ES2990971T3 - Nuevos anticuerpos anti-SIRPa y sus aplicaciones terapéuticas - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona nuevos anticuerpos anti-SIRPa capaces de antagonizar específicamente la interacción entre SIRPa y CD47, sin afectar la interacción entre SIRPg y CD47, y sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos anticuerpos anti-SIRPa y sus aplicaciones terapéuticas
Sector de la técnica
La invención pertenece al campo de la inmunoterapia. La presente invención proporciona nuevos anticuerpos anti-SIRPa capaces de disminuir específicamente la interacción entre SIRPa y CD47 sin afectar la interacción entre SIRPg y CD47.
Estado de la técnica
El direccionamiento a los puntos de control inmunitario de la inmunidad adaptativa ha demostrado una gran eficacia terapéutica para combatir numerosos cánceres, pero en una proporción limitada de pacientes. Los puntos de control inmunitario en células mieloides (macrófagos, células dendríticas, MDSC, PMN) siguen estando poco estudiados, mientras que estas células representan el tipo de célula inmunitaria más abundante en muchos tumores sólidos y, con frecuencia, se asocian con un mal pronóstico.
La proteína alfa reguladora de señales o SIRPa (también designada como SIRPa, CD172a o SHPS-1), se expresa en monocitos, la mayoría de las subpoblaciones de macrófagos tisulares, granulocitos, subconjuntos de células dendríticas en tejidos(linfoides, algunas células progenitoras de la médula ósea y en niveles variables en las neuronas, con una expresión notablemente alta en áreas del cerebro ricas en sinapsis, como la capa granular del cerebelo y el hipocampo. SIRPa es el miembro prototípico de la familia de receptores emparejados SIRP de proteínas SIRP estrechamente relacionadas. El gen que codifica SIRPa humana es un gen polimórfico y se han descrito varias variantes en la población humana. Las variantes de proteína más comunes son SIRPa v1 y v2 (números de registro NP_542970 (P78324) y CAA71403). Los polimorfismos en SIRP humana provocan cambios en los aminoácidos expuestos en superficie, pero esto no afecta la unión a CD47.
La interacción de SIRPa, expresada por células mieloides, con el receptor ubicuo CD47 es un importante punto de control inmunitario de la respuesta innata, implicado en la regulación de las funciones mieloides. La interacción de SIRPa con CD47 está ampliamente descrita y proporciona una señal reguladora por disminución que inhibe la fagocitosis de la célula hospedadora. CD47 se expresa ampliamente en niveles bajos en la mayoría de las células sanas, pero también se sobreexpresa en algunas células cancerosas. Por lo tanto, CD47 funciona como una señal de "no me comas". Tanto CD47 como SIRPa también participan en muchas otras interacciones. Una de las funciones fisiológicas mejor caracterizadas de la interacción CD47-SIRPa es su papel en la homeostasis de las células hematopoyéticas, en particular glóbulos rojos y plaquetas. Debido a que CD47 sirve como una señal de "no me comas" y, como tal, es un determinante importante de la fagocitosis de la célula hospedadora por macrófagos, la contribución potencial de la interacción CD47-SIRPa en la eliminación de las células cancerosas se ha investigado intensamente en los últimos años. Se ha demostrado que la abundancia de receptores CD47 en los tumores está inversamente correlacionada con la supervivencia global del paciente y constituye un factor pronóstico adverso para varios tipos de cáncer.
La vía SIRPa/CD47 está actualmente sujeta a diferentes desarrollos farmacéuticos para mejorar la fagocitosis de macrófagos. De hecho, como células infectadas, las células cancerosas llevan una carga aberrante tales como proteínas desconocidas o proteínas normales a niveles anormales, sin embargo, estas células subvierten frecuentemente los mecanismos innatos de control inmunitario al sobreexpresar simultáneamente moléculas inmunorreguladoras. Cada vez está más claro que uno de tales mecanismos implica a CD47, una proteína "propia" expresada por células normales. CD47 interactúa con SIRPa y da lugar a la transmisión de una señal de "no me comas" a los macrófagos fagocíticos, que luego dejan las células objetivo intactas. La sobreexpresión de CD47 por las células cancerosas las hace resistentes a los macrófagos, incluso cuando las células cancerosas están recubiertas con anticuerpos terapéuticos y se correlaciona con malos resultados clínicos en numerosos cánceres sólidos y hematológicos. En modelos experimentales, en particular modelos de xenoinjerto de tumor humano en ratones inmunodeficientes, el bloqueo de la vía CD47/SIRPa mediante agentes dirigidos a CD47 fue muy eficaz para promover la eliminación de tumores por parte de los macrófagos y disminuir la diseminación de células cancerosas y la formación de metástasis. El bloqueo de la vía CD47/SIRPa a través de agentes dirigidos a CD47, al mejorar la fagocitosis dependiente de anticuerpos por macrófagos, se ha descrito que actúa en sinergia con el agotamiento de los anticuerpos anticancerosos terapéuticos como Trastuzumab (anti-Her2), Cetuximab (anti-EGFR), Rituximab (anti-CD20) y Alemtuzumab (anti-CD52).
No obstante, recientemente se ha demostrado que los agentes dirigidos a CD47 (anti-CD47 o SIRPa-Fc) presentan toxicidad hematológica (anemia o trombocitopenia) relacionada con el papel fisiológico de CD47.
Además, CD47 también interactúa con otro miembro de la familia SIRP, SIRP-gamma (también designado como SIRPg, SIRPy, CD172g o SIRP beta 2) que está presente en la superficie de linfocitos T humanos y no en células mieloides humanas. SIRPg es el resultado de una duplicación del gen SIRPb en primates del viejo mundo hace casi 35 millones de años y se expresa de manera restringida en los linfocitos T a diferencia de la expresión de SIRPa en las células mieloides. SIRPg está ausente en ratones. Se ha demostrado que la interacción SIRPg-CD47 media la adhesión célula-célula, mejora la proliferación mediada por linfocitos T dependiente de superantígenos y coestimula la activación de linfocitos T (Piccioet al.,Blood, 105:6, 2005).
Debido a la alta similitud de secuencias entre SIRPa y SIRPg, en particular en la región que interactúa con CD47, los anticuerpos anti-SIRPa descritos en la técnica anterior también se unen a SIRPg y tienen efectos indeseables en humanos, como una inhibición de la proliferación de linfocitos T y una disminución de la respuesta inmunitaria. No se pudieron predecir tales efectos secundarios de los anticuerpos anti-CD47 o anti-SIRPa no selectivos, ya que las pruebas de los anticuerpos conocidos se realizaron en modelos de ratones, que no poseen el gen SIRPg, y por lo tanto tales efectos secundarios estaban ausentes.
Por tanto, sigue existiendo una necesidad significativa en la técnica de agentes nuevos y mejorados, en particular, anticuerpos, para inmunoterapia segura, en concreto, contra el cáncer, dirigidos a las células inmunitarias innatas sin impacto perjudicial en las respuestas inmunitarias de linfocitos T. En particular, existe la necesidad de inhibir la interacción SIRPa-CD47 sin afectar la interacción SIRPg-CD47. Los presentes inventores han dado un paso adelante significativo con la invención desvelada en el presente documento.
Se han proporcionado anticuerpos anti-SIRPa en la técnica anterior, por ejemplo en Leeet al.(Journal of Immunology, 2007), Hatherleyet al.(o Liuet al.Los anticuerpos anti-SIRPa divulgados en la técnica anterior exhiben capacidades de unión para otros miembros de la familia de proteínas SIRP, incluyendo SIRPb y SIRPg. Con el objetivo de proporcionar anticuerpos útiles en la terapia, los anticuerpos anti-SIRPa que afectan otras vías distintas a la vía CD47/SIRPa pueden tener efectos nocivos, por ejemplo, en la respuesta inmunitaria general. El propósito de la invención es satisfacer esta necesidad proporcionando nuevos agentes, en particular, anticuerpos, que permitan resolver total o parcialmente los problemas antes mencionados.
Objeto de la invención
En el presente documento, los inventores proporcionan nuevos anticuerpos anti-SIRPa, en particular anticuerpos humanizados, que antagonizan la interacción SIRPa-CD47 pero no se unen específicamente a SIRPg y, por lo tanto, no afectan la interacción SIRPg-CD47.
Los anticuerpos de la invención presentan en particular las siguientes ventajas:
- evitan la toxicidad hematológica debido a la expresión restringida de SIRPa (sin unión a glóbulos rojos (GR) y plaquetas humanos);
- reducen el crecimiento tumoral y modifican el microambiente tumoral en monoterapia;
- presentan efecto sinérgico con inhibidores de puntos de control y agentes coestimuladores;
- inducen respuestas duraderas y robustas de los linfocitos T de memoria antitumoral;
- permiten respuestas inmunitarias de linfocitos T humanos, siendo antagonista selectivo de la interacción SIRPa-CD47, sin perturbar la interacción CD47/SIRPg. De manera inesperada, los inventores proporcionan dichos anticuerpos selectivos a pesar de la alta identidad de secuencia entre las secuencias SIRPa y SIRPg.
Estos nuevos anticuerpos seleccionados en función de estas características son en particular prometedores para numerosas aplicaciones terapéuticas, en particular para el tratamiento de cáncer, incluidos cánceres inflamatorios y cánceres con células mieloides infiltradas (en particular con MDSC y/o células TAM infiltradas).
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 y - un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33.
ANTICUERPOS SIRPa (CON EPÍTOPOS)
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a al menos un péptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la materia.
Por conveniencia, se proporciona el significado de determinados términos y expresiones empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" comprende anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o anticuerpos recombinantes.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpos, anticuerpos que comparten una secuencia de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera común, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos "policlonales" que contienen una mezcla de anticuerpos de diferente secuencia de aminoácidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar mediante varias tecnologías conocidas, como presentación en fagos, bacterias, levadura o ribosómica, así como mediante métodos clásicos ejemplificados por anticuerpos derivados de hibridomas. Por lo tanto, el término "monoclonal" se utiliza para referirse a todos los anticuerpos derivados de un clon de ácido nucleico.
Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos recombinantes. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo recombinante" se refiere a los anticuerpos que se producen, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos que se expresan usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora; anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes; anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico debido a genes de inmunoglobulina humana; o anticuerpos que se producen, se expresan, se generan o se aíslan de cualquier otra manera en la que secuencias particulares de genes de inmunoglobulina (tales como secuencias de genes de inmunoglobulina humana) se ensamblan con otras secuencias de ADN. Los anticuerpos recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos quiméricos y humanizados.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que la secuencia del dominio variable derivado de la línea germinal de una especie de mamífero, tal como un ratón, se ha injertado en la secuencia del dominio constante derivado de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ser humano.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Como se usa en el presente documento, un "fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo" significa una parte de un anticuerpo, es decir, una molécula correspondiente a una parte de la estructura del anticuerpo de la invención, que presenta capacidad de unión a antígeno para SIRPa, posiblemente, en su forma nativa; dicho fragmento presenta en especial la misma o esencialmente la misma especificidad de unión al antígeno por dicho antígeno en comparación con la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo de cuatro cadenas correspondiente. Ventajosamente, los fragmentos de unión al antígeno tienen una afinidad de unión similar a la de los anticuerpos de 4 cadenas correspondientes. No obstante, el fragmento de unión al antígeno que tiene una afinidad de unión al antígeno reducida con respecto a los anticuerpos de 4 cadenas correspondientes también se incluye dentro de la invención. La capacidad de unión al antígeno se puede determinar midiendo la afinidad entre el anticuerpo y el fragmento diana. Estos fragmentos de unión al antígeno también pueden designarse "fragmentos funcionales" de anticuerpos.
Los fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos son fragmentos que comprenden sus dominios hipervariables designados CDR (regiones determinantes de la complementariedad) o parte/s de los mismos que abarcan el sitio de reconocimiento para el antígeno, es decir, el dominio extracelular de SIRPa, definiendo de esta manera la especificidad de reconocimiento del antígeno.
Cada dominio variable de cadena ligera y pesada (respectivamente VL y VH) de una inmunoglobulina de cuatro cadenas tiene tres CDR, denominadas VL-CDR1 (o LCDR1), VL-CDR2 (o LCDR2), VL-CDR3 (o LCDR3) y VH-CDR1 (o HCDR1), VH-CDR2 (o HCDR2), VH-CDR3 (o HCDR3), respectivamente.
El experto en la materia es capaz de determinar la ubicación de las distintas regiones/dominios de los anticuerpos haciendo referencia a las definiciones estándar expuestas a este respecto, incluyendo un sistema de numeración de referencia, una referencia al sistema de numeración de KABAT o por aplicación del algoritmo IMGT "collier de perle". A este respecto, para la definición de las secuencias de la invención, se observa que la delimitación de las regiones/dominios puede variar de un sistema de referencia a otro. Por consiguiente, las regiones/dominios tal como se definen en la presente invención abarcan secuencias que muestran variaciones en la longitud o localización de las secuencias en cuestión dentro de la secuencia de longitud completa de los dominios variables de los anticuerpos, de aproximadamente /- 10 %.
Basándose en la estructura de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, los fragmentos de unión a antígeno pueden definirse por lo tanto mediante comparación con secuencias de anticuerpos en las bases de datos disponibles y en la técnica anterior, y especialmente mediante comparación de la ubicación de los dominios funcionales en esas secuencias, observando que las posiciones de los dominios marco y constante están bien definidas para diversas clases de anticuerpos, especialmente para las IgG, en particular para las IgG de mamíferos. Esta comparación también incluye datos relacionados con las estructuras tridimensionales de los anticuerpos.
Para fines ilustrativos de realizaciones específicas de la invención, los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo que contienen los dominios variables que comprenden las CDR de dicho anticuerpo abarcan Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2. Los fragmentos Fv consisten en los dominios VL y VH de un anticuerpo asociados entre sí por interacciones hidrófobas; en fragmentos dsFv, el heterodímero VH:VL se estabiliza mediante un enlace disulfuro; en fragmentos scFv, los dominios VL y VH están conectados entre sí a través de un conector peptídico flexible, formando así una proteína de cadena única. Los fragmentos Fab son fragmentos monoméricos obtenibles por digestión con papaína de un anticuerpo; comprenden toda la cadena L y un fragmento VH-CH1 de la cadena H, unidos entre sí a través de un enlace disulfuro. El fragmento F(ab')2 puede producirse por digestión con pepsina de un anticuerpo debajo del disulfuro de la región bisagra; comprende dos fragmentos Fab', y adicionalmente una porción de la región bisagra de la molécula de inmunoglobulina. Los fragmentos Fab' se pueden obtener a partir de fragmentos F(ab')2 cortando un enlace disulfuro en la región bisagra. Los fragmentos F(ab')2 son divalentes, es decir, comprenden dos sitios de unión a antígeno, como la molécula de inmunoglobulina nativa; por otro lado, los fragmentos Fv (un atenuador de VHVL que constituye la parte variable de Fab), dsFv, scFv, Fab y Fab' son monovalentes, es decir, comprenden un único sitio de unión a antígeno. Estos fragmentos básicos de unión a antígeno de la invención pueden combinarse para obtener fragmentos de unión a antígeno multivalentes, tales como diacuerpos, tricuerpos o tetracuerpos. Estos fragmentos de unión a antígeno multivalentes también son parte de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, el término anticuerpos "biespecíficos" se refiere a anticuerpos que reconocen dos antígenos diferentes en virtud de poseer al menos una región (por ejemplo, derivada de una región variable de un primer anticuerpo) que es específica para un primer antígeno, y al menos una segunda región (por ejemplo, derivada de una región variable de un segundo anticuerpo) que es específica para un segundo antígeno. Un anticuerpo biespecífico se une específicamente a dos antígenos diana y, por lo tanto, es un tipo de anticuerpo multiespecífico. Anticuerpos multiespecíficos, que reconocen dos o más antígenos diferentes, pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante o incluir, pero sin limitación, anticuerpos producidos químicamente por cualquier método conveniente. Los anticuerpos biespecíficos incluyen todos los anticuerpos o conjugados de anticuerpos, o formas poliméricas de anticuerpos que son capaces de reconocer dos antígenos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos que se han reducido y reformado para conservar sus características bivalentes y anticuerpos que se han acoplado químicamente para que puedan tener varios sitios de reconocimiento de antígeno para cada antígeno, como BiME (anticuerpos biespecíficos potenciadores de macrófagos), BiTE (activador de linfocitos T biespecífico), DART (reorientación de afinidad dual); DNL (acoplamiento y bloqueo), DVD-Ig (inmunoglobulinas de dominio variable dual), HAS (albúmina sérica humana), kih (perillas en agujeros).
