ES2992208T3

ES2992208T3 - Diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar mediante biomarcadores de edición de ARN en sangre

Info

Publication number: ES2992208T3
Application number: ES20800688T
Authority: ES
Inventors: Dinah Weissmann; Nicolas Salvetat; Fabrice Chimienti
Original assignee: Alcediag SAS
Current assignee: Alcediag SAS
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2024-12-10
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: EP4055191C0; PL4055191T3; EP3819387A1; CN114945686A; US20230272472A1; PL4055191T4; WO2021089866A1; CA3155693A1; KR20220094201A; IL292588A; EP4055191B1; EP4055191A1; JP2023500847A

Abstract

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico diferencial in vitro del trastorno bipolar y la depresión unipolar en un paciente humano a partir de una muestra biológica de dicho paciente, utilizando al menos uno o una combinación de biomarcadores de ARN de edición A a I particulares asociados a una puntuación de depresión específica y un algoritmo. La presente invención también se refiere a un método para el diagnóstico del trastorno bipolar que implementa la combinación particular de biomarcadores de ARN de edición A a I asociados a una puntuación de depresión específica y un algoritmo de la presente invención. La presente invención también se refiere a un método para el seguimiento del tratamiento del trastorno bipolar o unipolar, implementando dicho método para el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar y la depresión unipolar de la presente invención. El kit para determinar si un paciente presenta un trastorno bipolar frente a un trastorno de depresión unipolar o un paciente de control sano también está comprendido en la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar mediante biomarcadores de edición de ARN en sangre

La presente invención se refiere a un método¡n vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano a partir de una muestra biológica de dicho paciente, usando al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I particulares asociados a una puntuación y algoritmo de depresión específicos. La presente invención se dirige también a un método para monitorizar el tratamiento para el trastorno bipolar o unipolar, implementando dicho método el método para el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar de la presente invención. La presente invención también abarca un kit para determinar si un paciente presenta un trastorno bipolar frente a un trastorno depresivo unipolar o paciente de control sano.

El trastorno bipolar (BD) es una enfermedad común, grave y crónica que afecta a más del 1 % de la población en todo el mundo, independientemente del origen, la etnia o el estado socioeconómico. La depresión bipolar se compone de episodios fluctuantes de depresión y manía o hipomanía. Los síntomas de los episodios maníacos pueden incluir un aumento inusual y persistente de la actividad o euforia, una menor necesidad de sueño, un aumento de la autoconfianza o de la impulsividad (para una revisión, véase1). Los pacientes con trastorno bipolar a menudo reciben un diagnóstico erróneo, aproximadamente el 70 % de ellos reciben un diagnóstico erróneo de depresión unipolar o trastorno depresivo mayor. El retraso resultante en el diagnóstico correcto y el tratamiento apropiado da como resultado un peor pronóstico y tiene consecuencias devastadoras para los pacientes y, en última instancia, puede aumentar el riesgo de suicidio. Se estima que el intervalo promedio entre la aparición de los síntomas del BD y el diagnóstico y tratamiento adecuados es de 5,8 años. Además, la resistencia al tratamiento que se observa comúnmente con los antidepresivos clásicos en la depresión unipolar es debida a menudo a un diagnóstico erróneo de depresión bipolar2.

Las clasificaciones diagnósticas más ampliamente reconocidas son la décima revisión de la Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE-10) y la quinta edición del Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales (DSM-5), aunque este último sigue siendo controvertido para el diagnóstico preciso del trastorno bipolar1. Ambos se basan en la entrevista clínica y, por lo tanto, pueden parecer “subjetivos” , ya que se basan en la opinión del psiquiatra; no hay ningún objetivo; pruebas de laboratorio o marcadores biológicos para establecer la frontera entre los diferentes subtipos de depresión. Además, es mucho más probable que los pacientes bipolares acudan a los médicos durante un episodio depresivo. Por lo tanto, un objetivo principal de la investigación es identificar biomarcadores fiables y clínicamente útiles para diferenciar el trastorno bipolar de la depresión unipolar. Durante la última década, una serie de estudios han investigado la formación de neuroimágenes o los biomarcadores circulantes en el BD. En un estudio usando fMRI, Grotegerd y sus colaboradores han mostrado que la fMRI y la clasificación de patrones podrían clasificar a los sujetos deprimidos como unipolares o bipolares con buena confianza, aunque usando un tamaño de muestra pequeño de pacientes medicados3. Más recientemente, un método de RM para medir la activación y la conectividad del complejo amigdalino durante el procesamiento de las emociones faciales distinguió a los pacientes con BP de los pacientes con TDM con una precisión del 80 %. Sin embargo, el estudio no implicó a pacientes con TDM que estuvieran deprimidos en ese momento o, en el caso de pacientes con BP, que tuvieran síntomas maníacos o hipomaníacos en ese momento. De manera similar, actualmente no existen biomarcadores circulantes válidos para el BD. Una etapa importante sería identificar biomarcadores circulantes para el diagnóstico temprano en los pacientes. Hasta la fecha, muchas investigaciones se han centrado en las alteraciones de las rutas en el BD, incluyendo el estrés oxidativo y la desregulación de factores inflamatorios y tróficos (para una revisión, véase 4). Un metanálisis de 52 estudios identificó que los niveles disminuidos de BDNF plasmático, un miembro de la familia de factores de crecimiento de las neurotrofinas, se replicaron de manera consistente. Resulta interesante observar que los niveles de BDNF disminuyen durante los episodios tanto maníacos como depresivos, al contrario que en la eutimia. Sin embargo, los autores sugirieron que los niveles de BDNF solo podrían usarse como parte de una medida compuesta de proteínas sanguíneas de laboratorio debido a la falta de especificidad. La bibliografía existente también notifica consistentemente la existencia de estrés oxidativo en el BD. La peroxidación lipídica, el daño al ADN/ARN y el óxido nítrico se aumentan significativamente en pacientes con BD. Sin embargo, debido nuevamente a la falta de especificidad y robustez, no se ha identificado ningún biomarcador de estrés oxidativo como clínicamente útil per se. Se han mostrado sistemáticamente alteraciones de los marcadores inflamatorios periféricos en los trastornos del estado de ánimo, incluyendo la depresión unipolar y el BD, aunque no está claro si son causantes o una consecuencia de la enfermedad. Se ha mostrado un desequilibrio de las citocinas circulantes, incluyendo CXCL8, CXCL10 y CXCL11, en el BD en comparación con los controles. Sin embargo, no se hallaron diferencias durante los episodios de eutimia y manía. Un estudio piloto del mismo grupo también identificó niveles de TNFR1 solubles más altos en pacientes con BD. Además, los niveles de sTNFR1 fueron más altos durante la manía que en pacientes eutímicos, lo que confirma un informe previo donde las citocinas proinflamatorias, IL-2, IL-4 e IL-6, aumentaron en comparación con sujetos sanos. Un análisis transcriptómico mostró recientemente que solo unos pocos cambios en la expresión genética en sangre completa estaban asociados con el BD, mientras que el tratamiento con litio tiene un impacto más fuerte, lo que sugiere que monitorizar los niveles de expresión genética será de una utilidad pobre para desarrollar herramientas de diagnóstico para el BD.

Los métodos más prometedores parecen radicar en un panel de biomarcadores de múltiples parámetros, para lo cual existe una justificación biológica. Estos biomarcadores deberían cuantificarse usando una muestra de sangre rutinaria y una metodología de laboratorio estándar; a menudo se desarrolla en paralelo un algoritmo de diagnóstico específico. A modo de ejemplo, un enfoque metabolómico basándose en la RMN de protones (RMN de 1H) identificó muy recientemente un panel de 10 compuestos diferentes que podrían usarse como biomarcadores para discriminar entre controles sanos, BD y esquizofrenias. La evidencia acumulada ha indicado que la edición de ARN, que se realiza principalmente por las enzimas ADAR (adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN), puede estar críticamente implicada en enfermedades neurológicas o inmunitarias, entre otras patologías (para una revisión, véase 6). La disminución de la edición de los sitios R/G de los receptores AMPA debido a la regulación por disminución de ADAR2 tiene un posible papel en la fisiopatología de los trastornos mentales, incluyendo la esquizofrenia y el trastorno bipolar.

El documento US2017/211144 se refiere a genes y rutas expresados diferencialmente en el trastorno bipolar y/o el trastorno depresivo mayor.

En el estudio actual, nos centramos en la modificación de edición de ARN a nivel de todo el transcriptoma mediante Sec-ARN en pacientes unipolares y con BD para identificar variantes de edición que podrían usarse como biomarcadores para establecer un ensayo de diagnóstico clínicamente útil para el diagnóstico diferencial del BD. Se identificó una edición diferencial significativa en un número de genes implicados en diferentes rutas relevantes para los trastornos del estado de ánimo, por ejemplo, el sistema inmunitario y la función del SNC, por ejemplo, la regulación de MECP2, que se expresa altamente en las neuronas, donde participa en el proceso de formación de sinapsis. El panel de variantes de edición de ARN permitió el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar con alta especificidad y selectividad. Este estudio es el primero en evaluar múltiples variantes de edición de ARN en muestras de sangre de controles sanos y pacientes que padecen depresión unipolar o bipolar. Nuestros hallazgos contribuirán a una mejor comprensión de la fisiopatología molecular del BD y allanarán el camino para el desarrollo de un ensayo diagnóstico para el BD con aplicación clínica.

Se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para seleccionar un biomarcador, preferiblemente una combinación de al menos dos biomarcadores, que puede usarse para diagnosticar diferencialmente el trastorno bipolar y la depresión unipolar en un paciente humano, comprendiendo dicho método la etapa de:

a) analizar el conjunto de datos de Sec-ARN usando una canalización de análisis del editoma e identificar posiciones editadas diferencialmente de A a I con una cobertura mínima de 30x, lo que garantiza un alto grado de confianza en posiciones de bases particulares;

b) realizar un análisis diferencial para identificar sitios cuya edición podría ser específicamente diferente entre la depresión unipolar y los controles sanos,

c) aplicar los siguientes criterios de calidad preespecificados del grupo que consiste en: cobertura >30; AUC >0,6; 0,95 >Múltiplo de variación>1,05, p <0,05 y exclusión de sitios intergénicos;

d) opcionalmente, comprobar que no se observaron diferencias en la edición de ARN global entre pacientes y controles, preferiblemente calculando el índice de edición de Alu (AEI) global, que es una medida de la tasa global de edición de ARN en las repeticiones de Alu; e) mediante GSEA (análisis de enriquecimiento sobre conjuntos de genes) sobre los biomarcadores seleccionados en la etapa c) o d), preferiblemente usando herramientas de ontología genética, identificar y seleccionar biomarcadores que reflejen cambios en diferentes procesos biológicos, incluyendo funciones inmunitarias y del SNC (sistema nervioso central); y

f) aplicar los siguientes criterios de calidad especificados del grupo que consiste en: cobertura >30; AUC >0,8; 0,8 >Múltiplo de variación>1,20 y p <0,05) a una combinación de varios biomarcadores seleccionados en la etapa e) que representan diferentes mecanismos biológicos, y se seleccionaron aquellos que discriminaban claramente a los pacientes que presentaban trastorno bipolar y a los pacientes que presentaban depresión unipolar en dos grupos separados.

En una realización preferida, en la etapa f), se seleccionan las combinaciones de al menos dos biomarcadores si dichas combinaciones son estadísticamente significativas entre control y casos con un valor de p <10-4

Los síntomas que sirven como criterio para los trastornos bipolares, los trastornos depresivos y el TDM son bien conocidos por el experto y se describen, por ejemplo, en el libro DSM-5™ de la Asociación Estadounidense de Psiquiatría (2013, páginas p123-154 de Ds M-V);

Los diagnósticos incluidos en este capítulo son trastorno bipolar I, trastorno bipolar II, trastorno ciclotímico, trastorno bipolar y relacionado inducido por sustancias o medicamentos, trastorno bipolar y relacionado debido a otra afección médica, otro trastorno bipolar y relacionado especificado y trastorno bipolar y relacionado no especificado. Sin embargo, la gran mayoría de las personas cuyos síntomas cumplen los criterios de un episodio maníaco completamente sindrómico también experimentan episodios depresivos mayores durante el transcurso de sus vidas. El trastorno bipolar II, que requiere la experiencia a lo largo de la vida de al menos un episodio de depresión mayor y al menos un episodio de hipomanía, ya no se considera una afección “ más leve” que el trastorno bipolar I, en gran parte debido a la cantidad de tiempo que las personas con esta afección pasan deprimidas y porque la inestabilidad del estado de ánimo experimentado por las personas con trastorno bipolar II suele ir acompañada de un deterioro grave en la actividad laboral y social. El diagnóstico de trastorno ciclotímico se da a adultos que experimentan al menos 2 años (para los niños, un año completo) de períodos tanto de hipomanía como de depresión sin cumplir nunca los criterios para un episodio de manía, hipomanía o depresión mayor.

Los síntomas que sirven como criterio para la depresión unipolar también son bien conocidos por el experto y se describen, por ejemplo, en el libro DSM-5™- de la Asociación Estadounidense de Psiquiatría (2013, páginas 155 188). Los trastornos depresivos incluyen el trastorno de desregulación disruptiva del estado de ánimo, el trastorno depresivo mayor (incluyendo el episodio depresivo mayor), el trastorno depresivo persistente (distimia), el trastorno disfórico premenstrual, el trastorno depresivo inducido por sustancias o medicamentos, el trastorno depresivo debido a otra afección médica, otro trastorno depresivo especificado y trastorno depresivo no especificado.

La presente invención se dirige a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano a partir de una muestra biológica de dicho paciente, comprendiendo dicho método:

a) determinar al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I identificados por el método

para seleccionar un biomarcador según la invención:

- la proporción relativa de edición de ARN en un sitio de edición dado para al menos uno o una combinación de sitios que se pueden editar en el transcrito de ARN de dicho biomarcador t, y/o

- el porcentaje de una isoforma o de una combinación de isoformas del transcrito de ARN de dicho biomarcador;

en donde dichos al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I se seleccionan del grupo que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A;

b) determinar un valor resultante del/de los porcentaje(s) obtenido(s) en la etapa a);

c) determinar si dicho valor de resultado obtenido en la etapa b) es mayor o no es mayor que un valor de control obtenido para un sujeto unipolar de control, en donde el valor de control se determinó de una manera comparable a la del valor de resultado, obtenido en la etapa b); y

d) si dicho valor de resultado obtenido para el paciente es mayor que un umbral (por ejemplo, pero sin limitación, un punto de corte o una probabilidad), clasificar a dicho paciente como que tiene trastorno bipolar o, si dicho valor de resultado no es mayor que dicho umbral, clasificar a dicho paciente como que tiene depresión unipolar.

Preferiblemente, la presente invención se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano a partir de una muestra biológica de dicho paciente, comprendiendo dicho método:

a) determinar para una combinación de al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I identificados mediante el método para seleccionar una combinación de al menos dos biomarcadores según la presente invención:

- para cada biomarcador seleccionado, la proporción relativa de edición de ARN en un sitio de edición dado para al menos uno o una combinación de sitios que se pueden editar en el transcrito de ARN de dichos al menos dos biomarcadores, y/o

- el porcentaje relativo de una isoforma o de una combinación de isoformas del transcrito de ARN de cada uno de dichos dos biomarcadores;

b) determinar un valor de resultado obtenido para cada uno de dichos al menos dos biomarcadores y un valor de resultado final basándose en un algoritmo o ecuación que incluye el valor de resultado obtenido para cada biomarcador seleccionado;

c) determinar si dicho valor de resultado obtenido en la etapa b) es mayor o no es mayor que un valor de control obtenido para un sujeto unipolar de control, en donde el valor de control se determinó de una manera comparable a la del valor de resultado; y

d) si dicho valor de resultado obtenido para el paciente es mayor que un umbral, clasificar a dicho paciente como que tiene trastorno bipolar o, si dicho valor de resultado no es mayor que dicho umbral, clasificar a dicho paciente como que tiene depresión unipolar.

