ES2988499T3 - Composiciones y métodos para tratar trastornos de la retina - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a la prevención y/o tratamiento de trastornos de la retina, tales como distrofias de conos, distrofias de conos y bastones, en particular acromatopsia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para tratar trastornos de la retina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de distrofias de la retina, en particular, distrofias de conos, distrofias de conos-bastones y acromatopsia.
Antecedentes de la invención
En muchas especies de mamíferos, incluyendo los ratones y los seres humanos, el número de fotorreceptores de bastón que median la visión bajo luz tenue supera en gran medida al de fotorreceptores de cono. Sin embargo, en un mundo industrializado donde la iluminación permite que los conos funcionen durante todo el día y la noche, la visión mediada por bastones es menos importante. Muchos pacientes con ausencia de función de los bastones desde el nacimiento se identifican sólo incidentalmente y, de hecho, no pueden reconocer su visión anormal. En cambio, cuando hay disfunción de los conos, los pacientes siempre presentan síntomas y con frecuencia padecen una discapacidad visual que depende del grado de disfunción de sus conos.
En algunas afecciones, solamente, o mayoritariamente, los conos se pierden o son disfuncionales, y los bastones permanecen relativamente conservados. Dichas afecciones pueden conocerse como distrofias de conos o distrofias de conos-bastones (DCB). Las distrofias de conos o de conos-bastones son distrofias de la retina hereditarias que se caracterizan por la pérdida primaria de conos o, en ocasiones, por la pérdida simultánea de conos y bastones. Los síntomas incluyen pérdida de la visión, sensibilidad a las luces brillantes y mala visión del color. Por ejemplo, la acromatopsia es una distrofia de la retina hereditaria grave, con ausencia total de función de los conos desde el nacimiento pero, supuestamente, con una función de los bastones normal. Se han asociado a la enfermedad mutaciones en múltiples genes, incluyendoCNGA3, CNGB3yPDE6C.Cada uno de los genes causantes de la enfermedad codifica un componente esencial de la cascada de fototransducción de conos que traduce la luz en una señal eléctrica al provocar la hiperpolarización de la célula fotorreceptora. La deficiencia, por ejemplo, en la proteína CNGA3 o CNGB3 en las células fotorreceptoras conos conduce a una incapacidad de las células para hiperpolarizarse en respuesta a la luz. Como resultado, las células inicialmente sobreviven, pero no funcionan y el paciente padece de mala agudeza visual, falta de visión del color y fotofobia desde el nacimiento. Diversos grupos han desarrollado protocolos de terapia en ratones deficientes enCNGA3que mejoran la supervivencia y la función de los conos, así como la visión.
Otros ejemplos de genes causantes implicados en la patogenia de las distrofias de conos incluyenKCNV2, PDE6H, GNAT2yCACNA2D4.El genKCNV2codifica la proteína miembro 2 de la subfamilia V del modificador de canales de potasio dependientes de voltaje. Las mutaciones enKCNV2se asocian a distrofia de conos con electrorretinograma de bastones (ERG) supernormal, o distrofia de conos de la retina de tipo 3B, un trastorno autosómico recesivo que provoca pérdida visual de por vida combinada con una respuesta ERG supernormal a un destello de luz brillante. El genPDE6Hcodifica la subunidad inhibidora (gamma) de la fosfodiesterasa del GMPc específica de los conos. Las mutaciones en este gen se asocian a la distrofia de conos de la retina de tipo 3A (RCD3A,por sus siglas en inglés). El genGNAT2codifica la subunidad alfa específica de los conos de la transducina. Las mutaciones en el gen pueden dar como resultado distrofia de conos de inicio infantil. El gen CACNA2D4 codifica la subunidad alfa-2/delta 4 de canales de calcio dependientes de voltaje. Las mutaciones en el gen pueden provocar disfunción de los conos no progresiva (distrofia 4 de los conos de la retina, RCD4, por sus siglas en inglés).
En la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la alteración visual se debe principalmente a la degeneración de la fóvea rica en conos en la mácula central. Por lo tanto, los pacientes pierden la visión central y la agudeza visual, pero con frecuencia tienen una mácula periférica relativamente bien conservada y, por lo tanto, tienen cierta visión residual útil que está limitada por la escasez de conos fuera de la fóvea.
Existe la necesidad de desarrollar terapias que puedan mejorar la supervivencia y la función de los conos, con el fin de tratar o prevenir trastornos de la retina tales como las distrofias de conos y bastones.
Los documentos WO2015142941, WO2011034947 y Smallwoodet al.(2002)"Role of a Locus Control Región in the Mutually Exclusive Expression of Human Red and Green Cone Pigment Genes" PNAS Biological Sciences99 (2) 1008-1011 describen matrices de genes de pigmentos rojos y verdes que comprenden una región de control de locus en dirección 5' de un promotor.
Sumario de la invención
En el presente documento se describen ácidos nucleicos, unidades de control de la transcripción (TCU, por sus siglas en inglés), secuencias génicas optimizadas, construcciones de expresión y vectores para expresar genes en fotorreceptores de cono.
Las TCU divulgadas en el presente documento comprenden un promotor de opsina M o un fragmento del mismo bajo el control de la Región de control del locus (LCR, por sus siglas en inglés) de opsina M/L y son útiles para impulsar niveles altos de expresión en los tres tipos de conos humanos.
También se describen construcciones de expresión, que comprenden un genCNGA3humano bajo el control de una TCU optimizada para expresar genes en fotorreceptores de cono, en donde la TCU comprende un promotor de opsina M o fragmento del mismo bajo el control de la Región de control del locus de opsina M/L.
Las TCU y las construcciones de expresión pueden contener una mutación de 6 pb inmediatamente en dirección 3' del sitio de inicio de la transcripción en el promotor de opsina M o fragmento del mismo (mutación "M8"), en donde la mutación puede aumentar el efecto del tratamiento de los vectores y las construcciones de expresión que contienen esta mutación a lo largo del tiempo.
Se describe además una secuencia de codones optimizados del gen CNGA3, que se proporciona como la SEQ ID NO: 8.
También se describen vectores, tales como vectores víricos, que comprenden las construcciones de expresión divulgadas en el presente documento. La construcción de expresión puede suministrarse usando un vector derivado del serotipo 8 de adenovirus (AAV8) o un serotipo de AAV fuerte alternativo.
La invención también proporciona los ácidos nucleicos, unidades de control de la transcripción (TCU), secuencias génicas optimizadas, construcciones de expresión y vectores para su uso en métodos para el tratamiento y/o la prevención de trastornos o distrofias de la retina, incluyendo, pero sin limitación, distrofias de conos tales como la acromatopsia.
En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona:
una unidad de control de la transcripción (TCU) de hasta 2500 nucleótidos de longitud que comprende en dirección de 5' a 3':
(a) una Región de control del locus (LCR) que comprende
(i) la SEQ ID NO 1; o
(ii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (a)(i); y
(b) un elemento promotor que comprende
(i) al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17; o
(ii) al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16; o
(iii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (b)(ii), en donde los nucleótidos que corresponden a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16;
presentando dicha TCU actividad promotora específica de fotorreceptores de cono.
De acuerdo con el aspecto anterior, el elemento promotor (b) puede comprender opcionalmente (i) al menos los últimos 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17, o (ii) al menos los últimos 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16, o una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (ii) y en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 (GGGCCG) de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, el elemento promotor (b) puede comprender al menos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.
De acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, el elemento promotor (b) puede comprender la SEQ ID NO: 3 [elemento promotor de 529 pb en hG1.7] o la SEQ ID NO: 5 [elemento promotor de 247 pb en hG1.4] o una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 5.
En los aspectos anteriores, los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 (GGGCCG) de la SEQ ID NO: 2 se reemplazan por la SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con una realización, la TCU comprende la SEQ ID NO: 4 [variante de la construcción promotora hG1.7, faltan cuatro nucleótidos], la SEQ ID NO: 6 [construcción hG1.4] o la SEQ ID NO: 15 [construcción promotora hG1.7 en el producto].
La invención también proporciona una construcción de expresión que comprende una TCU descrita en el presente documento, en donde la TCU está unida operativamente a una secuencia que se ha de expresar de una manera específica de fotorreceptores de cono. En una realización, la secuencia unida operativamente a la TCU comprende un gen que codifica CNGA3, CNGB3, PDE6C, PDE6H, GNAT2, KCNV2 o CACNA2D4. En algunas realizaciones, la secuencia unida operativamente comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14, o que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 y tiene la capacidad de rescatar la función de los fotorreceptores de cono. En una realización, la secuencia unida operativamente comprende la SEQ ID NO: 8 [secuencia con codones optimizados de CNGA3] o que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 y tiene la capacidad de rescatar la función de los fotorreceptores de cono.
La invención también proporciona vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos, TCU, fragmentos promotores, genes con codones optimizados y/o construcciones de expresión descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el vector es un vector vírico.
En algunas realizaciones, el vector es un vector de AAV y/o comprende un genoma de AAV o un derivado del mismo. En una realización, el derivado es un derivado quimérico, reordenado o con cápside modificada. En una realización, el genoma de AAV es de un serotipo o aislado o clado de AAV derivado de forma natural. En una realización, el genoma de AAV es del serotipo 2 de AAV (AAV2), el serotipo 4 de AAV (AAV4) o el serotipo 8 de AAV (AAV8) y/o la cápside de AAV deriva de AAV8. En una realización preferida, el genoma deriva de AAV2 y la cápside deriva de AAV8. En una realización, el vector de AAV lleva un gen que codifica CNGA3.
La invención proporciona además células hospedadoras que contienen un ácido nucleico o vector divulgado en el presente documento, así como células hospedadoras que producen un ácido nucleico o vector vírico como se divulga en el presente documento. En una realización, la célula hospedadora es una célula HEK293 o HEK293T.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico o vector descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además ácidos nucleicos, vectores, secuencias génicas optimizadas y/o construcciones de expresión descritos en el presente documento para su uso en un método de prevención o tratamiento de trastornos de la retina. En una realización, el trastorno de la retina es acromatopsia. En algunas realizaciones, el vector para su uso en el método de prevención o tratamiento de trastornos de la retina se administra a un paciente mediante inyección retiniana, subretiniana o intravítrea directa.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de un estudio de expresión de gen indicadorin vivoen ratones transgénicos para evaluar el efecto de la posición de la Región de control del locus (LCR) en el promotor central de la opsina verde (M). Parte superior izquierda: La matriz de genes de pigmentos rojo y verde humanos normales que muestra las ubicaciones de la LCR, unidades de transcripción y exones. Parte inferior izquierda: Matrices de genes de pigmentos visuales modificadas que se muestran a una escala ampliada 10 veces. Los sitios de inicio y la dirección de la transcripción se muestran mediante flechas. Projo = promotor del gen de pigmento rojo humano. Pverde = promotor del gen de pigmento verde humano. AP, fosfatasa alcalina placentaria humana. lacZ, p-galactosidasa deE. coli.Derecha: Gráficos circulares que muestran la fracción de células que expresan transgenes que expresan solamente AP (color rojo), sólo lacZ (color verde oscuro), tanto AP como lacZ (color amarillo) o lacZ>>AP (color verde claro) en ratones quiméricos o transmitidos por estirpe germinal para las construcciones que se muestran a la izquierda. Los recuentos de células de diferentes ratones derivados de la misma estirpe de células ES se agruparon para producir un único gráfico circular. Los recuentos de células de aquellas estirpes de ratones de las que se eliminó el marcador PGK-neo mediante cruce con ratones cre de estirpe germinal se muestran inmediatamente a la derecha del gráfico circular de la estirpe parental correspondiente.
La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de la disposición cromosómica de los promotores de opsina roja (L) y verde (M) (en recuadro, parte superior). Diagramas esquemáticos de unidades de transcripción desarrolladas anteriormente (pR2.1 y PR1.7), así como de las unidades de control de la transcripción modificadas por ingeniería genética divulgadas en este estudio. LCR = Región de control del locus.
La Figura 3 ilustra el patrón de transducción de células de cono transducidas con un vector AAVssh10 que expresa proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) bajo el control de la TCU hG1.4. Se muestran criosecciones de retina derivada de células madre embrionarias humanas transducidas con AAVshh10-hG1.4(M8)-GFP. El patrón de transducción de las células de cono se visualizó mediante formación de imágenes de GFP (A). La colocalización de la opsina azul (opsina S; B) con GFP (B') y opsina roja/verde (opsina L/M; C) con GFP (C') se indica después de la tinción usando anticuerpos que se unen a la opsina azul (opsina S) o a las opsinas roja/verde (opsina L/M).
La Figura 4 ilustra que la inclusión de la secuencia M8 en la TCU potencia el rescate de las respuestas fototópicas en ratones con inactivación deCNGA3.Se muestran respuestas de electrorretinograma (ERG) fotópicas de ratones con inactivación deCnga3tratados con vectores AAV2/8 que llevan construcciones de CNGA3 con codones optimizados (coCNGA3) impulsadas por diferentes TCU con o sin la secuencia M8. Se muestran las respuestas ERG 1 mes (barras de la izquierda) y 2 meses (barras de la derecha) después de la inyección. Todos los animales se trataron a 1 mes de edad, excepto el grupo del extremo derecho; este grupo se trató a las 2 semanas.
La Figura 5 ilustra que CNGA3 con codones optimizados rescata las respuestas fototópicas en ratones con inactivación deCNGA3más eficazmente que el genCNGA3de tipo silvestre. Respuestas de ERG fotópicas en ratones con inactivación deCnga3tratados con vectores AAV2/8 que llevan construcciones de CNGA3 con codones optimizados ("co") y CNGA3 de tipo silvestre ("no co").
La Figura 6 ilustra que un vector AAV2/8 que expresa CNGA3 bajo el control de la TCU hG 1.4 es eficaz para restablecer la función de los conos en ratones con inactivación deCNGA3.(A) Trazos de ERG fotópico de un ratón con inactivación deCnga3tratado y sin tratar con AAV8. Se anotan las ondas A y B. El eje Y indica pV. Configuración de luminosidad: 10 Cdsm-2. (B) Respuestas de ERG fotópicas de ratones con inactivación deCnga3tratados con AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3 o AAV2/5-hG1.4(M8).coCNGA3. Configuración de luminosidad: 10 Cdsm-2.
La Figura 7 ilustra el Rescatein vivoa largo plazo de la sensibilidad de la retina con vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 bajo control de dos TCU optimizadas diferentes hasta 6 meses después del tratamiento. A los ratones deficientes enCnga3se les inyectó por vía subretiniana a la edad de 2 semanas AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3 (n = 14) o AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 (n = 13) (título 1 * 1012 vg/ml para ambos). Sin tratar (n = 3). Configuración de luminosidad: 10 Cdsm-2.
La Figura 8 ilustra el aumento de la supervivencia de los conosin vivo3-4 meses después del tratamiento con vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 bajo el control de la TCU hG1.7. Imágenes confocales de plano único de la retina de montaje plano de un ratón C57BL/6J de 3-4 meses de edad (A), o un ratón deficiente enCnga3de la misma edad sin inyectar (B) o inyectado (C) con AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 a las 2 semanas de edad. Las retinas se tiñeron con arrestina de conos y se aclararon. Barra de escala: 5 pm.
La Figura 9 ilustra el aumento de la supervivencia a largo plazo de los conosin vivo,13 meses después del tratamiento con un vector AAV2/8 que expresa CNGA3 bajo el control de la TCU hG1.7. Imágenes confocales de proyección Z (A, B) o imágenes confocales de plano único (C, D) de retina de montaje plano de un ratón deficiente en Cnga3 de 14 meses de edad inyectado con AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 a las 2 semanas de edad. Los ratones sin tratar no presentan tinción positiva de PNA a esta edad. Los montajes planos de retina se tiñeron con PNA (A, C) y arrestina de conos (B, D) y se aclararon. Barra de escala: 10 pm (A, B), 5 pm (C, D).
La Figura 10 ilustra una cuantificación de la mejora de la integridad sináptica entre las células de cono y las neuronas de soporte (células bipolares)in vivo3-4 meses después del tratamiento con un vector AAV2/8 que expresa CNGA3 bajo el control de la TCU hG1.7. La evaluación se realizó usando la intensidad de la señal del marcador sináptico Gpr179. El análisis de la intensidad de señal de la tinción de Gpr179 se realizó en imágenes confocales de un plano único de retinas de montaje plano de un ratón C57BL/6J de 3-4 meses de edad, o un ratón deficiente en Cnga3 de la misma edad sin inyectar o inyectado con AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 a las 2 semanas de edad. Las retinas se tiñeron con Gpr179 y PNA y después se aclararon. Las tinciones de Gpr179 se trazaron dibujando una línea a mano alzada en varias tinciones de Gpr179 relacionadas con pedículos de cono (se usó la tinción de PNA para confirmar los pedículos de cono) y más de 10 tinciones de Gpr179 relacionadas con esférulas de bastón (A). La intensidad de señal fue el resultado (B; línea blanca: Gpr179, línea roja: PNA). Se promediaron los picos de intensidad de señal de cada origen y se calculó la relación de GPr179 relacionada con pedículos de cono con respecto a esférulas de bastón (CP/RS, por sus siglas en inglés). Se usaron CP/RS de cuatro ubicaciones diferentes para el análisis estadístico (Ensayo de comparación múltiple de Bonferroni (ns: p>0,05, **: p<0,01, *: p<0,05)). Las barras de error indican el ETM. (C).
La Figura 11 ilustra que la expresión de CNGA3 bajo el control de la TCU hG1.4 en vectores AAV8 conduce a respuestas ERG mejoradas en ratones deficientes enCNGA3en comparación con los vectores de AAV Anc80L65, AAV44.9 o AAV5, respectivamente. (A). Comparación de Anc80L65 y AAV8. Se suministraron AAV-Anc80L65 o AAV8 que llevaban el casete de expresión hG1.4(M8).coCNGA3 a ratones deficientes en CngaJ a la edad de 2 semanas. **: p < 0,01, *: p < 0,05. Las barras de error indican el ETM. (B). Comparación de AAV8 y AAV44.9 para el suministro de CNGA3 en ratones deficientes enCnga3a las 4 semanas de edad. Las barras de error indican el ETM. (C) Comparación de AAV5 y AAV8. Se suministraron AAV5 o AAV8 que llevaban el casete de expresión hG1.4(M8).coCNGA3 a ratones deficientes enCnga3a la edad de 2 semanas. **: p<_0,01, *: p<_0,05. Las barras de error indican el ETM.
La Figura 12 ilustra los niveles de expresión mejorados para las TCU hG1.4 y hG1.7 que llevan la mutación M8 en comparación con los niveles de expresión observados para los promotores de conos conocidos. (A) Se transdujeron hEB de 17-19 semanas de edad con AAVShH10 que expresaba eGFP bajo dos promotores de opsina verde diferentes (hG1.4 y hG1.7) y se recogieron 2 semanas después (n = 6-8 para cada promotor). Después de la disociación, se analizaron las células para determinar la intensidad de fluorescencia media relativa (IFM) en células positivas para GFP (la IFM relativa en los hEB transducidos con AAVShH10-eGFP analizados el mismo día del experimento se calculó como una relación con respecto a la IFM en los EB transducidos con AAV ShH10-1.7L-eGFP) mediante citometría de flujo. El asterisco indica diferencia significativa (p < 0,01). Las barras de error indican el ETM. (B) Respuestas de ERG fotópicas de ratones con inactivación deCnga3tratados con AAV2/8-CAR-CNGA3 o dejados sin tratar. El eje Y indica pV. Configuración de luminosidad: 10 Cdsm'2.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ADN de un fragmento de 1,2 kb de la Región de control del locus de opsina M/L humana.
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de ADN de un fragmento de 2,0 kb del promotor de opsina M humana. La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de ADN de un fragmento de 500 pb del promotor de opsina M humana. La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de ADN de una variante de la construcción hG1.7(M8), que consiste en un fragmento de 1,2 kb de la Región de control del locus de la opsina M/L humana seguido de un fragmento de 500 pb del promotor de opsina M humana, incluyendo dicho fragmento promotor de opsina la mutación M8.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de ADN de un fragmento de 200 pb del promotor de opsina M humana. La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de ADNc de la construcción hG1.4(M8), que consiste en un fragmento de 1,2 kb de la Región de control del locus de la opsina M/L humana seguido de un fragmento de 200 pb del promotor de opsina M humana, incluyendo dicho fragmento promotor de opsina la mutación M8.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de ADNc del genCNGA3humano.
