ES2989647T3 - Métodos de cribado y aplicaciones terapéuticas basadas en la inhibición de la motilidad bacteriana - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección bacteriana o una afección asociada con la infección bacteriana, en la que la infección bacteriana es causada por bacterias flageladas. La presente invención se refiere además a un método para identificar compuestos que tienen actividad antimotilidad bacteriana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de cribado y aplicaciones terapéuticas basadas en la inhibición de la motilidad bacteriana

La presente invención se define por las reivindicaciones tal como se adjuntan. En el presente documento se describe de manera general, pero no queda cubierto por las reivindicaciones, un método de identificación de un compuesto que tiene actividad antimotilidad bacteriana, comprendiendo el método: (a) cultivar bacterias flageladas en presencia de un compuesto de prueba en condiciones de crecimiento; (b) determinar el nivel de expresión de un gen flagelar bacteriano o un gen de quimiotaxis bacteriano, en el que dicho nivel de expresión se determina detectando (i) el nivel de ARNm y/o de proteína de dicho gen flagelar bacteriano o dicho gen de quimiotaxis bacteriano; y/o (ii) una señal proporcionada por un constructo de gen indicador, en el que el constructo de gen indicador comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de gen indicador operativamente unido a un promotor de un gen flagelar bacteriano o de un gen de quimiotaxis bacteriano; y en el que una reducción en el nivel de expresión en comparación con el nivel de expresión en bacterias de la misma especie no cultivadas en presencia de dicho compuesto de prueba es indicativa de que dicho compuesto de prueba tiene actividad antimotilidad bacteriana y/o actividad bacteriostática y/o actividad bactericida; (c) cultivar en condiciones de crecimiento bacterias de la misma especie que en (a) en presencia del compuesto de prueba identificado en (b) que tiene actividad antimotilidad bacteriana y/o actividad bacteriostática y/o actividad bactericida; y (d) determinar la presencia o ausencia de crecimiento de dichas bacterias, en el que la ausencia de inhibición del crecimiento es indicativa de que dicho compuesto de prueba tiene una actividad antimotilidad bacteriana y no tiene sustancialmente ninguna actividad bacteriostática y bactericida; y opcionalmente (e) determinar la identidad y/o estructura de (i) el compuesto de prueba que tiene una actividad antimotilidad bacteriana; y/o (ii) una molécula diana de dicho compuesto de prueba, preferiblemente el epítopo de unión de dicho compuesto de prueba en dicha molécula diana.

En esta memoria descriptiva, se citan varios documentos incluyendo solicitudes de patente y manuales del fabricante.

Helicobacterpylori (H. pylori),anteriormente conocida comoCampylobacterpylori(C.pylori),es una bacteria flagelada microaerófila, Gram-negativa, de la clase deEpsilonproteobacteriay un patógeno gástrico humano prevalente que coloniza la mucosa gastroduodenal y produce inflamación, provocando millones de estados patológicos gastrointestinales graves, incluyendo una estimación de 900.000 nuevos casos de cáncer gástrico cada año a nivel mundial (Herrera y Parsonnet, 2009; Suerbaum y Michetti, 2002; Lertsettakarnet al.,2011; Chevance FF y Hughes KT, Methods Mol Biol. 2017; 1593: 47-71). La erradicación de H.pylories una estrategia viable para prevenir el cáncer gástrico (monografía de IARC 2014; Leeet al.,2008; Zhanget al.,2015).

Los tratamientos establecidos actuales de infecciones porH. pylorise basan en terapias de combinación, o bien como terapia triple, usando dos antibióticos (habitualmente amoxicilina y claritromicina) y un inhibidor de la bomba de protones (PPI), o bien como terapia cuádruple, en la que se aplican adicionalmente bismuto o antibióticos adicionales (Ko, Kim, Chung y Lee, 2019; Loboet al.,1994; Lutheret al.,2010; C. O'Morainet al.,2003; N. R. O'Morain, Dore, O'Connor, Gisbert y O'Morain, 2018). La norma actual de usar múltiples antibióticos para tratar infecciones porH. pylorise origina del hecho de que las terapias individuales no eliminaban de manera satisfactoria las bacterias en seres humanos tras los primeros ensayos. El fallo del tratamiento con antibióticos individuales puede deberse, tal como se propone, a la persistencia asintomática de las bacterias durante y tras el tratamiento, lo cual conduce entonces a recrudecimiento/recidiva de la infección en puntos de tiempo posteriores tras detenerse el tratamiento (Xia, Talley, Keane y O'Morain, 1997). Tal recrudecimiento bacteriano indica que la colonización bacteriana suprimida puede retroceder a los denominados “sitios resguardados”, tales como la zona de transición entre el cuerpo y el antro del estómago (van Zanten, Kolesnikow, Leung, O'Rourke y Lee, 2003). Estas zonas de persistencia pueden favorecer la supervivencia de las bacterias y ser inaccesibles para una acción antimicrobiana completa, en particular, si sólo se usa un único compuesto antibacteriano.

Las terapias de combinación actualmente aplicadas presentan una escasa eficacia y graves efectos secundarios. Una creciente preocupación es el efecto destructivo irreversible de terapias basadas en antibióticos comunes contra H.pylorisobre la microbiota humana residente beneficiosa, en particular del tracto digestivo (Blaser, 2016; Detlefsen, Huse, Sogin y Relman, 2008; Hsuet al.,2018). Esto se debe a que la mayoría de los antibióticos actualmente aplicados actúan contra dianas esenciales conservadas comunes para diferentes especies bacterianas. Otro obstáculo principal para el éxito del tratamiento de los antibióticos actualmente usados es el desarrollo aumentado de resistencia a antibióticos enH. pylori,pero también otros patógenos bacterianos simultáneamente presentes en el cuerpo del paciente (Agudoet al.,2009; Ducket al.,2004; Pilottoet al.,2000). Esto ha conducido a la inclusión de cepas deH. pyloriresistentes (en particular cepas resistentes a claritromicina) en la lista de prioridad del top 10 de la OMS de infecciones resistentes a antibióticos que necesitan urgentemente productos terapéuticos novedosos. Una desventaja adicional de las terapias de combinación actuales surge de inhibidores de la bomba de protones que se sospecha que contribuyen a la cancerogénesis como consecuencia a su impacto perturbador sobre el microbioma gástrico. Actualmente no hay vacunas contraH. pyloriclínicamente disponibles e intensos esfuerzos en este campo en estudios con seres humanos no han sido eficaces hasta la fecha (Aebischeret al.,2008; Maffertheineret al.,2018; Zenget al.,2015).

En los últimos años, se han sugerido diversas estrategias y actualmente se siguen para superar estas múltiples desventajas. Una estrategia ha sido desarrollar nuevas generaciones de antibióticos con selectividad de especie diana aumentada. Por ejemplo,Gavrishy colaboradores, aplicando un enfoque de cribado antibacteriano, identificaron HPi1 (3-hidrazinoquinoxalina-2-tiol), un compuesto novedoso que, en un ensayoin vitroy evaluación preliminar en un modelo de ratón, mostró actividad antibiótica clásica, aparentemente de manera selectiva contraH. pylori(Gavrishet al.,2014). Otro estudio de Kennedy y colaboradores notificó el desarrollo de amixicilo, un compuesto novedoso con actividad antibacteriana clásica que inhibe la función de piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (PFOR), una enzima metabólica esencial enH. pyloriimplicada en la generación de energía mediante descarboxilación oxidativa de piruvato, pero todavía falta también la validación clínica en pacientes humanos (Kennedyet al.,2016). Sin embargo, aunque un aumento de la selectividad haciaH. pyloripuede ayudar a perdonar a la microbiota residente, es probable que tales agentes con actividad antibiótica clásica, es decir, que seleccionan como diana el crecimiento y/o la supervivencia bacterianos, fomenten los mecanismos de evasión de patógenos que pueden culminar en el desarrollo de resistencia a antibióticos y/o persistencia recurrente.

Estrategias alternativas se dirigen a la inhibición de virulencia bacteriana, que, a diferencia de compuestos con actividad antibiótica clásica, van dirigidos a desarmar a los patógenos en lugar de destruirlos o inhibir su crecimiento. En general, se piensa que los fármacos dirigidos a virulencia (denominados “fármacos antivirulencia” o “bloqueadores de patógenos”) aplican menos presión selectiva para el desarrollo de resistencia a antibióticos que los enfoques tradicionales. Además, puede esperarse que los fármacos antivirulencia sean más específicos de microorganismo y, por tanto, sea menos probable que tengan un impacto sobre la flora comensal huésped. Se han sugerido diversas dianas para estrategias antivirulencia incluyendo la inhibición de la formación de biopelícula, adherencia y toxinas bacterianas (Allen, Popat, Diggle y Brown, 2014; Rasko y Sperandio, 2010; Totsika, 2017). Sin embargo, salvo por algunos anticuerpos recientemente aprobados contra toxinas bacterianas, los avances en este sentido han sido limitados (Theurezbacher y Piddock, 2019).

Los ejemplos de estrategias terapéuticas antivirulencia recientemente seguidas contraH. pylorison inhibidores (por ejemplo, de la clase de aril-amino-hidroxamato) de la enzima bacteriana ureasa, que se ha mostrado que se requiere para la colonización deH. pylori,pero no para su supervivencia (Ferrero, Thiberge, Huerre y Labigne, 1994; Kavermannet al.,2003; Salama, Shepherd y Falkow, 2004); y compuestos (por ejemplo, de la clase de selenazol) que seleccionan como diana la enzima metabólica anhidrasa carbónica, que, de manera similar a la ureasa, no es esencial para la supervivencia deH. pylori(Angeliet al.,2019).

Otra estrategia antivirulencia recientemente apoyada se basa en seleccionar como diana la motilidad bacteriana (es decir, la capacidad de movimiento direccional) y/o la quimiotaxis (es decir, la capacidad de movimiento en respuesta a un estímulo químico) que se ha encontrado que, enH. pyloriy otras bacterias flageladas, son factores críticos para la colonización de huésped y la patogenia (Erhardt, 2016). Sin embargo, a pesar de múltiples esfuerzos dedicados a la investigación y desarrollo, hasta la fecha no hay ningún fármaco antivirulencia eficaz dirigido a la motilidad bacteriana y no hay ningún método de cribado adecuado disponibles.

Por consiguiente, todavía existe una necesidad urgente en la técnica de proporcionar medios y métodos para tratar de manera satisfactoria infecciones de bacterias patógenas, y en particular bacterias patógenas tales comoH. pylori.La presente invención aborda esta necesidad y proporciona un método y compuestos de este tipo útiles para tales tratamientos.

La presente invención se define por las reivindicaciones. Por tanto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I),

para su uso en

(A) el tratamiento y/o la prevención de una infección bacteriana, en el que la infección bacteriana está provocada por bacterias flageladas seleccionadas deHelicobacter spp.yCampylobacter spp.;

(B) el tratamiento de un estado asociado con la infección bacteriana tal como se define en (A), en el que el estado se selecciona de úlcera péptica, gastritis, duodenitis, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT) gástrico, enteritis y enterocolitis; o

(C) la prevención de un estado asociado con la infección bacteriana tal como se define en (A), en el que el estado se selecciona de úlcera péptica, gastritis, duodenitis, cáncer gástrico (de estómago), linfoma de mAlT gástrico, enteritis y enterocolitis; y

en el que en (A) a (C) tiene que administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto a un sujeto que lo necesita, en el que el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, u otro animal; y

en el que:

(a) X e Y de la fórmula (I) se seleccionan independientemente de N, O y S;

(b) R<1>es:

(b-<1>) fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más de:

(i) alquilo C<1-3>o isopropilo; y/o

(ii) X o CX<3>(X se selecciona de Cl, Br, I y F); o

(b-<2>) bifenilo;

(c) R<2>es CX<3>o CH<2>CX<3>, en el que X se selecciona de H, F, Cl, Br e I;

(d) R<3>es CH<2>SX, en el que X es H o C(NH)NH<2>;

(e) R<4>se selecciona de F, Cl, Br e I; y

(f) R<5>es O; y

en el que el compuesto tiene una actividad antimotilidad sobre las bacterias.

En una realización preferida del compuesto para su uso según la invención, el compuesto es de fórmula (II):

en el que

(a) X e Y de la fórmula (II) se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S;

(b) R<2>es CH<3>o CH<2>CH<3>;

(c) R<3>es SX, en el que X es H o

(d) R<4>se selecciona de F, Cl, Br e I; y

(e) R<5>y R<6>se seleccionan cada uno independientemente de X o CX<3>(X se selecciona de H, F, Cl, Br e I), etilo, isopropilo o fenilo.

En una realización preferida de esta última realización

(a) X e Y de la fórmula (II) se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S;

(b) R<2>es CH<3>o CH<2>CH<3>;

(c) R<3>es SX, en el que X es H o

y

(d) R<4>se selecciona de F, Cl, Br e I;

(e) R<5>es H o CH<3>; y

(f) R<6>es X o CX<3>(X se selecciona de H, F, Cl, Br e I), etilo, isopropilo o fenilo.

En una realización adicional preferida del compuesto para su uso según la invención, el compuesto es de fórmula (III):

( I I I ) .

(a) R<2>es CH<3>o CH<2>CH<3>;

(b) R<3>es SX, en el que X es H o

y

(c) R<4>se selecciona de F, Cl, Br e I;

(d) R<5>es H o CH<3>; y

(e) R<6>es H, X o CX<3>(en el que X es H, F, Cl, Br o I), etilo, isopropilo o fenilo.

En una realización preferida de esta última realización,

(a) R<2>es CH<2>CH<3>y R<3>es SH; o

(b) R<2>es CH<3>y R<6>es H, X (en el que X es F, Cl, Br o I), CH<3>, etilo, isopropilo o fenilo.

En una realización preferida de estas dos últimas realizaciones,

(a) R<2>es CH<2>CH<3>, R<3>es SH, y R<5>y R<6>son cada uno H; o

(b) R<2>es CH<3>, R<3>es SH, y R<5>y R<6>son cada uno H.

En una realización adicional preferida del compuesto para su uso según la invención, el compuesto se selecciona de:

En una realización adicional preferida del compuesto para su uso según la invención, el compuesto se selecciona de:

En una realización adicional preferida del compuesto para su uso según la invención, laHelicobacter spp.y/o laCampylobacter spp.son

(a) bacterias patógenas gastrointestinales;

(b) bacterias patógenas gastroduodenales;

(c) bacterias patógenas urogenitales;

(d) no sensibles a tratamiento con antibióticos;

(e)Helicobacter pylori;y/o

(f)Campylobacter jejunioCampylobacter coli.

En una realización adicional preferida del compuesto para su uso según la invención, el compuesto tiene que administrarse en combinación, o de manera secuencial, con uno o más agentes adicionales seleccionados de:

(a) antibiótico, preferiblemente seleccionado de amoxicilina, penicilina, claritromicina, metronidazol, tetraciclina, tinidazol, rifampina, rifabutina, ciprofloxacina, gemifloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, norfloxacina y ofloxacina u otra fluoroquinolona o quinolona; y/o

(b) sal de bismuto, preferiblemente subcitrato de bismuto de potasio; y/o

(c) inhibidor de la bomba de protones (PPI), preferiblemente seleccionado de pantoprazol, omeprazol, lansoprazol, esomeprazol, rabeprazol, dexlansoprazol, dexrabeprazol y vonoprazán; y/o

(d) inhibidor de ureasa; y/o

(e) inhibidor de anhidrasa carbónica, preferiblemente acetazolamida.

También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un método de identificación de un compuesto que tiene actividad antimotilidad bacteriana, comprendiendo el método: (a) cultivar bacterias flageladas en presencia de un compuesto de prueba en condiciones de crecimiento; (b) determinar el nivel de expresión de un gen flagelar bacteriano o un gen de quimiotaxis bacteriano, en el que dicho nivel de expresión se determina detectando (i) el nivel de ARNm y/o de proteína de dicho gen flagelar bacteriano o dicho gen de quimiotaxis bacteriano; y/o (ii) una señal proporcionada por un constructo de gen indicador, en el que el constructo de gen indicador comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de gen indicador operativamente unido a un promotor de un gen flagelar bacteriano o de un gen de quimiotaxis bacteriano; y en el que una reducción en el nivel de expresión en comparación con el nivel de expresión en bacterias de la misma especie no cultivadas en presencia de dicho compuesto de prueba es indicativa de que dicho compuesto de prueba tiene actividad antimotilidad bacteriana y/o actividad bacteriostática y/o actividad bactericida; (c) cultivar en condiciones de crecimiento bacterias de la misma especie que en (a) en presencia del compuesto de prueba identificado en (b) que tiene actividad antimotilidad bacteriana y/o actividad bacteriostática y/o actividad bactericida; y (d) determinar la presencia o ausencia de crecimiento de dichas bacterias, en el que la ausencia de inhibición del crecimiento es indicativa de que dicho compuesto de prueba tiene una actividad antimotilidad bacteriana y no tiene sustancialmente ninguna actividad bacteriostática y bactericida; y opcionalmente (e) determinar la identidad y/o estructura de (i) el compuesto de prueba que tiene una actividad antimotilidad bacteriana; y/o (ii) una molécula diana de dicho compuesto de prueba, preferiblemente el epítopo de unión de dicho compuesto de prueba en dicha molécula diana.

El término “bacterias flageladas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier especie bacteriana que expresa al menos un flagelo. Un flagelo (plural: flagelos) es el orgánulo bacteriano que confiere motilidad.

El término “motilidad”, o “motilidad flagelar” tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a la capacidad de una bacteria flagelada de movimiento direccional. Un sistema de motilidad bacteriana funcional requiere la expresión funcional de uno o más flagelos como orgánulo para locomoción y el sistema de quimiotaxis (o sistema quimiosensor) que controla la rotación flagelar basándose en condiciones del entorno (revisado en Lertsettakarnet al.,2011; Chevance FF y Hughes KT, Methods Mol Biol. 2017; 1593: 47-71). Los componentes generales de estos sistemas y su compleja interacción se describen adicionalmente a continuación.

El término “quimiotaxis”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la orientación o al movimiento de una bacteria flagelada en respuesta a la presencia de un producto químico o gradiente químico, mediante lo cual dicha orientación o movimiento se ve influido de una manera positiva o negativa por la sustancia que muestra propiedades químicas. Los quimioatrayentes y quimiorrepelentes funcionan para inducir una quimiotaxis o bien positiva o bien negativa, respectivamente.

El término “actividad antimotilidad”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier actividad o efecto provocado por un compuesto que conduce a una inhibición de la motilidad disfuncional o completa.

Una actividad antimotilidad puede deberse a una actividad del compuesto que conduce a una biosíntesis alterada o defectuosa y/o a una función alterada de un flagelo bacteriano. Una actividad antimotilidad también puede deberse a una actividad de un compuesto que conduce a una biosíntesis alterada o defectuosa y/o a una función alterada de cualquier componente del sistema de quimiotaxis bacteriano. Por tanto, se entiende que una actividad antimotilidad puede resultar de una actividad del compuesto sobre cualquier componente estructural o regulador del sistema de quimiotaxis y/o flagelo bacteriano.

El término “actividad antiflagelar”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una forma particular de “actividad antimotilidad” en la que el compuesto afecta a la biosíntesis y/o función de un flagelo bacteriano.

Un “flagelo bacteriano” está compuesto por aproximadamente de 25 a 30 proteínas relativamente conservadas con números de copias que oscilan desde unas pocas hasta unos pocos miles y se realiza mediante autoensamblaje de esas proteínas. Generalmente, un flagelo consiste en un motor molecular incorporado en membrana que hace rotar un filamento helicoidal largo que funciona como hélice que impulsa la bacteria a través del entorno líquido.

Un flagelo bacteriano puede dividirse en dos subestructuras principales: el gancho-cuerpo basal (HBB) y el filamento extracelular (revisado en Lertsettakarnet al.,2011; Chevance FF y Hughes KT, Methods Mol Biol. 2017; 1593: 47-71).

El HBB puede dividirse además en tres estructuras: (a) la base (o cuerpo basal), ubicada en el citoplasma; (b) el vástago y estructuras de anillo asociadas, ubicados en el periplasma; y (c) el gancho localizado en la superficie. La base consiste en el anillo MS, el anillo C (o complejo de conmutación), el sistema de secreción de tipo III (T3SS) flagelar, y el motor. El anillo MS, ubicado en la membrana interna, es un homomultímero de FliF con un T3SS flagelar funcional (compuesto por FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ y FliR) dentro del parche de membrana central del anillo. El T3SS flagelar exporta muchas proteínas que forman parte del flagelo. El anillo C (compuesto por FliG, FliM, FliN o FliY; lasEpsilonproteobacteriacontienen tanto FliN como FliY), ubicado en la cara citoplasmática del anillo MS, funciona como conmutador flagelar (que regula la rotación del motor) y también ayuda en la secreción. FliG es ampliamente responsable del componente rotatorio del conmutador, haciendo girar el flagelo o bien en el sentido de las agujas del reloj o bien en el sentido contrario a las agujas del reloj dependiendo de la entrada a partir del sistema de quimiotaxis. Los componentes de motor incluyen MotA y MotB, que forman un canal de iones y el estator del complejo de motor flagelar, y actúan juntos para convertir el flujo de protones en una fuerza de giro (par) para la rotación flagelar. La mayoría de las proteínas flagelares ubicadas fuera de la membrana interna dependen del T3SS y el anillo MS y el complejo de conmutación para la exportación.

La biosíntesis del flagelo se produce desde el interior hacia el exterior, comenzando con el anillo MS y el complejo de conmutación, continuando con el complejo de HBB restante y terminando con el filamento extracelular. La secreción ordenada de proteínas para fomentar una biosíntesis flagelar apropiada es una propiedad inherente del T3SS flagelar. FliE, FlgB y FlgC son las primeras proteínas de vástago secretadas y se polimerizan en la superficie periplasmática del anillo MS para formar un tubo hueco. Proteínas flagelares secretadas de manera naciente adicionales (tales como las proteínas de vástago FlgF y FlgG) se polimerizan en la punta de la estructura flagelar que está brotando. Este patrón de secreción y polimerización en la punta se extiende a lo largo de toda la biosíntesis del gancho y filamento. Flgl y FlgH forman el anillo P en la capa de peptidoglicano y el anillo L en la membrana externa, respectivamente. Estos anillos se forman alrededor del vástago, proporcionando probablemente soporte y paso a través de estos componentes de envuelta celular. Después de completarse el vástago, se secretan FlgE y proteínas de gancho secundarias. FliK determina el número correcto de proteínas de FlgE necesarias para formar una longitud de gancho apropiada en especies deCampylobacteryHelicobacter.Tal como se muestra en especies deSalmonella,FliK funciona probablemente como regla molecular para medir la longitud de gancho a medida que se sintetiza. El contacto simultáneo de los extremos N y C-terminales de FliK con FlgD, que está presente en la punta del gancho en crecimiento, y con FlhB del T3SS en la base flagelar, significa que se ha formado un gancho con una longitud ideal. Entonces se produce un acontecimiento de escisión autoproteolítica en FlhB que altera la especificidad de sustrato de secreción mediante el T3SS de modo que entonces se exportan proteínas para la biosíntesis de filamento, tales como las flagelinas. La biosíntesis flagelar termina con la biosíntesis del filamento. EnH. pyloriy C.jejuni,el filamento está compuesto principalmente por la flagelina principal (flagelina A, FlaA) y la flagelina secundaria presente de manera menos abundante (flagelina B, FlaB). Mientras que se ha mostrado que FlaA es esencial para la flagelación y motilidad, el requisito de FlaB varía entre especies. En algunas bacterias (por ejemplo,H. pylori),el filamento está adicionalmente cubierto por una funda de tipo membrana.

