ES2990204T3

ES2990204T3 - Procedimientos de aislamiento y utilización de la membrana de Descemet y composiciones que incluyen membrana de Descemet aislada

Info

Publication number: ES2990204T3
Application number: ES19809212T
Authority: ES
Inventors: Joshua Honghan Hou; Peter Bedard; Ching Yuan
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2024-11-29
Anticipated expiration: 2039-10-18
Also published as: EP3867357C0; WO2020081934A1; US20250345484A1; EP3867357B1; EP4491716A2; US20210379246A1; EP4491716A3; US12383655B2; EP3867357A1

Abstract

Esta divulgación describe métodos para preparar una membrana de Descemet descelularizada y una membrana de Descemet aislada, métodos para utilizar una membrana de Descemet aislada y tejidos preparados utilizando una membrana de Descemet aislada. Esta divulgación describe además una composición que incluye una membrana de Descemet aislada. En algunas realizaciones, los tejidos y métodos descritos en este documento pueden utilizarse para tratar una deficiencia de células madre limbares o como un vendaje para la superficie ocular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de aislamiento y utilización de la membrana de Descemet y composiciones que incluyen membrana de Descemet aislada

Datos de la solicitud continua

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 62/747,715, presentada el 19 de octubre de 2018.

Antecedentes

La deficiencia de células madre limbares es una de las principales causas de ceguera corneal en Estados Unidos debido a las limitadas opciones de tratamiento disponibles y al mal pronóstico a largo plazo. Las células madre limbares son una población de células pluripotentes de la superficie ocular que mantienen y regeneran el epitelio vital y transparente de la córnea durante toda la vida. Además de ser transparente, el epitelio corneal es crucial para mantener la avascularidad de la córnea, protegerla de infecciones y mantener una película lagrimal sana sobre la córnea. La pérdida de células madre limbares debida a quemaduras químicas o térmicas; a traumatismos iatrogénicos incluyendo, por ejemplo, el uso excesivo de lentes de contacto, el uso crónico de gotas para el glaucoma o la cirugía ocular; o a una enfermedad autoinmune incluyendo, por ejemplo, el síndrome de Steven Johnson o el penfigoide cicatricial ocular, provoca una incapacidad para regenerar el epitelio corneal normal de la superficie ocular. Esta incapacidad provoca un dolor devastador y ceguera debido a erosiones corneales, cicatrices, derretimiento y conjuntivalización.

Chen et al, (The Journal of Cornea and External Disease vol. 20, no.7, 1 November 2001, p. (731-737) desvela que la membrana de Descemet (de donantes adultos) con células asociadas fue disecada del estroma. Se sembraron células endoteliales en la membrana de Descemet denudada de una segunda córnea donante.

El documento WO 00/47040 A1 describe cómo se extrajo la membrana de Descemet de las córneas de donantes y se eliminaron las células endoteliales adheridas. Se sembraron células endoteliales en la membrana de Descemet denudada y se cultivaron durante varios días.

Sumario de la invención

La invención se describe en las reivindicaciones. En la medida en que en la presente memoria descriptiva se describa otra materia, se incluye únicamente a modo de referencia.

La presente divulgación describe procedimientos de preparación de una membrana de Descemet descelularizada y una membrana de Descemet aislada, procedimientos de utilización de una membrana de Descemet aislada y tejidos preparados mediante el uso de una membrana de Descemet aislada. Esta divulgación describe además una composición que incluye una membrana de Descemet aislada. En algunas realizaciones, los tejidos y procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva pueden utilizarse para tratar una deficiencia de células madre limbares o como vendaje de la superficie ocular.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento que incluye eliminar el endotelio de una membrana de Descemet de una córnea para proporcionar una membrana de Descemet descelularizada y separar la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea para obtener una membrana de Descemet aislada y utilizar la membrana de Descemet aislada para apoyar la proliferación in vitro de células madre límbicas en la superficie anterior de la membrana de Descemet aislada.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que incluye una membrana de Descemet aislada, en la que la membrana de Descemet ha sido descelularizada y separada del estroma corneal y que comprende una o más células madre límbicas en contacto con la superficie anterior de la membrana de Descemet aislada.

Las palabras "preferente" y "preferentemente" se refieren a realizaciones de la invención que pueden proporcionar ciertas ventajas, en determinadas circunstancias. Sin embargo, también pueden preferirse otras formas de realización, en las mismas circunstancias o en otras. Además, la recitación de una o más realizaciones preferentes no implica que otras realizaciones no sean útiles y no pretende excluir otras realizaciones del alcance de la invención.

Los términos "comprende" y sus variaciones no tienen un significado limitativo cuando estos términos aparecen en la descripción y las reivindicaciones.

A menos que se especifique lo contrario, "un", "una", "el" y "al menos uno" se utilizan indistintamente y significan uno o más de uno.

También en la presente memoria descriptiva, las recitaciones de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números subsumidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

Para cualquier procedimiento desvelado en la presente memoria descriptiva que incluya etapas discretas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden factible. Y, según convenga, cualquier combinación de dos o más etapas puede llevarse a cabo simultáneamente.

El sumario anterior de la presente invención no pretende describir cada realización divulgada o cada implementación de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más particularmente realizaciones ilustrativas. En varios lugares de la aplicación, se ofrece orientación por medio de listas de ejemplos, que pueden utilizarse en diversas combinaciones. En cada caso, la lista recitada sirve sólo como grupo representativo y no debe interpretarse como una lista exclusiva.

La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización", "ciertas realizaciones" o "algunas realizaciones", etc., significa que un rasgo, configuración, composición o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización de la divulgación. Por lo tanto, las apariciones de tales frases en varios lugares a lo largo de esta especificación no se refieren necesariamente a la misma realización de la divulgación. Además, los rasgos, configuraciones, composiciones o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, etc. utilizados en la especificación y las reivindicaciones deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente" Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la especificación y en las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar en función de las propiedades deseadas que se pretenden obtener con la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la doctrina de los equivalentes al ámbito de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos notificados y aplicando técnicas ordinarias de redondeo.

Todos los encabezamientos son para comodidad del lector y no deben utilizarse para limitar el significado del texto que sigue al encabezamiento, a menos que así se especifique.

A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan con la mayor precisión posible. No obstante, todos los valores numéricos contienen intrínsecamente un intervalo resultante necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de ensayo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra una vista transversal de una córnea y la FIG. 1B muestra una vista frontal de una córnea, indicando las localizaciones anatómicas del limbo en la superficie anterior de la córnea. El anillo corneolímbico incluye el limbo y una pequeña porción de la córnea y la esclerótica inmediatamente adyacente al limbo. La membrana de Descemet está situada en la superficie posterior de la córnea y, como se muestra en el recuadro de la FIG. 1A, el endotelio (también denominado en la presente memoria descriptiva endotelio corneal) cubre la superficie posterior de la membrana de Descemet.