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de ADNc con codones optimizados del genCNGA3humano.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de ADNc del genPDE6Chumano.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de ADNc del genPDE6Hhumano.
La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de ADNc del genGNAT2humano.
La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de ADNc del genKCNV2humano.
La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de ADNc del genCACNA2D4humano.
La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de ADNc del genCNGB3humano.
La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de ADN de la construcción hG1.7(M8), que comprende un fragmento de 1,2 kb de la Región de control del locus de la opsina M/L humana seguida de la secuencia GATC y un fragmento de 500 pb del promotor de opsina M humana, incluyendo dicho fragmento promotor de opsina la mutación M8.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de la mutación M8.
La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de ADN de un fragmento de 2,0 kb del promotor de opsina M humana que contiene la mutación M8.
Descripción detallada de la invención
Se ha de entender que las diferentes aplicaciones de las secuencias polinucleotídicas divulgadas pueden adaptarse a las necesidades específicas de la técnica. También se ha de entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.
Además, como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contenido indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polinucleótido" incluye "polinucleótidos", la referencia a "un promotor" incluye "promotores", la referencia a "un vector" incluye dos o más de dichos vectores y similares. "Opsina M/L" y "opsina L/M" se usan indistintamente para referirse a la opsina verde y roja.
Unidades de control de la transcripción (TCU)
En un aspecto, la invención proporciona una TCU optimizada para la expresión de genes en células fotorreceptoras de cono de hasta 2500 nucleótidos de longitud que comprende en dirección de 5' a 3':
(a) una Región de control del locus 5 (LCR) que comprende
(i) la SEQ ID NO 1; o
(ii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (a)(i); y (b) un elemento promotor que comprende
(i) al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17; o
(ii) al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16; o
(iii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (b)(ii), en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 (GGGCCG) de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16;
presentando dicha TCU actividad promotora específica de fotorreceptores de cono.
En una realización, la divulgación proporciona una TCU que comprende un fragmento de la Región de control del locus (LCR) de opsina M/L. En una realización preferida, la TCU comprende un fragmento de la Región de control del locus (LCR) de opsina M/L humana.
En otra realización, la divulgación proporciona una TCU que comprende una región promotora, tal como el promotor de opsina M o un fragmento del mismo. En una realización preferida, la TCU divulgada en el presente documento comprende el promotor de opsina M humana o un fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, la TCU comprende fragmentos y/o variantes de la Región de control del locus (LCR) de opsina M/L humana y el promotor de opsina M humana o un fragmento del mismo, en donde la TCU tiene actividad promotora específica de fotorreceptores de cono.
En una realización, la TCU comprende una LCR que comprende una secuencia de nucleótidos, normalmente nucleótidos contiguos, de la SEQ ID NO: 1 que confiere expresión específica de fotorreceptores de cono de una secuencia polinucleotídica unida operativamente. También se contempla una LCR que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la LCR contiene una supresión o una inserción de uno o más nucleótidos, en donde la supresión o inserción no elimina la expresión específica de fotorreceptores de cono de una carga útil génica unida operativamente a la LCR modificada.
En una realización, la TCU comprende un promotor de opsina M o un fragmento del mismo, en donde el promotor de opsina M o fragmento del mismo comprende una secuencia de nucleótidos, normalmente nucleótidos contiguos, de la SEQ ID NO: 17 que confiere expresión específica de fotorreceptores de cono en una secuencia polinucleotídica unida operativamente. El promotor de opsina M o fragmento del mismo puede comprender, por ejemplo, hasta 1200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17, y preferentemente no más de 1100, no más de 1000, no más de 900, no más de 800, no más de 700, no más de 600, no más de 500, no más de 400, no más de 300 o no más de 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, el fragmento del promotor de opsina M comprende al menos 200, 300, 400 o 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17. También se contempla un fragmento del promotor de opsina M que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos 200 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 17, o al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos 300, al menos 400 o al menos 500 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, el promotor de opsina M o fragmento del mismo contiene una supresión o una inserción de uno o más nucleótidos, en donde la supresión o inserción no elimina la expresión específica de fotorreceptores de cono de una carga útil génica unida operativamente al promotor de opsina M o fragmento modificado. En algunas realizaciones, el promotor de opsina M o fragmento del mismo consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, el promotor de opsina M o fragmento del mismo consiste en la SEQ ID NO: 17.
Preferentemente, la TCU comprende un fragmento del promotor de opsina M que comprende la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 3. Se contempla además una TCU que comprende un fragmento del promotor de opsina M que comprende al menos 200, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con al menos 200, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento del promotor de opsina M consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento del promotor de opsina M consiste en la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, la TCU comprende al menos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con al menos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.
Preferentemente, la TCU comprende un fragmento del promotor de opsina M que comprende la SEQ ID NO: 5 o una secuencia que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el fragmento del promotor de opsina M consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el fragmento del promotor de opsina M consiste en la SEQ ID NO: 5.
Los promotores adicionales y fragmentos de los mismos contemplados para su uso en la TCU son promotores o fragmentos de promotores que difieren en su secuencia de las secuencias anteriores pero conservan la actividad promotora específica de fotorreceptores de cono. Dichas secuencias tienen al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 17 como se ha definido anteriormente. El porcentaje de identidad de secuencia de variantes se mide preferentemente sobre la longitud completa de la porción correspondiente de la SEQ ID NO: 17, o sobre una sección de 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17 alineada con la secuencia variante.
También se contemplan promotores y fragmentos de los mismos que comprenden una secuencia que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y/o con la SEQ ID NO: 5.
La identidad de secuencia puede calcularse usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo, pueden usarse los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la identidad o alinear secuencias (tal como identificar secuencias equivalentes o correspondientes (normalmente en su configuración por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993)J. Mol. Evol.36: 290-300; Altschul, S, Fet al.(1990)J Mol Biol215:403-10. El programa informático para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del "National Center for Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero un par de secuencias de alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschulet al.,citado anteriormente). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulada. Las extensiones de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulada queda fuera por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89: 10915-10919) alineaciones (B) de 50, previsión (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90: 5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es inferior a aproximadamente 1, preferentemente inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y mucho más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001. Como alternativa, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la identidad (por ejemplo, utilizado en su configuración predeterminada) (Devereuxet al.(1984)Nucleic Acids Research12, 387-395).
En algunas realizaciones, la TCU comprende un promotor de opsina M o fragmento del mismo que contiene una secuencia de mutación M8 TCTAGA (SEQ ID NO: 16). En una realización, la TCU comprende un promotor de opsina M o fragmento del mismo que contiene, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos de la SEQ ID NO: 16. Por ejemplo, los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 (GGGCCG) de la SEQ ID NO: 2 pueden reemplazarse por la SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, la TCU incluye secuencias de nucleótidos adicionales que no se encuentran de forma natural en la LCR de opsina M/L y/o regiones promotoras de opsina M. La secuencia de nucleótidos adicional puede estar en dirección 5' o 3' de la LCR o la región promotora de opsina M. En algunas realizaciones, la secuencia adicional se ubica entre la LCR y la región promotora de opsina M. En una realización, la secuencia "GATC" se ubica entre la región LCR y la región de opsina M.
En una realización, la TCU comprende la SEQ ID NO: 4. En una realización, la TCU comprende la SEQ ID NO: 6. En una realización, la TCU comprende la SEQ ID NO: 15.
También se contempla una TCU que comprende una secuencia que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 15.
En una realización, la TCU consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 4. En una realización, la TCU consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 6. En una realización, la TCU consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 15.
En una realización, la TCU consiste en la SEQ ID NO: 4. En una realización, la TCU consiste en la SEQ ID NO: 6. En una realización, la TCU consiste en la SEQ ID NO: 15.
Además, la TCU puede ubicarse en cualquier lugar dentro de una secuencia más grande siempre que se conserve la actividad promotora específica de fotorreceptores de cono. En las realizaciones, las TCU descritas en el presente documento se encuentran en dirección 5', o inmediatamente en dirección 5', con respecto al gen que ha de expresarse (por ejemplo, la carga útil) de una manera específica de fotorreceptores de cono como se describe en el presente documento.
La TCU también puede usarse en tándem con otros elementos reguladores, tales como uno o más promotores, potenciadores y/o LCR adicionales.
La TCU puede proporcionarse en forma de una molécula de ácido nucleico aislada.
La TCU proporcionada por la presente divulgación puede usarse para impulsar la expresión de genes (carga útil) en el fotorreceptor de cono de una manera específica de fotorreceptores de cono. La expresión específica de fotorreceptores de cono puede definirse como la expresión que solo está presente en el fotorreceptor de cono, pero no significativamente en otros tipos celulares. La expresión específica de fotorreceptores de cono puede definirse como una expresión que es más de aproximadamente 10 veces mayor, 20 veces mayor, 50 veces mayor o 100 o más veces mayor en el fotorreceptor de cono que en otros tipos celulares, especialmente las células fotorreceptoras de bastón. La expresión en los fotorreceptores de cono y otros tipos celulares puede medirse mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, los niveles de expresión de ARN pueden medirse mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de proteínas puede medirse mediante transferencia Western o inmunohistoquímica. Las TCU proporcionadas en el presente documento proporcionan la expresión de un gen unido operativamente en todos los subtipos de fotorreceptores de cono.
La TCU proporcionada por la presente divulgación puede usarse para impulsar una expresión significativamente mayor de genes en el fotorreceptor de cono en comparación con una<t>C<u>o promotor de referencia. La expresión significativamente aumentada puede definirse como más de aproximadamente 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces o 300 veces la expresión del gen en el fotorreceptor de cono en comparación con la expresión impulsada por una TCU o promotor de referencia, incluyendo, pero sin limitación, el promotor de opsina M original. La expresión en los fotorreceptores de cono y otros tipos celulares puede medirse mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, los niveles de expresión de ARN pueden medirse mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de proteínas puede medirse mediante transferencia Western o inmunohistoquímica.
La TCU proporcionada por la presente divulgación puede usarse para impulsar la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína en el fotorreceptor de cono, incluyendo secuencias de nucleótidos que expresan proteínas que normalmente no se expresan en el fotorreceptor de cono tales como GFP.
Por ejemplo, las TCU proporcionadas en la presente divulgación son útiles para expresar genes en fotorreceptores de cono necesarios para la función normal de los fotorreceptores de cono, incluyendo, pero sin limitación, la subunidad alfa-2 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina G(t) (GNAT2), el canal catiónico controlado por nucleótidos cíclicos alfa-3 (CNGA3), el canal catiónico controlado por nucleótidos cíclicos beta-3 (CNGB3), la subunidad alfa' de la fosfodiesterasa cíclica 3',5' específica de cGMP de los conos (PDE6C), la subunidad gamma de la fosfodiesterasa cíclica 3',5' sensible a la rodopsina de los conos de la retina (PDE6H), el miembro 2 de la subfamilia V de canales de potasio dependientes de voltaje (KCNV2) y la subunidad alfa-2/delta-4 de los canales de calcio dependientes de voltaje (CACNA2D4), que son proteínas esenciales para la función normal de los conos. Así pues, la presente invención proporciona Tc U y métodos para expresar, por ejemplo, genesGNAT2, CNGA3, CNGB3, PDE6C, PDE6H, KCNV2,yCACNA2D4en los fotorreceptores de cono. Los genesPDE6C, GNAT2, CNGA3yCNGB3son cuatro de los genes que contribuyen a la acromatopsia. PDE6C es la subunidad alfa de la fosfodiesterasa cíclica 3',5' específica de cGMP de los conos. GNAT2 es el componente alfa de la transducina de los conos, un elemento esencial de la cascada de fototransducción de los conos. CNGA3 es la subunidad alfa del canal iónico controlado por nucleótidos cíclicos de los conos, que se cierra en respuesta a la luz, hiperpolarizando de este modo la célula de cono. CNGB3 es la subunidad beta del canal iónico controlado por nucleótidos cíclicos de los conos, que se cierra en respuesta a la luz, hiperpolarizando de este modo la célula de cono.
Construcciones de expresión
La invención también proporciona construcciones de expresión que comprenden una TCU divulgada en el presente documento, unida operativamente a una secuencia, tal como una secuencia génica, que se ha de expresar de una manera específica de fotorreceptores de cono.
La expresión "unida operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se une de manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. Pueden introducirse múltiples copias del mismo o diferente polinucleótido en la construcción de expresión. Una construcción de expresión puede definirse como una secuencia polinucleotídica capaz de impulsar la expresión de una proteína a partir de una secuencia polinucleotídica que contiene una secuencia codificante.
Por lo tanto, la construcción de expresión puede comprender, por ejemplo, una secuencia codificante dePDE6H, PDE6C, GNAT2, KCNV2, CACNA2D4, CNGA3oCNGB3,por ejemplo, un polinucleótido seleccionado de las SEQ ID NO: 7 a 14, o una variante de las SEQ ID NO: 7 a 14 que conserva la funcionalidad de la proteína traducida a partir de la secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7 a 14.
Una variante de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 a 14 pueden definirse como cualquier variante de la secuencia de las SEQ ID NO: 7 a 14, incluyendo variantes de origen natural en la secuencia de ácido nucleico. La variante puede definirse como que tiene al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 7 a 14, en donde el polipéptido traducido a partir de la secuencia variante conserva su funcionalidad. La variante puede definirse como que tiene al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 7 a 14, en donde el polipéptido traducido a partir de la secuencia variante tiene la capacidad de rescatar la función de los fotorreceptores de cono. En las realizaciones, la variante es una versión de codones optimizados de la secuencia codificante.
Las construcciones de expresión contempladas en la divulgación pueden rescatar la función de los fotorreceptores de cono. El rescate de la función de los fotorreceptores de cono puede definirse como el restablecimiento de al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la función de los fotorreceptores de cono. La función de los fotorreceptores de cono puede analizarse mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia, por ejemplo, mediante análisis electrorretinográfico de las respuestas de la retina.
La función de rescate de los fotorreceptores de cono también puede definirse como la prolongación de la supervivencia de los conos. La prolongación de la supervivencia de los conos puede definirse como extender el tiempo en que un fotorreceptor de cono es funcional en aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % o más del 100 % en comparación con un fotorreceptor de cono afectado por una distrofia de conos. La función de los fotorreceptores de cono puede analizarse mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia, por ejemplo, mediante análisis electrorretinográfico de las respuestas de la retina. Los ejemplos de prolongación de la supervivencia de los conos también incluyen mejorar la actividad ERG o retardar la pérdida de la actividad ERG, mejorar la sensibilidad de la retina o ralentizar/detener la pérdida progresiva de la sensibilidad de la retina, ralentizar o detener la pérdida de células fotorreceptoras, mejorar la visión o ralentizar/detener la pérdida de visión.
La construcción de expresión de la invención puede comprender una TCU unida operativamente a un genCNGA3.En algunas realizaciones, la secuencia del gen CNGA3 comprende la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el gen CNGA3 comprende una secuencia con codones optimizados. La "optimización de codones" se refiere al proceso de alterar una secuencia polinucleotídica de origen natural para potenciar la expresión en el organismo diana, por ejemplo, seres humanos. En una realización de la presente invención, el genCNGA3humano, SEQ ID NO: 7, se ha optimizado para crear la SEQ ID NO: 8. En el ADNc deCNGA3optimizado de codones raros de la SEQ ID NO: 8 se han reemplazado por aquellos que aparecen con mayor frecuencia y/o aquellos que se encuentran frecuentemente en genes humanos altamente expresados.
En una realización, la construcción de expresión comprende una TCU unida operativamente a la SEQ ID NO: 8.
Vectores
La invención proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos, TCU, promotores y fragmentos de los mismos, genes optimizados y construcciones de expresión divulgados en el presente documento. El vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, puede ser un vector plasmídico o un ADN de minicírculo.
La eficacia de la terapia es, en general, dependiente del suministro adecuado y eficaz del ADN donado. Este proceso por lo general está mediado por vectores víricos. Así pues, la invención proporciona vectores víricos, que pueden basarse, por ejemplo, en el virus del herpes simple, adenovirus o lentivirus. El vector vírico puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV) o un derivado del mismo. El AAV es un vector particularmente atractivo ya que generalmente no es patógeno; la mayoría de las personas se han infectado con este virus durante su vida sin efectos adversos. El privilegio inmunitario del tejido ocular, como resultado de barreras anatómicas y factores inmunomoduladores, deja al ojo en gran medida exento de respuestas inmunitarias adversas.
En una realización, el vector vírico comprende un genoma de AAV de un serotipo, aislado o clado de origen natural del AAV, o un derivado del mismo.
Un "genoma de AAV" es una secuencia polinucleotídica que codifica las funciones necesarias para la producción de una partícula vírica de AAV. Estas funciones incluyen aquellas que operan en el ciclo de replicación y empaquetamiento para AAV en una célula hospedadora, incluyendo la encapsidación del genoma de AAV en una partícula vírica de AAV. Los virus AAV de origen natural son defectuosos en la replicación y dependen de que se proporcionen las funciones auxiliares entranspara completar un ciclo de replicación y empaquetamiento. En consecuencia y con la eliminación adicional de loa genesrepycapde AAV, el genoma de a Av del vector de la invención tiene replicación defectuosa.
El genoma de AAV puede estar en forma monocatenaria, de sentido positivo o negativo, o como alternativa en forma bicatenaria. El uso de una forma bicatenaria permite evitar la etapa de replicación de ADN en la célula diana y de esa manera puede acelerar la expresión transgénica.
El genoma de AAV puede ser de cualquier serotipo o aislado o clado derivado de forma natural de AAV. Como saben los expertos en la materia, los virus AAV que se producen en la naturaleza pueden clasificarse de acuerdo con diversos sistemas biológicos.
Habitualmente, los virus AAV se denominan en términos de su serotipo. Un "serotipo" corresponde a una subespecie variante de AAV que debido a su perfil de expresión de antígenos superficiales de la cápside tiene una reactividad distintiva que puede usarse para distinguirlo de otras subespecies variantes. Normalmente, un virus que tiene un serotipo de AAV particular no reacciona de forma cruzada de manera eficaz con anticuerpos neutralizantes específicos para cualquier otro serotipo de AAV. Los serotipos de AAV incluyen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 y AAV11, también serotipos recombinantes, tales como Rec2 y Rec3, recientemente identificados de cerebro de primates. En vectores de la invención, el genoma puede derivar de cualquier serotipo de AAV. La cápside también puede derivar de cualquier serotipo de AAV. El genoma y la cápside pueden derivar del mismo serotipo o de serotipos diferentes.
En una realización, el genoma del vector divulgado en el presente documento deriva del serotipo 2 de AAV (AAV2), serotipo 4 de AAV (AAV4), serotipo de AAV (AAV5) o serotipo 8 de AAV (AAV8). Otros vectores AAV que pueden usarse incluyen vectores derivados de AAV44.9 y AAV-Anc80. Se prefiere mucho más que el genoma derive de AAV2, que se une a las células diana a través del receptor de proteoglicano de sulfato de heparina, pero otros serotipos de interés particular para su uso en la invención incluyen AAV4, AAV5 y AAV8, que transducen eficazmente el tejido en el ojo, tal como el epitelio pigmentario de la retina.
Las secuencias de los genomas de AAV o de los elementos de los genomas de AAV incluyendo las secuencias ITR, los genes rep o cap para su uso en la invención pueden obtenerse de los siguientes números de registro para secuencias de genoma completo de AAV: Virus adenoasociado 1 NC_002077, AF063497; Virus adenoasociado 2 NC_001401; Virus adenoasociado 3 NC_001729; Virus adenoasociado 3B NC_001863; Virus adenoasociado 4 NC_001829; Virus adenoasociado 5 Y18065, AF085716; Virus adenoasociado 6 NC_001862; AAV aviar ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; AAV aviar cepa DA-1 NC_006263, AY629583; AAV bovino NC_005889, AY388617.