La expresión de los genes flagelares se controla mediante una compleja cascada reguladora de la transcripción de una manera jerárquica que permite producir proteínas flagelares por etapas, facilitando su secreción ordenada e interacciones apropiadas para garantizar que la biosíntesis flagelar se produce correctamente. En bacterias móviles, los genes flagelares pueden organizarse en clases (clase 1, 2 y 3; o genes tempranos, medios y tardíos, respectivamente) basándose en su orden temporal de expresión (Lertsettakamet al.,2011; Chevance FF y Hughes KT, Methods Mol Biol. 2017; 1593: 47-71).

Los genes de clase 1 se transcriben en primer lugar y habitualmente codifican para reguladores maestros de la transcripción que controlan la expresión de los enes de clase 2, que incluyen los que codifican para las proteínas de HBB. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de las demás bacterias móviles, enH. pyloriy C.jejunilos reguladores maestros flagelares canónicos parecen estar ausentes. En vez de eso, los genes de clase 1 de estas bacterias incluyen los que codifican para el T3SS flagelar, el sistema de dos componentes (TCS) de FIgS (histidina cinasa) y FlgR (regulador de respuesta), FlhF, GTPasa, y factor sigma 54 (a54) (un regulador de la transcripción que media en la unión de ARN polimerasa a promotores génicos) que se expresan de manera constitutiva mediante un promotor de mantenimiento.

Los genes de clase 3 incluyen la flagelina principal,flaAy otros genes de filamentos. La expresión de estos genes flagelares tardíos se controla mediante un promotor dependiente de factor sigma 28 (a28) (enH. pyloriyC. jejuni,codificado porfliA)y se regula de manera negativa por la FlgM anti-factor sigma. Debe observarse que la flagelina secundaria,flaB(al igual que varios otros genes flagelares comentados anteriormente), a diferencia deflaA,corresponde a un gen de clase 2 que se regula mediante un promotor dependiente de a54 (Josenhanset al.,2002). Como en otros sistemas bacterianos (por ejemplo,Salmonella),la expresión de genes de clase 3 dependientes de a28 deH. pyloriy C.jejunise reprime mediante FlgM (mediante la unión de a28) hasta que se completa el HBB. Una vez completado el HBB, se secreta o se retira FlgM mediante el T3SS, lo cual libera a28 de la represión y permite que interaccione con ARN polimerasa para expresar genes de clase 3. Entonces se producen FlaA y otras proteínas de filamento y se secretan a través del complejo de HBB para la biosíntesis de filamento.

Además de la cascada reguladora de la transcripción anteriormente descrita, la biosíntesis flagelar también se controla mediante mecanismos reguladores postranscripcionales y postraduccionales. Los mecanismos reguladores postranscripcionales de la biosíntesis flagelar enH. pyloriincluyen la acción de la proteína citoplasmática HP0985 que se une tanto a ARNm como a sustratos de proteína para influir en la transcripción o traducción de diversos componentes flagelares (Lertsettakamet al.,2011). Por ejemplo, HP0985 interacciona con ARNm deflaA,fomentando de ese modo la traducción de la flagelina principal. Los mecanismos reguladores postraduccionales de la biosíntesis flagelar incluyen la glicosilación de las proteínas de flagelina. Por tanto, se necesita glicosilar las flagelinas deCampylobacteryHelicobacterpara la biosíntesis de filamento flagelar. FlaA de ambas de estas especies, y FlaB deH. pylori,se modifican mediante sistemas de glicosliación de proteínas unida a O que añaden un glicano a serinas o treoninas específicas de las flagelinas. Se piensa que esta modificación proporciona interacciones de subunidades adicionales para apilar las flagelinas durante la biosíntesis de filamento.

Las bacterias flageladas pueden diferenciarse basándose en el número y la disposición de sus uno o más flagelos: las bacterias flageladas “peritricas” tienen múltiples flagelos por todo el cuerpo celular que sobresalen en todas las direcciones (por ejemplo,Escherichia coli, Bacillus subtilisySalmonella enterica),mientras que en bacterias flageladas “polares”, la biosíntesis flagelar está espacial y numéricamente restringida, incluyendo bacterias flageladas “monotricas”, que tiene un único flagelo en un polo celular; bacterias flageladas “anfítricas”, que tienen un único flagelo en cada uno de los dos polos celulares (por ejemplo, espiroquetas oSpirillumsp.); y bacterias flageladas lofotricas tienen múltiples flagelos ubicados en un polo de la célula bacteriana que actúan de manera sincronizada para impulsar las bacterias en una única dirección (por ejemplo,Helicobacter pylori).

El término “gen flagelar bacteriano”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier gen cuya expresión está implicada en la biosíntesis y/o función del uno o más flagelos de las bacterias flageladas. Tales genes pueden codificar para una proteína que forma en sí misma un componente estructural de dichos flagelos (denominados a continuación en el presente documento “gen flagelar estructural” y “proteína flagelar estructural”, respectivamente), y/o que actúa como proteína auxiliar (por ejemplo, una chaperona) para una proteína flagelar estructural de este tipo durante la traducción, secreción y/o ensamblaje (denominados a continuación en el presente documento “gen flagelar no estructural” y “proteína flagelar no estructural”, respectivamente). Los “genes flagelares no estructurales” también incluyen genes que codifican para un regulador de la transcripción o de la traducción de una proteína flagelar estructural o no estructural, en los que dicho regulador de la transcripción o de la traducción también puede ser un ARN (por ejemplo, un ARN no codificante) o una proteína (por ejemplo, una factor de transcripción). Los “genes flagelares no estructurales” también se refieren a genes que codifican para enzimas implicadas en la modificación postraduccional de proteínas flagelares estructurales, por ejemplo, las enzimas de biosíntesis de ácido pseudamínico (Pse) cuyo azúcar se encuentra como glicosilación unida a O en proteínas flagelares deH. pyloriyCampylobacter jejuni(tal como se describió anteriormente).

El gen flagelar bacteriano puede ser un gen flagelar estructural.

El gen flagelar bacteriano puede ser un gen flagelar bacteriano medio (clase 2) o tardío (clase 3); y en el que dicho gen flagelar bacteriano puede ser una gen flagelar estructural. Anteriormente se describen diversos genes flagelares bacterianos de clase 2 y clase 3 a modo de ejemplo (o sus proteínas correspondientes), tal como se conocen en la técnica, y se conocen más en la técnica. Cualquiera de estos, incluyendo cualquier homólogo (es decir, ortólogo o parálogo) de los mismos (algunos de los cuales pueden conocerse mediante nombres diferentes dependiendo de la especie bacteriana), puede emplearse en el método descrito en el presente documento.

El gen flagelar bacteriano puede ser uno encontrado exclusivamente en las bacterias o grupo de bacterias seleccionadas como diana particulares (por ejemplo, determinadas bacterias patógenas) mientras que está ausente en bacterias no seleccionadas como diana (por ejemplo, determinadas bacterias (beneficiosas) de la microbiota residente). El término “ausente en bacterias no seleccionadas como diana”, tal como se usa en el presente documento, significa que el gen flagelar bacteriano cuyo nivel de expresión se evalúa en el método descrito difiere en cuanto a su secuencia de ARNm y/o secuencia de proteína codificada con respecto a cualquier secuencia de ARNm y/o secuencia de proteína codificada en las bacterias no seleccionadas como diana (por ejemplo, determinadas bacterias beneficiosas de la microbiota residente) en al menos el 20 %, el 30 %, el 40 % o el 50 %. En el caso en el que el nivel de expresión del gen flagelar bacteriano se evalúa indirectamente basándose en su actividad de promotor (según la etapa (b) (ii)), se prefiere que el promotor de dicho gen flagelar bacteriano difiera en cuanto a su secuencia de nucleótidos con respecto a cualquier secuencia de nucleótidos en las bacterias no seleccionadas como diana (por ejemplo, determinadas bacterias (beneficiosas) de la microbiota residente) en al menos el 20 %, el 30 %, el 40 % o el 50 %.

El gen flagelar bacteriano puede ser uno expresado de manera abundante en las bacterias flageladas. Tal como se usa en el presente documento, el término “expresado de manera abundante” se refiere a un ARNm y/o proteína que, en las bacterias respectivas, se expresa normalmente a varios miles de copias por célula.

El sistema de quimiotaxis bacteriano (Lertsettakamet al.,2011; Chevance FF y Hughes KT, Methods Mol Biol. 2017; 1593: 47-71) está menos conservado y puede implicar unas pocas docenas de quimiorreceptores y proteínas de señalización. Las moléculas de transducción de señales principales incluyen (i) quimiorreceptores, (ii) la cinasa CheA, (iii) el regulador de respuesta CheY, y (iv) la proteína de acoplamiento CheW, que acopla físicamente receptores a CheA.

El sentido de la rotación flagelar se controla mediante el estado de fosforilación de CheY La cantidad de CheY-P se regula, entre otras cosas, mediante unión de ligando a los quimiorreceptores, de tal manera que un ligando atrayente suprime la actividad de cinasa CheA y predomina CheY no fosforilado. En su forma no fosforilada, CheY no puede interaccionar con el conmutador flagelar, los flagelos rotan en el sentido contrario a las agujas del reloj, haciendo por tanto que las bacterias se muevan hacia delante. En ausencia de un ligando atrayente, CheA fosforila CheY CheY-P se une al conmutador flagelar para hacer girar el flagelo en el sentido de las agujas del reloj, lo cual fomenta el volteo bacteriano y cambia el sentido. Varias proteínas de quimiotaxis fuera del conjunto de quimiotaxis principal se encuentran habitualmente en muchas, pero no todas, de las bacterias móviles. El primer conjunto son fosfatasas, tales como CheZ y FliY, que aceleran la actividad de desfosforilación intrínseca de CheY El segundo conjunto son las enzimas CheR y CheB, que metilan y desmetilan, respectivamente, residuos glutamilo de quimiorreceptor para controlar las respuestas de adaptación a niveles de ligando sostenidos. El tercer conjunto son las proteínas de acoplamiento alternativo tales como CheV, que son homólogas a proteínas CheW con un dominio receptor adicional (REC). H.pyloriyC. jejunicontienen de manera colectiva todas las proteínas de quimiotaxis anteriores y responden de manera quimiotáctica a varios compuestos diferentes.

Las señales quimiotácticas se detectan mediante quimiorreceptores, que son proteínas multidominio solubles o unidas a membrana que portan un dominio sensor y un dominio de señalización.H. pyloritiene cuatro quimiorreceptores conocidos (también conocidos como “proteínas de tipo transductor” (TIp) o “proteínas de quimiotaxis aceptoras de metilo” (MCP)), TIpA, TIpB, TlpC y TlpD, que están implicadas en la detección y mediación de respuestas frente a diferentes señales del entorno (por ejemplo, arginina, niveles bajos de pH o energía).C. jejunitiene diez quimiorreceptores conocidos. Entre ellos se encuentran CetA y CetB, que funcionan juntos y detectan piruvato y fumarato, el quimiorreceptor Tlp7, que detecta formiato, y Tlp1, que detecta aspartato como quimioatrayente. Estudios de mutagénesis enH. pyloriy C.jejunihan mostrado o sugerido que la expresión funcional de estos quimiorreceptores tiene un impacto crítico sobre la colonización del huésped.

Los quimiorreceptores comunican su información de unión de ligando al motor flagelar mediante las proteínas de transducción de señales principales CheA, CheW y CheY (tal como se describió anteriormente). Se ha mostrado que CheA es altamente crítica para la quimiotaxis debido a su función en fomentar la fosforilación de CheY (que a su vez controla la rotación flagelar), y estudios con mutantes decheAhan mostrado que no son quimiotácticosin vitroy tienen defectos en la colonización de animales. CheW es una proteína de acoplamiento que une quimiorreceptores con CheA para modular la actividad cinasa de esta última, y estudios han mostrado que CheW es esencial para la quimiotaxis enH. pyloriy C.jejuni.Se sabe que CheY, que es altamente homólogo en H.pyloriy C.jejuni,interacciona con FliM (parte del anillo C flagelar o complejo de conmutación; descrito anteriormente) de una manera dependiente de la fosforilación.

La actividad de las proteínas de quimiotaxis principales anteriormente descritas se ve afectad por una multitud de proteínas de quimiotaxis auxiliares, no encontradas en todas las bacterias quimiotácticas, incluyendo CheY-P fosfatasas, CheR metiltransferasas relacionadas con la adaptación y CheB metilesterasas, y proteínas de acoplamiento híbrido de CheV y CheW-REC: las CheY-P fosfatasas, mediante regulación de la desfosforilación de CheY, desempeñan una función crítica en el control de la rotación flagelar. Estas enzimas incluyen CheZ (por ejemplo, enH. pylori, C. jejuniyE. coli)y FliY (parte del anillo C flagelar enH. pylori,y C.jejuni).EnH. pylori,se ha mostrado que mutantes defliYno son móviles. Las CheR metiltransferasas y CheB metilesterasas son funcionalmente antagonistas, actuando en la desmetilación y metilación de quimiorreceptores para adaptar su actividad. Aunque la mayoría de lasEpsilonproteobacteriacodifican para CheB, CheR, y CheV,H. pyloricarece de CheB y CheR y en su lugar tiene tres proteínas CheV (CheV1, CheV2 y CheV3).

La señal procedente del complejo de quimiorreceptor se retransmite al motor flagelar mediante el complejo de conmutación que consiste en FliG, FliM, y FliN (y adicionalmente FliY en todas lasEpsilonproteobacteria,incluyendoH. pyloriyC. jejuni).Se ha mostrado que la mutación de uno cualquiera de estos genes enH. pylorida como resultado fenotipos no móviles. Desde el punto de vista mecanístico (tal como se ha mostrado en E.coli),CheY-P se une a FliM y FliN para controlar el sentido de rotación del rotor flagelar FliG.

El término “gen de quimiotaxis bacteriano”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier gen cuya expresión está implicada en la biosíntesis y/o función del sistema de quimiotaxis en las bacterias flageladas. Tales genes pueden codificar para una proteína forma en sí misma un componente estructural de dicho sistema de quimiotaxis (denominados a continuación en el presente documento “gen de quimiotaxis estructural” y “proteína de quimiotaxis estructural”, respectivamente), y/o que actúa como proteína auxiliar (por ejemplo, una chaperona) para una proteína de quimiotaxis estructural de este tipo durante la traducción, secreción y/o ensamblaje (denominados a continuación en el presente documento “gen de quimiotaxis no estructural” y “proteína de quimiotaxis no estructural”, respectivamente). Los “genes de quimiotaxis no estructurales” también incluyen genes que codifican par un regulador de la transcripción o de la traducción de una proteína de quimiotaxis estructural o no estructural, en los que dicho regulador de la transcripción o de la traducción también puede ser un ARN (por ejemplo, un ARN no codificante) o una proteína (por ejemplo, un factor de transcripción). Los “genes de quimiotaxis no estructurales” también se refieren a genes que codifican para enzimas implicadas en la modificación postraduccional de proteínas de quimiotaxis estructurales, por ejemplo, enzimas implicadas en la fosforilación/desfosforilación, metilación/desmetilación o glicosilación.

El gen de quimiotaxis bacteriano puede ser un gen de quimiotaxis estructural. En la técnica se conocen diversos genes de quimiotaxis (estructurales) (o proteínas correspondientes) que pueden emplearse en el método descrito en el presente documento, pero no reivindicado, y anteriormente en el presente documento se describen representantes a modo de ejemplo.

El gen de quimiotaxis estructural puede codificar para un quimiorreceptor, preferiblemente seleccionado del grupo de Tlp/MCP (tal como se describió anteriormente); más preferiblemente, el quimiorreceptor se selecciona de TIpA, TIpB, TIpC y TIpD (por ejemplo, deH. pylori).

El gen de quimiotaxis estructural puede codificar para una proteína de transducción de señales principal, preferiblemente seleccionada de CheA, CheW y CheY

El término “cultivar”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a mantener una población de células bacterianas en condiciones adecuadas para el crecimiento (por ejemplo, en “condiciones de crecimiento”, definidas a continuación) usando un medio de cultivo adecuado (por ejemplo, medios líquidos, sólidos o semisólidos) que contiene todos los elementos requeridos por las bacterias para el crecimiento, tales como una fuente de carbono, agua, diversas sales y una fuente de aminoácidos y nitrógeno.

El término “condiciones de crecimiento”, o “condiciones sin estrés” tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a condiciones de cultivo tales que facilitan el crecimiento (proliferación celular o división celular) de las células bacterianas, y en las que se minimizan o eliminan completamente los factores del estrés del entorno (por ejemplo, temperatura o pH extremos, estrés osmótico, estrés físico/mecánico (por ejemplo, fuerzas de cizalladura), presión extrema, presencia de biocidas, estrés químico, limitación nutricional, etc.) que pueden provocar que una célula entre en un estado de reposo (parada celular) o incluso muerte celular. Las “condiciones de crecimiento” se definen generalmente por el medio de cultivo y el entorno (por ejemplo, material, forma y tamaño del recipiente de cultivo (por ejemplo, matraz o placa de micropocillos, etc.) y el dispositivo de cultivo (por ejemplo, agitador (velocidad/amplitud de agitación) o incubador estático), temperatura, composición de gas de la atmósfera (condiciones aerobias o anaerobias, dependiente de niveles de N<2>, CO<2>y/o O<2>), presión atmosférica, etc.) en los que se cultivan las bacterias. Sin embargo, se entiende que, cuando se seleccionan “condiciones de crecimiento” apropiadas, no debe tenerse en cuenta ningún efecto de uno o más de los compuestos de prueba (por ejemplo, efecto bacteriostático y/o bactericida) también presentes en el cultivo.

Para la mayoría de las bacterias, en la técnica se conocen condiciones de crecimiento adecuadas y, si se requiere, pueden optimizarse ajustando componentes y/o condiciones individuales mediante mediciones de rutina. El experto es consciente de que las “condiciones de crecimiento” particulares pueden diferir dependiendo de condiciones en el entorno natural de la clase particular de bacterias. En los ejemplos adjuntos se especifican condiciones de crecimiento a modo de ejemplo adecuadas paraH. pylori(véase el ejemplo 1).

El término “nivel de expresión”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de determinar el nivel de expresión de un gen flagelar bacteriano o de un gen de quimiotaxis bacteriano, se refiere al nivel (o cantidad) de expresión de dicho gen flagelar bacteriano o dicho gen de quimiotaxis bacteriano. La acción de determinar realmente (es decir, detectar y/o cuantificar) el nivel de expresión se refiere a la acción de determinar activamente si dicho gen se expresa en una muestra o no. Esta acción puede incluir determinar si la expresión del gen está regulada por incremento, regulada por disminución o sustancialmente no cambiada en comparación con un nivel de control expresado en una muestra.

El nivel de expresión de un gen flagelar bacteriano o gen de quimiotaxis bacteriano puede determinarse detectando el nivel de ARNm y/o proteína de dicho gen flagelar bacteriano o gen de quimiotaxis bacteriano.

El término “ácido nucleico”, tal como se usa en el presente documento de manera intercambiable con el término “secuencia de nucleótidos”, se refiere a polinucleótidos incluyendo ácido desoxirribonucleico (ADN), tal como ADNc o ADN genómico, y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). Se entiende que el término “ARN” tal como se usa en el presente documento comprende todas las formas de ARN incluyendo ARNm.

El término “proteína” describe un grupo de moléculas que comprende el grupo de péptidos, que consisten en hasta 30 aminoácidos, así como el grupo de polipéptidos, que consisten en más de 30 aminoácidos. Las proteínas pueden formar adicionalmente dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de proteína. Las moléculas de proteína que forman tales dímeros, trímeros, etc., pueden ser idénticas o no idénticas. Por consiguiente, las estructuras de orden superior correspondientes se denominan homo o heterodímeros, homo o heterotrímeros, etc. Los homo o heterodímeros, etc., también se encuentran dentro de la definición del término “proteína”. El término “proteína” también se refiere a péptidos y polipéptidos química o postraduccionalmente modificados.

Los métodos habitualmente usados conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen, sin limitación, secuenciación de ARN (RNA-seq) (por ejemplo, Stark, Grzelak y Hadfield, Nature Reviews Genetics (2019) 20:631-656), transferencia de tipo Northern e hibridaciónin situ(por ejemplo, Parker y Barnes, Met. Mol. Biol., 106:247-283, 1999); ensayos de protección de ARNasa (por ejemplo, Hod, Biotechniques, 13:852-854, 1992); y métodos basados en PCR, tales como reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (Weiset al.,Trends in Genetics, 8:263-264, 1992) y PCR cuantitativa en tiempo real, también denominada qRT-PCR. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer ARNm específico. Los métodos representativos para análisis de la expresión génica basado en secuenciación incluyen análisis en serie de la expresión génica (SAGE), y análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firmas en paralelo masiva (MPSS).

En la técnica se conocen bien métodos generales para el aislamiento de ARNm y/o ARN (por ejemplo, ARN total) y se dan a conocer en libros de texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubelet al.,Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). En ejemplos particulares, el aislamiento de ARN puede realizarse usando un kit de purificación, conjunto de tampón y proteasa obtenidos a partir de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Otros kits de aislamiento de ARN comercialmente disponibles incluyen el kit de purificación de ARN y ADN completo MASTERPURE™ (EPICENTRE™ Biotechnologies) y el kit de aislamiento de ARN en bloques de parafina (Ambion, Inc.). En el método de determinación del perfil de expresión génica MassARRAY™ (Sequenom, Inc.), a ADNc obtenido a partir de la transcripción inversa de ARN total se le añaden cantidades conocidas de una molécula de ADN sintética (competidor), que coincide con la región de ADNc seleccionada como diana en todas las posiciones, salvo por una única base, y sirve como patrón interno. Se amplifica la mezcla de ADNc/competidor mediante PCR convencional y se somete a un tratamiento con enzima fosfatasa alcalina de camarón (SAP) tras la PCR, lo cual da como resultado la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Tras la inactivación de la fosfatasa alcalina, se someten los productos de PCR a partir del competidor y ADNc a extensión de cebadores, lo cual genera señales de masa distintas para los productos de PCR derivados de competidor y de ADNc. Tras la purificación, se dispensan esos productos sobre una matriz de chip, que se carga previamente con componentes necesarios para el análisis con análisis por espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización por desorción de láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Después se cuantifica el ADNc presente en la reacción analizando las razones de las áreas de picos en el espectro de masas generado. Para más detalles véase, por ejemplo, Ding y Cantor, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 100:3059-3064, 2003. Otros métodos para determinar la expresión de ARNm que implican PCR incluyen, por ejemplo, presentación diferencial (Liang y Pardee, Science, 257:967-971, 1992); polimorfismo de longitud de fragmentos amplificado (Kawamotoet al.,Genome Res., 12:1305-1312, 1999);<tecnología BEAD ARRAY™ (Illumina, San Diego,>C<a>,<EE.>U<u>.;<Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease>(Supplement to Biotechniques), junio de 2002; Fergusonet al.,Anal. Chem., 72:5618, 2000; y ejemplos en el presente documento); tecnología XMAP™ (Luminex Corp., Austin, TX, EE. UU.); ensayo BADGE (Yanget al,Genome Res., 11:1888-1898, 2001); y análisis determinación del perfil de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumuraet al.,Nucl. Acids. Res., 31(16):e94, 2003).

