de las mismas que comprenden o consisten en una unidad SI; E y J son independientemente -O-, -S - o -N(R33), en donde R33 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; y R45 es CO<2>H o CH<2>OH. En modalidades más preferidas, J es -NH-. En otras modalidades preferidas, E es -O-.
Son más preferidas aquellas modalidades en donde Lb'es un resto maleimida (M1) o Lb es un resto succinimida (M2) o amida-ácido (M3).
En otras modalidades más preferidas, Lb-Lo-D+ tiene la estructura de:
en donde A, R2A, R3, R45, R7B y R45 son como se definieron previamente. En modalidades más preferidas uno o ambos de V, Z3 son =CH-.
En modalidades más preferidas, un resto Lb'-Lo-D+ o -Lb-Lo-D+ compuesto por una unidad de fármaco tubulisina cuaternizado tiene la estructura de:
en donde la línea ondulada indica unión covalente a un grupo sulfhidrilo de un resto de direccionamiento. En modalidades más preferidas, el resto carbohidrato unido covalentemente al SI a través de un enlace glicosídico tiene su carbono anomérico en la configuración p. En otras modalidades más preferidas R45 es -C H<2>OH o -C O<2>H.
En cualquiera de las modalidades anteriores para el resto que contiene Lb-, Lb'-, M1-, M2- o M3 compuesto por un fármaco de tubulisina cuaternizada, R3 es preferentemente metilo o R2 es preferentemente acetato o m es preferentemente 1. Además, se prefieren para tales restos que contienen Lb-, Lb'-, M1-, M2 - o M3 son aquellos en donde R3 es metilo, etilo o propilo y -O R 2A es -OC(O)CH<3>, -O CH<3>, -O C H<2>CH<3>o -O C H<2>CH<2>CH<3>.
Las modalidades particularmente preferidas tienen la estructura de:
en donde la línea ondulada indica unión covalente a un grupo sulfhidrilo de un resto de direccionamiento y donde R34 es bencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, -CH(OH)CH<3>o tiene la estructura de
y R35 es metilo, -(CH<2>)<4>-NH<2>, -(CH<2>)<3>NH(C=O)NH<2>, (CH<2>)<3>NH(C=NH)NH<2>, o -(CH<2>)<2>CO<2>H, y R7B es hidrógeno u -OH. Otras modalidades particularmente preferidas tienen la estructura de:
en donde R2 y R3 son independientemente metilo, etilo o propilo o R2 es -C(O )CH<3>y R3 es metilo, etilo o propilo. En cualquiera de los restos Lb que contiene compuestos de un medicamento tubulisina cuaternizado, se prefieren particularmente aquellos en los que el resto de direccionamiento es un anticuerpo unido y en cualquiera de los restos M2- o M3- que contienen compuesto de un fármaco tubulisina cuaternizado, se prefieren particularmente aquellos en los que el grupo sulfhidrilo enlazado es de un resto dirigido a un anticuerpo.
En cualquiera de las estructuras para un resto que contiene Lb o Lb' compuesto por A, A se reemplaza con -Ai-Ao-, en donde esas subunidades de A son como se describen para tales restos cuando están presentes en los correspondientes Lb - o Lb'- que contienen restos que comprenden una unidad de fármaco de auristatina cuaternizado y Lo que tiene una unidad de extensión. Otros restos de este tipo se describen adicionalmente a continuación para unidades de extensión en M1-A, M2-A, M3A-A y M3B.
Para cualquiera de los restos que contienen Lb, Lb', M1, M2 o M3 compuestos por un fármaco de tubulisina cuaternizada, un grupo de extensión preferido corresponde en estructura a un ácido que contiene amina como se define aquí con<y>-ácido aminocaproico más preferido. Por tanto, una unidad de extensión preferida tiene la estructura de -(CH<2>)<5>-C(=O)-. Otros grupos de extensión preferidos tienen la fórmula de -C (R a1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH2)m'-C(=O)-, -C(R a1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-CH(CO<2>H)-(CH<2>)m'-i-C(=O)-o-C(Ra1)(Ra2)-[C(Rb1)(Rb1)]m-(C=O)-NH-(CH<2>)m'-i-CH(CO<2>H)-C(=O)- en donde m es un número entero que varía de 0 a 5 y m' es un número entero que varía de 1 a 5 donde Ra1 es hidrógeno o tiene la fórmula de -[C(R- )(R- )]-[C(R2)(R2N(R22)(R23) y en donde los otros grupos variables son como se definieron previamente. Para esas unidades de camilla, se prefiere Ra1 es -C H<2>NH<2>.
Son más preferidas aquellas unidades de extensión que proporcionan restos M--A, M2-A, M3A-A y M3B que tienen las estructuras de:
Otras unidades de extensión más preferidas son las que proporcionan restos M -A<1>-A<0>-, M -A<1>-A<0>, M3A-Ai -Ao- y M3B-A<1>-A<0>- que tienen las estructuras de :
Aún otras unidades de extensión más preferidas son aquellas que proporcionan restos M1-A<1>-Ao-, M2-A<1>-Ao, M3A-A<1>-Ao- y M3B-A<1>-Ao- que tienen los estructuras de:
1.6 Tratamiento de las afecciones de hiperproliferacion
Los conjugados ligando-fármaco son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o cancerosa, provocar apoptosis en una célula tumoral o cancerosa, o para tratar el cáncer en un paciente. Los conjugados ligandofármaco se pueden utilizar en consecuencia en una variedad de situaciones para el tratamiento de cánceres. Los conjugados ligando-fármaco se pueden usar para administrar un fármaco a una célula tumoral o cancerosa. Sin estar limitados por la teoría, la unidad de ligando de un conjugado ligando-fármaco puede unirse o se asocia con un antígeno asociado a la superficie celular de célula cancerosa o a una célula tumoral o receptor, y tras la unión el conjugado ligando-fármaco se puede introducir (internalizar) dentro de una célula tumoral o célula cancerosa a través de endocitosis mediada por antígenos u otro mecanismo de internalización. El antígeno puede estar unido a una célula tumoral o cancerosa o puede ser una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o cancerosa. Una vez dentro de la célula, a través de un mecanismo de escisión enzimático o no enzimático, dependiendo de los componentes del sistema enlazador, el fármaco se libera dentro de la célula. Alternativamente, el fármaco o la unidad de fármaco se puede escindir del conjugado ligando-fármaco en las proximidades de la célula tumoral o la célula cancerosa, y el fármaco o la unidad de fármaco penetra posteriormente en la célula.
Los conjugados ligando-fármaco pueden proporcionar un direccionamiento de fármacos contra el cáncer o tumores específicos de la conjugación, reduciendo así la toxicidad general del fármaco.
Las unidades de enlazador pueden estabilizar los conjugados ligando-fármaco en la sangre, pero pueden liberar fármaco una vez dentro de la célula.
La unidad de ligando puede unirse a la célula tumoral o la célula cancerosa.
La unidad de ligando puede unirse a un antígeno de una célula tumoral o célula cancerosa que se encuentra en la superficie de la célula tumoral o cancerosa.
La unidad de ligando puede unirse a un antígeno de la célula tumoral o de la célula cancerosa que es una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o la célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de ligando para una célula tumoral o una célula cancerosa en particular puede ser importante para determinar los tumores o cánceres que se tratan con mayor eficacia. Por ejemplo, un conjugado de fármaco y ligando que tiene una unidad de ligando BR96 puede ser útil para tratar carcinomas positivos a antígeno, incluidos los de pulmón, mama, colon, ovarios y páncreas. Los conjugados ligando-fármaco que tienen una unidad de ligando de unión anti-CD30 o anti-CD70 pueden ser útiles para tratar neoplasias hematológicas.
Otros tipos particulares de cánceres que pueden tratarse con conjugados de un fármaco ligando incluyen, pero no se limitan a, los siguientes tumores sólidos, cánceres transmitidos por la sangre, leucemias agudas y crónicas y linfomas.
Los tumores sólidos incluyen, pero no se limitan a fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer óseo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer bucal, cáncer nasal, cáncer de garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, cáncer de piel, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Los cánceres de transmisión sanguínea incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda "ALL", leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia aguda linfoblástica de células T, leucemia mieloblástica aguda "AML", leucemia promielocítica aguda "APL", leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroleucémica, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mielocítica crónica "LMC", leucemia linfocítica crónica "LLC", leucemia de células pilosas y mieloma múltiple.
Las leucemias agudas y crónicas incluyen, pero no se limitan a, leucemias linfoblásticas, mielógenas, linfocíticas y mielocíticas.
Los linfomas incluyen, entre otros, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas y policitemia vera.
Los cánceres, incluidos, entre otros, un tumor, metástasis u otras enfermedades o trastornos caracterizados por células hiperproliferantes, pueden tratarse o inhibirse su progresión mediante la administración de una composición de ADC.
Se proporcionan métodos para tratar el cáncer, que incluyen administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de LDC y un agente quimioterapéutico. Puede que no se haya encontrado que el cáncer que se va a tratar con un quimioterápico en combinación con un LDC sea refractario al agente quimioterapéutico. Alternativamente, el cáncer que se va a tratar con un quimioterápico en combinación con un ADC puede ser refractario al agente quimioterapéutico. Las composiciones de LDC se pueden administrar a un paciente que también se ha sometido a cirugía como tratamiento para el cáncer.
El paciente también puede recibir un tratamiento adicional, como radioterapia. El conjugado ligando-fármaco se puede administrar al mismo tiempo que el agente quimioterapéutico o con radioterapia. El agente quimioterapéutico o la radioterapia se pueden administrar antes o después de la administración de un conjugado de fármaco y ligando. Se puede administrar un agente quimioterapéutico durante una serie de sesiones. Puede administrarse uno cualquiera o una combinación de los agentes quimioterapéuticos, tales como agentes quimioterapéuticos estándar de cuidado.
Adicionalmente, los métodos de tratamiento del cáncer con un conjugado ligando-fármaco se proporcionan como una alternativa a la quimioterapia o la radioterapia cuando la quimioterapia o la radioterapia han demostrado o pueden resultar demasiado toxicas, por ejemplo, producen efectos secundarios inaceptables o insoportables para el sujeto que está siendo tratado. El paciente que está siendo tratado puede, opcionalmente, ser tratado con otro tratamiento contra el cáncer, como cirugía, radioterapia o quimioterapia, dependiendo de qué tratamiento se considere aceptable o soportable.
1.7 Composiciones farmacéuticas que comprenden un LDC
La presente descripción divulga composiciones farmacéuticas que comprenden una composición de LDC descrito en la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma que permita que un LDC se administre a un paciente para el tratamiento de un trastorno asociado con la expresión del antígeno al que se une el anticuerpo de ADC. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma líquida o sólida liofilizada. La vía de administración preferida es la parenteral. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas y técnicas de inyección o infusión intravenosa, intramuscular e intraesternal. Preferiblemente, una composición farmacéutica que comprende un ADC se administra por vía intravenosa en forma de solución líquida.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para permitir que un compuesto esté biodisponible tras la administración de la composición a un paciente. Tales composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un sólido liofilizado puede proporcionar una única unidad de dosificación cuando se reconstituye como una solución o suspensión tras la adición de un vehículo líquido adecuado.
Los materiales usados para preparar las composiciones farmacéuticas son preferentemente no tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para los expertos en la técnica que la dosis optima del (de los) ingrediente(s) activo(s) en la composición farmacéutica dependerá de una variedad de factores. Los factores de interés incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo, un ser humano), la forma particular de la composición farmacéutica, la forma de administración y la composición empleada.
La composición farmacéutica puede estar, por ejemplo, en forma líquida. El líquido puede ser útil para administrarlo mediante inyección. En una composición para administración por inyección, también se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir, además, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como aminoácidos, acetatos, citratos o fosfatos; detergentes tales como tensioactivos no iónicos, polioles; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composición parenteral puede envasarse en una ampolla, una jeringa desechable o un frasco de dosis múltiples fabricado de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante ilustrativo. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
La cantidad del conjugado que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayosin vitrooin vivopara ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en las composiciones también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debería decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.
La composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de una composición de LDC de manera que se obtendrá una dosis adecuada para la administración a un sujeto que la necesite. Típicamente, esta cantidad es al menos aproximadamente 0,01 % en peso de la composición farmacéutica.
Para la administración intravenosa, la composición farmacéutica puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de una composición de LDC por kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la composición farmacéutica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de una composición de ADC por kg de peso corporal del animal. En otro aspecto, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal de una composición de ADC.
Generalmente, la dosis de una composición de LDC que se administra a un paciente es típicamente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto o entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto, o entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del sujeto, o entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg o aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto, o entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto, o entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosis administrada puede ser entre aproximadamente 0,1 a 4 mg/kg, preferentemente de 0,1 a 3,2 mg/kg, o con mayor preferencia de 0,1 a 2,7 mg/kg del peso corporal del sujeto durante un ciclo de tratamiento.
Un LDC puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos(por ejemplo,mucosa oral, mucosa rectal e intestinal). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de administración, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, y pueden usarse para administrar un compuesto. Se puede administrar más de un compuesto o composición a un paciente.
Los conjugados pueden formularse de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a animales, particularmente seres humanos. Generalmente, los portadores o vehículos para la administración intravenosa son soluciones tampón acuosas isotónicas y estériles. Cuando sea necesario, las composiciones pueden incluir, además, un agente solubilizante. Las composiciones para la administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando se va a administrar un conjugado por infusión, se puede dispensar, por ejemplo, con una botella de infusión que contenga agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando el conjugado se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en total conformidad con todas las normativas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden composiciones de LDC de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, todas, o sustancialmente todas, o más del 50 % de los LDC en la composición farmacéutica comprenden una succinimida hidrolizada tio-sustituida. Preferentemente, más del 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , 80 % , 85 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % de los conjugados de fármaco ligando presentes en la composición farmacéutica comprenden una succinimida tio-sustituida hidrolizada.
1.8 Preparación
Esquema 1:
El esquema 1 es una preparación ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador de fórmula Lb'-Ai(BU)-Ao-Y(W)-D+ en donde Lb' es un resto M1, Y es un resto autodestructivo PAB (SI), W es un resto carbohidrato (Su) unido a SI a través de un enlace glicosídico en donde dicho enlace se puede escindir mediante una glicosidasa, y D+ es una auristatina cuaternizado. En ese resto Lb'-Lo-D+ particular, la estructura Lb'-A<1>(BU)- representa un resto Lss ilustrativo.
Esquem a 2:
El esquema 2 es una preparación ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador de fórmula Lbl-A1(BU)-A0-Y-W -D en donde Lb es un resto M1, Y es un resto autodestructivo (SI) PAB, W es un resto dipeptídico unido a SI a través de un enlace anilida en donde dicho enlace se puede escindir mediante una proteasa reguladora y D+ es una auristatina cuaternizado. En ese resto Lb-Lo-D+ particular, la estructura Lb-A<1>(BU)- representa un resto Lss ilustrativo unido covalentemente a otra subunidad de extensión y el resto dipeptídico val-cit proporciona el reconocimiento por dicha proteasa, que en este caso es catepsina B.
Esquem a 3
El esquema 3 es una preparación ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador Lb'-Ai(BU)-Ao-Y(W)-D+ en donde Lb' es un resto M1, Y es un PAB autodestructivo (SI), W es un resto carbohidrato (Su) unido a SI a través de un enlace glicosídico en donde dicho enlace se puede escindir mediante una glicosidasa, y D+ es un dímero de fenazina cuaternizado. En ese compuesto Lb'-Lo-D+ particular, la estructura Lb'-A<1>-Ao- representa un resto M1-A- que tiene dos subunidades de extensión (es decir, -A - es -A<1>-Ao-).
Esquem a 4
El Esquema 4 es una preparación ilustrativa de un compuesto NH<2>-W-Y-D+ como intermedio para obtener un compuesto fármaco-enlazador de fórmula Lb'-Lo-D+ en donde Y es un resto PAB autodestructivo (SI), W es un resto dipeptídico unido a SI a través de un enlace anilida en el que dicho enlace se puede escindir mediante una proteasa reguladora y D+ es una unidad de fármaco tubulisina cuaternizado.
El esquema 5 es una preparación ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador Lb'-A-W-Y-D+ y un compuesto fármaco-enlazador Lb'-A(BU)-W-Y-D+ obtenido a partir del acoplamiento peptídico del intermedio NH<2>-W-Y-D+ del esquema 4 con un intermedio Lb'-A-CO<2>H o Lb'-A(BU)-CO<2>H en donde Lb'es un resto maleimida (M1). Los productos así formados, M1-A-W-Y-D+ y M1-A(BU)-W-Y-D+ son un ejemplo de compuestos enlazadores de fármacos Lb'-Lo-D+ que tienen una unidad de fármaco tubulisina cuaternizado.
Esquem a 6
El esquema 6 es una preparación ilustrativa de un resto Lb'-A<1>(BU)-A<6>-Y(W)-D+ en donde Lb' es un resto M1, Y es un resto PAB autodestructivo (SI), W es un resto carbohidrato (Su) unido a SI a través de un enlace glicosídico en donde dicho enlace se puede escindir mediante una glicosidasa, y D+ es un inhibidor de MDR cuaternizado en donde el inhibidor es Tariquidar. En ese resto Lb'-Lo-D+ particular, la estructura Lb'-A(BU)- representa un resto Lss ilustrativo.
Esquem a 7
El esquema 7 representa preparaciones ilustrativas de tubulisinas de fórmula D<g>-<4>, en donde R7B es hidrógeno y R2B es hidrógeno, metilo o etilo, que tienen un éter (es decir, metil, etil o propil éter) como sustituyente unido a O que reemplaza al acetato en el resto tubuvalina de la tubulisina M y que no tienen el grupo funcional N, O-acetal químicamente inestable de tales tubulisinas. Los compuestos 64-66 se estabilizan adicionalmente en comparación con la tubulisina M reemplazando el sustituyente acetato de tubuvalina hidrolíticamente inestable con un resto éter.
en donde R7B es hidrógeno o un sustituyente unido a O, preferentemente hidrógeno o -OH en la posiciónpara,y R8A es hidrógeno o alquilo inferior, ente metilo; y donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de Dg o Dh.
En modalidades preferidas de estructura Dg o Dh, un R7 es hidrógeno y el otro R7 es un arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene la estructura de
en donde R7B es -H u -OH; y donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de D<g>o D<h>.
En otras modalidades de estructura Dg y Dh, un R7 es hidrógeno o alquilo inferior, preferentemente hidrógeno o metilo, con mayor preferencia hidrógeno, y el otro R7 es arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene la estructura de uno de:
en donde Z es un alquileno opcionalmente sustituido o un alquenileno opcionalmente sustituido, R7B es hidrógeno o un sustituyente unido a O, preferentemente hidrógeno u -OH en la posiciónpara,R8A es hidrógeno o alquilo inferior, preferentemente metilo, y el subíndice n es 0, 1 o 2, preferentemente 0 o 1; y donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de Dg o Dh. En otras modalidades más de la estructura Dg y Dh -N(R7)(R7) es -NH(alquilo C<1>-Ca) en donde el alquilo C<1>-C<6>está opcionalmente sustituido con -C O<2>H o un éster del mismo, o con un fenilo opcionalmente sustituido. En modalidades preferidas -N(R7)(R7) se selecciona del grupo que consiste en -NH(CH<3>), -CH<2>CH<2>Ph, and -C H<2>-C O<2>H, -C H<2>CH<2>C O<2>H y -C H<2>CH<2>CH<2>CO<2>H.
En algunas modalidades de la estructura Dg' y Dh', R7 y R10 junto con los átomos a los que están unidos definen un heterociclo opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros, en donde -N (R7)-CH (R10)(CH 2R11) tiene la estructura de ,
donde donde la línea ondulada indica el punto de unión a lo que resta de D<g>' o D<h>'.
Esquem a 8
El esquema 8 representa una preparación ilustrativa de compuestos enlazadores de fármacos de fórmula Lb'-Lo-D+ en donde D+ es un compuesto de tubulisina cuaternizado que tiene un resto éter como sustituyente unido a O que reemplaza al acetato en el resto tubuvalina de la tubulisina M y que no tiene el grupo funcional N,O-acetal químicamente inestable de tales tubulisinas. En los compuestos ejemplificados, -Lo-D+ tiene la estructura de Aa-Yy(Ww)-D+ en donde los subíndices a, y, y w son cada uno. Por lo tanto, los compuestos 78-80 representan compuestos enlazadores de fármacos ilustrativos en donde W es un resto carbohidrato unido a una unidad espaciadora autodestructiva (Y) que tiene la estructura de un resto PAB a través de un enlace glicosídico escindible por una glicosidasa a la que está unido D+ en donde D+ es un compuesto de tubulisina cuaternizado. Los compuestos 78-80 representan además compuestos enlazadores de fármacos cuyos componentes Lb' están compuestos por un resto M1 y una unidad básica para proporcionar un componente enlazador autoestabilizante (L<ss>) de un conjugado de fármaco y ligando a partir de su condensación con un resto de direccionamiento que tiene un grupo funcional tiol reactivo como en un tiol de cisteína de un anticuerpo.
Los esquemas 9 y 10 juntos proporcionan una preparación alternativa de compuestos enlazadores de fármacos de fórmula Lb'-Lo-D+ en donde -Lo-D+ tiene la estructura de Aa-Yy(Ww)-D+ en donde los subíndices a, y, y w son cada uno, en donde -A - es -Ai-Ao-. Por lo tanto, el compuesto 104 representa un compuesto fármaco enlazador ilustrativo de fórmula Lb-Ai(BU)-Ao-Y(W)-D+ en donde W es un resto carbohidrato unido a una unidad espaciadora autodestructiva (Y) que tiene la estructura de un resto PAB a través de un enlace glicosídico escindible por una glicosidasa a la que está unido D+ en donde D+ es un compuesto de tubulisina cuaternizado. Para el compuesto 104, la tubulisina cuaternizado es la de Tubulisina M que tiene un resto éter que retiene el componente acetato de tubuvalina pero no tiene el grupo funcional N, O-acetal químicamente inestable de tales tubulisinas.
Esquem a 11
El esquema 11 representa una síntesis ilustrativa de un intermedio W'w-Yy-D+ para la preparación de un compuesto fármaco enlazador Lb'-Lo-D+ de fórmula Dg<-3>, en donde R7B es -H y R2B es metilo, y en donde los subíndices w e y son cada uno 1 y donde W' es un precursor de W en un compuesto fármaco enlazador o conjugado de fármaco ligando preparado a partir del compuesto intermedio de compuesto fármaco enlazador. El compuesto 111 representa además un compuesto intermedio fármaco enlazador en donde W es un resto dipéptido e Y es una unidad espaciadora autodestructiva ejemplificada por un resto PAB. En el Compuesto 111 ese dipéptido está ejemplificado por -valina-glutamato-y D+ está ejemplificado por Tubulisina M cuaternizado.
El esquema 12 ejemplifica la preparación de un compuesto fármaco-enlazador Lb'-Lo-D+ de fórmula Dg-<3>, en donde R7B es -H y R2B es metilo, a partir de un intermedio de fórmula H-Ww-Yy-D+, a saber, el Compuesto 111 , en donde los subíndices w e y son cada uno 1, y W, Y y D+ se ejemplifican mediante un resto dipeptídico (-valina-glutamato-), un resto PAB autodestructivo y tubulisina M cuaternizado, respectivamente. El compuesto 113 representa además el producto que tiene la fórmula de Lb'-A(BU)-W-Y-D+ a partir de la incorporación de un precursor del resto de unión covalente de ligando (Lb') en un compuesto fármaco-enlazador, en donde Lb'-A(BU)- se compone de un resto maleimida (M1), una Unidad de extensión (A) sustituida por una Unidad básica (BU) condensando el Compuesto 6 que tiene restos M1 y un precursor de Unidad de extensión sustituido con BU (Aa') sustituido en donde el subíndice a es 1, en donde ese precursor en la condensación con Ww-Yy-D+ del compuesto 111 completará la formación del componente Lo de la unidad enlazadora Lb'-L0- después de la desprotección de BOC.
153, R=CH2CH(CH3)2158, R=CH2CH(CH3)2
154, R=CH2C{CH3)3159, R=CH2C(CH3)3
Los esquemas 13 y 14 juntos proporcionan síntesis ilustrativas de tubulisinas en donde el resto acetato del componente tubuvalina de Tubulisina M ha sido reemplazado por otros restos unidos a O que tienen la fórmula -OC(O)R2B como se muestra en la estructura D<g>-<3>.
El esquema 15 muestra una síntesis ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador para la preparación de conjugados de fármaco ligando que tienen una unidad de fármaco de tubulisina no cuaternizado, en donde el sustituyente acetato unido a O del componente de tubuvalina de des-metil tubulisina M se ha sustituido por un resto éter como sustituyente unido a O unido a y en donde la unidad de fármaco de Tub(OCH<3>) está unida a través de su componente N-terminal a una unidad enlazadora mediante el grupo funcional carbonilo de la unidad de extensión. Un LDC del Compuesto172representa un conjugado no escindible (es decir, es resistente a la liberación mediada por proteasa de des-metil Tubulisina M (OCH<3>)-OH libre y tiene la fórmula general M<1>-AD en donde M<1>es el resto maleimida, la unidad extensora A es un alquileno y la unidad D de fármaco no cuaternizado es des-MeTub(OCH<3>)-OH. Un conjugado de fármaco y ligando de ese compuesto fármaco-enlazador tiene la fórmula general L-S-M<2>-A-D, en donde M<2>es un resto succinimida resultante de la adición conjugada de un resto de direccionamiento tiol a M<1>del compuesto fármaco-enlazador. Un resto activo que finalmente se libera de la proteólisis inespecífica cuando la unidad de ligando del LDC es de un resto de direccionamiento de anticuerpo (es decir, es un ADC) tiene la estructura de Cys-SM<2>-A-Tub(OCH<3>)-OH en donde el resto C y s-S - es de un aminoácido cisteína, la unidad de ligando de anticuerpo.