La Figura 2A - FIG 2G muestran un procedimiento ejemplar para la separación de una membrana de Descemet del estroma de una córnea, y un procedimiento ejemplar para utilizar la membrana de Descemet aislada como sustrato de cultivo celular para cultivar células madre limbares y como soporte para trasplantar células madre limbares. La Figura 2A muestra la inyección forzada de aire o fluido en la córnea, lo que provoca que la membrana de Descemet (MD) se separe del estroma con una burbuja de aire o fluido, como se muestra en la FIG. 2B. Entonces, como se muestra en la Figura 2C, se puede extirpar el tejido estromal, exponiendo la MD anterior al anillo corneolímbico. Como se muestra en la Figura 2D, el anillo corneolimbal con el MD aislado adherido 360° puede incubarse en medios de cultivo celular, permitiendo que las células madre limbares del limbo crezcan sobre la superficie anterior del MD, como se muestra en la FIG. 2E. Finalmente, como se muestra en la Figura 2F, una lámina confluente de células madre limbares en MD puede ser extirpada y trasplantada en una superficie ocular. La Figura 2G muestra un diagrama de flujo de algunos procedimientos ejemplares para fabricar y utilizar una membrana de Descemet aislada.

La Figura 3A - FIG 3F muestran imágenes de una córnea antes, durante y después de que la membrana de Descemet se haya separado del estroma de una córnea de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva. La Figura 3A muestra una fotografía de una córnea donante, con la membrana de Descemet orientada hacia la cámara. La Figura 3B muestra una fotografía de una córnea donante, con la membrana de Descemet mirando hacia la cámara, después de que se haya inyectado líquido entre el estroma de la córnea y la membrana de Descemet haya sido separada del estroma corneal por el líquido. La Figura 3C muestra una imagen de tomografía de coherencia óptica (TCO) del líquido inyectado entre el estroma de la córnea y la membrana de Descemet aislada. La Figura 3D muestra una fotografía de una córnea donante montada en una falsa cámara anterior. La membrana de Descemet ya ha sido separada del estroma corneal por el líquido y está orientada en sentido contrario a la cámara. En la fotografía, se extirpa el estroma corneal. La Figura 3E muestra una fotografía de una córnea donante después de retirar el estroma de la córnea, dejando al descubierto la superficie anterior de la membrana de Descemet y exponiendo la membrana de Descemet al anillo corneolimbal, que contiene el limbo y las células madre limbares. La Figura 3F muestra una fotografía de haz de hendidura de una córnea donante después de que se haya eliminado el estroma de la córnea y se haya desnudado la membrana de Descemet aislada, exponiendo la superficie anterior de la membrana de Descemet aislada al anillo corneolimbal.

La Figura 4A - FIG 4F muestran imágenes que demuestran el crecimiento de células madre limbares del anillo corneolimbal intacto sobre la membrana de Descemet aislada después de que la membrana de Descemet haya sido expuesta según un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva. La Figura 4A muestra la tinción con azul Tripán de la membrana de Descemet después de que las células madre limbares hayan crecido en la membrana de Descemet a partir del anillo corneolimbal intacto. El azul tripán proporciona contraste para mostrar dónde han crecido las células madre limbares; la membrana de Descemet que no está cubierta de células madre limbares se tiñe de azul, mientras que la membrana de Descemet que está cubierta de células madre limbares permanece clara. La mayor parte de la membrana de Descemet está cubierta de células madre limbares. La Figura 4b muestra la tinción de inmunofluorescencia con Calceína AM; las células viables presentan fluorescencia verde. La presencia de células fluorescentes verdes cubriendo la membrana de Descemet demuestra que hay células viables creciendo en la membrana de Descemet. La Figura 4C muestra una imagen 10x de la tinción de inmunofluorescencia con Calceína AM. La Figura 4D muestra una imagen de contraste de fase 4x. La morfología celular de las células de la membrana de Descemet coincide con la de las células madre limbares. La Figura 4E muestra una imagen de contraste de fase 10x. La Figura 4F muestra la tinción de inmunofluorescencia roja para ANp63a, un marcador de células madre expresado en los núcleos celulares, y la tinción de inmunofluorescencia verde para ABCG2, un marcador de células madre expresado en las membranas celulares. La tinción de inmunofluorescencia azul para DAPI resalta todos los núcleos celulares. La expresión tanto de ANp63a como de ABCG2 en las células cultivadas en la membrana de Descemet es coherente con un fenotipo de célula madre limbal.

La Figura 5A muestra una vista superior de una membrana de Descemet trasplantada en una córnea donante y teñida con azul Tripán (para ayudar a la visualización); la membrana de Descemet es clara y se ajusta bien a la superficie anterior de la córnea. La Figura 5B muestra una vista oblicua de la membrana de Descemet trasplantada en una córnea donante y teñida con azul Tripán; la membrana de Descemet es clara y se ajusta bien a la superficie anterior de la córnea.

La Figura 6 muestra una imagen de una membrana amniótica humana trasplantada en la córnea de un paciente, que demuestra la semiopacidad de la membrana amniótica, según Connon et al., Br J Ophthalmol. 2010; 94:1057-1061.

La Figura 7A - FIG 7C muestran una serie de imágenes de tomografía de coherencia óptica (TCO) que demuestran que la membrana de Descemet es resistente a la digestión por colagenasa. La Figura 7A muestra una córnea donante inalterada. La Figura 7B muestra una córnea donante que ha sido cortada con un microqueratomo para eliminar el 80% superior de la córnea para adelgazar la córnea y reducir el tiempo total necesario para digerir la córnea con colagenasa. La Figura 7C muestra la digestión completa del 20% posterior de la córnea y la persistencia de una membrana de Descemet intacta tras 45 minutos de exposición a la colagenasa A.

La Figura 8 muestra una imagen que demuestra la capacidad de la membrana de Descemet para soportar células madre limbares en cultivo. La tinción de inmunofluorescencia muestra la expresión de los marcadores de células madre limbares, ANp63a (rojo/rosa) y ABCG2 (verde), en células cultivadas a partir de explantes limbares sobre la membrana de Descemet (MD, por debajo de la línea discontinua), pero no sobre plástico de cultivo tisular (PCT, por encima de la línea discontinua). La tinción de inmunofluorescencia DAPI (azul) indica todos los núcleos celulares.

La Figura 9 muestra la capacidad de la membrana de Descemet para soportar el crecimiento de células epiteliales corneales en la superficie de una córnea en un modelo de cultivo de órganos. El panel izquierdo muestra la inmunotinción con ácido periódico-Schiff (APS), que indica la presencia de la membrana de Descemet en la superficie de la córnea. El panel derecho muestra inmunotinción con pancitoqueratina, que indica células epiteliales corneales que crecen sobre la membrana de Descemet.

La Figura 10 muestra ejemplos de membranas de Descemet de córneas de donantes teñidas con azul Tripán (para ayudar a la visualización) después de la crioconservación y descongelación, como se describe en el Ejemplo 7; la membrana de Descemet mantiene su transparencia y propensión a desplazarse.

La Figura 11A muestra células madre limbares liberadas de tejidos limbares por digestión con colagenasa y luego inmunotinción con varios marcadores de células madre limbares y DAPI, como se describe en el Ejemplo 8A. Aumento: 40x. La Figura 11B muestra células madre limbares humanas que fueron cultivadas a partir de explantes limbares, luego tripsinizadas y resembradas de la suspensión celular sobre la membrana de Descemet, como se describe en el Ejemplo 8B. Aumento: 10x.