Varias investigaciones para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos han conducido al diseño de las regiones Fc para optimizar las propiedades de los anticuerpos permitiendo la generación de moléculas que se adapten mejor a la actividad farmacológica que se requiere de las mismas. La región Fc de un anticuerpo media su semivida en suero y sus funciones efectoras, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Varias mutaciones ubicadas en la superficie de contacto entre los dominios CH2 y CH3, tales como T250Q/M428L y M252Y/S254T/T256E H433K/N434F, han demostrado aumentar la afinidad de unión a FcRn y la semivida de IgG1in vivo.No obstante, no siempre existe una relación directa entre el aumento de la unión a FcRn y la mejora de la semivida. Un enfoque para mejorar la eficacia de un anticuerpo terapéutico es aumentar su persistencia en suero, permitiendo así mayores niveles en circulación, administración menos frecuente y dosis reducidas. Se pueden desear regiones Fc diseñadas para reducir o aumentar la función efectora del anticuerpo. Para los anticuerpos que se dirigen a las moléculas de la superficie celular, en especial, aquellas de las células inmunitarias, se requiere anular las funciones efectoras. En cambio, para los anticuerpos destinados al uso oncológico, el aumento de las funciones efectoras puede mejorar la actividad terapéutica. Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a los receptores Fcy de activación (FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa), al receptor FcYRIIb inhibidor y al primer componente del complemento (C1q) con diferentes afinidades, produciendo funciones efectoras muy diferentes. La unión de IgG a los FcyR o C1q depende de los restos ubicados en la región bisagra y en el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son fundamentales para la unión de los FcyR y C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo modificado" corresponde a una molécula que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento funcional del mismo está asociado con una molécula funcionalmente diferente. Un anticuerpo modificado de la invención puede ser una proteína quimérica de fusión o un conjugado resultante de cualquier forma adecuada de unión, incluida la unión covalente, injerto, enlace químico con un grupo químico o biológico o con una molécula, tal como un polímero de PEG u otro grupo protector o molécula adecuada para la protección contra la escisión de proteasasin vivo,para mejorar la estabilidad y/o la vida media del anticuerpo o fragmento funcional. Con técnicas similares, especialmente por acoplamiento químico o injerto, se puede preparar un anticuerpo modificado con una molécula biológicamente activa, siendo dicha molécula activa elegida, por ejemplo, entre toxinas, en particular la exotoxina A de Pseudomonas, la cadena A de la toxina vegetal ricina o toxina saporina, especialmente un principio activo terapéutico, un vector (que incluye especialmente un vector de proteína) adecuado para dirigir el anticuerpo o fragmento funcional a células o tejidos específicos del cuerpo humano, o se puede asociar con una etiqueta o con un enlazador, especialmente cuando se usan fragmentos del anticuerpo. La PEGilación del anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo es una realización particularmente interesante ya que mejora las condiciones de administración de la sustancia activa al huésped, especialmente para una aplicación terapéutica. La PEGilación puede ser específica del sitio para evitar interferencias con los sitios de reconocimiento de los anticuerpos o fragmentos funcionales, y puede realizarse con PEG de alto peso molecular. La PEGilación se puede lograr a través de residuos de cisteína libres presentes en la secuencia del anticuerpo o fragmento funcional o a través de residuos de cisteína libres agregados en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento funcional.
Las macromoléculas de la descripción comprenden anticuerpos y fragmentos de los mismos pero también comprenden proteínas artificiales, péptidos y cualquier compuesto químico con capacidad de unirse a antígenos semejante a la de los anticuerpos, también denominado en este documento anticuerpo mimético de unión a antígeno. Estas proteínas comprenden afitinas y anticalinas. Las afitinas son proteínas artificiales con la capacidad de unirse selectivamente a antígenos. Se derivan estructuralmente de la proteína de unión a ADN Sac7d, encontrada enSulfolobus acidocaldarius,un microorganismo perteneciente al dominio Archaea. Al aleatorizar los aminoácidos en la superficie de unión de Sac7d, por ejemplo, generando variantes correspondientes a sustituciones aleatorias de 11 residuos de la interfaz de unión de Sac7d, se puede generar una biblioteca de afitina y someter la biblioteca de proteínas resultante a rondas de presentación en ribosomas, la afinidad puede dirigirse hacia diversas dianas, tales como péptidos, proteínas, virus y bacterias. Las afitinas son miméticos de anticuerpos y se están desarrollando como herramientas en biotecnología. También se han utilizado como inhibidores específicos de diversas enzimas (Krehenbrinket al.,J. mol. Biol., 383:5, 2008). El experto en la materia puede desarrollar fácilmente anticalinas con las propiedades de unión requeridas utilizando métodos conocidos en la técnica, en particular como se divulga en la solicitud de patente WO2008068637 y la publicación citada anteriormente, en particular la generación de bibliotecas de presentación en fagos y/o presentación en ribosomas y su selección utilizando un antígeno como se divulga en el presente documento. Las anticalinas son proteínas artificiales que son capaces de unirse a antígenos, ya sea a proteínas o a pequeñas moléculas. Son miméticos de anticuerpo derivados de lipocalinas humanas, que son una familia de proteínas que se unen naturalmente. Las anticalinas son aproximadamente ocho veces más pequeñas, con un tamaño de aproximadamente 180 aminoácidos y una masa de aproximadamente 20 kDa (Skerra, Febs J., 275:11, 2008). Se han generado bibliotecas de presentación en fagos de anticalina que permiten la detección y selección, en particular de anticalinas con propiedades de unión específicas. El experto en la materia puede desarrollar fácilmente afitinas con las propiedades de unión requeridas utilizando métodos conocidos en la técnica, en particular como se divulga en la patente europea EP1270725 B1, patente estadounidense US8536307 B2, (Schlehuber y Skerra, Biophys. Chem., 96:2-3, 2002) y la publicación citada anteriormente, en particular la generación de bibliotecas de presentación en fagos y/o presentación en ribosomas y su selección utilizando un antígeno como se divulga en el presente documento. Tanto las anticalinas como las afitinas pueden producirse en varios sistemas de expresión que comprenden sistemas de expresión bacterianos. Por lo tanto, la descripción proporciona afitinas, anticalinas y otros miméticos de anticuerpo similares con las características de los anticuerpos descritos en el presente documento, en particular en lo que respecta a la unión a SIRPa, la inhibición de la interacción entre SIRPa y CD47, la no unión a SlRPg, la no unión a linfocitos T, la no inhibición de la proliferación de linfocitos T, la no inhibición de la interacción entre SlRPg y CD47 todas ellas contempladas como macromoléculas de la invención.
Todas las realizaciones divulgadas en el presente documento para anticuerpos o fragmentos de los mismos se transponenmutatis mutandisa las macromoléculas de la descripción, en particular a los miméticos de anticuerpo que se unen a antígeno.
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" significa la parte de un antígeno a la que se une el anticuerpo. Los epítopos de los antígenos proteicos se pueden dividir en dos categorías, epítopo conformacional y epítopo lineal. Un epítopo conformacional corresponde a secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Un epítopo lineal corresponde a una secuencia continua de aminoácidos del antígeno.
En la descripción, los péptidos que están presentes dentro de SIRPa y que están unidos por los anticuerpos anti-SIRPa son constitutivos del epítopo reconocido específicamente por estos anticuerpos.
En la descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a al menos dos, tres, cuatro o cinco péptidos que comprenden o que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente al péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E) dentro de SIRPa y a al menos un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a los péptidos que comprenden o que consisten en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a al menos un péptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 7 (GRELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 8 (KFRKGSPDDVE), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a los péptidos de la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 7 (GRELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 8 (KFRKGSPDDVE), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a al menos un péptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 9 (ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 10 (KFRKGSPDTE), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE).
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a los péptidos de la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 9 (ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 10 (KFRKGSPDTE), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a al menos un péptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 11 (GRELIYN), DVE, SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a los péptidos de la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 11 (GRELIYN), DVE, SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a al menos un péptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 13 (ARELIYN), SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a los péptidos de la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 13 (ARELIYN), SEQ ID NO: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE) dentro de SIRPa.
Los péptidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 corresponden a epítopos lineales.
Los inventores han identificado estos epítopos lineales mediante una exploración de oligopéptidos basada en matrices (a veces llamado exploración de péptidos superpuestos o análisis pepscan). Esta técnica utiliza una biblioteca de secuencias de oligopéptidos de segmentos superpuestos y no superpuestos de una proteína diana y somete a prueba su capacidad para unirse al anticuerpo de interés. Combinando secuencias de péptidos no adyacentes de diferentes partes de la proteína diana y reforzando la rigidez conformacional de este péptido combinado (por ejemplo, mediante el uso de andamios CLIPS) (Timmermanet al.,2007, J Mol Recognit., Sep-Oct;20(5):283-99), los epítopos discontinuos se pueden mapear con muy alta confiabilidad y precisión (Gaseitsiweet al.,2010 - Clin Vaccine Immunol. Enero; 17(1): 168-175). Todos los anticuerpos sometidos a prueba de la invención, incluyendo HEFLB, se unen específicamente a dichos epítopos.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR), SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) y SEQ ID NO: 72 (SPRDITLKW) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende o que consiste en los péptidos de la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR), SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) y SEQ ID NO: 72 (SPRDITLKW) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR) y SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN).
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende o que consiste en los péptidos de la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR) y SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 73 (YNQK) y "SIR" dentro de SIRPa.
En una realización, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende o que consiste en el péptido de secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73 (YNQK) y el péptido de secuencia de aminoácidos SIR dentro de SIRPa.
Los péptidos de la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 y SIRP corresponden a epítopos conformacionales. Estos epítopos conformacionales se han determinado por los inventores utilizando procedimientos de protección de la proteólisis (digestión enzimática: quimotripsina, tripsina del complejo anticuerpo-antígeno inmovilizado en cromatografía de afinidad) seguido de análisis de espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF) para detectar y secuenciar dichos péptidos de interés, como lo sabe bien un experto en la materia (Van de Wateret al.,Clinical Immunology and Immunopathology, 1997, vol. 85). El antígeno utilizado fue la SIRPa humana (número de acceso NP_542970) y uno de los anticuerpos de la invención utilizado fue la variante HEFLB.
El anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno de acuerdo con la invención se une específicamente a dichos epítopos conformacionales que comprenden o que consisten en dichos péptidos en su disposición conformacional dentro del SIRPa nativo.
El péptido de secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73 (YNQK) corresponde al péptido que consiste en aminoácidos en la posición 80 a 83 en la secuencia de aminoácidos de SIRPa humana referenciada por el número de acceso NP_542970.
El péptido de la secuencia de aminoácidos SIR, el péptido SIR, corresponde al péptido que consiste en los aminoácidos en la posición 105 a 107 en la secuencia de aminoácidos de SIRPa humana referenciada por el número de acceso NP_542970.
Como se usa en el presente documento, el término "SIRPa" se refiere a una proteína SIRPa de una especie de mamífero, preferentemente una SIRPa humana (por ejemplo, números de acceso NP_542970 (P78324) y CAA71403).
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo anti-SIRPa" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a SIRPa, en particular a una SIRPa humana.
La unión específica entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y el epítopo (o la región que comprende el epítopo) implica que el anticuerpo exhibe una afinidad apreciable por el epítopo (la región que comprende el epítopo) en una proteína o antígeno particular (en este caso SIRPa). La "afinidad apreciable" incluye la unión con una afinidad de aproximadamente 10'9 M (KD) o más fuerte. Preferentemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión está entre 10'9 M y 10'12 M, opcionalmente entre 10'9 M y 10'10 M, en particular 10'10 M. Se puede comprobar fácilmente si un dominio de unión reacciona específicamente con o se une a una diana mediante, entre otras cosas, comparación de la reacción de dicho dominio de unión con una proteína diana o antígeno con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de la proteína diana.
La afinidad se puede determinar mediante diversos métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, análisis Biacore, análisis de Blitz y diagrama de Scatchard.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que tiene un valor de KD inferior a 10-9 M, preferentemente inferior a 10-10 M de SIRPa, más preferentemente inferior a 1,10-11 M, particularmente por análisis Biacore.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que disminuye la interacción entre SIRPa y CD47.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que inhibe parcial o completamente, en particular, completamente, la unión de CD47 a SIRPa, en particular de CD47 humano a SIRPa humano.
Un anticuerpo de este tipo de la invención se une específicamente a SIRPa y antagoniza la interacción entre SIRPa y CD47.
En particular, el anticuerpo antagonista anti-SIRPa de la invención es capaz de reducir o inhibir la unión de CD47 a SIRPa en al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, preferentemente un 80 %, más preferentemente un 90 % o lo más preferentemente un 100 %, en comparación con una molécula de control negativo, en un ensayo de unión.
En particular, el anticuerpo antagonista anti-SIRPa de la invención es capaz de reducir o inhibir la unión de CD47 a SIRPa en del 50 % al 100 %, preferentemente del 60 % al 90 %, más preferentemente del 70 % al 80 %, en comparación con una molécula de control negativo, en un ensayo de unión.
Los métodos de determinación de la especificidad y afinidad de los anticuerpos por inhibición competitiva son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlowet al.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Colliganet al.,Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc.,<n>Y (1992; 1993); Muller, Meth. Enzym., 92: 589-601 (1983)) y se describen en los ejemplos que se presentan a continuación.
Estos métodos incluyen, pero sin limitación, análisis Biacore, análisis Blitz, citometría de flujo y ensayo ELISA.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa como se definió anteriormente que tiene una CI50 inferior a 500 ng/ml, en particular inferior a 400 ng/ml, 300 ng/ml, más particularmente inferior a 200 ng/ml, como se determina en un ensayo de unión competitiva a SIRPa entre CD47 y el anticuerpo anti-SIRPa mediante ELISA.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa como se definió anteriormente que tiene una CI50 inferior a 500 ng/ml, en particular inferior a 400 ng/ml, 300 ng/ml, más particularmente inferior a 200 ng/ml, inferior a 150 ng/ml y aún más particularmente inferior a 100 ng/ml como se determina por ensayo de citometría de competición en monocitos humanos entre CD47 y el anticuerpo anti-SIRPa.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no se une específicamente a SIRPg, preferentemente a SIRPg humana.
Un anticuerpo de este tipo de la invención no afecta ni impide la interacción entre SIRPg y CD47.
Como se usa en el presente documento, el término "SIRPg" se refiere a una proteína reguladora de señales gamma (también denominada SIRP gamma, CD172g o SIRP beta 2), de una especie de mamífero, preferentemente una SIRPg humana.
Una secuencia de referencia de la proteína SIRPg humana, utilizada en los ejemplos de la presente solicitud, corresponde a la secuencia asociada al número de acceso Q9P1W8.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que tiene un valor KD superior a 10'9 M, preferentemente superior a 10'8 M, más preferentemente superior a 10'7 M de SIRPg, en particular mediante el análisis Blitz.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no inhibe, antagoniza, significativamente la unión de CD47 a SIRP-g, que no compite significativamente con la unión de CD47 a SIRPg.
Este efecto antagonista puede determinarse utilizando los métodos definidos en los ejemplos de la presente solicitud.
