ES2988754T3

ES2988754T3 - Conjugados compuestos por péptidos que se dirigen a la membrana para el aislamiento y análisis de vesículas extracelulares y su integración

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Publication number: ES2988754T3
Application number: ES20797166T
Authority: ES
Original assignee: Cretich Marina
Current assignee: Cretich Marina
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2024-11-21
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: EP4025911B8; EP4025911A1; US20230221307A1; EP4025911B1; WO2021044381A1; EP4025911C0

Abstract

Una sonda molecular que comprende al menos una primera fracción y al menos una segunda fracción que están unidas covalentemente a la sonda molecular, en donde: la al menos una primera fracción comprende al menos un péptido de unión o peptidomimético para unir la sonda molecular a al menos una membrana de vesícula extracelular (VE), en donde la unión está mediada por detección de curvatura de membrana de VE; y la al menos una segunda fracción comprende al menos un grupo de unión de soporte para unir la sonda molecular a al menos un soporte. La sonda molecular también puede comprender una fracción espaciadora, y/o una fracción de marcado, y/o una fracción de modificación. La sonda molecular puede estar unida a un soporte sólido o semisólido que incluye un soporte de micromatriz. La sonda molecular puede usarse en métodos en los que se pone en contacto con una muestra que puede incluir la vesícula extracelular y puede implicar etapas de detección y aislamiento. Los kits pueden incluir la sonda molecular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados compuestos por péptidos que se dirigen a la membrana para el aislamiento y análisis de vesículas extracelulares y su integración

ANTECEDENTES

[0001] Las vesículas extracelulares (VE) son partículas biológicas membranosas de tamaño micro y nanométrico liberadas por las células que desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular. Se cree que estas partículas encerradas en una membrana de aproximadamente 30 a aproximadamente 1000 nm de diámetro desempeñan importantes funciones (pato)fisiológicas en los procesos biológicos, por ejemplo, transferencia de proteínas e información genética, liberación de citocinas y degradación de la matriz extracelular, angiogénesis y comunicación de célula a célula durante la progresión del cáncer. Estas partículas se detectan en la sangre humana a concentraciones de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 ng/ml y también se encuentran en otros fluidos biológicos tales como orina, saliva y líquido cefalorraquídeo. Las VE transportan una cantidad impresionante de información molecular, incluyendo proteínas y ARN no codificantes, representando así una fuente fenomenal de biomarcadores circulantes [1]. Como tales, las VE están generando expectativas sin precedentes en el campo de la biopsia líquida y como herramientas teranósticas de próxima generación [2].

[0002] No obstante, para aprovechar al máximo el potencial de las VE, aún quedan varios desafíos por superar en su separación y análisis [3]. De hecho, algunas características fisicoquímicas de las VE (por ejemplo, tamaño, densidad de flotabilidad) se superponen con las de otros componentes a nanoescala de fluidos biológicos, tales como las lipoproteínas de alta densidad (HDL), virus, orgánulos y agregados proteicos. Estos "contaminantes" de tamaño nanométrico pueden aislarse accidentalmente junto con las VE a través de las técnicas de aislamiento de VE más comunes (véanse los puntos generales sobre los métodos de aislamiento en la Tabla 1), lo que afecta el análisis posterior de las vesículas con respecto a su recuento, función y contenido [4].

Tabla 1: Métodos comunes de aislamiento de vesículas extracelulares

[0003] Plataformas analíticas para análisis de alto rendimiento de VE que no dependen del pretratamiento de la muestra, los artefactos de purificación limitantes, por lo tanto, son muy deseables. En este escenario, Jorgensen y sus colaboradores introdujeron las micromatrices de VE para fenotipificar las VE en una plataforma de micromatrices de proteínas [5]. En esta técnica, los anticuerpos se utilizan para la captura selectiva de VE por proteínas asociadas a la superficie, seguido de la elaboración de perfiles de VE mediante detección basada en fluorescencia de proteínas transmembrana características (CD9, CD63 y CD81). Cabe destacar que este enfoque no requiere el aislamiento previo de VE, sino que puede realizarse directamente en muestras biológicas complejas. Este formato se ha extendido al análisis de vesículas capturadas con anticuerpos en un modo sin etiquetas utilizando imágenes de resonancia de plasmón superficial (SPRi)[6] y un sensor de imágenes de reflectancia interferométrica de partículas individuales (SP-IRIS) [7]. Los marcadores usados habitualmente para la captura de VE incluyen tetraspaninas (CD9, CD63, CD81, CD82), MHC de clase I y II, HSP70, anexina V, flotilina y EpCAM.

[0004] No obstante, la focalización de las proteínas expuestas a la superficie aún presenta varios inconvenientes: i) el análisis puede verse sesgado por la presencia de antígenos solubles y corona de proteína de VE; ii) la variabilidad inherente de la especificidad y afinidad de los anticuerpos puede perjudicar la eficiencia de captura de VE; iii) la abundancia relativa de los marcadores proteicos está sujeta a fluctuaciones significativas (interindividuales, el estado de salud, el órgano/tejido de origen, etc.) que pueden reducir el valor de los estudios comparativos.

[0005] La posibilidad de establecer un marcador de VE "universal" representaría, por tanto, un cambio paradigmático y una primera etapa hacia una mayor consistencia analítica. A este respecto, la membrana de las VE se caracteriza por rasgos físicos y químicos que son bastante peculiares en el espacio extracelular [8]. Las VE pequeñas con diámetros de 30-150 nm tienen, de hecho, membranas muy curvadas, cuyas capas externas suelen contener una gran cantidad de fosfolípidos aniónicos insaturados junto con la presencia de defectos característicos de empaquetamiento de lípidos [9], [10], [11]. Por ejemplo, se ha informado que las VE contienen un aumento del 7-8 % en fosfatidilserina en la capa externa de la membrana, mientras que, las células normales contienen una cantidad insignificante de fosfatidilserina, del 0,5 al 1 %.

[0006] Cabe destacar que muchas proteínas están fisiológicamente implicadas en la modulación dinámica de la curvatura de la membrana que ocurre durante una multitud de procesos celulares (incluida la secreción de vesículas); sin embargo, es particularmente notable que algunos de ellos sean capaces de detectar y unirse con exquisita selectividad sólo a membranas muy curvadas [12-15]. Estos incluyen el dominio Bin-Amfifisina-Rvs (BAR) [16] de la anfifisina, las proteínas del sensor de empaquetamiento de lípidos ArfGAP1 (ALPS) [17], el dominio C2B de la sinaptotagmina-I y el dominio efector de la proteína sustrato de la C-quinasa rica en alanina miristoilada (MARCKS-ED) [18]. En consecuencia, los péptidos sensores de membrana han surgido como novedosas sondas moleculares cómodas y fáciles de sintetizar para detectar membranas muy curvadas [11,19].

[0007] Los mecanismos de detección de curvatura pueden ser múltiples y cooperativos. En algunos casos, los primeros eventos de reconocimiento y unión de la membrana se basan en interacciones electrostáticas complementarias entre el dominio efector del péptido/proteína y los fosfolípidos en la capa de la membrana externa, que posteriormente pueden conducir a la inserción del efector sensor en los defectos de membrana que caracterizan a las membranas muy curvadas. Este mecanismo es característico, pero sin limitación, de hélices anfipáticas. Otras vías de reconocimiento se caracterizan por una complementariedad estructural donde los andamios proteicos curvados coinciden con la curvatura de las membranas. Por el contrario, la detección de la curvatura de la membrana de cadenas de aminoácidos desordenadas puede ser impulsada por un mecanismo entrópico predominante. Algunos grupos han propuesto péptidos dirigidos a la membrana como una herramienta para la obtención de imágenes de fluorescencia de vesículas extracelulares en solución [19-22].

[0008] Se utilizó una sonda que consiste en Magainina 1 unida covalentemente a biotina que está unida a una superficie [29] para detectar bacterias en ensayos de biosensores. El documento EP2491952A1 divulga una construcción que comprende bradicinina y un componente A que tiene la capacidad de participar en la unión de una VE a través de la detección de la curvatura de la membrana.

[0009] Se divulga otra sonda diseñada para unirse a VE a través de detección de membrana [30]; en este caso, la construcción comprende sinaptogamina y una sonda fluorescente o bradicinina y una sonda fluorescente [22].

[0010] No obstante, hasta donde se sabe, no se ha realizado ningún informe o afirmación previa sobre la posibilidad de construir conjugados basados en péptidos sensores de membrana como se describe y/o reivindica en el presente documento que podrían explotarse favorablemente para el aislamiento de VE, enriquecimiento o captura para ámbitos analíticos. En particular, al parecer, ningún informe aborda conjugados soportados, tales como los biochips analíticos, microperlas, materiales de hidrogel y polímeros. En estos campos de aplicación, existen muchas ventajas en el uso de péptidos y sondas relacionadas con péptidos, ya que son estables, fácilmente modificable para ajustar las propiedades deseadas, son económicos de preparar incluso a gran escala y no sufren variabilidad de lote a lote tal como en el caso de las preparaciones de anticuerpos. Véase, por ejemplo, el documento WO 2019/039179.

SUMARIO

[0011] En una primera forma de realización, la invención se refiere a una sonda molecular según la reivindicación 1, comprendiendo dicha sonda al menos una primera fracción y al menos una segunda fracción que están cada una unidas covalentemente a la sonda molecular, en donde:

la al menos una primera fracción comprende al menos un péptido de unión o peptidomimético para unir la sonda molecular a al menos una membrana de vesícula extracelular (VE), en donde la unión está mediada por la detección de la curvatura de la membrana de la VE;

la al menos una segunda fracción comprende al menos un grupo de unión al soporte para la unión de la sonda molecular a al menos un soporte;

el al menos un grupo de unión al soporte está unido al al menos un soporte; y

el péptido o peptidomimético deriva de un péptido o dominio proteico que detecta la curvatura de la membrana,

en donde el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina, MARCKS, sinaptotagmina, arfgapl, sinapsina (I) o endofilina.

[0012] En un aspecto preferido, en la sonda de la reivindicación 1, el péptido o peptidomimético está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular.

[0013] En un aspecto adicional más, la invención se refiere a una sonda, en donde la vesícula extracelular es un exosoma, una microvesícula, una nanovesícula o microvesícula lipídica sintética.

[0014] Otro aspecto de la invención se refiere a una sonda, en donde el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina.

[0015] En un aspecto adicional, la invención se refiere a una sonda, en donde la primera fracción comprende el péptido y el péptido es un péptido catiónico.

[0016] Otro aspecto de la invención se refiere a una sonda, en donde el péptido o peptidomimético es lineal, ramificado, cíclico, tándem, multimérico, multidominio o multivalente. En un aspecto adicional más, el péptido o peptidomimético es dimérico.

[0017] En un aspecto adicional más, la invención se refiere a una sonda, en donde el grupo de unión al soporte comprende azida, alquino, tiol, alqueno, amina, ácido carboxílico, aldehído o maleimida.

[0018] Otro aspecto de la invención se refiere a una sonda, en donde el grupo de unión al soporte comprende propargilo.

[0019] En un aspecto adicional de la invención, la sonda comprende además al menos una tercera fracción que está unida covalentemente a la sonda molecular y que es un espaciador entre la primera fracción y la segunda fracción. Preferentemente, el espaciador es un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos, una fracción orgánica o un espaciador escindible. Más preferentemente, el espaciador comprende poli(etilenglicol), lisina o glicina.

[0020] En otro aspecto adicional de la invención, la sonda comprende además al menos una cuarta fracción que es un marcador, en donde el marcador es un marcador fluorescente.