Por ejemplo, pero sin limitación, en el método de diagnóstico según la presente invención, dicho umbral, punto de corte o probabilidad (denominado también “ puntuación de depresión” ) puede ser, pero sin limitación:

- el valor Z calculado para el paciente de control sano cuando se usa el programa mROC, o - la probabilidad de que un paciente se considere como que padece trastornos del estado de ánimo, trastornos depresivos o MDD.

En la presente descripción, el término biomarcador o diana tienen el mismo significado y pueden usarse indistintamente. En una realización preferida, en el método para diagnosticar la depresión según la presente invención, se seleccionan las combinaciones de al menos dos biomarcadores si dichas combinaciones son estadísticamente significativas entre sujetos de control sanos y casos (pacientes que tienen trastornos bipolares o unipolares), o entre sujetos de control bipolares y unipolares con un valor de p <10-4

En una realización preferida, en el métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según la invención, dicho biomarcador de ARN de edición de A a I se selecciona del grupo que consiste en MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

En una realización más preferida, en el método invitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según la invención, dichos al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I se seleccionan del grupo que consiste en MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A. Se prefieren los métodos para el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según la presente invención en donde en la etapa b), el valor de resultado o valor de resultado final se calcula mediante un algoritmo que implementa un método multivariante que incluye:

- programa mROC, en particular para identificar la combinación lineal, que maximiza la curva ROC de AUC (área bajo la curva) y en donde se proporciona la ecuación para la combinación respectiva y puede usarse como un nuevo marcador virtual Z, de la siguiente manera:

Z = a.(Biomarcador 1) b. (Biomarcador 2) ...i. (Biomarcador i)- ....n.(Biomarcador n)donde i son coeficientes calculados y (Biomarcador i) son el nivel del biomarcador considerado (es decir, el nivel del sitio de edición de ARN o de isoformas para una diana/biomarcador dado); y/o

- un enfoque de bosques aleatorios (RF) aplicado para evaluar los sitios de edición de ARN y/o combinaciones de isoformas, en particular para clasificar la importancia del/de los sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s), y para combinar el/los mejor(es) sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s), y/u opcionalmente - un análisis multivariante aplicado para evaluar el/los sitio(s) de edición de ARN y/o combinaciones de isoformas para el diagnóstico, seleccionándose dicho análisis multivariante, por ejemplo, del grupo que consiste en: - modelo de regresión logística aplicado para análisis univariante y multivariante para estimar el riesgo relativo de un paciente a diferentes valores de nivel de sitio de edición de a Rn o de isoformas;

- enfoque CART (árboles de clasificación y regresión) aplicado para evaluar combinaciones de sitio(s) de edición de ARN y/o isoformas; y/o

- enfoque de máquina de vectores de soporte (SVM);

- enfoque de red neuronal artificial (ANN);

- enfoque de red bayesiana;

- enfoque de WKNN (k vecinos más cercanos ponderados);

- mínimos cuadrados parciales - análisis discriminante (PLS-DA);

- análisis discriminante lineal y cuadrático (LDAI QDA), y

- cualquier otro método matemático que combina biomarcadores.

En una realización preferida, en el métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según la invención, dicho trastorno de depresión unipolar es principalmente un trastorno depresivo mayor (TDM).

En una realización preferida, en el métodoin vitro parael diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según la invención, dicha muestra biológica es sangre completa, suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo, siendo la sangre completa la muestra biológica más preferida

Se prefieren biomarcadores seleccionados en donde el valor de resultado o la puntuación de depresión obtenida en la etapa c) es estadística/específicamente diferente de dicho valor de resultado de control en p < 0,05.

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde han de satisfacerse los siguientes criterios para el biomarcador o para la combinación de biomarcadores seleccionados en la etapa a):

- la cobertura >30;

- AUC >0,6, más preferido AUC >0,8;

- 0,95 >Múltiplo de variación>1,05, y

- p <0,05.

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde dicho(s) biomarcador(es) de edición de ARN A a I seleccionado(s) comprendido(s) en la etapa a) se selecciona(n) del grupo que consiste en una combinación que comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los siguientes biomarcadores: MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A, preferiblemente la combinación de los 8 biomarcadores citados.

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde dicho(s) biomarcador(es) de ARN de edición de A a I seleccionado(s) comprende(n) en la etapa a) la combinación de los siguientes 5 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2 y PRKCB.

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde dicho(s) biomarcador(es) de ARN de edición de A a I seleccionado(s) comprende(n) en la etapa a) la combinación de los siguientes 5 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2 y PRKCB y al menos otro biomarcador seleccionado del grupo que consiste en los siguientes biomarcadores; CAMK1D y LYN, preferiblemente la combinación de los siguientes 6 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2, PRKCB y LYN cuando el modelo se ajusta por edad, sexo, tratamiento psiquiátrico y adicción, o los siguientes 6 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2, PRKCB y CAMK1D cuando el modelo se ajusta por edad y sexo, preferiblemente cuando se usa un algoritmo de bosques aleatorios (RF) aplicado para evaluar los sitios de edición de ARN y/o combinaciones de isoformas, en particular para clasificar la importancia del/de los sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s), y para combinar el/los mejor(es) sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s).

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde dicho(s) biomarcador(es) de ARN de edición de A a I seleccionado(s) comprende(n) en la etapa a) la combinación de los siguientes 5 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2 y PRKCB y al menos otro biomarcador seleccionado del grupo que consiste en los siguientes biomarcadores; CAMK1D y LYN, y en donde el cálculo del porcentaje relativo de al menos uno del sitio de edición de ARN o isoforma se basa en el sitio de edición de ARN o isoforma enumerado en las Tablas 5.1 y 5.2, preferiblemente cuando se usa un algoritmo de bosques aleatorios (RF) aplicado para evaluar los sitios de edición de ARN y/o combinaciones de isoformas, en particular para clasificar la importancia del/de los sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s), y para combinar el/los mejor(es) sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s)

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde dicho biomarcador de ARN de edición de A a I seleccionado comprende en la etapa a) uno o una combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 biomarcadores seleccionados y en donde el cálculo del porcentaje relativo de al menos uno del sitio de edición de ARN o isoforma se basa en el sitio de edición de ARN o isoforma enumerado en las Tablas 2A (sitios de edición), 2B (isoformas) y 3 (sitios de edición)

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde dicha combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 biomarcadores seleccionados es una combinación seleccionada de las combinaciones de biomarcadores dadas en las Tablas 4, 5 y 6, preferiblemente las combinaciones que comprenden los siguientes 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde el algoritmo o la ecuación que permite el cálculo del valor de resultado o puntuación de depresión Z se seleccionan de las ecuaciones de Z enumeradas en los ejemplos, preferiblemente la ecuación implementa una combinación de los siguientes 8 biomarcadores: MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según las reivindicaciones anteriores, en donde si el paciente que se va a analizar es una mujer, en la etapa a) dicho al menos uno o combinación de al menos dos biomarcador(es) de ARN de edición de A a I se selecciona(n) del grupo de biomarcadores que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A, preferiblemente las combinaciones de biomarcadores o la ecuación de Z dadas en los Ejemplos o figuras con pacientes de la población femenina, más preferiblemente las combinaciones que comprenden los 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A, más preferiblemente las combinaciones enumeradas en la Tabla 7.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según las reivindicaciones anteriores, en donde si el paciente que se va a analizar es un hombre, en la etapa a) dicho al menos uno o combinación de al menos dos biomarcador(es) de ARN de edición de A a I se selecciona(n) del grupo de biomarcadores que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A, preferiblemente las combinaciones de biomarcadores o la ecuación de Z dadas en los Ejemplos o figuras con pacientes de la población femenina, más preferiblemente las combinaciones que comprenden los 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A, más preferiblemente las combinaciones enumeradas en la Tabla 8.

En una realización más preferida, la presente invención se dirige a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar y la depresión unipolar en un paciente humano, según la presente invención, en donde la combinación de biomarcadores y/o la ecuación de Z o el algoritmo asociado a dicha combinación es diferente si el paciente a analizar es una mujer o un hombre.

Preferiblemente, la combinación de biomarcadores y/o la ecuación de Z de si el paciente a analizar es mujer u hombre se selecciona de la combinación y/o la ecuación de Z representada en los ejemplos o en las figuras para este caso particular.

Se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar 1 y bipolar 2 en un paciente humano a partir de una muestra biológica, preferiblemente una muestra de sangre, del paciente, en donde dicho método comprende la etapa de:

a) determinar una combinación de al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I seleccionados del grupo que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A;

c) determinar si dicho valor de resultado obtenido en la etapa b) es mayor o no es mayor que un valor de control obtenido para un sujeto bipolar 1 y/o bipolar 2 de control, en donde el valor de control se determinó de una manera comparable a la del valor de resultado; y

d) si dicho valor de resultado obtenido para el paciente es mayor, o no, que un umbral, clasificar a dicho paciente como que tiene trastorno bipolar 1 o bipolar 2.

También se prefieren los métodosin vitropara el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar 1 y bipolar 2 en un paciente humano de la presente invención en donde dicha combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 biomarcadores seleccionados es una combinación seleccionada de los biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A, preferiblemente las combinaciones que comprenden los siguientes 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

T ambién se prefieren los métodos en donde el algoritmo o la ecuación que permite el cálculo del valor de resultado o puntuación de depresión Z se seleccionan de las ecuaciones de Z enumeradas en los ejemplos, particularmente en la Tabla 13 y la Figura 13 B, preferiblemente la ecuación implementa una combinación de los siguientes 8 biomarcadores: MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

Se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de un paciente que tiene trastorno bipolar y un paciente sano a partir de una muestra biológica, preferiblemente una muestra de sangre, del paciente, en donde dicho método comprende las etapas de:

c) determinar si dicho valor de resultado obtenido en la etapa b) es mayor o no es mayor que un valor de control obtenido para un sujeto sano de control y bipolar, en donde el valor de control se determinó de una manera comparable a la del valor de resultado; y

d) si dicho valor de resultado obtenido para el paciente es mayor, o no, que un umbral, clasificar a dicho paciente como paciente sano o que tiene trastorno bipolar.

También se prefieren los métodosin vitropara el diagnóstico diferencial de un paciente con trastorno bipolar y un paciente sano en un paciente humano de la presente invención en donde dicha combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 biomarcadores seleccionados es una combinación seleccionada de los biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A, preferiblemente las combinaciones que comprenden los siguientes 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, G<a>B2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

También se prefieren los métodos de la presente invención en donde el algoritmo o la ecuación que permite el cálculo del valor de resultado o puntuación de depresión Z se seleccionan de las ecuaciones de Z enumeradas en los ejemplos, particularmente en la Tabla 12 y la Figura 13 C, preferiblemente la ecuación implementa una combinación de los siguientes 8 biomarcadores: MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

También se prefieren los métodos de la presente invención, en donde en la etapa a) se miden la proporción relativa de edición de ARN en una edición dada y/o el porcentaje de una isoforma mediante NGS en dicha muestra biológica.

También se prefieren los métodos de la invención, en donde en la etapa a), la secuencia de amplicón/nucleica usada para la detección de los sitios de edición de ARN y/o las isoformas del transcrito de ARN de dicho biomarcador se obtiene o se puede obtener con el conjunto de cebadores enumerados en la Tabla 1 para cada uno de los biomarcadores seleccionados (Id. de sec. n.° 1 a 36). También se prefieren los métodos de la presente invención, en donde en la etapa a), la secuencia de amplicón/nucleica usada para la detección de los sitios de edición de ARN y/o las isoformas del transcrito de ARN de dicho biomarcador se obtiene o se puede obtener con un conjunto o una combinación de conjuntos de cebadores que permiten obtener un amplicón(es) o secuencia(s) de ácido nucleico que incluyen, o son idénticos a, el(los) amplicón(es) o secuencia(s) de ácido nucleico que se pueden obtener mediante el conjunto de cebadores enumerados en la Tabla 1 (Id. de sec. n.°1 a la Id. de sec. n.°36).

Dicha secuencia de amplicón o ácido nucleico usada para la detección de los sitios de edición de ARN y/o las isoformas del transcrito de ARN de dicho biomarcador podría ser la propia secuencia completa del transcrito de ARN.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a un método para monitorizar el tratamiento del trastorno bipolar o depresión unipolar en un paciente humano, a partir de una muestra biológica de dicho paciente, comprendiendo dicho método:

A) diagnosticar de manera diferencial trastorno bipolar o depresión unipolar en dicho ser humano mediante el método según el método de la invención antes del inicio del tratamiento que se desea monitorizar.

B) repetir las etapas (a) a c) del método de la invención, después de un período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para dicho trastorno bipolar o depresión unipolar, para obtener un valor de resultado postratamiento;

C) comparar el valor de resultado postratamiento de la etapa (c) con:

- el valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para dicho trastorno bipolar o depresión unipolar, y

- el valor de resultado (valor final de control) para pacientes con trastorno bipolar o depresión unipolar de control, y

clasificar dicho tratamiento como efectivo si el valor de resultado postratamiento obtenido en la etapa B) es más cercano al valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para pacientes con trastorno bipolar o depresión unipolar de control.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a un método para determinar si un paciente responderá a un tratamiento de trastorno bipolar que permite que el paciente se encuentre en un estado eutímico (estado de ánimo normal) a partir de una muestra biológica, preferiblemente una muestra de sangre de dicho paciente, comprendiendo dicho método la etapa de: A) diagnosticar de manera diferencial trastorno bipolar para dicho ser humano mediante el método según la presente invención antes del inicio del tratamiento que se desea monitorizar.

B) repetir las etapas (a) a c) del método de la presente invención, después de un período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para dicho trastorno bipolar, para obtener un valor de resultado postratamiento; C) comparar el valor de resultado postratamiento de la etapa (c) con:

- el valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para dicho trastorno bipolar, y

- el valor de resultado (valor final de control) para pacientes con trastorno bipolar de control que se encuentran en un estado eutímico, y

clasificar a dicho paciente como paciente que responde al tratamiento si el valor de resultado postratamiento obtenido en la etapa B) es más cercano al valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para pacientes con trastorno bipolar de control que se encuentran en un estado eutímico.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a un hit para diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y unipolar, preferiblemente un TDM, en un paciente humano, comprendiendo dicho kit:

1) - opcionalmente, instrucciones para aplicar el método para el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano, con el fin de obtener el valor de resultado cuyo análisis determina si dicho paciente presenta un trastorno bipolar o depresión unipolar; y

2) - un par de cebadores o una combinación de al menos dos pares de cebadores seleccionados del grupo de cebadores que consiste en la Id. de sec. n.° 1 a la Id. de sec. n.° 36 y, cuya selección depende del/de los biomarcador(es) usado(s) para el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano;

o

- un par o una combinación de pares de cebadores que permiten obtener un(os) amplicón(es) idéntico(s) al/a los amplicón(es) que se puede(n) obtener mediante los pares de cebadores enumerados en la Tabla 1 (Id. de sec. n.°1 a la Id. de sec. n.°36).