La Figura 12A muestra que las células madre limbares cultivadas a partir de fragmentos de explantes limbares o de limbo intacto en la membrana de Descemet mostraron una expresión más co-localizada de marcadores putativos de células madre limbares (ABCG2 y ANp63a) que las células cultivadas en plástico de cultivo tisular (PCT). La Figura 12B muestra que las células madre limbares sembradas a partir de una suspensión y cultivadas en la membrana de Descemet mostraron una expresión más co-localizada de los marcadores putativos de células madre limbares que las células sembradas a partir de una suspensión y cultivadas en la membrana amniótica humana (MAH).

Descripción detallada de las realizaciones ilustrativas

Tratamientos existentes para la deficiencia de células madre limbares

Se han descrito varias opciones quirúrgicas para el tratamiento de la deficiencia grave de células madre limbares: aloinjertos queratolimbales (ALQL), trasplantes epiteliales limbares simples (TELS) y trasplantes limbares cultivados (TLC). El uso de cada una de estas técnicas, como se describe más adelante, sigue siendo limitado y subóptimo.

En ALQL se extirpa todo el limbo y la córnea y conjuntiva adyacentes (anillo corneolimbal) de una córnea donante y se trasplanta todo el trozo de tejidos mixtos en el ojo receptor. Este procedimiento da lugar a una elevada tasa de rechazo debido a la gran cantidad de tejidos y antígenos mezclados (incluidas las células dendríticas presentadoras de antígenos residentes en el limbo) que se trasplantan además de las células madre limbares. Deben administrarse al paciente fármacos inmunosupresores sistémicos para prevenir el rechazo. Además, normalmente se necesitan dos córneas de donante para tener suficiente tejido corneolimbal de donante para cubrir el limbo dañado de un solo ojo receptor. El procedimiento también requiere mucho tiempo y es difícil para el cirujano, ya que la disección debe realizarse en el quirófano en el momento de la intervención (para que el injerto esté fresco). Además, puede resultar difícil diseccionar el limbo donante sin dañar las células madre del donante o tomar demasiada córnea y conjuntiva adyacentes.

En el TELS, se extrae un injerto ALQL (anillo corneolimbal) de un ojo donante, pero en lugar de trasplantarlo directamente, el injerto se corta en múltiples fragmentos pequeños (explantes limbares). A continuación, estos explantes se esparcen por la córnea enferma sobre un lecho de membrana amniótica. Con el tiempo, las células madre limbares crecen a partir de los fragmentos y vuelven a recubrir la córnea. Los fragmentos se retiran después de que la córnea se cubra de células. En comparación con el ALQL, el TELS no requiere tanto tejido donante y al final se trasplanta menos tejido extraño, aparte de las células madre limbares, porque se eliminan los fragmentos limbares. Sin embargo, los resultados siguen siendo variables y subóptimos. A menudo, los fragmentos limbares se desprenden antes de que se produzca el crecimiento de las células madre limbares, con lo que la intervención fracasa. Además, al preparar los explantes puede producirse un traumatismo importante en el tejido donante, lo que puede dar lugar a que una parte significativa de los fragmentos no muestren crecimiento de células madre limbares. Antes del trasplante, tampoco hay forma de comprobar objetivamente la viabilidad de las células madre trasplantadas. Por último, la supervivencia a largo plazo de las células madre limbares en la córnea, fuera de un microentorno de nicho limbal, es limitada. Sin un microentorno de nicho limbal, las células madre tienen dificultades para mantener su fenotipo de células madre y a menudo pierden la capacidad de proliferar indefinidamente.

Un procedimiento para realizar TLC se describe en la Patente de EE.UU. Núm. 7.347.875. Generalmente, en este procedimiento, las células madre limbares se extraen del receptor previsto o de un donante tomando pequeñas biopsias (explantes) del limbo de un ojo sano. A continuación, los explantes se cultivan en una membrana amniótica humana. Una vez cultivada una lámina de células madre, se trasplanta toda la lámina, incluida la membrana amniótica, a un ojo receptor. Con esta técnica, se trasplanta una población pura de células madre, por lo que se supone que el riesgo de rechazo inmunitario es menor que con la ALQl . Además, con la TLC se puede trasplantar un gran número de células madre a partir de un pequeño trozo del limbo del donante. Además, la viabilidad de las células madre en cultivo puede confirmarse antes de la cirugía de trasplante. Por último, con TLC, la mayor parte del trabajo de preparación del injerto se realiza en el laboratorio, fuera del quirófano, lo que ahorra tiempo y dinero a los cirujanos.

No obstante, existen varios problemas con este procedimiento para preparar injertos de células madre limbares. La primera es que el uso de biopsias de tejido limbal provoca un traumatismo significativo en el limbo donante y en las células madre limbares del donante. Como resultado, hasta un 20% de los cultivos de explantes limbares no crecen en el laboratorio. En segundo lugar, el uso de membrana amniótica introduce otra posible fuente exógena de infección para el receptor del trasplante, ya que la membrana amniótica se obtiene de donantes distintos del donante utilizado para las biopsias de limbo. Por lo tanto, al utilizar membrana amniótica se introduce un riesgo adicional de transmisión vírica o bacteriana. En tercer lugar, aunque se ha demostrado que la membrana amniótica procesada no es inmunogénica en la mayoría de los pacientes, los antígenos adicionales del tejido placentario alogénico pueden seguir siendo un factor de riesgo de rechazo inmunitario del injerto trasplantado. En cuarto lugar, el uso de membrana amniótica como sustrato para los cultivos celulares requiere muchos recursos; la mayoría de los cirujanos no tienen acceso a injertos de TLC basados en membrana amniótica. Además, la membrana amniótica es cara y difícil de almacenar (requiere un almacenamiento a -80°C con una vida útil limitada). En quinto lugar, la membrana amniótica no es transparente ni perfectamente estable en la superficie ocular.

Debido a que la membrana amniótica no es transparente ni completamente estable en la superficie ocular, hay dos resultados potenciales que ocurren después de que un injerto de células madre limbares basado en membrana amniótica se trasplanta en el ojo, y ninguno es ideal. Un posible resultado es que la membrana amniótica persista y se incorpore a la córnea a largo plazo. La claridad de la córnea del paciente se ve comprometida por la membrana amniótica semiopaca, y la visión puede seguir siendo deficiente a pesar del éxito del trasplante de células madre Nimbares viables. El resultado alternativo es que la membrana amniótica se disuelva antes de incorporarse completamente a la córnea. En este caso, la córnea puede ser transparente, pero las células madre trasplantadas pierden el sustrato que ayuda a mantener su viabilidad y, potencialmente, su fenotipo de células madre. Sin un microambiente de nicho limbal, es muy difícil que las células madre mantengan su fenotipo de células madre. Las células madre que crecen directamente en la propia córnea, fuera de un microambiente de nicho limbal normal o de un entorno similar al nicho limbal, acabarán diferenciándose en células epiteliales corneales maduras y perderán su capacidad de proliferar indefinidamente. Esta diferenciación provoca el fracaso a largo plazo de los trasplantes de células madre limbares, ya que las células epiteliales terminalmente diferenciadas no pueden mantener la superficie ocular durante toda la vida del paciente. En consecuencia, el éxito a largo plazo (por ejemplo, más allá de cinco años) sigue siendo limitado con los actuales injertos de células madre limbares a base de membrana amniótica.

