ES2988961T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica de herencia dominante - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento de la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica de herencia dominante Download PDF

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Abstract

La presente divulgación presenta composiciones y métodos para el tratamiento de la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT), en particular formas de la enfermedad que se heredan de manera autosómica dominante, mediante terapia génica con calsequestrina 2 (CASQ2). Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para tratar la CPVT causada por mutaciones en, por ejemplo, el receptor 2 de rianodina y la calmodulina, como la calmodulina 1 (CALM1) y la CALM3. La divulgación proporciona una variedad de vectores que se pueden utilizar para la administración de un transgén CASQ2 a un paciente, como un paciente humano que padece CPVT autosómica dominante, incluidos vectores de virus adenoasociados, entre otros. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento de la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica de herencia dominante
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la biotecnología de ácidos nucleicos y proporciona composiciones para la utilización en el tratamiento de trastornos genéticos hereditarios.
Antecedentes de la invención.
La taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) se caracteriza por la desregulación de la señalización del calcio en las células cardíacas. Los pacientes con TVPC dominante a menudo presentan una liberación excesiva o desregulada del calcio del retículo sarcoplasmático de los miocitos cardíacos, particularmente durante la diástole. Esta liberación de calcio puede desencadenar una serie de eventos de señalización que terminan en un potencial de acción que puede dar lugar a un latido cardíaco extrasistólico. Lo anterior, a su vez, puede conducir a arritmia, que, si no se trata, puede resultar mortal. Hay una escasez de estrategias disponibles para aliviar con éxito los síntomas de la TVPC, y sigue existiendo una necesidad de terapias curativas para esta enfermedad.
Descripción resumida de la invención
Se describen en la presente memoria composiciones para el uso en el tratamiento de una forma de herencia dominante de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) en un paciente, tal como un paciente humano. Las composiciones y métodos de la descripción se refieren a la administración de un gen codificante de la proteína funcional calsecuestrina 2 (CASQ2, por sus siglas en inglés) en un paciente que sufre de TVPC dominante. Por ejemplo, usando las composiciones indicadas en la presente memoria, puede administrarse un transgén codificante de la proteína CASQ2 funcional en el paciente mediante terapia génica viral. El transgén se puede administrar de tal manera que facilite la expresión de CASQ2 en una célula del paciente, tal como una célula cardíaca (por ejemplo, un miocito cardíaco). La exposición se basa, en parte, en el hallazgo de que la administración de un gen codificante de CASQ2 puede mejorar la TVPC en el paciente que ya expresa una proteína CASQ2 funcional, y que, por el contrario, sufre de una o más mutaciones dañinas en otra proteína reguladora del calcio. Por ejemplo, el paciente puede mostrar una o más de una variedad de mutaciones que dan lugar a TVPC dominante, tal como una mutación de ganancia de función en un gen codificante del receptor de rianodina 2 (RYR2, por sus siglas en inglés) y/o una mutación en un gen codificante de una calmodulina, tal como la calmodulina 1 (CALM1) o la calmodulina 3 (CALM3). Utilizando las composiciones descritas en la presente memoria, la regulación cardíaca del calcio puede ser restaurada en pacientes con TVPC dominante, a pesar de la presencia de mutaciones en diversas proteínas moduladoras del calcio y sin necesidad de proporcionar versiones funcionales de genes endógenos mutados.
En un primer aspecto, la invención proporciona una composición para el uso según se define en la reivindicación 1.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para el uso según se define en la reivindicación 2.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para el uso según se define en la reivindicación 3.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para el uso según se define en la reivindicación 4. En la presente memoria se describe, a modo de un aspecto que no forma parte de la presente invención, un método para el tratamiento o la prevención de la TVPC dominante en un paciente (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano, que lo necesita) mediante la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2.
En la presente memoria se describe, a modo de un aspecto que no forma parte de la presente invención, un método para reducir la arritmia en un paciente (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano) en el que se ha diagnosticado TVPC dominante, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2. Por ejemplo, la exposición describe un método de reducción de la cantidad de eventos de arritmia en un paciente (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano) a quien se ha diagnosticado que presenta TVPC dominante, mediante la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2. Por ejemplo, la exposición describe adicionalmente un método de reducción de la frecuencia de eventos de arritmia en un paciente (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano) a quien se ha diagnosticado que presenta TVPC dominante, mediante la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2.
En la presente memoria se describe, a modo de un aspecto que no forma parte de la presente invención, un método para restaurar la homeostasis del calcio en el corazón de un paciente (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano) al que se ha diagnosticado TVPC dominante, mediante la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2.
En la presente memoria se describe, a modo de un aspecto que no forma parte de la presente invención, un método para reducir las liberaciones espontáneas de calcio, por ejemplo, en el miocito cardíaco (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano) al que se ha diagnosticado TVPC dominante, mediante la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2.
En la presente memoria se describe, a modo de un aspecto que no forma parte de la presente invención, un método para reducir las despolarizaciones tardías en un paciente (p. ej., un mamífero, tal como un paciente humano) en el que se ha diagnosticado TVPC dominante, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2.
El paciente muestra una mutación de ganancia de función en un gen endógeno codificante de RYR2. Por ejemplo, la mutación en RYR2 puede resultar en un aumento de la liberación de calcio citosólico en un miocito cardíaco que se pone en contacto con un agonista de RYR2 en comparación con un miocito cardíaco que no ha sido puesto en contacto con el agonista de RYR2. Particularmente, la mutación en RYR2 puede ser R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y/o R4959Q.
Por ejemplo, el paciente puede presentar una combinación de dos o más de las mutaciones en RYR2 indicadas anteriormente. En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación R4497C y una mutación N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S o R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación N4104K y una o más de las mutaciones R4497C, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación N4895D y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación R176Q y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación G178A y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación R420W y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación G178A y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación L433P y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación P1067S y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación S2246L y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, R420W y R4496L, G178A, L433P, P1067S, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación G2273R y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación F2307L y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación E2311D y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación L2344P y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, R420W y R444P, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación R2474S y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación T2504M y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación K3717R y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación L3778F y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación G3926D y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación G3946S y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación Q4159P y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación V4319-K4324dup y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación R4651I y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación V4771I y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación F4851L y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación A4860G y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, I4867M, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación I4867M y uno o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, P4902S y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación P4902S y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M y R4959Q.
En algunas realizaciones, el paciente presenta la mutación R4959Q y una o más de las mutaciones R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M y P4902S.
En algunas realizaciones, el paciente muestra una mutación en un gen endógeno codificante de una calmodulina. Por ejemplo, el paciente puede presentar una mutación en CALM1, tal como una mutación que reduce la inhibición de CALM1 de la liberación de calcio del retículo sarcoplasmático de un miocito cardíaco.
En algunas realizaciones, el CALM1 que alberga la mutación activa directamente la liberación de calcio del retículo sarcoplasmático del miocito cardíaco. Por ejemplo, la mutación puede aumentar la estabilidad de una conformación abierta de RYR2 en el complejo CALM1-RYR2 presente en una solución acuosa que presenta una concentración de Ca2+de entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 5 pM (p. ej., una concentración de Ca2+de entre aproximadamente 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 Mm, 300 nM, 35o nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM o 5 pM). En algunas realizaciones, la mutación en CALM1 es N97S o N53I.
En algunas realizaciones, el paciente presenta una mutación en CALM3, tal como una mutación que resulta en la activación directa de la liberación de calcio del retículo sarcoplasmático en el miocito cardíaco. En algunas realizaciones, la mutación en CALM3 es A103V.
En algunas realizaciones, la mutación en RYR2 o una calmodulina (p. ej., CALM1 y/o CALM3) es heterocigótica.
En algunas realizaciones (p. ej., en las que se trata a un paciente humano), se muestra el transgén CASQ2 codifica una proteína que presente una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1) . El transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos SEC iD n.° 1. Por ejemplo, el transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente hasta 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 25 sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica para una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEC ID n.° 1 solo en sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En algunas realizaciones (p. ej., en las que se somete a tratamiento a un paciente humano), el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. Por ejemplo, el transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente hasta 50 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sustituciones no conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 25 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 10 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1.
En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEC iD n.° 3 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 3) . El transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3. Por ejemplo, el transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente hasta 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 25 sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica para una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEC ID n.° 3 solo en sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras respecto a la secuencia de aminoácidos<s>E<c>iD n.° 3. Por ejemplo, el transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente hasta 50 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sustituciones no conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 25 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3. En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 codifica una proteína que presenta hasta 10 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 3.
En algunas realizaciones (p. ej., en las que se somete a tratamiento a un paciente humano), el transgén CASQ2 presenta una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 2 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 2) .
En algunas realizaciones, el transgén CASQ2 presenta una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 4 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 4) .
En algunas realizaciones, la composición que contiene el transgén CASQ2 es un vector, tal como un vector viral. El vector viral puede ser, por ejemplo, un virus adenoasociado (VAA), adenovirus, lentivirus, retrovirus, virus de la viruela, baculovirus, virus del herpes simple, virus vaccinia o un virus sintético (p. ej., un virus quimérico, un virus de mosaico o un virus pseudotipado, y/o un virus que contiene una proteína foránea polímero sintético, nanopartícula y/o molécula pequeña). En algunas realizaciones, el vector viral es un vector VAA, tal como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, V<a>A6, VAA7, VAA8, VAA9, o vector de serotipo VAArh74. El vector VAA puede ser pseudotipado. En algunas realizaciones, el vector VAA pseudotipado es VAA2/8 o AV2/9.
En algunas realizaciones, la composición es un vector (p. ej., un vector viral, tal como un vector VAA descrito anteriormente, p. ej., un vector VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAArh74, VAA2/8, o AV2/9), y el vector se administra en el paciente a una dosis de aproximadamente 1x106copias genómicas (CG)/kg a aproximadamente 1x1018CG/kg (p. ej., a una dosis de aproximadamente 1x106 CG/kg, 2x106 CG/kg, 3x106 CG/kg, 4x106 CG/kg, 5x106 CG/kg, 6x106 CG/kg, 7x106 CG/kg, 8x106 CG/kg, 9x106 CG/kg, 1x107 CG/kg, 2x107 CG/kg, 3x107 CG/kg, 4x107 CG/kg, 5x107 CG/kg, 6x107 CG/kg, 7x107 CG/kg, 8x107 CG/kg, 9x107 CG/kg, 1x108 CG/kg, 2x108 CG/kg, 3x108 CG/kg, 4x108 CG/kg, 5x108 CG/kg, 6x108 CG/kg, 7x108 CG/kg, 8x108 CG/kg, 9x108 CG/kg, 1x109 CG/kg, 2x109 CG/kg, 3x109 CG/kg, 4x109 CG/kg, 5x109 CG/kg, 6x109 CG/kg, 7x109 CG/kg, 8x109 CG/kg, 9x109 CG/kg, 1x1010 CG/kg, 2x1010 CG/kg, 3x1010 CG/kg, 4x1010 CG/kg, 5x1010 CG/kg, 6 x1010 CG/kg, 7x1010 CG/kg, 8x1010 CG/kg, 9x1010 CG/kg, 1x1011 CG/kg, 2x1011 CG/kg, 3x1011 CG/kg, 4x1011 CG/kg, 5x1011 CG/kg, 6x1011 CG/kg, 7x1011 CG/kg, 8x1011 CG/kg, 9x1011 CG/kg, 1x1012 CG/kg, 2x1012 CG/kg, 3x1012 CG/kg, 4x1012 CG/kg, 5x1012 CG/kg, 6x1012 CG/kg, 7x1012 CG/kg, 8x1012 CG/kg, 9x1012 CG/kg, 1x1013 CG/kg, 2x1013 CG/kg, 3x1013 CG/kg, 4x1013 CG/kg, 5x1013 CG/kg, 6x1013 CG/kg, 7x1013 CG/kg, 8x1013 CG/kg, 9x1013 CG/kg, 1x1014 CG/kg, 2x1014 CG/kg, 3x1014 CG/kg, 4x1014 CG/kg, 5x1014 CG/kg, 6x1014 CG/kg, 7x1014 CG/kg, 8x1014 CG/kg, 9x1014 CG/kg, 1x1015 CG/kg, 2x10 15 CG/kg, 3x1015 CG/kg, 4x1015 CG/kg, 5x1015 CG/kg, 6x1015 CG/kg, 7x1015 CG/kg, 8x1015 CG/kg, 9x 1015 CG/kg, 1x1016 CG/kg, 2x1016 CG/kg, 3x1016 CG/kg, 4x1016 CG/kg, 5x1016 CG/kg, 6x1016 CG/kg, 7x1016 CG/kg, 8x1016 CG/kg, 9x1016 CG/kg, 1x1017 CG/kg, 2x1017 CG/kg, 3x1017 CG/kg, 4x1017 CG/kg, 5x1017 CG/kg, 6x1017 CG/kg, 7x1017 CG/kg, 8x1017 CG/kg, 9x1017 CG/kg, o 1x1018 CG/kg). En algunas realizaciones, el vector se administra en el paciente a una dosis de entre aproximadamente 1x108 CG/kg y aproximadamente 1x1016 CG/kg (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 1x108 CG/kg, 2x108 CG/kg, 3x108 CG/kg, 4x108 CG/kg, 5x108 CG/kg, 6x108 CG/kg, 7x108 CG/kg, 8x108 CG/kg, 9x108 CG/kg, 1x109 CG/kg, 2x109 CG/kg, 3x109 CG/kg, 4x109 CG/kg, 5x109 CG/kg, 6x109 CG/kg, 7x109 CG/kg, 8x109 CG/kg, 9x109 CG/kg, 1x1010 CG/kg, 2 x1010 CG/kg, 3x1010 CG/kg, 4x1010 CG/kg, 5x1010 CG/kg, 6x1010 CG/kg, 7x1010 CG/kg, 8 x1010 CG/kg, 9x1010 CG/kg, 1x1011 CG/kg, 2x1011 CG/kg, 3x1011 CG/kg, 4x1011 CG/kg, 5x1011 CG/kg, 6x1011 CG/kg, 7x1011 CG/kg, 8x1011 CG/kg, 9x1011 CG/kg, 1x1012 CG/kg, 2x1012 CG/kg, 3x1012 CG/kg, 4x1012 CG/kg, 5x1012 CG/kg, 6x1012 CG/kg, 7x1012 CG/kg, 8x1012 CG/kg, 9x1012 CG/kg, 1x1013 CG/kg, 2x1013 CG/kg, 3x1013 CG/kg, 4x1013 CG/kg, 5x1013 CG/kg, 6x1013 CG/kg, 7x1013 CG/kg, 8x1013 CG/kg, 9x1013 CG/kg, 1x1014 CG/kg, 2x1014 CG/kg, 3x1014 CG/kg, 4x1014 CG/kg, 5x1014 CG/kg, 6x1014 CG/kg, 7x1014 CG/kg, 8x1014 CG/kg, 9x1014 CG/kg, 1x1015 CG/kg, 2x1015 CG/kg, 3x1015 CG/kg, 4x1015 CG/kg, 5x1015 CG/kg, 6x1015 CG/kg, 7x1015 CG/kg, 8x1015 CG/kg, 9x1015 CG/kg, o 1x1016 CG/kg). En algunas realizaciones, el vector se administra en el paciente a una dosis de entre aproximadamente 1x1010 CG/kg y aproximadamente 1x1014 CG/kg (p. ej., a una dosis de aproximadamente 1x1010 CG/kg, 2 x10 10 CG/kg, 3x1010 CG/kg, 4x1010 CG/kg, 5x1010 CG/kg, 6x1010 CG/kg, 7x1010 CG/kg, 8x1010 CG/kg, 9x1010 CG/kg, 1x1011 CG/kg, 2x1011 CG/kg, 3x1011 CG/kg, 4x1011 CG/kg, 5x1011 CG/kg, 6x1011 CG/kg, 7x1011 CG/kg, 8x1011 CG/kg, 9x1011 CG/kg, 1x1012 CG/kg, 2x1012 CG/kg, 3x1012 CG/kg, 4x1012 CG/kg, 5x1012 CG/kg, 6x1012 CG/kg, 7x1012 CG/kg, 8x1012 CG/kg, 9x1012 CG/kg, 1x1013 CG/kg, 2x1013 CG/kg, 3x1013 CG/kg, 4x1013 CG/kg, 5x1013 CG/kg, 6x1013 CG/kg, 7x1013 CG/kg, 8x1013 CG/kg, 9x1013 CG/kg o 1x1014 CG/kg).
