ES2988838A1 - Method for predicting Crohn's disease patient response to anti-TNF-alpha therapy - Google Patents
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Abstract
Método para predecir la respuesta del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-α basado en los niveles plasmáticos de vinculina junto con el índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI), la inducción con corticosteroides y la resección intestinal.Method to predict the response of Crohn's disease patients to anti-TNF-α therapy based on plasma levels of vinculin together with the Crohn's disease activity index (CDAI), corticosteroid induction and bowel resection.
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Método para predecir la respuesta del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF- aMethod for predicting the response of Crohn's disease patients to anti-TNF-a therapy
CAMPO DE LA INVENCIÓNFIELD OF INVENTION
La presente invención se enmarca en el campo de la Medicina, concretamente en el estudio y tratamiento de enfermedades autoinmunes, como la enfermedad de Crohn. La invención se centra en el pronóstico individualizado de la efectividad del tratamiento con los inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa (anti-TNF-a) aplicado en dicha enfermedad. The present invention is framed in the field of Medicine, specifically in the study and treatment of autoimmune diseases, such as Crohn's disease. The invention focuses on the individualized prognosis of the effectiveness of treatment with tumor necrosis factor alpha inhibitors (anti-TNF-a) applied in said disease.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIORSTATE OF THE PRIOR ART
La enfermedad de Crohn (EC) es una enfermedad intestinal inflamatoria crónica (EII) que resulta de una respuesta inmunitaria anormal a los microbios entéricos en individuos genéticamente predispuestos, y puede afectar a cualquier localización del tracto gastrointestinal. Crohn's disease (CD) is a chronic inflammatory bowel disease (IBD) that results from an abnormal immune response to enteric microbes in genetically predisposed individuals, and can affect any location of the gastrointestinal tract.
La terapia clásica contra la EC consiste en distintas combinaciones de corticosteroides, agentes inmunosupresores y, en algunos casos, cirugía. Sin embargo, en los últimos años se han desarrollado nuevos fármacos biológicos. Entre ellos destacan los inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa o anti-TNF-a, también llamados "anti-TNF-a” que corresponde a las siglas en inglés de "Tumoral Necrosis Factor alpha”. Algunos de estos compuestos, como infliximab, adalimumab y biosimilares, se han convertido en una modalidad terapéutica primordial en la EC [1,2]. Classical therapy for CD consists of various combinations of corticosteroids, immunosuppressive agents, and in some cases surgery. However, in recent years, new biological drugs have been developed. Among them, the most notable are tumor necrosis factor alpha inhibitors or anti-TNF-a, also called "anti-TNF-a" which corresponds to the acronym in English for "Tumor Necrosis Factor alpha". Some of these compounds, such as infliximab, adalimumab, and biosimilars, have become a primary therapeutic modality in CD [1,2].
El anti-TNF-a es una citocina ubicua cuyos niveles en sangre aumentan significativamente durante el proceso inflamatorio que tiene lugar en la EII. Los agentes anti-TNF-a se unen al TNF-a soluble y a su precursor transmembrana, bloqueando así la interacción entre el TNF-a y los receptores TNF tipo 1 y 2, y la subsiguiente señalización celular proinflamatoria. El uso de agentes anti-TNF favorece la cicatrización de la mucosa, evita la necesidad de corticoides y reduce la necesidad de cirugía y hospitalizaciones, mejorando así la calidad de vida de los pacientes con EII [3]. Sin embargo, su eficacia en pacientes con EC es heterogénea. La falta de respuesta primaria al tratamiento anti-TNF-a se produce en hasta el 40% de los pacientes con EII en ensayos randomizados, y en el 10-20% de los pacientes en series reales. La pérdida de respuesta secundaria también es frecuente en pacientes con EC, con una incidencia que oscila entre el 23% y el 46% a los 12 meses del inicio del tratamiento anti-TNF-a [4,5]. Además, el uso crónico de inhibidores del TNF-a es caro y conlleva un riesgo significativo de infecciones, acontecimientos autoinmunitarios paradójicos, trastornos linfoproliferativos, enfermedades desmielinizantes y cardiopatías [2]. Anti-TNF-a is a ubiquitous cytokine whose blood levels increase significantly during the inflammatory process taking place in IBD. Anti-TNF-a agents bind to soluble TNF-a and its transmembrane precursor, thus blocking the interaction between TNF-a and TNF type 1 and 2 receptors, and the subsequent proinflammatory cell signaling. The use of anti-TNF agents promotes mucosal healing, avoids the need for corticosteroids, and reduces the need for surgery and hospitalizations, thus improving the quality of life of patients with IBD [3]. However, its efficacy in patients with CD is heterogeneous. Primary lack of response to anti-TNF-a treatment occurs in up to 40% of patients with IBD in randomized trials, and in 10-20% of patients in real-world series. Secondary loss of response is also common in patients with CD, with an incidence ranging from 23% to 46% at 12 months after initiation of anti-TNF-a therapy [4,5]. Furthermore, chronic use of TNF-a inhibitors is expensive and carries a significant risk of infections, paradoxical autoimmune events, lymphoproliferative disorders, demyelinating diseases, and heart disease [2].
La identificación de predictores no invasivos de respuesta a la terapia anti-TNF-a permitiría una prescripción más eficiente de estos fármacos, optimizando así las indicaciones y minimizando los efectos secundarios y los costes. Esto resulta especialmente atractivo en la EC dada la disponibilidad de otras terapias biológicas dirigidas a diferentes vías moleculares (por ejemplo, la integrina anti-a4p7, la subunidad anti-p40 de la interleucina-12 y la interleucina-23). The identification of noninvasive predictors of response to anti-TNF-a therapy would allow for more efficient prescription of these drugs, thus optimizing indications and minimizing side effects and costs. This is particularly attractive in CD given the availability of other biological therapies targeting different molecular pathways (e.g., anti-a4p7 integrin, anti-p40 subunit of interleukin-12, and interleukin-23).
Varios estudios han tratado de identificar biomarcadores fiables de respuesta a los agentes anti-TNF-a, la mayoría de ellos centrados en la farmacogenómica. Se han identificado variaciones genéticas relacionadas con el receptor Fc, la apoptosis, la señalización del TNF y la autofagia. Otros estudios se han centrado en la abundancia de ARNm en sangre periférica y tejido intestinal, en el análisis de la microbiota o en marcadores proteicos [6]. Sin embargo, ninguno de ellos era lo suficientemente preciso como para aplicarlo en la práctica clínica habitual. Several studies have attempted to identify reliable biomarkers of response to anti-TNF-a agents, most of them focusing on pharmacogenomics. Genetic variations related to the Fc receptor, apoptosis, TNF signaling and autophagy have been identified. Other studies have focused on mRNA abundance in peripheral blood and intestinal tissue, microbiota analysis or protein markers [6]. However, none of them were sufficiently accurate to be applied in routine clinical practice.
La proteómica ha demostrado su utilidad en el descubrimiento de biomarcadores relacionados con la EII. Sin embargo, hasta ahora ningún estudio ha encontrado predictores proteómicos definitivos de la respuesta primaria a los agentes anti-TNF-a en la EC [7]. Proteomics has demonstrated its utility in the discovery of IBD-related biomarkers. However, so far no study has found definitive proteomic predictors of primary response to anti-TNF-a agents in CD [7].
La adquisición secuencial en ventana de todos los espectros de masas teóricos(Sequential Window Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectrao "SWATH” por sus siglas en inglés) es uno de los enfoques más prometedores en proteómica. Consiste en utilizar la información disponible en las bibliotecas espectrales de iones fragmento para extraer los mapas completos de iones fragmento generados mediante un método de adquisición de espectrometría de masas independiente de los datos [8]. Sequential Window Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectra (SWATH) is one of the most promising approaches in proteomics. It consists of using the information available in fragment ion spectral libraries to extract complete fragment ion maps generated by a data-independent mass spectrometry acquisition method [8].
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención se centra en identificar biomarcadores fiables para predecirla respuesta el tratamiento con fármacos anti-TNF-aen pacientes con EC. The present invention focuses on identifying reliable biomarkers to predict the response to treatment with anti-TNF-a drugs in patients with CD.
Para ello se haya hecho usode las técnicas de proteómica SWATH. For this purpose, SWATH proteomic techniques have been used.
Se clasificaron 113 pacientes con EC según su respuesta clínica a las 12 semanas de tratamiento con anti-TNF-a comoRemisión a Corto Plazo (RCP) o No Remisión a Corto Plazo (NRCP). Se compararon los perfiles de expresión proteica de las muestras de plasma en un subconjunto de pacientes de ambos grupos antes de la terapia anti-TNF-a mediante proteómica SWATH. One hundred and eleventy-three patients with CD were classified according to their clinical response after 12 weeks of anti-TNF-a treatment as Short-Term Remission (STR) or Short-Term Non-Remission (SNR). Protein expression profiles of plasma samples in a subset of patients from both groups were compared before anti-TNF-a therapy using SWATH proteomics.
Se identificaron18 proteínas plasmáticas expresadas de forma diferencial(p<0,01,fold change>2,4) implicadas en la organización del citoesqueleto y la unión celular, la hemostasia/función plaquetaria, el metabolismo de los hidratos de carbono y la respuesta inmunitaria como biomarcadores candidatos de la RCP. 18 differentially expressed plasma proteins (p<0.01, fold change>2.4) involved in cytoskeletal organization and cell junction, hemostasis/platelet function, carbohydrate metabolism, and immune response were identified as candidate biomarkers of CPR.
Debe tenerse en cuenta que el citoesqueleto ejerce funciones reguladoras clave en el mantenimiento de las barreras celulares mediante adhesiones célula-célula y célula-matriz, y que la integridad del citoesqueleto es primordial para mantener la integridad de la barrera epitelial del tracto gastrointestinal, una de las primeras barreras físicas contra factores externos, incluido el microbioma intestinal aberrante. It should be noted that the cytoskeleton exerts key regulatory functions in maintaining cellular barriers through cell-cell and cell-matrix adhesions, and that the integrity of the cytoskeleton is paramount to maintaining the integrity of the epithelial barrier of the gastrointestinal tract, one of the first physical barriers against external factors, including the aberrant intestinal microbiome.