Los virus AAV también pueden denominarse en términos de clados o clones. Esto se refiere a la relación filogenética de virus AAV derivados de forma natural, y normalmente a un grupo filogenético de virus AAV que pueden rastrearse hasta un ancestro común, e incluye todos los descendientes del mismo. Adicionalmente, los virus AAV pueden denominarse en términos de un aislado específico, es decir, un aislado genético de un virus AAV específico encontrado en la naturaleza. La expresión aislado genético describe una población de virus AAV que ha experimentado mezcla genética limitada con otros virus AAV de origen natural, definiendo de ese modo una población reconociblemente distintiva a nivel genético.
Los ejemplos de clados y de aislados de AAV que pueden usarse en la invención incluyen: Clado
A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu. 48 AY530611, Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609,
Clado B: Hu. 19 AY530584, Hu. 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377,
Clado C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623,
Clado D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013,
Clado E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556,
Clado F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, Aislado clonal AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003.
Los expertos en la materia pueden seleccionar un serotipo, clado, clon o aislado apropiado de AAV para su uso en la presente invención basándose en su conocimiento general común.
Debe entenderse, sin embargo, que la invención también abarca el uso de un genoma de AAV de otros serotipos que pueden no haberse identificado o caracterizado aún. El serotipo de AAV determina la especificidad tisular de infección (o tropismo) de un virus AAV. En consecuencia, los serotipos de AAV preferidos para su uso en virus AAV administrados a pacientes de acuerdo con la invención son aquellos que tienen tropismo natural por o una alta eficiencia de infección de células fotorreceptores de cono diana.
El AAV de tipo silvestre, que contiene genes víricos, insertan su material genómico en el cromosoma 19 de la célula hospedadora. El genoma de ADN monocatenario de AAV comprende dos repeticiones terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) y dos marcos de lectura abiertos, que contiene genes estructurales (cap) y de empaquetamiento (rep).
Normalmente, el genoma de AAV de un serotipo o aislado o clado obtenido de forma natural de AAV comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR). Los vectores de la invención generalmente comprenden dos ITR, preferentemente una en cada extremo del genoma. Una secuencia de ITR actúa encispara proporcionar un origen de replicación funcional, y permite la integración y escisión del vector a partir del genoma de una célula. Las secuencias de ITR preferidas son las de AAV2 y variantes de las mismas. El genoma de AAV generalmente comprende genes de empaquetamiento, tales como los genesrepy/ocapque codifican las funciones de empaquetamiento para una partícula vírica de AAV. El genrepcodifica una o más de las proteínas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 o variantes de las mismas. El gencapcodifica una o más proteínas de la cápside tales como VP1, VP2 y VP3 o variantes de las mismas. Estas proteínas componen la cápside de una partícula vírica de AAV. Las variantes de cápside se analizan a continuación.
Con fines terapéuticos, las ITR pueden proporcionarseen cisademás del gen terapéutico. Por lo tanto, el virus AAV puede modificarse: los genes víricos pueden eliminarse del genoma, produciendo AAV recombinante (rAAV). El rAAV contiene el gen terapéutico y al menos una ITR. La eliminación de los genes víricos hace que el rAAV sea incapaz de insertar de manera activa su genoma en el ADN de la célula hospedadora. En su lugar, los genomas de rAAV se fusionan a través de las ITR, formando estructuras circulares, episómicas o se insertan en roturas cromosómicas preexistentes. Para la producción vírica, los genes estructurales y de empaquetamiento, ahora eliminados del rAAV, se suministranen trans,en forma de plásmido auxiliar.
Preferentemente, el genoma de AAV se derivatizará con fines de administración a los pacientes. Dicha derivatización es convencional en la técnica y la presente invención abarca el uso de cualquier derivado conocido de un genoma de AAV, y derivados que pudieran generarse aplicando técnicas conocidas en la técnica.
Los derivados de un genoma de AAV incluyen cualquier forma truncada o modificada de un genoma de AAV que permite la expresión de un transgén Rep-1 a partir de un vector de la invenciónin vivo.Normalmente, es posible truncar el genoma de AAV de forma significativa para que incluya una secuencia vírica mínima, que aún conserve la función anterior. Esto se prefiere por motivos de seguridad para reducir el riesgo de recombinación del vector con el virus de tipo silvestre, y también para evitar desencadenar una respuesta inmunitaria celular por la presencia de proteínas de genes víricos en la célula diana.
Normalmente, un derivado incluirá al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR), preferentemente más de una ITR, tal como dos ITR o más. Una o más de las ITR pueden obtenerse de genomas de AAV que tienen diferentes serotipos, o pueden ser una ITR quimérica o mutante. Una ITR mutante preferida es una que tiene una eliminación de untrs(sitio de resolución terminal). Esta supresión permite la replicación continua del genoma para generar un genoma monocatenario que contiene secuencias tanto codificantes como complementarias, es decir, un genoma de AAV autocomplementario. Esto permite evitar la replicación de ADN en la célula diana, y además posibilita la expresión transgénica acelerada.
La una o más ITR flanquearán preferentemente el casete de construcción de expresión que contiene el promotor y el transgén de la invención. Se prefiere la inclusión de una o más ITR para ayudar al empaquetamiento del vector de la invención en partículas víricas. En realizaciones preferidas, los elementos de ITR serán las únicas secuencias conservadas del genoma de AAV natural en el derivado. Por lo tanto, un derivado preferentemente no incluirá los genesrepy/ocapdel genoma natural y cualquier otra secuencia del genoma natural. Esto se prefiere, por las razones descritas anteriormente, y también para reducir la posibilidad de integración del vector en el genoma de la célula hospedadora. Adicionalmente, la reducción del tamaño del genoma de AAV permite una flexibilidad aumentada en la incorporación de otros elementos de secuencia (tales como elementos reguladores) dentro del vector además del transgén.
Con referencia al genoma de AAV2, las siguientes porciones, por lo tanto, podrían eliminarse en un derivado de la invención: Una secuencia de repetición terminal invertida (ITR), los genes de replicación (rep) y de la cápside (cap). Sin embargo, en algunas realizaciones, incluyendo realizacionesin vitro,los derivados pueden incluir uno o más genesrepy/ocapu otras secuencias víricas de un genoma de AAV.
Un derivado puede ser un derivado quimérico, reordenado o de cápside modificada de uno o más virus AAV de origen natural. La invención abarca el suministro de secuencias de proteínas de la cápside de diferentes serotipos, ciados, clones o aislados de AAV dentro del mismo vector. La invención abarca el empaquetamiento del genoma de un serotipo en la cápside de otro serotipo, es decir, la pseudotipificación.
Los derivados quiméricos, reordenados o de cápside modificada se seleccionarán generalmente para proporcionar una o más funcionalidades deseadas para el vector vírico. Por lo tanto, estos derivados pueden presentar una eficiencia aumentada de suministro génico, inmunogenicidad (humoral o celular) disminuida, un intervalo de tropismo alterado y/o direccionamiento mejorado de un tipo celular particular en comparación con un vector vírico de AAV que comprende un genoma de AAV de origen natural, tal como el de AAV2. La eficiencia aumentada de suministro génico puede efectuarse por unión mejorada al receptor o correceptor en la superficie celular, internalización mejorada, tráfico mejorado dentro de la célula y al núcleo, pérdida del recubrimiento de la partícula vírica y conversión mejorada de un genoma monocatenario en una forma bicatenaria. La eficiencia aumentada también puede referirse a una gama de tropismo o direccionamiento alterado a una población celular específica, de manera que la dosis del vector no se diluya por la administración a tejidos donde no se necesita.
Las proteínas de la cápside quiméricas incluyen aquellas generadas por recombinación entre dos o más secuencias codificantes de la cápside de serotipos de AAV de origen natural. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante un enfoque de rescate de marcadores en que se cotransfectan secuencias de cápside no infecciosas de un serotipo con secuencias de cápside de un serotipo diferente, y se usa selección directa para seleccionar secuencias de cápside que tengan las propiedades deseadas. Las secuencias de la cápside de los diferentes serotipos pueden alterarse por recombinación homóloga dentro de la célula para producir proteínas de la cápside quiméricas novedosas.
Las proteínas de la cápside quiméricas también incluyen aquellas generadas por modificación por ingeniería genética de secuencias de proteína de la cápside para transferir dominios proteínicos de la cápside específicos, bucles superficiales o restos de aminoácidos específicos entre dos o más proteínas de la cápside, por ejemplo, entre dos o más proteínas de la cápside de diferentes serotipos.
Las proteínas de la cápside reordenadas o quiméricas también pueden generarse por reordenamiento del ADN o por PCR propensa a errores. Pueden crearse genes de la cápside de AAV híbridos por fragmentación aleatoria de las secuencias de genes de AAV relacionados, por ejemplo, aquellos que codifican proteínas de la cápside de múltiples serotipos diferentes y después volviendo a ensamblar posteriormente los fragmentos en una reacción de polimerasa de autocebado, que también puede provocar entrecruzamientos en regiones de homología de secuencia. Puede explorarse una biblioteca de genes de AAV híbridos creados de esta manera por reordenamiento de genes de la cápside de varios serotipos para identificar clones víricos que tengan una funcionalidad deseada. De manera similar, puede usarse PCR propensa a errores para mutar aleatoriamente genes de la cápside de AAV para crear una biblioteca diversa de variantes que después pueden seleccionarse para una propiedad deseada.
Las secuencias de los genes de la cápside también pueden modificarse genéticamente para introducir supresiones, sustituciones o inserciones específicas con respecto a la secuencia de tipo silvestre natural. En particular, los genes de la cápside pueden modificarse por la inserción de una secuencia de una proteína o péptido no relacionados dentro de un marco de lectura abierto de una secuencia codificante de la cápside, o en el extremo N y/o C de una secuencia codificante de la cápside.
La proteína o péptido no relacionados puede ser ventajosamente uno que actúe como ligando para un tipo celular particular, confiriendo de ese modo unión mejorada a una célula diana o mejorando la especificidad del direccionamiento del vector a una población celular particular.
La proteína no relacionada también puede ser una que ayude a la purificación de la partícula vírica como parte del proceso de producción, es decir, una epítopo o etiqueta de afinidad. El sitio de inserción generalmente se seleccionará para que no interfiera con otras funciones de la partícula vírica, por ejemplo, internalización, tráfico de la partícula vírica. Los expertos en la materia pueden identificar sitios adecuados para la inserción basándose en su conocimiento general común.
La invención abarca además el suministro de secuencias de un genoma de AAV en un orden y una configuración diferentes a los de un genoma de AAV natural. La invención también abarca el remplazo de una o más secuencias o genes de AAV con secuencias de otro virus o con genes quiméricos compuestos de secuencias de más de un virus. Dichos genes quiméricos pueden estar compuestos por secuencias de dos o más proteínas víricas relacionadas de especies víricas diferentes.
El vector de la invención toma la forma de un vector vírico que comprende los promotores y las construcciones de expresión de la invención.
Para disipar cualquier duda, la invención también proporciona una partícula vírica de AAV que comprende un vector de la invención. Las partículas de AAV de la invención incluyen formas de cápside intercambiada en las que un genoma o derivado de AAV que tiene una ITR de un serotipo se empaqueta en la cápside de un serotipo diferente. Las partículas de AAV de la invención también incluyen formas de mosaico en las que una mezcla de proteínas de la cápside no modificadas de dos o más serotipos diferentes compone la envuelta vírica. La partícula de AAV también incluye formas modificadas químicamente que albergan ligandos adsorbidos a la superficie de la cápside. Por ejemplo, dichos ligandos pueden incluir anticuerpos para dirigirlos a un receptor de superficie celular particular.
El genoma de AAV2, como los de todos los serotipos de AAV, puede estar encerrado en varias proteínas de la cápside diferentes. AAV2 puede empaquetarse en su cápside de AAV2 natural (AAV2/2) o puede pseudotipificarse con otras cápsides (por ejemplo, genoma de AAV2 en la cápside de AAV1, dando como resultado AAV2/1, o genoma de AAV2 en la cápside de AAV8, dando como resultado AAV2/8).
En una realización preferida, la cápside de AAV deriva de AAV8. En una realización particularmente preferida, cuando la secuencia unida operativamente es un genCNGA3,se prefiere que la cápside sea AAV8 u otra cápside distinta de AAV5.
El AAV transduce células mediante endocitosis mediada por receptores específicos de serotipos. Un factor importante que influye en la cinética de la expresión transgénica de rAAV es la tasa de pérdida de recubrimiento de partículas víricas dentro del endosoma. Esto, a su vez, depende del tipo de cápside que encierra el material genético. Después de la pérdida del recubrimiento, el genoma de rAAV monocatenario lineal se estabiliza formando una molécula bicatenaria a través de síntesisde novode una cadena complementaria. El uso de ADN autocomplementario puede evitar esta etapa al producir ADN transgénico bicatenario. Se ha descubierto que la expresión del gen autocomplementario de AAV2/8 tiene un inicio más rápido y una amplitud mayor, en comparación con AAV2/8 monocatenario. Por lo tanto, evitando el desfase de tiempo asociado a la síntesis de la segunda cadena, aumentan los niveles de expresión génica, en comparación con la expresión transgénica de construcciones monocatenarias convencionales. Estudios posteriores que investigaron el efecto del ADN autocomplementario en otros pseudotipos de AAV produjeron resultados similares. Una advertencia a esta técnica es que, ya que AAV tiene una capacidad de empaquetamiento de aproximadamente 4,8 kb, el genoma recombinante autocomplementario debe tener el tamaño apropiado (es decir, 2,3 kb o menos).
Además de modificar la capacidad de empaquetamiento, la pseudotipificación del genoma de AAV2 con otras cápsides de AAV puede alterar la especificidad celular y la cinética de la expresión transgénica. Por ejemplo, cuando AAV2 está pseudotipificado con la cápside de AAV4, la expresión del transgén se dirige específicamente a las células del RPE. Además, se informa que AAV2/8 transduce fotorreceptores de manera más eficaz que AAV2/2 o AAV2/5.
Preparación de vectores
El vector de la invención puede prepararse por medios convencionales conocidos en la técnica para el suministro de vectores para terapia. Por lo tanto, pueden usarse métodos bien establecidos y públicos de transfección de dominios, empaquetado y purificación para preparar una preparación de vector adecuada.
Como se ha analizado anteriormente, un vector de la invención puede comprender el genoma completo de un virus AAV de origen natural además de un promotor de la invención o una variante del mismo. Sin embargo, habitualmente se usará un genoma derivatizado, por ejemplo, un derivado que tiene al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR), pero que puede carecer de los genes de AAV tales comorepocap.
En dichas realizaciones, para proporcionar el ensamblaje del genoma derivatizado en una partícula vírica de AAV, pueden proporcionarse construcciones genéticas adicionales que proporcionan las funciones de virus AAV y/o auxiliares en una célula hospedadora en combinación con el genoma derivatizado. Estas construcciones adicionales generalmente contendrán genes que codifican proteínas estructurales de la cápside de AAV, es decir,cap,VP1, VP2, VP3 y genes que codifican otras funcione necesarias para el ciclo vital de AAV, tales comorep.La selección de las proteínas estructurales de la cápside proporcionadas en la construcción adicional determinará el serotipo del vector vírico empaquetado.
Un vector vírico empaquetado particularmente preferido para su uso en la invención comprende un genoma derivatizado de AAV2 en combinación con la proteína de la cápside de AAV8.
Como se ha mencionado anteriormente, los virus AAV son de replicación incompetente y, por lo tanto, normalmente también se proporcionarán funciones víricas auxiliares, preferentemente funciones adenovíricas auxiliares en una o más construcciones adicionales para permitir la replicación de AAV. También existen sistemas conocidos por el experto en la materia que usan una única construcción que comprenderep, gorray funciones auxiliares Ad, por lo que no se requieren construcciones auxiliares adicionales.
Todas las construcciones adicionales anteriores pueden proporcionarse como plásmidos u otros elementos episómicos en la célula hospedadora, o como alternativa pueden integrarse una o más construcciones en el genoma de la célula hospedadora.
La unidad de control de la transcripción de la invención tiene la capacidad de rescatar la pérdida de la función de los fotorreceptores de cono, que puede producirse, por ejemplo, por mutaciones en el genCNGA3."Rescate" generalmente significa cualquier mejora o ralentización de la progresión de un trastorno o fenotipo de distrofia de la retina, por ejemplo, restablecer la presencia de la proteína CNGA3 en el fotorreceptor de cono, mejorar la actividad de ERG o ralentizar la pérdida de actividad de ERG, mejorar la sensibilidad de la retina o ralentizar/detener la pérdida progresiva de la sensibilidad de la retina, ralentizar o detener la pérdida de células fotorreceptoras, mejorar la visión o ralentizar/detener la pérdida de visión.
Las propiedades de la unidad de control de la transcripción de la invención también pueden someterse a ensayo usano técnicas basadas en las de los Ejemplos. En particular, una unidad de control de la transcripción de la invención puede ensamblarse en un vector de la invención y suministrarse a la retina de un animal de ensayo deficiente en CNGA3, tal como un ratón, y observarse los efectos y compararlos con un control. Preferentemente, el control será el otro ojo del mismo animal, que no se trata o se trata con un vector de control tal como uno que contenga un gen indicador en oposición a una secuencia de la invención. El análisis por electrorretinografía de las respuestas de la retina a la luz puede usarse para confirmar que las células fotorreceptoras de los ojos que se tratan son más sensibles a la luz que los fotorreceptores de los ojos sin tratar o que se tratan con un vector de control. La sensibilidad a la luz del ojo tratado puede ser, por ejemplo, al menos 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces mayor que la del ojo sin tratar o tratado con control.
Usos médicos
En un aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico (tales como TCU, promotores y fragmentos de los mismos, genes con codones optimizados, construcciones de expresión y vectores) para su uso en métodos para el tratamiento y/o la prevención de trastornos o distrofias de la retina en un paciente que lo necesite.
La retina está compuesta por la capa de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y tres capas de células neurosensoriales; a saber (de externa a interna), la capa nuclear externa (que contiene células fotorreceptoras de cono y bastón), la capa nuclear interna (que contiene células bipolares) y la capa de células ganglionares. Los trastornos o distrofias de la retina pueden definirse como enfermedades de la retina, caracterizadas por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras y la pérdida simultánea de la visión. Los trastornos o distrofias de la retina pueden ser trastornos o distrofias de la retina hereditarios.
En una realización, se proporcionan moléculas de ácido nucleico para el tratamiento y/o la prevención de la distrofia de conos-bastones y/o distrofia de conos. Las distrofias de conos-bastones pueden definirse como enfermedades caracterizadas por la pérdida progresiva de las células fotorreceptoras de los conos y la pérdida simultánea de la visión y pueden ser hereditarias. En una realización, el trastorno de la retina es acromatopsia o degeneración macular. La degeneración macular puede ser degeneración macular asociada a la edad (DMAE), por ejemplo, DMAE húmeda o neovascular o atrofia geográfica, una afección de degeneración macular hereditaria o una distrofia de conos hereditaria.
Los términos "paciente" y "sujeto" pueden usarse indistintamente. El paciente es preferentemente un mamífero. El mamífero puede ser un animal de granja comercial, tal como un caballo, una vaca, una oveja o un cerdo, un animal de laboratorio, tal como un ratón o una rata, o una mascota, tal como un gato, un perro, un conejo o una cobaya. El paciente es más preferentemente un ser humano. El sujeto puede ser de sexo masculino o femenino. El sujeto se identifica preferentemente como que está en riesgo de, o que tiene, un trastorno o distrofia de la retina.
Las expresiones "tratar'1, "tratado", "que trata", o "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) una afección fisiológica, un trastorno o una enfermedad no deseados, u obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, el alivio de los síntomas; la disminución del alcance de la afección, trastorno o enfermedad; la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la afección, trastorno o enfermedad; el retraso en la aparición o ralentización de la progresión de la afección, trastorno o enfermedad; la mejoría de la afección, trastorno o patología; y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable, o la potenciación o mejora de la afección, trastorno o enfermedad. El tratamiento incluye desencadenar una respuesta clínicamente significativa sin niveles excesivos de efectos secundarios.
