ES2988357T3 - Polipéptidos que modulan las respuestas inmunes dependientes de SIGLEC - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un polipéptido glicosilado que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica u homóloga a al menos un fragmento de una proteína de mamífero, preferiblemente humana, en donde dicho polipéptido glicosilado contiene uno o más O-glicanos sialilados y en donde el polipéptido glicosilado muestra una afinidad de unión aumentada a uno o más SIGLEC, seleccionados entre SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 en comparación con la proteína de mamífero o fragmento de la misma. La invención se refiere además a una composición que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido es un polipéptido glicosilado que contiene uno o más O-glicanos sialilados y el segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a una segunda proteína de mamífero, en particular humana, en donde en comparación con el segundo polipéptido la composición tiene una afinidad de unión aumentada a un SIGLEC seleccionado entre uno o más SIGLEC, seleccionados entre SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos que modulan las respuestas inmunes dependientes de SIGLEC

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a polipéptidos glicosilados basados en una proteína de mamífero que exhiben una respuesta inmunitaria reducida o una tolerancia inmunitaria aumentada debido a la unión modulada de SIGLEC y a métodos de tratamiento que utilizan el polipéptido glicosilado. La invención se refiere además a complejos proteicos que exhiben una respuesta inmunitaria reducida o una tolerancia inmunitaria aumentada debido a la unión modulada de SIGLEC y a métodos de tratamiento que utilizan los complejos proteicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que obstaculizan la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación sanguínea. En su forma más común, la hemofilia A, el factor de coagulación VIII (FVIII) es deficiente. La hemofilia A se presenta en aproximadamente 1 de cada 5.000-10.000 nacimientos de varones. La proteína FVIII es un cofactor esencial en la coagulación sanguínea con propiedades multifuncionales. La deficiencia de FVIII se puede tratar con concentrados de FVIII derivados del plasma o con FVIII producido de forma recombinante. El tratamiento con concentrados de FVIII ha llevado a una vida normalizada de los pacientes con hemofilia. Históricamente, la hemofilia A se ha tratado con FVIII procedente del plasma sanguíneo humano. En el plasma sanguíneo, en condiciones normales, la molécula de FVIII siempre está asociada a su cofactor; el factor de von Willebrand (vWF), que estabiliza la molécula de FVIII frente a diferentes formas de degeneración.

[0003] Se han descrito muchos procedimientos para la purificación del Factor VIII a partir de plasma o cultivos que producen de forma recombinante el Factor VIII (rFVlll) con o sin la presencia del Factor de von Willebrand. En los años 90 se comercializaron los primeros productos de FVIII recombinante (rFVlll), divididos en moléculas de rFVIII de longitud completa, imitando la forma principal de FVIII en el plasma sanguíneo, y moléculas de rFVIII con el dominio B eliminado (Eriksson et al., 2001), en las que se ha eliminado una porción inactiva (el dominio B), ambas con un alto grado de pureza (todas sin vWF).

[0004] Los pacientes con hemofilia A son tratados con FVIII a demanda o como terapia profiláctica administrada varias veces a la semana. Para el tratamiento profiláctico se administran 15-25 IU/kg de peso corporal de FVIII tres veces por semana, lo cual es necesario debido a la necesidad constante de FVIII y su corta vida media en el sistema sanguíneo, que en humanos es de solo alrededor de 11 horas. (Ewenstein et al., 2004).

[0005] En casos frecuentes, el tratamiento constante con FVIII administrado exógenamente causa una respuesta del sistema inmunológico del paciente (Saenko et al., Haemophilia 8:1-11 (2002)), lo que presenta una limitación grave para la terapia.

[0006] Actualmente, la opción más común para lograr tolerancia inmunológica en pacientes con hemofilia A (deficiencia congénita de FVIII) e inhibidores es la inducción de tolerancia inmunológica (ITI), donde se administran dosis altas de FVIII durante períodos prolongados de tiempo. Sin embargo, el tratamiento puede durar hasta dos años, no tiene éxito en aproximadamente el 30 % de los pacientes, es extraordinariamente costoso y no se puede utilizar de manera profiláctica para suprimir el desarrollo inicial de anticuerpos inhibidores.

[0007] Por lo tanto, se necesitan enfoques para atenuar la respuesta inmunitaria. Un enfoque prometedor es la optimización de la glicosilación de FVIII o de su socio de unión vWF.

[0008] Por ejemplo, el documento WO 2014/176125 A1 se refiere a conjugados inmunitarios para inducir tolerancia inmunitaria específica de antígeno a FVIII. Los conjugados inmunitarios son proteínas FVIII conjugadas con ligandos de glucanos específicos que se dirigen a SIGLEC expresados en células B, a saber, SIG-1 o SIG-10 (o el ortólogo SIG-G). Los ligandos de glucanos están acoplados en particular a liposomas en los que se introduce FVIII.

[0009] Las lectinas de inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (SIGLEC) comprenden una familia de 15 receptores de superficie celular humanos y 9 murinos que se expresan en varios glóbulos blancos del sistema inmunológico con la excepción de la mayoría de las células T en ratones y humanos. Las SIGLEC se encuentran en diferentes tipos de células y se unen a diferentes estructuras de glicanos (revisadas en Paulson et al., 2012). Por ejemplo, se ha demostrado una unión de vWF y FVIII a SIG-5 (Pegon 2012). Sin embargo, el mecanismo de unión sigue siendo desconocido.

[0010] Un enfoque diferente se describe en WO 2014/179184 A1. Los autores sugieren reducir las respuestas inmunitarias de anticuerpos no deseadas e inducir la tolerancia inmunitaria de los factores de coagulación sanguínea, como el FVIII, mediante la adición de ligandos SIGLEC. Los ligandos SIGLEC se seleccionan de 9-N-bifenilcarboxil-NeuAca2-6Gal~I-4GlcNAc (6'-BPCNeuAc), NeuAca2-6Galwl-4GlcNAc y NeuAca2-6Galwl-4(6-sulfo)GlcNAc. El ligando SIGLEC está unido al factor de coagulación a través de un polímero soluble en agua.

[0011] Lai et al. (2015) es un artículo de revisión que examina tres factores distintos que contribuyen al destino del FVIII casi inmediatamente después de la infusión, a saber, las características de la proteína, la célula y el microambiente.

[0012] Solecka et al. (2016) describe un análisis específico del sitio de la O-glicosilación de vWF.

[0013] Canis et al. (2009) es un estudio adicional que investiga los sitios de O-glicosilación en vWF derivado de plasma humano.

[0014] Lenting et al. (2012) es un artículo de revisión sobre la estructura y función de vWF. El artículo analiza los atributos únicos de vWF con respecto a su estructura multimérica y los mecanismos inusuales que regulan su participación en el proceso hemostático.

[0015] El documento WO 2013/120939 A1 se refiere a un polipéptido vWF modificado con una afinidad de unión aumentada a FVIII, así como a un complejo que comprende FVIII y el polipéptido vWF modificado.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0016] La presente invención se basa, entre otras cosas, en el hallazgo de que la estructura de glicano que se produce de forma natural en las proteínas derivadas del plasma, en particular vWF, permite una interacción con un grupo de SIGLEC, en particular SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. Además, los inventores descubrieron que mediante la modificación de la estructura de los glicanos de una proteína se puede aumentar la interacción con las SIGLEC, como SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. Este aumento conduce a una respuesta inmunitaria reducida y/o a una mayor tolerancia inmunitaria del paciente al que se administra la proteína.

[0017] Por tanto, según un primer aspecto, la invención proporciona un polipéptido glicosilado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a al menos un fragmento de vWF humano (SEQ ID NO: 1), en donde dicho polipéptido glicosilado contiene uno o más grupos de sitios de O-glicosilación, en donde dichos grupos contienen al menos dos sitios de O-glicosilación y uno o más O-glicanos sialilados, en donde el número combinado de O-glicanos sialilados de núcleo 2 y núcleo extendido 1 del polipéptido glicosilado es mayor que el número de O-glicanos sialilados de núcleo 2 y núcleo extendido 1 del vWF humano o su fragmento y en donde el polipéptido glicosilado muestra una afinidad de unión aumentada a uno o más SIGLEC, seleccionados del grupo que consiste en SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 en comparación con el vWF humano o su fragmento.

[0018] Los inventores han definido específicamente una estructura de glicano que, por un lado, es necesaria para la interacción con los SIGLEC, pero cuya adición también conduce a una mayor unión a los SIGLEC. Los responsables de esto son los O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o los O-glicanos núcleo 1 extendidos.

[0019] Una proteína con una composición de glicano que incluye O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o O-glicanos núcleo 1 extendidos sialilados, en particular O-glicanos núcleo 2 sialilados, se puede utilizar para modificar la respuesta inmunitaria de un paciente a una proteína terapéutica mediante administración combinada.

[0020] Así, según un segundo aspecto la invención se refiere al uso de un VWF humano que contiene uno o más O-glicanos sialilados y que exhibe una unión incrementada a uno o más SIGLECs, seleccionados de SIG-5, SIG-7, SIG-8, y SIG-9 para reducir la respuesta inmune de una segunda proteína o incrementar la tolerancia inmune de un paciente a una segunda proteína, en donde la segunda proteína es en particular una proteína terapéutica.

[0021] Usando la modificación del polipéptido glicosilado con una afinidad de unión a SIGLECs no sólo es posible modificar directamente la afinidad de unión a SIGLEC del propio polipéptido modificado, sino también de un complejo o composición proteica, del cual el polipéptido glicosilado es una parte, tal como el complejo de factor VIII (FVIII) y factor von-Willebrand (vWF).

[0022] Por lo tanto, según un tercer aspecto, la invención proporciona una composición proteica que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido es un polipéptido glicosilado según el primer aspecto y el segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a una segunda proteína de mamífero, en particular humana, en donde - en comparación con el segundo polipéptido - la composición tiene una afinidad de unión aumentada a uno o más SIGLEC seleccionados entre SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. El primer y el segundo polipéptido de la composición según el tercer aspecto forman preferiblemente un complejo proteico.

[0023] Según un cuarto aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido glicosilado según el primer aspecto de la invención. En un quinto aspecto, la invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un polinucleótido según el cuarto aspecto de la invención.

[0024] El polipéptido glicosilado según el primer aspecto, en particular vWF o FVIII y la composición según el tercer aspecto, en particular un complejo de FVIII y vWF, son - debido a la respuesta inmune reducida - particularmente útiles en el tratamiento médico.

[0025] Por lo tanto, según un cuarto aspecto, la invención proporciona un polipéptido glicosilado definido según el primer aspecto o una composición definida según el tercer aspecto para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno hemorrágico.

FIGURAS

[0026]

La figura 1 muestra los resultados de una prueba de unión de vWF a diferentes SIGLEC. La absorbancia a 492 nm es proporcional al vWF unido al SIGLEC identificado respectivamente o a los controles. SIG-2, SIG-5, SIG-7, SIG-F, SIG-9 y SIG-10 se inmovilizaron mediante proteína A en una placa de microtitulación a 500 ng/pocillo. Se añadió vWF biotinilado a una concentración de 0 a 0,8 mg/ml y después del lavado, se visualizó la unión con estreptavidina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó anti-vWF y anti-IgY de pollo como control.

La figura 2 muestra una representación esquemática de la estructura del dominio vWF, incluyendo N- y O-glicosilación, sitios de escisión de la proteasa V8 y fragmentos resultantes después de la escisión de la proteasa V8.

La figura 3 muestra los resultados de una prueba de unión de un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal de vWF a SIGLEC SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9. La absorbancia a 492 nm es proporcional al fragmento de vWF unido al SIGLEC identificado respectivamente o al control. SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 se inmovilizaron mediante proteína A en una placa de microtitulación a 500 ng/pocillo. Se añadieron el fragmento de VWF N-terminal biotinilado (barras de color gris oscuro) y el fragmento de VWF C-terminal (barras de color gris claro) a una concentración de 1 mg/ml y, tras el lavado, se visualizó la unión con estreptavidina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó IgY anti-pollo como control negativo.

La figura 4 muestra los resultados de una prueba de unión del fragmento de vWF N-terminal, en forma desialilada, des-N-glicosilada y sin tratar. La absorbancia a 492 nm es proporcional al fragmento de vWF N-terminal unido al SIGLEC identificado respectivamente o al control. El fragmento de VWF N-terminal antes de la digestión está representado por barras blancas, el fragmento des-N-glicosilado por PNGasa F por barras grises y el fragmento desialilado por barras negras. SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 se inmovilizaron a través de proteína A en una placa de microtitulación a 500 ng/pocillo. Los fragmentos de vWF N-terminal biotinilados (antes de la digestión, digeridos con PNGase For Sialidase A) se añadieron a una concentración de 8 mg/mL y después del lavado, se visualizó la unión con estreptavidina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó IgY anti-pollo como control.

La figura 5 muestra los resultados de una prueba de unión del Cluster I y Cluster II de O-glicosilación a SIGLEC. La absorbancia a 492 nm es proporcional al fragmento del Cluster I (barras de color gris claro) o al fragmento del Cluster II (barras de color gris oscuro) unido al SIGLEC identificado respectivamente o al control. Los SIG-5, SIG-7, SIG-F, SIG-9 y SIG-10 se inmovilizaron mediante proteína A en una placa de microtitulación a 500 ng/pocillo. Se añadieron los Cluster I y Cluster II biotinilados a una concentración de 4 mg/mL y, tras el lavado, se visualizó la unión con estreptavidina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó IgY anti-pollo como control negativo.

La figura 6 muestra los resultados de una prueba de unión del Cluster II de O-glicosilación a SIGLEC antes y después del tratamiento con Sialidasa A. La absorbancia a 492 nm es proporcional al fragmento del Cluster II sin tratar (barras de color gris claro) o al fragmento del Cluster II digerido con Sialidasa A (barras de color gris oscuro) unido al SIGLEC identificado respectivamente o al control. SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 se inmovilizaron a través de proteína A en una placa de microtitulación a 500 ng/pocillo. Se añadió el grupo II biotinilado antes de la digestión (barras de color gris claro) y se digirió con sialidasa A a una concentración de 2 mg/ml y, después del lavado, se visualizó la unión con estreptavidina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó IgY anti-pollo como control negativo.

La figura 7 muestra una representación esquemática de los fragmentos de vWF expresados de forma recombinante Seq11 y Seq12.

La figura 8 muestra los espectros de espectroscopia de masas MALDI del O-glicopéptido aislado de Seq11 después de la digestión tríptica/quimotríptica; digestión con sialidasa A y enriquecimiento con lectina. La secuencia peptídica identificada es KVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLY VEDISEPPLHGSAW (SEQ ID NO: 6), los últimos cuatro aminoácidos (subrayados) corresponden a la etiqueta unida al extremo C de la secuencia. El espectro superior muestra el glicopéptido completamente O-glicosilado, el espectro inferior muestra el mismo glicopéptido después de la digestión con O-glicosidasa.

La figura 9 muestra los espectros MALDI MS del O-glicopéptido aislado de Seq12 después de la digestión tripsíptica/quimotripsina; digestión con sialidasa A y enriquecimiento con lectina. La secuencia peptídica identificada es KVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLY VEDISEPPLHQEPGGL VVPPTDAPVSPTTL YVEDISEPPLHQEPGGL VV PPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHGSAW (SEQ ID NO: 7), los últimos cuatro aminoácidos (subrayados) corresponden a la etiqueta unida al extremo C de la secuencia. El espectro superior muestra el glicopéptido completamente O-glicosilado, el espectro inferior muestra el mismo glicopéptido después de la digestión con Oglicosidasa.