En la invención, se puede considerar que un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno) no antagoniza la unión de CD47 a SIRPg si dicho anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno) no induce ningún aumento, o induce un aumento inferior a 1 log, del valor KD de CD47 en un ensayo competitivo de unión a SIRPg mediante Blitz.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no se une específicamente a linfocitos T, en particular a linfocitos T CD3+.
En particular, el anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o anticuerpo mimético de unión a antígeno de la invención no se une a linfocitos T de especies de mamíferos, en particular a linfocitos T humanos.
En particular, se considera que un anticuerpo anti-SIRPa (o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno) no se une específicamente a linfocitos T humanos si, en una población de linfocitos T humanos aislados de PBMC de un donante sano, menos del 10 %, preferentemente menos del 5 %, más preferentemente menos del 2 %, lo más preferentemente menos del 1 % de la población de linfocitos T humanos se reconocen por dicho anticuerpo anti-SIRPa (o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno).
Este efecto puede medirse mediante los métodos descritos en los ejemplos de la presente solicitud. En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no inhibe significativamente la proliferación de linfocitos T, en particular linfocitos T CD3+, preferentemente de especies de mamíferos y más preferentemente de linfocitos T humanos.
En particular, se considera que un anticuerpo anti-SIRPa no inhibe significativamente la proliferación de linfocitos T si la proliferación de linfocitos T se reduce en menos del 30 %, preferentemente menos del 20 %, más preferentemente en menos del 10 %, lo más preferentemente menos del 5 % en comparación con un control negativo.
La proliferación de linfocitos T se puede determinar mediante diversos métodos. Por ejemplo, la proliferación de linfocitos T se puede medir mediante la incorporación de H3-timidina como se describe en los ejemplos de la presente solicitud.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no inhibe, antagoniza, significativamente la unión de proteínas tensioactivas a SIRP-a, que no compite significativamente con la unión de las proteínas tensioactivas a SIRPa.
Como se usa en el presente documento, las "proteínas tensioactivas" son lectinas de tipo C (dependientes de calcio) que contienen colágeno, que contribuyen significativamente a la homeostasis de tensioactivos y a la inmunidad pulmonar (para una revisión, véase Kishoreet al.,Surfactant proteins SP-A and SP-D: structure, function and receptors, Mol Immunol, 43(9), 1293-315, 2006).
Como se usa en el presente documento, el término "proteína tensioactiva" se refiere a una proteína tensioactiva de una especie de mamífero, preferentemente una proteína tensioactiva humana.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no inhibe la unión de la proteína tensioactiva humana D (SP-D) a SIRPa.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no inhibe la unión de la proteína tensioactiva humana A (SP-A) a SIRPa.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que no antagoniza la interacción entre las proteínas tensioactivas y SIRPa.
La competición entre SIRPa y las proteínas tensioactivas se puede determinar mediante un ensayo competitivo utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, análisis Biacore, análisis Blitz y ensayo ELISA.
En la invención, se puede considerar que un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno) no antagoniza la unión de una proteína tensioactiva a SIRPa si dicho anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno) no induce ningún aumento, o induce un aumento inferior a 1 log, del valor KD de la proteína tensioactiva en un ensayo competitivo de unión a SIRPa mediante Blitz.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que se une débilmente o no se une específicamente a SIRPb.
Como se usa en el presente documento, el término "SIRPb" se refiere a una proteína SIRPb (también designada como SIRPp, proteína reguladora de señales beta-1, SIRP-beta-1, miembro B de la familia similar a antígeno CD172 B o CD172b) de una especie de mamífero, preferentemente una SIRPb humana.
Una secuencia de referencia de la proteína SIRPb humana, utilizada en los ejemplos de la presente solicitud, corresponde a la secuencia asociada al número de acceso Q5TFQ8-1.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que tiene un valor KD superior a 10'9 M, preferentemente superior a 10'8 M para SIRPb, en particular mediante el análisis Blitz.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD) o SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),
- HCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 (GGTGTMAWFAY), SEQ ID NO: 18 (GGTGTLAWFAY), SEQ ID NO: 19 (GGTGTMAYFAY) o SEQ ID NO: 20 (GGTGTLAYFAY),
- LCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), y
- LCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
18D5 / Variante A /Variante B
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 (SYWVH), HCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD),
HCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 (GGTGTMAWFAY),
LCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), y
- LCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
Variante C
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),
- HCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 (GGTGTMAWFAY),
- LCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), y
- LCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
Variante E
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 (SYWVH), HCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),
HCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 (GGTGTLAWFAY),
LCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), y
- LCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
Variante F
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 (SYWVH), HCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),
HCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19 (GGTGTMAYFAY),
LCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), y
- LCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
Variante EF
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),
- HCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20 (GGTGTLAYFAY),
- LCDR1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS), y
- LCDR3 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
Dichos anticuerpos anti-SIRPa pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 y/o HCDR2 y/o HCDR3 de los anticuerpos humanos como se proporciona en el presente documento; y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 y/o LCDR2 y/o LCDR3 de los anticuerpos humanos como se proporciona en el presente documento.
Dicho anticuerpo puede comprender una variante de secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de los anticuerpos humanos proporcionados, cuya variante comprende una o más inserciones de aminoácidos dentro o adyacentes a un residuo de CDR y/o deleciones dentro o adyacentes a un residuo de CDR y/o sustituciones de residuo(s) de CDR (siendo la(s) sustitución (sustituciones) el tipo preferido de alteración de aminoácidos para generar dichas variantes).
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 y/o
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N<o>: 31, SEQ ID<n>O: 32 y SEQ ID NO: 33.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la s Eq ID n O: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID No : 31, SEQ ID n O: 32 y SEQ ID NO: 33.
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33.
Las secuencias de los dominios variables específicos se dan en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1.Ejemplos de dominios variables de cadena pesada y dominios variables de cadena ligera de anticuerpos de acuerdo con la invención.
continuación
Las secuencias de los dominios variables de los anticuerpos ejemplificados en la presente invención pueden deducirse de las combinaciones de las secuencias mostradas en la Tabla 2.
Tabla 2.Dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos específicos de acuerdo con la invención.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33.
Se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:
33, y
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la s Eq ID n O: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30.
La invención se refiere preferentemente a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 29 y SEQ ID NO: 30,
más preferentemente
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 30,
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33, que es parte de la presente invención,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 28 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 28 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33, que es parte de la presente invención,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33, que es parte de la presente invención,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32,
o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33, que es parte de la presente invención.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que no tiene sustitución del aminoácido W en la posición 33 (W33) en el dominio variable de cadena pesada, identificándose dicha posición con respecto a la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30, y/o no tiene sustitución de los aminoácidos Y en la posición 39 (Y39), R en la posición 55 (R55) y/o F en la posición 60 (F60) en el dominio variable de la cadena ligera, identificándose dichas posiciones con respecto a la SEQ ID NO: 31, S<e>Q ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33, en particular no tiene sustitución en la posición W33 en el dominio variable de cadena pesada y no tiene sustitución en las posiciones Y39, R55 y F60 en el dominio variable de cadena ligera.
En la invención, los anticuerpos se pueden producir con cualquier dominio constante de cadena pesada y cadena ligera.
En una realización, el anticuerpo anti-SIRPa humana de la invención es un anticuerpo monoclonal humanizado, en particular, en donde el dominio constante de cadena ligera del anticuerpo se deriva de un dominio constante de cadena ligera kappa humana, más particularmente en donde el dominio constante de cadena ligera consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35, y en donde el dominio constante de cadena pesada del anticuerpo se deriva de un dominio constante de cadena pesada (tipo natural o mutada) de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, en particular de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana, más en particular en donde el dominio constante de cadena pesada del anticuerpo consiste en la secuencia con la SEQ ID NO: 34.
Como bien sabe un experto en la materia, la elección de los isotipos IgG del dominio constante de la cadena pesada se centra en si se requieren funciones específicas y en la necesidad de una semividain vivoadecuada. Por ejemplo, los anticuerpos diseñados para la erradicación selectiva de las células cancerosas generalmente requieren un isotipo activo que permita la activación del complemento y la destrucción celular mediada por el efector mediante la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los isotipos humanos tanto IgG1 como IgG3 (semivida más corta) cumplen estos criterios, en particular, el isotipo IgG1 humano (tipo silvestre y variantes). En particular, dependiendo del isotipo IgG del dominio constante de la cadena pesada (en particular, el tipo natural humano y las variantes del isotipo IgG1), el anticuerpo anti-SIRPa humana de la invención puede ser citotóxico para las células que expresan SIRPa a través de un mecanismo de CDC, ADCC y/o ADCP (Salfeld, nature biotechnology, vol. 25, n.° 12, 2007; Iraniet al.Molecular Immunology, vol. 67, número 2, parte A, 2015). De hecho, la región del fragmento cristalizable (Fc) interactúa con una variedad de moléculas auxiliares para mediar funciones efectoras indirectas tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Tabla 3.Ejemplos de un dominio constante de cadena pesada y un dominio constante de cadena ligera adecuados ara los anticuer os de acuerdo con la invención.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa como se definió anteriormente que comprende:
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 56 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 57,
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43,
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, que es parte de la presente invención,
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, que es parte de la presente invención,
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, que es parte de la presente invención,
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, que es parte de la presente invención.
gera de anticuer os es ecíficos de acuerdo con la invención
L
P
continuación
continuación
continuación
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente que es capaz de inducir la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras. En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente, en donde dichas células no supresoras secretan citocinas proinflamatorias tales como IL6, IL12 y TNF, y ningún nivel o nivel bajo de citocinas antiinflamatorias como IL10 y TGFp.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente, en donde dichas células no supresoras expresan iNOS.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente, en donde dichas células no supresoras no expresan los marcadores MHC Clase II y expresan los marcadores CD80-CD86.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente, en donde dichas células no supresoras expresan al menos un marcador de las células citolíticas naturales (NK).
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de inhibir la polarización M2 de los macrófagos y/o favorece a los macrófagos de tipo M1 proinflamatorios.
Los anticuerpos de la invención pueden modificar la polarización de los macrófagos para inducir un entorno proinflamatorio, es decir, pueden inhibir la señal antiinflamatoria proporcionada por los macrófagos de tipo M2 y/o favorecer la señal proinflamatoria proporcionada por los macrófagos de tipo M1. Este enfoque permite restablecer un entorno inflamatorio favorable a la acción de los linfocitos T efectores, en particular en la eliminación de las células cancerosas.
ANTICUERPOS SIRPa
Las realizaciones recitadas para los anticuerpos como se definieron anteriormente se repitenmutadis mutandisa los anticuerpos enunciados en los otros aspectos de la invención.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID No : 70 (ELIYNQKEGHFPR), Se Q ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) y SEQ ID NO: 72 (SPRDITLKW) dentro de SIRPa.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende o que consiste en los péptidos de la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR), SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) y SEQ ID NO: 72 (SPRDITLKW) dentro de SIRPa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR) y SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN).
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende o que consiste en los péptidos de la SEQ ID NO: 70 (ELIYNQKEGHFPR) y SEQ ID NO: 71 (RNNMDFSIRIGN) dentro de SIRPa.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 73 (YNQK) y SIR.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo conformacional que comprende o que consiste en los péptidos de la SEQ ID NO: 73 (YNQK) y SIR dentro de SIRPa.
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que comprende:
a) una cadena pesada que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y/o
b) una cadena ligera que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3,
en donde dichas CDR se definen de la siguiente manera:
- HCDR1 que comprende o que consiste en un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 (SYWVH), - HCDR2 que comprende o que consiste en un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD) o SEQ ID NO: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG),
- HCDR3 que comprende o que consiste en un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 (GGTGTMAWFAY), SEQ ID NO: 18 (GGTGTLAWFAY), SEQ ID NO: 19 (GGTGTMAYFAY) o SEQ ID NO: 20 (GGTGTLAYFAY),
- LCDR1 que comprende o que consiste en un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY),
- LCDR2 que comprende o que consiste en un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 (RVSNRFS) y
- LCDR3 que comprende o que consiste en un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 (FQGTHVPYT).
En la presente descripción, se divulga un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg, en particular que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
APLICACIONES
En otro aspecto, la invención se refiere a:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención,
para su uso como un medicamento.
La presente descripción también divulga un método de tratamiento en un sujeto que lo necesita que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
La presente descripción también divulga el uso de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en la fabricación de un medicamento.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
para su uso en el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras.
Como se define en el presente documento, "una afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras" corresponde a un cáncer que incluye cánceres inflamatorios y cánceres con células mieloides infiltradas (en particular con MDSC y/o células TAM infiltradas), una enfermedad infecciosa, un traumatismo, una enfermedad autoinmunitaria (como artritis reumatoide, diabetes tipo 1, lupus, psoriasis), una vacunación, una enfermedad inflamatoria crónica (como la enfermedad inflamatoria intestinal, incluida la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, aterosclerosis o disfunciones de trasplante.
La presente descripción también divulga un método de tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
La presente descripción también divulga el uso de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras.
La presente descripción también divulga:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
para su uso en el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos a macrófagos proinflamatorios.
De hecho, SIRPa actúa como un inhibidor de puntos de control y participa en la polarización de los macrófagos. En particular, el bloqueo de SIRPa induce una función proinflamatoria de los macrófagos asociados a los macrófagos tipo 1 (M1 proinflamatorio = M (IFNg)) e inhibe la actividad supresora de los macrófagos en el tumor, ya que el perfil proinflamatorio de los macrófagos se obtiene a expensas de los macrófagos tipo 2 (alta actividad fagocítica tipo M2 = M (IL4)). Por lo tanto, un antagonista de SIRPa es capaz de inhibir la polarización fenotípica M2 de los macrófagos y/o favorece la función proinflamatoria de los macrófagos de tipo M1 y puede utilizarse con fines terapéuticos.
Como se define en el presente documento, "una afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos para favorecer a los macrófagos proinflamatorios" corresponde por ejemplo a un cáncer sólido, un cáncer líquido, una enfermedad infecciosa, un traumatismo, una enfermedad autoinmunitaria, una vacunación, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis o una enfermedad inflamatoria crónica. La presente descripción también divulga un método de tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos a macrófagos proinflamatorios en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
En la presente descripción, se divulga el uso de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos a macrófagos proinflamatorios. Modificar la polarización de los macrófagos para favorecer las células proinflamatorias puede ser útil en diversas patologías o situaciones. Como se ha descrito anteriormente, esta modificación es particularmente útil en el contexto de los cánceres, para restablecer una actividad antitumoral de los macrófagos y/o prevenir la actividad protumoral de los macrófagos de tipo M2. Respuestas inmunitarias inadecuadas debido a un exceso de polarización de los macrófagos de tipo M2 también se producen en enfermedades infecciosas, fibrosis, vacunación, traumatismos y enfermedades inflamatorias crónicas.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización particular, el anticuerpo anti-SIRPa se puede utilizar para tratar a un individuo que tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cánceres de pulmón, cánceres de mesotelioma, cánceres de ovario, cánceres de hígado, cánceres de vejiga, cánceres de cerebro, cánceres de mama, cánceres de colon, sarcomas, cánceres de páncreas, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de riñón, timomas, gliomas, melanomas y cánceres hematológicos como linfomas (linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), leucemias como la leucemia linfoblástica aguda o crónica T y B (ALL o CLL) o leucemia mieloide aguda o crónica (AML o CML) y los mielomas.
En una realización, la invención se refiere a:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención
para su uso en el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en un cáncer (en particular cánceres inflamatorios y cánceres con células mieloides infiltradas, particularmente con MDSC y/o células TAM infiltradas), una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y disfunción de trasplante.
En una realización, la descripción divulga un método de tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en un cáncer (en particular cánceres inflamatorios y cánceres con células mieloides infiltradas, particularmente con MDSC y/o células TAM infiltradas), una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y una disfunción de trasplante en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
En una realización, la descripción divulga el uso de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en un cáncer (en particular cánceres inflamatorios y cánceres con células mieloides infiltradas, particularmente con MDSC y/o células TAM infiltradas), una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y disfunción de trasplante.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención, para sus usos como se definieron anteriormente, en donde dicho anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra a un paciente que presenta un tumor SIRPa positivo.