Los siguientes ejemplos y las figuras y leyendas en lo sucesivo en la presente memoria se han escogido para proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa para poder implementar y usar la presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de lo que el inventor considera que es su invención, ni pretenden mostrar que solo se llevaron a cabo los experimentos en lo sucesivo en la presente memoria.

Otras características y ventajas de la invención se irán poniendo de manifiesto en el resto de la descripción con los Ejemplos, las Figuras y las Tablas, las leyendas para las cuales se dan a continuación en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos y las tablas

Figuras 1A-1D:Identificación y validación de sitios de edición de ARN de A a I diferencialmente entre controles sanos y pacientes con DEP usando datos de Sec-ARN de sangre humana.

A: Localización genómica de los sitios de edición detectados

B: Repartición de eventos de edición de A a I o genes editados por cromosoma.

Gris oscuro (eje y izquierdo): Repartición de eventos de edición de A a I identificados con una cobertura mínima de 30 en el estudio de Sec-ARN.

Gris claro (eje y derecho): Repartición de genes editados identificados con una cobertura mínima de 30 en el estudio de Sec-ARN

C: Gráfico de volcán de sitios editados diferencialmente entre controles y pacientes con DEP. El gráfico de volcán muestra los sitios de genes editados diferencialmente regulados al alza y a la baja entre el grupo de pacientes deprimidos (DEP) y el grupo de control. Para cada gráfico, el eje x representa el log (2) (múltiplo de variación) (FC), y el eje y representa -log 10 (valores de p). Los sitios de edición con un valor de p ajustado de menos de 0,05 Y FC >5 % se asignaron como editados diferencialmente y se indican en verde.

D: Índice de edición de Alu entre controles y pacientes deprimidos. Distribución de valores de índice de edición de Alu (AEI) en controles y pacientes con DEP. Los datos son la media ± EEM. El valor de p del índice de edición se calculó usando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

Figura 2:Análisis de componentes principales de las 646 variantes en 366 genes editados diferencialmente entre pacientes deprimidos y controles sanos identificados en el estudio de Sec-ARN.

El gráfico de dispersión visualiza la primera, la segunda y la tercera componentes principales y los porcentajes de varianza respectivos en los ejes x, y y z de la relación (múltiplo de variación) de los biomarcadores. círculos grises: Pacientes con DEP; círculo negro: Controles sanos.

Figura 3:Asociaciones proteína-proteína en los 14 genes editados diferencialmente usados en las cohortes de priorización. El diagrama muestra las interacciones proteína-proteína en el grupo de 14 genes seleccionados en la cohorte de priorización. Los genes fueron anotados y coloreados según su implicación en procesos biológicos.

: proceso de regulación del sistema inmunitario (GO:0002682);

: ruta de señalización del receptor a través de JAK-STAT (GO:0007259);

: regulación de la respuesta inmunitaria (GO:0050776)

Figuras 4A-4D:Ejemplos de rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm de la primera cohorte de priorización (n = 35) analizado mediante monoplex.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 2 sitios de edición de ARN en 2 dianas diferentes. B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 3 sitios de edición de ARN en 2 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 4 sitios de edición de ARN en 3 dianas diferentes. D: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 24 sitios de edición de ARN presentes en 3 dianas diferentes.

Figuras 5A-5E:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm de la segunda cohorte de priorización (n = 58) analizado mediante secuenciación multiplexada.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 3 sitios de edición de ARN en 2 dianas diferentes. B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 4 sitios de edición de ARN en 2 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 5 sitios de edición de ARN en 3 dianas diferentes. D: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 6 sitios de edición de ARN presentes en 3 dianas diferentes.

E: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 14 sitios de edición de ARN en 4 dianas diferentes.

Figuras 6A-6CRendimiento diagnóstico de la edición de ARNm de la cohorte de validación (n = 256) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 29 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 32 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 44 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes.

Figuras 7A-7E:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm de la población femenina de la cohorte de validación (n = 179) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 17 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes.

B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 23 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 44 sitios de edición de ARN en 8 dianas diferentes. D: Curva ROC obtenida tras aprendizaje automático con el método de mROC.

E: Curva ROC obtenida tras aprendizaje automático con el método de Bosque aleatorio

Figuras 8A-8E:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm de la población masculina de la cohorte de validación (n = 77) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 18 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 39 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 47 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. D: Curva ROC obtenida tras aprendizaje automático con el método de mROC.

Figuras 9A-9C:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm entre pacientes bipolares y pacientes eutímicos de la población femenina de la cohorte de validación (n = 90) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas. A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 9 sitios de edición de ARN en 4 dianas diferentes. B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 18 sitios de edición de ARN en 4 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 24 sitios de edición de ARN en 5 dianas diferentes.

Figuras 10A-10C:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm entre pacientes bipolares y pacientes eutímicos de la población masculina de la cohorte de validación (n = 47) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas. A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 12 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 23 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes. C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido mediante el uso de 28 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes.

Figuras 11A-11C:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm entre pacientes depresivos bipolares y controles sanos (n = 239) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido en toda la población mediante el uso de 60 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes.

B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido en mujeres mediante el uso de 32 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes.

C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido en hombres mediante el uso de 50 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes.

Figuras 12A-12C:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm entre pacientes eutímicos bipolares y controles sanos (n = 183) analizado mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

A: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido en toda la población mediante el uso de 53 sitios de edición de ARN en 6 dianas diferentes.

B: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido en mujeres mediante el uso de 41 sitios de edición de ARN en 8 dianas diferentes.

C: Ejemplo de rendimiento diagnóstico obtenido en hombres mediante el uso de 35 sitios de edición de ARN en 7 dianas diferentes.

Figura 14:Características demográficas y diagnóstico psiquiátrico de la población de estudio incluida en el estudio de Sec-ARN.

Los datos son la media ± EEM. Los valores p de las características principales se visualizan con la prueba t de Student; IMC: Índice de masa corporal

Figura 15:Categorización funcional de los 366 genes editados diferencialmente entre DEP y controles basándose en anotaciones de ontología genética (GO).

Se muestran los resultados de las 20 pruebas de sobrerrepresentación de GO principales para el enriquecimiento de términos GO de procesos biológicos con genes editados diferencialmente. La entrada a las herramientas de análisis de enriquecimiento de GO fue la lista de 366 genes editados diferencialmente entre DEP y los controles. Se presentan la relación entre el número de genes/número total de genes incluidos en el término GO y los valores p corregidos usando el método de Benjamini-Hochberg para múltiples pruebas. TDF, tasa de descubrimientos falsos; GO, ontología genética.

Figura 16:Análisis de enriquecimiento de la ruta de señalización de los 366 genes editados diferencialmente entre DEP y los controles.

La figura muestra las rutas significativas obtenidas realizando un análisis de sobrerrepresentación en Reactome. Se muestran la relación entre el número de genes/número total de genes incluidos en la ruta y los valores p corregidos usando el método de Benjamini-Hochberg para múltiples pruebas.

Figura 17:Variantes de edición de genes y ARN analizadas en la cohorte de priorización.

Se muestran el gen y la posición (GRCh38) de la variante de edición, la cobertura después de Sec-ARN, el cambio entre controles y pacientes con DEP, el valor de p y el área bajo la curva calculada a partir de datos de Sec-ARN. Los valores p se calcularon usando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

Figura 18:Categorización funcional de los 14 genes editados diferencialmente usados en las cohortes de priorización basándose en anotaciones de ontología genética (GO).

Se muestran los resultados de las 20 pruebas de sobrerrepresentación de GO principales para el enriquecimiento de términos GO de procesos biológicos con genes editados diferencialmente. La entrada a las herramientas de análisis de enriquecimiento de GO fue la lista de 14 genes editados diferencialmente entre DEP y controles analizados en las cohortes de priorización. Se presentan valores p corregidos usando el método de Benjamini-Hochberg para múltiples pruebas. TDF, tasa de descubrimientos falsos; GO, ontología genética.

Figura 19:Análisis de enriquecimiento de la ruta de señalización de los 14 genes analizados en las cohortes de priorización. La figura muestra las rutas significativas obtenidas al realizar el análisis de sobrerrepresentación en Reactome. Se muestran los valores p corregidos usando el método de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples.

Figura 20:Las características demográficas y el diagnóstico psiquiátrico de la población de estudio incluyeron el primer estudio de priorización analizado en monoplex.

Los datos son la media ± EEM. Los valores p de las características principales se visualizan con la prueba t de Student. IMC: Índice de masa corporal. Se muestran las pruebas.

Figura 21:Las características demográficas y el diagnóstico psiquiátrico de la población de estudio incluyeron el segundo estudio de priorización analizado mediante secuenciación multiplexada.

Los datos son la media ± EEM. Los valores p de las características principales se visualizan con la prueba t de Student. IMC: Índice de masa corporal.

Figura 22:Características demográficas y diagnóstico psiquiátrico de la población de estudio incluida en la cohorte de validación.

Los datos son la media ± EEM. Los valores p de las características principales se visualizan con la prueba t de Student. IMC: Índice de masa corporal

Figura 23:Características demográficas y diagnóstico psiquiátrico de los controles sanos y pacientes bipolares. Los datos son la media ± EEM. Los valores p de las características principales se visualizan con la prueba t de Student. CTRL: Controles sanos; IMC: Índice de masa corporal

Figura 24:Características demográficas y diagnóstico psiquiátrico de pacientes con trastorno bipolar de tipo I y tipo II. Los datos son la media ± EEM. Los valores p de las características principales se visualizan con la prueba t de Student. CTRL: Controles sanos; IMC: Índice de masa corporal

Figura 25:Categorización funcional de los 366 genes editados diferencialmente entre DEP y controles basándose en anotaciones de g:Profiler.

Se muestran los resultados de las 20 pruebas de sobrerrepresentación de GO principales para el enriquecimiento de términos GO de procesos biológicos con genes editados diferencialmente. La entrada al g: Profiler fue la lista de 366 genes editados diferencialmente entre DEP y los controles. Se presentan la relación entre el número de genes/número total de genes incluidos en el término GO y los valores p corregidos usando el método de Benjamini-Hochberg para múltiples pruebas. TDF, tasa de descubrimientos falsos; GO, ontología genética.

Figura 26:Categorización funcional de los 366 genes editados diferencialmente entre DEP y controles basándose en anotaciones de GOnet.

Se muestran los resultados de las 20 pruebas de sobrerrepresentación de GO principales para el enriquecimiento de términos GO de procesos biológicos con genes editados diferencialmente. La entrada al GOnet fue la lista de 366 genes editados diferencialmente entre DEP y los controles. Se presentan la relación entre el número de genes/número total de genes incluidos en el término GO y los valores p corregidos usando el método de Benjamini-Hochberg para múltiples pruebas. TDF, tasa de descubrimientos falsos; GO, ontología genética.

Figuras 27A-27B:Correlación entre las puntuaciones clínicas MADRS e IDS-C30 para los sujetos incluidos en el estudio de Sec-ARN.

A: Correlación entre las puntuaciones clínicas MADRS e IDS-C30 para los pacientes con BD. El gráfico muestra una confianza de intervalos del 95 %. Se indican el coeficiente de correlación de Pearson y el valor de p.

B: Correlación entre las puntuaciones clínicas MADRS e IDS-C30 para los pacientes unipolares. El gráfico muestra una confianza de intervalos del 95 %. Se indican el coeficiente de correlación de Pearson y el valor de p.

Figura 28:Visión general de la canalización de análisis del editoma

Canalización de búsqueda de edición de ARN a partir del análisis del editoma

Figuras 29A-29B:Rendimiento diagnóstico de la edición de ARNm de la cohorte de validación (n = 256) analizado mediante secuenciación multiplexada de 6 dianas usando el modelo 1 (Figura 29A) y el modelo 2 (Figura 29B) de Bosque aleatorio.

A. Curva característica operativa del receptor y rendimientos diagnósticos para la depresión bipolar con el primer modelo ajustado por edad, sexo, tratamiento psiquiátrico y adicción. Se representan gráficamente las probabilidades de la respuesta correcta de los conjuntos sometidos a prueba

B. Curva característica operativa del receptor y rendimientos diagnósticos para la depresión bipolar con el segundo modelo ajustado por edad y sexo. Se representan gráficamente las probabilidades de la respuesta correcta de los conjuntos sometidos a prueba

EJEMPLO 1: Materiales y métodos

Sujetos y evaluación clínica

Pacientes deprimidos (n = 297; DEP) se reclutaron entre los pacientes ambulatorios del Departamento de Psiquiatría de Emergencia y Cuidados Intermedios (CHRU de Montpellier) según los principios de la Declaración de Helsinki de 1975 y sus actualizaciones sucesivas. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético local francés (CPP Sud-Méditerranée IV en Montpellier, CPP n.° A01978-41). Todos los participantes, de entre 18 y 67 años, entendieron y firmaron un consentimiento informado por escrito antes de ingresar al estudio. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional local, según los requisitos de aprobación y las buenas prácticas clínicas. Todos los pacientes cumplieron los criterios de depresión unipolar y trastorno bipolar del Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales IV (DSM-IV) usando la Entrevista Neuropsiquiátrica Internacional MINI. La presencia o ausencia de diagnósticos psiquiátricos y estados de ánimo al momento de ingresar al estudio fueron confirmados por psiquiatras capacitados. Durante la entrevista estandarizada, los psiquiatras manejaron la versión francesa de la Escala de Calificación de Depresión de Montgomery-Ásberg (MADRS) y el Inventario de Sintomatología Depresiva de 30 ítems, Calificado por el Clínico (IDS-C30). La gravedad de los síntomas maníacos en el trastorno bipolar se evaluó mediante la Escala de calificación de manía de Young (YMRS). Es importante destacar que elegimos incluir solo pacientes cuyos niveles de gravedad de depresión eran moderados y severos (MADRS > 20 y/o IDSC-30 > 24), para evitar pacientes “ límite” , por ejemplo, pacientes con puntuaciones bajas de depresión o pacientes a quienes una escala de depresión los definía como deprimidos mientras que la otra los definía como saludables. Los sujetos de control emparejados por edad, raza y sexo (n = 143) fueron reclutados de una lista de voluntarios del Centro de Investigación Clínica (CHRU de Montpellier).

Extracción y cualificación de ARN a partir de sangre completa

Se recuperó un volumen de 4 ml de sangre completa de cada paciente en tubos de ARN sanguíneo PAXgene™, que están optimizados para la estabilización del ARN y se almacenan a -20 °C antes de transferirse a -80 °C. Las muestras se distribuyeron aleatoriamente en los diferentes conjuntos de extracciones. Las muestras de sangre se descongelaron a 4 °C durante la noche y se centrifugaron durante 10 min a 3.000 g. El sedimento se lavó con 4 ml de DPBS 1X y se resuspendió en 400 pl de DPBS 1X. Las muestras de ARN totales se aislaron usando el kit MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume (LifeScience), según el protocolo automatizado del fabricante. Los ARN se eluyeron en 100 pl de tampón de elución MagNA Pure 96. Durante la preparación de la muestra y la extracción de ARN, se tomaron precauciones estándar para evitar la degradación del ARN por las ARNasas. Las concentraciones de ARN total y los niveles de calidad se determinaron con los instrumentos Qubit Fluorometer (Invitrogen) y LabChip (Perkin-Elmer, HT RNA Reagent Kit), respectivamente.