Los compuestos enlazadores de fármacos que reemplazan la tubulisina M con otra tubulisina que contiene amina terciaria que retiene el resto acetato en su componente de tubuvalina o reemplazan ese resto con un éter o un sustituyente diferente aciloxi o unido a O (por ejemplo, un carbamato unido a O) de fórmulaD<g>, D<g - i>. D<g - 2>, D<g -3>, D<g -4>, D<g -5>, D<g -6>, D<g -7>, D<g -8>, D<h>, D<h - i>o D<h -2>se preparan de forma análoga a la del Esquema 4, Esquema 7, Esquema<8>, Esquemas 9+10, Esquema 11 , Esquema 12 o Esquemas 13+14.
Esquema 16 muestra una síntesis ilustrativa de un compuesto enlazador fármaco para la preparación de conjugados Ligando Fármaco que tiene la fórmula de Lb'-A-i(BU)-Ao-Y(W)-D+ en donde Lb es un resto M<1>, Y es un resto PAB autodestructivo (SI), W es un resto carbohidrato (Su) unido a SI a través de un enlace glicosídico en donde dicho enlace se puede escindir mediante una glicosidasa, y D+ es Dolastatina 10 cuaternizado. En esa modalidad de fármaco-enlazador de fórmula Lb'-Lo-D+ la estructura Lb'-A<1>(BU)- representa un resto Lss ilustrativo. El compuesto 177 es análogo al compuesto<8>del esquema 1 en donde la auristatina E cuaternizado se reemplaza por dolastatina 10 cuaternizado. Los conjugados de ligando-fármaco preparados a partir del compuesto 177 liberan dolastatina 10 libre, que es otro miembro de la clase de compuestos auristatina y que contiene un grupo funcional amina terciaria, tras la acción de la p-glucuronidasa.
El esquema 17 muestra una síntesis ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador para la preparación de conjugados de fármaco ligando en donde la monometil dolastatina<10>se conjuga a través de un grupo funcional carbamato a un resto PAB. Un conjugado de fármaco y ligando unido a carbamato no es adecuado para un fármaco que contiene amina terciaria en el que ese grupo funcional amina es el punto de unión a un resto PAB. Los conjugados del Compuesto 183 liberan un fármaco libre que contiene amina secundaria (es decir, monometil dolastatina 10) y los conjugados del Compuesto 177 liberan el fármaco libre que contiene el terciario parental (es decir, dolastatina<1 0>) mediante el mismo procesamiento enzimático mediante p-glucuronidasa.
El esquema 18 muestra una síntesis ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador para la preparación de conjugados de fármaco ligando que tienen la fórmula Lb'-A-i(BU)-Ao-Y(W)-D+ en donde Lb' es un resto M<1>, Y es un resto PAB autodestructivo (SI), W es un resto carbohidrato (Su) unido a SI a través de un enlace glicosídico en donde dicho enlace se puede escindir mediante una glicosidasa, y D+ es Auristatina F cuaternizado. En esa modalidad de la fórmula Lb'-Lo-D+ la estructura Lb'-A1(BU)- representa un resto Lss ilustrativa. El compuesto 189 es análogo al compuesto<8>, el compuesto 14 y el compuesto 17 de los esquemas 1, 4 y 17, respectivamente, en donde la auristatina E cuaternizado o la dolastatina 10 cuaternizado se reemplazan por MMAF cuaternizado. MMAF es otro fármaco que contiene aminas terciarias de la clase de compuestos auristatina.
Los compuestos enlazadores de fármacos que reemplazan a Auristatina E, Dolastatina 10 o Auristatina F con compuestos de fórmulaD<a>, D<b>, D<c>, D<e>, D<e - 1>, D<e - 2>, D<f>, D<f - 1>,oD<e / f -3>se preparan de manera similar a la ejemplificada en el Esquema 1, Esquema 2, Esquema 5, Esquema 16 o Esquema 18 según sea apropiado.
El esquema 19 muestra una síntesis ilustrativa de un compuesto fármaco-enlazador para la preparación de conjugados de fármaco ligando que tienen una unidad de fármaco de tubulisina no cuaternizado, en la que la unidad de fármaco de tubulisina M está unida a través de su componente C-terminal a una unidad enlazadora mediante el grupo funcional hidrazina de la unidad de extensión. Un LDC a partir del Compuesto 172 representa un conjugado escindible comprende el resto -W-Y-, en donde W es el dipéptido valina-Citrulina- y es de la fórmula general M<1>-A-W-Y-D o M<1>-A-W<2>-W<1>-PABC-D en donde M<1>es el resto maleimida, la unidad de extensión A es un alquileno, W es una unidad de péptido escindible de fórmula -W<2>-W<1>-, en donde W<1>es citrulina y W<2>es valina, PABc es el resto paminobeniloxicarbonilo como unidad espaciadora autodestructiva Y, la unidad de extensión A es un alquileno y la unidad D de fármaco no cuaternizado es TubM-NHNH-. Un conjugado de fármaco y ligando de ese compuesto fármaco-enlazador tiene la fórmula general L-S-M<2>-A-W-Y-D o L-S-M<2>-A-W<2>-W<1>-PABC-D, en donde M<2>es un resto succinimida resultante de la adición conjugada de un resto direccional tiol a M<1>del compuesto Fármaco Enlazador. Un resto de fármaco activo que se libera de la proteólisis específica del contexto en W tiene la estructura de TubM-NH-NH2-.
EJEM PLO S
Los ejemplos que no entran en el ámbito de aplicación de las reivindicaciones anexas se proporcionan para ayudar a comprender mejor la invención reivindicada.
General: Química
Todos los solventes anhidros comercialmente disponibles se usaron sin purificación adicional. La cromatografía analítica en capa fina se realizó sobre láminas de aluminio de gel de sílice 60 F254 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ). La cromatografía radial se realizó en un aparato de Chromatotron (Harris Research, Palo Alto, CA). La cromatografía en columna se realizó en un sistema de purificación rápido de Biotage Isolera One™ (Charlotte, NC). La HPLC analítica se realizó en un sistema de suministro de disolvente Varian ProStar 210™ configurado con un detector Varian ProStar 330 PDA. Las muestras se eluyeron de una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergi™ 2,0 x 150 mm, 4 pm, 80 A. La fase móvil ácida consistió en acetonitrilo y agua que contenían ácido trifluoroacético al 0,05 % o ácido fórmico al 0,1 % (indicado para cada compuesto). Los compuestos se eluyeron con un gradiente lineal de acetonitrilo ácido desde el 5 % a 1 min después de la inyección, hasta el 95 % a los 11 min, seguido de acetonitrilo isocrático al 95 % a los 15 min (velocidad de flujo = 1,0 ml/min). La LC-MS se realizó en dos sistemas diferentes. El sistema de LC-MS 1 consistió en un espectrómetro de masas ZMD Micromass conectado a un instrumento de HPLC HP Agilent 1100 equipado con una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergi 2,0 x 150 mm, 4 pm, 80 A. El eluyente ácido consistió en un gradiente lineal de acetonitrilo del 5 % al 95 % en ácido fórmico acuoso al 0,1 % durante 10 min, seguido de acetonitrilo isocrático al 95 % durante 5 min (velocidad de flujo = 0,4 ml/min). El sistema de LC-MS 2 consistió en un espectrómetro de masas Waters Xevo G2™ Tof conectado a un módulo de separaciones Waters 2695 con un detector de matriz de fotodiodos Waters 2996; la columna, las fases móviles, el gradiente y la velocidad de flujo fueron los mismos que para el sistema de LC-M S 1. El sistema UPLC-MS 1 consistía en un detector de masas Waters SQ conectado a un LC Acquity™ Ultra Performance equipado con una columna de fase inversa Acquity UPLC BEH C 18 2,1 x 50 mm, 1,7 pm. La fase móvil ácida (ácido fórmico al 0,1 % ) consistió en un gradiente de acetonitrilo al 3 %/agua al 97 % hasta acetonitrilo al 100 % (velocidad de flujo = 0,5 ml/min). El sistema UPLC-M S 2 consistía en un espectrómetro de masas Waters Xevo G 2 ToF interconectado a un LC Waters Acquity H-Class Ultra Performance equipado con una columna de fase inversa Acquity UPLC BEH C 18 2,1 x 50 mm, 1,7 pm. La fase móvil ácida (ácido fórmico al 0,1 % ) consistió en un gradiente de acetonitrilo al 3 %/agua al 97 % hasta acetonitrilo al 100 % (velocidad de flujo = 0,7 ml/min). La HPLC preparativa se realizó en un sistema de suministro de disolvente Varian ProStar 210 configurado con un detector Varian ProStar 330 PDA. Los productos se purificaron en una columna de fase inversa C 12 Phenomenex Synergi 10,0 x 250 mm, 4 pm, 80 A eluyendo con ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (disolvente A) y ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (disolvente B). Los métodos de purificación generalmente consistieron en gradientes lineales de solvente A a solvente B, pasando de solvente A acuoso al 90 % a solvente A al 10 % . El caudal fue de 4,6 ml/min con monitoreo a 254 nm. Los datos espectrales de RMN se recogieron en un espectrómetro Varian Mercury de 400 MHz. Las constantes de acoplamiento (J) se expresan en hercios.
General: Biología
Ensayosin vitro.Las células cultivadas en crecimiento en fase logarítmica se sembraron durante 24 h en placas de 96 pocillos que contenían 150 pl de RPMI 1640 complementado con FBS al 20 % . Se prepararon diluciones en serie de conjugados de anticuerpo fármaco en medios de cultivo celular a una concentración de trabajo 4x; se añadieron 50 pl de cada dilución a las placas de 96 pocillos. Después de la adición de ADC, las células se incubaron con los compuestos de prueba durante 4 días a 37 °C . Después de 96 h, se evaluó la inhibición del crecimiento mediante Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI) y se midió la luminiscencia en un lector de placas. El valor de IC<50>, determinado por triplicado, se define aquí como la concentración que da como resultado una reducción del 50 % en el crecimiento celular con respecto a los controles no tratados.
Modelos de xenoinjertoin vivo.Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité para el uso y cuidado de animales en una instalación totalmente acreditada por la Asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio. Se llevaron a cabo experimentos de eficacia en un modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy. Las células tumorales L540cy, como una suspensión celular, se implantaron subcutáneamente en ratones SCID inmunodeprimidos. Tras el injerto del tumor, los ratones se asignaron al azar a los grupos de estudio cuando el volumen tumoral promedio alcanzo aproximadamente 100 mm<3>. El ADC o los controles se dosificaron una vez mediante inyección intraperitoneal. El volumen tumoral en función del tiempo se determinó mediante la fórmula (L x W<2>)/2. Los animales se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 1000 mm<3>. Los ratones que mostraron regresiones duraderas se sacrificaron alrededor del día 100 después del implante.
Experimentos de estabilidadex vivo.La evaluación de la carga de fármacos de los ADC humanizados en muestras de plasma de roedores mediante LC-MS de fase reversa se logró aislando primero los ADC con resina IgSelect™ (GE Healthcare), que se une selectivamente al dominio Fc humano. Los ADC se prepararon con<8>fármacos por anticuerpo de MDPR-glucurónido-amina cuaternaria-AE<8>o mDPR-Val-Cit-PAB-amina cuaternaria-AE (mDPR-vcPAB4-AE) 14 usando cAC10 completamente reducido. Los ADC (1,0 mg/ml) se incubaron en plasma estéril de rata y ratón durante 10 días a 37 °C. En ocho puntos de tiempo durante la incubación, se extrajo una alícuota de 50 pl de cada ADC y se congeló a -80 °C. Una vez completado el transcurso del tiempo, se purificaron los ADC de cada muestra y se analizaron mediante HPLC de fase inversa en línea con un espectrómetro de masas TOF para determinar la relación fármaco:anticuerpo.
Experimentos de liberación de fármacos enzimáticos. Se añadieron quince pl de solución madre de fármacoenlazador 10 mM de<8>en DMA a 27 pl de DMSO y se inactivaron con N-acetilcisteína (30 pl de solución madre 100 mM en PBS) en un tubo Eppendorf. Se añadieron 48 pl de PBS y se dejó reposar el tubo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se prepararon reservas de enzimas al mismo tiempo disolviendo p-glucuronidasa (de hígado bovino, >1 000000 unidades/g de sólido) en NaOAc 100 mM hasta una concentración final de 1 o 2 mg/ml, después de lo cual se combinaron 38 pL de la solución de enlazador desactivada con 170 pL de solución madre de enzima reciente y 132 pL de NaOAc 100 mM luego se incubaron a 37 °C. Se tomaron 25 pl en cada momento, se añadieron a 150 pl de MeOH, se sellaron y se almacenaron a -80 °C hasta que se tomaron todos los momentos. A continuación, las muestras se centrifugaron a alta velocidad durante 20 minutos y se analizaron mediante UPLC-MS, contando los iones para el enlazador inactivó intacto y el fármaco liberado.
Liberación intracelular de fármacos. Para el estudio se usaron células TF1a, L428 y H CT-15. Las células que habían sido cultivadas en condiciones normales se cosecharon y se lavaron en medio fresco a ~ 5 x 10<5>células/ml. Para cada condición de tratamiento, 5 -15x10<6>células se sembraron en frascos T25 o T150. Se añadió cOKT9-5023 (<8>-fármacos/Ab) a 1 pg/ml a los cultivos y se incubaron a 37 °C, CO<2>al 5 % durante 24 h. Para las células en suspensión, se recogió un volumen conocido de cultivo celular mediante centrifugación (500 xg, 5 min, 4 °C) y se extrajo una alícuota del medio y se almacenó para análisis espectral de masas (-20 °C). Para las células adherentes, el medio se retiró cuidadosamente (una alícuota almacenada para análisis espectral de masas) y las células se levantaron con tripsina-EDTA seguido de centrifugación (500 xg, 5 min, 4 °C) para recoger el sedimento celular. Tanto para las células en suspensión como para las adherentes, los sedimentos celulares recolectados se resuspendieron en PBS helado y se extrajo una alícuota para la enumeración y determinación de los diámetros celulares promedio usando un analizador de viabilidad celular Vi-Cell XR2.03 (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Las suspensiones celulares restantes se sedimentaron (500 xg, 5 min) y luego se lavaron una vez más con 1 ml de PBS enfriado con hielo. Los sedimentos resultantes se almacenaron a -20 °C.
Se generaron muestras sin tratar usando sedimentos de células sin tratar y medio de cultivo para usar en curvas de calibración. Los sedimentos de células sin tratar se enriquecieron con 4 pl de analito estándar 25X. Se suspendieron tanto los sedimentos celulares enriquecidos como los tratados mediante agitación con vórtex en 400 pl de patrón interno que contenía MeOH y se colocaron a -20 °C durante 15 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 16,000 xg y los sobrenadantes se prepararon para la extracción en fase sólida. Las muestras de medio de cultivo sin tratar (0,5 ml) se enriquecieron con 4 pl de estándar 25X. Tanto los medios de cultivo enriquecidos como los tratados se mezclaron con 10 pl de patrón interno y se prepararon para la extracción en fase sólida. Las muestras se sometieron a extracción en fase sólida y las soluciones que contenían el fármaco recuperadas se secaron y reconstituyeron para cuantificación mediante LC-MS/MS. Para derivar una ecuación para la cuantificación del fármaco liberado en las muestras experimentales desconocidas, el área de pico para cada estándar de fármaco se dividió por el área de pico obtenida para el estándar interno. Las relaciones de área de pico resultantes se representaron gráficamente como una función de las cantidades estándar añadidas y los puntos de datos se ajustaron a una curva mediante el uso de regresión lineal. Las relaciones de área de pico obtenidas para el fármaco liberado con respecto al patrón interno en las muestras experimentales se convirtieron en cantidades de fármaco utilizando la ecuación derivada.
Ejemplo 1:(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(bromometil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-tríil triacetato (2):
Un matraz secado a la llama se cargó con fragmento enlazador glucurónido conocido (Bioconjugate Chem. 2006, 17, 831-840) (1, 210 mg, 281 pmol) en 4,5 ml de THF anhidro. La solución se agitó a temperatura ambiente bajo N<2>. Se añadieron secuencialmente trifenilfosfina (111 mg, 421,5 pmol) y N-bromosuccinimida (75 mg, 421,5 pmol) y la solución se agitó durante 2 horas. La reacción se condensó a presión reducida y se purificó sobre sílice mediante una columna Biotage (Hexanos/EtOAc, 30 % -50 % -70 % ) para proporcionar 2 (222 mg, 97 % ). UPLC-M S analítica (sistema 1): tr=2,36 min,m/z(ES+) encontrado 811,34.
Ejemplo 2:(S)-N-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-((((2S,3R,4S,5S,6S))-3,4,5-tríacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (4):
Un recipiente a presión se cargó con intermedio de unidad de extensor-glucurónido bromado (2, 111 mg, 137 pmol) del Ejemplo I y auristatina E (3, 100 mg, 137 pmol) en anhidro 2-butanona (4,2 ml). El recipiente de reacción se lavó abundantemente con N<2>y se selló. Después, la reacción se agitó y se calentó a 80 °C durante 12 horas. La mezcla resultante se enfrió, se condensó a presión reducida y se purificó sobre sílice mediante una columna Biotage (CH<2>Ch/MeOH, 2 % -20 % -100 % ) para proporcionar 4 (113 mg, 56 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 2,02 min,m/z(ES+) encontrado 1462,53.
Ejemplo 3:(S)-N-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptano-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (5):Se cargó un matraz con glucurónido-AE (4, 113 mg, 77 pmol) en THF (1,3 ml) y MeOH (1,3 ml). Esta solución se agitó en atmósfera de N<2>y se enfrió a 0 °C. LiOH H<2>O (19 mg, 462 pmol) se solubilizó en H<2>O (1,3 ml) gota a gota a continuación añadido. Se dejó que la reacción se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (26 pl, 462 pmol) y se condensó a presión reducida. El residuo se recogió en DMSO mínimo y se purificó mediante LC preparativa para proporcionar 5 (34 mg, 40 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,20 min,m/z(ES+) encontrado 1100,51.
Ejemplo_______ 4.(S)-N-(3-(3-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H pirrol-1-il)pmpanamido)pmpanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetmhidm-2H-pimn-2-il)oxi)bendl)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (7):
Se cargó un matraz con glucurónido-AE desprotegido (5, 34 mg, 31 pmol) en DMF anhidra (0,31 ml). Se añadió mDPR(Boc)-OSu (<6>, 14 mg, 37 pmol) bajo N<2>. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (27 pl, 155 pmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (27 pl) y se purificó mediante LC preparativa para proporcionar 7 (29 mg, 68 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,52 min,m/z(ES+) encontrado 1366,40.
Ejemplo______ 5:(S)-N-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-tríhidroxitetrahidro-2Hpiran-2-il)oxi)bendl)-1-(((S)-1-(((3R,4S,SS)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutano-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (8):
Un matraz que contenía mDPR(Boc)-Glucurónido-AE (7, 29 mg, 21 pmol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (1,1 ml) y se agitó durante 4 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó por LC preparativa para producir<8>(20 mg, 75 % ). UPLC-MS analítica: tr= 1,23 min,m/z(ES+) encontrado 1266,39. HPLC-M<s>analítica (sistema 2): tr= 9,53 min,m/z(ES+) encontrado 1266,70.
Ejemplo 6:(9H-fluoren-9-il)metil((S)-1-(((S)-1-((4-(bromometil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (10):
Se añadió dipéptido Fmoc-Val-Cit-PAB (9, 75 mg, 125 pmol) a un matraz secado a la llama en atmósfera de N<2>y se enfrió a 0 °C . Se añadió gota a gota una solución de HBr al 33 % en ácido acético (1,3 ml). La solución se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Después, el HBr restante se eliminó mediante una corriente de N<2>y la reacción se condensó adicionalmente a presión reducida. El residuo resultante se recogió en THF y se volvió a condensar 3 veces y luego se llevó adelante sin purificación adicional. UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 2,19 min,m/z(ES+) encontrado 664,47.
Ejemplo 7:(S)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo)-1-(((S)-1-(((3R,4S,Ss)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (11):
A un recipiente a presión cargado con dipéptido bromado crudo (10, 48 mg, 72 pmol) se le añadió auristatina E (3, 30 mg, 41 pmol) y 2-butanona anhidra (2,2 ml). El recipiente se lavó abundantemente con N<2>y se selló. Después, la reacción se calentó a 80 °C con agitación durante 3 horas. Al no observar reacción por<l>C-MS, se añadió N,N-diisopropiletilamina (7 pL, 41 pmol) y la reacción se volvió a sellar durante 12 horas. La mezcla de reacción se condensó a presión reducida y se purificó mediante LC preparativa para proporcionar 11 (13 mg, 24 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,88 min,m/z(ES+) encontrado 1315,57.
Ejemplo 8:(S)-N-(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,SS)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (12):
Se añadió Fmoc-Val-Cit-PAB-AE (11, 13 mg, 10 pmol) a un matraz con DMF anhidra (0,4 ml). Se añadió piperidina (0,1 ml) en N<2>. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se purificó directamente mediante LC preparativa para proporcionar 12 (8 mg, 74 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,27 min,m/z(ES+) encontrado 1093,62.
Ejemplo 9:(S)-N-(4-((7S,10S,13S)-7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-10-isopropil-2,2-dimetil-4,8,11-trioxo-13-(3-ureidopropil)-3-oxa-5,9,12-triazatetradecanamido)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N, N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (13):
Se cargó un matraz con Val-Cit-PAB-AE (12, 8 mg, 7,3 pmol) en DMF anhidra (146 pL). Se añadió mDPR(Boc)-OSu (<6>, 3,3 mg, 8,8 pmol) bajo N<2>. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (6 pl, 35 pmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (6 pl) y se purificó mediante LC preparativa para proporcionar 13 (2 mg, 17 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,66 min,m/z(ES+) encontrado 1359,51.
Ejemplo 10:(S)-N-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)-1-(((S)-]-(((3R,4S,5S)-]- (S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (14):
Un matraz que contiene mDPR(Boc)-Val-Cit-PAB-AE (13, 2 mg, 1,5 pmol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (294 pl) y se agitó durante 3 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó por LC preparativa para producir 14 (2,2 mg, 99 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,30 min,m/z(ES+) encontrado 1259,69. HPLC-M S analítica (sistema 2): tr= 9,22 min,m/z(ES+) encontrado 1259,78.
Ejemplo 11:N-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-tríacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-N-metil-3-(metil(2-(9-metilfenazina-1-carboxamido)etil)amino)-N-(2-(9-metilfenazina-1-carboxamido)etil)propan-1-aminio (16):
Intermedio de unidad de glucurónido-extensión bromado 2 (25 mg, 30 pmol) del Ejemplo 1 y dímero de fenazina simétrico 15 (J. Med. Chem., 2001, 44, 1407) (19 mg, 30 pmol) se disolvieron en butanona anhidra (0,48 ml) y dimetilformamida anhidra (0,48 ml). La reacción se purgó con nitrógeno y se calentó a 80 °C en un tubo sellado durante 18 h. El análisis LC/MS reveló el producto en presencia de material de partida y subproducto bis-alquilado. A continuación, el material bruto se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar la amina cuaternaria 16 (8,5 mg, 21 % ). HPLC-M S analítica (sistema 1): tr= 12,52 min,m/z(ES+) encontrado 1359,19.
Ejemplo 12:N-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-ilo)oxi)bencil)-N-metil-3-(metil(2-(9-metilfenazina-1-carboxamido)etil)amino)-N-(2-(9-metilfenazina-1-carboxamido)etil)propan-1-aminio (17):
Se cargó un matraz con enlazador de amina cuaternaria 16 (8,5 mg, 6,0 pmol) disuelto en metanol (0,2 ml) y tetrahidrofurano (0,2 ml), luego se enfrió bajo nitrógeno a 0 °C en un baño de hielo. Se disolvió hidróxido de litio monohidrato (0,75 mg, 18 pmol) en agua (0,1 ml) y la solución se añadió gota a gota al matraz de reacción. Se añadieron más agua (0,2 ml), metanol (0,2 ml) y tetrahidrofurano (0,2 ml). Después, la reacción se agitó durante 1,5 horas a 0 °C, luego se añadió hidróxido de litio adicional (0,75 mg, 18 pmol) en 0,1 ml de agua a la reacción. A las 3 horas, la reacción se completó mediante LC, luego se inactivó con ácido acético glacial (2,1 pl) y se concentró mediante evaporación rotatoria. El material bruto se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el enlazador 17 de amina cuaternaria completamente desprotegido (3,7 mg, 62 % ). HPLC-M S analítica (sistema 1): tr= 10,26 min,m/z(ES+) encontrado 997,45.