La figura 10 muestra los resultados de una prueba de unión de los polipéptidos recombinantes Seq11 y Seq12 a SIGLEC. La absorbancia a 492 nm es proporcional a Seq11 (barras de color gris oscuro) o Seq12 (barras de color gris claro) unidos a los SIGLEC identificados respectivamente o al control. SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 se inmovilizaron mediante proteína A en una microplaca a 500 ng/pocillo. Se aplicaron secuencias con etiqueta Strep en la placa a concentraciones molares iguales de 42 nM y, después del lavado, se visualizó la unión con estreptactina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó anti-IgY de pollo como control negativo y anti vWF pAb como control positivo.

La figura 11 muestra los resultados de una prueba de unión de los polipéptidos recombinantes Seq11 y Seq12 después del tratamiento con sialidasa A a SIGLEC. La absorbancia a 492 nm es proporcional a Seq11 (barras gris oscuro) o Seq12 (barras gris claro) unidos al SIGLEC identificado respectivamente o al control. SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 se inmovilizaron a través de la proteína A en una placa de microtitulación a 500 ng/pocillo. Las secuencias portadoras de etiqueta Strep se desialilaron enzimáticamente y se aplicaron en la placa a concentraciones molares iguales de 42 nM y después del lavado, se visualizó la unión con estreptomicina conjugada con HRP y se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó IgY anti-pollo como control negativo y pAb anti-vWF como control positivo.

La figura 12 muestra los resultados de una unión dependiente de la concentración del polipéptido recombinante Seq11 a SIGLEC y el análisis de Scatchard de las curvas de unión específica.

La figura 13 muestra los resultados de una unión dependiente de la concentración del polipéptido recombinante Seq12 a SIGLEC y el análisis de Scatchard de las curvas de unión específica.

La figura 14 muestra el resumen de los valores de Kd obtenidos del análisis de Scatchard realizado para las curvas presentadas en la Fig. 12 y la Fig. 13.

La figura 15 muestra los valores de las constantes de afinidad de disociación (K<d>) calculados para la unión de Seq11, Seq12 y VWF plasmático de longitud completa a FVIII recombinante. Los datos se obtuvieron por RPS.

La figura 16 muestra el efecto de los fragmentos de VWF N- y C-terminales sobre IL-12p70 e IFN-y. Las moDC se cultivaron con varias concentraciones de los fragmentos de VWF sin (columna izquierda) o con (columna derecha) la adición de 0,1 pg/ml de LPS. Los niveles extracelulares de las citocinas se determinaron simultáneamente a través de una matriz de perlas citométricas. Los niveles de IL-12p70 e IFN-y de las células no estimuladas estaban, para la mayoría de los donantes, por debajo del límite de detección (bd, 0,6 pg/ml para IL-12p70 y 1,8 pg/ml para IFN-<y>). Los datos se presentan como media ± SEM, y cada punto representa un donante.

La figura 17 muestra los resultados de la fosforilación de las SIGLEC y las moléculas adaptadoras SHP-1 y SHP-2 implicadas en la señalización de las SIGLEC, tras la estimulación de moDC durante 10 minutos con 500 nM del fragmento N-terminal del VWF. Las células estimuladas con el mismo volumen de 100 mM de NaCl sirvieron como control. El análisis de la fosforilación de inmunorreceptores en los lisados celulares se llevó a cabo con el kit de matriz de inmunorreceptores humanos Proteome Profiler. Los resultados se muestran como densidad de píxeles media ± SEM de 2-4 experimentos individuales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0027] Para proporcionar una comprensión clara y consistente de la especificación y las reivindicaciones, y el alcance que se le debe dar a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

Definiciones

[0028] Un "péptido" como se usa en el presente documento puede estar compuesto por cualquier número de aminoácidos de cualquier tipo, preferiblemente aminoácidos de origen natural, que, preferiblemente, están unidos por enlaces peptídicos. En particular, un péptido comprende al menos 3 aminoácidos, preferiblemente al menos 5, al menos 7, al menos 9, al menos 12 o al menos 15 aminoácidos. Además, no existe un límite superior para la longitud de un péptido. Sin embargo, preferiblemente, un péptido según la invención no excede una longitud de 500 aminoácidos, más preferiblemente no excede una longitud de 300 aminoácidos; incluso más preferiblemente no es más largo que 250 aminoácidos.

[0029] Por lo tanto, el término "péptido" incluye "oligopéptidos", que normalmente se refieren a péptidos con una longitud de 2 a 10 aminoácidos, y "polipéptidos" que normalmente se refieren a péptidos con una longitud de más de 10 aminoácidos.

[0030] El término "proteína" como se utiliza en este documento se refiere a un péptido con al menos 60, al menos 80, preferiblemente al menos 100 aminoácidos. Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente. Los polipéptidos y proteínas como se utilizan en este documento incluyen proteínas sintetizadas químicamente, así como proteínas sintetizadas naturalmente que están codificadas por genes. Los polipéptidos o proteínas pueden obtenerse de una fuente natural, como sangre humana o producirse en cultivo celular como proteínas recombinantes.

[0031] Como se utiliza en este documento, el término "proteína de mamífero" se refiere a la proteína de mamífero de origen natural, es decir, una proteína expresada naturalmente por un organismo mamífero.

[0032] Por lo tanto, la proteína de mamífero tiene una secuencia de aminoácidos de origen natural y modificaciones postraduccionales de origen natural, tales como la glicosilación. De acuerdo con la invención, los términos proteína de mamífero y proteína de mamífero de origen natural se pueden usar indistintamente.

[0033] Tal como se usa en el presente documento, el término "proteína humana" se refiere a la proteína humana de origen natural, es decir, una proteína expresada de forma natural por un organismo humano. Por lo tanto, la proteína humana tiene una secuencia de aminoácidos de origen natural y modificaciones postraduccionales de origen natural, tales como la glicosilación. De acuerdo con la invención, los términos proteína humana y proteína humana de origen natural se usan indistintamente.

[0034] "Proteínas recombinantes" o "polipéptidos recombinantes" tal como se usan en el presente documento son aquellos que están codificados por transgenes introducidos en las células mediante técnicas de biología molecular. Las proteínas se pueden modificar mediante métodos químicos o mediante enzimas en procesos postraduccionales.

[0035] El término "proteína de fusión" según la invención se refiere a proteínas creadas mediante la unión de dos o más genes, ADNc o secuencias que codificaron originalmente proteínas/péptidos separados. Los genes pueden estar presentes de forma natural en el mismo organismo o en organismos diferentes o pueden ser polinucleótidos sintéticos.

[0036] El término "proteína terapéutica" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a proteínas o polipéptidos con un efecto terapéutico, es decir, proteínas utilizadas como ingrediente farmacéutico activo.

[0037] La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia". Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción no breve) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos idénticos x 100)/(Longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación)

[0038] El término transicional "que comprende", que es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "se caracteriza por", es inclusivo o abierto y no excluye elementos o pasos de método adicionales no enumerados. La frase transicional "que consiste en" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en la reivindicación, excepto las impurezas asociadas ordinariamente con el mismo. Cuando la frase "consiste en" aparece en una cláusula del cuerpo de una reivindicación, en lugar de inmediatamente después del preámbulo, limita únicamente el elemento establecido en esa cláusula; otros elementos no se excluyen de la reivindicación en su totalidad. La frase de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados "y aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas" de la invención reivindicada. "Una reivindicación 'que consiste esencialmente en' ocupa un punto intermedio entre las reivindicaciones cerradas que están escritas en un formato 'que consiste en' y las reivindicaciones completamente abiertas que están redactadas en un formato 'que comprende'".

[0039] "Homólogo" como se utiliza en el presente documento significa que la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos respectiva tiene un grado especificado de identidad con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de referencia. Se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 % idéntica a la secuencia objeto, utilizando la herramienta de alineación de secuencias convencional Clustal W con parámetros predeterminados. Por lo general, los homólogos incluirán los mismos residuos del sitio activo que la secuencia de aminoácidos objeto, aunque pueden incluir cualquier número de sustituciones de aminoácidos conservadoras. "Idéntico" como se utiliza en el presente documento se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos o nucleótidos con una secuencia de referencia del 100 %.

[0040] El término "recombinante", cuando se utiliza en referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector objeto, indica que el objeto ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos en niveles diferentes o en condiciones diferentes a las que se encuentran en la naturaleza.

[0041] Como se utiliza en el presente documento, los términos "transformado", "transformado de forma estable" y "transgénico", utilizados con referencia a una célula, significan que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o transportada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.

[0042] El término "fragmento" como se utiliza en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxiterminal de uno o más aminoácidos en comparación con la proteína nativa o de tipo salvaje pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácidos deducida de un ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen típicamente al menos 50 aminoácidos de longitud.

[0043] El término "glicosilación" como se utiliza en el presente documento se refiere a la unión de glicanos a moléculas, por ejemplo, a proteínas. La glicosilación puede ser una reacción enzimática. La unión formada puede ser a través de enlaces covalentes. En consecuencia, un polipéptido glicosilado como se utiliza en el presente documento es un polipéptido al que está unido un glicano. La frase "altamente glicosilado" se refiere a una molécula, como una enzima, que está glicosilada en todos o casi todos los sitios de glicosilación disponibles, por ejemplo, sitios de glicosilación unidos a O o unidos a N.

[0044] El término "glicano" como se utiliza en el presente documento se refiere a un polisacárido u oligosacárido, o a la sección de carbohidratos de una glicoproteína o un polipéptido glicosilado. Los glicanos pueden ser homopolímeros o heteropolímeros de residuos de monosacáridos. Pueden ser moléculas lineales o ramificadas. Los glicanos contienen típicamente al menos tres azúcares y pueden ser lineales o ramificados. Un glicano puede incluir residuos de azúcar naturales (por ejemplo, glucosa, N-acetilglucosamina, ácido N-acetil neuramínico, galactosa, manosa, fucosa, hexosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, 2'-desoxirribosa, fosfomanosa, 6' sulfo N-acetilglucosamina, etc.).

[0045] El término "O-glicanos" como se utiliza en este documento se refiere a glicanos que generalmente se encuentran unidos covalentemente a residuos de serina y treonina de glicoproteínas de mamíferos.

[0046] Los O-glicanos pueden estar unidos en a a través de una fracción de N-acetilgalactosamina (GalNAc) al -OH de serina o treonina mediante un enlace O-glicosídico. Otros enlaces incluyen O-fucosa con enlace a, O-xilosa con enlace p, O-manosa con enlace a, OGlcNAc (N -acetilglucosamina) con enlace p, O-galactosa con enlace a o p y glicanos de O glucosa con enlace a o p.

[0047] El término "sialilado" como se utiliza en el presente documento se refiere a moléculas, en particular glicanos que han reaccionado con ácido siálico o sus derivados.

[0048] Los términos "afinidad de unión" o "afinidad" como se utilizan en el presente documento indican la fuerza de la unión entre dos moléculas, en particular un ligando y un objetivo proteico. Las afinidades de unión están influenciadas por interacciones intermoleculares no covalentes entre las dos moléculas, como enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas y fuerzas de van-der-Waals.

[0049] Una respuesta inmunitaria como se utiliza en el presente documento se refiere a una respuesta inmunitaria adaptativa o innata. La respuesta inmunitaria innata se refiere a mecanismos de defensa no específicos que se activan inmediatamente o en cuestión de horas tras la aparición de un antígeno en el cuerpo. Estos mecanismos incluyen barreras físicas como la piel, sustancias químicas en la sangre y células del sistema inmunitario que atacan a células extrañas en el cuerpo. La respuesta inmunitaria innata se activa mediante las propiedades químicas del antígeno. La respuesta inmunitaria adaptativa se refiere a respuestas inmunitarias específicas del antígeno. Para ello, primero se debe procesar y reconocer el antígeno. Una vez que se ha reconocido un antígeno, el sistema inmunitario adaptativo crea una gran cantidad de células inmunitarias diseñadas específicamente para atacar ese antígeno.

[0050] Como se utiliza en el presente documento, "tolerancia inmunitaria" (o simplemente "tolerancia") es el proceso por el cual el sistema inmunitario no ataca a un antígeno. Se presenta en tres formas: tolerancia central, tolerancia periférica y tolerancia adquirida. La tolerancia puede ser "natural" o "autotolerancia", donde el cuerpo no genera una respuesta inmune a los autoantígenos, o "tolerancia inducida", donde la tolerancia a los antígenos se puede crear manipulando el sistema inmunológico.

Polipéptido glicosilado

[0051] Según un primer aspecto, la invención proporciona un polipéptido glicosilado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a al menos un fragmento de vWF humano (SEQ iD NO: 1), en donde dicho polipéptido glicosilado contiene uno o más grupos de sitios de O-glicosilación, en donde dichos grupos contienen al menos dos sitios de O-glicosilación y uno o más O-glicanos sialilados, en donde el número combinado de O-glicanos sialilados de núcleo 2 y núcleo extendido 1 del polipéptido glicosilado es mayor que el número de O-glicanos sialilados de núcleo 2 y núcleo extendido 1 del vWF humano o el fragmento del mismo y en donde el polipéptido glicosilado muestra

[0052] El polipéptido glicosilado según la invención se basa en VWF humano, es decir, contiene una secuencia de aminoácidos idéntica u homóloga a VWF o un fragmento del mismo.

[0053] El factor VIII en humanos está codificado por el gen F8 que comprende 187.000 pares de bases y seis exones. El ARNm transcrito tiene una longitud de 9,029 pares de bases y se traduce en una proteína con 2,351 aminoácidos de la que, mediante una modificación postraduccional, se eliminan 19 aminoácidos. La molécula de FVIII en humanos está glicosilada en una cadena lateral de 31 aminoácidos (25 X N-glicosilación, 6 X O-glicosilación).

[0054] Después de la traducción, la cadena de aminoácidos es escindida por proteasas específicas en posiciones que conducen a la formación de una cadena pesada con aproximadamente 200 kDa y una cadena ligera con aproximadamente 80 kDa. La organización de dominios se caracteriza típicamente como A1-A2-B-A3-C1-C2. La cadena ligera está formada por los dominios A3-C1-C2. La cadena pesada está compuesta por los dominios A1-A2-B. Las cadenas pesadas que se encuentran en el plasma tienen una composición heterogénea con pesos moleculares que varían de 90 a 200 kDa. La razón de esto es la heterogeneidad en su glicosilación, la existencia de variantes de empalme y la existencia de productos proteolíticos tales como la cadena pesada A<1>A<2>agotada del dominio B. La secuencia de aminoácidos del FVIII de longitud completa se identifica por los aminoácidos 20 a 2,351 de P00451 de SwissProt, 21 de julio de 1986.

[0055] La proteína humana es preferiblemente FVIII de longitud completa identificado por los aminoácidos 20 a 2,351 de P00451 de SwissProt, 21 de julio de 1986, un FVIII con dominio B eliminado o una proteína FVIII en la que una parte del dominio B ha sido reemplazada por un enlazador.

[0056] El vWF es una glicoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el vWF actúa como mediador entre receptores específicos en la superficie de las plaquetas y componentes de la matriz extracelular, como el colágeno. Además, el vWF actúa como proteína portadora y estabilizadora del factor VIII procoagulante. El vWF se sintetiza en células endoteliales y megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. El polipéptido precursor, pre-pro-vWF, consta de un péptido señal de 22 residuos, un propéptido de 741 residuos y el polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en el factor de von Willebrand plasmático maduro (Fischer et al., 1994). El vWF de longitud completa se identifica por la entrada Uniprot P04275.

[0057] Tras la secreción en el plasma, el vWF circula en forma de varias especies con diferentes tamaños moleculares. Estas moléculas de vWF consisten en oligo- y multímeros de la subunidad madura de 2050 residuos de aminoácidos. El vWF se puede encontrar habitualmente en el plasma como multímeros cuyo tamaño varía aproximadamente de 500 a 20.000 kDa (Furlan et al., 1996). El vWF en particular tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de la entrada P04275 de Uniprot. Más preferiblemente, la proteína vWF se identifica por SEQ ID NO: 1.