En algunas realizaciones, la composición es un liposoma, vesícula, vesícula sintética, exosoma, exosoma sintético, dendrímero o nanopartícula.
En algunas realizaciones, el transgén codificante de CASQ2 está ligado operablemente a un promotor que induce la expresión de CASQ2 en un miocito cardíaco. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor de desmina, promotor de citomegalovirus, promotor de la cadena ligera de miosina-2, promotor de actina alfa, promotor de troponina 1, promotor del intercambiador Na+/Ca2+, promotor de distrofina, promotor de creatina quinasa, promotor de la integrina alfa 7, promotor del péptido natriurético cerebral, promotor de alfa B-cristalina/promotor de proteína de choque térmico pequeña, promotor de cadena pesada alfa de la miosina o promotor del factor natriurético auricular. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de desmina.
En algunas realizaciones, el promotor de desmina contiene una región que presenta la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -984 a 76 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena, o una región que es por lo menos 85 % idéntica (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica) a dicha secuencia de ácido nucleico). En algunas realizaciones, el promotor de desmina contiene una región que presenta la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -973 a -693 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena, o una región que es por lo menos 85 % idéntica (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica) a dicha secuencia de ácido nucleico). En algunas realizaciones, el promotor de desmina contiene una región que presenta la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -984 a -644 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena, o una región que es por lo menos 85 % idéntica (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica) a dicha secuencia de ácido nucleico). En algunas realizaciones, el promotor de desmina contiene una región que presenta la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -269 a 76 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena, o una región que es por lo menos 85 % idéntica (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica) a dicha secuencia de ácido nucleico).
En algunas realizaciones, el promotor de desmina contiene una primera región que presenta (i) la secuencia de ácido nucleico de nucleótidos -973 a -693 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena o (ii) una identidad de secuencia de por lo menos 85%(p. ej., una identidad de secuencia de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) respecto a la secuencia de ácido nucleico de nucleótidos -973 a -693 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena.
El promotor de desmina puede contener, además, una segunda región que presenta (i) la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -269 a 76 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina humana endógena o (ii) una identidad de secuencia de por lo menos 85 % (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o una identidad de secuencia 100 %) respecto a la secuencia de ácido nucleico de nucleótidos -269 a 76 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena.
En algunas realizaciones, la primera región está operativamente ligada a la segunda región. Por ejemplo, la primera región puede unirse directamente a la segunda región, con o sin nucleótidos intermedios. En algunas realizaciones, la primera región se encuentra en el lado 5' de la segunda región (es decir, de tal manera que el extremo 3' de la primera región está unido al extremo 5' de la segunda región). En algunas realizaciones, la primera región se encuentra en el lado 3' de la segunda región (es decir, de tal manera que el extremo 5' de la primera región está unido al extremo 3' de la segunda región).
En algunas realizaciones, el promotor de desmina puede contener una primera región que presenta (i) la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -984 a -644 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina humana endógena o (ii) una identidad de secuencia de por lo menos 85 % (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) respecto a la secuencia de ácido nucleico de nucleótidos -984 a -644 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena. El promotor de desmina puede contener, además, una segunda región que presenta (i) la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos -269 a 76 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina humana endógena o (ii) una identidad de secuencia de por lo menos 85 % (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o una identidad de secuencia 100 %) respecto a la secuencia de ácido nucleico de nucleótidos -269 a 76 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la desmina humana endógena. En algunas realizaciones, la primera región está operativamente ligada a la segunda región. Por ejemplo, la primera región puede unirse directamente a la segunda región, con o sin nucleótidos intermedios. En algunas realizaciones, la primera región se encuentra en el lado 5' de la segunda región (es decir, de tal manera que el extremo 3' de la primera región está unido al extremo 5' de la segunda región). En algunas realizaciones, la primera región se encuentra en el lado 3' de la segunda región (es decir, de tal manera que el extremo 5' de la primera región está unido al extremo 3' de la segunda región).
Los promotores de desmina de ejemplo que pueden utilizarse junto con las composiciones y métodos de exposición se describen en Gao et al., Journal of Biological Chemistry 273:6402-6409 (1998).
En algunas realizaciones, tras la administración de la composición en el paciente, la expresión de CASQ2 aumenta en una célula cardíaca (p. ej., un miocito cardíaco) en el paciente. La expresión de CASQ2 puede evaluarse, por ejemplo, mediante la medición de la proteína CASQ2 o del ARNm de CASQ2 utilizando ensayos de expresión génica conocidos de la técnica y descritos en la presente memoria. Tras la administración de la composición en el paciente, la expresión de CASQ2 en la célula cardíaca puede incrementarse, por ejemplo, en un factor de entre aproximadamente 1,1 y aproximadamente 10, o superior (p. ej., aproximadamente 1,1 , 1,2 , 1,3 , 1,4 , 1,5 , 1,6 , 1,7 , 1,8 , 1 ,9 ,2 ,2 ,1 , 2 ,2 ,2 ,3 ,2 ,4 ,2 ,5 ,2 ,6 ,2 ,7 ,2 ,8 ,2 ,9 , 3 , 3,1 , 3 ,2 ,3 ,3 , 3 ,4 ,3 ,5 , 3 ,6 ,3 ,7 ,3 ,8 ,3 ,9 ,4 ,4 ,1 , 4,2 , 4,3 , 4,4 , 4,5 , 4,6 ,4 ,7 ,4 ,8 ,4 ,9 ,5 , 5,1 , 5 ,2 ,5 ,3 , 5 ,4 ,5 ,5 ,5 ,6 ,5 ,7 ,5 ,8 , 5 ,9 ,6 ,6,1 , 6 ,2 ,6 ,3 ,6 ,4 ,6 ,5 ,6,6 , 6 ,7 ,6,8 ,6,9 , 7 , 7,1 , 7 ,2 ,7 ,3 , 7 ,4 ,7 ,5 , 7 ,6 ,7 ,7 , 7,8 , 7,9 , 8 ,8,1 , 8 ,2 ,8 ,3 ,8 ,4 ,8 ,5 ,8,6 ,8 ,7 ,8,8 , 8 ,9 ,9 , 9,1 , 9 ,2 ,9 ,3 , 9 ,4 ,9 ,5 , 9 ,6 ,9 ,7 , 9,8 , 9,8 , 10 o superior). Por ejemplo, la expresión de CASQ2 se puede incrementar en un factor de entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 3,5 en la célula cardíaca (p. ej., de aproximadamente 0,5 , 1,6 , 1,7 , 1,8 , 1,6 , 1 ,9 ,2 ,2 ,1 , 2 ,2 ,2 ,3 ,2 ,4 ,2 ,5 ,2 ,6 ,2 ,7 ,2 ,8 ,2 ,9 ,3 , 3,1 , 3 ,2 ,3 ,3 , 3,4 o 3,5). En algunas realizaciones, la expresión de CASQ2 se incrementa en un factor de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 en la célula (p. ej., en un factor de aproximadamente 2, 2,1 , 2 ,2 ,2 ,3 ,2 ,4 ,2 ,5 ,2 ,6 ,2 ,7 ,2 ,8 ,2 ,9 o 3). En algunas realizaciones, la expresión de CASQ2 se incrementa en un factor de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3 en la célula (p. ej., un factor de 2 ,5 ,2 ,6 ,2 ,7 ,2 ,8 ,2 ,9 o 3).
En algunas realizaciones, tras la administración de la composición en el paciente, la expresión de RYR2, triadina y/o junctina no se altera sustancialmente en la célula cardíaca (p. ej., en el miocito cardíaco) en el paciente, según se valora, por ejemplo, mediante la evaluación de la expresión de proteínas y/o del ARNm. Por ejemplo, tras la administración de la composición en el paciente, la expresión de RYR2, triadina y/o junctina aumenta y/o disminuye en menos de 10 % (por ejemplo, 9,9 %, 9,8 %, 9,7 %, 9,6 %, 9,5 %, 9,4 %, 9,3 %, 9,2 %, 9,1 %, 9 %, 8,9 %, 8,8 %, 8,7 %, 8,6 %, 8,5 %, 8,4 %, 8,3 %, 8,2 %, 8,1 %, 8 %, 7,9 %, 7,8 %, 7,7 %, 7,6 %, 7,5 %, 7,4 %, 7,3 %, 7,2 %, 7,1 %, 7 %, 6,9 %, 6,8 %, 6,7 %, 6,6 %, 6,5 %, 6,4 %, 6,3 %, 6,2 %, 6,1 %, 6 %, 5,9 %, 5,8 %, 5,7 %, 5,6 %, 5,5 %, 5,4 %, 5,3 %, 5,2 %, 5,1 %, 5 %, 4,9 %, 4,8 %, 4,7 %, 4,6 %, 4,5 %, 4,4 %, 4,3 %, 4,2 %, 4,1 %, 4 %, 3,9 %, 3,8 %, 3,7 %, 3,6 %, 3,5 %, 3,4 %, 3,3 %, 3,2 %, 3,1 %, 3 %, 2,9 %, 2,8 %, 2,7 %, 2,6 %, 2,5 %, 2,4 %, 2,3 %, 2,2 %, 2,1 %, 2 %, 1,9 %, 1,8 %, 1,7 %, 1,6 %, 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, o menos).
En algunas realizaciones, la composición se administra en el paciente por vía intravenosa, intratecal, intramuscular, intradérmica, transdérmica, etc. parenteral, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intraarterial, intravascular, inhalación, perfusión, lavado y/o administración oral.
En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, en la presente memoria se describe un kit que incluye una composición que contiene un transgén codificante de CASQ2. El kit puede incluir, además, un impreso en el paquete con instrucciones para el usuario del kit para administrar la composición en el paciente (p., ej., un paciente humano) para tratar la TVPC dominante o un síntoma de la misma en el paciente de acuerdo con el método de cualquiera de los aspectos anteriores de la invención y/o cualquiera de las realizaciones anteriormente proporcionadas de la misma.
En algunas realizaciones del aspecto anterior, el transgén de CASQ2 codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1) .
En algunas realizaciones del aspecto anterior, el transgén de CASQ2 codifica una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 2 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 2) .
En algunas realizaciones del aspecto anterior, la composición que contiene el transgén CASQ2 es un vector, tal como un vector viral. El vector viral puede ser, por ejemplo, un virus adenoasociado (VAA), adenovirus, lentivirus, retrovirus, virus de la viruela, baculovirus, virus del herpes simple o virus vaccinia. En algunas realizaciones, el vector viral es un vector VAA, tal como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, o vector de serotipo VAArh74. El vector VAA puede ser pseudotipado. En algunas realizaciones, el vector VAA pseudotipado es VAA2/8 o AV2/9.
En algunas realizaciones del aspecto anterior, la composición es un liposoma, vesícula, vesícula sintética, exosoma, exosoma sintético, dendrímero o nanopartícula.
En algunas realizaciones del aspecto anterior, el transgén codificante de CASQ2 está ligado operablemente a un promotor que induce la expresión de CASQ2 en un miocito cardíaco. Por ejemplo, el promotor puede ser el promotor de desmina, el promotor de la cadena ligera de la miosina-2, el promotor de la actina alfa, el promotor de la troponina 1, el promotor del intercambiador Na+/Ca2+, el promotor de la distrofina, el promotor de la creatina quinasa, el promotor de la integrina alfa-7, el promotor del péptido natriurético cerebral, el promotor de proteínas de choque térmico pequeñas, el promotor de la cadena pesada de la miosina alfa o el promotor del factor natriurético auricular.
Definiciones
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aproximadamente" se refiere a un valor que es superior o inferior en como máximo 10 % al valor que se indica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "calmodulina 1" ("CALM1") y "calmodulina 3" ("CALM3") se refieren a la proteína de unión al calcio de la calmodulina expresada como mensajeros secundarios, por ejemplo, en las células musculares (p. ej., en miocitos cardíacos). CALM1 y CALM3 ayudan a regular la concentración citosólica de iones de calcio divalente. Una secuencia de ejemplo de aminoácidos de CALM1 de tipo salvaje se encuentra en la secuencia de referencia de NCBI n.° NP_008819.1. Del mismo modo, una secuencia de ejemplo de aminoácidos de CALM3 de tipo salvaje se encuentra en la secuencia de referencia de NCBI n.° NP_001316851.1.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "calsecuestrina 2" y "CASQ2" se refieren a la proteína de unión al calcio responsable de regular las concentraciones citosólicas de calcio divalente, por ejemplo, en el tejido muscular, tal como en los miocitos cardíacos. En el ser humano, el gen natural codificante de CASQ2 se encuentra localizado en el cromosoma 1 y también se conoce como "PDIB2". Los términos "calsecuestrina 2", "CASQ2" y "PDIB2" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren no solo a formas de tipo salvaje de CASQ2, sino también a variantes de proteínas CASQ2 de tipo salvaje y ácidos nucleicos codificantes de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de CASQ2 humano de tipo salvaje se proporcionan en la presente memoria como SEC ID n.° 1, y se caracteriza en la técnica como secuencia de referencia del NCBI n.° NP_001223.2. Además, las secuencias de ácido nucleico de CASQ2 humano de tipo salvaje se proporcionan en la presente memoria como SEC ID n.° 2, y se caracterizan en la técnica como secuencia de referencia del NCBI n.° NP_001223.2. Entre los transgenes CASQ2 que se pueden utilizar junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen aquellos codificante de una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1), así como los transgenes codificante de una proteína que presenta una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos (p. ej., de hasta 5, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 25, hasta 30, hasta 35, hasta 40, hasta 45, o hasta 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos) y/o una o más sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., hasta 5, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 25, hasta 30, hasta 35, hasta 40, hasta 45 o hasta 50 sustituciones de aminoácidos no conservadoras) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. Entre los transgenes de CASQ2 de ejemplo que se pueden utilizar junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen aquellos que presentan una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 85%idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2 (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2) . Los transgenes CASQ2 en la presente memoria incluyen, además, aquellos fragmentos de las proteínas anteriores que conservan la capacidad de polimerizar y unirse al calcio divalente, por ejemplo, con una afinidad que es superior o inferior como máximo en 25 % (p. ej., con una afinidad superior o inferior en como máximo 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o 25 %) a la afinidad de CASQ2 de tipo salvaje y/o con una estequiometría que se desvía de la de CASQ2 de tipo salvaje en no más de 25 % (por ejemplo, no más de 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos). Se conocen de la técnica y se describen ejemplos de ensayos que pueden usarse para evaluar la afinidad de unión al calcio en, por ejemplo, Johnson et al. Methods Mol. Biol. 173:89-102 (2002).
Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica" y "TVPC" se refieren a una canalopatía hereditaria caracterizada por una alta susceptibilidad del paciente a arritmias potencialmente mortales. Se han descrito dos formas de la enfermedad: la variante autosómica dominante y la variante autosómica recesiva. La forma autosómica dominante de la enfermedad está asociada a mutaciones en el gen del receptor de rianodina cardíaca tipo 2 (RYR2), mientras que la variante autosómica recesiva está asociada a mutaciones en el gen CASQ2 (ver, por ejemplo, Priori et al., Circulation 104 (Suplemento II):335 (2001), y Lahat et al., Enm. J. Hum. Genet. 69:1378-1384 (2001).
Los pacientes que presentan la enfermedad de herencia dominante, denominada indistintamente en la presente memoria "TVPC dominante" y "TVPC autosómico dominante", habitualmente presentan taquicardia ventricular bidireccional y polimórfica en respuesta a la activación simpática. Los perfiles electrocardiográficos en reposo de los pacientes que presentan TVPC dominante no son notables y la estructura cardíaca se encuentra conservada. Las arritmias en la TVPC son provocadas por eventos de liberación de calcio que no son desencadenados por un potencial de acción, referidos en la presente memoria como "liberaciones espontáneas de calcio" o "LEC". El LEC se inicia como un evento localizado que involucra una sola unidad de liberación de calcio (ULC), aunque también puede difundirse a ULC vecinas, desencadenando de esta manera una mayor liberación de calcio, lo que resulta en una onda de calcio en toda la célula. Cuando se produce una liberación anormal de calcio del retículo sarcoplásmico, el potencial de acción resultante puede propagarse a todo el corazón, lo que resulta en un latido extrasistólico. Cuando esta cadena de eventos se vuelve repetitiva, se desencadena actividad arrítmica. La TVPC dominante es a menudo causada por mutaciones en el receptor de rianodina 2 (RYR2), que han demostrado facilitar la aparición de LEC durante la estimulación p-adrenérgica. Las arritmias generadas como resultado de esta desregulación de la actividad del calcio pueden conducir a arritmias potencialmente mortales (ver, por ejemplo, Liu et al., Circulation Research 99:292-298 (2006).
Entre las mutaciones en RYR2 que se asocian con la TVPC dominante se incluyen R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q.
Tal como se usa en la presente memoria, las mutaciones en las proteínas se representan usando la forma "AA1-N-AA2", donde AA1 representa el aminoácido que ocurre en la posición N de la forma de tipo salvaje de la proteína de interés, y AA2 representa el aminoácido que ocurre en la posición N de la forma mutada de la proteína. Por ejemplo, el mutante RYR2 "R4497C" se refiere a una forma variante de RYR2 en la que el residuo de arginina en la posición 4497 de la proteína RYR2 de tipo salvaje se reemplaza por un residuo de cisteína. El mutante RYR2 "V4319-K4324dup" se refiere a una forma variante del gen RYR2 en la que están duplicados los nucleótidos codificante de los residuos de aminoácidos V4319 a K4324 de RYR2 de tipo salvaje, lo que resulta en una inserción de una instancia adicional de los 18 nucleótidos codificante de dichos aminoácidos (p. ej., una inserción de los residuos GTCGAAGGTGCTAAAAAG (SEC ID n.° 7) Entre los nucleótidos 12955 y 12956 de un gen RYR2 de tipo salvaje).
Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "mutación conservadora", "sustitución conservadora" o "sustitución conservadora de aminoácidos" se refieren a una sustitución de uno o más aminoácidos por uno o más aminoácidos diferentes que muestran propiedades fisicoquímicas similares, tales como polaridad, carga electrostática y volumen estérico. Estas propiedades se resumen para cada uno de los veinte aminoácidos naturales en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas representativas de los aminoácidos naturales
(continuación)
En esta tabla se aprecia que las familias de aminoácidos conservadores incluyen, p. ej., (i) G, A, V, L, I, P y M; ii) D y E; iii) C, S y T; iv) H, K y R; (v) N y Q; y (vi) F, Y y W. Una mutación o sustitución conservadora es, por lo tanto, aquella que sustituye un aminoácido por un miembro de la misma familia de aminoácidos (p. ej., una sustitución de Ser por Thr o Lys por Arg).
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "promotor de desmina" se refiere a (i) un polinucleótido que presenta la secuencia de ácidos nucleicos del promotor endógeno de desmina humana, definido por los nucleótidos -984 a 76, ambos inclusive, con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina humana, así como a (ii) variantes y porciones funcionales de los mismos. Por ejemplo, entre los promotores de desmina que se pueden utilizar junto con las composiciones y métodos de la exposición se incluyen aquellos que son por lo menos 85 % idénticos (por ejemplo, idénticos al 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 % o más) respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos -984 a 76, ambos inclusive, con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina humana y que promueven la expresión de un transgén de CASQ2 en una célula (p. ej., una célula eucariótica, tal como una célula de mamífero, una célula humana, o una célula cardiomiocito humana) cuando el transgén está ligado operablemente al promotor. Son ejemplos adicionales de promotores de desmina que pueden utilizarse junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria los descritos en Gao et al., Journal of Biological Chemistry 273:6402-6409 (1998).
Tal como se utiliza en la presente memoria en el contexto de un elemento regulador de la transcripción, tal como un promotor, la expresión "porción funcional" se refiere a una porción de un ácido nucleico más grande que conserva la capacidad de estimular la transcripción de un gen de interés en una célula diana. Por ejemplo, el promotor endógeno de desmina humana contiene los nucleótidos -984 a 76, ambos inclusive, con respecto al sitio de inicio de transcripción de la desmina. Son ejemplos de porciones funcionales de este locus que son capaces de retener las propiedades activadoras de la transcripción del ácido nucleico más grande las regiones que contienen nucleótidos -973 a -693, ambos inclusive, con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina. Son ejemplos adicionales las regiones que contienen nucleótidos -269 a 76, ambos inclusive, con respecto al sitio de inicio de la transcripción de desmina.
Del mismo modo, tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "promotor de citomegalovirus", "promotor de cadena ligera de miosina-2", "promotor de actina alfa", "promotor de troponina 1", "promotor del intercambiador Na+/Ca2+", "promotor de distrofina", "promotor de creatina quinasa", "promotor de integrina alfa-7", "promotor de péptido natriurético cerebral" se refieren a las formas de tipo salvaje del promotor de citomegalovirus humano endógeno, promotor de la cadena ligera 2 de la miosina, promotor de actina alfa, promotor de troponina 1, promotor de intercambio Na+/Ca2+, promotor de distrofina, promotor de creatina quinasa, promotor de integrina alfa-7, promotor de péptido natriurético cerebral, promotor de alfa B-cristalina/proteína de choque térmico pequeña, promotor de cadena pesada de miosina alfa y promotor de factor natriurético auricular, respectivamente, así como variantes y porciones funcionales de los mismos.
Tal como se utiliza en la presente memoria en el contexto de una mutación, el término "heterocigótico" se refiere al caso en el que un paciente presenta un alelo mutante de un gen particular: un alelo materno mutante o un alelo paterno mutante.
Tal como se utiliza en la presente memoria en el contexto de una mutación, el término "homocigótico" se refiere al caso en el que un paciente presenta dos alelos mutantes de un gen particular: un alelo materno mutante y un alelo paterno mutante.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "mutación de ganancia de función" se refiere a una mutación en la que la función de una proteína es potenciada en virtud de la sustitución, inserción y/o eliminación de uno o más aminoácidos dentro de la proteína. Por ejemplo, la proteína del receptor de rianodina 2 (RYR2) es una proteína de canal que media en la liberación de iones de calcio divalente del retículo sarcoplasmático de los miocitos cardíacos en el citosol. Las mutaciones de ejemplo de ganancia de función en el contexto de RYR2 son aquellas que resultan en una exportación elevada de calcio mediada por RYR2 desde el retículo sarcoplasmático. Entre las mutaciones de ganancia de función en RYR2 se incluyen R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y/o R4959Q, entre otros.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "operablemente ligado" se refiere a una primera molécula (p. ej., un primer ácido nucleico) unida a una segunda molécula (p. ej., un segundo ácido nucleico), en donde las moléculas están dispuestas de tal manera que la primera molécula afecta a la función de la segunda molécula. Las dos moléculas pueden o no ser parte de una sola molécula contigua y pueden o no ser contiguos entre sí. Por ejemplo, un promotor está ligado operablemente a una molécula polinucleótida transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula polinucleótida transcribible de interés en la célula. Además, dos porciones de un elemento regulador de la transcripción están conectadas operablemente entre sí si se unen de tal manera que la funcionalidad de activación de la transcripción de una porción no resulta afectada adversamente por la presencia de la otra porción. Dos elementos reguladores de la transcripción pueden estar operativamente ligados entre sí por medio de un ácido nucleico conector (p. ej., un ácido nucleico intermedio no codificante) o pueden estar operablemente ligados entre sí en ausencia de nucleótidos intermedios.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia polinucleótida o polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de ácidos nucleicos o aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los ácidos nucleicos o aminoácidos en la secuencia polinucleótida o polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se puede conseguir de diversas maneras que están dentro de las capacidades del experto en la materia, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2 o Megalign. Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Por ejemplo, se pueden generar valores de porcentaje de identidad de secuencias utilizando el programa informático de comparación de secuencias BLAST. A título ilustrativo, el porcentaje de identidad de una secuencia dada de ácido nucleico o aminoácidos, A, respecto a, con o frente a una secuencia determinada de ácido nucleico o aminoácidos, B (que puede expresarse alternativamente como una secuencia determinada de ácido nucleico o aminoácidos, A que presenta un determinado porcentaje de identidad de secuencias respecto a, con o frente a una determinada secuencia de ácido nucleico o aminoácidos, B) se calcula de la siguiente manera:
100 multiplicado por (la fracción X/Y)
donde X es el número de nucleótidos o aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por un programa de alineación de secuencias (p. ej., BLAST) en la alineación de A y B de este programa, y donde Y es el número total de ácidos nucleicos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos B, el porcentaje de identidad de secuencias entre A y B no será igual al porcentaje de identidad de secuencias entre B y A.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla que contiene un agente terapéutico, opcionalmente en combinación con uno o más excipientes, diluyentes y/o portadores farmacéuticamente aceptables para la administración en un sujeto, tal como un mamífero, p. ej., un ser humano, con el fin de prevenir, tratar o controlar una enfermedad o afección particular que afecta o puede afectar al sujeto.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de administración, que resultan adecuados para el contacto con los tejidos de un sujeto, tal como un mamífero (p. ej., un ser humano) sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica y otras complicaciones problemáticas proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "receptor de rianodina 2" y "RYR2" se refieren a la proteína de canal de calcio ubicada en el exterior del retículo sarcoplasmático, por ejemplo, en los miocitos cardíacos. RYR2 media en la liberación de calcio divalente del retículo sarcoplasmático, que a su vez estimula los potenciales de acción que conducen a contracciones cardíacas. Una secuencia de ejemplo de aminoácidos de RYR2 humano de tipo salvaje se encuentra en la secuencia de referencia de NCBI n.° NP_001026.2.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "agonista del receptor 2 de rianodina" y "agonista de RYR2" se refieren a agentes que estimulan las propiedades de liberación de calcio de la proteína del canal RYR2. Entre los agonistas de ejemplo de RYR2 se incluyen, aunque sin limitación, cafeína, epinefrina, trifluoroperazina, y maurocalcina, entre otros.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "muestra" se refiere a una muestra (p. ej., sangre, componente sanguíneo (p. ej., suero o plasma), orina, saliva, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, tejido (p. ej., placentario o dérmico), líquido pancreático, muestra de vellosidades coriónicas, o células) aisladas de un sujeto. El sujeto puede ser, por ejemplo, un paciente que sufre de una enfermedad descrita en la presente memoria, tal como un trastorno cardíaco hereditario (por ejemplo, una taquicardia, tal como la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica dominante).
Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "se une específicamente" y "se une" se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia de una molécula o ion particular, tal como un ion de calcio divalente, en una población heterogénea de iones, sales, moléculas pequeñas y/o proteínas que son reconocidos, por ejemplo, por un ligando o receptor, tal como particularmente una proteína de unión a calcio. Un ligando (p. ej., una proteína de unión al calcio) que se une específicamente a una especie (p. ej., un ion divalente) puede unirse a la especie, por ejemplo, con una Kd inferior a 1 mM. Por ejemplo, un ligando que se une específicamente a una especie puede unirse a la especie con una K<d>de hasta 100 jm (p. ej., de entre la 1 pM y 100<j>M). Un ligando que no muestra unión específica a otra molécula o ion puede presentar una K<d>superior a 1 mM (p. ej., 1<j>M, 100<j>M, 500<j>M, 1 mM, o mayor) para esa molécula o ion en particular. Puede utilizarse una variedad de formatos de ensayo para determinar la afinidad de un ligando para una proteína específica. Por ejemplo, los ensayos ELISA de fase sólida se utilizan rutinariamente para identificar ligandos que se unen específicamente a una proteína diana. Ver, p. ej., Harlow & Lane, Antibody, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1988) y Harlow & Lane, Usando Antibody, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1999), para una descripción de los formatos de ensayo y las condiciones que pueden utilizarse para determinar la unión específica a proteínas. Se describen ensayos de ejemplos que se pueden utilizar para determinar la afinidad de un ligando para un ion diana (p. ej., un ion de calcio divalente), p. ej., en Johnson et al. Methods Mol. Biol. 173:89-102 (2002).