El paciente puede ser asintomático y/o tener predisposición a la enfermedad. Así pues, la invención también proporciona un vector para su uso en un método de prevención o tratamiento de trastornos de la retina que comprende una etapa de identificar si un sujeto está en riesgo o no de desarrollar, o tiene, trastornos de la retina, tales como distrofias de conos, incluyendo, pero sin limitación, acromatopsia. Puede administrarse a un sujeto de este tipo una cantidad profilácticamente eficaz de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento. Una cantidad profilácticamente eficaz es una cantidad que previene la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad. Así pues, en algunas realizaciones, un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento puede administrarse para prevenir o retrasar la aparición de uno o más síntomas de trastornos de la retina, tales como distrofias de conos-bastones, incluyendo, pero sin limitación, acromatopsia. Como alternativa, un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento puede administrarse una vez han aparecido los síntomas de la enfermedad en un sujeto, es decir, para curar los síntomas existentes de la enfermedad. Puede administrarse a un sujeto de este tipo una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un ácido nucleico expuesto en el presente documento que, cuando se administra a un mamífero, es eficaz para producir el efecto terapéutico deseado. En una realización, la invención proporciona un vector para su uso en métodos de tratamiento y/o la prevención de un trastorno o distrofia de la retina, en donde un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento se administra a un paciente que lo necesite en una cantidad terapéuticamente eficaz. En algunas realizaciones, el trastorno o distrofia de la retina es una distrofia de conos, incluyendo, pero sin limitación, acromatopsia.
En el presente documento también se describe el uso de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de trastornos o distrofias de la retina, tales como distrofias de conos, incluyendo, pero sin limitación, acromatopsia. La invención también proporciona un vector para su uso en un método de tratamiento o prevención de trastornos de la retina, tales como distrofias de conos, en particular la acromatopsia en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento.
Métodos de administración
En general, se prefiere el suministro directo retiniano, subretiniano o intravítreo de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento, normalmente mediante inyección. Por lo tanto, se prefiere el suministro en la retina, en el espacio subretiniano o en el espacio intravítreo.
Por lo tanto, en el presente documento también se describe (pero no forma parte de la invención) un método de tratamiento o prevención de distrofias de conos, en particular la acromatopsia en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento mediante inyección retiniana, subretiniana o intravítrea directa.
En el presente documento se describe el uso de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento en un método de tratamiento o prevención de trastornos de la retina, tales como distrofias de conos, en particular, la acromatopsia mediante la administración de dicho vector a un paciente mediante inyección retiniana, subretiniana o intravítrea directa.
Adicionalmente, en el presente documento se describe (pero no forma parte de la invención) el uso de un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir trastornos de la retina, tales como distrofias de conos, en particular la acromatopsia mediante inyección retiniana, subretiniana o intravítrea directa.
La invención también proporciona un ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento para su uso en el tratamiento de trastornos de la retina, tales como distrofias de conos, en particular, la acromatopsia, en donde dicho vector se administra directamente en la retina, en el espacio subretiniano o en el espacio intravítreo.
La administración del ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento, normalmente se realiza mediante inyección directa retiniana o subretiniana. Esto incluye el suministro directo a las células fotorreceptoras de cono.
El suministro se realiza normalmente de forma directa o subretiniana en la retina degenerada de un paciente que padece trastornos retinianos, tales como distrofias de conos, en particular, acromatopsia.
El ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento puede transducir las células diana anteriores sin entrar en ninguna de las otras poblaciones celulares. También puede usarse inyección intravítrea para suministrar el vector de la invención.
La dosis del ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento puede determinarse de acuerdo con diversos parámetros, especialmente de acuerdo con la edad, el peso y el estado del paciente que se ha de tratar; la vía de administración; y la pauta requerida. De nuevo, un médico será capaz de determinar la vía de administración necesaria y la dosis para cualquier paciente particular.
Una dosis única típica es entre 1010 y 1012 partículas de genoma, dependiendo de la cantidad de tejido de la retina restante que necesita transducción. Una partícula de genoma se define en el presente documento como una cápside de AAV que contiene una molécula de ADN monocatenario que puede cuantificarse con un método específico de secuencia (tal como PCR en tiempo real). Esa dosis puede proporcionarse como una única dosis, pero puede repetirse para el otro ojo o en casos en los que el ácido nucleico, tal como un vector, como se divulga en el presente documento, es posible que no se haya dirigido a la región correcta de la retina por cualquier motivo (tal como una complicación quirúrgica). El tratamiento es preferentemente un único tratamiento permanente para cada ojo, pero pueden considerarse inyecciones repetidas, por ejemplo, en años futuros y/o con diferentes serotipos de AAV.
Células hospedadoras
La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico, tal como un vector o un vector vírico, o partícula vírica de AAV divulgada en el presente documento. Puede usarse cualquier célula hospedadora adecuada para producir los ácidos nucleicos, como tales vectores, divulgados en el presente documento. En general, dichas células serán células de mamífero transfectadas, pero también pueden usarse otros tipos de células, por ejemplo, células de insectos. En términos de sistemas de producción de células de mamíferos, se prefieren HEK293 y<h>E<k>293T para los vectores de AAV. También pueden usarse células BHK o CHO.
Composiciones farmacéuticas y dosis
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico, tal como un vector, divulgado en el presente documento, así como un portador, diluyente, excipiente, adyuvante, tampón, estabilizante y/u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador, diluyente, excipiente, adyuvante, tampón, estabilizante y/u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia y una secuencia de ácido nucleico, un plásmido, un vector o un vector vírico como se describe en el presente documento.
La naturaleza precisa del portador u otro material puede determinarse por los expertos de acuerdo con la vía de administración, es decir, en este caso inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea.
La composición farmacéutica normalmente está en forma líquida. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un portador líquido, tal como agua, vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, cloruro de magnesio, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. En algunos casos, puede usarse un tensioactivo, tal como ácido plurónico (PF68) al 0,001 %.
Para la inyección en el sitio afectado, el principio activo estará en forma de una solución acuosa que es apirógena y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos pertinentes en la materia serán bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato, solución de Hartmann. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera.
Para la liberación retardada, el vector puede incluirse en una composición farmacéutica que se formula para la liberación lenta, tal como en microcápsulas formadas a partir de polímeros biocompatibles o en sistemas de transportadores liposómicos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Las dosis y las pautas posológicas pueden determinarse dentro de la experiencia normal del médico responsable de la administración de la composición. La dosis del agente o agentes activos puede variar, dependiendo del motivo de uso, el sujeto individual y el modo de administración. La dosis puede ajustarse basándose en el peso del sujeto, la edad y la salud del sujeto, y la tolerancia al compuesto o compuestos o la composición.
Terapias de combinación
Los ácidos nucleicos, TCU, promotores, genes con codones optimizados, construcciones de expresión, vectores y/o composiciones farmacéuticas divulgados en el presente documento pueden usarse en combinación con cualquier otra terapia para el tratamiento o la prevención de distrofias de la retina, tales como distrofias de conos, incluyendo, pero sin limitación, acromatopsia.
Kits
Los ácidos nucleicos, TCU, promotores, genes con codones optimizados, construcciones de expresión, vectores y/o composiciones farmacéuticas divulgados en el presente documento pueden empaquetarse en un kit.
Ejemplos
Materiales y métodos
Construcción del plásmido
Para crear una versión mejorada del promotor deopsina de cono verde,se combinó laRegión de control del locus(LCR) (Smallwoodet al.,2002) de 1250 pb con diversos fragmentos del promotor central de opsina verde (pb -480 a 40) en el plásmido parental pAAV/CMV.eGFP, creando la construcción plasmídica pAAV/hG1.7.eGFP y pAAV/hG1.4.eGFP. Se produjeron construcciones de vector que llevan los promotores mutados 'M8' mediante mutagénesis específica de sitio.
Para las construcciones génicas terapéuticas, pAAV/coCNGA3 se creó clonando la secuencia de CNGA3 de codones optimizados y optimizada por Kozak de un plásmido pUC57 (producido por GenScript) en el plásmido de pAAV que transportaba las diversas construcciones del promotor de opsina de cono verde (M).
Optimización de codones
La optimización de codones se logró a través de la herramienta de optimización de codones OptimumGeneTM patentada de GenScript.
Protocolo de producción de virus AAV2/8 y AAV2/5
Se produjeron virus AAV2 del serotipo 8 recombinante y virus AAV2 del serotipo 5 usando el método de triple transfección de células 293T descrito anteriormente (Gaoet al.2002). Se transfectaron placas de 145 cm2 de células 293T (20 placas por lote de virus) con una mezcla compuesta por el Plásmido de interés: Plásmido de cápside vírica:ADN del plásmido auxiliar en una relación de 1:1:3, polietilenimina (PEI - Polysciences Inc., Eppelheim, Alemania) y DMEM después de una incubación de 10 minutos. Las células transfectadas se colocaron en lecho durante 24 horas. 48 horas después de la transfección, las células se recogieron, se concentraron por centrifugación, se resuspendieron en tampón TD (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, K2HPO40,7 mM, MgCl2 3,5 mM, Base de Tris 25 mM [pH = 7,5]). Después, esto se lisó mediante 3-4 ciclos de congelación-descongelación, seguidos de Benzonase (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) y después los residuos celulares se eliminaron mediante etapas sucesivas de centrifugación y filtración con jeringa.
La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico (usando un método basado en el de Davidoffet al.2004). El eluato se concentró en un tubo concentrador Vivaspin 4 de 10 kDa (Sartorius Stedim Biotech, Fisher Scientific, Loughborough, Reino unido), se lavó en PBS-MK, después se concentró a un volumen de 100-150 pl, después se dividió en alícuotas para almacenamiento a -80 °C (largo plazo) o 4 °C (corto plazo).
Producción y transducción de orgánulos de la retina derivados de células madre humanas
La estirpe de células madre embrionarias (ESC, por sus siglas en inglés) humanas H9 (utilizada solo como estirpe celular de referencia) se mantuvo en condiciones libres de alimentador en medio E8 y placas de 6 pocillos recubiertas con geltrex. Las hESC se disociaron usando una solución de dispasa y colagenasa. Los grumos de ESC se recogieron y se resuspendieron en medio E8. Para la diferenciación del neuroepitelio retiniano, las ESC humanas se mantuvieron hasta la confluencia, momento en el que se añadió a los cultivos un medio sin FGF durante dos días. Se añadió medio de inducción proneuronal (DMEM/F12 avanzado, aminoácidos no esenciales MEM, Complemento N2, Glutamina 100 mM y Pen/Strep) hasta que se observaron vesículas ópticas. Las vesículas se extirparon manualmente y se mantuvieron en placas de 96 pocillos en medio de diferenciación de la retina (DMEM, F12, Pen/Strep y B27 sin ácido retinoico) y a las 6 semanas de diferenciación el medio se complementó con FBS, taurina y glutamax y a las 10 semanas se añadió RA.
Se añadieron vectores de AAV (serotipo SsH10) que llevaban las construcciones dePromotor de opsina de cono verdeque impulsaban eGFP al medio a 1,2 * 1011 vg/pocillo (1-3 orgánulos/pocillo). Los orgánulos se cultivaron durante 28 días adicionales antes de su recogida y análisis.
Inmunohistoquímica
Los ojos se prepararon para la fijación mediante perforación de la córnea y después se sumergieron en paraformaldehído al 1 % (PFA, pH 7,4). Los orgánulos de la retina se fijaron mediante inmersión en paraformaldehído al 1 % (PFA, pH 7,4). Los ojos se dejaron fijar a temperatura ambiente durante una hora, antes de sacarlos de la solución y sumergirlos totalmente en la matriz de embebido a temperatura de corte óptima (OCT, por sus siglas en inglés), con la parte anterior-posterior del ojo suspendida en el eje horizontal-vertical dentro de los tubos de embebido. Después, se congelaron y se almacenaron a -20 °C hasta que se necesitaron para el corte.
Se prepararon secciones de 10 - 18 micrómetros usando el criostato Bright® OTF5000 (Bright Instrument Co Ltd, Cambridgeshire, Reino Unido), permitiendo de este modo la visualización de los aspectos tanto superior como inferior de la retina. Los cortes se recogieron inmediatamente después de seccionarlas en portaobjetos de microscopio recubiertos de polilisina y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente. Las láminas se almacenaron a -20 °C o se analizaron directamente.
Para la inmunohistoquímica, las secciones se bloquearon en suero de cabra al 5 % y albúmina de suero bovino al 1 % en PBS. Se incubaron anticuerpos primarios antiopsina de conos (Millipore) durante la noche a 4 °C. Las secciones se incubaron con anticuerpo secundario durante 2 horas a TA y se lavaron. Se usaron anticuerpos secundarios Alexafluor (Invitrogen-Molecular Probes) a una dilución de 1:500. Los portaobjetos se tiñeron con<d>A<p>I como una adición al medio de montaje (DAPI al 0,1%en el medio) o por inmersión en DAPI al 0,2%en TBS y lavado con PBS antes del montaje en medio de montaje fluorescente (DAKO). Los portaobjetos montados se almacenaron a 4 °C.
Los portaobjetos montados se fotografiaron usando un microscopio confocal Leica DM5500Q (Leica Biosystems, Alemania) o un Zeiss AxioObserver Z1 (Carl Zeiss Inc, Gottingen, Alemania).
Inyección subretiniana
Se realizaron inyecciones subretinianas en ratonesCpfl5(deficientes en CNGA3) (Haweset al.,2006) y C57BL/6 aproximadamente 2 semanas después del nacimiento. Se utilizó un microscopio quirúrgico durante toda la cirugía oftálmica. A 1,5 cm, se insertó una aguja hipodérmica de calibre 34 (Hamilton, Suiza) tangencialmente a través de la esclerótica, creando una herida por túnel esclótico autosellante (Tanet al.2009). Se inyectaron 1,0 - 1,5 pl de la suspensión vírica dentro de los hemisferios superior e inferior del espacio subretiniano, cada uno de los cuales crea un desprendimiento de retina bulloso visible oftalmoscópicamente. Se utilizaron C57BL/6 para el estudio del promotor y se inyectaron con 1*1012 de título vírico. Se usaron ratonesCpfl5en los estudios de rescate deCNGA3.A los ratones se les inyectaron construcciones víricas deCNGA3en un ojo designado, con las construcciones víricas de control inyectadas en el ojo contralateral. Todos los ratones se inyectaron bilateralmente.
Eficacia del tratamiento in vivo
La restauración de la función de la retina se evaluó mediante electrorretinografía fotópica. Se obtuvieron registros de ERG a partir de ambos ojos simultáneamente. Después de la adaptación a la oscuridad durante la noche (~12 horas), se aplicó una gota de fenilefrina al 2,5 % y tropicamida al 1 % (Minims, Bausch & Lomb) en cada ojo para dilatar la pupila y los ojos se mantuvieron húmedos aplicando un lubricante. Los ERG se realizaron usando equipos disponibles en el mercado (Espion ERG Diagnosys System). Se obtuvieron registros fotópicos de un destello único a intensidades de luz crecientes de 0,1, 1, 3,16, 10, 31,6 y 75,28 cd.s/m2 sobre un fondo de 30 cd/m2. A menos que se indique otra cosa, las cifras muestran las amplitudes promedio de la onda b fotópica (media ± DE) 4 semanas después del tratamiento, cuando ambos vectores alcanzaron la expresión máxima.
Ejemplo 1: Optimización de una unidad de control de la transcripción (TCU) específica de conos
La Región de control del locus (LCR) humana, que está situada en dirección 5' del gen de opsina roja, potencia la expresión de los genes de la opsina roja (opsina L) y de la opsina verde (opsina M), que están ubicados en tándem (véase la Figura 1, parte superior izquierda). Los promotores específicos de conos potentes han utilizado anteriormente la LCR y el promotor de opsina roja, ya que son elementos físicamente adyacentes. En un estudio de expresión del gen indicadorin vivoen ratones transgénicos por Smallwoodet al,se examinaron los diferentes niveles de expresión del promotor de opsina roja o verde basándose en su proximidad física a la LCR. Smallwoodet al.construyeron varios derivados de la matriz roja y verde humana para demostrar diferentes niveles de expresión del promotor de opsina roja o verde basándose en su proximidad física a la LCR (véase le Figura 1, parte inferior izquierda). Cada derivado consistía en un gen indicador de fosfatasa alcalina (AP) bajo el control del promotor de opsina roja y una pgalactosidasa (LacZ) bajo el control del promotor de opsina verde. Para cada estirpe de células madre embrionarias, se analizaron retinas de múltiples fundadores quiméricos o de múltiples descendientes que habían heredado el transgén de forma estable. En este último caso, el análisis se realizó antes y después del cruce con ratones cre de estirpe germinal para eliminar el casete PGK-neo flanqueado por loxP.
En la construcción de tipo silvestre, que usa la disposición cromosómica natural (pPMS107), el 65-95 % de los conos expresan AP (bajo el control del promotor de opsina roja) o lacZ (bajo el control del promotor de opsina verde), pero no ambos. Insertar un espaciador de 9 kb entre las dos unidades de transcripción (es decir, aumentar la distancia entre la LCR y el promotor de opsina verde, construcción pPMS108) conduce a un gran cambio de células que expresan lacZ (promotor verde) a células que expresan AP (promotor rojo). Intercambiar las ubicaciones de las dos unidades de transcripción (pPMS101) y colocar el promotor central de opsina verde inmediatamente después de la LCR (pPMS101), sesgó el perfil de expresión de estos ratones transgénicos casi exclusivamente hacia la transcripción del promotor central de opsina verde (>99 %).
La presente divulgación proporciona una unidad de control de la transcripción (TCU) específica de los conos alternativa que utiliza la LCR humana y un promotor de opsina verde humano optimizado. Se identificó un elemento central conservado del promotor de opsina verde humana (0,2 kb) y se generó una serie de TCU usando promotores de opsina verde modificados por ingeniería genética usando la región LCR y promotores de opsina verde de diversos tamaños: 2,0 Kb (hG2.0), 1,7 Kb (hG1.7) y 1,4 Kb (hG1.4), véase la Figura 2. También se generó como control un fragmento de promotor de opsina roja de 1,7 Kb (PR1.7, análogo al promotor utilizado por AGTC Yeet al.,2016)).
Adicionalmente, se generó una serie de vectores AAVshh10 que contenían indicadores de GFP impulsados por los promotores descritos anteriormente y se evaluó la expresión en cultivos de retina derivados de ES humanas.
Todas las construcciones sometidas a ensayo proporcionaron perfiles de transducción similares en términos de niveles de expresión de GFP y especificidad de células cono. Las construcciones con fragmentos promotores más pequeños proporcionan más espacio para empaquetar genes más grandes dentro del vector de AAV.
Ejemplo 2 - Una TCU optimizada proporciona una expresión robusta de un gen indicador en todos los subtipos de conos
Para someter a ensayo la capacidad de las TCU optimizadas divulgadas en el presente documento para promover la expresión de proteína indicadora en las células de cono, se transdujeron retinas derivadas de ES humanas usando AAVshh10-hG1.4.GFP, se observó una expresión robusta del gen indicador (Figura 3A) en todos los subtipos de conos (Figura 3B', C').
En comparación con un promotor de arrestina de conos (CAR, por sus siglas en inglés) humano caracterizado anteriormente, los niveles de expresión proporcionados por hG1.4 fueron superiores en los conos humanos y no hubo expresión ectópica en las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR, por sus siglas en inglés) ni en las células de bastón. En ratones, los promotores de cono basados en promotores de opsina roja humana no eran específicos del cono y mediaban la expresión también en bastones (Yeet al.,2016).
Ejemplo 3: Optimización adicional de las TCU y optimización de codones del gen CNGA3 humano
Cambiando la secuencia GGGCCG en las posiciones 5 a 10 con respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen de opsina verde a TCTAGA, duplica el nivel de expresión resultante. Esta alteración de secuencia (M8), véase la SEQ ID NO: 16, por lo tanto, se incorporó a las construcciones hG1.4 y hG1.7
Además, la secuencia codificante deCNGA3se sometió a optimización de codones, para intentar mejorar el sesgo de uso de codones y el contenido en CG, y eliminar cualquier sitio de procesamiento críptico y posibles estructuras de tallo-bucle en el ARNm.