Preparación de bibliotecas para secuenciación de ARN

Para la preparación de bibliotecas de ARN a partir de ARN derivados de la sangre, elegimos una estrategia específica destinada a agotar en un solo paso tanto el ARN ribosómico como los ARN de globina, que son dos formas de ARN abundante, para enriquecer la biblioteca con ARN totales (ARNm). Se prefirieron los ARN totales a los ARN mensajeros, ya que se ha mostrado que la edición de ARN en las células sanguíneas se enriqueció en la región intrónica de elementos repetitivos, que se eliminan durante el empalme para producir ARN mensajeros. Por ello, usamos un kit de biblioteca TruSeq Stranded Total RNA (Illumina) con Ribo-Zero Globin, que está diseñado específicamente para muestras de sangre, según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se agotaron 300 ng de ARN totales en ARN ribosómico y ARN de globina usando sondas de agotamiento de ARNr y globina en combinación con perlas magnéticas. Después de la purificación, los ARN se fragmentan en fragmentos de 250 pb en promedio usando cationes divalentes a temperatura elevada. A continuación, se logró la síntesis de ADNc de primera cadena usando la transcriptasa inversa Superscript II (Thermo Fisher Scientific) y cebadores aleatorios. A continuación, se realiza la síntesis de ADNc de segunda cadena usando la ADN polimerasa I y la ARNasa H. Durante la síntesis de ADNc de segunda cadena, se incorpora dUTP en lugar de dTTP para generar una biblioteca específica de cadena. Después de la síntesis de ADNc de segunda cadena, los extremos 3' de los fragmentos romos se adenilan en 3' antes de la ligadura del adaptador. Es importante destacar que cada índice se ha atribuido a todos los grupos para evitar un sesgo putativo debido al efecto inespecífico del índice sobre la profundidad de la secuenciación. A continuación, fragmentos de ADN que tienen moléculas adaptadoras en ambos extremos se amplificaron mediante PCR para aumentar la cantidad de ADN en la biblioteca. A continuación, se realizaron controles de calidad usando instrumentos tanto Qubit Fluorometer (Invitrogen) como LabChip (Perkin-Elmer, HT DNA 5K Reagent Kit) para la cuantificación de las plantillas de la biblioteca de ADN y el análisis de control de calidad, respectivamente. A continuación, las muestras se agruparon en una biblioteca y se purificaron usando el sistema de limpieza de PCR Magbio. La biblioteca se desnaturalizó usando NaOH 0,1 M y se secuenció en un experimento con Illumina NextSeq 500/550 de alto rendimiento usando química de extremos emparejados con una longitud de lectura de 75 pb.

Procesamiento de datos Sec-ARN, análisis de expresión diferencial y análisis del editoma

Las lecturas de extremos emparejados se generaron usando un Illumina NextSeq 500 y se desmultiplexaron usando bcl2fastq (versión 2.17.1.14, Illumina). La calidad de la secuenciación se realizó usando el software FastQC (versión 0.11.7, https://github.com/s-andrews/FastQC). Las alineaciones de lectura se realizaron usando la versión del genoma humano hg38 con el alineador STAR7, seguido de una realineación con Genome Analysis Tool Kit (GATK, versión 4.1.4.0)8, eliminación de duplicados de PCR y denominación de variantes de un solo nucleótido (SNV) finales. La identificación y cuantificación de los eventos de edición de A a I se realizó usando RNAEditor (versión 1.0)9. A continuación, se realizó un filtrado adicional y una anotación funcional de los eventos editados con ANNOVAR10, RepeatMasker11 y BiomaRt12

Preparación y secuenciación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación dirigida

Para la preparación de bibliotecas de secuenciación de nueva generación (NGS), elegimos un enfoque dirigido multiplexado para secuenciar selectivamente la región de interés dentro de cada diana relevante. Se usaron cebadores de PCR validados para amplificar la región de interés mediante PCR (Tabla 1). Para la amplificación por PCR, se usó la enzima Q5 Hot Start High Fidelity (New England Biolabs) según las pautas del fabricante. La reacción de PCR se realizó en un termociclador Peqstar 96x usando un protocolo de PCR optimizado. Se evaluaron tanto la cantidad como la calidad del producto de<p>C<r>. La pureza del amplicón se determinó con un analizador de ácidos nucleicos (LabChipGx, Perkin Elmer) y la cuantificación se realizó usando el método Qubit basado en fluorescencia. Después del control de calidad, las reacciones de PCR se purificaron usando perlas magnéticas (sistema High Prep PCR MAGbio, Mokascience). A continuación, se cuantificó el ADN usando el sistema Qubit y se calculó el rendimiento de purificación. A continuación, las muestras se indexaron individualmente mediante amplificación por PCR usando la enzima PCR de alta fidelidad Q5 Hot start (New England Biolabs) y el kit Illumina 96 Indexes (kit Nextera XT index; Ilumina). A continuación, las muestras se agruparon en una biblioteca y se purificaron usando el sistema de limpieza de PCR Magbio. La biblioteca se desnaturalizó usando NaOH 0,1 M y se cargó en un cartucho de secuenciación (Illumina MiSeq Reagent Kit V3 o Illumina NextSeq 500/550 Mid-Output) según las pautas de Illumina. Se incorporó a las bibliotecas una agrupación de ARN total comercial de leucocitos periféricos de sangre humana (Clontech, n.° 636592) para determinar la variabilidad entre diferentes celdas de flujo de secuenciación durante el transcurso del experimento. Se agregaron bibliotecas de NGS para introducir diversidad en las bibliotecas usando PhiX Control V3 (Illumina) y se secuenciaron (secuenciación de lectura única, longitud de lectura de 150 pb) en concentraciones estándar usando secuenciación profunda (> 50.000 secuencias por muestra).

Análisis bioinformático de datos de secuenciación dirigida

Los datos de secuenciación se descargaron de los secuenciadores NextSeq o MiSeq (Illumina). La calidad de la secuenciación se realizó usando el software FastQC (versión 0.11.7, https://github.com/s-andrews/FastQC). Se consideró una profundidad de secuenciación mínima de 20.000 lecturas para cada muestra para un análisis adicional. Se realizó una etapa de pretratamiento que consistió en eliminar las secuencias adaptadoras y filtrar las secuencias según su tamaño y puntuación de calidad. Se eliminaron las lecturas cortas (< 100 nucleótidos) y las lecturas con un QC promedio < 20. Para mejorar la calidad de alineación de las secuencias, se usaron herramientas de filtrado y recorte de lectura flexibles para datos NGS de Illumina (fastx_toolkit v0.0.14 y prinseq, versión 0.20.4). Después de realizar las etapas de preprocesamiento, se realizó un control de calidad adicional de cada archivo fastq limpio antes de realizar un análisis adicional.

La alineación de las lecturas procesadas se realizó usando bowtie213 (versión 2.2.9) con modo sensible de extremo a extremo. La alineación se realizó con la secuencia de referencia más reciente del genoma humano14 (GRCh38). Las alineaciones no únicas, las lecturas no alineadas o las lecturas que contienen inserción/eliminación (INDEL) se eliminaron del análisis corriente abajo mediante el software SAMtools15 (versión 1.7). Se usó SAMtools mpileup16 para la denominación de SVN. La búsqueda de la posición editada en la alineación se realizó mediante secuencias de comandos internas para contar el número de nucleótidos diferentes en cada ubicación genómica. Para cada posición, la secuencia de comandos calcula el porcentaje de lecturas que tienen una 'G' [Número de lecturas 'G'/ (Número de lecturas ' G' Número de lecturas 'A') * 100]. Las referencias de ubicación genómica 'A' con porcentaje en lecturas 'G' > 0,1 son detectadas automáticamente por la secuencia de comandos y se consideran como 'sitio de edición de A a I'. La última etapa fue calcular el porcentaje de todas las isoformas posibles de cada transcrito. Por definición, la proporción relativa de edición de ARN en un “sitio” de edición determinado representa la suma de las modificaciones de edición medidas en esta coordenada genómica única. Por el contrario, una isoforma de ARNm es una molécula única que puede contener o no múltiples modificaciones de edición en el mismo transcrito. Por ejemplo, para un transcrito dado, la isoforma BC del ARNm contiene una modificación de A a I tanto en el sitio B como en el sitio C dentro del mismo transcrito. Se estableció una proporción relativa de al menos el 0,1 % como umbral para ser incluido en el análisis.

Análisis estadístico de datos

Todas las estadísticas y cifras se calcularon con el software estadístico de código abierto “ R/Bioconductor” (versión R 3.5.3)17 o el software GraphPad Prism (versión 7.0). Los valores de los biomarcadores (es decir, los sitios de edición de ARN y las isoformas de los genes diana y la expresión de ARNm de los ADAR) se presentan habitualmente como media ± error estándar de la media (EEM). Para garantizar una distribución normal de los datos, todos los biomarcadores podrían transformarse usando el paquete R bestNormalize (versión 1.4.2). Para garantizar una distribución normal de los datos, todos los biomarcadores podrían transformarse usando el paquete R bestNormalize (versión 1.4.2). Se realizó un análisis diferencial usando la prueba más adecuada entre la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney, la prueba t de Student o la prueba t de Welch según la normalidad y la distribución de la varianza de la muestra. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

La proporción relativa de edición de ARN, tanto en sitios como en isoformas, se analizó ajustándola al nivel de transcrito relativo del gen de referencia. Los valores de edición de ARN ajustados se calcularon de la siguiente manera:

Valor de edición ajustado*= (valor de edición de ARN X nivel de transcrito relativo)/100)

El rendimiento diagnóstico del biomarcador podría caracterizarse por: sensibilidad, que representa su capacidad para detectar el grupo “ bipolar” y especificidad, que representa su capacidad para detectar el grupo “ unipolar"’. Los resultados de la evaluación de una prueba diagnóstica se pueden resumir en una tabla de contingencia 2x2 comparando estos dos grupos bien definidos. Fijando un punto de corte, los dos grupos podrían clasificarse en categorías según los resultados de la prueba, categorizados o bien como positivos o bien como negativos. Dado un biomarcador particular, se puede identificar un número de pacientes A con un resultado positivo en la prueba dentro del grupo bipolar (el “Verdadero Positivo” : TP) y pacientes B con un resultado negativo en la prueba dentro del grupo “ unipolar” (el “Verdadero Negativo” : TN). De la misma manera, se observan pacientes C con un resultado de prueba negativo dentro del grupo “ bipolar” (el “ Falso Negativo” : FN) y pacientes D con un resultado de prueba positivo dentro del grupo “ unipolar” (el “ Falso Positivo” : FP). La sensibilidad se define como TP/(TP FN); que se denomina en la presente memoria “tasa de positivos verdaderos” . La especificidad se define como TN/(TN FP); que se denomina en la presente memoria “ tasa de negativos verdaderos” .

La precisión de cada biomarcador y su poder discriminatorio se evaluaron usando un análisis de características operativas del receptor (ROC)18 Las curvas ROC son la visualización gráfica de la relación recíproca entre la sensibilidad (Se) y la especificidad (Sp) de una prueba para varios valores. Además, todos los biomarcadores se combinaron entre sí para evaluar el aumento potencial de la sensibilidad y especificidad usando múltiples enfoques como, por ejemplo, el programa mROC19 o Bosque aleatorio20.

mROC es un programa dedicado para identificar la combinación lineal2122, que maximiza la curva ROC de AUC (Área bajo la curva)23. Se proporciona la ecuación para la combinación respectiva y puede usarse como un nuevo marcador virtual Z, de la siguiente manera:

Z = a X biomarcador 1 b X biomarcador 2 c X biomarcador 3

donde a, b, c son coeficientes calculados y los biomarcadores 1,2,3 son el nivel del biomarcador considerado.

Se aplicó Bosque Aleatorio (RF) como anteriormente para evaluar las combinaciones de isoformas/sitios de edición de ARN. Este método combina la idea de “ embolsado” de Breiman20 y la selección aleatoria de características para construir una colección de árboles de decisión con varianza controlada. Por ello pueden usarse bosques aleatorios para clasificar la importancia de la edición de isoforma y combinar las mejores isoformas. Se implementó el embolsado asimétrico con reducción de tamaño múltiple (MultDS) con clasificador de variables integrado24. Este método intenta aprovechar toda la información de las clases mayoritarias mediante un submuestreo múltiple pero manteniendo fija la clase minoritaria. Nuestro algoritmo generó 100 bosques aleatorios a partir del conjunto de entrenamiento, cada uno con el mismo número fijo de la clase minoritaria y un número igual o ajustado de lo muestreado aleatoriamente, generando árboles casi equilibrados. Para la clasificación de nuevos datos, los resultados se combinaron posteriormente mediante votación mayoritaria de los 100 bosques aleatorios entrenados. Para estimar los parámetros RF para cada 100 bosques aleatorios entrenados, se aplicó una validación cruzada de 10 veces. La implementación se realizó usando el paquete R randomForest (versión 4.6-14) y el paquete R caret (versión 6.0-84).

EJEMPLO 2: Resultados

Características de las muestras del estudio de descubrimiento

Los pacientes incluidos en las muestras de Sec-ARN fueron emparejados con respecto a todas las variables, por ejemplo, sexo, edad o IMC, que no fueron estadísticamente diferentes entre los grupos (Figura 14). Elegimos dos evaluaciones clínicas diferentes para confirmar la presencia de diagnósticos psiquiátricos, en concreto, MADRS e IDSC-30, ambas designadas por el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales de la Asociación Estadounidense de Psiquiatría. Tanto los pacientes unipolares como los bipolares fueron clasificados como deprimidos según las puntuaciones clínicas en las escalas de depresión MADRs e IDSC-30, y fueron estadísticamente significativos con respecto a controles sanos (Figura 14). Además, observamos una asociación significativa entre las dos evaluaciones clínicas (para BD (r2 = 0,747, p < 0,0001 para BD, r2 = 0,934, p < 0,0001 para Unipolar, Figuras 27A y 27B), lo que sugiere una asignación correcta de los pacientes y una homogeneidad relativa en la puntuación de la depresión. No hubo ninguna diferencia estadística en la gravedad de los síntomas maníacos evaluados por la YMRS entre los pacientes que padecían depresión unipolar o aquellos que padecían trastorno bipolar (Figura 14), lo que sugiere que los pacientes con BD incluidos en el estudio estaban en un episodio depresivo real.

Análisis del editoma

Para obtener un panorama global de la modificación de los eventos de edición de ARN en pacientes deprimidos, analizamos el conjunto de datos de Sec-ARN usando una canalización de análisis del editoma interna (véanse los métodos de la Figura 28). Identificamos 37.599 posiciones editadas diferencialmente de A a I con una cobertura mínima de 30x, lo que garantiza un alto grado de confianza en posiciones de bases particulares. La cobertura describe el número promedio de lecturas que se alinean con o “cubren” bases de referencia conocidas. La mayoría de las posiciones editadas (sitios 32, 183, un 85,6 % del total) estaban presentes en intrones (Figura 1A), en consonancia con otros estudios en tejidos humanos25. El porcentaje de posiciones editadas en regiones 3' no traducidas (3'UTR) de ARNm fue del 6,2 % (2344 sitios), en línea con informes anteriores que usaron Sec-ARN. El número de sitios de edición tuvo una distribución homogénea por todo el genoma, aunque los genes editados en los cromosomas 4, 9, 18, 19, 20, 21 y 22 estuvieron ligeramente sobrerrepresentados (Figura 1B). A continuación, realizamos un análisis diferencial para identificar sitios cuya edición podría ser específicamente diferente entre DEP y controles sanos. Después de aplicar criterios de calidad preestablecidos (exclusión de sitios intergénicos, cobertura >30; AUC >0,6; 0,95 >Múltiplo de variación>1,05 y p <0,05), se identificaron 646 variantes editadas diferencialmente entre pacientes deprimidos y controles sanos (Figura 1C), representando 366 genes. Los criterios de calidad se establecieron con el fin de proporcionar biomarcadores (BMK) de diagnóstico potenciales para trastornos depresivos con utilidad clínica. Es importante destacar que no se observaron diferencias en la edición global del ARN entre pacientes y controles. De hecho, calculamos el índice de edición de Alu (AEI) global, que es una medida de la tasa global de edición de ARN en repeticiones deAlu.Las repeticiones deAluson, con diferencia, la región editada más común en el genoma humano y, por tanto, son indicativas de la tasa de edición global26. No hallamos diferencias significativas en el AEI entre los controles y los pacientes deprimidos (media de control de AEI = 0,300 ± 0,002, media de DEP de AEI = 0,299 ± 0,003, valor de p = 0,57, Figura 1D). Como el índice de edición de Alu caracteriza el nivel de edición promedio ponderado en todas las secuencias de Alu expresadas, estos datos sugieren que la edición diferencial del ARN era específica de la diana en lugar de depender del estado de la enfermedad.