También puede determinarse expresión génica diferencial usando técnicas de micromatrices. En estos métodos, se siembran en placa, o se disponen en matriz, sobre un sustrato de microchip parejas de unión específicas, tales como sondas (incluyendo ADNc u oligonucleótidos) específicas para ARN de interés o anticuerpos específicos para proteínas de interés. Se pone la micromatriz en contacto con una muestra que contiene una o más dianas (por ejemplo, ARNm o proteína) para una o más de las parejas de unión específicas en la micromatriz. Las parejas de unión específicas dispuestas en matriz forman interacciones detectables específicas (por ejemplo, se hibridan o se unen específicamente) con sus dianas relacionadas en la muestra de interés.

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcritos génicos, sin necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En el método de SAGE, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de manera única un transcrito, siempre que la etiqueta se obtenga a partir de una posición única dentro de cada transcrito. Entonces, muchos transcritos se unen entre sí para formar largas moléculas en serie, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de las múltiples etiquetas de manera simultánea. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede cuantificarse determinando la abundancia de etiquetas individuales, e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta (véase, por ejemplo, Velculescuet al.,Science, 270:484-487, 1995, y Velculescuet al.,Cell, 88:243-51, 1997).

El análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firmas en paralelo masiva (MPSS) se describió por primera vez por Brenneret al.(Nature Biotechnology, 18:630-634, 2000). Es un enfoque de secuenciación que combina la secuenciación de firmas no basada en gel con la clonaciónin vitrode millones de moldes en microperlas independientes de 5 |im de diámetro. Se construye una biblioteca de microperlas de moldes de ADN mediante clonaciónin vitro.Esto va seguido por el ensamblaje de una matriz plana de las microperlas que contienen molde en una célula de flujo a una alta densidad. Los extremos libres de los moldes clonados en cada microperla se analizan simultáneamente usando un método de secuenciación de firmas basado en fluorescencia que no requiere la separación de fragmentos de ADN.

También puede determinarse la expresión génica diferencial usando técnicas de hibridaciónin situ,tales como hibridaciónin situde fluorescencia (FISH) o hibridaciónin situde cromógeno (CISH). En estos métodos, se ponen en contacto parejas de unión específicas, tales como sondas marcadas con un fluoróforo o cromógeno específico para un ADNc o ARNm diana (por ejemplo, una molécula de ADNc o ARNm de GASI, TKI, o WNT5A) con una muestra, tal como una muestra de células bacterianas (o lisado de las mismas) montada en un sustrato (por ejemplo, portaobjetos de vidrio). Las parejas de unión específicas forman interacciones detectables específicas (por ejemplo, se hibridan) con sus dianas relacionadas en la muestra. Por ejemplo, hibridación entre las sondas y el ácido nucleico diana puede detectarse, por ejemplo, detectando una etiqueta asociada con la sonda. En algunos ejemplos, se usa microscopía, tal como microscopía de fluorescencia.

Los métodos para medir los niveles de expresión de proteínas (es decir, péptido/polipéptido) incluyen, pero no se limitan a: inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia de plasmón superficial, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímico, cromatografía de líquidos con espectrometría de masas (CL-EM), tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF), espectrometría de masas, microcitometría, micromatriz, microscopía, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), citometría de flujo y ensayos basados en una propiedad de la proteína incluyendo, pero sin limitarse a, unión a ADN, unión a ligando o interacción con otras parejas de proteína.

El nivel de expresión de un gen flagelar bacteriano o gen de quimiotaxis bacteriano también puede determinarse detectando una señal proporcionada por un constructo de gen indicador, en el que el constructo de gen indicador comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de gen indicador operativamente unido a un promotor de un gen flagelar bacteriano o de un gen de quimiotaxis bacteriano.

El término “producto de gen indicador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier producto transcripcional o traduccional (incluyendo ARNm y proteínas/polipéptidos) que (i) no está presente de manera endógena en las células huésped sometidas a prueba y (ii) proporciona una señal detectable y/o cuantificable. La señal puede detectarse/cuantificarse directamente, mediante la presencia o ausencia del producto de gen indicador, y/o indirectamente, mediante la actividad (por ejemplo, actividad enzimática) del producto de gen indicador.

El término “operativamente unido” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico sobre un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una se ve afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido con una secuencia codificante (por ejemplo, un gen indicador) cuando puede afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor).

En la técnica se conocen genes indicadores adecuados y productos de los mismos (también denominados habitualmente en el presente documento “indicadores”) que pueden usarse en el método descrito. Por ejemplo, puede usarse una variedad de enzimas como indicadores incluyendo, pero sin limitarse a, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (Gorman,et al.(1982) Molecular Cell Biology 2:1044; Prost,et al.(1986) Gen 45:107-111), p-galactosidasa (Nolan,et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2603-2607), p-lactamasa, p-glucuronidasa y fosfatasa alcalina (Berger,et al.(1988) Gen 66:1-10; Cullen,et al.(1992) Methods Enzymol. 216:362-368). La transcripción del gen indicador conduce a la producción de la enzima en células de prueba. Entonces puede medirse la cantidad de enzima presente mediante su acción enzimática sobre un sustrato que da como resultado la formación de un producto de reacción detectable. En la técnica se conocen métodos para determinar la cantidad de producto de reacción. Tales métodos o bien detectan la cantidad de producto de reacción generado o bien la cantidad restante de sustrato que está relacionada con la cantidad de actividad enzimática. Para algunas enzimas, tales como p-galactosidasa, pglucuronidasa y p-lactamasa, están disponibles sustratos fluorogénicos bien conocidos que permiten que la enzima convierta tales sustratos en productos fluorescentes detectables.

Puede usarse una variedad de proteínas bioluminiscentes, quimioluminiscentes y fluorescentes como indicadores emisores de luz.

Los indicadores emisores de luz a modo de ejemplo, que son enzimas y requieren cofactor(es)/sustrato(s) para emitir luz, incluyen, sin limitación, la luciferasa bacteriana (producto del gen luxAB) deVibrio harveyi(Karp (1989) Biochim. Biophys. Acta 1007:84-90; Stewart,et al.(1992) J. Gen. Microbiol. 138:1289-1300), la luciferasa de luciernaga,Photinus pyralis(De Wet,et al.(1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737), luciferasa deGaussia(GLuc), luciferasa deRenilla(RLuc), luciferasa deOplophorus(OLuc) y luciferasas modificadas por ingeniería, tales como luciferasa NanoLuc® (Nluc) (Promega). Otros tipos de indicadores emisores de luz, que no requieren sustratos o cofactores, incluyen, sin limitación, la proteína verde fluorescente de tipo natural (GFP) deAequorea victoria(Chalfie,et al.(1994) Science 263:802-805), GFP modificadas (Heim,et al.(1995) Nature 373:663-4; Dammeyer Tet al.,Comput Struct Biotechnol J. 2012 22; 3), y los productos génicos codificados por el operón lux dePhotorhabdus luminescens(luxABCDE) (Francis,et al.(2000) Infect. Immun. 68(6):3594-600). La transcripción y traducción de estos tipos de genes indicadores conduce a la acumulación de las proteínas fluorescentes o bioluminiscentes en células de prueba, lo cual puede medirse mediante un dispositivo, tal como un fluorímetro, citómetro de flujo o luminómetro. En la técnica se conocen bien métodos para realizar ensayos en materiales fluorescentes (por ejemplo, Lackowicz, 1983, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Nueva York, Plenum Press).

En los ejemplos dados a conocer en el presente documento, se empleó una cepa indicadora bacteriana que tenía un gen de luciferasa integrado de manera cromosómica (que codifica para luciferasa LuxAB deV. harveyi)operativamente unido a la región de promotor de la flagelina A principal. Por consiguiente, basándose en esta configuración particular, tras la transcripción, la luciferasa se expresa de manera intracelular. Dado que esta enzima, para producir una señal de luminiscencia, requiere conversión de sustrato, se sometieron las células bacterianas a lisis en presencia del sustrato añadido decanal (Sigma) antes de la medición de la luminiscencia (véase el ejemplo 1). Por consiguiente, se entiende que, en determinados casos, por ejemplo cuando un producto de gen indicador se expresa de manera intracelular en las células de prueba y/o cuando el producto de gen indicador requiere un cofactor/sustrato para producir una señal mediante conversión enzimática de (o interacción con) ese cofactor/sustrato, las células bacterianas pueden someterse a lisis/perturbarse antes de la detección de la señal proporcionada por el producto de gen indicador. El experto conoce métodos adecuados para la perturbación de células bacterianas, incluyendo, sin limitación, técnicas mecánicas/físicas, químicas y enzimáticas, incluyendo, sin limitación, homogeneizador de alta presión (por ejemplo, prensa francesa), molino de bolas, homogenización líquida, ondas sonoras de alta frecuencia (sonicación), choque osmótico, ciclos de congelación/descongelación y trituración manual (Islam, MS,et al.Micromachines (2017); 8(3): 83. A Review on Macroscale and Microscale Cell Lysis Methods).

Sin embargo, en casos en los que el producto de gen indicador se expresa de manera extracelular, es decir, se expresa de manera soluble y se secreta en el medio de cultivo circundante (por ejemplo, debido a la presencia de secuencia de señal) y/o se expresa y se secreta como parte de una proteína de fusión soluble o unida a membrana (por ejemplo, una proteína de luminiscencia fusionada a una proteína flagelar estructural extracelular) y/o no requiere un sustrato/cofactor para producir una señal detectable (por ejemplo, GFP), puede no requerirse ninguna etapa de lisis para la detección de la señal indicadora.

Los compuestos, o denominados de manera intercambiable en el presente documento “compuestos de prueba”, pueden incluir proteínas (incluyendo proteínas modificadas de manera postraduccional), péptidos (incluyendo métodos química o enzimáticamente modificados), lípidos, hidratos de carbono, ADN, ARN, aptámeros o moléculas pequeñas (incluyendo anticuerpos, hormonas, monosacáridos, oligosacáridos, glicanos, lípidos, glicolípidos, esteroides, aniones o cationes, fármacos, moléculas orgánicas pequeñas, oligonucleótidos y genes que codifican para proteínas de los agentes o moléculas antisentido), incluyendo bibliotecas de compuestos. Los compuestos de prueba pueden producirse de manera natural (por ejemplo, encontrarse en la naturaleza o aislarse de la naturaleza) o pueden producirse de manera no natural (por ejemplo, sintéticos, sintetizados químicamente o artificiales). Si se desea, los compuestos de prueba pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, bibliotecas biológicas, bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralelas direccionables de manera espacial, métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución, el método de bibliotecas de “una perla, un compuesto”, y métodos de bibliotecas sintéticas usando selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica está limitado a bibliotecas de polipéptidos, mientras que los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a bibliotecas de polipéptidos, oligómeros no peptídicos o compuestos de molécula pequeña. Véase Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997. En la técnica se conocen bien métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares (véase, por ejemplo, DeWittet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erbet al.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermannet al.,J Med Chem.

37,2678, 1994; Choet al.,Science 261, 1303, 1993; Carellet al.,Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33, 2059, 1994; Carell et Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et J. Med Chem. 37, 1233, 1994). Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (véase, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992), o en perlas (Lam KS, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas, plásmidos (Cull et Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992), o fagos (Scott y Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirlaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991).

El término “bacteriostático”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de inhibir el crecimiento (división celular) de las bacterias, mientras que el término “bactericida” se refiere a la capacidad de destruir (o destruir esencialmente) las bacterias.

La presencia o ausencia de “crecimiento” bacteriano (también denominado de manera intercambiable en el presente documento “actividad de crecimiento”) puede determinarse y monitorizarse mediante diversos métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el crecimiento bacteriano puede determinarse evaluando la cantidad de células bacterianas después de diferentes intervalos de tiempo de cultivo. La cantidad de células bacterianas puede evaluarse, por ejemplo, mediante mediciones de turbidez o densidad óptica (DO) de bacterias en suspensión y usa un fotómetro (también denominado espectrofotómetro). La DO puede medirse a 600 nm (también denominado en el presente documento as “D.O. 600,” “d. o. 600,” “DO600” etc.). Además, pueden usarse mediciones físicas (por ejemplo, peso seco de células tras la centrifugación) o mediciones químicas (por ejemplo, tasa de consumo de oxígeno, contenido de nitrógeno, proteína o ADN) para determinar y/o monitorizar el crecimiento bacteriano en un cultivo. Además, sembrar en placas para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) o para observar un aumento en el diámetro de colonias a lo largo del tiempo es otro método convencional para determinar y/o monitorizar el crecimiento bacteriano en un cultivo.

Según el método descrito en el presente documento, pero no reivindicado, puede determinarse una ausencia de inhibición del crecimiento en la etapa (d), si las bacterias cultivadas en presencia del compuesto de prueba presentan, con preferencia creciente, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, y lo más preferiblemente al menos el 100 % de actividad de crecimiento en comparación con un control, en el que dicho control comprende bacterias de la misma especie cultivadas en ausencia del compuesto de prueba. Anteriormente se describieron métodos para evaluar la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano.

Según la etapa (d), los compuestos de prueba que no tienen “sustancialmente ninguna actividad bacteriostática”, pueden referirse preferiblemente a tales compuestos que no tienen ningún efecto de inhibición del crecimiento detectable sobre las bacterias, pero también pueden referirse a tales compuestos que sólo tienen un efecto de inhibición del crecimiento minoritario sobre dichas bacterias, lo que significa que las bacterias, en presencia del compuesto de prueba, presentan, con preferencia creciente, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, y lo más preferiblemente al menos el<10 0>% de actividad de crecimiento en comparación con ausencia del compuesto de prueba.

Con el fin de identificar los compuestos de prueba que tienen (exclusivamente) actividad antimotilidad bacteriana y clasificar aquellos compuestos de prueba que tienen efectos anti-viabilidad (por ejemplo, actividad de inhibición del crecimiento (actividad bactericida y/o bacteriostática)), en lugar de evaluar la presencia o ausencia de inhibición del crecimiento (en las etapas (d) y (e)), pueden emplearse ensayos secundarios alternativos (o cribados inversos), incluyendo, sin limitación, pruebas metabólicas (ensayos de inhibición respiratoria), ensayo de contenido de ATP (BacTiter Glo) (por ejemplo, ensayo de viabilidad de células microbianas BacTiter-Glo™ (Promega; Madison WI, EE. UU.)), o ensayo de CIM, tal como también se hace referencia en el presente documento (por ejemplo, ejemplo 2).

El método puede comprender la etapa (e) adicional de determinar la identidad y/o estructura de (i) el compuesto de prueba que tiene una actividad antimotilidad bacteriana; y/o (ii) una molécula diana de dicho compuesto de prueba, preferiblemente el epítopo de unión de dicho compuesto de prueba en dicha molécula diana. En la técnica se conocen métodos para determinar la identidad y/o estructura de un compuesto de prueba, incluyendo, sin limitación, espectrometría de masas, espectroscopía de RMN, espectroscopía vibracional o cristalografía de rayos X.

El término “molécula diana”, tal como se denomina en el presente documento, se refiere a una molécula endógena de las bacterias con la que interacciona un compuesto de prueba que tiene una actividad antimotilidad bacteriana, interacción que provoca el, o al menos contribuye al, efecto antimotilidad del compuesto de prueba.

El término “epítopo de unión”, tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento con los términos “sitio de unión” o “sitio de interacción”, se refiere a una región en la molécula diana (una región de este tipo puede estar constituida, por ejemplo, por determinados residuos de aminoácido y/o modificaciones postraduccional o porciones de los mismos en una proteína, o determinados nucleótidos o porciones de los mismos en un ácido nucleico) que se une a, o interacciona con, el compuesto de prueba.

En la técnica también se conocen bien métodos para determinar la identidad de una molécula diana de un compuesto de prueba. Por ejemplo, bacterias que se han cultivado en presencia de un compuesto de prueba que tiene una actividad antimotilidad bacteriana pueden someterse a análisis de expresión transcripcional y/otraduccional, en el que se determina el/los nivel(es) de expresión de ARNm o proteína, respectivamente, de uno o más genes seleccionados (por ejemplo, determinados genes flagelares o de quimiotaxis), que se sospecha que son posibles moléculas diana. Alternativamente, pueden someterse las bacterias a determinación de perfil transcriptómico y/o proteómico. Entonces, un nivel de ARNm y/o proteína detectado que puede estar regulado por incremento o por disminución en comparación con bacterias cultivadas en ausencia del compuesto de prueba puede ser indicativo de una posible molécula diana. Una vez que se ha identificado una posible molécula diana, pueden usarse métodos conocidos adicionales (por ejemplo, técnicas bioquímicas, biofísicas y/o estructurales) para verificar/confirmar una interacción entre el compuesto de prueba y dicha molécula diana. Estos últimos métodos también pueden usarse para identificar un epítopo de unión del compuesto de prueba en dicha molécula diana.

Otros apoyado recientemente, en paralelo con los presentes inventores, el concepto de terapias antimotilidad frente a diversos patógenos humanos (revisado, por ejemplo, en Erhardt 2016). Por ejemplo,Menardy colaboradores usaron un enfoquein vitropara el cribado y la identificación de compuestos que seleccionan como diana la ruta de biosíntesis de ácido pseudamínico (Pse), un azúcar, que enH. pyloriy C.jejuniestá unido de manera O-glicosídica a las proteínas de flagelina principales y se piensa que se requiere para el ensamblaje de flagelina y la consiguiente motilidad. En este ensayo, se combinaron cinco enzimas de biosíntesis de Pse aisladas en una única reacciónin vitrolibre de células y se evaluó su actividad o inhibición en presencia de compuestos de prueba mediante detección de fosfato que se libera habitualmente en la etapa enzimática final tras la conversión de sustrato (Menardet al.,2014). Los autores notificaron su hallazgo de algunos compuestos que inhibían la producción de flagelina en ensayos celulares posteriores, y sin inhibir el crecimiento bacteriano (sin embargo, no se han mostrado datos de crecimiento correspondientes). Sin embargo, este diseño de ensayo presenta varias limitaciones y desventajas. Por ejemplo, su sensibilidad para identificar agentes que tienen actividad antiflagelar/antimotilidad está restringida a compuestos que interfieren con estas cinco enzimas particulares (a nivel de proteína), excluyendo de ese modo cualquier posible efecto directo o indirecto que, en el contexto celular más complejo, pueda surgir a partir de una inhibición de otras moléculas diana más aguas arriba en la cascada de expresión flagelar (incluyendo también reguladores), poniendo también en cuestión general si someter a ensayo estas enzimas de manera libre de células puede reflejar su actividad celular. Además, tiene que llevarse a cabo una compleja expresión recombinante y purificación de estas enzimas, lo cual puede no ser adaptable a otros sistemas bacterianos y hace que este ensayo sea costoso e inadecuado, particularmente para aplicaciones en las que deben analizarse varias especies bacterianas diferentes.

En un estudio diferente deJohnsony colaboradores, se notificó un ensayo de cribado de alto rendimiento (HTS) basado en una cepa de C.jejunimodificada por ingeniería que tenía un gen indicador (que codifica para cloranfenicol acetiltransferasa (CAT)) bajo el control del promotor deflgDE2(el operón deflgDE2en C.jejunicomprende los genes que codifican para las supuestas proteínas de gancho FlgD y FlgE2). Mediante esta configuración, se hizo que el crecimiento/supervivencia bacteriano en medio de selección que comprende cloranfenicol fuera dependiente de la actividad del promotor de flgDE2, cuya actividad se evaluó en presencia de un compuesto de prueba (Johnson, Yuhas, McQuade, Larsen y DiRita, 2015). Sin embargo, a pesar del cribado de un gran número de compuestos de prueba, sólo se identificaron compuestos de este tipo que tienen principalmente actividad antibacteriana clásica (inhibidora del crecimiento).

En este caso, los presentes inventores se proponen desarrollar un método de cribado para identificar compuestos novedosos que inhiben exclusivamente funciones asociadas con la motilidad en bacterias flageladas sin ejercer efectos anti-viabilidad para usarse como nuevo enfoque terapéutico para tratar y/o prevenir infecciones bacterianas correspondientes y estados asociados, en particular para los que implicanH. pylori.Se desarrolló un potente sistema de cribado basado en indicador para detectar diversos efectos antiflagelares/antimotilidad, adecuado para aplicaciones de cribado de alto rendimiento (HTS).

Usando el método descrito en el presente documento para cribar aproximadamente 4.000 compuestos pequeños de diversas bibliotecas de compuestos, pudieron identificarse diversos compuestos que tenían fuertes efectos antibacterianos y/o antiflagelares sobreH. pylori.Varios compuestos activos primarios tenían valores de “concentración inhibitoria mínima” (CIM) antibacteriana bajos (muy eficaces) y actuaban sobreH. pyloria diferentes niveles, probablemente mediante inhibición metabólica. Sin embargo, de la manera más sorprendente, se identificaron varios compuestos que inhibían exclusivamente la motilidad deH. pylorisin inhibir la viabilidad (es decir, crecimiento y/o supervivencia bacteriano). Un estudio de tratamiento de prueba de principio posterior en un modelo animal de infección crónica porH. pyloriconfirmó que los compuestos identificados muestran una actividadin vivosignificativa y pueden reducir los recuentos bacterianos en una infección porH. pyloripersistente sin dañar la riqueza o diversidad de microbiotain vivo,demostrando de ese modo que este enfoque de cribado puede identificar agentes antimotilidad potentes y selectivos para tratar la infección porH. pylori.

Para ser indicativa de que un compuesto de prueba tiene actividad antimotilidad bacteriana y/o actividad bacteriostática y/o actividad bactericida, la reducción en el nivel de expresión determinada en la etapa (b) en presencia de un compuesto de prueba puede ser, con preferencia creciente, de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 % y lo más preferiblemente al menos el 90 % en comparación con el nivel de expresión determinado en bacterias de la misma especie no cultivadas en presencia de dicho compuesto de prueba. Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos, un punto de corte de una reducción de al menos el 30 % de la señal indicadora de fluorescencia detectada (inhibición >30 %) fue eficaz para seleccionar compuestos que tenían una actividad antiflagelar.

El periodo de tiempo del cultivo de las bacterias flageladas en la etapa (a) antes de determinar el nivel de expresión del gen flagelar bacteriano en la etapa (b) puede elegirse para que sea significativamente más corto que el periodo de tiempo requerido por bacterias de la misma especie cultivadas en condiciones de cultivo idénticas en ausencia del compuesto de prueba, para experimentar un crecimiento detectable (por ejemplo, aumento del número/densidad celular) en más de, con preferencia creciente, el 50 %, el 40 %, el 30 %, el 20 %, el 10 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 %, el 1 % (con respecto al punto inicial del cultivo). Tal como se muestra en los ejemplos 1 y 2 adjuntos, el tiempo de cultivo de la cepa indicadora deH. pyloriantes de la cuantificación de la señal indicadora era de 4 h a 37°C, lo cual es significativamente más corto que el tiempo de duplicación previsto deH. pylorien las condiciones de cultivo aplicadas. Esta configuración se eligió por los presentes inventores con el fin de limitar la contribución que surge de los efectos de crecimiento (un aumento del número de células) con respecto a la señal indicadora detectada, lo cual hizo que este ensayo primario fuera más sensible frente a la detección de efectos flagelares.

La actividad antimotilidad bacteriana puede ser una inhibición de (a) motilidad; (b) quimiotaxis; (c) biosíntesis, secreción y/o ensamblaje flagelar; y/o (d) regulación de genes flagelares; en al menos el 30 % en comparación con ausencia del compuesto de prueba.

El gen flagelar bacteriano puede ser un gen flagelar bacteriano de estadio tardío; y preferiblemente el gen flagelar bacteriano de estadio tardío es un gen flagelar estructural.