Entre las18 proteínas plasmáticas expresadas de forma diferencialpodemos encontrar: Among the 18 differentially expressed plasma proteins we can find:
COF1, un importante factor de actina-polimerización que controla la apertura de las uniones estrechas en la barrera epitelial;1433Z,una proteína de unión a cadherinas que interviene en la adhesión entre células;VINCo vinculina, una proteína de unión a filamentos de actina que, al igual queRSU1, se colocaliza en las adhesiones focales y participa en la adhesión célula-matriz;GDIR2,cuyo aumento regula la reorganización del citoesqueleto de actina; COF1, a major actin polymerization factor that controls the opening of tight junctions in the epithelial barrier;1433Z, a cadherin-binding protein involved in cell-cell adhesion;VINCo vinculin, an actin filament-binding protein that, likeRSU1, colocalizes at focal adhesions and is involved in cell-matrix adhesion;GDIR2, up-regulation of which regulates actin cytoskeletal reorganization;
SDPR,una proteína implicada en la transducción de señales que se ha asociado físicamente con PLEK en las plaquetas;ACTN1yMOES,que asocian indirectamente a PLEK con la actina;PLEK,asociada a la polimerización de actina y a procesos relacionados como la reorganización del citoesqueleto, la agregación plaquetaria, la secreción de gránulos o la diseminación celular;SDPRy MOES,que participan en diferentes procesos relacionados con la reorganización del citoesqueleto y la biología de las plaquetas, como la endocitosis, la adhesión, la locomoción y la señalización;S10A4,proteína relacionada con el citoesqueleto que se amplifica en un microambiente inflamatorio;GDIB,asociada con la reducción de la inflamación en el microambiente tumoral y la supresión de metástasis; SDPR, a protein involved in signal transduction that has been physically associated with PLEK in platelets;ACTN1andMOES, which indirectly associate PLEK with actin;PLEK, associated with actin polymerization and related processes such as cytoskeletal reorganization, platelet aggregation, granule secretion, or cell spreading;SDPRand MOES, which are involved in different processes related to cytoskeletal reorganization and platelet biology such as endocytosis, adhesion, locomotion, and signaling;S10A4, a cytoskeleton-related protein that is amplified in an inflammatory microenvironment;GDIB, associated with reduced inflammation in the tumor microenvironment and suppression of metastasis;
GSTO-1,que interviene en la respuesta inflamatoria.La al-alfa-enolasa;ENOA,enzima multifuncional implicada en muchas enfermedades, incluidos los trastornos inflamatorios; GSTO-1, which is involved in the inflammatory response.Alpha-enolase;ENOA, a multifunctional enzyme involved in many diseases, including inflammatory disorders;
ALDOAyTPIS,proteínas relacionadas con la glucólisis;TAGL2, ZYX y PDLI1.ALDOA and TPIS, glycolysis-related proteins; TAGL2, ZYX and PDLI1.
De entre las 18 proteínas plasmáticas expresadas de forma diferencial anteriormente citadas destaca lavinculina (VICN), que resultó ser una de las proteínas más desreguladas (p<0,001), junto con ENOA. La expresión diferencial de vinculina fue posteriormente confirmada por ELISA (p=0,054). Among the 18 differentially expressed plasma proteins mentioned above, vinculin (VICN) stood out as one of the most deregulated proteins (p<0.001), together with ENOA. The differential expression of vinculin was subsequently confirmed by ELISA (p=0.054).
La Vinculina (VINC) es una proteína de membrana-citoesqueletica ubicada en las placas de las adhesiones focales e involucrada en el anclaje de las moléculas de integrina al citoesqueleto de actina. Se han descrito tres isoformas de esta molécula en humanos, siendo su secuencia canónica la compuesta por los 1134 aminoácidos que se indican a continuación comoSEQID NO.1: Vinculin (VINC) is a membrane-cytoskeletal protein located in focal adhesion plaques and involved in anchoring integrin molecules to the actin cytoskeleton. Three isoforms of this molecule have been described in humans, its canonical sequence being composed of the 1134 amino acids indicated below as SEQID NO.1:
MPVFHTRTIESILEPVAQQISHLVIMHEEGEVDGKAIPDLTAPVAAVQAAVSNLVRVGKETVQ TTEDQILKRDMPPAFIKVENACTKLVQAAQMLQSDPYSVPARDYLIDGSRGILSGTSDLLLTF DEAEVRKIIRVCKGILEYLTVAEVVETMEDLVTYTKNLGPGMTKMAKMIDERQQELTHQEHR VMLVNSMNTVKELLPVLISAMKIFVTTKNSKNQGIEEALKNRNFTVEKMSAEINEIIRVLQLTS WDEDAWASKDTEAMKRALASIDSKLNQAKGWLRDPSASPGDAGEQAIRQILDEAGKVGEL CAGKERREILGTCKMLGQMTDQVADLRARGQGSSPVAMQKAQQVSQGLDVLTAKVENAA RKLEAMTNSKQSIAKKIDAAQNWLADPNGGPEGEEQIRGALAEARKIAELCDDPKERDDILR SLGEISALTSKLADLRRQGKGDSPEARALAKQVATALQNLQTKTNRAVANSRPAKAAVHLE GKIEQAQRWIDNPTVDDRGVGQAAIRGLVAEGHRLANVMMGPYRQDLLAKCDRVDQLTAQ LADLAARGEGESPQARALASQLQDSLKDLKARMQEAMTQEVSDVFSDTTTPIKLLAVAATA PPDAPNREEVFDERAANFENHSGKLGATAEKAAAVGTANKSTVEGIQASVKTARELTPQVV SAARILLRNPGNQAAYEHFETMKNQWIDNVEKMTGLVDEAIDTKSLLDASEEAIKKDLDKCK VAMANIQPQMLVAGATSIARRANRILLVAKREVENSEDPKFREAVKAASDELSKTISPMVMD AKAVAGNISDPGLQKSFLDSGYRILGAVAKVREAFQPQEPDFPPPPPDLEQLRLTDELAPPK PPLPEGEVPPPRPPPPEEKDEEFPEQKAGEVINQPMMMAARQLHDEARKWSSKPGIPAAE VGIGVVAEADAADAAGFPVPPDMEDDYEPELLLMPSNQPVNQPILAAAQSLHREATKWSSK GNDIIAAAKRMALLMAEMSRLVRGGSGTKRALIQCAKDIAKASDEVTRLAKEVAKQCTDKRI RTNLLQVCERIPTISTQLKILSTVKATMLGRTNISDEESEQATEMLVHNAQNLMQSVKETVRE AEAASIKIRTDAGFTLRWVRKTPWYQ MPVFHTRTIESILEPVAQQISHLVIMHEEGEVDGKAIPDLTAPVAAVQAAVSNLVRVGKETVQ TTEDQILKRDMPPAFIKVENACTKLVQAAQMLQSDPYSVPARDYLIDGSRGILSGTSDLLLTF DEAEVRKIIRVCKGILEYLTVAEVVETMEDLVTYTKNLGPGMTKMAKMIDERQQELTHQEHR VMLVNSMNTVKELLPVLISAMKIFVTTKNSKNQGIEEALKNRNFTVEKMSAEINEIIRVLQLTS WDEDAWASKDTEAMKRALASIDSKLNQAKGWLRDPSASPGDAGEQAIRQILDEAGKVGEL CAGKERREILGTCKMLGQMTDQVADLRARGQGSSPVAMQKAQQVSQGLDVLTAKVENAA RKLEAMTNSKQSIAKKIDAAQNWLADPNGGPEGEEQIRGALAEARKIAELCDDPKERDDILR SLGEISALTSKLADLRRQGKGDSPEARALAKQVATALQNLQTKTNRAVANSRPAKAAVHLE GKIEQAQRWIDNPTVDDRGVGQAAIRGLVAEGHRLANVMMGPYRQDLLAKCDRVDQLTAQ LADLAARGEGESPQARALASQLQDSLKDLKARMQEAMTQEVSDVFSDTTTPIKLLAVAATA PPDAPNREEVFDERAANFENHSGKLGATAEKAAAAVGTANKSTVEGIQASVKTARELTPQVV SAARILLRNPGNQAAYEHFETMKNQWIDNVEKMTGLVDEAIDTKSLLDASEEAIKKDLDKCK VAMANIQPQMLVAGATSIARRANRILLVAKREVENSEDPKFREAVKAASDELSKTISPMVMD AKAVAGNISDPGLQKSFLDSGYRILGAVAKVREAFQPQEPDFPPPPPDLEQLRLTDELAPPK PPLPEGEVPPPRPPPPEEKDEEFPEQKAGEVINQPMMMAARQLHDEARKWSSKPGIPAAE VGIGVVAEADAADAAGFPVPPDMEDDYEPELLLMPSNQPVNQPILAAAQSLHREATKWSSK GNDIIAAAKRMALLMAEMSRLVRGGSGTKRALIQCAKDIAKASDEVTRLAKEVAKQCTDKRI RTNLLQVCERIPTISTQLKILSTVKATMLGRTNISDEESEQATEMLVHNAQNLMQSVKETVRE AEAASIKIRTDAGFTLRWVRKTPWYQ
La Vinculina (VINC) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1, y que comprendería diversas variantes procedentes de: Vinculin (VINC) is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1, and which would include various variants from:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1, a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), b) nucleic acid molecules whose complementary chain hybridizes with the polynucleotide sequence of a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and/or b) due to the degeneracy of the genetic code,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína vinculina. d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the vinculin protein.
Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) correspondiente al gen VLC, LRG_383, con número NG_008868.1, nombrada como SEQIDNO. 2. Among these nucleic acid molecules is the one collected in the GenBank (NCBI) sequence corresponding to the VLC gene, LRG_383, with number NG_008868.1, named as SEQIDNO. 2.
En el análisis univariante y multivariante se incluyeron como parámetros a considerar como potenciales biomarcadores predictores de la respuesta a la terapia anti-TNF-a: el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn (CDAI), la inducción con corticosteroides y la resección intestinal, los niveles plasmáticos de vinculina y los niveles plasmáticos de ENOA. In the univariate and multivariate analysis, the following parameters were included as potential biomarkers predicting response to anti-TNF-a therapy: Crohn's Disease Activity Index (CDAI), corticosteroid induction and intestinal resection, plasma levels of vinculin and plasma levels of ENOA.
El índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn (CDAI) clasifica a los pacientes en función de la puntuación obtenida a través del siguiente cuestionario: The Crohn's Disease Activity Index (CDAI) classifies patients based on the score obtained through the following questionnaire:
- El paciente informó un patrón de las heces: Número medio de deposiciones líquidas o blandas al día durante siete días (14 puntos por deposición). Con difenoxilato o loperamida para diarrea (30 puntos). - The patient reported a stool pattern: Average number of loose or liquid stools per day for seven days (14 points per stool). With diphenoxylate or loperamide for diarrhea (30 points).
- Calificación de dolor abdominal promedio durante siete días: Nada (0 puntos), Dolor leve (35 puntos), Dolor moderado (70 puntos), Dolor intenso (105 puntos). - Average abdominal pain rating over seven days: None (0 points), Mild pain (35 points), Moderate pain (70 points), Severe pain (105 points).
- Bienestar general cada día durante siete días: Bien (0 puntos), Levemente por debajo de lo normal (49 puntos), Malo (98 puntos), Muy malo (147 puntos), Terrible (196 puntos). - General well-being every day for seven days: Good (0 points), Slightly below normal (49 points), Poor (98 points), Very poor (147 points), Terrible (196 points).
- Complicaciones: Artritis o artralgia (20 puntos), Iritis o uveítis (20 puntos), Eritema nudoso, pioderma gangrenoso o estomatitis aftosa (20 puntos), Fisura anal, fístula o absceso (20 puntos), Otra fístula (20 puntos), Temperatura por encima de los 100 °F (37,8 °C) en la última semana (20 puntos). - Complications: Arthritis or arthralgia (20 points), Iritis or uveitis (20 points), Erythema nodosum, pyoderma gangrenosum, or aphthous stomatitis (20 points), Anal fissure, fistula, or abscess (20 points), Other fistula (20 points), Temperature above 100°F (37.8°C) in the past week (20 points).
- Hallazgo de una masa abdominal: Sin masa (0 puntos), Masa posible (20 puntos), Masa definitiva (50 puntos). - Finding of an abdominal mass: No mass (0 points), Possible mass (20 points), Definite mass (50 points).
- Anemia y cambio de peso: Desviación absoluta del hematocrito del 47% en los hombres o del 42% en las mujeres (6 puntos por desviación porcentual). Desviación porcentual del peso estándar (1 punto por cada porcentaje de desviación). - Anemia and weight change: Absolute deviation of hematocrit of 47% in men or 42% in women (6 points per percentage deviation). Percentage deviation from standard weight (1 point for each percentage deviation).
En función de los resultados obtenidos se clasifica como: Remisión asintomática (0 - 149 puntos), Enfermedad de Crohn activa de forma leve a moderada (150 - 220 puntos), Enfermedad de Crohn activa de forma moderada a grave (221 - 450 puntos) y Enfermedad activa de forma grave a fulminante (451 - 1100 puntos). Based on the results obtained, it is classified as: Asymptomatic remission (0 - 149 points), Mild to moderately active Crohn's disease (150 - 220 points), Moderately to severely active Crohn's disease (221 - 450 points) and Severely to fulminant active disease (451 - 1100 points).
Con inducción con corticosteroides, nos referimos al tratamiento concomitante con corticosteroides, es decir, pacientes a los que simultáneamente se les administra corticosteroides y tratamiento biológico. Suelen ser pacientes con una enfermedad más agresiva. Corticosteroid induction refers to concomitant treatment with corticosteroids, i.e. patients who are simultaneously given corticosteroids and biological therapy. These are usually patients with a more aggressive disease.
Se valoró la capacidad predictiva de la respuesta acorto plazo (12 semanas)medida comoRemisión a Corto Plazo (RCP) o No Remisión a Corto Plazo (NRCP)del Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal (CDAI), la inducción con corticosteroides, la resección intestinal, los niveles plasmáticos de vinculina y de ENOA basales, tanto por separado como en conjunto. The predictive capacity of short-term response (12 weeks) measured as Short-Term Remission (STR) or Short-Term No Remission (SNR) of the baseline Crohn's Disease Activity Index (CDAI), corticosteroid induction, bowel resection, baseline plasma levels of vinculin and ENOA, both separately and together, was assessed.
Tambien se valoró su capacidad predictiva de la respuesta alargo plazo (12 meses)medida comoremisión sostenida (RS), agrupando para ello a los pacientes que inicialmente se detectaban comoNo Remisión a Corto Plazo (NRCP)con los que presentaban a largo plazopérdida de respuesta (PR).Its predictive capacity for long-term response (12 months) measured as sustained remission (SR) was also assessed, grouping patients who were initially detected as Non Short-Term Remission (NSTR) with those who presented long-term loss of response (PR).
A la luz de los resultados obtenidos se proponen a continuación una serie de biomarcadores que permiten la selección de los pacientes con EC candidatos al tratamiento anti-TNF-a, de forma que los fármacos anti-TNF-a se prescriban de forma más segura, eligiendo a aquellos pacientes con mayor probabilidad de respuesta terapéutica. In light of the results obtained, a series of biomarkers are proposed below that allow the selection of patients with CD who are candidates for anti-TNF-a treatment, so that anti-TNF-a drugs are prescribed more safely, choosing those patients with a greater probability of therapeutic response.
Por tanto, unprimer aspectode la invención se refiere al uso delÍndice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal, la inducción con corticosteroides, la resección intestinal previa y los niveles basales de expresión de vinculinaen muestras aisladas de plasma, solos o en cualquiera de sus combinaciones, comobiomarcadoresparapredecir la respuesta del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a.Therefore, a first aspect of the invention relates to the use of baseline Crohn's Disease Activity Index, corticosteroid induction, prior intestinal resection and baseline levels of vinculin expression in isolated plasma samples, alone or in any combination thereof, as biomarkers to predict the response of Crohn's disease patients to anti-TNF-a therapy.
La respuesta a la terapia anti-TNF-a se clasifica como respuestaa corto plazo, aquí definido como12 semanas desde el inicio del tratamiento,o como respuestaa largo plazo, aquí definido como12 meses desde el inicio del tratamiento.Response to anti-TNF-a therapy is classified as short-term response, here defined as 12 weeks from the start of treatment, or as long-term response, here defined as 12 months from the start of treatment.
La respuesta a corto plazo categoriza a los pacientes en aquellos que presentanRemisión a Corto Plazo (RCP) o No Remisión a Corto Plazo (NRCP).Short-term response categorizes patients into those who present Short-Term Remission (STR) or No Short-Term Remission (NTR).
La respuesta a largo plazo categoriza a los pacientes en aquellos que presentanremisión sostenida (RS) o no, grupo que incluye a los pacientes conNo Remisión a Corto Plazo (NRCP)y a los que presentanpérdida de respuesta (PR).Long-term response categorizes patients into those who present sustained remission (SR) or not, a group that includes patients with No Short-Term Remission (NRCP) and those who present loss of response (PR).
Unsegundo aspectode la invención se refiere a un perfil de biomarcadores que comprende Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal y/o la inducción con corticosteroides y/o la resección intestinal previa para predecir la respuesta del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a a corto plazo. A second aspect of the invention relates to a biomarker profile comprising baseline Crohn's Disease Activity Index and/or corticosteroid induction and/or prior bowel resection to predict a Crohn's disease patient's response to short-term anti-TNF-a therapy.
En una realización preferida de este aspecto de la invención el perfil de biomarcadores comprende todos los biomarcadores mencionados de forma simultánea, y más preferiblemente, además comprende los niveles basales de expresión de vinculina en muestras aisladas de plasma. In a preferred embodiment of this aspect of the invention the biomarker profile comprises all the mentioned biomarkers simultaneously, and more preferably, additionally comprises the basal levels of vinculin expression in isolated plasma samples.
Untercer aspectode la invención se refiere al uso de ese perfil de biomarcadores para predecir la respuesta a corto plazo del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a. A third aspect of the invention relates to the use of said biomarker profile to predict the short-term response of the Crohn's disease patient to anti-TNF-a therapy.
Uncuarto aspectode la invención se refiere al método de obtención datos útiles para predecir la respuesta acorto plazodel paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a que comprende obtener el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal y/o determinar si el individuo ha sido sometido a resección intestinal previa y/o determinar si el individuo ha sido sometido a inducción con corticosteroides. A fourth aspect of the invention relates to a method of obtaining data useful for predicting the short-term response of a Crohn's disease patient to anti-TNF-a therapy comprising obtaining a baseline Crohn's Disease Activity Index and/or determining whether the individual has undergone prior bowel resection and/or determining whether the individual has undergone corticosteroid induction.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se obtienen el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal y se determina si el individuo ha sido sometido a resección intestinal previa y a inducción con corticosteroides, y además se miden los niveles basales de expresión de vinculina en muestras previamente aisladas de plasma, para compararlos posteriormente con los valores obtenidos de una muestra de referencia aislada de individuos con Resmisión a Corto Plazo. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the baseline Crohn's Disease Activity Index is obtained and it is determined whether the individual has undergone previous intestinal resection and corticosteroid induction, and in addition the baseline levels of vinculin expression are measured in previously isolated plasma samples, to subsequently compare them with the values obtained from a reference sample isolated from individuals with Short-Term Resmission.
