ES2988862B2 - Producción de mixoquelinas a partir de una cepa mutante de Myxococcus xanthus - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de mixoquelinas a partir de una cepa muíante deMyxococcus xanthus

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se enmarca en el campo de la Biotecnología y de la Microbiología. En concreto, la invención está dirigida a la obtención, a partir de microorganismos modificados genéticamente, de compuestos orgánicos de interés industrial, en este caso, de un tipo de sideróforos como son las mixoquelinas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los sideróforos son moléculas de pequeño tamaño y de naturaleza química variada secretadas por microorganismos. Presentan una gran afinidad por el ion hierro Fe3+, la forma en la que se encuentra el hierro en condiciones óxicas. Este ion hierro Fe3+ tiene muy poca solubilidad a pH neutro y por tanto se encuentra poco disponible en muchos medios naturales. Los sideróforos forman complejos con estos iones, quelándolos y haciéndolos así disponibles para los microorganismos, de forma que puedan abastecerse de las cantidades de este metal necesarias para vivir. Debe tenerse en cuenta que el hierro es un metal esencial para la mayoría de los seres vivos.

Actualmente los sideróforos son utilizados en muy diversos campos, entre otros, en Medicina, donde se han utilizado como transportadores de fármacos en el organismo o para tratar enfermedades originadas por un exceso de hierro (1).

Las mixoquelinas son sideróforos que quelan el hierro del medio con una altísima afinidad. Estas sustancias son producidas porMyxococcus xanthus,de quien toma el nombre, y también por otros microorganismos. Fue descubierta por Kunzeet al.,en 1989 (2) y existen dos tipos de ellas, la mixoquelina A y la mixoquelina B, las dos producidas porM. xanthus.La fórmula molecular de la mixoquelina A es C20H24N2O7, su nombre de acuerdo con IUPAC (3) es: N-[(5S)-5-[(2,3-dihidroxibenzoil)amino]-6-hidroxihexil]-2,3-dihidroxibenzamida. Mientras que la fórmula de la mixoquelina B es C20H25N3O6, y se la denomina N-[(5S)-6-amino-5-[(2,3-dihidroxibenzoil)amino]hexil]-2,3-dihidroxibenzamida. La fórmula general de las mixoquelinas, con la especificación de los radicales que diferencian a la A de la B, es la siguiente.

Como ocurre con otros sideróforos, las bacterias solamente producen mixoquelinas cuando se encuentran en presencia de bajas concentraciones de hierro, lo que a su vez afecta a la viabilidad y crecimiento de los microorganismos implicados en su producción. Además, los niveles que se producen de estos sideróforos son relativamente bajos de cara a posibilitar su explotación a nivel industrial. Por ello, la producción de estos compuestos y su purificación resulta laboriosa y costosa. La producción actual es bastante escasa y está limitada a unas pocas empresas, lo que impide su comercialización en grandes cantidades.

En concreto, las mixoquelinas tienen multitud de aplicaciones en muy diversos campos, entre los que destacan el campo de la salud, para el tratamiento del cáncer, donde se ha demostrado que es citotóxico para ciertas células cancerosas humanas, como células de cáncer de colon, pudiendo ser utilizado como antitumoral. También se ha demostrado que las mixoquelinas inhiben la actividad de la 5-lipoxigenasa humana implicada en la enfermedad de este mismo nombre, que causa artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedades autoinmunes, rinitis alérgica, conjuntivitis, asma, erupciones cutáneas, eczema y coronariopatías.

Su uso también está siendo evaluado para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la absorción de hierro, como en la hemocromatosis hereditaria, donde el hierro no se adquiere de forma eficiente por el organismo, o aquellas donde se da una absorción exagerada de hierro porque el organismo no dispone de un mecanismo eficaz para su eliminación, ya que el exceso de hierro puede inducir un estado de estrés oxidativo celular persistente con daño tisular y, eventualmente, fallo multiorgánico. También se puede utilizar para tratar enfermedades relacionadas con el acumulo de hierro en ciertos órganos y síndromes mielodisplásticos y trastornos hemáticos con hematopoyesis ineficaz.

Se conoce su uso como antimicrobiano contra multitud de bacterias patógenas del géneroBacillus,comoB. brevis(DSM30),B. cereus(DSM621),B. megaterium(DSM32),B. subtilis(DSM10),B. thuringiensis(DSM2046), y otras comoMicrococcus luteus(GBF26),Staphylococcus aureus(GBF16),Arthrobacter simplex(DSM20130),Brevibactenum linens(DSM20425),Corynebacterium fascians(DSM20131),Nocardia corallina(ATCC13258) yEscherichia coli(DSM498). Estudios recientes apoyan la idea de utilizar sideróforos como antibióticos para tratar infecciones por estos microorganismos. En todos estos ejemplos, las mixoquelinas impedirían que los patógenos pudieran crecer al no disponer del hierro suficiente.