El término gen flagelar bacteriano “tardío” o “de estadio tardío” tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a tales genes flagelares bacterianos que se expresan de manera tardía en la cascada reguladora de biosíntesis flagelar (tal como se describió anteriormente). En general, los genes tardíos están regulados por disminución en bacterias defectuosas con respecto a genes tempranos o medios, y ni los genes medios ni los tardíos se expresan en bacterias defectuosas con respecto a genes de clase temprana. Por consiguiente, debido a la posición del gen flagelar bacteriano como gen “de estadio tardío” en la cascada jerárquica de regulación de genes flagelares, evaluar la expresión de un gen flagelar bacteriano de estadio tardío de este tipo puede detectar posibles efectos de un compuesto de prueba sobre múltiples rutas diferentes que afectan a la regulación de genes flagelares, ensamblaje y secreción de sustrato que convergen en la inhibición de la motilidad flagelar.

El “gen flagelar bacteriano de estadio tardío” puede ser un gen cuya expresión se controla mediante un promotor dependiente de factor sigma 28 (a28) y/o es un “gen de clase 3” (tal como se describió anteriormente).

El “gen flagelar bacteriano de estadio tardío” puede ser un gen que codifica para una proteína de filamento.

El “gen flagelar bacteriano de estadio tardío” puede ser un gen que codifica para una flagelina, preferiblemente una flagelina estructural principal, e incluso más preferiblemente una flagelina A (FlaA), flagelina B (FlaB) o cualquier otro gen de subunidad de flagelina ortólogo.

La flagelina es el elemento estructural del filamento flagelar. En algunas bacterias, los filamentos consisten en una única clase de flagelina; en otras consisten en varias clases de flagelina que son isómeros estrechamente relacionados. El gen que codifica para flagelina (inicialmente denominadohag(de antígeno H)) tiene diferentes nombres en diversas especies bacterianas, por ejemplo, sin limitación,flaA, flaB(por ejemplo, enHelicobacter spp., Camilobacter spp., Vibrio cholerae), fliC(por ejemplo, enPseudomonas aeruginosa, Salmonella spp.,yEschericha spp.).Dependiendo de la especie de bacterias flageladas seleccionada como diana, puede emplearse cualquiera de estos genes de flagelina y ortólogos de los mismos en el método descrito en el presente documento, y el experto podrá seleccionar los genes respectivos basándose en la bibliografía disponible.

El gen flagelar bacteriano o gen de quimiotaxis bacteriano puede ser de (a)Helicobacter spp.,preferiblemente deHelicobacter pylori;o (b)Campylobacter spp.,preferiblementeCampylobacter jejuni.Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos, el método identificó satisfactoriamente compuestos antimotilidad en el contexto deHelicobacter pylori.Por tanto, se espera que el enfoque sea eficaz paraEpsilonproteobacteriaen general, en particular paraHelicobacter spp.yCampylobacter spp.

Las bacterias flageladas pueden serHelicobacter spp.,preferiblementeH. pylori,y el “gen flagelar bacteriano” puede ser uno que codifica para la flagelina principal FlaA.

El producto de gen indicador puede seleccionarse del grupo que consiste enVibrioluciferasa, luciferasa de luciérnaga, luciferasa deGaussia(GLuc), luciferasa deRenilla(RLuc), luciferasa deOplophorus(OLuc), luciferasa NanoLuc (NLuc), aequorina de medusa, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína cian fluorescente (CFP), proteína roja fluorescente (RFP), mCherry, mOrange, mRaspberry, mKO, TagRFP, mKate, mRuby, FusionRed, mScariet, DsRED, DsRed-Express, cloranfenicol acetiltransferasa (<c>A<t>), p-galactosidasa y fosfatasa alcalina.

El producto de gen indicador puede ser una luciferasa. Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos, la luciferasa luxAB bacteriana deVibrio harveyicodificada por el operón luxAB demostró ser particularmente eficaz como producto de gen indicador en el método descrito en el presente documento. Por tanto, se espera que otras enzimas luciferasa (por ejemplo, tal como se describió anteriormente) también sean adecuadas.

El producto de gen indicador puede ser luciferasa LuxAB deVibrio harveyi.

El constructo de gen indicador puede estar (a) integrado en el genoma bacteriano; o (b) en un vector de plásmido transformado en las bacterias.

Tal como se muestra en los ejemplos, un constructo de gen indicador que se integró en el genoma bacteriano (el cromosoma bacteriano) fue particularmente eficaz para detectar el nivel de expresión de gen flagelar. Puede concebirse que un sistema en el que el constructo de gen indicador está, en vez de eso, presente en un vector de plásmido transformado en las bacterias flageladas también será funcional, aunque puede esperarse que un sistema basado en plásmido de este tipo sea menos estable. Por tanto, lo más preferido es que el constructo de gen indicador esté integrado en el genoma bacteriano. En la técnica se conocen bien métodos para integrar de manera estable un gen en un cromosoma bacteriano, por ejemplo mediante recombinación homóloga.

Se entiende que el promotor del gen flagelar bacteriano o del gen de quimiotaxis bacteriano comprendido en el constructo de gen indicador corresponde a una secuencia de promotor que o bien se encuentra de manera endógena en las bacterias flageladas respectivas sometidas al método descrito en el presente documento, o bien al menos está tan estrechamente relacionado con un promotor encontrado de manera endógena de este tipo que puede regularse mediante los mismos mecanismos/factores que regulan la actividad de dicho promotor endógeno.

Pueden emplearse dos o más especies bacterianas diferentes en (i) las etapas (a) a (d); o en (ii) las etapas (c) a (d) del método.

Llevar a cabo el método en presencia de dos o más especies bacterianas diferentes en las etapas (a) y (d) puede permitir evaluar un posible efecto de un compuesto de prueba sobre varias especies bacterianas diana diferentes en paralelo (por ejemplo, en un único recipiente de reacción, o en un único pocillo de una placa de micropocillos). Una configuración de este tipo puede ser particularmente útil en enfoques de alto rendimiento para evaluar si un compuesto de prueba es activo frente a varias cepas bacterianas diferentes (por ejemplo, diferentes cepas bacterianas patógenas; o una o más cepas patógenas y una o más cepas no patógenas (por ejemplo, cualquier bacteria beneficiosa de la microbiota residente)). En tales casos en los que se emplean juntas varias cepas bacterianas diferentes, pueden usarse diferentes genes indicadores en estas cepas bacterianas diferentes con el fin de permitir resolver/asignar los efectos observados de un compuesto de prueba a las cepas bacterianas individuales (por ejemplo, usando genes indicadores que proporcionan productos distinguibles de gen indicador (por ejemplo, señales de fluorescencia de color diferente)).

Las etapas (a) y (b) y/o las etapas (c) y (d) se llevan a cabo en presencia de más de un compuesto de prueba (por ejemplo, un grupo de compuestos estructuralmente relacionados). Una configuración de este tipo puede usarse, por ejemplo, como cribado preliminar de un gran número de compuestos de prueba con alto rendimiento; una vez que se ha determinado una actividad para un grupo de compuestos, puede repetirse el método para verificar posibles actividades de compuestos individuales.

El cultivo en las etapas (a) y (c) puede llevarse a cabo en placas de múltiples pocillos; y/o en presencia de más de un compuesto de prueba.

El término “placa de múltiples pocillos”, “placa de micropocillos” o “placa de microtitulación” tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a una matriz bidimensional de pocillos direccionables ubicados sobre una superficie sustancialmente plana. Más específicamente, múltiples pocillos puede referirse a una placa de un material adecuado, tal como poliestireno, que comprende un número diferenciado de “pocillos” (cavidades) para captar muestras, por ejemplo, las células bacterianas en medio de cultivo. Los ejemplos comunes son placas de múltiples pocillos que tienen 6, 12, 24, 48, 96, 384 o 1536 de tales pocillos.

El método descrito en el presente documento, pero no reivindicado, puede comprender además importar la información sobre si el compuesto de prueba tiene una actividad antimotilidad bacteriana y/o información sobre la estructura de dicho compuesto de prueba y/o su molécula diana a un estado contratante del CPE en el que se ha validado la patente, una vez concedida.

El término “infección”, “ infección bacteriana” o “infección microbiana” tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a la presencia de bacterias en o sobre el cuerpo de un sujeto, presencia que tiene un impacto negativo sobre la salud del sujeto o supone un riesgo de afectar de manera negativa a la salud del sujeto.

Se apreciará que los usos médicos y las aplicaciones terapéuticas de la invención son útiles en los campos de la medicina humana y medicina veterinaria. Por tanto, el “sujeto” o “ individuo” según los usos médicos de la invención es un mamífero, preferiblemente ser humano, u otros animales. Con fines veterinarios, los sujetos incluyen, por ejemplo, animales de granja tales como vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, y aves de corral tales como pollos, pavos, patos y gansos; animales de compañía tales como perros y gatos; animales exóticos y/o zoológico; animales de laboratorio incluyendo ratones, ratas, conejos, cobayas y hámsteres.

En general, se sabe que la infección bacteriana con bacterias flageladas está asociada con una multitud de estados patológicos agudos y crónicos que implican casi cualquier tejido o sistema de órganos, y, para muchos patógenos bacterianos, se ha mostrado que la motilidad flagelar es un determinante crítico para la colonización del huésped y la patogenia.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, “cantidad farmacéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a una cantidad, que tiene un efecto terapéutico o es la cantidad requerida para producir un efecto terapéutico en un sujeto. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición farmacéutica del mismo es la cantidad del compuesto o la composición farmacéutica requerida para producir un efecto terapéutico deseado tal como puede evaluarse mediante resultados de ensayos clínicos, estudios de infección en animales de modelo y/o estudiosin vitro(por ejemplo, en medios de agar o caldo). La cantidad farmacéuticamente eficaz depende de varios factores, incluyendo el, pero sin limitarse al, microorganismo particular (por ejemplo, bacterias) implicado, características del sujeto (por ejemplo, peso, sexo, edad e historia clínica), gravedad de la infección y el tipo particular del agente usado. Para una aplicación (o tratamiento) profiláctica (es decir, preventiva), una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es la cantidad que será eficaz para prevenir una infección bacteriana o para prevenir síntomas de enfermedad que aún no se han producido de una infección ya prevalente.

El compuesto puede formularse para su administración según la invención como parte de una composición farmacéutica. Para administración oral, la composición farmacéutica puede formularse para dar formas de dosificación sólidas tales como comprimidos, pastillas, polvos, gránulos o cápsulas, etc., y estas formas de dosificación sólidas pueden prepararse mezclando el compuesto de la invención con uno o más excipientes tales como almidón, carbonato de calcio, sacarosa o lactosa, gelatina, etc. Además, pueden usarse lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, etc., además de simples excipientes. Además, la composición farmacéutica puede formularse para dar formas de dosificación líquidas tales como suspensiones, líquidos para uso interno, emulsiones, jarabes, etc., y pueden usarse diversos excipientes tales como humectantes, edulcorantes, compuestos aromáticos, conservantes, etc., además de agua y líquido, parafina para la formulación de formas de dosificación líquidas. Para administración parenteral, la composición farmacéutica se formula generalmente mezclando el compuesto de la invención al grado de pureza deseado, en una forma de dosificación inyectable unitaria (disolución, suspensión o emulsión), con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no es tóxico para receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros componentes de la formulación.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto los componentes de la composición farmacéutica de manera uniforme e íntima con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos. Entonces, si es necesario, se conforma el producto para dar la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente una disolución que es isotónica con respecto a la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen agua, solución salina, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo también son útiles en el presente documento, así como liposomas. El portador contiene de manera adecuada cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; albúmina sérica, gelatina; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.

Los componentes de la composición farmacéutica que van a usarse para administración terapéutica deben ser estériles. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Generalmente se colocan componentes terapéuticos de la composición farmacéutica en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Los componentes de la composición farmacéutica se almacenarán habitualmente en recipientes de unidades o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales, como disolución acuosa o como formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5 ml de disolución acuosa al 1 % (p/v) esterilizada por filtración, y se liofiliza la mezcla resultante. La disolución de infusión se prepara reconstituyendo el/los compuesto(s) liofilizado(s) usando agua para inyección bacteriostática.

El compuesto según la invención (o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto) puede administrarse de manera sistémica (por ejemplo, por vía oral, rectal, parenteral (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, intraperitoneal, transdérmica (por ejemplo, mediante un parche), tópica (como polvos, pomadas, gotas o parche transdérmico), bucal, o como pulverización oral o nasal, mediante inhalación, por vía subcutánea o similares), mediante administración en el sistema nervioso central (por ejemplo, en el cerebro (por ejemplo, por vía intracerebral, intraventricular o intracerebroventricular) o médula espinal o en el líquido cefalorraquídeo) o cualquier combinación de las mismas. Sin embargo, normalmente se prefieren las vías de administración oral, por motivos de una administración más conveniente (por ejemplo, menos invasiva) (por ejemplo, la posibilidad de administración por el propio paciente) y particularmente en casos en los que las bacterias patógenas seleccionadas como diana (por ejemplo,H. pylori)están presentes en el tracto gastrointestinal.

El compuesto puede administrarse en una o más administraciones de dosis, al menos una vez al día, durante uno o más días (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días; 2, 3, 4 semanas; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses; 2 años, 3 años, 4 años o más tiempo). Sin embargo, el experto entiende que la duración de la administración, según la presente invención, puede mantenerse opcionalmente durante el resto de la vida del sujeto. El compuesto puede administrarse diariamente o con menos frecuencia, por ejemplo, cada dos días, dos veces por semana, cada semana, cada dos semanas, dos veces al mes, cada mes, cada dos meses, etc.

Puede administrarse una cantidad eficaz del compuesto a un sujeto que lo necesita de una vez cada 6 horas a una vez cada 60 horas, más preferiblemente de una vez cada 12 horas a una vez cada 48 horas, y lo más preferiblemente una vez cada aproximadamente 24 horas. En relación con la presente invención, se encontró que el tratamiento de ratones infectados porH. pyloricon el compuesto era eficaz cuando se administraba una vez al día, tal como se detalla en el ejemplo 3.

El compuesto puede administrarse durante un periodo de al menos 3 días, preferiblemente al menos 5 días, más preferiblemente al menos 7 días. Tal como también resulta evidente a partir del ejemplo 3, el compuesto activo 2/BL2 era terapéuticamente activo (tal como se concluye, por ejemplo, a partir de una reducción de observada de recuentos de ufc en ratones infectados por H.pyloritratados con BL2) cuando se administró el compuesto una vez al día (a una única dosis de 10 mg/kg/día) durante 7 días consecutivos.

El compuesto de la invención puede administrarse al sujeto a una dosis adecuada y/o una cantidad terapéuticamente eficaz. Esto se comentará adicionalmente a continuación en el presente documento.

La dosificación del compuesto de la invención requerida variará en cierta medida de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, peso y estado general del sujeto, el agente activo particular y el portador farmacéutico usado, el modo de administración y similares. Por ejemplo, la dosis del compuesto cuando se administra por vía parenteral puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a 1000 mg/kg de peso corporal de paciente (p.c.), aunque, tal como se indicó anteriormente, esto estará sujeto a discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,5 mg/kg/día, y lo más preferiblemente para seres humanos entre aproximadamente 5 y 100 mg/kg/día. Si se administra de manera continua, la composición farmacéutica se administra normalmente a una tasa de dosis de aproximadamente 1 mg/kg/hora a aproximadamente 50 mg/kg/hora, o bien mediante 1-4 inyecciones al día o bien mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba. También puede emplearse una disolución de bolsa intravenosa. La longitud de tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parecen variar dependiendo del efecto deseado. Las cantidades particulares pueden determinarse mediante pruebas convencionales que conoce bien el experto en la técnica.

Para determinar dosificaciones terapéuticamente eficaces para formulaciones farmacéuticas particulares, por ejemplo, pueden usarse modelos de animales (por ejemplo, ratones, jerbos, etc.) de infección bacteriana (por ejemplo, infección crónica porH. pylori)para monitorizar niveles de respuesta. Entonces puede determinarse la eficacia terapéutica, por ejemplo, a partir de una reducción de las unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias en animales infectados y tratados, con respecto a animales infectados no tratados; y pueden evaluarse posibles efectos sobre la microbiota residual, por ejemplo, mediante secuenciación de amplicones de ARNr 16S tal como se describe en los ejemplos dados a conocer en el presente documento (véanse el ejemplo 1 (métodos) y el ejemplo 3).

Como regla general, los intervalos de dosificación para la administración de las formulaciones de compuesto o composiciones farmacéuticas son aquellos suficientemente grandes como para producir el efecto deseado en los que se afecta a los síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, puede realizarse una mejora funcional, mejora histológica, expresión génica y similares y monitorizarse para determinar el desenlace deseado. La dosificación no debe ser tan grande que provoque efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas y reacciones inflamatorias no deseadas. La dosificación puede variar dependiendo de la vía de administración usada.

El compuesto puede administrarse a una dosis de entre 0,1 mg/kg de peso corporal y 2000 mg/kg de peso corporal. En el contexto de la presente invención, se encontró que el tratamiento del modelo de ratón con el compuesto era eficaz a la dosificación sometida a prueba de 10 mg/kg de peso corporal de ratón, tal como se detalla en el ejemplo 3. Por tanto, se espera que generalmente dosificaciones comparables pueden ser terapéuticamente eficaces en sujetos de mamífero, en particular en sujetos humanos.

Según la invención, el compuesto tiene una “actividad antimotilidad” (tal como se definió anteriormente en el presente documento), preferiblemente una “actividad antiflagelar” (tal como se definió anteriormente en el presente documento). En la técnica se conocen medios y métodos para someter a ensayo la presencia o ausencia de tales actividades y se describen en el presente documento. Por ejemplo, el ensayo de luciferasaflaAdado a conocer en el presente documento (por ejemplo, el ensayo de luciferasa / bioluminiscencia descrito en los ejemplos 1 y 2) puede usarse con se fin. Alternativamente, la presencia o ausencia de tales actividades también puede determinarse, por ejemplo, mediante seguimiento de la motilidad (microscópico), por ejemplo, tal como también se describe en los ejemplos dados a conocer en el presente documento.

El compuesto puede tener una actividad inhibitoria detectable (es decir, “actividad antimotilidad”), cuando se someten a ensayo en un ensayo antimotilidad tal como se da a conocer en el presente documento, por ejemplo, en el ensayo de luciferasaflaAdado a conocer en el presente documento (por ejemplo, descrito en los ejemplos 1 y 2), en el que una reducción de una señal de gen indicador detectada (bioluminiscencia detectada) en presencia del compuesto en comparación con la ausencia de dicho compuesto es indicativa de una actividad inhibitoria de dicho compuesto. El experto sabe que una CI<50>de un ensayo de este tipo puede determinarse como una medida de una actividad inhibitoria de este tipo.

La CI<50>(es decir, la concentración inhibitoria semimáxima) es una medida habitualmente aplicada de la potencia de una sustancia en la inhibición de una función biológica o bioquímica específica (por ejemplo, expresión del gen indicador en la cepa indicadora deflaAsometida a ensayo mediante detección de la señal indicadora de bioluminiscencia). CI<50>es una medida cuantitativa que indica cuánto de una sustancia inhibidora particular (por ejemplo, fármaco/compuesto) se necesita para inhibir,in vitro,un proceso biológico o componente biológico dado en el 50 %.

Según la presente divulgación, el término “actividad inhibitoria detectable” significa que un compuesto correspondiente tiene una CI<50>máxima de, con preferencia creciente, 100 |ig/ml, 75 |ig/ml, 50 |ig/ml, 40 |ig/ml, 30 |ig/ml, 20 |ig/ml, 10 |ig/ml, 5 |ig/ml, 4 |ig/ml, 3 |ig/ml, 2 |ig/ml, 1 |ig/ml o 0,5 |ig/ml, en el que la CI<50>se determina mediante un ensayo antimotilidad, por ejemplo, usando cualquiera de las cepas indicadoras de luciferasa flaA deH. pyloridadas a conocer en el presente documento para someter a ensayo la señal indicadora en presencia (de concentraciones aumentadas de manera gradual) o ausencia de un compuesto de prueba (por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 1). El experto podrá adaptar tales ensayos para evaluar la presencia o ausencia de una actividad inhibitoria de un compuesto en otras especies bacterianas diana.

Por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 4 (usando la cepa N6 indicadora de luciferasa flaA deH. pylori),tabla 6, para los compuestos, compuesto activo 2, DJ-1, DJ-2, DJ-5, DJ-6, DJ-7, DJ-8, DJ-9 y DJ-12, se determinaron valores de CI<50>de menos de 4,5 |ig/ml; y para el compuesto DJ-2 se determinó una CI<50>de 0,44 |ig/ml. Para los compuestos DJ-10 y DJ-11, se determinaron valores de CI<50>de 10,83 |ig/ml y 10,56 |ig/ml, respectivamente. Dado que el compuesto principal, compuesto activo 2, que tiene una CI<50>de 2,75 |ig/ml era particularmente eficaz, se espera que derivados cercanos de este compuesto principal inicial también serán eficaces, particularmente los compuestos que tienen valores de CI<50>en un intervalo similar. También se determinaron intervalos de CI<50>similares para los compuestos, compuesto activo 2 y compuesto activo 2a (DJ-1) sometidos a ensayo con una cepa indicadora de luciferasa flaA deH. pyloriderivada de la cepa L7 deH. pylori(véase el ejemplo 6).

El compuesto puede tener una actividad antimotilidad (preferiblemente, actividad antiflagelar) y ningún, o sustancialmente ningún, efecto anti-viabilidad (por ejemplo, actividad de inhibición del crecimiento (actividad bactericida y/o bacteriostática). El compuesto puede tener actividad antimotilidad (preferiblemente antiflagelar) y ninguna (o sustancialmente ninguna) actividad bacteriostática y ninguna actividad bactericida.

En la técnica se conocen medios y métodos para someter a ensayo la presencia o ausencia de actividad bacteriostática o bactericida de un compuesto sobre especies diana bacterianas seleccionadas y se dan a conocer en el presente documento.

Las bacterias patógenas gastrointestinales y/o gastroduodenales conocidas incluyen, sin limitación,Helicobacter spp.,(por ejemplo,Helicobacter pylori), Campylobacter spp.(por ejemplo,Campylobacter jejuni), Staphylococcus spp. (Staphylococcus aureus), Bacillus subtilis, Escherichia colienterohemorrágica (EHEC),Escherichia colienterotoxigénica (ETEC),Escherichia colienteropatógena (EPEC),Escherichia coliproductora de toxina Shiga (STEC),Klebsiella pneumonia, Clostridium difficile, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp.,eYersinia spp.(por ejemplo,Yersinia enterocolitica).

Las bacterias patógenas urogenitales incluyen, sin limitación, estreptococos p-hemolíticos,Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Corynebacterium pyogenes, C. vaginale, Campylobacter spp., Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae.

La limitación opcional con respecto a las bacterias flageladas de “no ser sensibles a tratamiento con antibióticos”, se refiere a tales bacterias que o bien (i) tienen resistencia adquirida a al menos un antibiótico, en las que dicho antibiótico no puede ejercer su efecto bactericida y/o bacteriostático que tiene habitualmente sobre bacterias de la misma especie y/o género sin resistencia adquirida; o bien(ii)a tales bacterias contra las cuales no hay ningún antibiótico conocido disponible.