GSEA (análisis de enriquecimiento en conjuntos de genes) sobre estos 366 genes usando herramientas de ontología genética27 mostraron un fuerte enriquecimiento de términos (tasa de falsos descubrimientos < 0,05) para los procesos biológicos, incluyendo múltiples categorías inmunitarias (respuesta, activación y regulación), activación celular y procesos metabólicos (Figura 15). Este análisis se replicó con otras herramientas, como G:profiler28 (Figura 25) o GOnet29 (Figura 26), e indicó consistentemente un fuerte enriquecimiento en los procesos biológicos relacionados con el sistema inmunitario. Además, el análisis de las rutas de Reactome de esos 366 genes reveló un fuerte enriquecimiento en rutas relacionadas con el sistema inmunitario, es decir, la señalización de TCR, la translocación de ZAP-70 a la sinapsis inmunitaria o la señalización del interferón gamma (Figura 16). Cabe destacar que el análisis de componentes principales (PCA) mostró que este subconjunto de las 646 variantes de edición que representan 366 genes discriminaban claramente entre controles y pacientes deprimidos en 2 grupos separados (Figura 2), lo que sugiere que las variantes de edición en esos genes podrían usarse en combinación para discriminar selectivamente entre pacientes deprimidos y controles sanos.

Para acotar adicionalmente la lista de genes, se usaron criterios de calidad mucho más estrictos (cobertura >30; AUC >0,8; 0,8 >Múltiplo de variación>1,20 y p <0,05). A continuación, la base de datos de estos marcadores se seleccionó manualmente para alcanzar una combinación de varios biomarcadores que representan diferentes mecanismos biológicos. Usando estos criterios secundarios, se seleccionó una lista de 15 variantes, que representan 13 genes (Figura 17), tanto por su rendimiento diagnóstico como por su papel potencial en el sistema inmunitario o la biología de la enfermedad psiquiátrica y para estudiarse en una cohorte de priorización posterior. Además, nominamos otra diana, PDE8A, para el cual los datos previos indicaron una edición alterada en el cerebro suicida y en la sangre de la depresión inducida por fármacos en pacientes con VHC3031. El análisis de redes de asociación proteína-proteína con la base de datos STRING32 reveló una red con fuerte enriquecimiento en la interacción proteína-proteína (valor de p de PPI <4,5,10-6). Las interacciones dentro de STRING se basan en evidencia y consisten en interacciones directas (físicas) e indirectas (funcionales); en el presente caso nos centramos en una puntuación de interacción requerida mínima de 0,7, lo que es indicativo una confianza alta en las interacciones proteína-proteína reales. El análisis de red de asociación de proteínas funcionales de los 14 genes seleccionados usando herramientas de ontología genética27 también mostró un fuerte enriquecimiento en genes relacionados con: proceso de regulación del sistema inmunitario (8 genes, GO:0002682; p(TDF = 4-10'4), regulación de la respuesta inmunitaria, (6 genes, (GO:0050776, p(TDF = 2,2-10'3)) o ruta de señalización del receptor a través de JAK-STAT (4 genes, GO:0007259), que generalmente se activa después de la estimulación con interferón-alfa (Figura 3 y Figura 18). Además, el análisis de las rutas de Reactome indicó que esos 14 genes estaban enriquecidos en rutas relacionadas con el sistema inmunitario (p. ej., regulación de la señalización de IFNA (HSA-912694, p(TDF) < 0,025) o señalización de citocinas (HSA-1280215, p(TDF) < 0,026)) y regulación de neurotransmisores (p. ej., tráfico de receptores AMPA (HSA-399719, p(TDF) < 0,025), unión de glutamato y plasticidad sináptica (Ha S-399721, p(TDF) < 0,025) o receptores de neurotransmisores y transmisión de señales postsinápticas (HSA-112314, p(TDF) < 0,029)) (Figura 18). Resulta interesante observar que la ruta Top identificada en el análisis de Reactome (p(TDF) < 0,012) está vinculada al factor de transcripción Runx1, que recientemente se ha mostrado que media el efecto del estrés crónico por derrota social en un modelo de depresión en ratones a través de la regulación de la familia miR-30 de miARN33.

Descripción de la diana

PRKCB:Se sabe bien que la proteína quinasa C beta (PRKCB), que pertenece a la familia de las proteínas quinasas específicas de serina y treonina, desempeña un papel crucial en el sistema inmunitario, ya que los ratones con genes inactivados para p Kc B desarrollan una inmunodeficiencia caracterizada por una activación deficiente de las células B, una respuesta del receptor de las células B y defectos en las respuestas inmunitarias independientes de las células T. PRKCB también actúa como un regulador de la respuesta del eje HPA al estrés34. Un estudio de asociación de 44 genes candidatos con síntomas depresivos y de ansiedad en mujeres posparto reveló una asociación entre PRKCB y la depresión mayor. De hecho, PRKCB interactúa con CREB1 y lo fosforila, lo que regula directamente la expresión de varios genes implicados en la respuesta al estrés en el cerebro, tal como BDNF, el receptor de BDNF Trk-b y el receptor de glucocorticoides35.

MDM2:MDM2 es un inhibidor celular primario de p53 y podría ser una diana para el tratamiento contra el cáncer. Sin embargo, MDM2 también cataliza la ubiquitinación de la p-arrestina, que es una diana de los antidepresivos. En el SNC, MDM2 está implicado en la expresión de superficie de AMPAR (receptor de glutamato) durante la plasticidad sináptica36. Resulta interesante observar que se ha mostrado que la edición de ARN en MDM2 regula los niveles de proteínas. De hecho, el aumento de la edición de ARN en el UTR 3' de MDM2 elimina la represión mediada por microARN, lo que puede aumentar sus niveles de ARNm.

PIAS1:PIAS1 (inhibidor proteico de STAT 1 activado) funciona como una SUMO ligasa que bloquea la actividad de unión al ADN de Stat1 e inhibe la activación genética mediada por Stat1 en respuesta al interferón. La sumoilación de factores de transcripción (HSA-3232118) es una de las principales rutas de Reactome en los 14 genes seleccionados para el análisis en la cohorte de priorización (Figura 19). PIAS1 inhibe selectivamente los genes inducibles por interferón y es un actor importante en la inmunidad innata37. Además, Pias1 interactúa con el receptor de glutamato metabotrópico presináptico 8 (mGluR8) y agrega una modificación postranscripcional por sumoilación, lo que sugiere que PIAS1 podría tener funciones reguladoras en la orientación y modulación de la señalización del receptor mGluR8.

IFNAR1:Numerosos estudios han vinculado los interferones con cambios inducidos por la inflamación en la función cerebral y la depresión, al menos en parte a través del efecto de IL-6, CXCL10 o por la inducción de la indolamina 2,3-dioxigenasa1 (IDO1 )38. Además, se ha mostrado que los polimorfismos en la región promotora del receptor IFN-alfa/beta 1 (IFNAR1) pueden influir en el riesgo de desarrollar depresión. Los interferones se usan para el tratamiento de la hepatitis viral, trastornos hematoproliferativos, trastornos autoinmunitarios y enfermedades malignas. Sin embargo, independientemente de la indicación de la terapia con IFN, los IFN se asocian con un riesgo del 30 al 70 % de depresión emergente con el tratamiento. En un trabajo previo hemos mostrado que los biomarcadores de edición de ARN permitieron discriminar entre pacientes que desarrollaron una depresión emergente con el tratamiento y aquellos que no.

IFNAR2:Los interferones actúan a través de sus receptores; el receptor de interferón tipo I (IFNaR) está compuesto por dos subunidades, IFNAR1 e IFNAR2. Un polimorfismo en el gen IFNAR2 (SNP 11876) mostró una asociación con la susceptibilidad a la esclerosis múltiple (p = 0,035). Resulta interesante observar que el mismo estudio también identificó un polimorfismo en el gen IFNAR1 (SNP 18417), que es miembro del mismo receptor.

LYN:LYN codifica una proteína tirosina quinasa no receptora que transmite señales desde los receptores de la superficie celular. Lyn desempeña un papel importante en la regulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas39. En el sistema nervioso central de los mamíferos, Lyn se expresa en gran medida en el núcleoaccumbens,la corteza cerebral y el tálamo. Además, Lyn participa en el control de la ruta del receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR, un receptor de glutamato ionotrópico). De hecho, las pruebas de comportamiento mostraron que la actividad motora espontánea se suprime en los ratones Lyn-/-, debido a la potenciación de la señalización del receptor NMDA. Además, Lyn interactúa físicamente con el receptor AMPA, un miembro de la familia de receptores de glutamato40. Tras la estimulación del receptor, Lyn activa la ruta de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), lo que a su vez aumenta la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Es importante destacar que la activación de receptores AMPA junto con la liberación de BDNF y la activación de las rutas de señalización sinaptogénica corriente abajo median los efectos antidepresivos de la ketamina. Las interacciones entre el receptor de glutamato y la Lyn cinasa experimentan adaptaciones drásticas en trastornos del estado de ánimo tales como el trastorno depresivo mayor.

AHR:El receptor de hidrocarburos arílicos (AHR) es un factor de transcripción dependiente de ligando altamente conservado que detecta toxinas ambientales y ligandos endógenos. El AHR también modula la diferenciación y la respuesta de las células inmunitarias41. AHR también controla la diferenciación de las células tanto T(reg) como Th17 de manera específica para cada ligando. La activación de AHR induce IDO y, por tanto, aumenta los niveles de quinurenina. El papel de la quinureína está bien documentado en el SNC, donde desempeña un papel importante en la fisiopatología de la depresión inducida por inflamación. El bloqueo farmacológico de AHR rescató el tráfico de monocitos inducido por la inflamación sistémica, el trastorno neuroinmunitario y el comportamiento de tipo depresivo en ratones. La edición de ARN afecta a la 3'UTR del ARNm de AHR humano, creando de ese modo una secuencia de reconocimiento de microARN que modula la expresión de AHR.

RASSF1:El miembro 1 de la familia del dominio de asociación Ras (RASSF1) RASSF1A es un gen supresor de tumores cuya inactivación se ha relacionado con una amplia variedad de cánceres humanos esporádicos y se inactiva epigenéticamente con alta frecuencia en una variedad de tumores sólidos. RASSF1A se asocia con MDM2 y potencia la actividad de la autoubiquitina ligasa de MDM242 Resulta interesante observar que un análisis de micromatrices identificó recientemente RASSF1A como un gen significativamente regulado a la baja en mujeres con antecedentes de depresión posparto.

GAB2:Las proteínas Gab funcionan corriente abajo de múltiples receptores, tal como los receptores de EGF, el factor de crecimiento de hepatocitos y los FGF. GAB2 es un componente importante de la diferenciación neuronal inducida por ácido retinoico, en parte al actuar corriente abajo del bFGF para mediar la supervivencia a través de la PI3 quinasa-AKT. GAB2 aumentó positivamente la expresión de IL-4 e IL-13 en células T activadas, lo que sugiere que<g>AB2 podría ser un regulador importante de la respuesta inmunitaria Th2 humana43.

CAMK1D:CAMK1D es un miembro de la familia de la proteína quinasa 1 dependiente de calcio/calmodulina y está implicado en la ruta de transducción de señales de quimiocinas que regula la función de los granulocitos44. En el SNC, CAMK1D se expresa principalmente en la región CA1 del hipocampo, donde se induce después de la potenciación a largo plazo (PLP), una potenciación duradera de la eficacia sináptica en el sistema nervioso central. Podría translocarse al núcleo en respuesta a estímulos que desencadenan la afluencia de Ca2+ intracelular, por ejemplo, glutamato, y activar la transcripción de genes dependiente de CREB. Cabe destacar que SNP rs2724812 en CAMK1D se ha asociado con la remisión después del tratamiento con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina mediante enfoques de aprendizaje profundo.

KCNJ15:El miembro 15 de la subfamilia J del canal dependiente de voltaje de potasio (KCNJ15) codifica un canal de potasio de tipo rectificador interno, Kir4.2. En el SNC, el canal KIR4.2 se expresa tardíamente en el desarrollo tanto en ratones como en el cerebro humano. Los canales de potasio de rectificación interna (canales Kir) son reguladores importantes de la señalización neuronal y la excitabilidad de la membrana. La activación de las subunidades del canal Kir desempeña un papel crucial en las enfermedades poligénicas del SNC. Además, se halló que rs928771 en KCNJ15 estaba asociado con alteraciones en los niveles de transcrito de KCNJ15 en sangre completa; el análisis de redes de conjuntos de datos del transcriptoma de la sangre y del hipocampo sugirió que las variantes de riesgo en el locus KCNJ15 podrían actuar a través de sus efectos reguladores sobre las rutas relacionadas con el sistema inmunitario46.

IL17RA:El receptor A de interleucina 17 (IL17RA) es una glicoproteína de membrana tipo I, que tiene una estructura similar a IFNAR1, que se une con baja afinidad a la interleucina 17A. La interleucina 17A (IL17A) es una citocina proinflamatoria secretada principalmente por linfocitos Th17 activados. Al unirse a su receptor cognado, IL17 envía señales a través de las rutas ERK, MAPK y NFKB, la totalidad de las cuales se han implicado en el trastorno depresivo.