En una realización, la invención se refiere a:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención,
para su uso en vacunación.
En una realización, la descripción divulga un método de vacunación de un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
En una realización, la descripción divulga el uso de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
para la fabricación de una vacuna.
Las células mieloides supresoras limitan la eficacia de la vacunación, especialmente en niños pequeños. Por lo tanto, un anti-SIRPa /g limitaría el beneficio proporcionado por un anti-SIRPa en la respuesta a la vacuna, evitando que los linfocitos T respondan a la vacunación.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se puede administrar en una variedad de vías adecuadas, por ejemplo, por vía intravenosa (IV), por vía subcutánea (SC), o, por vía intramuscular (IM) al sujeto.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede administrar solo o en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, un segundo anticuerpo monoclonal humano o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otro ejemplo, el anticuerpo se administra junto con otro agente, por ejemplo, un agente inmunosupresor, un agente estimulante de la eritropoyesis (ESA), en combinación con composiciones celulares terapéuticas y similares.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso como se define anteriormente, en donde el anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno se combina con un segundo agente terapéutico.
En particular, los anticuerpos anti-SIRPa de la presente invención se pueden combinar con algunas posibles estrategias diferentes para superar los mecanismos de evasión inmunitaria del tumor con agentes en desarrollo clínico o ya en el mercado (véase la tabla 1 de Antoniaet al.Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014):
1- revertir la inhibición de la inmunidad adaptativa (bloqueando las vías del punto de control de los linfocitos T), por ejemplo, usando una molécula anti-CTLA4, una molécula anti-PD1 o una molécula anti-PD-L1;
2- activar la inmunidad adaptativa (potenciando la señalización del receptor coestimulador de linfocitos T usando moléculas agonistas, en particular, anticuerpos), por ejemplo, dirigiendo a CD137 (4-1BB) utilizando moléculas agonistas que incluyen anticuerpos agonistas anti-CD137 (anti-4-1BB) o ligandos CD137 (4-1BB);
3- mejorar la función de las células inmunitarias innatas;
4- activar el sistema inmunitario (potenciando la función efectora de las células inmunitarias), por ejemplo, a través de estrategias basadas en vacunas.
La administración del segundo agente terapéutico puede ser simultánea o no con la administración del anticuerpo anti-SIRPa. Dependiendo de la naturaleza del segundo agente, se puede preparar una coadministración en forma de un fármaco de combinación (producto), también conocido como "combo". Un combo es una combinación de dosis fija que incluye dos o más principios activos farmacéuticos combinados en una única forma de dosificación, que se fabrica y distribuye en dosis fijas. Sin embargo, la pauta posológica y/o la vía de administración también pueden diferir.
En una realización preferida, este segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en agentes quimioterápicos, agentes de radioterapia, agentes inmunoterapéuticos, agentes de terapia celular (tales como células CAR-T), antibióticos y probióticos.
En particular, los agentes inmunoterapéuticos útiles en el contexto de la invención se seleccionan del grupo que consiste en vacunas terapéuticas (vacunas de ADN, ARN o péptidos), bloqueadores o activadores del punto de control inmunitario, en particular de células inmunitarias adaptativas (linfocitos T o B) o inmunoconjugados como conjugados anticuerpo-fármaco.
Como se usa en el presente documento, el término "agentes inmunoterapéuticos" se refiere en particular a agentes que podrían hacer que las vacunas contra el cáncer pasaran de ser fenómenos biológicos interesantes a agentes terapéuticos eficaces, incluyendo: factores de crecimiento de linfocitos T para aumentar el número y el repertorio de linfocitos T vírgenes, factores de crecimiento para aumentar el número de células dendríticas (DC), agonistas para activar DC y otras células presentadoras de antígenos (APC), adyuvantes para permitir y aumentar las vacunas contra el cáncer, agonistas para activar y estimular los linfocitos T, inhibidores del bloqueo del punto de control de los linfocitos T, factores de crecimiento de linfocitos T para aumentar el crecimiento y la supervivencia de los linfocitos T inmunitarios, agentes para inhibir, bloquear o neutralizar las citocinas inmunosupresoras derivadas de las células cancerosas y de las células inmunitarias.
Se conocen en la técnica numerosos bloqueadores o activadores del punto de control inmunitario. En el contexto de la invención, ejemplos de bloqueadores o activadores del punto de control inmunitario de células inmunitarias adaptativas (linfocitos B o T) que podrían ser útiles son anti-PDL1, anti-PD1, anti-CTLA4, anti-CD137, anti-CD2, anti-CD28, anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TIM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 y anti-OX40, anti agonista de CD40, CD40-L, agonistas de TLR, anti-ICOS, agonistas de los receptores ICOS-L y de linfocitos B, en particular anti-PDL1, anti-PD1, anti-CD137.
Dicho agente inmunoterapéutico también puede ser un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral, en particular, seleccionado del grupo que consiste en anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD20, anti-CD19, anti-CD52.
El anticuerpo puede administrarse en una dosis efectiva de aproximadamente 1 ng/kg de peso corporal a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, o más. En realizaciones específicas, la dosis puede variar desde 1 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, opcionalmente desde 10 pg/kg hasta 10 mg/kg o desde 100 pg/kg hasta 5 mg/kg.
La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" o "cantidad eficaz" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. La expresión "dosis eficaz" quiere decir que abarca una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades o dosis eficaces para este uso dependerán de la afección a tratar, la construcción del anticuerpo entregado, el contexto y los objetivos terapéuticos, la gravedad de la enfermedad, terapia anterior, el historial clínico del paciente y su respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y/o la condición (la edad y la salud general) del paciente, y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente. La dosis adecuada se puede ajustar de forma que pueda administrarse al paciente una sola vez o en una serie de administraciones, y con el fin de obtener el efecto terapéutico óptimo.
La dosificación para tales fines puede repetirse según sea necesario, por ejemplo diariamente, bisemanal, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, o según sea necesario durante las recaídas.
En un aspecto, la descripción divulga:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
para su uso en una prueba diagnóstica, particularmente en la medicina personalizada, más particularmente en una prueba diagnóstica complementaria.
En una realización, la descripción divulga un método de diagnóstico, particularmente en la medicina personalizada, más particularmente en una prueba diagnóstica complementaria, utilizando:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en particular que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg.
En una realización, la descripción divulga el uso de:
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno como se definió anteriormente o
- un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y/o que no se une específicamente a linfocitos T y/o que no inhibe la proliferación de linfocitos T y/o que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg, en particular, que inhibe la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg y que no se une específicamente a linfocitos T y que no inhibe la proliferación de linfocitos T y que no inhibe la unión de CD47 a SIRPg,
en la fabricación de un medicamento para una prueba diagnóstica, particularmente en la medicina personalizada, más particularmente en una prueba diagnóstica complementaria.
En un aspecto, la invención también se refiere a un métodoin vitrooex vivo,en particular, un método adecuado para su uso en medicina personalizada, más en particular en una prueba complementaria, en donde un anticuerpo anti-SIRPa o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se utiliza para la detección de células SIRPa+ en una muestra obtenida previamente de un sujeto y opcionalmente para la cuantificación de la expresión de SIRPa.
En un aspecto, la descripción divulga el uso de un anticuerpo anti-SIRPa o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, en la fabricación de un medicamento adecuado para su uso en una prueba diagnóstica, en particular para su uso en medicina personalizada o en una prueba diagnóstica complementaria.
En un aspecto, la invención también se refiere al uso de al menos un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, como medio para la determinación de la expresión y/o nivel de expresión de SIRPa en una muestra biológica obtenida previamente de un individuo.
En un aspecto, la invención también se refiere a un métodoin vitrooex vivopara determinar células SIRPa positivas en un sujeto a partir de una muestra biológica obtenida previamente de dicho sujeto, que comprende:
i) determinarin vitrola expresión y/o el nivel de expresión de SIRPa, en una muestra biológica obtenida previamente de dicho sujeto utilizando el anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de anticuerpo de unión a antígeno de la invención.
En un aspecto, la invención también se refiere al uso, en particular,in vitrooex vivo,de al menos un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno de la invención en un método en donde SIRPa se usa como un biomarcador que es predictivo de la respuesta a un tratamiento en un sujeto, en particular, en un sujeto con cáncer.
En un aspecto, la invención también se refiere a un métodoin vitrooex vivopara predecir la respuesta de un sujeto con cáncer a un tratamiento, en particular, con un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, que comprende:
- determinar el nivel de expresión de SIRPa en una muestra de tumor obtenida previamente de un sujeto, en particular, con un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y - comparar el nivel de expresión de SIRPa con un valor representativo de un nivel de expresión de SIRPa en una población de sujetos que no responden,
en donde un nivel de expresión más alto de SIRPa en la muestra tumoral del sujeto es indicativo de un sujeto que responderá al tratamiento.
En un aspecto, la invención también se refiere a un método para determinarin vitrooex vivola presencia de células SIRPa+ en una muestra obtenida previamente de un sujeto, que comprende determinar la presencia de SIRPa como un biomarcador que es predictivo de la respuesta de un sujeto a un tratamiento, en particular una respuesta de un sujeto diagnosticado con cáncer, en donde dicho método comprende:
- determinar el nivel de expresión de SIRPa en una muestra tumoral obtenida previamente de un sujeto, en particular, con un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y
- comparar el nivel de expresión de SIRPa con un valor representativo de un nivel de expresión de SIRPa en una población de sujetos que no responden,
en donde un nivel de expresión más alto de SIRPa en la muestra tumoral del sujeto es indicativo de un paciente que responderá al tratamiento.
COMPOSICIONES
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" pretende abarcar una composición adecuada para su administración a un sujeto o paciente, tal como un mamífero, especialmente un ser humano. En general, una "composición farmacéutica" es estéril y normalmente in contaminantes que sean capaces de provocar una respuesta indeseable en el sujeto (por ejemplo, el compuesto(s) en la composición farmacéutica es de calidad farmacéutica).
Las composiciones farmacéuticas pueden diseñarse para su administración a sujetos o a pacientes que lo necesiten a través de varias vías de administración diferentes, incluyendo la oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, intraqueal y similares.
Como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar un excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante que son útiles para preparar una composición farmacéutica que generalmente son seguros, no tóxicos y ni biológicamente ni de otro modo indeseables, e incluyen un excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico. "Un vehículo farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en el presente documento incluye tanto uno como más de un excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante.
En particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende como principio activo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
PRODUCTOS DE COMBINACIÓN
En otro aspecto, la invención se refiere a un medio terapéutico, en particular, un medio de producto de combinación, que comprende como principios activos: un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención y un segundo agente terapéutico, en donde dichos principios activos están formulados para terapia separada, secuencial o combinada, en particular, para un uso combinado o secuencial.
En particular, la invención se refiere a un producto de combinación que comprende un anticuerpo anti-SIRPa o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención y un segundo agente terapéutico para su uso simultáneo, separado o secuencial como un medicamento.
En una realización, la invención se refiere a un producto de combinación como se ha definido anteriormente, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en agentes quimioterápicos, agentes de radioterapia, agentes de terapia celular, agentes inmunoterapéuticos, antibióticos y probióticos.
En una realización, la invención se refiere a un producto de combinación como se ha definido anteriormente, en donde dicho agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en vacunas terapéuticas, bloqueadores o activadores del punto de control inmunitario, en particular, de células inmunitarias adaptativas (linfocitos T y B) y conjugados de anticuerpo-fármaco.
En una realización, la invención se refiere a un producto de combinación como se ha definido anteriormente, en donde dicho bloqueador o activador de puntos de control inmunitario de células inmunitarias adaptativas (linfocitos T y B) se selecciona del grupo que consiste en anti-PDL1, anti-PD1, anti-CTLA4, anti-CD137, anti-Cü2, anti-CD28, anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TIM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 y anti-OX40, anti-agonista de CD40, CD40-L, agonistas de TLR, anti-ICOS, agonistas de los receptores ICOS-L y de linfocitos B, en particular seleccionado del grupo que consiste en anti-PDL1, anti-PD1 y anti-CD137.
En una realización, dicho agente inmunoterapéutico es un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral, en particular, seleccionado del grupo que consiste en anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD20, anti-CD19, anti-CD52.
En un aspecto, la descripción divulga un producto de combinación como se definió anteriormente, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras.
En una realización, la descripción divulga un método de tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar simultánea, separada o secuencialmente a dicho sujeto una cantidad eficaz de un producto de combinación como se definió anteriormente.
En una realización, la descripción divulga el uso de un producto de combinación como se definió anteriormente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse mediante la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (Mo-MDSC) en células no supresoras.
En un aspecto, la descripción divulga un producto de combinación como se definió anteriormente, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos a macrófagos proinflamatorios.
En una realización, la descripción divulga un método de tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos a macrófagos proinflamatorios en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar simultánea, separada o secuencialmente a dicho sujeto una cantidad eficaz de un producto de combinación como se definió anteriormente.
En una realización, la descripción divulga el uso de un producto de combinación como se define anteriormente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquier afección susceptible de mejorarse o prevenirse modificando la polarización de los macrófagos a macrófagos proinflamatorios.
En un aspecto, la invención se refiere a un producto de combinación como se ha definido anteriormente, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y disfunción del trasplante o para su uso en vacunación.
En una realización, la descripción divulga un método de tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y una disfunción de trasplante de un sujeto que lo necesita que comprende administrar simultánea, separada o secuencialmente a dicho sujeto una cantidad eficaz de un producto de combinación como se definió anteriormente.
En una realización, la descripción divulga el uso de un producto de combinación como se define anteriormente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica (como con Pseudomonas o CMV), fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y disfunción del trasplante o para su uso en vacunación.
ÁCIDOS NUCLEICOS
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente de acuerdo con la invención.
Como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria, lineal y circular. Preferentemente está comprendido en un vector que está preferentemente comprendido en una célula hospedadora.
En una realización, la descripción divulga una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico o consistiendo en al menos una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 69.
En una realización, la descripción divulga una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico:
- una secuencia que codifica el dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo, que comprende preferentemente:
- SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 60,
- SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 62 y
- SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66,
y/o
- una secuencia que codifica el dominio variable de cadena ligera de dicho anticuerpo, que comprende preferentemente:
- SEQ ID NO: 67,
- SEQ ID NO: 68 y
- SEQ ID NO: 69.
Tabla 5. Secuencias que codifican las CDR de los dominios variables de cadena pesada y las CDR de los dominios variables de cadena ligera de anticuerpos de acuerdo con la invención.
En particular, la descripción divulga una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55.
Tabla 6.Secuencias que codifican los dominios variables de cadena pesada y los dominios variables de cadena ligera de anticuer os de acuerdo con la invención.