Además del representante más destacadoH. pylori,se han encontrado otras especies deHelicobacterpatógenas en el estómago, intestino y tracto biliar. Por ejemplo, se ha encontradoH. heilmannii,que se sabe que comprende varias especies incluyendoH. bizzozeroniiyH. salmonis,en el estómago y también se sospecha que provoca las mismas enfermedades queH. pylori.Otras especies que infectan a seres humanos incluyenH. cinaedi, H. pullorum, H. canis, H. canadensis, H. fennelliae, H. rappini, H. bilis, H. hepaticusyH. suis(Testermanet al.,World J Gastroenterol (2014); 20(36): 12781-12808). Tal como se muestra en el ejemplo 3 adjunto, el compuesto (BL2) identificado mediante la presente invención demostró ser terapéuticamente eficaz en el tratamiento de un modelo de animal de infección crónica porH. pylori.Por tanto, se espera que el mismo compuesto o derivados estrechamente relacionados también sean eficaces en el tratamiento de otrosHelicobacter spp.patógenos.

Las especies deCampylobacterson bacterias flageladas Gram-negativas, microaerófilas, no fermentadoras, de la claseEpsilonproteobacteria. Campylobacter spp.provoca gastroenteritis aguda con diarrea, dolor abdominal, fiebre, náuseas y vómitos. Recientemente, se han identificado infecciones porCampylobactercomo el antecedente más común a una enfermedad neurológica aguda, el síndrome de Guillain-Barré. Estas bacterias colonizan los intestinos delgado y grueso, provocando diarrea inflamatoria con fiebre. Las infecciones por C.jejuniyC. colison endémicas en todo el mundo e hiperendémicas en países en desarrollo. Los lactantes y jóvenes adultos son los que presentan infecciones con mayor frecuencia. La incidencia de enfermedad presenta picos en verano. Los animales domésticos y salvajes son reservorios para los microorganismos. Los brotes están asociados con agua o productos animales contaminados agua (Medical Microbiology. 4a ed., Univ. of Texas Medical Branch at Galveston, 1996. capítulo 23; Rosner BM,et al.,Sci Rep. 2017; 7(1):5139). Además, la infección porCampylobactertambién puede provocar complicaciones neurológicas, tales como artritis reactiva, síndrome de Guillain-Barré (GBS) y síndrome de Miller-Fisher. Estos dos últimos pueden ser muy intensos e incluso conducir a muerte de los pacientes.

El patógeno bacterianoHelicobacter pylori (H. pylori)coloniza habitualmente la mucosa gástrica humana durante la primera infancia y persiste a lo largo de toda la vida. Este microorganismo ha desarrollado múltiples mecanismos para escapar al aclaramiento por el sistema inmunitario y, principalmente mediante inducción de inflamación en el estómago, se piensa que es causante de una multitud de estados patológicos graves (Testermanet al.,World J Gastroenterol (2014); 20(36): 12781-12808; Whiteet al.,J Inflamm Res. (2015); 8: 137-147; Suerbaum y Michetti, N Engl J Med. 2002; 347(15):1175-86).

Por ejemplo, se conoce la infección porH. pyloricomo causa principal de enfermedad de úlcera péptica y cáncer gástrico. Las úlceras pépticas son llagas que se desarrollan en el revestimiento del estómago o la parte superior del intestino delgado (duodeno). Una úlcera en el estómago se denomina úlcera gástrica, y una úlcera en el duodeno se denomina úlcera duodenal. Se cree queH. pylorise transmite de una persona a otra mediante contacto estrecho y exposición a materia fecal o vómitos. La infección resultante debilita la mucosa protectora en el estómago y el duodeno, permitiendo que atraviese ácido hasta el revestimiento sensible por debajo. Tanto el ácido como las bacterias irritan el revestimiento y provocan que se forme una úlcera.

Si no se trata, una infección porH. pyloripuede provocar gastritis (es decir, inflamación del revestimiento del estómago) o duodenitis (es decir, inflamación del duodeno). La gastritis puede producirse de manera repentina (gastritis aguda) o gradual (gastritis crónica). Una infección porH. pylorisin tratar también puede avanzar para dar enfermedad de úlcera péptica o cáncer de estómago más tarde en la vida. La gastritis erosiva es erosión de mucosa gástrica provocada por daño de las defensas mucosas. La gastritis crónica se refiere a una amplia gama de problemas de los tejidos gástricos. En el caso de gastritis inducida por infección y/o colonización porH. pylori,puede aparecer infección aguda como gastritis aguda con dolor abdominal (dolor de estómago) o náuseas. Cuando se desarrolla para dar gastritis crónica, los síntomas, si están presentes, son con frecuencia los de dispepsia no ulcerosa: dolores de estómago, náuseas, hinchamiento, eructos y algunas veces vómitos o heces negras. Los individuos infectados porH. pyloritienen un riesgo a lo largo de toda la vida del 10 al 20 % de desarrollar úlceras pépticas y un riesgo del 1 al 2 % de adquirir cáncer gástrico (de estómago), incluyendo, entre otras cosas, adenocarcinoma gástrico y linfoma de MALT (nombre oficial: linfoma de células B de zona marginal extraganglionar de tejido linfoide asociado con mucosa).

El adenocarcinoma gástrico se divide en subtipo intestinal y subtipo difuso. El adenocarcinoma de tipo intestinal es más común. La secuencia de cambios patológicos que conducen a cáncer de tipo intestinal comienza con gastritis, seguido por atrofia gástrica (pérdida de estructura glandular) y progresa para dar metaplasia intestinal, displasia y finalmente carcinoma. Esta progresión se produce a lo largo de muchos años; por consiguiente, la mayoría de los pacientes son de mediana edad o mayores. Factores ambientales, tales como fumar y la dieta, aumentan el riesgo de desarrollar adenocarcinoma gástrico. El adenocarcinoma asociado conH. pylorise produce principalmente en la parte distal del estómago (distinto de cardias) estómago. Además, se ha identificado la infección porH. pyloricomo posible causa, o al menos que contribuye al desarrollo de adenocarcinoma de tipo difuso, que está caracterizado por células tumorales dispersadas y falta de organización glandular (Testermanet al.,World J Gastroenterol (2014); 20(36): 12781-12808).

Se ha notificado además queH. pylories responsable del 92 %-98 % de los linfomas de MALT gástricos (Testermanet al.,World J Gastroenterol (2014); 20(36): 12781-12808). La mayoría de los linfomas de MALT gástricos son de grado bajo cuando se descubren y dependen de una estimulación de antígeno continuada. Se piensa que la respuesta inmunológica provocada por la infección bacteriana puede conducir a gastritis crónica con formación de folículos linfoides dentro del estómago. Estos folículos linfoides están compuestos por células T reactivas y células B y células plasmáticas activadas. Las células B son responsables de iniciar una expansión clonal de células de tipo centrocitos que forman la histología básica del linfoma de MALT. Los síntomas clínicos son vagos y variados, siendo el dolor abdominal una queja común en la presentación. La infección porH. pylorise ha implicado además con otros tipos de linfoma, incluyendo linfoma de células B grandes difuso (DLBCL).

Además, se ha vinculado de manera causante la infección porH. pyloricon enterocolitis, una inflamación del tracto digestivo, que implica enteritis del intestino delgado y colitis del colon. Las manifestaciones clínicas comunes de enterocolitis son frecuentes defecaciones diarreicas, con o sin náuseas, vómitos, dolor abdominal, fiebre, escalofríos y alteración del estado general. Las manifestaciones generales vienen dadas por la diseminación del agente infeccioso o sus toxinas a través del cuerpo, o (lo más frecuentemente) por pérdidas significativas de agua y minerales, la consecuencia de diarrea y vómitos.

Por ejemplo, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de infección porH. pylorio estado asociado, el compuesto de la invención puede administrarse en combinación, o de manera secuencial, con los constituyentes de una terapia triple o cuádruple (según la norma de tratamiento actualmente recomendada), en el que, preferiblemente, la(s) dosificación/dosificaciones de uno o más de los constituyentes de dichas terapias triples o cuádruples, por ejemplo, uno o ambos de los dos antibióticos aplicados, es/son inferior(es) (por ejemplo, al menos aproximadamente el 5 %, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% inferior(es)) en comparación con su dosificación actualmente aplicada en las terapias triples o cuádruples convencionales (véase O'Connor Aet al.,Helicobacter. 2019; 24, sup. 1:e12640, revisión: “Treatmentof Helicobacter pylori Infection 2019”). Se espera que regímenes de tratamiento correspondientes, en los que se aplican dosificaciones reducidas de uno o más antibióticos, pueden reducir las respuestas de estrés por antibióticos de las bacterias (incluyendo los mecanismos (de defensa) que impulsan el desarrollo de persistencia), mientras que al mismo tiempo se benefician de los efectos antivirulencia (es decir, antimotilidad) del compuesto de la invención, y, por tanto, ser particularmente eficaces en la erradicación deH. pylori,al tiempo que reducen el riesgo de efectos secundarios.

La invención se describe en el presente documento, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de patente que incluye definiciones.

Con respecto a las realizaciones caracterizadas en esta memoria descriptiva, en particular en las reivindicaciones, se pretende que cada realización mencionada en una reivindicación dependiente se combine con cada realización de cada reivindicación (independiente o dependiente) de la que depende dicha reivindicación dependiente. Por ejemplo, en el caso de una reivindicación independiente 1 que menciona 3 alternativas A, B y C, una reivindicación dependiente 2 que menciona 3 alternativas D, E y F y una reivindicación 3 que depende de las reivindicaciones 1 y 2 y que menciona 3 alternativas G, He I, debe entenderse que la memoria descriptiva da a conocer de manera inequívoca realizaciones correspondientes a las combinaciones A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, a menos que se mencione específicamente lo contrario.

De manera similar, y también en los casos en los que las reivindicaciones independientes y/o dependientes n mencionan alternativas, se entiende que si las reivindicaciones dependientes hacen referencia a una pluralidad de reivindicaciones anteriores, se considera que se da a conocer explícitamente cualquier combinación de contenido cubierto por las mismas. Por ejemplo, en el caso de una reivindicación independiente 1, una reivindicación dependiente 2 que hace referencia a la reivindicación 1, y una reivindicación dependiente 3 que hace referencia a ambas reivindicaciones 2 y 1, se desprende que la combinación del contenido de las reivindicaciones 3 y 1 se da a conocer de manera clara e inequívoca al igual que la combinación del contenido de las reivindicaciones 3, 2 y 1. En el caso en el que está presente una reivindicación dependiente 4 adicional que hace referencia a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, se desprende que se da a conocer de manera clara e inequívoca la combinación del contenido de las reivindicaciones 4 y 1, de las reivindicaciones 4, 2 y 1, de las reivindicaciones 4, 3 y 1, así como de las reivindicaciones 4, 3, 2 y 1.

Las figuras muestran

Figura 1: el desarrollo y establecimiento de un sistema de cribado mediante cribado indicador basado en luciferasa primario para detectar la expresión y biosíntesis flagelar deH. pylorien placas de múltiples pocillos y la identificación de compuestos pequeños activos mediante el cribado. A) Resultados de cribado indicador de luciferasa flagelar para una biblioteca a modo de ejemplo de más de 1200 compuestos; cada punto representa un resultado de compuesto. El eje de las x muestra el número de compuestos sometidos a prueba, el eje de las y muestra actividad de indicador en porcentaje de un control sin inhibición positivo que se estableció al 100 %. Se observaron las actividades inhibitoria así como potenciadora de los compuestos. Las marcas amarillas representan los bordes del factor Z, correspondiente a tres veces el error estándar de los controles positivos (sin inhibición). Los puntos fuera de los márgenes de factor Z se consideran efectos inhibidores o potenciadores (compuestos activos o positivos). B) Identificación de compuestos inhibidores activos en cinco bibliotecas de compuestos pequeños usando el cribado indicador de luciferasa flagelar primario. Se usó un punto de corte superior del 30% de inhibición para identificar y numerar las actividades fuertemente inhibitorias en el cribado primario. Los compuestos activos se facilitan en porcentaje de los compuestos cribados totales en cada biblioteca.

Figura 2: características antibacterianas enH. pyloride un compuesto positivo de cribado primario que tenía efectos antibacterianos específicos directos contraH. pylori.Este compuesto era un resultado activo/positivo, compuesto activo 1, que inhibió tanto el crecimiento (determinado mediante CIM/CBM) como la actividad de indicador flagelar. En B) se facilita la determinación de la CI<50>de la actividad de indicador para este compuesto (cribado primario), C) se facilita la determinación de la CI<50>para la actividad metabólica (cribado inverso) y D) se facilitan valores de CIM/CBM para el mismo compuesto, que muestra actividad antibacteriana contraH. pylori.

Figura 3: estructura química y actividad antiflagelar del compuesto activo primario, compuesto activo 2 (BL2), compuesto antimotilina, contraH. pylori.El compuesto activo 2 era un fuerte inhibidor en el cribado indicador antiflagelar primario, pero no inhibió el crecimiento o la actividad metabólica deH. pylori(CIM/CBM> 256 |ig/ml), véase también la tabla 3). El panel A) representa la identidad química del compuesto (panel superior) y un análogo químico cercano, compuesto activo 2a (BL2a, panel inferior) con características similares (un residuo de halógeno sustituido); el panel B) muestra los valores de CI<50>para el compuesto BL2 en el ensayo indicador de H.pyloribasado en luciferasa primario.

Figura 4: actividad antimotilidad sobre bacteriasH. pylorivivas de dos compuestos activos/positivosin vitro.Se realizaron ensayos de seguimiento conH. pylorien medio líquido (RPMI1640 con suero de caballo al 3% ) y se grabaron vídeos en un sistema de obtención de imágenes en directo CELL-R (Olympus, véanse los métodos). A) Se cuantificaron las paradas/inversiones durante las series de nado de las bacterias como medición de taxis intacta y motilidad direccional y velocidad curvilínea (CLV) tal como se describe en (Behrenset al.,2016). La significación de diferencias entre el control positivo (control) y las muestras bacterianas tratadas con compuesto para 15 bacterias cada una se indica mediante asteriscos. * < 0,05. n.s. = diferencia no significativa.

Figura 5: la aplicación terapéutica de prueba de principio de compuesto antimotilina activo primario (BL2) en un modelo de infección de ratón porH. pyloricrónica preclínico reveló una actividad significativain vivo.El panel A) muestra un esquema del diseño experimental. En el panel B), se muestran los valores de ufc de cuatro grupos de ratones infectados porH. pyloricon o sin administración de compuesto BL2 en combinación con metronidazol o tras la administración únicamente de BL2 (véase la tabla 4). Todos los ratones en el grupo de control infectado positivo eran positivos para ufc; tres animales en este grupo tenían bajos recuentos. C) Análisis de microbiota de todos los grupos en este experimento mediante análisis de amplicones de 16S. La composición de microbiota no era significativamente diferente entre los grupos (comparaciones múltiples, AMOVA de dos factores). Para resultados de AMOVA detallados, véase la tabla 5. En B no se muestran dos grupos que no se infectaron son que tan sólo se les administró BL2 o tan sólo se les administró dosis simulada. La configuración experimental detallada se describe en los métodos y la tabla 4.

Figura 6: la inmunotransferencia de tipo Western revela la reducción de proteína flagelina FlaA tras la incubación con compuesto antimotilina activo, compuesto activo 2 (BL2). Se monitorizaron dos puntos de tiempo diferentes de una curva de crecimiento deH. pylorien medio BHI líquido (extracto de levadura al 3%, suero de caballo al 5%), T1 (exponencial temprano) T2 (crecimiento exponencial tardío) para detectar diferencias en la expresión de proteína en presencia (+) o ausencia de compuesto activo 2. Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western con las fracciones insoluble (IS), soluble (S) y asociada a superficie (OF) de las bacterias. Se desarrollaron inmunotransferencias con antisueros anti-FlaA, anti-FlhA y anti-CagL como controles de fraccionamiento, tal como se indica. La inmunotransferencia de FlaA revela una reducción significativa de la flagelina principal FlaA en el punto de tiempo T2 tras complementarse con compuesto activo 2 en las fracciones bacterianas soluble y asociada a superficie. FlhA sirve como control de fraccionamiento para la fracción insoluble. CagL, que aumentó ligeramente mediante compuesto activo 2, se muestra como segundo control para la fracción insoluble.

Figura 7: PCR identificó una fuerte carga bacteriana residual en un modelo de infección crónica porH. pyloriterapéutico para el antibiótico metronidazol pero no para el compuesto bloqueador de patógenos activo BL2. A) Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para un segmento de nucleótidos parcial del gencagLdeH. pyloricon homogeneizados de cuerpo de estómago a partir del experimento de infección crónica de ratón y tratamiento con BL2. Se muestran los resultados de PCR a partir de ratones agrupados en cuatro grupos (sólo infectados por HP; grupos separados por líneas azules) (tabla 4) en el orden de aparición. Grupo 1: ratones 1 a 10; grupo 2: ratones 11 a 20; grupo 3: ratones 21 a 30; grupo 4 ratones 31 a 40. Los números de ratón se muestran encima de los carriles de PCR. Las secuencias de alta calidad obtenidas a partir de PCR positivas paracagLen ausencia de cultivo positivo se introducen en recuadros; se muestran lecturas de secuencias de Sanger respectivas en B). Las secuencias de nucleótidos de los ratones 29, 36 y 38 contienen SNP en comparación con la cepa de entrada (recuadro rojo), mientras que las secuencias de los otros nuevos aislados y bandas de PCR de homogeneizados no contienen SNP. N = control negativo sin ADN; P = control de PCR positivo usando ADN genómico de cepa deH. pyloriadaptada a ratón; L = marcador de peso molecular de tamaño de nucleótidos -1 kb más marcador de peso molecular de Thermo Scientific. C) No se determinó ningún cambio significativo de cargas de citocina en plasma (medido mediante el ensayo Bioplex de BioRad) en el modelo de infección crónica de ratón con o sin intervención terapéutica con BL2. Los grupos de ratones (seis grupos, 54 ratones) se agrupan tal como se representa en el esquema en la figura 5, tabla 4.

Los ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1: materiales y métodos

Cepas bacterianas y cultivo

Se cultivóH. pylorien placas de agar sangre (sangre de caballo al 10% en agar sangre base Columbia, Oxoid), complementadas con una combinación de antibiótico y antifúngico en condiciones microaerobias tal como se describió anteriormente (Behrenset al.,2016). Para ensayos de inhibición del crecimiento, se cultivóH. pylorien caldo de cultivo (caldo BHI, complementado con extracto de levadura al 3 % y suero de caballo al 5 %), no complementado con ningún agente antibiótico o antifúngico. La atmósfera microaerobia requerida para el crecimiento se proporcionó en cámaras de incubación herméticas con una mezcla de gases específica (el 5 % de O<2>, el 10 % de CO<2>, el 85 % de N<2>) o en jarras anaerobias con bolsas generadoras de gas de agotamiento de oxígeno (Anaerocult C, Merck). Otras cepas bacterianas usadas en los ensayos fueronEscherichia coliRP437 yCampylobacter jejuni11186. Se cultivóE. colide manera rutinaria en placas de agar LB y se realizaron cultivos líquidos para ensayos de concentración inhibitoria mínima (CIM) en medio de caldo de LB. Se hizo crecer C.jejunien placas de agar sangre con sangre de oveja al 5 % y se realizó cultivo líquido para pruebas de antibióticos en medio de caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI), complementado con extracto de levadura al 3 %.

Desarrollo de una cepa indicadora de luminiscencia deH. pyloricomo herramienta de cribado para compuestos que tienen efectos antiflagelares

Se fusionó el promotor deflaAdeH. pyloricon un operón de luciferasa(luxAB)deVibrio harveyien un plásmido suicida deH. pylori(Niehus, Ye, Suerbaum y Josenhans, 2002). Volvió a combinarse la fusión de indicador deflaAen el cromosoma deH. pyloriy la cepa resultante demostró ser fuertemente positiva para luminiscencia en las pruebas. La cepa indicadora (N6flaA-lux4B)activó luminiscencia hasta aproximadamente de 40.000 a 60.000 cuentas por segundo usando sustrato de luciferasa a una DO<600>de 0,8 (fase logarítmica media) en cultivo líquido. El valor de control negativo de una cepa no indicadora o cepa indicadora sin sustrato de luminiscencia era próximo a cero. Por tanto, la relación señal-ruido del ensayo es de entre 104 y 105. El factor Z (Zhanget al.,1999) determinado para el ensayo con diversos inhibidores bacterianos medidos por cuadruplicado o triplicado era de manera rutinaria de entre 0,6 y 0,7, con un intervalo de confianza del 95 %.

Se validó la cepa indicadora usando los compuestos carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazina (CCCP) (inhibidor de potencial de membrana esencial para la motilidad flagelar), rotenona (inhibidor de complejo I de la cadena respiratoria) y el antibiótico ampicilina (inhibidor de la biosíntesis de la pared celular). Mientras que los dos primeros inhibidores metabólicos/de la cadena respiratoria inhibieron la actividad de indicador de luminiscencia, el antibiótico contra la pared celular, que es altamente eficaz contraH. pylori,no alteró las lecturas en el ensayo de indicador de luciferasa. Esto distingue claramente el ensayo de cribado de un cribado antibacteriano clásico.

Ensayo de luciferasa / bioluminiscencia usado durante el procedimiento de cribado

Se sometieron cepas indicadoras de luminiscencia deH. pyloria pase en placas de agar sangre menos de 22 horas antes del inicio del experimento. El número de pases para estos ensayos no fue superior a cinco para conservar la estabilidad genética y propiedades de la cepa. Se preparó tampón de reacción de luciferasa de la siguiente manera: se disolvieron fosfato de disodio 50 mM (Na<2>HPO<4>) y BSA al 2 % en agua para HPLC, se esterilizaron mediante filtración, se extrajeron alícuotas y se congelaron a -20°C.

Se recogieron bacterias en medio de infusión de cerebro-corazón (BHI, extracto de levadura al 3 % con suero de caballo al 5 % añadido) y se ajustaron hasta una DO<600>de 0,8 a temperatura ambiente. Se añadieron 50 |il de la suspensión bacteriana por pocillo de una placa de 96 pocillos (no de unión, Greiner Bio-One 655901).

Se añadieron 2 |il de cada uno de los compuestos de prueba (proporcionados como una disolución en DMSO 10 mM) a los pocillos de muestra. Se añadió la misma cantidad de DMSO diluido puro a los pocillos de control para una concentración de un máximo de DMSO al 4 % por pocillo, dado que concentraciones superiores interferirán con funciones metabólicas deH. pyloriy provocarán falsos resultados negativos. Se incubó la placa de micropocillos dentro de una bolsa de gas de PM sellada estéril (BIOLOG n.° 3032) junto con un envase CampyGen Compact (Oxoid) para generar condiciones microaerobias a 37°C y con agitación a 175 r. p. m. durante 4 h.

Poco antes de realizar la medición, se preparó el sustrato de luciferasa diluyendo el sustrato de luminiscencia decanal (disolución madre al 10 %, Sigma Aldrich) a una dilución de 1:2.000 en tampón de reacción de luciferasa. Se añadieron 60 |il del sustrato por pocillo de una placa de 96 micropocillos blanca (Thermo Scientific n.° 236105) sin la tapa.

Para la medición de luciferasa final, se transfirieron 10 |il de la disolución bacteriana con el dispositivo epMotion 96 (Eppendorf) simultáneamente a los pocillos que contenían el sustrato de luciferasa y se incubaron en un agitador de placas de micropocillos durante 10 s para someter las bacterias a lisis. Se registraron las mediciones con un lector de placas Perkin Elmer Victor 3/WNallac 1420 (luminometría, tiempo de medición: 0,5 s) y se integraron para dar cuentas por s. Para la medición de fondo, se añadieron 10 |il de medio estéril que contenía DMSO al 4 % a los pocillos. Para cada medición, se realizaron al menos cuatro pocillos de control positivo para indicador de luciferasa (sin compuesto inhibidor) y cuatro pocillos de control negativo (antecedentes sin bacterias) en el mismo día y en las mismas condiciones de ensayo en paralelo.