Unquinto aspectode la invención refiere al métodoin vitropara predecir la respuesta a corto plazo del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a que comprende el método de obtención de datos utiles anteriormente descrito, y que además comprende asignar al individuo que presenta un Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal mayor de 150 y/o que ha sido sometido a inducción con corticosteroides y/o que ha sido sometido a resección intestinal previa, al grupo de individuos que presenta No Resmisión a Corto Plazo. A fifth aspect of the invention relates to the in vitro method for predicting the short-term response of a Crohn's disease patient to anti-TNF-a therapy, which comprises the method of obtaining useful data described above, and which also comprises assigning the individual who has a baseline Crohn's Disease Activity Index greater than 150 and/or who has undergone induction with corticosteroids and/or who has undergone prior intestinal resection, to the group of individuals who present No Short-Term Resmission.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se asigna al individuo que presenta los niveles basales de expresión de vinculina disminuidos respecto al valor de referencia de individuos con Remisión a Corto Plazo, un Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn mayor de 150, y que ha sido sometido a inducción con corticosteroides y a resección intestinal previa, al grupo de individuos que presenta No Remisión a Corto Plazo. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the individual who presents the basal levels of vinculin expression decreased with respect to the reference value of individuals with Short-Term Remission, a Crohn's Disease Activity Index greater than 150, and who has undergone induction with corticosteroids and prior intestinal resection, is assigned to the group of individuals who present No Short-Term Remission.
Unsexto aspectode la invención se refiere a un perfil de biomarcadores como biomarcadores para predecir la respuesta a la terapia anti-TNF-a a largo plazo que comprende el índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn y/o la resección intestinal previa. A sixth aspect of the invention relates to a biomarker profile as biomarkers for predicting response to long-term anti-TNF-a therapy comprising Crohn's Disease Activity Index and/or prior bowel resection.
En una realización preferida de este aspecto de la invención el perfil de biomarcadores comprende todos los biomarcadores mencionados de forma simultánea, y además comprende los niveles basales de expresión de vinculina en muestras aisladas de plasma. In a preferred embodiment of this aspect of the invention the biomarker profile comprises all the aforementioned biomarkers simultaneously, and also comprises the basal levels of vinculin expression in isolated plasma samples.
Unséptimo aspectode la invención se refiere al uso de ese perfil de biomarcadores para predecir la respuesta a largo plazo del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a. A seventh aspect of the invention relates to the use of said biomarker profile to predict the long-term response of the Crohn's disease patient to anti-TNF-a therapy.
Unoctavo aspectode la invención se refiere al método de obtención datos útiles para predecir la respuesta alargo plazodel paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a que comprende obtener el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn y/o determinar si el individuo ha sido sometido resección intestinal previa. An eighth aspect of the invention relates to a method of obtaining data useful for predicting the long-term response of a Crohn's disease patient to anti-TNF-a therapy, comprising obtaining a Crohn's Disease Activity Index and/or determining whether the individual has undergone prior intestinal resection.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se obtienen el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal y se determina si el individuo ha sido sometido a resección intestinal previa, y además comprende medir los niveles expresión de vinculina en muestras previamente aisladas de plasma y compararlos con los valores obtenidos de una muestra de referencia aislada de individuos con Respuesta Sostenida. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the baseline Crohn's Disease Activity Index is obtained and it is determined whether the individual has undergone previous intestinal resection, and further comprises measuring the expression levels of vinculin in previously isolated plasma samples and comparing them with the values obtained from a reference sample isolated from individuals with Sustained Response.
Unnoveno aspectode la invención se refiere a un métodoin vitropara predecir la respuesta a largo plazo del paciente de enfermedad de Crohn a la terapia anti-TNF-a que comprende el método de obtención de datos utiles anteriormente descrito, y que además comprende asignar al individuo que presenta un Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn mayor de 150 y/o ha sido sometido a resección intestinal previa, al grupo de individuos que no presenta Respuesta Sostenida. A ninth aspect of the invention relates to an in vitro method for predicting the long-term response of a Crohn's disease patient to anti-TNF-a therapy comprising the method of obtaining useful data described above, and further comprising assigning the individual who has a Crohn's Disease Activity Index greater than 150 and/or has undergone prior intestinal resection, to the group of individuals who do not show a Sustained Response.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se asigna al individuo que presenta un Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn basal mayor de 150 y que ha sido sometido a inducción con corticosteroides y que presenta los niveles de expresión de vinculina disminuidos respecto al valor de referencia de individuos con Respuesta Sostenida, al grupo de individuos que No presenta Respuesta Sostenida. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the individual who has a baseline Crohn's Disease Activity Index greater than 150 and who has undergone induction with corticosteroids and who has decreased levels of vinculin expression compared to the reference value of individuals with Sustained Response, is assigned to the group of individuals who do not present Sustained Response.
En el contexto de la presente invención, los términos "niveles basales” o "valores basales” o CDAI "basal” refieren a las medidas y valores tomados de forma previa a iniciar el tratamiento con anti-TNF-a en pacientes EC. In the context of the present invention, the terms “baseline levels” or “baseline values” or “baseline” CDAI refer to measurements and values taken prior to starting treatment with anti-TNF-a in CD patients.
Una "muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es plasma. An “isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and/or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art. Preferably, the isolated biological sample is plasma.
En el contexto de la presente invención, el término” nivel de expresión” o "niveles de expresión” refiere a la cantidad de proteína en plasma detectada mediante ELISA In the context of the present invention, the term “expression level” or “expression levels” refers to the amount of protein in plasma detected by ELISA.
En el contexto de la presente invención, se entiende por"muestra de referencia" la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de la presente invención. En una realización preferida, el valor de referencia se obtiene de los valores de expresión obtenidos de una muestra con pacientes EC que responden positivamente al tratamiento con anti-TNF-a, bien a corto plazo, es decir, individuos con Resmisión a Corto Plazo, o bien a largo plazo, es decir, individuos con Respuesta Sostenida. In the context of the present invention, the term "reference sample" is understood to mean the sample used to determine the variation in the expression levels of the present invention. In a preferred embodiment, the reference value is obtained from the expression values obtained from a sample with CD patients who respond positively to treatment with anti-TNF-a, either in the short term, i.e. individuals with Short-Term Resmission, or in the long term, i.e. individuals with Sustained Response.
Preferiblemente, se toman muestras de referencia de varios individuos con EC respondedores al tratamiento con anti-TNF-a y se combinan, de modo que el valor de referencia refleje el valor medio de dichas moléculas en la población de individuos respondedores, bien a corto, bien a largo plazo, al tratamiento con anti-TNF-a."Valor de referencia"es el nivel de expresión de vinculina en una muestra de referencia. Preferably, reference samples are taken from several individuals with CD responding to anti-TNF-a treatment and combined, so that the reference value reflects the average value of these molecules in the population of individuals responding, either in the short or long term, to anti-TNF-a treatment. "Reference value" is the level of vinculin expression in a reference sample.
La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión, es decir, la proteína. Esta medida está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN. Dicha señal (a la que también podemos referirnos como señal de intensidad) puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática). The measurement of the amount or concentration of the expression product, preferably in a semi-quantitative or quantitative manner, can be carried out directly or indirectly. Direct measurement refers to the measurement of the amount or concentration of the expression product, i.e. the protein. This measurement is directly correlated with the number of RNA molecules. Such a signal (which can also be referred to as an intensity signal) can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products. Indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (e.g. the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or enzymatic reaction products).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento. The term "quantity" as used in the description refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of the expression products, as well as any other value or parameter related to them or that can be derived from them. Such values or parameters include signal intensity values obtained from any of the physical or chemical properties of said expression products obtained by direct measurement. Additionally, such values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de vinculina de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de vinculina de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. The term "comparison" as used in the description refers to, but is not limited to, the comparison of the amount of vinculin expression products in the biological sample to be analyzed, also called the test biological sample, with an amount of vinculin in one or more desirable reference samples. The reference sample may be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the test biological sample.
En la invención, el método para determinar los niveles basales de expresión de vinculina en las muestras previamente aisladas de plasma no necesita estar particularmente limitado y puede seleccionarse de entre cualquiera de los disponibles en el estado de la técnica. En una realización preferida, se pueden obtener mediante cualquiera de las siguientes técnicas: SWATH, ELISA o inmunoensayo. In the invention, the method for determining the basal levels of vinculin expression in the previously isolated plasma samples need not be particularly limited and can be selected from any of those available in the state of the art. In a preferred embodiment, they can be obtained by any of the following techniques: SWATH, ELISA or immunoassay.
Los niveles de referencia pueden ser determinados mediante la medición de los niveles de expresión, y esos niveles de referencia se pueden ajustar a las poblaciones específicas (por ejemplo, un nivel de referencia puede estar relacionada con la edad, por lo que las comparaciones se puede hacer entre los niveles de expresión en las muestras de los sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para una enfermedad particular, el fenotipo, o falta de ella en un determinado grupo de edad). El experto en la técnica apreciará que el tipo de muestra de referencia puede variar dependiendo del método específico a realizar. Reference levels may be determined by measuring expression levels, and those reference levels may be tailored to specific populations (e.g., a reference level may be age-related, so that comparisons can be made between expression levels in samples from subjects of a certain age and reference levels for a particular disease, phenotype, or lack thereof in a particular age group). One skilled in the art will appreciate that the type of reference sample may vary depending on the specific method being performed.
El perfil de expresión en la muestra de referencia puede ser generado a partir de una población de dos o más personas. La población, por ejemplo, pueden contener 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más personas. The expression profile in the reference sample may be generated from a population of two or more individuals. The population, for example, may contain 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 or more individuals.
Una vez que los niveles de expresión en relación con los valores de referencia se han determinado, es necesario identificar si existen alteraciones en la expresión (aumento o disminución de la expresión). La expresión (y los niveles del producto de expresión del gen) se considera aumentada en una muestra de la materia objeto de estudio cuando los niveles de incremento con respecto a la muestra de referencia son al menos de un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, al menos un 25%, por lo menos 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%, por menos por lo menos 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100%, por lo menos 110 %, por lo menos 120%, por lo menos 130%, por lo menos 140%, por lo menos 150%, o más. Del mismo modo, la expresión se considerada disminuida cuando sus niveles disminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, por lo menos el 25%, al menos un 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%), por lo menos el 65%, por lo menos 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100% (es decir, ausente). Once the expression levels in relation to the reference values have been determined, it is necessary to identify whether there are alterations in expression (increase or decrease in expression). Expression (and levels of the gene expression product) are considered to be increased in a sample of the subject matter when the levels of increase relative to the reference sample are at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, or more. Similarly, expression is considered decreased when its levels decrease with respect to the reference sample by at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%), at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100% (i.e., absent).