[0021] En otro aspecto adicional de la invención, la sonda comprende además al menos una quinta fracción que es una fracción modificadora de la vesícula extracelular y que es una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una secuencia de ADN o ARN.

[0022] En una segunda forma de realización, la invención se refiere a un kit que comprende la sonda molecular de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

Breve descripción de las figuras

[0023]

Figura 1: secuencias de los péptidos probados modificados con espaciadores de PEG de cadena corta (CH2CH2O)x que contiene una propargilglicina terminal (Prg).

Figura 2: esquema de presentaciones mono y multivalentes de los diferentes péptidos inmovilizados sobre chip analítico.

Figura 3: análisis NTA de la muestra aislada de HEK UC. NTA proporcionó un tamaño de partícula medio de 203 ± 3 nm y una concentración de 3,94*10® partículas/ml.

Figura 4: imágenes TEM de la muestra aislada HEK UC.

Figura 5: análisis de transferencia Western de la muestra aislada de HEK UC. Se verifica la presencia de las proteínas transmembrana CD9 y CD63 y de las proteínas luminales ALIX y TSG101.

Figura 6: densidad de partículas HEK UC por mm2 detectado en puntos de péptidos BP y BPn en una muestra en blanco (PBS filtrado) y en un intervalo de concentraciones de 1x1o6 - 1x109 de VE/ml. Se observa un claro efecto dosis-respuesta. La señal en el péptido BPn es insignificante.

Figura 7: imágenes puntuales representativas de los péptidos BP y BPn. Los puntos grises indican partículas detectadas.

Figura 8: densidad de partículas HEK UC por mm2 detectado en una micromatriz de anticuerpos (anti CD81/CD63/CD9). Sólo la concentración de 1*109 partículas/ml se puede distinguir del anticuerpo de control negativo.

Figura 9: densidad de partículas por mm2 detectadas en los péptidos BP y BPb y BPt multivalentes cuando se incuban con 1*109 partículas/ml de la muestra HEK UC.

Figura 10: análisis NTA de la muestra de suero UC. NTA proporcionó un tamaño de partícula medio de 210 ± 2,5 nm y una concentración de 1,23*109 partículas/ml.

Figura 11: resultados NTA del análisis de la muestra aislada de SEC del suero. NTA proporcionó un tamaño de partícula medio de 208 ± 2,3 nm y una concentración de 1,27*109 partículas/ml.

Figura 12: imágenes TEM de la muestra de UC a partir de suero humano.

Figura 13: imágenes TEM de las muestras de SEC.

Figura 14: análisis de transferencia Western de las muestras aisladas de UC (A) y SEC (B) de suero humano. Se comprueba la presencia de las proteínas transmembrana CD9 y CD63 y de las proteínas luminales ALIX y TSG101. La muestra<u>C (A) es positiva para CD63, CD9; ALIX y TSG101. La muestra SEC (B) es positiva para CD63 y TSG101.

Figura 15: recuento sin marcadores de VE para la muestra aislada de UC del suero humano en los péptidos BP. Figura 16: recuento sin marcadores para la muestra aislada de SEC del suero humano en los péptidos BP. Figura 17: recuento sin marcadores de vesículas de suero humano no purificado en los péptidos BP.

Figura 18: A: densidad de VE en péptidos BP inmovilizados de forma quimioselectiva en Co-poli-azida o aleatoria en MCP-2. La capacidad de captura de VE se elimina cuando los péptidos no están orientados en la superficie de la micromatriz. B: comparación de imágenes representativas de un punto de BP inmovilizado de forma quimioselectiva o aleatoria. El tamaño del punto es más pequeño en el co-poli-azida, bordes bien definidos y recuento de partículas mayor después de la incubación.

Figura 19: comparación de la capacidad de unión de las VE aisladas de SEC del suero humano (1x109 partículas/ml) incubadas en BP y BPn inmovilizados mediante química de clic, mediante estreptavidina/biotina y por inmovilización aleatoria.

Figura 20: A: mediante SEC se aislaron VE del suero humano caracterizado antes del tratamiento; B: después de 6 horas de incubación a 37 °C sin enzima; C: después de 6 horas de incubación a 37 °C en presencia de tripsina. Figura 21: (A): densidad de partículas para VE aisladas mediante SEC a partir de suero humano incubado a una concentración de 1x109 partículas/ml. La captura de VE por los péptidos BP no se ve afectada por el tratamiento con tripsina. (B) la unión de VE en el chip de anticuerpos CD81/CD63/CD9 se elimina mediante digestión de proteínas de superficie con tripsina.

Figura 22: intensidad de fluorescencia después de la incubación con anticuerpos anti-CD9/CD63/CD81 de VE del aislamiento mediante SEC, Aislamiento por UC y un grupo puro de sueros mediante péptidos BP colocados en portaobjetos de silicona.

Figura 23: panel superior: esquema del método. Los hidrogeles funcionalizados con péptidos BP atrapan las VE y son permeables a los contaminantes y a las sondas fluorescentes. Las señales fluorescentes son detectables después de la incubación con anticuerpos antitetraspaninas y aptámeros de péptidos fluorescentes. La fluorescencia en geles vacíos es insignificante.

Figura 24: un grupo de suero humano y VE de líneas celulares HCT se caracterizaron mediante NTA (panel superior) y se atraparon en el hidrogel modificado con BP. Las señales fluorescentes son detectables después de la incubación con anticuerpos antitetraspaninas y aptámeros de péptidos fluorescentes. La fluorescencia en geles vacíos es insignificante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

INTRODUCCIÓN Y DEFINICIONES

[0024] La presente invención se refiere a sondas moleculares y kits que comprenden las sondas moleculares, como se describe en las reivindicaciones 1 y 15.

[0025] Como se divulga en el presente documento, una "fuente de VE" puede significar una fuente biológica, sintética o comercial de, por ejemplo, vesículas lipídicas de tamaño entre 10 y 1.000 nm o nanovesículas lipídicas de tamaño entre 10 y 200 nm. Este término incluye, pero sin limitaciones, el sobrenadante de cultivo celular, un biofluido no procesado, un biofluido y/o una preparación comercial de VE.

[0026] Como se divulga en el presente documento, "aislamiento" puede significar el proceso mediante el cual se obtienen VE (se enriquecen y/o recuperan) a partir de una fuente de VE. El aislamiento de VE puede ocurrir sobre un soporte sólido (superficie del chip, microperlas, filtro) o a través de un soporte semisólido (hidrogel, polímero, resina) o fluyendo a través de una membrana o un filtro.

[0027] Como se divulga en el presente documento, "análisis" o "detección" pueden significar cualquier proceso analítico químico, biológico o físico destinado a revelar una característica o propiedad química, biológica o física de las VE que puede explotarse para extrapolar información sobre la presencia, número, tamaño, composición, carga, propiedad mecánica de VE.

[0028] Como se divulga en el presente documento, el grupo de unión al soporte puede ser parte de la estructura de una molécula caracterizada por elementos específicos y una estructura bien definida y precisa, que confiere al compuesto una reactividad típica similar a la de otros compuestos que contienen el mismo grupo y que en este contexto se introduce para conferir al péptido una reactividad específica (ortogonal) con una contraparte presente en el soporte de inmovilización.

[0029] Como se divulga en el presente documento, el espaciador puede ser una molécula química y funcionalmente inerte introducida en el contexto relativo con el único propósito de distanciar la molécula activa de la superficie en el espacio.

[0030] Como se divulga en el presente documento, el polímero funcional puede ser un polímero utilizado para recubrir los soportes y favorecer la inmovilización de los péptidos por grupos (funcionales) reactivos con una contraparte presente en el péptido.

[0031] Como se divulga en el presente documento, una interacción no covalente puede ser cualquier interacción molecular que no se base estrictamente en un enlace covalente como se conoce en la técnica. Como tales, las interacciones no covalentes pueden ser, por ejemplo, interacciones electrostáticas, interacciones pi, interacciones de Van der Waals, efectos hidrofóbicos y puentes de hidrógeno.

[0032] Un primer aspecto, que se describe con más detalle en lo sucesivo en el presente documento, proporciona una sonda molecular que comprende al menos una primera fracción y al menos una segunda fracción que están cada una unidas covalentemente a la sonda molecular, en donde: la al menos una primera fracción comprende al menos un péptido de unión o peptidomimético para unir la sonda molecular a al menos una membrana de vesícula extracelular (VE), en donde la unión está mediada por la detección de la curvatura de la membrana de la VE; y la al menos una segunda fracción comprende al menos un grupo de unión al soporte para la unión de la sonda molecular a al menos un soporte;

el al menos un grupo de unión al soporte está unido al al menos un soporte; y el péptido o peptidomimético deriva de un péptido o dominio proteico que detecta la curvatura de la membrana, en donde el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina, MARCKS, sinaptotagmina, arfgap1, sinapsina (I) o endofilina. El péptido o peptidomimético puede derivar de la secuencia de aminoácidos de origen natural de un dominio peptídico o proteico con propiedades de unión a la membrana.

[0033] Las fracciones primera y segunda pueden estar unidas covalentemente entre sí, de manera directa o indirecta.

[0034] La sonda molecular puede existir en diferentes formas o realizaciones. Por ejemplo, la sonda molecular puede estar en una forma para que se produzca la unión o la reacción covalente, o puede estar en una forma después de que se haya producido esa unión o reacción covalente.

[0035] Por ejemplo, en una forma de realización, el péptido o peptidomimético de la sonda molecular no está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular, mientras que en otra forma de realización, el péptido o peptidomimético está unido al menos a una membrana de vesícula extracelular.

[0036] En una forma de realización, el grupo de unión al soporte de la sonda molecular no está unido al al menos un soporte, mientras que en otra realización, el grupo de unión al soporte está unido al al menos un soporte.

[0037] En otra forma de realización, el péptido o peptidomimético de la sonda molecular no está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular y el grupo de unión al soporte de la sonda molecular tampoco está unido al al menos a un soporte.

[0038] En otra forma de realización, el péptido o peptidomimético de la sonda molecular está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular y el grupo de unión al soporte de la sonda molecular también está unido al al menos a un soporte.

[0039] En otra forma de realización, el péptido o peptidomimético de la sonda molecular no está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular, pero el grupo de unión al soporte de la sonda molecular está unido al al menos un soporte. En cambio, en otra forma de realización, el péptido o peptidomimético de la sonda molecular está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular, pero el grupo de unión al soporte de la sonda molecular no está unido al al menos un soporte.

[0040] Las secuencias peptídicas son conocidas en la técnica y, como se divulga en el presente documento, las secuencias peptídicas se indican de acuerdo con el código convencional de una letra o el código convencional de tres letras.

[0041] Cuando las fracciones se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, estas también incluyen las fracciones químicamente idénticas que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -OCH2-.

[0042] Las sondas peptídicas pueden incluir péptidos (tamaño promedio de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 restos, pero sin limitación a este tamaño), variantes y derivados de péptidos, peptidomiméticos que comparten la capacidad de unirse a las membranas de las VE. Las sondas peptídicas también pueden contener o estar constituidas enteramente por aminoácidos L o D.

[0043] La sonda molecular puede comprender fracciones tanto aminoacídicas como no aminoacídicas. Las fracciones no aminoacídicas se pueden utilizar como parte del grupo de unión al soporte para unirse a un soporte o para marcaje.

[0044] Las estrategias para la modificación posterior a la síntesis de sondas moleculares pueden incluir técnicas de ligadura química, modificaciones enzimáticas o cualquier otra técnica conocida para modificaciones de péptidos y proteínas.