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPC

FHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQ

DYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEWESGRY

IILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKV

SSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCES

IGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQH

PEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQIC

HCDWNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEA

EFEVLKAFWDMMERLRISQKWVRVAWEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVAST

SEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLK

QIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEA QSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPG DIQWPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCS QPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNWPEKAH LLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNR VTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGN EKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCT GSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELH SDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYG LCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAE CHKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHG CPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQIC TCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPT LTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLAST ATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRS GFTYVLHEGECCGRCLPSACEWTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQR NVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGV ISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCK VNERGEYFWEKRVTGCPPFDEHKCLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEV EVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSWYHEVLNAMECKCSPR KCSK (SEQ ID NO: 1)

[0058] El polipéptido glicosilado puede contener, por ejemplo, un fragmento de vWF como se define en WO 2015/185758 A2. Como se muestra en el documento WO 2015/185758 A2, el complejo de FVIII y los fragmentos de vWF como se definen en el mismo exhiben una unión reducida a las membranas de fosfolípidos en comparación con FVIII solo, así como una unión reducida al colágeno III y heparina en comparación con el complejo de FVIII y vWF de longitud completa.

[0059] A este respecto, el fragmento de vWF es en particular un fragmento que comienza con el aminoácido 1 de SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos 1 a 272 de SEQ ID NO: 1 comprenden el dominio de unión de FVIII de vWF.

[0060] El fragmento de vWF que comienza preferiblemente con el aminoácido 1 de SEQ ID NO: 1 termina preferiblemente con un aminoácido de SEQ ID NO: 1 en el rango de 1142 a 1390.

[0061] El fragmento termina más preferiblemente con un aminoácido de SEQ ID NO: 1 en el rango de 1267 a 1390. Más preferiblemente, el fragmento de vWF termina con un aminoácido de SEQ ID NO: 1 en el rango de 1337 a 1390.

[0062] Se debe entender que el polipéptido glicosilado tiene una afinidad de unión aumentada en comparación con la proteína o fragmento de mamífero definido por la secuencia de aminoácidos contenida en el péptido glicosilado. Por lo tanto, si el polipéptido glicosilado comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína de mamífero de longitud completa, el polipéptido glicosilado tiene una mayor afinidad por las SIGLEC en comparación con la proteína de mamífero de longitud completa.

[0063] Por otra parte, si el polipéptido glicosilado comprende un fragmento de una proteína de mamífero definida por una subsecuencia de la proteína de mamífero, el polipéptido glicosilado tiene una afinidad de unión aumentada en comparación con el fragmento idéntico derivado de la proteína de origen natural. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos en el polipéptido glicosilado es idéntica u homóloga a un fragmento de vWF, el polipéptido glicosilado según el primer aspecto tiene una afinidad de unión aumentada a uno o más SIGLEC en comparación con el mismo fragmento obtenido a partir de la fragmentación de vWF derivado de plasma.

[0064] Como se muestra en los ejemplos, se determinó una estructura de glicano de vWF que se une específicamente a al menos los SIGLEC SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 (véase el ejemplo 1). Por lo tanto, de acuerdo con una forma de realización del primer aspecto, el uno o más SIGLEC se seleccionan del grupo SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9.

[0065] Los inventores han descubierto sorprendentemente que en el vWF humano los O-glicanos son responsables de la unión a SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. Por el contrario, los N-glicanos no muestran ninguna unión a estos SIGLEC (véase el ejemplo 2). Esto es particularmente sorprendente, porque hasta ahora eran más bien los N-glicanos los que se había demostrado que interactuaban con los SIGLEC (Lai et al., 2015).

[0066] Los inventores determinaron además que los O-glicanos no solo tienen que estar sialilados para la unión a SIG-5, SIG-7, SIG-8, SIG-9, sino que también tiene que estar presente un porcentaje mínimo de glicanos núcleo 2 (véase el ejemplo 4).

[0067] Por lo tanto, la unión de SIGLEC y, en consecuencia, la respuesta inmunitaria reducida se basa en un número o porcentaje aumentado de O-glicanos núcleo 2 sialilados en la proteína glicosilada en comparación con el número de O-glicanos núcleo 2 sialilados de la proteína de mamífero o fragmento de la misma.

[0068] Debido a las similitudes estructurales, se supone que los O-glicanos núcleo 1 extendidos sialilados tienen el mismo efecto que los glicanos núcleo 2 sialilados. Por lo tanto, para aumentar la afinidad de unión a los SIGLEC definidos anteriormente, preferiblemente se aumenta el número o porcentaje combinado de O-glicanos núcleo 2 y de núcleo 1 extendidos sialilados.

[0069] Por lo tanto, según una forma de realización, el número de O-glicanos núcleo 2 y/o de núcleo 1 extendidos sialilados del polipéptido glicosilado es mayor que el número de O-glicanos núcleo 2 y/o de núcleo 1 extendidos sialilados de la proteína de mamífero o fragmento de la misma. En este sentido, también aumenta el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o de núcleo 1 extendido en comparación con el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 y/o de núcleo 1 extendido de la proteína de mamífero.

[0070] Esto significa que el número combinado de O-glicanos núcleo 2 sialilados y O-glicanos núcleo 1 extendido sialilados del polipéptido glicosilado es mayor que el número combinado de O-glicanos núcleo 2 sialilados y O-glicanos núcleo 1 extendido sialilados de la proteína de mamífero o fragmento de la misma.

[0071] Según una forma de realización, se puede aumentar el número de O-glicanos núcleo 2 sialilados. En este sentido, también aumenta el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 sialilados en comparación con el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 de la proteína de mamífero.

[0072] Los SIGLEC para los que se demostró una unión están involucrados en la respuesta inmunitaria de humanos y ratones. Los SIGLEC tienen en común un dominio de Ig de conjunto V N-terminal que se une a ligandos que contienen ácido siálico, y un número variable de dominios de Ig de conjunto C2 que extienden el lado de unión del ligando lejos de la superficie de la membrana.

[0073] Además, muchos SIGLEC tienen motivos de tirosina citoplasmáticos, incluyendo el motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) y motivos similares a ITIM, que se encuentran comúnmente en correceptores involucrados en la regulación de la señalización celular. Otros SIGLEC no contienen motivos de tirosina pero contienen una región transmembrana cargada positivamente que permite la asociación con las proteínas adaptadoras. Los SIGLEC no reconocen patrones moleculares asociados al peligro (DAMPS) sino determinantes de "servidumbre".

[0074] Las SIGLEC se unen a dichos autoligandos sialilados en la misma célula en "cis" y en células adyacentes en "trans". Las SIGLEC humanas se conocen habitualmente como SIG-1 a SIG-14. Las SIGLEC de ratón SIG-E, SIG-F y SIG-G son ortólogos de las SIGLEC humanas SIG-9, SIG-8 y SIG-10, respectivamente.

[0075] Las SIG-1 a SIG-4 también se conocen con los nombres de sialoadhesina, CD22, CD33 y MAG, respectivamente. CD22 y SIG-10 se encuentran en las células B, SIG-5 en los neutrófilos y monocitos, SIG-7 en las células NK, SIG-8 en los eosinófilos, SIG-9 en los monocitos, neutrófilos y células dendríticas (Paulson et al., 2012).

[0076] Las SIGLEC se unen a una variedad de diferentes estructuras de glucanos. Cada uno de los SIGLEC SIG-2, S iG-5, SIG-7, SIG-8, SIG-9 y SIG-10 tiene una preferencia de glucanos diferente (Paulson et al., 2012). Las SIGLEC desempeñan un papel en la inmunidad innata y adaptativa. En particular, SIG-2 y SIG-10 que se encuentran en las células B de humanos y ratones.

[0077] Según Paulson et al., SIG-2 y SIG-10 parecen contribuir sinérgicamente a la tolerancia periférica de las células B. Además, las SIGLEC parecen actuar como correceptores inhibidores de los receptores tipo Toll (TLR). En este sentido, se ha demostrado que la reticulación de SIG-7 o SIG-9 con receptores de activación da como resultado la inhibición de la actividad citolítica de las células NK contra las células tumorales y la liberación de mediadores químicos de los mastocitos, respectivamente.

[0078] Además, la reticulación de SIG-E (SIG-9) y SIG-11 por un anticuerpo inmovilizado da como resultado la inhibición de la producción de citocinas en respuesta a LPS en macrófagos.

[0079] Cabe destacar que se ha demostrado que una expresión tópica de SIG-5 y SIG-9 en una línea celular de macrófagos inhibe la producción de TNFalfa y mejora la producción de IL-10 en respuesta a peptidoglicano, ligando ATLR2, LPS y CpG. Además, la expresión de SIG-E (SIG-9) inducida por LPS en macrófagos parece afectar a la señalización de TLR. Además, los patógenos sialilados amortiguan la respuesta inmunitaria a través de SIGLEC. Como ejemplo, el estreptococo del grupo B expresa el residuo Neu-Aca-1 Galp-1-4GIcNAc en los polisacáridos capsulares y recluta SIGLEC-9 en los neutrófilos, lo que da como resultado la supresión de la función microbicida de los neutrófilos.

[0080] En consecuencia, sin querer limitarse a la teoría, se cree que la unión a SIGLEC en células presentadoras de antígenos (como, por ejemplo, las células dendríticas) conduce a la regulación negativa de la expresión de receptores proinflamatorios y a la regulación positiva de la expresión de receptores inmunosupresores en la superficie celular. Además, la unión conduce a una producción mejorada de citocinas antiinflamatorias, reduce la producción de citocinas proinflamatorias y, en consecuencia, conduce a la inhibición de la proliferación de células T y la producción de anticuerpos. Por lo tanto, la unión de los SIGLEC SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 conduce a una respuesta inmunitaria reducida o a una mayor tolerancia inmunitaria cuando se administra el polipéptido glicosilado a un paciente.

[0081] Por lo tanto, el polipéptido glicosilado según el primer aspecto también se puede definir como un polipéptido glicosilado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a al menos un fragmento de VWF humano en donde en comparación con el VWF humano del mismo:

- la respuesta inmune de un humano al polipéptido glicosilado se reduce; y/o

- la tolerancia inmune de un humano al polipéptido glicosilado se incrementa.

[0082] El polipéptido glicosilado comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a al menos un fragmento de VWF humano en donde dicho polipéptido glicosilado contiene uno o más O-glicanos sialilados y en donde el número combinado de O-glicanos núcleo 2 sialilados y O-glicanos núcleo 1 extendido sialilados del polipéptido glicosilado es mayor que el número combinado de O-glicanos núcleo 2 sialilados y O-glicanos núcleo 1 extendido sialilados del VWF humano o fragmento del mismo.

[0083] El polipéptido glicosilado comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a al menos un fragmento de una proteína de mamífero, preferiblemente una proteína humana, en donde dicho polipéptido glicosilado contiene uno o más O-glicanos sialilados y en donde el número de O-glicanos núcleo 2 sialilados del polipéptido glicosilado es mayor que el número combinado de O-glicanos núcleo 2 sialilados de la proteína de mamífero o fragmento de la misma.

[0084] Para acoplar los O-glicanos a la secuencia de aminoácidos del polipéptido glicosilado, este contiene uno o más sitios de O-glicosilación. Los sitios de O-glicosilación del polipéptido glicosilado pueden ser los sitios de O-glicosilación estándar serina (Ser) y treonina (Thr). Sin embargo, también se ha descrito la unión de O-glicanos a tirosina (Tyr), hidroxilisina (Hydroxy-Lys) o hidroxiprolina (Hydroxy-Pro) y es posible en el contexto de la invención. Por lo tanto, el uno o más sitios de O-glicosilación en el polipéptido glicosilado pueden seleccionarse de Ser, Thr, Tyr, Hydroxy-Lys e Hydroxy-Pro en cualquier otro sitio de O-glicosilación posible. Preferiblemente, los sitios de O-glicosilación se seleccionan de Ser y Thr.

[0085] Los sitios de glicosilación estándar Ser y Thr generalmente muestran la mayor ocupación con O-glicanos. Por lo tanto, de acuerdo con una forma de realización, el uno o más sitios de glicosilación se seleccionan de Ser y Thr.

[0086] En el contexto de la invención, por razones prácticas, el término "polipéptido glicosilado" se utiliza en forma singular. Generalmente, el polipéptido glicosilado se presentará en forma de una composición de polipéptidos del mismo tipo. En este sentido, los polipéptidos glicosilados en forma temprana son una composición de polipéptidos glicosilados que tienen la misma secuencia de aminoácidos, sin embargo, existen variaciones en la glicosilación. Por ejemplo, no todas las moléculas individuales de la composición pueden estar glicosiladas al 100 por ciento. Además, pueden surgir diferencias en los glicanos unidos a un sitio de O-glicosilación específico. En consecuencia, la presente invención también se refiere a una composición que comprende al menos moléculas de polipéptido glicosilado de un primer tipo, en donde la secuencia de aminoácidos de las moléculas de proteína del primer tipo es idéntica u homóloga a al menos un fragmento de una proteína de mamífero, preferiblemente humana, y las moléculas de proteína contienen uno o más sitios de glicosilación.

[0087] Preferiblemente, el polipéptido contiene uno o más grupos de sitios de glicosilación. Aunque un único sitio de glicosilación puede ser suficiente para la unión de SIGLEC, esto supone que la formación de un grupo de sitios de O-glicosilación conduce a una unión mejorada a SIGLEC. La formación de grupos de sitios de glicosilación se observa a menudo en proteínas de mamíferos, los ejemplos son IgA humana que contiene O-glicanos agrupados en la región bisagra (ver Franc et al., 2013) y mucina humana (ver Guzman-Aranguez y Argüeso, 2010).

[0088] En este sentido, ya dos sitios de O-glicosilación en proximidades cercanas se consideran un grupo de O-glicosilación. Por lo tanto, el uno o más grupos de sitios de O-glicosilación contienen al menos dos sitios de O-glicosilación. Los grupos de sitios de O-glicosilación pueden tener diferentes números de sitios de O-glicosilación. Por ejemplo, el polipéptido glicosilado puede contener un grupo con dos y un segundo grupo con tres sitios de glicosilación. Entre los sitios de O-glicosilación de un grupo también pueden estar presentes sitios de N-glicosilación. Preferiblemente no hay sitios de N-glicosilación en el grupo de O-glicosilación.

[0089] Además, un grupo puede contener tres sitios de O-glicosilación y el otro cuatro sitios de O-glicosilación. Un número de tres sitios de O-glicosilación da como resultado tres O-glicanos vecinos que pueden interactuar todos con los SIGLEC y, por lo tanto, conducir a un efecto aumentado. Según una forma de realización, los uno o más grupos de sitios de O-glicosilación contienen preferiblemente al menos tres sitios de O-glicosilación.

[0090] En vWF, hay dos grupos con cuatro sitios de O-glicosilación cada uno. Por lo tanto, preferiblemente un polipéptido contiene uno o más grupos con al menos cuatro sitios de O-glicosilación. Actualmente, se supone que cuanto mayor sea el número de sitios de O-glicosilación, mayor será la afinidad de unión.

[0091] Un grupo de sitios de O-glicosilación puede definirse por dos o más sitios de O-glicosilación dentro de una distancia corta en la secuencia de aminoácidos. Esos grupos también se denominan "grupos de secuencia". Sin embargo, debido al ensamblaje tridimensional del polipéptido glicosilado, un grupo de O-glicosilación también puede incluir sitios de O-glicosilación que están a una distancia mayor dentro de la secuencia de aminoácidos, pero que después del plegado se encuentran en estrecha proximidad. Este último tipo de grupos también se denomina "grupo de plegado".