Ejemplo 13:N-(4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-3-(3-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)propanamido)bencil)-N-metil-3-(metil(2-(9-metilfenazina-1-carboxamido))etil)amino)-N-(2-(9-metilfenazina-1-carboxamido)etil)propan-1-aminio (19):
A una solución agitada del enlazador 17 (3,7 mg, 3,6 pmol) en dimetilformamida anhidra (0,18 ml) bajo nitrógeno se le añadió éster 18 de maleimidocaproil-succinimida (1,2 mg, 4,0 pmol) como una solución en dimetilformamida anhidra (0,18 ml), seguido de diisopropiletilamida (3,8 pl). Después de agitar la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente bajo nitrógeno, se añadieron 18 (0,6 mg) adicionales en 90 pL de dimetilformamida, seguido de 90 pL de dimetilsulfóxido para facilitar la disolución de todos los reactivos. La reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante dos horas más, luego se purificó mediante múltiples inyecciones de HPLC preparativa para eliminar el 18 residual del producto, el enlazador 19 de dímero de amina-fenazina cuaternaria (2,1 mg, 45 % ). HPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 10,76 min,m/z(ES+) encontrado 1190,35.
Ejemplo 14:Ácido S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-propanoico (22):
Se cargó un matraz con Boc-Val-OSu (20, 1,0 g, 3,18 mmol) y H-Ala-OH (21, 312 mg, 3,5 mmol) en dimetilformamida anhidra (10,6 ml). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (1,1 ml, 6,4 mmol) y la solución se agitó bajo N<2>a 50 °C durante 12 horas. La reacción se recogió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para producir 22 (808 mg, 88 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,38 min,m/z(ES+) encontrado 289,60.
Ejemplo 15:terc-butil((S)-1-(((S)-1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (24):
Se cargó un matraz secado a la llama con dipéptido 22 (808 mg, 2,8 mmol) y alcohol 4-aminobenzoico 23 (345 mg, 2,8 mmol) en diclorometano anhidro (14 ml). Se añadió EEDQ (762 mg, 3,1 mmol) como un sólido y se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 12 h. Después, la reacción se condensó y se purificó sobre sílice mediante una columna Biotage (CH<2>Ch/MeOH, 0 % -10 % ) para proporcionar 24 (660 mg, 60 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,51 min,m/z(ES+) encontrado 394,51.
Ejemplo 16:terc-butil((S)-1-(((S)-1-((4-(bromometil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil1-1-oxobutan-2-il) carbamato (25):
Un matraz que contenía Boc-Val-Ala-PABA-OH (24, 100 mg, 254 pmol), N-bromosuccinimida (68 mg, 381 pmol) y trifenilfosfina (100 mg, 381 pmol) se lavó abundantemente con nitrógeno. La reacción se recogió en THF (4 ml) y se agitó durante 12 horas. La reacción se condensó y se purificó sobre sílice mediante una columna Biotage (Hexanos/EtOAc, 10 % -100 % ) para proporcionar 25 (94 mg, 81 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 2,09 min,m/z(ES+) encontrado 456,10.
Ejemplo 17:(2S,4R)-terc-butil 4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (27):
Se cargó un matraz secado a la llama con Tubulisina M (26, 10 mg, 14 |jmol) en DCM anhidro (0,7 ml) y t-butanol (0,7 ml). Se añadieron diisopropilcarbodiimida (3,2 j l , 21 jm ol) y DMAP (0,08 mg, 0,7 jm ol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. La reacción se condensó, se recogió en DMSO y se purificó mediante Hp Lc preparativa para producir 27 (3,5 mg, 32 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1):t=1,35 min,m/z(ES+) encontrado 784,56.
Ejemplo 18:(2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (28):
Se cargó un recipiente a presión con Boc-Val-Ala-PAB-Br (25, 3,5 mg, 7,7 jmol) y tubulisina M protegida (4,0 mg, 5,1 jmol) en butanona anhidra (0,765 ml). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (1,8 jl, 10 jmol) y la reacción se lavó abundantemente con nitrógeno. El recipiente se selló y se dejó agitar a 80 °C durante 12 horas. La reacción se condensó, se recogió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para producir 28 (3,5 mg, 58 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,51 min,m/z(ES+) encontrado 1159,58.
Ejemplo 19:(2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (29):
Un matraz que contenía Boc-Val-Ala-PAB-TubM-OtBu (28, 3,5 mg, 3 jmol) se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>O<2>(0,3 ml) y se agitó durante 4 horas. La reacción se condensó, se recogió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para producir 29 (1,9 mg, 63 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,05 min,m/z(ES+) encontrado 1003,60.
Ejemplo 20:(2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil)-1-metilpiperídin-1-io (30):
Se recogió MC-OSu (18, 0,6 mg, 2 jm ol) en dimetilformamida anhidra (0,2 ml) y se añadió a un matraz que contenía Val-Ala-PAB-TubM (29, 1,9 mg, 2 jmol). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (1,0 mg, 8 jm ol) y la reacción se agitó bajo nitrógeno durante 3 horas. La reacción se recogió en D<m>S<o>y se purificó mediante HPLC preparativa para producir el enlazador 30 de amina cuaternaria tubulisina (1,2 mg, 53 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,25 min,m/z(ES+) encontrado 1196,45.
Ejemplo 21:(2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((7S,10S,13S)-7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-10-isopropil-2,2,13-trimetil-4,8,11-trioxo-3-oxa-5,9,12-triazatetradecanamido)-bencil)-1-metilpiperidin-1-io (31):
Se recogió MDPR(Boc)-OSu (<6>, 1,3 mg, 3,5 jm ol) en dimetilformamida anhidra (0,3 ml) y se añadió a un matraz que contenía Val-Ala-PAB-TubM (29, 3,2 mg, 3,2 jmol). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (1,6 mg, 13 jmol) y la reacción se agitó bajo nitrógeno durante 3 horas. La reacción se recogió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para producir 31 (2,0 mg, 49 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,35 min,m/z(ES+) encontrado 1269,76.
Ejemplo 22:((2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil)-1-metilpipendin-1-io (32):
Un matraz que contenía MDPR(Boc)-Val-Ala-PAB-TubM (31, 2 mg, 1,6 jmol) se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>O<2>(1,6 ml) y se agitó durante 4 horas. La reacción se condensó, se recogió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para producir 32 (1,0 mg, 54 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,02 min,m/z(ES+) encontrado 1169,72.
Ejemplo 23:2-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(4-(4,5-dimetoxi-2-(quinolin-3-carboxamido)benzamido)fenetil)-6,7-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-2-io (34):
Se cargó un recipiente a presión con el intermedio de unidad de extensión-glucurónido bromado (2, 78 mg, 96 jmol) del Ejemplo 1 y Tariquidar (33, 62 mg, 96 jmol) en 2-butanona anhidra (2,9 ml). A continuación, el recipiente de reacción se purgó con nitrógeno y se selló. Después, la reacción se agitó y se calentó a 80 °C durante 4 horas, momento en el que la LC/MS reveló la conversión en un producto cuaternizado. El resultante se enfrió, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 34 (123 mg, 90 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 2,05 min,m/z(ES+) encontrado 1377,74. HPLC-M<s>analítica (sistema 2): tr= 11,23 min,m/z(ES+) encontrado 1377,47.
Ejemplo_____ 24:2-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(4-(4,5-dimetoxi-2-(quinolin-3-carboxamido)benzamido)fenetil)-6,7-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-2-io (35):
Se cargó un matraz con enlazador de amina cuaternaria 34 (123 mg, 83 jmol) disuelto en metanol (1,4 ml) y tetrahidrofurano (1,4 ml), luego se enfrió bajo nitrógeno a 0 °C en un baño de hielo. Se disolvió hidróxido de litio monohidrato (21 mg, 500 jmol) en agua (1,4 ml) y la solución se añadió gota a gota al matraz de reacción. Después, la reacción se agitó durante 2 horas a 0 °C, luego se añadió más hidróxido de litio (7 mg, 170 jmol) en 0,45 ml de agua a la reacción. A las 3 horas, la reacción se completó mediante LC, se inactivó con ácido acético glacial (28 jl) y se concentró mediante evaporación rotatoria. El material bruto se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar un conector 35 de amina cuaternaria completamente desprotegido (71 mg, 85 % ). UpLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,29 min,m/z(ES+) encontrado 1015,74.
Ejemplo 25:2-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(4-(4,5-dimetoxi-2)-(quinolina-3-carboxamido)benzamido)-fenetil)-6,7-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-2-io (36):
Se añadió una solución de MDPR(Boc)-OSu<6>(20 mg, 52 jmol) en dimetilformamida anhidra (0,9 ml) a un matraz que contenía glucurónido-Tariquidar 35 desprotegido (40 mg, 35 jmol). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (30 jl) y la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 3 horas, momento en el que la LC-MS reveló la conversión en producto. El producto de reacción crudo se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el producto acoplado, MDPR(Boc)-glucurónido-Tariquidar (30 mg, 67 % ). HPLC-M S analítica (sistema 2): tr= 9,99 min,m/z(ES+) encontrado 1281,45. Un matraz que contenía mDPR(Boc)-glucurónido-Tariquidar (28 mg, 20 jmol) se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (2 ml) y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, momento en el que la LC-M S indicó una desprotección completa. La reacción se diluyó en 2 ml de DMSO, se concentró mediante evaporación rotatoria y se purificó mediante HPLC preparativa para producir 36 (20 mg, cuant.). UPLC-MS analítica (sistema 1): (ES+) tr= 1,30 min,mlzencontrado 1181,64. HPLC-MS analítica (sistema 2): (ES+) tr= 8,95 min,mlzencontrado 1181,41.
Ejemplo 26:Procedimiento general para preparar intermedios de éter de tubuvalina
Eterificación: Se carga un matraz secado a la llama con el intermedio de tubuvalina protegida con Boc (J. Org. Chem., 2008, 73, 4362-4369) 41 en tetrahidrofurano anhidro (50 mM), al que se le añadió 18-corona-6 (2,0 equivalentes) y se enfrió a -78 °C. Se añade gota a gota hexametildisilazida de potasio (1,5 equivalentes) como una solución 1 M en tetrahidrofurano y luego se agita la reacción durante 1 hora a -78 °C bajo nitrógeno. Luego se añade yodoalcano (2-5 equivalentes) y la reacción se calienta lentamente a temperatura ambiente y seguida por UPLC/MS. Una vez que se consume el material de partida, la reacción se enfría en hielo y se desactiva con cloruro de amonio saturado y se diluye en diclorometano (10 volúmenes). La capa orgánica se lava con HCl 0,1 M y la fase acuosa resultante se extrae dos veces con diclorometano. A continuación, los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran hasta la sequedad. La purificación de los productos de éster etílico alquilado en O protegido con BOC en bruto (BOC-Tuv(O-éter)-OEt) se logra mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice o HPLC preparativa. Los compuestos 42, 43 y 44 (esquema 7) se prepararon para ejemplificar el procedimiento general.
2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etilo (42): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,62 min,m/z(ES+) calculado 401,21, encontrado 401,28.
2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-etoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etilo (43): Intermedio de tubuvalina 41 (170 mg, 440 jm ol) se O-etiló como se describió anteriormente con yodoetano (89 jl, 880 jmol) para proporcionar el compuesto del título después de la purificación en gel de sílice eluyendo las mezclas de metanol y diclorometano. UP<l>C-M S (sistema 2): tr= 1,66 min,m/z(ES+) calculado 415,23 (M+H)+, encontrado 415,29
2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-4-metil-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxilato de etilo (44): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,77 min, m/z (ES+) calculado 428,23 (M+H)+, encontrado 451,30 (M+Na)+. 1H RMN (1:1 mezcla de rotámeros, CDCh) 8 (ppm) 0,91 (m, 9H), 1,40 (t,J =7,0 Hz, 3H), 1,47 (dos s, debido a los rotámeros, 9H), 1,64 (m, 3H), 1,87 (m, 2H), 2,74 (m, 3H), 3,42 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,42 (q,J= 7,0 Hz, 2H), 4,50 (m, 1H)), 8,14 (dos s debido a los rotámeros, 1H).
Desprotección: La saponificación de los productos O-alquilados purificados (BOC-Tuv(O-éter-OEt) para proporcionar los correspondientes compuestos ácidos libres de éter tubuvalina (BOC-Tuv(O-éter)-OH) se lleva a cabo a 20 mM de concentración de reacción usando una mezcla de disolventes 1:1 :1 de mezcla de tetrahidrofurano:metanol:agua como se indica a continuación. Los intermedios de tubuvalina O-alquilados se disuelven en 1 volumen de cada tetrahidrofurano y metanol. Luego, la mezcla se enfría en un baño de hielo a 0 °C. Se disuelve hidróxido de litio monohidrato (2-3 equivalentes) en 1 volumen de agua destilada y se añade gota a gota al matraz de reacción, con agitación a 0 °C . A continuación, se deja calentar la reacción a temperatura ambiente y se controla mediante UPLC/MS. Una vez que el material de partida se convierte en ácido libre, la reacción se desactiva con ácido acético glacial (2-3 equivalentes) y se concentra por evaporación rotatoria. A continuación, los ácidos carboxílicos brutos se purifican mediante HPLC preparativa. Los compuestos 45, 46 y 47 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 42, 43 y 44, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etilo (45): UPLC-MS (sistema 1):t=1,47 min,m/z(ES+) calculado 373,18, encontrado 373,41. 1 H RMN (1:1 mezcla de rotámeros, CDCh) 8 (ppm) 0,87 (dd,J =6,7, 2,0 Hz, 3H), 0,96 (dd,J =6,7, 1,2 Hz, 3H), 1,49 (dos s debido a los rotámeros, 9H), 1,67 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 2,01 (m, 1H), 2,70 (m, 3H), 3,41 (s, 3H), 4,12 (m, 1H), 4,36 (primer rotámero, dd,J =10,5, 2,3 Hz, 0,5 H), 4,48 (segundo rotámero, d,J= 8,6 Hz, 0,5 H), 8,28 (dos s debido a los rotámeros, 1 H).
2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-etoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etilo (46): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,48 min, m/z (ES+) calculado 387,20 (M+H)+, encontrado 387,26. 1 H RMN (CDCh) 8 (ppm) 0,88 (dd,J= 6,7, 2,0 Hz, 3H), 0,96 (d,J= 6,6 Hz, 3H), 1,49 (dos s de rotámeros, 9H), 1,68 (m, 1H), 1,86 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 2,69 (m, 3H), 3,53 (m, 2H), 4,09 (m, 1H), 4,43 (primer rotámero, dd,J= 10,2, 2,7 Hz, 0,5 H), 4,54 (segundo rotámero, d,J =7,0 Hz, 0,5 H), 8,24 (dos s debido a los rotámeros, 1 H).
2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-4-metil-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxilato de etilo (47): UPLC-MS (sistema 2):t=1,58 min, m/z (ES+) calculado 401,21 (M+H)+, encontrado 401,28 (M+Na)+.
Ejemplo 27:Procedimiento general para la introducción del componente tubofenilalanina mediante acoplamiento de amida.
Acoplamiento de péptidos: Los ácidos libres de tubuvalina O-alquilada (BOC-Tuv(O-éter)-OH) del Ejemplo 26 se preactivan mediante disolución en dimetilformamida anhidra (25-50 mM) y adición de HATU (2,4 equivalentes) y DIPEA (5 equivalentes). A continuación, la mezcla de reacción se agita bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se añade el ácido activado al éster alílico de tubofenilalanina 40 (Org. Lett., 2007, 9, 1605-1607) y luego la reacción se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno, con el progreso controlado por UPLC/MS. Una vez completada la reacción, se añade luego ácido acético glacial (14 equivalentes) y el producto (BOC-Tuv(O-éter)-Tup-O-alilo) se purifica mediante HPLC preparativa. Los compuestos 48, 49 y 50 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 45, 46 y 47, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general. (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (48): U<p>L<c>-M<s>(sistema 1): tr= 1,96 min,m/z(ES+) calculado 602,33 (M+H)+, encontrado 602,26. (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-etoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (49): U PLC-<m>S (sistema 2): tr= 1,84 min,m/z(ES+) calculado 616,34 (M+H)+, encontrado 616,43. (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-4-metil-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (5o): UPLC-MS (sistema 2): tr= 2,00 min,m/z(ES+) calculado 630,36 (M+H)+, encontrado 630,45.
1H RMN (CDCla) 8 (ppm) 0,94 (m, 9H), 1,19 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 1,49 (s, 9H), 1,64 (m, 5H), 1,84 (m, 1H), 2,03 (m, 2H), 2,63 (m, 1H), 2,73 (m, 3H), 2,93 (m, 2H), 3,41 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 4,29 (m, 1H), 4,41 (m, 2H), 4,55 (m, 2H), 5,25 (m, 2H), 5,88 (m, 1H), 7,24 (m, 5H), 8,05 (dos s de rotámeros, 1H).
Desprotección: Los productos purificados de dipéptido de tubuvalina-tubofenilalanina O-alquilado (BOC-Tuv(O-éter)-Tup-O-alilo) se desprotegen para revelar el grupo funcional de amina secundaria de tubuvalina en condiciones ácidas con TFA al 10 % en diclorometano (25 mM). Específicamente, el material de partida se disuelve en diclorometano anhidro (9 volúmenes) y se agita bajo nitrógeno a 0 °C. A continuación, se añade gota a gota ácido trifluoroacético (1 volumen) a la solución agitada. La reacción se calienta lentamente a temperatura ambiente y se controla mediante UPLC/MS. Una vez completada, la reacción se concentra por evaporación rotatoria y se bombea en una línea de vacío durante la noche. Las aminas libres (NH(CH<3>)-Tuv(O-éter)-Tup-O-alilo) se llevan adelante sin purificación adicional. Los compuestos 51, 52 y 53 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 48, 49 y 50, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-1-metoxi-4-metil-3-(metilamino)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (51): UPLC-MS (sistema 1):t=1 ,17 min,m/z(ES+) calculado 524,26 (M+Na)+, encontrado 524,27.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-1-etoxi-4-metil-3-(metilamino)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (52): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1 ,11 min,m/z(ES+) calculado 516,29 (M+H)+, encontrado 516,37.
(2S,4R)-alil2-metil-4-(2-((1R,3R)-4-metil-3-(metilamino)-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxamido)-5-fenilpentanoato (53): UPLC-M s (sistema 2): tr= 1,16 min,m/z(ES+) calculado 530,31 (M+H)+, encontrado 530,40.
Se preparan dipéptidos análogos reemplazando la tubofenilalanina adecuadamente protegida del Compuesto 40 con otras entradas de ácido que contienen aminoácidos o amina, adecuadamente protegidas y como se indica para el Esquema 7, incluyendo
en donde R7B es un sustituyente unido a O, preferentemente -OH, el subíndice n es 0, 1 o 2, preferentemente 0 o 1; y además incluyendo NH<2>-C H<2>-C O<2>H, NH<2>-C H<2>CH<2>C O<2>H y NH<2>-C H<2>CH<2>CH<2>CO<2>H.
Ejemplo 28:Procedimiento general para el acoplamiento de amidas de dipéptidos de éster de alquilo de tubuvalinatubofenilalanina O-alquilados con L-isoleucina protegida con Fmoc.
Se disuelve FM O C-L- isoleucina (1,3-2 equivalentes) en dimetilformamida anhidra (50-200 mM) y se preactiva con HATU (1,5-2 equivalentes) y DIPEA (2 equivalentes); la mezcla se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, se añade el ácido activado a los dipéptidos NH<2>-Tuv(O-éter)-Tup-O-alilo preparados de acuerdo con el Ejemplo 27; la reacción se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se controla mediante UPLC/MS. Una vez que la reacción deja de progresar o se completa, se añade ácido acético glacial (13 equivalentes) y los productos de tripéptido FMOC-Ile-Tuv(O-éter)-TupO-alilo resultantes se purifican mediante HPLC preparativa. Los compuestos 54, 55 y 56 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 51, 52 y 53, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
(2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-1-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7-metil-3,6-dioxo-2,11-dioxa-4,7-diazadodecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (54): UPLC-M<s>(sistema 1): tr= 2,07 min,m/z(ES+) calculado 837,43 (M+H)+, encontrado 837,20
(2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-1-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7-metil-3,6-dioxo-2,11-dioxa-4,7-diazatridecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (55): UPLC-M<s>(sistema 2): tr= 1,95 min,m/z(ES+) calculado 851,44 (M+H)+, encontrado 851,54.
(2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-1-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7-metil-3,6-dioxo-2,11-dioxa-4,7-diazatetradecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (56): UPLC-MS (sistema 2): tr= 2,25 min,m/z(ES+) calculado 865,46 (M+H)+, encontrado 865,65.
Se preparan tripéptidos análogos de acuerdo con el procedimiento general de los Ejemplos 26-28 reemplazando la tubofenilalanina adecuadamente protegida del Compuesto 40 en el Ejemplo 26 con otras entradas de ácido que contienen aminoácidos o amina, adecuadamente protegidas y como se indica en el Esquema 7. Alternativamente o además de la sustitución de los tubufenilalanina adecuadamente protegido otros tripéptidos se obtienen mediante la sustitución de FMOC-L-isoleucina con otra adecuadamente protegido amino ácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba, tales como FMOC-L-leucina
Ejemplo 29:Procedimiento general para el acoplamiento de amida de tripéptidos de éster alílico de isoleucinatubuvalina(O-éter)-tubofenilalanina con ácidos que contienen amina terciaria para la introducción del componente N-terminal de tubulisina.
Desprotección: Los tripéptidos con FMOC (FMOC-Ile-Tuv(O-éter)-TupO-alilo) preparados de acuerdo con el Ejemplo 28 se desprotegen mediante la eliminación del grupo protector FMOC usando piperidina al 20 % en dimetilformamida (20 mM), con agitación bajo nitrógeno a temperatura ambiente. Una vez que se logra la desprotección completa, según se controla por UPLC/MS, la mezcla de reacción se concentra por evaporación rotatoria. A continuación, el producto bruto se purifica mediante HPLC preparativa para proporcionar los tripéptidos de amina libres (NH2-Ile-Tuv(O-éter)-TupO-alilo). Los compuestos 57, 58 y 59 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 54, 55 y 56, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (57): UPLC-M S (sistema 1): tr= 1,30 min,m/z(ES+) calculado 637,34 (M+Na)+, encontrado 637,57.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-1-etoxi-4-metilpentil)hiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (58): UPLC-MS (sistema2): tr= 1,18min,m/z(ES+) calculado 629,38 (M+H)+, encontrado 629,45.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-4-metil-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (59): UP<l>C-MS (sistema 2): tr= 1,29 min,m/z(ES+) calculado 643,39 (M+H)+, encontrado 643,55.
Acoplamiento de péptidos: Se disuelve ácido (R)-N-metil-pipecólico (D-Mep) 60 (1,5-2 equivalentes) en dimetilformamida anhidra (25-50 mM) y se preactiva con HATU (2 equivalentes) y DIPEA (4 equivalentes). equivalentes); la mezcla de reacción se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añade entonces el ácido activado a la NH<2>-Ile-Tuv(O-éter)-TupO-alil tripéptidos obtenidos a partir de la desprotección de Fmoc; la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se controló mediante UPLC/MS. Una vez completada la reacción, se añade luego ácido acético glacial (14 equivalentes) y los productos tetrapéptidos (D-Mep-Ile-Tuv(O-éter)-TupO-alilo) se purifican mediante HPLC preparativa. Los compuestos 61 , 62 y 63 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 57 , 58 y 59, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general. (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (61 ): UPLC-MS (sistema 1): tr= 1,29 min,m/z(ES+) calculado 762,42 (M+Na)+, encontrado 762,32.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-etoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (62): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,25 min,m/z(ES+) calculado 754,46 (M+H)+, encontrado 754,55.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metil-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (63): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,36 min,m/z(ES+) calculado 768,48 (M+H)+, encontrado 768,55.
Para obtener los correspondientes éteres de tubulisina como fármaco libre (D-Mep-Ile-Tuv(O-éter)-TupOH), los tetrapéptidos de éter de tubulisina protegidos con éster alílico se desprotegen para proporcionar éteres de tubulisina que tienen un resto ácido de tubofenilalanina libre mediante disolución en anhidro. diclorometano (20 mM) y tratamiento con tetraquis (trifenilfosfina) de paladio (0,1 equivalentes), trifenilfosfina (0,2 equivalentes) y pirrolidina anhidra (8 equivalentes), y la reacción se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Una vez que la UPLC/MS revela la conversión en el producto ácido libre, la reacción se apaga con ácido acético glacial (22 equivalentes), se diluye con acetonitrilo y dimetilformamida y luego se concentra por evaporación rotatoria. A continuación, el éter de tubulisina crudo se purifica mediante HPLC preparativa. Los compuestos 64, 65 y 66 (esquema 7) se prepararon a partir de los compuestos 61 , 62 y 63, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (64): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,05 min,m/z(ES+) calculado 700,41 (M+H)+, encontrado 700,50.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-etoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (65): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,09 min,m/z(ES+) calculado 714,43 (M+H)+, encontrado 714,51
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metil-1-propoxipentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (66): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,19 min,m/z(ES+) calculado 728,44 (M+H)+, encontrado 728,54.
Éteres de tubulisina adicionales, incluidos aquellos que tienen variación (es) en las entradas de aminoácidos o ácidos que contienen amina que reemplazan la entrada de tubofenilalanina (Compuesto 40) del Ejemplo 27 como se muestra en el mismo, y/o el aminoácido FMOC (FMOC-Ile) del Ejemplo 28 se preparan reemplazando D-Mep con otras entradas de ácido pipecólico N-alquilado o con un ácido azetidinil-2-carboxílico N-alquilado, N-alquilado-D-prolina o N,N-di-alquil aminoácido como N,N-dimetilglicina.
