ES2993458T3 - Cross-linked polymer modified nanoparticles - Google Patents

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Wassana Yantasee
Worapol Ngamcherdtrakul
Jingga Morry
David Castro
Joe Gray
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Oregon Health and Science University
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    • A61K49/1875—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle coated or functionalised with an antibody
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Abstract

En el presente documento se describen nanoestructuras que comprenden una nanopartícula recubierta de agentes adicionales, como polímeros catiónicos, estabilizadores, moléculas de orientación, marcadores, oligonucleótidos y moléculas pequeñas. Estas estructuras se pueden utilizar para administrar compuestos para tratar tumores sólidos y diagnosticar cáncer y otras enfermedades. Además, se describen métodos para elaborar dichos compuestos y el uso de dichos compuestos para tratar o diagnosticar enfermedades humanas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas modificadas con polímero reticulado
Declaración de interés del gobierno
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo los términos de los números de concesión R01 GM089918 y R41 DK094571, así como el contrato número HHSN261201300078C otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos sobre esta invención.
Antecedentes
Se ha desarrollado una amplia variedad de arquitecturas moleculares para el tratamiento de patologías humanas, sin embargo, la incapacidad de administrar eficazmente tales moléculas a su objetivo biológico previsto ha dificultado su implementación como modalidades terapéuticas. Los oligonucleótidos, proteínas, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, péptidos y moléculas pequeñas por igual a menudo han exhibido una penetración deficiente a través de barreras biológicas o estabilidad deficiente en sistemas metabólicamente activos. A pesar de las característicasin vitroa menudo prometedoras de los compuestos dentro de estas clases, su incapacidad para provocar fenotipos terapéuticos ha inspirado intentos para mejorar su administración y estabilidadin vivo.
Por ejemplo, los agentes terapéuticos de ARN representan una clase prometedora de compuestos para modular la expresión génica. Los oligonucleótidos de ARN, tal como ARN de interferencia pequeño (ARNip) y micro ARN (miARN), aunque a menudo son eficacesin vitro,pueden experimentar una vida media de circulación corta y dificultad para penetrar las barreras extracelulares e intracelulares. El mismo fenómeno se ha observado para las terapias peptídicas, tal como pequeñas proteínas, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y péptidos, así como una variedad de moléculas pequeñas.
Para abordar estos desafíos, se ha desarrollado una variedad de tecnologías basadas en partículas con el objetivo de producir agentes capaces de mejorar la administración biológica y la estabilidad de las moléculas anteriores. Por ejemplo, una amplia gama de materiales de nanopartículas orgánicos e inorgánicos tales como cápsidas virales, ciclodextrina, polímeros catiónicos, nanopartículas de oro, péptidos (R. Kanastyet al.,2013; D. Haussecker, 2012) y nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNP) (C. Argyoet al.,2013; F. Tanget al.,2012) se han evaluado como portadores de ARNip con el potencial de aumentar la vida media de ARNip en la sangre, permitir el escape del sistema reticuloendotelial y potenciar la captación celular específica del tumor. Sin embargo, ninguna de las nanoconstrucciones ha logrado un índice terapéutico deseable en clínicas para tratar tumores sólidos en sitios distintos del hígado. JI WON PARK ET AL: "Clustered Magnetite Nanocrystals Cross-Linked with PEI for Efficient siRNA Delivery", BIOMACROMOLECULES, (2011-02-14), divulga nanocristales magnéticos nanoparticulares con inmovilización superficial anclada por DOPA de PEI sobre las nanopartículas de magnetita. Las nanopartes reticuladas con PEI forman una estructura similar a una concha para la administración de ARN de interferencia pequeño (ARNip) para el silenciamiento génico.
Los intentos para mejorar la acumulación de tumores han explotado la administración pasiva usando el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) de los tumores (H. Maedaet al.,2000). Se descubrió que la unión de polímeros catiónicos que incluyen polietilenimina-ciclodextrina (J. Shenet al.,2014) y poli(metacrilato de 2-dimetilaminoetilo) (PDMAEMA) (D. Linet al.,2013) aumentó la absorción celular de nanopartículas de sílice mesoporosas. Aunque prometedor, no se ha informado una actividad antitumoral significativain vivopara estas construcciones (J. Shenet al.,2014, D. Linet al.,2013).
Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha de construcciones de nanopartículas capaces de mejorar la administración y la estabilidad de compuestos terapéuticosin vivo, tal como oligonucleótidos (por ejemplo, ARNip o miARN), pequeñas proteínas, péptidos y moléculas pequeñas.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención presenta una nanoconstrucción que contiene un polímero catiónico unido a una superficie exterior de una nanopartícula, en donde el polímero catiónico está reticulado como se define en las reivindicaciones. La nanoconstrucción incluye además un estabilizador unido al polímero catiónico o nanopartícula, para evitar la agregación de la nanoconstrucción en solución. En algunas realizaciones, la nanopartícula es mesoporosa, tal como una nanopartícula de sílice mesoporosa. La nanopartícula puede ser una nanopartícula de sílice, una nanopartícula de silicio, una nanopartícula de óxido de hierro, una nanopartícula de plata o un nanotubo de carbono, por ejemplo, una nanopartícula de sílice mesoporosa o una nanopartícula de óxido de hierro.
La nanoconstrucción tiene un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene un diámetro de 5 a 90 nm. En algunas realizaciones, la superficie exterior de la nanopartícula incluye grupos funcionales tiol, amina, carboxilato o fosfonato.
El polímero catiónico es de aproximadamente el 5% aaproximadamente el 30%en peso de la nanoconstrucción. En algunas realizaciones, el polímero catiónico es de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 25 % en peso de la nanoconstrucción. El polímero catiónico puede ser polietilenimina (PEI), quitosano, polipropilenimina, polilisina, poliamidoamina, poli(alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(N-isopropilacrilamida-co-acrilamida), poli(N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico), dietilaminoetil-dextrano, poli-(bromuro de N-etil-vinilpiridinio), poli(metacrilato de (dimetilamino)etilo) y/o polietilenglicol-co-poli(cloruro de metacrilato de trimetilaminoetilo). En algunas realizaciones, la polietilenimina tiene un peso molecular de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 10kDa. El polímero catiónico se reticula haciendo reaccionar el polímero catiónico en la superficie de la nanopartícula con un reticulante en presencia de polímero catiónico en solución, por ejemplo, para evitar o reducir la agregación de nanoconstrucciones.
En algunas realizaciones, el estabilizador es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 % en peso de la nanoconstrucción. Por ejemplo, el estabilizador puede ser de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 25 % en peso de la nanoconstrucción. El estabilizador puede ser polietilenglicol (PEG), dextrano, ácido polisiálico, ácido hialurónico (HA), polivinilpirrolidona (PVP), poli(alcohol vinílico) (PVA) y poliacrilamida (PAM). El polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa.
La nanoconstrucción incluye al menos un tipo de oligonucleótido, por ejemplo, ARNip, miARN, imitador de miARN u oligómero antisentido, unido electrostáticamente al polímero catiónico. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es ARNip, por ejemplo, que se dirige a uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en HER2, AKT1, AKT2, AKT3, EPS8L1, GRB7, AR, Myc, VEGF, VEGF-R1, RTP801, proNGF, queratina K6A, Bcl-2, PLK1, LMP2, LMP7, MECL1, RRM2, PKN3, Survivina, HIF1a, Furina, KSP, eiF-4E, p53, p-catenina, ApoB, PCSK9, HSP47, CFTR, CTGF, SNALP, nucleocápsidas de VRS, CD47, PD-L1 y CTLA-4. El al menos un tipo de oligonucleótido puede ser de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 15% en peso de la nanoconstrucción. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 % en peso de la nanoconstrucción. El al menos un tipo de oligonucleótido puede incluir dos o más ARNip diferentes cargados en la nanoconstrucción.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción incluye además una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo, una citocina. En algunas realizaciones, la molécula pequeña o proteína es de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 30 % en peso de la nanoconstrucción. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente quimioterápico, inhibidor de molécula pequeña o un polipéptido. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un marcador. En algunas realizaciones, el marcador es un lantánido, un colorante fluorescente, una nanopartícula de oro, un punto cuántico, un trazador de tomografía por emisión de positrones (PET) o un agente de contraste de formación de imágenes por resonancia magnética (IRM).
La nanoconstrucción también puede incluir un agente de direccionamiento, tal como un anticuerpo, un anticuerpo scFv, un aficuerpo, un aptámero, un péptido o molécula de direccionamiento pequeña. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 10% en peso de la nanoconstrucción, por ejemplo, de aproximadamente el 0,3 % a aproximadamente el 5 % en peso de la nanoconstrucción. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento pequeña es un hidrato de carbono o ligando.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se liofiliza, por ejemplo, con un azúcar, tal como trehalosa u otro lioprotector. El azúcar, por ejemplo, trehalosa u otro lioprotector puede ser de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 % en peso de la nanoconstrucción.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye una cantidad eficaz de una nanoconstrucción de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención presenta un método de administración de un agente a un sitio en un sujeto humano u otro sujeto mamífero. El método puede incluir administrar una cantidad eficaz de una nanoconstrucción de la invención que contiene el agente al sujeto humano u otro sujeto mamífero. La administración se realiza en condiciones para administrar la nanoconstrucción en el sitio, tal como una célula o tumor. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se administra en condiciones en las que la célula internaliza la nanoconstrucción. La nanoconstrucción puede administrarse por vía subcutánea, por vía tópica, por vía sistémica, por vía intravesical, por vía oral, por vía intratumoral o por vía intraperitoneal. Cualesquier referencias en la descripción a métodos de tratamiento, diagnóstico o cirugía se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento, diagnóstico o cirugía del cuerpo humano o animal mediante terapia.
El sujeto, por ejemplo, está padeciendo una enfermedad o afección caracterizada por la sobreexpresión de uno o más genes en relación con la expresión del uno o más genes en un sujeto sano. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es AMD, edema macular, atrofia crónica del nervio óptico, paquioniquia congénita, leucemia linfocítica crónica, linfoma metastásico, cáncer metastásico, tumores sólidos, lesión renal aguda, función de injerto retardada, poliposis adenomatosa familiar, hipercolesterolemia, fibrosis hepática, fibrosis quística, cicatrización dérmica, infección por Ébola, infección por VRS o inflamación. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se administra en una cantidad suficiente para tratar al sujeto que tiene la enfermedad o afección.