Las células Th17 son potentes reguladores de la función cerebral, ya que se dirigen a varias células residentes del cerebro, incluyendo neuronas, astrocitos y microglía, y participan en la neuroinflamación47. IL17RA se expresa en gran medida en las células endoteliales de la barrera hematoencefálica (BHE) en las lesiones de esclerosis múltiple, donde IL17 aumenta la permeabilidad de la BHE al alterar uniones estrechas, promoviendo de ese modo la inflamación del SNC. La IL17 proinflamatoria también es secretada por microglía y astrocitos activados y tiene un efecto perjudicial sobre las neuronas. El análisis de citometría de flujo de las PBMC en sujetos deprimidos no medicados reveló un aumento significativo en el número de células Th17 periféricas y una concentración sérica elevada de IL-17, lo que sugiere un papel potencial de las células Th17 en pacientes con TDM. De manera similar, las células Th17 se aumentan en el cerebro de los ratones después de una situación de indefensión aprendida o estrés crónico por restricción, que son dos modelos comunes similares a la depresión. La inhibición de la producción o función de las células Th17 reduce la vulnerabilidad a un comportamiento similar a la depresión en los mismos modelos de ratón

PTPRC:La proteína tirosina fosfatasa, receptor tipo C (PTPRC), también conocida como antígeno leucocitario común o CD45, es una proteína tirosina fosfatasa de membrana integral, que contiene un segmento externo y es capaz de iniciar la señalización transmembrana en respuesta a ligandos externos48. En el sistema inmunitario, PTPRC es esencial para la activación de células T y B al mediar los contactos entre células y regular las proteínas tirosina quinasas implicadas en la transducción de señales. PTPRC suprime y regula negativamente la señalización del receptor de citocinas; la interrupción selectiva de la expresión de PTPRc conduce a una activación mediada por el receptor de interferón potenciada de las proteínas quinasas JAK y STAT49. Cabe destacar que una mutación puntual en PTPRC (transición de nucleótido C a G en la posición 77 del exón 4) se ha asociado con el desarrollo de la esclerosis múltiple, la enfermedad desmielinizante más común del SNC. En el cerebro, el comportamiento similar a la ansiedad inducido por la derrota social repetida, un modelo de depresión en ratones, se correspondió con un aumento en los macrófagos cerebrales que sobreexpresaban PTPRC. En el mismo modelo de depresión en ratones, se mostró que las benzodiazepinas clásicas revierten los síntomas y bloquean la acumulación inducida por el estrés de macrófagos que expresan niveles altos de PTPRC en el SNC. Además, en pacientes diagnosticados con trastorno depresivo mayor, el PTPRC fue mayor en los pacientes que en los sujetos sanos. La relación de PTPRC disminuyó con tratamiento antidepresivo tal como venlafaxina o fluoxetina, y se correlacionó positivamente con la gravedad de la depresión50, lo que sugiere que el tratamiento antidepresivo contribuye a la regulación inmunológica en pacientes con trastorno depresivo mayor.

PDE8A:Los receptores de glutamato o serotonina son receptores acoplados a proteína G (GPCR) implicados en una variedad de trastornos psiquiátricos, para los cuales la regulación espacial y temporal de la concentración de segundos mensajeros es crucial para la señalización posterior. Las fosfodiesterasas (PDE) son moduladores clave de la transducción de señales y están implicadas en la activación de células inflamatorias, el comportamiento, la memoria y la cognición. PDE8A es una fosfodiesterasa específica de AMPc que se expresa en el cerebro y la sangre. Se ha identificado una edición alterada del ARN en las transcripciones de PDE8A en células T de pacientes que padecen lupus eritematoso sistémico, un trastorno autoinmunitario crónico, al igual que en células T normales con IFN-a. Hay una disminución del doble en la expresión de la fosfodiesterasa 8A (PDE8A) en la corteza temporal de pacientes con trastorno depresivo mayor (TDM)51. Recientemente hemos mostrado alteraciones específicas de la región cerebral en la edición de ARN en el ARNm de PDE8A en fallecidos por suicidio, lo que proporcionó el primer marcador cerebral relacionado con la respuesta inmunitaria para el suicidio30. La edición del ARN de PDE8A también aumenta en las células de neuroblastoma SHSY-5Y tratadas con interferón alfa, como en los pacientes con VHC sometidos a terapia de combinación antiviral con IFN-a y ribavirina. Es importante destacar que la medición de la edición de ARN en PDE8A permitió discriminar entre el grupo de pacientes que desarrollaron una depresión emergente con el tratamiento y los que no, lo que sugiere que los biomarcadores de edición de ARN I-A podrían ser útiles para monitorizar la depresión emergente con el tratamiento31.

En el presente caso, nos centramos en las modificaciones de edición de ARN a nivel de todo el transcriptoma en pacientes unipolares y con BD para identificar variantes de edición que podrían usarse como biomarcadores para establecer un ensayo de diagnóstico clínicamente útil para el diagnóstico diferencial del BD. Con el fin de priorizar un subconjunto de variantes clínicamente útiles para un ensayo de diagnóstico para el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar, cada uno de los genes diana descritos anteriormente se probó individualmente en dos cohortes de “ priorización” separadas (n = 35, Figura 20 y n = 58, Figura 21) midiendo la tasa de edición en pacientes unipolares y con BD mediante NGS. En la primera cohorte, cada diana se secuenció individualmente, mientras que en la segunda cohorte se midieron las tasas de edición de biomarcadores multiplexando 4 BMK. Se realizó un método estadístico de análisis multivariante, evaluando para cada combinación de sitios editados de ARN y/o isotermas, para hallar la mejor combinación de biomarcadores. Para potenciar el rendimiento diagnóstico, minimizando el número de biomarcadores, se calculó la mejor combinación con diferentes números de biomarcadores.

La lista de cebadores usados para la detección de sitios de edición de ARN se indica en la Tabla 1.

Tabla 1: Cebadores usados para la detección de sitios de edición de ARN

Como era importante validar los resultados obtenidos en el estudio de Sec-ARN, en primer lugar realizamos un análisis diferencial de cada diana en las cohortes de priorización. Como se muestra en las tablas siguientes, se halló que todos los sitios e isoformas identificados en el estudio de Sec-ARN eran significativos en un análisis posterior sobre una población más grande.

Tabla 2A-2B:Análisis diferencial de sitios de edición e isoformas identificados en el estudio de Sec-ARN en los pacientes de la primera cohorte de priorización analizados en monoplex.

Se muestran ejemplos de datos de Sec-ARN de diferentes dianas con nombre de diana, sitio o isoforma editado diferencialmente, valor de p y múltiplo de variación del sitio o isoforma editado, curva ROC de AUC, el valor medio de la edición en el sitio considerado y el número de población.

Tabla 2A

Tabla 2B

Tabla3: Análisis diferencial de sitios de edición e isotermas identificados en el estudio de Sec-ARN en los pacientes de la segunda cohorte de priorización analizados con secuenciación multiplexada.

Se muestran ejemplos de datos de Sec-ARN de diferentes dianas con nombre de diana, sitio editado diferencialmente, valor de p y múltiplo de variación del sitio editado, curva ROC de AUC, el valor medio de la edición en el sitio considerado y el número de población.

A continuación, se analizaron combinaciones de biomarcadores para identificar el mejor rendimiento diagnóstico para el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar, con diferentes números de biomarcadores. En la primera cohorte, cuando solo se usaron 2 sitios de 2 dianas diferentes, obtuvimos un AUC de 0,812 (Sp 81,3 %; Se 79,0 %, Figura 4A). Otra combinación de 3 sitios, usando 2 BMK, dio resultados aún mejores, con un AUC de 0,872 (Sp 87,5 %; Se 79,0 %, Figura 4B). La ecuación usada para esta combinación es la siguiente:

Z= (2,03684329038398)* IFNAR1_X115_G (12,2505281183792)* LYN X151_F (-

0,765269706061865)*IFNAR1_X111_A

Cuando el número de sitios editados diferencialmente se aumentó a 4, con 3 dianas diferentes, el AUC fue de 0,901 (Sp 93,8 %; (Se 89,5 %, Figura 4C). Además, cuando se combinaron y se analizaron hasta 24 sitios editados diferencialmente, todos contenidos en solo tres biomarcadores diferentes, obtuvimos un rendimiento sobresaliente, con un AUC de 1,00, con una especificidad y una sensibilidad excelentes (100 % y 100 %, respectivamente, Figura 4D). La ecuación usada para esta combinación es la siguiente:

Z=: (18131,4993489419)* LYN X191_B (-1,0712864185386)* PTPRC_X240_I (-4,64009201823763e-

05)*IFNAR1_X152_C (0,996774248934566)* IFNAR1_X129_B (0,0381530674132845)* PTPRC_X227_H

(1885,81023403163)* LYN_X148_A (-0,736314805340674)* IFNAR1_X111_A (4390,83243262018)*LYN_X263_O (6,2909637469539)* IFNAR1_X115_G (13,9766314855872)* IFNAR1_X84_F (15,0973299759625)* IFNAR1_X231_D (-32,585224895614)* IFNAR1_X162_E (-310,251286436275)*LYN_X207_M (- 16,457803229942)* LYN_X63_C ( 2,01190201250814)* IFNAR1_X191_nan (3,99543996199355)* IFNAR1_X160_nan (-5,82765669149742)* IFNAR1_X85_nan (0,883565177670863)*IFNAR1_X151_nan (0,655717782231297)* IFNAR1 X227_H (

16,1663006759008)* LYN_X167_I (-72,6085985517623)* LYN X64_D (26,1324832381722)* LYN_X284_P (-

19,0669113948407)*IFNAR1_X76_nan (-33,3105655669062)* IFNAR1_X182_nan

La lista de todas las combinaciones sometidas a prueba en esta cohorte, la totalidad de las cuales incluyeron los 35 pacientes de la cohorte, se presenta en la Tabla 4. Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <0,01.

Tabla 4: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de la primera cohorte de priorización analizados en monoplex.

En la segunda cohorte de priorización, usando secuenciación multiplexada, cuando solo se eligieron 3 sitios en 2 BMK diferentes, el AUC fue 0,759 (Sp 89,7 %; Se 69,0 %, Figura 5A). Cuando se combinaron 4 sitios en 2 BMK, el AUC aumentó a 0,772 (Sp 82,8 %; Se 75,9 %, Figura 5B). Con combinaciones de 5 y 6 sitios, el AUC aumentó a 0,815 y 0,810, con especificidades de 81,0 % y 82,8 % y sensibilidades de 93,1 % y 82,8 %, respectivamente (Figura 5C y D). Cuando se aumentó la combinación para incluir 14 sitios, el AUC fue superior a 0,85 (AUC 0,860, Sp 89,7 %, Se 82,8 %, Figura 5E). Para esta combinación, la ecuación usada es la siguiente:

Z= (0,510073028938919)* IFNAR1_Site85 (0,000530246141972222)* PTPRC_Site240 (1,61121867548568)* IFNAR1_Site66 (0,000171269688832027)* IFNAR1_Site152_C (-0,000399273936550938)* PRKCB_Site152_L -(1,99301166582376)* GAB2_Site159 (0,496425680926631)* IFNAR1_Site151 (-0,343700289838798)* PRKCB_Site99 (2,72505005033054)* PRKCB_Site94 (-0,0231770987287983)* IFNAR1_Site129_B (0,00239888123061141)* PTPRC_Site227_H (-0,471278382211274)* IFNAR1_Site78 (-0,0500319554438776)* PTPRC_Site226_A ( 0,852148596678129)* IFNAR1_Site101

La lista de todas las combinaciones sometidas a prueba en la segunda cohorte de priorización se presenta en la Tabla 5. Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <0,01.

Tabla 5: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de la segunda cohorte de priorización analizados con secuenciación multiplexada

En conjunto, estos datos sugieren que los diferentes biomarcadores del panel de 14 genes seleccionados en las cohortes de priorización podrían usarse para el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar.

Se seleccionó un panel de los 8 biomarcadores más interesantes y se secuenció en un formato múltiplex para validar adicionalmente nuestros resultados en una cohorte grande (cohorte de validación) de 297 sujetos, de los cuales 160 eran pacientes depresivos unipolares. La población con trastorno bipolar estuvo compuesta por 96 pacientes bipolares en un episodio depresivo real (Figura 22) y 41 pacientes eutímicos, que no se tuvieron en cuenta en este análisis para el diagnóstico diferencial de la depresión bipolar. De esta forma, se analizó una población total de pacientes deprimidos (n = 256), que padecían depresión o bien unipolar o bien bipolar.

Todos los BMK se combinaron entre sí para evaluar el aumento potencial en la sensibilidad y especificidad usando Bosque aleatorio (RF). El análisis de las variantes de edición de ARN de 6 BMK (GAB2, IFNAR1, KCNJ15, LYN, MDM2 y PRKCB) dio una curva ROC de AUC de 0,934 (IC 95 %: [0,880 - 0,987]), con una sensibilidad del 91,2 % y una especificidad del 84,6 % (Figura 29 A) sobre el conjunto de datos de prueba, para el primer modelo ajustado por edad, sexo, tratamiento psiquiátrico y adicción.

Tabla 5.1: Modelo de Bosque aleatorio ajustado por edad, sexo, tratamiento psiquiátrico y adicciones Modelo1, véase la Figura 29A)

Además, un segundo modelo de Bosque aleatorio ajustado solo por edad y sexo usando 6 BMK (CAMK1D, IFNAR1, GAB2, MDM2, KCNJ15 y PRKCB) dio una curva ROC de AUC de 0,899 (IC 95 %: [0,826 - 0,971]), con una sensibilidad del 84,8 % y una especificidad del 83,7 % (Figura 29 B) sobre el conjunto de datos de prueba.

Tabla 5.2: Modelo de Bosque aleatorio ajustado por edad y sexo (Modelo 2, véase la Figura 29B)

Ambos modelos permiten una clara separación entre pacientes unipolares y bipolares

Además, cuando analizamos los sitios de edición de toda la población y combinamos 29 variantes de edición en 6 BMK usando el enfoque mROC, obtuvimos un AUC de 0,829 (Sp 81,3 %; Se 78,1 %, Figura 6A). Cuando se usaron 6 biomarcadores incluidos en el múltiplex y se combinaron 32 sitios editados diferencialmente, el AUC se elevó a 0,835, con una Especificidad del 81,9 % y una Sensibilidad del 80,2 % (Figura 6B) usando también el método mROC. Cuando se añadió un biomarcador más y se aumentó adicionalmente el número de sitios de edición en esos 7 BMK para alcanzar 44 sitios, todos los cuales se secuenciaron en múltiplex en un solo experimento, el AUC aumentó adicionalmente a 0,876 (Sp 88,8 %; Se 80,2 %, Figura 6C). En este último caso, la ecuación usada es la siguiente:

Z= (0,329681470592662)* MDM2_Site68821571 (0,236048209760787)* CAMK1D_Site12378440 (0,399861222643987)* MDM2_ASVX (0,0160482522095354)* MDM2_Site68821612_A (0,375844895908091)*PRKCB_Site23920921_L (0,116863680480038)* MDM2_Site68821643 -(0,235485105099063)* PRKCB_M (-0,49839847485377)* MDM2_Site68821576_V (-0,124892097355352)* MDM2_Site68821616_X (0,28431910435528)* MDM2_SV (0,066416717861871)* MDM2_Site68821625 (0,0585507722904674)*IFNAR1.1_Site33355798 - (0,220791132716944)* GAB2_Site78331080 (0,373002573187011)* IFNAR1.1Site33355829_I (0,177845820560045)* IFNAR1.1_Site33355809 (0,111074557540484)* KCNJ15_AF (0,0432162523917806)* MDM2_Site68821586_W (0,0198450297310912)* MDM2_SVW (0,185938219857141)* PRKCB_Site23920874 (0,258962106244043)* GAB2_CDEJ (0,0733750604485723)*CAMK1D_AS (0,128439671600768)* MDM2_Site68821584 (0,2412371608579)* IFNAR1.1_ABCG -(0,176406879704957)* PRKCB_AD (0,239625600163975)*IFNAR1.1_Site33355817 -(0,136223551823182)*CAMK1D_DE (0,134350140951696)* MDM2_STX - (0,112627144618545)* GAB2_CD (

0,0683274951449568)* MDM2_SWX (-0,153964487695514)* MDM2_Site68821602 (0,0876023949116742)*MDM2_Site68821563 (- 0,51644072467136)* IFNAR1.1_Site33355838_P -(0,248333456561587)* GAB2_BDEH+ (0,134133017079705)* IFNAR1.1_Site33355806_M (0,105132967365637)*

MDM2_WX (0,201724555879812)* GAB2 DEHJ - (0,14489914590203)* GAB2_AE (-

0,309844742843455)*GAB2_Site78330929_J (-0,03435818038963)* MDM2_AS (-0,0215011144074209)* LYN_AF (-0,196845543135798)* PRKCB_Site23920844_B (-0,349471597671111)* IFNAR1.1_Site33355830_C

(0,131993541547468)* GAB2_BCDEJ - (0,146581798182588)* PRKCB_K

La lista de todas las combinaciones sometidas a prueba en la segunda cohorte de priorización, la totalidad de las cuales incluyeron los 86 pacientes, se presenta en la Tabla 6. Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <10'4

Tabla 6: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes deprimidos (N = 256) de la cohorte de validación analizada con secuenciación multiplexada

El panel de biomarcadores analizado anteriormente dio unos rendimientos diagnósticos excelentes para diagnosticar diferencialmente el BD y el trastorno unipolar en toda la población de pacientes deprimidos de la cohorte de validación (256 sujetos), lo que sugiere que nuestro panel de biomarcadores podría de hecho tener aplicaciones clínicas en el diagnóstico diferencial del B<d>.