AGGTGCA
CCTGGCT
TACACCTT
CGGCCAA
CCCCAGC
GACAAGG
GCTTATAT
CCGTGTA
GCTTGGTT
GTGTCTGC
continuación
AGGTGCAG
GCCAGGCG
CTACACCT
GATGCCAG
ACCCT AGC
GGACCATG
AGCCTATC
GCTATGTA
GGCTTGGT
AGTGTCTTC
AGGTGCAG
CCAGGCGA
TACTCCTTC
ATGCCAGG
CCCT AGCG
GACCATGT
GCCTATCT
CTATGTAC
GCTTGGTT
GTGTCTTCC
AGGTGCAG
CCAGGCGA
CTACTCTTT
ATGCCAGG
CCCCAGCG
GGCCATGT
GCCTATCT
GCTATGTA
GCTTGGTT
GTGTCTTCC
AGGTGCAG
CCAGGCGA
CT ACT CTTT
ATGCCAGG
CCCCAGCG
GGCCATGT
GCCTATCT
GCTATGTA
GCTTGGTT
GTGTCTTCC
AGGTGCAG
CCAGGCGA
CTACTCTTT
ATGCCAGG
CCCCAGCG
GGCCATGT
GCCTATCT
GCTATGTA
GCTTACTTC
GTGTCTTCC
(continuación)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG GCCAGGCGAGAGCCTGAGGATCT
GCTACTCTTTCACCTCCTATTGGG
GATGCCAGGCAAGGGCCTGGAGT ACCCCAGCGACTCTGATACACACT
GGGCCATGTGACCCTGTCCGTGG
AGCCTATCTGCAGCTGTCCAGCCT
CGCTATGTACTATTGCGTGAGGG
GGCTTACTTCGCTTATTGGGGCCA
AGTGTCTTCC
GACGTGGTCATGACCCAGACACC
TCCCTGGGCGATCAGGCCTCTATC
AGT CCCTGGTGCACAGCTAT G GC
GTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGT
CTACAGGGTGTCTAATCGGTTCTC
GTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCA
ATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGA CTGTTTTCAG G GCACCCATGTGCC
GGCACCAAGCTGGAGATCAAG
G ACGTGGTCATG ACACAGAGCCC
ACCCTGGGACAGCCAGCCTCTATC
AGTCCCTG GTG CACAG CT ATGGC
GTACCAGCAGAGGCCCGGACAGA TCTACAGGGTGTCTAATCGGTTCT
GGTTTAGCGGCTCTGGCTCCGGC
AGATCTCTAGAGTGGAGGCTGAG TTCTGTTTTCAGGGCACCCATGTG GCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
GACGTGGTCATGACACAGAGCCC
ACCCTGGGACAGCCAGCCTCTATC
AGTCCCTG GTG CACAG CTACGG C
GGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAG ATCTATAGGGTGTCTAATCGGTTC
GGTTTAGCGGATCTGGATCCGGA
AGATCTCTAGAGTGGAGGCTGAG TATTGTTTCCAGGGCACCCATGTG
GCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
VECTORES
En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente.
Como se usa en el presente documento, un "vector" es una molécula de ácido nucleico usada como vehículo para transferir material genético a una célula. El término "vector" engloba plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores diseñados comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable. En general, el propio vector es una secuencia de nucleótidos, comúnmente, una secuencia de ADN, que comprende una inserción (transgén) y una secuencia mayor que sirve como la "cadena principal" del vector. Los vectores modernos pueden englobar características adicionales además de la inserción transgénica y una cadena principal: un promotor, un marcador genético, resistencia a antibióticos, un gen indicador, una secuencia de dirección, un marcador de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (construcciones de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana, y, en general, tienen secuencias de control.
CÉLULAS HOSPEDADORAS
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora aislada que comprende un vector como se definió anteriormente. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" pretende incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda ser o haya sido receptor de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas y polinucleótidos codificantes de la construcción de anticuerpo de la presente invención; y/o receptores de la propia construcción de anticuerpo. La introducción del material respectivo a la célula puede llevarse a cabo mediante transformación, transfección y similares. La expresión "célula hospedadora" también pretende incluir la progenie o la posible progenie de una sola célula. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas, y también incluyen, pero sin limitación, bacterias, células de levadura, células de hongos, células vegetales y células animales tales como células de insectos y células de mamíferos,por ejemplo,murino, rata, conejo, de macaco o de ser humano.
KITS
En otro aspecto, la descripción divulga un kit que comprende:
- un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se definió anteriormente,
- una molécula de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno,
- un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico y/o
- una célula que comprende dicho vector.
Por cuestiones de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación empaquetada de reactivos.
En el contexto de la presente invención, el término "kit" significa dos o más componentes (uno de los cuales corresponde al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula de la invención) empaquetados juntos en un envase, recipiente o de otra manera. Por lo tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para lograr un determinado objetivo, que se puede comercializar como una sola unidad.
El kit puede comprender uno o más recipientes (como viales, ampollas, envases, jeringas, frascos, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiados que contiene la construcción de anticuerpo de la presente invención en una dosis apropiada para su administración. El kit puede contener adicionalmente instrucciones de uso (por ejemplo, en forma de folleto o manual de instrucciones), medios para administrar la construcción de anticuerpo de la presente invención, tales como una jeringa, bomba, infusor o similar, medios para reconstituir la construcción de anticuerpo de la invención y/o medios para diluir la construcción de anticuerpo de la invención.
En una realización, la descripción divulga un kit como se definió anteriormente para una unidad de administración monodosis. El kit de la invención también puede contener un primer recipiente que comprenda una construcción de anticuerpo seca/liofilizada y un segundo recipiente que comprenda una formulación acuosa. En determinadas realizaciones de la presente invención, se incluyen kits que contienen jeringas precargadas de una o varias cámaras (por ejemplo, jeringas con líquido y liojeringas).
ANTÍGENOS
En un aspecto, la descripción divulga un polipéptido, en particular un antígeno, que comprende o que consiste en la secuencia de epítopo de SIRPa humana que consiste en la SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E). En una realización, la descripción divulga un polipéptido, en particular un antígeno, que comprende o que consiste en la secuencia de epítopo de SIRPa humana que consiste en la SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), teniendo dicho polipéptido un tamaño de hasta 300 aminoácidos.
En una realización, el polipéptido tiene un tamaño entre 50 y 300, preferentemente entre 100 y 250 aminoácidos.
En una realización, el polipéptido tiene un tamaño de hasta 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos.
En una realización, la descripción divulga un polipéptido, en particular un antígeno, que comprende o que consiste en la secuencia de epítopo de SIRPa humana que consiste en la SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E) y al menos una secuencia de epítopo de SIRPa humana que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIP<v>G<p>), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) o SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE).
En una realización, la descripción divulga un polipéptido, en particular un antígeno, que comprende o que consiste en las secuencias de epítopo de SIRPa humana que consisten en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), S<e>Q ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE).
En una realización, la descripción divulga un polipéptido, en particular un antígeno, que comprende o que consiste en al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, consistiendo dicho polipéptido en una secuencia de hasta 300 aminoácidos.
En una realización, la descripción divulga un polipéptido, en particular un antígeno, que comprende o que consiste en el péptido de secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73 (YNQK) y/o el péptido de secuencia de aminoácidos SIR dentro de SIRPa, consistiendo dicho polipéptido en una secuencia de hasta 300 aminoácidos.
MÉTODO PARA FABRICAR UN ANTICUERPO
En un aspecto, la descripción divulga un método para fabricar un anticuerpo, en particular un anticuerpo de la invención, que comprende inmunizar a un animal no humano, en particular, un mamífero no humano, contra al menos un antígeno como se definió anteriormente, y en particular recoger el suero resultante de dicho animal no humano inmunizado para obtener anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno.
En particular, la descripción divulga un método para fabricar un anticuerpo que comprende inmunizar un animal no humano contra un antígeno que comprende o que consiste en la secuencia de epítopo de SIRPa humana que consiste en la SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), y en particular recoger el suero resultante de dicho animal no humano inmunizado para obtener anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno.
En particular, la descripción divulga un método para fabricar un anticuerpo que comprende inmunizar a un animal no humano contra un antígeno que comprende o que consiste en la secuencia de epítopo de SIRPa humana que consiste en la SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E) y al menos una secuencia de epítopo de SIRPa humana seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) o SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE), y en particular recoger el suero resultante de dicho animal no humano inmunizado para obtener anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno.
En particular, la descripción divulga un método para fabricar un anticuerpo que comprende inmunizar a un animal no humano contra un antígeno que comprende o que consiste en las secuencias de epítopo de SIRPa humana que consisten en la SEQ ID NO: 1 (SLIPVGP), SEQ ID NO: 2 (G/ARELIYNQKEGH), SEQ ID NO: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), SEQ ID NO: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), SEQ ID NO: 5 (ICEVAHVTLQG) y SEQ ID NO: 6 (YPQRLQLTWLE), y en particular recoger el suero resultante de dicho animal no humano inmunizado para obtener anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno.
MÉTODO PARA SELECCIONAR UN ANTICUERPO
En un aspecto, la descripción divulga un método para seleccionar un anticuerpo de la invención, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo, que comprende o que consiste en al menos una de las siguientes etapas:
a. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en los Ejemplos 1, 2 y 3) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para unirse a SIRPa, en particular a un antígeno como se definió anteriormente,
b. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en los Ejemplos 7 y 8) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para unirse a SIRPb,
c. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en los Ejemplos 9 y 10) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para unirse a SIRPg,
d. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en los Ejemplos 4 y 5) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para inhibir la unión de CD47 humano a SIRPa humana;
e. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo 12) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para unirse a linfocitos T;
f. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en el ejemplo 13) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para inhibir la proliferación de linfocitos T;
g. someter a prueba (por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo 11) la capacidad de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo para inhibir la unión de CD47 humano a SIRPg humana;
y que comprende opcionalmente la siguiente etapa:
- seleccionar un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o mimético de dicho anticuerpo que se une específicamente a SIRPa, en particular a un antígeno como se definió anteriormente, y que inhibe significativamente la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg humana y/o que no se une específicamente a linfocitos T humanos, y/o que no inhibe significativamente la proliferación de linfocitos T humanos y/o que no inhibe significativamente la unión de CD47 humano a SIRPg humana; más particularmente que se une específicamente a SIRPa, en particular a un antígeno como se definió anteriormente, y que inhibe significativamente la unión de CD47 a SIRPa y que no se une específicamente a SIRPg humana y que no se une específicamente a linfocitos T humanos y que no inhibe significativamente la proliferación de linfocitos T humanos y que no inhibe significativamente la unión de CD47 humano a SIRPg.
El método para seleccionar un anticuerpo de la invención puede realizarse ventajosamente además del método para fabricar un anticuerpo de acuerdo con la invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1.Análisis de unión de anticuerpos anti-SIRPa mediante ensayo ELISA (recubrimiento de SIRPa humana-His y detección de anti-kappa humana).
Evaluación mediante ELISA sobre SIRPa-His inmovilizado de quimérico (♦), HALA (□), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (■), HEFLB (■), SIRP29 (A ), Kwar23 (o) en laFigura A;de HCLA (•), HCLB (x), HELA (0), HELB (-) en laFigura B;de HALB(-),HBLA(_),HBLB(■)en laFigura C.La revelación se realizó con un anticuerpo anti-humano de burro y se reveló mediante colorimetría a 450 nm utilizando sustrato TMB. DE50 es la concentración del anticuerpo indicado para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo. Unión del clon m18D5 (■) (n=4), clon comercial SE5A5 (A) (n=7), clon 6G10 (v) (n=3) y clon 12D7 (□) (n=4) en laFigura D.
Figura 2.Análisis de afinidad mediante Biacore de anticuerpos anti-SIRP en la proteína recombinante SIRPa humana. La proteína recombinante SIRPa-His se inmovilizó en un chip CM5 a 5 pg/ml (500 RU) y se agregaron los anticuerpos indicados en diferente concentración. Los valores se midieron después de un período de asociación (ka) de 3 min seguido de un período de disociación de 10 min (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).
Figura 3.Análisis de unión de anticuerpos anti-SIRPa en monocitos humanos (homocigotos para la variante 1 de SIRPa (v1/v1)).
(A, B)Evaluación mediante citofluorometría en monocitos humanos v1/v1 (previamente teñidos con anticuerpo inhibidor de unión al receptor Fc humano) de quimérico (♦), HALA (□), H<f>L<a>(*), HFLB (+), HEFLA (), HE<f>L<b>(■), SIRP29 (A ), Kwar23 (o). La revelación se realizó con un AcM anti-Fc humano de ratón marcado con PE en un citómetro Cantoll, valores correspondientes al porcentaje de monocitos teñidos. DE50 es la concentración del anticuerpo indicado para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo.Figura Acorresponde al porcentaje de monocitos v1/v1 teñidos.Figura Bcorresponde a la media de la intensidad de fluorescencia (<i>F<m>) de los monocitos v1/v1.
(C, D)Estudio de la unión de anticuerpos SIRPa en monocitos humanos mediante citometría de flujo (FACS): se probaron diferentes anticuerpos anti-SIRPa: m18D5 (■) (n=1), SE7C2 (A)(n=2), 12D7 (□)(n=2), 6G10 (♦) (n=4):Figura Crepresenta la intensidad de fluorescencia media (IFM) de los diferentes anticuerpos con respecto a una respuesta a la dosis.Figura Drepresenta el porcentaje de monocitos teñidos con respecto a la respuesta a la dosis de anticuerpos. Se realizaron análisis estadísticos cuando fue posible.
(E, F, G)Unión de variantes de SIRPa en la población mediante anticuerpos anti-SIRPa h: La capacidad de diferentes anticuerpos anti-hSIRPa para unirse a variantes de SIRPa en los 32 voluntarios se midió mediante FACS con un PE-anti IgG de ratón. Todos los clones fueron probados a 10 pg/ml: m18D5 (■), 12D7 (▼), 6G10 (♦) y anticuerpos comerciales SE5A5 (□), SE7C2 (A).Figura Erepresenta los voluntarios de variante 1 homocigóticos (n=16).Figura Frepresenta los voluntarios de variante 2 homocigóticos (n=8).Figura Grepresenta los voluntarios de V1/V2 homocigóticos (n=8).
Figura 4.Competición de anticuerpos anti-SIRPa con CD47 en SIRPa.
(A)Evaluación mediante ELISA sobre SIRPa-His inmovilizado de quimérico (♦), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (A ) , HEFLB (■), SIRP29 (A ), Kwar23 (o) a diferentes concentraciones incubadas con concentración constante de CD47-Fc biotinilado (6 pg/ml). La revelación se realizó con estreptavidina peroxidasa para detectar la molécula de CD47 y se reveló mediante colorimetría a 450 nm utilizando sustrato TMB. Se dan los resultados de un segundo experimento con los valores CI50. CI50 es la concentración del anticuerpo indicado para inhibir el 50 % de la señal en este ensayo.
(B)Estudio de la actividad antagonista de los anticuerpos anti-SIRPa en la interacción SIRPa-CD47 mediante ELISA: Los diferentes anticuerpos anti-SIRPa se probaron en función de una respuesta a la dosis: clon m18D5 (■)(n=1), anticuerpo comercial SE5A5 (A)(n=2) y m12D7 (D)(n=2). La figura representa el porcentaje de interacciones SIRPa-CD47 positivas para CD47 medidas mediante ELISA durante una respuesta a la dosis de anticuerpos anti-hSIRPa.
Figura 5.Competición de anticuerpos anti-SIRPa con CD47 en monocitos humanos.
(A, B)Evaluación mediante citometría en monocitos humanos (v1/v1) de quimérico (♦), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (), HEFLB (■) a diferentes concentraciones incubadas con concentración constante de CD47-Fc biotinilado (10 pg/ml). La revelación se realizó con ficoeritrina-estreptavidina para detectar la molécula CD47 y se reveló mediante citómetro Cantoll. CI50 es la concentración del anticuerpo indicado para inhibir el 50 % de la señal en este ensayo.Figura Acorresponde al porcentaje de células positivas.Figura Bcorresponde a la media de la intensidad de fluorescencia.(C)Estudio de la actividad antagonista de los anticuerpos anti-SIRPa en la interacción Sirpa-CD47 mediante FACS: Los diferentes anticuerpos anti-SIRPa se probaron en función de una respuesta a la dosis: clon m18D5 (^)(n=1), anticuerpo comercial SE7C2 (A ) (n=2) y m12D7 (D)(n=2).
Figura Crepresenta el porcentaje de células positivas para CD47 medido mediante FACS después de la competición con anticuerpos anti-hSIRPa.