[0045] La sonda molecular se puede utilizar en combinación con uno o una pluralidad de peptídicos o peptidomiméticos en la primera fracción. La combinación puede comprender un cóctel (una mezcla) de sondas peptídicas o peptidomiméticas individuales o puede estar en forma de una sonda peptídica o peptidomimética de fusión o una sonda peptídica o peptidomimética de múltiples dominios. Se pueden unir entre sí dos o más copias de una sonda peptídica, sola o en combinación con una sonda peptídica o peptidomimética adicional, o unidas a través de un andamiaje molecular.

[0046] Una sonda peptídica de la invención se puede utilizar en combinación con uno o más péptidos o sondas peptídicas adicionales. La combinación puede comprender un cóctel (una mezcla simple) de sondas peptídicas individuales o puede estar en forma de una sonda peptídica de fusión o una sonda peptídica de múltiples dominios. Se pueden unir entre sí dos o más copias de una sonda peptídica de la invención, sola o en combinación con una o más sondas peptídicas adicionales o unidas a través de un andamiaje molecular.

PRIMERA FRACCIÓN PARA UNIR LA SONDA A LA MEMBRANA DE VE

[0047] El péptido o peptidomimético de la primera fracción está adaptado para que la unión esté mediada por la detección de la curvatura de la membrana VE. La detección de curvatura de membrana VE es conocida en la técnica pero no se ha utilizado como se describe y/o reivindica en el presente documento. La unión a la membrana del VE puede ser tal que la unión no esté mediada por una proteína de membrana de la membrana del VE. El péptido o peptidomimético puede derivar de la secuencia de aminoácidos de origen natural de un dominio peptídico o proteico con propiedades de unión a la membrana.

[0048] Se pueden utilizar péptidos o peptidomiméticos en la primera fracción. Los peptidomiméticos o "miméticos de péptidos" son conocidos en la técnica y pueden usarse en lugar de la fracción de unión a la membrana VE peptídica en la primera fracción. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan elementos de la estructura secundaria de proteínas o péptidos. La razón subyacente detrás del uso de miméticos de péptidos es que la estructura peptídica de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de tal manera que se faciliten las interacciones moleculares. Un péptido mimético permite interacciones moleculares similares a la molécula original.

[0049] En una forma de realización, la vesícula extracelular es un exosoma o una microvesícula. En una forma de realización, la vesícula extracelular es un exosoma y, en otra forma de realización, la vesícula extracelular es una microvesícula.

[0050] La primera fracción de la sonda molecular se puede generar en función de su capacidad para asociarse con vesículas extracelulares mediante, por ejemplo, unión a vesículas de diámetro más pequeño (por ejemplo, de 10 nm a 150 nm de diámetro, o de 30 nm a 100 nm de escala) mediante la detección de la curvatura de la vesícula en comparación con la de una vesícula más grande de unos pocos a varios cientos de nanómetros como se conoce en la técnica.

[0051] En una forma realización, el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina, MARCKS, sinaptotagmina, arfgap1, sinapsina (I) o endofilina. En una forma de realización, el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina; en otra forma de realización, deriva de MARCKS; en otra forma de realización, deriva de sinaptotagmina; y en otra forma de realización, deriva de arfgap1, sinapsina (I) o endofilina. En una forma de realización, la primera fracción comprende el péptido y el péptido es un péptido catiónico. En una forma de realización, el péptido o peptidomimético es lineal, ramificado, cíclico, tándem, multimérico, multidominio o multivalente. En una realización, el péptido o peptidomimético es dimérico.

[0052] En una forma de realización, el grupo de unión al soporte comprende azida, alquino, tiol, alqueno, amina, ácido carboxílico, aldehído o maleimida. En una forma de realización, el grupo de unión al soporte comprende propargilo.

[0053] En una forma de realización, la sonda comprende además al menos una tercera fracción que está unida covalentemente a la sonda molecular y que es un espaciador entre la primera fracción y la segunda fracción. En una forma de realización, el espaciador es un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos, una fracción orgánica o un espaciador escindible. En una forma de realización, el espaciador comprende poli(etilenglicol), lisina o glicina.

[0054] En una forma de realización, el péptido o peptidomimético es cíclico, multimérico, multidominio o multivalente. En una forma de realización, es cíclico; en otra forma de realización, es multimérico; en otra forma de realización, es multidominio; y en otra forma de realización, es multivalente.

[0055] La primera fracción que comprende el péptido o peptidomimético está adaptada para acoplarse a la sonda molecular y en algunos casos para acoplarse directamente a la segunda fracción que tiene el grupo de unión al soporte para unirse a un soporte.

SEGUNDA FRACCIÓN PARA UNIR LA SONDA AL SOPORTE

[0056] El grupo de unión al soporte de la segunda fracción puede ser nucleofílico o electrófilo en su capacidad para unirse a un soporte. Los grupos de unión al soporte pueden proporcionar unión covalente o unión específica al soporte. Se pueden usar grupos tales como biotina, avidina, estreptavidina y análogos de los mismos. El grupo de unión al soporte también puede estar representado por un oligopéptido, oligonucleótido o secuencia híbrida que proporciona una unión estable al soporte a través de interacciones no covalentes.

[0057] Por ejemplo, el grupo de unión al soporte puede comprender azida, alquino, tiol, alqueno, amina, ácido carboxílico, aldehído o maleimida. En una forma de realización, el grupo de unión al soporte comprende azida, alquino, tiol, alqueno, amina, ácido carboxílico, aldehído o maleimida. En una forma de realización, el grupo de unión al soporte comprende propargilo.

[0058] En una forma de realización, el grupo de unión al soporte puede ser o puede comprender un aminoácido, incluyendo un aminoácido no natural, tal como, por ejemplo, propargilglicina. Este puede reaccionar con, por ejemplo, un grupo azida en el soporte.

[0059] Otro ejemplo es un grupo funcional polihistidina.

[0060] La segunda fracción también está adaptada para unirse a la primera fracción.

[0061] En algunas formas de realización, el grupo de unión al soporte está unido al extremo N o C de la sonda peptídica, minimizando así cualquier interferencia en la unión de la sonda a la membrana de la VE. Como alternativa, el grupo de unión al soporte puede estar unido a restos de aminoácidos que son aceptores de enlaces amido o carboxílicos, que pueden estar presentes de forma natural en la molécula o insertarse artificialmente mediante técnicas químicas.

[0062] Las formas de realización preferidas incluyen las siguientes, incluyendo combinaciones de estas realizaciones:

la primera fracción comprende el péptido; o la primera fracción comprende el peptidomimético;

la vesícula extracelular es un exosoma; la vesícula extracelular es una microvesícula; o la vesícula extracelular es una nanovesícula o microvesícula lipídica sintética;

la unión no está mediada por una proteína de membrana de la VE; o el péptido o peptidomimético deriva de un péptido o dominio proteico que detecta la curvatura de la membrana;

el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina, MARCKS, sinaptotagmina, arfgap1, sinapsina (I) o endofilina; o el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina.

la primera fracción comprende el péptido y el péptido es un péptido catiónico; o el péptido o peptidomimético es lineal, ramificado, cíclico, tándem, multimérico, multidominio o multivalente; el péptido o peptidomimético es dimérico.

el grupo de unión al soporte comprende azida, alquino, tiol, alqueno, amina, ácido carboxílico, aldehído o maleimida; o el grupo de unión al soporte comprende propargilo.

TERCERA FRACCIÓN: FORMAS DE REALIZACIÓN DEL ESPACIADOR OPCIONAL

[0063] La sonda molecular, opcionalmente, puede comprender al menos una tercera fracción que comprende al menos un espaciador. Los espaciadores o enlazadores se conocen en la técnica.

[0064] El grupo peptídico o peptidomimético (primera fracción) se puede acoplar directamente al grupo de unión al péptido (segunda fracción) utilizado o indirectamente a través de un espaciador. El espaciador no está particularmente limitado pero puede ser, por ejemplo, un solo aminoácido (por ejemplo, G (glicina)), una secuencia de aminoácidos o un resto orgánico, tal como ácido 3,6-dioxaoctanoico, ácido aminohexanoico u otros. El espaciador puede ser hidrofílico o hidrofóbico o puede tener propiedades híbridas.

[0065] Un espaciador puede ser escindible, lo que significa que puede romperse en una o más partes después de un estímulo, lo que conduce a la liberación de la membrana de la VE unida. Los estímulos que pueden utilizarse para activar la escisión del espaciador son diversos, que incluyen, pero sin limitación: pH, agentes reductores, radiación UV, radiación IR, temperatura, metales, iones, agentes quelantes, detergentes, sustancias químicas y enzimas.

[0066] En una forma de realización preferida, la sonda comprende además al menos una tercera fracción que está unida covalentemente a la sonda molecular y que es un espaciador entre la primera fracción y la segunda fracción. El espaciador puede ser, por ejemplo, un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos, una fracción orgánica o un espaciador escindible. El espaciador puede comprender, por ejemplo, poli(etilenglicol), lisina o glicina.

[0067] En otra forma de realización, la sonda molecular no comprende además al menos una tercera fracción que sea un espaciador entre la primera fracción y la segunda fracción.

CUARTA FRACCIÓN: FORMA DE REALIZACIÓN DE MARCADOR OPCIONAL

[0068] La sonda molecular, opcionalmente, puede comprender al menos una cuarta fracción para marcar la sonda, con marcaje específico del sitio con moléculas señal, incluyendo, por ejemplo, fluoróforos, enzimas o puntos cuánticos. El marcaje se conoce en la técnica.

[0069] La sonda comprende además al menos una cuarta fracción que es un marcador, incluyendo, por ejemplo, un marcador fluorescente.

[0070] En una forma de realización, sin embargo, la sonda no comprende además al menos una cuarta fracción que sea un marcador.

QUINTA FRACCIÓN: FORMA DE REALIZACIÓN OPCIONAL PARA MODIFICAR LA FRACCIÓN PARA LA VESÍCULA EXTRACELULAR

[0071] La sonda molecular, opcionalmente, puede comprender al menos una quinta fracción para modificar (por ejemplo, funcionalizar o decorar) la VE. Esta fracción es distinta de la tercera y/o cuarta fracción. La quinta fracción para modificar puede ser, por ejemplo, al menos una molécula pequeña. Los ejemplos incluyen, sin límite, fármacos o azúcares o con otras moléculas, incluyendo, por ejemplo, secuencias de ADN/ARN, péptidos o proteínas.

[0072] En particular, la sonda puede comprender además al menos una quinta fracción que es una fracción modificadora de la vesícula extracelular y que es una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una secuencia de ADN o ARN.

[0073] En otra forma de realización, la sonda no comprende además al menos una quinta fracción que es una fracción modificadora de la vesícula extracelular y que es una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una secuencia de ADN o ARN.

SOPORTE

[0074] Las sondas moleculares están adaptadas para unirse y usarse con al menos un soporte o, más particularmente, al menos una superficie de al menos un soporte. El soporte también puede denominarse "vehículo", y soportes y vehículos, junto con sus superficies, se conocen en la técnica. Por ejemplo, el soporte puede ser sólido o puede ser semisólido. En una forma de realización, el soporte comprende un chip, un portaobjetos, una perla, un pocillo, un hidrogel, una resina, un polímero, un filtro o una membrana. El soporte puede ser, por ejemplo, parte de una micromatriz. El soporte puede comprender un hidrogel, que incluye, por ejemplo, un hidrogel peptídico.

[0075] El soporte puede comprender una superficie parcialmente o totalmente recubierta, adaptada para unirse a la sonda. El soporte puede comprender una superficie parcialmente o totalmente recubierta, adaptada para unirse a la sonda, en donde el recubrimiento comprende un polímero.