En el campo de la investigación, las mixoquelinas se pueden utilizar como quelante de alta eficiencia para la sobreexpresión de ciertos antibióticos en algunas bacterias o para estudiar el efecto de los sideróforos de patógenos sobre el sistema inmune humano.

Se plantean también como candidatas óptimas para sustituir al 2,2-dipiridilo, el agente secuestrador de hierro más utilizado en los laboratorios de investigación actualmente, que es mucho menos eficaz que las mixoquelinas.

Se han descrito muchas otras aplicaciones de este compuesto en áreas como la biorremediación, para tratar suelos y aguas contaminados con altas concentraciones de hierro; la agricultura, ya que resultan beneficiosos para las plantas; y la alimentación, como suplemento de hierro en pacientes con anemia o como aditivo con hierro en los productos alimenticios alternativos vegetarianos y veganos, donde puede adicionar hierro sin que sea de origen animal.

El proceso de síntesis de las mixoquelinas enM. xanthuses bien conocido, aunque se desconoce cómo se regula la expresión de estos genes.

En la actualidad, se han propuesto dos estrategias para tratar de aumentar la producción de esta molécula. Por un lado, se ha planteado la deleción del gen que codifica el represor que actúa como factor de transcripción de los genes implicados en su síntesis como una posible alternativa para obtener mayores cantidades de este compuesto. Una bacteria con dicho gen delecionado produciría cantidades grandes de sideróforos en medios convencionales, independientemente de la cantidad de hierro que haya en ellos. Sin embargo, existen numerosas dificultades para obtener un mutante de este tipo, al menos enM. xanthus,al no conocerse hasta la fecha los reguladores implicados.

Un estudio previo (4) propuso la existencia de dos genes principales como candidatos a ser el regulador Fur encargado de la represión de la biosíntesis de la mixoquelina. En dicho estudio solamente se consiguió mutar uno de los dos genes, descartándose ese como regulador. Así, dedujeron que tendría que ser el otro gen el regulador pero sin demostrarlo experimentalmente. El gen propuesto sería el identificado en el genoma deM. xanthuscon el identificador genómico MXAN_3702. Sin embargo, este gen había sido descrito como un gen vital, cuya deleción provocaba muerte celular, razón por la cual no se ha obtenido un mutante de este tipo hasta el momento. Por ese motivo, tampoco se había podido demostrar que efectivamente se tratara del regulador de la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de las mixoquelinas.

Otra estrategia consistiría en expresar en un sistema heterólogo los genes implicados en la biosíntesis de las mixoquelinas. Sin embargo, en la biosíntesis de las mixoquelinas deM. xanthusintervienen 8 genes de gran tamaño, por lo que es muy difícil obtener cepas modificadas genéticamente capaces a su vez de producir una gran cantidad de estos sideróforos. Se han llevado a cabo pruebas en este sentido tratando de clonar los genes responsables de la biosíntesis de las mixoquelinas en bacterias comoPseudoaltemmonas piscicidapara producir un compuesto alternativo llamado “pseudomixoquelina” (5). Sin embargo, hasta la fecha no se ha conseguido un organismo modificado genéticamente que efectivamente sobreproduzca este tipo de sideróforos utilizando esta estrategia.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente memoria describe una cepa mutante deMyxococcus xanthus,que presenta una deleción en el gen que codifica el factor de transcripción responsable de reprimir la expresión de los genes que codifican las proteínas responsables de la biosíntesis de los sideróforos mixoquelinas. Este gen regulador, identificado previamente como MXAN_3702, no se había podido mutar anteriormente y tampoco se había podido demostrar que ejerciera esta función.

En la presente memoria se describe cómo se ha conseguido obtener un mutante donde dicho gen está delecionado, y así comprobar que efectivamente funciona reprimiendo la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de las dos mixoquelinas. Como consecuencia de ello, el mutante deM. xanthuses capaz de producir mixoquelinas en grandes cantidades.

El identificador genómico MXAN_3702 codifica un regulador de tipo Fur(“Ferric Uptake Regulator’o Regulador de la captación de hierro) (6). Por este motivo, al gen de la invención se le ha denominado como“furA".