Figura 6. (A)Análisis de afinidad mediante Blitz del anticuerpo anti-SIRP en la proteína recombinante SIRPa humana preincubada o no con ligando SP-D. La proteína recombinante SIRPa-His se inmovilizó en un biosensor NINTA a 10 pg/ml y se añadió el ligando SP-D a 100 pg/ml (concentración de saturación). Luego se añadió el anticuerpo anti-SIRPa a 20 pg/ml y se dedujeron los valores de afinidad después de un período de asociación (ka) de 120 segundos seguido de un período de disociación de 120 segundos (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).(B)Análisis de afinidad mediante Blitz del anticuerpo anti-SIRP en la proteína recombinante SIRPa humana preincubada con el anticuerpo 18D5 de ratón. La proteína recombinante SIRPa-His se inmovilizó en un biosensor NINTA a 10 pg/ml y se añadió el anticuerpo anti-SIRPa a 20 pg/ml (concentración de saturación). Luego se añadió el ligando SP-D a 100 pg/ml y se dedujeron los valores de afinidad después de un período de asociación (ka) de 120 segundos seguido de un período de disociación de 120 segundos (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).
Figura 7. (A)Análisis de afinidad mediante Blitz de anticuerpos anti-SIRP en la proteína recombinante SIRPb humana. La proteína recombinante SIRPb-His se inmovilizó en un biosensor NINTA y se añadieron los anticuerpos indicados a 20 pg/ml. Los valores se dedujeron después de un período de asociación (ka) de 120 segundos seguido de un período de disociación de 120 segundos (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).(B)Análisis de unión de anticuerpos anti-SIRP (recubrimiento de SIRPb humana-His humano y detección de anti-kappa humana). Evaluación mediante ELISA sobre SIRPb-His inmovilizado de HEFLB (■), SIRP29 (A ), Kwar23 (o), B4B6 (♦) y control de Ac lgG4 ( ; ). La revelación se realizó con un anticuerpo anti-humano de burro con excepción de B4B6 revelado con un anticuerpo de ratón y revelado mediante colorimetría a 450 nm usando sustrato TMB.
Figura 8. (A)Análisis de afinidad mediante Blitz de anticuerpos anti-SIRP en la proteína recombinante SIRPg humana. La proteína recombinante SIRPg-His se inmovilizó en un biosensor NINTA y se añadieron los anticuerpos indicados a 10 pg/ml. Los valores se dedujeron después de un período de asociación (ka) de 120 segundos seguido de un período de disociación de 120 segundos (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).(B)Análisis de unión mediante ensayo ELISA de anticuerpos anti-SIRP en SIRPg (recubrimiento SIRPg-His humano y detección de anti-kappa humana). Evaluación mediante ELISA sobre SIRPg-His inmovilizado de HEFLB (■), SIRP29 (A), Kwar23 (o), LSB2-20 (•) y control de Ac lgG4 (■). La revelación se realizó con un anticuerpo anti-humano de burro y se reveló mediante colorimetría a 450 nm utilizando sustrato TMB.
Figura 9.Análisis de afinidad mediante Blitz de CD47 en la proteína recombinante SIRPg humana preincubada con anticuerpos anti-SIRP. La proteína recombinante SIRPg-His se inmovilizó en un biosensor NINTA a 10 pg/ml y los anticuerpos indicados se agregaron a 20 pg/ml (concentración de saturación). Entonces, se añadió el ligando CD47Fc a 100 pg/ml y se dedujeron los valores de afinidad después de un período de asociación (ka) de 120 segundos seguido de un período de disociación de 120 segundos (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).
Figura 10.Intensidad de fluorescencia media geométrica medida mediante citometría de flujo en(A)linfocitos T CD3+ humanos periféricos,(B)glóbulos rojos o(C)plaquetas después de la tinción con diferentes anticuerpos monoclonales y revelación con anticuerpo fluorescente secundario anti-IgG.
Figura 11.Porcentaje de linfocitos T CD3+ humanos periféricos positivos después de la tinción con diferentes anticuerpos monoclonales. La tabla indica el valor del % de células positivas en experimentos duplicados.
Figura 12.Los linfocitos T humanos aislados de células mononucleares de sangre periférica de voluntarios sanos fueron estimuladas con(A) (C)perlas anti-CD3+ y anti-CD28 en una relación de 1:1 durante 3 días o(B) (D)con células dendríticas alogénicas (DC) en una relación de 5 linfocitos T : 1 DC durante 5 días o(E)con diferentes concentraciones de derivado proteico no purificado de tuberculina (PPD) durante 5 días. Los anticuerpos se añadieron el día 0 del cultivo. La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.
Figura 13.Los linfocitos T CD8+ de ratón se aislaron de esplenocitos de ratones no sometidos previamente a experimentación. Los linfocitos T CD8 se estimularon con perlas anti-CD3+ y anti-CD28 en una relación de 1:1 durante 3 días. Los anticuerpos se añadieron el día 0 del cultivo. La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.
Figura 14.Los linfocitos T humanos aislados de células mononucleares de sangre periférica de voluntarios sanos se estimularon con células dendríticas (DC) alogénicas a una relación de 5 linfocitos T : 1 DC durante 5 días. Los anticuerpos se añadieron el día 0 del cultivo. La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.
Figura 15. (A)Efecto antitumoral de la administración i.p. de anti-SIRPa (clon P84) tres veces por semana durante 4 semanas (300 pg/inyección) en combinación o no con dos inyecciones (día 4 y 8) de AcM anti-4-1-BB (clon 3H3, 100 pg/inyección) o con inyecciones (dos veces por semana) de anti-PDL-1 (clon 10F.9G2, 200 pg/inyección, tratamiento durante 4 semanas) en un modelo ortotrópico de hepatoma murino (2,5x106 de células Hepa 1.6 inyectadas a través de la vena porta el día 0). Los ratones se consideraron curados cuando sobrevivieron tres veces más tiempo que el necesario para que murieran todos los ratones de control.(B)Las células infiltradas del tumor se analizaron el día 13 después de la inoculación del tumor.(C)Las células infiltradas del tumor y las células del bazo se analizaron el día 13 después de la inoculación del tumor.(D)Los ratones previamente curados en el modelo de hepatoma mediante inyección de anti-SIRPa anti-4-1BB o los ratones mutados con SIRPa tratados con anti-4-1BB fueron nuevamente estimulados mediante inyección de células Hepa 1.6 en el bazo (2,5106 células/ratón). Se inyectaron a los ratones no sometidos previamente a experimentación en paralelo en la misma vía para comparar el desarrollo del tumor con ratones reexpuestos. Luego los ratones quedaron sin tratar.(E)Los ratones previamente curados en el modelo de hepatoma con anti-SIRPa anti-4-1BB fueron nuevamente expuestos a una inyección de células Hepa 1.6 en el bazo (2,5x106 células/ratón) y se les extrajo el bazo 30 días después de la nueva exposición. Se aislaron esplenocitos y esplenocitos de linfocitos T. A los ratones no sometidos previamente a experimentación se les inyectó por vía intravenosa el vehículo, esplenocitos completos (10x106/ratón) o linfocitos T purificados a partir de esplenocitos (2,5x106/ratón) y todos recibieron una inyección de células Hepa1.6 en el bazo (2,5x106 células/ratón). Luego los ratones fueron dejados sin tratamiento y se consideró que estaban curados cuando sobrevivieron tres veces más tiempo que el necesario para que murieran todos los ratones de control.
Figura 16.Los ratones previamente curados en el modelo de hepatoma mediante la inyección de anti-SIRPa anti-PDL1 fueron nuevamente expuestos mediante la inyección de células Hepa 1.6 en el bazo (2,5x106 células/ratón). Se inyectaron a los ratones no sometidos previamente a experimentación en paralelo en la misma vía para comparar el desarrollo del tumor con ratones reexpuestos. Luego los ratones quedaron sin tratar.
Figura 17.Efecto antitumoral de la administración i.p. de anti-SIRPa (clon P84) tres veces por semana durante 4 semanas (200 pg/inyección) en un modelo ortotópico de carcinoma mamario murino (0,25x106 de células 4T1 inyectadas en la glándula mamaria). El desarrollo del tumor se evaluó midiendo el diámetro del tumor y se calculó de acuerdo con la fórmula: =(0,52*(d2))15. Los ratones fueron sacrificados cuando el desarrollo del tumor era de casi 1000 mm3 de acuerdo con las pautas éticas.
Figura 18.Análisis del fenotipo de células inmunitarias en el bazo, tumor y ganglios linfáticos de ratones tratados con anti-SIRPa (clon P84) o AcM de control i.p. tres veces por semana durante dos semanas (200 pg/inyección) en un modelo ortotrópico de carcinoma mamario murino (0,25x106 de células 4T1 inyectadas en la glándula mamaria). El análisis de células inmunitarias se realizó dos semanas después de la inoculación del tumor.
Figura 19.Se administraron anti-SIRPa (clon P84), anti-CD47 (clon MIAP410) y control de isotipo irrelevante por vía intraperitoneal el día 0 y el día 2 a 12 mg/kg en ratones C57BI/6. Se recogieron muestras de sangre el día 0 y el día 3 en tubos que contenían EDTA y se realizó un hemograma con un analizador de hematología XS-800i (Sysmex). El nivel de hemoglobina (izquierda) y el porcentaje de hematocrito (derecha) se evaluaron el día 3. Las líneas de puntos representan valores de intervalo normal en los ratones C57BI/6 para cada parámetro.
Figura 20.(Arriba) Análisis de citometría de flujo de AcM anti-SIRPa (HEFLB, gris) y anti-CD47 (B6H12, negro) en comparación con un AcM de control (línea de puntos) en plaquetas humanas recién aisladas de la sangre de donantes sanos. (Abajo) Medición de la agregación de plaquetas humanas utilizando un agregómetro óptico en presencia de 50 pg/ml de AcM de control, anti-SIRPa (HEFLB), anti-CD47 (B6H12) o anti-integrina aIIb como control positivo del inhibidor de la agregación. Se evaluaron anticuerpos en plaquetas no activadas y activadas con ADP.
Figura 21.Los linfocitos T CD4+ alogénicos se cultivaron en una relación de 1:1 con células mieloides CD14+ extraídas de ascitis de cáncer de ovario(A)fresco o(B)congelado con 10 pg/ml de anticuerpo de control (blanco), anti-SIRPa HEFLB (negro) o AcM anti-CD47 (gris). La proliferación se midió el día 5 por incorporación de 3H-timidina.(C)Como alternativa, los linfocitos T alogénicos se cultivaron en una relación de 5:1 con células dendríticas alogénicas y diferente relación de células mieloides CD14+ extraídas de ascitis de cáncer de ovario en presencia de 10 pg/ml de anticuerpo como en(A).
Descripción detallada de la invención
Ejemplos
En los siguientes Ejemplos, el anticuerpo "18D5" (o "m18D5") corresponde al anticuerpo de ratón 18D5, el anticuerpo "quimérico" corresponde al anticuerpo quimérico 18D5 de ratón/humano y los anticuerpos "HALA, HALB, HBLA, HBLB, HCLA, HCLB, HELA, HELB, HFLA, HFLB, HEFLA y HEFLB" corresponden a variantes de 18D5 humanizadas específicas. Los anticuerpos 6G10 y 12D7 pertenecen al Solicitante; estos anticuerpos se han obtenido mediante el mismo método que m18D5 y se utilizan como control. Estos anticuerpos de control son anticuerpos anti-SIRPa humana monoclonales de ratón IgG2a.
Además, se utilizaron anticuerpos comerciales para la comparación. El primero es un anticuerpo anti-SIRPa, denominado SE7C2 (Santa Cruz sc-23863); el segundo anticuerpo es un anticuerpo capaz de reconocer tanto SIRP a como p y se llama SE5A5 (BioLegend BLE323802); y el tercero es un anticuerpo anti-SIRPa humana llamado Kwar23 (Creative Biolabs). También se utilizó para comparación un anticuerpo anti-SIRPa humana denominado SIRP29 de la Universidad de Toronto descrito en la solicitud P<c>T WO2013056352.
Ejemplo 1. Análisis de unión de los anticuerpos anti-SIRPa en SIRPa mediante ELISA
Método:La actividad de unión de los anticuerpos anti-SIRPa se evaluó mediante ELISA. Para el ensayo ELISA con el anticuerpo quimérico, los anticuerpos humanizados, SIRP29 y Kwar23, una hSIRPa recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11612-H08H) se inmovilizó en plástico a 0,5 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2) y se añadió el anticuerpo purificado para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió anticuerpo anti-IgG humana de burro marcado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU.; referencia 709-035-149) y se reveló mediante métodos convencionales.
Para el ensayo ELISA con los anticuerpos de ratón, una hSIRPa recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10975-H08H) se inmovilizó en plástico a 0,5 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2) y se añadió el anticuerpo purificado para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió anticuerpo anti-cadena Fc de ratón de cabra marcado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; referencia 115-036-071) y se reveló mediante métodos convencionales.
Resultados:Como se muestra en laFigura 1A,1B y 1C, la actividad de unión de los diferentes anticuerpos anti-SIRPa en SIRPa medida mediante ELISA mostró concentraciones efectivas (CE50) de 2,9 ng/ml para el anticuerpo quimérico, 3,9 ng/ml para HALA, 5,1 ng/ml para HFLA, 4,0 ng/ml para HFl B, 7,1 ng/ml para HEFLA, 4,4 ng/ml de HEFLB en un primer experimento, 4,06 ng/ml para el anticuerpo quimérico, 5,60 ng/ml para HCLA, 5,59 ng/ml para HCLB, 4,61 ng/ml para HELA, 4,13 ng/ml para HELB en un segundo experimento y 2,74 ng/ml para el anticuerpo quimérico, 2,53 ng/ml para HALB, 2,68 ng/ml para HBLA, 2,95 ng/ml para HBLB en un tercer experimento. Estos resultados indican que los anticuerpos de la invención sometidos a prueba son buenos aglutinantes de SIRPa mediante ELISA en comparación con otros anticuerpos anti-SIRPa conocidos SIRP29 (3,7 ng/ml) y Kwar23 (3,3 ng/ml). Estos resultados indican que el epítopo reconocido por todos los anticuerpos de la invención es accesible cuando SIRPa recubre un pocillo de plástico.
Como se muestra en laFigura 1D, la actividad de unión de diferentes anticuerpos anti-SIRPa en SIRPa medida mediante ELISA mostró una dosis efectiva (DE50) de 0,16 nM (24 ng/ml) para SE5A5 y 0,06 nM (9 ng/ml) para el clon m18D5. Los clones 6G10 y 12D7 no parecieron unirse a SIRPa mediante ensayo ELISA. Estos resultados indican que el clon m18D5 es un buen aglutinante de SIRPa mediante ELISA en comparación con un anticuerpo comercial e indican que el epítopo reconocido por este clon es accesible cuando SIRPa está recubierto sobre un pocillo de plástico en comparación con los clones 6G10 y 12D7.
Ejemplo 2. Medición de la afinidad del biosensor de los anticuerpos anti-SIRPa para SIRPa
Método:Se inmovilizó hSIRPa recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11612-H08H) en un chip sensor CM5 (GeHealthcare; Francia) a 5 pg/ml (500 RU) y se aplicaron anticuerpos a diferentes concentraciones con un caudal de 40 pl/min. El análisis se realizó con un BIAcore 3000 (Biacore, GeHealthcare). Los valores se midieron después de un período de asociación (ka) de 3 min seguido de un período de disociación de 10 min (kd) para determinar la constante de afinidad (KD).
Resultados:Como se muestra en laFigura 2, los anticuerpos de la invención tienen una fuerte afinidad (KD) por SIRPa (de 1,93e-10 M a 3,67e-10 M), que es equivalente a la afinidad de los anticuerpos anti-SIRPa conocidos SIRP29 y Kwar23 y mejor que la afinidad de los anticuerpos anti-SIRPa comerciales SE7C2 y SE5A5.
Ejemplo 3. Ensayo de unión a SIRPa en monocitos humanos mediante citofluorometría
Método:Para medir la unión de los anticuerpos anti-SIRPa en monocitos humanos, se añadió en primer lugar inhibidor de la unión a receptor Fc humano (BD pharmingen; EE. UU.; referencia 564220) durante 30 min a temperatura ambiente para bloquear los receptores Fc humanos en monocitos humanos para reducir el fondo. Entonces, un anticuerpo se incubó durante 30 minutos a 4 °C y se lavó antes de teñir 30 minutos a 4 °C con Fc de IgG anti-humana marcado con PE (Biolegend; EE. UU.; referencia 409303). Para los anticuerpos de ratón, se usó un anticuerpo antilgG de ratón marcado con PE (Jackson Immunoresearch; referencia 715-116-151). Las muestras se analizaron en un citofluorómetro BD LSRII o Canto II.