Como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva, en algunos aspectos, la presente divulgación describe un TLC modificado que utiliza la membrana de Descemet como sustrato para el cultivo de células madre limbares en lugar de la membrana amniótica. La membrana de Descemet es la membrana basal multicapa del endotelio corneal(véaseFIG. 1). La membrana de Descemet se aísla de forma rutinaria, junto con las células endoteliales, a partir de córneas de donantes y se trasplanta intraocularmente en pacientes para sustituir la membrana de Descemet dañada y/o las células endoteliales corneales, tal y como informan Park, et al., Ophthalmology. 2015; 122:2432-2442(véase tambiénla patente estadounidense Núm. 8.889.415). No se tiene constancia de que se haya descrito anteriormente el trasplante de la membrana de Descemet en la superficie ocular externa del ojo.

Como se describe más adelante, la membrana de Descemet proporciona inesperadamente múltiples ventajas como sustrato para apoyar la proliferación y la supervivencia a largo plazo de las células madre limbares, tantoin vivoen la superficie ocular comoex vivoen cultivo. La similitud de la membrana de Descemet con la membrana basal del microambiente del nicho limbal, desde el punto de vista bioquímico, es una característica oscura de la membrana de Descemet que no se ha explotado anteriormente para promover el crecimiento de las células madre limbales e inhibir su posterior diferenciación en células epiteliales corneales no amplificadoras. Los procedimientos de la presente divulgación explotan esta característica de la membrana de Descemet, y la presente divulgación describe, en algunas realizaciones, un procedimiento de utilización de la membrana de Descemet como sustrato para el cultivo de células madre limbares.

Procedimientos de preparación de la membrana de Descemet descelularizada y de la membrana de Descemet aislada

En un aspecto, la presente divulgación describe un procedimiento de eliminación del endotelio de una membrana de Descemet de una córnea para proporcionar una membrana de Descemet descelularizada y separar una membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea para obtener una membrana de Descemet aislada.

En algunas realizaciones, la córnea puede ser una córnea donante incluyendo, por ejemplo, una córnea cadavérica. En algunas realizaciones, la córnea puede ser una córnea humana. En algunas realizaciones, la córnea puede ser una córnea porcina.

En algunas realizaciones, el endotelio corneal puede separarse de la membrana de Descemet para formar una membrana de Descemet descelularizada por medio de descelularización mecánica, enzimática y/o química. En algunas realizaciones, la separación del endotelio corneal de la membrana de Descemet para formar una membrana de Descemet descelularizada deja intacto el epitelio corneal.

En algunas realizaciones, una membrana de Descemet descelularizada puede separarse del estroma de una córnea para obtener una membrana de Descemet aislada pelando manualmente la membrana de Descemet del estroma de la córnea. En algunas realizaciones, el epitelio corneal puede eliminarse preferentemente con el estroma de la córnea.

En algunas realizaciones, una membrana de Descemet descelularizada puede separarse del estroma de una córnea para obtener una membrana de Descemet aislada inyectando aire o fluido o ambos en la córnea. El fluido puede incluir cualquier fluido adecuado. En algunas realizaciones, el fluido puede incluir, por ejemplo, solución salina, solución de almacenamiento corneal o cualquier solución amortiguada. En algunas realizaciones, la córnea residual (por ejemplo, incluyendo el epitelio corneal y el estroma corneal) que se ha separado de la membrana de Descemet puede extirparse para exponer la membrana de Descemet aislada.

En algunas realizaciones, separar la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea y retirar dicho estroma incluye exponer la membrana de Descemet aislada a una célula madre limbal que se encuentra en el anillo corneolimbal de la córnea. En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir además una incisión de espesor parcial en el anillo corneolimbal. Una incisión de este tipo puede favorecer el crecimiento de células madre limbares a partir del anillo corneolimbal. Los dibujos de un procedimiento ejemplar de separación de la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea y de exposición de la membrana de Descemet aislada a una célula madre limbal se muestran en la FIG. 2A - FIG 2C.

En otras realizaciones, la membrana de Descemet aislada puede ser extirpada completamente del resto de la córnea (incluyendo el anillo corneolimbal) incluyendo, por ejemplo, por medio de la trepanación de la membrana de Descemet.

Procedimientos de almacenamiento de una membrana de Descemet aislada

En otro aspecto, la presente divulgación describe un procedimiento de almacenamiento de una membrana de Descemet aislada. En algunas realizaciones, incluyendo, por ejemplo, cuando la membrana de Descemet ha sido completamente extirpada por trepanación o pelada manualmente del resto de la córnea, la membrana de Descemet aislada puede conservarse sin tener en cuenta la viabilidad celular. En algunas realizaciones, incluyendo, por ejemplo, cuando la membrana de Descemet no se ha extirpado completamente del anillo corneolimbal o cuando la membrana de Descemet aislada se ha utilizado como sustrato de cultivo celular, la membrana de Descemet aislada puede conservarse por un medio que mantenga la viabilidad celular. En algunas realizaciones, la membrana de Descemet aislada puede congelarse, liofilizarse y/o crioconservarse.

En algunas realizaciones, la membrana de Descemet aislada puede esterilizarse antes o después de la preservación, o ambas cosas, antes y después de la preservación. La membrana de Descemet aislada puede esterilizarse por cualquier medio adecuado, incluyendo, por ejemplo, irradiación gamma, desinfectante químico, tratamiento antibiótico, tratamiento con gas de óxido de etileno o exposición a CO2 supercrítico.

Procedimientos de utilización de una membrana de Descemet aislada

En otro aspecto, la presente divulgación describe procedimientos de utilización de una membrana de Descemet aislada.

Procedimientos de utilización de una membrana de Descemet aislada como sustrato de cultivo celular

En algunos aspectos, la presente divulgación describe el uso de una membrana de Descemet aislada como sustrato de cultivo celular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente divulgación describe el uso de una membrana de Descemet aislada como sustrato de cultivo celular para favorecer la proliferación de una célula madre limbal. En algunas realizaciones, la célula madre limbal puede adherirse a la membrana de Descemet aislada.

En algunas realizaciones, una membrana de Descemet aislada puede fijarse a una superficie de cultivo celular que incluye, por ejemplo, plástico de cultivo tisular. En la FIG. 1 se muestra un dibujo de un procedimiento ejemplar de fijación de la membrana de Descemet a una superficie de cultivo celular. 2D. En algunas realizaciones, la membrana de Descemet puede estar unida de forma reversible a la superficie de cultivo celular.