En algunas divulgaciones no de acuerdo con la invención, el agente es un marcador, tal como un lantánido, una nanopartícula de oro, un punto cuántico, un colorante fluorescente, un trazador de PET o un agente de contraste de IRM.
De acuerdo con la invención, el agente es un agente terapéutico, tal como un ácido nucleico capaz de modular la expresión de una proteína objetivo. El ácido nucleico puede ser un ARNip, miARN, imitador de miARN u oligómero antisentido. En algunas realizaciones, se reduce la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente quimioterápico, un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo, un péptido y/o una citocina.
En algunas realizaciones, se diagnostica al sujeto de cáncer. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es una cantidad terapéuticamente eficaz. En algunas realizaciones, el cáncer es resistente a un anticuerpo monoclonal o a un inhibidor de molécula pequeña. El agente terapéutico puede ser un oligonucleótido que se dirige a la expresión de una proteína inhibida por el anticuerpo monoclonal o el inhibidor de molécula pequeña.
En algunas realizaciones, el sujeto está diagnosticado con o está en riesgo de fibrosis o inflamación. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción reduce las especies reactivas de oxígeno, cobre biodisponible y/o nivel de expresión de NOX en el sujeto. En algunas realizaciones, el agente se administra en una cantidad suficiente para reducir la migración tumoral o la inflamación en el sujeto humano u otro sujeto mamífero. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción modula un efecto adverso de una o más citocinas.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para hacer una nanoconstrucción que incluye proporcionar una nanopartícula recubierta con un polímero catiónico y reticular el polímero catiónico para hacer la nanoconstrucción. La nanopartícula puede ser una nanopartícula de sílice, una nanopartícula de silicio, una nanopartícula de óxido de hierro, una nanopartícula de oro, una nanopartícula de plata o un nanotubo de carbono, por ejemplo, una nanopartícula de sílice mesoporosa o una nanopartícula de óxido de hierro. En algunas realizaciones, el polímero catiónico se reticula en presencia de polímero catiónico libre. En algunas realizaciones, el polímero catiónico es polietienimina, quitosano, polipropilenimina, polilisina, poliamidoamina, poli(alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(N-isopropilacrilamida-co-acrilamida), poli(N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico), dietilaminoetil-dextrano, poli-(bromuro de N-etil-vinilpiridinio), poli(metacrilato de (dimetilamino)etilo) y/o polietilenglicol-co-poli(cloruro de metacrilato de trimetilaminoetilo). La polietilenimina puede tener un peso molecular de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 10 kDa.
El polímero catiónico puede reticularse usando ditiobis[propionato de succinimidilo] (DSP), 3,3'-ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP) o 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo (DTBP). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polímero catiónico se reticula usando DSP.
El método incluye unir un estabilizador a la nanoconstrucción. El estabilizador puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol, dextrano, ácido polisiálico, HA, PVP, PVA y PAM. En algunas realizaciones, el polietilenglicol tiene un peso molecular de desde aproximadamente 1 kDa hasta aproximadamente 20 kDa. En algunas realizaciones, el método incluye incubar maleimida-polietilenglicol-éster N-hidroxisuccinimidílico (Mal-PEG-NHS) con la nanoconstrucción en una relación en peso de desde aproximadamente 0,5:1 hasta aproximadamente 5:1.
Opcionalmente, el método incluye además unir un agente de direccionamiento a la nanoconstrucción, por ejemplo, a las nanopartículas, polímero catiónico o estabilizador. El método puede incluir mezclar la nanoconstrucción con al menos un tipo de oligonucleótido, por ejemplo, un ARNip, miARN, imitador de miARN u oligómero antisentido, que se une de forma no covalente al polímero catiónico.
Opcionalmente, el método incluye mezclar una molécula pequeña o proteína con la nanopartícula o la nanoconstrucción de modo que la molécula pequeña o proteína se una a la nanoconstrucción, por ejemplo, a las nanopartículas, polímero catiónico o estabilizador. La molécula pequeña o proteína puede ser un agente quimioterápico, un marcador, un péptido y/o una citocina.
Además, opcionalmente, el método incluye liofilizar la nanoconstrucción, por ejemplo, con un azúcar, por ejemplo, trehalosa u otro lioprotector.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para marcar un objetivo poniendo en contacto una nanoconstrucción de la invención con el objetivo en condiciones para unir la nanoconstrucción al objetivo. En algunas realizaciones, el objetivo es una célula o proteína. La nanoconstrucción puede internalizarse por la célula. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se une al exterior de la célula. La nanopartícula de la nanoconstrucción es, por ejemplo, una nanopartícula de sílice, una nanopartícula de silicio, una nanopartícula de óxido de hierro, una nanopartícula de plata o un nanotubo de carbono, por ejemplo, una nanopartícula de sílice mesoporosa o una nanopartícula de óxido de hierro.
Opcionalmente, el marcador es un lantánido, un colorante fluorescente, una nanopartícula de oro, un punto cuántico, un trazador de PET o un agente de contraste de IRM. El método puede incluir cuantificar la cantidad de objetivo detectando el marcador después de que la nanoconstrucción se una al objetivo.
En algunas realizaciones, el método incluye administrar el objetivo marcado a un sujeto y detectar la ubicación del objetivo después de administrar el objetivo marcado. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción incluye además un agente terapéutico. En algunas realizaciones, la detección es por fluorescencia, resonancia magnética o PET.
En otro aspecto, la invención presenta una nanoconstrucción multicapa que contiene una nanopartícula de sílice mesoporosa de entre aproximadamente 10 nm a aproximadamente 90 nm de diámetro y un polímero catiónico unido electrostáticamente a una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa como se define en las reivindicaciones. El polímero catiónico está reticulado. La nanoconstrucción contiene adicionalmente un estabilizador unido covalentemente a una amina del polímero catiónico, así como un agente de direccionamiento unido covalentemente al estabilizador. El estabilizador evita la agregación de la nanoconstrucción en solución.
En algunas realizaciones, el polímero catiónico se reticula con un enlace escindible. En algunas realizaciones, la nanopartícula de sílice mesoporosa tiene un diámetro de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 60 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula de sílice mesoporosa es un antioxidante. En algunas realizaciones, el tamaño hidrodinámico de la nanoconstrucción es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 200 nm, por ejemplo, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 120 nm.
La nanoconstrucción incluye al menos un tipo de oligonucleótido unido electrostáticamente al polímero catiónico. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es un ARNip, miARN, imitador de miARN u oligómero antisentido. En algunas realizaciones, la relación de masa de la nanopartícula de sílice mesoporosa con respecto al al menos un tipo de oligonucleótido es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 100:1. El al menos un tipo de oligonucleótido puede ser un ARNip que silencia la expresión de PLK1, AKT1/BCL2, HER2, EPS8L1 y HSP47. Por ejemplo, el al menos un tipo de oligonucleótido puede ser miR-342-5p.
En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido incluye dos o más ARNip diferentes cargados en la nanoconstrucción, tal como dos o más ARNip diferentes cargados en la nanoconstrucción que se dirigen a diferentes genes tumorales. En algunas realizaciones, los dos o más ARNip diferentes cargados en la nanoconstrucción se seleccionan de siPLK1, siAKT1/BCL2, siHER2, siEPS8L1 o siHSP47.
En algunas realizaciones, el estabilizador protege el al menos un tipo de oligonucleótido de la degradación enzimática en suero durante al menos 24 horas.
La nanopartícula de sílice mesoporosa puede ser porosa. Por ejemplo, los poros pueden tener un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 6 nm. En algunas realizaciones, el poro tiene una primera abertura en una primera ubicación en una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa y una segunda abertura diferente en una segunda ubicación en la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción incluye al menos un marcador, tal como un lantánido o un colorante fluorescente. En algunas realizaciones, el marcador se une tanto a una superficie interna del poro como a la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el marcador se une al polímero catiónico.
La nanoconstrucción puede incluir una molécula pequeña. En algunas realizaciones, la molécula pequeña está unida en el interior de un poro. La molécula pequeña puede unirse a la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, la molécula pequeña se une al polímero catiónico. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 30 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente quimioterápico, tales como doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, carboplatino, rapamicina o camptotecina.
En algunas divulgaciones, no de acuerdo con la invención, el polímero catiónico es de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa. El polímero catiónico puede ser polietilenimina, tal como polietilenimina ramificada. En algunas realizaciones, la polietilenimina es de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 10 kDa. En algunas realizaciones, la polietilenimina es de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa.
En algunas realizaciones, el estabilizador es entre aproximadamente el 5 y aproximadamente el 40 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa. El estabilizador puede ser polietilenglicol, tal como polietilenglicol que es de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa. En algunas realizaciones, el polietilenglicol es de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción no desencadena la liberación de citocinas de las células mononucleares de sangre periférica.
En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 10 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa. El agente de direccionamiento puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo scFv, un aptámero, un péptido o agente de molécula de direccionamiento pequeña. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF-A, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD52 o anticuerpo anti-TNFa. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es un agente terapéutico, tal como un anticuerpo anti-HER2.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se liofiliza, por ejemplo, con trehalosa. En algunas realizaciones, la trehalosa es de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10% en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para hacer una nanoconstrucción. El método puede incluir combinar un primer tensioactivo con un segundo tensioactivo diferente para formar una primera mezcla y añadir un precursor de sílice a la primera mezcla para formar una segunda mezcla. Esto puede dar como resultado la síntesis de una nanopartícula mesoporosa. El método puede incluir eliminar los tensioactivos primero y segundo de la nanopartícula de sílice mesoporosa y recubrir una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa con un polímero catiónico para formar una nanopartícula de sílice mesoporosa-polímero catiónico. El método puede incluir reticular el polímero catiónico en presencia de polímero catiónico libre, conjugar un estabilizador a una amina del polímero catiónico para formar una nanopartícula de sílice mesoporosa-polímero catiónico-estabilizador y conjugar un agente de direccionamiento a un grupo maleimida del estabilizador para formar la nanoconstrucción.