En el contexto de la presente invención, los términos "sujeto", "paciente" o "individuo" se usan aquí de manera intercambiable para referirse a todos los animales clasificados como mamíferos e incluyen, entre otros, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano de cualquier sexo, edad o raza. In the context of the present invention, the terms "subject", "patient" or "individual" are used interchangeably herein to refer to all animals classified as mammals and include, but are not limited to, domestic and farm animals, primates and humans, for example, humans, non-human primates, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents. Preferably, the subject is a human of any sex, age or race.
A lo largo de la descripción y reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, complementos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se entenderán en parte a partir de la descripción y en parte a partir de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención. Throughout the description and claims, the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical features, adjuncts, components or steps. To those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will become understood in part from the description and in part from practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration and are not intended to limit the present invention.
Los términos “uno o más" o “al menos un” o “varios”, tal y como se usan en este documento, incluyen uno y la especificación individualizada de cualquier número que sea más de uno, como dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc." The terms “one or more” or “at least one” or “several” as used herein include one and the individualized specification of any number that is more than one, such as two, three, four, five, six, etc.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1:Cuantificación de la concentración plasmática de ENOA y VINC mediante ELISA. El tamaño de la muestra fue de 97 para el grupo de remisión a corto plazo (RCP) y 16 para el grupo sin RCP (NRCP). Figure 1: Quantification of plasma concentration of ENOA and VINC by ELISA. The sample size was 97 for the short-term remission group (SRC) and 16 for the non-SRC group (NRCP).
Figura 2:Comparación de los niveles plasmáticos de VINC mediante ELISA, entre el subgrupo de pacientes con remisión sostenida (RS) y pérdida de respuesta (PR) y con remisión sostenida (RS) y el grupo NRCP. Significación estadística entre grupos (*). ;;Figura 3:La curva ROC mostró que el modelo de regresión construido utilizando los niveles plasmáticos de VINC en combinación con parámetros clínico-patológicos para predecir la respuesta a corto plazo del paciente con EC a la terapia con fármacos anti-TNF ;DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN;;Se realizó un estudio multicéntrico, observacional y prospectivo de pacientes con EC que iniciaron tratamiento anti-TNF-a con infliximab, adalimumab o infliximab biosimilar. La elección del agente anti-TNF-a quedó a discreción del médico responsable y los fármacos se prescribieron de acuerdo con la pauta posológica autorizada. El protocolo del estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios éticos contenidos en la Declaración de Helsinki y el protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Ética Biomédica de Andalucía. Todos los pacientes fueron informados y dieron su consentimiento por escrito para participar. ;;Población de estudio ;Ciento trece pacientes adultos con EC, naive a fármacos anti-TNF-a y con indicación de terapia anti-TNF-a por actividad clínica, endoscópica o radiológica, fueron reclutados en tres hospitales académicos: Hospital Universitario Reina Sofía (Córdoba, España), Hospital Universitario de la Princesa (Madrid, España) y Hospital Universitario de Galdakano (Vizcaya, España). ;;La respuesta terapéutica se evaluó 12 semanas después del inicio del fármaco anti-TNF-a, y los pacientes se clasificaron como pacientes conRemisión a Corto Plazo (RCP)o conNo Remisión a Corto Plazo (NRCP).La respuesta primaria del estudio fue la ausencia de respuesta clínica, evaluada según el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn (CDAI) en la enfermedad luminal, y según la Evaluación del Drenaje de la Fístula en la enfermedad perianal. Los criterios para considerar la ausencia de respuesta fueron CDAI>150; actividad endoscópica o radiológica; drenaje purulento tras una compresión suave con el dedo; nueva fístula; aumento de la dosis; cambio a un fármaco diferente; adición de otros inmunosupresores; cirugía o dilatación endoscópica. ;;Los pacientes con Remisión a Corto Plazo (RCP) se estratificaron además en pacientes conremisión sostenida (RS) y pacientes conpérdida de respuesta (PR)tras 12 meses de tratamiento. ;;Muestras de plasma ;;Las muestras de plasma se recogieron en los 2 días anteriores a la primera dosis del agente anti-TNF-a en tubos EDTA-K3 de 9 ml (K3E VACUETTE®, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria). Todas las muestras se centrifugaron en la primera hora tras la recogida, a 3.000 rpm y 4°C durante 10 min. El plasma se recuperó inmediatamente y se almacenó a -80°C hasta su análisis. ;;Preparación de la muestra para el análisis cromatografía de líquidos - espectrometría de masas (LC-MS) ;;El análisis proteómico se realizó en un subconjunto de 20 pacientes seleccionados aleatoriamente y clasificados según el resultado primario del estudio como pacientes RCP (n=16; 8 RS y 8 PR) o pacientes NRCP (n=4). ;;Las 14 proteínas más abundantes en la sangre se depletaron utilizando el kit Hu-14 Multiple Affinity Removal System (Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas no deplecionadas se concentraron utilizando concentradores de centrifugación de corte de 5.000 pesos moleculares (Agilent Technologies). A continuación, las muestras se limpiaron para eliminar cualquier contaminante mediante precipitación de proteínas con TCA/acetona, y se solubilizaron en 50 ^l de RapiGest SF al 0,2% (Waters, Mil-ford, MA, EE.UU.) en bicarbonato amónico 50 mM. El contenido total de proteínas se midió utilizando el kit Qubit Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y 50 ^g de proteínas se digirieron con tripsina siguiendo un protocolo adaptado de Vowinckelet al.Brevemente, las muestras de proteína se incubaron con 5 mM de ditiotreitol a 60°C durante 30 min y después con 10 mM de yodoacetamida a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 min. Se añadió tripsina modificada de grado de secuenciación (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en una proporción de 1:40 tripsina: proteína y se incubó a 37°C durante 2 horas; se volvió a añadir la misma cantidad de tripsina y se incubó a 37°C durante otras 15 horas. A continuación, RapiGest se precipitó por centrifugación tras incubar con ácido trifluoroacético al 0,5% a 37°C durante 1 hora. El volumen final se ajustó con agua mili-Q y acetonitrilo hasta una concentración final de 0,5 ^g de péptido/^L, 2,25% de acetonitrilo y 0,2% de ácido trifluoroacético. ;;Creación de la biblioteca espectral ;;Para crear las bibliotecas espectrales MS/MS, las soluciones peptídicas se analizaron mediante un enfoqueshotgunde adquisición dependiente de datos (DDA) utilizando nano-LC-MS/MS. Para obtener una buena representación de los péptidos y proteínas presentes en las 20 muestras, se prepararon viales agrupados, que consistían en mezclas equivalentes de las muestras originales. Se separó un ^g de cada muestra agrupada (2 ^L) en un sistema nano-LC Ekspert nLC415 (Eksigent, Dublín, CA, EE.UU.) utilizando una columna Acclaim PepMap C18 (75 ^m x 25 cm, 3 ^m, 100 Á) (Thermo Fisher Scientific) a un caudal de 300 nl/min. Como disolventes A y B se utilizaron agua y acetonitrilo, ambos con un contenido de ácido fórmico del 0,1%, respectivamente. El gradiente fue del 5% al 30% de B durante 120 minutos, 10 minutos al 90% de B y, por último, 20 minutos al 5% de B para equilibrar la columna, con un tiempo total de 150 minutos. ;;Una vez eluidos los péptidos, se inyectaron directamente en un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-TOF Triple TOF 5600+ (Sciex, Redwood City, CA, EE.UU.), operado con un sistema de adquisición dependiente de datos "top 65" en modo de iones positivos. Se utilizó una fuente ESI NanoSpray III (Sciex) para la interfaz entre nLC y MS, con una aplicación de voltaje de 2.600 V. El modo de adquisición consistió en un barrido MS de sondeo de 250 ms de 350 a 1.250 m/z, seguido de un barrido MS/MS de 230 a 1.700 m/z (tiempo de adquisición de 60 ms, energía de colisión rodante) de los 65 iones precursores superiores del barrido de sondeo, para un tiempo de ciclo total de 4,2 s. La fragmentación de los iones precursores en el barrido de sondeo de 250 ms se realizó en un tiempo de ciclo de 4,2 s. El tiempo de ciclo total fue de 1,5 s. A continuación, los precursores fragmentados se añadieron a una lista de exclusión dinámica durante 15 s. Todos los iones con carga única se excluyeron del análisis MS/MS. ;;Las identificaciones de péptidos y proteínas se realizaron utilizando el software Protein Pilot (versión 5.0.1, Sciex) con una base de datos humana Swiss-Prot concatenated targetreverse decoy (descargada en marzo de 2016), que contiene 20.200 secuencias de proteínas diana, especificando yodoacetamida como alquilación de Cys. La tasa de falsos descubrimientos (FDR) se fijó en 0,01 tanto para los péptidos como para las proteínas. A continuación, se utilizaron los espectros MS/MS de los péptidos identificados para generar la biblioteca espectral para la extracción de picos SWATH utilizando el complemento para el software PeakView (versión 2.1, Sciex) MS/MSALL with SWATH Acquisition MicroApp (versión 2.0, Sciex). Los péptidos con una puntuación de confianza superior al 99% (obtenida a partir de la búsqueda en la base de datos Protein Pilot) se incluyeron en la biblioteca espectral. ;;Cuantificación relativa mediante adquisición SWATH ;;Las muestras individuales se analizaron utilizando un método de Adquisición Independiente de Datos (DIA). Cada muestra (2 ^L) se analizó utilizando el equipo LC-MS y el gradiente LC descritos anteriormente para construir la biblioteca espectral en lugar de utilizar el método de adquisición SWATH-MS. El método consistió en