En algunas realizaciones, cuando una membrana de Descemet aislada se adhiere a una superficie de cultivo celular, la membrana de Descemet aislada se habrá extirpado preferentemente por completo o pelado manualmente del resto de la córnea (incluido el anillo corneolimbal). En algunas realizaciones, incluyendo, por ejemplo, cuando una membrana de Descemet aislada está unida reversiblemente a una superficie de cultivo celular, se puede cultivar un explante limbal en presencia de la membrana de Descemet aislada. En algunas realizaciones, el explante limbal puede proceder del mismo donante (por ejemplo, de la misma córnea cadavérica) o de un donante diferente (por ejemplo, de la córnea de un donante vivo) que la membrana de Descemet aislada. En algunas realizaciones, el explante limbal incluye una parte del anillo corneolimbal. En algunas realizaciones, el explante limbal incluye un anillo corneolimbal completo. En algunas realizaciones, el explante limbal puede cultivarse en condiciones que permitan el crecimiento de una célula madre limbal del explante limbal en la membrana de Descemet aislada, dando como resultado una membrana de Descemet aislada con células madre limbales en su superficie.

En algunas realizaciones, la separación de la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea para obtener una membrana de Descemet aislada expone la membrana de Descemet aislada a las células madre limbales que se encuentran en el anillo corneolimbal. Por ejemplo, cuando la membrana de Descemet aislada no se extirpa (por medio de trepanación) ni se pela manualmente del anillo corneolimbal, la membrana de Descemet aislada puede quedar expuesta a las células madre limbares que se encuentran en el anillo corneolimbal al eliminar el estroma de la córnea. En algunas realizaciones, el anillo corneolimbal permanece unido a la membrana de Descemet aislada.

Adicional o alternativamente, una membrana de Descemet aislada puede ser expuesta a células madre limbares obtenidas de otra fuente u obtenidas de la misma fuente donante pero separadas del anillo corneolimbal. En algunas realizaciones, un cultivo de explante limbal puede tratarse para liberar células madre limbales (en una suspensión celular) que pueden sembrarse en una membrana de Descemet aislada. En algunas realizaciones, un cultivo de explante limbal y/o un anillo de tejido limbal pueden digerirse con una o más de las siguientes tripsinas(Sharifi, et al., Biocell. 2010;34:53-55), dispasa(Zhang, et al., Curr Eye Res. 2016;41:318-325), o colagenasa (Chen, et al., Tissue Eng Part C Methods. 2011;17:537-548) para liberar las células madre limbares basales (véase la FIG. 11A). En algunas realizaciones, una vez en suspensión, las células madre limbares pueden sembrarse en una membrana de Descemet aislada sin más manipulación (véase la FIG. 11B). En algunas realizaciones, las células madre limbares pueden clasificarse (por ejemplo, por medio de citometría de flujo) para seleccionar células con un marcador o marcadores específicos de células madre limbares antes de sembrarlas en una membrana de Descemet aislada. En los Ejemplos 8A y 8B se describen procedimientos ejemplares de preparación de células madre limbares para su cultivo en la membrana de Descemet.

Los cultivos de explantes limbares y/o células madre limbares pueden mantenerse en cualquier medio de crecimiento adecuado. Los medios de crecimiento adecuados pueden incluir, por ejemplo, un medio de crecimiento que contenga suero autólogo humano, suero fetal bovino, lisados de plaquetas humanas, y un medio de crecimiento que contenga medio libre de suero con extractos de hipófisis bovina, suplemento de crecimiento con componentes recombinantes o suplementos químicamente definidos.

Una membrana de Descemet aislada puede cultivarse en condiciones que permitan el crecimiento de células madre limbares (por ejemplo, de un explante limbal y/o de un anillo corneolimbal) en la membrana de Descemet aislada. En la FIG. 1 se muestra un procedimiento ejemplar de cultivo de la membrana de Descemet para lograr el crecimiento de células limbares en la membrana de Descemet. 2E. En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir la realización de una incisión de espesor parcial en el anillo corneolimbal para promover el crecimiento de células madre limbares.

El procedimiento puede incluir la colocación de la membrana de Descemet aislada en un medio de cultivo celular. El medio de cultivo celular puede incluir cualquier medio de cultivo celular adecuado, incluyendo, por ejemplo, un medio de crecimiento de células epiteliales u otros medios adecuados para el cultivo de órganos corneales. Un medio ejemplar adecuado para el cultivo de órganos corneales es CorneaMax® (Eurobio, Les Ulis, Francia). En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular pueden estar libres de suero. En algunas realizaciones, incluyendo, por ejemplo, cuando el medio de cultivo celular está libre de suero, el medio de cultivo celular puede incluir extracto de hipófisis. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular puede incluir uno o más de un medio de cultivo complejo suplementado con suero bovino fetal, un medio de cultivo complejo suplementado con suero humano, un medio de cultivo complejo suplementado con suero de lisado de plaquetas, o un medio de crecimiento de queratinocitos químicamente definido. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular pueden promover preferentemente el crecimiento de células madre limbares y/o mantener la pluripotencia de las células madre limbares.

En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir la incubación de la membrana de Descemet aislada en el medio de cultivo celular en condiciones típicas de cultivo celular incluyendo, por ejemplo, a una temperatura en un intervalo de 32°C a 38°C y/o a 5% de CO2. La membrana de Descemet aislada se incuba con un explante limbal y/o una célula madre limbal.

Trasplante de una membrana de Descemet aislada

En un aspecto adicional, las composiciones son para trasplantar una membrana de Descemet aislada a una superficie ocular de un paciente que lo necesite.

Un dibujo de un procedimiento ejemplar de trasplante de una membrana de Descemet que incluye células madre limbares se muestra en la FIG. 2F La membrana de Descemet trasplantada es una membrana de Descemet aislada preparada por medio de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, una membrana de Descemet aislada que incluya células madre limbares producidas por medio de los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva puede trasplantarse a un paciente que presente una deficiencia parcial de células madre limbares, una deficiencia total de células madre limbares, un defecto epitelial persistente, una erosión epitelial, una úlcera corneal, un derretimiento corneal y/o una enfermedad de la superficie ocular. La deficiencia de células madre limbares puede estar causada, por ejemplo, por quemaduras (químicas, térmicas o industriales); el uso excesivo de ciertos medicamentos; traumatismos iatrogénicos, incluyendo, por ejemplo, el uso excesivo de lentes de contacto, el uso crónico de gotas para el glaucoma o la cirugía ocular; una enfermedad autoinmune, incluyendo, por ejemplo, el síndrome de Steven Johnson o el penfigoide cicatricial ocular; o la enfermedad de injerto contra huésped (EICH); etc.

El trasplante de una membrana de Descemet aislada a una superficie ocular de un paciente, como se describe en la presente memoria descriptiva, puede tener ciertas ventajas sobre los tratamientos existentes para la deficiencia de células madre limbares. Por ejemplo, el trasplante de una membrana de Descemet aislada a una superficie ocular de un paciente, como se describe en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, incluyendo una célula madre limbal), tiene ciertas ventajas sobre un injerto TLC basado en membrana amniótica. Un procedimiento similar al TLC realizado mediante el uso de una membrana de Descemet aislada es menos costoso que un procedimiento basado en una membrana amniótica (porque aprovecha la membrana de Descemet libre que viene con cada córnea y limbo donante), y también hace posible producir injertos similares al TLC en un banco de ojos, mejorando el acceso de los cirujanos a la tecnología TLC.