[0092] El grupo de O-glicosilación 2 de vWF contiene 4 sitios de O-glicosilación dentro de 20 aminoácidos, que están dispuestos como un giro beta. En consecuencia, la distancia de los O-glicanos o los sitios de O-glicosilación es de 27,2 A a 34,0 A, lo que conduce a una distancia media de 6,8 A a 8,5 A. Por lo tanto, la distancia media de dos sitios de O-glicosilación en un grupo puede estar en el intervalo de 4,0 A a 15,0 A. Por debajo de 4,0 A puede haber un impedimento estérico de los O-glicanos, en particular puede no ser posible glicosilar ambos sitios de O-glicosilación. Por encima de la distancia media de dos aminoácidos de más de 15,0 A es probable que no haya un efecto colaborativo de los O-glicanos. El efecto colaborativo es, por ejemplo, una interacción con SIGLEC en la misma célula. Preferiblemente, la distancia media de dos sitios de O-glicosilación en un grupo está en el intervalo de 5,0 A a 12,0 A. Más preferiblemente, la distancia media de dos sitios de O-glicosilación en un grupo está en el intervalo de 6,0 A a 9,0 A.

[0093] Los grupos de plegamiento pueden abarcar secuencias de aminoácidos de más de 100 aminoácidos. Sin embargo, se prefiere que la disposición espacial del grupo no supere los 80 A. Si los sitios de O-glicosilación están separados más de 80 A, se supone que los O-glicanos no exhiben un efecto combinado. El efecto combinado de los O-glicanos en un grupo es más fuerte si los O-glicanos están ubicados dentro de un área con un diámetro de 50 A. Por lo tanto, más preferiblemente, el grupo de disposición espacial no supera los 50 A.

[0094] Según una forma de realización, el uno o más grupos, es decir, grupos de secuencias, contienen al menos un sitio de O-glicosilación en diez aminoácidos. Si los sitios de O-glicosilación se extienden más, se cree que los O-glicanos unidos al sitio de O-glicosilación no pueden actuar juntos de forma adecuada en la misma célula que contiene las SIGLEC.

[0095] Preferiblemente, el uno o más grupos contienen al menos un sitio de O-glicosilación en cuatro aminoácidos. Con una distancia media de los sitios de O-glicosilación de cuatro aminoácidos, existe una alta probabilidad de que los sitios de O-glicosilación también estén en estrecha proximidad después del plegado. La proximidad espacial permite una interacción colaborativa de los glicanos en el grupo con las SIGLEC en la misma célula.

[0096] Más preferiblemente, el uno o más grupos contienen al menos un sitio de O-glicosilación en tres aminoácidos. Como se muestra en los ejemplos, el péptido vWF probado contiene grupos con un sitio de O-glicosilación en dos aminoácidos. Por lo tanto, según una forma de realización preferida, el uno o más grupos contienen al menos un sitio de glicosilación en dos aminoácidos.

[0097] Como se muestra en los ejemplos, ya uno de dichos grupos de O-glicosilación es suficiente para una fuerte interacción con los SIGLEC. Además, también se muestra mediante la comparación de dos polipéptidos vWF que un mayor número de grupos de sitios de O-glicosilación conduce a una mayor afinidad de unión del péptido a los SIGLEC, en particular a SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. Por lo tanto, el polipéptido glicosilado comprende preferiblemente al menos dos grupos de glicosilación, más preferiblemente al menos tres grupos de glicosilación.

[0098] Sin querer limitarnos a la teoría, la afinidad de unión del polipéptido glicosilado a los SIGLEC es mayor cuanto más cerca están ubicados los grupos. A este respecto, si hay dos grupos, preferiblemente están separados por menos de 100 aminoácidos. Una distancia de menos de 100 aminoácidos permite un efecto colaborativo de los grupos de glicanos en la unión de SIGLEC. Más preferiblemente, dos grupos están separados por menos de 50 aminoácidos. Lo más preferiblemente, dos grupos están separados por menos de 30 aminoácidos.

[0099] De acuerdo con una forma de realización, la distancia entre dos grupos vecinos cualesquiera es menor de 100 aminoácidos, preferiblemente la distancia entre dos grupos cualesquiera dentro del polipéptido glicosilado es menor de 50 aminoácidos. Más preferiblemente, la distancia entre dos grupos vecinos cualesquiera es menor de 30 aminoácidos.

[0100] El polipéptido glicosilado contiene preferiblemente al menos un grupo adicional de sitios de O-glicosilación en comparación con la proteína humana a la que la secuencia es homóloga o idéntica.

[0101] Como se definió anteriormente, como todos los polipéptidos glicosilados, el polipéptido glicosilado según la invención representa una composición de moléculas de polipéptidos glicosilados. Estas moléculas exhiben un cierto grado de heterogeneidad dentro del patrón de glicosilación, en particular no todos los sitios de glicosilación están necesariamente ocupados por O-glicanos. La ocupación por O-glicanos depende en particular de la célula huésped en la que se produce el polipéptido glicosilado recomendado. Preferiblemente, la célula huésped, es decir, el sistema de expresión, se elige de tal manera que el porcentaje de ocupación de los sitios de O-glicosilación sea superior al 70 %. Si la ocupación es inferior al 70 %, es posible que no haya suficientes O-glicanos presentes para la unión de SIGLEC. Preferiblemente, más del 80 % de los sitios de O-glicosilación están ocupados por O-glicanos. Más preferiblemente, más del 90 % de los sitios de O-glicosilación están ocupados por O-glicanos. De acuerdo con una forma de realización preferida, más del 95 % de los sitios de O-glicosilación están ocupados por O-glicanos.

[0102] La composición de los glicanos unidos al polipéptido glicosilado depende del método de producción. Los O-glicanos pueden ser glicanos naturales o sintéticos. Los O-glicanos naturales son, por ejemplo, glicanos con la siguiente estructura central:

O-glicano núcleo 1: Galp1^3GalNAca1^-Ser/Thr

O-glicano núcleo 1 extendido: Galp1^4GlcNAcp1^3Galp1^3GalNAca1^-Ser/Thr

O-glicano núcleo 2: Galp1^3(Galp1^3GlcNAcp1^6)GalNAc a1^Ser/Thr

[0103] Se sabe que los SIGLEC se unen al ácido siálico. De conformidad con esto, se muestra en los ejemplos que la desialilación abolió la unión a los SIGLEC (véase el Ejemplo 3). Por lo tanto, se confirma que la sialilación de los O-glicanos es un prerrequisito para la unión. Por consiguiente, se prefiere un alto porcentaje de sialilación de los O-glicanos en el polipéptido glicosilado.

[0104] Por consiguiente, los O-glicanos del polipéptido glicosilado están preferiblemente sialilados, es decir, contienen al menos un ácido siálico como parte de la molécula de glicano.

[0105] Los O-glicanos sialilados pueden contener al menos dos ácidos siálicos en enlace glucosídico alfa 2-3. Los O-glicanos sialilados en el polipéptido glicosilado son en particular O-glicanos núcleo 1 o de núcleo 2. A continuación se ofrece una descripción general de las estructuras de los O-glicanos núcleo 1, del núcleo 1 extendido y del núcleo 2:

O-glicano núcleo 1 sialilado: NeuNAca2^3Galp1^3GalNAca1^Ser/Thr

O-glicano núcleo 1 sialilado extendido: NeuNAca2^3Galp1^4G lcNAcp1^3Galp1^3GalNAca1^Ser/Thr

O-glicano núcleo 2 sialilado: NeuNAca2^3Galp1^4G lcNAcp1^6(NeuNAca2^ 3Galp1^3)GalNAca1^Ser/Thr

[0106] Es posible que tanto el núcleo 1 como el núcleo 2 y/o los O-glicanos núcleo 1 extendidos deben estar presentes en el polipéptido glicosilado. Según una forma de realización, el polipéptido glicosilado comprende O-glicanos núcleo 1 sialilados, así como O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o del núcleo 1 extendido. Como se muestra en el ejemplo 4, el porcentaje de glicanos núcleo 2 del 2,5 % basado en el número total de O-glicanos no es suficiente para la interacción con SIGLEC. Por lo tanto, según una forma de realización del polipéptido glicosilado, el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 basado en el número de O-glicanos es al menos del 5 %. En el mismo ejemplo, se muestra que el grupo 2 con un porcentaje de O-glicanos núcleo 2 basado en un número de O-glicanos del 10,78 % conduce a una fuerte interacción con los SIGLEC. Por lo tanto, de acuerdo con una forma de realización preferida, el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 basado en el número de O-glicanos en el polipéptido glicosilado es al menos 8 %. Más preferiblemente, el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 basado en el número de O-glicanos es al menos 10 %.

[0107] En el ejemplo 7, se determinó que aproximadamente el 80 % de las moléculas de glicopéptido de los péptidos vWF producidos de manera recombinante contienen un O-glicano núcleo 2 o un glicano núcleo 1 extendido. En consecuencia, el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 y/o de núcleo 1 extendido sialilados basado en el número total de O-glicanos es al menos 20 %. Por lo tanto, de acuerdo con una forma de realización, la concentración de O-glicanos núcleo 2 y/o núcleo 1 extendido basado en el número de O-glicanos en el polipéptido glicosilado es al menos 15%, más preferiblemente al menos 18 % y lo más preferiblemente al menos 20 %.

[0108] El número o porcentaje de O-glicanos núcleo 2 en el polipéptido glicosilado, en particular el número o porcentaje de moléculas individuales del polipéptido glicosilado que portan un O-glicano del núcleo 2, se puede aumentar mediante cualquiera de las siguientes estrategias:

Una estrategia es utilizar la enzima p 1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa. Esta enzima está involucrada en la formación de O-glicanos núcleo 2. Por lo tanto, se puede obtener un aumento en las moléculas que portan el núcleo 2 y/o el número de O-glicanos núcleo 2 por molécula de polipéptido mediante la expresión del polipéptido glicosilado en una línea celular que sobreexpresa una enzima p 1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa.

[0109] Otra opción es la expresión del polipéptido glicosilado en una línea celular de expresión derivada de una línea celular cancerosa. Se ha demostrado con frecuencia que las líneas celulares cancerosas producen proteínas glicosiladas con una mayor cantidad de O-glicanos núcleo 2.

[0110] Una estrategia para aumentar el porcentaje de núcleo 1 extendido es usar la enzima p 1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa. Esta enzima está involucrada en la formación de O-glicanos núcleo 1 extendido. Por lo tanto, se puede obtener un aumento en las moléculas que llevan núcleo 1 extendido y/o el número de O-glicano del núcleo 1 extendido por molécula de polipéptido mediante la expresión del polipéptido glicosilado en una línea celular que sobreexpresa una p 1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa.

[0111] La concentración de O-glicanos sialilados del núcleo 2 y/o del núcleo 1 extendido se puede aumentar mediante la síntesis química de glicanos.

[0112] Por consiguiente, basándose en las enseñanzas de la invención, el experto en la materia puede adaptar los glicanos para determinar glicanos sintéticos con alta afinidad de unión. Según una forma de realización preferida, los O-glicanos son glicanos naturales.

[0113] Según una forma de realización, al menos una parte de los O-glicanos núcleo 2 sialilados en el polipéptido glicosilado contiene un grupo sulfato unido a galactosa (Gal) o N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc) o fucosa unida a GlcNAc en el O-glicano de tipo núcleo 2, que representa un ligando de unión de alta afinidad para SIGLEC 7, 8 y 9 (Paulson et al., 2012).

[0114] El experto en la materia conoce diferentes formas de producir sitios de O-glicosilación adicionales. El polipéptido glicosilado puede tener un número aumentado de O-glicanos núcleo 2 sialilados debido a un número aumentado de sitios de O-glicosilación en comparación con la proteína humana o fragmento de la misma.

[0115] En este sentido, el polipéptido glicosilado puede ser una proteína de fusión, en donde una segunda secuencia de aminoácidos que contiene uno o más sitios de O-glicosilación está unida covalentemente a la secuencia de aminoácidos idéntica u homóloga a la proteína humana o fragmento de la misma (primera secuencia de aminoácidos). La segunda secuencia de aminoácidos puede estar ubicada en el extremo N con respecto a la primera secuencia de aminoácidos. Alternativamente, la segunda secuencia de aminoácidos puede estar ubicada en el extremo C con respecto a la primera secuencia de aminoácidos. El polipéptido glicosilado puede contener secuencias de aminoácidos adicionales tanto en el extremo N como en el extremo C con respecto a la primera secuencia de aminoácidos.

[0116] En consecuencia, en dicha proteína de fusión puede estar presente una segunda secuencia de aminoácidos y opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales que contienen principalmente sitios de O-glicosilación, en particular grupos de O-glicosilación. El grupo de sitios de O-glicosilación puede basarse en una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína de mamífero conocida, en particular humana.

[0117] La segunda secuencia de aminoácidos puede comprender uno o más de los siguientes grupos de O-glicosilación:

WPPTXAPVXPTTXYVXXXSXPP (SEQ ID NO: 8),

VVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPP (SEQ ID NO: 9),

PPPTXPPXXAXVTVXPXXXXVSTXXP (SEQ ID NO: 10),

PPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGP (SEQ ID NO: 11), VSSTSXXXXSTXPSXXXAAXTXXTSSXXPPSXPVXXXSXXXTTXXXX (SEQ ID NO: 12), VSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDDTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGK (SEQ ID NO: 13), XXXATTXPXXXXXXTXPXXX (SEQ ID NO: 14),

QFNATTIPENDIEKTDPWFA (SEQ ID NO: 15),

XXTTAATXXX (SEQ ID NO: 16),

LGTTAATELK (SEQ ID NO: 17),

XXPTPXXXSXSXXXEAX (SEQ ID NO: 18),

QSPTPHGLSLSDLQEAK (SEQ ID NO: 19),

VXXXXXXXXXTXTSXXSPXXXXXVXXSXXXXTXAXX (SEQ ID NO: 20), y VHIYQKDLFFTETSDGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIK (SEQ ID NO: 21).

[0118] En las secuencias SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20, X representa cualquiera de los aminoácidos naturales.

[0119] Las SEQ ID NO: 9 y 11 se encuentran en vWF y las SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19 y 21 se derivan del dominio B de FVIII.

[0120] La segunda secuencia de aminoácidos puede comprender una o más de las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. La segunda secuencia de aminoácidos puede contener combinaciones de las secuencias.

La segunda secuencia de aminoácidos comprende preferiblemente múltiples copias de una de las secuencias SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. La segunda secuencia de aminoácidos puede comprender además combinaciones de múltiples copias de SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20.

[0121] La segunda secuencia de aminoácidos puede comprender una o más de las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 21. La segunda secuencia de aminoácidos puede contener combinaciones de las secuencias. La segunda secuencia de aminoácidos comprende preferiblemente múltiples copias de una de las secuencias de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 21. La segunda secuencia de aminoácidos puede comprender además combinaciones de múltiples copias de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 21.

[0122] Según una forma de realización preferida, la segunda secuencia de aminoácidos contiene una o más copias de SEQ ID NO: 8.

[0123] Además, la segunda secuencia de aminoácidos puede tener un cierto porcentaje de identidad con la secuencia de una proteína glicosilada de origen natural. El nivel de identidad con una proteína de origen natural es preferiblemente del 80 %, más preferiblemente al menos del 90 %.

[0124] Alternativamente, la secuencia de aminoácidos de los sitios de O-glicosilación en la segunda secuencia de aminoácidos puede ser completamente sintética. Una secuencia de aminoácidos totalmente sintética como se utiliza en el presente documento es una secuencia que no se basa en una proteína conocida, en particular una proteína de mamífero.