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a un organismo que recibe tratamiento para una enfermedad o afección particular tal como se describe en la presente memoria (tal como un trastorno cardíaco hereditario, p. ej., taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica autosómica dominante). Entre los ejemplos de sujetos y pacientes se incluyen mamíferos, tales como seres humanos, que reciben tratamiento para una enfermedad o afección descrita en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "taquicardia" se refiere a una frecuencia cardíaca mostrada por un paciente (p. ej., un paciente humano que presenta TVPC dominante) que excede la frecuencia cardíaca normal en reposo para una especie dada. En el caso del tratamiento de un paciente humano, la taquicardia incluye casos en los que la frecuencia cardíaca del paciente supera los 100 latidos por minuto. Los métodos para monitorizar la taquicardia son conocidos de la técnica y se describen, por ejemplo, en el Ejemplo 1, posteriormente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "elemento regulador de la transcripción" se refiere a un ácido nucleico que controla, por lo menos en parte, la transcripción de un gen de interés. Entre los elementos reguladores de la transcripción se pueden incluir promotores, intensificadores y otros ácidos nucleicos (p. ej., señales de poliadenilación) que controlan o ayudan a controlar la transcripción génica. Se describen ejemplos de elementos reguladores de la transcripción, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego,<c>A, 1990).
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como la progresión de un trastorno cardíaco hereditario, tal como la TVPC, y en particular, la TVPC dominante. En el contexto del tratamiento con TVPC, entre los resultados clínicos beneficiosos o deseados se incluyen, aunque sin limitación, el alivio de los síntomas, la disminución del alcance de la enfermedad, el estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. El tratamiento de un paciente con TVPC (por ejemplo, TVPC dominante) puede manifestarse en uno o más cambios detectables, tales como una disminución en la cantidad o frecuencia de los eventos de arritmia (por ejemplo, eventos de taquicardia) mostrados por el paciente en un período de tiempo específico después de la administración de un agente terapéutico descrito en la presente memoria (p. ej., una disminución en la cantidad o frecuencia de eventos de arritmia (p. ej., eventos de taquicardia) mostrados por el paciente después de la administración de un vector, tal como un vector viral, codificante de un transgén CASQ2 descrito en la presente memoria). Por ejemplo, entre las indicaciones de éxito en el tratamiento de un paciente con TVPC dominante utilizando las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen el hallazgo de que la cantidad y/o frecuencia de eventos de arritmia (p. ej., eventos de taquicardia) mostrados por el paciente ha disminuido, p. ej., en un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %, en un período de tiempo especificado después de la administración del agente terapéutico respecto a la cantidad y/o la frecuencia de eventos de arritmia (p. ej., eventos de taquicardia) mostrados por el paciente un período de tiempo (p. ej., un período de tiempo de la misma duración) previo a la administración del agente terapéutico. Entre las indicaciones clínicas adicionales de éxito en el tratamiento de un paciente con TVPC se incluyen el hallazgo de que la concentración diastólica promedio de calcio citosólico ([Ca2+]) en una célula cardíaca (p. ej., en un cardiomiocito) del paciente ha disminuido, por ejemplo, en un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o más, tras la administración de un agente terapéutico en el paciente. Todavía otra indicación de éxito del tratamiento es el hallazgo de que la expresión de CASQ2 en el paciente (p. ej., en una célula cardíaca del paciente, tal como un cardiomiocito) ha aumentado después de la administración del agente terapéutico. La expresión CASQ2 puede aumentar, por ejemplo, en un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, o en un factor de 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 o más. La concentración de proteína CASQ2 puede determinarseex vivo,por ejemplo, utilizando ensayos de detección de proteínas conocidos de la técnica, incluyendo los ensayos ELISA descritos en la presente memoria. La concentración de ácidos nucleicos codificante de CASQ2 puede determinarseex vivo,por ejemplo, utilizando ensayos de detección de ácidos nucleicos (p. ej., ensayos RNA Seq) descritos en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico, p. ej., ADN o ARN, que puede funcionar como un vehículo para la administración de un gen de interés en una célula (p. ej., una célula de mamífero, tal como una célula humana), tal como para los fines de replicación y/o expresión. Los vectores de ejemplo útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria son plásmidos, vectores de<a>D<n>, vectores de ARN, viriones, u otro replicón adecuado (p. ej., vector viral). Se ha desarrollado una variedad de vectores para la administración de polinucleótidos codificantes de proteínas exógenas en una célula procariótica o eucariótica. Se dan a conocer ejemplos de tales vectores de expresión en, por ejemplo, el documento n.° WO 1994/11026.
Los vectores de expresión descritos en la presente memoria contienen una secuencia polinucleótida, así como, p. ej., elementos de secuencia adicionales utilizados para la expresión de proteínas y/o la integración de estas secuencias polinucleótidas en el genoma de una célula de mamífero. Entre determinados vectores que pueden ser utilizados para la expresión de transgenes descritos en la presente memoria se incluyen plásmidos que contienen secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras e intensificadoras, que dirigen la transcripción génica. Otros vectores útiles para la expresión de transgenes contienen secuencias polinucleótidas que intensifican la tasa de traducción de dichos genes o mejoran la estabilidad o exportación nuclear del ARNm que resulta de la transcripción génica. Entre estos elementos de secuencia se incluyen, p. ej., regiones 5' y 3' no traducidas, un sitio interno de entrada ribosómico (IRES, por sus siglas en inglés) y un sitio de señal de poliadenilación para dirigir la transcripción eficiente del gen transportado por el vector de expresión. Los vectores de expresión descritos en la presente memoria también pueden contener un polinucleótido codificante de un marcador para la selección de células que contienen dicho vector. Entre los ejemplos de un marcador adecuado se incluyen genes codificantes de resistencia a antibióticos, tales como ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o nourseotricina.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 es un diagrama del constructo pVAA2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGP utilizado en los experimentos de terapia génica de CASQ2 murino descritos en el Ejemplo 1, posteriormente. El vector contiene, en la dirección 5'-a-3', una repetición terminal invertida (RTI) 5' VAA2, promotor de citomegalovirus (CMV), intrón del virus 40 del simio (SV40, por sus siglas en inglés), transgén de calsequestrina 2 (CASQ2) murina de tipo salvaje, sitio interno de entrada ribosómica (IRES), transgén de proteína fluorescente verde mejorada (eGFP, por sus siglas en inglés), elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE, por sus siglas en inglés), secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH, por sus siglas en inglés) y 3' RTI del VAA2 El constructo pVAA2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP utilizado en el Ejemplo 1, posteriormente, fue empaquetado en una cápside de VAA9, generando de esta manera el vector recombinante VAA2/9.
La FIG. 2 es un gráfico que muestra el efecto del vector pVAA2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP sobre el porcentaje de eventos arrítmicos en ratones heterocigóticos R4496C/+ con inserción génica ("knock-in") (Ryr2-Het), un modelo de TVPC autosómica dominante, tras la exposición a epinefrina (2 mg/kg) y cafeína (120 mg/kg). La columna negra (izquierda) indica que todos los ratones RyR2-Het no tratados (n=5) mostraban arritmias después de la administración de epinefrina y cafeína. Los resultados a la derecha del gráfico muestran que ninguno de los ratones RyR2-Het infectados por el vector pVAA2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP (n=4) desarrollaron arritmias. La FIG. 3 es un gráfico que muestra la expresión de ARNm de CASQ2, RYR2 cardíaco, triadina y junctina en tejido miocárdico de ratones de tipo salvaje y ratones RYR2 R4496C/+ que o bien no habían sido tratados o bien habían sido tratados con el vector pVAA2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP. Los resultados se informan como el factor de expresión de ARNm normalizado respecto a la expresión de ARNm en ratones de tipo salvaje (WT, columnas blancas). Las columnas negras muestran el factor de expresión de transcritos de ARNm en ratones heterocigóticos RyR2 R4496C/+knock-in(RyR2-Het) frente a ratones de tipo salvaje (WT, por sus siglas en inglés); las columnas grises muestran el factor de expresión de transcritos de ARNm en ratones heterocigóticos RyR2 R4496C/+knock-intratados con el vector pVAA2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP (RyR2-Het VAA9-CASQ2) frente a ratones de tipo salvaje (WT).
La FIG. 4 es un diagrama que muestra diversos componentes de otro vector VAA que se observó que presentaba un efecto antiarrítmico en ratones heterocigóticos R4496C/+knock-in.El vector contenía un casete de expresión de CASQ2 flanqueado por RTI 5' y 3' de VAA2. El casete de expresión incluía un transgén codificante de CASQ2 de tipo salvaje operablemente ligado a un promotor de desmina.
La FIG. 5 es un gráfico que muestra el efecto de un VAA2/8 pseudotipado recombinante que contenía el vector mostrado en la fig. 4 sobre el porcentaje de eventos arrítmicos en ratones heterocigóticos R4496C/+knock-in(RyR2-Het) tras la exposición a epinefrina (2 mg/kg) y cafeína (120 mg/kg). La columna negra (izquierda) indica que aproximadamente el 44% (4 de 9) de los ratones RyR2-Het no tratados (n=9) mostraban arritmias después de la administración de epinefrina y cafeína. Los resultados a la derecha del gráfico muestran que ninguno de los ratones RyR2-Het infectados por el vector rVAA2/8 codificante de CASQ2 (n=9) desarrollaron arritmias.
Descripción detallada
En la presente memoria se describen composiciones y métodos de tratamiento de la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC), y particularmente la TVPC autosómica dominante, en un paciente, tal como un paciente humano. La TVPC dominante es causada por mutaciones en una o más proteínas que regulan la concentración de iones de calcio divalente en los miocitos cardíacos. Por ejemplo, la TVPC dominante está asociada a diversas mutaciones en la proteína del receptor 2 de rianodina (RYR2), particularmente mutaciones de ganancia de función que regulan la liberación de iones de calcio divalente mediada por RYR2 del retículo sarcoplasmático. Tal como se describe a continuación, lo anterior conduce a una cascada de eventos de señalización y eventos de contracción muscular que terminan en un latido cardíaco. La TVPC dominante también está asociada a mutaciones de pérdida de función en proteínas calmodulinas, tales como la calmodulina 1 (CALM1) y CALM3. Estas proteínas ayudan a regular el calcio citosólico mediante la unión y el secuestro de iones de calcio divalente, evitando de esta manera la propagación de un potencial de acción. El exceso de liberación de calcio del retículo sarcoplásmico durante la diástole (un período de relajación cardíaca) engendra un latido cardíaco extrasistólico, que puede desencadenar una arritmia.
La presente exposición se basa, en parte, en el hallazgo de que la TVPC dominante puede tratarse sin necesidad de proporcionar al paciente una proteína funcional RYR2, CALM1 o CALM3 o un transgén codificante de la misma. Utilizando las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, un paciente, tal como un paciente humano, que presenta TVPc dominante puede ser tratado mediante la administración de un transgén codificante de una proteína calsecuestrina 2 (CASQ2) funcional. La administración de CASQ2, a su vez, restaura la homeostasis del calcio en el corazón, llevando a una reducción de los eventos de arritmia y al retorno de un latido cardíaco normal.
Utilizando las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, puede administrarse un transgén codificante de una proteína CASQ2 funcional en un paciente por medio de la terapia génica viral, entre otros enfoques descritos posteriormente, tal como el uso de liposomas, vesículas, exosomas, dendrímeros o nanopartículas. Las siguientes secciones proporcionan un resumen de la fisiopatología subyacente a la TVPC dominante, así como una descripción de vectores de ejemplo y otros vehículos de administración génica que pueden ser utilizados para proporcionar a los pacientes un transgén CASQ2 funcional.
TVPC dominante
La TVPC es una canalopatía hereditaria caracterizada por una alta susceptibilidad a arritmias potencialmente mortales. Se han descrito dos formas de la enfermedad: la variante autosómica dominante y la variante autosómica recesiva. La primera está asociada a mutaciones en el gen cardiaco RYR2, mientras que la variante autosómica recesiva está asociada a mutaciones en el gen cardiaco CASQ2 (Priori et al., Circulation 104 (suplemento M):335 (2001), y Lahat et al., Am. J. Hum. Genet. 69:1378-1384 (2001)). Las observaciones clínicas han demostrado que los pacientes con la forma dominante de TVPC desarrollan taquicardia ventricular bidireccional y polimórfica en respuesta a la activación simpática, mientras que sus perfiles electrocardiográficos en reposo no son destacables y la estructura cardíaca se encuentra conservada.
La patología subyacente a la TVPC dominante está asociada a una función anormal del mecanismo fisiológico conocido como liberación de calcio inducida por calcio (CICR, por sus siglas en inglés), que es fundamental para mantener el acoplamiento de excitación-contracción cardíaco. La apertura y cierre altamente coordinados de canales iónicos dependientes de voltaje ubicados en la membrana de los miocitos cardíacos genera un potencial de acción cardíaca. Durante la fase de meseta del potencial de acción, la apertura de los canales de Ca2+ de tipo L dependientes de voltaje permite el flujo de entrada de Ca2+ en el plasmalema. Este proceso desencadena el transitorio de calcio e induce la apertura del canal de liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico: RYR2 (Bers, Nature 415:198-205 (2002)). Estas liberaciones locales ocurren en estructuras especializadas conocidas como "unidades de liberación de calcio" (CRU, por sus siglas en inglés). Los CRU se localizan preferentemente a nivel de los túbulos transversales (túbulos T), donde la membrana del retículo sarcoplasmático se yuxtapone a la membrana celular. Una CRU está formada por conjuntos de RYR2, que abarcan la membrana del retículo sarcoplásmico, que están en estrecha proximidad a los canales de Ca2+ tipo L en la membrana celular (Franzini-Armstrong, et I., Ann. NY Acad. Sci. 1047:76-85 (2005)). El Ca2+ liberado del retículo sarcoplasmático se une a la troponina C e induce una serie de cambios alostéricos en los filamentos de miosina, conduciendo a la contracción de la fibra muscular. La posterior eliminación de Ca2+ está mediada por el cierre concomitante del RYR2 y la acción de la ATPasa Ca2+ del retículo sarcoplasmático, que bombea Ca2+ de nuevo a las reservas del retículo sarcoplasmático.
Otro componente de la terminación del transitorio de Ca2+ es el intercambiador Na+-Ca2+ (NCX). El NCX extruye un ion Ca2+ (dos cargas positivas) por cada tres iones de Na+ (tres cargas positivas) incorporados en la célula. De esta manera, el NCX elimina Ca2+, generando una corriente despolarizadora neta hacia adentro: la corriente de entrada (iti) del transitorio (Pieske, et al., Circ. Res. 85:38-46 (1999)). El NCX se vuelve muy importante para la eliminación de Ca2+ en condiciones caracterizadas por la sobrecarga de calcio, por ejemplo, en el caso de mutaciones genéticas RYR2.
Las arritmias en TVPC son inducidas por eventos de liberación de Ca2+ que no son desencadenados por un potencial de acción y, por lo tanto, se denominan "liberaciones espontáneas de calcio" (LEC). Una LEC se inicia como un evento localizado que involucra una sola CRU, aunque también puede difundirse a los CRU vecinos, desencadenando una mayor liberación de Ca2+ para producir una onda de calcio en toda la célula. La probabilidad de que la LEC lleve a una onda de calcio está influenciada por el equilibrio entre el contenido de Ca2+ del retículo sarcoplasmático y la concentración de Ca2+ que induce la liberación de Ca2+, el llamado "umbral de calcio del retículo sarcoplasmático". La función de RYR2 posee un papel fundamental en el control de dicho umbral. Se ha propuesto que varias mutaciones en RYR2 asociadas a la TVPC actúan disminuyendo el umbral de calcio del retículo sarcoplasmático, de modo que la LEC resulta inducida con facilidad (Venetucci et al., Nat. Rev. Cardiol. 9:561-75 (2012)).