Los reguladores de tipo Fur aparecen en forma activa, y por tanto reprimen la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de mixoquelina, cuando se une a Fe2+, forma en la que normalmente el hierro que es captado por los sideróforos, ya que una vez se introduce al citoplasma, es reducido a Fe2+, siendo éste es el que activa al represor Fur. Por el contrario, en ausencia de hierro, no se une al metal, se inactiva, y permite que se expresen esos genes que se encuentran bajo su control.

En el contexto de la presente invención, FurA se define como la proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, siendo esta la siguiente:

MARTRGDFEGFLMSNSHSHHHDDHDKDEGLARYMAQHGLKSTRQRSLIIDTFFAVGGHLS VEELWNKVREQDTKVSVATVYRTMKLLSECGLAHARNFGDGQTRYEAAAGRDHHDHLVCT RCGTIIEFENERIEALQDAVARKHGFKVTSHKMELYGLCRDCQRAGSAASEA

FurA también está definido por la molécula de ácido nucleico que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína FurA.

Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia nucleotídica aquí nombrada como la SEQ ID NO: 2 y que corresponde con el genfurA:

ATGGCGCGGACCCGCGGCGACTTTGAAGGATTTCTCATGAGCAACAGTCACAGCCATC ACCACGACGACCACGACAAGGACGAGGGGCTTGCCCGCTACATGGCCCAGCACGGCC TGAAGAGCACGCGGCAGCGCAGCCTCATCATCGACACGTTCTTCGCGGTGGGAGGCC ACCTGTCGGTGGAGGAGCTGTGGAACAAGGTGCGTGAACAGGACACCAAGGTGTCCGT CGCCACCGTTTACCGGACCATGAAGCTGCTCAGCGAGTGTGGCCTGGCCCACGCGCG CAACTTCGGGGACGGGCAGACGCGCTACGAGGCGGCCGCGGGGCGCGACCACCATG ACCACCTGGTCTGTACGCGCTGCGGCACCATCATCGAGTTCGAGAACGAGCGCATCGA GGCGCTTCAGGACGCCGTGGCCCGCAAGCACGGCTTCAAGGTGACGTCGCACAAGAT GGAGCTGTACGGCCTGTGTCGTGACTGTCAGCGGGCCGGGTCGGCCGCCTCGGAGGC CTGA

El mutante deM. xanthusobtenido por la delección del genfurA,lo denominaremos en la presente memoria como AfurA. Este mutanteAfurAes capaz de producir muchos más sideróforos que la cepa silvestre deM. xanthus.Por tanto, los sobrenadantes de los medios de cultivo en los que ha crecido este mutante se encuentran muy enriquecidos en mixoquelinas.

Se propone así un método de producción de los sideróforos mixoquelinas a partir del cultivo de esta cepa deM. xanthusmodificada genéticamente.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a la cepa mutante deMyxococcus xanthuso cepaAfurA,obtenida mediante deleción del genfurA,cuyo identificador genómico es MXAN_3702 y cuya secuencia es la nombrada como SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el mutante es obtenido a partir de la cepa silvestreM. xanthusDK1622.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de la mutante deM. xanthusque comprende las siguientes etapas:

a) electroporar una cepa silvestre deM. xanthuscon un plásmido que contiene la región aguas arriba y abajo del genfurA,y

b) delecionar el genfurAdel genoma deM. xanthusmediante doble recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma deM. xanthus.

Preferiblemente, el plásmido del paso a) se construye a partir del vector pBJ113 y los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 que anillan con la región aguas arriba del genfurAy los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que anillan con la región aguas abajo del genfurA,digeridos con las enzimas de restricciónHindIIIyBamHIy BamHI y EcoRI respectivamente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el plásmido del paso a) es clonado enEscherichia coli.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el procedimiento además comprende:

c) seleccionar la cepa mutante deM. xanthusque presenta deleción del genfurA.

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa mutante deM. xanthuspara la producción de mixoquelinas.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de mixoquelinas utilizando la cepa mutante deM. xanthusque comprende las siguientes etapas:

a) crecer la cepa mutante deM. xanthusen medio líquido, y

b) extraer las mixoquelinas del sobrenadante.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el crecimiento de la cepa mutante deM. xanthusse lleva a cabo a temperatura de 30°C.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Comprobación de la electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de PCR y vector PBJ113 digeridos. En la primera calle el marcador de peso molecular, los tamaños de los fragmentos vienen expresados en pb a la izquierda. En la segunda calle el vector PBJ113 linealizado con un tamaño de 5000 pb. En la tercera y cuarta calle los fragmentos aguas arriba y aguas abajo del gen de interés, de 800 y 796 pb respectivamente (valores indicados a la derecha).