[0125] Según una forma de realización, el enlazador covalente que conecta la segunda secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos idéntica u homóloga a la proteína humana o fragmento de la misma en el polipéptido glicosilado se selecciona de un enlace peptídico, un enlazador químico o un enlace glicosídico. Los enlazadores químicos elegibles a este respecto son:

- enlazadores de amina a amina tales como bismaleimidoetano, 1,8-bismaleimido-dietilenglicol,

- enlazadores de amina a sulfhidrilo tales como yodoacetato de succinimidilo, éster de N-a-maleimidoacet-oxisuccinimida, - enlazadores de carboxilo a amina diciclohexilcarbodiimida, clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y - enlazadores de sulfhidrilo a carbohidrato tales como hidrazida de ácido N-p-maleimidopropiónico, hidrazida de ácido N-£-maleimidocaproico.

[0126] El enlazador de la proteína de fusión según la invención puede estar formado por una secuencia de péptido espaciador que separa la primera y la segunda secuencia de aminoácidos que definen la proteína de fusión. La secuencia de péptido espaciador puede facilitar el plegamiento correcto de las partes individuales de proteína o péptido y puede hacer que sea más probable que las partes individuales de proteína o péptido retengan sus propiedades funcionales individuales. Las secuencias de péptidos espaciadores se pueden insertar en secuencias de a Dn de proteína de fusión durante el ensamblaje en marco de los fragmentos de ADN individuales que forman la secuencia de ADN de proteína de fusión completa, es decir, durante la PCR superpuesta o la ligadura de ADN.

[0127] Un enlace peptídico tiene la ventaja de que el polipéptido completamente glicosilado se puede expresar de inmediato como proteína de fusión.

[0128] La segunda secuencia de aminoácidos se puede añadir a la primera secuencia de aminoácidos mediante un enlazador químico y, por lo tanto, después de la expresión de la proteína.

[0129] Como se muestra en los ejemplos, en particular el vWF (y sus fragmentos) que contienen los grupos de O-glicosilación 1 y/o 2 se unen a SIGLE<c>.

[0130] Según una forma de realización, la identidad de secuencia con el VWF humano (SEQ ID NO: 1) en el polipéptido glicosilado es al menos del 95 % y, más preferiblemente, al menos del 98 %. Según una forma de realización preferida, la primera secuencia de aminoácidos es al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 1 a 505 de SEQ ID NO: 1.

[0131] La longitud de la segunda secuencia de aminoácidos está preferiblemente en el rango de 5 a 100 aminoácidos, más preferiblemente de 10 a 80 aminoácidos, lo más preferiblemente de 20 a 70 aminoácidos.

[0132] Según una forma de realización, el segundo aminoácido es al menos 98 % homólogo a los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la segunda secuencia de aminoácidos es idéntica a los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1. Según una forma de realización más preferida, una segunda secuencia de aminoácidos es al menos 98 % homóloga a dos copias consecutivas de los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la segunda secuencia de aminoácidos es idéntica a dos copias consecutivas de los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1.

[0133] Una proteína de fusión representativa según la invención es Seq12. Seq12 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEY

APGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILV

GNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSIS

WLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQT

MVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCP

QSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE

VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGG

LWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH

[0134] La siguiente secuencia (SEQ ID NO: 3) representa Seq12 con un péptido señal adicional de 22 aminoácidos (en negrita y subrayado). Una expresión de este péptido proporciona una forma monomérica de Seq12. El péptido señal se escinde enzimáticamente.

MIPAKFAGVLLALALILPGTLCSLSCRPPMVKLVCPADHLRAEGLECTKTCQrryDLECMSMGCySGCLCPPGM

VRHENRCVALERCPCFHOGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPG

ECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEWESGR

YIILLLGKALSVWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGMFDGIQNHDLTSSWLQVEEDPVDFGTJSWKVSSQCAD

TRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAA

YAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYHSCAEACQVTCQHEEPLACPVQCVEGCHAHCPP

GKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLWPSDPSHCQICECDWNLTCEACQEPGGLWEETDAPV

SPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAEVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDIS

<e p p l h>(SEQ ID NO: 3)

[0135] Otra proteína de fusión representativa según la invención es Pro-Seq12 que incluye Seq12 y un propéptido (en negrita) con un péptido señal (en negrita y subrayado). Pro-Seq12 se identifica por SEQ ID NO: 4:

MIPARFASVLLAIALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVHTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSII

GDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNF

QVLLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFAKSWALSSGEÍWCERASPPSSSCNISSGEMCK

GLWEQCQLLKSTSVFARCHFLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACS

PVCPAGMEYRQCVSPCARTCQSLHIHEMCQERCVDSCSCPEGQLUDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSR

DCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGCSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDKDA

VCTRSVTVRLPGLHNSLVKLXHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVK

LSPVYAGKTCGLCGNYMGNgGDDFLTPSaiAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLgKQHSDPCAIiNPSHTRFSEEAC

AVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNOPKGCV

YLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCY

CEDGHMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADMLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMG

CVSGCLCPPGFA’RHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWMCTDHVCDATCSTIGMAHYL

TFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKD

e t h f e w e s g r y iil l l g k a l s w w d r h l s is w l k q t y q e k v c g l c g m f d g iq n n d l t s s n l q v e e d p v d f g

NSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHMNIMKQTMVDSSCRILISDVFQDGMKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIG

DCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERWLRENGYECEWRYWSCAPACQVTCQHPEPLACPVQ

CVEGCHAHCPPGKILDELLOTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPG

GLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPV

SPTTLYVEDIEEPPLH (SEQ ID NO: 4)

[0136] La expresión de Pro-Seq12 da como resultado la formación de dímeros. Los dímeros peptídicos permanecen intactos también después de la escisión del propéptido.

[0137] Según una forma de realización, los polipéptidos glicosilados contienen una primera secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 % idéntica a los aminoácidos 1 a 505 de SEQ ID NO: 1. La segunda secuencia de aminoácidos es al menos un 98 % homóloga a dos copias consecutivas de los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1.

[0138] Según una forma de realización, el polipéptido glicosilado se produce por expresión en una línea celular humana. Generalmente, cualquier línea celular humana es adecuada para la expresión del polipéptido glicosilado. Un péptido de glicosilación favorable se obtiene particularmente con líneas celulares HEK.

[0139] Ejemplos de líneas celulares HEK para la producción del polipéptido glicosilado son HEK 293 F, Flp-In™-293 (Invitrogen, R75007), 293 (ATCC® CRL-1573), 293 EBNA, 293 H (ThermoScientific 11631017), 293S, 293T (ATCC® CRL- 3216™), 293T/17 (ATCC® CRL11268™), 293T/17 SF (ATCC® ACS4500™), HEK 293 STF (ATCC® CRL 3249™), HEK- 293.2sus (ATCC® CRL-1573™). Una línea celular preferida para la producción del polipéptido es la línea celular HEK 293 F.

[0140] Otras líneas celulares adecuadas como células hospedadoras para la expresión incluyen líneas celulares derivadas de células de leucemia mieloide humana. Ejemplos específicos de células hospedadoras son K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X, GT-5s y células derivadas de cualquiera de dichas células hospedadoras. K562 es una línea celular de leucemia mieloide humana presente en la American Type Culture Collection (ATCC CCL-243). Las líneas celulares restantes se derivan de células K562 y se han seleccionado por características de glicosilación específicas.

[0141] De acuerdo con una forma de realización alternativa, uno o más sitios de glicosilación se encuentran dentro de la secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a la proteína de mamífero o fragmento de la misma. Se debe entender que los sitios de O-glicosilación que no están presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína o fragmento de mamífero se encuentran dentro de la secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica dentro del polipéptido glicosilado.

[0142] El uno o más sitios de O-glicosilación dentro de la secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a la proteína de mamífero o fragmento de la misma pueden insertarse dentro de la secuencia. Alternativamente, el uno o más sitios de O-glicosilación pueden reemplazar aminoácidos de la proteína de mamífero. Se prefiere un reemplazo de aminoácidos ya que no cambia el tamaño de la cadena polipeptídica y, por lo tanto, es menos probable que influya en la estructura tridimensional de la proteína.

[0143] El uno o más sitios de O-glicosilación dentro de la secuencia de aminoácidos se encuentran preferiblemente en partes de la secuencia que no forman sitios de unión o centros activos de la proteína. Además, el uno o más sitios de O-glicosilación se agregan preferiblemente en una posición de aminoácido que estará expuesta a la superficie de la proteína plegada. Para lograr la menor influencia en la actividad o integridad de la proteína, los uno o más sitios de O-glicosilación se pueden agregar a un bucle flexible de la proteína.

[0144] En el caso de las proteínas FVIII, los uno o más sitios de O-glicosilación se agregan preferiblemente en la posición de o reemplazando el dominio B.

[0145] En una forma de realización, el polipéptido glicosilado se modifica mediante la unión con uno o más polímeros biocompatibles para mejorar, por ejemplo, la vida media o la estabilidad. Los polímeros biocompatibles adecuados incluyen óxidos de polialquileno tales como, sin limitación, polietilenglicol (PEG), dextranos, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidratos, polímeros de aminoácidos, derivados de biotina, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, anhídrido de ácido maleico-polietilenglicol, anhídrido de ácido málico-poliestirenopolioxazolina, poliacriloilmorfolina, heparina, albúmina, celulosas, hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil-almidones e hidroxipropil-almidones, glucógeno, agarosas y derivados de los mismos, goma guar, pululano, inulina, goma xantana, carragenina, pectina, hidrolizados de ácido algínico, otros biopolímeros y cualquier equivalente de los mismos. En una forma de realización, el polímero es polietilenglicol (PEG). En otra forma de realización, el polímero es metoxipolietilenglicol (mPEG). Otros compuestos de polialquilenglicol útiles son los polipropilenglicoles (PPG), los polibutilenglicoles (PBG), los éteres de glicidilo de p Eg (Epox-PEG), el PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), los polietilenglicoles ramificados, los polietilenglicoles lineales, los polietilenglicoles bifurcados y los polietilenglicoles de múltiples brazos o "superramificados" (PEG en estrella). El polímero biocompatible está conectado preferiblemente al polipéptido por uno de los siguientes residuos -SH, OH, -COOH.

[0146] Según una forma de realización, el polipéptido glicosilado es capaz de formar dímeros o multímeros. La formación de dímeros y, en particular, de multímeros aumenta el número de O-glicanos o grupos de O-glicanos en estrecha proximidad. Por lo tanto, más O-glicanos pueden interactuar con SIGLEC en una célula. Además, los O-glicanos pueden interactuar con varias células que expresan SIGLEC que se encuentran muy cerca unas de otras, aumentando así la tolerancia inmunitaria.

[0147] La multimerización puede ser el resultado de un dominio de multimerización en la secuencia de aminoácidos de la proteína de mamífero en la que se basa el polipéptido glicosilado. Como alternativa, los multímeros del polipéptido glicosilado se pueden formar introduciendo dominios de multimerización en la secuencia de aminoácidos del polipéptido glicosilado.

[0148] Un ejemplo de una proteína de fusión según la invención que forma multímeros es Pro-Seq12-Mult que incluye Seql2 y un propéptido (en negrita) con un péptido señal (en negrita y subrayado) así como una secuencia de multimerización, el "dominio de nudo de cisterna" de vWF (subrayado). Pro-Seq12-Mult se identifica por SEQ ID NO: 5:

MIPARFAGVLLAIALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYS FAGYCSY LLAGGCQKRS FS11

GDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNF

QVLLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQK

GLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACS

PVCPAGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSR

DCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDA

VCTRSVTVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVK

LSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEAC

AVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQV

YLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCY

CEDGFMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMG

CVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYL

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[0149] Alternativamente, la multimerización del polipéptido glicosilado se puede obtener mediante la unión a un polímero o un liposoma.

Uso de un polipéptido glicosilado

[0150] Como se definió anteriormente, los inventores han descubierto que una proteína con una composición de glicano que incluye O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o O-glicanos núcleo 1 extendidos sialilados interactúa con SIGLEC definidos y, por lo tanto, influye en las células del sistema inmunitario de los mamíferos. En particular, un polipéptido glicosilado exhibe una respuesta inmunitaria reducida. Por lo tanto, dicho polipéptido glicosilado, si se administra con una segunda proteína, puede influir en la respuesta inmunitaria de un paciente a la segunda proteína. Por lo tanto, un polipéptido glicosilado con O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o O-glicanos núcleo 1 extendidos sialilados se puede utilizar para modificar, en particular reducir, la respuesta inmunitaria de un paciente a una proteína, en particular una proteína terapéutica en administración combinada.

[0151] Por lo tanto, según un segundo aspecto, la invención se refiere al uso de un VWF humano que contiene uno o más O-glicanos sialilados y que exhibe unión a uno o más SIGLEC, seleccionados entre SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 para reducir la respuesta inmunitaria de una segunda proteína o aumentar la tolerancia inmunitaria de un paciente a una segunda proteína, en donde la segunda proteína es en particular una proteína terapéutica.

[0152] Preferiblemente, el polipéptido glicosilado utilizado para reducir la respuesta inmunitaria comprende O-glicanos núcleo 2 sialilados y/o O-glicanos núcleo 1 extendido sialilados. Más preferiblemente, el polipéptido glicosilado se define como el polipéptido glicosilado según el primer aspecto.

Composición y complejo proteico

[0153] Por consiguiente, el concepto según la invención, es decir, la respuesta inmunitaria reducida de una proteína humana mediante, por ejemplo, la adición de uno o más O-glicanos núcleo 2 sialilados, no sólo se puede conseguir mediante la preparación de una proteína de fusión o mediante la inserción o sustitución de aminoácidos por sitios de O-glicosilación, sino también mediante la adición de un polipéptido adicional como se describe en el uso según el segundo aspecto. Esto conduce a la formación de una composición del polipéptido glicosilado y un segundo polipéptido, cuya respuesta inmunitaria se va a reducir.

[0154] Por consiguiente, en un tercer aspecto, la presente invención también se refiere a una composición que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido es un polipéptido glicosilado de acuerdo con el primer aspecto y el segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a una segunda proteína de mamífero, en particular humana, en donde en comparación con el segundo polipéptido, la composición tiene una afinidad de unión aumentada a un SIGLEC seleccionado de uno o más SIGLEC, seleccionados de SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9.

[0155] También es posible proporcionar un socio de unión a un polipéptido, que tiene una afinidad de unión aumentada a un SIGLEC, de modo que el complejo de los dos polipéptidos tiene una afinidad de unión aumentada al SIGLEC en comparación con el polipéptido.

[0156] Por lo tanto, según un tercer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido es un polipéptido glicosilado según el primer aspecto y el segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a una segunda proteína de mamífero, en particular humana, en donde en comparación con el segundo polipéptido:

- la composición tiene una afinidad de unión aumentada a un SIGLEC seleccionado entre; SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 y/o

- la respuesta inmune de un humano al complejo se reduce; y/o

- la tolerancia inmune de un humano al complejo se incrementa.

[0157] La segunda proteína humana es preferiblemente una proteína sanguínea humana. La proteína sanguínea humana puede ser un factor de coagulación sanguínea humano, una proteína de transporte, un inhibidor de proteasa, una inmunoglobulina, una proteína plasmática relacionada con células, una apolipoproteína, un factor del complemento, un factor de crecimiento, una proteína antiangionética, una proteína altamente glicosilada, un factor sanguíneo u otra proteína sanguínea humana.

[0158] El factor de coagulación sanguínea humano se selecciona en particular del grupo que consiste en fibrinógeno, monómero de fibrina, protrombina, trombina, FV/FVa, FX/FXa, FIX/FIXa, FVII/FVlla, FVIII/FVllla, FXI/FXIa, FXII/FXIIa, FXIII/FXIIIa, factor de von Willebrand y ADAMTS13.

[0159] La proteína de transporte se puede seleccionar de albúmina, transferrina, ceruloplasmina, haptoglobina, hemoglobina y hemopexina.

[0160] Los posibles inhibidores de proteasa son, por ejemplo, p-antitrombina, a-antitrombina, antitrombina oxidada, 2-macroglobulina, inhibidor de Cl, inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), cofactor II de heparina, inhibidor de proteína C (PAI-3), proteína C, proteína S y proteína Z.