Ejemplo 30:Preparación del precursor de Lss (S)-perfluorofenil 3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1 -il)propanoato(68).
Un matraz cargado con mDPR(Boc)-OH (67) (Nature Biotech, 2014, 32, 1059-1062) 67 (500 mg, 1,76 mmol), a la que se añadió pentafluorofenol (324 mg, 1,76 mmol) una solución en DMF (8,8 ml) seguido de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (371 mg, 1,93 mmol)) como un sólido. La reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se inactivó con 50 ml de NH<4>Cl saturado en H<2>O y 50 ml de H<2>O. La capa acuosa se extrajo con DCM dos veces, los extractos orgánicos se lavan a continuación con salmuera, se secaron sobre NaSO<4>, y se condensaron a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (589 mg, 74 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2):t=1,51 min,m/z(ES+) calculado 473,07 (M+Na)+, encontrado 473,14.
El compuesto<6 8>, abreviado como mDPR(BOC)-OPFF es un precursor de Lss ilustrativa (es decir, un tipo de resto que contiene Lb') de fórmula M1-A'(BU)-COOH en forma activada para la preparación de compuestos fármacoenlazador, incluidos los de fórmula general M<1>-A-<i>(BU)-A<o>-W-Y-D+ y M<1>-A(<b>U)-Y(W) -D+ en donde M<1>es un resto maleimida, A' es un precursor de sub(unidad) de extensión, A<1>y Ao son subunidades de la unidad A de extensión, BU es una unidad básica, como un resto aminoalquilo, Y es una unidad espaciadora autodestructiva e -Y(W)- es un resto de glucurónido y comprende, por ejemplo, un residuo de ácido glucurónico como resto carbohidrato y un residuo de PAB como resto autodestructivo; y D+ es una tubulisina cuaternizado.
Ejemplo 31:Procedimiento general para preparar compuestos intermedios de fármaco-enlazador que incorporan un mecanismo de liberación de ácido glucurónico a partir de ásteres de tubulisina (O-éter)-alilo.
Los intermedios de compuestos de fármaco-enlazador ilustrativos de fórmula A'-Yy(W'w)-D+ donde los subíndices w' e y son cada uno 1, A' es precursor de unidad de extensión, D+ es una tubulisina unidad de fármaco (O-éter) cuaternizado y -Y(W')- es una unidad de glucurónido que se preparan a partir de ésteres de tubulisina (O-éter)-alilo del Ejemplo 29 de la siguiente manera. Los productos así obtenidos están representados por la fórmula general de FMOC-GlucQ-Tub(O-éter)-O-alilo.
Elaboración de la unidad enlazadora: Se carga un recipiente a presión con D-Mep-Ile-Tuv(O-éter)-Tup-O-alilo (1 equivalente) y el intermedio 2 de unidad de extensión-glucurónido bromado (1,5 equivalentes) del Ejemplo 1 en anhidro 2-butanona (50 mM). El recipiente de reacción se enjuaga con N<2>y se cierra herméticamente. Después, la reacción se agita y se calienta a 60 °C durante 18 horas. La mezcla resultante se enfría, se condensa para dar un residuo a presión reducida, luego se transporta en bruto o se recoge en DMSO mínimo para purificarla mediante HPLC preparativa para proporcionar los compuestos del título. Los compuestos 69, 70 y 71 (esquema 8) se prepararon a partir de los compuestos 61,<6 2>y 63, respectivamente, y el compuesto 2 para ejemplificar el procedimiento general.
(2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-5- (aliloxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-1-metoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (69): UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,61 min,m/z(ES+) calculado 1470,68 (M)+, encontrado 1471,68.
(2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-5-(aliloxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-1-etoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (70): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,49 min, m/z (ES+) calculado 1484,69 (M)+, encontrado 1484.84.
(2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-5- (aliloxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metil-1-propoxipentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (71): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,47 min, m/z (<e>S+) calculado 1498,71 (M)+, encontrado 1498.85.
Desprotección: Los productos FMOC-GlucQ-Tub(O-éter) -O-alilo se desprotegen globalmente en THF y MeOH enfriado a 0 °C . L iO H ^ O (6,0 equivalentes) a la que se añade H<2>O gota a gota (1:1:1 de THF:MeOH:H<2>O, 50 mM de concentración final) después de lo cual la reacción se deja calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El THF y el MeOH se eliminan a presión reducida y el precipitado resultante se resolubiliza usando DMSO mínimo y la mezcla se purifica mediante HPLC preparativa. Los productos desprotegidos globalmente se abrevian como H-GlucQ-Tub(O-éter)-OH. Los compuestos 72, 73 y 74 (esquema 8) se prepararon a partir de los compuestos 69, 70 y 71, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
(2R)-1-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-ilo)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-ilo)carbamoil)tiazol-2-il)-1-metoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (72): Se desprotegió Fmoc-GlucQ-Tub(oMe)-OAlil 69 (17 mg, 12 pmol) como anteriormente para proporcionar 72 (4,3 mg, 34 % ). UPLC-MS analítica (sistema 1):tr =1,08 min, m/z (ES+) calculado 1068,53 (M)+, encontrado 1068,66.
(2R)-1-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,SS,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-ilo)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-ilo)carbamoil)tiazol-2-il)-1-etoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (73): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,95 min, m/z (ES+) calculado 1082,55 (m )+, encontrado 1082,68.
(2R)-1-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-ilo) oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-ilo)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metil-1-propoxipentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (74): UPLC-MS analítica (sistema 2):tr=0,98 min, m/z (ES+) calculado 1096,56 (m )+, encontrado 1096,67.
Ejemplo 32:Procedimiento general para la preparación de compuestos Fármaco Enlazador mediante acoplamiento de amida de un precursor de la subunidad Lss- Extensión con un intermedio fármaco-enlazador compuesto por una unidad de glucurónido y una unidad de fármaco de tubulisina (O-éter) cuaternizado.
Los ejemplos de compuestos de fármaco-enlazador de la fórmula Lb'-Aa-Yy(W'w)-D+ en donde los subíndices a, y, y w' son cada uno 1 y en donde Lb'-A- tiene la fórmula de M<1>-A-i(BU)-Ao-, en donde M<1>-A-i(BU)- representa un precursor de un autoestabilizante (Lss), que es un tipo de resto que contiene Lb' en un Conjugado de fármaco y ligando, en donde A<1>es una subunidad de una unidad de extensión A con A<o>como la otra subunidad, D+ es una unidad de fármaco tubulisina (O-éter) cuaternizado y -Y(W')- es una unidad de glucurónido, son preparados a partir de compuestos H-GlucQ-Tub(O-éter)-OH de la siguiente manera y se abrevia como mDPR-GlucQ-Tub(O-éter)-OH en donde mDPR- es un resto M1'A<1>(BU)-Ao-.
Elaboración de la unidad enlazadora: Se carga un matraz con la amina H-GlucQ-Tub(O-éter)-OH del Ejemplo 31 a la que se añade mDPR(Boc)-OPFP (68, 1,2 equivalentes) del Ejemplo 30 como una solución en DMF (10 mM). N,N-diisopropiletilamina (4,0 equivalentes) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se inactivó con AcOH (4,0 equivalentes), luego se diluyó en<d>M<s>O (1 volumen) y se purificó mediante HPLC preparativa. Los compuestos 75 , 76 y 77 (esquema 8) se prepararon a partir de los compuestos 72 , 73 y 74, respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general.
(2R)-1-(3-(3-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo))propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-ilo)-1-metoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (75): UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,22 min, m/z (ES+) calculado 1334,62 (M)+, encontrado 1334,68
(2R)-1-(3-(3-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo))propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-ilo)-1-etoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (76): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,19 min,m/z(ES+) calculado 1348,64 (M)+, encontrado 1348,79.
(2R)-1-(3-(3-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo))propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-ilo)-4-metil-1-propoxipentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (77 ): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,24 min,m/z(ES+) calculado 1362,65 (M)+, encontrado 1362,78.
Desprotección: Los productos de la formación de enlaces amida se desprotegen para eliminar el grupo protector BOC de la siguiente manera. Se carga un matraz con mDPR(BOC)-GlucQ-Tub(O-éter)-OH y se enfría a 0 °C. Se agrega una solución al 10 % de TFA en DCM (50 mM) y la reacción se deja calentar a temperatura ambiente mientras se agita durante 1 hora. A continuación, la reacción se diluye con DMSO (1 volumen), se elimina el DCM a presión reducida y luego se purifica mediante HPLC preparativa. Los compuestos 78, 79 y 80 (esquema 8) se prepararon a partir de los compuestos 75 , 76 y 77 , respectivamente, para ejemplificar el procedimiento general. (2R)-1-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-((((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-1-metoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (78): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,09 min, m/z (ES+) calculado 1234,57 (M)+, encontrado 1234,65.
(2R)-1-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-((((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-1-etoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidin-1-io (79): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,95 min, m/z (ES+) calculado 1248,59 (M)+, encontrado 1248,72.
(2R)-1-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-((((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)hiazol-2-il)-4-metil-1-propoxipentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1 -metilpiperidin-1 -io (80): UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,03 min,m/z(ES+) calculado 1262,60 (M)+, encontrado 1262,73.
Ejemplo 33:Preparación de éster alílico de isoleudna-tubuvalina(OAc)-tubofenilalanina
Saponificación: Se cargó un matraz con BOC-Tuv(OAc)-Tup-OEt (90, 50 mg, 81 pmol) en THF (1,35 ml) y MeOH (1,35 ml) y se enfrió a 0 °C. LiOH • H<2>O (27 mg, 647 pmol) se solubilizó en H<2>O (1,35 ml) gota a gota a continuación añadido. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (37 pl, 647 pmol) y se condensó a presión reducida. El residuo se recogió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((tercbutoxicarbonil)(metil)amino)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (91) (44 mg, cuant.) (Esquema<9>). UP<l>C-M S analítica (sistema 2): tr= 1,53 min,m/z(ES+) calculado 548,28 (M+H)+, encontrado 548,24.
La acetilación y desprotección del éster de alilo: El BOC-Tuv(OH)-Tup-OH (91, 44 mg, 81 pmol) del producto se solubilizó en piridina anhidra (1,6 ml) y se agitó a temperatura ambiente bajo N<2>. Se añadió gota a gota anhídrido acético (15,4 pl, 162 pmol). Se añadió 1,0 equivalente adicional de anhídrido acético después de una hora de agitación y la reacción se completó por LCMS después de 2 horas. La reacción se concentró a sequedad a presión reducida y luego se resolubilizó en alcohol alílico anhidro (1,6 ml). Se añadió pirocarbonato de dialilo (54 pl, 325 pmol) seguido de DMAP sólido (3,0 mg, 24 pmol). Se dejó agitar la reacción a temperatura ambiente y se controló mediante LCMS, se añadió pirocarbonato de dialilo adicional según fuera necesario para impulsar la reacción hasta su finalización (4,0 equivalentes adicionales). A continuación, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (92) (Esquema 9) (33 mg, 65 % ). Up LC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,75 min,m/z(ES+) calculado 630,32 (M+H)+, encontrado 630,42.
Desprotección de dipéptido: Un matraz cargado con BOC-Tuv(OAc)-Tup-O-alilo se enfrió a 0 °C bajo N<2>(92, 33 mg, 21 pmol). Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,52 ml) y se agitó durante 4 horas. La reacción se concentró a presión reducida, se resolubilizó en DCM y se condensó 3 veces para eliminar el TFA para proporcionar (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-4-metil-3-(metilamino)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato en bruto (93). U<p>L<c>-MS analítica (sistema 2): tr= 1,03 min,m/z(ES+) calculado 530,27 (M+H)+, encontrado 530,36. El compuesto 93 (esquema 9) se llevó adelante sin purificación adicional.
Acoplamiento de péptidos: A un matraz cargado con H-Tuv(OAc)-Tup-O-Alil (93, 28 mg, 53 pmol) se añadió BO C-L-Ile-OH (15 mg, 63 pmol) y HATU (40 mg, 106 pmol) como sólidos seguidos de DMF (1,0 ml). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (37 pl, 211 pmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar (2S,4R)-alil 4-(2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,2,8-trimetil-4,7,13-trioxo-3,12-dioxa-5,8-diazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (94) (Esquema 9) (19 mg, 49 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,72 min,m/z(ES+) calculado 743,41 (M+H)+, encontrado 743,51.
Desprotección de tripéptido: Un matraz cargado con B0C-Ile-Tuv(OAc)-Tup-Oalilo (94, 19 mg, 26 pmol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,52 ml) y se agitó durante 4 horas. La reacción se concentró a presión reducida, se resolubilizó en DCM y se condensó 3 veces para eliminar el TFA para proporcionar (2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato crudo (95). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,18 min,m/z(ES+) calculado 643,36 (M+H)+, encontrado 643,42. El compuesto 95 (esquema 9), abreviado como Ile-Tuv(OAc)-Tup-O-alil (éster alílico de isoleucina-tubuvalina(OAc)-tubofenilalanina), se llevó adelante sin purificación adicional.
Ejemplo 34.Preparación de un heterocicloalquilo de nitrógeno cuaternizado correspondiente al resto N-terminal del fármaco de tubulisina libre.
Precursor N-terminal (D-Mep): Se recogió H-Pip-OtBu (96, 500 mg, 2,70 mmol) en MeOH (4,50 ml), AcOH (4,50 ml) y CH<2>O al 37 % en H<2>O (4,50 ml) y se agitó durante 20 minutos. Se añadió lentamente NaBHaCN (509 mg, 8,10 mmol) como un sólido hasta un burbujeo vigoroso, se agitó durante 30 minutos. Después, la reacción se vertió en 200 ml de una solución saturada de NaHCO<3>y se extrajo 3 veces con 200 ml de DCM. Las capas orgánicas se lavaron con salmuera, se secó sobre Na<2>SO<4>, y se condensaron a presión reducida para proporcionar (R)-terc-butilo 1-metilpiperidina-2-carboxilato de metilo (97) (516 mg, 96 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr = 0,53 min, m/z (ES+) calculado 200,17 (M+H)+, encontrado 200,21. El Compuesto 97 (Esquema 10), denominado BOC-D-Mep-OtBu, se llevó adelante sin purificación adicional para la condensación con el intermedio 2 de unidad de extensiónglucurónido bromado del Ejemplo 1 de la siguiente manera.
Cuaternización: Se cargó un recipiente a presión con producto intermedio de unidad de extensión-glucurónido bromado (<2>, 104 mg, 128 pmol) y D-Mep-OtBu (97, 34 mg, 171 pmol) en 2-butanona anhidra (1,71 ml). El recipiente de reacción se lavó abundantemente con N<2>y se selló. Después, la reacción se agitó y se calentó a 60 °C durante 12 horas. La mezcla resultante se enfrió, se condensó a presión reducida, se recogió en DMSO mínimo y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar (2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilo)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(terc-butoxicarbonil)-1metilpiperidin-1-io (98) (97 mg, 82 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,32 min, m/z (ES+) calculado 930,40 (M)+, encontrado 930,49. A continuación, se eliminaron los grupos protectores del resto carbohidrato seguido de reprotección como el éster alílico para proporcionar el Compuesto 99 (Esquema 10) de la siguiente manera.
Desprotección de glicósidos: A un matraz secado a la llama cargado con el Compuesto 98 (97 mg, 104 jmol) que tiene grupos protectores de acetato y éster metílico en alcohol alílico anhidro (2,09 ml) bajo N<2>, se le añadió Ti(O C<2>H<5>)<4>(87 |j L, 417 jmol) y la mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C con agitación durante 2 horas. Después, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en 50 ml de HCl 1M. Después de descansar durante 45 minutos, el HCl se extrajo 3 veces con 50 ml de DCM. Los orgánicos resultantes se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na<2>SO<4>, se condensaron y se purificaron por HPLC preparativa para proporcionar (2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilo)amino)-propanamido)-4-(((2s,3R,4S,5S,6S)-6-((aliloxi)carbonil)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(terc-butoxicarbonil)-1 -metilpiperidin-1-io (99) (42 mg, 48 % ). UPLC-MS analítica (sistema 2):t=1,18 min,m/z(<e>S+) calculado 830,39 (M)+, encontrado 830,49.
Ejemplo 35.Preparación de un compuesto intermedio fármaco-enlazador mediante acoplamiento de amida de un intermedio tripéptido de tubulisina que tiene un resto tubuvalina-(O-acilo) a un heterocicloalquilo de nitrógeno cuaternizado correspondiente al del fármaco de tubulisina libre.El Compuesto 99 (Esquema 10), abreviado como FMOC-Gluc(O-Alil)Q-D-Mep-OtBu, del Ejemplo 34 se desprotegió mediante la eliminación del grupo protector t-butil éster para proporcionar el Compuesto 100, que luego se acopló a la isoleucina-tubuvalina(OAc)-éster alílico de tubofenilalanina (Compuesto 95) del Ejemplo 33 mediante formación de enlaces peptídicos mediante los siguientes métodos.
Desprotección de N-terminal (D-Mep): un matraz que contenía FMOC-Gluc(O-alilo)Q-D-Mep-OtBu (99, 42 mg, 50 jm ol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 30 % en C H<2>Ch (2,5 ml) y se agitó durante 18 horas. La reacción se concentró a presión reducida, se recogió en DMSO mínimo y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 25 mg (64 % ) de (2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-((aliloxi)carbonil)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-ilo)oxi)bencil)-2-carboxi-1 -metilpiperidin-1-io (100). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,05 min,m/z(ES+) calculado 774,32 (M)+, encontrado 774,42.
Acoplamiento de péptidos: el Compuesto 100 (Esquema 10), abreviado como FMOC-Gluc(O-Alol)Q-D-Mep-OH, se condensó con tripéptido 95 mediante la adición del Compuesto 100 (28 mg, 36 jmol) y HATU (27 mg, 72 jmol) como sólidos a un matraz cargado con H-Ile-Tuv(OAc)-Tup-O-Alil (95, 23 mg, 36 jmol) seguido de DMF (0,714 ml). Luego se añadió N,N-diisopropiletilamina (25 jl, 143 jmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, la reacción se recogió en DMSO y se purificó mediante LC preparativa para proporcionar 23 mg (46 % ) de (2R)-1-(3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-((aliloxi)carbonil)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-5-(aliloxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-metilpiperidina-1-io (101). UPLC-M<s>analítica (sistema 2): tr= 1,39 min,m/z(ES+) calculado 1398,66 (M)+, encontrado 1398,81.
Desprotección de glicósidos y Tup: el FMOC y los grupos protectores de alilo del producto FMOC-Gluc(O-Alil)Q-Mep-Ile-Tuv(OAc)-Tup-O-Alil (es decir, Compuesto 101), también abreviado como Fmoc-Gluc(O-Alil)Q-TubM-OAlil, mientras que retenía el acetato de tubuvalina, se logró de la siguiente manera. FMOC-Gluc(O-alilo)Q-TubM-Oalilo (101, 21 mg, 15 jm ol) se recogió en DCM (1,5 ml) en agitación en atmósfera de N<2>. Se añadieron Pd(PPh<3>)<4>(3,5 mg, 3,1 jm ol) y PPh<3>(1,6 mg, 6,1 jm ol) como sólidos seguido de pirrolidina (20,1 jL , 245 jmol). La reacción se agitó a 2 horas a temperatura ambiente, luego se recogió en 1 ml de DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó por LC preparativa para proporcionar 13 mg (79 % ) de (2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (102). U<p>LC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,94 min,m/z(ES+) calculado 1096,53 (M)+, encontrado 1096,65.
El compuesto 102, abreviado como H-GlucQ-TubM-OH, es un compuesto intermedio de fármaco-enlazador ilustrativo de la fórmula A'-Yy(W'w)-D+ en donde los subíndices y, y w' son cada uno 1 y en donde A' es un precursor de (sub)unidad de extensión, -Y(W)- es una unidad de glucurónido, que se compone de una unidad espaciadora PAB capaz de autodestruirse para liberar el fármaco de tubulisina (D) y un resto de ácido glucurónico, y D+ es tubulisina M cuaternizada. Para preparar compuestos intermedios de compuestos fármaco enlazador análogos que tengan tubulisina cuaternizada alternativa que contenga entradas de componentes de tubuvalina (O-acilo) en donde el resto acetato de BOC-Tuv(O-Ac)-Tup (OEt) (90) es reemplazado con un compuesto de fórmula general BOC-Tuv(O-Acil)-Tup(OEt) en el Ejemplo 33 para preparar H-Ile-Tuv(O-Acil)-Tup-O-alilo, correspondiente al Compuesto 95. Ese intermedio se lleva adelante de acuerdo con los Ejemplos 34 y 35 para proporcionar compuestos de fórmula general H-GlucQ-D-Mep-Ile-Tuv(O-Acil)-Tup-OH, abreviado además como H-GlucQ-Tub(O-Acil)-OH, que corresponde al compuesto intermedio de fármaco-enlazador del Compuesto 102.
Otras variaciones son, o incluyen además, reemplazar el heterocicloalquilo que contiene amina terciaria de 6 miembros adecuadamente protegido, BOC-D-Mep-OtBu (Compuesto 97), del Esquema 10 con otra amina terciaria de 5 o 6 miembros adecuadamente protegida que contiene heterociclo tal como éster t-butílico del ácido BOC-N-etilpipecólico, éster t-butílico de BOC-N-metil-prolina o éster t-butílico del ácido BOC-N-metil-azetidinil-2-carboxílico para proporcionar compuestos análogos al Compuesto 99 y Compuesto<1 0 2>, respectivamente, del Esquema 10 en el que el resto D-Mep cuaternizado de FMOC-Gluc(O-Alil)Q-D-Mep-OtBu y H-GlucQ-D-Mep-Ile-Tuv(O-Ac)-Tup OH, o más generalmente de H-GlucQ-D-Mep-Ile-Tuv(O-Acil)-Tup-OH, se reemplaza por otro heterocicloalquilo que contiene amina terciaria cuaternizada. También se obtienen variaciones adicionales de compuestos intermedios de fármaco-enlazador en los que el heterocicloalquilo se reemplaza con una amina terciaria que contiene ácido carboxílico mediante el Esquema 10 para proporcionar variantes de anillo abierto N-terminal de compuestos de enlace de fármaco de tubulisinas cuaternizados.
Ejemplo 36:Preparación de compuestos fármaco enlazador mediante acoplamiento de amida de un precursor de la subunidad Ls s -extensión con un intermedio fármaco enlazador compuesto por una unidad de glucurónido y una unidad de fármaco tubulisina (O-acilo) cuaternizado.
Acoplamiento de precursor de Lss (mDPR): Se cargó un matraz con H-GlucQ-TubM-OH (102, 13,1 mg, 11,9 pmol) del Ejemplo 35 en DMF anhidra (0,595 ml) al que mDPR(BOC)-OSu (<6>, 4,6 mg, 11,9 pmol) se añadió bajo N<2>. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (8,3 pl, 47,8 pmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (8,3 pl) y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 5,2 mg (33 % ) de (2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(3-(3-((S)-3-((tercbutoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (103). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,20 min,m/z(ES+) calculado 1362,62 (M)+, encontrado 1362,75.
Desprotección del precursor de L<ss>: el grupo protector BOC en mDPR(BOC)-GlucQ-TubM-OH (103) se elimina como sigue para preparar compuestos de fármaco-enlazador adecuados para preparar conjugados ligando-fármaco mediante la condensación con un resto de direccionamiento que contiene tiol.
Un matraz cargado con MDPR(Boc)-GlucQ-TubM-OH (103, 5,2 mg, 3,8 mol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,84 ml) y se agitó durante 4 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 4,8 mg (81 % ) de 2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1 -metilpiperidin-1-io (104). Up LC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,95 min,m/z(ES+) calculado 1262,56 (M)+, encontrado 1262,68.
También se preparan mediante el Ejemplo 36 compuestos de enlace de fármaco que tienen variaciones en el residuo N-terminal de tubulisina cuaternizado en el que el resto D-Mep cuaternizado en tubulisina M se reemplaza con otro heterocicloalquilo cuaternizado de 6 miembros que contiene amina terciaria. Además, se preparan mediante el Ejemplo 36 otros compuestos de enlace de fármaco obtenidos a partir de heterocicloalquilos que contienen amina terciaria de 4 o 5 miembros sustituidos con ácido carboxílico. Otras variaciones reemplazan el heterocicloalquilo cuaternizado de 6 miembros de D-Mep con versiones acíclicas mediante el uso en el Ejemplo 33 de ácidos que contienen amina terciaria adecuadamente protegidos para proporcionar una versión N-terminal de anillo abierto de compuestos de enlace farmacológico de tubulisina cuaternizado. Otras variaciones más reemplazan el resto acetato del componente tubuvalina como se describe en el Ejemplo 33-35 para compuestos intermedios de fármacoenlazador con otro grupo aciloxi para proporcionar compuestos análogos de fármaco-enlazador. Las variaciones adicionales incorporan ambos cambios, es decir, variaciones en el resto N-terminal y el resto aciloxi de tubuvalina.
Los compuestos preparados por el ejemplo 36 son ejemplos de compuestos de fármaco-enlazador de fórmula M1-A-i(BU)-Ao-Y(W)-D+ o Lb'-Ao-Y(W)-D+ en donde Lb' está compuesto por un resto maleimida (M1), una unidad básica (BU) y una subunidad (A<1>) de la unidad de extensión y Ao es otra subunidad de la unidad de extensión, en donde Lb' es un precursor de Lss en un conjugado de ligando fármaco preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador.