Opcionalmente, el primer tensioactivo es cloruro de cetiltrimetilamonio. En algunas realizaciones, el segundo tensioactivo diferente es trietanolamina.
La primera mezcla puede calentarse antes de añadir el precursor de sílice. En algunas realizaciones, la segunda mezcla se calienta antes de recuperar las nanopartículas de sílice mesoporosas.
Opcionalmente, el método incluye añadir organosilanos a la segunda mezcla después de calentar la solución.
Aplicar por revestimiento opcionalmente el polímero catiónico sobre la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa incluye mezclar el polímero catiónico con la nanopartícula de sílice mesoporosa en presencia de un disolvente para formar una tercera mezcla. En algunas realizaciones, la relación de masa del polímero catiónico con respecto a la nanopartícula de sílice mesoporosa es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:4. En algunas realizaciones, el polímero catiónico es polietilenimina. En algunas realizaciones, la polietilenimina es de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 10kDa. En algunas realizaciones, el polímero catiónico se reticula usando DSP (ditiobis[propionato de succinimidilo], DTSSP (3,3'-ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo)) o DTBP (3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo). En algunas realizaciones, el polímero catiónico se reticula usando ditiobis(propionato de succinimidilo).
Opcionalmente, el estabilizador se añade al polímero catiónico de nanopartículas de sílice mesoporosa en presencia de un tampón de PBS en una cantidad de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:1 de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el estabilizador es polietilenglicol. En algunas realizaciones, el polietilenglicol es de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa. En algunas realizaciones, el polietilenglicol es de aproximadamente 5 kDa.
Opcionalmente, el agente de direccionamiento es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo scFv, un aptámero, un péptido o un agente de direccionamiento de moléculas pequeñas.
Opcionalmente, el método incluye mezclar una construcción de nanopartícula de sílice mesoporosa-polímero catiónico-estabilizador-agente de direccionamiento con al menos un tipo de oligonucleótido.
En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido se une electrostáticamente a la nanoconstrucción.
En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es ARNip, miARN, imitadores de miARN, ADN o un oligómero antisentido. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es siPLK1, siAKT1/BCL2, siHER2, siEPS8L1 o siHSP47. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es miR-342-5p. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se mezcla con la construcción de nanopartícula de sílice mesoporosapolímero catiónico-estabilizador-agente de direccionamiento en una relación de masa de nanopartícula por oligonucleótido de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es ARNip. En algunas realizaciones, el ARNip es contra HER2 (siHER2). En algunas realizaciones, el ARNip se mezcla con la construcción de nanopartícula de sílice mesoporosa-polímero catiónico-estabilizador-agente de direccionamiento en una relación de masa de nanopartícula por oligonucleótido de aproximadamente 25:1 a aproximadamente 50:1.
Opcionalmente, el método incluye combinar la primera mezcla con una molécula pequeña antes de recubrir la nanopartícula de sílice mesoporosa con el polímero catiónico. En otras realizaciones, el método incluye combinar la primera mezcla con una molécula pequeña después de recubrir la nanopartícula de sílice mesoporosa con el polímero catiónico. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente quimioterápico. En algunas realizaciones, el agente quimioterápico es doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, carboplatino, rapamicina o camptotecina.
Opcionalmente, el método incluye mezclar al menos un marcador. En algunas realizaciones, el marcador se añade a la primera mezcla. En algunas realizaciones, el marcador se añade a la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el marcador se añade a la nanopartícula de sílice mesoporosa-polímero catiónico. En algunas realizaciones, el marcador se añade a la nanopartícula de sílice mesoporosa-polímero catiónico-estabilizador. En algunas realizaciones, el marcador es un lantánido. En otras realizaciones, el marcador es un colorante fluorescente. En algunas realizaciones, el colorante fluorescente se conjuga tanto con una superficie interna del poro como a la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa usando una reacción de amina-éster NHS.
Opcionalmente, el método incluye liofilizar la nanoconstrucción, por ejemplo, con trehalosa. La cantidad de trehalosa puede ser del 1-10 % en peso de la nanopartícula de sílice mesoporosa.
En otro aspecto, la invención presenta un método para tratar el cáncer en un sujeto humano u otro sujeto mamífero mediante la administración de una cantidad eficaz de una nanoconstrucción que contiene una nanopartícula de sílice mesoporosa de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 90 nm de diámetro y un polímero catiónico reticulado unido electrostáticamente a una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. La nanoconstrucción puede contener un estabilizador unido covalentemente a una amina del polímero catiónico, un agente de direccionamiento unido covalentemente al estabilizador, y al menos un tipo de oligonucleótido unido electrostáticamente al polímero catiónico en la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. El al menos un tipo de oligonucleótido puede estar protegido por el estabilizador, por ejemplo, de la degradación enzimática.
En algunas realizaciones, el cáncer es resistente a un anticuerpo monoclonal, y el al menos un tipo de oligonucleótido puede dirigirse al mismo gen que el anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el cáncer es resistente a un inhibidor de molécula pequeña, y el al menos un tipo de oligonucleótido puede dirigirse al mismo gen que el inhibidor de molécula pequeña. En algunas realizaciones, el cáncer es HER2+ y puede ser resistente a trastuzumab y/o lapatinib. En algunas realizaciones, una dosis de la nanoconstrucción reduce los niveles de proteína HER2 en al menos un 40 %. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido puede dirigirse a dos o más genes. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es un dúplex de ARNip contra tanto AKT1 como BCL2.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de sílice mesoporosa es un antioxidante. La nanopartícula de sílice mesoporosa puede ser terapéutica. En algunas realizaciones, el al menos un tipo de oligonucleótido es un ARNip, miARN, imitador de miARN u oligómero antisentido. Por ejemplo, la administración del ARNip en la nanoconstrucción puede aumentar la tasa de muerte de células cancerosas en al menos un 15 % con respecto a la administración del ARNip con un reactivo de transfección.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción incluye un agente quimioterápico. En algunas realizaciones, la adición del agente quimioterápico no afecta negativamente a la eficacia de silenciamiento génico del al menos un tipo de oligonucleótido. En algunas realizaciones, la administración conjunta del ARNip y el agente quimioterápico mejora la muerte de células cancerosas provocada por agentes quimioterápicos en al menos un 10 %.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para diagnosticar cáncer en un sujeto mamífero.
El método incluye administrar una nanoconstrucción que contiene una nanopartícula de sílice mesoporosa porosa de entre aproximadamente 10 nm a aproximadamente 80 nm de diámetro y un polímero catiónico reticulado unido electrostáticamente a una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. La nanoconstrucción puede contener un estabilizador unido covalentemente a una amina del polímero catiónico, un agente de direccionamiento unido covalentemente al estabilizador y un marcador unido a la nanoconstrucción. El uso del marcador permite la formación de imágenes de tumores y la cuantificación de proteínas tumorales dirigidas por el agente de direccionamiento.
En algunas realizaciones, la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa incluye grupos funcionales tiol, amina o fosfonato. El marcador, por ejemplo, un colorante fluorescente o un lantánido, puede unirse a grupos funcionales en la superficie de la nanopartícula de sílice mesoporosa.
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción permite la detección de tumores por IRM. En algunas realizaciones, el marcador es gadolinio. El marcador puede unirse tanto en una superficie interna del poro en la nanopartícula de sílice mesoporosa como en la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el marcador se une al polímero catiónico unido electrostáticamente a la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo scFv, un aptámero, un péptido o un agente de molécula de direccionamiento pequeña. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es un anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF-A, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD52 o anticuerpo anti-TNFa.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método de caracterización de proteína dirigida en una muestra de tejido.
El método incluye teñir la proteína objetivo con una nanoconstrucción que contiene una nanopartícula de sílice mesoporosa de entre aproximadamente 10 nm a aproximadamente 80 nm de diámetro y un polímero catiónico reticulado unido electrostáticamente a una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. La nanoconstrucción puede contener un estabilizador unido covalentemente a una amina del polímero catiónico, un agente de direccionamiento unido covalentemente al estabilizador y un marcador unido a la nanopartícula de sílice mesoporosa. El marcador permite cuantificar una cantidad de la proteína seleccionada como objetivo, por ejemplo, mediante formación de imágenes.
En algunas realizaciones, la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa incluye grupos funcionales tiol, amina o fosfonato. El marcador puede unirse a los grupos funcionales en la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el marcador se une al polímero catiónico en la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. En algunas realizaciones, el marcador es lantánido, tal como gadolinio o un colorante fluorescente. La proteína seleccionada como objetivo puede cuantificarse mediante espectrometría de masas.
En otro aspecto, la invención presenta un método para tratar el cáncer, inflamación y fibrosis en un sujeto humano u otro sujeto mamífero. El método incluye administrar una cantidad eficaz de una nanoconstrucción que contiene una nanopartícula de sílice mesoporosa porosa de entre aproximadamente 30 nm a aproximadamente 90 nm de diámetro y un polímero catiónico reticulado unido electrostáticamente a una superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. La nanoconstrucción contiene un estabilizador unido covalentemente a una amina del polímero catiónico y al menos un tipo de oligonucleótido unido electrostáticamente al polímero catiónico en la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa mediante interacción electrostática. El al menos un tipo de oligonucleótido puede estar protegido por el estabilizador, por ejemplo, de la degradación enzimática.
La nanoconstrucción puede ser un antioxidante. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción reduce las especies reactivas de oxígeno y el nivel de expresión de NOX4. La nanoconstrucción puede modular el efecto adverso de las citocinas. En algunas realizaciones, el uso de la nanoconstrucción disminuye un marcador fibrótico. En algunas realizaciones, el marcador fibrótico es COL I o alfa-SMA. El al menos un tipo de oligonucleótido puede ser un ARNip, miARN, imitador de miARN o un oligómero antisentido, tal como un ARNip contra HSP47 (siHSP47).
En algunas realizaciones, el portador de nanopartícula de sílice mesoporosa es terapéutico. La nanoconstrucción puede incluir un inhibidor de molécula pequeña seleccionado de dasatinib, imatinib y nilotinib.