Resultados:Como se muestra en laFigura 3, los resultados indican una fuerte unión de los anticuerpos anti-SIRPa de la invención en monocitos humanos y una unión a la proteína de unión (medida con la IFM (Intensidad Fluorescente Mediana)) que los anticuerpos anti-SIRPa conocidos Kwar23, SE7C2 y SE5A5.
Ejemplo 4. Análisis competitivo entre CD47 y los anticuerpos anti-SIRPa mediante ensayo ELISA de antagonistas
Método:Para el ensayo ELISA competitivo, se inmovilizó hSIRPa recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11612-H08H) sobre plástico a 0,5 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2). Para el anticuerpo quimérico, los anticuerpos humanizados, SIRP29 y Kwar23, se mezcló un anticuerpo purificado (a diferentes concentraciones) con 6 pg/ml final (concentración fija) de Cü47Fc humana biotinilada (AcroBiosystems interchim; Francia; referencia: #CD7-H82F6) para medir la unión competitiva durante 2 h a 37 °C. Tras la incubación y el lavado, se añadió estreptavidina marcada con peroxidasa (Vector laboratoring; EE. UU.; referencia SA-5004) para detectar la unión de Biotina-CD47Fc y se reveló mediante métodos convencionales.
Para los anticuerpos de ratón, se mezcló un anticuerpo purificado (a diferentes concentraciones) con 0,04 pg/ml de CD47Fc (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 12283-H02H) para medir la unión competitiva durante 2 h a 37 °C. Tras la incubación y el lavado, se añadió anticuerpo anti-Fc humano de burro marcado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; referencia 709-035-149) para detectar la unión a CD47Fc y se reveló mediante métodos convencionales.
Resultados:Como se muestra en laFigura 4, los anticuerpos de la invención tienen una actividad antagonista sobre la interacción SIRPa-CD47. En particular, se observa que el anticuerpo quimérico, HFLA, HFLB, HEFLA y HEFLB tienen una mejor actividad antagonista en comparación con la actividad antagonista de SIRP29 y el anticuerpo anti-SIRPa comercial SE5A5.
Ejemplo 5. Análisis competitivo entre CD47 y los anticuerpos anti-SIRPa humanizados en monocitos humanos mediante ensayo de citofluorometría de antagonistas
Método:Para medir la competición entre CD47 y los anticuerpos anti-SIRPa humanizados en monocitos humanos, se añadió un anticuerpo purificado a los monocitos durante 15 minutos a 4 °C, luego se mezcló con 5 pg/ml final de CD47Fc humano biotinilado (AcroBiosystems interchim; Francia; referencia: #CD7-H82F6) y se incubó durante 30 minutos a 4 °C para medir el anticuerpo de unión competitiva. Tras la incubación y el lavado, se añadió estreptavidina marcada con PE (BDBiosciences; EE. UU.; referencia 554061) durante 15 min a 4 °C para detectar la unión de Biotina-CD47Fc y se analizó en un citofluorómetro BD LSRII o Canto II.
Para medir la competición entre CD47 y los anticuerpos anti-hSIRPa de ratón en monocitos humanos, se añadió un anticuerpo purificado a los monocitos durante 15 minutos a 4 °C, luego se mezcló con 5 pg/ml final de CD47Fc (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 12283-H02H) y se incubó durante 15 min a 4 °C para medir el anticuerpo de unión competitiva. T ras la incubación y el lavado, se añadió anticuerpo anti-Fc humano marcado con FITC (Beckman Coulter; referencia IM1627) durante 15 min a 4 °C para detectar la unión de CD47Fc y se analizó en un citofluorómetro BD LSRII o Canto II.
Resultados:Como se muestra en laFigura 5, los anticuerpos de la invención tienen una actividad antagonista sobre la interacción SIRPa-CD47 en monocitos humanos.
Ejemplo 6. Competición por el método Blitz con SP-D
Método:Este método se realizó con un Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 No 61010-1).
Condición A: SIRPa Anticuerpo anti-SIRPa Proteína Tensioactiva D (SP-D). En una primera etapa, se inmovilizó proteína recombinante SIRPa (His) (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11612-H08H) a 10 pg/ml mediante una cola de histidina en un biosensor de Ni-NTA (Forté Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. En una segunda etapa, se añadieron anticuerpos anti-SIRPa a 20 pg/ml (concentración de saturación) durante 120 segundos. Entonces, se asoció SP-D humano (R et D Systems; EE. UU.; referencia 1920-SP-050) a 100 pg/ml, en competición con los anticuerpos anti-SIRPa, durante 120 segundos. La disociación de SP-D se realizó en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Condición B: SIRPa Proteína Tensioactiva D (SP-D) Anticuerpo anti-SIRPa. En una primera etapa, se inmovilizó proteína recombinante Sirp-a (His) (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11612-H08H) a 10 pg/ml mediante una cola de histidina en un biosensor de Ni-NTA (Forté Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. En una segunda etapa, se añadió SP-D humana (R et D Systems; EE. UU.; referencia 1920-SP-050) a 100 pg/ml durante 120 segundos. Entonces, se asociaron anticuerpos anti-SIRPa a 20 pg/ml (concentración de saturación) durante 120 segundos. Se realizó la disociación del anticuerpo anti-SIRPa en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Resultados:Como se muestra en laFigura 6, la unión del anticuerpo anti-SIRPa 18D5 no bloquea la unión de SP-D a SIRPa y la unión de SP-D no bloquea la unión de 18D5 a SIRPa. Por lo tanto, el anticuerpo de la invención no inhibe la interacción entre SIRPa y SP-D.
Ejemplo 7. Afinidad de los anticuerpos anti-SIRPa por SIRPb mediante el método Blitz
Método:Este método se realizó con un Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 No 61010-1). Se inmovilizó hSIRPb-His recombinante (Antibodies-online; EE. UU.; referencia ABIN3077231) a 10 pg/ml mediante una cola de histidina en un biosensor de Ni-NTA (Forté Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. Entonces, se asoció un anticuerpo anti-SIRPa a 20 pg/ml durante 120 segundos. Se realizó la disociación del anticuerpo anti-SIRPa en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Resultados:Como se muestra en laFigura 7A, los anticuerpos de la invención tienen una menor afinidad por SIRPb en comparación con SIRPa. En particular, se observa que el anticuerpo quimérico, HFLA, HFLB, HEFLA, h Ef LB tiene una afinidad reducida por SIRPb en comparación con SIRP29 y Kwar23.
Ejemplo 8. Unión mediante ELISA de anticuerpos anti-SIRP en SIRPb
Método:Para el ensayo ELISA de actividad, se inmovilizó hSIRPb-His recombinante (Antibodies-online; EE. UU.; referencia AB!N1466557) en plástico a 1 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2) y se añadió un anticuerpo purificado para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió anticuerpo anti-IgG humana de burro marcado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU.; referencia 709-035-149) y se reveló mediante métodos convencionales.
Resultados:Como se muestra en laFigura 7B, los anticuerpos anti-SIRPa tienen una baja afinidad por SIRPb. Se debe indicar que la revelación se realizó con un anticuerpo anti-humano de burro para todos los anticuerpos excepto B4B6 (revelado con un anticuerpo de ratón), lo que puede explicar que la señal obtenida para el anticuerpo anti-SIRPb B4B6 sea menor que la señal obtenida para los anticuerpos anti-SIRPa.
Ejemplo 9. Análisis de afinidad de los anticuerpos anti-SIRPa por SIRPg mediante el método Blitz
Método:Este método se realizó con un Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 No 61010-1). Se inmovilizó hSIRPg-His recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11828-H08H) a 10 pg/ml mediante una cola de histidina en un biosensor de Ni-NTA (Forté Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. Entonces, se asoció un anticuerpo anti-SIRPa a 20 pg/ml durante 120 segundos. Se realizó la disociación del anticuerpo anti-SIRPa en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Resultados:Como se muestra en laFigura 8A, los anticuerpos anti-SIRPa de la invención tienen una baja afinidad por SIRPg. Esta afinidad es ligeramente más débil que la afinidad de los anticuerpos anti-SIRPa conocidos SIRP29 y Kwar23. No obstante, las propiedades cinéticas difieren entre los anticuerpos anti-SIRPa, SIRP29 y Kwar23, con una constante de tasa de disociación (Kd) alta para los anticuerpos anti-SIRPa en comparación con SIRP29 y Kwar23. En particular, HFLB tiene la afinidad más baja por SIRPg con un valor KD de 1,036e-7 M que equivale a una diferencia de 2 log en comparación con los valores KD de SIRP29 y Kwar23.
Ejemplo 10. Unión mediante ELISA de los anticuerpos anti-SIRP en SIRPg
Método:Para el ensayo ELISA de actividad, se inmovilizó hSIRPg-His (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11828-H08H) en plástico a 1 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2) y se añadió anticuerpo purificado para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió anticuerpo anti-IgG humana de burro marcado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU.; referencia 709-035-149) y se reveló mediante métodos convencionales.
Resultados:Como se muestra en laFigura 8B, el anticuerpo anti-SIRPa HEFLB no se une a SIRPg, mientras que los anticuerpos anti-SIRPa conocidos SIRP29 y Kwar23 muestran una unión significativa a SIRPg.
Ejemplo 11. Competición mediante el método Blitz con CD47 para SIRPg: SIRPg anticuerpo anti-SIRPa CD47
Método:Este método se realizó con un Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 No 61010-1). En una primera etapa, se inmovilizó hSIRPg-His (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 11828-H08H) a 10 pg/ml mediante una cola de histidina en un biosensor de Ni-NTA (Forté Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. En una segunda etapa, se añadió un anticuerpo anti-SIRPa a 20 pg/ml (concentración de saturación) durante 120 segundos. Entonces, se asoció CD47Fc humano ((Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 12283-H02H) se asoció a 100 pg/ml, en competición con los anticuerpos anti-SIRPa, durante 120 segundos. La disociación de CD47Fc se realizó en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Resultados:Como se muestra en laFigura 9, el anticuerpo anti-SIRPa HEFLB de la invención no compite con la unión de CD47 a SIRPg. Por el contrario, los otros anticuerpos conocidos SIRP29 y, en particular, kwar23 compiten con la unión de CD47 a SIRPg.
Ejemplo 12. Unión a células sanguíneas mediante citometría de flujo
Método:El experimento se realizó para analizar la unión de los anticuerpos anti-SIRPa en células sanguíneas humanas. Se extrajeron linfocitos T CD3 positivos, glóbulos rojos y plaquetas de sangre purificada de voluntarios sanos. Las células se tiñeron durante 30 min a 4 °C con 10 microgramos/ml de cada anticuerpo sometido a prueba, se lavaron y luego se tiñeron con un anticuerpo anti-IgG fluorescente secundario durante otros 30 min a 4 °C. Después de los lavados, las células se analizaron en un citómetro de flujo CANTO II (BD Bioscience).
Resultados:Como se muestra en laFigura 10, los linfocitos T, los glóbulos rojos y las plaquetas son positivos para CD47, que se expresa de forma ubicua y se tiñeron con el anticuerpo B6H12. Los anticuerpos SIRP29 y Kwar23, como LSB2.20 (anticuerpo anti-SIRPy específico), se unen a los linfocitos T que se sabe que expresan SIRP<y>. No obstante, el anticuerpo humanizado 18D5 anti-SIRPa no se une a los linfocitos T (se obtuvieron los mismos resultados con cuatro variantes humanizadas de 18D5 diferentes probadas). Los glóbulos rojos y las plaquetas no expresan SIRPa y, por lo tanto, no se revelaron con el anticuerpo humanizado 18D5 y los otros anticuerpos anti-SIRPa. Este resultado muestra la especificidad del anticuerpo humanizado 18D5 para SIRPa en células vivas en comparación con los anticuerpos anti-SIRPa conocidos.
Como se muestra en laFigura 11, los linfocitos T no se tiñen con el anticuerpo humanizado 18D5 (se obtuvieron los mismos resultados con cinco variantes humanizadas diferentes de 18D5 probadas) y con el 18D5 quimérico (datos no mostrados), mientras que más del 70 % de los linfocitos T se tiñen con SIRP29 y Kwar23.
Ejemplo 13. Proliferación de linfocitos T CD3+ humanos
Método:Las hPBMC se aislaron de la capa leucoplaquetaria de voluntarios sanos. Los linfocitos T CD4 o CD8 se seleccionaron mediante selección positiva utilizando un AutoMACS (Miltenyi) y se colocaron en placa en una placa de 96 pocillos (50.000 células/pocillo). Las señales proliferativas fueron proporcionadas por microperlas recubiertas de anti-CD3/anti-CD28 (LifeTechnologies) en una relación de 1 perla por 1 linfocito T durante tres días, o células dendríticas maduras alogénicas generadasin vitroen una relación de 5 linfocitos T por 1 mDC durante 5 días o con diferentes concentraciones de derivado proteico no purificado de tuberculina (PPD) durante 5 días. Los anticuerpos dirigidos a la vía SIRPa/CD47 se añadieron desde el comienzo de la prueba de proliferación a una concentración de saturación (10 pg/ml). La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.Resultados:Como se muestra en laFigura 12, las variantes HALA y HEFLB de anticuerpo anti-SIRPa no inhiben la proliferación de linfocitos T cuando se estimulan con perlas anti-CD3+ y anti-CD28(A) (C)o con células dendríticas alogénicas(B) (D)o con PPD(E),mientras que el anticuerpo anti-SIRPa Kwar23 inhibe la proliferación de linfocitos T cuando los linfocitos T se estimulan con células dendríticas alogénicas. Como se esperaba, los anticuerpos anti-CD47 y el anticuerpo anti-SIRPg son inhibidores de la proliferación de linfocitos T.
Ejemplo 14. Proliferación de linfocitos T CD8+ en ratones
Método:Se aislaron esplenocitos de ratones no sometidos previamente a experimentación. Los linfocitos T CD8 se seleccionaron mediante selección positiva utilizando un AutoMACS (Miltenyi) y se colocaron en placa en una placa de 96 pocillos (50.000 células/pocillo). Las señales proliferativas fueron proporcionadas por microperlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 (LifeTechnologies) en una relación de 1 perla por 1 linfocito T durante tres días. Se añadieron un anticuerpo anti-SIRPa de ratón (P84) y un anticuerpo anti-CD47 (MIAP310) dirigidos a la vía SIRPa/CD47 desde el comienzo de la prueba de proliferación a una concentración de saturación (10 pg/ml). La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.
Resultados:Como se muestra en laFigura 13, no hay inhibición del anticuerpo anti-SIRPa o anti-CD47 sobre la proliferación de linfocitos T de ratón. Este resultado se explica por el hecho de que los ratones no expresan el gen SIRPg. Por lo tanto, los ratones se pueden utilizar como modelo para predecir los efectosin vivode un anticuerpo anti-SIRPa específico que no se une a SIRPg. En cambio, la eficacia preclínica de anticuerpos anti-CD47 o anti-SIRPa no selectivosin vivo,en particular sobre la inmunidad adaptativa y la generación de linfocitos T de memoria, no es predictiva de la situación humana.
Ejemplo 15. Proliferación de linfocitos T humanos
Método:Las hPBMC se aislaron de la capa leucoplaquetaria de voluntarios sanos. Los linfocitos T CD4 o CD8 se seleccionaron mediante selección positiva utilizando un AutoMACS (Miltenyi) y se colocaron en placa en una placa de 96 pocillos (50.000 células/pocillo). Las señales proliferativas fueron proporcionadas por microperlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 (LifeTechnologies) en una relación de 1 perla por 1 linfocito T durante tres días, o células dendríticas maduras alogénicas generadasin vitroen una relación de 5 linfocitos T por 1 mDC durante 5 días. Los anticuerpos se añadieron desde el inicio de la prueba de proliferación a una concentración de saturación (5 pg/ml para los anticuerpos anti-CD47 y anti-SIRPa y 2,5 pg/ml para los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 y el recombinante 4-1BBL). La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.