[0076] El soporte puede comprender puntos o líneas para la unión a la sonda.

[0077] Los ejemplos incluyen perlas a microescala y nanoescala, así como hidrogeles, incluidos hidrogeles fabricados mediante hidrogelificadores peptídicos autoensamblables. La unión al soporte puede ser covalente o no covalente y puede ser facilitada y orientada espacialmente por una fracción asociada al péptido que permite la unión covalente o no covalente, tal como una fracción que tiene una alta afinidad con un componente unido al vehículo, soporte o superficie. Como un ejemplo no limitante, la sonda molecular puede aportar una fracción de biotina y el componente asociado a la superficie u otro soporte puede ser avidina. En otro ejemplo, la química de clic se puede utilizar para unir la sonda molecular a un soporte recubierto por un polímero funcional. El péptido se puede inmovilizar sobre la superficie o soporte sólido o semisólido antes o después de la adición de la muestra que contiene VE.

[0078] En formas de realización de la invención, la superficie o vehículo sólido o semisólido es una lámina o chip para micromatrices, el suelo o la pared de un pocillo de microtitulación; una superficie o membrana filtrante (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno), tal como por ejemplo una membrana Immobilon); una fibra hueca; un hidrogel peptídico o cualquier otro hidrogel sintético o natural, un polímero natural o sintético; un medio cromatográfico en perlas (por ejemplo, un gel de agarosa o de poliacrilamida); una perla magnética; una matriz de celulosa fibrosa; una matriz de HPLC; una matriz de FPLC; una sustancia que tiene moléculas de tal tamaño que las moléculas con la sonda peptídica unida a ellas, cuando se disuelven o dispersan en una fase líquida, pueden retenerse mediante un filtro; una sustancia capaz de formar micelas o participar en la formación de micelas permitiendo cambiar o intercambiar una fase líquida sin arrastrar las micelas; un polímero soluble en agua; o cualquier otro vehículo, soporte o superficie adecuado.

[0079] Como vehículo perteneciente a la presente invención, se puede utilizar cualquier vehículo siempre que sea insoluble e incluya una sustancia orgánica, tal como, poliestireno, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, metacrilato de polimetilo, amida poliacrílica, metacrilato de poliglicidilo, polipropileno, poliolefina, poliimida, poliuretano, poliéster, cloruro de polivinilo, polietileno, policlorocarbonato, una resina de silicona, caucho de silicona, agarosa, dextrano, un copolímero de etileno-anhídrido maleico, o similares; un polímero natural o sintético; un hidrogel natural o sintético que incluye hidrogeles fabricados mediante hidrogelificador peptídico autoensamblable; una sustancia inorgánica, tales como vidrio, óxido de silicio, tierra de diatomeas, cristal poroso, vidrio oscurecido, alúmina, gel de sílice, un óxido metálico o similares; una sustancia magnética, tal como hierro, cobalto, níquel, magnetita, cromita o similares; y aquellos preparados utilizando aleaciones de estas sustancias magnéticas como materias primas. Además, estos vehículos pueden utilizarse en una amplia variedad de formas, tal como una superficie plana o nanoestructurada, una microplaca, un tubo, un microcanal, pilares, una pieza con forma de disco, partículas (perlas) y similares.

[0080] La asociación de la sonda peptídica al vehículo puede ser covalente o no covalente y la inmovilización no covalente puede ser no específica (por ejemplo, unión no específica a una superficie de poliestireno en, por ejemplo, un pocillo de microtitulación). La unión selectiva o semiselectiva a un vehículo, soporte o superficie sólido o semisólido, puede lograrse mediante la sonda peptídica que aporta una fracción reactiva (asa química o grupo funcional) o un péptido, oligonucleótido o secuencia híbrida adicional que permite su unión covalente o no covalente al vehículo, soporte o superficie sólido o semisólido. Por ejemplo, la fracción puede tener afinidad con un componente unido al vehículo, soporte o superficie. En este caso, la fracción puede ser, por ejemplo, un grupo de biotina o biotinilo o un análogo del mismo unido a la sonda peptídica, y el componente es, por tanto, avidina, estreptavidina o un análogo de las mismas. Una alternativa es una situación en la que la sonda peptídica tiene un marcador de poli-histidina y el vehículo comprende un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA) cargado con iones Ni++. Una lista no limitante de otras asas químicas comunes y grupos reactivos que pueden incluirse para los fines de conjugación utilizados en las sondas peptídicas de la presente invención es azidas, alquinos, tioles, alquenos, aminas, ácidos carboxílicos, aldehídos, maleimidas. Entre los vehículos, soportes o superficies adecuados se encuentran, por ejemplo, perlas magnéticas o látex de copolímeros tales como estireno-divinilbenceno, estireno hidroxilado-divinilbenceno, poliestireno, poliestireno carboxilado, perlas de negro de humo, vidrio no activado o vidrio activado con poliestireno o cloruro de polivinilo, vidrio magnético poroso activado con epoxi, partículas de gelatina o polisacáridos u otras partículas proteicas, anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos Fab de dichos anticuerpos.

[0081] Se pueden utilizar diferentes formas de realización para unir el grupo de unión al péptido de la sonda molecular a un soporte. Los ejemplos incluyen la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (química de clic); cicloadición de azida-alquino promovida por tensión (química de clic libre de cobre); conjugación de tiol-maleimida; formación de enlaces amida promovida por activadores de grupos carboxilo: y conjugación mediada por biotinaestreptavidina. También se pueden encontrar referencias bibliográficas a estos protocolos. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes de EE. UU. 2016/0200847; 2016/0228842; 2015/0087555; y 2013/0115382.

MICROMATRICES

[0082] Las micromatrices son conocidas en la técnica y el soporte y otros elementos de las formas de realización descritas se pueden integrar en una micromatriz. Las micromatrices pueden diseñarse con patrones definidos geométricamente que incluyen puntos y líneas, tal como se conoce en la técnica.

MUESTRAS Y VE A ANALIZAR

[0083] La muestra que potencialmente comprende una VE no está particularmente limitada. La muestra se puede tomar, por ejemplo, de cualquier tejido biológico. La muestra puede ser pretratada o modificada antes de ser sometida a un uso posterior con las sondas moleculares descritas en el presente documento.

[0084] En formas de realización de la invención, el ensayo puede comprender, por ejemplo, inmovilizar una sonda molecular de la invención, añadir la muestra que contiene Ve y luego detectar la cantidad de VE unida a la sonda, por ejemplo añadiendo una sustancia marcada (conjugado, socio de unión), tal como un anticuerpo marcado, que reconoce específicamente las VE.

[0085] La inmovilización de una sonda peptídica de la invención puede ser covalente o no covalente y la inmovilización no covalente puede ser no específica (por ejemplo, unión no específica a una superficie de poliestireno en, por ejemplo, un pocillo de microtitulación). La unión selectiva o semiselectiva a un vehículo, soporte o superficie sólido o semisólido, puede lograrse mediante la sonda peptídica que aporta una fracción reactiva (asa química o grupo funcional) que permite su unión covalente o no covalente al vehículo, soporte o superficie sólido o semisólido. Por ejemplo, la fracción puede tener afinidad con un componente unido al vehículo, soporte o superficie. En este caso, la fracción puede ser, por ejemplo, un grupo de biotina o biotinilo o un análogo del mismo unido a la sonda peptídica y el componente es, por tanto, avidina, estreptavidina o un análogo de las mismas. Una alternativa es una situación en la que la sonda peptídica tiene un marcador de poli-histidina y el vehículo comprende un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA) cargado con iones Ni++. Una lista no limitante de otras asas químicas comunes y grupos reactivos que pueden incluirse para los fines de conjugación utilizados en las sondas peptídicas de la presente invención incluye azidas, alquinos, tioles, alquenos, aminas, ácidos carboxílicos, aldehídos y maleimidas. Entre los vehículos, soportes o superficies adecuados se encuentran, por ejemplo, perlas magnéticas o látex de copolímeros tales como estirenodivinilbenceno, estireno hidroxilado-divinilbenceno, poliestireno, poliestireno carboxilado, perlas de negro de humo, vidrio no activado o vidrio activado con poliestireno o cloruro de polivinilo, vidrio magnético poroso activado con epoxi, partículas de gelatina o polisacáridos u otras partículas de proteínas.

[0086] Los dispositivos para realizar ensayos de unión específica, son conocidos y pueden adaptarse fácilmente para su uso en los presentes métodos. Los ensayos en fase sólida, en general, son más fáciles de realizar que los métodos de ensayo heterogéneos que requieren una etapa de separación, tales como precipitación, centrifugación, filtración, cromatografía o magnetismo, porque la separación de reactivos es más rápida y sencilla. Los dispositivos de ensayo en fase sólida incluyen portaobjetos de micromatriz, placas de microtitulación, dispositivos de ensayo de flujo continuo, tiras reactivas y dispositivos inmunocapilares o inmunocromatográficos o de inmunoensayo.

[0087] En una forma de realización de la invención, los péptidos de la invención están inmovilizados sobre perlas (microesferas), para métodos basados en citometría de flujo para analizar y/o detectar VE.

[0088] Como se ha descrito anteriormente, en algunas formas de realización de la invención, la sonda peptídica está provista de un marcador adecuado que permite la detección. Se pueden utilizar marcadores convencionales que sean capaces, solo o en concierto con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. Los métodos de detección adecuados incluyen, por ejemplo, detección de un agente que está marcado, directa o indirectamente, con un marcador fluorescente mediante microscopía de inmunofluorescencia, incluyendo microscopía confocal o para citometría de flujo (FACscan); detección de un agente marcado radiactivamente mediante autorradiografía; microscopía electrónica.

[0089] Un "sistema de detección" para detectar el complejo VE-sonda peptídica, como se usa en el presente documento, puede comprender un socio de unión detectable, tal como un anticuerpo específico para la sonda peptídica. En una forma de realización, el socio de unión se marca directamente. En otra forma de realización, el socio de unión está unido a un reactivo generador de señales, tal como una enzima que, en presencia de un sustrato adecuado, puede producir una señal detectable. Una superficie para inmovilizar la sonda peptídica puede acompañar opcionalmente al sistema de detección.

[0090] En formas de realización de la invención, el procedimiento de detección comprende la detección por cambio del índice de refracción en el complejo sonda peptídica-VE que puede detectarse por interferometría o resonancia de plasmón superficial.

[0091] En formas de realización de la invención, el procedimiento de detección comprende la inspección visible del complejo VE-sonda peptídica para detectar un cambio de color, o la inspección del complejo VE-sonda peptídica para detectar un cambio físico-químico. Los cambios físico-químicos pueden ocurrir con reacciones de oxidación u otras reacciones químicas. Pueden detectarse a simple vista, usando un espectrofotómetro o similares.

[0092] En una forma de realización del método, la sonda peptídica, o una mezcla de sondas peptídicas, se transfiere mediante electroborrado o punto borrado sobre papel de nitrocelulosa. Posteriormente, el fluido biológico (por ejemplo, suero, plasma, saliva) se incuba con el antígeno transferido y se permite que la VE en el fluido biológico se una al antígeno o antígenos. Luego se puede detectar el anticuerpo unido, por ejemplo, mediante métodos inmunoenzimáticos estándar.

[0093] En otra forma de realización del método, se conjugan perlas de látex o poliestireno a la sonda peptídica de la invención. Posteriormente, el fluido biológico se incuba con el conjugado de perla/sonda peptídica, formando así una mezcla de reacción. Luego se analiza la mezcla de reacción para determinar la presencia de las VE.