A continuación, buscamos investigar si el rendimiento diagnóstico de nuestro ensayo podría mejorarse adicionalmente teniendo en cuenta las diferencias específicas según el sexo. De hecho, se ha sugerido la existencia de firmas transcripcionales específicas del sexo en la depresión. Se ha mostrado previamente que el perfil transcripcional cerebral de pacientes deprimidos difiere en gran medida según el sexo, lo que sugiere que los mecanismos moleculares subyacentes a la depresión podrían diferir entre mujeres y hombres52. De este modo, se analizaron por separado unas modificaciones en la edición del ARN en la población masculina y femenina de la cohorte de validación para pacientes con BD y unipolares depresivos. Cuando se introdujo la especificidad del sexo en el análisis, se observó una mejora significativa en el rendimiento diagnóstico. Cabe destacar que la cohorte de validación femenina (n = 179) incluyó más sujetos que la cohorte de validación masculina (n = 77), ya que esto refleja la proporción de machos y hembras que padecen depresión en la población general en todo el mundo. De hecho, en la población femenina de la cohorte de validación (n = 179, 110 pacientes unipolares y 69 pacientes con BD), cuando combinamos 17 variantes incluidas en 7 biomarcadores, el AUC fue de 0,834 (Sp 93,6 %; Se 65,2 %, Figura 7A). La ecuación usada en este caso es la siguiente:

Z= - (0,238519750711572)* PRKCB_M (0,228320745055679)* MDM2_Site68821571 (0,226760422516651 )*LYN_AH - (0,273858599096893)* CAMK1D_DE (0,166296414954285)* MDM2_Site68821625

(0,0683620503515642)* PDE8A_Site85096717_C - (0,194138597912751)* GAB2_CD (0,00210889117258426)*MDM2_Site68821572_T - (0,178806599979693)* IFNAR1.1_E - (0,0810270919845117)* GAB2_BCD (0,118255695159956)* PRKCB_Site23920921_L (-0,197975165223792)* MDM2_Site68821576_V -(0,213318581871191)* GAB2_Site78331080 (0,192660926804618)* GAB2_CDEJ (0,124216008873012)*LYN_AM (0,102544252586713)* MDM2_ASVX (0,107503746972775)* LYN_Site56012555

Cuando el número de variantes de edición de ARN se aumentó a 23, en 7 dianas diferentes, el AUC aumentó a 0,851 con una especificidad y una sensibilidad superiores al 80 % (Sp 82,7 %; Se 81,2 %, Figura 7B). Además, cuando usamos los 8 biomarcadores incluidos en el multiplex y combinamos 44 sitios editados diferencialmente, el AUC alcanzó 0,904 (Sp 90,9 %; Se 88,4 %, Figura 7C).

Usando un enfoque de aprendizaje automático con mROC y Bosque aleatorio (véanse el material y los métodos), separamos aleatoriamente las poblaciones específicas por sexo en un conjunto de entrenamiento y uno de prueba. Al dividir aleatoriamente la población femenina en un conjunto de entrenamiento (70 % de toda la población) y un conjunto de prueba (30 % de toda la población) y aplicar los métodos mencionados anteriormente, obtuvimos un A<u>C de 0,782 en el conjunto de prueba con el método mROC (Sp 81,8 %; Se 81,0 %, Figura 7D) y un AUC de 0,858 con el método de Bosque aleatorio (Sp 80,0 %; Se 81,0 %, Figura 7E). En conjunto, los datos obtenidos mediante dos métodos diferentes de aprendizaje automático en la cohorte de validación femenina confirmaron el excelente rendimiento diagnóstico de nuestro panel de biomarcadores.

La lista de todas las combinaciones sometidas a prueba en la cohorte de validación femenina se presenta en la Tabla 7. Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <10'4.

Tabla 7: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de la población femenina de la cohorte de validación (n = 179) analizados mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

El rendimiento de la población masculina fue aún mejor. De hecho, al analizar por separado la población masculina de la cohorte de validación (n = 77, 50 pacientes unipolares y 27 pacientes con b D) e incluidas 18 variantes de edición en 6 BMK, obtuvimos un AUC de 0,918 (Sp 86,0 %; Se 88,9 %, Figura 8A). En este caso, la ecuación usada es la siguiente:

+ (0,1918844546789)* CAMK1D_AS (0,614946165065453)* PRKCB_Site23920921_L

(0,55731200448775)*CAMK1D_CE (0,277761284589955)* PRKCB_DJKM (-0,360618380284487)* MDM2_SV

(0,306320519931475)* IFNAR1.1_Site33355809 (0,456841145698979)* MDM2_ASVX (-0,0482494197161185)*

CAMK1D_ES (0,0376282919358852)* GAB2_DE - (0,710430719330234)* LYN_F (0,118310642804172)*

M D M2_Site68821643 (-0,135214425904151)* IFNAR1.1_Site33355820_0 (0,309202697888314)* LYN_AF ( 0,0028544497314405)* LYN_Site56012521 (0,266463664183522)*MDM2_STVX (0,315139778360142)* CAMK1D_BD (- 0,0526783771932407)* PRKCB_Site23920868 (0,123898740861286)* IFNAR1.1_ABCE. Cuando se tuvieron en cuenta 39 variantes de edición de ARN dentro de esos 6 BMK, el AUC fue superior a 0,9 (AUC 0,954, Spe 96,0 %, Se 85,2 %, Figura 8B). Además, cuando el número de variantes de edición en esos mismos 6 BMK se aumentó a 47, obtuvimos un a Uc de 0,99 (Sp 96,0 %; Se 100 %, Figura 8C).

Usando aprendizaje automático, dividimos aleatoriamente la población masculina en un conjunto de entrenamiento (el 65 % de toda la población) y un conjunto de prueba (el 35 % de toda la población) y obtuvimos un AUC con mROC de 0,817 (Sp 86,7 %, Se 87,5 %, Figura 8D), mientras que el método de Bosque aleatorio condujo a un AUC de 0,850 (Sp 89 %, Se 80 %, Figura 8E).

La lista de todas las combinaciones sometidas a prueba en la cohorte de validación masculina se presenta en la Tabla 8. Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <10'4 Tabla 8: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de la población masculina de la cohorte de validación (n = 77) analizados mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

Los datos obtenidos con ambos métodos dieron, por lo tanto, rendimientos diagnósticos excelentes para el diagnóstico específico por sexo de DEP, con AUC superiores a 0,800, especificidades y sensibilidades superiores al 80 % tanto para hembras como para machos, lo que indica un ensayo diagnóstico para el diagnóstico diferencial del trastorno bipolar que podría usarse en el consultorio.

Como hemos identificado biomarcadores de edición de ARN para el diagnóstico diferencial del BD, buscamos investigar si las isoformas no editadas de las dianas validadas podrían ser útiles para discriminar las poblaciones de pacientes unipolares y bipolares y podrían usarse en combinación con biomarcadores de edición de ARN. A continuación, se calculó la ROC de AUC para cada diana no editada, junto con la significación para cada isoforma no editada. El análisis de las isoformas no editadas de MDM2 en la cohorte de validación (n = 256) dio un AUC de 0,609 y fue significativamente diferente entre Unipolar y BD (p < 0,05, Tabla 9).

Tabla 9: Rendimientos diagnósticos obtenidos con la isoforma no editada de MDM2 en la cohorte de validación analizada con secuenciación multiplexada

Además, cuando las isoformas no editadas de las dianas validadas se combinaron con una isoforma de las mismas dianas, observamos diferencias significativas entre los pacientes unipolares y con BD (Tabla 10), lo que sugiere que las isoformas no editadas también podrían usarse en el ensayo de diagnóstico.

Tabla 10: Rendimientos diagnósticos obtenidos con isoformas no editadas combinadas con dianas editadas en la cohorte de validación analizada con secuenciación multiplexada

La depresión bipolar se compone de episodios fluctuantes de depresión y manía. Sin embargo, los pacientes que responden al tratamiento a menudo experimentan un estado eutímico, que suele estar en medio de un rango que va de la depresión a la manía. A pesar de que el DSM-5 no definió ningún criterio diagnóstico para la eutimia53, generalmente se refiere a un estado de remisión clínica, a menudo temporal, para síndromes del estado de ánimo tales como el trastorno bipolar. Como el panel de biomarcadores que identificamos permite el diagnóstico diferencial del BD, buscamos investigar si esos biomarcadores podrían diferenciar entre pacientes bipolares depresivos y pacientes eutímicos, para poder realizar un seguimiento de los pacientes durante el tratamiento y evaluar la respuesta al tratamiento. De esta forma, analizamos el rendimiento diagnóstico de los biomarcadores identificados en una población de pacientes bipolares depresivos y eutímicos (Figura 22).

En la Tabla 11 se presentan ejemplos de combinaciones sometidas a prueba en toda la población de pacientes bipolares depresivos y pacientes eutímicos (n = 137, véase la Figura 22). Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <10-4

Tabla 11: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de toda la población de pacientes bipolares depresivos y pacientes eutímicos (n = 137) analizados mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

En la cohorte de validación femenina (n = 90), cuando solo se introdujeron en el análisis 9 variantes incluidas, presentes en 4 biomarcadores, el AUC fue de 0,847 (Sp 76,2 %; Se 82,6 %, Figura 9A). La ecuación usada en este caso es la siguiente:

Z= - (0,0895727555887869)* MDM2_SWX - (0,284497312947692)* CAMK1D_Site12378438 -(0,0124820173731589)* MDM2_Site68821612_A - (0,420995574249043)* GAB2_E -(0,329608502036281 )*MDM2_ASX (0,362901517502019)* MDM2_Site68821629 - (0,113622915523371 )* MDM2_Site68821573 -(0,0962399148413304)* MDM2_SW- (0,148613926406161)* PRKCB_Site23920927_M

Cuando se aumentó el número de variantes de edición para alcanzar 18 variantes, presentes en 5 biomarcadores, el rendimiento aumentó y el AUC fue de 0,965 (Sp 90,5 %; Se 97,7 %, Figura 9B). Además, cuando se combinaron y se analizaron hasta 24 sitios editados diferencialmente, todos contenidos en 5 biomarcadores diferentes, obtuvimos un rendimiento sobresaliente, con un AUC de 0,984, con una especificidad y una sensibilidad excelentes (90,5 % y 98,6 %, respectivamente, Figura 9C)

El rendimiento de la población masculina fue aún mejor. De hecho, en la cohorte de validación masculina de BD deprimido y eutímicos (n = 47), cuando solo se incluyeron 12 variantes, presentes en 6 biomarcadores diferentes, obtuvimos un AUC de 0,994 (Sp 95 %, Se 100 %, Figura 10a ). Cuando el número de variantes de edición se aumentó ligeramente a 23, incluidas en 6 biomarcadores diferentes, el AUC aumentó a 1,00, con una especificidad y una sensibilidad del 100 % (Figura 10B). La inclusión de 28 variantes de edición en esos 6 biomarcadores dio el mismo rendimiento: el AUC fue de 1,00, con una especificidad del 100 % y una sensibilidad del 100 % (Figura 10C). En este caso, la ecuación usada fue la siguiente:

Z= - (1,52336682837312)* IFNAR1.1_ABCF - (3,26057883489785)* CAMK1 D_R -

(0,763880452664734)*LYN_Site56012450 - (-0,561253833023493)* CAMK1 D_RS - (-3,33767767845627)* GAB2_BDEHJK (1,55430607429165)* GAB2_Site78330955_G - (4,52292549457016)* CAMK1D_ABEG - (-1,07661353764004)*GAB2_CE - (-3,45753212466969)* CAMK1D_Site12378438 (1,32699847321958)* PRKCB_IJK - (

1,2518372990998)* GAB2_BE - (1,79465029376655)* CAMK1D_BF - (1,38897817068785)* IFNAR1.1_AB -

(2,00128623265317)* PRKCB_M - (-0,237584778376622)* MDM2_A - (0,989889267419364)* CAMK1D_GS -

(0,328234691570068)* IFNAR1.1_AC (1,82350692467403)* MDM2_T

(0,69901718503897)*IFNAR1.1_Site33355820_O (0,145098039959207)* PRKCB_Site23920874 (2,27039659579243)*PRKCB_Site23920910_J - (-0,815680192672586)* GAB2_Site78331030 (-0,287785099217686)*PRKCB_Site23920919_K - (0,576710638047866)* MDM2_SVW (1,14884163937465)* PRKCB_ADGHIJKM -(0,251734426707645)* GAB2_EH (-2,18488230071751)* PRKCB_Site23920921_L

(1,19656964307143)*PRKCB_Z.

En conjunto, estos datos sugieren que los diferentes biomarcadores del panel de 8 genes seleccionados en las cohortes de validación también podrían usarse para diferenciar los pacientes con trastorno bipolar depresivos de los pacientes eutímicos, lo que sugiere que esos biomarcadores también podrían usarse para el seguimiento del tratamiento.

Como el panel de biomarcadores analizado anteriormente dio unos rendimientos diagnósticos excelentes para diagnosticar diferencialmente BD y unipolar en pacientes deprimidos, buscamos investigar si esos biomarcadores podrían permitir la discriminación del BD de los controles sanos (Tabla 12). A continuación, investigamos si los biomarcadores de edición de ARN validados para el diagnóstico diferencial del BD también se editaron de manera diferencial en una población de control sana. Los sujetos de control emparejados por edad, raza y sexo (n = 143) fueron reclutados de una lista de voluntarios del Centro de Investigación Clínica (CHRU de Montpellier). Los biomarcadores de edición de ARN se midieron como se ha descrito anteriormente y se compararon con la población de pacientes deprimidos con trastorno bipolar (n = 96). En toda la población, cuando se combinaron 60 biomarcadores de edición de 7 biomarcadores diferentes, todos ellos secuenciados en múltiplex en un único experimento, la ROC de AUC fue 0,899 (Sp 88,1 %, Se 88,5 %, Figura 11A). En la Tabla 12 se presentan ejemplos de combinaciones sometidas a prueba en toda la población de pacientes bipolares depresivos y controles sanos (n = 239, véase la Figura 22). Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <10'4

Tabla 12: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de toda la población de pacientes bipolares depresivos y controles sanos (n = 137) analizados mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

Cuando introdujimos especificidad por sexo en el análisis y combinamos 32 biomarcadores de edición de los mismos 7 biomarcadores en la población de mujeres (n = 159, de las cuales 90 eran controles sanos y 69 pacientes con BD), el AUC subió a 0,908 (Sp 84,4 %, Se 92,8 %, Figura 11B). De manera similar, cuando se combinaron y se analizaron 50 biomarcadores de edición de los mismos 7 biomarcadores en la población masculina (n = 80, de los cuales 53 eran controles sanos y 27 pacientes con BD), separamos perfectamente los controles sanos y los pacientes con BD, con un AUC de 1 (Sp 100 %, Se 100 %, Figura 11C).