Las construcciones hG1.4(M8) (SEQ ID NO: 6) y hG1.7(M8) (SEQ ID NO: 15) se usaron en vectores AAV2/8 que llevaban un ADNc deCNGA3humano con codones optimizados (coCNGA3) y se determinó la eficacia de los vectores en un modelo de ratón con inactivación deCNGA3usando evaluaciones electrorretinográficas (ERG) de la función de los conos. Un mes después de la administración del vector, no hubo ninguna ventaja clara sobre el vector sin la secuencia M8, aunque el vector hG1.7(M8) pareció mostrar una pequeña mejora sobre el vector correspondiente sin la secuencia M8 (Figura 4, barras izquierdas de la columna). Cuando se repitieron las evaluaciones de ERG en estos animales 2 meses después de la administración, las amplitudes en los animales inyectados con vectores 'M8' aumentaron adicionalmente (Figura 4, barras derechas de la columna), mientras que las amplitudes en los animales inyectados con los vectores convencionales permanecieron consistentes (hG1.4) o aumentaron marginalmente (hG1.7). Se demostró que los niveles máximos de expresión son importantes para conseguir un buen rescate funcional en la acromatopsia debido a CNGA3 y estos resultados indican que la inclusión de la secuencia M8 en las construcciones es beneficiosa para el tratamiento.
El genCNGA3con codones optimizados rescató las respuestas fotópicas en ratón con inactivación deCnga3más eficazmente que el gen CNGA3 humano de tipo silvestre (Figura 5). Las construcciones que llevan el promotor de opsina roja (1.7L) que impulsa el gen CNGA3 humano de tipo silvestre o un gen CNGA3 humano de codones optimizados se empaquetaron en un serotipo AAV2/8 y se inyectaron por vía subretiniana en ratones deficientes enCnga3.Se evaluaron las respuestas ERG fotópicas 1 mes y 2 meses después de la inyección. Las respuestas ERG en los animales que recibieron el vector con codones optimizados fueron uniformemente más altas que en los animales que recibieron el gen de tipo silvestre (Figura 5).
Ejemplo 4: Los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 pueden rescatar las respuestas fotópicas en ratón con inactivación de CNGA3, mientras que la construcción AA2/5 correspondiente proporciona un rescate mínimo
Para evaluar la capacidad de los vectores AAV2/5 y AAV2/8 que expresan CNGA3 para rescatar las respuestas fotópicas, se inyectaron vectores víricos AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3 y AAV2/5-hG1.4(M8).coCNGA3 por vía subretiniana en ratones con inactivación decnga3de 1 mes de edad. Se evaluaron las respuestas ERG fotópicas 4 semanas después de la administración. Los inventores observaron respuestas fotópicas robustas en ojos tratados con AAV2/8 con amplitudes de ondas b de ERG de hasta 70 pV (Figura 6 A y B). Los ojos que recibieron inyecciones subretiniana en ambos hemisferios (superior/inferior) mostraron la mayor mejoría en la amplitud de la onda b de ERG. En comparación, un ratón de tipo silvestre tiene amplitudes de aproximadamente 100-120 pV en las mismas configuraciones experimentales. No hubo respuestas de los ojos sin tratar y los ojos tratados con AAV2/5 proporcionaron respuestas mínimas (Figura 6 A y B). Estos datos muestran que el vector AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3 es capaz de proporcionar niveles de expresión altos de CNGA3 y restablecer la función de los conos en ratones con inactivación deCNGA3con respecto a la de aproximadamente el 60 % de los de tipo silvestre, como se midió por las amplitudes de las ondas b ERG de los conos.
Para demostrar adicionalmente que el rescate de la sensibilidad de la retina por los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 era duradero, A los ratones deficientes enCnga3se les inyectó por vía subretiniana a la edad de 2 semanas AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3 (n = 14) o AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 (n = 13) (título 1 * 1012 vg/ml para ambos) o se dejaron sin tratar (n = 3). La transfección con cualquiera de los vectores conduce a un rescate sostenido de la sensibilidad de la retina hasta seis meses después del tratamiento (Figura 7).
Ejemplo 5: Los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 promueven la supervivencia de los conos a largo plazo
La capacidad de los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 para promover la supervivencia de los conos se evaluó inyectando AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 a un ratón deficiente en Cnga3 a las 2 semanas de edad. Un ratónC57BL/6Jde 3-4 meses de edad, que no recibió una inyección, sirvió como control para conos sanos. Se aislaron las retinas, se tiñeron con arrestina de conos y se aclararon.
Las retinas deficientes en CngaJ transducidas con AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3 (véase la Figura 8C) mostraron la supervivencia de los conosin vivo3-4 meses después del tratamiento. El grado de supervivencia fue similar a la supervivencia de los conos del control sano (véase la Figura 8A) y aumentó significativamente en comparación con las retinas deficientes en CngaJ sin inyectar (véase la Figura 8B).
La capacidad de los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 para promover la supervivencia de los conos fue duradera y aún pudo observarse 13 meses después del tratamiento con el vector (véase la Figura 9).
Ejemplo 6: Los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 conservan la conectividad sináptica in vivo
Para evaluar la capacidad de los vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 para mejorar la integridad sináptica entre las células de cono y las neuronas de soporte (células bipolares), a un ratón deficiente en Cnga3 de 2 semanas de edad se le inyectó AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3. 3-4 meses después del tratamiento, las retinas se aislaron y se tiñeron con Gpr179 y PNA y después se aclararon. La conectividad sináptica se determinó midiendo la intensidad de la señal del marcador sináptico Gpr179 en imágenes confocales de un plano único de retinas de montaje plano. Para procesar la imagen se usó el software Leica Las X. Las tinciones de Gpr179 se trazaron dibujando una línea a mano alzada en varias tinciones de Gpr179 relacionadas con pedículos de cono (se usó la tinción de PNA para confirmar los pedículos de cono) y más de 10 tinciones de Gpr179 relacionadas con esférulas de bastón (A). La intensidad de señal fue el resultado (B; línea blanca: Gpr179, línea roja: PNA). Se promediaron los picos de intensidad de señal de cada origen y se calculó la relación de GPr179 relacionada con pedículos de cono con respecto a esférulas de bastón (CP/RS, por sus siglas en inglés). Se usaron CP/RS de cuatro ubicaciones diferentes para el análisis estadístico (Ensayo de comparación múltiple de Bonferroni (ns: p>0,05, **: p < 0,01, *: p <_ 0,05)). Las retinas de un ratóndeficiente en Cnga3sin inyectar y un ratónC57BL/6Jsin inyectar de la misma edad (3-4 meses) sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente.
Como se muestra en la Figura 10, la transducción de retinas con vectores AAV2/8 que expresan CNGA3 conduce a una conectividad sináptica similar a la de un ratón de control sano y significativamente mejorada en comparación con las retinas sin inyectar.
Ejemplo 7: El suministro de coCNGA3 usando AAV2/8 proporciona un mayor beneficio que el suministro mediante los serotipos novedosos de AAV potentes, AAV-Anc80, AAV-44.9 y AAV5
Hay disponibles varios serotipos y cápsides de AAV diferentes disponibles para la expresión de genes. Por ejemplo, se demostró que la cápside Anc80-L65 recientemente desarrollada tiene un tropismo eficiente a los fotorreceptores y es comparable o incluso superior a AAV8. Además, también se ha demostrado que el serotipo AAV44.9 novedoso presenta una transducción eficiente y una alta expresión en las células fotorreceptoras cuando se somete a ensayo en combinación con un marcador fluorescente. Por lo tanto, se comparó la capacidad de cuatro vectores de AAV diferentes, Anc80-L65, AAV44.9, AAV5 y AAV8, para expresar coCNGA3 y proporcionar respuestas ERG sostenidas.
Los respectivos vectores que llevan el casete de expresión hG1.4(M8)-coCNGA3 (1,0 x 1012 vg/ml) se suministraron al espacio subretiniano de ratones deficientes enCnga3a la edad de 2 semanas y se registró un ERG fotópico de destello único en diferentes puntos temporales posteriores a la inyección (véase la Figura 11). Se usó el estímulo luminoso de 10 cd.s/m2 para el análisis. Como se muestra en la Figura 11, la transferencia de genes mediada por AAV8 condujo a respuestas ERG superiores en comparación con Anc80-L65 (véase la Figura 11A), AAV44.9 (véase la Figura 11B) o AAV5 (véase la Figura 11C y la Figura 6).
Ejemplo 8: Comparación de TCU optimizadas con promotores específicos de conos conocidos anteriormente
Para comparar el nivel de expresión de las TCU divulgadas en el presente documento con uno de los promotores específicos de conos más potentes disponibles (1.7L), se transdujeron cuerpos embrionarios humanos (hEB) de 17 19 semanas de edad con el vector de AAV AAVShH10 que expresa eGFP bajo el control de hG1.4(M8), hG1.7(M8) o P1.7L, respectivamente, y se recogieron 2 semanas después (n = 6-8 para cada promotor). Después de la disociación, se analizaron las células para determinar la intensidad de fluorescencia media (IFM) relativa en células positivas para GFP. La IFM relativa en los hEB transducidos con los diferentes vectores se evaluó mediante citometría de flujo y se calculó como relación con respecto a la IFM en los EB transducidos con AAV ShH10-1.7L-eGFP. Como se muestra en la Figura 12A, la construcción hG1.7 proporciona un aumento de aproximadamente el 50 % en la expresión de GFP en comparación con el promotor 1.7L conocido anteriormente.
Adicionalmente, se sometió a ensayo un vector AAV2/8 que impulsaba hCNGA3 a partir del promotor hCAR (arrestina de conos humanos) en ratones con inactivación deCNGA3.Las respuestas fotópicas de rescate no superaron el 30 % de los niveles de tipo silvestre (Figura 12B).
Se ha informado que puede usarse un vector AAV2/5(Y719F) y un promotor de opsina de conos azules de ratón para rescatar ratones con inactivación deCNGA3.En dicho estudio, las amplitudes de ERG fotópico alcanzaron el 30 % del tipo silvestre cuando se inyectaron en P12 y se evaluaron 10 semanas después del tratamiento (Michalakiset al.,2010). Recientemente se ha usado un vector AAV5 y un promotor de opsina roja de 2,1 kb para rescatar ovejas deficientes en CNGA3. En este estudio, se observó una duplicación de ERG de parpadeo de conos en comparación con ratones sin tratar (Baninet al.,2015). Sin embargo, se sabe que ambos promotores funcionan sólo en un subconjunto de conos humanos (el promotor de opsina de conos azules está activo sólo en conos azules y el promotor de opsina roja 2.1 está activo sólo en conos rojos).
Un estudio usando un vector AAV2/5 con un promotor de CBA para expresarCNGA3murino en ratones con inactivación deCNGA3realizado por el laboratorio de Hauswirth mostró el rescate de hasta el 70 % de las amplitudes de onda b de conos ERG de tipo silvestre cuando los ratones se trataron muy precozmente (P14 evaluado 3 semanas después del tratamiento - título vírico 1E13) (Panget al.,2012). Los inventores lograron una eficacia similar en el rescate de la visión fotópica tratando el mismo modelo animal más tarde en la vida (1 mes - título vírico 7E12). Aunque la acromatopsia en seres humanos es un trastorno estacionario, el modelo de ratón deCNGA3padece muerte de células de cono durante el primer mes, lo que indica que un tratamiento precoz es beneficioso. Es poco probable que se use el promotor de CBA no específico en un ensayo de CNGA3, pero respalda la afirmación de los inventores de que los niveles altos de expresión de CNGA3 son importantes para un rescate óptimo.
Referencias
Altschul S. F.A protein alignment scoring system sensitive at all evolutionary distances.1993J Mol Evol36:290-300.
Altschul S. F.et al Basic local alignment search tool.1990J Mol Biol215:403-10.
Banin E., Gootwine E., Obolensky A., Ezra-Elia R., Ejzenberg A., Zelinger L., Honig H., Rosov A., Yamin E., Sharon D., Averbukh E., Hauswirth W. W., Ofri R.Gene Augmentation
Therapy Restores Retinal Function and Visual Behavior in a Sheep Model of CNGA3 Achromatopsia.2015Mol Ther.Sep; 23(9): 1423-33.
Davidoffet al. Purification of recombinant adeno-associated virus type 8 vectors by ion exchange chromatography generates clinical grade vector stock.2004J. Virol. Methods121; 209-215.
Devereux J.et al. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX.1984Nucleic Acids Research12, 387-395.
Gao G. P., Alvira M. R., Wang L., Calcedo R., Johnston J., Wilson J. M.Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,99 (18) (2002), págs. 11854 11859
Hawes N., Wang X., Hurd R. E., Wang J., Davisson M. T., Nusinowitz S., Heckenlively J. R., Chang B.A Point Mutation in the Cnga3 Gene Causes Cone Photoreceptor Function Loss (cpfl5) in Mice.2006Invest Ophthalmol Vis Sci47: Resumen-e 4579
Henikoff S. y Henikoff J. G.Amino acid substitution matrices from protein blocks.1992Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 10915-10919.
Karlin S. y Altschul S. F.Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.
1993Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 5873-5787.
Michalakis S., Mühlfriedel R., Tanimoto N., Krishnamoorthy V., Koch S., Fischer M. D., Becirovic E., Bai L., Huber G., Beck S. C., Fahl E., Büning H., Paquet-Durand F., Zong X.,
Gollisch T., Biel M., Seeliger M. W.Restoration of cone vision in the CNGA3-/- mouse model of congenital complete lack of cone photoreceptor function.2010Mol Ther.Dec; 18(12): 2057-63.
Pang J. J., Deng W. T., Dai X., Lei B., Everhart D., Umino Y., Li J., Zhang K., Mao S., Boye S. L., Liu L., Chiodo V. A., Liu X., Shi W., Tao Y., Chang B., Hauswirth W. W.AAV-mediated cone rescue in a naturally occurring mouse model of CNGA3-Achromatopsia.2012PLoS One.7(4): e35250.
Shabaan S. A. y Deeb S. S.Functional Analysis of the Promoters of the Human Red and Green Visual Pigment Genes.1998IOVS39: 885-896.
Smallwood P. M., Wang Y., Nathans J.Role of a Locus Control Region in the mutually exclusive expression of human red and green cone pigment genes.2002Proc Natl Acad Sci USA.Enero 22; 99(2): 1008-11.
Ye G. J., Budzynski E., Sonnentag P., Nork T. M., Sheibani N., Gurel Z., Boye S. L., Peterson J. J., Boye S. E., Hauswirth W. W., Chulay J. D.Cone-Specific Promoters for Gene Therapy of Achromatopsia and Other Retinal Diseases.2016Hum Gene Ther.Enero; 27(1): 72-82.