Ejemplo 37:Procedimiento general para preparar compuestos intermedios de fármaco-enlazador que incorporan un mecanismo de liberación de péptidos que tiene una unidad de fármaco de tubulisina(O-acilo) cuaternizado.
Los intermedios de compuestos de fármaco-enlazador ilustrativos de la fórmula A'-Ww-Yy-D+ se preparan como sigue en donde los subíndices w e y son cada uno y en donde A' es el precursor de la unidad de extensión, D+ es una unidad de fármaco de tubulisina cuaternizada y -W -Y- es una unidad de escisión peptídica (W) unida covalentemente a una unidad espaciadora autodestructiva (Y) en donde W proporciona un sitio de reconocimiento de proteasa, cuya acción libera el fármaco de tubulisina libre de un conjugado de fármaco y ligando (LDC), en donde el LDC está compuesto por ese A'-Ww-Yy-D+ como el resto -Lo-D+. En general, un intermedio péptido-unidad espaciadora adecuadamente protegido de fórmula BOC-W<2>-W<1>-PAB-Br, en donde W<1>y W<2>son subunidades de aminoácidos de W y PAB es el intermedio de unidad espadadora Y autodestructiva, es primero preparado por acoplamiento de enlace peptídico de W<2>protegido con b Oc a H-W<1>-PAB-OH seguido de bromación del carbono bencílico para proporcionar el intermedio péptido-unidad espaciadora BOC-W<2>-W-i-PAB-Br. Una tubulisina, adecuadamente protegida en el componente C-terminal, como por ejemplo como el éster alílico, se condensa luego con el intermedio péptido-espaciador para la cuaternización de su componente que contiene amina terciaria para proporcionar después de la desprotección global un compuesto intermedio de fármaco enlazador. de fórmula H-W -Y-D+ (es decir, H-W<2>-W<1>-PAB-D+). El producto de esa secuencia de reacción se ejemplifica mediante la siguiente preparación de H-Val-Glu-pAB4-TubM-OH (Esquema 11), en donde el residuo de dipéptido -Val-Glu- corresponde a -W<2>-W<1>.
Acoplamiento de péptidos de unidad espaciadora: un matraz cargado con FMOC-Glu(OtBu)-OH (105, 2,0 g, 4,7 mmol), H-PAB-o H (23, 579 mg, 4,7 mmol) y C h C H (25 ml) se agitó a temperatura ambiente. Se añadió EEDQ (1,40 g, 5,6 mmol) como un sólido y la mezcla se agitó durante la noche. El producto se eluyó de una placa de cromatotrón de 4 mm con EtOAc, se condensaron las fracciones que contenían el producto. El residuo resultante se recogió en piperidina al 20 % en DCM, se agitó durante 15 minutos y luego se condensó hasta un aceite. El aceite se disolvió en DCM y se eluyó de una placa de cromatotrón de 2 mm usando MeOH al 10 % -20 % en gradiente de DCM para proporcionar 860 mg (60 % ) de (S)-terc-butil 4-amino-5-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-5-oxopentanoato (106). UPLC-MS analítica (sistema 2):t=0,65 min,m/z(ES+) calculado 309,18 (M+H)+, encontrado 309,24.
Acoplamiento de péptidos unitarios escindibles: A un matraz cargado con H-Glu(OtBu)-PAB-OH (106, 860 mg, 2,78 mmol) en DMF (10 ml) se añadió BOC-Val-OSu (20) (1,13 g, 3,60 mmol) y DIPEA (0,75 ml). Después de 30 minutos la mezcla de reacción se vertió en 100 ml de EtOAc y se lavó con H<2>O 3x, 1x salmuera, y se secó sobre Na<2>SO<4>. La solución se secó a presión reducida, se solubilizó en 50 ml de EtOAc y se precipitó con EtOAc al 10 % en hexanos (50 ml). Los sólidos se recogieron y secaron para proporcionar 0,97 g (70 % ) de (S)-terc-butil 4-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-((4-(hidroximetil) fenil)amino)-5-oxopentanoato (107). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,37 min,m/z(ES+) calculado 508,30 (M+H)+, encontrado 508,38.
Funcionalización de la unidad espaciadora: un matraz cargado con BOC-Val-Glu(OtBu)-PAB-OH (107, 200 mg, 394 |jmol), N-bromosuccinimida (105 mg, 591 jm ol) y trifenilfosfina (155 mg, 591 jmol) se lavó con N<2>. La reacción se recogió en THF (4 ml) y se agitó durante 12 horas. La reacción se condensó y se purificó sobre sílice mediante una columna Biotage (Hexanos/EtOAc, 10 % -100 % ) para proporcionar 210 mg (93 % ) de (S)-terc-butil 5-((4-(bromometil)fenil)amino)-4-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-oxopentanoato (108). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,56 min,m/z(ES+) calculado 570,22 (M+H)+, encontrado 570,30.
Cuaternización: un matraz cargado con BOC-Val-Glu(OtBu)-PAB-Br (108, 40 mg, 70 jmol) y TubM-OAlil (Org. Lett., 2007, 9, 1605-1607) (109, 45 mg, 59 jmol) se lavó abundantemente con N<2>. Se añadió butanona (1,17 ml) y la reacción se calentó a 60 °C mientras se agitaba. Después de 18 horas, la reacción se condensó a sequedad, se recogió en DCM mínimo y se purificó mediante Biotage (0-20 % DCM/MeOH) para proporcionar 62 mg (85 % ) de (2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-5-(aliloxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-ilo)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-5-(terc-butoxi)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-oxopentanamido)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (110). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,47 min,m/z(ES+) calculado 1257,72 (M)+, encontrado 1257,85.
Desprotección: Un matraz cargado con BOC-Val-Glu(OtBu)-PABQ-TubM-Oalilo (110, 42 mg, 50 jmol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 30 % en CH<2>Ch (0,99 ml) y se agitó durante 18 horas. La reacción se concentró a presión reducida, se recogió en DCM y se volvió a condensar 3 veces. A continuación, el residuo se recogió en d C m (0,98 ml) al que se añadieron Pd(PPh<3 )4>(5,7 mg, 4,9 jmol) y PPh<3>(2,6 mg, 9,8 jmol) como sólidos seguido de pirrolidina (32 jL , 392 jmol). Después de 1 hora, la reacción se recogió en DMSO mínimo, se condensó y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 47 mg (90 % ) de (2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R))-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metilo)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-4-carboxibutanamido)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (111). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,95 min,m/z(ES+) calculado 1061,57 (M)+, encontrado 1061,69.
Otros compuestos intermedios de fármaco-enlazador análogos al compuesto 111 se preparan reemplazando las entradas de FMOC-Glu(Ot-Bu)-OH (105) y BOC-Val-OSu (20) para W2 y W1 respectivamente con otras entradas de aminoácidos apropiadas, que los compuestos intermedios de fármaco-enlazador preparados de fórmula H-W<2>-W<1>-PAB-D+ tienen la estructura de
en donde R34 es bencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, -CH(OH)CH<3>o tiene la estructura de
y R<35>es metilo, -(CH<2>)<4>-NH<2>, -(CH<2>)<3>NH(C=O)NH<2>, (CH<2>)<3>NH(C=NH)NH<2>, o -(CH<2>)<2>CO<2>H, en donde la línea ondulada en el dipéptido N-terminal indica unión covalente a A o Lb o Lb' y la línea ondulada en el dipéptido C-terminal indica unión covalente a J de un resto SI.
Ejemplo 38:Procedimiento general para preparar compuestos de fármaco-enlazador mediante la introducción de un resto precursor de Lss en compuestos intermedios de fármaco-enlazador que incorporan un mecanismo de liberación de péptidos que tiene una unidad de fármaco de tubulisina(O-acilo) cuaternizado.
Los compuestos de fármaco enlazador de la fórmula Lb'-Y-W-D+ en donde Lb'- es M<1>-A(BU)- y -Y-W-D+ corresponde a intermedios de compuesto fármaco-enlazador del Ejemplo 37, se ilustran por el Esquema 12. La ejemplificación se proporciona de la siguiente manera para la síntesis del compuesto fármaco-enlazador mDPR-Val-Glu-pABQ-TubM-OH (113) cuya fórmula generalizada es M<1>-A(BU)-W<2>-W<1>-PABQ-TubM-OH.
Acoplamiento de Lss(mDPR): se cargó un matraz con H-ValGluPAB4-TubM (111, 22,5 mg, 21,2 ^mol) en DMF anhidro (0,420 ml), al que se añadió mDPR(Boc)-OSu (6, 8,9 mg, 23,3 ^mol)) como un sólido bajo N<2>. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (14,8 ^l, 84,7 ^mol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (14,8 ^l) y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 11,5 mg (40 %) de (2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1 -oxopentan-2-il)carbamoil)-1 -(4-((7S, 10S, 13S)-13-(2-carboxietil)-7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-10-isopropil-2,2-dimetil-4,8,11-trioxo-3-oxa-5,9,12-triazatetradecanamido)bencil)-1 -metilpiperidin-1-io (112) (11,5 mg, 40 %). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,31 min, m/z (ES+) calculado 1327,66 (M)+, encontrado 1327,94.
Desprotección: Un matraz cargado con MDPR(Boc)-ValGluPAB4-TubM (112, 11,5 mg, 8,6 mol) se enfrió a 0 °C bajo N<2>. Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,86 ml) y se agitó durante 2 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 9,9 mg (93 %) de (2R)-2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metilo)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)-4-carboxibutanamido)bencil)-1-metilpiperidin-1-io (113). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,99 min,m/z(eS+) calculado 1227,61 (M)+, encontrado 1227,83.
Ejemplo 39:Preparación de compuestos intermedios de tubulisina que tienen restos aciloxi alternativos en sustitución de acetato en el componente de tubuvalina.
La preparación de los compuestos del título procede del compuesto desacetil tubuvalina protegido con BOC a través del acoplamiento de péptidos a tubofenilalanina como su éster alílico. El resto acilo se reintroduce luego usando el anhídrido de ácido apropiado (Método 1), como se ejemplifica para propioniloxi y butiriloxi, o cloruro de ácido (Método 2) como se ejemplifica para cloruro de ácido isobutírico para reemplazar el resto de acetato de tubuvalina (es decir, isobutiriloxi reemplaza acetoxi). Alternativamente, el hidroxilo de tubuvalina se esterifica mediante la activación con DCC de un ácido carboxílico alifático (Método 3), como se ejemplifica para la sustitución de dimetilbutiriloxi e isovalerilo del resto acetato de tubuvalina. Los compuestos obtenidos tienen la fórmula general BOC-Tuv(O-acil)-Tup-O-alil como se muestra en el Esquema 13. El grupo protector BOC se elimina para permitir el acoplamiento de péptidos para introducir el componente N-terminal para proporcionar los análogos de tubulisina M.
Hidrolisis de Tuv: Se cargó un matraz con acetato de tubuvalina (Org. Lett., 2007, 9, 1605-1607) 122 (225 mg, 560 ^mol) disuelto en metanol (5 ml) y tetrahidrofurano (5 ml), luego se enfrió bajo nitrógeno a 0 °C en un baño de hielo. Se disolvió hidróxido de litio monohidrato (71 mg, 1680 ^mol) en agua (5 ml) y la solución se añadió gota a gota al matraz de reacción. Después, la reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que UPLC/MS reveló una conversión completa en producto. A continuación, el material se diluyó con diclorometano y se lavó con HCl 0,1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano, luego los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para proporcionar 200 mg (cuant.) Del compuesto ácido libre 2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxílico ácido (123) UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,33 min,m/z(ES+) calculado 359,17 (M+H)+, encontrado 359,14.
Acoplamiento de péptidos: Se preactivó el compuesto ácido libre de tubuvalina 123 (200 mg, 560 pmol) mediante disolución en dimetilformamida anhidra (5,4 ml, 100 mM) y adición de HATU (250 mg, 670 pmol) y DlPEA (0,59 ml, 3,36 mmol); luego, la mezcla se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se añadió el ácido activado al éster alílico de tubofenilalanina 40 (Org. Lett., 2007, 9, 1605-1607) y la reacción se agitó luego a temperatura ambiente bajo nitrógeno, con el progreso controlado por UPLC/MS. Una vez completada la reacción, se añadió ácido acético glacial (14 equivalentes) y el producto se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 272 mg (83 %) del dipéptido Tuv(OH)-Tup-Oalil (2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-3-((tercbutoxicarbonil)(metil)amino)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (124). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,84 min,m/z(ES+) calculado 588,31 (M+H)+, encontrado 588,29.
Reacilación (Método 1): Se disolvió dipéptido Tuv(OH)-Tup-Oalil 124 (26 mg, 44 pmol) en piridina anhidra (1,8 ml, 25 mM) y se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota anhídrido propiónico 125 (113 pl, 20 equivalentes) y luego se controló la reacción mediante UPLC/MS. Se añadió anhídrido propiónico adicional (20 equivalentes) para lograr la conversión en producto. El material se diluyó con diclorometano y se lavó con HCl 0,1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano, luego los orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para proporcionar el producto crudo, que posteriormente se purificó por HPLC preparativa para proporcionar 17 mg (61 %) de producto BOC-Tuv(propioniloxi)-Tup-O-alilo (2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-4-metil-1-(propioniloxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (127). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 1,99 min,m/z(ES+) calculado 644,34 (M+H)+, encontrado 644,26.
Se disolvió Tuv(OH)-Tup-Oalil dipéptido 124 (27 mg, 46 pmol) en piridina anhidra (0,9 ml, 50 mM) y se agitó en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota anhídrido butírico 126 (225 pl, 30 equivalentes) y luego se controló la reacción mediante UPLC/MS. Se añadió anhídrido butírico adicional (40 equivalentes) en tres porciones para lograr la conversión en producto. El material se diluyó con diclorometano y se lavó con HCl 0,1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano, luego los orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para proporcionar el producto crudo, que posteriormente se purificó por HPLC preparativa para proporcionar 24 mg (80 %) de producto BOC-Tuv (butiriloxi)-Tup-O-alilo (2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-(butiriloxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (128). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 2,13 min,m/z(ES+) calculado 658,35 (M+H)+, encontrado 658,23.
Reacilación (Método 2): Se disolvió dipéptido Tuv(OH)-Tup-Oalil 124 (26 mg, 44 pmol) en piridina anhidra (1,8 ml, 25 mM) y se agitó en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota cloruro de isobutirilo 129 (93 pl, 20 equivalentes) y luego se controló la reacción mediante UPLC/MS. Tras la conversión en producto, el material se diluyó luego con diclorometano y se lavó con HCl 0,1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano, luego los orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para proporcionar el producto crudo, que posteriormente se purificó por HPLC preparativa para proporcionar 29 mg (cuant.) de producto BOC-Tuv(Isobutiriloxi)-Tup-O-alilo (2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-3-((tercbutoxicarbonil)(metil)amino)-1-(isobutiriloxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (130). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr= 2,13 min,m/z(Es ) calculado 658,35 (M+H)+, encontrado 658,33.
Reacilación (Método 3): Se cargó un matraz con ácido isovalérico 131 (94 pl, 851 pmol) disuelto en diclorometano anhidro (5,6 ml, 15 mM) y la solución se agitó a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. Luego se añadió DMAP (10 mg, 85 pmol), seguido de DCC (88 mg, 425 pmol) y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 horas. El ácido activado resultante se añadió luego al dipéptido 124 de Tuv (OH)-Tup-Oalil (50 mg, 85 pmol) y la reacción se agitó durante la noche, momento en el que la UPLC/MS reveló la conversión en producto. Después, la reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con HCl 0,1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano, luego los orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para proporcionar el producto crudo, que posteriormente se purificó por HPLC preparativa para proporcionar 52 mg (91 %) de producto BOC-Tuv (isovaliriloxi)-Tup-Oalilo (2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-4-metil-1-((3-metilbutanoil) oxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (133) UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,91 min,m/z(ES+) calculado 672,37 (M+H)+, encontrado 672,46.
Se cargó un matraz con ácido gem-dimetilbutírico 132 (98 pl, 766 pmol) disuelto en diclorometano anhidro (5,1 ml, 15 mM) y la solución se agitó a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. Luego se añadió DMAP (9 mg, 77 pmol), seguido de DCC (79 mg, 383 pmol) y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 horas. El ácido activado resultante se añadió luego al dipéptido 124 de Tuv(OH)-Tup-Oalil (45 mg, 77 pmol) y la reacción se agitó durante la noche, momento en donde la UPLC/MS reveló la conversión en producto. Después, la reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con HCl 0,1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano, luego los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para proporcionar el producto crudo, que posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 49 mg (93 % ) de producto BOC-Tuv(dimetilbutiriloxi)-Tup-O-alil (2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-1-((3,3-dimetilbutanoil) oxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (134). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,88 min,m/z(ES+) calculado 686,39 (M+H)+, encontrado 686,47.
Desprotección: Los intermedios BOC-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo preparados por el Método 1, 2 o 3 se desprotegieron en condiciones ácidas con TFA al 10 % en diclorometano (25 mM) para revelar el grupo funcional de amina secundaria como sigue. El intermedio protegido con BOC se disuelve en diclorometano anhidro (9 volúmenes) y se agita bajo nitrógeno a 0 °C. A continuación, se añade gota a gota ácido trifluoroacético (1 volumen) a la solución agitada. La reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente y se controló mediante UPLC/MS. Una vez completada, la reacción se concentró mediante evaporación rotatoria y se bombeo en una línea de vacío durante la noche. Las aminas libres de fórmula general H-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo así obtenidas se llevan adelante para la introducción del componente N-terminal sin purificación adicional.
Los compuestos H-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo que se prepararon (Compuestos 135-139) se muestran en el Esquema 14 y se enumeran a continuación.
(2S,4R)-alil2-metil-4-(2-((1R,3R)-4-metil-3-(metilamino)-1-(propioniloxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-5-fenilpentanoato (135): Up LC-MS (sistema 1): tr= 1,24 min,m/z(e S+) calculado 544,29 (M+H)+, encontrado 544,25
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-1-(butiriloxi)-4-metil-3-(metilamino)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (136): UPLC-m S (sistema 2): tr= 1,20 min,m/z(ES+) calculado 558,30 (M+H)+, encontrado 558,38
(2S,4R)-alil4-(2-((1R,3R)-1-(isobutiriloxi)-4-metil-3-(metilamino)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (137): Up LC-MS (sistema 1): tr= 1,30 min,m/z(ES+) calculado 558,30 (M+H)+, encontrado 557,93.
(2S,4R)-alil2-metil-4-(2-((1R,3R)-4-metil-3-(metilamino)-1-((3-metilbutanoil) oxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-5-fenilpentanoato (138):. U<p>LC-M<s>(sistema 2): tr= 1,23 min,m/z(ES+) calculado 572,32 (M+H)+, encontrado 572,40.
(2S,4R)-alil4-(2-((1R,3R)-1-((3,3-dimetilbutanoil) oxi)-4-metil-3-(metilamino)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (139): U<p l>C-MS (sistema 2): tr = 1,27 min,m/z(ES+) calculado 586,33 (M+H)+, encontrado 586,42.
Ejemplo 40:Procedimiento general para el acoplamiento de amida de isoleucina con dipéptido de éster alílico de tubuvalina(O-acil)-tubofenilalanina
Se disuelve Fmoc-L-isoleucina (4 equivalentes) en dimetilformamida anhidra (50 mM) y se preactiva con HATU (4 equivalentes) y DIPEA (8 equivalentes); la mezcla se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, se añade el ácido activado a los dipéptidos de fórmula general H-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo; la reacción se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se controla mediante UPLC/MS. Una vez que la reacción deja de progresar o se completa, se añade ácido acético glacial (13 equivalentes) y el producto de reacción se purifica mediante HPLC prep. El grupo protector FMOC se elimina luego tratando los tripéptidos Fmoc-Ile-Tuv(O-acil)-Tup-O-alil con piperidina al 20 % en dimetilformamida (20 mM), con agitación bajo nitrógeno a temperatura ambiente. Una vez que se logró la desprotección completa, según se controló por UPLC/MS, la mezcla de reacción se concentró por evaporación rotatoria. El producto bruto de fórmula general H-Ile-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo se purificó luego mediante HPLC preparativa para proporcionar tripéptidos de amina libres.
Los compuestos 140-144 de fórmula general FMOC-Ile-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo mostrados en el Esquema 14 y enumerados a continuación se prepararon de acuerdo con el procedimiento de acoplamiento de péptidos anterior. (2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-l-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7-metil-3,6,12-trioxo-2, ll-dioxa-4,7-diazatetradecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (140): UPLC-MS (sistema 1): tr= 2 ,11 min,m/z(ES+) calculado 879,44 (M+H)+, encontrado 879,60.
(2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-1-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7-metil-3,6,12-trioxo-2,11-dioxa-4,7-diazapentadecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (141): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,94 min,m/z(ES+) calculado 893,45 (M+H)+, encontrado 893,56.
(2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-l-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7, 14-dimetil-3,6,12-trioxo-2,11-dioxa-4,7-diazapentadecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (143): UPLC-MS (sistema 2): tr = 2,06 min,m/z(ES+) calculado 907,47 (M+H)+, encontrado 907,58.
(2S,4R)-alilo 4-(2-((5S,8R,10R)-5-((S)-sec-butil)-1-(9H-fluoren-9-il)-8-isopropil-7, 14,14-trimetil-3,6,12-trioxo-2,11 -dioxa-4,7-diazapentadecan-10-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (144): UPLC -MS (sistema 2): tr= 2,50 min,m/z(E<s>+) calculado 921,49 (M+H)+, encontrado 921,59
Los compuestos 145-149 de fórmula general H-Ile-Tuv(O-acil)-Tup-O-alilo mostrados en el Esquema 14 y enumerados a continuación se prepararon de acuerdo con el procedimiento de desprotección de FMOc anterior a partir de los Compuestos 140-144, respectivamente.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-4-metil-1-(propioniloxi)pentilo)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (145): UPLC-MS (sistema 1):t=1,29 min,m/z(ES+) calculado 657,37 (M+H)+, encontrado 658,04.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-1-(butiriloxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (146): Up LC-M S (sistema 2): tr= 1,24 min,m/z(ES+) calculado 671,39 (M+H)+, encontrado 671,48.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-1-(isobutiriloxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (147): UPLC-MS (sistema 1): tr= 1,33 min,m/z(ES+) calculado 671,39 (M+H)+, encontrado 671,33
(2S,4R)-alilo 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-4-metil-1-((3-metilbutanoílo)) oxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (148): UPLC-MS (sistema 2):t=1,31 min,m/z(ES+) calculado 685,40 (M+H)+, encontrado 685,49.
(2S,4R)-alil4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3-dimetilpentanamido)-1-((3,3-dimetilbutanoil) oxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (149): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,30 min,m/z(ES+) calculado 699,42 (M+H)+, encontrado 699,51.
Otros tripéptidos que incorporan un componente tubuvalina-(O-acilo) se preparan de manera similar reemplazando FMOC-Ile con otros aminoácidos alifáticos (por ejemplo, FMOC-Leu) o ácidos que contienen amina alifática.
Ejemplo 41:Procedimiento general para el acoplamiento de amida de isoleucina-tubuvalina(O-O-acil)-tubofenilalanina alil éster tripéptido con ácidos que contienen amina terciaria para la introducción del componente N-terminal de tubulisina.
Se disuelve ácido (R)-N-metil-pipecólico (D-Mep) 60 (2 equivalentes) en dimetilformamida anhidra (20-25 mM) y se preactiva con HATU (2 equivalentes) y DIPEA (4 equivalentes); la mezcla se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, se añade el ácido activado al tripéptido del Ejemplo 40 que tiene la fórmula general H-Ile-Tuv(O-Acil)-Tup-O-alilo; la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se controló mediante UPLC/MS. Una vez completada la reacción, se añade luego ácido acético glacial (14 equivalentes) y el producto tetrapéptido de fórmula general D-Mep-Ile-Tuv(O-Acil)-Tup-O-alilo se purificó mediante HPLC preparativa. A continuación, el grupo protector alilo se elimina sin pérdida del resto acilo de tubuvalina disolviendo el tetrapéptido de tubulisina protegido con éster de alilo (150-154) en diclorometano anhidro (20 mM) tratado con tetraquis-(trifenilfosfina) de paladio (0,1 equiv.), Trifenilfosfina (0,2 equivalentes) y pirrolidina anhidra (8 equivalentes), y la reacción se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Una vez que la UPLC/MS revela la conversión en el producto ácido libre, la reacción se apaga con ácido acético glacial (22 equivalentes), se diluye con acetonitrilo y dimetilformamida y luego se concentra por evaporación rotatoria. Los compuestos de tubulisina brutos de fórmula general D-Mep-Ile-Tuv(O-Acil)-Tup-O-alilo se purifican luego mediante HPLC preparativa.
Los compuestos 150-154 de fórmula general D-Mep-Ile-Tuv(O-acil) -Tup-O-alilo mostrados en el Esquema 14 y enumerados a continuación se prepararon de acuerdo con el procedimiento de acoplamiento de péptidos anterior a partir de los Compuestos 145-149, respectivamente.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido) pentanamido)-4-metil-1-(propioniloxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (150): UPLC-MS (sistema 1): tr= 1,33 min,m/z(ES+) calculada 782,45 (M+H)+, encontrado 781,82.
(2S,4R)-alil4-(2-((1R,3R)-1-(butiriloxi)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (151): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,31 min,m/z(ES+) calculado 796,47 (M+H)+, encontrado 796,57.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-(isobutiriloxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (152): UPLC-MS (sistema 1): tr= 1,37 min,m/z(ES+) calculado 796,47 (M+H)+, encontrado 795,78.