Cuando se produce una fuga anormal de Ca2+, la concentración citosólica de Ca2+ aumenta, y la célula debe activar mecanismos para prevenir la interrupción de la homeostasis de Ca2+ y restablecer el nivel diastólico fisiológico de Ca2+. La corriente Iti produce despolarizaciones transitorias de la membrana después de la finalización del potencial de acción, conocida como postdespolarización tardía (DAD, por sus siglas en inglés). Cuando la amplitud de un DAD alcanza el umbral de voltaje para la activación del canal Na+, se genera un potencial de acción desencadenado. La propagación de un potencial de acción a todo el corazón genera un latido extrasistólico. Cuando esta cadena de eventos se vuelve repetitiva y varios DAD alcanzan el umbral de generación de potenciales de acción que se propagan, se induce una actividad arrítmica desencadenada. En varios estudios, se ha demostrado que las mutaciones de RYR2 facilitan la aparición de LEC durante la estimulación p-adrenérgica y, a su vez, provocan DAD y actividad desencadenada, conduciendo a arritmias potencialmente mortales (Liu et al., Circulation Research 99:292-298 (2006)).
La generación y caracterización de un modelo de ratón RYR2 R4496C/+knock-inde TVPC autosómica dominante (ver, por ejemplo, Cerrone et al., M, Circulation Research 96:e77-e82 (2005), y la patente US n.° 7.741.529) han proporcionado una mejor comprensión del mecanismo patogénico de esta enfermedad. Los ratones heterocigóticos RyR2 R4496C/+ recapitulan la TVPC humana y desarrollan arritmias ventriculares bidireccionales y polimórficas inducidas adrenérgicamente. La mutación R4496C en ratones, que corresponde a la mutación R4497C en seres humanos, aumenta la sensibilidad del canal RYR2 al calcio luminal, facilitando de esta manera la liberación espontánea de calcio del retículo sarcoplasmático.
Entre las mutaciones de ejemplo que pueden dar lugar a TVPC dominante se incluyen R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y R4959Q. Entre las mutaciones en CALM1 que pueden conducir a TVPC dominante se incluyen N97S y N53I, y una mutación de ejemplo en CALM3 que puede conducir a TVPC dominante es A103V.
Actualmente se ha encontrado que la TVPC causada, p. ej., por mutaciones en RYR2, CALM1 y/o CALM3 que conducen a arritmias, tal como R4997C en el ser humano, puede tratarse sin necesidad de proporcionar al paciente transgenes funcionales codificante de estas proteínas. Por el contrario, utilizando las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, los pacientes con TVPC dominante pueden ser tratados mediante la administración de un vehículo de administración que contiene un transgén CASQ2. Se describen en detalle posteriormente vehículos de ejemplo para la administración de CASQ2 útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria.
Tratamiento de TVPC mediante terapia génica de CASQ2
Transgenes de CASQ2
Utilizando las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, se puede proporcionar un transgén codificante de CASQ2 a un paciente, tal como un paciente humano que presenta TVPC dominante, con el fin de tratar la patología. El transgén de CASQ2 puede ser administrado en el paciente por medio de una variedad de vectores (p. ej., vectores virales), entre otras composiciones para la terapia génica descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones (p. ej., en las que se somete a tratamiento a un paciente humano), el transgén de CASQ2 codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o 100 % idéntica) a la secuencia de aminoácidos de CASQ2 humano de tipo salvaje, proporcionada en SEC ID n.° 1, mostrada posteriormente. Entre los transgenes de CASQ2 para su uso junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen aquellos que codifican una proteína que presenta una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. Por ejemplo, el transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente hasta 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. El transgén de CASQ2 puede, adicional o alternativamente, codificar una proteína que presenta una o más sustituciones no conservadoras de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1. Por ejemplo, el transgén CASQ2 puede codificar una proteína que presente hasta 50 sustituciones no conservadoras de aminoácidos (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sustituciones no conservadoras de aminoácidos) respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1.
En algunas realizaciones (p. ej., en las que se somete a tratamiento a un paciente humano), el transgén de CASQ2 codifica una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 85 % idéntica (p. ej., 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o 100 % idéntica) a la secuencia de ácido nucleico de CASQ2 humano de tipo salvaje, proporcionada en SEC ID n.° 2, mostrada posteriormente.
Las secuencias de ejemplo de aminoácidos y ácidos nucleicos de CASQ2 de tipo salvaje que resultan útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se describen en la Tabla 2, a continuación.
Tabla 2. Secuencias de ejemplo de aminoácidos y ácidos nucleicos de CASQ2
(continuación)
(continuación)
Los transgenes de CASQ2 en la presente memoria incluyen, además, aquellos fragmentos de las proteínas anteriores que conservan la capacidad de polimerizar y unirse al calcio divalente, por ejemplo, con una afinidad que es superior o inferior como máximo en 25 % (p. ej., con una afinidad superior o inferior en, como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o 25 %) a la afinidad de CASQ2 de tipo salvaje y/o con una estequiometría que se desvía de la de CASQ2 de tipo salvaje en no más de 25 % (por ejemplo, no más de 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos). Los ejemplos de ensayos que pueden usarse para evaluar la afinidad de unión al calcio y la estequiometría son conocidos de la técnica y se describen, por ejemplo, en Johnson et al. Methods Mol. Biol. 173:89-102 (2002).
Elementos reguladores de la transcripción
Los transgenes de CASQ2, tal como se describen en la presente memoria, pueden incorporarse en un vehículo de administración, tal como un vector, plásmido u otro vehículo de administración de ácido nucleico descrito en la presente memoria, de tal manera que el transgén esté operablemente ligado a un promotor. Los promotores de ejemplo que resultan útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria son aquellos que inducen la expresión del transgén en una célula cardíaca en un paciente (p. ej., un paciente humano), tal como un miocito cardíaco. Por ejemplo, entre los promotores que se pueden utilizar para inducir la expresión de CASQ2 en los vehículos de administración génica descritos en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, el promotor de desmina, el promotor de citomegalovirus, el promotor de cadena ligera de miosina 2, el promotor de actina alfa, el promotor de troponina 1, el promotor de intercambiador Na+/Ca2+, el promotor de distrofina, el promotor de creatina quinasa, el promotor de integrina alfa 7, el promotor del péptido natriurético cerebral, el promotor de alfa B-cristalina/proteína de choque térmico pequeña, el promotor de cadena pesada alfa de la miosina, o el promotor del factor natriurético auricular.
Vectores para la administración de ácidos nucleicos exógenos en células diana
Vectores virales para la administración de ácidos nucleicos
Los genomas virales proporcionan una fuente rica de vectores que se pueden utilizar para la administración eficiente de un gen de interés en el genoma de una célula diana en un paciente (p. ej., una célula de mamífero, tal como una célula humana). Los genomas virales son vectores particularmente útiles para la administración de genes debido a que los polinucleótidos contenidos en dichos genomas se incorporan normalmente en el genoma de una célula diana mediante transducción generalizada o especializada. Estos procesos ocurren como parte del ciclo natural de replicación viral, y no requieren proteínas o reactivos añadidos para inducir la integración génica. Son ejemplos de vectores virales que se pueden utilizar junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, VAA, retrovirus, adenovirus (p. ej., Ad5, Ad26, VAA), retrovirus, adenovirus (p. ej., Ad5, Ad26, Ad34, Ad35 y Ad48), parvovirus (p. ej., virus adenoasociados), coronavirus, virus ARN de cadena negativa, tales como ortomixovirus (p. ej., virus influenza), rabdovirus (p. ej., virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (p. ej., sarampión y Sendai), virus ARN de cadena positiva, tales como picornavirus y alfavirus, y virus ADN de doble cadena, incluyendo adenovirus, herpesvirus (p. ej., virus del herpes simple de tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y virus de la viruela (p. ej., vaccinia, vaccinia Ankara modificado (VAM), viruela aviar y viruela del canario). Entre otros virus que se pueden utilizar junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Entre los ejemplos de retrovirus se incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus tipo C de mamíferos, virus tipo B, virus tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus y espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en: Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Entre otros ejemplos se incluyen los virus de la leucemia murina, los virus del sarcoma murino, el virus del tumor mamario de ratón, el virus de la leucemia bovina, el virus de la leucemia felina, el virus del sarcoma felino, el virus de la leucemia aviar, el virus de la leucemia de células T humanas, el virus endógeno del babuino, el virus de la leucemia del mono gibón, el virus del mono Mason Pfizer, el virus de la inmunodeficiencia del simio, el virus del sarcoma del simio, el virus del sarcoma de Rous y lentivirus. Otros ejemplos de vectores se describen, por ejemplo, en la patente US n.° 5.801.030.
Vectores VAA para la administración de ácidos nucleicos
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incorporan en vectores y/o viriones de VAAr con el fin de facilitar su introducción en una célula, tal como una célula cardíaca diana (p. ej., miocito cardíaco) en un paciente. Entre los vectores de VAAr útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen constructos de ácido nucleico recombinante que contienen (1) un transgén de CASQ2 y (2) ácidos nucleicos virales que facilitan la integración y expresión de los genes heterólogos. Los ácidos nucleicos virales pueden incluir aquellas secuencias de VAA que se requieren en cis para la replicación y empaquetado (p. ej., RTI funcionales) del a Dn en un virión. Tales vectores de VAAr también pueden contener genes marcadores o informadores. Entre los vectores de VAAr útiles se incluyen aquellos que presentan uno o más de los genes de VAA naturales eliminados en su totalidad o en parte, aunque conservan secuencias flanqueantes de RTI funcionales. Los RTI de VAA pueden ser de cualquier serotipo (p. ej., derivado del serotipo 2) adecuado para una aplicación particular. Los métodos para el uso de vectores VAAr se describen en, por ejemplo, Tal et al., J. Biomed. Sci. 7:279-291 (2000), y Monahan y Samulski, Gene Delivery 7:24-30 (2000).
Los ácidos nucleicos y vectores descritos en la presente memoria pueden ser incorporados en un virión de VAAr para facilitar la introducción del ácido nucleico o vector en una célula. Las proteínas de la cápsula de VAA componen la porción exterior de ácido no nucleico del virión y están codificadas por el gencapdel VAA. El gencapcodifica tres proteínas virales de cubierta, PV1, PV2 y PV3, que resultan necesarias para el ensamblaje del virión. La construcción de viriones VAAr ha sido descrita, por ejemplo, en las patentes US n.° 5.173.414 , n.° 5.139.941, n.° 5.863.541, n.° 5.869.305, n.° 6.057.152 ;y n.° 6.376.237; así como en Rabinowitz et al., J. Virol. 76:791-801 (2002) y Bowles et al., J. Virol. 77:423-432 (2003).
Entre los viriones de VAAr útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen aquellos derivados de una variedad de serotipos de VAA, incluyendo VAA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. La construcción y el uso de vectores VAA y proteínas de VAA de diferentes serotipos se describen en, por ejemplo, Chao et al., Mol. Ther. 2:619-623 (2000); Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428-3432 (2000); Xiao et al., J. Virol. 72:2224-2232 (1998); Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000); Halbert et al., J. Virol. 75:6615-6624 (2001) y Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001).
También resultan útiles junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, los vectores VAAr pseudotipados. Entre los vectores pseudotipados se incluyen vectores VAA de un serotipo dado (p. ej., VAA2) pseudotipado con un gen de cápside derivado de un serotipo distinto del serotipo dado (p. .ej., VAA1, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8 o VAA9, entre otros). Por ejemplo, un vector pseudotipado representativo es un vector VAA2 codificante de una proteína terapéutica pseudotipada con un gen de cápside derivado del VAA de serotipo 8 o de VAA de serotipo 9. Las técnicas que implican la construcción y el uso de viriones VAAr pseudotipados son conocidas de la técnica y se describen en, por ejemplo, Duan et al., J. Virol. 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167 (2002) y Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081 (2001).
Los viriones de VAA que presentan mutaciones dentro de la cápside del virión se pueden usar para infectar tipos de células particulares más eficazmente que los viriones de cápside no mutados. Por ejemplo, los VAA mutantes adecuados pueden presentar mutaciones de inserción de ligando para facilitar el reconocimiento por el VAA de tipos celulares específicos. La construcción y caracterización de los VAA mutantes de cápside, incluyendo mutantes de inserción, mutantes de cribado de alanina y mutantes de etiqueta epítopo se describen en Wu et al., J. Virol. 74:8635-45 (2000). Entre otros viriones de VAAr que se pueden utilizar en los métodos de la invención se incluyen aquellos híbridos de cápside que se generan mediante cultivo molecular de los virus, así como mediante la reorganización de exones. Ver, por ejemplo, Soong et al., Nat. Genet., 25:436-439 (2000) y Kolman y Stemmer, Nat. Biotechnol. 19:423-428 (2001).
Métodos adicionales para la administración de transgenes en células diana
Técnicas de transfección
Las técnicas que se pueden utilizar para introducir un transgén de CASQ2, tal como un transgén de CASQ2 operablemente ligado a un elemento regulador de la transcripción descrito en la presente memoria, en una célula diana son conocidas de la técnica. Por ejemplo, la electroporación se puede utilizar para permeabilizar las células de mamíferos (p. ej., las células diana humanas) mediante la aplicación de un potencial electrostático en la célula de interés. Las células de los mamíferos, tales como las células humanas, sometidas a un campo eléctrico externo de esta manera, son posteriormente predispuestas a la incorporación de ácidos nucleicos exógenos. La electroporación de células de mamíferos se describe en detalle, por ejemplo, en Chu et al., Nucleic Acids Research 15:1311 (1987).
Una técnica similar, Nucleofection™, utiliza un campo eléctrico aplicado con el fin de estimular la incorporación de polinucleótidos exógenos en el núcleo de una célula eucariótica. Nucleofection™ y los protocolos útiles para llevar a cabo dicha técnica se describen en detalle en, por ejemplo, Distler et al., Experimental Dermatology 14:315 (2005), así como en el documento n.° US 2010/0317114.
Entre las técnicas adicionales útiles para la transfección de células diana se incluye la metodología de formación de poros mediante compresión (en inglés "squeeze-poration"). Esta técnica induce la deformación mecánica rápida de las células con el fin de estimular la incorporación de ADN exógeno a través de los poros membranosos que se forman en respuesta al estrés aplicado. Esta tecnología resulta ventajosa debido a que no se requiere un vector para la administración de ácidos nucleicos en la célula, tal como una célula diana humana. La poración por compresión se describe en detalle en, p. ej., Sharei et al., Journal of Visualized Experiments 81 :e50980 (2013).