En algunas realizaciones, el inhibidor de molécula pequeña se une tanto a una superficie interna del poro en la nanopartícula de sílice mesoporosa como a la superficie exterior de la nanopartícula de sílice mesoporosa. El inhibidor de molécula pequeña puede unirse al polímero catiónico. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción administra el inhibidor de molécula pequeña a las células objetivo. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la nanoconstrucción se administra por vía tópica.
Para cualquiera de los aspectos anteriores, la nanoconstrucción incluye un estabilizador, por ejemplo, PEG y un agente de direccionamiento, por ejemplo, un anticuerpo. En estas realizaciones, las nanopartículas son, por ejemplo, sílice mesoporosa u óxido de hierro, y el polímero catiónico es, por ejemplo, PEI. Tales nanoconstrucciones pueden incluir además un oligonucleótido, una molécula pequeña y/o un marcador.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1C muestran (A) imágenes de TEM de núcleos de nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNP) de varios tamaños (B) esquema de la modificación de superficie de la MSNP y (C) la distribución de tamaño hidrodinámica de las nanoconstrucciones hechas a partir de núcleos de MSNP que se muestran en (A) y la superficie modificada como se ilustra en (B). A menos que se especifique lo contrario, MSNP era un núcleo S-47, la polietilenimina (PEI) era de 10 kDa y estaba reticulada, PEG era de 5 kDa, y el anticuerpo era trastuzumab (T) a lo largo de esta solicitud.
Las Figuras 2A-2B muestran (A) el perfil de tamaño hidrodinámico de MSNP modificadas como en la Figura 1 y sintetizadas en diferentes condiciones de reticulación y (B) un gráfico que representa la capacidad de tamponamiento de tres nanoconstrucciones con PEI de 1,8 kDa reticulada (T-NP18C), PEI de 10 kDa no reticulada (T-N<p>10) y PEI de 10 kDa reticulada (T-NP10C) medida en NaCl 150 mM. La condición de reticulación era "0,1 mg/ml de DSP 2 mg de PEI" como se muestra en la Figura 2A.
Las Figuras 3A-3B muestran (A) la eficacia de silenciamiento de luciferasa de nanoconstrucciones hechas a partir de PEG de 5 kDa pero con condiciones de carga de PEG variadas; relación de masa 1:1 de Mal-PEG-NHS:MSNP añadiendo Mal-PEG-NHS como polvo seco directamente a la suspensión de MSNP-PEI en PBS y agitando durante 90-120 min o relación de masa 5:1 disolviendo primero Mal-PEG-NHS en PBS antes de mezclar durante la noche con suspensión de MSNP-PEI en PBS, y (B) el perfil de tamaño hidrodinámico de MSNP modificado como en la Figura 1(B) con PEG de diversos pesos moleculares (cargado como Mal-PEG-NHS seco a una relación de masa de 1:1)
Las Figuras 4A-4B son una serie de gráficos que muestran el impacto de relación de masa variada de nanopartícula de sílice mesoporosa (MSNP) por trastuzumab durante la síntesis en (A) la viabilidad celular y (B) la absorción celular por las células BT474.
Las Figuras 5A-5B son gráficos que representan el silenciamiento de luciferasa en LM2-4luc+/H2N tras el tratamiento con siLUC 30 nM sobre en nanoconstrucción conjugada con trastuzumab (T-NP) a una relación de masa de NP/ARNip de (A) 25 y (B) 50 medida a las 48 horas después de la transfección.
Las Figuras 6A-6E muestran (A) la cantidad de siHER2 intacto que sobrevivió a la degradación enzimática en suero humano medida por electroforesis en gel, (B) cuantificación de siHER2 intacto correspondiente, (C) el efecto de PEG en la protección de ARNip de la degradación enzimática (frente a MSNP-PEI y ARNip libre), (D) el efecto de PEG en la prevención de que las nanoconstrucciones se agreguen en tamaños más grandes tras la carga de ARNip, y (E) nanoconstrucciones producidas por una condición de carga de PEG optimizada. La optimización del método se ha realizado para reducir la cantidad de uso de Mal-PEG-NHS de una relación de masa de Mal-PEG-NHS:MSNP de 5:1 a 1:1 como se muestra en la Figura 3A; el material resultante aún podría proteger el ARNip (Figura 6E) de la misma manera que usando una relación de PEG más alta (5:1) (Figuras 6A-6B).
Las Figuras 7A-7B muestran que (A) la nanoconstrucción (T-ARNip-NP) tiene un tamaño hidrodinámico mucho más pequeño (deseable) y (B) una mejor eficacia de silenciamiento que las contrapartes de poliplejo de ARNip-PEI (sin núcleo de MSNP). La relación N/P se define como la relación molar de nitrógeno polimérico (N) a fosfato de oligonucleótido (P).
Las Figuras 8A-8I muestran la absorción celular de siSCR-NP por diversas líneas celulares. La Figura 8A es un gráfico que ilustra el % de absorción celular de trastuzumab(T)-siSCR-NP por células de cáncer de mama BT474 (HER2+). La Figura 8B es un gráfico que ilustra el % de absorción celular de trastuzumab(T)-siSCR-NP por células de cáncer de mama SKBR3 (HER2+). La Figura 8C es un gráfico que ilustra el % de absorción celular de trastuzumab(T)-siSCR-NP por células de cáncer de mama MCF7 (HER2-). Un anticuerpo de control negativo, rituximab (R), demostró especificidad para la contraparte de nanoconstrucción conjugada con trastuzumab. La Figura 8D muestra una transferencia tipo Western que confirma el contenido de HER2 de estas 3 líneas celulares. La Figura 8E muestra el grado de internalización celular de nanoconstrucciones de siSCR marcadas con colorante por células BT474. La Figura 8F muestra el grado de internalización celular de nanoconstrucciones de siSCR marcadas con colorante por células SKBR3. La Figura 8G muestra el grado de internalización celular de nanoconstrucciones de siSCR marcadas con colorante por células MCF7. Las Figuras 8H-8I muestran que cuando se cambia de trastuzumab a un anticuerpo diferente (por ejemplo, anticuerpo anti-EGFR o cetuximab o "C"), el material (C-siSCR-NP10C) podría dirigirse a células (H) con alta expresión de EGFR. La Figura 8I muestra una mayor absorción celular de nanoconstrucciones C-siSCR-NP10C por células EGFR+ en comparación con células sin expresión de EGFR.
Las Figuras 9A-9D muestran la eficacia de silenciamiento de HER2 y las propiedades de eliminación de células cancerosas de nanoconstrucciones de siHER2. La Figura 9A es un gráfico que representa la atenuación de HER2 mediante nanoconstrucciones de siHER2 (T-NP10c) como expresión de proteína HER2 reducida por célula de tres células HER2+ a las 72 horas después del tratamiento con siHER2 frente a siSCR (60 nM) en T-NP10c. La Figura 9B es un gráfico que muestra una expresión de HER2 reducida al nivel de ARNm (48 horas después del tratamiento con siHER2 frente a siSCR), la Figura 9C es un gráfico que muestra el resultado funcional de la actividad apoptótica aumentada (4 días después del tratamiento con siHER2 frente a siSCR). La Figura 9D es un gráfico que muestra viabilidad celular reducida de células BT474 (4 días después del tratamiento con siHER2 frente a siSCR).
La Figura 10 muestra que el tratamiento con T-siHER2-NP10C dio como resultado una menor viabilidad de las células de cáncer de mama HER2+ pero tuvo poco impacto en las células de mama HER2- y en las células no de mama (4 días después de la transfección); con un recuadro que muestra los niveles de HER2 de las células medidos por transferencia tipo Western.
La Figura 11 muestra la expresión reducida de la proteína HER2 (mediante tinción inmunofluorescente) en BT474 tras el tratamiento con T-siSCR-NP10C (debido a trastuzumab) y T-siHER2-NP10C (debido a siHER2 y trastuzumab). n.° 1-4 representan réplicas.
Las Figuras 12A-12C muestran la eficacia de silenciamiento de HER2 de nanoconstrucciones de siHER2. La Figura 12A es un gráfico que muestra la reducción de la proteína HER2 en tres líneas celulares HER2+ tras el tratamiento con siHER2 60 nM frente a siSCR en nanoconstrucciones con PEI de 1,8 kDa reticulada. La Figura 12B es un gráfico que muestra la reducción de la proteína HER2 en tres líneas celulares HER2+ tras el tratamiento con siHER2 120 nM frente a siSCR en nanoconstrucciones con PEI de 1,8 kDa reticulada. La Figura 12C es un gráfico que muestra la reducción de la proteína HER2 en tres líneas celulares HER2+ tras el tratamiento con siHER2 60 nM frente a siSCR en el agente de transfección comercial, DharmaFECT. Se utilizó la misma condición de tratamiento que la usada en la figura 9A.
Las Figuras 13A-13C muestran el efecto de trastuzumab y nanoconstrucciones de siHER2 en la viabilidad celular. La Figura 13A es un gráfico que muestra que BT474-R es resistente a trastuzumab, en comparación con BT474 parental. La Figura 13B es un gráfico que muestra la capacidad de T-siHER2-NP10C para lograr la misma respuesta en BT474-R y BT474 con respecto a la acción de siHER2, mientras que la Figura 13C es un gráfico que muestra que trastuzumab en una nanoconstrucción sin siHER2 (T-siSCR-NP10C) provoca menos respuesta en las células BT474-R resistentes. Se usó ARNip 60 nM y se midió la viabilidad celular 5 días después del tratamiento con medio reabastecido durante la noche después del tratamiento.
Las Figuras 14A-14C muestran la compatibilidad sanguínea de nanoconstrucciones de siHER2. La Figura 14A muestra una excelente compatibilidad con la sangre de nanoconstrucciones de siHER2 (T-siHER2-NP18C y T-siHER2-NP10C) sin un aumento significativo en la hemólisis sobre los controles de vehículo (solución salina y PBS) o un punto de referencia de nanopartículas-fármaco aprobado por la FDA (Abraxane). La Figura 14B es un gráfico que no muestra un aumento significativo en el tiempo de coagulación sobre los controles de vehículo (solución salina y PBS) o los puntos de referencia de nanopartícula-fármaco aprobados por la FDA (Abraxane o Feraheme). La Figura 14C es un gráfico que no muestra un aumento significativo en la agregación de plaquetas sobre los controles de vehículo (solución salina y PBS) o los puntos de referencia de nanopartícula-fármaco aprobados por la FDA (Abraxane o Feraheme). 1X es el nivel en sangre humana anticipado, y 5X es 5 veces ese nivel.