repetir un ciclo con 60 barridos TOF MS/MS (300 a 1.600 m/z, modo de alta sensibilidad, tiempo de adquisición de 90 ms) de ventanas secuenciales de aislamiento de precursores solapadas de anchura variable (solapamiento de 1 m/z) que cubrían el intervalo de masas de 350 a 1.250 m/z con un barrido TOF MS previo (350 a 1.250 m/z, tiempo de adquisición de 50 ms) para cada ciclo. La duración total del ciclo fue de 5,5 s. La anchura de las 60 ventanas variables se optimizó en función de la densidad de iones encontrada en los análisis DDA previos utilizando una hoja de cálculo de ventanas variables SWATH de Sciex. ;;Análisis de datos SWATH ;;La extracción selectiva de datos de las trazas de cromatogramas de iones fragmento de las series SWATH se realizó con PeakView (versión 2.1) utilizando la microaplicación MS/MSALL con SWATH Acquisition (versión 2.0). Esta aplicación procesó los datos utilizando la biblioteca espectral creada a partir de los datosshotgun.Se seleccionaron hasta 10 péptidos por proteína y 12 fragmentos por péptido, basándose en la intensidad de la señal; los péptidos compartidos y modificados se excluyeron del procesamiento. Se utilizaron ventanas de diez minutos y anchuras de 20 ppm para extraer los cromatogramas de iones; se intentó la cuantificación SWATH para todas las proteínas de la biblioteca de iones que fueron identificadas por ProteinPilot con un FDR inferior al 1%. Los tiempos de retención de los péptidos que se seleccionaron para cada proteína se realinearon en cada corrida de acuerdo con 118 péptidos endógenos de la Apolipoproteína B-100, eluidos a lo largo de todo el eje temporal. A continuación, se generaron los cromatogramas de iones extraídos para cada ion fragmento seleccionado; las áreas de pico de los péptidos se obtuvieron sumando las áreas de pico de los iones fragmento correspondientes. PeakView calculó un FDR y una puntuación para cada péptido asignado según los componentes cromatográficos y espectrales; sólo los péptidos con un FDR inferior al 1% se utilizaron para la cuantificación de proteínas. La cuantificación de proteínas se calculó sumando las áreas de pico de los péptidos correspondientes. Se utilizó MarkerView (versión 1.2.1, Sciex) para la normalización de la señal; la abundancia diferencial se comprobó aplicando la prueba T a nivel de proteína, utilizando SPSS versión 25.0 (IBM, Chicago, IL, EE.UU.). ;;Análisis de rutas funcionales ;;Las rutas funcionales de los biomarcadores candidatos identificados se analizaron mediante DAVID Bioinformatics Resources 6.7. ;;Ensayo inmunoenzimático ;;Se utilizó la prueba ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para cuantificar la concentración proteica de alfa-enolasa humana (ENOA) (Abnova, Taipei, Taiwán) y vinculina (VINC) (Antibodies-online, Aachen, Alemania) en muestras de plasma de 113 pacientes (97 RCP y 16 NRCP). El ensayo se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante y los datos obtenidos se utilizaron para validar los resultados de la proteómica. ;;Análisis estadístico ;;Las variables categóricas se presentaron en tablas de frecuencias, mientras que las continuas se expresaron como media y desviación estándar o como mediana y rango intercuartílico (RIQ) para las que presentaban una distribución asimétrica. Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para comprobar la normalidad de la distribución. Se utilizó la prueba de Chi cuadrado para las frecuencias, la prueba T de Student o ANOVA para las variables cuantitativas con distribución normal, y la prueba U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis para las distribuciones asimétricas. Un valor p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis se realizaron con el programa SPSS versión 25.0. ;;Estudio descriptivo y predictores clínicos de remisión a corto plazo;;Ciento trece pacientes fueron analizados clínicamente para determinar su respuesta clínica a corto plazo al tratamiento anti-TNF-a. De ellos, el 85,8% de los pacientes presentaron RCP y el 14,2% NRCPS. LaTabla 1muestra las características basales de los pacientes según la respuesta clínica al tratamiento. ;;Tabla 1.Relación entre las características demográficas y clínicas y la respuesta de los pacientes al tratamiento anti-TNF-a. Análisis univariante para pacientes con remisión a corto plazo (RCP) y pacientes sin RCP (NRCP). ;; ; ; ;;; * IMC: índice de masa corporal; CDAI: índice de actividad de la enfermedad de Crohn; CMB: leucocitos; PCR: proteína C reactiva; VSG: velocidad de sedimentación globular; ENOA: alfa-enolasa; VINC: vinculina; RM: razón de momios, razón de oportunidades o razón de probabilidades; IC: intervalo de confianza. Figure 2:Comparison of VINC plasma levels by ELISA between the subgroup of patients with sustained remission (SR) and loss of response (PR) and with sustained remission (RS) and the NRCP group. Statistical significance between groups (*). ;;Figure 3:The ROC curve showed that the regression model built using VINC plasma levels in combination with clinicopathological parameters to predict the short-term response of CD patients to anti-TNF drug therapy ;DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION;;A multicenter, observational, prospective study was conducted in CD patients who started anti-TNF-a treatment with infliximab, adalimumab or biosimilar infliximab. The choice of anti-TNF-a agent was at the discretion of the treating physician and drugs were prescribed according to the approved dosing regimen. The study protocol was carried out in accordance with the ethical principles contained in the Declaration of Helsinki and the research protocol was approved by the Biomedical Ethics Committee of Andalusia. All patients were informed and gave their written consent to participate. ;;Study population ;One hundred and thirteen adult patients with CD, naive to anti-TNF-a drugs and with an indication for anti-TNF-a therapy due to clinical, endoscopic or radiological activity, were recruited in three academic hospitals: Hospital Universitario Reina Sofía (Córdoba, Spain), Hospital Universitario de la Princesa (Madrid, Spain) and Hospital Universitario de Galdakano (Vizcaya, Spain). ;;Therapeutic response was assessed 12 weeks after initiation of anti-TNF-a drug, and patients were classified as having Short-Term Remission (STR) or No Short-Term Remission (NRTR). The primary response in the study was absence of clinical response, as assessed by the Crohn's Disease Activity Index (CDAI) in luminal disease and by the Fistula Drainage Assessment (FDA) in perianal disease. Criteria for absence of response were CDAI>150; endoscopic or radiological activity; purulent drainage upon gentle finger compression; new fistula; dose increase; change to a different drug; addition of other immunosuppressants; surgery or endoscopic dilatation. ;;Patients with Short-Term Remission (STR) were further stratified into patients with sustained remission (SR) and patients with loss of response (PR) after 12 months of treatment. ;;Plasma samples ;;Plasma samples were collected within 2 days prior to the first dose of anti-TNF-a agent into 9 mL EDTA-K3 tubes (K3E VACUETTE®, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria). All samples were centrifuged within 1 hour after collection at 3,000 rpm and 4°C for 10 min. Plasma was recovered immediately and stored at -80°C until analysis. ;;Sample preparation for analysis Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) ;;Proteomic analysis was performed in a subset of 20 randomly selected patients classified according to the primary outcome of the study as either RCP patients (n=16; 8 RS and 8 PR) or NRCP patients (n=4). ;;The 14 most abundant proteins in blood were depleted using the Hu-14 Multiple Affinity Removal System kit (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) following the manufacturer's instructions. Non-depleted proteins were concentrated using 5,000 molecular weight cut-off centrifugation concentrators (Agilent Technologies). Samples were then cleaned to remove any contaminants by TCA/acetone protein precipitation and solubilized in 50 µl of 0.2% RapiGest SF (Waters, Mil-ford, MA, USA) in 50 mM ammonium bicarbonate. Total protein content was measured using the Qubit Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and 50 µg of proteins were digested with trypsin following a protocol adapted from Vowincke et al. Briefly, protein samples were incubated with 5 mM dithiothreitol at 60°C for 30 min and then with 10 mM iodoacetamide at room temperature in the dark for 30 min. Modified sequencing grade trypsin (Promega, Madison, WI, USA) was added at a ratio of 1:40 trypsin:protein and incubated at 37°C for 2 h; the same amount of trypsin was added again and incubated at 37°C for another 15 h. RapiGest was then precipitated by centrifugation after incubation with 0.5% trifluoroacetic acid at 37°C for 1 h. The final volume was adjusted with milli-Q water and acetonitrile to a final concentration of 0.5 ^g peptide/^L, 2.25% acetonitrile, and 0.2% trifluoroacetic acid. ;;Spectral library creation ;;To create the MS/MS spectral libraries, the peptide solutions were analyzed by a shotgun data-dependent acquisition (DDA) approach using nano-LC-MS/MS. To obtain a good representation of the peptides and proteins present in the 20 samples, pooled vials, consisting of equivalent mixtures of the original samples, were prepared. One ^g of each pooled sample (2 ^L) was separated on an Ekspert nLC415 nano-LC system (Eksigent, Dublin, CA, USA) using an Acclaim PepMap C18 column (75 ^m x 25 cm, 3 ^m, 100 Å) (Thermo Fisher Scientific) at a flow rate of 300 nL/min. Water and acetonitrile, both containing 0.1% formic acid, respectively, were used as solvents A and B. The gradient was from 5% to 30% B over 120 min, 10 min to 90% B, and finally 20 min to equilibrate the column at 5% B, for a total time of 150 min. ;;Once the peptides were eluted, they were directly injected into a Triple TOF 5600+ hybrid quadrupole-TOF mass spectrometer (Sciex, Redwood City, CA, USA), operated with a "top 65" data-dependent acquisition system in positive ion mode. A NanoSpray III ESI source (Sciex) was used for the interface between nLC and MS, with an applied voltage of 2,600 V. The acquisition mode consisted of a 250 ms probing MS scan from 