La lipofección representa otra técnica útil para la transfección de células diana. Este método implica la carga de ácidos nucleicos en un liposoma, que frecuentemente presenta grupos funcionales catiónicos, tales como aminas cuaternarias o protonadas, hacia el exterior del liposoma. Lo anterior promueve interacciones electrostáticas entre el liposoma y la célula debido a la naturaleza aniónica de la membrana celular, que en última instancia conduce a la incorporación de los ácidos nucleicos exógenos, por ejemplo, por fusión directa del liposoma con la membrana celular o por endocitosis del complejo. La lipofección se describe en detalle en, por ejemplo, la patente n.° US 7.442.386.
Entre las técnicas similares que aprovechan las interacciones iónicas con la membrana celular para provocar la incorporación de ácidos nucleicos foráneos se incluyen el contacto de la célula con un complejo de polímero catiónicoácido nucleico. Las moléculas catiónicas de ejemplo que se asocian con polinucleótidos para impartir una carga positiva favorable para la interacción con la membrana celular son los dendrímeros activados (descritos en, p. ej., Dennig, tópicos en Current Chemistry 228:227 (2003)) y el dietilaminoetilo (DEAE)-dextrano, su uso como agente de transfección se describe en detalle en, por ejemplo, Gulick et al., Current Protocolos in Molecular Biology 40:I:9,2:9.2.1 (1997). Las perlas magnéticas son otra herramienta que se puede utilizar para transfectar las células diana de una manera suave y eficiente, ya que esta metodología utiliza un campo magnético aplicado para dirigir la incorporación de ácidos nucleicos. Esta tecnología se describe en detalle en, por ejemplo, el documento n.° US 2010/0227406.
Otra herramienta útil para inducir la incorporación de ácidos nucleicos exógenos por las células diana es la laserfección, una técnica que implica exponer una célula a radiación electromagnética de una longitud de onda particular con el fin de permeabilizar suavemente las células y permitir que los polinucleótidos atraviesen la membrana celular. Esta técnica se describe en detalle en, p. ej., Rhodes et al., Methods in Cell Biology 82:309 (2007).
Las microvesículas representan otro vehículo potencial que se puede utilizar para modificar el genoma de una célula diana de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, las microvesículas que han sido inducidas por la co-sobreexpresión de la glicoproteína VSV-G con, por ejemplo, una proteína modificadora del genoma, tal como una nucleasa, pueden utilizarse para administración eficaz de proteínas en una célula que seguidamente catalice el corte específico de sitio de una secuencia de polinucleótido endógeno a fin de preparar el genoma de la célula para la incorporación covalente de un polinucleótido de interés, tal como un gen o secuencia reguladora. El uso de dichas vesículas, también conocidas como Gesicles, para la modificación genética de células eucariotas se describe en detalle en, p. ej., Quinn et al., Modificación genética de las células diana por administración directa de proteína activa [resumen]. en: Methylation changes in early embryonic genes in cancer [resumen], en: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 13 de mayo de 2015, resumen n.° 122.
Incorporación de genes diana mediante técnicas de edición génica
Además de lo anterior, se ha desarrollado una variedad de herramientas que se pueden utilizar para la incorporación de un gen de interés en una célula diana, tal como una célula humana. Uno de tales métodos que se puede utilizar para incorporar polinucleótidos codificantes de genes diana en las células diana implica el uso de transposones. Los transposones son polinucleótidos codificantes de enzimas transposasa y que contienen una secuencia polinucleótida o un gen de interés flanqueado por sitios de excisión 5' y 3'. Una vez que un transposón ha sido administrado en una célula, se inicia la expresión del gen de transposasa, resultando en enzimas activos que escinden el gen de interés respecto del transposón. Esta actividad está mediada por el reconocimiento específico de sitio de los sitios de excisión de transposón por la transposasa. En algunos casos, estos sitios de excisión pueden ser repeticiones terminales o repeticiones terminales invertidas. Una vez extraído del transposón, el gen de interés puede integrarse en el genoma de la célula de mamífero mediante la escisión catalizada por transposasa de sitios de excisión similares que existen dentro del genoma nuclear de la célula. Lo anterior permite que el gen de interés sea insertado en el a Dn nuclear escindido en los sitios de excisión complementarios, y la posterior ligación covalente de los enlaces fosfodiéster que unen el gen de interés al ADN del genoma celular de mamífero completa el proceso de incorporación. En determinados casos, el transposón puede ser un retrotransposón, de modo que el gen codificante del gen diana se transcribe primero en un producto de<a>R<n>y después se transcribe inversamente en ADN antes de su incorporación en el genoma de la célula de mamífero. Los sistemas de transposón de ejemplo son el transposónpiggybac(descrito en detalle en, p. ej., el documento n.° WO 2010/085699) y el transposónsleepingbeauty(descrito en detalle en, p. ej., el documento n.° US 2005/0112764), las exposiciones de cada una de las cuales se incorporan en la presente memoria como referencia, ya que se refieren a transposones para su uso en la administración génica en una célula de interés.
Otra herramienta para la integración de genes diana en el genoma de una célula diana es el sistema CRISPR (por sus siglas en inglés, sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas)/Cas, un sistema que originalmente se desarrolló como un mecanismo de defensa adaptativa en bacterias y arqueobacterias contra la infección viral. El sistema CRISPR/Cas incluye secuencias de repetición palindrómica dentro del ADN plasmídico y una nucleasa Cas9 asociada. Este conjunto de ADN y proteína dirige el corte del ADN en un sitio específico de una secuencia diana mediante la incorporación en primer lugar de ADN foráneo en loslocide CRISPR. Los polinucleótidos que contienen dichas secuencias foráneas y los elementos repetitivos-espaciadores del locus de CRISPR se transcriben a su vez en una célula huésped para crear un ARN guía, que seguidamente puede hibridarse con una secuencia diana y localizar la nucleasa Cas9 en este sitio. De esta manera, puede generarse la escisión del ADN mediada por cas9 altamente específica de sitio en un polinucleótido foráneo debido a que la interacción que lleva a cas9 a una estrecha proximidad de la molécula de ADN diana está gobernada por la hibridación ARN:ADN. Como resultado, se puede diseñar un sistema CRISPR/Cas para cortar cualquier molécula de ADN diana de interés. Esta técnica ha sido aprovechada para editar genomas eucarióticos (Hwang et al., Nature Biotechnology 31:227 (2013)) y puede ser utilizada como un medio eficiente de edición específica de sitio de los genomas de la célula diana con el fin de escindir el ADN antes de la incorporación de un gen codificante de un gen diana. El uso de CRISPR/Cas para modular la expresión génica se ha descrito en, por ejemplo, la patente n.° US 8.697.359.
Los métodos alternativos para el corte específico de sitio del ADN genómico antes de la incorporación de un gen de interés en una célula diana incluyen el uso de nucleasas de dedo de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés) y nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés). A diferencia del sistema CRISPR/Cas, estos enzimas no contienen un polinucleótido guía para la localización a una secuencia diana específica. La especificidad de la diana, por el contrario, está controlada por dominios de unión a ADN dentro de estos enzimas. Se describe el uso de ZFN y TALEN en aplicaciones de edición genómica en, por ejemplo, Urnov et al., Nature Reviews Genetics 11:636 (2010), y en Joung et al., Nature Reviews Biología Celular Molecular 14:49 (2013).
Las técnicas adicionales de edición del genoma que se pueden utilizar para incorporar polinucleótidos codificante de genes diana en el genoma de una célula diana incluyen el uso de meganucleasas ARCUSTM que pueden ser diseñadas racionalmente para el corte específico de sitio del ADN genómico. El uso de dichos enzimas para la incorporación de genes codificante de genes diana en el genoma de una célula de mamíferos resulta ventajoso en vista de las relaciones de estructura-actividad definidas que se han establecido para tales enzimas. Las meganucleasas de una sola cadena pueden modificarse en determinadas posiciones de aminoácidos con el fin de crear nucleasas que cortan selectivamente el ADN en las ubicaciones deseadas, permitiendo la incorporación específica de sitio de un gen diana en el ADN nuclear de una célula diana. Estas nucleasas de cadena única se han descrito ampliamente en, por ejemplo, las patentes n.° US 8.021.867 y n.° US 8.445.521.
Métodos de medición de la expresión de transgén
El nivel de expresión de un transgén de CASQ2 expresado por una célula diana en un paciente (p. ej., en un miocito cardíaco) se puede determinar, por ejemplo, mediante evaluación de la concentración o abundancia relativa de los transcritos de ARNm derivados de la transcripción del transgén de CASQ2. Adicional o alternativamente, la expresión génica se puede determinar mediante evaluación de la concentración o abundancia relativa de la proteína CASQ2 producida por transcripción y traducción de un transgén de CASQ2. Las concentraciones de proteínas también se pueden evaluar mediante ensayos funcionales, tales como los ensayos de abundancia de calcio. Las secciones siguientes describen técnicas de ejemplo que se pueden utilizar para medir el nivel de expresión de un transgén de CASQ2 al administrarlo en un paciente, tal como un paciente con TVPC dominante tal como se describe en la presente memoria. La expresión de transgén puede ser evaluada por varias metodologías conocidas de la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, la secuenciación de ácidos nucleicos, el análisis de micromatrices, la proteómica, la hibridaciónin situ(p. ej., la hibridación fluorescentein situ(FISH, por sus siglas en inglés)), los ensayos basados en la amplificación, la hibridaciónin situ,la separación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés),el análisis Northern y/o el análisis de PCR de los ARNm.
Detección de ácidos nucleicos
Entre los métodos basados en ácidos nucleicos para determinar métodos de detección de expresión de transgenes, conjuntos de datos de métodos adecuados para el análisis junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen técnicas basadas en imágenes (p. ej., transferencia Northern o Southern), que pueden utilizarse junto con células obtenidas de un paciente después de la administración del transgén. El análisis de transferencia Northern es una técnica convencional bien conocida de la técnica y se describe en, por ejemplo, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edición, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Los protocolos típicos para evaluar el estado de los genes y productos génicos se encuentran en, por ejemplo, Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocolos in Molecular Biology, Unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis de PCR).
Las técnicas de detección de transgenes que se pueden utilizar junto con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria para evaluar la expresión de CASQ2 incluyen experimentos de secuenciación de micromatrices (p. ej., secuenciación de Sanger y métodos de secuenciación de próxima generación, también conocidos como secuenciación de alto rendimiento o secuenciación profunda). Entre las tecnologías de secuenciación de ejemplo de próxima generación se incluyen, aunque sin limitación, secuenciación de Illumina, secuenciación Ion Torrent, secuenciación 454, secuenciación SOLiD y plataformas de secuenciación de nanoporos. También se pueden utilizar métodos adicionales de secuenciación conocidos de la técnica. Por ejemplo, la expresión de transgenes a nivel de ARNm puede determinarse usando RNA-Seq (p. ej., tal como se describe en Mortazavi et al., Nat. Métodos 5:621-628 (2008)).
RNA-Seq es una tecnología robusta para la monitorización de la expresión mediante secuenciación directa de las moléculas de ARN en una muestra. En resumen, esta metodología puede implicar la fragmentación del ARN a una longitud promedio de 200 nucleótidos, la conversión a ADNc mediante cebado aleatorio, y la síntesis de ADNc de doble cadena (p. ej., utilizando el kit de síntesis de ADNc de doble cadena Just cDNA de Agilent Technology). A continuación, el ADNc se convierte en una biblioteca molecular para la secuenciación mediante la adición de adaptadores de secuencia para cada biblioteca (por ejemplo, de Illumina®/Solexa), y las 50 a 100 lecturas de nucleótidos resultantes se localizan en el genoma.
Los niveles de expresión de transgénicos se pueden determinar utilizando plataformas basadas en micronatrices (p. ej., matrices de polimorfismo de un solo nucleótido), ya que la tecnología de micromatrices ofrece una resolución elevada. Se pueden encontrar en la literatura detalles de diversos métodos de micromatriz. Ver, por ejemplo, la patente US n.° 6.232.068 y Pollack et al., Nat. Genet. 23:41-46 (1999).
Utilizando micromatrices de ácido nucleico, las muestras de ARNm se transcriben inversamente y se marcan, generando ADNc. Las sondas pueden entonces hibridarse con uno o más ácidos nucleicos complementarios organizados e inmovilizados sobre un soporte sólido. La matriz se puede configurar, por ejemplo, de tal manera que se conozca la secuencia y la posición de cada elemento de la matriz. La hibridación de una sonda marcada con un elemento particular de la matriz indica que la muestra a partir de la que se obtuvo la sonda expresa ese gen. El nivel de expresión se puede cuantificar de acuerdo con la magnitud de la señal detectada en los complejos de sondamuestra hibridados. Un experimento habitual con micromatrices implica las siguientes etapas: 1) preparación de la diana marcada fluorescentemente a partir del ARN aislado de la muestra, 2) hibridación de la diana marcada con la micromatriz, 3) lavado, tinción y escaneo de la matriz, 4) análisis de la imagen escaneada y 5) generación de perfiles de expresión génica. Un ejemplo de un procesador de micromatriz es el sistema Affymetrix GENECHIP®, que está disponible comercialmente y comprende matrices fabricadas por síntesis directa de los oligonucleótidos sobre una superficie de vidrio. Pueden utilizarse otros sistemas, tal como es conocido por el experto en la materia.
Los ensayos basados en la amplificación también se pueden usar para medir el nivel de expresión de un transgén en una célula diana después de la administración en un paciente. En tales ensayos, las secuencias de ácidos nucleicos del gen actúan como molde en una reacción de amplificación (por ejemplo, una PCR, tal como la qPCR). En una amplificación cuantitativa, la cantidad de producto de amplificación es proporcional a la cantidad de molde en la muestra original. La comparación con controles apropiados proporciona una medida del nivel de expresión del gen, correspondiente a la sonda específica utilizada, según los principios descritos en la presente memoria. Los métodos de qPCR en tiempo real con sondas TaqMan son bien conocidos de la técnica. Se proporcionan protocolos detallados para qPCR en tiempo real, por ejemplo, en Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001 (1996) y en Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996).
Los niveles de expresión génica tal como se indican en la presente memoria pueden determinarse mediante la tecnología RT-PCR. Las sondas utilizadas para PCR pueden marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un isótopo radioactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o un enzima.
Detección de proteínas
La expresión de transgenes adicionalmente se puede determinar mediante la medición de la concentración o abundancia relativa de un producto proteico correspondiente (p. ej., CASQ2) codificado por un gen de interés. Los niveles de proteína se pueden evaluar utilizando técnicas de detección estándar conocidas de la técnica. Entre los ensayos de expresión de proteínas adecuados para el uso con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se incluyen enfoques proteómicos, análisis inmunohistoquímico y/o transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos de unión molecular, ELISA, ensayo de inmunofiltración ligada a enzimas (ELIFA, por sus siglas en inglés), espectrometría de masas, inmunoensayo espectrométrico de masas y ensayos bioquímicos de actividad enzimática. En particular, los métodos proteómicos se pueden utilizar para generar conjuntos de datos de expresión de proteínas a gran escala en multiplex. Los métodos proteómicos pueden utilizar espectrometría de masas para detectar y cuantificar polipéptidos (p. ej., proteínas) y/o micromatrices de péptidos utilizando reactivos de captura (p. ej., anticuerpos) específicos de un panel de proteínas diana para identificar y medir los niveles de expresión de proteínas expresadas en una muestra (p. ej., una muestra de una sola célula o una población multicelular).