[0094] Un ensayo para el análisis es un análisis de VE basado en micromatrices (matrices de VE). En la matriz de Ve , el péptido de la invención se coloca y se une a la superficie de un portaobjetos o chip de micromatriz directamente o a través de una matriz de captura (es decir, recubrimiento polimérico funcional, sistema estreptavidina/avidina). A continuación se bloquean los sitios de unión no específica a proteínas en la superficie con un agente apropiado, tales como etanolamina, seroalbúmina bovina (BSA), una solución tamponada de leche en polvo descremada. A continuación, la micromatriz se incuba con una muestra biológica que potencialmente, opcionalmente o probablemente contenga VE (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular, suero, plasma, saliva, LCR). La muestra se puede aplicar pura o, más a menudo, se puede diluir, generalmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1-5,0 % en peso) de proteína, tal como BSA y detergentes tal como Tween 20. Después de incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que se produzca la unión específica, se lava el chip/portaobjetos para eliminar el material no adherido. El portaobjetos se puede someter a detección sin marcador, por ejemplo, mediante SP-IRIS (sensores de imágenes de reflectancia interferométrica de partículas individuales) para el recuento digital de VE inmovilizadas u otra detección interferométrica o mediante resonancia de plasmón superficial y otra detección plasmónica.

[0095] En una forma de realización, la micromatriz se incuba luego con una concentración óptima de un anticuerpo apropiado (por ejemplo, para marcadores de VE específicas tales como CD9, CD63, CD81) u otro ligando (por ejemplo, péptido, aptámero) que está conjugado con un marcador de fluorescencia o un punto cuántico o una enzima u otro marcador. El marcador se puede elegir entre diversas moléculas o enzimas fluorescentes, quimioluminiscentes, incluidas peroxidasa de rábano picante (HRP), p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc. Se permite tiempo suficiente para que se produzca nuevamente la unión específica, luego, el portaobjetos se lava nuevamente para eliminar el conjugado no unido y se somete a detección mediante detectores de fluorescencia o quimioluminiscencia o se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se deja desarrollar el color y se determina la densidad óptica visualmente o instrumentalmente (medida a una longitud de onda adecuada).

[0096] Un ensayo para el análisis de VE es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, es decir, un ELISA. Normalmente, en un ELISA, la sonda peptídica de la invención está unida a la superficie de un pocillo de microtitulación directamente o a través de una matriz de captura (es decir, anticuerpo, recubrimiento de polímero, estreptavidina/biotina). A continuación se bloquean los sitios de unión no específica a proteínas en la superficie con un agente apropiado, tal como albúmina de suero bovino (BSA), una solución tamponada de leche en polvo descremada. Luego, el pocillo se incuba con una muestra biológica que probablemente contenga VE. La muestra se puede aplicar pura o, más a menudo, se puede diluir, generalmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1-5,0 % en peso) de proteína, tal como BSA y detergentes tal como Tween 20. Después de incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que se produzca la unión específica, el pocillo se lava para eliminar el material no unido y luego se incuba con una concentración óptima de un anticuerpo apropiado (por ejemplo, para marcadores de VE específicos tales como CD9, CD63, CD81) que se conjuga con una enzima u otro marcador mediante procedimientos estándar y se disuelve en un tampón de bloqueo. El marcador se puede elegir entre diversos de enzimas, incluidas peroxidasa de rábano picante (HRP), p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc. Se permite tiempo suficiente para que se produzca nuevamente la unión específica, luego se lava nuevamente el pocillo para eliminar el conjugado no unido y se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se deja desarrollar el color y se determina la densidad óptica de los contenidos del pocillo visualmente o instrumentalmente (medida a una longitud de onda adecuada).

[0097] En otra forma de realización de la invención, el ensayo descrito anteriormente se realiza en líquido, usando perlas, que comprende perlas magnéticas, donde se unen las sondas peptídicas de la invención.

[0098] En una forma de realización de un ELISA, una sonda peptídica de la invención está inmovilizada sobre una superficie, tal como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente que está recubierta con estreptavidina o un compuesto de unión a biotina equivalente a una concentración óptima en un tampón de recubrimiento alcalino e incubada a 4 °C durante la noche. Después de un número adecuado de lavados con tampones de lavado estándar, se aplica a cada pocillo una concentración óptima de una forma biotinilada de una composición/antígeno de esta invención disuelta en un tampón de bloqueo convencional; se añade una muestra; y el ensayo procede como se ha indicado anteriormente.

[0099] Otro formato de ensayo útil es el formato de flujo lateral. La sonda peptídica de la invención está inmovilizada sobre membrana, tal como una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (por ejemplo, una membrana Immobilon (Millipore)) o una membrana de nitrocelulosa. Cuando se utiliza una solución de muestra (sangre, suero, etc.) se aplica a la almohadilla de aplicación de muestra, se disuelven los anticuerpos de detección marcados que se unen a VE en la muestra. Esta mezcla se transporta a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene la sonda peptídica) por acción capilar. Si hay VE presentes, se unen a la sonda peptídica representada en la membrana generando una señal. Se utiliza un anticuerpo adicional específico para el anticuerpo marcado con oro coloidal (tal como IgG de cabra anti-ratón) para producir una señal de control.

[0100] Cualquier experto en la materia debe entender que cualquier número de formatos de ensayo convencionales, en particular formatos de inmunoensayo, pueden diseñarse para utilizar las sondas peptídicas aisladas de la presente invención para la detección de VE. Por lo tanto, la presente invención no está limitada por la selección del formato de ensayo particular y se cree que abarca formatos de ensayo que son conocidos por los expertos en la materia.

[0101] Otros formatos de ensayo útiles incluyen el recipiente con filtro y la tira reactiva. En el ensayo anterior, las sondas peptídicas de la invención se fijan a un filtro de vidrio sinterizado o de membrana en la abertura de una pequeña tapa. El fluido biológico o muestra (por ejemplo, aproximadamente 5 ml) se pasa a través del filtro. Si la VE está presente, se unirá al filtro, que luego podrá visualizarse a través de un segundo anticuerpo/detector. El ensayo con tira reactiva implica la fijación de un antígeno o anticuerpo a un filtro, que luego se sumerge en el fluido biológico, se seca y se tamiza con una molécula detectora.

[0102] Otro formato de ensayo útil incluye la inmovilización de sondas peptídicas de la invención en una matriz de hidrogel tal como un hidrogel peptídico, un gel de agarosa o cualquier hidrogel polimérico o biopolimérico y combinación de los mismos. El fluido biológico o la muestra se mezclan con la matriz de hidrogel o se ponen en contacto con ella. Si la VE está presente, se forma un complejo sonda peptídica-VE y se detecta con cualquiera de las modalidades descritas anteriormente.

[0103] Gran parte de la discusión anterior está dirigida a la detección de VE en fluidos biológicos. No obstante, se debe entender que la discusión también se aplica a la detección de VE en cualquier medio extracelular (por ejemplo, líneas celulares o medios de cultivo de organoides) y de muestras pretratadas (es decir, muestras sometidas a procedimientos de aislamiento de VE tales como cromatografía de exclusión por tamaño, ultracentrifugación, etc.).

[0104] En un aspecto de la invención, una sonda peptídica de la invención está asociada con un vehículo para el aislamiento de VE. La invención comprende poner en contacto (incubar, hacer reaccionar) una sonda peptídica de la invención inmovilizada en el soporte con una muestra de un fluido biológico (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular, orina o saliva, suero o LCR) de un sujeto (por ejemplo, humano u otro animal) u otra fuente (por ejemplo, microorganismo o cultivo celular o extracto vegetal) para capturar VE. En presencia de VE, se forma un complejo y se aísla de la solución.

[0105] Se dará una explicación a partir de un ejemplo tomando el caso del uso de partículas magnéticas, como vehículo perteneciente a la presente invención. En primer lugar, un recipiente, con el vehículo de sonda peptídica de la presente invención como se ha descrito anteriormente, se instala en un soporte magnético, para recoger la sonda peptídica-vehículo de la presente invención en una pared del tubo utilizando fuerza magnética, y desechar la solución en el recipiente. Seguidamente, se añade la solución de lavado al recipiente y se agita. La operación de lavado puede repetirse varias veces, según sea necesario. Un método para la obtención de VE de la presente invención se caracteriza por comprender las siguientes etapas: (1) Una etapa para formar un complejo de la sonda peptídica unida al vehículo y la VE en la muestra, (2) Una etapa para separar el complejo y la muestra, por ejemplo mediante fuerza magnética o centrifugación (3) Una etapa para separar la VE del complejo para obtener las VE.

[0106] En un formato, la sonda peptídica de la invención o una mezcla de sondas peptídicas se conjuga o se mezcla con hidrogelificantes peptídicos autoensamblables. Después de mezclar hidrogeles modificados con sonda peptídica con muestras (por ejemplo, suero que contiene VE) y la permeación de contaminantes fuera del hidrogel, Las VE quedan atrapadas dentro de hidrogeles funcionalizados y son detectadas por anticuerpos secundarios o sondas peptídicas marcadas de la invención.

[0107] En un formato, después de las etapas descritas anteriormente, las VE se recolectan después de la liberación de la sonda peptídica del hidrogel o revirtiendo la unión de la sonda peptídica a las VE o mediante centrifugación.

[0108] En un formato de la invención, la sonda peptídica de la invención o una mezcla de sondas peptídicas está conjugada con polímeros sintéticos o naturales o una composición de los mismos, entró en contacto con la muestra que contenía VE, después de la formación del complejo sonda peptídica-VE, el polímero se somete a centrifugación para extraer las VE.

[0109] En un formato, después de las etapas descritas anteriormente, las VE se recolectan después de la liberación de la sonda peptídica del polímero o revirtiendo la unión de la sonda peptídica a las VE.

[0110] En un formato de la invención, la sonda peptídica de la invención o una mezcla de sondas peptídicas está conjugada con polímeros sintéticos o naturales o una combinación de los mismos, entró en contacto con la muestra que contenía VE, después de la formación del complejo sonda peptídica-VE, el polímero se somete a centrifugación para extraer las VE.

[0111] En un formato de la invención, la sonda peptídica de la invención o una mezcla de sondas peptídicas se conjuga con un medio cromatográfico en perlas (por ejemplo, un gel de agarosa o poliacrilamida); una matriz de celulosa fibrosa; una matriz de HPLC; una matriz de FPLC; una sustancia que tiene moléculas de tal tamaño que las moléculas con la sonda peptídica unida a ellas, cuando se disuelven o dispersan en una fase líquida, puede retenerse mediante un filtro. El vehículo descrito anteriormente se pone en contacto estáticamente o bajo un flujo con la muestra que contiene VE, el complejo péptido-VE se forma y se retiene en la solución.

[0112] En un formato, después de las etapas descritas anteriormente, las VE se recolectan después de la liberación de la sonda peptídica del vehículo o revirtiendo la unión de la sonda peptídica con las VE.

[0113] Una forma de realización de la invención incluye la integración del aislamiento y análisis de VE como se ha descrito anteriormente en una plataforma/chip/dispositivo o kit.

[0114] Otra forma de realización es para aislamiento y/o liberación.

[0115] La asociación de sondas peptídicas con VE también puede revertirse de forma dirigida después de un estímulo, lo que lleva a la liberación de las VE unidas. Los estímulos que pueden utilizarse para posiblemente revertir la unión son diversos, que incluyen, pero sin limitación: pH, agentes reductores, radiación UV, radiación IR, temperatura, metales, iones, agentes quelantes, detergentes, sustancias químicas y/o enzimas.