Figura 2. Comprobación de la electroforesis en gel de agarosa del plásmido candidato. En la primera calle el marcador de peso molecular, los tamaños de los fragmentos vienen expresados en pb a la izquierda (izquierda). En la segunda calle el plásmido candidato circular y en la tercera el vector PBJ113 circular a modo de control.

Figura 3. Comprobación de la electroforesis en gel de agarosa del plásmido candidato. En la primera calle el marcador de peso molecular, los tamaños de los fragmentos vienen expresados en pb a la izquierda (izquierda). En la segunda calle los fragmentos del plásmido digerido conHindIIIyBamHI,5796 y 800 pb. En la tercera calle el producto de PCR del fragmento aguas arriba a modo de control, 800 pb. En la cuarta calle los fragmentos del plásmido digerido con BamHI y EcoRI, 5800 y 796 pb. En la quinta calle el producto de PCR del fragmento aguas abajo a modo de control, 796 pb. En la sexta calle los fragmentos del plásmido digerido conHindIIIy EcoRI, 5000 y 1596 pb. En la séptima calle el vector PBJ113 digerido conHindIIIyEcoRIa modo de control, 5000 pb. A la derecha los tamaños aproximados de los fragmentos.

Figura 4. Comprobación de la electroforesis en gel de agarosa de los intermediarios candidato. En la primera calle el marcador de peso molecular, los tamaños de los fragmentos vienen expresados en pb a la izquierda. En las calles marcada del 1 al 8 los diferentes candidatos. Todos ellos dan dos fragmentos principalmente de 2115 y 1596 pb (derecha). Mientras que el control de la cepa silvestre DK1622 (WT) solamente da un fragmento de 2115 pb ya que no posee incorporado el plásmido.

Figura 5. Comprobación de la electroforesis en gel de agarosa de mutantes candidatos. En la primera calle tenemos el marcador de peso molecular, los tamaños de los fragmentos vienen expresados en pb a la izquierda (izquierda). En las calles marcada del 1 al 10 los diferentes candidatos. Las cepas silvestres dan un fragmento de 2115 pb, mientras que las cepas mutantes, 8 y 10, dan fragmentos de 1596 pb. En la muestra 7 se obtuvo mezcla de silvestre y mutante. A la derecha los tamaños aproximados de los fragmentos.

Figura 6 : Producción de mixoquelinas del mutanteAfurArespecto a la cepa silvestre deM. xanthusDK1622 (WT) en presencia (+Fe) y ausencia (-Fe) de hierro. La intensidad del color azul indica los niveles de expresión de uno de los genes responsables de la biosíntesis de las mixoquelinas.

Figura 7: Ensayo de producción de mixoquelinas en medio CAS-Blue de la cepa silvestre (WT) y del mutante (AfurA). El color naranja alrededor de las bacterias se debe a la producción de mixoquelinas.

Figura 8 : Cantidad de mixoquelinas producidas, medida mediante densidad óptica a 450 nm por número de bacterias, tanto en la cepa silvestre (WT) como en el mutante (AfurA).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Construcción del mutante

El mutanteAfurAde la invención se generó mediante la deleción del genfurAen la cepa silvestre deM. xanthusDK1622, por electroporación de un plásmido con la región aguas arriba y abajo del gen. Posteriormente, mediante una doble recombinación homóloga entre dichos fragmentos y el genoma, se generó un mutante con deleción en el genfurA.A continuación, se describe el proceso detalladamente:

En primer lugar, se diseñaron 4 oligonucleótidos (Tabla 1) que anillaran en la región aguas arriba y aguas abajo del gen, conservando el codón de inicio y el de terminación.

Para posteriormente unir estos fragmentos entre sí e introducirlos en el vector pBJ113 (7) se le adicionó una secuencia de diana de restricción a dichos oligonucleótidos (secuencia subrayada en los 4 oligonucleótidos de la Tabla 1).

Tabla 1. Secuencia de los oligonucleótidos empleados en la construcción del plásmido.

Ambas regiones se amplificaron mediante PCR utilizando el termocicladorMJ Mini Personal Thermal CycledeBioRad.Para realizar este proceso se emplearon 10-200 ng de ADN molde de la cepa DK1622 deM. xanthus,1 ^l de cada uno de los oligonucleótidos (100 ^M), 0,5 ^l de PolimerasaPrimeSTAR™ HS DNA Polymerase(5 unidades/^l), 4 ^l de Mezcla de dNTPs(deoxynucleotide triphosphates)(10 mM), 25 ^l de TampónGC PrimeSTAR(2X), 5 ^l de Dimetilsulfóxido y H2OMilliQhasta completar 50 ^l de volumen final.