Información de secuencias
SEQ ID NO: 1 - fragmento de 1,2 kb de la Región de control del locus (LCR) de la opsina M/L
TAGGAATAGAAGGGTGGGTGCAGGAGGCTGAGGGGTGGGGAAAGGGCATGGGTGTTTCATGAGGACAGAGCTTCCGT
TTCATGCAATGAAAAGAGTTTGGAGACGGATGGTGGTGACTGGACTATACACTTACACACGGTAGCGATGGTACACT
TTGTATTATGTATATTTTACCACGATCTTTTTAAAGTGTCAAAGGCAAATGGCCAAATGGTTCCTTGTCCTATAGCT
GTAGCAGCCATCGGCTGTTAGTGACAAAGCCCCTGAGTCAAGATGACAGCAGCCCCCATAACTCCTAATCGGCTCTC
CCGCGTGGAGTCATTTAGGAGTAGTCGCATTAGAGACAAGTCCAACATCTAATCTTCCACCCTGGCCAGGGCCCCAG
CTGGCAGCGAGGGTGGGAGACTCCGGGCAGAGCAGAGGGCGCTGACATTGGGGCCCGGCCTGGCTTGGGTCCCTCTG
GCCTTTCCCCAGGGGCCCTCTTTCCTTGGGGCTTTCTTGGGCCGCCACTGCTCCCGCTCCTCTCCCCCCATCCCACC
CCCTCACCCCCTCGTTCTTCATATCCTTCTCTAGTGCTCCCTCCACTTTCATCCACCCTTCTGCAAGAGTGTGGGAC
CTTTAGGCTAAAATGGGACTTGATCTTCTGTTAGCCCTAATCATCAATTAGCAGAGCCGGTGAAGGTGCAGAACCTA
CCGCCTTTCCAGGCCTCCTCCCACCTCTGCCACCTCCACTCTCCTTCCTGGGATGTGGGGGCTGGCACACGTGTGGC
CCAGGGCATTGGTGGGATTGCACTGAGCTGGGTCATTAGCGTAATCCTGGACAAGGGCAGACAGGGCGAGCGGAGGG
CCAGCTCCGGGGCTCAGGCAAGGCTGGGGGCTTCCCCCAGACACCCCACTCCTCCTCTGCTGGACCCCCACTTCATA
GGGCACTTCGTGTTCTCAAAGGGCTTCCAAATAGCATGGTGGCCTTGGATGCCCAGGGAAGCCTCAGAGTTGCTTAT
CTCCCTCTAGACAGAAGGGGAATCTCGGTCAAGAGGGAGAGGTCGCCCTGTTCAAGGCCACCCAGCCAGCTCATGGC
GGTAATGGGACAAGGCTGGCCAGCCATCCCACCCTCAGAAGGGACCCGGTGGGGCAGGTGATCTCAGAGGAGGCTCA
CTTCTGGGTCTCACATTCTTG
SEQ ID NO: 2- fragmento del promotor de opsina M de 2,0 kb, fragmento de 500 pb de la SEQ ID NO: 3 subrayada, UTR en cursiva sin secuencia ded M8
TAAAAAGCAAGTCTTGCCAGGGCAGTGGTGTGCACCTGTGGTCCCAGCTACTCAGGATGCTGAGGCAGGAGGATTAC
TTGTGCCCAGCAAGTAGAGGCTGCAGTGACCTGTGACTGTGCTACTGCCCTCCAACCTGGGTGACAGAGTGAGACCT
TGTCTCAAAAAAAAAAGAGCGGGGGGGGGGGGCCGGGCCGGGCGTGGTGGCTCACAGCTGTAATCCCAGCACTTTGG
GAAGCCAAGGCGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCATCATGGTCAACACTGCGAAACACTGTCCCTAC
TAAAAATACAAAAAT TAGCCGGG CAT G GT G G CACACAC C T GTAAT C C CAG CTACTGGG GAG G C T GAG G CAG GAGAAT
TGCTTGAGCCGGGGAGACGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGACTGACAAGAGTGAG
ATT GT CT CAAAAAAAAAAAAAAAGTAAT CACTAGAAAAGAAGCTACATATGTACATAACAT CCAAATAACCAAGAGG
AGAAAAAAAT G G GAC T T GAT TAAT CAAAACAAAAACAAAAAAGAAAGAAAGAAAG G G G GAGAAAATAAAACAAG G G C
TGGGTGTGCTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGAAGCCAAGGTGGGTGGATCTCTTGAGCTCAGGAGGTCA
AGACCAGCCTGGGCAACATGGCGAAACCCCGTCTCTATTAAAAAAAAAATTAATACAACAATTATCCTGGAGTGGTG
GTGCACACCTGTAGTCCCAGCTACCCAGGACGCTGAGACGGGAGGATCGCTTGATCCCGGGGATGTCGAGGCTGCCG
T GAT C G CAC CAC T G C C C T C CAG C CAG G GT G G CAGAC T GAGAC C C CAT C T CAAAAAATAAATAAATAAAAG CAAACAA
GAAAAAAAAAGGCTT GAAACATAT CT GATAGATAAAGGGCTAAT CAACACAATATATAAAGAAC T G CAAATCAGTAA
AC T AAGAG C AAAT AAC C C AAT AT AAAGAC AT T AAAG G GT AG C C AC G GAC AT C T C AGAC GAC GAAAAAC AAAAGAC AG
TAAAC GTATAATAAAACAT GTAAT T G CAAG GT GAT C C G G GAATAGTAAG C GAAAAG CAACAAT TAAATAC TAT T T T C
TCATCCACCAGAACGCCAAAAATTAAAAAGCCTAACAATGTCCAGGGCTGGCGAGAATGTGGCAGAAGGTGATGTCA
CATACCCTGCAAGTGGGAATCTAAACAGATTCAGGGTTTTGGTTTTTTTTTAATCGCAATTAGGTGGCCTGTTAAAT
X X X X X X X b X X' bAbAbAbrAbrXT i T b L T L T H j'1 'T b L L ,bAbbrbTbrbrAbr XbrbAAXbrbrbXbbrAXb X X br br bXbALbbrbAAbbX
CGACCTCCCAGGTACAAGCGATTCTCCTGTCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGAGTACAGGTATTTGCCACTAAGCCC
AGCTAATTGTTTTTTATTTAGTAGAAACGGGGTTTCACCATGTTAGTCAGGCTGGTCGGGAACTCCTGACCTCAGGA
GATCTACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGTGCCACTGTGCCCAGCCACTTTTTTTTAGACA
GAGTCTTGGTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTTCAGTGGCGCCATCTCAGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCAGATTCAA
GCGATTCTCCTGCCTCGACCTCCCAGTAGCTGGGATTACAGGTTTCCAGCAAATCCCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGC
TCGCCTCAGGAGCAAGGAAGCAAGGGGTGGGAGGAGGAGGTCTAAGTCCCAGGCCCAATTAAGAGATCAGATGGTGT
AGGATTTGGGAGCTTTTAAGGTGAAGAGGCCCGGGCTGATCCCACTGGCCGGTATAAAGCACCGTGACCCTCAGGTG
ACGCACCAGGGCCGGCTGCCGTCGGGGACAGGGCTTTCCATAGCC
SEQ ID NO: 3 - fragmento de opsina M de 500 pb, UTR en cursiva, mutación M8 subrayada
ACAGGTATTTGCCACTAAGCCCAGCTAATTGTTTTTTATTTAGTAGAAACGGGGTTTCACCATGTTAGTCAGGCTGG
TCGGGAACTCCTGACCTCAGGAGATCTACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGTGCCACTGTG
CCCAGCCACTTTTTTTTAGACAGAGTCTTGGTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTTCAGTGGCGCCATCTCAGCTCACTGC
AACCTCCGCCTCCCAGATTCAAGCGATTCTCCTGCCTCGACCTCCCAGTAGCTGGGATTACAGGTTTCCAGCAAATC
CCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGCTCGCCTCAGGAGCAAGGAAGCAAGGGGTGGGAGGAGGAGGTCTAAGTCCCAGGCC
CAATTAAGAGATCAGATGGTGTAGGATTTGGGAGCTTTTAAGGTGAAGAGGCCCGGGCTGATCCCACTGGCCGGTAT
AAAGCACCGTGACCCTCAGGTGACGCACCATCTAGAGCTGCCGTCGGGGACAGGGCTTTCCATAGCC
SEQ ID NO: 4 - variante de la construcción hG1.7(M8), fragmento de LCR de opsina M/L de 1,2 kb, fragmento de opsina M de 500 pb, UTR en cursiva, mutación M8 subrayada
TAGGAATAGAAGGGTGGGTGCAGGAGGCTGAGGGGTGGGGAAAGGGCATGGGTGTTTCATGAGGACAGAGCTTCCGT
TTCATGCAATGAAAAGAGTTTGGAGACGGATGGTGGTGACTGGACTATACACTTACACACGGTAGCGATGGTACACT
TTGTATTATGTATATTTTACCACGATCTTTTTAAAGTGTCAAAGGCAAATGGCCAAATGGTTCCTTGTCCTATAGCT
GTAGCAGCCATCGGCTGTTAGTGACAAAGCCCCTGAGTCAAGATGACAGCAGCCCCCATAACTCCTAATCGGCTCTC
CCGCGTGGAGTCATTTAGGAGTAGTCGCATTAGAGACAAGTCCAACATCTAATCTTCCACCCTGGCCAGGGCCCCAG
CTGGCAGCGAGGGTGGGAGACTCCGGGCAGAGCAGAGGGCGCTGACATTGGGGCCCGGCCTGGCTTGGGTCCCTCTG
GCCTTTCCCCAGGGGCCCTCTTTCCTTGGGGCTTTCTTGGGCCGCCACTGCTCCCGCTCCTCTCCCCCCATCCCACC
CCCTCACCCCCTCGTTCTTCATATCCTTCTCTAGTGCTCCCTCCACTTTCATCCACCCTTCTGCAAGAGTGTGGGAC
CACAAATGAGTTTTCACCTGGCCTGGGGACACACGTGCCCCCACAGGTGCTGAGTGACTTTCTAGGACAGTAATCTG
CTTTAGGCTAAAATGGGACTTGATCTTCTGTTAGCCCTAATCATCAATTAGCAGAGCCGGTGAAGGTGCAGAACCTA
CCGCCTTTCCAGGCCTCCTCCCACCTCTGCCACCTCCACTCTCCTTCCTGGGATGTGGGGGCTGGCACACGTGTGGC
CCAGGGCATTGGTGGGATTGCACTGAGCTGGGTCATTAGCGTAATCCTGGACAAGGGCAGACAGGGCGAGCGGAGGG
CCAGCTCCGGGGCTCAGGCAAGGCTGGGGGCTTCCCCCAGACACCCCACTCCTCCTCTGCTGGACCCCCACTTCATA
GGGCACTTCGTGTTCTCAAAGGGCTTCCAAATAGCATGGTGGCCTTGGATGCCCAGGGAAGCCTCAGAGTTGCTTAT
CTCCCTCTAGACAGAAGGGGAATCTCGGTCAAGAGGGAGAGGTCGCCCTGTTCAAGGCCACCCAGCCAGCTCATGGC
GGTAATGGGACAAGGCTGGCCAGCCATCCCACCCTCAGAAGGGACCCGGTGGGGCAGGTGATCTCAGAGGAGGCTCA
CTTCTGGGTCTCACATTCTTGACAGGTATTTGCCACTAAGCCCAGCTAATTGTTTTTTATTTAGTAGAAACGGGGTT
TCACCATGTTAGTCAGGCTGGTCGGGAACTCCTGACCTCAGGAGATCTACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGA
TTACAGGCGTGTGCCACTGTGCCCAGCCACTTTTTTTTAGACAGAGTCTTGGTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTTCAGT
GGCGCCATCTCAGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCAGATTCAAGCGATTCTCCTGCCTCGACCTCCCAGTAGCTGGG
ATTACAGGTTTCCAGCAAATCCCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGCTCGCCTCAGGAGCAAGGAAGCAAGGGGTGGGAGG
AGGAGGTCTAAGTCCCAGGCCCAATTAAGAGATCAGATGGTGTAGGATTTGGGAGCTTTTAAGGTGAAGAGGCCCGG
GCTGATCCCACTGGCCGGTATAAAGCACCGTGACCCTCAGGTGACGCACCATCTAGAGCTGCCGTCGGGGACAGGGC
TTTCCATAGCC
SEQ ID NO: 5 - fragmento de opsina M de 200 pb, UTR en cursiva, mutación M8 subrayada
GATCGATTACAGGTTTCCAGCAAATCCCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGCTCGCCTCAGGAGCAAGGAAGCAAGGGGTG
GGAGGAGGAGGTCTAAGTCCCAGGCCCAATTAAGAGATCAGATGGTGTAGGATTTGGGAGCTTTTAAGGTGAAGAGG
CCCGGGCTGATCCCACTGGCCGGTATAAAGCACCGTGACCCTCAGGTGACGCACCATCTAGAGCTGCCGTCGGGGAC
AGGGCTTTCCATAGCC
SEQ ID NO: 6 - construcción hG1.4(M8): fragmento de LCR de opsina M/L de 1,2 kb, fragmento de opsina M de 200 pb, UTR en cursiva, mutación M8 subrayada
TAGGAATAGAAGGGTGGGTGCAGGAGGCTGAGGGGTGGGGAAAGGGCATGGGTGTTTCATGAGGACAGAGCTTCCGT
TTCATGCAATGAAAAGAGTTTGGAGACGGATGGTGGTGACTGGACTATACACTTACACACGGTAGCGATGGTACACT
TTGTATTATGTATATTTTACCACGATCTTTTTAAAGTGTCAAAGGCAAATGGCCAAATGGTTCCTTGTCCTATAGCT
GTAGCAGCCATCGGCTGTTAGTGACAAAGCCCCTGAGTCAAGATGACAGCAGCCCCCATAACTCCTAATCGGCTCTC
CCGCGTGGAGTCATTTAGGAGTAGTCGCATTAGAGACAAGTCCAACATCTAATCTTCCACCCTGGCCAGGGCCCCAG
CTGGCAGCGAGGGTGGGAGACTCCGGGCAGAGCAGAGGGCGCTGACATTGGGGCCCGGCCTGGCTTGGGTCCCTCTG
GCCTTTCCCCAGGGGCCCTCTTTCCTTGGGGCTTTCTTGGGCCGCCACTGCTCCCGCTCCTCTCCCCCCATCCCACC
CCCTCACCCCCTCGTTCTTCATATCCTTCTCTAGTGCTCCCTCCACTTTCATCCACCCTTCTGCAAGAGTGTGGGAC
CACAAATGAGTTTTCACCTGGCCTGGGGACACACGTGCCCCCACAGGTGCTGAGTGACTTTCTAGGACAGTAATCTG
CTTTAGGCTAAAATGGGACTTGATCTTCTGTTAGCCCTAATCATCAATTAGCAGAGCCGGTGAAGGTGCAGAACCTA
CCGCCTTTCCAGGCCTCCTCCCACCTCTGCCACCTCCACTCTCCTTCCTGGGATGTGGGGGCTGGCACACGTGTGGC
CCAGGGCATTGGTGGGATTGCACTGAGCTGGGTCATTAGCGTAATCCTGGACAAGGGCAGACAGGGCGAGCGGAGGG
CCAGCTCCGGGGCTCAGGCAAGGCTGGGGGCTTCCCCCAGACACCCCACTCCTCCTCTGCTGGACCCCCACTTCATA
GGGCACTTCGTGTTCTCAAAGGGCTTCCAAATAGCATGGTGGCCTTGGATGCCCAGGGAAGCCTCAGAGTTGCTTAT
CTCCCTCTAGACAGAAGGGGAATCTCGGTCAAGAGGGAGAGGTCGCCCTGTTCAAGGCCACCCAGCCAGCTCATGGC
GGTAATGGGACAAGGCTGGCCAGCCATCCCACCCTCAGAAGGGACCCGGTGGGGCAGGTGATCTCAGAGGAGGCTCA
CTTCTGGGTCTCACATTCTTGGATCGATTACAGGTTTCCAGCAAATCCCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGCTCGCCTCA
GGAGCAAGGAAGCAAGGGGTGGGAGGAGGAGGTCTAAGTCCCAGGCCCAATTAAGAGATCAGATGGTGTAGGATTTG
GGAGCTTTTAAGGTGAAGAGGCCCGGGCTGATCCCACTGGCCGGTATAAAGCACCGTGACCCTCAGGTGACGCACCA
TCTAGAGCTGCCGTCGGGGACAGGGCTTTCCATAGCC
SEQ ID NO: 7 - ADNc de CNGA3 con codones optimizados
AT G G C CAAGAT CAACAC C CAATAC T C C CAC C C C T C CAG GAC C CAC C T CAAG GTAAAGAC C T CAGAC C GAGAT C T CAA
TCGCGCTGAAAATGGCCTCAGCAGAGCCCACTCGTCAAGTGAGGAGACATCGTCAGTGCTGCAGCCGGGGATCGCCA
TGGAGACCAGAGGACTGGCTGACTCCGGGCAGGGCTCCTTCACCGGCCAGGGGATCGCCAGGCTGTCGCGCCTCATC
TTCTTGCTGCGCAGGTGGGCTGCCAGGCATGTGCACCACCAGGACCAGGGACCGGACTCTTTTCCTGATCGTTTCCG
T GGAGC C GAGCT TAAGGAGGT GT C CAGC CAAGAAAGCAAT GC C CAGGCAAAT GT GGGCAGC CAGGAGC CAGCAGACA
GAG G GAGAAG CGCCTGGCCCCTGGC CAAAT G CAACAC TAACAC CAG CAACAACAC G GAG GAG GAGAAGAAGAC GAAA
AAGAAGGATGCGATCGTGGTGGACCCGTCCAGCAACCTGTACTACCGCTGGCTGACCGCCATCGCCCTGCCTGTCTT
CTATAACTGGTATCTGCTTATTTGCAGGGCCTGTTTCGATGAGCTGCAGTCCGAGTACCTGATGCTGTGGCTGGTCC
TGGACTACTCGGCAGATGTCCTGTATGTCTTGGATGTGCTTGTACGAGCTCGGACAGGTTTTCTCGAGCAAGGCTTA
ATGGTCAGTGATACCAACAGGCTGTGGCAGCATTACAAGACGACCACGCAGTTCAAGCTGGATGTGTTGTCCCTGGT
CCCCACCGACCTGGCTTACTTAAAGGTGGGCACAAACTACCCAGAAGTGAGGTTCAACCGCCTACTGAAGTTTTCCC
GGCTCTTTGAATTCTTTGACCGCACAGAGACAAGGACCAACTACCCCAATATGTTCAGGATTGGGAACTTGGTCTTG
TACATTCTCATCATCATCCACTGGAATGCCTGCATCTACTTTGCCATTTCCAAGTTCATTGGTTTTGGGACAGACTC
CTGGGTCTACCCAAACATCTCAATCCCAGAGCATGGGCGCCTCTCCAGGAAGTACATTTACAGTCTCTACTGGTCCA
CCTTGACCCTTACCACCATTGGTGAGACCCCACCCCCCGTGAAAGATGAGGAGTATCTCTTTGTGGTCGTAGACTTC
TTGGTGGGTGTTCTGATTTTTGCCACCATTGTGGGCAATGTGGGCTCCATGATCTCGAATATGAATGCCTCACGGGC
AGAGTTCCAGGCCAAGATTGATTCCATCAAGCAGTACATGCAGTTCCGCAAGGTCACCAAGGACTTGGAGACGCGGG
TTATCCGGTGGTTTGACTACCTGTGGGCCAACAAGAAGACGGTGGATGAGAAGGAGGTGCTCAAGAGCCTCCCAGAC
AAGCTGAAGGCTGAGATCGCCATCAACGTGCACCTGGACACGCTGAAGAAGGTTCGCATCTTCCAGGACTGTGAGGC
AGGGCTGCTGGTGGAGCTGGTGCTGAAGCTGCGACCCACTGTGTTCAGCCCTGGGGATTATATCTGCAAGAAGGGAG
ATATTGGGAAGGAGATGTACATCATCAACGAGGGCAAGCTGGCCGTGGTGGCTGATGATGGGGTCACCCAGTTCGTG
GTCCTCAGCGATGGCAGCTACTTCGGGGAGATCAGCATTCTGAACATCAAGGGGAGCAAGTCGGGGAACCGCAGGAC
GGCCAACATCCGCAGCATTGGCTACTCAGACCTGTTCTGCCTCTCAAAGGACGATCTCATGGAGGCCCTCACCGAGT
AC C C C GAAG C CAAGAAG G C C C T G GAG GAGAAAG GAC G G CAGAT C C T GAT GAAAGACAAC C T GAT CGAT GAG GAG C T G
GCCAGGGCGGGCGCGGACCCCAAGGACCTTGAGGAGAAAGTGGAGCAGCTGGGGTCCTCCCTGGACACCCTGCAGAC
CAGGTTTGCACGCCTCCTGGCTGAGTACAACGCCACCCAGATGAAGATGAAGCAGCGTCTCAGCCAACTGGAAAGCC
AGGTGAAGGGTGGTGGGGACAAGCCCCTGGCTGATGGGGAAGTTCCCGGGGATGCTACAAAAACAGAGGACAAACAA
CAGTGA
SEQ ID NO: 8 - ADNc deCNGA3de codones optim izados
AT G G C AAAAAT C AAT AC C C AGT AC AG C C AC C C C T C AC GAAC T C AC C T GAAAGT C AAAAC AAG C GAT AGAGAC C T GAA
CAGAGCCGAGAACGGCCTGTCCAGGGCCCACAGCTCCTCTGAGGAAACTAGTTCAGTGCTGCAGCCTGGAATCGCTA
TGGAGACCAGAGGGCTGGCTGACTCTGGCCAAGGAAGTTTCACAGGGCAGGGCATCGCCAGGCTGTCTAGACTGATT
TTTCTGCTGAGGAGATGGGCCGCTAGGCATGTGCACCATCAGGACCAGGGACCCGATAGTTTCCCTGAC
AGGTTCAGGGGGGCCGAACTGAAGGAGGTCAGCTCCCAGGAATCTAACGCACAGGCCAATGTGGGCAGTCAGGAGCC
C G C T GATAGAG GAC G GT C C G CAT GGCCTCTGGC CAAGT G CAACAC TAATAC C T C TAACAATACAGAG GAAGAGAAGA
AAACTAAGAAAAAGGATGCCATCGTGGTCGACCCTTCTAGTAACCTGTACTATAGGTGGCTGACAGCTATCGCACTG
CCAGTGTTCTACAATTGGTATCTGCTGATTTGCAGAGCTTGTTTTGACGAACTGCAGAGTGAGTATCTG
ATGCTGTGGCTGGTGCTGGATTACTCAGCAGACGTGCTGTATGTGCTGGATGTCCTGGTGCGCGCACGAACTGGGTT
C C T G GAG CAG G G C C T GAT G GT GAG C GACAC CAACAGAC T GT G G CAG CAC TACAAAAC CACAAC T CAGT T T AAG C T G G
ATGTCCTGTCCCTGGTGCCAACCGACCTGGCCTACCTGAAAGTCGGCACAAACTATCCCGAGGTGCGGTTCAATCGC
CTGCTGAAGTTCTCTCGGCTGTTTGAGTTCTTCGATAGGACAGAGACTAGAACCAACTACCCAAATATG
TTCCGCATCGGCAACCTGGTGCTGTATATTCTGATCATTATCCACTGGAATGCTTGTATCTACTTTGCAATCAGCAA
GTTCATTGGATTTGGGACCGACAGCTGGGTGTATCCAAACATTTCCATCCCCGAACATGGACGACTGAGCAGGAAGT
ACAT C TAT T CAC T GTAC T G GAG CACAC T GAC T C T GAC CACAAT T G G G GAGAC CCCCCCTC CAGT GAAG GAT GAAGAG
TACCTGTTCGTGGTCGTGGACTTTCTGGTCGGCGTGCTGATCTTCGCAACAATTGTCGGCAATGTGGGA
AGTAT GAT C T CAAACAT GAAT G C C T CAC GAG C T GAGT T C CAG G C TAAAAT T GACAG CAT CAAG CAGTATAT G CAGT T
TAGAAAAGTCACTAAGGATCTGGAGACCAGAGTGATCCGGTGGTTTGACTACCTGTGGGCCAACAAAAAGACAGTCG
ATGAAAAAGAGGTGCTGAAGAGCCTGCCCGACAAACTGAAGGCAGAGATTGCCATCAATGTCCATCTGGATACTCTG