350 to 1,250 m/z, followed by a MS/MS scan from 230 to 1,700 m/z (60 ms acquisition time, rolling collision energy) of the top 65 precursor ions from the probing scan, for a total cycle time of 4.2 s. Fragmentation of precursor ions in the 250 ms probing scan was performed in a cycle time of 4.2 s. The total cycle time was 1.5 s. Fragmented precursors were then added to a dynamic exclusion list for 15 s. All singly charged ions were excluded from MS/MS analysis. ;;Peptide and protein identifications were performed using Protein Pilot software (version 5.0.1, Sciex) with a Swiss-Prot concatenated targetreverse decoy human database (downloaded March 2016), containing 20,200 target protein sequences, specifying iodoacetamide as Cys alkylation. The false discovery rate (FDR) was set at 0.01 for both peptides and proteins. The MS/MS spectra of the identified peptides were then used to generate the spectral library for SWATH peak extraction using the MS/MSALL with SWATH Acquisition MicroApp (version 2.0, Sciex) plug-in for PeakView software (version 2.1, Sciex). Peptides with a confidence score greater than 99% (obtained from searching the Protein Pilot database) were included in the spectral library. ;;Relative quantitation by SWATH acquisition ;;Individual samples were analyzed using a Data Independent Acquisition (DIA) method. Each sample (2 ^L) was analyzed using the LC-MS equipment and LC gradient described above to construct the spectral library instead of using the SWATH-MS acquisition method. The method consisted of repeating a run with 60 TOF MS/MS scans (300 to 1600 m/z, high sensitivity mode, 90 ms acquisition time) of sequential overlapping precursor isolation windows of varying width (1 m/z overlap) covering the mass range 350 to 1250 m/z with a previous TOF MS scan (350 to 1250 m/z, 50 ms acquisition time) for each run. The total run time was 5.5 s. The width of the 60 variable windows was optimized based on the ion density found in previous DDA analyses using a Sciex SWATH variable window spreadsheet. ;;SWATH data analysis;;Selective data extraction from fragment ion chromatogram traces of SWATH series was performed with PeakView (version 2.1) using the MS/MSALL microapplication with SWATH Acquisition (version 2.0). This application processed the data using the spectral library created from the shotgun data. Up to 10 peptides per protein and 12 fragments per peptide were selected based on signal intensity; shared and modified peptides were excluded from processing. Ten-minute windows and 20 ppm widths were used to extract ion chromatograms; SWATH quantitation was attempted for all proteins in the ion library that were identified by ProteinPilot with an FDR less than 1%. The retention times of the peptides that were selected for each protein were realigned in each run according to 118 endogenous Apolipoprotein B-100 peptides eluted along the entire time axis. Extracted ion chromatograms were then generated for each selected fragment ion; the peak areas of the peptides were obtained by summing the peak areas of the corresponding fragment ions. PeakView calculated an FDR and score for each assigned peptide based on the chromatographic and spectral components; only peptides with an FDR less than 1% were used for protein quantification. Protein quantification was calculated by summing the peak areas of the corresponding peptides. MarkerView (version 1.2.1, Sciex) was used for signal normalization; Differential abundance was checked by applying the T-test at the protein level, using SPSS version 25.0 (IBM, Chicago, IL, USA). ;;Functional pathway analysis ;;The functional pathways of the identified candidate biomarkers were analyzed using DAVID Bioinformatics Resources 6.7. ;;Enzyme-linked immunosorbent assay ;;The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was used to quantify the protein concentration of human alpha-enolase (ENOA) (Abnova, Taipei, Taiwan) and vinculin (VINC) (Antibodies-online, Aachen, Germany) in plasma samples from 113 patients (97 RCP and 16 NRCP). The assay was performed following the manufacturer's instructions and the data obtained were used to validate the proteomics results. ;;Statistical analysis ;;Categorical variables were presented in frequency tables, while continuous variables were expressed as mean and standard deviation or as median and interquartile range (IQR) for those with an asymmetric distribution. The Kolmogorov-Smirnov test was used to check the normality of the distribution. The Chi-square test was used for frequencies, the Student t test or ANOVA for quantitative variables with normal distribution, and the Mann-Whitney U test or Kruskal-Wallis for asymmetric distributions. A p value less than 0.05 was considered statistically significant. All analyses were performed using SPSS version 25.0. ;;Descriptive study and clinical predictors of short-term remission;;One hundred and thirteen patients were clinically analyzed to determine their short-term clinical response to anti-TNF-a treatment. Of these, 85.8% of patients presented CPR and 14.2% NRCPS. Table 1 shows the baseline characteristics of patients according to clinical response to treatment. ;;Table 1. Relationship between demographic and clinical characteristics and patient response to anti-TNF-a treatment. Univariate analysis for patients with short-term remission (STR) and patients without STR (NRTR). ;; ; ; ;;; * BMI: body mass index; CDAI: Crohn's disease activity index; WBC: leukocytes; CRP: C-reactive protein; ESR: erythrocyte sedimentation rate; ENOA: alpha-enolase; LVNC: vinculin; MR: odds ratio; CI: confidence interval.
En cuanto al agente anti-TNF-a prescrito, el 50,4% fueron tratados con infliximab o biosimilar, y el 49,6% recibieron adalimumab, sin diferencias estadísticas en cuanto a la respuesta terapéutica. L Regarding the anti-TNF-a agent prescribed, 50.4% were treated with infliximab or biosimilar, and 49.6% received adalimumab, with no statistical differences in therapeutic response.
Los pacientes más jóvenes (NRCP: 53,5 (43,0-59,3) años frente a RCP: 39,0 (27,5-50,0) años, p=0,005) y con un diagnóstico más reciente de EC (NRCP: 22,0 (2,5-26,0) frente a RCP: 4,0 (1,0-13,0), p=0,021), tenían más probabilidades de presentar una RCP a los fármacos anti-TNF-a. Younger patients (NRCP: 53.5 (43.0-59.3) years vs. RCP: 39.0 (27.5-50.0) years, p=0.005) and with a more recent diagnosis of EC (NRCP: 22.0 (2.5-26.0) vs. RCP: 4.0 (1.0-13.0), p=0.021), were more likely to have a CPR to anti-TNF-a drugs.
Por el contrario, la inducción con corticosteroides (NRCP: 50,0% vs. RCP: 16,5%, p=0,006), la resección intestinal previa (NRCP: 62,5% vs. RCP: 20,6%, p=0,001) y CDAI elevado al inicio (NRCP: 235,5 (149,3-310,0) vs. RCP: 91,2 (54,9-166,0), p=0,000) se asociaron positivamente con la NRCP (Tabla 1). In contrast, corticosteroid induction (NRCP: 50.0% vs. RCP: 16.5%, p=0.006), prior bowel resection (NRCP: 62.5% vs. RCP: 20.6%, p=0.001), and elevated CDAI at baseline (NRCP: 235.5 (149.3-310.0) vs. RCP: 91.2 (54.9-166.0), p=0.000) were positively associated with NRCP (Table 1).
Marcadores proteómicos de la remisión a corto plazo (RCP)Proteomic markers of short-term remission (STR)
Se cuantificaron 300 proteínas plasmáticas en el análisis proteómico. Como biomarcadores potenciales de la respuesta primaria identificamos 18 proteínas expresadas diferencialmente (p<0,009 y cambio de pliegue >2,4): ENOA, VINC, PDZ y LIM dominio proteína 1 (PDLI1), Rho GDP-inhibidor de la disociación 2 (GDIR2), Zyxin (ZYX), Fructosa-bisfosfato aldolasa A (ALDOA), Moesin (MOES), Glutatión S-transferasa omega-1 (GSTO-1), Al-pha-actinina-1 (ACTN1), Transgelina-2 (TAGL2), Proteína 2 asociada a la proteína de respuesta a la privación de suero/Caveolae (SDPR), Inhibidor beta de la disociación de Rab GDP (GDIB), Cofilina-1 (COF1), Proteína S100-A4 (S10A4), Proteína supresora de Ras 1 (RSU1), Pleckstrin (PLEK), Proteína 14-3-3 zeta/delta (1433Z) y Triosafosfato isomerasa (TPIS) (Tabla 2). 300 plasma proteins were quantified in the proteomic analysis. As potential biomarkers of primary response we identified 18 differentially expressed proteins (p<0.009 and fold change >2.4): ENOA, VINC, PDZ and LIM domain protein 1 (PDLI1), Rho GDP-dissociation inhibitor 2 (GDIR2), Zyxin (ZYX), Fructose-bisphosphate aldolase A (ALDOA), Moesin (MOES), Glutathione S-transferase omega-1 (GSTO-1), Al-pha-actinin-1 (ACTN1), Transgelin-2 (TAGL2), Serum deprivation response protein/Caveolae-associated protein 2 (SDPR), Rab GDP-dissociation inhibitor beta (GDIB), Cofilin-1 (COF1), Protein S100-A4 (S10A4), Ras suppressor protein 1 (RSU1), Pleckstrin (PLEK), Protein 14-3-3 zeta/delta (1433Z) and Triosephosphate isomerase (TPIS) (Table 2).
El análisis de las vías funcionales mostró que 17 de estas 18 proteínas identificadas están reguladas por la acetilación. Además, 14 de estos biomarcadores potenciales de respuesta al anti-TNF-a participan en la hemostasia/función plaquetaria (VINC, ALDOA, MOES, ACTN1, TAGL2, SDPR, COF1 y PLEK) y/o intervienen en la organización del citoesqueleto y/o la adhesión celular (VINC, PDLI1, GDIR2, ZYX, ALDOA, MOES, ACTN1, TAGL2, SDPR, COF1, S10A4, RSU1, PLEK y 1433Z), 3 de ellas están relacionadas con la respuesta inflamatoria (GSTO1, GDIB y S10A4) y 3 proteínas están implicadas en el proceso glucolítico (ENOA, ALDOA y TPIS). Functional pathway analysis showed that 17 of these 18 identified proteins are regulated by acetylation. Furthermore, 14 of these potential anti-TNF-a response biomarkers are involved in platelet hemostasis/function (VINC, ALDOA, MOES, ACTN1, TAGL2, SDPR, COF1, and PLEK) and/or are involved in cytoskeletal organization and/or cell adhesion (VINC, PDLI1, GDIR2, ZYX, ALDOA, MOES, ACTN1, TAGL2, SDPR, COF1, S10A4, RSU1, PLEK, and 1433Z), 3 of them are related to the inflammatory response (GSTO1, GDIB, and S10A4), and 3 proteins are involved in the glycolytic process (ENOA, ALDOA, and TPIS).
Tabla 2.Proteínas expresadas diferencialmente identificadas en muestras de plasma de pacientes con enfermedad de Crohn con RCP a anti-TNF-a. Significación estadística mediante prueba t (p<0,01). Table 2. Differentially expressed proteins identified in plasma samples from Crohn's disease patients with anti-TNF-a PCR. Statistical significance by t test (p<0.01).