Cuando se realizó el mismo análisis entre controles sanos (n = 143) y pacientes eutímicos bipolares (n = 41), con 53 biomarcadores de edición combinados de 6 biomarcadores diferentes, la ROC de AUC fue 0,972 (Sp 95,8 %, Se 95,0 %, Figura 12A)

Cuando introdujimos especificidad por sexo en el análisis y combinamos 41 biomarcadores de edición de los 8 biomarcadores en la población de mujeres (n = 121, de las cuales 90 eran controles sanos y 21 eutímicos bipolares), el AUC subió a 0,997 (Sp 98,9 %, Se 100 %, Figura 12B). De manera similar, cuando se combinaron y se analizaron 35 biomarcadores de edición de 7 biomarcadores en la población masculina (n = 73, de los cuales 53 eran controles sanos y 20 pacientes eutímicos bipolares), también separamos perfectamente los controles sanos y los pacientes con BD, con un AUC de 1 (Sp 100 %, Se 100 %, Figura 12C).

En conjunto, estos datos sugieren que los diferentes biomarcadores del panel de 8 genes seleccionados en las cohortes de validación podrían usarse para diferenciar pacientes con trastorno bipolar depresivos o pacientes eutímicos bipolares de controles sanos con una sensibilidad y una especificidad excelentes.

La depresión bipolar se compone de episodios fluctuantes de depresión y manía. Existen dos tipos principales de trastornos bipolares: el trastorno bipolar I y el trastorno bipolar II, que según el Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales, quinta edición (DSM5) se diferencian principalmente por la gravedad de los episodios maníacos y la experiencia de un episodio depresivo mayor53. Por lo tanto, buscamos investigar si los biomarcadores seleccionados descritos anteriormente podrían usarse para discriminar entre los dos subtipos de depresión bipolar. De esta forma, analizamos el rendimiento diagnóstico de los biomarcadores identificados en la población de pacientes bipolares, que han sido clasificados por psiquiatras capacitados como BD de tipo I o de tipo II (Figura 24). Cuando analizamos los sitios de edición de toda la población (n = 140, de los cuales 58 eran BD de tipo I y 82 BD de tipo II) y combinamos 28 variantes de edición en 6 B<m>K, obtuvimos un AUC de 0,898 (Sp 86,2 %; Se 85,4 %, Figura 13A).

En la Tabla 13 se presentan ejemplos de combinaciones sometidas a prueba en toda la población de pacientes bipolares tipo I y tipo II (n = 140). Todas las combinaciones fueron estadísticamente significativas entre el control y los casos con un valor de p <10-4

Tabla 13: Rendimientos diagnósticos obtenidos con pacientes de toda la población de pacientes bipolares de tipo I y tipo II (n = 140) analizados mediante secuenciación multiplexada de 8 dianas.

Cuando introdujimos especificidad por sexo en el análisis y combinamos 49 biomarcadores de edición de los 8 biomarcadores del panel en la población de mujeres (n = 88, de las cuales 36 eran BD de tipo I y 52 BD de tipo II), el AUC subió a 0,980 (Sp 97,2 %, Se 94,2 %, Figura 13B). De manera similar, cuando se combinaron y se analizaron 48 biomarcadores de edición de los mismos 8 biomarcadores en la población masculina (n = 52, de los cuales 22 eran BD de tipo I y 30 BD de tipo II), separamos perfectamente los controles sanos y los pacientes con BD, con un AUC de 1 (Sp 100 %, Se 100 %, Figura 13C).

En conjunto, estos datos sugieren que los diferentes biomarcadores del panel de 8 genes seleccionados en las cohortes de validación podrían usarse para diferenciar los dos subtipos del trastorno bipolar con una sensibilidad y una especificidad excelentes.

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Claims

REIVINDICACIONES

Un método¡n vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano a partir de una muestra biológica de dicho paciente, comprendiendo dicho método:

a) determinar, para una combinación de al menos dos ARN de edición de A a I:

-para cada biomarcador seleccionado, la proporción relativa de edición de ARN en un sitio de edición dado para al menos uno o una combinación de sitios que se pueden editar en el transcrito de ARN de dichos al menos dos biomarcadores, y/o

-el porcentaje relativo de una isoforma o de una combinación de isoformas del transcrito de ARN de cada uno de dichos dos biomarcadores;

en donde dichos al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I se seleccionan del grupo que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A;

b) determinar un valor de resultado obtenido para cada uno de dichos al menos dos biomarcadores y un valor de resultado final basándose en un algoritmo o ecuación que incluye el valor de resultado obtenido para cada biomarcador seleccionado;

c) determinar si dicho valor de resultado obtenido en la etapa b) es mayor o no es mayor que un valor de control obtenido para un sujeto unipolar de control, en donde el valor de control se determinó de una manera comparable a la del valor de resultado; y

d) si dicho valor de resultado obtenido para el paciente es mayor que un umbral, clasificar a dicho paciente como que tiene trastorno bipolar o, si dicho valor de resultado no es mayor que dicho umbral, clasificar a dicho paciente como que tiene depresión unipolar.

El métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según la reivindicación 1, en donde en la etapa b), dichos al menos dos biomarcadores de ARN de edición de A a I se seleccionan del grupo que consiste en MDm2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

El método invitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según una de las reivindicaciones 1 y 2, en donde en la etapa b),

el valor de resultado o valor de resultado final, se calcula mediante un algoritmo que implementa un método multivariante que incluye:

-programa mROC, en particular para identificar la combinación lineal, que maximiza la curva ROC de AUC (área bajo la curva) y en donde se proporciona la ecuación para la combinación respectiva y se puede usar como un nuevo marcador virtual Z, de la siguiente manera:

Z = a.(Biomarcador 1) b.(Biomarcador 2) ...i.(Biomarcador i) ....n.(Biomarcador n)

donde i son coeficientes calculados y (Biomarcador i) son el nivel del biomarcador considerado (es decir, el nivel del sitio de edición de ARN o de isoformas para una diana/biomarcador dado); y/o

-un enfoque de bosques aleatorios (RF) aplicado para evaluar los sitios de edición de ARN y/o combinaciones de isoformas, en particular para clasificar la importancia del/de los sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s), y para combinar el/los mejor(es) sitio(s) de edición de ARN y/o isoforma(s), y/u opcionalmente

-un análisis multivariante aplicado para evaluar el/los sitio(s) de edición de ARN y/o combinaciones de isoformas para el diagnóstico, seleccionándose dicho análisis multivariante, por ejemplo, del grupo que consiste en:

-modelo de regresión logística aplicado para análisis univariante y multivariante para estimar el riesgo relativo de un paciente a diferentes valores de nivel de sitio de edición de ARN o de isoformas;

-enfoque CART (árboles de clasificación y regresión) aplicado para evaluar combinaciones de sitio(s) de edición de ARN y/o isoformas; y/o

-enfoque de máquina de vectores de soporte (SVM);

-enfoque de red neuronal artificial (ANN);

-enfoque de red bayesiana;

-enfoque de WKNN (k vecinos más cercanos ponderados);

-mínimos cuadrados parciales - análisis discriminante (PLS-DA);

-análisis discriminante lineal y cuadrático (LDA/ QDA), y

-cualquier otro método matemático que combina biomarcadores

4.El método de una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho trastorno de depresión unipolar es principalmente un episodio depresivo mayor (DEP).

5. El método de una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha muestra biológica es sangre completa, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo o saliva, prefiriéndose la muestra de sangre completa.

6. El método de una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde para cada biomarcador seleccionado, dicho valor de resultado es estadística/específicamente diferente de dicho valor de resultado de control a p <0,05.

7. El método de una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde han de satisfacerse los siguientes criterios para el biomarcador o la combinación de biomarcadores seleccionados en la etapa a):

-la cobertura >30;

-AUC >0,8;

-0,95 >Múltiplo de variación>1,05, y

-p <0,05.

8. El método de una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho(s) biomarcador(es) de ARN de edición de A a I seleccionado(s) comprendido(s) en la etapa a) se selecciona(n) del grupo que consiste en: una combinación que comprende al menos 3, 4, 5, 6 o 7 de los siguientes biomarcadores: MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D,<k>C<n>J15 y PDE8A, preferiblemente la combinación de los 8 biomarcadores citados.

9. El método de una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho(s) biomarcador(es) de ARN de edición de A a I seleccionado(s) comprende(n) en la etapa a) la combinación de los siguientes 5 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2 y PRKCB.

10. El método de una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho(s) biomarcador(es) de ARN de edición de A a I seleccionado(s) comprende(n) en la etapa a) la combinación de los siguientes 5 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, k Cn J15, MDM2 y PRKCB y al menos otro biomarcador seleccionado del grupo que consiste en los siguientes biomarcadores: CAMK1D y LYN, preferiblemente la combinación de los siguientes 6 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2,<p>R<k>CB y LYN cuando el modelo se ajusta por edad, sexo, tratamiento psiquiátrico y adicción, o preferiblemente los siguientes 6 biomarcadores: GAB2, IFNAR1, KCNJ15, MDM2, PRKCB y CAMK1D cuando el modelo se ajusta por edad y sexo.

11. El método de una de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho uno o combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 biomarcadores seleccionados comprende el cálculo del porcentaje relativo de al menos uno del sitio de edición de ARN o isoforma enumerados en la Tabla 2A (sitios de edición), 2B (isoformas) u 11 (sitios de edición) para cada uno de los biomarcadores seleccionados.

12. El método de una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 biomarcadores seleccionados se selecciona de las combinaciones de biomarcadores proporcionadas en la Tabla 12 y 13, preferiblemente las combinaciones que comprenden los siguientes 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

13. El método de una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el algoritmo o la ecuación que permite el cálculo del valor de resultado o puntuación de depresión Z se seleccionan de las ecuaciones de Z enumeradas en los ejemplos, preferiblemente la ecuación implementa una combinación de los siguientes 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A.

14. Un método¡n vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde si el paciente que se va a analizar es una mujer, en la etapa a) dicho al menos uno o combinación de al menos dos biomarcador(es) de ARN de edición de A a I se selecciona(n) del grupo de biomarcadores que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A, preferiblemente las combinaciones de biomarcadores o la ecuación de Z proporcionadas en los ejemplos o figuras con pacientes de la población femenina, más preferiblemente las combinaciones que comprenden los 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2,<c>A<m>K1D, KCNJ15 y PDE8A, más preferiblemente las combinaciones enumeradas en la Tabla 6.

15. Un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano según una de las reivindicaciones 1 a 13, en donde si el paciente que se va a analizar es un hombre, en la etapa a) dicho al menos uno o combinación de al menos dos biomarcador(es) de ARN de edición de A a I se selecciona(n) del grupo de biomarcadores que consiste en los biomarcadores MDM2, PRKCB, PIAS1, IFNAR1, LYN, AHR, RASSF1, GAB2, CAMK1D, IL17RA, PTPRC, KCNJ15, IFNAR2 y PDE8A, preferiblemente las combinaciones de biomarcadores o la ecuación de Z proporcionadas en los ejemplos o figuras con pacientes de la población masculina, más preferiblemente las combinaciones que comprenden los 8 biomarcadores MDM2, PRKCB, IFNAR1, LYN, GAB2, CAMK1D, KCNJ15 y PDE8A, más preferiblemente las combinaciones enumeradas en la Tabla 7.

16. Un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano, en donde dicho método comprende el método para el diagnóstico de depresión para un paciente humano según una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la combinación de biomarcadores y/o la ecuación de Z asociada con dicha combinación usada para el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano es diferente si el paciente que se va a analizar es una mujer o un hombre.

17. El método de una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde en la etapa a) se miden la proporción relativa de edición de ARN en una edición dada y/o el porcentaje de una isoforma mediante NGS en dicha muestra biológica.

18. El método de una de las reivindicaciones 1 a 17, en donde en la etapa a), la secuencia de amplicón/nucleica usada para la detección de los sitios de edición de ARN y/o las isoformas del transcrito de ARN de dicho biomarcador se obtiene o se puede obtener con:

-el conjunto de cebadores enumerados en la tabla 1 para cada uno de los biomarcadores seleccionados (Id. de sec. n.° 1 a 36), o

-un conjunto o una combinación de conjuntos de cebadores que permiten obtener un amplicón/amplicones que incluye(n), o es/son idéntico(s) al/a los amplicón/amplicones que se puede(n) obtener mediante el conjunto de cebadores enumerados en la Tabla 19 (Id. de sec. n.° 1 a la Id. de sec. n.° 36).

19. Un método para monitorizar el tratamiento para el trastorno bipolar o la depresión unipolar en un paciente humano, comprendiendo dicho método:

A) diagnosticar de manera diferencial el trastorno bipolar o la depresión unipolar en dicho ser humano mediante el método según una de las reivindicaciones 1 a 18 antes del inicio del tratamiento que se desea monitorizar.

B) repetir las etapas (a) a c) del método de una de las reivindicaciones 2 a 18, después de un período de tiempo durante el cual dicho paciente recibió tratamiento para dicho trastorno bipolar o depresión unipolar, para obtener un valor de resultado postratamiento;

C) comparar el valor de resultado postratamiento de la etapa (c) con:

-el valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para dicho trastorno bipolar o depresión unipolar, y

-el valor de resultado (valor final de control) para pacientes con trastorno bipolar o depresión unipolar de control, y

clasificar dicho tratamiento como efectivo si el valor de resultado postratamiento obtenido en la etapa B) es más cercano al valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para pacientes con trastorno bipolar o depresión unipolar de control.

20. Un método para determinar si un paciente responderá a un tratamiento para el trastorno bipolar que permite que el paciente se encuentre en un estado eutímico (estado de ánimo normal) a partir de una muestra de sangre de dicho paciente, comprendiendo dicho método la etapa de:

A) diagnosticar de manera diferencial el trastorno bipolar para dicho ser humano mediante el método según una de las reivindicaciones 1 a 18 antes del inicio del tratamiento que se desea monitorizar.

B) repetir las etapas (a) a c) del método de una de las reivindicaciones 2 a 18, después de un período de tiempo durante el cual dicho paciente recibió tratamiento para dicho trastorno bipolar, para obtener un valor de resultado postratamiento;

C) comparar el valor de resultado postratamiento de la etapa (c) con:

-el valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para dicho trastorno bipolar, y

-el valor de resultado (valor final de control) para pacientes con trastorno bipolar de control que se encuentran en un estado eutímico, y

clasificar a dicho paciente como paciente que responde al tratamiento si el valor de resultado postratamiento obtenido en la etapa B) es más cercano al valor de resultado obtenido antes del período de tiempo durante el cual dicho paciente recibe tratamiento para pacientes con trastorno bipolar de control que se encuentran en un estado eutímico.

21. Kit para diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y unipolar, en un paciente humano, comprendiendo dicho kit: 1)- opcionalmente, instrucciones para aplicar el método según una de las reivindicaciones 1 a 18, con el fin de obtener el valor de resultado cuyo análisis determina si dicho paciente presenta un trastorno bipolar o depresión unipolar; y
2)i) una combinación de al menos dos pares de cebadores seleccionados del grupo de cebadores que consiste en la Id. de sec. n.° 1 a la Id. de sec. n.° 36 y, cuya selección depende del/de los biomarcador(es) usado(s) para el diagnóstico diferencial de trastorno bipolar y depresión unipolar en un paciente humano;

o

ii) una combinación de al menos dos pares de cebadores que permiten obtener los amplicones idénticos a los amplicones obtenidos mediante los al menos dos pares de cebadores seleccionados en i).