(2S,4R)-alil4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metil-1-((3-metilbutanoil)oxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (153): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,35 min,m/z(ES+) calculado 810,49 (M+H)+, encontrado 810,59.
(2S,4R)-alil 4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-((3,3-dimetilbutanoil)oxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoato (154): UPLC-MS (sistema 2):tr=1,38 min,m/z(ES+) calculado 824,50 (M+H)+, encontrado 824,60.
Los compuestos 155-159 de fórmula general D-Mep-Ile-Tuv(O-acil)-Tup-OH mostrados en el Esquema 14 y enumerados a continuación se prepararon de acuerdo con el procedimiento de desprotección de alilo anterior a partir de los Compuestos 150-154, respectivamente.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metil-1-(propioniloxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (155): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1 ,11 min,m/z(ES+) calculo 742,42 (M+H)+, encontrado 742,51.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-(butiriloxi)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (156): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,16 min,m/z(ES+) calculado 756,44 (M+H)+, encontrado 756,54.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-l-(isobutiriloxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (157): UPLC-MS (sistema 1): tr= 1,23 min,m/z(ES+) calculado 756,44 (M+H)+, encontrado 756,82.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metil-1-((3-metilbutanoil)oxi)pentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (158): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,22 min,m/z(ES+) calculado 770,45 (M+H)+, encontrado 770,55.
Ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-((3,3-dimetilbutanoil)oxi)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (159): UPLC-MS (sistema 2): tr= 1,23 min,m/z(ES+) calculado 784,47 (M+H)+, encontrado 784,57.
Compuestos de tubulisina O-acilo adicionales, incluidos los que tienen variación (S) en las entradas de aminoácidos o ácidos que contienen amina que reemplazan el resto de tubofenilalanina (Compuesto 40) del Ejemplo 39, como se muestra en el Ejemplo 27, y/o la entrada de aminoácidos FMOC (FMOC-Ile) del Ejemplo 40, se preparan reemplazando D-Mep con otras entradas de ácido pipecólico N-alquilado o con un ácido azetidinil-<2>-carboxílico N-alquilado, N-alquilado-D-prolina o N,N-dialquilo aminoácido como N,N-dimetilglicina.
Ejemplo 42:Preparación de un compuesto fármaco-enlazador que tiene una unidad de fármaco de tubulisina no escindible con unión N-terminal a una unidad de extensión.
Se preparó un compuesto fármaco-enlazador de fórmula general M<1>-A-D, en donde M<1>es un resto maleimida, A es una unidad de extensión y D es una tubulisina con unión N-terminal al precursor de la unidad enlazadora M<1>-A como se muestra en el esquema 15. En que el Compuesto Esquema 172 ejemplifica un compuesto de fármaco-enlazador, cuya preparación se describe a continuación, donde la unidad de fármaco es desmetil-Tubulisina M (O-CH<3>) (170) en el que el sustituyente de acetato unido a O del componente tubuvalina ha sido reemplazado con -O CH<3>. Ese compuesto fármaco-enlazador proporciona un conjugado de fármaco y ligando (LDC) a través de la unión de una unidad de ligando a través de un grupo funcional tiol de un resto de direccionamiento que es resistente a la liberación del fármaco libre. Para un LDC derivado del Compuesto 172 y un resto de direccionamiento de anticuerpo, el resto activo liberado está típicamente representado por la estructura general de Cys-M<2>-A-D, en donde M<2>es un resto succinimida resultante de la adición de Michael de un tiol de cisteína al resto maleimida del compuesto fármaco-enlazador M<1>-A-D. El resto activo eventualmente liberado de tales LDC puede considerarse una tubulisina M (O-éter) en la que el sustituyente metilo del resto D-Mep ha sido reemplazado por tiol, un resto alquilo sustituido. Des-metil-Tub(OMe)-O-alil: Se disolvió ácido (R)-N-BOC-pipecólico 60<( 6>mg, 24 pmol) en dimetilformamida anhidra (0,46 ml, 25 mM) y se preactivó con HATU (9 mg, 24 pmol) y DIPEA (9 pl, 48 pmol); la mezcla se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, se añadió el ácido activado al tripéptido 57 de H-Ile-Tuv(OMe)-Tup-O-alilo (10 mg, 12 pmol) del Ejemplo 28; la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se controló mediante UPLC/MS. Después, la reacción se inactivó con ácido acético y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 12 mg (cuant.) (R)-terc-butil 2-(((2S,3S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(((2R,4S)-5-(aliloxi)-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-1-metoxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)carbamoil) piperidin-1-carboxilato (168). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr = 1,99 min,m/z(ES+) calculado 847,47 (M+Na)+, encontrado 847,87.
Desprotección: BOC-Tub(OMe)-OAlil (168, 12 mg, 15 pmol) se recogió en DCM (0,75 ml) en agitación en atmósfera de N<2>. Se añadieron Pd(PPh<3>)<4>(1,7 mg, 1,5 pmol) y PPh<3>(0,8 mg, 3 pmol) como sólidos seguido de pirrolidina (11 pl, 120 pmol). La reacción se agitó a 2 horas a temperatura ambiente, luego se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar 9 mg (76 % ) de (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-((R)-1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-2-carboxamido)-N,3-dimetilpentanamido)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol Ácido -4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (169): UPLC-MS analítica (sistema 1):t,=1,80 min, m/z (ES+) calculado 786,45 (M+H)+, encontrado 786,67
Desprotección N-terminal: Un matraz cargado con BOC-TubOMe-OH se enfrió a 0 °C bajo N<2>(169, 9 mg, 11 |jmol). Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,5 ml) y se agitó durante 4 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar (5 mg) 63 % de (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((Ácido 2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-piperidin-2-carboxamido)pentanamido)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (170). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr = 1 ,15 min, m/z (ES+) calculado 686,40 (M+H)+, encontrado 685,59.
Acoplamiento de Lb'-A-: Se disolvió ácido maleimidocaproico 171 (2 mg, 9,5 jmol) en dimetilformamida anhidra (0,5 ml, 20 mM) y se preactivó con HATU (2,3 mg,<6>jmol) y DIPEA (5 jl, 29 jmol); la mezcla se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, se añadió el ácido activado al éter metílico de tubulisina 170 (5 mg, 7,3 jmol); la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se controló mediante UPLC/MS. Después, la reacción se inactivó con ácido acético y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 7 mg (cuant.) de ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-((R)-1-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)piperidin-2-carboxamido)-N,3-dimetilpentanamido)-1-metoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (172). UPLC-MS analítica (sistema 1): tr=<1 , 6 0>min,m/z(ES+) calculado 879,47 (M+H)+, encontrado 879,11.
Los conjugados de amina cuaternaria como se describen en la presente descripción liberan condicionalmente tubulisinas que tienen un componente N-terminal que contiene amina terciaria en el que el átomo de nitrógeno de ese componente está directamente sustituido por un resto alquilo (es decir, a través de un enlace nitrógeno-carbono). En contraste, el resto de fármaco activo liberado de forma no condicional de un conjugado de fármaco y ligando preparado a partir del compuesto 172 de fármaco-enlazador tiene un componente N-terminal que contiene una amina secundaria sustituida por un alquileno a través de un grupo funcional amida.
Ejemplo 43:Preparación de un compuesto fármaco-enlazador que tiene dolastatina 10 cuaternizado que incorpora una unidad de glucurónido.
Cuaternización: Se cargó un recipiente a presión con el producto intermedio 2 (62 mg, 76 jmol) de unidad de extensión-glucurónido bromado del Ejemplo 1 y dolastatina 10 (173, 45 mg, 51 jmol) en 2-butanona anhidra (1,0 ml). El recipiente de reacción se lavó abundantemente con N<2>y se selló. Después, la reacción se agitó y se calentó a 80 °C durante 12 horas. La mezcla resultante se enfrió, se condensó a presión reducida y se llevó adelante sin purificación adicional para proporcionar (S)-N- (3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (174). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,42 min,m/z(ES+) calculado 1515,74 (M)+, encontrado 1515,91.
Desprotección de glicósidos: se cargó un matraz con FMOC-GlucQ-DIO (174, 39 mg, 26 jmol) en THF (0,42 ml) y MeOH (0,42 ml). Esta solución se agitó en atmósfera de N<2>y se enfrió a<0>°C. L O H H<2>O (<8 , 6>mg,<2 0 6>jmol) se solubilizó en H<2>O (0,42 ml) gota a gota a continuación añadido. Se dejó que la reacción se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (12 jl, 206 jmol) y se condensó a presión reducida. El residuo se recogió en DMSO mínimo y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 7 mg (24 % ) (S)-N-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-((((3R, 4S, 5S)-3-metoxi -1-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-ilo)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (175). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,90 min,m/z(ES+) calculado 1153,62 (M)+, encontrado 1153,78.
Acoplamiento de Lss (mDPR): Se cargó un matraz con H-GlucQ-D10 (175, 7,0 mg, 6,0 jmol) en DMF anhidra (0,62 ml). Se añadió mDPR(BOC)-OSu (<6>, 2,3 mg, 6,1 jmol) bajo N<2>. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (4,2 jl, 24 jmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (4,2 jl) y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 5,5 mg (64 % ) de (S)-N-(3-(3-((S)-3-((tercbutoxicarbonilo)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R, 2 R )-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1 -oxobutan-2-aminio (176). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,18 min,m/z(ES+) calculado 1419,71 (M)+, encontrado 1419,87.
Desprotección de Lss (MDPR): se enfrió a 0 °C bajo N<2>un matraz que contenía MDPR (BOC) -GlucQ-D10 (176, 5,5 mg, 3,9 mol). Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,39 ml) y se agitó durante 4 horas. A continuación, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 5,1 mg (99 % ) de (S)-N- (3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4, 5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1(((S)-1-(((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil) pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (177). UPLC-MS analítica:tr =0,95 min,m/z(ES+) calculado 1319,66 (M)+, encontrado 1319,81.
Ejemplo 44:Preparación de un compuesto fármaco-enlazador que tiene Dolastatina 10 con unión de carbamato a una unidad de glucurónido
Unión de la unidad de fármaco carbamato: Se cargó un matraz con FM OC-Gluc-PNP (Bioconjugate Chem., 2006, 17, 831-840.) (178, 60 mg,<6 6>pmol) y monometildolastatina 10 (179, 46 mg, 60 pmol) en DMF anhidra (0,96 ml) a la que se añadió piridina (0,24 ml) seguida de HOBt (3,2 mg, 24 pmol). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche, se condensó a presión reducida y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH) para proporcionar 54 mg (59 % ) de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)ammo)-0propanamido)-4-((5S, 8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butilo)-5,8-diisopropil-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-m etil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-<2>-il) etil)amino) propil) -pirrolidin<- 1>-il)-2-oxoetil)-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)-fenoxi) -6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetato (180). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,65 min, m/z (ES+) calculado 1545,71 (M+H)+, encontrado 1545,98.
Desprotección de glicósidos: se cargó un matraz con Fmoc-Gluc-MMDIO (180, 54 mg, 35 pmol) en THF (0,78 ml) y MeOH (0,78 ml). Esta solución se agitó en atmósfera de N<2>y se enfrió a 0 °C. L O H H<2>O (12 mg, 278 pmol) se solubilizó en H<2>O (0,78 ml) gota a gota a continuación añadido. Se dejó que la reacción se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (17 pl, 278 pmol) y se condensó a presión reducida. El residuo se recogió en DMSO mínimo y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 9,6 mg (23 % ) de ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-am inopropanam ido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-secbutil)-5,8-diisopropil-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil) pirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-4,10-ácido dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil) fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (181). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1 ,13 min,m/z(ES+) calculado 1183,60 (M+H)+, encontrado 1183,70.
Acoplamiento de unidad glucurónido-fármaco: se cargó un matraz con H-Gluc-MMD10 (181, 9,6 mg, 8,1 pmol) en DMF anhidra (0,81 ml). Se añadió mDPR(Boc)-OSu (<6>, 3,4 mg, 8,9 pmol) en N<2>. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (5,7 pl, 32 pmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se inactivó con ácido acético (5,7 pl) y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar 5,2 mg (44 % ) de Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(5S, 8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-5,8-diisopropil-12-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo -3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4.7.10- triazatetradecil)fenoxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (182). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,40 min,m/z(ES+) calculado 1449,69 (M+H)+, encontrado 1449,80.
Desprotección: un matraz que contenía mDPR(Boc)-Gluc-MMD10 se enfrió a 0 °C bajo N<2>(182, 5,6 mg, 3,9 mol). Se añadió gota a gota una solución de TFA al 10 % en CH<2>Ch (0,39 ml) y se agitó durante 4 horas. Después, la reacción se recogió en DMSO, se condensó a presión reducida y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar 5,2 mg (99 % ) de Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-5,8-diisopropil-12-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4.7.10- triazatetradecil)fenoxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (183). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1 ,13 min,m/z(ES+) calculado 1349,64 (M+H)+, encontrado 1349,75.
El esquema 17 para el ejemplo 44 representa una secuencia de reacción ejemplar para preparar compuestos de fármaco-enlazador que tienen unidades de fármaco unidas a carbamato. Los conjugados de fármaco ligando que se pueden obtener a partir de dicho compuesto carbamato de fármaco-enlazador, que contienen unidades de fármaco no cuaternizados, pueden compararse con la versión cuaternizado cuya síntesis de los compuestos de enlace de fármaco cuaternizados necesarios se proporciona mediante la generalización del esquema 16. Para la adaptación a un compuesto carbamato de fármaco-enlazador, se debe eliminar un sustituyente alquilo del grupo de función de amina terciaria de un fármaco que contiene amina terciaria si su unión como unidad de fármaco debe ser a través del nitrógeno de ese grupo funcional. La liberación del fármaco libre de un conjugado de fármaco y ligando que tiene esa modificación en la unidad de fármaco liberará el fármaco modificado, que se espera que tenga propiedades diferentes en comparación con el fármaco original que puede ser indeseable.
Ejemplo 45:Preparación de un compuesto fármaco-enlazador que tiene Auristatina F cuaternizado que incorpora una unidad de glucurónido
Protección C-terminal de Auristatina F: Se cargó un matraz de fondo redondo con Auristatina F 184 (150 mg, 201 pmol) y se disolvió en alcohol alílico (10 ml). La reacción se enfrió a 0 °C y se añadió pirocarbonato de alilo (149 mg, 804 pmol) seguido de DMAP (7,3 mg, 60 pmol). La reacción se extruyó C O<2>vigorosamente y se ralentizó después de 15 min. La reacción se analizó por UPLC después de agitar a TA durante 2 h y mostró > 90 % conv. La reacción se concentró al vacío y el crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (MeOH al 0-25 % ). Las fracciones se concentraron a sequedad para proporcionar 111 mg (71 % ) de (S)-alil 2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato (185). UPLC-MS analítica (sistema 2):t=1,1 min,m/z(ES+) calculado 786,54 (M+H)+, encontrado 786,72.
Cuaternización: A un matraz de 20 ml que contenía AF-OAlil 185 (111 mg, 141 pmol) se le añadió el intermedio 2 de unidad de extensión-glucurónido bromado (160 mg, 197 pmol) y DMF seco (5 ml). La solución se agitó a 65 °C durante 16 h y la reacción se completó mediante UPLC. La reacción se secó, se recogió en DMSO y se purificó por HPLC. Las fracciones de producto se concentraron hasta sequedad para proporcionar 85 mg (40 % ) de (S)-N- (3-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6s)-3,4,5-triacetoxi-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R, 4S, SS)-1-((S)-2-((1R, 2R)-3-(((S)-1-(aliloxi)-1-oxo-3-fenilpropano-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (186). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1,45 min,m/z(ES+) calculado 1516 ,77 (M)+, encontrado 1517,03.
Desprotección de glicósidos: Se añadió THF (4 ml) y MeOH (4 ml) a un vial de 20 ml que contenía GlucQ-AF-OAlil 186 protegido (85 mg, 56 pmol). La reacción se enfrió a 0 °C y se añadió una solución de LiOH (18 mg/ml en agua) en una porción. La reacción se agitó a TA durante 3 h y la reacción se completó mediante UPLC. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se recogió en DMSO/H<2>O (1: 1). La HPLC preparativa seguida de liofilización proporcionó 42 mg (62 % ) de (S)-N-(3-(3-aminopropanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,SS)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-carboxi-2-feniletil)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metilo -1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1 - oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (187). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,88 min,m/z(ES+) calculado 1114 ,63 (M)+, encontrado 1114,83.
Acoplamiento de L<ss>(mDPR): Se cargó un vial de 3 ml con NH<2>-GluQ-AF 187 (42 mg, 39 pmol) y DMF seca (1,6 ml). La solución se agitó y se añadió mDPR-(Boc)-OPfp<6 8>(19 mg, 42 pmol). La reacción se agitó durante 5 min a TA y luego se añadió DIPE<a>(13 pl, 77 pmol). La reacción se agitó durante 1 h a TA y la reacción se completó mediante UPLC. La preparación por HPLC del crudo seguido de liofilización proporcionó 13 mg (24 % ) de (S)-N-(3-(3-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-carboxi-2 - feniletil)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (188). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 1 ,12 min,m/z(ES+) calculado 1380,72 (M)+, encontrado 1380,87.
Desprotección de L<ss>(mDPR)-Ao-Y(W)-D+: Un vial de 20 ml que contenía Boc-mDPR-GlucQ-AF (13 mg, 9 pmol) se enfrió a 0 °C y se añadió una solución al 20 % de TFA en<d>C<m>(1,0 ml). La reacción se dejó calentar lentamente a TA y se agitó durante 4 h, y la reacción se completó mediante UPLC. DMSO/0,1 % de TFA en H<2>O se añadió a la reacción y luego se purificó en HPLC para dar 1,5 mg (33 % ) de (S)-N-(3-(3-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-carboxi-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)bencil)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R),2R)-3-(((S)-1-carboxi-2-feniletil)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-N,N,3-trimetil-1-oxobutan-2-aminio (189). UPLC-MS analítica (sistema 2): tr= 0,86 min,m/z(ES+) calculado 1280,67 (M)+, encontrado 1280,80.
El Esquema 18 para el Ejemplo 45 y el Esquema 16 para el Ejemplo 43 junto con el Esquema 1 proporcionan rutas representativas para preparar compuestos de Fármaco-enlazador de fórmula general Lb'-Ao-Y(W)-D+, más específicamente MrArAo-Y(W)-D+ en donde D+ es una auristatina cuaternizada (es decir, dolastatina 10, auristatina E o auristatina F, respectivamente). Otros compuestos de fármaco-enlazador de esa fórmula general se preparan con compuestos de auristatina adicionales que tienen un grupo funcional amina terciaria, particularmente cuando están presentes como grupo funcional de un componente de aminoácido N-terminal.
Ejemplo 46:Preparación de un compuesto fármaco-enlazador que tiene una unidad de fármaco de tubulisina liberable condicionalmente con unión C-terminal a una unidad de extensión.
Se sintetizó tubulisina M-hidrazida como un fármaco libre (190) y se acopló al compuesto intermedio de fármacoenlazador activado por Val-Cit-PAB-PNP (192) como se muestra en el Esquema 24. Brevemente, se acopló tubulisina M (26) a carbazato de butilo terciario mediante activación con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida en presencia de hidroxibenzotriazol. El producto acoplado se desprotegió con BOC en condiciones estándar con ácido trifluoroacético en diclorometano para producir el fármaco libre, tubulisina M-hidrazida (1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidin-2-carboxamido)pentanamido)-1-(4-(((2R,4S)-5-hidrazinil-4-metil-5-oxo-1-fenilpentan-2-il)carbamoil)tiazol -2-il)-4-metilpentil acetato (190). Un compuesto fármaco-enlazador M C-Val-Cit-PABN-D escindible de fórmula general M<1>-A-W -Y-D, en donde M<1>es un resto maleimida, A es un alquileno como unidad espaciadora, W es W<2>-W<1>-, en donde W<1>es citrulina y W<2>es valina, Y es un resto PAB como la unidad espaciadora autodestructiva unida a la unidad de fármaco tubulisina a través de un grupo funcional hidrazida, se preparó haciendo reaccionar el nitrógeno de la hidrazida con el intermedio del compuesto fármaco-enlazador activado por PNP 4-((S)-2-((S)-2-(6(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil(4-nitrofenil)carbonato (191) en presencia de diisopropiletilamina, hidroxibenzotriazol y piridina como codisolvente, proporcionando el compuesto de enlace de fármaco 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 2-((2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoil)hidrazinacarboxilato (192) con un rendimiento del 33 % a partir de la tubulisina M-hidrazida (190).
La proteólisis condicional de un conjugado de fármaco y ligando preparado a partir del compuesto 192 de fármacoenlazador libera el compuesto 190 como el resto de fármaco activo en el que el residuo C-terminal permanece modificado como su hidrazida. Los conjugados de amina cuaternaria como se describen en la presente descripción liberan tubulisinas que tienen un grupo funcional ácido carboxílico libre en sus C-terminales.
Ejemplo 47:Evaluación de la desacilación del componente tubuvalina(O-acilo) de conjugados de fármaco ligando que tienen una unidad de fármaco tub(O-acilo)cuaternizado.
En una placa de filtro de 96 pocillos de polipropileno de 2,5 ^m, se añadió 1 ml de PBS a cada pocillo. Se aplicó una suspensión de 200 ^l de resina mAbSelect™ Proteína A a cada pocillo y se eliminó el componente acuoso con vacío. Se aplicó a la resina una alícuota de 20 ^l de cada muestra de plasma descongelada y se dejó que se mezclara a 4 °C durante 1 hora. El flujo se recogió en una placa mediante centrifugación (500 g, 3 minutos) y la resina se lavó con 200 ^l de tampón de papaína [2X] (KPO<4>40 mM, EDTA 20 mM, pH 7) mediante otra centrifugación.
La enzima de papaína se disolvió a 2,5 mg/ml en tampón de papaína [1X] (KPO<4>, 20 mM, EDTA 10 mM, cisteína 2 mM, pH 7) y se incubó a 37 °C durante 15 minutos. Se añadió una alícuota de 200 ^l de papaína a cada pocillo con resina. La placa se selló y se incubó durante 2 horas a 37 °C. El flujo continuo se recuperó mediante centrifugación (500 g, 3 minutos). La resina se lavó con 100 ^l de tampón de papaína [1X] y se combinó con el flujo continuo. Las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf y se añadieron 1000 ^l de MeOH enfriado con hielo a cada tubo y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Las muestras se precipitaron mediante centrifugación a 16000 g durante 5 minutos a 4 °C y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de 96 pocillos.
Se preparó una curva estándar de ocho puntos que variaba de 1-10000 nM para cada fármaco en MeOH al 50 %. Se añadió una alícuota de 20 ^l de cada estándar a la placa de 96 pocillos que también contenía las muestras. Se añadieron a cada pocillo estándar una alícuota de 300 ^l de KPO<4>20 mM, EDTA 10 mM, cisteína 2 mM (tampón de papaína 1X) y 1000 ^l de MeOH. La placa se evaporó bajo nitrógeno hasta sequedad.
La placa se reconstituyó con 70 ^l de acetonitrilo al 20 % ácido fórmico al 0,1 % y se inyectó una alícuota de 50 ^l en un Waters Acquity LC acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Quattro Premier. El espectrómetro de masas mide la transición de los iones originales a los iones del fragmento MS/MS, lo que da como resultado un área de pico para cada analito en la muestra y el estándar. Las áreas de los picos estándar se representaron gráficamente en función de la concentración de fármaco y las áreas de los picos medidas de las muestras se cuantificaron usando la ecuación de la línea determinada por la curva estándar.
Ejemplo 47.Citotoxicidad in vitro de un conjugado de ligando fármaco que tiene una tubulisina cuaternizada como resto D+.
Una composición de LDC, que se dirige a células de linfoma, se obtuvo a partir del compuesto fármaco-enlazador 30 del Esquema 5 y el anticuerpo monoclonal cAC10, en donde la composición contiene predominantemente LDC que tienen 8 unidades D+ en donde D+ se cuaterniza tubulisina M. Este LDC que predomina está representado por la siguiente estructura
en donde Ab es cAC10 y p' es 8 y S es un átomo de azufre de un residuo de cisteína de anticuerpo. La citotoxicidad de ese LDC, que está compuesto por un anticuerpo monoclonal que se dirige a la unidad de ligando de anticuerpo CD30, una unidad escindible de dipéptido y tubulisina M cuaternizada, hacia un panel de líneas celulares de linfoma CD30+ se comparó con un conjugado de control en donde el anticuerpo cAC10 se reemplaza por un anticuerpo de control (h2H12) que se dirige a CD33. La citotoxicidad del conjugado cAC10-D+ ocurre después de su internalización celular en células CD30+ y la escisión proteolítica del dipéptido Val-Ala, que es la unidad escindible del LDC, para liberar tubulisina M. Los resultados de esa comparación se proporcionan en la Tabla 2 en la que IC50 para la inhibición del crecimiento celular se proporciona en unidades de ng/ml.
Tabla 2. Citotoxicidadin vitrode un conjugado de fármaco ligando de tubulisina M cuaternizado dirigido a células de linfoma CD30+
En particular, KM-2, L428, L540cy-BVR y Del/BYR son líneas celulares resistentes a múltiples fármacos. Se preparó una composición de LDC en la que se eliminó el sustituyente metilo del residuo Mep de tubulisina M y la amina secundaria resultante se unió a través de un carbamato a un resto autodestructivo de PAB que se activa mediante la escisión de la catepsina de una unidad escindible valina-citrulina (vc). Se encontró que la composición de LDC, que se preparó a partir del compuesto 172 de fármaco enlazador como se describe en el Ejemplo 53, era inactiva, lo que confirma la importancia del farmacóforo de amina terciaria para la actividad citotóxica de las tubulisinas.