Las figuras 15A-15F muestran la inducción de citocinas en células mononucleares de sangre periférica después del tratamiento con nanoconstrucción y la prueba de endotoxina de la nanoconstrucción. La Figura 15A es un gráfico que muestra la inducción de IFN-a en células mononucleares de sangre periférica después de una exposición de 24 horas con T-siHER2-NP18C, T-NP10C, T-siHER2-NP10C, Abraxane o Feraheme. La Figura 15B es un gráfico que muestra la inducción de IL-1p en células mononucleares de sangre periférica después de una exposición de 24 horas con T-siHER2-NP18C, T-NP10C, T-siHER2-NP10C, Abraxane o Feraheme. La Figura 15C es un gráfico que muestra la inducción de IL-6 en células mononucleares de sangre periférica después de una exposición de 24 horas con T-siHER2-NP18C, T-NP10C, T-siHER2-NP10C, Abraxane o Feraheme. La Figura 15D es un gráfico que muestra la inducción de TNF-a en células mononucleares de sangre periférica después de una exposición de 24 horas con T-siHER2-NP18C, T-NP10C, T-siHER2-NP10C, Abraxane o Feraheme. La Figura 15E es una imagen registrada del ensayo de coágulo de gel de LAL en las nanoconstrucciones (T-siHER2-NP10C) a una concentración 5X. La Figura 15F es una imagen registrada del ensayo de coágulo de gel de LAL en Abraxane a una concentración 5X. Ambos son negativos para endotoxina de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las figuras 16A-16B muestran imágenes de inmunofluorescencia representativas de tejidos tumorales HCC1954 recogidos de ratones (n=4/grupo) a los 4 días después de la inyección i.v. con una dosis de T-NP10C cargada con siHER2 o siSCR (1,25 mg/kg de ARNip, NP/ARNip de 50) o control de PBS (A) y niveles cuantitativos de HER2 de los tejidos tumorales (B).
Las Figuras 17A-17D son una serie de gráficos que muestran el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales después del tratamiento con nanoconstrucción. La Figura 17A es un gráfico que muestra el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales HCC1954 ortotópicos que reciben múltiples dosis (i.v., puntos de tiempo indicados por flechas) de T-NP10C cargada con siHER2 o siSCR (1,25 mg/kg de ARNip, NP/ARNip de 50) o control de PBS (n=5/grupo). La Figura 17B es un gráfico que muestra el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales de HCC1954 ortotópicos que reciben múltiples dosis de trastuzumab (10 mg/kg, i.p.) o solución salina (n=7/grupo) en los puntos de tiempo indicados por flechas. La Figura 17C es un gráfico que muestra el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales de HCC1954 ortotópicos que reciben múltiples dosis de trastuzumab (5 mg/kg, i.v.) o solución salina (n=5/grupo) en los puntos de tiempo indicados por flechas. La Figura 17D es un gráfico que muestra el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales de HCC1954 ortotópicos que reciben múltiples dosis de trastuzumab (5 mg/kg, i.v.) más paclitaxel (3,1 mg/kg, i.v.) o solución salina (n=9/grupo) en los puntos de tiempo indicados por flechas.
La Figura 18 es un gráfico que muestra el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales de HCC1954 ortotópicos (n=11/grupo) después de la inyección i.v. con múltiples dosis de T-NP10 (núcleo O-87, no reticulado) cargada con siHER2 o siSCR (2,5 mg/kg de ARNip, NP/ARNip de 50) o control de PBS en los puntos de tiempo indicados por las flechas.
La Figura 19 es un gráfico que representa el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos de HCC1954 ortotópicos tratados con siHER2-NP10C (sin anticuerpo) (n=8), T-siSCR-NP10C (n=7), o control de solución salina (n=5) indicando las flechas los días de inyección i.v., dosis de siHER2 o siSCR de 1,25 mg/kg y relación NP/ARNip de 50.
Las Figuras 20A-20B muestran el crecimiento tumoral en ratones que portan xenoinjertos tumorales resistentes a trastuzumab después del tratamiento con nanoconstrucción. La Figura 20A es un gráfico que muestra que BT474-TRgf es resistente a trastuzumabin vitroen comparación con BT474 parental. La Figura 20B es un gráfico que muestra el crecimiento tumoral en ratones que llevan xenoinjertos BT474-TRgf (n=5-7/grupo) después de la inyección i.v. con solución salina, trastuzumab (2,5 mg/kg, dos veces por semana) o nanoconstrucción conjugada con trastuzumab (T-NP) cargada con siHER2 o siSCR en los puntos de tiempo indicados por flechas. El negro indica 1,25 mg de ARNip/kg y el gris indica 2,5 mg de ARNip/kg.
Las Figuras 21A-21E muestran la pureza y especificidad de scFV de HER2, y la distribución de tamaño, y la eficacia de silenciamiento de luciferasa de nanoconstrucciones que contienen scFV de HER2, trastuzumab (T) o ácido fólico (FA). La Figura 21A muestra un gel que indica una pureza comparable de tres lotes de scFv de HER2. La Figura 21B es un diagrama que confirma la presencia de scFv de HER2 usando el anticuerpo Anti-etiqueta 6xHis. La Figura 21C muestra la especificidad de scFv de HER2 para células HER2+ (BT474, SKBR3 y JIMT1) sobre células HER2- (MCF7 y MDAMB468). La Figura 21D muestra los tamaños hidrodinámicos de NP conjugada con scFV de HER2 (scFV-NP), NP conjugada con ácido fólico (FA-NP) y NP conjugada con trastuzumab (T-NP), todos cargados con el mismo contenido de siHER2. La Figura 21E muestra la eficacia de silenciamiento de luciferasa de nanoconstrucciones que tienen tres agentes de direccionamiento diferentes como en la Figura 21D. Para la carga de scFV de HER2, se usó el 1 y el 4 % en peso de MSNP durante la síntesis. Para FA, se usó el 25 % en peso como Mal-PEG(5 kDa)-FA durante la síntesis.
Las Figuras 22A-22D muestran el tamaño, potencial zeta, eficacia de silenciamiento de luciferasa y efectos de viabilidad celular de nanoconstrucciones liofilizadas y recién preparadas. La Figura 22A es un gráfico que muestra el diámetro hidrodinámico de nanoconstrucciones liofilizadas (N<p>o T-NP) con cantidades variadas de trehalosa (TL) en comparación con nanoconstrucciones recién hechas (frescas) del mismo lote. La Figura 22B es un gráfico que muestra el potencial zeta de nanoconstrucciones liofilizadas (NP o T-NP) con cantidades variadas de trehalosa (TL) en comparación con nanoconstrucciones recién hechas (frescas) del mismo lote. La Figura 22C es un gráfico que muestra la eficacia de silenciamiento de nanoconstrucciones liofilizadas (NP o T-NP) con cantidades variadas de trehalosa (TL) en comparación con nanoconstrucciones recién hechas (frescas) del mismo lote. La Figura 22D es un gráfico que muestra la eficacia de eliminación de células cancerosas de nanoconstrucciones liofilizadas (NP o T-NP) con cantidades variadas de trehalosa (TL) en comparación con nanoconstrucciones recién hechas (frescas) del mismo lote. Los datos indican el 5 % de TL (en peso de nanoconstrucción) como la mejor condición para conservar todas las propiedades del material fresco. (A-B) sin ARNip, (C) con siLUC 30 nM frente a siSCR, (D) con siHER260 nM frente a siSCR.
Las Figuras 23A-23E muestran el tamaño, potencial zeta, propiedades de carga de ARNip, la eficacia de silenciamiento de luciferasa y las propiedades de eliminación de células cancerosas de las nanoconstrucciones conjugadas con trastuzumab liofilizadas (T-NP) almacenadas a diversas temperaturas y tiempos en relación con las de las nanoconstrucciones recién preparadas del mismo lote. La figura 23A es un gráfico que muestra el diámetro hidrodinámico relativo de T-NP liofilizada con el 5 % de trehalosa (TL) y almacenada a diversas temperaturas. La Figura 23B es un gráfico que muestra el potencial zeta relativo de T-Np liofilizada con el 5 % de trehalosa (TL) y almacenada a diversas temperaturas. La Figura 23C es un gráfico que muestra la carga relativa de ARNip de T-NP liofilizada con trehalosa al 5 % (TL) y almacenada a diversas temperaturas. La Figura 23D es un gráfico que muestra la eficacia de silenciamiento relativa de T-NP liofilizada con el 5 % de trehalosa (TL) y almacenada a diversas temperaturas. La Figura 23E es un gráfico que muestra la eficacia relativa de eliminación de células cancerosas de T-NP liofilizada con el 5 % de trehalosa (TL) y almacenada a diversas temperaturas. Los datos indican -20 °C como la mejor temperatura de almacenamiento para conservar todas las propiedades del material fresco durante al menos 24 semanas (6 meses). (A-D): siLUC 30 nM y siLUC/NP de 50; (E): siHER260 nM y siHER2/NP de 50.
Las Figuras 24A-24B son gráficos que muestran la viabilidad de BT474 en respuesta a 30 nM (cada uno) de diversos tratamientos de ARNip (A) y que confirman la atenuación de proteínas en células HCC38 mediante el ARNip de doble direccionamiento (B) (siAKT1/BCL2; una cadena se dirige al gen AKT1 y la otra se dirige al gen BCL2).
La Figura 25 es una serie de gráficos que representan la evaluación de la respuesta a la dosis cuatro días después del tratamiento con ARNip 30 nM dirigido a HER2, PLK1 y AKT1/BCL2 en líneas celulares BT474, HCC1569, HCC1954 y JIMT1.
La Figura 26 es un gráfico que representa el efecto de direccionamiento de ARNip de HER2, PLK1 y AKT1/BCL2 (suministrados con el agente de transfección comercial, DharmaFECT) sobre la viabilidad de diferentes subtipos de cáncer de mama y células de órganos no objetivo.