[0161] Ejemplos de inmunoglobulinas tales como anticuerpos policlonales (IgG), anticuerpos monoclonales, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, IgM, IgE, IgD y proteína de Bence Jones.

[0162] La proteína plasmática relacionada con las células puede ser, por ejemplo, fibronectina, tromboglobulina, factor plaquetario 4. Ejemplos de apolipoproteínas son apo AI, apo A-II y apo E.

[0163] Los factores de complemento según la invención son, por ejemplo, factor B, factor D, factor H, factor I, inactivador de C3b, properdina, proteína de unión a C4, etc.

[0164] Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-a), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento de hepatocitos.

[0165] Las proteínas antiangionéticas incluyen antitrombina latente, antitrombina prelatente, antitrombina oxidada y plasminógeno.

[0166] Ejemplos de proteínas altamente glicosiladas son la glicoproteína ácida alfa-1, la antiquimotripsina, el inhibidor de inter-a-tripsina, la glicoproteína a-2-HS, la proteína C reactiva. Los factores sanguíneos pueden ser, por ejemplo, tales como eritropoyetina, interferón, factores tumorales, tPA, gCSF.

[0167] Otras proteínas sanguíneas humanas incluyen la glicoproteína rica en histidina, la lectina de unión a manano, la proteína de unión a C4, la fibronectina, la globulina GC, el plasminógeno/plasmina, la microglobulina a-1, la proteína C reactiva.

[0168] La segunda proteína humana se selecciona en particular de FVIII, FVII/FVIIa, FIX, ADAMTS13.

[0169] La composición según el tercer aspecto es en particular un complejo proteico del primer y segundo polipéptido.

[0170] El segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína de mamífero, en particular humana. Para reducir la respuesta inmunitaria de un ser humano al segundo polipéptido, un primer polipéptido forma un complejo con el segundo polipéptido.

[0171] Para la formación del complejo proteico, el primer polipéptido comprende en particular un dominio de unión, que permite una unión al segundo polipéptido y un dominio de glicosilación. El dominio de glicosilación comprende en particular uno o más sitios de O-glicosilación, preferiblemente un grupo de O-glicosilación.

[0172] De acuerdo con una forma de realización, el segundo polipéptido es una proteína FVIII, y el primer polipéptido comprende el dominio de unión de FVIII de vWF y uno o más sitios de O-glicosilación a los que se unen los O-glicanos 2 del núcleo sialilado.

[0173] Un ejemplo preferido de la composición es un complejo proteico de una proteína FVIII con una secuencia de aminoácidos 95 % idéntica a la secuencia identificada por los aminoácidos 20 a 2.351 de P00451 y un primer polipéptido como pareja de unión que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 1 a 172 de SEQ ID NO: 1.

[0174] Según una forma de realización del complejo proteico del tercer aspecto, el primer polipéptido es un polipéptido según el primer aspecto.

[0175] Según una forma de realización adicional, el segundo polipéptido puede seleccionarse, por ejemplo, entre FVIII, FVII, FIX y ADAMTS13.

[0176] En una forma de realización del tercer aspecto, el primer polipéptido comprende al menos un fragmento de vWF humano y un segundo polipéptido es una proteína FVIII, en particular una proteína FVIII de longitud completa, una proteína FVIII con el dominio B eliminado o una proteína FVIII en la que parte del dominio B ha sido reemplazada por un enlazador. De acuerdo con una forma de realización, el primer polipéptido está definido por los aminoácidos 1 a 505 de SEQ ID NO: 1, que se produjo en células HEK, en particular células h Ek 293F.

[0177] Según una forma de realización adicional, el primer polipéptido está definido por los aminoácidos 1 a 505 de SEQ ID NO: 1 y una copia de los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1. Además, el primer polipéptido puede estar definido por una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

[0178] Como se muestra en los ejemplos, una proteína con una afinidad de unión mejorada a SIGLEC, en particular SIG-5, SIG-7, SIG-8 y/o SIG-9, puede producirse con la línea celular HEK 293F. Por lo tanto, según una forma de realización adicional del complejo proteico, el primer y segundo polipéptidos se producen mediante la expresión recomendada en una línea celular humana, preferiblemente una línea celular HEK. Ejemplos de líneas celulares HEK para la producción del polipéptido glicosilado son HEK 293 F, Flp-In™-293, 293, 293 EBNA, 293 H, 293S, 293T, 293T/17, 293T/17 SF, HEK 293 STF y HEK-293.2sus. Una línea celular preferida para la producción del polipéptido es la línea celular HEK 293 F. El primer y el segundo polipéptido pueden producirse mediante expresión recombinante separada y unirse posteriormente.

[0179] Alternativamente, el primer y el segundo polipéptido se expresan de forma recombinante en la misma célula. Para ello, el primer y el segundo polipéptido pueden estar codificados por el mismo vector o por dos vectores diferentes.

Polinucleótido

[0180] Según un cuarto aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido glicosilado según el primer aspecto de la invención.

[0181] El polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN o una molécula de ARN. El polinucleótido aislado es preferiblemente una molécula de ADN, en particular una molécula de ADNc. Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un péptido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, la preparación a partir de ADNc o una combinación de las mismas. La clonación de los polinucleótidos a partir de dicho<a>D<n>genómico se puede efectuar, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida o el cribado de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas (véase, por ejemplo, Innis et al., 1990) PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada por ligadura (LAT) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA).

[0182] El polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica un polipéptido glicosilado con una secuencia de aminoácidos similar o idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.

[0183] En particular, el polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica un polipéptido glicosilado que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 %, lo más preferiblemente el 100 % con SEQ ID NO: 2. Además, el polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica un polipéptido glicosilado que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 %, lo más preferiblemente el 100 % con SEQ ID NO: 3. De acuerdo con una forma de realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica un polipéptido glicosilado que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 %, lo más preferiblemente el 100 % con SEQ ID NO: 4. Según una forma de realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica un polipéptido glicosilado que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 %, lo más preferiblemente el 100 % con SEQ ID NO: 5.

Vector de expresión

[0184] En un quinto aspecto, la invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un polinucleótido según el cuarto aspecto de la invención.

[0185] El vector de expresión comprende además preferiblemente elementos de control tales como un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. El polinucleótido según el cuarto aspecto y los elementos de control pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en dichos sitios.

[0186] El polinucleótido puede insertarse en un vector de expresión apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificanteseubica en el vector de expresión de modo que la secuencia codificante esté operativamente unida con las secuencias de control apropiadas para la expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda producir la expresión del polinucleótido del cuarto aspecto de la invención. La elección del vector de expresión dependerá típicamente de la compatibilidad del vector de expresión con la célula huésped en la que se va a introducir el vector de expresión. Los vectores de expresión pueden ser un plásmido lineal o circular cerrado.

[0187] El vector de expresión está adaptado preferiblemente a la expresión en células de mamíferos. El vector de expresión puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

[0188] El vector es preferiblemente uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o los cromosomas en los que se ha integrado. Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector de expresión puede depender de cualquier otro elemento del vector de expresión para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación precisa en el cromosoma.

[0189] Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente uno o más (por ejemplo, varios) marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a los biocidas o a los virus, resistencia a los metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.

[0190] Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0191] Según una forma de realización, la estructura principal del vector del vector según el quinto aspecto se selecciona de pCDNA3, pCDNA3.1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, pIRES y pSCAS.

[0192] El vector según el quinto aspecto puede transformarse de forma transitoria o intransitoria en una célula huésped. La célula huésped puede ser cualquiera de las células enumeradas anteriormente. Preferiblemente, la célula huésped es HEK 293F.

Uso médico y método de tratamiento

[0193] Como se ha descrito anteriormente, el polipéptido glicosilado y la composición, en particular el complejo proteico según la invención, tienen la ventaja de una respuesta inmunitaria reducida en pacientes, en particular pacientes humanos. Por tanto, un polipéptido glicosilado y un complejo proteico son en particular útiles como ingredientes activos para el tratamiento médico.

[0194] Según un sexto aspecto, la invención proporciona un polipéptido glicosilado definido según el primer aspecto para su uso en un tratamiento médico. Como alternativa, según el sexto aspecto, la invención proporciona una composición definida según el tercer aspecto para su uso en un tratamiento médico. Preferiblemente, el tratamiento médico es la prevención de un trastorno hemorrágico.

[0195] Tal como se utiliza en el presente documento, "trastorno hemorrágico" se refiere a una enfermedad o afección que altera la hemostasia normal. El trastorno hemorrágico puede ser, por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor VIII, deficiencia del factor XI, enfermedad de von Willebrand, trombastenia de Glanzmann, síndrome de Bernard Soulier, púrpura trombocitopénica idiopática, hemorragia intracerebral, traumatismo, lesión cerebral traumática y similares.

[0196] Como se utiliza en el presente documento, "hemofilia" se refiere a un grupo de trastornos hemorrágicos asociados con un aumento del tiempo de formación de coágulos sanguíneos en comparación con el tiempo de formación de coágulos sanguíneos en individuos sanos sin hemofilia. "Hemofilia" se refiere tanto a la hemofilia A, que es un trastorno que conduce a la producción de factor VIII defectuoso, como a la hemofilia B, que es un trastorno que conduce a la producción de factor IX defectuoso.

[0197] El trastorno hemorrágico es preferiblemente hemofilia. El tratamiento puede ser, por ejemplo, el tratamiento de la hemofilia de pacientes no tratados previamente (PUPS) () o un tratamiento de inducción de tolerancia inmunitaria (ITI).

[0198] Según una forma de realización alternativa del tercer aspecto, la invención proporciona un complejo proteico definido según el segundo aspecto para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno hemorrágico.

[0199] El tratamiento comprende preferiblemente administrar a un paciente una cantidad eficaz del polipéptido glicosilado o composición, en particular un complejo proteico.

[0200] El polipéptido glicosilado o composición, en particular complejo proteico, descrito en el presente documento se puede administrar solo o en forma de composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden comprender una cantidad eficaz de los conjugados formulados con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de las formas de realización se pueden preparar y administrar a un sujeto mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional (10.a ed., 2001); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins (20.a ed., 2003); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al. (eds), Lippincott Williams & Wilkins (7.a ed., 1999). Además, las composiciones farmacéuticas de las formas de realización también pueden formularse para incluir otros fármacos o agentes biológicos médicamente útiles. La composición farmacéutica comprende típicamente una cantidad terapéuticamente eficaz del complejo proteico o polipéptido glicosilado combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable es cualquier vehículo conocido o establecido en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares incluyen agua estéril libre de pirógenos y solución salina estéril libre de pirógenos. Otras formas de vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para las presentes formas de realización incluyen aglutinantes, desintegrantes, surfactantes, aceleradores de absorción, agentes de retención de humedad, absorbentes, lubricantes, rellenos, extensores, agentes que imparten humedad, conservantes, estabilizadores, emulsionantes, agentes solubilizantes, sales que controlan la presión osmótica, agentes diluyentes tales como tampones y excipientes que se utilizan habitualmente dependiendo de la forma de uso de la formulación. Estos se seleccionan y utilizan opcionalmente dependiendo de la dosis unitaria de la formulación resultante.

[0201] Para aplicaciones in vivo, el polipéptido glicosilado, complejo proteico o composición farmacéutica se puede administrar al paciente por cualquier vía de administración habitual, por ejemplo, por vía oral, parenteral o por inhalación. La administración parenteral incluye inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal, agentes líquidos, suspensiones, emulsiones y agentes de goteo. Para la administración parenteral, el polipéptido glicosilado, el complejo proteico o la composición farmacéutica deben ser un agente inyectable, como un agente líquido o una suspensión.

[0202] En otras formas de realización, el polipéptido glicosilado, el complejo proteico o la composición farmacéutica se administran por vía oral a un paciente. En estas formas de realización, una forma del fármaco incluye formulaciones sólidas, como comprimidos, comprimidos recubiertos, agentes en polvo, gránulos, cápsulas y píldoras, formulaciones líquidas, como agentes líquidos (por ejemplo, gotas para los ojos, gotas para la nariz), suspensiones, emulsiones y jarabes, inhalaciones, como agentes en aerosol, atomizadores y nebulizadores, y agentes de inclusión en liposomas. En otras formas de realización más, el polipéptido glicosilado, el complejo proteico o la composición farmacéutica se administran por inhalación al tracto respiratorio de un paciente para dirigirse a la tráquea y/o al pulmón de un sujeto.

[0203] Según una forma de realización del sexto aspecto, el polipéptido glicosilado o la composición, en particular el complejo proteico para su uso, comprende una inyección intravenosa o no intravenosa. La inyección no intravenosa es preferiblemente una inyección subcutánea.

[0204] La invención se describirá además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Unión del factor de Willebrand de longitud completa (vWF) a SIGLEC:

1.1. Procedimiento experimental

[0205] Se obtuvieron SIG-2, SIG-5, SIG-7, SIG-F (equivalente de ratón de SIG-8 humano), SIG-9 y SIG-10 recombinantes como proteínas de fusión Fc de R&D Systems. Primero, se revistió Proteína A (SERVA Feinbiochemica GmbH & Co) sobre una placa en una concentración de 0,5 mg/pocillo, a 4 °C, durante la noche (O/N). Después de los pasos de bloqueo y lavado con tampón de lavado (HEPES 20 mM, NaCl 125 mM, EDTA 1 mM, BSA al 1 %), los SIGLEC de fusión Fc o los anticuerpos de control se unieron a la proteína A mediante una incubación de 1 h a 37 °C a una concentración de 5 mg/ml. Se inmovilizó anti vWF-pAb (Dako, n.° A0082) como control positivo y anti-IgY de pollo (Sigma Aldrich, n.° C2288) como control negativo a través de la parte Fc del anticuerpo.

[0206] El VWF derivado de plasma (pdVWF) se biotiniló utilizando el kit de biotinilación EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotin (Thermo Fisher Scientific). Se aplicó una serie de concentraciones de vWF biotinilado en los pocillos a concentraciones de 0 a 0,8 mg/ml. Después de cinco pasos de lavado con tampón de lavado, se añadió estreptavidina acoplada a HRP (Thermo Fisher Scientific, n.° 31001) a los pocillos y se incubó durante 1 hora a 37 °C con cinco pasos de lavado posteriores.

[0207] Para la visualización del pdvWF biotinilado unido, los pocillos se incubaron con sustrato de dihidrocloruro de o-<fenilendiamina (SIGM AFAST ™>OpD,<#P9187, Sigma Aldrich). Posteriormente, se midió la absorbancia a 492 nm.>1.2 Resultados

[0208] Como se muestra en la Fig. 1, la absorbancia a 492 nm aumenta con la concentración inicial de vWF en los experimentos de unión con SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9. Los valores están ligeramente por encima (SIG-F y SIG-9) o por debajo (SIG-5 y SIG-7) del control positivo (anti-vWF). Por el contrario, la absorbancia en los experimentos de unión con SIG-2, SIG-10 y el control negativo Anti-Chicken IgY fue de alrededor de 0 independientemente de la concentración.

[0209] Por consiguiente, el vWF se une a SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 de una manera dependiente de la concentración. Por otro lado, el vWF no se une a SIG-2 y SIG-10.

Ejemplo 2 - Unión de fragmentos de vWF a SIGLEC

2.1 Procedimiento experimental

[0210] Los fragmentos C- y N-terminales de vWF se prepararon mediante digestión con proteasa V8 (Thermo Fisher Scietific, n.° 201959) realizada durante 3 h, 37 °C, 300 rpm, utilizando una relación enzima-proteína p/p de 1:100 en un tampón Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,8 y se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna MonoQ 5/50 GL (GE Healthcare n.° 17-5166-01). El tampón de ejecución fue Tris-HCl 20 mM pH 7,4 y el tampón de elución Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM pH 7,4. Los fragmentos se purificaron y desalinizaron aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 610/300 GL (GE Healthcare n.° 17-5172-01) utilizando NaCl 100 mM como tampón de ejecución.