Una vez realizada la mezcla, se sometió a 30 ciclos de amplificación en las siguientes condiciones (Tabla 2).

Tabla 2. Condiciones de la PCR para la amplificación de los fragmentos empleados en la construcción del plásmido.

*La temperatura de hibridación estaba condicionada en cada caso por la secuencia (cantidad de adeninas, timinas, citosinas y guaninas) de los oligonucleótidos. Para determinar la temperatura se empleó la siguiente fórmula:

[2x(A+T)+4x(C+G)]-4

Por lo que se utilizó 64°C para el fragmento de aguas arriba y 60°C para el fragmento de aguas abajo.

Una vez obtenidos los dos fragmentos de ADN amplificados, se procedió a su purificación con el kitHigh Pure PCR Product Purífication Kit(Roche). Para ello, se mezcló el ADN con 500 ^l de tampón de unión, para que, posteriormente, el ADN se una a la columna de afinidad del tubo de centrífuga de filtrado. Se sometió a centrifugación a 15.000 rpm durante 1 minuto para dejar unido solamente el ADN. Después, se realizaron dos lavados, uno con 500 ^l y otro con 200 ^l de tampón de lavado del kit. Finalmente, se adicionaron 60 ^l de tampón de elución para separar el ADN de la columna y así recuperarlo.

A continuación, se digirieron los productos de ambas PCRs con las enzimas de restricción correspondientes,HindlIIyBamHIel fragmento de aguas arriba y BamHI y EcoRI el fragmento de aguas abajo. También, se digirió el vector PBJ113 con las enzimasHindIIIy EcoRI, que es el vector plasmídico donde se insertarán dichos fragmentos más adelante. Para realizar esta serie de digestiones se mezclaron por 5 ^g de ADN, 10 ^l de TampónFastDigest(10X) de Thermo scientific, 3 ^l de Enzima de restricción FastDigest de Thermo scientific y H2OMilliQhasta completar 100 ^l de volumen final.

La mezcla se dejó incubando durante 45 minutos a 37°C. Posteriormente, se volvieron a purificar, tanto los fragmentos digeridos como el vector PBJ113, con el kitHigh Pure PCR Product Purification Kit(Roche). Posteriormente, se comprobaron mediante electroforesis con tampón TAE en un gel de agarosa al 0,7% dePronadisa.A continuación, se reveló incubándolo con una solución que conteníaGelReddeBiotium.

En la Figura 1, podemos ver el tamaño de dichas muestras.

Después, se realizó la ligación entre el vector y los dos fragmentos con la enzimaT4-DNA ligase.Para ello, se utilizaron 20 ng de vector y 40 ng de cada inserto. Se realizó la mezcla junto con 2 ^l de tampón de ligación 10X y se completó con H2OMilliQhasta un volumen final de 19 ^l. Esta mezcla se incubó a 37°C durante 5 minutos y posteriormente en hielo 10 minutos. Finalmente, se añadió 1 ^l de ligasa a la mezcla y se dejó toda la noche incubando a 16°C para la correcta ligación del ADN.

Al día siguiente, se introdujo la mezcla de ligación en la cepa TOP10 deEscherichia colimediante choque térmico.

Para ello, se utilizaron 30 ^l de células competentes de la cepa TOP10, junto con 10 ng de mezcla de ligación a transformar en un tubo de vidrio estéril y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Después, la mezcla se sometió a un choque térmico que consistió en pasarla rápidamente a un baño a 42°C durante 2 minutos. Seguidamente, se añadió a la mezcla 0,4 ml de medio líquido LB y se incubó a 200 rpm durante 1 hora a 37°C. Finalmente, se sembró 100 ^l del cultivo en una placa de medio LB con kanamicina 25 ^g/ml, para que solamente crezcan las bacterias que hayan incorporado el plásmido ya que el vector posee el gen de resistencia a kanamicina, y X-gal 40 ^g/ml para la selección blanco-azul de las colonias. Las placas se dejaron incubando a 37°C hasta el día siguiente.