[0116] Una forma de realización de la invención incluye enlazadores y métodos apropiados para liberar VE después de la captura. Un enlazador (espaciador) puede ser un solo aminoácido (por ejemplo, G (glicina)), una secuencia de aminoácidos o un resto orgánico, tal como ácido 3,6-dioxaoctanoico, ácido aminohexanoico u otros. El espaciador puede ser hidrófilo o hidrófobo o tener propiedades híbridas. El espaciador puede ser escindible, lo que significa que puede romperse en una o más partes después de un estímulo, lo que lleva a la liberación de las VE unidas. Los estímulos que pueden utilizarse para activar la escisión del espaciador son diversos, que incluyen, pero sin limitación: pH, agentes reductores, radiación UV, radiación IR, temperatura, metales, detergentes, sustancias químicas y/o enzimas.

[0117] Otra forma de realización es para el aislamiento de VE, modificación de la membrana (por ejemplo, funcionalización o decoración) y liberación.

[0118] En una forma de realización de la invención, una sonda peptídica de la invención que lleva una fracción funcional opcional está asociada con un vehículo para el aislamiento de VE y se utiliza para la decoración y el aislamiento de la membrana de VE integradas. Una forma de realización comprende poner en contacto (incubar, hacer reaccionar) una sonda peptídica de la invención que lleva la fracción decorativa de membrana opcional (molécula pequeña, péptido, secuencia de ADN/ARN, proteína) e inmovilizar en el vehículo con una muestra de un fluido biológico (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular, orina o saliva, sangre o LCR) de un sujeto (por ejemplo, humano u otro animal) u otra preparación de VE de diversas fuentes (por ejemplo, microorganismo o cultivo celular o extracto vegetal o bolsas de sangre) para capturar y decorar las membranas de VE. En presencia de VE, se forma un complejo y se aísla de la solución.

[0119] En un formato, después de las etapas descritas anteriormente, las VE modificadas (o VE decoradas o VE funcionalizadas) se recolectan después de la liberación de la sonda peptídica del vehículo o revirtiendo la unión de la sonda peptídica a las VE.

[0120] Una forma de realización de la invención incluye la integración de la modificación de VE, decoración y aislamiento como se ha descrito anteriormente en una plataforma/chip/dispositivo o kit.

KITS

[0121] Se conocen kits en el estado de la técnica y se pueden llevar a cabo una amplia variedad de kits con diferentes componentes descritos en el presente documento y se pueden llevar a cabo instrucciones y recipientes para el uso de los kits.

[0122] Una forma de realización de la invención lo constituyen los kits para el análisis de VE, que comprende una o más sondas peptídicas de la invención, una o más composiciones de la invención y opcionalmente comprende una o más sondas peptídicas adicionales. La(s) sonda(s) peptídica(s) pueden comprender un marcador detectable o el kit puede incluir un sistema de detección (por ejemplo, un conjugado marcado y un reactivo; o perlas que comprenden firmas espectrales únicas) para detectar VE que se unen a la sonda peptídica. En una realización, el kit puede contener un sustrato (por ejemplo, sólido o semisólido) para inmovilizar el péptido, tal como una lámina de micromatriz, una placa de micropocillos, una membrana de Immobilon o nitrocelulosa, resina, perlas magnéticas, perlas de látex o de poliestireno y soluciones tampón que se utilizarán para realizar el experimento.

[0123] El kit puede incluir uno o más de los formatos de aislamiento de VE descritos anteriormente (perlas, polímero, hidrogel, etc.) integrado con uno de los formatos de detección de VE descritos anteriormente (micromatriz, ELISA, etc.), otro dispositivo de ensayo apropiado, diversos diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de VE específicamente unidos y otros reactivos generadores de señales, tales como anticuerpos, sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Un experto en la materia puede determinar fácilmente otros componentes de un kit.

[0124] En una forma de realización, un kit comprende tampones u otros reactivos apropiados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo sonda peptídica-VE. Estos kits proporcionan un modo cómodo y eficiente para que un laboratorio de investigación analice las Ve .

[0125] Los reactivos para micromatrices, ELISA u otros ensayos según la presente invención se pueden proporcionar en forma de kits. Estos kits son útiles para detectar VE contenidas en una muestra. Dichos kits de análisis de VE pueden contener una sonda peptídica de la invención (y, si se desea, se pueden utilizar sondas peptídicas adicionales como las comentadas anteriormente) y, opcionalmente, un sistema para (medios que permiten) la detección de una sonda peptídica de la invención unida a VE, y/o una superficie a la que se puede unir la sonda peptídica. En una forma de realización, un kit contiene una mezcla de sondas peptídicas adecuadas o medios para preparar dichas mezclas y/o reactivos para detectar complejos sonda peptídica-VE.

[0126] El kit puede incluir portaobjetos o chips de micromatrices o placas de microtitulación o perlas a las que se han unido las sondas peptídicas de la invención, otro dispositivo de ensayo apropiado, diversos diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de VE específicamente unidos y otros reactivos generadores de señales, tales como anticuerpos, sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Un experto en la materia puede determinar fácilmente otros componentes de un kit. Dichos componentes pueden incluir reactivos de recubrimiento, anticuerpos policlonales o monoclonales, o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, VE purificadas o semipurificadas como patrones, anticuerpos detectores, un anticuerpo anti-ratón o anti-humano con una molécula indicadora conjugada al mismo, una placa ELISA preparada para absorción, gráficos indicadores para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, barras o recipientes aplicadores, una taza preparatoria de muestra, etc. En una forma de realización, un kit comprende tampones u otros reactivos apropiados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo sonda peptídica-VE. Estos kits proporcionan un modo cómodo y eficiente para que un laboratorio de investigación analice las VE.

[0127] Kits para realizar este u otros métodos de ensayo, que usan anticuerpos de detección u otro socio de unión específico de la invención y el medio de ensayo también están incluidos en la invención. Un experto en la materia puede determinar fácilmente otros componentes de un kit.

[0128] Una forma de realización de la invención es un kit para el aislamiento de VE, que comprende una o más sondas peptídicas de la invención o una o más composiciones de la invención, y opcionalmente comprende una o más sondas peptídicas adicionales y tampones y soluciones para capturar y liberar VE.

[0129] En una forma de realización, un kit comprende al menos un tampón opcionalmente con otros reactivos apropiados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo sonda peptídica-VE para la modificación o decoración de la membrana VE. Dichos kits proporcionan un modo cómodo y eficiente de modificación o decoración integrada junto con aislamiento.

EJEMPLOS DE TRABAJO

[0130] Se incluyen los siguientes ejemplos de trabajo no limitativos para ilustrar otras diversas formas de realización. Los expertos en la materia deben tener en cuenta que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas que se ha descubierto que funcionan bien en la práctica de los métodos, composiciones y aparatos reivindicados. No obstante, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las formas de realización específicas que se divulgan y aun así obtener un resultado similar o parecido sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Preparación de sondas peptídicas derivadas de bradicinina

[0131] El péptido bradicinina (BK) es un ligando peptídico catiónico (secuencia: RPPGFSPFR) que se seleccionó como molécula o secuencia central en este ejemplo por las siguientes razones. Se informa que BK y algunos de sus derivados muestran una afinidad selectiva por superficies de vesículas muy curvadas, particularmente cuando se muestra en una forma trimérica multivalente [22]. El conocimiento generado previamente sugiere que BK puebla conformaciones no estructuradas en soluciones acuosas, pero sufre modificaciones conformacionales al interactuar con los lípidos de la membrana, que permite la acumulación de la conformación peptídica activa en vesículas altamente aniónicas. Otros hallazgos sugieren que un aumento en la concentración local de péptidos en la superficie de la vesícula no solo se debe a la arginina catiónica en las posiciones 1 y 9, sino también a la fenilalanina en las posiciones 5 y 8, lo que avala la interacción péptido-lípido impulsada por electrostática e hidrofóbica. Se considera que estas dos propiedades facilitan la diferenciación de la composición fosfolipídica de las vesículas. Los restos de prolina inducen una conformación de giro B que orienta los restos de arginina en la misma cara del péptido a una forma similar a una garra. Según informes de la literatura, se cree que esta conformación es importante para el reconocimiento y la unión de lípidos [18-21].

[0132] En el presente documento, la secuencia de BK informada previamente fue rediseñada en una forma adecuada para su conjugación selectiva de sitio a diferentes soportes y superficies. Se añadieron restos de lisina y glicina como espaciadores y también para permitir la ramificación de la secuencia en la posición de la lisina extendiendo la secuencia del péptido a partir de ambos grupos amino de la lisina (véanse las Figuras 1 y 2).

[0133] También se incorporaron moléculas espaciadoras adicionales de polietilenglicol (Figura 1). También se añadió un resto de glicina propargilo terminal para permitir la conjugación mediada por química de clic a un soporte [23,24]; como alternativa, se incorporó un resto de cisteína para su posterior funcionalización con biotina o sondas fluorescentes. Se aplicó el mismo esquema general para sintetizar una sonda peptídica lineal (BP) y dos multivalentes, una sonda ramificada (BPb) y una sonda en tándem (BPt). (Figura 2). También se produjeron una secuencia peptídica mixta (BPs) y una secuencia mutada (BPm). Por último, dado el papel clave de las interacciones electrostáticas en la iniciación del complejo mecanismo de detección de membrana informado para BK, también se sintetizó un péptido de control negativo donde los restos de arginina se mutaron a restos de ácido glutámico (BPn) (con carga opuesta). Todas las secuencias se presentan en la Figura 1.

[0134] Todas las sondas peptídicas informadas en la Figura 1 se sintetizaron utilizando química Fmoc estándar y síntesis de péptidos en fase sólida asistida por microondas en resina de amida Rink. Las secuencias se ensamblaron utilizando una mezcla Oxyma/DIC como activadores para las etapas de acoplamiento. El extremo N se desprotegió utilizando 20 % de piperidina en DMF. Se utilizó DMF para lavados posteriores al acoplamiento y posteriores a la desprotección. Las sondas peptídicas se escindieron de la resina utilizando una mezcla 92,5/2,5/2,5/2,5 de TFA/TIS/H2O/tioanisol, purificada por HPLC de fase inversa, liofilizada y caracterizada por espectrometría de masas.

Ejemplo 1: Captura y análisis en chips SP-IRIS de VE de la línea celular HEK y de suero humano

Micromatrices de péptidos

[0135] Los péptidos se disolvieron primero en DMSO a una solución madre de 1 mM y luego se diluyeron a la concentración de manchado final (100<j>M) en el tampón de impresión para la conjugación de CuACC en superficies recubiertas con co-poli-azida (Na/Acetato 5 mM pH 4,8, Trehalosa 50 mM, CuSO4 100<j>M, THPTA 400<j>M y ácido ascórbico 6,25 mM). Chips de silicio impresos con una capa de SiO2 de 80 nm, adecuado para SP-IRIS mediante la plataforma ExoView™ se colocaron en disposición 5 puntos replicados de péptidos mediante inmovilización quimioselectiva mediada por CuAAC. Las micromatrices se dispusieron en chips de silicio estampados recubiertos con Co-poli-azida [23,24], con un espesor de capa de óxido de 80 nm, utilizando un S12 Spotter sin contacto (Scienion Co., Berlín, Alemania), depositando 1 gota por cada mancha.

[0136] Los chips impresos se colocaron en una cámara húmeda y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente.

[0137] Al día siguiente, los chips se sumergieron en una solución de agua filtrada con EDTA 2 mM durante 1 hora, después se lavaron con agua Milli-Q.

[0138] Las micromatrices se caracterizaron cuantificando la densidad de inmovilización de péptidos y de acuerdo con hallazgos previos [23] [24], el rendimiento de unión promedio de cada péptido fue 1,5-3,5 ng/mm2.