AAAAAGGTGCGGATCTTCCAGGACTGCGAAGCAGGACTGCTGGTCGAGCTGGTGCTGAAGCTGCGCCCT
ACCGTGTTTAGCC CAG G C GAT TATAT C T GTAAAAAG G G G GACAT T G G CAAAGAAAT GTACAT TAT CAAC GAG G G GAA
GCTGGCTGTCGTGGCAGACGATGGCGTGACCCAGTTCGTCGTGCTGAGCGATGGCAGCTATTTTGGGGAAATTTCCA
TCCTGAATATCAAAGGCTCCAAGTCTGGAAACCGGCGCACAGCTAATATTCGGTCCATCGGATATTCTGACCTGTTC
TGCCTGTCTAAGGACGATCTGATGGAGGCACTGACTGAATACCCCGAGGCCAAAAAGGCTCTGGAAGAG
AAAG G C C G G CAGAT C C T GAT GAAG GATAAC C T GAT T GAC GAAGAG C T G G CAC GAG C T G GAG CAGAC C C TAAAGAT C T
GGAAGAGAAGGTGGAGCAGCTGGGATCAAGCCTGGATACCCTGCAGACACGCTTCGCTCGACTGCTGGCAGAATACA
ATGCCACCCAGATGAAAATGAAGCAGCGCCTGAGTCAGCTGGAGTCACAGGTGAAAGGCGGAGGGGACAAGCCCCTG
G CAGAT G G C GAAGT C C C T G G C GAC G C TACAAAAACAGAAGATAAACAG CAGTAA
SEQ ID NO: 9 - ADNc de PDE6C, NM 006204.3
ATGGGTGAGATCAACCAAGTTGCCGTGGAGAAATACCTGGAGGAGAACCCTCAGTTTGCCAAGGAGTACTTTGACAG
GAAGTTGCGGGTGGAGGTGCTGGGAGAAATCTTCAAGAACAGCCAGGTGCCAGTCCAGTCCAGCATGTCCTTCTCTG
AGCTGACCCAGGTGGAGGAGTCAGCCCTGTGCTTGGAGCTGCTGTGGACCGTGCAGGAGGAGGGGGGCACCCCAGAG
CAGGGGGTTCACAGGGCCCTGCAGAGGCTGGCCCACCTGCTCCAGGCTGACCGCTGCAGCATGTTCCTGTGCCGGTC
CCGGAACGGCATACCTGAGGTGGCCTCTAGGTTGCTGGATGTCACCCCCACCTCCAAGTTTGAGGACAACCTGGTGG
GCCCTGACAAAGAAGTTGTGTTTCCATTGGACATTGGGATAGTGGGTTGGGCTGCTCACACGAAGAAAACTCATAAT
GT C C CAGAT GT GAAAAAGAACAG C CAT T T T T C T GAC T T CAT G GACAAG CAAAC T G G GTAT GT CACTAAGAAC C T G C T
GGCAACCCCGATCGTGGTGGGCAAGGAGGTTCTTGCTGTGATCATGGCAGTTAACAAAGTAAATGCATCTGAATTTT
CCAAACAGGATGAAGAGGTCTTTTCCAAATACCTCAACTTTGTGTCTATCATCCTAAGGCTTCATCACACCAGCTAC
ATGTACAATATTGAATCCCGAAGAAGCCAGATCCTTATGTGGTCAGCCAATAAAGTATTTGAAGAACTCACAGATGT
TGAGCGACAGTTTCACAAAGCGCTCTACACGGTTAGATCATATCTGAACTGTGAACGATACTCCATTGGACTGCTGG
ACAT GAC CAAGGAGAAGGAAT T CTAC GAT GAAT GGC CAAT CAAGCT T GGAGAAGTAGAGC CT TATAAAGGT C CAAAG
ACAC C T GAT G G CAG G GAAGT CAAC T T T TATAAAAT CAT T GAT TACAT T T TACAT G GAAAAGAAGAGAT CAAAGT GAT
TCCGACGCCTCCTGCAGACCACTGGACACTCATTAGTGGGTTGCCAACATATGTTGCTGAAAATGGATTTATCTGTA
ACAT GAT GAAT GCCCCTGCG GAT GAATAC T T CACAT T T CAGAAAG GAC C T GTAGAC GAAAC TGGTTGGGT C AT T AAG
AATGTTTTGTCCCTGCCTATTGTCAACAAGAAAGAAGATATTGTGGGAGTGGCTACATTTTACAACAGGAAGGATGG
AAAAC C T T T C GAT GAG CAT GAT GAATACAT TAC C GAGAC T C T CACACAAT T T C T T G GAT GGTCTCTTT TAAATAC T G
ACAC C TAC GATAAGAT GAATAAG C TAGAAAACAGAAAG GACAT T G C T CAG GAAAT G C T CAT GAACCAAAC CAAAG C C
ACT C CT GAAGAAAT TAAGTCCATTTT GAAATTT CAAGAGAAGTTAAAT GTT GAT GTAATT GACGACT GTGAAGAAAA
ACAACTTGTTGCAATTTTGAAAGAGGACTTGCCAGACCCACGCTCAGCAGAACTGTACGAATTCCGCTTCAGTGACT
TCCCCCTTACAGAGCACGGATTGATTAAATGTGGAATACGACTGTTTTTTGAAATAAATGTGGTGGAGAAATTCAAA
GTACCTGTAGAGGTTCTTACCAGATGGATGTACACTGTGAGGAAAGGGTACCGAGCTGTCACTTACCACAATTGGCG
G CAT G G GT T CAAC GT G G G G CAGAC CAT GTTTACTTTGCT GAT GACAG GAAGAT TAAAGAAGTAC TACACAGAT C T C G
AAGCCTTTGCCATGCTTGCTGCTGCTTTCTGCCATGATATTGACCACAGAGGCACCAATAATTTGTACCAGATGAAA
TCCACGTCTCCATTAGCAAGACTTCATGGTTCTTCTATTTTGGAGAGGCACCACCTGGAGTACAGTAAGACTCTGTT
GCAGGATGAGAGTTTAAACATCTTCCAGAACCTAAATAAGCGGCAGTTTGAAACAGTTATTCATTTGTTCGAGGTCG
CAATAATAG CAAC T GAC C T G G C T T TATAT T T CAAGAAGAG GAC CAT GT T T CAAAAAAT T GT T GAT G C C T GT GAACAA
AT GCAAAC GGAAGAAGAAGC CAT CAAATAT GTAACT GT T GAT C CAAC CAAGAAAGAGAT TAT CATGGCAAT GAT GAT
GACGGCATGTGACTTGTCTGCTATTACCAAGCCCTGGGAGGTGCAAAGTCAGGTAGCACTTATGGTTGCAAATGAAT
T T T GGGAACAAGGAGAT CT GGAGAGAACAGT GT T GCAGCAACAAC C CAT T C CTAT GAT GGACAGAAACAAAAGAGAT
GAATTACCTAAACTTCAAGTTGGATTTATTGATTTTGTTTGTACTTTTGTATATAAGGAGTTCTCACGGTTTCACAA
AGAAATCACACCTAT GCT GAGT GGT CTT CAGAATAACAGAGTAGAAT GGAAATCACTAGCT GAT GAGTATGAT GCAA
AGAT GAAG GT CAT T GAAGAG GAG G CAAAAAAG CAAGAAG GAG GAG C C GAAAAAG C T G C T GAAGATT C AG GAG GT G GT
GAT GACAAAAAGTCCAAAACATGTTTAAT GTT GTAA
SEQ ID NO: 10 - ADNc de PDE6H, NM 006205.2
ATGAGTGACAACACTACTCTGCCTGCTCCAGCTTCAAACCAGGGTCCTACCACCCCACGCAAAGGCCCTCCCAAGTT
CAAGCAGAGGCAGACT C GC CAAT T CAAGAGTAAAC CT C CAAAGAAAGGT GT GAAAGGAT T T GGAGAT GACAT T C CAG
GAAT G GAG G G G C TAG GAACAGATAT CACAGT GAT T T GT C CAT G G GAG G CAT T CAG C CAC C T G GAAT T G CAT GAG C T C
GCTCAGTTTGGGATTATCTGA
SEQ ID NO: 11 - ADNc de GNAT2, NM 005272.3
AT G G GAAGT G GAG C CAGT GCT GAG GACAAAGAAC T G G C CAAGAG GT C CAAG GAG C TAGAAAAGAAG C T G CAG GAG GA
TGCTGATAAGGAAGCCAAGACTGTCAAGCTGCTACTGCTGGGTGCTGGGGAGTCAGGAAAGAGCACCATCGTCAAAC
AGAT GAAGAT CAT T CAC CAG GAT G G C TAT T CAC CAGAAGAAT G C C T G GAGT T CAAG G C TAT CAT CTAT G GAAAT GT G
CTGCAGTCCATCCTGGCTATCATCCGGGCCATGACCACACTGGGCATCGATTATGCTGAACCAAGCTGTGCGGATGA
CGGGCGACAGCTCAACAACCTGGCTGACTCCATTGAGGAGGGAACCATGCCTCCTGAGCTCGTGGAGGTCATTAGGA
GGTTGTGGAAGGATGGTGGGGTGCAAGCCTGCTTCGAGAGAGCTGCAGAATACCAGCTTAATGACTCCGCATCTTAC
TAC C T GAAC CAAT TAGAAC GAAT TACAGAC C C T GAGTAC CTCCCTAGT GAG CAAGAT GT G C T C C GAT C CAGAGT CAA
AACCACGGGCATCATTGAAACCAAGTTTTCCGTCAAAGACTTGAATTTCAGGATGTTTGATGTGGGAGGGCAGAGAT
CCGAGAGAAAGAAGTGGATCCACTGCTTCGAGGGAGTCACCTGCATCATTTTCTGTGCAGCCCTCAGTGCCTATGAT
ATGGTGCTGGTGGAAGATGACGAAGTGAATCGTATGCATGAGTCTTTGCATCTGTTCAACAGCATATGTAACCACAA
ATTCTTTGCGGCTACTTCCATTGTCCTCTTTCTCAACAAGAAGGACCTCTTTGAGGAAAAAATCAAGAAAGTCCATC
T CAG CAT TTGTTTTC CAGAGTAT GAT G GTAACAAC T C C TAT GAT GAT G C G G G GAAT TACATAAAGAG C CAGT T C C T T
GACCT CAATAT GCGAAAAGAT GT CAAAGAAAT CTACAGTCACAT GACCT GT GCTACAGATACACAGAATGT CAAATT
TGTGTTTGATGCAGTTACAGATATTATCATCAAAGAAAACCTCAAGGACTGCGGCCTCTTCTAA
SEQ ID NO: 12 - ADNc de KCNV2, NM_133497.3
AT G C T CAAACAGAGT GAGAG GAGAC G GT C C T G GAG C TACAG G C C C T G GAACAC GAC G GAGAAT GAG G G CAG C CAACA
CCGCAGGAGCATTTGCTCCCTGGGTGCCCGTTCCGGCTCCCAGGCCAGCATCCACGGCTGGACAGAGGGCAACTATA
AC T AC T AC AT C GAG GAAGAC GAAGAC G G C GAG GAG GAG GAC C AGT G GAAG GAC GAC C T G G C AGAAGAG GAC C AG C AG
GCAGGGGAGGTCACCACCGCCAAGCCCGAGGGCCCCAGCGACCCTCCGGCCCTGCTGTCCACGCTGAATGTGAACGT
GGGTGGCCACAGCTACCAGCTGGACTACTGCGAGCTGGCCGGCTTCCCCAAGACGCGCCTAGGTCGCCTGGCCACCT
C CAC CAG C C G CAG C C G C CAG C TAAG C C T GT G C GAC GAC TAC GAG GAG CAGACAGAC GAATAC T T CT T C GAC C G C GAC
CCGGCCGTCTTCCAGCTGGTCTACAATTTCTACCTGTCCGGGGTGCTGCTGGTGCTCGACGGGCTGTGTCCGCGCCG
CTTCCTGGAGGAGCTGGGCTACTGGGGCGTGCGGCTCAAGTACACGCCACGCTGCTGCCGCATCTGCTTCGAGGAGC
GGCGCGACGAGCTGAGCGAACGGCTCAAGATCCAGCACGAGCTGCGCGCGCAGGCGCAGGTCGAGGAGGCGGAGGAA
CTCTTCCGCGACATGCGCTTCTACGGCCCGCAGCGGCGCCGCCTCTGGAACCTCATGGAGAAGCCATTCTCCTCGGT
GGCCGCCAAGGCCATCGGGGTGGCCTCCAGCACCTTCGTGCTCGTCTCCGTGGTGGCGCTGGCGCTCAACACCGTGG
AGGAGATGCAGCAGCACTCGGGGCAGGGCGAGGGCGGCCCAGACCTGCGGCCCATCCTGGAGCACGTGGAGATGCTG
TGCATGGGCTTCTTCACGCTCGAGTACCTGCTGCGCCTAGCCTCCACGCCCGACCTGAGGCGCTTCGCGCGCAGCGC
CCTCAACCTGGTGGACCTGGTGGCCATCCTGCCGCTCTACCTTCAGCTGCTGCTCGAGTGCTTCACGGGCGAGGGCC
ACCAACGCGGCCAGACGGTGGGCAGCGTGGGTAAGGTGGGTCAGGTGTTGCGCGTCATGCGCCTCATGCGCATCTTC
CGCATCCTCAAGCTGGCGCGCCACTCCACCGGACTGCGTGCCTTCGGCTTCACGCTGCGCCAGTGCTACCAGCAGGT
GGGCTGCCTGCTGCTCTTCATCGCCATGGGCATCTTCACTTTCTCTGCGGCTGTCTACTCTGTGGAGCACGATGTGC
CCAGCACCAACTTCACTACCATCCCCCACTCCTGGTGGTGGGCCGCGGTGAGCATCTCCACCGTGGGCTACGGAGAC
ATGTACCCAGAGACCCACCTGGGCAGGTTTTTTGCCTTCCTCTGCATTGCTTTTGGGATCATTCTCAACGGGATGCC
CAT T T C CAT C C T C TACAACAAGT T T T C T GAT TAC TACAG CAAG C T GAAG G C T TAT GAGTATAC CAC CATAC G CAG G G
AGAG G G GAGAG GT GAAC T T CAT G CAGAGAG C CAGAAAGAAGATAG C T GAGT GTTTGCTTG GAAG CAAC C CAC AG C T C
AC C C CAAGACAAGAGAAT TAG
SEQ ID NO: 13 - ADNc deCACNA2D4,NM 172364.4
ATGGTCTGTGGCTGCTCTGCCCTCCTTCCCCTCCCCAACCCCAGGCCCACCATGCCTGCAACTCCCAACTTCCTCGC
AAACCCCAGCTCCAGCAGCCGCTGGATTCCCCTCCAGCCAATGCCCGTGGCCTGGGCCTTTGTGCAGAAGACCTCGG
CCCTCCTGTGGCTGCTGCTTCTAGGCACCTCCCTGTCCCCTGCGTGGGGACAGGCCAAGATTCCTCTGGAAACAGTG
AAGCTATGGGCTGACACCTTCGGCGGGGACCTGTATAACACTGTGACCAAATACTCAGGCTCTCTCTTGCTGCAGAA
GAAGTACAAGGATGTGGAGTCCAGTCTGAAGATCGAGGAGGTGGATGGCTTGGAGCTGGTGAGGAAGTTCTCAGAGG
ACATGGAGAACATGCTGCGGAGGAAAGTCGAGGCGGTCCAGAATCTGGTGGAAGCTGCCGAGGAGGCCGACCTGAAC
CACGAATTCAATGAATCCCTGGTGTTCGACTATTACAACTCGGTCCTGATCAACGAGAGGGACGAGAAGGGCAACTT
CGTGGAGCTGGGCGCCGAGTTCCTCCTGGAGTCCAATGCTCACTTCAGCAACCTGCCGGTGAACACCTCCATCAGCA
GCGTGCAGCTGCCCACCAACGTGTACAACAAAGACCCAGATATTTTAAATGGAGTCTACATGTCTGAAGCCTTGAAT
GCTGTCTTCGTGGAGAACTTCCAGAGAGACCCAACGTTGACCTGGCAATATTTTGGCAGTGCAACTGGATTCTTCAG
GAT C TAT C CAG GTATAAAAT G GACAC C T GAT GAGAAT G GAGT CAT TAC T T T T GAC T G C C GAAAC CG C G G C T G GTAC A
TTCAAGCTGCTACTTCTCCCAAGGACATAGTGATTTTGGTGGACGTGAGCGGCAGTATGAAGGGGCTGAGGATGACT
AT T GC CAAGCACAC CAT CAC CAC CAT CT T GGACAC C CT GGGGGAGAAT GACT T CAT TAATAT CATAGC GTACAAT GA
CTACGTCCATTACATCGAGCCTTGTTTTAAAGGGATCCTCGTCCAGGCGGACCGAGACAATCGAGAGCATTTCAAAC
TGCTGGTGGAGGAGTTGATGGTCAAAGGTGTGGGGGTCGTGGACCAAGCCCTGAGAGAAGCCTTCCAGATCCTGAAG
CAGTTCCAAGAGGCCAAGCAAGGAAGCCTCTGCAACCAGGCCATCATGCTCATCAGCGACGGCGCCGTGGAGGACTA
CGAGCCGGTGTTTGAGAAGTATAACTGGCCAGACTGTAAGGTCCGAGTTTTCACTTACCTCATTGGGAGAGAAGTGT
CTTTTGCTGACCGCATGAAGTGGATTGCATGCAACAACAAAGGCTACTACACGCAGATCTCAACGCTGGCGGACACC
CAG GAGAAC GT GAT G GAATAC C T G CAC GT G C T CAG C C G C C C CAT G GT CAT CAAC CAC GAC CAC GAC AT C AT C T G GAC
AGAGGCCTACATGGACAGCAAGCTCCTCAGCTCGCAGGCTCAGAGCCTGACACTGCTCACCACTGTGGCCATGCCAG
TCTTCAGCAAGAAGAACGAAACGCGATCCCATGGCATTCTCCTGGGTGTGGTGGGCTCAGATGTGGCCCTGAGAGAG
CTGATGAAGCTGGCGCCCCGGTACAAGCTTGGAGTGCACGGATACGCCTTTCTGAACACCAACAATGGCTACATCCT
CTCCCATCCCGACCTCCGGCCCCTGTACAGAGAGGGGAAGAAACTAAAACCCAAACCTAACTACAACAGTGTGGATC
TCTCCGAAGTGGAGTGGGAAGACCAGGCTGAATCTCTGAGAACAGCCATGATCAATAGGGAAACAGGTACTCTCTCG
ATGGATGTGAAGGTTCCGATGGATAAAGGGAAGCGAGTTCTTTTCCTGACCAATGACTACTTCTTCACGGACATCAG
CGACACCCCTTTCAGTTTGGGGGTGGTGCTGTCCCGGGGCCACGGAGAATACATCCTTCTGGGGAACACGTCTGTGG
AAGAAGGCCTGCATGACTTGCTTCACCCAGACCTGGCCCTGGCCGGTGACTGGATCTACTGCATCACAGATATTGAC
CCAGACCACCGGAAGCTCAGCCAGCTAGAGGCCATGATCCGCTTCCTCACCAGGAAGGACCCAGACCTGGAGTGTGA
CGAGGAGCTGGTCCGGGAGGTGCTGTTTGACGCGGTGGTGACAGCCCCCATGGAAGCCTACTGGACAGCGCTGGCCC
TCAACATGTCCGAGGAGTCTGAACACGTGGTGGACATGGCCTTCCTGGGCACCCGGGCTGGCCTCCTGAGAAGCAGC
TTGTTCGTGGGCTCCGAGAAGGTCTCCGACAGGAAGTTCCTGACACCTGAGGACGAGGCCAGCGTGTTCACCCTGGA
CCGCTTCCCGCTGTGGTACCGCCAGGCCTCAGAGCATCCTGCTGGCAGCTTCGTCTTCAACCTCCGCTGGGCAGAAG
GACCAGAAAGTGCGGGTGAACCCATGGTGGTGACGGCAAGCACAGCTGTGGCGGTGACCGTGGACAAGAGGACAGCC
ATTGCTGCAGCCGCGGGCGTCCAAATGAAGCTGGAATTCCTCCAGCGCAAATTCTGGGCGGCAACGCGGCAGTGCAG
CACTGTGGATGGGCCGTGCACACAGAGCTGCGAGGACAGTGATCTGGACTGCTTCGTCATCGACAACAACGGGTTCA
TTCTGATCTCCAAGAGGTCCCGAGAGACGGGAAGATTTCTGGGGGAGGTGGATGGTGCTGTCCTGACCCAGCTGCTC
AGCATGGGGGTGTTCAGCCAAGTGACTATGTATGACTATCAGGCCATGTGCAAACCCTCGAGTCACCACCACAGTGC
AGCCCAGCCCCTGGTCAGCCCAATTTCTGCCTTCTTGACGGCGACCAGGTGGCTGCTGCAGGAGCTGGTGCTGTTCC
TGCTGGAGTGGAGTGTCTGGGGCTCCTGGTACGACAGAGGGGCCGAGGCCAAAAGTGTCTTCCATCACTCCCACAAA
CACAAGAAGCAGGACCCGCTGCAGCCCTGCGACACGGAGTACCCCGTGTTCGTGTACCAGCCGGCCATCCGGGAGGC
CAACGGGATCGTGGAGTGCGGGCCCTGCCAGAAGGTATTTGTGGTGCAGCAGATTCCCAACAGTAACCTCCTCCTCC
T G GT GACAGAC C C CAC C T GT GAC T G CAG CAT C T T C C CAC CAGT G C T G CAG GAG G C GACAGAAGT CAAATATAAT G C C
TCTGTCAAATGTGACCGGATGCGCTCCCAGAAGCTCCGCCGGCGACCAGACTCCTGCCACGCCTTCCATCCAGAGGA
GAATGCCCAGGACTGCGGCGGCGCCTCGGACACCTCAGCCTCGCCGCCCCTACTCCTGCTGCCTGTGTGTGCCTGGG
GGCTACTGCCCCAACTCCTGCGGTGA
SEQ ID NO: 14 - ADNc de CNGB3, NM 019098.4
ATGTTTAAATCGCTGACAAAAGTCAACAAGGTGAAGCCTATAGGAGAGAACAATGAGAATGAACAAAGTTCTCGTCG
GAATGAAGAAGGCT CT CACCCAAGTAAT CAGT CT CAGCAAACCACAGCACAGGAAGAAAACAAAGGTGAAGAGAAAT
C T C T CAAAAC CAAGT CAAC T C CAGT CAC GT C T GAAGAG C CACACAC CAACATACAAGACAAAC T CT C CAAGAAAAAT
T C C T C T G GAGAT C T GAC CACAAAC C C T GAC C C T CAAAAT G CAG CAGAAC CAAC T G GAACAGT G C CAGAG C AGAAG GA
AATGGACCCCGGGAAAGAAGGTCCAAACAGCCCACAAAACAAACCGCCTGCAGCTCCTGTTATAAATGAGTATGCCG
AT G C C CAG C TACACAAC C T G GT GAAAAGAAT G C GT CAAAGAACAG C C C T C TACAAGAAAAAGT T GGT AGAG G GAGAT
CTCTCCTCACCCGAAGCCAGCCCACAAACTGCAAAGCCCACGGCTGTACCACCAGTAAAAGAAAGCGATGATAAGCC
i s r i f i i n r ,n rPrn n r ,rr n r annr<vn<T'T'n<rPiXixrPrp r 'n n n O T r a a a a a r a a Ii ' í a r r 'T " T " p a a r a f a anL<TT±r<T<TTim±nmm±<T<Tm±zar
TTCCAAACAGCATAGATTCATACACAGATCGACTCTATCTCCTGTGGCTCTTGCTTGTCACTCTTGCCTATAACTGG
AACTGCTGGTTTATACCACTGCGCCTCGTCTTCCCATATCAAACCGCAGACAACATACACTACTGGCTTATTGCGGA
CAT CATAT GT GATAT CAT CTAC CT T TAT GATAT GCTAT T TAT C CAGC C CAGACT C CAGT T T GTAAGAGGAGGAGACA
TAATAGT G GAT T CAAAT GAG C TAAG GAAACAC TACAG GAC T T C T C CAAAAT T T CAGT T G GAT GT CG CAT CAATAATA
CCATTTGATATTTGCTACCTCTTCTTTGGGTTTAATCCAATGTTTAGAGCAAATAGGATGTTAAAGTACACTTCATT
T T T T GAAT T TAAT CAT CAC C TAGAGT C TATAAT G GACAAAG CATATAT C TACAGAGT TAT T C GAACAAC T G GATAC T
TGCTGTTTATTCTGCACATTAATGCCTGTGTTTATTACTGGGCTTCAAACTATGAAGGAATTGGCACTACTAGATGG
GTGTATGATGGGGAAGGAAACGAGTATCTGAGATGTTATTATTGGGCAGTTCGAACTTTAATTACCATTGGTGGCCT
ACCAGAACCACAAACTTTATTTGAAATTGTTTTTCAACTCTTGAATTTTTTTTCTGGAGTTTTTGTGTTCTCCAGTT
TAAT T G GT CAGAT GAGAGAT GT GAT T G GAG CAG C TACAG C CAAT CAGAAC TACTTCCGCGCCTG CAT G GAT GACAC C
ATTGCCTACATGAACAATTACTCCATTCCTAAACTTGTGCAAAAGCGAGTTCGGACTTGGTATGAATATACATGGGA
CTCTCAAAGAATGCTAGATGAGTCTGATTTGCTTAAGACCCTACCAACTACGGTCCAGTTAGCCCTCGCCATTGATG