Cálculo del factor Z del ensayo de cribado

Se calculó el factor Z tal como se describe por Zhanget al.[Zhanget al.,1999]

a - desviación estándar,^- media, positivo - controles positivos, negativo - controles negativos

A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening AssaysJi-Hu Zhang, Thomas D. Y Chung y Kevin R. Oldenburg

J Biomol Screen 19994: 67

3DE de la muestra 3DE del control

|media de la muestra -media del control|

Valor de Estructura del ensayo Relacionado con el factor Z cribado

1 DE = 0 (sin variación), o el intervalo dinámico ^ ~ Un ensayo ideal

1 > Z > 0,5 La banda de separación es grande Un ensayo excelente

0,5 > Z > 0 La banda de separación es pequeña Un ensayo doble

0 Sin banda de separación, las bandas de variación de señal de Un ensayo de tipo “sí/no” muestra y de variación de señal de control están en contacto

<0 Sin banda de separación, las bandas de variación de señal de Cribado esencialmente muestra y de variación de señal de control están solapadas imposible *Nota: para ensayos de tipo agonista/activación, los datos de control en la ecuación se sustituyen por los datos de control positivo (señal activada máxima); para ensayos de tipo antagonista/inhibición, los datos de control en la ecuación se sustituyen por los datos de control negativo (señal mínima), (véanse también la ec. 2 y la figura 4).

Concentración inhibitoria mínima (CIM), concentración bactericida mínima (CBM) de los compuestos de prueba

Con el fin de distinguir compuestos que tienen actividad antiflagelar de compuestos que tienen efectos antibióticos clásicos (es decir, efectos bacteriostáticos y/o bactericidas), se sometieron adicionalmente los compuestos de prueba a pruebas de CIM/CBM. Se hizo crecerHelicobacter pylorien cultivo líquido recogiendo bacterias a partir de placas que se hicieron crecer durante la noche en medio de infusión de cerebro-corazón (BHI, Oxoid) con extracto de levadura al 3 % y suero de caballo al 5 %, se añadieron a un inóculo adicional de DO<600>= 0,05. Se incubaron 10 ml de esta suspensión bacteriana como cultivo previo en un tubo Falcon de 50 ml con la tapa entreabierta dentro de una jarra de incubación hermética y una atmósfera microaerobia generada mediante envases de generación de gas Anaerocult C de Merck a 37°C y agitación a 175 r. p. m. durante la noche. Al día siguiente, antes del comienzo del experimento, DO<600>del cultivo líquido estaba de manera rutinaria por debajo de 1, en fase de crecimiento exponencial media.

A continuación, se añadieron 200 |il de la suspensión bacteriana por pocillo de una placa de 24 pocillos (Greiner Cellstar n.° 662160) diluida hasta una DO<600>inicial de 0,07. Se añadieron compuestos (en DMSO) a los pocillos de muestra por duplicado en una dilución en serie empezando a un límite superior de 256 |ig/ml. Se añadió DMSO puro a todos los pocillos para una concentración de DMSO al 2 % por pocillo. Se incubó la placa de múltiples pocillos (con tapa) dentro de una jarra de incubación y una atmósfera microaerobia generada mediante sobres Anaerocult C de Merck a 37°C y agitación a 175 r. p. m. durante 24 h. Para la medición, se combinaron los duplicados tras la inspección visual, se diluyeron 1:3 en medio y se midieron en cubetas de plástico como DO a 600 nm. Se definió el límite de detección del crecimiento como una DO<600>de 0,05. Se consideró que los valores iguales o inferiores eran indicadores de un crecimiento completamente inhibido y se contaron como concentración inhibitoria mínima (CIM). También puede reducirse la escala de este método de determinación de CIM también método, automatizarse adicionalmente y medirse en placas de 96 o 384 pocillos en un incubador de placas de micropocillos equipado con una cámara de gas para incubación bacteriana microaerobia.

También se confirmaron las CIM de antibióticos conocidos (por ejemplo, metronidazol) usando tiras Etest (Liofilchem) en placas de agar sangre.

Para la evaluación de la “concentración bactericida mínima” (CBM), se cultivaron en línea bacterias del experimento de CIM y se sembraron en placas a diferentes diluciones en serie en agar sangre, incluyendo la concentración de compuesto más baja en la que todavía podía medirse crecimiento bacteriano mediante DO<600>(DO<600>^ 0,05), y tres niveles de concentración de compuesto (si era posible). Se incubaron las placas de agar sangre a 37°C en una atmósfera anaerobia, o bien dentro de una jarra de incubación (Oxoid) con un envase de gas Anaerocult C (Merck), o bien en un armario anaerobio aireado con una mezcla de gas microaerobia tal como se expuso anteriormente (Scholzen).

Para la evaluación de la CBM, se sembraron en placa bacterias del experimento de CIM como líneas o en diluciones apropiadas en placas de agar sangre Columbia, usando bucles de inoculación. Se incubaron las placas a 37°C durante la noche para detectar el crecimiento.

Seguimiento de motilidad microscópico deH. pylorien presencia de compuestos de prueba

Para evaluar efectos de un compuesto de prueba sobre la motilidad deH. pylori,se realizó un seguimiento microscópico de células bacterianas en presencia del compuesto de prueba. En particular, se calentó previamente medio RPMI 1640 tamponado con HEPES (Gibco), complementado con suero bovino fetal al 3 % (Biochrom), hasta 37°C. Se recogióHelicobacterpylori(cepa N6) en medio hasta una DO<600>de prueba de 0,033, se distribuyó a matraces de cultivo celular con tapas de filtro (volumen de prueba de 2 ml cada uno) y se mantuvieron en una cámara de incubación humidificada a 37°C en atmósfera ambiental que contenía adicionalmente el 5 % de dióxido de carbono. La incubación previa para equilibrado del cultivo bacteriano se llevó a cabo durante 15 min antes del comienzo del experimento. Se estableció la cámara de microscopio (sistema Olympus CELL-R) a una atmósfera de 37°C, el 5 % de dióxido de carbono y el 50 % de humedad. Se añadieron compuestos a los matraces, seguido por mezclado suave. Se observó la motilidad de las bacterias después de 0, 15 y 120 min de incubación. Se grabaron vídeos con softwarecellR(Olympus) después de 15 min de incubación con los compuestos. Se realizó un seguimiento de seis células bacterianas visible durante aproximadamente 100 fotogramas por vídeo usando el sistema y softwarecellR(Behrenset al.,2016; Schweinitzeret al.,2008). Se observó y numeró la velocidad, número de paradas/inversiones y longitudes de seguimiento para cada célula bacteriana, considerándose cada movimiento hacia atrás y hacia delante (inversión) de una célula como dos paradas.

Pruebas previas de compuestos activos para determinar la toxicidad en ratones (preparación de modelo preclínico)

Se sometieron inicialmente a prueba los compuestos activos BL1 y BL2, que se eligieron para someterse a prueba en un modelo preclínico, para determinar la toxicidad en el modelo de ratón mediante pruebas de dosis tóxica mínima (DTM). Las pruebas de DTM (protocolo DTM Tox56000, Eurofins Panlabs) se realizaron según normas internacionales, tal como se expondrá brevemente a continuación: se administraron a tres ratones dosis de los compuestos a cada dosis prevista. Se preparó el compuesto activo BL1 en una concentración en disolución madre adecuada en el 5 % de DMSO, o el 5 % de DMSO, el 10 % de solutol, el 85 % PBS (par 40 y 60 mg/kg/día), y se administró en dosis a 10, 30, 40 o 60 mg/kg/día mediante inyección intraperitoneal (125 |il para cada dosis). Se administraron dosis de compuesto activo BL2 por vía oral, a 10 mg/kg/día, 30 mg/kg/día o 60 mg/kg/día, diluidas con DMSO al 5 %, carboximetilcelulosa (CMC) al 2,5 %, en PBS, también a 125 |il por dosis por animal. La dosificación en cada caso empezó con la dosis más baja en los tres animales, seguida por observación durante hasta 72 h. Posteriormente, se administró la siguiente dosis superior a un conjunto diferente de tres ratones, etc. Se identificó que ambos compuestos que van a usarse posteriormente para la administración terapéuticain vivono eran tóxicos para ratones por debajo de una dosis administrada de 40 mg/kg al día. El compuesto BL1 mostró una toxicidad variable a 60 mg/kg/día, lo cual se atribuyó principalmente a una escasa solubilidad del compuesto, pero no mostró ninguna toxicidad a 40 mg/kg/día. BL2 era muy soluble y no mostró ninguna toxicidad hasta<6 0>mg/kg/día.

Infección porH. pyloriy administración de compuesto terapéutico en el ratón como modelo preclínico para el principio terapéutico antimotilidad

Se obtuvieron ratones C57B/L6 libres de patógenos específicos, de<6 - 8>semanas de edad, de Charles River Laboratories. Se aclimataron al nuevo entorno durante una semana antes de empezar los ensayos. Durante toda la duración del experimento, los ratones tuvieron acceso a alimento estéril y agua estéril a voluntad. En la semana uno del experimento, se administróH. pyloria 3*10<8>bacterias por ratón por inóculo (100 |il) en dos días con un día de interrupción entre medias. El tratamiento de prueba de principio se inició dos semanas después del final de la semana de inoculación, suponiendo una infección estable en este punto de tiempo. Se trataron los ratones en grupos independientes (8-14 animales por grupo), tal como se expone en los resultados, con compuesto(s), antibiótico (metronidazol a 14,3 mg/kg/día), una combinación tanto de antibiótico como de compuesto (para concentraciones, véanse los resultados) o se trataron de manera simulada una vez al día a lo largo de siete días consecutivos mediante sonda intragástrica. Tras la semana de tratamiento, se mantuvieron los ratones durante otras dos semanas en condiciones de alojamiento y alimentación normales con alimento esterilizado y agua estéril a voluntad. Al final del periodo de ensayo (semana siete), se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical con anestesia con CO<2>.

Los experimentos con animales los autorizó LAVES (autoridad gubernamental de la Baja Sajonia) de acuerdo con la ley federal alemana. La infección de ratones porH. pylorifue persistente durante más de seis semanas (la duración total del experimento) pero no provocó ninguna característica patológica perceptible en el estómago de ratones en el modelo usado en este caso tal como se evaluó por patólogos de ratones experimentados.

Secuenciación de amplicones de microbiota y análisis a partir de heces de ratón como medida de compuesto y principio activo terapéutico novedoso bien tolerado para proteger la microbiota

Se realizó un análisis de la microbiota de la parte inferior del intestino a partir de bolitas fecales recogidas de cada animal poco antes del final del experimento de tratamiento. Se realizó secuenciación de amplicones de ARNr 16S para la identificación de la composición de la microbiota. Se realizó la preparación de ADN total, preparaciones de bibliotecas de amplicones de 16S, secuenciación de microbiota (secuenciador MiSeq de Illumina) y análisis final usando química NexteraXT de Illumina y los cebadores específicos de región v3-v4 de ADNr 16S bacteriano para la generación de amplicones tal como se describió anteriormente (Yanget al.,2016). Se recogieron lecturas de secuenciación emparejadas a partir de un instrumento MiSeq (Illumina), se analizaron y se buscó en las mismas para detectar diversos grupos taxonómicos bacterianos usando un proceso normalizado frente a varias bases de datos de 16S bacteriano apropiadas.

Análisis de citocinas a partir de sangre de ratón mediante ensayo de perlas multiplexado Bioplex de Biorad como medida de compuesto bien tolerado como opción de tratamiento novedosa

Antes de la infección y al final del experimento de tratamiento, se extrajo sangre de ratón a partir de la vena del ojo de unos pocos ratones seleccionados (aproximadamente de 30 a 100 |il por ratón). Posteriormente se separó el plasma sanguíneo a partir de células usando dispositivos de centrifugación de separación (Microvette de litio-heparina de Sarstedt). Se diluyó el plasma en tampón de ensayo Bioplex de Biorad hasta una cuarta parte de la concentración inicial y se midió en el ensayo de citocinas multiplexado basado en perlas 23-Plex BioPlex (Biorad n.° m60009rdpd) según las instrucciones del fabricante y usando los patrones proporcionados. Se midió cada muestra en un volumen total de 50 |il por duplicado.

Ejemplo 2: cribado e identificación de compuestos antiflagelares contra H. pylori

El desarrollo de cribado antiflagelar y establecimiento y mejora de cribado de biblioteca de alto rendimiento identifica numerosos compuestos activos sobre una cepa indicadora de ensamblaje flagelar deH. pylori

Se desarrolló una cepa indicadora de biogénesis flagelar deH. pyloribasándose en una fusión de luciferasa con el promotor flagelarflaAdeH. pylorital como se describió en el ejemplo 1. Debido a la posición del genflaAcomo un denominado “gen tardío” (o gen de “estadio tardío”) en la cascada jerárquica de la regulación de genes flagelares, este constructo indicador puede detectar efectos sobre múltiples rutas diferentes que afectan a la regulación de genes flagelares, ensamblaje y secreción de sustrato (Josenhanset al.,2002; Niehuset al.,2004) que convergen en la inhibición de la motilidad flagelar, lo cual es esencial para el microorganismoin vivo(Lertsettakarnet al.,2011). Se verificó que el constructo indicador presentaba una alta sensibilidad, alta relación señal-ruido (bajo fondo) de 10.000 a 60.000 (determinado en unidades de luminiscencia relativas (ULR)) con un valor de fondo de 5 a 10, y un factor Z de aproximadamente 0,6 a 0,7. Las bacterias de control positivo realizadas en 8 repeticiones por placa no se inhibieron en ningún momento (R2>95 %), lo cual hace que el sistema pueda someterse fácilmente a cribado de medio a alto rendimiento (HTS) (métodos).

Para establecer el cribado en el indicador de luciferasa deH. pylorien formato de cribado de alto rendimiento (HTS, formato de placa de 96 pocillos), se sometieron a prueba aproximadamente 4.000 compuestos contenidos en cinco bibliotecas de compuestos pequeños para determinar efectos dirigidos a la biosíntesis flagelar enH. pylori.

El cribado de las bibliotecas para determinar efectos inhibidores sobre la cepa indicadora flagelarde H. pylori,incluyendo al menos dos repeticiones de cribado biológicas (repeticiones biológicas), verificó que el principio de cribado podía identificar compuestos inhibidores de manera fiable y eficiente. El cribado identificó numerosos compuestos conocidos y no caracterizados que tenían un efecto inhibidor significativo (bioluminiscencia reducida) sobre la cepa indicadora (figura 1A). Aunque muchos compuestos mostraron actividad inhibitoria, algunos compuestos aumentaron la actividad del constructo indicador (bioluminiscencia aumentada) (figura 1A). Un efecto inhibidor observado (bioluminiscencia reducida en comparación con el control) en el ensayo de luciferasa (cribado primario) indica que un compuesto de prueba tiene un efecto antiflagelar y/o un efecto bactericida.

Se realizó un cribado inverso para determinar la inhibición del crecimiento, también en placas de múltiples pocillos, que demostró que el cribado primario también detectó varios compuestos que tenían efectos tanto inhibidores del crecimiento así como antiflagelares. El cribado inverso también identificó compuestos que mostraron exclusivamente efectos inhibidores en el cribado antiflagelar. Algunos compuestos (incluyendo antibióticos conocidos) no mostraron ningún efecto en el cribado antiflagelar, lo cual verificó que el cribado es específico para determinados efectos celular y no detecta de manera general compuestos antibacterianos. En conjunto, aproximadamente el 6 % de todos los compuestos cribados mostraron actividad (inhibición >30 %) en el cribado indicador de luminiscencia flagelar primario (figura 1B). Se identificó que aproximadamente el 1%de los compuestos activos totales sólo tenían efectos inhibidores sobre la actividad luciferasa indicadora, pero no mostraron un efecto antibacteriano directo (bacteriostático y/o bactericida).

Numerosos compuestos activos novedosos tienen efectos antiflagelares y antivitales combinados sobre H.pylori in vitro

A continuación, se determinaron los valores de CI<50>para la inhibición de la luminiscencia y la viabilidad para un panel de compuestos seleccionados que se encontró que tenían una actividad inhibitoria en el cribado primario. Se identificó un amplio intervalo de valores de CI<50>para los diferentes compuestos (tabla 1, figura 2, figura 3). Muchos compuestos activos de los cribados de luciferasa (en promedio, el 80 % de todos los compuestos activos) también tenían un efecto antibacteriano/antiviabilidad (datos propios no publicados, y DZIF/Haas, comunicación personal). Por tanto, se determinaron valores de CIM/CBM para un panel seleccionado de compuestos fuertemente inhibidores principalmente de la biblioteca gamma, recopilada en los enfoques de cribado y que también contiene clases de compuestos terapéuticamente activos conocidos, incluyendo antibióticos conocidos. Esta metodología confirmó que la mayoría de los compuestos inhibidores activos previamente seleccionados, que se sometieron adicionalmente a prueba en detalle, ejercían un efecto bactericida o bacteriostático sobre H.pyloria diversas concentraciones (tabla 1). Se determinó que varios compuestos mostraban bajos valores de CIM/CBM, lo cual los destacó para estudios antibacterianos adicionales. Sin embargo, de manera importante, algunos otros compuestos de diversas bibliotecas no mostraron actividad antibacteriana, lo cual los identificó para estudios adicionales sobre sus efectos antiflagelares (tabla 3).

Los compuestos activos antiflagelares novedosos ejercen efectos específicos deH. pylori

En vez de desarrollar un compuesto antibacteriano de amplio espectro, el objetivo de este estudio era identificar compuestos que seleccionan como diana específicamenteH. pylori.En primer lugar, se verificó que los efectos de compuestos no eran específicos de cepa para una única cepa deH. pylorisometiendo a prueba una segunda cepa deH. pylori(P12). Los efectos de compuestos cuantitativos (CIM/CBM) fueron similares para ambas cepas (tabla 1).

Después, se sometió a prueba un panel de 12 compuestos activos previamente seleccionados a partir de la biblioteca beta según el criterio de que mostraron >= 90 % de reducción de la actividad de luminiscencia, para determinar su actividad antibacteriana frente a otras bacterias, incluyendoC. jejuniyE. coliusando un ensayo para la determinación de la inhibición respiratoria y CIM/CBM. Se observaron efectos antibacterianos muy débiles con siete de los compuestos seleccionados sobre C.jejuni,y con tan sólo un compuesto sobreE. coli(tabla 2). Por tanto, puede concluirse que los compuestos seleccionados identificados en el cribado antiflagelar deH. pyloriactúan de manera más bien selectiva sobreH. pyloriy no sobre otras especies bacterianas.

Identificación de compuestos antiflagelares contraH. pylorique no tienen efectos antivitales (antibiótico clásico) y selección/caracterización de compuestos bloqueadores de patógenos activos para investigaciones adicionales

Algunos compuestos identificados en el cribado primario no tenían ningún efecto antibacteriano tal como se evaluó mediante cualquiera de la prueba metabólica (ensayo de inhibición respiratoria), ensayo de contenido en ATP (BacTiter Glo) o ensayo de CIM. Un pequeño número de compuestos sólo modularon la actividad de luminiscencia en el ensayo dirigido a flagelos y no mostraron ningún efecto inhibidor en ningún otro ensayo antibacteriano secundario. Los compuestos seleccionados de estos compuestos activos se sometieron adicionalmente a prueba en ensayos de motilidad microscópicos enH. pylori(tal como se describió en el ejemplo 1). Dos compuestos modificaron directamente la motilidad a bajas concentraciones, ambos reduciendo la velocidad de motilidad tras un breve tiempo de incubación (entre 5 y 15 min), y cambiando los patrones de motilidad (número de paradas/inversiones) (figura 3), lo cual indicó que estos compuestos se dirigen de manera selectiva contra funciones asociadas con la motilidad y pueden representar bloqueadores de patógenos activos. Posteriormente, se seleccionó un compuesto prometedor (compuesto activo 2/BL2; tabla 3), que no mostró efectos antibacterianos clásicos (CIM > 256 |ig/ml) y tenía una CI<50>baja de 2,75 |ig/ml (figura 2) en el ensayo de luciferasa, para investigaciones adicionales. Este compuesto también redujo las cantidades de la flagelina principal, FlaA (subunidad de proteína principal de orgánulos de motilidad/flagelos), tal como se muestra en la figura 6.

Ejemplo 3: evaluación preclínica in vivo de compuesto antimotilina BL2

El bloqueador de patógenos BL2 antiflagelar y no antimetabólico conduce a una reducción sustancial de la colonización cuando se administra terapéuticamente en un modelo de ratón preclínico deH. pyloriy confirma la actividad del principio terapéutico novedoso

Se seleccionó el compuesto BL2 para realizar un modelo de tratamiento preclínico de prueba de principio contra una infección porH. pyloriestablecida, como experimentoin vivoen ratones. Tal como se indicó en el ejemplo 2, se encontró que este compuesto no era tóxico para ratones a dosis por debajo de 60 mg/kg/día, administradas por vía oral, lo cual era un prerrequisito para su uso en un modelo preclínico. Durante toda la duración del experimento, los ratones tuvieron acceso a alimento estéril y agua estéril a voluntad.

Después, se sometió adicionalmente a prueba BL2 para determinar la eficacia terapéutica en un modelo de ratón de infección porH. pyloricrónica (figura 5). Se establecieron seis grupos de ratones (10 ratones por grupo en cada uno de los cuatro grupos infectados y/o tratados, y seis ratones en ambos de los grupos de control) en este ensayo de tratamiento de ratones. Para los grupos de tratamiento, se infectaron ratones en la semana uno (usando aproximadamente 3*108 bacterias por animal; métodos) y se manifestó la infección crónica durante dos semanas más. El tratamiento una vez al día (sonda intragástrica) comenzó en la semana cuatro en siete días consecutivos. Para los grupos de tratamiento, se evaluaron tres grupos infectados porH. pylorien paralelo. Se administró una dosis de tratamiento diariamente.

El grupo uno se trató únicamente con metronidazol (14,3 mg/kg/día), un antibiótico anti-H.pyloriestablecido. La concentración de antibiótico corresponde a concentraciones usadas de manera rutinaria en el tratamiento de seres humanos. El grupo dos se trató con metronidazol (administrado en dosis a 14,3 mg/kg/día) y BL2 (10 mg/kg/día) en combinación, y el grupo tres recibió únicamente BL2 (10 mg/kg/día). Además, se mantuvo un grupo infectado y tratado de manera simulada como control positivo, y se apartaron dos grupos infectados de manera simulada, uno para administrar únicamente BL2 (10 mg/kg/día; control de compuesto de microbiota) y uno que se infectó de manera simulada y se trató de manera simulada (control nulo de microbiota).

La lectura del tratamiento satisfactorio fue la reducción de las unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias en ratones infectados y tratados, con respecto a ratones infectados no tratados, al final del experimento. Se determinó una actividad terapéutica significativa para el compuesto BL2 contraH. pylori,con una reducción estadísticamente significativa de recuentos de ufc en el antro para el grupo infectado tratado con BL2 en comparación con el control infectado (figura 5). El cuerpo también mostró una tendencia hacia ufc reducidas en los animales infectados y tratados, pero esta tendencia no fue estadísticamente significativa. Tal como se esperaba, el grupo de metronidazol sólo y el grupo de tratamiento combinado con metronidazol y BL2 también tuvieron recuentos bacterianos significativamente reducidos en comparación con el control infectado (figura 5A,B). Todos los ratones en el grupo de control positivo infectado se colonizaron (tanto recuentos de ufc como positivos mediante PCR), aunque los recuentos de ufc en tres animales positivos fueron bastante bajos.