[0211] Los fragmentos obtenidos (C-terminal y N-terminal) se representan esquemáticamente en la Fig. 2 con una identificación de dominios y sitios de glicosilación.

[0212] El fragmento C-terminal de vWF purificado y el fragmento N-terminal de vWF se biotinilaron utilizando el kit de biotinilación EZ-Link™ SulfoNHS-Biotin (Thermo Fisher Scientific) y la unión a SIGLEC se midió como se describe en el ejemplo 1 con una concentración del fragmento C-terminal de vWF y del fragmento N-terminal de vWF de 1 pg/ml. 2.2 Resultados

[0213] Con base en los valores de absorbancia mostrados en la Fig. 3, el fragmento N-terminal de vWF, que contiene la mayoría de los sitios de O-glicosilación y 2 grupos de O-glicano (Grupo 1 y Grupo 2), se une a SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9. Por el contrario, se midió poca o ninguna absorbancia para el fragmento C-terminal de vWF. En consecuencia, este último fragmento no se une a las SIGLEC.

Ejemplo 3 - Unión de la parte N-terminal de vWF a las SIGLEC

3.1. Procedimiento experimental

[0214] Una porción del fragmento N-terminal de vWF obtenido en el ejemplo 2 se desialiló enzimáticamente utilizando sialidasa A. La incubación se realizó a 37 °C durante 3 h en fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0 utilizando 2 pl de enzima para 100 pg de fragmento de VWF (Sialidase A™ #GK80040 se obtuvo de Prozyme).

[0215] Una segunda porción de los fragmentos de vWF N-terminal se des-N-glicosiló. La incubación se realizó durante la noche a 37 °C en tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 utilizando 1 pl de enzima para 20 pg de fragmento de VWF (PNGase F #P0704 se obtuvo de New England Biolabs).

[0216] Se analizaron muestras del fragmento de vWF N-terminal desialilado, des-N-glicosilado y sin tratar para determinar su unión a SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. El experimento de unión se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1 con una concentración de los fragmentos N-terminales de vWF de 8 pg/mL.

3.2 Resultados:

[0217] Como se muestra en la Fig. 4, los valores de absorbancia determinados para el fragmento N-terminal de vWF des-N-glicosilado y el fragmento N-terminal de vWF sin tratar difieren solo ligeramente. Por lo tanto, la des-N-glicosilación no influye en la unión, lo que demuestra que la unión está mediada por O-glicanos.

[0218] La desialilación de O-glicanos reduce fuertemente o elimina la unión del fragmento N-terminal de vWF a SIGLEC como se muestra en la Fig. 4. Por lo tanto, la unión del fragmento N-terminal de vWF está mediada por el ácido siálico unido a las cadenas de O-glicano.

Ejemplo 4 - Unión SIGLEC de péptidos que contienen los grupos de O-glicanos 1 y 2

4.1 Procedimiento experimental

[0219] El vWF contiene dos grupos de sitios de O-glicosilación completamente ocupados (ver Solecka et.al 2016), representados esquemáticamente en la Fig. 2. Ambos grupos difieren en la cantidad relativa de estructuras de núcleo 2. Solo el 4,9 % de las moléculas de glicopéptidos contienen estructuras de núcleo 2 en el grupo 1. En consecuencia, el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 sialilados basado en el número total de O-glicanos en el grupo 1 es del 1,25 %.

[0220] Por otro lado, el 34,86 % de las moléculas de glicopéptidos contienen estructuras de núcleo 2 en el grupo 2 (ver Solecka et al., 2016). En consecuencia, el porcentaje de O-glicanos sialilados del núcleo 2 basado en el número total de O-glicanos en el grupo 2 es del 10,78 %.

[0221] Para medir la unión de los dos grupos de forma independiente, el fragmento N-terminal de vWF se trató con tripsina, produciendo el siguiente fragmento: fragmento del grupo 1 que abarca los AA 449 a 511 y fragmento del grupo 2 que abarca los AA 674 a 728/729 de VWF de SEQ ID NO: 1. Los fragmentos se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Brevemente, el pdVWF se redujo y las cisteínas libres se bloquearon con maleimida-PEG2-biotina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (EZ-Link™ Maleimida-PEG2-Biotina, n.° 21901BID se obtuvo de Thermo Fisher Scientific). Después de la digestión con tripsina a 37 °C durante la noche, los péptidos de alto peso molecular se concentraron utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de corte de 10 kDa (Millipore). Posteriormente, los péptidos se separaron en una columna Jupiter 5p 300Á C18 (Phenomenex). La fase móvil fue: A- 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA) en H2O; B- 0,085 % de TFA en acetonitrilo y la velocidad de flujo fue de 0,3 mL/min. Los péptidos/glicopéptidos eluyentes se detectaron por absorción ultravioleta a una longitud de onda de 215 nm. Las fracciones de interés se recolectaron, se liofilizaron y posteriormente se reconstituyeron en 10 pL de H<2>O. Dado que ambos grupos contienen cisteínas, a ambos se les suministró una biotina.

[0222] Se llevó a cabo un experimento de unión como se describe en el Ejemplo 1 con los SIGLEC SIG-5, SIG-7, SIG-F, SIG-9 y SIG-10 y una concentración de los fragmentos del grupo 1 y del grupo 2 de 4 pg/mL.

[0223] Adicionalmente, una muestra de los fragmentos del grupo 1 y del grupo 2 se trató por desialilación y posteriormente se probó en un experimento de unión como se describe en el Ejemplo 1 con una concentración de los fragmentos del grupo 1 y del grupo 2 desialilados de 2 pg/mL.

4.2 Resultados:

[0224] El fragmento del grupo 2 se unió a los SIGLEC SIG-5, SIG-7, SIG-F, SIG-9 en base a los valores de absorbancia mostrados en la Fig. 5. No se detectó absorbancia o se detectó poca absorbancia con SIG-10, lo que confirma los resultados de los otros ejemplos.

[0225] En consecuencia, un alto porcentaje de estructuras de núcleo 2 en grupos de O-glicano es un requisito para la unión a SIG-5, SIG-7, SIG-F, SIG-9.

Ejemplo 5 - Dependencia del ácido siálico de la unión de SIGLEC del grupo 2

5.1 Procedimiento experimental

[0226] Se desialiló una muestra del fragmento del grupo 2 obtenido como se describe en el Ejemplo 4. Los fragmentos del grupo 2 desialilados y los fragmentos del grupo 2 sin tratar se probaron posteriormente en un experimento de unión como se describe en el Ejemplo 1 con los SIGLEC SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 y una concentración de los fragmentos del grupo 1 y del grupo 2 desialilados de 2 pg/ml.

5.2 Resultados

[0227] Los valores de absorbancia detectados para el fragmento del grupo 2 sin tratar confirmaron los resultados encontrados en el Ejemplo 4 (véase la Fig. 6). El fragmento del grupo 2 desialilado no exhibe unión o solo exhibe poca. Por lo tanto, la sialilación de las 2 estructuras centrales de los grupos de O-glicano es un requisito para la unión a SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9.

Ejemplo 6 - Expresión recombinante de fragmentos de VWF con o sin repeticiones de glicano O-ligadas que contienen el s itio de unión de FVIII

[0228] Se expresaron dos fragmentos de vWF recombinantes en la línea celular HEK 293 F. El primer fragmento, Seq11, abarca AA 1-505 de SEQ ID NO: 1 y contiene el grupo 1 con los sitios de O-glicosilación 485, 492, 493, 500).

[0229] El segundo fragmento Seq12 comprende los AA 1 a 505 de SEQ ID NO: 1 y 2 repeticiones adicionales de los AA 475-505 (AA 1-505 2x 475-505) y, por lo tanto, dos copias adicionales de repeticiones del grupo de O-glicanos del grupo 1.

[0230] Seq11 y Seq12 se expresaron transitoriamente en la línea celular HEK293 con un etiqueta Strep C-terminal y se purificaron mediante cromatografía de afinidad Strep-tactin (IBA GmbH). Por lo tanto, los ADNc que codifican Seq11 y Seq12 se sintetizaron mediante GeneArt (Thermo Fisher Scientific) y se clonaron en el vector de expresión pDSG (IBA GmbH), que contiene un Twin-Streptag. Se transformaron lasE. coliTOP10 (IBA gmbH) con los constructos y se seleccionaron clones individuales tras una incubación durante la noche a 37 °C en placas de agar LB que contenían ampicilina. Las preparaciones de ADN plasmídico se realizaron utilizando el kit QIAamp DNA-Mini o Maxi (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La orientación correcta y la integridad de los constructos clonados se verificaron mediante secuenciación. Para la expresión eucariota de ambos fragmentos de vWF, las células MEXi-293 (IBA GmbH) cultivadas en medio de transfección MEXi (IBA GmbH), se transfectaron con 1,5 mg/l de los constructos utilizando 4,5 mg/ml de polietilenimina lineal de 25 kDa. Después de 2-4 horas de incubación a 37 °C, 5 % de CO2 y 100-150 rpm, el cultivo se diluyó 1:2 con medio de transfección MEXi y se continuó el cultivo hasta que la viabilidad celular alcanzó el 75 %. Posteriormente, el sobrenadante se separó de las células mediante centrifugación a 4°C y 300 x g. Con el fin de minimizar el efecto inhibidor de la biotina en el medio de cultivo celular y ajustar el pH, se añadieron al sobrenadante 0,1 volúmenes de tampón (1 M Tris-HCl, 1,5 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8,0) y 0,09 % (v/v) de solución BioLock (IBA GmbH) y se incubó durante 20 min a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se aplicó a la columna Strep-Tactin XT (IBA GmbH), se lavó cinco veces con tampón de lavado (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) y las proteínas que contenían etiqueta Strep unidas se eluyeron con tampón de elución (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM destiobiotina, pH 8,0).

[0231] Ambos fragmentos Seq11 y Seq12 se representan esquemáticamente en la Fig. 7.

Ejemplo 7 - Análisis de la O-glicosilación de los fragmentos de vWF Seq11 y Seq12

7.1 Procedimiento experimental

[0232] La O-glicosilación de los fragmentos Seq11 y Seq12 producidos según el Ejemplo 6 se analizó mediante espectrometría de masas.

[0233] Para ello, Seq11 y Seq12 se redujeron y alquilaron primero mediante incubación con 50 mM de ditiotreitol a 60 °C y posteriormente 20 min con 100 mM de yodoacetamida. Después de la digestión con tripsina y quimotripsina, los péptidos obtenidos se volvieron a tamponar en tampón de digestión de sialidasa A y se desialilaron durante la noche utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 3. Los O-glicopéptidos se enriquecieron específicamente mediante cromatografía de afinidad con jacalina(lectina de Artocarpus integrifolia)utilizando lectina inmovilizada en agarosa (Vector Laboratories).

La jacalina-agarosa se empaquetó en una columna impulsada por gravedad y la cromatografía se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los O-glicopéptidos eluidos se purificaron para una medición MALDI MS utilizando puntas de pipeta Ziptip C4 (Millipore) y se sometieron a una medición en un modo de ion positivo lineal utilizando una matriz de super DHB de 25 mg/ml disuelta en 50 % de acetonitrilo/0,1 % de ácido trifluoroacético.

[0234] Una alícuota de glicopéptidos enriquecidos se trató adicionalmente con O-glicosidasa (Endo-a-N-Acetilgalactosaminidasa, #P0733, New England Biolabs). Brevemente, los péptidos se incubaron con la enzima durante 2 h a 37 °C utilizando 1 pl de enzima por 10 ml de glicoproteína. Dado que la O-glicosidasa es específica solo para los O-glicanos núcleo 1 (disacárido Galp1^3GalNAca1^-Ser/Thr), deja los O-glicanos núcleo 2 y/o los O-glicanos núcleo 1 extendidos unidos a la estructura principal del péptido.

7.2 Resultados

[0235] Los resultados se resumen en las Figuras 8 y 9.

[0236] Los O-glicopéptidos se identificaron mediante una descomposición posterior a la fuente (PSD) MALDI. La secuencia peptídica del fragmento Seq11 identificado es KVTLNPs Dp EHCQICHCDWNL TCEACQEPGGL WPPTDAPVSPTTL YVEDISEP PLHGSAW (Se Q ID NO: 6). Los últimos cuatro aminoácidos (subrayados) corresponden a la etiqueta Strep C-terminal. Este péptido contiene cuatro sitios de O-glicosilación.

[0237] El espectro superior de la Fig. 8 muestra el glicopéptido completamente O-glicosilado, el espectro inferior de la Fig. 8 muestra el mismo glicopéptido después de la digestión con O-glicosidasa. El cambio de masa de 1460,3 Da después de la digestión con O-glicosidasa (marcado con una flecha), corresponde a cuatro O-glicanos núcleo 1 cada uno con una masa de 365 Da. Las distancias de masa de 365 Da, observadas en el espectro superior, corresponden a diferentes glicoformas del mismo péptido, mientras que cada aducto de masa adicional de 365 Da corresponde a un disacárido Galp1^4GlcNAc que forma la estructura central 2. Después del tratamiento con O-glicosidasa, se observan formas completamente desglicosiladas del péptido (8358,6 Da) y glicoformas que contienen estructuras núcleo 2 (Galp1^4GlcNAcp1^6(Galp1^-3)GalNAc, 730 Da) y/o estructuras núcleo 1 extendidas (Galp1^4GlcNAcp1^3Galp1^3GalNAc, 730 Da).

[0238] La secuencia peptídica identificada del fragmento Seq12 es KVTLNPSDPEHCQICHCDWNL TCEACQEPGGL WPPTDAPVSPTTL YVEDISEP PLHQEPGGL WPPTDAPVSPTTL YVEDISEPPLHQEPGGL WPPTDAPVSPTTL Y VEDISEPPLHGSAW (SEQ ID NO: 7). Los últimos cuatro aminoácidos (subrayados) corresponden a la etiqueta Strep C-terminal.

[0239] El espectro superior de la Fig. 9 muestra el glicopéptido completamente O-glicosilado, el espectro inferior de la Fig. 9 muestra el mismo glicopéptido después de la digestión con O-glicosidasa. El cambio de masa de 4380,3 Da después de la digestión con O-glicosidasa corresponde a doce O-glicanos núcleo 1 cada uno con una masa de 365 Da, lo que confirma que los doce sitios de O-glicosilación en Seq12 están ocupados por O-glicanos. De manera similar, como se observó para Seq11, las distancias de 365 Da y 730 Da observadas en los espectros corresponden al disacárido Galp1^4GlcNAc o a las estructuras de núcleo 2 y/o núcleo 1 extendido, respectivamente.

[0240] La cuantificación de los O-glicanos de tipo núcleo 1 y núcleo 2 se basa en la cantidad relativa de los glicopéptidos con el O-glicano respectivo unido. La cuantificación de las diferentes glicoformas de un péptido dado se realiza mediante la evaluación de la intensidad de la señal en el espectro MALDI.

[0241] Para el glicopéptido Seq11, la cuantificación se realiza en función de la intensidad de la señal MALDI de las diferentes glicoformas del mismo péptido. La intensidad máxima total de todas las glicoformas de este péptido (8358 Da, 8724 Da, 9089 Da, 9454 Da, 9819 Da, 10181 Da, 10543 Da, 10910 Da, 11277 Da) es igual a 41275 au, lo que representa el 100 %.