Si picaron 16 colonias y se extrajeron los plásmidos mediante el kitHigh Pure Plasmid Isolation Kit.Para ello, las células deE. coliportadoras del plásmido se recogieron con asa de siembra y se transfirieron a un tubo eppendorf. Luego, se resuspendieron en 250 ^l del tampón de resuspensión con ARNasa para eliminar el ARN y, a continuación, con 250 ^l de tampón de lisis, que utiliza NaOH y SDS para lisar las células, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron 350 ^l de tampón de unión, el cual permite al ADN unirse a la columna de afinidad que poseen los tubos de centrífuga de filtrado y, además, permite que en frío las proteínas y restos celulares formen un precipitado floculante. Por esto, se incubaron 5 minutos en hielo y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El ADN plasmídico presente en el sobrenadante se transfirió a los tubos de centrífuga de filtrado, donde se realizaron dos lavados con 500 ^l de cada una de las dos soluciones de lavado que proporciona el kit. Finalmente, se añadieron 60 ^l de tampón de elución para que el ADN se separara de la columna de afinidad y así se recuperara en este tampón.

Los plásmidos extraídos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (en las mismas condiciones descritas anteriormente). En la Figura 2, se observa la correcta obtención del plásmido ya que este posee un mayor tamaño que el vector sin los dos insertos.

Además, se realizó una segunda comprobación del plásmido, en la que se utilizaron las mismas enzimas de digestión que fueron empleadas para la ligación, de tal forma que los fragmentos liberados correspondan con los insertos. En la Figura 3, se muestra dicha liberación de cada fragmento de forma individual y conjunta.

Una vez obtenido y verificado el plásmido, se introdujo en la cepa silvestre DK1622 deM. xanthusmediante electroporación.

Previamente se dializó 1 ^g del plásmido con agua destilada mediante una membrana de diálisis (0,025 ^m de tamaño de poro deMerck)durante 30 minutos. Por otro lado, se prepararon células electrocompetentes de la mixobacteria. Para ello, se partió de un cultivo en CTT líquido deM. xanthusDK1622 en fase exponencial. El medio CTT tenía los siguientes componentes y concentraciones: Bacto-casitona (10 g/l), MgSO47H2O (2 g/l), tampón Tris-HCl 1 M pH 7,6 (10 ml/l) y Tampón KH2PO4-K2HPO40,1 M pH 7,6 (10 ml/l).

Se centrifugó 1,5 ml de dicho cultivo a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. El precipitado celular se resuspendió en 1 ml aguaHPLCestéril y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Tras dos ciclos más de lavado y centrifugado, las células precipitadas se resuspendieron en un volumen de 40 ^l de aguaHPLCy ya estuvieron listas para llevar a cabo la electroporación.

Para la electroporación, en primer lugar, se mezcló el plásmido dializado y las células electrocompetentes. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación(Gene Pulser Cuvette0,1 cm deBioRad)con dos láminas metálicas de 1 mm de separación, donde se sometió a un choque eléctrico bajo las siguientes condiciones: Voltaje: 650 V; Capacitancia: 25 ^F; Resistencia: 200 Q.

Tras la electroporación, rápidamente se recuperaron las células electroporadas resuspendiéndolas en 1 ml de medio CTT y se transfirió a un matraz con 1,5 ml de medio CTT. Este matraz se incubó a 30°C a 300 rpm de agitación durante 6 horas para permitir la integración del plásmido en el cromosoma por recombinación homóloga y permitir a las células la expresión de los genes de resistencia a antibióticos presentes en él. Por último, el cultivo se sembró mediante sobrecapa de 5 ml de CTT semisólido (0,8% de agar) en dos placas de CTT sólido con kanamicina a 80 ^g/ml, una con 250 ^l de cultivo y la otra con los restantes 2,25 ml. Dichas placas se mantuvieron a 30°C durante una semana, cuando aparecieron las colonias.

Estas colonias se picaron y sembraron en placas de CTT sólido con kanamicina a 80 ^g/ml para asegurar que solo crecen las células que hayan incorporado el plásmido en el genoma mediante recombinación homóloga por alguno de los dos insertos del plásmido, puesto queM. xanthusno puede albergar plásmidos ya que no tiene la maquinaria proteica necesaria para su replicación. A estas cepas que con el plásmido insertado se les denomina intermediarios.

Estos intermediarios se comprobaron mediante PCR. Primero, se extrajo el ADN genómico mediante el kitWizard® Genomic DNA Purífication Kit.Para ello, se partió de 1 ml de cultivo de aproximadamente 1 de densidad óptica a 600 nm y se centrifugó durante 3 minutos a 15.000 rpm. Las células se resuspendieron en 500 ^l de solución de lisis y se dejaron incubando 5 minutos a 80°C para lisar las células. A continuación, se adicionaron 3 ^l de la solución de ARNasa y se incubó la mezcla durante 30 minutos a 37°C para degradar el ARN. Posteriormente, se añadieron 200 ^l de solución de precipitación de proteínas y las muestras se incubaron 5 minutos en hielo. Se centrifugaron las muestras 3 minutos a 15.000 rpm y el sobrenadante, que contiene el ADN, se precipitó con 2-propanol y se sometió a un lavado con etanol al 70%. Finalmente, se rehidrató el ADN con 50 ^l de la solución de rehidratación de ADN y se dejó toda la noche a 4°C. Al día siguiente, se resuspendió en la propia solución y se conservó a -20°C hasta su uso.