Cuando se sometió a prueba para determinar la presencia de bacterias residuales en homogeneizados de estómago de ratones negativos para ufc usando PCR específica de gen (tal como se describe en métodos; véase el ejemplo 1), se encontró que, tras el tratamiento con metronidazol, o tras el tratamiento de combinación de antibiótico más compuesto BL2, todos los ratones todavía tenían una señal bacteriana específica detectable (PCR) en sus estómagos (dos semanas tras el tratamiento; figura 7A). La secuenciación de Sanger de la señal de PCR específica tras la purificación de ADN reveló secuencias génicas deH. pyloricorrectas(cagL;figura 7B) para todas estas bandas amplificadas mediante PCR. Sorprendentemente, el grupo de ratones infectados a los que se les había administrado únicamente BL2 tenían una fuerte reducción de la señal de PCR específica de gen a las dos semanas tras el tratamiento en todos salvo dos ratones (figura 7A).

La evaluación de histopatología de todos los grupos de ratones infectados, con o sin tratamiento, no mostró ninguna patología de estómago elevada en ninguno de los animales, tal como se había observado anteriormente con todos los modelos de ratón deH. pylori,debido a causas biológicas desconocidas que generalmente limitan la patología porH. pylorien el ratón.

La patología también puede ser variable en seres humanos y, por tanto, no es una lectura adecuada. Por tanto, dado que el punto distintivo del modelo usado en este caso es la reducción de las ufc bacterianas y no la patología, esto no cambia la interpretación del desenlace de tratamiento positivo.

El principio terapéutico novedoso se tolera bien en el modelo preclínico: la composición de microbiota fecal y las citocinas en plasma no se ven significativamente alteradas por un compuesto antiflagelar terapéuticamente eficaz en el modelo de ratón de infección porH. pyloriy tratamiento

A partir del estudio de tratamiento de ratones experimental, se recogieron bolitas fecales de todos los grupos de ratones al final del experimento (antes de la autopsia) con el fin de evaluar la influencia de la infección porH. pylorisola o de la administración de compuesto terapéutico sobre la composición de microbiota fecal de todos los animales.

Se analizó la microbiota mediante secuenciación de amplicones de ARNr 16S de microbiota fecal de las regiones variables V3-V4.

El compuesto activo BL2 por sí solo no ejerció una influencia notable sobre la composición o riqueza de la microbiota fecal (figura 5C) (tabla 5). Además, la infección porH. pyloripor sí sola, o una combinación de infección y administración de compuesto, no condujo a una diferencia notable en ninguna de las muestras de muestras microbiota fecal en comparación con los grupos de control negativo en el ensayo de tratamiento (figura 5C) (tabla 5). Las pruebas de plasma de ratón a partir del ensayo de tratamiento para detectar la producción de citocinas sistémicas en la sangre mediante prueba de perlas multiplexada (métodos) no revelaron ningún cambio significativo en las cantidades de citocinas en la sangre en los grupos de control, los grupos infectados y los grupos tratados con compuesto y/o antibiótico (figura 7).

En este caso, los presentes inventores desarrollaron un potente sistema de cribado basado en luciferasa para detectar diversos efectos antiflagelares y antimotilidad contraH. pylori,y lo establecieron para aplicarlo en placas de 96 o 384 pocillos. Usando este ensayo de cribado, se identificaron numerosos compuestos activos que tenían fuertes efectos antibacterianos y/o antiflagelares sobreH. pylori.Varios compuestos activos primarios tenían bajos valores de CIM antibacteriana (muy eficaces) y actuaban sobreH. pyloria diferentes niveles, probablemente mediante inhibición metabólica. Además, se identificaron algunos compuestos prometedores que no inhibían la viabilidad deH. pylorien absoluto, sino que exclusivamente inhibían en el cribado flagelar y ensayos de inhibición de la motilidad.

La aplicación terapéutica del compuesto antimotilidad selectivo BL2 (junto con su análogo BL2a, ambos denominados antimotilina), identificados mediante el enfoque de cribado selectivo, no fue activa contra H.pyloride una manera antibacteriana clásica (antibiótica). En un modelo de ratón deH. pyloripreclínico de infección crónica, BL2 fue significativamente eficaz en la reducción de cargas bacterianas, tanto en el cuerpo gástrico como en el antro. También redujo la detección bacteriana molecular en el estómago mediante PCR a las 2 semanas tras el tratamiento por debajo de los niveles de detección, en contraposición a la terapia con antibiótico individual usando metronidazol, que no dejó ningún recuento bacteriano en el mismo punto de tiempo, pero en el que todavía podían detectarse fácilmente bacterias mediante PCR. Esto es un resultado prometedor para el principio novedoso, que motiva inversiones adicionales en el concepto terapéutico de bloqueadores de patógenos antimotilina contraH. pylori.

Los resultados notificados en este caso usando el nuevo principio antimotilidad (antimotilina) y antivirulencia contraH. pylorien el modelo de animal proporcionan un punto de partida prometedor para una nueva clase de terapia de combinación o incluso individual contraH. pylori.Estos resultados también indican que la actividad antibiótica de compuestos contraH. pyloriimpone una fuerte presión selectiva y tiempos de supervivencia bacteriana más prolongados en el estómago, lo cual, a lo largo del tiempo de persistencia, puede conducir a aumentar el desarrollo de resistencia bacteriana y una probabilidad superior de recidiva. En cambio, el compuesto antimotilidad proporciona un aclaramiento más rápido de las bacterias a partir del estómago, lo cual era claramente visible mediante PCR a las 2 semanas tras el tratamiento. Además, la dosis terapéutica del compuesto bloqueador de patógenos no alteró la composición o riqueza de microbiota de la microbiota intestinal residente después de una semana de intervención terapéutica diaria, lo cual puede indicar que el principio terapéutico novedoso se tolera bien con menos efectos secundarios prominentes sobre la microbiota gastrointestinal.

En conclusión, los presentes inventores desarrollaron un tipo novedoso de cribado antimotilidad e identificaron compuestos bloqueadores de patógenos prometedores (antimotilinas) que parecen ser específicamente activos sobre una infección por H.pyloricrónica. Parece que merece la pena aplicar el ensayo de cribado antimotilidad a colecciones de compuestos más grandes, y validar adicionalmente el enfoque terapéutico novedoso de inhibición de la motilidad de la infección porH. pyloricrónica como terapia antivirulencia específica.

Ejemplo 4: variantes de compuestos activos adicionales

Empezando a partir del compuesto activo 2 (BL2), identificado mediante el método de cribado dado a conocer en el presente documento como compuesto principal inicial, los presentes inventores diseñaron y sintetizaron las siguientes variantes/derivados de compuesto adicionales. La síntesis química, purificación y caracterización estructural (mediante espectroscopía de 1D-RMN) de los compuestos se describen en el ejemplo 5, a continuación.

La actividad antiflagelar/antimotilidad de estos compuestos adicionales se confirmó aplicando los compuestos en el ensayo indicador deH. pyloribasado en luciferasa dado a conocer en el presente documento (usando la cepa N6 indicadora de luciferasaflaAdeH. pylori).Los compuestos y sus valores de CI<50>determinados respectivos se presentan en la tabla 6, a continuación.

Tal como resulta evidente a partir de los datos de CI<50>obtenidos (tabla 6), esencialmente todas las variantes/derivados de compuestos sometidos a prueba (con excepción de los compuestos DJ-3 y DJ-4) tienen actividad inhibitoria y con valores de CI<50>comparables tal como se determina para el compuesto principal inicial, compuesto activo 2 (BL2). Entre las variantes sometidas a prueba, los compuestos DJ-1, -2, -5, -6, -7, -8, -9 y -12 tienen una alta potencia inhibitoria teniendo todos ellos valores de CI<50><4,5 |ig/ml; y teniendo el compuesto DJ-2 la CI<50>determinada más baja de 0,44 |ig/ml indicativa de una actividad inhibitoria particularmente alta. Los compuestos DJ-10 y DJ-11 eran ligeramente menos activos con valores de CI<50>determinados de 10,83 |ig/ml y 10,56 |ig/ml, respectivamente, y teniendo todavía los compuestos DJ-13 y DJ-14 una actividad inhibitoria detectable pero más débil. No pudo detectarse ninguna actividad inhibitoria para los compuestos DJ-3 y DJ-4, probablemente debido a diferencias significativas en sus estructuras químicas.

Tabla 6:

ID de compuesto^ | pseudónimo | CI<50>*

Pruebas adicionales para determinar posibles efectos antiviabilidad en un ensayo secundario:

Para pruebas adicionales, todas las nuevas variantes de compuesto que demostraron actividad inhibitoria en el ensayo de luciferasa flaA primario (es decir, DJ-1 (= compuesto activo 2a sintetizado de nuevo), DJ-2, DJ-5, DJ-6, DJ-7, DJ-8, DJ-9, DJ-10, DJ-11, DJ-12, y DJ-13), se sometieron a prueba para determinar la actividad antibacteriana sobreH. pylori(cepa N6) en un ensayo secundario (ensayo de crecimiento) monitorizando la DO<600>como sustituto de la proliferación bacteriana a lo largo del tiempo, a concentraciones de 20 |ig/ml.

Sorprendentemente, en este ensayo secundario, ninguno de los compuestos indicados mostró ninguna actividad antibacteriana clásica (antibiótica - bactericida o bacteriostática) y, por tanto, no inhibieron la proliferación deH. pylori, indicando que todos estos derivados del compuesto activo 2a también actúan exclusivamente como inhibidores de la motilidad bacteriana sin afectar a la viabilidad.

Ejemplo 5: síntesis química

Se disolvieron 1,0 mmol de la hidrazina respectiva o su clorhidrato respectivo y 1 mmol de acetoacetato de etilo en 2 ml de ácido acético en un tubo sellado. Después se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiental durante 3 h. Después se agitó la mezcla de reacción a 100°C durante 3 h y después a 80°C durante 15 h. Después de enfriarse, se disolvió la mezcla de reacción en acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con disolución saturada de NaHCO<3>una vez y se separaron las fases. Se secó la fase orgánica sobre Na<2>SO<4>, se filtró y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de fase normal pero no pudo purificarse completamente. Se usó el producto bruto sin purificación adicional.

Ejemplo 5.1: 5-metil-2-(p-tolil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A1.1

Rendimiento: 101 mg (54%)

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 2,22 (s, 3H, CH<3>), 2,36 (s, 3H, CH<3>), 7,27 (dd, 2H,J= 8,7 Hz,J= 0,6 Hz, 2x CH), 7,46 (d, 2H,J= 8,5 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,18 min, m/z 189 [M+H]+

Ejemplo 5.2: 2-(3,5-dimetilfenil)-5-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A1.1

Rendimiento: 112 mg

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 2,22 (s, 3H, CH<3>), 2,34 (s, 6H, 2x CH<3>), 6,94-6,97 (m, 1H, CH), 7,20-7,24 (m, 2H, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,51 min, m/z 203 [M+H]+

Ejemplo 5.3: 2-(4-isopropilfenil)-5-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A1.1

Rendimiento: 147 mg

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 1,27 (d, 6H,J= 6,9 Hz, 2x CH<3>), 2,22 (s, 3H, CH<3>), 2,94 (sept., 1H,J= 6,9 Hz, CH), 7,33 (d, 2H,J= 8,5 Hz, 2x CH), 7,50 (d, 2H,J= 8,5 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,51 min, m/z 203 [M+H]+

Procedimiento A1.2

Ar ^NHü

clorh

oidrato

base libre

Se disolvieron 1,0 mmol de la hidrazina o su clorhidrato respectivo y 1 mmol de su clorhidrato respectivo en 2 ml -4 ml de ácido acético en un tubo sellado. La mezcla de reacción estuvo a 110°C durante 16 h. Después de enfriarse, se disolvió la mezcla de reacción en acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con disolución saturada de NaHCO<3>una vez. Se secó la fase orgánica sobre Na<2>SO<4>, se filtró y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de fase normal pero no pudo purificarse completamente. Se usó el producto bruto sin purificación adicional.

Ejemplo 5.4: 2-([1,1 '-bifenil]-4-il)-5-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A1.2

Rendimiento: 117 mg

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 2,25 (s, 3H, CH<3>), 7,33-7,37 (m, 1H, CH), 7,42-7,48 (m, 2H, 2x CH), 7,62-7,66 (m, 2H, 2x CH), 7,72 (s, 4H, 4x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,58 min, m/z 251 [M+H]+

Ejemplo 5.5: 2-(4’-clorofenil)-5-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A1.2

Rendimiento: 133 mg

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 2,22 (s, 3H, CH<3>), 7,44 (d, 2H,J= 8,9 Hz, CH), 7,64 (d, 2H,J= 8,9 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,37 min, m/z 209 [M+H]+

Ejemplo 5.6: 5-metil-2-(4’-(trifluorometil)fenil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A1.2

Rendimiento: 198 mg

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 5= 2,24 (s,3H, CH<3>), 7,74 (d, 2H,J =8,6 Hz, 2x CH), 7,90 (d, 2H,J = 8,5 Hz, 2xCH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,60 min, m/z 243 [M+H]+

Procedimiento A2

Se llevó a cabo la reacción bajo atmósfera de argón usando la técnica de Schlenk. Se disolvieron 1,0 eq de la pirazolidinona respectiva y un exceso de yodometano a partir de al menos 7,5 eq en 2 ml de acetonitrilo anhidro. Después se agitó la reacción durante 2 h a 110°C y después se agitó durante 12 h a de 90°C a 110°C. Después de enfriarse hasta temperatura ambiental, se disolvió la mezcla en acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con disolución saturada de NaHCO<3>una vez. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa una vez con acetato de etilo. Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na<2>SO<4>, se filtraron y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de fase normal.

Ejemplo 5.7: 1,5-dimetil-2-(p-tolil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A2

Rendimiento: el 35 % a lo largo de dos etapas (69 mg)

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 5 = 2,29 (d, 3H,J= 0,7 Hz, CH<3>), 2,41 (s, 3H, CH<3>), 3,18 (s, 3H, CH<3>), 5,34 (s, 1H, CH) 7,23 (d, 2H,J= 8,3 Hz, 2x CH), 7,35 (d, 2H,J= 8,0 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,15 min, m/z 203 [M+H]+

Ejemplo 5.8: 1,5-dimetil-2-(3',5'-dimetilfenil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A2

Rendimiento: el 43 % a lo largo de dos etapas (69 mg)

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 5 = 2,29 (d, 3H,J= 0,8 Hz, CH<3>), 2,37 (s, 3H, CH<3>), 2,37 (s, 3H, CH<3>), 3,18 (s, 3H, CH<3>), 5,03 (s, 1H, CH), 6,94-6,97 (m, 2H, 2x CH), 7,09-7,12 (m, 1H, CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,26 min, m/z 217 [M+H]+

Ejemplo 5.9: 2-(4'-isopropilfenil)-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A2

Rendimiento: el 48 % a lo largo de dos etapas (110 mg)

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 1,29 (d, 6H,J= 7,0 Hz, 2x CH<3>), 2,30 (s, 3H, CH<3>), 2,99 (sept., 1H,J= 7,0 Hz, CH), 5,35 (s, 1H, CH), 7,27 (d, 2H,J= 8,5 Hz, 2x CH), 7,42 (d, 2H,J= 8,2 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,36 min, m/z 231 [M+H]+

Ejemplo 5.10: 2-([1',1 ”-bifenil1-4’-il)-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A2

Rendimiento: el 30 % a lo largo de dos etapas (77 mg)

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 2,32 (s, 3H, CH<3>), 3,21 (s. 3H, CH<3>), 5,39 (s, 1H, CH), 7,36-7,39 (m, 1H, CH), 7,44 (d, 2H,J= 8,6 Hz, 2x CH), 7,45-7,48 (m, 2H, 2x CH), 7,65-7,68 (m, 2H, 2x CH), 7,79 (d, 2H, J= 8,6 Hz, 2x CH) ppm. Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,45 min, m/z 265 [M+H]+

Ejemplo 5.11: 2-(4'-clorofenil)-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A2

Rendimiento: el 38 % a lo largo de dos etapas (83 mg)

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4): 8 = 2,30 (s, 3H, CH<3>), 3,18 (s 3H, CH<3>), 5,37 (s, 1H, CH), 7,36 (d, 2H,J= 8,9 Hz, 2x CH), 7,54 (d, 2H,J= 8,9 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,19 min, m/z 223 [M+H]+

Ejemplo 5.12: 1,5-dimetil-2-(4’-(trifluorometil)fenil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A2

Rendimiento: el 30 % (83 mg)

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 2,33 (d, 3H,J= 0,8 Hz, CH<3>), 3,20 (s, 3H, CH<3>), 5,41 (s, 1H, CH), 7,58 (d, 2H,J= 8,3 Hz, 2x CH), 7,83 (d, 2H,J= 8,4 Hz, 2x CH) ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,35 min, m/z 257 [M+H]+

Procedimiento A3

Se llevó a cabo la reacción bajo atmósfera de argón usando la técnica de Schlenk. Se disolvió 1,0 eq de la pirazolidinona metilada respectiva en diclorometano anhidro y se enfrió la disolución hasta 0°C. Posteriormente se añadió 1,0 eq de N-bromsuccinimida (NBS) a lo largo de 2 h. Se agitó adicionalmente la reacción durante media hora a 0°C y después se calentó hasta temperatura ambiental. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiental durante 1 h. Se eliminó el disolvente a presión reducida. Se disolvió la materia prima en acetato de etilo y se lavó la fase orgánica tres veces con disolución saturada de NaHCO<3>y dos veces con agua. Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na<2>SO<4>, se filtraron y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se usó el producto bruto sin purificación adicional.

Ejemplo 5.13: 4-bromo-1,5-dimetil-2-(p-tolil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A3

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,43 min, m/z 295 y 297 [M+H]+

Ejemplo 5.14: 4-bromo-2-(3',5'-dimetilfenil)-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A3

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,31 min, m/z 281 y 283 [M+H]+

Ejemplo 5.15: 4-bromo-2-(4'-isopropilfenil)-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A3

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,56 min, m/z 309 y 311 [M+H]+ Ejemplo 5.16: 2-([1’,1”-bifenil]-4’-il)-4-bromo-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A3

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,62 min, m/z 343 y 345 [M+H]+ Ejemplo 5.17: 4-bromo-2-(4’-clorofenil)-1,5-dimetil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A3

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,43 min, m/z 301 y 303 y 305 [M+H]+ Ejemplo 5.18: 4-bromo-1,5-dimetil-2-(4’-(trifluorometil)fenil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A3

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,54 min, m/z 335 y 337 [M+H]+ Procedimiento A4

Se llevó a cabo la reacción bajo atmósfera de argón usando la técnica de Schlenk. Se disolvió 1,0 eq de la pirazolidinona mono-bromada respectiva en diclorometano anhidro y se enfrió la disolución hasta 0°C. Se añadió 1,0 eq de bromo, disuelto en diclorometano anhidro, gota a gota a lo largo de 2 h. Se calentó la reacción hasta temperatura ambiental y se mantuvo a la misma durante 1,75 h. Se diluyó la reacción con NaHCO<3>saturado. Se separaron las fases y se extrajo la acuosa dos veces con diclorometano. Se eliminó el disolvente de las fases orgánicas combinadas a presión reducida. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de fase normal pero no pudo purificarse completamente. Se usó el producto bruto sin purificación adicional.

Ejemplo 5.19: 4-bromo-5-(bromometil)-1-metil-2-(p-tolil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A4

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,48 min, m/z 317 (intensidad del 100 %) [M+H]+

Ejemplo 5.20: 4-bromo-5-(bromometil)-2-(3',5'-dimetilfenil)-1-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A4

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,62 min, m/z 331 (intensidad del 100 %) [M+H]+

Ejemplo 5.21: 4-bromo-5-(bromometil)-2-(4'-isopropilfenil)-1-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A4

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,70 min, m/z 389 (intensidad del 100 %) [M+H]+

Ejemplo 5.22: 2-([1',1”-bifenil]-4'-il)-4-bromo-5-(bromometil)-1-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A4

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,72 min, m/z 423 (intensidad del 100 %) [M+H]+

Ejemplo 5.23: 4-bromo-5-(bromometil)-2-(4’-clorofenil)-1-metil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A4

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,53 min, m/z 381 (intensidad del 100 %) [M+H]+

Ejemplo 5.24: 4-bromo-5-(bromometil)-1-metil-2-(4’-(trifluorometil)fenil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona

Sintetizada según el procedimiento A4

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,65 min, m/z 415 (intensidad del 100 %) [M+H]+ Procedimiento A5.1

Se disolvieron 1,0 eq de la pirazolidinona mono-bromada respectiva y 1,0 eq de tiourea en etanol en un tubo sellado. Se calentó la mezcla de reacción hasta 80°C y se agitó a esta temperatura durante 1 h. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiental y después se agitó a temperatura ambiental durante 12 h. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se purificó el producto bruto resultante mediante HPLC. Tras liofilizarse, se aisló el producto como un sólido incoloro, formando una sal de TFA.

Procedimiento A5.2

Se disolvieron 1,0 eq de la pirazolidinona mono-bromada respectiva y 1,0 eq de tiourea en etanol en un tubo sellado. Se calentó la mezcla de reacción hasta 80°C y se agitó a esta temperatura durante 1,5 h. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiental. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se purificó el producto bruto resultante mediante HPLC. Tras liofilizarse, se aisló el producto como un sólido incoloro, formando una sal de TFA. Ejemplo 5.25: carbamimidotioato de (4-bromo-2-metil-5-oxo-1-(p-tolil)-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo

Sal de TFA

Sintetizado según el procedimiento A5.2

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4): 8 = 2,42 (s, 3H, CH<3>), 3,30 (s, 3H, CH<3>), 4,62 (s, 2H, CH<2>), 7,26 (d, 2H,J= 8,3 Hz, 2x CH), 7,39 (d, 2H,J= 8,3 Hz, 2x CH) ppm.

19F-RMN (500 MHz, metanol-d4): 8 = -77,0 (s, F<3>CCOOH) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4): 8 =21,3, 27,4, 36,4, 90,3, 127,7, 131,5, 132,0, 141,2, 149,0, 162,8, 170,3 ppm. Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 0,40 min, m/z 355 y 357 [M+H]+

Ejemplo 5.26: carbamimidotioato de (4-bromo-1-(3',5'-dimetilfenil)-2-metil-5-oxo-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo

Sal de TFA

Sintetizado según el procedimiento A5.2

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 2,38 (s, 3H, CH<3>), 2,38 (s, 3H, CH<3>), 3,30 (s, 3H, CH<3>), 4,62 (s, 2H, CH<2>), 6,98 7,01 (m, 2H, 2x CH), 7,15-7,17 (m, 1H, 2x CH) ppm.

19F-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = -77,0 (s, F<3>CCOOH) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 21,4, 27,4, 36,5, 90,5, 125,3, 132,0, 134,4, 141,2, 149,3, 162,8, 170,3 ppm. Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 0,84 min, m/z 369 y 371 [M+H]+

Ejemplo 5.27: carbamimidotioato de (4-bromo-1-(4'-isopropilfenil)-2-metil-5-oxo-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo

Sal de TFA

Sintetizado según el procedimiento A5.2

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = 1,29 (d, 6H,J= 6,9 Hz, CH<3>), 3,00 (sept., 1H,J= 6,9 Hz, CH), 3,31 (s, 3H, CH<3>), 4,62 (s, 2H, CH<2>), 7,31 (d, 2H,J= 8,4 Hz, 2x CH), 7,45 (d, 2H,J= 8,3 Hz, 2x CH) ppm.