[0242] La glicoforma que contiene solo glicanos núcleo 1 con una masa de 8358 Da exhibe una intensidad de 8410 au, lo que corresponde al 20 % del total. Por lo tanto, todas las demás glicoformas (80 %) contienen al menos un glicano de tipo núcleo 2 y/o núcleo 1 extendido unido. En esta medición, el núcleo 2 y el núcleo 1 extendido no son distinguibles. En consecuencia, el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 y/o de núcleo 1 extendido basado en el número total de O-glicanos es al menos del 20 %.

[0243] En consecuencia, los cuatro sitios de O-glicosilación en Seq11 y los doce sitios de O-glicosilación en Seq12, ambos producidos de forma recombinante en una línea celular HEK, están ocupados con O-glicanos núcleo 1 y en un alto porcentaje también con O-glicanos núcleo 2 y/o O-glicanos núcleo 1 extendido. Considerando la alta cantidad de O-glicanos núcleo 2, ambas secuencias pueden ser buenos ligandos para la unión de SIGLEC. La adición de dos repeticiones de secuencia adicionales, que contienen cuatro sitios de O-glicosilación, dio como resultado con éxito una proteína con doce O-glicanos agrupados y completamente ocupados.

Ejemplo 8 - Análisis de la unión SIGLEC de Seq11 y Seq12

8.1 Procedimiento experimental

[0244] Las proteínas recombinantes que llevan etiqueta Strep Seq11 y Seq12 se probaron en el ELISA de unión SIGLEC como se describe en el Ejemplo 1, excepto por la estrategia de detección. En lugar de Streptavidina-HRP, se utilizó el conjugado Strep-Tactin-HRP (#2-1502-001, IBA GmbH) para la detección de las proteínas etiqueta Strep. La concentración de Strep-Tactin-HRP aplicada fue de 0,25 pg/ml. Ambas proteínas, Seq11 y Seq12, se probaron en una concentración molar igual de 42 nM.

8.2 Resultados

[0245] Como se muestra en la Fig. 10, ambos polipéptidos Seq11 y Seq12 exhibieron una unión a SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9. La absorbancia medida para ambos polipéptidos Seq11 y Seq12 a los cuatro SIGLEC estaba en el mismo rango que la unión de Seq11 y Seq12 a anti-vWF.

[0246] Por el contrario, la absorbancia de Seq11 y Seq12 en el experimento con SIG-2 y SIG10 estaba en el mismo rango que el experimento de control negativo con anticuerpo anti-pollo. Por lo tanto, ni Seq11 ni Seq12 se unieron a SIG-2 o a SIG-10 (ver Fig. 10).

Ejemplo 9 - Dependencia del ácido siálico de la unión de SIGLEC de Seq11 y Seq12

9.1 Procedimiento experimental

[0247] Se repitió el protocolo experimental según el Ejemplo 8 con la adición de una digestión con sialidasa A de los polipéptidos marcados con estreptococos Seq11 y Seq12. La desialilación se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 3.

9.2 Resultados

[0248] Los resultados de los experimentos de unión con Seq11 y Seq12 desialilados se muestran en la Fig. 11. Según las absorbancias medidas, la unión de Seq11 y Seq12 desialilados a SIG-5 se reduce fuertemente en comparación con los polipéptidos no tratados. La unión a SIG-7, SIG-F y SIG-9 se elimina por completo, es decir, la absorbancia está al mismo nivel que el determinado para la unión a SIG-2 y SIG10. Por lo tanto, la unión de ambos polipéptidos Seq11 y Seq12 a SIG-5, SIG-7, SIG-F y SIG-9 depende del ácido siálico.

Ejemplo 10 - Comparación de la unión de SIGLEC de Seq11 y Seq12

10.1 Procedimiento experimental

[0249] Para medir y comparar las afinidades de unión aparentes de Seq11 y Seq12, se aplicó el ELISA de SIGLEC con análisis de Scatchard de las curvas de unión. El ELISA se realizó como se describe en los Ejemplos 8 y 9. El análisis de Scatchard se realizó utilizando el software Graph Pad Prism.

10.2 Resultados

[0250] Las curvas de unión de las secuencias 11 y 12 y los gráficos de Scatchard correspondientes se representan en las figuras 12 y 13. Las afinidades de unión aparentes (Kd) derivadas de los gráficos de Scatchard se resumen en la figura 14. El aumento de las repeticiones de O-glicano en Seq12 tuvo un efecto significativo en la afinidad de unión de SIGLEC. La afinidad por SIG-5 pudo aumentarse de 0,494 mM para Seq11 a 0,14 mM para Seq12. La afinidad por SIG-7 pudo aumentarse de 0,371 mM para Seq11 a 0,005 mM para Seq12. La afinidad por SIG-8 pudo aumentarse de 1,027 mM para Seq11 a 0,015 mM para Seq12. Finalmente, la afinidad por SIG-9 se pudo aumentar de 0,591 mM para Seq11 a 0,041 mM para Seq12.

Ejemplo 11 - Determinación de la afinidad de unión de FVIII de Seq11 y Seq12

11.1 Procedimiento experimental

[0251] La unión de FVIII de ambas secuencias se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (RPS). El análisis se llevó a cabo utilizando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). Los polipéptidos de las secuencias 11 y 12 se inmovilizaron en un chip CM5 utilizando un kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare). Como control positivo se inmovilizó VWF plasmático de longitud completa (Wilate, Octapharma). Posteriormente, se inyectó una serie de concentraciones de FVIII (Nuwiq, Octapharma) (0,2 nM, 0,6 nM, 1,7 nM, 5,0 nM, 15 nM, 45 nM) sobre la superficie del chip sensor. El tampón de ejecución fue 150 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,05 %.

11.2 Resultados

[0252] La medición de RPS reveló que la afinidad de unión de FVIII (Kd) de ambas secuencias es igual a 1,4 nM. Por lo tanto, las repeticiones de O-glicano adicionales no tienen impacto en la afinidad de unión a FVIII.

Ejemplo 12 - El fragmento de VWF N-terminal, pero no el C-terminal, reduce el nivel extracelular de IL-12p70 e IFN-Y

12.1 Antecedentes

[0253] Las SIGLEC se expresan en varias células del sistema inmunitario, incluidos monocitos y células dendríticas, y exhiben un papel en la adhesión celular y endocitosis. También modulan las vías de señalización de la inmunidad adaptativa e innata (Macauley et al., 2014). La mayoría de las SIGLEC contienen un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) o un motivo similar a ITIM en su dominio citoplasmático, que se ha demostrado que funciona en la atenuación de la respuesta inflamatoria al inhibir la proliferación y activación celular (Vitale et al., 1999; Ikehara et al., 2004), inducir apoptosis (Nutku et al., 2003) y suprimir la producción de citocinas (Erdmann et al., 2009; Chen et al., 2013).

[0254] Para ver si los niveles de citocinas inflamatorias producidas por células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros (moDC) se alteran en presencia de los fragmentos de vWF que interactúan con SIGLEC, se analizaron simultáneamente las cantidades de IL-12p70 e IFN-y en el sobrenadante de moDC estimuladas mediante citometría de flujo.

12.2 Diseño experimental

[0255] Los monocitos de donantes sanos se enriquecieron mediante gradiente de Ficoll y posteriormente los monocitos CD14+ se purificaron mediante clasificación magnética de células. Para obtener moDC, los monocitos CD14+ se cultivaron durante 5 a 6 días en medio RPMI suplementado con 10 % de suero bovino fetal, 1000 U/ml de interleucina 4 y 1000 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos. El perfil de citocinas secretado por los moDC se analizó 24 h después de la estimulación con los respectivos fragmentos de vWF mediante la matriz de perlas citométricas CBA Flex (BD) que detecta IL-12p70 e IFN-y de acuerdo con la recomendación del fabricante. Las células tratadas con el mismo volumen de 100 mM de NaCl sirvieron como control. Las muestras se analizaron con el citómetro de flujo FACSVerse. El análisis final y el cálculo de la concentración de citocinas se llevaron a cabo utilizando el software FCAP Array (BD).

12.3 Resultados

[0256] La Figura 16 muestra la concentración de citocinas después de la incubación de los moDC con los dos fragmentos de vWF con y sin estimulación con LPS. Según estos resultados, la parte N-terminal, pero no la C-terminal del vWF reduce la producción de citocinas proinflamatorias sintetizadas en respuesta a la estimulación con LPS. Sin la estimulación con LPS, no se pudo detectar ningún efecto de los fragmentos de vWF sobre la secreción de las citocinas proinflamatorias.

Ejemplo 13 - Análisis de la fosforilación de SIGLEC y sus moléculas adaptadoras

13.1 Antecedentes

[0257] Tras la unión del ligando que contiene ácido siálico, los motivos ITIM y similares a ITIM de los SIGLEC se fosforilan por las tirosina quinasas de la familia SRC, lo que conduce al reclutamiento de las fosfatasas de tirosina proteica (SHP)-1 y SHP-2 que contienen el dominio de homología 2 de SRC (SH2). Una vez activadas, estas fosfatasas pueden desfosforilar sustratos celulares, controlando así la activación de varias vías de señalización (Crocker et al., 2007). Si bien se le ha atribuido a SHP-1 un papel en la señalización inhibidora, SHP-2 mejora la transducción de señales en la mayoría de las vías de señalización, pero también se ha informado que está involucrada en la regulación negativa de los procesos de señalización intracelular (An et al., 2006; Avril et al., 2004; Boyd et al., 2009; Qu, 2000; Salmond y Alexander, 2006).

13.2 Procedimiento experimental

[0258] Los MoDC se prepararon como se describe en el ejemplo 12. Para determinar la influencia del fragmento vWF N-terminal en la fosforilación de tirosina de los SIGLEC y sus moléculas adaptadoras SHP-1 y SHP-2, se incubaron 6*106 moDC durante 10 minutos con 500 nM del fragmento vWF N-terminal. Las células estimuladas con el mismo volumen de 100 mM de NaCl sirvieron como control. El análisis de la fosforilación de inmunorreceptores se llevó a cabo con el kit Proteome Profiler Human Phospho-Immunoreceptor Array Kit (R&D systems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante utilizando 500 |jg de lisado celular.

13.3 Resultados

[0259] Los resultados de la matriz de fosfoinmunoreceptores se muestran en la figura 17. Según la densidad de píxeles medida, el fragmento de vWF N-terminal altera específicamente la fosforilación de SHP-1, SHP-2, SIG-5 y SIG-7 en comparación con el control. No se pudo observar la fosforilación de SIG-2 y SIG-10, lo que concuerda estrechamente con la falta de unión del fragmento de vWF N-terminal a estas SIGLEC.

REFERENCIAS

[0260]

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Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido glicosilado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%idéntica a al menos un fragmento de vWF humano (SEQ ID NO: 1), en donde dicho polipéptido glicosilado contiene uno o más grupos de sitios de O-glicosilación, en donde dichos grupos contienen al menos dos sitios de O-glicosilación y uno o más O-glicanos sialilados, en donde el número combinado de O-glicanos sialilados de núcleo 2 y núcleo extendido 1 del polipéptido glicosilado es mayor que el número de O-glicanos sialilados de núcleo 2 y núcleo extendido 1 del vWF humano o el fragmento del mismo y en donde el polipéptido glicosilado muestra una afinidad de unión aumentada a uno o más SIGLEC, seleccionados entre SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 en comparación con el vWF humano o el fragmento del mismo.

2. Polipéptido glicosilado según la reivindicación 1, en el que el número de O-glicanos núcleo 2 sialilados del polipéptido glicosilado es mayor que el número de O-glicanos núcleo 2 sialilados de la proteína humana o fragmento de la misma.

3. Polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el uno o más grupos contienen al menos tres sitios de O-glicosilación y preferiblemente al menos cuatro sitios de O-glicosilación y/o el uno o más grupos contienen al menos un sitio de O-glicosilación en diez aminoácidos, preferiblemente al menos un sitio de O-glicosilación en cuatro aminoácidos, más preferiblemente al menos un sitio de O-glicosilación en tres aminoácidos y lo más preferiblemente un sitio de O-glicosilación en dos aminoácidos.

4. Polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que contiene al menos dos grupos, más preferiblemente al menos tres grupos, en donde los grupos están separados preferiblemente por menos de 100 aminoácidos, más preferiblemente en menos de 50, más preferiblemente en menos de 30 aminoácidos.

5. Polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el porcentaje de O-glicanos núcleo 2 sialilados basado en el número de O-glicanos sialilados es preferiblemente al menos 5 %, más preferiblemente al menos 10 %, más preferiblemente al menos 35 %.

6. Polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número total de sitios de O-glicosilación del polipéptido glicosilado es mayor que el número total de sitios de O-glicosilación de dicho vWF humano o dicho fragmento del mismo.

7. Polipéptido glicosilado según la reivindicación 6, en el que uno o más sitios de O-glicosilación están ubicados dentro de la secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a la proteína humana o fragmento de la misma, en particular reemplazando aminoácidos de la proteína humana o fragmento de la misma.

8. Polipéptido glicosilado según la reivindicación 6, en el que el polipéptido glicosilado es una proteína de fusión, en el que una segunda secuencia de aminoácidos que contiene uno o más sitios de O-glicosilación está unida covalentemente a la secuencia de aminoácidos idéntica u homóloga a la proteína humana o fragmento de la misma, en el que preferiblemente el enlazador covalente es un enlace seleccionado de un enlace peptídico, un enlazador químico o un enlace glucosídico.

9. Polipéptido glicosilado según la reivindicación 8, en el que la segunda secuencia de aminoácidos es al menos 98 % homóloga, preferiblemente idéntica a los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1 o a dos copias consecutivas de los aminoácidos 475 a 505 de SEQ ID NO: 1.

10. Polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 producido por expresión en una línea celular humana.

11. Uso de un polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que contiene uno o más grupos adicionales de O-glicanos sialilados y que muestra una unión aumentada a uno o más SIGLEC, seleccionados entre SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 para reducir la respuesta inmunitaria de un segundo polipéptido, en particular una proteína terapéutica.

12. Composición que comprende un primer y un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido es un polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y el segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos homóloga o idéntica a una segunda proteína de mamífero, en particular humana, en la que el primer y el segundo polipéptido forman un complejo proteico y en la que, en comparación con el segundo polipéptido, la composición tiene una afinidad de unión aumentada a un SIGLEC seleccionado de uno o más SIGLEC, seleccionados de SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que el segundo polipéptido se selecciona de una proteína FVIII, FVII, FIX, ADAMTS13, en particular una proteína FVIII de longitud completa, una proteína FVIII con el dominio B eliminado o una proteína FVIII en la que una parte del dominio B ha sido reemplazada por un enlazador.

14. Composición según la reivindicación 11 o 12, en la que el primer polipéptido comprende al menos un fragmento de vWF humano, en particular el fragmento de vWF es al menos 95 % idéntico a la secuencia definida por 1 a 505 de SEQ ID NO: 1, al menos 95%idéntico a SEQ ID NO: 2, al menos 95%idéntico a SEQ ID NO: 3, al menos 95%idéntico a SEQ ID NO: 4 o al menos 95 % idéntico a SEQ ID NO: 5 o y el segundo polipéptido es una proteína FVIII.

15. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido glicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

16. Un vector que contiene una estructura principal del vector y el polinucleótido según la reivindicación 15, en el que la estructura principal del vector se selecciona preferiblemente de pCDNA3, pCDNA3.1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, pIRES y pSCAS.

17. Una célula huésped que contiene el polinucleótido según la reivindicación 15 o el vector según la reivindicación 16, en el que la célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero, preferiblemente una célula humana, más preferiblemente una célula renal humana, lo más preferiblemente una línea celular renal embrionaria humana, en particular una línea celular HEK293 tal como HEK293F.

18. Un polipéptido glicosilado definido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una composición definida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno hemorrágico, seleccionado preferiblemente entre el tratamiento de pacientes no tratados previamente (PUP) y el tratamiento de introducción de tolerancia inmunitaria (ITI).