Las Figuras 27A-27B son gráficos que muestran especificidad de tratamiento potenciada para células de cáncer de mama HER2+ (HCC1954) en comparación con una línea celular epitelial de mama no tumorigénica (MCF10A) con siPLK1 o miR342-5p administrados por la nanoconstrucción conjugada con trastuzumab (T-NP10C) (A), así como el efecto de la administración de siPLK1 o miR342-5p por DharmaFECT comercial, que exhiben una especificidad de tratamiento más pobre para las células cancerosas que para las células no tumorigénicas. Todos los experimentos se realizaron con ARNip o miARN 30 nM (B).
Las Figuras 28A-28B son gráficos que muestran la capacidad de las nanoconstrucciones para cargar y administrar el péptido formador de poros GALA, que mejora el escape endosomal de la nanoconstrucción de ARNip, promover la actividad de silenciamiento de luciferasa (A), así como el efecto de la administración conjunta de trastuzumab (T), paclitaxel (PTX) y ARNip (siHER2) cargados en nanoconstrucciones y administrados a células cancerosas J<i>M<t>1 (B). (A): ARNip 15 nM, Np/ARNip 50, actividad medida 2 días después del tratamiento. (B): ARNip 30 nM, NP/ARNip 50, viabilidad medida 5 días después del tratamiento.
La Figura 29 es un gráfico que muestra que la carga de agentes quimioterápicos (paclitaxel, PTX, o doxorrubicina, DOX) en las nanoconstrucciones no perjudicó significativamente la eficacia de silenciamiento del ARNip contra la luciferasa (siLUC) (ARNip 30 nM, NP/ARNip 50, actividad medida 5 días después del tratamiento).
La Figura 30 es un gráfico que muestra el efecto de inhibición del crecimiento tumoral de HCC1954 de nanoconstrucciones cargadas tanto con siHER2 como con paclitaxel (T-siHER2-NP(PTX)) sobre aquellas cargadas con siSCR y paclitaxel (T-siSCR-NP(PTX)) o contrapartes de fármaco libre (trastuzumab paclitaxel). Las flechas indican inyecciones (1,25 mg de ARNip/kg, NP/ARNip 50).
Figuras 31A-31D. Las Figuras 31A-31B son una serie de gráficos que muestran nanoconstrucciones que contienen PEI y PEG (MSNP-PEI-PEG y cargadas con siSCR no dirigida) que podrían reducir la actividad de ROS intracelular de fibroblastos dérmicos primarios con una potencia similar a la de NAC (A), así como las propiedades antioxidantes (depuración de DPPH) del material (medidas en un sistema sin células) se atribuyeron al núcleo de MSNP en lugar de a PEI o PEG (B). La Figura 31C es un gráfico que muestra que las nanoconstrucciones podrían reducir las expresiones proteicas de genes profibróticos (HSP47, NOX4) y marcadores fibróticos (COL I y alfa-SMA) sin dañar las células en un modelo de fibrosisin vitro(fibroblastos dérmicos estimulados con TGF-beta). La Figura 31D es un gráfico que muestra que las nanoconstrucciones podrían reducir los niveles de ARNm de NOX4, COL I y alfa-SMA en un segundo modelo de fibrosisin vitro(fibroblastos tratados con bleomicina). Los datos de Morryet al.2015.
Las Figuras 32A-32G muestran el diseño experimental y los resultados de los ensayos realizados para sondear la capacidad de las nanoconstrucciones para tratar la enfermedad fibrótica de la piel. La Figura 32A es un esquema que muestra el diseño de estudio de una serie de experimentos destinados a determinar la eficacia de la nanoconstrucción siHSP47 (MSNP-PEI-PEG) para tratar la enfermedad fibrótica de la pielin vivo(fibrosis cutánea estimulada por bleomicina en ratones). La Figura 32B es una serie de imágenes representativas que muestran que la siHSP47-NP podría reducir el engrosamiento dérmico de ratones provocado por el tratamiento con bleomicina. La Figura 32C es un gráfico que muestra la capacidad de siHSP47-NP para reducir el espesamiento dérmico de ratones provocado por el tratamiento con bleomicina. La Figura 32D es un gráfico que muestra la capacidad de siHSP47-NP para reducir la expresión del marcador fibrótico HSP47. La Figura 32E es un gráfico que muestra la capacidad de siHSP47-NP para reducir la expresión del marcador fibrótico NOX4. La Figura 32F es un gráfico que muestra la capacidad de siHSP47-NP para reducir la expresión del marcador fibrótico alfa-SMA. La Figura 32G es un gráfico que muestra la capacidad de siHSP47-NP para reducir la expresión del marcador fibrótico COL I. Se observaron algunos efectos de reducción (aunque menos) con siSCR-NP debido a las propiedades antioxidantes del núcleo de MSNP.
Las Figuras 33A-33D son gráficos que muestran los efectos celulares del tratamiento con siPLK1-NP. La Figura 33A es un gráfico que muestra que el tratamiento con siPLK1-NP de células LM2-4luc+/H2N podría reducir la expresión de PLK1 a nivel de ARNm. La Figura 33B es un gráfico que muestra que el tratamiento con siPLK1-NP puede reducir la expresión de proteína PLK1 al nivel de proteína. La Figura 33C es un gráfico que muestra la capacidad de siPLK1-NP para aumentar la distribución de fase del ciclo celular de G2/M con una potencia similar a la del inhibidor de PLK1 (BI2536). La Figura 33D es un gráfico que muestra la capacidad de siPLK1-NP para disminuir la viabilidad de las células cancerosas. Dosis de ARNip de 50 nM y NP/ARNip de 50, dosis de BI2536 de 10 nM, tiempo de tratamiento: 24 h para (A), 48 h para (B), 24 h para (C) y 5 días para (D).
Las Figuras 34A-34H muestran el efecto del tratamiento con nanoconstrucción en células cancerosas LM2-4luc+H2N. La Figura 34A es un gráfico que muestra que el tratamiento con nanoconstrucción de células cancerosas LM2-4luc+/H2N podría reducir el nivel de ROS intracelular con una potencia similar a la de NAC 2 mM y DPI 5|jM. La Figura 34B es un gráfico que muestra que el tratamiento con nanoconstrucción de células cancerosas LM2-4luc+/H2N no provoca la muerte celular a las concentraciones usadas. La Figura 34C es un gráfico que muestra la capacidad del tratamiento con nanoconstrucción de células cancerosas LM2-luc+/H2N para reducir la expresión de ARNm de NOX4 con una potencia similar a la de NAC 20 mM. La Figura 34D es una serie de imágenes que muestran que las nanoconstrucciones (cargadas con siSCR, DY677-siSCR o siPLKI) podrían reducir la migración de células cancerosas en ensayos de cicatrización. La Figura 34E es un gráfico que muestra que las nanoconstrucciones cargadas con siSCR o siPLKI podrían reducir la migración de células cancerosas más eficazmente que el ARNip administrado con DharmaFECT. La Figura 34F es una serie de imágenes que muestran que las nanoconstrucciones (cargadas con siSCR) podrían inhibir la invasión de células cancerosas en ensayos de degradación de FITC-gelatina con una potencia similar a la de DPI 5 j M. La Figura 34G es un gráfico que muestra que las nanoconstrucciones cargadas con siSCR podrían inhibir la invasión de células cancerosas en ensayos de degradación de FITC-gelatina con una potencia similar a la de DPI 5<j>M. La Figura 34H es un gráfico que muestra que las nanoconstrucciones cargadas con siSCR podrían inhibir la invasión de células cancerosas en ensayos de cámara de Boyden recubierta de Matrigel con una potencia similar al DPI pero mayor que la de NAC 2-10 mM. En todo momento se usó una dosis de ARNip de 50 nM y una relación de NP/ARNip de 50 en masa. Las Figuras 35A-35H muestran el diseño experimental y los resultados de los ensayos realizados para determinar los efectos terapéuticos de nanoconstrucciones conjugadas con trastuzumab y cargadas con siPLKI (T-siPLK1-NP) en un modelo de ratón con cáncer metastásico. La Figura 35A es un esquema que muestra el diseño de estudios a corto y largo plazo destinados a comprender si T-siPLK1-NP puede tratar el cáncer de mama HER2+ metastásico (LM2-4luc+/H2N)in vivo.La Figura 35B es un gráfico que muestra los resultados del estudio a corto plazo (n = 5/grupo). T-siPLK1-NP podría reducir la tasa de incidencia de cáncer en diversos órganos de ratones y la carga tumoral total después de 6 dosis de tratamiento. También se observó cierta reducción de la tasa de incidencia con T-siSCR-NP. La Figura 35C es un gráfico que muestra que T-siPLK1-NP también podría reducir las señales de formación de imágenesin vivo(IVIS) del cáncer en la región del tórax (pulmón) de los ratones. La Figura 35D es un gráfico que muestra que T-siPLK1-NP podría reducir el peso del pulmón de ratones que portan cáncer al nivel similar al de ratones normales (sin cáncer). La Figura 35E es un gráfico que muestra que T-siPLK1-NP podría reducir los niveles de expresión de ARNm de PLK1 del cáncer humano que preside los pulmones de los ratones. Estudio a largo plazo (n = 8/grupo): La Figura 35F es un gráfico que muestra que T-siPLK1-NP podría reducir las señales de IVIS del cáncer en la región del tórax (pulmón) de los ratones. La Figura 35G es un gráfico que muestra la supervivencia extendida de ratones del mismo estudio debido al tratamiento con T-siPLK1-NP. La Figura 35H es una serie de imágenes que muestran la capacidad de T-siPLK1-NP para reducir las lesiones cancerosas en los tejidos pulmonares como se muestra mediante imágenes H&E representativas y tinción con anti-vimentina humana. Tratamientos como se especifica; las líneas verticales en (C) y (F) representan días de dosificación.
La Figura 36 muestra la actividad de ceruloplasmina (un biomarcador de cobre biodisponible) del suero del estudio a corto plazo en las Figuras 35A-35H (n=5/grupo, suero recogido en el sacrificio). "Solución salina" representa a ratones con tumor con tratamiento con solución salina; "Normal" representa ratones normales sin tumores.