Uno de los principales retos del trasplante de células madre limbares es mantener la viabilidad a largo plazo, el potencial proliferativo y el fenotipo general de células madre de las células trasplantadas fuera del microambiente del nicho limbal nativo. Como se muestra en la Figura 4 y el Ejemplo 2, cuando se utiliza como sustrato, la membrana de Descemet favorece la rápida expansión de las células madre limbares en cultivo, al tiempo que mantiene el fenotipo de célula madre en la mayoría de las células hasta varias semanas en cultivo (según la morfología celular y la expresión de los marcadores de células madre ABCG2 y ANp63a. El trasplante de la membrana de Descemet junto con células madre limbares en la superficie ocular proporciona una técnica novedosa y viable para establecer un microambiente estable similar a un nicho en la córnea y, por lo tanto, puede proporcionar una técnica sólida y prometedora para la reconstrucción a largo plazo de la superficie ocular. Además, la membrana de Descemet intacta es ópticamente transparente(véasela FIG. 5), resistente a la digestión con colagenasa(véaseFIG. 7), mínimamente inmunogénicas cuando se trasplantan intraocularmente y disponibles gratuitamente con cada córnea donante de la que se extraen células madre.

Incluyendo, por ejemplo, cuando la membrana de Descemet aislada es descelularizada, la membrana de Descemet aislada puede ser utilizada como un vendaje ocular incluyendo, por ejemplo, en pacientes con un trauma de la superficie ocular, una erosión recurrente, un derretimiento corneal, o una úlcera corneal estéril. Tales pacientes pueden incluir cualquier paciente con una enfermedad que comprometa la superficie ocular, incluyendo, por ejemplo, pacientes con diabetes, pacientes con glaucoma, pacientes con lesiones resultantes del uso crónico de lentes de contacto, pacientes con complicaciones de la cirugía LASIK, pacientes con problemas neurotróficos, pacientes con deficiencia lagrimal grave y/o pacientes con queratopatía por exposición.

Por ejemplo, una membrana de Descemet aislada (con o sin la presencia de una célula madre limbal) puede ser útil como terapia reconstructiva en casos de quemaduras o traumatismos menores de la superficie ocular. Por ejemplo, cuando el epitelio está dañado pero queda suficiente población de células madre limbares nativas para regenerar el epitelio corneal, la membrana de Descemet aislada (sin células madre limbares), cuando se coloca como tratamiento de rejuvenecimiento, puede establecer una capa de vendaje estable en la superficie ocular de la córnea que promueva el recrecimiento del epitelio propio de los pacientesin situ,al tiempo que protege el estroma corneal de la degradación enzimática por mediadores inflamatorios en la película lagrimal debido a su resistencia natural a la colagenasa. La membrana de Descemet aislada puede mantenerse estable durante extensos periodos de tiempo pero es todavía transparente y no obstructiva visualmente. Dado que la membrana de Descemet aislada se descelulariza para eliminar las células endoteliales, la membrana de Descemet aislada no tiene células que el organismo pueda rechazar, por lo que el riesgo de rechazo es mínimo.

La membrana de Descemet aislada puede adherirse a la córnea receptora por cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, la membrana de Descemet puede adherirse a la córnea receptora por medio de secado al aire. En algunas realizaciones, la membrana de Descemet puede adherirse a la córnea receptora mediante el uso de uno o más de un sellador de fibrina, nanopartículas de sílice coloidal y reticulación de colágeno de rosa de bengala iniciada por luz.

Composiciones que incluyen una membrana de Descemet aislada

En otro aspecto, la presente divulgación describe una composición que incluye una membrana de Descemet aislada, en la que la membrana de Descemet ha sido descelularizada y separada del estroma corneal y la composición incluye además una célula madre limbal. En algunas realizaciones, la célula madre limbal y la membrana de Descemet aislada proceden de la misma córnea. La célula madre limbal puede, en algunas realizaciones, estar en contacto con (por ejemplo, presente en la superficie de) la membrana de Descemet aislada.

En algunas realizaciones, la composición incluye membrana de Descemet aislada unida a un anillo corneolimbal. En algunas realizaciones, la composición incluye una célula madre limbal, la célula madre limbal puede estar presente en el anillo corneolimbal y/o en la superficie de la membrana de Descemet aislada que se ha desnudado al anillo corneolimbal.

En algunas realizaciones, la membrana de Descemet aislada puede actuar como sustrato para la célula madre limbal.

En algunas realizaciones, la membrana de Descemet aislada puede haber sido esterilizada o preservada, o ambas cosas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este Ejemplo describe un procedimiento para el aislamiento de una membrana de Descemet del estroma de una córnea, para formar una membrana de Descemet aislada, como se muestra en una realización en la FIG. 2 y la Figura 3B- FIG. 3C.

En primer lugar, se eliminó el endotelio de la membrana de Descemet por medio de desbridamiento mecánico para formar una membrana de Descemet descelularizada. A continuación, se aisló la membrana de Descemet descelularizada del estroma de una córnea inyectando manualmente solución de almacenamiento de córnea con una presión no superior a 600 mmHg en el estroma posterior, cerca de la membrana de Descemet. Se utilizó una cuchilla superafilada para realizar una incisión a través del estroma. Se utilizaron tijeras para realizar un corte circunferencial continuo a fin de extirpar la córnea residual dejando el anillo corneolímbico unido a la membrana de Descemet aislada.

En algunos casos, la membrana de Descemet fue entonces extirpada del anillo corneolimbal mediante el uso de un trépano. En algunos casos, la membrana de Descemet se descontaminó exponiéndola a una solución de povidona yodada al 5%.

Ejemplo 2

Este Ejemplo describe un procedimiento para la separación de una membrana de Descemet del estroma de una córnea, y un procedimiento ejemplar para utilizar la membrana de Descemet aislada como sustrato de cultivo celular para cultivar una célula madre limbal, como se muestra en una realización en la FIG. 2.

La membrana de Descemet aislada se preparó como se describe en el Ejemplo 1. La córnea residual se extirpó, exponiendo la membrana de Descemet aislada al anillo corneolimbal, como se muestra en una realización en la FIG.

3D.

La membrana de Descemet aislada (FIG. 3E) se colocaron en medios de cultivo complejos suplementados con suero bovino fetal y se cultivaron a 37°C, 5% CO2 durante un máximo de 4 semanas. Las células salieron del anillo corneolimbal y crecieron sobre la membrana de Descemet aislada (FIG. 3F).

Los cultivos resultantes se tiñeron con azul tripán al 0,06% durante 1 minuto o con calceína AM 2 pM durante 20 minutos. Como se muestra en la Figura 4A - FlG 4C, las células viables (que excluyen el azul tripán o se tiñen de verde) crecieron sobre la mayor parte de la membrana de Descemet aislada en 1 semana.

Como se muestra en la Figura 4D - FIG 4E, la morfología celular de las células que crecían en la membrana de Descemet aislada a la semana correspondía a células madre limbares y no a fibroblastos.