También se encontró que el resto de ácido carboxílico en el residuo Tup/Tut era intolerante a la modificación cuando se usaba en un sitio alternativo de conjugación. Por lo tanto, cuando ese ácido carboxílico se convirtió en una hidrazida para permitir la unión de la tubulisina M a través de su residuo Tup al mismo resto autodestructivo de PAB (también a través del grupo funcional carbamato), el conjugado se preparó a partir del compuesto fármaco-enlazador MC-Val-Cit-PABC-NHNH-Tub M, abreviado en la Tabla 3 como vcPABN (hidrazida), se encontró que había perdido una actividad significativa cuando se comparó con el conjugado preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador cuaternizado MC-Val-Ala-PAB4-TubM abreviado como vaPAB4. Ese resultado confirma la importancia del ácido carboxílico libre para la citotoxicidad de la tubulisina M (dado que el fármaco liberado se modifica como la hidrazida en esa posición) y se resume en la Tabla 3 para los conjugados de cOKT9, que se dirigen al antígeno CD71. En la Tabla 3, cOKT9-vaPAB4 (que tiene una carga predominante 8), que libera la tubulisina M, corresponde en estructura al conjugado cACIO de la Tabla 2 en el que el resto de direccionamiento cACIO es reemplazado por cOKT9. cOKT9-vcPABN (hidrazida) que tiene DAR de 6,7 de la Tabla 3 es la construcción de tubulisina unida a carbamato correspondiente a tubulisina M en la que la tubulisina liberada se modifica en el residuo Tup como se describió anteriormente. El LDC prominente en ambas composiciones tiene 8 fármacos (u 8 unidades de fármaco cuaternizado) unidos por anticuerpo.
Tabla 3. Citotoxicidadin vitrode un conjugado de fármaco y ligando de tubulisina cuaternizado dirigido a células de linfoma C71 en comparación con el conjugado de fármaco y ligando de tubulisina no cuaternizado que se une al componente C-terminal
Los valores entre paréntesis indican los porcentajes de células viables que quedan en la parte inferior de la curva dosis-respuesta. Los números de copia de CD71 para las líneas celulares HT-116, L-427, KH-H2, L540cy, MM.1R y HL60cy que se probaron son 5K, 35K, 121K, 33K, 32K y 228K, respectivamente. Los resultados de la Tabla 3 se confirman mediante el Ejemplo 64 en el que el ADC de cOKT9-hidrazida que tiene el resto fármaco enlazador MC-Val-Cit-PABN-TubM (192) se compara con el ADC de cOKT9 preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador MC-Val-Ala -PAB4-TubM (30)
Los resultados de la Tabla 2 y la Tabla 3 indican que se obtienen conjugados de fármaco ligando potentes e inmunológicamente específicos cuando se incorpora una tubulisina en tales construcciones como una unidad de fármaco cuaternizada y que tales conjugados son activos contra líneas celulares multirresistentes. Además, se encontró sorprendentemente que el conjugado cuaternizado obtenido a partir del compuesto 30 tenía la capacidad de destruir células que no expresaban el antígeno CD30 cuando esas células se cocultivaban con células CD30+ que son el objetivo del conjugado. Así, la composición de LDC mostró una IC<50>de 6 ng/ml contra un cocultivo de células L540cy:U268Luc+, con 0 % de células viables restantes en la parte inferior de la curva de dosis-respuesta. L540cy son<c>D30+ y U266 son CD30'
Ejemplo 48.Citotoxicidad in vitro de conjugados de fármaco ligando que tienen una auristatina cuaternizado como resto D+.
La citotoxicidad del LDC compuesto por el anticuerpo monoclonal cAC10, que se dirige a CD30, y auristatina E cuaternizado hacia un panel de líneas celulares de linfoma CD30+ se comparó con un conjugado de control en donde el anticuerpo cAC10 se reemplaza por un anticuerpo de control (hBU12) que se dirige a CD19. También se utilizan células de control que no tienen antígeno CD30+ detectable, pero que tienen antígeno C19. La citotoxicidad del conjugado cAC10-D+ ocurre después de su internalización celular en células CD30+ y la escisión de la catepsina del dipéptido Val-Cit, que es la unidad escindible del LDC, para los conjugados designados en la Tabla 4 como vcPAB4-AE, o escisión por glucuronidasa del enlace glicosídico de carbohidrato, que es el sitio de escisión de las unidades escindibles para los conjugados cAC10 designados como gluc4-AE, para liberar auristatina E libre.
Asimismo, se produce citotoxicidad para los conjugados análogos de hBU12 cuando estos conjugados se internalizan en células CD19+ que tienen número de copias suficiente del antígeno relevante. Los resultados de estas comparaciones se proporcionan en la Tabla 4 en la que IC<50>para inhibición del crecimiento celular se proporciona en unidades de ng/ml.
Las composiciones de LDC designadas como vcPAB4-AE en la Tabla 4 se obtuvieron del compuesto 14 del Esquema 2 y el anticuerpo monoclonal cACIO, que se dirige a las células de linfoma CD30+, o el anticuerpo monoclonal hBU12, que se dirige a las células C19+, en donde la composición contiene predominantemente lDc que tienen 8 Unidades D+, en donde D+ es auristatina E cuaternizado. El LDC predominante, después de la hidrólisis controlada del sistema de anillo de succinimida, está representada por la siguiente estructura:
en donde el resto Ab-S- de cACIO o hBU12 está unido al carbono a o p en el ácido carboxílico M3. El M3-A indicó en la estructura anterior representa un resto enlazador autoestabilizado (LS), que está unido al dipéptido Val-Cit que sirve como unidad escindible.
Las composiciones de LDC designadas como gluc4-AE en la Tabla 4 se obtuvieron del compuesto 8 del Esquema 1 y el anticuerpo monoclonal cAC10, que se dirige a las células de linfoma CD30+ y el anticuerpo monoclonal hBU12, que se dirige a las células C19+ en donde D+ es auristatina E cuaternizado. El LDC predominante de la composición, después de la hidrólisis controlada del sistema de anillo de succinimida, está representada por la siguiente estructura:
en donde el resto Ab-S- de cACIO o hBU12 está unido al carbono a o p en el ácido carboxílico M3. M3-A1 indicado en la estructura anterior representa un resto enlazador autoestabilizado (Ls), que está unido a la subunidad Ao de A.
Tanto la composición de vcPAB4-AE como la de gluc4-AE contienen predominantemente LDC que tienen 8 unidades D+ por anticuerpo (es decir, p' es 8).
Tabla 4. Citotoxicidadin vitrode un conjugado de fármaco y ligando de auristatina cuaternizado dirigido a células de linfoma CD30+ o células de linfoma C19+.
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Karpas 299 son CD30+ (número de copia 238K) y tienen cantidades bajas de CD 19 (número de copia 10K), L-428 son CD30+ (número de copia 77K) y no tienen antígeno C 19 detectable, y L540cy son CD30+ (número de copia 433K) y tienen cantidades bajas de CD 19 (número de copia 23K). Por otro lado, Ramos y RL no tienen CD30 detectable y tienen diferentes niveles de C D 19 (32K vs. 18K, respectivamente). Los valores entre paréntesis indican los porcentajes de células viables que quedan en la parte inferior de la curva dosis-respuesta.
Los resultados de la Tabla 4 indican que se obtienen LDC potentes e inmunológicamente específicas cuando se incorpora una auristatina que contiene una amina terciaria en tales construcciones como una unidad de fármaco cuaternizada.
Ejemplo 49.Citotoxicidad in vitro de compuestos de tubulisina (O-éter) como fármacos libres.
Las células se trataron durante 96 horas con compuestos de ácido libre de éter tubulisina de fórmula general Tub(O-Et)-OH (64-66), o se trataron con tubulisina M (26), luego se evaluó la viabilidad como se describe en los métodos. Los resultados se resumen en la Tabla 5 con valores de IC<50>dados en unidades de concentración nM.
Tabla 5. Citotoxicidadin vitrode compuestos de tubulisina (O-éter) como fármacos libres en comparación con Tubulisina M
Los cuatro compuestos de prueba fueron muy potentes en todas las líneas celulares probadas. El compuesto de tubulisina etil éter Tub(OEt) (62) tendió a ser más potente que los análogos de metilo (61) y propilo (63). Los compuestos de éter etílico y tubulisina M mantuvieron el nivel más alto de potencia en el contexto de las líneas celulares MDR+ L428 y HL60/RV.
Ejemplo 50.Citotoxicidad in vitro de compuestos de tubulisina (O-acilo) como fármacos libres.
Las células se trataron durante 96 horas con ésteres de tubulisina 155-159 (es decir, Tub(O-éster)-OH) o tubulisina M (26), luego se evaluó la viabilidad como se describe en los métodos. Los resultados se resumen en la Tabla<6>con valores de IC<50>dados en concentraciones de nM. Los ésteres de tubulisina 155-158 se comportaron de manera comparable a la tubulisina M, con potencias similares en todas las líneas celulares. El compuesto de tubulisina O-acilo más impedido estéricamente (159) mostró una potencia significativamente disminuida en relación con la tubulisina M, con pérdidas de potencia que varían de 5 a 47 veces en relación con la tubulisina M.
Tabla 6. Citotoxicidadi n v i t r ode otros compuestos de tubulisina (O-acilo) como fármacos libres en comparación con la tubulisina M
Ejemplo 51.C i t o t o x i c i d a d in v i t r o d e o t r o s c o n j u g a d o s d e f á r m a c o l i g a n d o q u e t ie n e n u n i d a d e s d e f á r m a c o d e t u b u l i s i n a ( O - é t e r ) c u a t e r n i z a d o s d i r i g i d a s a c é l u la s d e l i n f o m a C D 30
Los conjugados de fármaco ligando anti-CD30 que llevan éteres de tubulisina cuaternizados (es decir, Tub(compuestos de O-éter) se compararon con el conjugado de tubulisina M correspondiente que tiene cada uno 8 unidades de fármaco cuaternizado/unidad de ligando de anticuerpo y que tiene unidades enlazadoras de glucuronidasa condicional. Las células se trataron con los conjugados cAC10 (anti-CD30) durante 96 h y luego se evaluó su viabilidad. Los IC<50>se muestran en la Tabla 7 dada en unidades de concentración ng/ml. El conjugado preparado a partir del Fármaco Enlazador de tubulisina etil éter 79 fue consistentemente más potente que los análogos de metilo (78) o propilo (80). Con la excepción de L428, el conjugado preparado a partir del fármacoenlazador 79 de tubulisina etiléter se comportó de forma similar al preparado a partir del fármaco-enlazador 104 de fármaco de tubulisina M. Todas los LDC estaban inactivos (sin efecto a 1000 ng/ml) en una línea celular Ramos NHL negativa para CD30, lo que indica un alto grado de especificidad inmunológica.
Tabla 7. Citotoxicidadi n v i t r ode conjugados de fármaco ligando dirigidos a células de linfoma CD30+ que tienen unidades de fármaco de tubulisina (O-éter) cuaternizados y unidades enlazadoras de liberación condicional de glucuronidasa
Ejemplo 52.C i t o t o x i c i d a d i n v i t r o d e c o n j u g a d o s d e f á r m a c o l i g a n d o q u e t ie n e n u n i d a d e s d e f á r m a c o d e t u b u l i s i n a M c u a t e r n i z a d o s d i r i g i d a s a c é l u la s d e l i n f o m a C D 30 o c é l u la s d e l e u c e m ia C D 33 .
Se conjugó el compuesto MC-Val-Ala-PAB4-TubM (30) de tubulisina de amina cuaternaria de fármaco enlazador con AC10 quimérico y 2H12 humanizado, que son anticuerpos anti-CD30 y anti-CD33, respectivamente, a 8 unidades de fármaco cuaternizado por anticuerpo. Los conjugados se probaron en un panel de linfomas CD30 positivos y CD33 positivos y líneas celulares de leucemia mieloide aguda (AML), respectivamente. Los resultados (en ng/ml) para las líneas celulares positivas para CD30 se muestran en la Tabla 8. El conjugado de unión a CD30, cAC10-30, fue muy potente en todas las líneas celulares; mientras que, el control de no unión h2H12-30 en este contexto fue inactivo, con IC<50>> 1000 ng/ml.
Tabla 8. Citotoxicidadi n v i t r ode conjugados de fármaco ligando dirigidos a células de linfoma CD30+ que tienen unidades de fármaco de tubulisina M cuaternizados con hidrofobicidad variable de unidad enlazadora.
Los resultados para el panel de la línea celular de AML que expresa CD33 se muestran en la Tabla 9. El conjugado de unión a CD33, h2H12-30, fue potente en todas las líneas celulares con IC50 en el intervalo de 0,9 a 18 ng/ml. El conjugado estaba inactivo en L540cy negativo para CD33, lo que indica un alto grado de especificidad inmunológica para este ADC.
Tabla 9. Citotoxicidadi n v i t r ode conjugados de fármaco ligando dirigidos a células de leucemia CD33+ que tienen unidades de fármaco tubulisina M cuaternizados con hidrofobicidad variable de unidad enlazadora.
Ejemplo 53.C i t o t o x i c i d a d in v i t r o d e c o n j u g a d o s d e f á r m a c o l i g a n d o d i r i g i d o s a c é l u la s d e l i n f o m a C D 3 0 q u e t ie n e n u n i d a d e s d e f á r m a c o t u b u l i s i n a M c u a t e r n i z a d o s c o n h i d r o f o b i c i d a d v a r ia b le d e u n i d a d e n l a z a d o r a .
Se prepararon varios compuestos de fármaco enlazador hidrófilos que tenían tubulisina M cuaternizado y se evaluaroni n v i t r olos conjugados de fármaco ligando dirigidos a células CD30+ derivadas de ellos a 8 unidades de fármaco/unidad de ligando de anticuerpo cAC10; los resultados se muestran en la Tabla 10 (valores de IC<50>dados en unidades ng/ml). Los datos indican que el conjugado tiene tubulisina M unida a través de un dipéptido -Val-Glumás hidrófilo preparado a partir de Fármaco Enlazador 113, que proporciona la liberación condicional por catepsina de Tubulisina M libre, y el conjugado preparado a partir de Fármaco Enlazador 104 que incorpora una unidad de glucurónido hidrófila, que proporcionan la liberación condicional por glucuronidasa de tubulisina M libre, son equipotentes al conjugado de control -Val-Ala- preparado a partir de Fármaco-Enlazador 32 para la liberación del fármaco libre condicional de catepsina. Todos los conjugados muestran un alto grado de especificidad inmunológica, con IC<50>> 1000 ng/ml en células de carcinoma hepatocelular antígeno-negativas Hep3B.
Tabla 10. Citotoxicidadi n v i t r ode conjugados de fármaco ligando que tienen tubulisina M cuaternizado dirigida a células de linfoma CD30+ con hidrofobicidad variable en la unidad enlazadora
Ejemplo 54:C i t o t o x i c i d a d e s in v i t r o d e c o n j u g a d o s d e f á r m a c o l i g a n d o q u e t ie n e n u n i d a d e s d e f á r m a c o n o c u a t e r n i z a d o s u n i d a s a u n i d a d e s e n l a z a d o r a s a t r a v é s d e l c o m p o n e n t e N - t e r m i n a l d e c o m p u e s t o s d e r i v a d o s d e t u b u l i s i n a
Antes de la presente invención, la conjugación con un fármaco que contiene una amina terciaria en la que se va a utilizar el nitrógeno amínico como punto de unión requería la eliminación de un sustituyente alquilo de la amina terciaria. La amina secundaria así obtenida permite que se vuelva a alquilar con un componente de unidad enlazadora para proporcionar un grupo funcional de amina terciaria completamente diferente o la acilación para proporcionar un grupo funcional de amida secundaria. En ambos enfoques se evita la liberación del fármaco original. Además, el resto de fármaco activo que se libera es un compuesto que contiene amina terciaria o amida diferente que puede tener una actividad biológica alterada en comparación con el fármaco original o es una amina secundaria que puede tener una cinética de liberación deficiente y/o una actividad biológica alterada. Determinar el resultado de aplicar la estrategia de eliminar un sustituyente alquilo de la amina terciaria de una tubulisina para proporcionar un punto de unión para una unidad de fármaco no cuaternizado des-metil-tubulisina M y des-metil-Tub(OCH<3>):OH (170) se prepararon de acuerdo con los procedimientos del documento WO 2013/085925 y Ejemplo 42 (ver Esquema 15), respectivamente. El compuesto 170 es análogo a la de desmetil-tubulisina M mediante la sustitución del sustituyente acetato unido a O del componente tubuvalina de desmetil tubulisina M con el resto éter unido a O -OCH<3>. La unidad enlazadora que tiene la fórmula general de M1-A-, abreviada como MC, en la que M1 es un resto maleimida y la unidad de extensión A es un alquileno, se une luego a des-metil-tubulisina M y desmetil-Tub(OCH<3>)-OH a través de un grupo funcional amida para proporcionar los compuestos de fármaco-enlazador 166 y 172, respectivamente. Cuando se incorporan en conjugados de fármaco ligando, los restos enlazadores de esos dos compuestos liberarán de forma no condicional un resto de fármaco activo que retiene un resto de unidad enlazadora (es decir, es un compuesto que contiene amida) o una amina secundaria como des-metil Tubulisina M o desmetil-Tub(OCH<3>)-OH, que resulta de la escisión inespecífica del enlace amida. Como se espera que el último tipo de liberación sea lento, los compuestos de Fármaco-Enlazador, como los compuestos 166 y 172, se caracterizan por ser eficazmente no escindibles.
Se prepararon conjugados anti-CD30 cACIO a partir de los compuestos de fármaco-enlazador 166 y 172, que se obtuvieron a partir de tubulisinas que contienen amina secundaria, a 8 fármacos/mAb y se compararon con las tubulisinas que contienen aminas terciarias tubulisina M y tubulisina (OCH<3>)-OH, que se conjugaron mediante la estrategia de amina cuaternaria de la presente invención. Los resultados como se muestra en la Tabla 11 (valores de IC<50>en unidades de ng/ml) indican que los conjugados de fármaco ligando de anticuerpo cAC10 a partir de los compuestos Fármaco-Enlazador 166 y 172 basándose en la estrategia de N-desalquilación de un compuesto que contiene amina terciaria para proporcionar la unión de una amina no cuaternaria de una unidad de fármaco tubulisina estaban inactivas en las líneas celulares de linfoma en comparación con los comparadores unidos a amina cuaternaria preparados a partir de los compuestos de fármaco-enlazador 104 (4° TubM) y 78 (4°Tub(OCH3)-OH), que libera fármaco libre que retiene la funcionalidad de amina terciaria del fármaco original.
Tabla 11. Comparación de conjugados de fármaco ligando de unidades de fármaco de tubulisina cuaternizada y no cuaternizado
Ejemplo 55.C i t o t o x i c i d a d in v iv o d e u n c o n j u g a d o d e l i g a n d o - f á r m a c o q u e t ie n e u n a a u r i s t a t i n a c u a t e r n i z a d a c o m o r e s t o D .
Se trató un modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy con una dosis única i.p. de la composición de la Tabla 4 que tiene cACIO como el resto de direccionamiento y vcPAB4-AE como unidad de fármaco cuaternizadaenlazador para el que el conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo predominante tiene 4 unidades D+ por anticuerpo (es decir, p' es 4). La comparación de ese conjugado se realizó con otro conjugado de cACIO, cuya construcción enlazador-fármaco se designa como vcPABC-MMAE (Figura 1). En ese LDC, se eliminó un sustituyente metilo de la amina terciaria de auristatina E (AE) para proporcionar monometil auristatina E (MMAE) que luego se conjugó a través de su amina secundaria a través de un carbamato a un resto autodestructivo de PAB activado por la escisión de catepsina de la misma unidad escindible valina-citrulina. Los resultados de esa comparación se muestran en la Figura 1. En esa Figura cAC10-C es el conjugado cAC10-vcPAB-MMAE carbamato, cAC10-vcPAB4-AE designado cAC10-14 es el conjugado cuaternizado de AE, y h00-C se refiere a h00-vcPAB-MMAE y h00-14 a h00-vcPAB4-AE, en donde hOO es un anticuerpo universal de no unión usado como unidad de ligando de control no dirigida. Los resultados de la Figura 1 demuestran que la citotoxicidadi n v i t r odel conjugado cuaternizado de AE cAC10, que se dirige a las células de linfoma de Hodgkin CD30+ y libera el fármaco libre que contiene amina terciaria (AE), se traducei n v i v ode una manera dependiente de la dosis y es superior al conjugado en el que se libera el correspondiente fármaco que contiene amina secundaria (MMAE). Los resultados de la administración de los conjugados correspondientes que se dirigen a un antígeno que no está presente en las células L540cy (el Ab monoclonal es hOO) son similares al tratamiento simulado. En particular, a la dosis más alta (2 mg/kg) ensayada, el conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo vcPAB4-AE provocó la ablación completa del tumor, que no rebotó durante el resto del estudio.
También se realizó una comparación entre el conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo dirigido contra CD30 que incorpora una unidad de fármaco AE cuaternizado y una unidad de glucurónido para la liberación condicional del fármaco de auristatina por una glucuronidasa y un conjugado similar en el que la unidad de fármaco MMAE no cuaternizado se une a la unidad de glucurónido a través de un carbamato. Por tanto, la composición de conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo gluc4-AE cuaternizado de la Tabla 4, de nuevo con el LDC predominante que tiene 4 unidades D+ por anticuerpo cAC10, con la composición de gluc-MMAE correspondiente. Los enlazadores gluc4-AE y gluc-MMAE también se conjugaron con hOO, que como se indicó previamente es una proteína universal que no se une (y por lo tanto no se une a las células de linfoma de Hodgkin L540cy) para proporcionar LDC de control. Los resultados se muestran en la Figura 2. En esa Figura 1, cAC10-glcu4-AE, designado cAC10-8, es el conjugado de AE cuaternizado, cAC10-B es el conjugado cAC10-gluc-MME unido a carbamato, y h00-gluc4-AE, designado como h00-8, y h00-glu-MMAE, designado como h00-B, son los respectivos conjugados de control. Al igual que con el conjugado cAC10-vcPAB4-AE, el resultadoi n v i t r ocon el conjugado cAC10-gluc4-AE, que libera una amina terciaria libre que contiene auristatina (AE), se ha traducido de una manera dependiente de la dosisin v iv oy es superior al conjugado correspondiente (cAC10-gluc-MMAE) que libera la versión desmetil de esa auristatina (MMAE). Además, la Figura 1 y la Figura 2 muestran que lose f e c t o s in v iv ode los conjugados cuaternizados son inmunológicamente específicos.
Ejemplo 56.C i t o t o x i c i d a d in v iv o d e u n c o n j u g a d o d e l i g a n d o f á r m a c o q u e t ie n e u n a t u b u l i s i n a c u a t e r n i z a d a c o m o r e s t o D y u n i d a d d e e s c i s i ó n d e p é p t i d o
Se evaluó un conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo cAC10, designado cAC10-32, que tiene un resto fármaco enlazador amina-tubulisina M cuaternaria que incorpora la unidad escindible -Val-Ala- preparada a partir del compuesto 32 de fármaco enlazador, en dos modelos de xenoinjerto CD30+, Karpas299 ALCL y linfoma de Hodgkin L540cy. Los resultados se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente. En ambos experimentos, a los ratones portadores de tumores se les administró una sola dosis i.p. del compuesto de prueba cuando el volumen promedio del tumor alcanzo los 100 mm3
En el modelo de xenoinjerto Karpas299 (ver Figura 5), el conjugado cACIO anti-CD30 dirigido a 4-fármacos/mAb indujo un retraso en el crecimiento del tumor después de una dosis de 0,3 mg/kg; mientras que una dosis más alta de 1 mg/kg resultó en regresiones completas y duraderas en 4 de 5 ratones. Por el contrario, el conjugado sin unión hOO no mostró actividad a la dosis de 1 mg/kg, lo que indica un alto grado de especificidad inmunológica.
Se observaron resultados similares en el modelo de xenoinjerto L540cy (ver Figura 6). El conjugado dirigido, anti-CD30 cargado con 6-fármacos/mAb indujo un retraso en el crecimiento del tumor después de una dosis de 0,3 mg/kg; mientras que una dosis más alta de 1 mg/kg resultó en regresiones completas y duraderas en 3 de 4 ratones.