Validación de ENOA y VINC como marcadores potenciales de remisión a corto plazo Validation of ENOA and VINC as potential markers of short-term remission
ENOA y VINC fueron seleccionadas para realizar la validación de los resultados proteómicos mediante pruebas ELISA, debido a su mayor nivel de significación (Tabla 2). ENOA and VINC were selected to perform the validation of proteomic results using ELISA tests, due to their higher level of significance (Table 2).
Según ELISA, ambas proteínas mostraron un aumento no significativo en las muestras de plasma de los pacientes con RCP(Figura 1 A y B). Sin embargo, en el caso de VINC, la expresión diferencial rozó la significación estadística (NRCP: 0,8 (0,2-1,2) vs. RCP: 1,2 (0,6 2,0), p=0,054) (Figura 1B). According to ELISA, both proteins showed a non-significant increase in plasma samples from patients with CPR (Figure 1 A and B). However, in the case of VINC, the differential expression bordered on statistical significance (NRCP: 0.8 (0.2-1.2) vs. CPR: 1.2 (0.6-2.0), p=0.054) (Figure 1B).
Posteriormente, los pacientes del grupo RCP se estratificaron en pacientes con RS (Respuesta Sostenida) y pacientes con PR (Pérdida de Respuesta) tras 12 meses de tratamiento. En la comparativa de los valores obtenidos, encontramos diferencias significativas en los niveles plasmáticos de VINC entre los grupos de RS (1.3 (0.8-2.1)) y PR (0.7 (0.2-1.8)) (p=0.019), y entre RS y NRCP (0.8 (0.2-1.2)) (p=0.014) (Figura 2A). Estas diferencias concordaban con los resultados anteriores obtenidos en el análisis proteómico para VINC solo para los grupos RS (492127.1 ± 219002.2) y NRCP (106569.3 ± 65803.9) (p=0.001) (Figura 2B). Subsequently, patients in the RCP group were stratified into patients with RS (Sustained Response) and patients with PR (Loss of Response) after 12 months of treatment. In the comparison of the values obtained, we found significant differences in the plasma levels of VINC between the RS (1.3 (0.8-2.1)) and PR (0.7 (0.2-1.8)) groups (p=0.019), and between RS and NRCP (0.8 (0.2-1.2)) (p=0.014) (Figure 2A). These differences were in agreement with the previous results obtained in the proteomic analysis for VINC only for the RS (492127.1 ± 219002.2) and NRCP (106569.3 ± 65803.9) groups (p=0.001) (Figure 2B).
Valoración del pronóstico de pacientes con EC sometidos a terapia anti-TNF-a a corto plazoAssessment of the prognosis of patients with CD undergoing short-term anti-TNF-a therapy
A continuación, se evaluó el valor pronóstico de los parámetros clínicos y patológicos para predecir la respuesta del paciente al tratamiento anti-TNF-a. Edad [RM: 1,1 (1,0-1,1), p=0,009)], duración de la enfermedad [RM: 1,1 (1,0-1,2), p=0,006], inducción con corticosteroides [RM: 5,1 (1,7-15,5), p=0. 004] y principalmente, la resección intestinal [RM: 6,4 (2,1-19,8), p=0,001] y la puntuación CDAI basal [RM: 1,0 (1,0-1,0), p=0,000], fueron factores independientes de NRCP (Tabla 1). The prognostic value of clinical and pathological parameters in predicting patient response to anti-TNF-a therapy was then evaluated. Age [OR: 1.1 (1.0-1.1), p=0.009)], disease duration [OR: 1.1 (1.0-1.2), p=0.006], corticosteroid induction [OR: 5.1 (1.7-15.5), p=0. 004] and mainly, bowel resection [OR: 6.4 (2.1-19.8), p=0.001] and baseline CDAI score [OR: 1.0 (1.0-1.0), p=0.000], were independent factors of NRCP (Table 1).
En un análisis multivariante, la inducción con corticosteroides [RM: 8,6 (1,7-43,5), p=0,009], la resección intestinal [RM: 10,5 (2,1-52,0), p=0,004] y la puntuación basal del CDAI [RM: 1,0 (1,0-1,0), p=0,003] fueron factores predictores de NRCP. La inclusión de los niveles basales de VINC en el análisis aumentó la capacidad predictiva del modelo (Tabla 3). In multivariate analysis, corticosteroid induction [OR: 8.6 (1.7-43.5), p=0.009], bowel resection [OR: 10.5 (2.1-52.0), p=0.004] and baseline CDAI score [OR: 1.0 (1.0-1.0), p=0.003] were predictors of NRCP. Inclusion of baseline LVNC levels in the analysis increased the predictive ability of the model (Table 3).
Tabla 3.Análisis multivariante para predecir NRCP al tratamiento anti-TNF-a en EC. Table 3. Multivariate analysis to predict NRCP to anti-TNF-a treatment in EC.
Se obtuvo una muy buena capacidad discriminante del modelo ajustado que incluye la inducción con corticosteroides, la resección intestinal y la puntuación basal del CDAI, sin los niveles basales de VINC [AUC (IC 95%) = 0,904 (0,838-0,970)]. Los resultados fueron e incluso mejores incluyendo los niveles basales de [AUC (IC 95%) = 0,919 (0,862-0,977)] (Tabla 4yFigura 3). A very good discriminant capacity was obtained from the adjusted model including corticosteroid induction, bowel resection and baseline CDAI score, without baseline LVNC levels [AUC (95% CI) = 0.904 (0.838-0.970)]. The results were even better including baseline levels of [AUC (95% CI) = 0.919 (0.862-0.977)] (Table 4 and Figure 3).
Tabla 4.Área Bajo Curva - Característica Operativa del Receptor (AUC-ROC) de los modelos multivariantes de la figura 3. La tabla muestra la comparación del AUC-ROC obtenido para los parámetros individuales incluidos en el modelo ajustado y para su combinación con o sin vinculina. Table 4. Area Under the Curve - Receiver Operating Characteristic (AUC-ROC) of the multivariate models in Figure 3. The table shows the comparison of the AUC-ROC obtained for the individual parameters included in the adjusted model and for their combination with or without vinculin.
Valoración del pronóstico de pacientes con EC sometidos a terapia anti-TNF-a a largo plazo Assessment of the prognosis of patients with CD undergoing long-term anti-TNF-a therapy
Una vez trascurridos 12 meses desde el inicio del tratamiento con anti-TNF-a se rehacen los grupos con el fin de comparar el grupo de RS (respuesta sostenida a los 12 meses, n=75) frente al nuevo grupo formado por PR (pérdida de respuesta a los 12 meses) y NRCP (no respuesta a corto plazo) (n=38). After 12 months from the start of treatment with anti-TNF-a, the groups were re-established in order to compare the RS group (sustained response at 12 months, n=75) against the new group consisting of PR (loss of response at 12 months) and NRCP (no response in the short term) (n=38).
Se detecta que existen diferencias significativas entre ambos grupos tanto para VINC (p=0,002) como para ENOA (p=0,031) (Tabla 5), cuando en la respuesta a corto plazo, solo VINC rozaba la significación estadística (Figura 1B). Significant differences were detected between both groups for both VINC (p=0.002) and ENOA (p=0.031) (Table 5), whereas in the short-term response, only VINC was close to statistical significance (Figure 1B).
Tabla 5. Valores de expresión de VINC y ENOA para los grupos de respuesta a anti-TNF-a a largo plazo. Se muestran los valores de la mediana y rango intercuartílico. Table 5. VINC and ENOA expression values for long-term anti-TNF-a response groups. Median and interquartile range values are shown.
En el modelo univariante, tanto la resección intestinal (2,6 (1,1 -6,2), p=0,029) como el CDAI basal (1,0 (1,0-1,0), p=0,011) y los niveles de expresión de VINC basales (0,7 (0,5-1,0), p=0,038), serían predictores de respuesta por sí solos, a diferencia del modelo anterior donde VINC no era predictor por si solo, pero sí la Inducción con corticoides, que ahora no lo es (1,2 (0,5-3,2), p=0,651). In the univariate model, both intestinal resection (2.6 (1.1-6.2), p=0.029) and baseline CDAI (1.0 (1.0-1.0), p=0.011) and baseline VINC expression levels (0.7 (0.5-1.0), p=0.038) would be predictors of response on their own, unlike the previous model where VINC was not a predictor on its own, but corticosteroid induction was, which is not now (1.2 (0.5-3.2), p=0.651).
En el modelo multivariante, VINC (0,7 (0,5-1,0), p=0,031) agregaría valor predictivo al modelo compuesto por la resección intestinal (2,9 (1,1 -7,6), p=0,026) y la puntuación basal del CDAI (1,0 (1,0-1,0), p=0,040) como factores predictores de respuesta sostenida a los 12 meses. La capacidad discriminante del modelo ajustado que incluye resección intestinal, puntuación basal del CDAI y los niveles de expresión de VINC basales, fue significativa estadísticamente aunque discreta [AUC (IC 95%) = 0,696 (0,592-0,800)] (Tabla 6). In the multivariate model, VINC (0.7 (0.5-1.0), p=0.031) would add predictive value to the model composed of bowel resection (2.9 (1.1-7.6), p=0.026) and baseline CDAI score (1.0 (1.0-1.0), p=0.040) as predictors of sustained response at 12 months. The discriminant capacity of the adjusted model including bowel resection, baseline CDAI score and baseline VINC expression levels was statistically significant although discrete [AUC (95% CI) = 0.696 (0.592-0.800)] (Table 6).
Aunque sí que hay diferencias significativas para la ENOA entre los grupos (Tabla 5) en este nuevo agrupamiento, no tiene valor predictivo de respuesta. Although there are significant differences for ENOA between the groups (Table 5) in this new grouping, it has no predictive value for response.
Tabla 6.Área Bajo Curva - Característica Operativa del Receptor (AUC-ROC) del modelo multivariante propuesto para la respuesta a tratamiento valorada a largo plazo. La tabla muestra la comparación del AUC-ROC obtenido para los parámetros individuales incluidos en el modelo ajustado. Table 6. Area Under the Curve - Receiver Operating Characteristic (AUC-ROC) of the proposed multivariate model for the long-term treatment response. The table shows the comparison of the AUC-ROC obtained for the individual parameters included in the adjusted model.
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