Las micromatrices peptídicas de ejemplo presentan una pluralidad de polipéptidos ligados al sustrato, en donde la unión de un oligonucleótido, un péptido o una proteína a cada una de la pluralidad de polipéptidos ligados es detectable por separado. Alternativamente, la micromatriz de péptidos puede incluir una pluralidad de ligantes, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, ligantes de exposición fágica, ligantes de doble híbrido de levadura, aptámeros, que pueden detectar específicamente la unión de oligonucleótidos específicos, péptidos o proteínas. Se pueden encontrar ejemplos de matrices de péptidos en las patentes n.° US 6.268.210, n.° US 5.766.960 ,y n.° 5.143.854.
Se puede utilizar espectrometría de masas (EM) junto con los métodos descritos en la presente memoria para identificar y caracterizar la expresión del transgén en una célula de un paciente (p. ej., un paciente humano) después de la administración del transgén. Puede utilizarse cualquier método de EM conocido de la técnica para determinar, detectar y/o medir un fragmento de proteína o péptido de interés, por ejemplo, CL-EM, EM-ESI, Em /EM-ESI, EM-MALDI-TOF, EM-MALDI-TOF/TOF, EM en tándem, y similares. Los espectrómetros de masas generalmente contienen una fuente de iones y óptica, analizador de masas y electrónica de procesamiento de los datos. Entre los analizadores de masas se incluyen espectrómetros de masas de barrido y de haz iónico, tales como los espectrómetros de masas de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés) y cuadrupolo (Q, por su sigla en inglés), y los espectrómetros de masas de atrapamiento, tales como la trampa iónica (IT, por sus siglas en inglés), Orbitrap y resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FT-ICR, por sus siglas en inglés), que pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente memoria. Se pueden encontrar en la literatura datos de diversos métodos de EM. Ver, por ejemplo, Yates et al., Annu. Rev. Biomed. Eng. 11:49-79, 2009.
Antes del análisis de la EM, las proteínas en la muestra obtenida del paciente se pueden digerir primero en péptidos más pequeños por digestión química (p. ej., a través del corte con bromuro de cianógeno) o enzimática (p.ej., con tripsina). Las muestras complejas de péptidos también se benefician del uso de técnicas de separación en fase inicial, p. ej., 2D-PAGE, HPLC, RPLC, y cromatografía de afinidad. La muestra digerida, y opcionalmente separada, se ioniza usando una fuente de iones para crear moléculas cargadas para su posterior análisis. La ionización de la muestra puede llevarse a cabo, p. ej., mediante ionización por electropulverización (ESI, por sus siglas en inglés), ionización química a presión atmosférica (APCI, por sus siglas en inglés), fotoionización, ionización electrónica, bombardeo con átomo rápidos (FAB, por sus siglas en inglés)/ionización secundaria de líquidos (LSIMS, por sus siglas en inglés), desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés), ionización de campo, desorción de campo, ionización por termopulverización por pulverización de plasma e ionización por haz de partículas. La información adicional relacionada con la selección del método de ionización es conocida por el experto en la materia.
Después de la ionización, los péptidos digeridos seguidamente pueden fragmentarse para generar espectros de EM/EM característicos. La EM en tándem, también conocida como EM/EM, puede resultar particularmente útil para analizar mezclas complejas. La EM en tándem implica múltiples etapas de selección de EM, con alguna forma de fragmentación de iones entre las etapas, que se puede llevar a cabo con elementos de espectrómetro de masas individuales separados en el espacio o utilizando un solo espectrómetro de masas con las etapas de EM separadas en el tiempo. En la EM en tándem espacialmente separada, los elementos están físicamente separados y diferenciados, con una conexión física entre los elementos para mantener un alto vacío. En la EM en tándem temporalmente separada, la separación se consigue con iones atrapados en el mismo lugar, con múltiples etapas de separación que tienen lugar a lo largo del tiempo. Los espectros de EM/EM característicos a continuación pueden entonces ser comparados con una base de datos de secuencias peptídicas (p. ej., SEQUEST). Las modificaciones post-traduccionales de los péptidos también se pueden determinar, por ejemplo, mediante la búsqueda de espectros en una base de datos permitiendo modificaciones peptídicas específicas.
Composiciones farmacéuticas
Los transgenes de CASQ2 descritos en la presente memoria pueden incorporarse en un vehículo para su administración en el paciente, tal como un paciente humano que sufre de TVPC dominante, tal como se describe en la presente memoria. Las composiciones farmacéuticas que contienen vectores, tales como vectores virales, que contienen el transgén de CASQ2 se pueden preparar mediante métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, tales composiciones pueden prepararse utilizando, p. ej., portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), y en la forma deseada, p. ej., en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.
Las mezclas de ácidos nucleicos y vectores virales descritos en la presente memoria pueden prepararse en agua convenientemente mezclados con uno o más excipientes, portadores o diluyentes. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, dichas preparaciones pueden contener un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos. Entre las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles, para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (descritas en la patente n.° US 5.466.468).
En cualquier caso, la formulación puede ser estéril y puede ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Las formulaciones pueden ser estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, resultará preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La incorporación prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante la utilización en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Por ejemplo, una solución que contenga una composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede ser convenientemente tamponada, en caso necesario, y en primer lugar convertir el diluyente en isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares resultan especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los medios acuosos estériles que pueden ser utilizados serán conocidos por el experto en la materia, a la luz de la presente exposición. Por ejemplo, puede disolverse una dosis en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión. Se producirá alguna variación en las dosis dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para la administración en seres humanos, las preparaciones pueden requerir el cumplimento de normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo exigido por las normas de la Oficina de biológicos de la FDA.
Vías de administración y dosificación
Los vectores virales, tales como los vectores VAA y otros descritos en la presente memoria, que contienen el transgén pueden administrarse en un paciente (p. ej., un paciente humano) mediante una variedad de vías de administración. La vía de administración puede variar, por ejemplo, con el inicio y la gravedad de la enfermedad, y entre ellas se pueden incluir, por ejemplo, las administraciones intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intraarterial, intravascular, por inhalación, la infusión, el lavado y la administración oral. La administración intravascular incluye la administración en la vasculatura del paciente. En algunas realizaciones, la administración se realiza en un vaso, que se considera que es una vena (intravenosa), y en algunas administraciones, la administración se realiza en un vaso que se considera que es una arteria (intraarterial). Entre las venas se incluyen, aunque sin limitación, la vena yugular interna, una vena periférica, una vena coronaria, una vena hepática, la vena porta, y la vena safena magna, la vena pulmonar, la vena cava superior, la vena cava inferior, la vena gástrica, la vena esplénica, la vena mesentérica inferior, la vena mesentérica superior, la vena cefálica y/o la vena femoral. Entre las arterias se incluyen, aunque sin limitación, la arteria coronaria, la arteria pulmonar, la arteria braquial, la arteria carótida interna, el arco aórtico, la arteria femoral, una arteria periférica y/o una arteria ciliar. Se encuentra contemplado que la administración se realice mediante una arteriola o capilar.
Los regímenes de tratamiento pueden variar y con frecuencia dependen de la gravedad de la enfermedad y de la edad, el peso y el sexo del paciente. El tratamiento puede incluir la administración de vectores (p. ej., vectores virales) u otros agentes descritos en la presente memoria como útiles para la introducción de un transgén en una célula diana en diversas dosis unitarias. Cada dosis unitaria normalmente contendrá una cantidad predeterminada de la composición terapéutica.
En los casos en los que el transgén se administra en el paciente mediante terapia génica viral (por ejemplo, mediante la administración de un vector VAA descrito en la presente memoria, tal como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAARH74, VAA2/8, o VAA2/9, vector), el vector viral puede administrarse en el paciente a una dosis de entre, por ejemplo, aproximadamente 1x106 copias del genoma (CG)/kg y aproximadamente 1x1018CG/kg (p. ej., a una dosis de aproximadamente 1x106 CG/kg, 2x106 CG/kg, 3x106 CG/kg, 4x106 CG/kg, 5x106 CG/kg, 6x106 CG/kg, 7x106 CG/kg, 8x106 CG/kg, 9x106 CG/kg, 1x107 CG/kg, 2x107CG/kg, 3x107 CG/kg, 4x107 CG/kg, 5x107 CG/kg, 6x107 CG/kg, 7x107 CG/kg, 8x107CG/kg, 9x107 CG/kg, 1x108 CG/kg, 2x108 CG/kg, 3x108 CG/kg, 4x108 CG/kg, 5x108 CG/kg, 6x108 CG/kg, 7x108 CG/kg, 8x108 CG/kg, 9x108 CG/kg, 1x109 CG/kg, 2x109 CG/kg, 3x109 CG/kg, 4x109 CG/kg, 5x109 CG/kg, 6x109 CG/kg, 7x109 CG/kg, 8x109 CG/kg, 9x109 CG/kg, 1x1010 CG/kg, 2x1010 CG/kg, 3x1010 CG/kg, 4x1010 CG/kg, 5x1010 CG/kg, 6 x1010 CG/kg, 7x1010 CG/kg, 8x1010 CG/kg, 9x1010 CG/kg, 1x1c11 CG/kg, 2x1c11 CG/kg, 3x1c11 CG/kg, 4x1c11 CG/kg, 5x1c11 CG/kg, 6x1c11 CG/kg, 7x1c11 CG/kg, 8x1c11 CG/kg, 9x1c11 CG/kg, 1x1012 CG/kg, 2x1012 CG/kg, 3x1012 CG/kg, 4x1012 CG/kg, 5x1012 CG/kg, 6x1012 CG/kg, 7x1012 CG/kg, 8x1012 CG/kg, 9x1012 CG/kg, 1x1013 CG/kg, 2x1013 CG/kg, 3x1013 CG/kg, 4x1013 CG/kg, 5x1013 CG/kg, 6x1013 CG/kg, 7x1013 CG/kg, 8x1013 CG/kg, 9x1013 CG/kg, 1x1014 CG/kg, 2x1014 CG/kg, 3x1014 CG/kg, 4x1014 CG/kg, 5x1014 CG/kg, 6x1014 CG/kg, 7x1014 CG/kg, 8x1014 CG/kg, 9x1014 CG/kg, 1x1015 CG/kg, 2x10 15 CG/kg, 3x1015 CG/kg, 4x1015 CG/kg, 5x1015 CG/kg, 6x1015 CG/kg, 7x1015 CG/kg, 8x1015 CG/kg, 9x1015 CG/kg, 1x1016 CG/kg, 2x1016 CG/kg, 3x1016 CG/kg, 4x1016 CG/kg, 5x1016 CG/kg, 6x1016 CG/kg, 7x1016 CG/kg, 8x1016 CG/kg, 9x1016 CG/kg, 1x1017 CG/kg, 2x1017 CG/kg, 3x1017 CG/kg, 4x1017 CG/kg, 5x1017 CG/kg, 6x1017 CG/kg, 7x1017 CG/kg, 8x1017 CG/kg, 9x1017 CG/kg o 1x1018 CG/kg). En algunas realizaciones, el vector se administra en el paciente a una dosis de entre aproximadamente 1x108 CG/kg y aproximadamente 1x1016 CG/kg (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 1x108 CG/kg, 2x108 CG/kg, 3x108 CG/kg, 4x108 CG/kg, 5x108 CG/kg, 6x108 CG/kg, 7x108 CG/kg, 8x108 CG/kg, 9x108 CG/kg, 1x109 CG/kg, 2x109 CG/kg, 3x109 CG/kg, 4x109 CG/kg, 5x109 CG/kg, 6x109 CG/kg, 7x109 CG/kg, 8x109 CG/kg, 9x109 CG/kg, 1x1010 CG/kg, 2 x1010 CG/kg, 3x1010 CG/kg, 4x1010 CG/kg, 5x1010 CG/kg, 6x1010 CG/kg, 7x1010 CG/kg, 8 x1010 CG/kg, 9x1010 CG/kg, 1x1c11 CG/kg, 2x1c11 CG/kg, 3x1c11 CG/kg, 4x1c11 CG/kg, 5x1c11 CG/kg, 6x1c11 CG/kg, 7x1c11 CG/kg, 8x1c11 CG/kg, 9x1c11 CG/kg, 1x1012 CG/kg, 2x1012 CG/kg, 3x1012 CG/kg, 4x1012 CG/kg, 5x1012 CG/kg, 6x1012 CG/kg, 7x1012 CG/kg, 8x1012 CG/kg, 9x1012 CG/kg, 1x1013 CG/kg, 2x1013 CG/kg, 3x1013 CG/kg, 4x1013 CG/kg, 5x1013 CG/kg, 6x1013 CG/kg, 7x1013 CG/kg, 8x1013 CG/kg, 9x1013 CG/kg, 1x1014 CG/kg, 2x1014 CG/kg, 3x1014 CG/kg, 4x1014 CG/kg, 5x1014 CG/kg, 6x1014 CG/kg, 7x1014 CG/kg, 8x1014 CG/kg, 9x1014 CG/kg, 1x1015 CG/kg, 2x1015 CG/kg, 3x1015 CG/kg, 4x1015 CG/kg, 5x1015 CG/kg, 6x1015 CG/kg, 7x1015 CG/kg, 8x1015 CG/kg, 9x1015 CG/kg, o 1x1016 CG/kg). En algunas realizaciones, el vector se administra en el paciente a una dosis de entre aproximadamente 1x1010GC/kg y aproximadamente 1x1014GC/kg (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 1x1010 CG/kg, 2 x1010 CG/kg, 3x1010 CG/kg, 4x1010 CG/kg, 5x1010 CG/kg, 6x1010 CG/kg, 7x1010 CG/kg, 8x1010 CG/kg, 9x1010 CG/kg, 1x1c11 CG/kg, 2x1c11 CG/kg, 3x1c11 CG/kg, 4x1c11 CG/kg, 5x1c11 CG/kg, 6x1c11 CG/kg, 7x1c11 CG/kg, 8x1c11 CG/kg, 9x1c11 CG/kg, 1x1012 CG/kg, 2x1012 CG/kg, 3x1012 CG/kg, 4x1012 CG/kg, 5x1012 CG/kg, 6x1012 CG/kg, 7x1012 CG/kg, 8x1012 CG/kg, 9x1012 CG/kg, 1x1013 CG/kg, 2x1013 CG/kg, 3x1013 CG/kg, 4x1013 CG/kg, 5x1013 CG/kg, 6x1013 CG/kg, 7x1013 CG/kg, 8x1013 CG/kg, 9x1013 CG/kg o 1x1014 CG/kg).
Ejemplos
Se describen los siguientes ejemplos a fin de proporcionar al experto habitual en la materia una descripción de cómo las composiciones y métodos descritos en la presente memoria pueden ser utilizados, preparados y evaluados, y se proporcionan a título puramente de ejemplo de la invención y no pretenden ser limitativos del alcance de la invención que se define mediante las reivindicaciones.