19F-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = -77,0 (s, F<3>CCOOH) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 24,4, 27,4, 35,4, 36,4, 90,4, 118,0 (q,J= 291 Hz), 127,9, 129,0, 132,1, 149,1, 152,0, 162,5 (q,J= 36 Hz), 162,8, 170,3 ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 0,98 min, m/z 383 y 385 [M+H]+

Ejemplo 5.28: carbamimidotioato de (1-([1’,1”-bifenil]-4’-il)-4-bromo-2-metil-5-oxo-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo

Sal de TFA

Sintetizado según el procedimiento A5.1

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 3,36 (s, 3H, CH<3>), 4,65 (s, 2H, CH<2>), 7,38-7,42 (m, 1H, CH), 7,46-7,51 (m, 4H, 4x CH), 7,65-7,69 (m, 2H, 2x CH), 7,81-7,85 (m, 2H, 2x CH) ppm.

19F-RMN (500 MHz, metanol-d4) 8 = -77,0 (s, F<3>CCOOH) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 27,5, 36,8, 91,0, 127,7, 128,3, 129,3, 129,4, 130,3, 133,8, 141,1, 143,5, 150,2, 163,0, 170,3 ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,08 min, m/z 417 y 419 [M+H]+

Ejemplo 5.29: carbamimidotioato de (4-bromo-1-(4’-clorofenil)-2-metil-5-oxo-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo

Sal de TFA

Sintetizado según el procedimiento A5.1

1H-RMN (700 MHz, metanol-d4) 8 = 3,30 (s, 3H, CH<3>), 4,63 (s, 2H, CH<2>), 7,40 (d, 2H,J= 8,8 Hz, 2x CH), 7,58 (d, 2H,J= 8,8 Hz, 2x CH) ppm.

19F-RMN (500 MHz, metanol-d4) 5= -77,0 (s,F<3>CCOOH) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4) 5 = 27,5, 36,9, 91,4, 118,2 (q,J = 292 Hz,CF<3>COOH), 128,6, 131,0, 133,6, 135,8, 151,0, 162,8, 163,1, 170,3 ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 0,56 min, m/z 375 y 377 (int. del 100 %) y 379 [M+H]+

Ejemplo 5.30: carbamimidotioato de (4-bromo-2-metil-5-oxo-1-(4'-(trifluorometil)fenil)-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo

Sal de TFA

Sintetizado según el procedimiento A5.1

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4): 5 = 3,32 (s, 3H, CH<3>), 4,64 (s, 2H, CH<2>), 7,63 (d, 2H,J= 8,3 Hz, 2x CH), 7,88 (d, 2H,J= 8,4 Hz, 2x CH) ppm.

19F-RMN (500 MHz, metanol-d4): 5 = -77,0 (s, F<3>CCOOH), -64,1 (s, CF<3>-Cq) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4): 5 = 27,6, 37,5, 92,5, 118,2 (q,J= 293 Hz, CF<3>COOH), 125,4 (q,J= 272 Hz, CF<3>), 126,4, 127,9 (q, J = 4 Hz, CH), 131,0 (q,J= 33 Hz, Cq), 138,5, 152,8, 152,9, 163,2 (q,J= 33 Hz, CF<3>COOH), 163,2, 170,3 ppm

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 0,92 min, m/z 409 y 411 [M+H]+

Ejemplo 5.31: 5,5’-(tiobis(metilene))bis(4-bromo-1-metil-2-(p-tolil)-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona)

Sintetizada según el procedimiento A5.1

1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 5 = 2,41 (s, 6H, 2x CH<3>), 3,31 (s, 6H, 2x CH<3>), 4,09 (s, 4H, 2x CH<2>), 7,26 (m, 4H, 4x CH), 7,37 (m, 4H, 4x CH) ppm.

13C{1H}-RMN (700 MHz, metanol-d4) 5 = 21,3, 26,9, 36,2, 88,96, 88,98, 127,9, 131,5, 132,2, 141,0, 151,5, 151,6, 163,1 ppm.

Datos de CL/EM de baja resolución (método A): 1,60 min, m/z 591 y 593 y 595 [M+H]+

Se disolvió antipireno (0,94 g, 4,99 mmol) en DCM (10 ml) y se dejó agitar en atmósfera abierta a 0°C. Se añadió NBS (0,889 g, 4,99 mmol) a la disolución en tres porciones a lo largo de 30 min. Tras completarse la adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 30 min. Tras terminarse el tiempo de reacción, se extinguió con disolución acuosa saturada de K<2>CO<3>(30 ml). Se extrajo la mezcla de reacción con acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con agua dos veces y se secó sobre Na<2>SO<4>. Se evaporó la porción orgánica a vacío para obtener el compuesto bruto 4-bromo-1,5-dimetil-2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona 2.

Se disolvió el compuesto 2 (1,22 g, 4,57 mmol) en CCU. Se añadió NBS (70,0 mg, 0,39 mmol) al mismo en 6 porciones a lo largo de 3 h mientras se sometía a reflujo. Se sometió adicionalmente la mezcla de reacción a reflujo durante 4 h. Se filtró el sólido y se extrajo con 1 ml de CCU caliente. Se evaporó el filtrado y se purificó el residuo con acetato de etilo al 60 % en éter de petróleo para dar 4-bromo-5-(bromometil)-1-metil-2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona.

Rendimiento: el 77 % (100 mg)

1H-RMN (400 MHz, m etano l^) 8 = 7,57 (t, 2H,J= 7,6 Hz, 2x CH), 7,49 (t, 1H,J= 7,4 Hz, CH), 7,39 (d, 2H,J= 7,7 Hz, 2x CH), 4,64 (s, 2H, CH<2>Br), 3,35 - 3,22 (m, 3H, CH<3>) ppm.

13C{1H}-RMN (101 MHz, m etano l^) 8 = 148,5, 133,2, 129,4, 128,8, 125,9, 89,5, 35,2, 26,0 ppm.

Ejemplo 5.33: carbamimidotioato de (4-bromo-2-metil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo, 4

4-bromo-5-(bromometil)-1-metil-2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona, 3 (1,1 g, 3,18 mmol) en etanol (8ml) y se añadió tiourea (0,242 g, 3,18 mmol) en etanol (4 ml) a la misma. Se sometió la mezcla de reacción a reflujo durante 1 h. Se evaporó el disolvente y se purificó el sólido mediante HPLC para dar carbamimidotioato de (4-bromo-2-metil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metilo como sal de TFA.

<1>H-RMN (400 MHz, metanol-d<4>): 8 = 7,60 (t, 2H,J= 7,6 Hz, 2x CH), 7,52 (t, 1H,J= 7,4 Hz, CH), 7,42 (d, 2H,J =7,5 Hz, 2x CH), 4,65 (s, 2H, CH<2>), 3,33 (s, 3H, CH<3>) ppm.

13C{1H}-RMN (101 MHz, metanol-d<4>): 8 = 168,7, 161,4, 148,5, 133,2, 129,4, 128,8, 125,9, 89,3, 35,1, 25,9 ppm. HRMS (ESI): calculada para C ^H ^B r^O S ([M+Na]+): m/z 362,9891

medida: m/z 362,9892.

Ejemplo 5.34: 4-bromo-5-(mercaptomet¡l)-1-met¡l-2-fen¡l-1,2-d¡h¡dro-3H-p¡razol-3-ona, 5

Se d¡solv¡ó carbam¡m¡dot¡oato de (4-bromo-2-met¡l-5-oxo-1-fen¡l-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡razol-3-¡l)met¡lo, 4 (90 mg, 0,264 mmol) en h¡dróx¡do de sod¡o acuoso al 10 % (0,5 ml, 0,26 mmol) y se calentó a 40°C durante 2 h. Se enfr¡ó la mezcla de reacc¡ón y se extrajo con DCM (1 ml). Se secó la fase orgán¡ca y se concentró para dar el producto bruto, que se pur¡f¡có med¡ante HPLC para proporc¡onar el compuesto 5.

Rend¡m¡ento: el 13 % (10 mg)

1H-RMN (400 MHz, CDCls): 8 = 7,48 (t, 2H,J= 7,7 Hz, 2x CH), 7,43 - 7,29 (m, 3H, 3x CH), 3,71 (d, 2H,J= 8,0 Hz, CH<2>SH), 3,22 (s, 3H, CH<3>), 2,11 (t 1H,J= 8,0 Hz, SH) ppm.

13C{1H}-RMN (101 MHz, CDCla): 8 = 161,7, 154,1, 133,8, 129,6, 129,5, 128,0, 125,1, 89,5, 36,4, 18,8 ppm.

EM de alta resoluc¡ón (ESI): calculada para C ^H ^B r^O S ([M+Na]+): m/z 320,9673

med¡da: m/z 320,9679.

Ejemplo 5.35: 4-bromo-5-(((2-h¡drox¡et¡l)t¡o)met¡l)-1-met¡l-2-fen¡l-1,2-d¡h¡dro-3H-p¡razol-3-ona, 6

Se añad¡eron 4-bromo-5-(bromomet¡l)-1-met¡l-2-fen¡l-1,2-d¡h¡dro-3H-p¡razol-3-ona, 5 (100 mg, 0,29 mmol) y 2-mercaptoetan-1-ol (20,95 |il, 0,30 mmol) a una suspens¡ón con ag¡tac¡ón de carbonato de potas¡o (100 mg, 0,72 mmol), 18-corona-6 (0,806 |il, 3,78 |imol) y yoduro de potas¡o (1 mg, 6,02 |imol) en acetona anh¡dra. Se somet¡ó la mezcla a reflujo durante 15 h, se enfr¡ó hasta temperatura amb¡ental, se f¡ltró y se concentró a pres¡ón reduc¡da. Después se añad¡ó agua al res¡duo y después se extrajo la mezcla tres veces con d¡et¡l éter. Se lavaron las fases orgán¡cas comb¡nadas con agua (2 ml), d¡soluc¡ón saturada de NaCl (2 ml) y se secaron sobre MgSO<4>. Después se concentró esto a pres¡ón reduc¡da para dar el producto bruto. Se pur¡f¡có el producto bruto med¡ante HPLC para dar 4-bromo-5-(((2-h¡drox¡et¡l)t¡o)met¡l)-1-met¡l-2-fen¡l-1,2-d¡h¡dro-3H-p¡razol-3-ona.

Rendimiento: el 5%(5 mg)

<1>H-RMN (400 MHz, CDCI<3>): 8 = 7,50 (t, 2H,J= 7,6 Hz, 2x CH), 7,39 (t, 3H,J= 8,8 Hz, 3x CH), 3,85 (t, 2H,J= 5,9 Hz, CH<2>OH), 3,79 (s, 2H, CH<2>S), 3,27 (s, 3H, CH<3>), 2,85 (t, 2H,J= 5,9 Hz, CH<2>) ppm.

13C{1H}-RMN (101 MHz, CDCI<3>) 8 = 151,5, 133,7, 129,6, 128,4, 125,5, 60,9, 36,1, 34,7, 25,6 ppm.

MS de alta resolución (ESI): calculada para C-i<3>H-i<5>BrN<2>O<2>S ([M+Na]+): 364,9936

medida m/z 364,9926.

Se sometió una disolución de 4-bromo-5-(bromometil)-1-metil-2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona (467 mg, 1,35 mmol) y 1,3-dioxoisoindolin-2-ida de potasio (250 mg, 1,35 mmol) en acetona (0,54 ml) a reflujo durante 12 h. Se separó el sólido por filtración y se concentró el filtrado a presión reducida. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna con acetato de etilo al 60 % en éter de petróleo para dar 2-((4-bromo-2-metil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metil)isoindolin-1,3-diona como un sólido incoloro.

Rendimiento: el 13 % (70 mg)

Ejemplo 5.37: 5-(aminometil)-4-bromo-1-metil-2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona, 8

A una disolución de 2-((4-bromo-2-metil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-pirazol-3-il)metil)isoindolin-1,3-diona (40 mg, 0,097 mmol) en metanol se le añadió hidrato de hidrazina (0,016 ml, 0,310 mmol) y se agitó la mezcla de reacción durante media hora. Se añadió HCl al 5 % (1 ml) a la mezcla de reacción y se agitó la reacción durante la noche. Se purificó la mezcla de reacción mediante HPLC para dar el producto 5-(aminometil)-4-bromo-1-metil-2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona como una sal de TFA incolora.

Rendimiento del 37 % (10 mg)

<1>H-RMN (400 MHz, metanol^): 5= 7,59(t, 2H,J =7,6 Hz, 2x CH), 7,50 (t, 1H,J = 7,4 Hz,CH), 7,44 (d, 2H,J =7,6 Hz, 2x CH), 4,06 (s, 2H, CH<2>), 3,32 (s, 3H, CH<3>) ppm.

13C{1H}-RMN (101 MHz, metanol-d<4>) 5161,7, 152,1, 133,4, 129,3, 128,6, 126,0, 87,5, 34,8, 34,7 ppm.

MS de alta resolución (ESI): calculada para C ^H ^B r^O ([M+H]+): m/z 282,0242

medida: m/z 282,0243.

Bibliografía:

Fulmeret al.:Fulmeret al.,Organometallics, 2010, 29, 2176-2179

Ejemplo 6:

Las cepas deH. pyloripueden ser genética y fenotípicamente diversas. La cepa de pruebas clínicas principal,H. pyloriN6, es de origen europeo (originalmente aislada en Francia de un paciente con inflamación de estómago/gastritis) y tiene diferencias genéticas fenotípicas con respecto a otros aislados clínicos recogidos a nivel mundial, por ejemplo de origen africano, sudamericano o asiático (referencia Olbermannet al.).Con el fin de verificar si/demonstrar que los compuestos antimotilina dados a conocer en el presente documento también son activos (en cuanto a actividad antimotilidad/antiflagelar) sobre otra cepa deH. pyloriclínicamente relevante que se origina de un trasfondo étnico diferente, los presentes inventores también sometieron a ensayo los compuestos activos primarios identificados, compuesto activo 2 y compuesto activo 2a, en ensayos de indicador de luciferasaflaAcon una cepa indicadora derivada de una segunda cepa deH. pyloride aislado clínico, “L7” (generada tal como se describió para N6 en el ejemplo 1). Este segundo aislado clínico L7 (referencia Olbermannet al.),se origina de Asia y es genéticamente muy distante de la cepa N6. Se modificó nuevamente por ingeniería el indicador de luciferasa flaA-luxAB para expresarse en la cepa L7 y se sometió a ensayo para determinar la inhibición de luciferasa tal como se muestra a continuación. Resultados de la cepa indicadora de flaA-luc del segundo aislado clínico de H. pylori (cepa L7*)

Resultados de Cl del Resultados de Cl del

Se muestran los resultados normalizados (se estableció el valor de luciferasa respectivo más alto al 100 %) de tres clones de la cepa L7 deH. pylori,cepa indicadora de flaA-luxAB; se generó nuevamente la cepa indicadora L7 en consecuencia tal como se describió para la cepa N6 (véase el ejemplo 1). El método de ensayo (ejemplo 1) para la determinación de luciferasa se realizó tal como se describió para la cepa indicadora N6 (ejemplo 1, ejemplo 4). Se muestran para comparación tres clones generados independientemente (clon 1, clon 2, clon 3) de la misma cepa indicadora.

Los dos compuestos sometidos a prueba mostraron actividades similares (CI<50>en intervalos comparables) tanto en la cepa indicadora original N6 flaA-luxAB como en la segunda cepa indicadora L7 flaA-luxAB, confirmando por tanto la aplicabilidad general de la invención para la especieH. pylori.

*una segunda cepa clínica, L7, de origen asiático, que se usó para generar la segunda cepa indicadora de flaA, se menciona en: Olbermann P, Josenhans C, Moodley Y, Uhr M, Stamer C, Vauterin M, Suerbaum S, Achtman M, Linz B., PLoS Genet. 2010; 6(8):e1001069. doi: 10.1371/journal.pgen.1001069.

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Las citas de las patentes, solicitudes de patente, publicaciones y documentos anteriores no es una admisión de que ninguno de los anteriores sea técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de esas publicaciones o documentos. Su cita no es una indicación de una búsqueda de divulgaciones relevantes. Todas las afirmaciones referentes a la(s) fecha(s) o contenido de los documentos se basan en información disponible y no suponen una admisión en cuanto a su precisión o exactitud.

El término “un” o “una” puede referirse a uno o una pluralidad de los elementos que modifica (por ejemplo, “un portador” puede significar uno o más portadores) a menos que quede claro en el contexto que se describe o bien uno de los elementos o bien más de uno de los elementos. El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento se refiere a un valor dentro del 10 % del parámetro subyacente (es decir, más o menos el 10 %), y el uso del término “aproximadamente” al comienzo de una serie de valores modifica a cada uno de los valores (es decir, “aproximadamente 1,2 y 3” se refiere a aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un peso de “aproximadamente 100 gramos” puede incluir pesos de entre 90 gramos y 110 gramos. Además, cuando se describe una lista de valores en el presente documento (por ejemplo, aproximadamente el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 85 % o el 86 %) la lista incluye todos los valores intermedios y fraccionales de los mismos (por ejemplo, el 54 %, el 85,4 %).

En la(s) siguiente(s) reivindicación/reivindicaciones se exponen determinadas realizaciones de la tecnología.

Tabla 1

Tabla 1: actividad antibacteriana comparativa de un panel previamente seleccionado de compuestos activos primarios (A1-A15) descubiertos en un cribado antimotilidad deH. pyloricontra dos cepas deH. pyloridiferentes, N6 y P12. Las pruebas secundarias incluyeron la CI<50>del ensayo de antimotilidad y la CI<50>de pruebas de vitalidad (antirrespiratorias), y la CIM/CBM. Para la segunda cepa, sólo se realizó CIM/CBM, dado que todos salvo un compuesto positivo previamente seleccionado mostraron actividad destructiva contraH. pylori.Las actividades determinadas fueron similares en las dos cepas.

Tabla 1, continuación

Tabla 2

Tabla 2: actividad específica contraH. pylori.Pruebas de actividad antibacteriana comparativa (CIM/CBM) de un panel previamente seleccionado de compuestos activos primarios (A1-A15) contra dos especies bacterianas intestinales diferentes,Campylobacter jejuni(cepa 11168) yEscherichia coli(cepa RP437). Se detectó algo de actividad antibacteriana débil de diversos compuestos activos primarios contra C.jejuni,mientras que no se encontró ninguna actividad antibacteriana contra E.coli.Dado queC. jejunies extremadamente sensible frente al disolvente DMSO, los ensayos seleccionados se realizaron en ausencia de DMSO.

E. coliRP437

Tabla 3

Tabla 3: resultados para cribados deH. pylori(luciferasa y metabólico) de compuestos análogos, compuesto activo 2 (BL2) y compuesto activo 2a (BL2a); CI<50>de ensayo indicador de luciferasa flagelar para el compuesto activo 2 y el compuesto activo 2a. Los valores de > 100% para el ensayo metabólico indican ausencia de inhibición mediante el compuesto sobre el metabolismo bacteriano central. Esto corresponde a valores de CIM de >256, sin inhibición del crecimiento mediante el compuesto (véase el texto principal).

Tabla 4

Tabla 4: orden de grupos de ratones para experimento de tratamiento de prueba de principio en modelo de ratón conH. pyloricrónico para el compuesto pequeño BL2 (compuesto activo 2)

Tabla 5

Tabla 5: AMOVA (Bray-Curtis) de análisis de microbiota de ratones tratados con compuesto activo 2 confirma la ausencia de diferencia significativa de la microbiota

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Compuesto de fórmula (I),

   para su uso en (A) el tratamiento y/o la prevención de una infección bacteriana, en el que la infección bacteriana está provocada por bacterias flageladas seleccionadas deHelicobacter spp.yCampylobacter spp.; (B) el tratamiento de un estado asociado con la infección bacteriana tal como se define en (A), en el que el estado se selecciona de úlcera péptica, gastritis, duodenitis, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT) gástrico, enteritis y enterocolitis; o (C) la prevención de un estado asociado con la infección bacteriana tal como se define en (A), en el que el estado se selecciona de úlcera péptica, gastritis, duodenitis, cáncer gástrico (de estómago), linfoma de MALT gástrico, enteritis y enterocolitis; y en el que en (A) a (C) tiene que administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto a un sujeto que lo necesita, en el que el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, u otro animal; y en el que: (a) X e Y de la fórmula (I) se seleccionan independientemente de N, O y S; (b) R1 es: (b-1) fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más de: (i) alquilo C<1-3>o isopropilo; y/o (ii) X o CX<3>(X se selecciona de Cl, Br, I y F); o (b-2) bifenilo; (c) R2 es CX<3>o CH<2>CX<3>, en el que X se selecciona de H, F, Cl, Br e I; (d) R3 es CH<2>SX, en el que X es H o C(NH)NH<2>; (e) R4 se selecciona de F, CI, Br e I; y (f) R5 es O; y en el que el compuesto de fórmula (I) tiene una actividad antimotilidad sobre las bacterias. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto es de fórmula (II):

   (II), en el que (a) X e Y de la fórmula (II) se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S; (b) R2 es CH<3>o CH<2>CH<3>; (c) R3 es SX, en el que X es H o

   y (d) R4 se selecciona de F, Cl, Br e I; y (e) R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de X o CX<3>(X se selecciona de H, F, Cl, Br e I), etilo, isopropilo o fenilo. Compuesto para su uso según la reivindicación 2, en el que (a) X e Y de la fórmula (II) se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S; (b) R2 es CH<3>o CH<2>CH<3>; (c) R3 es SX, en el que X es H o

   y (d) R4 se selecciona de F, Cl, Br e I; (e) R5 es H o CH<3>; y (f) R6 es X o CX<3>(X se selecciona de H, F, Cl, Br e I), etilo, isopropilo o fenilo. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto es de fórmula (III):

   y (c) R4 se selecciona de F, Cl, Br e I; (d) R5 es H o CH<3>; y (e) R6 es H, X o CX<3>(en el que X es H, F, Cl, Br o I), etilo, isopropilo o fenilo. Compuesto para su uso según la reivindicación 4, en el que (a) R2 es CH<2>CH<3>y R3 es SH; o (b) R2 es CH<3>y R6 es H, X (en el que X es F, Cl, Br o I), CH<3>, etilo, isopropilo o fenilo. Compuesto para su uso según la reivindicación 4 o 5, en el que (a) R2 es CH<2>CH<3>, R3 es SH, y R5 y R6 son cada uno H; o (b) R2 es CH<3>, R3 es SH, y R5 y R6 son cada uno H. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona de:

   Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que laHelicobacter spp.y/o laCampylobacter spp.son (a) bacterias patógenas gastrointestinales; (b) bacterias patógenas gastroduodenales; (c) bacterias patógenas urogenitales; (d) no sensibles a tratamiento con antibióticos; (e)Helicobacter pylori;y/o (f)Campylobacter jejunioCampylobacter coli. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el compuesto tiene que administrarse en combinación, o de manera secuencial, con uno o más agentes adicionales seleccionados de: (a) antibiótico, preferiblemente seleccionado de amoxicilina, penicilina, claritromicina, metronidazol, tetraciclina, tinidazol, rifampina, rifabutina, ciprofloxacina, gemifloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, norfloxacina y ofloxacina u otra fluoroquinolona o quinolona; y/o (b) sal de bismuto, preferiblemente subcitrato de bismuto de potasio; y/o (c) inhibidor de la bomba de protones (PPI), preferiblemente seleccionado de pantoprazol, omeprazol, lansoprazol, esomeprazol, rabeprazol, dexlansoprazol, dexrabeprazol y vonoprazán; y/o (d) inhibidor de ureasa; y/o (e) inhibidor de anhidrasa carbónica, preferiblemente acetazolamida.