TGAACTTCAGCATCATCAGCAAAGTCGACTTGTTCAAGGGTTGTGATACACAGATGATTTATGACATGTTGCTAAGA
TTGAAATCCGTTCTCTATTTGCCTGGTGACTTTGTCTGCAAAAAGGGAGAAATTGGCAAGGAAATGTATATCATCAA
r i ^ r r i ^ r u i j r i a i a i a x i - i a i a ' r i a ' i " i " r i a
GAGAAATCAGCCTTCTAGCAGCAGGAGGAGGAAACCGTCGAACTGCCAATGTGGTGGCCCACGGGTTTGCCAATCTT
T TAAC T C TAGACAAAAAGAC C C T C CAAGAAAT T C TAGT G CAT TAT C CAGAT T C T GAAAG GAT C C T CAT GAAGAAAG C
CAGAGTGCTTTTAAAGCAGAAGGCTAAGACCGCAGAAGCAACCCCTCCAAGAAAAGATCTTGCCCTCCTCTTCCCAC
C GAAAGAAGAGACAC C CAAAC T GT T TAAAAC TCTCCTAG GAG G CACAG GAAAAG CAAGT C T T G CAAGAC TAC T C AAA
T T GAAG C GAGAG CAAG CAG C T CAGAAGAAAGAAAAT T C T GAAG GAG GAGAG GAAGAAG GAAAAGAAAAT GAAGATAA
ACAAAAAGAAAATGAAGATAAACAAAAAGAAAATGAAGATAAAGGAAAAGAAAAT GAAGATAAAGATAAAGGAAGAG
AGC CAGAAGAGAAGC CACT GGACAGAC CT GAAT GTACAGCAAGT C CTAT T GCAGT GGAGGAAGAAC C C CACT CAGT T
SEQ ID NO: 15 - construcción hG1.7(M8), fragmento de LCR de opsina M/L de 1,2 kb, fragmento de opsina M de 500 pb, UTR en cursiva, mutación M8 subrayada
TAGGAATAGAAGGGTGGGTGCAGGAGGCTGAGGGGTGGGGAAAGGGCATGGGTGTTTCATGAGGACAGAGCTTCCGT
TTCATGCAATGAAAAGAGTTTGGAGACGGATGGTGGTGACTGGACTATACACTTACACACGGTAGCGATGGTACACT
TTGTATTATGTATATTTTACCACGATCTTTTTAAAGTGTCAAAGGCAAATGGCCAAATGGTTCCTTGTCCTATAGCT
GTAGCAGCCATCGGCTGTTAGTGACAAAGCCCCTGAGTCAAGATGACAGCAGCCCCCATAACTCCTAATCGGCTCTC
CCGCGTGGAGTCATTTAGGAGTAGTCGCATTAGAGACAAGTCCAACATCTAATCTTCCACCCTGGCCAGGGCCCCAG
CTGGCAGCGAGGGTGGGAGACTCCGGGCAGAGCAGAGGGCGCTGACATTGGGGCCCGGCCTGGCTTGGGTCCCTCTG
GCCTTTCCCCAGGGGCCCTCTTTCCTTGGGGCTTTCTTGGGCCGCCACTGCTCCCGCTCCTCTCCCCCCATCCCACC
CCCTCACCCCCTCGTTCTTCATATCCTTCTCTAGTGCTCCCTCCACTTTCATCCACCCTTCTGCAAGAGTGTGGGAC
CACAAATGAGTTTTCACCTGGCCTGGGGACACACGTGCCCCCACAGGTGCTGAGTGACTTTCTAGGACAGTAATCTG
CTTTAGGCTAAAATGGGACTTGATCTTCTGTTAGCCCTAATCATCAATTAGCAGAGCCGGTGAAGGTGCAGAACCTA
CCGCCTTTCCAGGCCTCCTCCCACCTCTGCCACCTCCACTCTCCTTCCTGGGATGTGGGGGCTGGCACACGTGTGGC
CCAGGGCATTGGTGGGATTGCACTGAGCTGGGTCATTAGCGTAATCCTGGACAAGGGCAGACAGGGCGAGCGGAGGG
CCAGCTCCGGGGCTCAGGCAAGGCTGGGGGCTTCCCCCAGACACCCCACTCCTCCTCTGCTGGACCCCCACTTCATA
GGGCACTTCGTGTTCTCAAAGGGCTTCCAAATAGCATGGTGGCCTTGGATGCCCAGGGAAGCCTCAGAGTTGCTTAT
CTCCCTCTAGACAGAAGGGGAATCTCGGTCAAGAGGGAGAGGTCGCCCTGTTCAAGGCCACCCAGCCAGCTCATGGC
GGTAATGGGACAAGGCTGGCCAGCCATCCCACCCTCAGAAGGGACCCGGTGGGGCAGGTGATCTCAGAGGAGGCTCA
CTTCTGGGTCTCACATTCTTGGATCACAGGTATTTGCCACTAAGCCCAGCTAATTGTTTTTTATTTAGTAGAAACGG
GGTTTCACCATGTTAGTCAGGCTGGTCGGGAACTCCTGACCTCAGGAGATCTACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCT
GGGATTACAGGCGTGTGCCACTGTGCCCAGCCACTTTTTTTTAGACAGAGTCTTGGTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTT
CAGTGGCGCCATCTCAGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCAGATTCAAGCGATTCTCCTGCCTCGACCTCCCAGTAGC
TGGGATTACAGGTTTCCAGCAAATCCCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGCTCGCCTCAGGAGCAAGGAAGCAAGGGGTGG
GAGGAGGAGGTCTAAGTCCCAGGCCCAATTAAGAGATCAGATGGTGTAGGATTTGGGAGCTTTTAAGGTGAAGAGGC
CCGGGCTGATCCCACTGGCCGGTATAAAGCACCGTGACCCTCAGGTGACGCACCATCTAGAGCTGCCGTCGGGGACA
GGGCTTTCCATAGCC
SEQ ID NO: 16 - mutación M8
TCTAGA
SEQ ID NO: 17 - SEQ ID NO: 2 - fragmento de promotor de opsina M de 2 - 2,0 kb, fragmento de 500 pb de la SEQ ID NO: 3 subrayada, UTR en cursiva, mutación M8 subrayada
TAAAAAGCAAGTCTTGCCAGGGCAGTGGTGTGCACCTGTGGTCCCAGCTACTCAGGATGCTGAGGCAGGAGGATTAC
TTGTGCCCAGCAAGTAGAGGCTGCAGTGACCTGTGACTGTGCTACTGCCCTCCAACCTGGGTGACAGAGTGAGACCT
TGTCTCAAAAAAAAAAGAGCGGGGGGGGGGGGCCGGGCCGGGCGTGGTGGCTCACAGCTGTAATCCCAGCACTTTGG
GAAGCCAAGGCGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCATCATGGTCAACACTGCGAAACACTGTCCCTAC
T AAAAAT AC AAAAAT TAGCCGGG C AT G GT G G C AC AC AC C T GT AAT C C C AG CTACTGGG GAG G C T GAG G C AG GAGAAT
TGCTTGAGCCGGGGAGACGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGACTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGACTGACAAGAGTGAG
ATT GT CT CAAAAAAAAAAAAAAAGTAAT CACTAGAAAAGAAGCTACATATGTACATAACAT CCAAATAACCAAGAGG
AGAAAAAAAT G G GAC T T GAT TAAT CAAAACAAAAACAAAAAAGAAAGAAAGAAAG G G G GAGAAAATAAAACAAG G G C
TGGGTGTGCTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGAAGCCAAGGTGGGTGGATCTCTTGAGCTCAGGAGGTCA
AGACCAGCCTGGGCAACATGGCGAAACCCCGTCTCTATTAAAAAAAAAATTAATACAACAATTATCCTGGAGTGGTG
GTGCACACCTGTAGTCCCAGCTACCCAGGACGCTGAGACGGGAGGATCGCTTGATCCCGGGGATGTCGAGGCTGCCG
T GAT C G CAC CAC T G C C C T C CAG C CAG G GT G G CAGAC T GAGAC C C CAT C T CAAAAAATAAATAAATAAAAG CAAACAA
GAAAAAAAAAGGCTT GAAACATAT CT GATAGATAAAGGGCTAAT CAACACAATATATAAAGAAC T G CAAATCAGTAA
AC TAAGAG CAAATAAC C CAATATAAAGACAT TAAAG G GTAG C CAC G GACAT C T CAGAC GAC GAAAAACAAAAGACAG
TAAAC GTATAATAAAACAT GTAAT T G CAAG GT GAT C C G G GAATAGTAAG C GAAAAG CAACAAT TAAATAC TAT T T T C
TCATCCACCAGAACGCCAAAAATTAAAAAGCCTAACAATGTCCAGGGCTGGCGAGAATGTGGCAGAAGGTGATGTCA
CATACCCTGCAAGTGGGAATCTAAACAGATTCAGGGTTTTGGTTTTTTTTTAATCGCAATTAGGTGGCCTGTTAAAT
TTTTTTTCTTGAGACAGAGTTTTGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCTCGATCTTGGCTCACCGCAACCT
CGACCTCCCAGGTACAAGCGATTCTCCTGTCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGAGTACAGGTATTTGCCACTAAGCCC
AGCTAATTGTTTTTTATTTAGTAGAAACGGGGTTTCACCATGTTAGTCAGGCTGGTCGGGAACTCCTGACCTCAGGA
GATCTACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGTGCCACTGTGCCCAGCCACTTTTTTTTAGACA
GAGTCTTGGTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTTCAGTGGCGCCATCTCAGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCAGATTCAA
GCGATTCTCCTGCCTCGACCTCCCAGTAGCTGGGATTACAGGTTTCCAGCAAATCCCTCTGAGCCGCCCCCGGGGGC
TCGCCTCAGGAGCAAGGAAGCAAGGGGTGGGAGGAGGAGGTCTAAGTCCCAGGCCCAATTAAGAGATCAGATGGTGT
AGGATTTGGGAGCTTTTAAGGTGAAGAGGCCCGGGCTGATCCCACTGGCCGGTATAAAGCACCGTGACCCTCAGGTG
ACGCA CCATCTAGAGCTGCCGTCGGGGACAGGGCTTTCCATAGCC

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una unidad de control de la transcripción (TCU) de hasta 2500 nucleótidos de longitud que comprende en dirección de 5' a 3':
(a) una Región de control del locus (LCR) que comprende
(i) la SEQ ID NO 1; o
(ii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (a)(i); y (b) un elemento promotor que comprende
(i) al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17; o
(ii) al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16; o
(iii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (b)(ii), en donde los nucleótidos que corresponden a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16;
presentando dicha TCU actividad promotora específica de fotorreceptores de cono.
2. El TCU de la reivindicación 1, en donde (b) comprende:
(i) al menos los últimos 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17, o
(ii) al menos los últimos 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 en donde los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16, o
(iii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (ii), en donde los nucleótidos que corresponden a los nucleótidos 1934 a 1939 de la SEQ ID NO: 2 se han reemplazado por la SEQ ID NO: 16;
presentando dicha TCU actividad promotora específica de fotorreceptores de cono.
3. El TCU de la reivindicación 1 o 2, en donde el elemento promotor comprende al menos los últimos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17.
4. La TCU de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el elemento promotor comprende al menos los últimos 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 17.
5. La TCU de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde (b) comprende al menos 200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.
6. La TCU de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde (b) comprende:
(i) la SEQ ID NO: 3; o
(ii) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia (i); presentando dicha TCU actividad promotora específica de fotorreceptores de cono,
opcionalmente en donde la TCU comprende la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 15.
7. El TCU de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el elemento promotor comprende la SEQ ID NO: 5,
opcionalmente en donde la TCU comprende la SEQ ID NO: 6.
8. El TCU de la reivindicación 1, en donde la TCU comprende:
(a) una LCR que comprende la SEQ ID NO: 1; y
(b) un elemento promotor que comprende la s Eq ID NO: 3.
9. Una construcción de expresión que comprende la TCU de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, unida operativamente a una secuencia que se ha de expresar de una manera específica de fotorreceptores de cono.
10. La construcción de expresión de la reivindicación 9, en donde la secuencia unida operativamente esCNGA3, CNGB3, PDE6C, PDE6H, GNAT2, KCNV2oCACNA2D4,opcionalmente en donde:
(i) la secuencia unida operativamente comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14, o que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 y tiene la capacidad de rescatar la función de los fotorreceptores de cono; y/o
(ii) la secuencia unida operativamente comprende la SEQ ID NO: 8 o que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 y tiene la capacidad de rescatar la función de los fotorreceptores de cono.
11. Un vector que comprende la TCU de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.
12. El vector de la reivindicación 11 que es un vector vírico, opcionalmente en donde el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV).
13. El vector de AVV de la reivindicación 12, en donde el vector comprende un genoma de AAV o un derivado del mismo, opcionalmente en donde el vector comprende un genoma de AAV o un derivado del mismo, y en donde la cápside de AAV deriva de AAV8,
preferentemente en donde la cápside de AAV deriva de AAV8 y la construcción de expresión se define de acuerdo con la reivindicación 9 o 10,
preferentemente en donde la secuencia unida operativamente esCNGA3.
14. El vector de la reivindicación 13, en donde:
(a) dicho derivado es un derivado quimérico, reordenado o con cápside modificada; y/o
(b) dicho genoma de AAV es de un serotipo o aislado o clado de AAV derivado de forma natural, opcionalmente en donde dicho genoma de AAV es del serotipo 2 de AAV (AAV2), el serotipo 4 de AAV (AAV4) o el serotipo 8 de AAV (AAV8) y/o en donde la cápside deriva de AAV8, preferentemente en donde el genoma deriva de AAV2 y la cápside deriva de AAV8.
15. Una célula hospedadora que contiene un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o produce un vector vírico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, opcionalmente en donde la célula es una célula HEK293 o HEK293T.
16. Una composición farmacéutica que comprende un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 y un portador farmacéuticamente aceptable.
17. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para su uso en un método de prevención o tratamiento de distrofias de la retina.
18. Un vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde:
(a) el trastorno de la retina es acromatopsia; y/o
(b) el tratamiento o la prevención es mediante la administración del vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 a un paciente mediante inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea, opcionalmente en donde dicho vector se administra directamente en la retina, en el espacio subretiniano o en el espacio intravítreo.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11241460B2 (en) 2013-03-15 2022-02-08 Astellas Institute For Regenerative Medicine Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells
EP4292600A3 (en) 2013-03-15 2024-04-10 Astellas Institute for Regenerative Medicine Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells
GB2584664B (en) * 2019-06-10 2023-05-24 Newcells Biotech Ltd Improved retinal organoids and methods of making the same
CN113025616B (zh) * 2021-04-21 2023-05-02 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI2及其克隆与应用
AU2022275948A1 (en) * 2021-05-20 2023-12-21 Artema Therapeutics, Inc. Kcnv2 variants and their use
WO2023039175A2 (en) * 2021-09-09 2023-03-16 Applied Genetic Technologies Corporation Predictors of achromatopsia treatment efficacy

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008073303A2 (en) * 2006-12-07 2008-06-19 Switchgear Genomics Transcriptional regulatory elements of biological pathways, tools, and methods
US20120172419A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Medical College Of Wisconsin Research Foundation Inc. Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity
CN103608455B (zh) * 2011-01-07 2019-01-15 应用遗传科技公司 用于治疗色盲和其它疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法
EP3800191B1 (en) * 2014-03-17 2025-08-20 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
US11021519B2 (en) * 2015-03-02 2021-06-01 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
WO2017144080A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-31 Eyeserv Gmbh Gene therapy for the treatment of a disease of retinal cone cells

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