Ejemplo 57.C i t o t o x i c i d a d in v iv o d e u n c o n j u g a d o d e l i g a n d o f á r m a c o q u e t i e n e u n a t u b u l i s i n a c u a t e r n i z a d a ( O - é t e r ) c o m o r e s t o D u n i d o a t r a v é s d e u n a u n i d a d d e g l u c u r ó n id o
Se evaluaron fármacos-enlazadores de amina cuaternaria basados en glucurónidos en el modelo de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy. Los conjugados de fármaco ligando de anticuerpo (ADC) preparados a partir de los compuestos 104, 79 y 80 de fármaco enlazador tienen unidades de fármaco D+ tubulisina M cuaternizado y éteres de tubulisina cuaternizado tubulisina (O-etilo) y tubulisina (O-propil) éter, respectivamente, que se unen por Unidades de glucurónido. Esos ADC, designados como cAC10-104, cAC10-79 y cAC10-80, respectivamente, fueron también comparados con cAC10-32, que tiene Tubulisina M cuaternizada como D+ e incorporar el dipéptido Val-Ala- como la unidad escindible. Todos los conjugados se cargaron a 4-fármacos/mAb para minimizar los efectos de ADC PK. A los ratones portadores de xenoinjertos de CD30+ L540cy se les administró una única dosis i.p. de compuestos de prueba a 0,6 o 2 mg/kg cuando el volumen tumoral medio alcanzó los 100 mm3. Como se muestra en la Figura 9, todos los ADC mostraron regresiones tumorales significativas durante 30 días. Al nivel de dosis más bajo de 0. 6 mg/kg de cAC10-32, los tumores en 4/5 ratones aumentaron de tamaño el día 36; mientras que todos los ratones tenían regresiones tumorales completas en ese momento después del tratamiento con 0,6 mg/kg de cAC10-104. Para los conjugados de fármaco ligando de anticuerpo derivados de los compuestos de enlace de fármaco 79 y 80 que presentan éteres de tubulisina cuaternizadas, se observó regresiones tumorales completas en ambas dosis en el día 36 del estudio.
Ejemplo 58.C i t o t o x i c i d a d in v iv o d e u n c o n j u g a d o d e l i g a n d o - f á r m a c o q u e t ie n e a u r i s t a t i n a s c u a t e r n i z a d a s a l t e r n a t i v a s c o m o r e s t o D u n i d o a t r a v é s d e u n a u n i d a d d e g l u c u r ó n id o
Se evaluaron los conjugados de fármaco ligando de anticuerpo (ADC) que tenían restos enlazadores de fármaco de amina cuaternaria glucurónido para la liberación dirigida de dolastatina 10 antimitótica y auristatina F y se prepararon a partir de los compuestos fármaco enlazador 177 y 189, respectivamente. Esos ADC se designan cAC10-l77 en la Figura 11 y cAC10-189 en la Figura 10.
cAC10-189 que tiene una carga de fármaco de 8 unidades de fármaco de auristatina F cuaternizada por anticuerpo se evaluó en modelo de xenoinjerto de linfoma L540cy Hodgkin en comparación con animales de control con dosis 1. p. únicas de 0,5 mg/kg y 2 mg/Kg. En el mismo estudio el ADC, designado cAC 10-78, preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador 78 en la que la tubulisina éter de Tub(OCH<3>)-OH está cuaternizada fue también probado. Para cAC10-78, la DAR fue de 6 éteres de tubulisina cuaternizada por anticuerpo. Ambos conjugados tienen la unidad de fármaco cuaternizada unida a unidades enlazadoras idénticas que incorporan una unidad de glucurónido. Los resultados se muestran en la Figura 10. Hasta el día 20, todos los compuestos de prueba mostraron regresión tumoral a ambos niveles de dosis.
El conjugado ligando fármaco de anticuerpo que tiene dolastatina amina cuaternaria 10 como el D+ se evaluó en el mismo modelo de xenoinjerto L540cy a dosis únicas i.p. de 0,4 mg/kg y 0,8 mg/kg en relación con la monometildolastatina 10, que se unió a la unidad de glucurónido a través de un grupo funcional carbamato. El conjugado ligando fármaco de anticuerpo (ADC) con dolastatina cuaternizada 10 preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador 177 que tiene la unidad de glucurónido se designa en la Figura 11 como cAC10-177, mientras que el ADC que tiene la unidad de fármaco no cuaternizado unido a la misma unidad de glucurónido se designa cAC10-183. Ambos ADC en comparación con sus respectivos controles no dirigidos h00-177 y h00-183 indujeron regresiones completas duraderas a la dosis más baja probada de 0,4 mg/kg, con 5/5 curas para la dolastatina 10 unida a amina cuaternaria (177) en comparación a 4/5 curas para la monometildolastatina 10 unida a carbamato (183). A la dosis más alta probada (0,8 mg/kg), el control hOO de no unión que porta dolastatina 10 unida a carbamato exhibió una regresión tumoral transitoria en comparación con un breve retraso en el crecimiento tumoral para la dolastatina 10 unida a amina cuaternaria. En última instancia, ambas construcciones de ADC mostraron especificidad inmunológica.
Ejemplo 59.Liberación intracelular de fármaco que contiene amina terciaria libre de una unidad de fármaco cuaternizada en un conjugado de fármaco y ligando.
Las líneas de células MDR que son CD71 se exponen a un LDC (1 Mg/ml) compuesta por un anticuerpo dirigido a CD71 (cOKT9) y un inhibidor de MDR cuaternizado (Tariquidar™). La composición de LDC designado como cOKT9-gluc4-T se obtuvo a partir del compuesto 36 del Esquema<6>y predominantemente contiene LDC que tienen<8>unidades D+ en donde D+ es Tariquidar cuaternizado. El LDC predominante de la composición, después de la hidrólisis controlada del sistema de anillos de succinimida, está representado por la estructura de:
en donde el resto Ab-S- está unido al carbono a o p en el ácido carboxílico M3; y p es<8>.
La concentración de fármaco administrado y retenido intracelularmente liberado del conjugado de fármaco y ligando se muestra en la Tabla 12 y se compara con la cantidad de fármaco intracelular (es decir, fármaco unido a pgp) que resulta del tratamiento de las células con 50 nM de fármaco libre. Con el tratamiento con LDC, los valores entre paréntesis son concentraciones extracelulares del inhibidor de MDR que se han filtrado de la célula diana, mientras que los valores entre paréntesis para el tratamiento con fármaco libre representan la cantidad de fármaco libre que permanece fuera de la célula.
Tabla 12: Suministro de fármaco intracelular mediante un conjugado de fármaco y ligando que tiene un inhibidor de MDR cuaternizado.
Los resultados de la Tabla 12 indican que el inhibidor de MDR Tariquidar se ha administrado de manera eficaz intracelularmente en células MDR. Cuando se analiza en términos de pmol de fármaco liberado de 10<6>células, la composición de cOKT9-glu4-T libera 50-80%de su carga de fármaco a las células diana.
Ejemplo 60.Cinética de la liberación de fármacos enzimáticos de una unidad de fármaco cuaternizada
Versiones de N-acetilcisteína (NAC) del conjugado carbamato cAC10-gluc-MMAE y los conjugados de fármaco ligando cAC10-gluc4-AE cuaternizado descritos en el Ejemplo 53 (es decir, cACIO se reemplaza con NAC, en donde p' para la estructura correspondiente es 1) se sometieron a 0,5 mg/ml o 1 mg/ml de glucuronidasa y se compararon con un control que no tenía glucuronidasa presente. Los resultados de la Figura 4 indicaron que la cinética de liberación de AE de la unidad de fármaco cuaternizada del conjugado NAC-gluc4-AE es comparable para la cinética de liberación de MMAE del conjugado NAC-gluc-MMAE, con liberación completa de AE que ocurre dentro de 3,5-4,5 horas en dependencia de la concentración de enzima. En la Figura 4, NAC<- 8>es el conjugado que tiene una unidad de fármaco cuaternizada que libera fármaco libre que contiene amina terciaria (AE) y NAC-B es el conjugado de carbamato NAC-gluc-MMAE que libera y la correspondiente desmetil auristatina (MmAE).
Ejemplo 61:Estabilidad ex vivo de conjugados de fármaco ligando que tienen una unidad de fármaco de auristatina cuaternizada.
En la Figura 3 se muestran las pérdidas de integridad de las composiciones de conjugado de fármaco y ligando cAC10-vcPAB4-AE y cAC10-gluc4-AE del Ejemplo 55 después de la incubación en plasma de ratón y rata. En la Figura 3 el conjugado gluc4-AE se designa cAC10-8 y el conjugado vcPAB4-AE se designa cAC10-14. Los resultados indican que ambos tipos de construcciones de fármaco enlazador cuaternizado tienen buena estabilidad y no liberan prematuramente el fármaco que contiene amina terciaria libre. Los conjugados y tubulisina cuaternizada y los sistemas modelo de conjugados de dímero de fenazina y tarquidar cuaternizados en los que está presente N-acetilcisteína en lugar de un anticuerpo de direccionamiento también se sometieron a las mismas condiciones experimentales. En esos casos tampoco hubo liberación prematura de fármaco libre.
Ejemplo 62.Estabilidad in vivo de conjugados de fármaco ligando que tienen una unidad de fármaco tubulisina(O-acilo) cuaternizado.
Se recogieron muestras de plasma del estudio de xenoinjerto L540cy del Ejemplo 56, Figura 6, el cual estudió la citotoxicidad dirigida de ADC cAC10-32, de todos los ratones 4 y 10 días después de la dosis (días de estudio 11 y 17, respectivamente) para evaluar el grado de desacetilación de tubulisina M. Se sabe que la pérdida de acetato de tubuvalina da como resultado la desactivación de la tubulisina. Por ejemplo, la desacetilación de tubulisina U, que forma tubulisina V, resultó en una pérdida de potencia> 100 veces (J. Med. Chem., 2009, 52, 238-240.). Las muestras de plasma del xenoinjerto L540cy del Ejemplo 56 a los 4 y 10 días después de la dosificación se procesaron para capturar ADC, el fármaco se liberó enzimáticamente y el grado de desacetilación se cuantificó mediante espectrometría de masas. Cuatro días después de la inyección (Figura 7), la carga útil del fármaco tubulisina conjugada fue desacetilada> 40 % en los tres niveles de dosis. Diez días después de la dosis (Figura 8), el grado de desacetilación fue> 70 % en todos los niveles de dosis. Estos hallazgos sugieren que el ADC circulante está experimentando una pérdida de potencia de la carga útil en función del tiempo, quizás atenuando la actividadin vivo.
Ejemplo 63:Evaluación farmacocinética (PK) de conjugados de fármaco ligando que tienen una tubulisina cuaternizada como unidad de fármaco D+.
Se realizaron experimentos farmacocinéticos (PK) mediante el uso de anticuerpo o ADC radiomarcados. Los compuestos de prueba PK se marcaron radiactivamente mediante el uso del siguiente procedimiento. A una solución de anticuerpo o ADC en PBS suplementado con fosfato de potasio 50 mM adicional (pH 8,0) y cloruro sódico 50 mM se añadió 55 pCi de propionato de N-succinimidilo, [propionato-2,3-3H]- (Moravek Biochemicals, cat. núm.: MT 919, 80 Ci/mmol, 1 mCi/ml, solución 9:1 de hexano:acetato de etilo) por mg de anticuerpo o ADC. La mezcla resultante se agitó con vórtice y se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se centrifugó a 4000 g durante 5 minutos y la capa acuosa inferior se retiró y se dividió en unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore, cat. núm.: UFC903024, MWCO de 30 kDa). La radiactividad no conjugada se eliminó mediante 4 rondas de dilución y centrifugación a 4000 g. Los productos resultantes se filtraron a través de unidades de filtro centrífugo Ultrafree-MC estériles de 0,22 pm (Millipore, cat. núm.: UFC30GV0S) y la concentración final de anticuerpo o ADC se midió mediante espectrofotometría. La actividad específica (pCi/mg) de cada producto se determinó mediante conteo de centelleo líquido.
Se examinaron las propiedades farmacocinéticas del anticuerpo no conjugado o el ADC en varios experimentos. En cada experimento, se inyectó 1 mg de ADC o anticuerpo radiomarcado por kg de peso del animal a través de la vena de la cola. Cada compuesto de prueba se dosificó una vez en animales replicados. Se extrajo sangre en tubos con K2EDTA a través de la vena safena o mediante punción cardíaca para las hemorragias terminales en varios momentos. El plasma se aisló mediante centrifugación durante 10 minutos a 10000 g. Se añadió una muestra de 10-20 pl de plasma de cada punto de tiempo a 4 ml de coctel de centelleo líquido Ecoscint-A (National Diagnostics) y se midió la radiactividad total mediante conteo de centelleo líquido. Los valores resultantes de desintegraciones por minuto se convirtieron a pCi y se usó la actividad específica de los compuestos de prueba radiomarcados para calcular la concentración de anticuerpo o ADC que quedaba en el plasma en cada momento.
La Figura 12 muestra los perfiles de exposición para conjugados preparados a partir del Compuesto de Fármaco-Enlazador mDPR-Val-Ala-pAB4-TubM (32) y los análogos 113 de enlazador hidrófilos descritos en el Ejemplo 51. El ADC con unidad de ligando de IgG humanizado y DAR 4 de tubulisina M cuaternizado preparada a partir del compuesto 32 de fármaco-enlazador, que tiene una unidad escindible de dipéptido -Val-Ala y se designa como hlgG-32(4), tenía un perfil de aclaramiento idéntico al del anticuerpo no modificado; sin embargo, el ADC en DAR de 8, designado como hIgG-32(8), el ADC se eliminó de la circulación mucho más rápidamente. El ADC correspondiente con DAR 8 preparado a partir del compuesto 113 de Fármaco Enlazador designado hIgG-113(8) en el que el residuo de alanina en la unidad escindible se sustituye con glutamato no dio como resultado un aumento de la exposición. Con hIgG ADC designado hIgG-104(8) preparado a partir del compuesto 104 de fármaco enlazador en el que la unidad escindible de dipéptido hidrófobo de hIgG-32(8) se reemplaza por la unidad de glucurónido más polar, se observó una ligera mejora en la eliminación
La Figura 13 contiene las exposiciones de PK para los conjugados DAR<8>hOO que tienen el compuesto de éter de tubulisina unido a amina cuaternaria de glucurónido Tub(O-Pr)-OH preparado a partir del compuesto de enlace de fármaco (80). Ese conjugado de fármaco y ligando de anticuerpo hOO que porta<8>copias del resto fármaco enlazador derivado de mDPR-gluc4-Tub(OPr)-OH 80 se eliminó de la circulación mucho más rápidamente que el anticuerpo no modificado.
La Figura 14 muestra las propiedades de aclaramiento de conjugados de fármaco ligando de anticuerpo DAR<8>hOO (hOO ADC) que tienen restos de fármaco enlazador compuestos por una unidad de glucurónido y citotoxina auristatina E o dolastatina 10 como unidades de fármaco D+ cuaternizados y los conjugados equivalentes que tienen unidades de fármaco unidas a carbamato como unidad de fármaco no cuaternizado en las que se ha eliminado un grupo metilo de AE y dolastatina 10 (es decir, conjugados de Unidades de fármaco no cuaternizados MMAE y monometil-dolastatina 10). El ADC hOO con el resto fármaco enlazador de auristatina E de amina cuaternaria glucurónido preparado a partir del compuesto 8 de fármaco enlazador proporcionó propiedades PK idénticas a las del anticuerpo no modificado durante 7 días. Sin embargo, el conjugado de ADC hOO que tiene la monometilauristatina E unida a carbamato no cuaternizada designada h00-B provocó un aclaramiento de ADC acelerado. Por el contrario, el h00-ADC que tiene dolastatina 10 cuaternizada preparada a partir del compuesto 177 fármaco enlazador y designado como h00-177, y el ADC h00 que tiene monometidolastatina 10 no cuaternizada unida a la unidad enlazadora mediante un grupo funcional carbamato, que se prepara a partir el compuesto de carbamato Fármaco Enlazador 183 y designado como h00-183, se eliminó más rápidamente que el anticuerpo desnudo y tuvo exposiciones similares.
Ejemplo 64:Comparación in vitro entre la citotoxicidad in vitro de tubulisina M-hidrazida y fármaco tubulisina M hidrazida como fármacos libres.
Se ha descrito una estrategia C-terminal para conjugar tubulisinas como análogos de hidrazida (Cancer Res., 2008,<6 8>, 9839-9844) previamente para la tubulisina B. Este enfoque es una alternativa a la estrategia de amina cuaternaria descrita en la presente descripción y la estrategia de conjugación N-terminal no escindible del Ejemplo 54, e implica la derivatización del componente tubulisina C-terminal(véase elEjemplo 47). La tubulisina M-hidrazida (190) se evaluóin vitrocomo fármaco libre en relación con la tubulisina M no modificada (26) a través de un panel de líneas celulares; las células se trataron durante 96 horas y los resultados se muestran en la Tabla<11>(valores de IC<50>en concentración nM).
Tabla 13. Comparación de lacitotoxicidad in vitrode tubulisina M y tubulisina M hidrazida como fármacos libres
La tubulisina M-hidrazida fue consistentemente menos potente que el fármaco libre de origen, tubulisina M, en todas las líneas celulares probadas. La pérdida de potencia del derivado de hidrazida varió de 4 a 25 veces en las cuatro líneas celulares.
Ejemplo 63.Comparación in vitro de tubulisina M como un resto fármaco enlazador hidrazida carbamato Val-Cit-PABN no cuaternizado en comparación con tubulisina M Val-Ala-PAB4 cuaternizada.
El compuesto fármaco-enlazador MC-vaPAB4-TubM (30) de tubulisina M de amina cuaternaria de Val-Ala y el compuesto fármaco-enlazador mDPR-Val-Cit-PABN (192) de tubulisina M-hidrazida unida a carbamato se conjugaron con cOKT-9, una IgG anti-receptor de transferrina. Brevemente, cOKT-9 se redujo completamente con T C E P para revelar<8>residuos de cisteína conjugables. Los tioles resultantes se alquilaron con los compuestos Fármaco Enlazador 30 y 192 que contenían maleimido, añadidos en exceso. Se encontró que los conjugados de cOKT-9 estaban cargados a<8>y 6,7 fármacos/mAb para los enlazadores 30 y 192, respectivamente. Se trató un panel de líneas de células cancerosas con los conjugados resultantes durante 96 horas y se evaluó su viabilidad. Los resultados se muestran en la Tabla 1 con IC<50>dadas en unidades de ng/ml.
Tabla 14. Citotoxicidadin vitrode un conjugado de fármaco y ligando de tubulisina cuaternizada dirigido al receptor de transferrina en comparación con el conjugado de fármaco y ligando de tubulisina no cuaternizada que tiene unión al componente C-terminal.
El conjugado que porta TubM-hidrazida (192) fue significativamente menos potente que el comparador TubM (30) unido a amina cuaternaria. La tubulisina derivatizada osciló entre 1 y 3 logaritmos menos potente que la tubulisina M parental.
Ejemplo 65:Evaluación in vitro de auristatina F unida a través de un enlazador de amina cuaternaria de glucurónido.El conjugado de fármaco y ligando (ADC) de anticuerpo cOKT9 preparado a partir del compuesto 189 de fármaco enlazador de auristatina F de amina cuaternaria glucurónido se preparó como se describe y se conjugó a 8-fármacos/Ab para cOKT-9, un anticuerpo anti-receptor de transferrina. El ADC resultante se probó en un panel de líneas de células cancerosas para compararlo con el ADC correspondiente preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador-carbamato MC-Val-Cit-PABC-MMAF 193 (Bioconjugate Chem., 2006, 17, 114-124). Los resultados se muestran en la Tabla 13.
Tabla 15. Citotoxicidad de un conjugado de fármaco ligando de auristatina F cuaternizada dirigido al receptor de transferrina en comparación con un conjugado de fármaco ligando de auristatina no cuaternizada correspondiente
El conjugado que tiene auristatina F como una unidad de fármaco de amina cuaternaria preparado a partir del compuesto fármaco-enlazador 189, que tiene una unidad de glucurónido y el precursor LSS autoestabilizante mDPR, proporciona una citotoxicidad similar a la que se muestra en la Tabla 14 (valores de IC<50>en unidades de ng/ml) a un ADC preparado a partir del compuesto 193 Fármaco-Enlazador Val-Cit PAB (vcPABC)-MMAF carbamato en la mayoría de las líneas celulares. En contraste con el Compuesto 189, ese compuesto de Fármaco-Enlazador tiene una unidad enlazadora que no contiene un precursor de L<ss>y está compuesto por una unidad escindible de dipéptido. En las líneas celulares de AML HL60 y HL60/RV se observó una modesta disminución (de 2 a 3 veces) en la potencia con respecto al control Val-Cit-PABC carbamato obtenido a partir de 193.
Ejemplo 66:Citotoxicidad de conjugados de fármaco ligando de dímero de fenazina cuaternizada dirigidos a células cancerosas.
El compuesto fármaco-enlazador de dímero de fenazina, amina cuaternaria, 19 se conjugó con anticuerpos quiméricos AC10 y 1F6 humanizado, que son anticuerpos anti-CD30 y anti-CD70, respectivamente, a DAR de 4 fármacos por anticuerpo. Los conjugados se probaron en dos líneas celulares de linfoma CD30+, Karpas299 y L540cy, y dos líneas celulares de carcinoma de células renales positivas para CD70, 786-O y Caki-1. Los datos se muestran en la Tabla 16 (valores de IC<50>en unidades de ng/ml).
Tabla 16. Citotoxicidad de conjugados fármaco ligando de dímero de fenazina cuaternizados dirigidos a células cancerosas CD30+ o CD70+
El conjugado de unión anti-CD30, cAC10-19, fue potente en la línea Karpas299 LACG; mientras que su control, h1F6-19, que no reconoce el antígeno CD30, era inactivó, lo que indica un alto grado de especificidad inmunológica. Tanto los conjugados cAC10-19 y h1F6-19 fueron inactivos en las células L540cy CD30+/CD70+. En las células RCC CD30 negativas/CD70 positivas el conjugado específico de antígeno CD70, h1F6-19, fue significativamente más potente que su conjugado de control cAC10-19, que no reconoce el antígeno CD70.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición de conjugado ligando-fármaco (LDC) para su uso en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad autoinmune, en la que la composición LDC está representada por la estructura de Fórmula 1:
  2. donde "Ligando es una Unidad Ligando (L), en la que L es capaz de unirse selectivamente a una fracción diana, y L es un anticuerpo o fragmento del mismo para definir un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), en el que la fracción diana es un antígeno capaz de unirse selectivamente al ADC, y en el que el antígeno es una proteína, glicoproteína o carbohidrato de la superficie celular accesible extracelularmente que se muestra preferentemente en células anormales en comparación con células normales, en el que las células anormales y normales son células de un mamífero, en el que las células anormales son células hiperproliferantes; Lb es un enlazador primario; Q1 es Aa-Ww, en el que A es una unidad de extensión opcional de modo que el subíndice a es 0 cuando A está ausente o 1 cuando A está presente y comprende dos, tres o cuatro subunidades; Q2 es W'w-E-, en el que Q2, cuando está presente, está unido a V, Z1, Z2, o Z3; Ww y Ww son unidades escindibles, en las que Ww de Q1 es capaz de ser escindida selectivamente por una proteasa intracelular o reguladora en comparación con las proteasas del suero, o por el glutatión a través del intercambio de disulfuro, o es más reactiva a la hidrólisis en condiciones más ácidas presentes en los lisosomas en comparación con el pH fisiológico del suero, W 'w-E de Q2 proporciona un enlace glicosídico escindible por una glicosidasa localizada intracelularmente, y el subíndice w es 0 o 1, de modo que Ww está ausente cuando w es 0 o Ww está presente cuando w es 1, y el subíndice w' es 0 o 1, en el que W'w-E está ausente cuando w' es 0 o W'w-E está presente cuando w' es 1, y en el que w w' es 1, de modo que uno y sólo uno de Ww, W'w-E está presente; V, Z1, Z2, y Z3 son =N- o =C(R24)-, donde R24 es hidrógeno, alquilo, alquenilo o alquino opcionalmente sustituido, o halógeno, -NO<2>, -CN, otro grupo de retirada de electrones, un grupo donador de electrones, -Q2, o -C(R8)(R9)-D+, donde al menos uno de V, Z1, Z2 y Z3 es =C(R24)- cuando w es 1, y al menos dos de V, Z1, Z2, y Z3 son =C(R24)- cuando w' es 1; siempre que cuando w sea 1, Q2 esté ausente, uno y sólo un R24 sea -C(R8)(R9)-D+, de modo que C(R8)(R9)-D+ esté enlazado a uno de V, Z1, Z2, Z3 cuando dicho grupo variable sea =C(R24)-, y los sustituyentes Q1-J- y -C(R8)(R9)-D+ seanortooparaentre sí, siempre que cuando w' es 1, uno y sólo un R24 es -C(R8)(R9)-D+, de modo que -C(R8)(R9)-D+ está enlazado a uno de V, Z1, Z2, Z3 cuando ese grupo variable es =C(R24)-, y uno y sólo un R24 es Q2, de modo que Q2 está enlazado a otro de V, Z1, Z2, Z3 cuando ese grupo variable es =C(R24)-, y los sustituyentes Q2 y -C(R8)(R9)-D+ sonortooparaentre sí; R8 y R9 son independientemente hidrógeno, o alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; R' es hidrógeno, halógeno, -NO<2>, -CN, otro grupo de retirada de electrones o un grupo donador de electrones; E y J independientemente son -O-, -S-, o -N(R33)-, donde R33 es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; D+ representa una estructura de un fármaco que contiene amina terciaria cuaternizada; y el subíndice p es una carga media de fármaco con un número comprendido entre 1 y 24; y en el que dicha escisión por una proteasa intracelular o reguladora, por glutatión a través del intercambio de disulfuro, por hidrólisis ácida, o por una glicosidasa resulta en la liberación del fármaco que contiene amina terciaria (D) de un compuesto conjugado ligando-fármaco de la composición. 2. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que la estructura de la composición está representada por la estructura de Fórmula 2A o Fórmula 2B:
  3. 3. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que la estructura de la composición está representada por la estructura de la Fórmula 3A, Fórmula 3B, Fórmula 3C, Fórmula 3D, Fórmula 3E o Fórmula 3F:
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