Las Figuras 37A-37B muestran una serie de lantánidos que se cargaron dentro de los poros de las nanopartículas MSNP en diversas cantidades (A), así como una serie de micrografías de fluorescencia que demuestran la tinción específica de células HER2+ y no de células HER2- con T-NP que contienen Dylight550 (B).
Las Figuras 38A-38C muestran el tamaño, eficacia de silenciamiento de luciferasa y relaxividad T2 de nanoconstrucciones que contienen óxido de hierro. La Figura 38A muestra la distribución de tamaño hidrodinámica de nanoconstrucciones que contienen un núcleo de nanopartículas de óxido de hierro (ION, Feraheme) modificado con PEI de 10 kDa, preparado usando 4:1 en masa de<i>O<n>:PEI (llamado F1) o 3:1 de ION:PEI (llamado F2), PEG de 5 kDa y conjugado con trastuzumab (T-F2). La Figura 38B es un gráfico que muestra la eficacia de silenciamiento de luciferasa de los tres materiales con una dosis de ARNip de 50 nM y NP/ARNip de 10. La Figura 38C es un gráfico que muestra la relaxividad T2 mejorada de F2 y T-F2 sobre Feraheme, medido por T2 IRM (instrumento de IRM de pequeños animales Bruker BioSpin 11.75T) que indica que los materiales pueden usarse como agentes de contraste de IRM.
Descripción detallada
En el presente documento se describen nanoconstrucciones tal como se definen en las reivindicaciones para el tratamiento de enfermedades, incluido el cáncer, inflamación y fibrosis. La nanoconstrucción contiene una nanopartícula, tales como nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNP), una nanopartícula de plata, una nanopartícula de óxido de hierro o un nanotubo de carbono, cargada con una variedad de agentes adicionales que incluyen, pero sin limitación, polímeros catiónicos, estabilizadores, agentes de direccionamiento, moléculas pequeñas o proteínas, marcadores y/u oligonucleótidos como se define en las reivindicaciones. También se contemplan combinaciones de diversos agentes adicionales. Por ejemplo, la nanoconstrucción incluye un polímero catiónico, estabilizador, agente de direccionamiento y molécula pequeña, marcador y/u oligonucleótido. Las nanoconstrucciones también pueden incluir más de un tipo de polímero catiónico, estabilizador, agente de direccionamiento, molécula pequeña, proteína, marcador y/u oligonucleótido. Por ejemplo, las nanoconstrucciones pueden incluir múltiples oligonucleótidos diferentes y/o moléculas pequeñas o proteínas que actúan sobre los mismos o diferentes objetivos. El uso de tales agentes adicionales puede proporcionar un efecto aditivo o sinérgico para el tratamiento de enfermedades cuando se administran juntos en una nanoconstrucción.
Nanopartículas
Las nanopartículas útiles con las composiciones y métodos de la invención incluyen, nanopartículas de sílice mesoporosas (por ejemplo, MSNP), nanopartículas de óxido de hierro, nanopartículas de plata y nanotubos de carbono como se define en las reivindicaciones. Las nanopartículas pueden o no ser porosas. Los tamaños a modo de ejemplo para los núcleos de nanopartículas son de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, o aproximadamente 5 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 40 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 70 nm, aproximadamente 80 nm, aproximadamente 90 nm o aproximadamente 100 nm. Generalmente, los núcleos de nanopartículas son esféricos, aunque otras formas, tal como varillas y discos, también pueden usarse.
Los componentes adicionales pueden unirse a las nanopartículas mediante diversos mecanismos, covalente o no covalentemente. Por ejemplo, los polímeros catiónicos pueden unirse a las nanopartículas por carga, por ejemplo, para nanopartículas de sílice u óxido de hierro. Como alternativa, las superficies de las nanopartículas pueden alterarse para incluir restos reactivos para la conjugación con polímeros catiónicos y/u otros componentes, o los polímeros catiónicos u otros componentes pueden incluir un resto que se une a las nanopartículas. Por ejemplo, núcleos de nanopartículas tal como nanopartículas de sílice, de silicio, de óxido de hierro y de plata, así como nanotubos de carbono, pueden modificarse con restos reactivos tal como tioles, fosfonato, carboxilato y aminas antes de la unión con polímeros catiónicos y otros componentes. Los polímeros catiónicos y otros componentes pueden modificarse para incluir estos u otros restos, incluyendo, pero sin limitación, maleimida, ésteres N-hidroxisuccinimidílicos (NHS), o azidas, antes de unirse a los núcleos de nanopartículas. Los componentes pueden unirse directamente a las nanopartículas, ya sea en la superficie o dentro de los poros si están presentes.
Polímeros catiónicos
Las nanopartículas, tal como las MSNP, están recubiertas con polímeros catiónicos u otros compuestos. El polímero catiónico puede unirse a la superficie de la nanopartícula usando cualquier medio apropiado. En algunas realizaciones, el polímero catiónico se une a la nanopartícula mediante interacción electrostática. El polímero catiónico puede ser cualquier polímero con una carga positiva, tales como, pero sin limitación, polietilenimina (PEI) (véase, por ejemplo, Ejemplo III), poliamidoamina, poli(alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), quitosano, poli(N-isopropilacrilamidaco-acrilamida), poli(N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico), poli(L-lisina), dietilaminoetil-dextrano, poli-(bromuro de N-etil-vinilpiridinio), poli(metacrilato de (dimetilamino)etilo) o polietilenglicol-co-poli(cloruro de metacrilato de trimetilaminoetilo). Otros polímeros catiónicos serán evidentes para los expertos en la materia, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Polymer Handbook, 4a Edición, editado por: Brandrup, E.H. Immergut y E.A. Grukle; John Wiley & Sons, 2003).
Los polímeros catiónicos pueden ser lineales o ramificados. En algunas realizaciones, los polímeros catiónicos pueden variar en tamaño desde aproximadamente 500 Da hasta 25 kDa y pueden ser ramificados o lineales. Por ejemplo, PEI ramificada con un tamaño promedio de 1,8 kDa a 10 kDa puede cargarse en el núcleo de nanopartículas. La relación de polímero catiónico a nanopartícula puede variar dependiendo del resultado deseado. El polímero catiónico puede estar presente del 1 al 50 % en peso del polímero por nanoconstrucción, por ejemplo, del 5 al 40, del 10 a 30 %, del 20 al 30 %, del 5 al 15 %, del 5 al 20 %, del 5 al 25 %, del 5 al 30 %, del 10 al 20 %, del 10 al 25 % o del 25 al 40 %, por ejemplo, aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30 o 35 %. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo III, PEI por MSNP a una relación en peso de 1:4 durante el recubrimiento inicial y a una relación en peso de 1:4 durante la reticulación dio como resultado un 14 % en peso de PEI por nanoconstrucción si se usó PEI de 10 kDa o un 16 % en peso si se usó PEI de 1,8 kDa (véase, por ejemplo, Tabla 5).
El escape endosomal y la eficacia de silenciamiento génico aumentan al aumentar la capacidad de tamponamiento de las nanopartículas. La reticulación de los polímeros catiónicos produce una mayor capacidad de tamponamiento como se muestra en la Figura 2B. De acuerdo con la invención, los polímeros catiónicos están reticulados, por ejemplo, con un enlace disulfuro escindible, recubrimiento previo o posterior sobre la nanopartícula. En algunas realizaciones, los polímeros catiónicos unidos se reticularon después de unirse a las nanopartículas, por ejemplo, MSNP, usando, por ejemplo, DSP (ditiobis[propionato de succinimidilo]), DTSSP (3,3'-ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) y DTBP (3,3-ditiobispropionimidato de dimetilo). La reticulación puede tener lugar en ausencia o presencia de PEI libre en la solución como se muestra en el Ejemplo III y la Figura 2A. En otras realizaciones, los polímeros catiónicos pueden no estar reticulados.
Estabilizantes
Unestabilizador puede conjugarse con la nanopartícula y/o el polímero catiónico, por ejemplo, por cualquier medio apropiado. En algunas realizaciones, un estabilizador se conjuga con una amina u otro grupo reactivo de un polímero catiónico reticulado que recubre la nanopartícula (por ejemplo, una MSNP). Los estabilizadores a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), dextrano, ácido polisiálico, ácido hialurónico (HA), polivinilpirrolidona (PVP), poli(alcohol vinílico) (PVA) y poliacrilamida (PAM).
Los estabilizadores pueden tener múltiples grupos químicamente reactivos, por ejemplo, para la unión a la nanopartícula, polímero catiónico y/u otro componente. Por ejemplo (por ejemplo, Ejemplo IV), los derivados de estabilizador reactivo, por ejemplo, PEG, pueden tener dos restos electrofílicos, tal como maleimida-PEG-éster N-hidroxisuccinimidílico (Mal-PEG-NHS), que contiene tanto un aceptor de Michael como un éster activado. El estabilizador, por ejemplo, PEG, utilizado junto con las composiciones y métodos de la invención generalmente tiene un peso molecular que oscila entre 500 Da-40 kDa, por ejemplo, 2-10 kDa como se muestra en la Figura 3A. Con PEG de 5 kDa, el material es óptimo en términos de tamaño y contenido de carga de PEG (Figura 3A). El estabilizador puede estar presente del 1 al 50 % en peso de estabilizador por nanoconstrucción, por ejemplo, del 5 al 30 % en peso, del 10 al 20 %, del 10 al 25 %, del 5 al 15 %, del 5 al 20 %, del 5 al 25 % o del 1 al 10 %, por ejemplo, aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 35, 40 o 45 %. Como se muestra en el Ejemplo IV, Mal-PEG(5 kDa)-NHS por M<s>NP se usa en una relación en peso de 1:1 a 5:1 durante la síntesis (Figura 3B), lo que da como resultado aproximadamente un 6 23 % de PEG por nanoconstrucción (véase la Tabla 5).