Los cultivos resultantes se tiñeron mediante el uso de los procedimientos descritos por Suri et al. Curr Eye Res. 2016; 41:1266-1273. Como se muestra en la Figura 4F, las células que crecen en la membrana de Descemet aislada expresan ANp63a y ABCG2, biomarcadores de células madre, tras 1 semana en cultivo.

Ejemplo 3

La membrana de Descemet aislada extirpada del corneolímbalo, preparada como se describe en el Ejemplo 1, se trasplantó a una córnea receptora tras el desbridamiento mecánico de la capa epitelial de la córnea receptora. La membrana de Descemet aislada se tiñó con azul tripán al 0,06% durante 1 minuto antes del trasplante para facilitar la visualización. La membrana de Descemet se adhirió a la córnea receptora por medio de secado al aire. Como se muestra en la Figura 5, la membrana de Descemet es transparente. Por el contrario, como se muestra en la Figura 6, una membrana amniótica, trasplantada en una córnea, es semiopaca, tal como describen Connon, et al., Br J Ophthalmol. 2010;94:1057-1061.)

Ejemplo 4

Este Ejemplo muestra que la membrana de Descemet es resistente a la degradación enzimática.

Una córnea donante(verFIG. 7A) se recortó con un microqueratomo hasta un 20% de grosor para reducir el tiempo total de digestión del estroma corneal por la colagenasa (FIG. 7B). A continuación, el lecho de estroma residual se trató durante 45 minutos con colagenasa A. Tras el tratamiento con colagenasa, el estroma se digirió por completo, pero la membrana de Descemet permaneció intacta (FIG. 7C).

Ejemplo 5

La membrana de Descemet aislada, preparada como se describe en el Ejemplo 1, se dejó secar sobre una superficie de cultivo tisular de poliestireno tratada. El anillo corneolimbal se picó en fragmentos de explante limbal de 1 mm2 y se adhirió a la superficie de plástico de cultivo tisular cerca de la membrana de Descemet. Se añadieron medios de cultivo complejos suplementados con suero bovino fetal. A continuación, los explantes limbares y la membrana de Descemet se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2. Los medios de cultivo se cambiaron cada 48 horas. Las células madre limbares proliferaron a partir de los fragmentos de explante limbal sobre el plástico de cultivo tisular y en la membrana de Descemet.

Después de 5 días, las células se inmunotinción, como se describe en la FIG 4 y el Ejemplo 2, para su expresión de ANp63a y ABCG2 para confirmar el fenotipo de célula madre limbal. En un cultivo confluente de células que crecían tanto sobre plástico de cultivo tisular como sobre la membrana de Descemet, las células de la membrana de Descemet mostraban una mayor expresión de los marcadores putativos de células madre limbares, ANp63a y ABCG2.

Los resultados se muestran en la Figura 8.

Ejemplo 6

La membrana de Descemet aislada extirpada del anillo corneolimbal, preparada como se describe en el Ejemplo 1, se trasplantó a una córnea tras el desbridamiento mecánico del epitelio de la córnea receptora como se describe en el Ejemplo 3. A continuación, la córnea se colocó en un medio de cultivo complejo suplementado con suero bovino fetal y se incubó a 37 °C y 5% de CO2. El epitelio corneal volvió a crecer sobre la membrana de Descemet al cabo de una semana. A continuación, se evaluó la córnea por medio de inmunohistoquímica para valorar la presencia de membrana de Descemet (inmunotinción APS positiva) y epitelio corneal (inmunotinción pancitoqueratina positiva) en la superficie de la córnea.

Los resultados se muestran en la Figura 9. Estos resultados respaldan la capacidad de las membranas de Descemet para actuar como un vendaje de la superficie ocular que favorece la cicatrización del epitelio corneal.

Ejemplo 7

Las membranas de Descemet aisladas extirpadas de sus anillos corneolimbales se aislaron como se describe en el Ejemplo 1, se esterilizaron por medio de tratamiento antibiótico, se congelaron a -80°C durante 1 mes y luego se descongelaron. Tras la congelación y descongelación, las membranas de Descemet mantuvieron su transparencia y propensión al desplazamiento. Una muestra ejemplar, teñida con azul tripán (para ayudar a la visibilidad), se muestra en la FIG. 10.

Ejemplo 8A

Este ejemplo describe un procedimiento ejemplar para aislar células madre limbares de un anillo corneolimbal para su cultivo en la membrana de Descemet.

Se trató un anillo corneolimbal con colagenasa para liberar las células madre limbares basales, según protocolos publicados anteriormente(Chen, et al., Tissue Eng Part C Methods. 2011;17:537-548), y resuspendidos en medio libre de suero con extractos de hipófisis bovina, suplemento de crecimiento con componentes recombinantes o suplementos químicamente definidos. Después de la resuspensión de las células madre limbares, las células se inmunotinción con marcadores de células madre limbares (ANp63a y ABCG2) y contratinción para núcleos (DAPI), como se describe en la FIG. 4F. Los resultados se muestran en la Figura 11A.

Estas células madre limbares aisladas enzimáticamente pueden enriquecerse aún más por medio de citometría de flujo y sembrarse en la membrana de Descemet.

Tras la siembra en la membrana de Descemet, los cultivos pueden mantenerse en (a) medio de crecimiento que contenga suero autólogo humano, suero bovino fetal, lisados de plaquetas humanas, o (b) medio libre de suero con extractos de hipófisis bovina, suplemento de crecimiento con componentes recombinantes o suplementos químicamente definidos.

Ejemplo 8B

Los explantes limbares se prepararon por medio de la trepanación del botón corneal central, cortando a continuación el anillo limbal en 12 a 16 pequeños fragmentos de explante limbal. Los fragmentos de explantes limbares se cultivaron en plástico de cultivo tisular mediante el uso de medio libre de suero con extractos de hipófisis bovina, suplemento de crecimiento con componentes recombinantes o suplementos químicamente definidos. Los explantes se cultivaron durante 7 a 10 días a 37 °C y 5% de CO2, hasta que las células madre limbares que brotaban de los explantes limbares estaban próximas a la confluencia en el plástico de cultivo tisular. A continuación, las células madre limbares se tripsinizaron en suspensión celular(Véase Sharifi, et al., Biocell. 2010;34:53-55). A continuación, las células se sembraron en suspensión sobre la membrana de Descemet a una confluencia aproximada del 20% y se dejaron crecer durante un máximo de 4 a 7 días (lo que supone un periodo total de cultivo de 14 días). Una imagen ejemplar de la membrana de Descemet resultante se muestra en la FlG. 11B.