Una vez extraído el ADN cromosómico de los candidatos intermediarios, se les realizó una PCR de comprobación (en las mismas condiciones anteriores) utilizando los oligonucleótidos de los extremos de los fragmentos, MXAN3702HindIII y MXAN3702EcoRI (Tabla 1). De tal forma que se amplificaron principalmente 2 fragmentos, ambos insertos del plásmido, 1596 pb, y el fragmento que alberga la región aguas arriba, el genfurAy la región aguas abajo, 2115 pb. A diferencia de la amplificación en la cepa silvestre DK1622, que solamente dará el fragmento correspondiente a 2115 pb ya que no posee el plásmido insertado en el cromosoma. En la Figura 4, se observan 8 candidatos analizados mediante electroforesis en gel de agarosa 0,7%, todos ellos correctos.

Posteriormente, para que tenga lugar una segunda recombinación homóloga y así se elimine el plásmido y el gen de interés, estos intermediarios se cultivaron en medio líquido sin kanamicina durante 24 horas para evitar la presión selectiva y que las cepas que sufran una segunda recombinación homóloga puedan sobrevivir. Seguidamente, se realizaron diluciones seriadas y se sembraron mediante sobrecapa semisólida en placas de CTT con galactosa 1%, para así dificultar el crecimiento de las células que posean el plásmido, puesto que conservan el gen de la galactoquinasa presente en el vector PBJ113. La recombinación homóloga puede tener lugar en cualquiera de los dos fragmentos. Por lo tanto, si la recombinación se da en el mismo lugar en el que se insertó al cromosoma, la cepa revertirá a silvestre. Pero, si esta tiene lugar en el sitio distintos al de la primera recombinación, se obtiene el mutante de deleción en fase. Para distinguir qué cepas eran silvestres o cuáles mutantes, se comprobaron mediante PCR. Previamente, nos aseguramos de que las colonias candidatas solamente crecían en medio con galactosa y no en medio con kanamicina, para descartar así la posible contaminación con cepas intermediarias.

Se extrajo el ADN cromosómico, siguiendo el método mencionado anteriormente, y se realizó una PCR utilizando de nuevo los oligonucleótidos de los extremos de los fragmentos, MXAN3702HindNI y MXAN3702EcoRI (Tabla 1). De tal forma que las cepas que hayan revertido a silvestre darán un fragmento que albergue los dos insertos y el genfurA,2115 pb, y las cepas mutantes solamente darán un fragmento correspondiente al tamaño de los dos insertos sin el gen, 1596 pb. El análisis de los candidatos se puede observar en la Figura 5.

Análisis de la producción de mixoquelinas

Se decidió continuar con el candidato 8 como mutanteAfurA(Figura 5).

Para estudiar la producción de sideróforos de este mutante, se construyó una fusión entre el genmxcG(relacionado con la biosíntesis de las mixoquelinas) y el gen reporterolacZdeE. coli,sobre el mutante AfurA. Así se pudo observar mediante ensayo en placa de CTT con X-gal y con/sin hierro adicionado, el color azul producido como consecuencia indirecta de la expresión del genmxcG.En la Figura 6, se observa como la colonia de esta construcciónAfurA- mxcGlacZproduce descontroladamente un color azul independiente de la presencia de hierro, mientras que la fusión entre el genmxcGylacZen la cepa silvestre DK1622 solamente se induce, a niveles mucho menores que el mutante, en medio sin hierro adicionado.

Por otra parte, también se estudió la producción de sideróforos del mutante AfurAmediante ensayo en medio CAS-Blue, el cual tiene una tonalidad azul y se torna a naranja en presencia de sideróforos. En la Figura 7, podemos observar como el mutanteAfurAproduce un halo naranja de mayor tamaño, 16,74 mm, que la cepa silvestre DK1622, 9,26 mm.