Resultados:Como se muestra en laFigura 14, los anticuerpos anti-PD-1/PD-LI y el 4-1BBL recombinante tienen un efecto potenciador sobre la proliferación de linfocitos T humanos, mientras que el anticuerpo anti-CD47 tiene un efecto negativo sobre la proliferación de linfocitos T humanos. En particular, el anticuerpo anti-CD47 previene la eficacia inmunoestimuladora de los linfocitos T humanos de los agentes agonistas anti-PD-1/PD-L1 o 4-1BB. El anticuerpo anti-SIRPa HEFLB no tiene un efecto significativo sobre la proliferación de linfocitos T.
Ejemplo 16. Efectos antitumorales en ratones
Método:Los ratones fueron anestesiados con un cóctel de xilazina/ketamina. Después de una laparotomía, se inyectaron células tumorales Hepa 1.6 a través de la vena porta (2,5x106 células/100 pl) en PBS. El tratamiento se inició 4 días después de la inyección del tumor. El anticuerpo monoclonal agonista anti-4-1BB (3H3) se inyectó dos veces en el día 4 y el día 8 después de la inyección por vía intraperitoneal de células Hepa 1.6 (células de hepatocarcinoma, HCC) en PBS (100 pg/inyección). El anticuerpo monoclonal anti-PDL1 se inyectó dos veces por semana durante 4 semanas por vía intraperitoneal en PBS (200 pg/inyección). El anticuerpo antagonista anti-SIRPa (P84) se inyectó tres veces por semana durante cuatro semanas por vía intraperitoneal en PBS (300 pg/inyección). La respuesta antitumoral se evaluó en el modelo ortotópico de HCC trece días después de la inoculación del tumor. En este momento, se recogieron el tumor y el bazo para fenotipificar las células inmunitarias que infiltraban el tumor o de forma sistémica. Los esplenocitos y las células no parenquimatosas (NPC) del hígado, que son las células inmunitarias infiltrantes, se tiñeron con cuatro mezclas diferentes para la adquisición por citometría de flujo.
Resultados:Como se muestra en laFigura 15A, el anticuerpo anti-SIRPa solo prolonga significativamente la supervivencia en una fracción de ratones (28 %). En combinación con anticuerpos anti-4-1BB o anti-PDL1, el anticuerpo anti-SIRPa permite una tasa de respuesta muy alta de ratones que sobreviven incluso después de la retirada del tratamiento.
Como se muestra en laFigura 15B, la combinación de anti-SIRPa con un agente coestimulador (por ejemplo, anti-4-1BB) o un inhibidor del punto de control de linfocitos T (por ejemplo, anti-PDL1) modifica el microentorno tumoral al disminuir las células inmunitarias reguladoras e inmunosupresoras (Treg, Mo-MDSC) mientras aumenta la acumulación de linfocitos T CD8+ de memoria efectores en combinación con anti-4-1BB. Las Mo-MDSC se caracterizan por una alta expresión de Ly6C y ninguna de Ly6G entre la población CD11b positiva y MHC clase II negativa.
Como se muestra en laFigura 15C, la combinación de anticuerpo anti-SIRPa con un agente coestimulador (por ejemplo, anti-4-1BB) o un inhibidor del punto de control de linfocitos T (por ejemplo, anti-PDL1) modifica la composición celular del microentorno tumoral y en la periferia del bazo, disminuyendo la frecuencia de linfocitos B inmaduros y vírgenes mientras aumenta la acumulación de células de memoria y plasmoblastos. De manera similar, la acumulación de células NK citolíticas (CD27-negativas) en el tumor y la periferia se induce mediante la combinación de anticuerpo anti-SIRPa con anticuerpo anti-41BB o anti-PDL1.
En conjunto, el anticuerpo anti-SIRPa modifica la inmunidad tumoral y periférica, en particular las células inmunitarias adaptativas (linfocitos T, Treg, linfocitos B) e innatas (MDSC, macrófagos, células NK) que contribuyen a la eliminación de tumores y a la protección a largo plazo.
Ejemplo 17. Efectos antitumorales en ratones previamente curados
Método:Los ratones previamente curados en el modelo de hepatoma mediante inyección de anti-SIRPa anti-4-1BB o los ratones mutados con SIRPa tratados con anti-4-1BB fueron nuevamente estimulados mediante inyección de células Hepa 1.6 en el bazo (2,5x106 células/ratón). Los ratones fueron anestesiados con un 3 % de isoflurano en el aire. Después de la incisión en el flanco de los ratones y el aislamiento del bazo, se inyectaron células tumorales Hepa 1.6 en el bazo (2,5x106 células/50 pl) en PBS. Se inyectaron a los ratones no sometidos previamente a experimentación en paralelo en la misma vía para comparar el desarrollo del tumor con ratones reexpuestos.
Resultados:Como se muestra en laFigura 15D, todos los ratones curados sobrevivieron cuando fueron reexpuestos y, por el contrario, todos los ratones no sometidos previamente a experimentación murieron. Este resultado demuestra que los linfocitos T de memoria se indujeron bajo terapia anti-SIRPa o ausencia de señales SIRPa (ratones mutados con SIRPa) y aún persisten a largo plazo en ratones curados.
Ejemplo 18. Efectos antitumorales de esplenocitos de linfocitos T o esplenocitos completos recogidos de ratones previamente curados
Método:Los ratones curados reexpuestos a anticuerpo anti-SIRPa anti-4-1BB fueron sacrificados y se les extrajo el bazo. Después de la lisis de los glóbulos rojos, se extrajeron esplenocitos y se aislaron linfocitos T CD3 positivos de una parte de los esplenocitos con un AutoMACS. Después de la anestesia, a los ratones se les inyectaron esplenocitos de linfocitos T (2,5x106 células/100 pl) o esplenocitos completos (10x106 células/100 pl) o solo excipiente (PBS) por vía intravenosa. Todos los ratones recibieron células Hepa 1.6 a través de la vena porta como se describió anteriormente (2,5x106 células/100 |jl).
Resultados:Como se muestra en laFigura 15E, los esplenocitos y los linfocitos T aislados recogidos de ratones curados tienen un efecto muy positivo en la supervivencia de ratones. Estos resultados indican que los linfocitos T de memoria están presentes en los esplenocitos de los ratones curados después del tratamiento del hepatoma y son responsables de la memoria inmunitaria adaptativa a largo plazo.
Ejemplo 19. Efectos antitumorales en ratones previamente curados
Método:Los ratones previamente curados en el modelo de hepatoma mediante la inyección de anti-SIRPa anti-PDL-1 fueron nuevamente expuestos mediante la inyección de células Hepa 1.6 en el bazo (2,5x106 células/ratón). Los ratones fueron anestesiados con un 3 % de isoflurano en el aire. Después de la incisión en el flanco de los ratones y el aislamiento del bazo, se inyectaron células tumorales Hepa 1.6 en el bazo (2,5x106 células/50 j l ) en PBS. Se inyectaron a los ratones no sometidos previamente a experimentación en paralelo en la misma vía para comparar el desarrollo del tumor con ratones reexpuestos.
Resultados:Como se muestra en laFigura 16, todos los ratones curados sobrevivieron cuando fueron reexpuestos y, por el contrario, todos los ratones no sometidos previamente a experimentación murieron. Este resultado sugiere que los linfocitos T de memoria todavía están presentes en los ratones curados. Este resultado demuestra que los linfocitos T de memoria fueron inducidos bajo terapia anti-SIRPa y aún persisten a largo plazo en ratones curados.
Ejemplo 20. Efectos del crecimiento de un tumor en un modelo de carcinoma mamario
Método:Los ratones fueron anestesiados con un 3 % de isoflurano en el aire. Los ratones fueron afeitados en el abdomen y se inyectaron células 4T1 en la glándula mamaria con una jeringa insulínica (30 Gauges) en 50 j l de PBS. El anticuerpo anti-SIRPa antagonista (P84) o un anticuerpo de control se inyectó tres veces por semana durante cuatro semanas por vía intraperitoneal en PBS (200 jg/inyección).
Resultados:Como se muestra en laFigura 17, el anticuerpo anti-SIRPa reduce significativamente (p<0,01) el crecimiento del tumor en el modelo de carcinoma mamario en comparación con un anticuerpo de control.
Figura 18muestra el análisis de células inmunitarias dos semanas después de la inoculación. El anticuerpo anti-SIRPa tiene un efecto positivo sobre las células mieloides y no mieloides (linfocitos T y células NK) tanto en el tumor como en la periferia (bazo) con una disminución drástica de Treg y acumulación de linfocitos T de memoria.
Ejemplo 21. Efectos de los anticuerpos SIRPa sobre la concentración de hemoglobina y sobre el hematocrito
Método:Se administraron anti-SIRPa (clon P84), anti-CD47 (clon MIAP410) y control de isotipo irrelevante por vía intraperitoneal el día 0 y el día 2 a 12 mg/kg en ratones C57Bl/6. Se recogieron muestras de sangre el día 0 y el día 3 en tubos que contenían EDTA y se realizó un hemograma con un analizador de hematología XS-800i (Sysmex). El nivel de hemoglobina (izquierda) y el porcentaje de hematocrito (derecha) se evaluaron el día 3.
Resultados:Como se muestra en laFigura 19, el anticuerpo anti-SIRPa no tiene efecto tóxico sobre la concentración de hemoglobina ni sobre el hematocrito. Por el contrario, el anticuerpo anti-CD47 induce una disminución de la concentración de hemoglobina y del hematocrito de acuerdo con la anemia observada durante la fase 1 en el hombre.
Ejemplo 22. Agregación de plaquetas
Método:Se extrajo sangre de voluntarios donantes sanos en tubos de extracción Vacuette (Greiner Bio-One) tamponados con citrato de sodio. El plasma rico en plaquetas (PRP) y el plasma pobre en plaquetas (PPP) se obtuvieron mediante centrifugación durante 10 minutos a 200 g y 15 minutos a 3.500 g, respectivamente. El PRP de trabajo se ajustó a 3,108 plaquetas.L'1.Ensayos de inhibición:Los AcM se preincubaron con PRP para una concentración final de 40 o 50 jg .m l-1 de anticuerpos de prueba. Después de 3 minutos sin agitación, la agregación de plaquetas se inició con la adición de ADP 5 jM . La agregación se determinó midiendo la transmisión de luz a través de la muestra a 37 °C con agitación continua utilizando un agregómetro óptico estándar (Trombo-Agregómetro TA-8V, SD Innovation SAS, Frouard, Francia). La transmisión de PPP se estableció en 100 %. La agregación se registró bajo agitación durante un total de 5 minutos.Ensayos de inducción:La agregación de plaquetas se inició directamente mediante la adición de AcM (50 jg .m l'1). La agregación se registró bajo agitación durante un total de 10 minutos como máximo.
Resultados:Como se muestra en laFigura 20, a diferencia de los anticuerpos anti-CD47, los anticuerpos anti-SIRPa no se unen a los glóbulos rojos ni a las plaquetas humanos. Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD47 induce la agregación de plaquetas humanasin vitromientras que los anticuerpos anti-SIRPa no lo hacen. De manera similar, los anticuerpos anti-SIRPa no alteran la agregación de plaquetas humanas inducida por ADP reversible, mientras que el anticuerpo anti-integrina alfa 2b la anula por completo.
Ejemplo 23. Proliferación de linfocitos T alogénicos por células CD14+ bloqueantes de SIRPa de una ascitis ovárica cancerosa
Método:Los linfocitos T CD4 alogénicos se aislaron mediante selección positiva utilizando un AutoMACS (Miltenyi) a partir de hPBMC de una capa leucoplaquetaria de un voluntario sano. Las células CD4 se colocaron en placa en una placa de 96 pocillos redondos (50.000 células/pocillo). Las células CD14+ se aislaron mediante el mismo método de la ascitis de una paciente con cáncer de ovario. Las células CD14+ se colocaron en placa con los linfocitos T CD4 alogénicos en una relación de 1:1 durante 5 días. En algunas condiciones, se añadieron células dendríticas derivadas de monocitos (moDC) alogénicas maduradas con LPS humanas en una relación de 1:5 para estimular los linfocitos T y se analizó la acción inmunosupresora de diferentes proporciones de MDSC CD14 purificadas de la ascitis. Los anticuerpos dirigidos a la vía SIRPa/CD47 se añadieron desde el comienzo de la prueba de proliferación a una concentración de saturación (10 pg/ml). La proliferación se midió mediante la incorporación de H3-timidina durante las últimas 12 h de cultivo.
Resultados:Tal como se muestra en lasfiguras 21A y 21B, las células mieloides humanas frescas y congeladas (TAM) purificadas a partir de ascitis de cáncer de ovario son linfocitos T humanos alogénicos hipoestimulantes. A diferencia de los anticuerpos anti-CD47, los anticuerpos anti-SIRPa modifican las propiedades de las células mieloides permitiendo la activación y proliferación de linfocitos T humanos.
Como se muestra en laFigura 21C, las células mieloides humanas (MDSC) purificadas a partir de ascitis de cáncer de ovario pueden suprimir la proliferación de linfocitos T humanos inducida por moDC alogénicas en una relación de células mieloides a linfocitos T de 1:1 y 2:1. A diferencia de los anticuerpos anti-CD47, los anticuerpos anti-SIRPa no potencian la inmunosupresión inducida por MDSC humanas.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-SIRPa humana, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 y - un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33.
2. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 30; y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 33.
3. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 28; y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 33.
4. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 29; y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 33.
5. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el dominio constante de cadena ligera consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35.
6. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el dominio constante de cadena pesada del anticuerpo consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 34.
7. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y - una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40 y - una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41 y - una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45
o
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y - una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45.
8. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende:
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y - una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45.
9. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende:
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40 y - una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45.
10. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende:
- una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41 y
- una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45.
11. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, para su uso como un medicamento.
12. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un cáncer, en particular el cáncer inflamatorio y cáncer con células mieloides infiltradas, particularmente con MDSC y/o células TAM infiltradas, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurológica, una lesión cerebral, un lesión nerviosa, una policitemia, una hemocromatosis, un traumatismo, un choque séptico, una enfermedad infecciosa crónica, en particular Pseudomonas y CMV, fibrosis, ateroesclerosis, obesidad, diabetes tipo II y disfunción de trasplante, o para su uso en vacunación.
13. El anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde dicho anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra a un paciente que presenta un tumor SIRPa positivo.
14. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Un producto de combinación que comprende:
- al menos un anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y
- al menos un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en agentes quimioterápicos, agentes de radioterapia, agentes inmunoterapéuticos, agentes de terapia celular, antibióticos y probióticos; en particular agentes inmunoterapéuticos seleccionados del grupo que consiste en bloqueadores o activadores de puntos de control de células inmunitarias adaptativas, en particular, seleccionado del grupo que consiste en anti-PDL1, anti-PD1, anti-CTLA4, anti-CD137, anti-CD2, anti-CD28, anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TIM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 y anti-OX40, anti-agonista de CD40, CD40-L, agonistas de TLR, anti ICOS, agonistas de los receptores ICOS-L y de linfocitos B,
para su uso simultáneo, separado o secuencial como un medicamento.
16. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
17. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Una célula hospedadora aislada que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16 y/o un vector de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Un métodoin vitrooex vivopara determinar una célula SIRPa positiva en un sujeto a partir de una muestra biológica obtenida previamente de dicho sujeto, que comprende:
i) determinarin vitrola expresión y/o el nivel de expresión de SIRPa, en una muestra biológica obtenida previamente de dicho sujeto utilizando el anticuerpo anti-SIRPa humana o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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