[0139] Como primer conjunto experimental para investigar la captura de VE basadas en sondas peptídicas, las VE se aislaron por primera vez de células HEK (riñón embrionario humano) mediante ultracentrifugación (UC).

Aislamiento de VE de HEK mediante ultracentrifugación

[0140] Se recolectaron medios acondicionados de tres días de células HEK y se centrifugaron a 500 g durante 25 minutos. Los sobrenadantes se filtraron con filtros de 0,22 mm (Merck Millipore) y se centrifugaron en un Sorvall™. Ultracentrífuga WX (ThermoFisher Scientific, WX Ultra 100 n.° 75000100) a 150.000 g durante 90 minutos a 4 °C con un SureSpin™ Rotor de cangilones oscilantes 630 (ThermoFisher Scientific) para granular las VE. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, los microgránulos que contenían VE se resuspendieron en PBS y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

[0141] La muestra de HEK por UC se caracterizó de acuerdo con las pautas MISVE2018 [25], mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), microscopía electrónica de transmisión (TEM) y transferencia Western (WB) para demostrar la presencia de proteínas luminales y de membrana de VE. Los resultados confirmaron la presencia de vesículas de tamaño, morfología y contenido proteico compatibles con VE (Figuras 3-5).

Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

[0142] El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un sistema NanoSight NS300 (Malvern Technologies, Malvern, Reino Unido) configurado con láser de 532 nm. Todas las muestras se diluyeron en PBS filtrado hasta un volumen final de 1 ml. Las concentraciones de medición ideales se encontraron probando previamente el valor ideal de partículas por cuadrícula (20-100 partículas/cuadrícula). Los siguientes ajustes se realizaron según el manual del software del fabricante. Se utilizó una bomba de jeringa con inyección de flujo constante y se capturaron y analizaron tres vídeos de 60 s con el software NTA versión 3.2. De cada vídeo, se usaron la media, el modo y la mediana del tamaño de las VE para calcular la concentración de muestras expresada en nanopartículas/ml.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

[0143] Las VE aisladas se absorbieron en rejillas de cobre formvar revestidas de carbono descargadas con resplandor y se lavaron con agua, contrastadas con acetato de uranilo al 2 % y se secaron al aire. Las rejillas se observaron con un microscopio electrónico de transmisión Zeiss LEO 512. Las imágenes fueron adquiridas por una cámara Proscan de escaneo lento de 2k * 2k montada en la parte inferior y controlada por el software EsivisionPro 3.2.

Análisis por transferencia Western

[0144] Las VE purificadas se resuspendieron en un tampón Laemmli no reductor para la detección de CD9 y CD63, en tampón reductor para ALIX y TSG101 y se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los sitios no específicos se bloquearon con leche desnatada al 5 % (p/v) en T-TBS (solución salina tamponada con Tris: NaCl 150 mM, TrisHCl 20 mM, pH 7,4 y 0,5 % de Tween 20). Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos: anti-CD9 de ratón (1:5000, BD Pharmingen, n.° 555370, San José, CA, EE.UU.), anti-CD63 de ratón (1:20000; BD Pharmingen, n.° 556019, San José, CA, EE.UU.), anti-ALIX de ratón (1:500, Santa Cruz, n.° sc-271975, Santa Cruz, CA, EE. UU.) y anti-TSG101 de ratón (1:500, Novus Bio, n.° NB200-112, Littleton, CO, EE.UU.). Después del lavado con T-TBS, las membranas se incubaron con IgG de cabra anti-ratón (1:10000-1:50000) conjugada con peroxidasa de rábano picante durante 45 minutos. Las bandas inmunorreactivas positivas se detectaron mediante el método de quimioluminiscencia mejorada (Immobilon™ sustrato HRP, n.° WBKLS0500, Millipore Corp., Billerica, MA, EE.UU.).

[0145] Con base en las cuantificaciones de NTA, se prepararon diluciones en serie de la muestra de HEK por UC en el intervalo de 1*106 - 1x109 partículas/ml en PBS, se filtraron con un filtro de 200 pm y se incubaron durante 150 minutos en chips de péptidos. Las muestras de VE estaban en condiciones estáticas en los chips impresos en una cámara húmeda. El análisis sin marcador de VE se llevó a cabo utilizando un lector nScan2 (NanoView Biosciences, Boston, MA). El lector adquiere automáticamente imágenes interferométricas de la micromatriz. El software NanoViewer 2.6.0 cuenta las nanopartículas capturadas en los puntos de péptidos dentro de un contraste de partículas definido por el usuario. Para el análisis de las VE, la ventana de tamaño se seleccionó como 1-30 % para incluir tamaños de partículas de 50-200 nm.

[0146] Los valores netos de las VE detectadas en BP y BPn de cinco réplicas puntuales se promediaron y se informaron como kilopartículas/milímetro cuadrado (Figura 6). Cabe destacar que se pudieron evaluar inmediatamente que se podía detectar una cantidad significativa de nanopartículas (puntos grises) dentro del área de los puntos BP (Figura 7), mientras que se observó una unión insignificante para el péptido de control negativo BPn en diversas concentraciones. Asimismo, la incubación de microchips con diferentes concentraciones de muestra puso de relieve un efecto dosis-respuesta, con señal de partículas detectadas en BP que se puede distinguir claramente hasta una concentración de 1*107 partículas/ml (Figura 6). Cabe de destacar que cuando las mismas diluciones en serie de la muestra de HEK por UC (1*106 - 1*109 partículas/ml) se incubaron en chips con anticuerpos anti-tetraspaninas (anti CD81/CD63/CD9), proporcionados por NanoView Biosciences (Boston MA), sólo la concentración más alta (1*109 partículas/ml) proporcionó un recuento distinguible de las señales no específicas detectadas en el control de anticuerpos negativo (Figura 8). Cabe destacar que, el recuento promedio de partículas detectado en los puntos de anticuerpos fue inferior al proporcionado por BP para cada muestra de HEK por UC analizada.

[0147] BP, BPb, BPt, BPs y BPm mostraron capacidad de captura de partículas. En cuanto a las formas peptídicas multivalentes BPb y BPt, sólo se observó un ligero aumento en la unión de vesículas (Figura 9). Esto está en aparente contradicción con la mejora de la unión de VE observada para BK-tri [22], pero este hallazgo podría atribuirse en realidad a la multivalencia inherente de la superficie del chip hacia la membrana de la vesícula. De hecho, debido a la diferencia de tamaño, muchas sondas peptídicas que sobresalen de la superficie del chip posiblemente estén implicadas de manera cooperativa en la unión de una sola vesícula. Con esta muestra de VE purificadas, los péptidos BPs y BPm proporcionaron una eficiencia de captura de VE comparable a la del péptido BP (Figura 9). En cualquier caso probado, los péptidos proporcionaron una capacidad de captura mayor que los anticuerpos anti CD81,<c>D63, CD9.

[0148] La captura de VE por BP a partir de suero humano se evaluó probando la micromatriz de péptidos con vesículas purificadas a partir de un grupo de muestras de suero mediante dos procedimientos comunes de aislamiento de VE: ultracentrifugación (UC) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Las muestras se caracterizaron mediante NTA, TEM y WB (figuras 10-14).

Separación del suero

[0149] Se recogieron cuatro ml de sangre en un BD VACUTAINER (tubo activador de coagulación). Las muestras de suero se separaron después de la centrifugación dentro de las dos horas siguientes a la recolección de sangre a 1900 g durante 10 minutos a 4 °C. Las muestras de suero de 5 controles sanos se agruparon y se congelaron a -20 °C hasta su uso.

[0150] UC del suero: se filtró 1 ml de grupo de suero con filtros de 0,22 mm (Merck Millipore), se diluyó 1:1 con PBS y se centrifugó en unaOptima™TLX Preparative Ultracentrifuge, Beckman CoulterTMa 150.000 g durante 120 minutos a 4 °C conunTLA-55 Rotor (Beckman CoulterTM)para granular las VE. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, los microgránulos que contenían VE se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

[0151] La SEC se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la columna única qEV (Izon, Christchurch, Nueva Zelanda). En resumen, después de equilibrar la columna con PBS, se cargaron 150 |j¡ del grupo de sueros, se recogieron 200 jl; se descartaron las primeras 5 fracciones (F1-F5). La séptima fracción (F7) que según el fabricante representa la fracción con mayor cantidad de vesículas fue utilizada para el análisis y tratamiento con tripsina.

[0152] Para la muestra de UC, se realizó un recuento sin marcadores en péptidos BP, proporcionando resultados análogos a los proporcionados por la muestra de HEK por UC (Figura 15), demostrando así una amplia aplicabilidad de los ligandos BP con diferentes protocolos de aislamiento. Cabe de destacar que, en estas muestras derivadas del suero, los péptidos multivalentes BPb y BPt proporcionaron una capacidad de captura claramente mejorada en comparación con BP (Figura 15).

[0153] Para la muestra SEC, se realizó un recuento sin marcadores en péptidos BP proporcionando resultados análogos a los proporcionados por la muestra de HEK por UC (Figura 16). No obstante, en estas muestras derivadas del suero, los péptidos multivalentes BPb y BPt proporcionaron una mejora espectacular de la capacidad de captura en comparación con BP, BPm y BPs (Figura 16).

[0154] Además de vesículas aisladas, los ligandos peptídicos se probaron con suero puro. Un flujo de trabajo sin aislamiento es realmente una característica muy deseable para obtener un análisis de V<e>imparcial. La muestra de suero agrupada se filtró con un filtro de jeringa de 0,2 jm , se diluyó 1:10 en PBS y se incubó en un chip con los péptidos BP. De acuerdo con resultados previos en muestras de UC y SEC, las partículas del suero no tratado se detectaron sin marcar en todos los péptidos; el control negativo BPn proporcionó una densidad de partículas ligeramente superior en comparación con los resultados obtenidos con muestras aisladas (Figura 17).

[0155] Para evaluar el papel de la exposición a péptidos en la superficie sobre la eficiencia de captura de VE, los inventores compararon una inmovilización no específica (aleatoria) en chips recubiertos de polímero reactivo a nucleófilos frente a una unión de péptidos quimioselectivos para proporcionar una orientación de sondas predeterminada. Cabe destacar que, ambas estrategias se basan en el mismo polímero para el recubrimiento de chips (MCP-2, Lucidant Polymers), que pueden funcionalizarse de forma diferente para introducir asas selectivamente reactivas (co-poli-azida) [24] para la inmovilización de péptidos de tipo clic.

[0156] Las micromatrices de péptidos se incubaron con VE aisladas por SEC del suero (1*109 partículas/ml ). Cabe destacar que, la capacidad de unión de VE de los péptidos BP se eliminó totalmente cuando los péptidos no estaban orientados adecuadamente mediante una estrategia de inmovilización de superficie selectiva del sitio (Figura 18A y 18B), lo que demuestra el importante papel de la orientación de la superficie.

[0157] Para proporcionar información adicional sobre la viabilidad general de este enfoque, la orientación de la superficie del péptido también se logró mediante el conocido sistema de biotina-estreptavidina, utilizando péptido BP biotinilado inmovilizado en estreptavidina colocada en MCP-2 que, aunque es menos eficiente que la inmovilización de tipo clic, mantuvo la capacidad de unión de las VE (Figura 19). En este caso, se detectó estreptavidina a una concentración de 1 mg/ml en PBS en portaobjetos MCP-2, tras el bloqueo con BSA al 1 % p/v en PBS, el portaobjetos se incubó durante 60 minutos con BP biotinilado 100 uM para permitir la inmovilización orientada. En el caso de inmovilización aleatoria de BP, se colocaron 100 uM de péptido en PBS en un portaobjetos recubierto con MCP-2.