Además, ha sido analizada la producción de mixoquelinas del silvestre DK1622 y del mutanteAfurAmediante espectrofotometría. Para ello, se inocularon las cepas en matraces de 40 ml de CTT líquido ajustando los cultivos a 0.015 de densidad óptica a 600nm a tiempo 0 horas. Se dejaron incubando los matraces a 30°C en agitación de 300 rpm durante 24 horas. Después, se midió la densidad óptica de los cultivos a 600 nm: 0,27 para la cepa silvestre DK1622 y 0,165 para el mutanteAfurA.Se retiraron las células de los cultivos haciéndolos pasar estos por un filtro, dejando así solamente el sobrenadante que contiene las mixoquelinas. Los sobrenadantes de ambos cultivos se midieron a densidad óptica de 450 nm, dando como resultado 0,08 y 0,154 para la cepa DK1622 yAfurA,respectivamente. Se ajustó la densidad óptica de las mixoquelinas a 450 nm por 1010 bacterias. Dando como resultado 9,18 para la cepa silvestre DK1622 y 36,41 para el mutanteAfurA(Figura 8).

Por lo tanto, este mutante produce constantemente sideróforos en los sobrenadantes en los que crece, a niveles muy superiores con respecto a la cepa silvestre DK1622. Aun creciendo más lento que la bacteria silvestre, permite obtener grandes cantidades de mixoquelinas, del orden de 4 veces más que la bacteria silvestre (Figura 8).

Referencias

1. Jayasinghe, S., Siriwardhana, A., y Karunaratne, V. (2015). Natural iron sequestering agents: their roles in nature and therapeutic potential.International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,7, 8-12. https://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/6444.

2. Kunze, B., Bedorf, N., Kohl, W., Hofle, G., y Reichenbach, H. (1989) Myxochelin A, a new iron-chelating compound fromAngiococcus disciformis(Myxobacterales). Production, isolation, physico-chemical and biological properties.J. Antibiot (Tokyo).42, 14-7. doi: 10.7164/antibiotics.42.14. PMID: 2493439.

3. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Myxochelin-A#section=IUPAC-Name&fullscreen=true

4. Altmeyer, M. (2011). Iron regulation in the MyxobacteriumMyxococcus xanthusDK1622. Tesis doctoral de la Universidad de Saarlandes.

5. Korp, J., Winand, L., Sester, A., y Nett, M. (2018). Engineering pseudochelin production inMyxococcus xanthus. Appl. Environ. Microbiol.84(22):e01789-18. doi: 10.1128/AEM.01789-18. PMID: 30217842; PMCID: PMC6210110.

6. Pérez, J., Contreras-Moreno, F. J., Muñoz-Dorado, J., y Moraleda-Muñoz, A. (2022). Development versus predation: Transcriptomic changes during the lifecycle ofMyxococcus xanthus. Frontiers in Microbiology13, DOI=10.3389/fmicb.2022.1004476.

7. Julien, B., Kaiser, A. D., y Garza, A. (2000). Spatial control of cell differentiation inMyxococcus xanthus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.97, 9098-9103.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Cepa mutante deMyxococcus xanthusobtenida mediante deleción del genfurAde secuencia SEQ ID NO: 2.

2. La cepa según la reivindicación anterior caracterizada por que el mutante es obtenido a partir de la cepa silvestreM. xanthusDK1622.

3. Procedimiento de obtención de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1- 2 que comprende las siguientes etapas:

a) electroporar una cepa silvestre deM. xanthuscon un plásmido que contiene la región aguas arriba y abajo del genfurA,y

b) delecionar el genfurAdel genoma deM. xanthusmediante doble recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma deM. xanthus.

4. El procedimiento de obtención según la reivindicación anterior caracterizado por que el plásmido del paso a) se construye a partir del vector pBJ113 y los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 que anillan con la región aguas arriba del genfurAy los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que anillan con la región aguas abajo del genfurA,digeridos con las enzimas de restricciónHindIIIyBamHIy BamHI y EcoRI respectivamente.

5. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 4 caracterizado por que el plásmido del paso a) es clonado enEscherichia coli.

6. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 5 caracterizado por que además comprende:

c) seleccionar la cepa mutante deM. xanthusque presenta deleción del genfurA.

7 Uso de la cepa mutante deM. xanthussegún cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2 para la producción de mixoquelinas.

8. Procedimiento de obtención de mixoquelinas utilizando la cepa mutante deM. xanthussegún cualquiera de las reivindicaciones 1- 2 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) crecer la cepa mutante deM. xanthusen medio líquido, y

b) extraer las mixoquelinas del sobrenadante.

9. Procedimiento de obtención de mixoquelinas según la reivindicación anterior caracterizado por que el crecimiento de la cepa mutante deM. xanthusse lleva a cabo a temperatura de 30°C.