Ejemplo 1. La administración de CASQ2 en ratones heterocigóticos RYR 4496C/+ elimina la arritmia de una manera independiente de la expresión de RYR2, triadina y junctina
Materiales y métodos:
Uso de animales
Los animales fueron mantenidos y criados en los Charles River Laboratories en Calco, Italia, y transferidos al ICS Maugeri Spa-SB para la caracterización del fenotipo. Los animales fueron mantenidos y estudiados de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité para el bienestar animal por la Universidad de Pavía.
Generación del modelo murino R4496C RYR2 knock-in
Los experimentos descritos en el presente ejemplo utilizaron un modelo de ratón heterocigótico RYR2 R4496C/+knock-inde TVPC dominante, que recapitula el fenotipo de la mutación humana RYR2 R4997C. Los detalles con respecto a la producción de este modelo de ratón se proporcionan en la patente n.° US 7.741.529.
Diseño y producción de vectores
Se proporciona una descripción detallada del diseño de uno de los vectores utilizados en estos experimentos en la patente n.° US 8.859.517. En resumen, se generó un vector adenoasociado de serotipo 9 (VAA2/9) pseudotipado que contenía la secuencia codificante, sin secuencias UTR, de CASQ2 murino de tipo salvaje (secuencia de referencia del NCBI n.° NM_009814.2). El CASQ2 murino de tipo salvaje fue clonado en el vector pGEM-T-Easy (Promega). Mediante digestión enzimática con EcoRl, se extrajo del vector pGEM el inserto correspondiente al transgén de CASQ2 y se subclonó en el vector bicistrónico pIRES (BD Biosciences, n.° de cat. 631605, Clontech Palo Alto CA, EE. UU.). Posteriormente, se subclonó el fragmento correspondiente al transgén de CASQ2 seguido de la secuencia IRES, mediante amplificación por PCR utilizando cebadores específicos (directo: 5'-CACAGCGGCCGCACAATGAAGGATTTACCTGCTCATGG-3' (SEC ID n.° 5) e inverso: 5'-CGAAGCATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (SEC ID n.° 6) que contenían el sitio enzimático NotI. El amplicón se insertó en el vector de esqueleto adenovírico pVAA-2,1-eGFP, serotipo 9 (que contiene una secuencia poli-A de hormona de crecimiento bovina (BGH, por sus siglas en inglés) y promotor del CMV), proporcionado por las instalaciones Adeno-Associated Virus (AAV) vector Core (Tigem, Napoli, Italia), mediante digestión enzimática con Not I. Todos los plásmidos fueron secuenciados.
La producción de VAA se realizó en colaboración con las instalaciones Tigem AAV Vector Core.
El vector VAA se produjo utilizando una transfección transitoria de 3 plásmidos en células HEK 293: pAd ayudante, pVAA rep-cap (empaquetamiento), pVAA Cis (incluyendo el inserto de CASQ2, clonado en el plásmido pVAA2.1-CMV-eGFP MCS). Se llevó a cabo un análisis de PCR en tiempo real y de transferencia por puntos para evaluar el título viral, y SDS-PAGE seguida de tinción de Coomassie para evaluar la presencia y pureza de las proteínas de cápside. También se evaluó la infectividad y la esterilidad. El servicio proporcionó una preparación viral en PBS con un rendimiento total superior a 1x1012 copias genómicas. Todas las reservas de VAA2/9-WT-mCASQ2-IRES-eGFP se congelaron a -80 °C en alícuotas simples y se descongelaron durante el procedimiento quirúrgico.
Se utilizaron métodos similares de producción de VAA recombinantes para proporcionar un segundo vector investigado en estos experimentos. El segundo vector era un vector VAA2/8 pseudotipado que contenía un transgén codificante de CASQ2 de tipo salvaje ligado operablemente a un promotor de desmina. Se muestran diversos componentes de este segundo vector en la fig. 4.
PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN total de tejido cardíaco de ratones heterocigóticos RyR2 R4496C/+ y RyR2 R4496C/+knock-ininfectados con el vector viral VAA9-WT-mCASQ2-IRES-eGFP fue purificado con el minikit RNeasy (Qiagen). Se utilizó una cantidad total de 1 |jg de ARN molde por reacción para el ensayo RT-PCR realizado con el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE. UU.). La cuantificación en tiempo real del ARNm de diversos genes de interés (RyR2 CASQ2, Triadin, Junctin) y el gen de referencia (GAPDH) se llevó a cabo en placas ópticas de 96 pocillos utilizando el módulo de detección CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Todas las muestras se analizaron por triplicado con SsoFast EvaGreen Supermix utilizando una mezcla de cebadores específicos y 20 ng de ADNc molde con cebadores previamente dados a conocer (Denegrí et al., Circulation 129:267381 (2014)). La PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 y se analizó utilizando el software Bio-Rad CFX96 Manager (versión 1.5).
Experimentos in vivo
El vector VAA que contenía el constructo mostrado en la fig. 1 se administró mediante inyección intraperitoneal de 100 |jl de virus purificado a dosis de 6,4x1011 copias genómicas en n=4 ratones neonatales con una jeringa de calibre 25 en el octavo día postnatal (P8). Un total de n=5 camadas no fueron tratadas.
A las 7 semanas de edad, se implantaron monitores de electrocardiografía (ECG) y radiotelemetría (Data Sciences International) por vía subcutánea bajo anestesia general (isoflurano al 1,5-3 %) en todos los ratones. Después de 72 horas de recuperación de la cirugía, se llevó a cabo la caracterización del fenotipo. Se registró el ECG basal para evaluar la presencia de arritmias espontáneas. Inmediatamente después, se sometió a ensayo la susceptibilidad de los ratones a las arritmias inducidas adrenérgicamente, mediante la administración de epinefrina (2 mg/kg) y cafeína (120 mg/kg) por inyección intraperitoneal (Cerrone et al., M, Circulation Research 96:e77-e82 (2005), Liu et al., Circulation Research 99:292-298 (2006)). Se permitió movimiento libre a todos los animales durante la realización de los registros de ECG.
A continuación, se repitió este experimento el vector VAA2/8 mostrado en la fig. 4 con el fin de investigar los efectos antiarrítmicos de dicho constructo en un organismo modelo para TVPC de herencia dominante. Se administró el vector VAA2/8 en ratones heterocigóticos RyR2 R4496C/+ (n=9) a dosis de 6x1013 genomas de vector (vg) por kg. Como control se utilizaron ratones heterocigóticos RyR2 R4496C/+ no tratados (n=9). A los dos meses de la administración, los ratones fueron evaluados mediante análisis electrofisiológicoin vivo(ECG) bajo estimulación de epinefrina y cafeína.
Resultados
Tal como se muestra en la FIG. 2, la administración de un vector VAA codificante de transgén de CASQ2 en ratones RYR2 R4996C/+ dio lugar a una supresión completa de la arritmia inducida por cafeína y epinefrina. Después de la estimulación p-adrenérgica, ninguno de los 4 ratones tratados con VAA CASQ2 mostró actividad arrítmica, mientras que la totalidad de los 5 ratones no tratados mostró arritmia. Además, los efectos terapéuticos de la administración de CASQ2 en ratones RYR2 R4996C/+ no eran dependientes de la actividad de RYR2 o de las proteínas asociadas a membrana, triadina y junctina. Tal como se muestra en la FIG. 3, la administración del vector VAA CASQ2 resultó en una expresión elevada de CASQ2 en los miocitos cardíacos, pero no alteró sustancialmente la expresión de RYR2, triadina o junctina en tales células.
Tal como se muestra en la fig. 5, se obtuvieron resultados similares utilizando el constructo de VAA2/8. En particular, la administración del vector VAA2/8-desmina-CASQ2 dio lugar a una supresión completa de la arritmia inducida por cafeína y epinefrina en ratones RYR2 R4996C/+, mientras que el 44 % de los ratones no tratados mostró arritmia.
En conjunto, estos resultados demuestran que la administración de transgén de CASQ2 en modelos murinos de TVPC dominante facilita la corrección de las arritmias bidireccionales y polimórficas. Inesperadamente, se encontró que la transferencia del gen CASQ2 por sí solo, sin necesidad de administrar RYR2, podía prevenir el ritmo fisiológico sinusal que desencadena arritmias debido a la activación adrenérgica. La terapia génica de CASQ2 en modelos de TVPC dominante murina dio como resultado una expresión aumentada de CASQ2 en miocitos cardíacos y restauró la función contráctil cardíaca antiarrítmica.
En vista de estos resultados y de la descripción proporcionada en la presente memoria, la terapia génica de CASQ2 podría utilizarse como paradigma para el tratamiento de la TVPC dominante, tal como se ilustra en el Ejemplo 2, a continuación.
Ejemplo 2. Tratamiento de la TVPC dominante en un paciente humano mediante la administración de un vector viral que contiene un transgén de CASQ2
Utilizando técnicas de biología molecular convencionales conocidas de la técnica, puede incorporarse un gen codificante de una proteína CASQ2, tal como la proteína humana CASQ2 de tipo salvaje que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1 (o una variante de la misma con una identidad de secuencia de por lo menos 85 % respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1), en un vector viral y formularse para la administración en un paciente humano. Por ejemplo, en un paciente que sufre de TVPC dominante se puede administrar un vector VAA que contenga un transgén de CASQ2 bajo el control de un elemento regulador transcripcional que promueve la expresión de CASQ2 en miocitos cardíacos. El vector VAA puede ser un vector pseudotipado que incorpore el transgén de CASQ2 entre las repeticiones terminales invertidas 5' y 3' de VAA2 y que esté encapsidado por las proteínas de cápside de VAA8 o VAA9 (p. ej., un vector VAA2/8 o VAA2/9). El vector VAA puede administrarse en el sujeto mediante una variedad de vías de administración, tales como intravenosa, intramuscular, o subcutánea, entre otras.
Tras la administración del vector en un paciente, el experto en la materia puede monitorizar la expresión del gen CASQ2, y la mejoría del paciente en respuesta a la terapia, mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, el médico puede monitorizar la función cardíaca del paciente mediante el análisis de la cantidad o frecuencia de eventos de arritmia mostrados por el paciente después de la administración del transgén. Un hallazgo de que el paciente muestra menos o ninguna actividad de arritmia en un período de tiempo específico después de la administración del transgén de CASQ2 en comparación con un período de tiempo equivalente evaluado antes de la administración del transgén puede indicar que el paciente está respondiendo favorablemente al tratamiento. Pueden determinarse y administrarse las dosis posteriores según se requiera.
Otras realizaciones
Otras realizaciones están comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones.

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    i.Composición que comprende un transgén codificante de calsecuestrina 2 (CASQ2) para la utilización en el tratamiento terapéutico de la taquicardia polimórfica ventricular catecolaminérgica dominante (TVPC) en un paciente humano que lo necesita, en la que el paciente muestra una mutación de ganancia de función en un gen endógeno codificante del receptor de rianodina 2 (RYR2).
  2. 2. Composición que comprende un transgén codificante de calsecuestrina 2 (CASQ2) para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicho tratamiento reduce la arritmia en dicho paciente humano.
  3. 3. Composición que comprende un transgén codificante de calsecuestrina 2 (CASQ2) para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicho tratamiento restaura la homeostasis del calcio en dicho paciente humano.
  4. 4. Composición que comprende un transgén codificante de calsecuestrina 2 (CASQ2) para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicho tratamiento reduce los eventos de postdespolarización en dicho paciente humano.
  5. 5. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la mutación en RYR2 resulta en un aumento de la liberación de calcio citosólico en un miocito cardíaco que es puesto en contacto con un agonista de RYR2 en comparación con un miocito cardíaco que no ha sido puesto en contacto con el agonista de RYR2.
  6. 6. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la mutación en RYR2 es R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324DUP, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S y/o R4959Q.
  7. 7. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la mutación es heterocigótica.
  8. 8. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el transgén de CASQ2 codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica, preferentemente por lo menos 90 % idéntica, más preferentemente por lo menos 95 % idéntica, a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1, y/o en la que el transgén de CASQ2 presenta una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 85 % idéntica, preferentemente por lo menos 90 % idéntica, más preferentemente por lo menos 95 % idéntica, a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 2.
  9. 9. Composición para la utilización según la reivindicación 8, en la que el transgén de CASQ2 codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 1 y/o presenta la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 2.
  10. 10. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es un vector, preferentemente en la que el vector es un vector viral, más preferentemente en la que el vector viral se selecciona del grupo que consiste en virus adenoasociado (VAA), adenovirus, lentivirus, retrovirus, virus de la viruela, baculovirus, virus del herpes simple, virus vaccinia y un virus sintético.
  11. 11. Composición para la utilización según la reivindicación 10, en la que el virus sintético es virus quimérico, virus mosaico, o virus pseudotipado, y/o comprende una proteína foránea, polímero sintético, nanopartícula, o molécula pequeña.
  12. 12. Composición para la utilización según la reivindicación 10, en la que el vector viral es un VAA, más preferentemente en la que el VAA es de serotipo VAA1, VAA2, VAa 3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9 o VAArh74.
  13. 13. Composición para la utilización según la reivindicación 10, en la que el vector viral es un VAA pseudotipado, preferentemente en la que el VAA pseudotipado es VAA2/8 o VAA2/9.
  14. 14. Composición para la utilización según la reivindicación 12, en la que el VAA comprende una proteína de cápside recombinante.
  15. 15. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es un liposoma, vesícula, vesícula sintética, exosoma, exosoma sintético, dendrímero o nanopartícula.
  16. 16. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el transgén está operablemente ligado a un promotor que induce la expresión de CASQ2 en un miocito cardíaco, preferentemente en la que el promotor es un promotor de desmina, promotor del citomegalovirus, promotor de la cadena ligera de la miosina-2, promotor de actina alfa, promotor de desmina, promotor de troponina 1, promotor de intercambiador Na+/Ca2+, promotor de distrofina, promotor de creatina quinasa, promotor de integrina alfa 7, promotor del péptido natriurético cerebral, promotor de alfa B-cristalina/proteína de choque térmico pequeña, promotor de la cadena pesada de la miosina alfa, o promotor del factor natriurético auricular, más preferentemente un promotor de desmina.
  17. 17. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que, al administrar la composición en el paciente, la expresión de CASQ2 se incrementa en una célula cardíaca del paciente, preferentemente en la que la célula cardíaca es un miocito cardíaco.
  18. 18. Composición para la utilización según la reivindicación 17, en la que la expresión de CASQ2 se evalúa mediante la medición del ARNm de la proteína CASQ2 o CASQ2 en la célula.
  19. 19. Composición para la utilización según la reivindicación 18, en la que la expresión del ARNm de CASQ2 se incrementa en un factor de entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 3,5, preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3, más preferentemente de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3, en la célula.
  20. 20. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que, al administrar la composición en el paciente, la expresión de RYR2, triadina y/o junctina no resulta sustancialmente alterada en una célula cardíaca del paciente.
  21. 21. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la composición se administra en el paciente por vía intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intraarterial, intravascular, inhalación, infusión, mediante lavado y/o administración oral.
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