Ejemplo 9A

Las células madre limbares cultivadas en plástico de cultivo tisular y en la membrana de Descemet mediante el uso de diferentes condiciones de cultivo se compararon para la expresión de marcadores de células madre limbares para demostrar la eficacia del uso de la membrana de Descemet como sustrato de cultivo para células madre limbares. En la primera condición de cultivo, los explantes limbares se cultivaron en plástico de cultivo tisular (PCT) mediante el uso de medios suplementados con suero bovino fetal (SBF). En la segunda condición de cultivo, se aisló la membrana de Descemet del anillo corneoescleral como se describe en el Ejemplo 1. A continuación, los explantes limbares se cultivaron en tejido de la membrana de Descemet aislada mediante el uso de medios suplementados con suero fetal bovino (SBF). En la tercera condición de cultivo, se aisló la membrana de Descemet del anillo corneoescleral como se describe en el Ejemplo 2, donde las células madre limbares del limbo intacto se expusieron a la membrana de Descemet y se cultivaron directamente sobre la membrana de Descemet del limbo intacto.

A continuación, se evaluó el crecimiento de los cultivos a partir de fragmentos de explantes limbares por medio de microscopía óptica invertida. Una muestra de cada condición de cultivo que alcanzó la confluencia se caracterizó por medio de inmunohistoquímica. Los cultivos se sometieron a inmunotinción para detectar marcadores putativos de células madre limbares (CML): ANp63a (nuclear) y ABCG2 (asociado a membrana). A continuación, dos revisores independientes contaron manualmente las células y las compararon para ANp63a y ABCG2 frente a la contratinción nuclear DAPI.

Como se muestra en la Figura 12A, las células madre limbares cultivadas a partir de explantes limbares demostraron una mayor esterilidad, medida por la expresión co-localizada de marcadores putativos de células madre limbares (ABCG2, ANp63a), cuando se cultivaron en la membrana de Descemet (MD) en comparación con el plástico de cultivo tisular (PCT). Además, las células madre limbares cultivadas a partir de limbo intacto demostraron una mayor esterilidad, medida por la expresión co-localizada de marcadores putativos de células madre limbares (ABCG2, ANp63a), en comparación con las células madre limbares cultivadas a partir de explantes limbares.

Ejemplo 9B

Las células madre Nimbares cultivadas en membrana amniótica humana y membrana de Descemet se compararon para la expresión de marcadores de células madre Nimbares para demostrar la eficacia del uso de la membrana de Descemet como sustrato de cultivo para células madre limbares. Las células madre limbares se tripsinizaron a partir de cultivos de explantes limbares y se suspendieron en medios libres de suero con extractos de hipófisis bovina, suplemento de crecimiento con componentes recombinantes o suplementos químicamente definidos, como se describe en el Ejemplo 8B. A continuación, se sembraron células madre limbares en suspensión sobre membrana amniótica humana (MAH) o membrana de Descemet (MD) y se mantuvieron en cultivo a 37 °C y 5% de CO2 durante 4 a 7 días.

A continuación, los cultivos se sometieron a inmunotinción para detectar marcadores putativos de células madre limbares (CML): ANp63a (nuclear) y ABCG2 (asociado a membrana). A continuación, dos revisores independientes contaron manualmente las células y las compararon para ANp63a y ABCG2 frente a la contratinción nuclear DAPI.

Como se muestra en la Figura 12B, las células madre limbares cultivadas a partir de suspensión celular demostraron una mayor esterilidad, medida por la expresión de marcadores putativos de células madre limbares (ABCG2, ANp63a), cuando se cultivaron en la membrana de Descemet en comparación con la membrana amniótica humana (MAH).

En el caso de que exista alguna incoherencia entre la divulgación de la presente solicitud y la(s) divulgación(es) de cualquier documento mencionado en la presente memoria descriptiva, prevalecerá la divulgación de la presente solicitud. La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han facilitado únicamente para facilitar la comprensión. De ello no se desprende ninguna limitación innecesaria.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro que comprende:

eliminar el endotelio de una membrana de Descemet de una córnea para obtener una membrana de Descemet descelularizada;

separar la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea para obtener una membrana de Descemet aislada; y

mediante el uso de la membrana de Descemet aislada para favorecer la proliferaciónin vitrode células madre límbicas en la superficie anterior de la membrana de Descemet aislada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

(i) la córnea comprende una córnea cadavérica; y/o

(ii) la córnea es humana o porcina; y/o

(iii) la eliminación del endotelio de una membrana de Descemet comprende al menos una de las operaciones de descelularización mecánica, enzimática o química.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que separar la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea comprende:

(i) inyectar fluido, aire o ambos en la córnea; y/o

(ii) pelado manual de la membrana de Descemet del estroma de la córnea.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el procedimiento comprende fijar reversiblemente la membrana de Descemet aislada a una superficie de cultivo celular.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende el cultivo de un explante limbal en presencia de la membrana de Descemet aislada, opcionalmente en el que el explante limbal comprende un anillo corneolimbal, y en el que el explante limbal se cultiva en condiciones que permiten el crecimiento de células madre limbales desde el anillo corneolimbal hasta la membrana de Descemet aislada.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que separar la membrana de Descemet descelularizada del estroma de la córnea para obtener una membrana de Descemet aislada comprende exponer la membrana de Descemet aislada a una célula madre limbal, opcionalmente en el que exponer la membrana de Descemet aislada a la célula madre limbal comprende exponer la membrana de Descemet aislada al anillo corneolimbal de la córnea.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en el que el procedimiento comprende además hacer una incisión de espesor parcial en el anillo corneolimbal para promover el crecimiento de células madre limbares.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento:

(i) comprende colocar la membrana de Descemet aislada, un explante limbal, y/o una célula madre limbal en un medio de cultivo celular, opcionalmente:

(a) en el que el medio de cultivo celular promueve el crecimiento de células madre limbares y/o mantiene la pluripotencia de las células madre limbares; y/o

(b) en el que el procedimiento comprende incubar la membrana de Descemet aislada y una célula madre limbal en el medio de cultivo celular a una temperatura comprendida entre 32°C y 38°C; y/o

(ii) comprende además:

(a) esterilizar la membrana de Descemet aislada; y/o

(b) una o más de las operaciones de congelación, liofilización y crioconservación de la membrana de Descemet aislada.

9. Una composición que comprende: una membrana de Descemet aislada, en la que la membrana de Descemet aislada se ha separado del estroma corneal y comprende una o más células madre límbicas en contacto con la superficie anterior de la membrana de Descemet aislada.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que la membrana de Descemet aislada ha sido esterilizada o preservada, o ambas cosas.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que

(a) la composición comprende un anillo corneolimbal, y además en el que la célula madre limbal está presente en el anillo corneolimbal, y/o

(b) de la célula madre limbal y de la membrana de Descemet aislada:

(i) la misma córnea; o

(ii) de córneas diferentes.

12. Uso de una membrana de Descemet aislada, en la que la membrana de Descemet se ha descelularizado y separado del estroma corneal, para favorecer la proliferaciónin vitrode una célula madre limbal.

13. La membrana de Descemet aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 u obtenida por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el trasplante de una membrana de Descemet aislada a una superficie ocular de un paciente que la necesite, opcionalmente en el que el paciente presenta al menos uno de:

(a) una deficiencia parcial de células madre limbares, una deficiencia total de células madre limbares, un defecto epitelial persistente, una erosión epitelial, una úlcera corneal, una fusión corneal o una enfermedad de la superficie ocular; o bien

(b) un traumatismo de la superficie ocular, una erosión recurrente, una fusión corneal o una úlcera corneal estéril.