[0158] Para comprender mejor el mecanismo de unión del péptido-VE y verificar si solo está mediado por la membrana lipídica y no por sus proteínas asociadas, las VE séricas aisladas por SEC se sometieron a digestión con tripsina, se cuantificaron por NTA (Figura 20) y se incubaron a la concentración de 1*109 partículas/ml en micromatrices de péptidos (Figura 21 A).

Tratamiento con tripsina

[0159] Para hidrolizar las proteínas de membrana, la muestra de SEC se incubó con 25 jg/m l de tripsina durante 6 horas a 37 °C en un termomixer Eppendorf de acuerdo con [26, 27]

[0160] La densidad de partículas en péptidos manchados de BP, para la muestra tratada con tripsina en comparación con la de una muestra sometida a una incubación análoga en ausencia de enzima proteolítica, demostró que la digestión de proteínas de membrana no afecta a la unión de vesículas. De hecho, la unión en algunos casos (en concreto, con los péptidos multivalentes) incluso se ve mejorada por la proteólisis y, por tanto, no está mediada por proteínas asociadas a la superficie. Por el contrario, cuando las mismas muestras se incubaron en un chip de anticuerpos (CD81/CD63/CD9) Tetraspanin Kits proporcionado por NanoView Biosciences (Boston MA), como se esperaba, no se detectó ninguna unión en la muestra digerida con tripsina (Figura 21B).

Ejemplo 2: Captura y análisis mediante micromatrices de fluorescencia de VE aisladas de suero humano por UC y SEC y de suero humano puro

[0161] Los péptidos BP se colocaron en portaobjetos de silicio recubiertos con co-poli-azida (véase el ejemplo 1).

[0162] Los portaobjetos se detectan mediante un detector sin contacto sciFLEXARRAYER S12. Cada portaobjetos se coloca para obtener dieciséis submatrices idénticas. Después del manchado, los portaobjetos se colocan en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante la noche. Posteriormente, los portaobjetos se incuban durante 60 minutos en una solución 2 mM de EDTA. Después de esto, los soportes de silicio se lavan con agua desionizada y se secan con una corriente de nitrógeno.

[0163] Los portaobjetos se someten a una incubación dinámica con muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 °C.

[0164] Las muestras purificadas se utilizan generalmente sin dilución (concentración de 1011 partículas/ml) o se pueden diluir 25:1 (25 pl de suero y 1 pl de tampón de incubación concentrado 20X) con Tampón de Incubación (Tris/HCl 0,5 M - pH 7,6, NaCl 1,5 M, 0,2 % de Tween 20.

[0165] Después de la incubación de la muestra, los portaobjetos se someten a un lavado dinámico con tampón de lavado (Tris/HCl 0,05 M pH 9, NaCl 0,25 M, 0,05 % v/v Tween 20), luego con PBS durante 2 minutos y se secaron.

[0166] Después, los portaobjetos se incuban con una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados (Ab CD9, Ab CD63, Ab<c>D81 de Adipogen Lifescience) 1 mg/ml diluido 1:1500 en tampón de incubación (Tris/HCl 0,5 M - pH 7,6, NaCl 1,5 M, 0,2 % de Tween 20). La incubación dinámica con anticuerpos de detección dura 2 horas a temperatura ambiente.

[0167] Los soportes de silicona se someten a un nuevo lavado dinámico con tampón de lavado durante 10 minutos y luego se lavan brevemente con PBS y se secan con corriente de nitrógeno.

[0168] Luego, los portaobjetos se incuban con Cy3-estreptavidina o Cy5 (Alexa Fluor 647) conjugada con estreptavidina 1 mg/ml diluida 1:1500 en tampón de incubación (Tris/HCl 0,5 M - pH 7,6, NaCl 1,5 M, 0,2 % de Tween 20) durante 30 minutos en modo dinámico y en oscuridad.

[0169] Al final, los soportes se lavan en modo dinámico con PBS durante 10 minutos, con agua desionizada y se secan con corriente de nitrógeno.

[0170] La fluorescencia se detecta mediante un escáner de fluorescencia, generalmente se utiliza una potencia láser del 100 % y una ganancia del 200 %. Los resultados se proporcionan como intensidad de fluorescencia de cada punto expresada como datos normalizados mediante la resta del fondo.

[0171] La figura 22 muestra la intensidad de fluorescencia de las VE detectadas al 100 % de la potencia del láser y la ganancia del fotomultiplicador.

[0172] Los péptidos BP capturan VE de las tres muestras analizadas, la señal de fluorescencia en BPn es insignificante, la multivalencia mejora la capacidad de captura de VE.

Ejemplo 3: Captura y análisis de VE aisladas de suero humano y SEC y de suero humano puro mediante hidrogeles modificados con BP

[0173] Recientemente, se desarrolló un hidrogel peptídico blando para aplicaciones en el campo microanalítico utilizando un hidrogelificador peptídico autoensamblable [28]. Esta estrategia produjo una matriz estable y, sin embargo, altamente permeable que permite la difusión controlada de biomoléculas dependiente del tamaño en función de la concentración de monómeros peptídicos. Cabe destacar que, el hidrogel supramolecular se forma rápidamente (<1 h) y espontáneamente a partir de un único monómero peptídico y es compatible con la fabricación de micromatrices debido a sus propiedades viscoelásticas favorables. Adicionalmente, el material exhibe propiedades autoadhesivas sobre superficies de polimetilmetacrilato (PMMA) hidrófobo y portaobjetos de silicona, que se aprovecharon para su integración directa en chips de micromatrices. Para desarrollar este material tan versátil, se usó un tramo de aminoácidos de 13 restos (Ac-YFQQKFQFQFEQQ-conh2, YF-Q11) que forma hidrogeles blandos en un amplio intervalo de concentración micromolar (25-500 uM).

[0174] La permeación del gel a las biomoléculas se evaluó según los pasos operativos típicos de los protocolos de inmunoensayo de micromatrices, utilizando biomoléculas marcadas con fluorescencia. La rápida difusión de biomoléculas de diferentes tamaños estuvo estrictamente ligada a la concentración de YF-Q11, que se puede ajustar para controlar la permeabilidad diferencial de los analitos a través de la matriz. A una concentración de 25 uM de YF-Q11, la difusión libre y completa ocurre en aproximadamente 2 minutos para todas las biomoléculas probadas.

[0175] Dadas estas premisas, se demostró la posibilidad de atrapar VE dentro del hidrogel YF-Q11 modificado con péptidos BP a través de una estrategia de coensamblaje y sondearlos con sondas de afinidad selectivas para VE (anticuerpos antitetraspaninas y sondas de afinidad de péptidos).

[0176] Se disolvieron alícuotas de YF-Q11 recién liofilizado en agua milliQ a una concentración de 500 uM. Luego, la solución resultante se sometió a ultrasonidos durante 5 minutos, se diluyó hasta la concentración deseada y luego se incubó a 40 °C durante 2 horas. Los hidrogeles blandos resultantes se funcionalizaron con BP mediante estrategias de coensamblaje con BP conjugado con YF-Q11 y se usaron para el aislamiento y análisis en micromatrices de VE.

[0177] Los conjugados covalentes de péptidos BP con YF-Q11 se obtuvieron mediante un enfoque de química de clic y se agregaron en una proporción del 10 % en la matriz de hidrogel YF-Q11 durante el paso de preimpresión a 40 °C. El conjugado BP se autoensambló dentro del hidrogel YF-Q11.

[0178] Los hidrogeles funcionalizados con BP se mezclaron con exosomas purificados extraídos de suero humano para obtener una suspensión de vesículas de 5*109 partículas/ml y se colocaron con sciFLEXARRAYER S12 sobre portaobjetos de silicona. Se colocaron hidrogeles de Bp vacíos en portaobjetos como controles negativos.

[0179] Los portaobjetos se lavaron durante 5 minutos en PBS para permitir que los contaminantes permearan fuera de los puntos de hidrogel y luego la micromatriz se incubó con una mezcla de anticuerpos dirigidos contra las tetraspaninas CD9, CD81, CD63 o con péptidos marcados con fluorescencia A8 o EPCAM-p. Las tetraspaninas son marcadores de exosomas conocidos, A8 y EPCAM-p son aptámeros peptídicos que, según la bibliografía, tienen afinidad por las proteínas de membrana VE HSP70, un antígeno de superficie de la célula epitelial, respectivamente. Se puede detectar una respuesta de fluorescencia clara en las VE que contienen manchas de hidrogel, lo que demuestra el atrapamiento y la permeación de las vesículas a las sondas de afinidad fluorescente (Figura 23). En cambio, en los puntos de control vacíos se detectaron señales insignificantes.

[0180] Se repitió el mismo experimento añadiendo a un gel YF-Q11 funcionalizado con BP de 25 uM dos muestras complejas diferentes: un suero sano y un medio de cultivo HCT116 (línea celular de cáncer colorrectal humano) previamente limpiado de restos celulares. Las dos muestras contienen 1,2*1011 y 2,6*109 partículas/ml respectivamente (Figura 24), según lo caracterizado por NTA (Análisis de Seguimiento de Nanopartículas). Se añadieron muestras sin diluir o diluidas en una proporción fija de 1:30 v/v al hidrogel, se detectaron, se lavaron durante 5 minutos para permitir que los contaminantes se difundieran y se incubaron con anticuerpos dirigidos contra las tetraspaninas CD9, CD81, CD63 o con péptidos marcados con fluorescencia A8 o EPCAM-p. Nuevamente, los resultados destacaron claramente una diferencia significativa entre los controles que contenían muestra y los controles vacíos, reforzando los datos previos obtenidos con VE purificadas (Figura 24).

REFERENCIAS CITADAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una sonda molecular que comprende al menos una primera fracción y al menos una segunda fracción que están cada una unidas covalentemente a la sonda molecular, en donde:

el al menos un grupo de unión al soporte está unido al al menos un soporte; y

el péptido o peptidomimético deriva de un péptido o dominio proteico que detecta la curvatura de la membrana, en donde el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina, MARCKS, sinaptotagmina, arfgapl, sinapsina (I) o endofilina.

2. La sonda de la reivindicación 1, en donde el péptido o peptidomimético está unido a la al menos una membrana de vesícula extracelular.

3. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la vesícula extracelular es un exosoma, una microvesícula, una nanovesícula o microvesícula lipídica sintética.

4. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el péptido o peptidomimético deriva de bradiquinina.

5. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la primera fracción comprende el péptido y el péptido es un péptido catiónico.

6. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el péptido o peptidomimético es lineal, ramificado, cíclico, tándem, multimérico, multidominio o multivalente.

7. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el péptido o peptidomimético es dimérico.

8. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el grupo de unión al soporte comprende azida, alquino, tiol, alqueno, amina, ácido carboxílico, aldehído o maleimida.

9. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el grupo de unión al soporte comprende propargilo.

10. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la sonda comprende además al menos una tercera fracción que está unida covalentemente a la sonda molecular y que es un espaciador entre la primera fracción y la segunda fracción.

11. La sonda de la reivindicación 10, en donde el espaciador es un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos, una fracción orgánica o un espaciador escindible.

12. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en donde el espaciador comprende poli(etilenglicol), lisina o glicina.

13. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la sonda comprende además al menos una cuarta fracción que es un marcador, en donde el marcador es un marcador fluorescente.

14. La sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la sonda comprende además al menos una quinta fracción que es una fracción modificadora de la vesícula extracelular y que es una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una secuencia de ADN o ARN.

15. Un kit que comprende la sonda molecular de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.