Agentes de marcación
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción puede marcarse, por ejemplo, con un lantánido o colorante fluorescente, por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo XXIV y la Figura 37. Un marcador puede ser cualquier sustancia capaz de ayudar a una máquina, detector, un sensor, dispositivo, columna, o el ojo humano con o sin aumento a diferenciar una composición marcada de composiciones no marcadas. Ejemplos de marcadores incluyen, pero sin limitación, isótopos radiactivos (por ejemplo, trazadores de PET), colorantes, manchas, puntos cuánticos, nanopartículas de oro, enzimas, metales no radiactivos (por ejemplo, agentes de contraste de IRM), imanes, biotina, etiquetas de proteínas, cualquier epítopo de anticuerpo, o cualquier combinación de los mismos. Los colorantes fluorescentes ilustrativos incluyen, pero sin limitación, FITC, RITC, colorantes Cy™, colorantes Dylight® reactivos con amina y colorantes Alexa Fluor® reactivos con amina. En algunas realizaciones, los lantánidos se pueden cargar en grupos hidroxilo, tiol, amina o fosfonato de nanopartículas, por ejemplo, MSNP, por enlace covalente o adsorción, por ejemplo, como se muestra en la Figura 37A. Los lantánidos pueden facilitar la detección de muestras con alta sensibilidad y resolución, por ejemplo, por espectrometría de masas (Figura 37A), mientras que los colorantes fluorescentes permiten la cuantificación de muestras mediante técnicas de formación de imágenes fluorescentes, por ejemplo, como se muestra en la Figura 37B. Las nanoconstrucciones que contienen lantánidos como el gadolinio también pueden servir como agentes de contraste de IRM para obtener imágenes de sitios de enfermedad.
En algunas realizaciones, los marcadores, tales como colorantes fluorescentes, pueden cargarse dentro de los poros de las nanopartículas, por ejemplo, amina-MSNP a través de sustitución de acilo nucleofílica, por ejemplo, entre una o más aminas unidas a nanopartículas y un resto de éster activado (tal como un éster NHS) unido a un colorante fluorescente. Tales marcadores producen nanoconstrucciones para aplicaciones de formación de imágenes de fluorescencia como se muestra en la Figura 37B). Un marcador de este tipo puede añadirse antes o después de la carga del polímero catiónico y/o estabilizador. En realizaciones adicionales, el marcador puede unirse al polímero catiónico, estabilizador u otro componente antes o después de su unión a la nanopartícula por cualquier medio apropiado.
Agentes de direccionamiento
La nanoconstrucción puede administrarse de manera específica o no específica. Las nanoconstrucciones pueden administrarse a un sitio, por ejemplo, para terapia, análisis o diagnóstico, tal como una célula o tejido. El sitio puede serin vivooex vivo.En algunas realizaciones, las nanoconstrucciones pueden administrarse a los tumores a través de la vasculatura con fugas de los tumores. En algunas realizaciones, la afinidad de la célula o tejido, por ejemplo, tumores, para las partículas catiónicas puede permitir que las nanoconstrucciones dotadas de una carga positiva debido a la presencia de polímeros catiónicos se acumulen en el sitio, por ejemplo, tumores y sitios de enfermedad (véase, por ejemplo, la Figura 19 que muestra la eficacia de la nanopartícula siHER2 sin agente de direccionamiento en xenoinjertos tumorales en ratones). En otras realizaciones, las nanoconstrucciones pueden incluir además un agente de direccionamiento, por ejemplo, para la administración específica de las nanoconstrucciones a sitios tales como tumores (véase, por ejemplo, las Figuras 16, 17 y 20 que muestran la eficacia de la nanopartícula siHER2 conjugada con trastuzumab en xenoinjertos tumorales en ratones). Los agentes de direccionamiento pueden usarse para dirigirse a un sitio y, opcionalmente, para ayudar o inducir la internalización en una célula.
Los agentes de direccionamiento ilustrativos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de fragmento variable monocatenario (scFv), otros fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, aptámeros, pequeñas moléculas de direccionamiento (por ejemplo, ligandos que se unen a receptores de superficie celular tales como N-acetilgalactosamina, manosa, transferrina y ácido fólico), aptámeros, hidratos de carbono y péptidos que tienen afinidad de unión a una célula o tejido, por ejemplo, un tumor. Los agentes de direccionamiento pueden unirse a las nanopartículas, polímero catiónico o estabilizador por cualquier medio apropiado. En algunas realizaciones, los agentes de direccionamiento son trastuzumab (Figuras 4 y 8), cetuximab (Figura 8I) o scFV de HER2 (Figuras 21A-21E), que pueden unirse a un estabilizador, por ejemplo, PEG, que ya está unido a las nanopartículas. En algunas realizaciones, los agentes de direccionamiento, tales como ácido fólico y transferrina, se unen primero a un estabilizador, por ejemplo, PEG, antes de la unión en la nanopartícula (Figuras 21D-21E para nanopartículas conjugadas con ácido fólico (FA)). En realizaciones adicionales, los agentes de direccionamiento, tales como anticuerpos monoclonales, pueden tener un efecto terapéutico (véase, por ejemplo, las Figuras 9, 11 y 28). Los anticuerpos monoclonales ilustrativos incluyen, pero sin limitación, anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF-A, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD52 y anticuerpo anti-TNFa, tales como alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, panitumumab, rituximab, infliximab, tositumomab, pertuzumab y trastuzumab.
Los agentes de direccionamiento pueden unirse a las nanoconstrucciones por cualquier medio, y las químicas de conjugación adecuadas se conocen en la técnica y se describen en el presente documento. En algunas realizaciones (por ejemplo, Ejemplo V), el agente de direccionamiento se tiola y posteriormente se conjuga con Mal-PEG-PEI-MSNP a través de una reacción de tiol-maleimida. En algunas realizaciones (por ejemplo, Ejemplo V), los agentes de direccionamiento se unen primero al estabilizador de PEG (por ejemplo, F<a>o transferrina en PEG-NHS, disponible comercialmente) antes de la conjugación a la nanopartícula mediante la reacción de un éster NHS y una amina. El agente de direccionamiento puede estar presente del 0,1 al 10% en peso de agente de direccionamiento por nanoconstrucción, por ejemplo, del 0,1 al 1 % o del 1 al 5 %, por ejemplo, del 1 al 10 % para anticuerpo o del 0,1 al 2 % para scFV, por ejemplo, aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 %. Por ejemplo, la MSNP por trastuzumab puede estar en la relación en peso de 50:1 a 1:1 (como se muestra en las Figuras 4A-4B) durante la síntesis, dando como resultado del 0,5 al 6 % en peso de trastuzumab por nanoconstrucción (la Tabla 5 muestra el 3 % en peso de anticuerpo si se usa una relación de 10:1). En otro ejemplo, del 1-4 % en peso de scFV de HER2 por MSNP durante la síntesis da como resultado del 0,3-0,5 % en peso de scFV de HER2 por nanoconstrucción.
Moléculas pequeñas y proteínas
En algunas realizaciones, la nanoconstrucción puede cargarse con moléculas pequeñas, proteínas (es decir, distintas de los agentes de direccionamiento) u otros agentes terapéuticos. Las moléculas pequeñas son moléculas, normalmente con un peso molecular inferior a aproximadamente 1000 Dalton, o en algunas realizaciones, inferior a aproximadamente 500 Dalton, en donde la molécula es capaz de modular, hasta cierto punto medible, una actividad de una molécula objetivo. Moléculas pequeñas a modo de ejemplo tales como péptidos, inhibidores de molécula pequeña, agentes quimioterápicos y otros fármacos pueden aumentar los efectos terapéuticos de la nanoconstrucción, por ejemplo, como se muestra en las figuras 28-30. Las moléculas pequeñas pueden ubicarse en el exterior de las nanopartículas, por ejemplo, en PEI y/o dentro de los poros del núcleo de nanopartículas, por ejemplo, MSNP. Las moléculas pequeñas, tales como inhibidores de molécula pequeña y otros agentes quimioterápicos, pueden seleccionarse en función de la eficacia y especificidad, por ejemplo, en la destrucción de células cancerosas sobre células no objetivo. Además de las moléculas pequeñas, proteínas pequeñas tal como citocinas con pesos moleculares inferiores a aproximadamente 50 kDa también pueden cargarse en la nanopartícula de la misma manera que las moléculas pequeñas.
En algunas realizaciones, agentes quimioterápicos tal como paclitaxel, docetaxel y doxorrubicina pueden cargarse en nanoconstrucciones mediante enlaces de hidrógeno con nanopartículas, por ejemplo, MSNP, restos superficiales (por ejemplo, hidroxilo o silanol) y/o polímero catiónico, por ejemplo, PEI. Los fármacos hidrófobos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel) pueden cargarse en las nanoconstrucciones durante o después del recubrimiento con polímero catiónico, por ejemplo, con PEI en etanol, mientras que los fármacos hidrófilos (por ejemplo, doxorrubicina) se pueden cargar en las nanoconstrucciones después del recubrimiento con estabilizador, por ejemplo, PEG, en PBS. La molécula pequeña puede estar presente del 0,01 al 50 % en peso de molécula pequeña por nanopartícula, por ejemplo, del 0,1 al 30 %, del 1 al 30%, del 1 al 20%, del 1 al 10%, del 1 al 5%, del 0,1 al 1 %, del 0,5 al 5% o del 0,5 al 10%. Por ejemplo, la molécula pequeña por MSNP se usa en una relación en peso de 1:10 a 1:1, lo que da como resultado del 0,1 al 30 % en peso de fármaco por nanoconstrucción.
Los agentes quimioterápicos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, metotrexato; plicamicina (mitramicina); mitotano; mercaptopolilisina; análogos de pirimidina tales como fluorouracilo; antibióticos antracíclicos tales como doxorrubicina; maitansinoides tales como ansamitocina; nucleósidos de D-arabinosilo, tal como arabinosil adenina; agentes alquilantes tales como PAM, I-PAM, altretamina, procarbazina, busulfán, dacarbazina, temozolomida, tiotepa y dacarbazina; antagonistas de purina tales como mercaptopurina; actinomicinas tales como dactinomicina; mitomicinas tales como mitomicina C; anti-esteroides tales como aminoglutetimida; antimicrotúbulos tales como estramustina y vinblastina; antiandrógenos tales como flutamida; análogos de GnRH tales como leuprolida; acetato de megestrol; antagonistas de los receptores de estrógenos tales como tamoxifeno; amsacrina (m-AMSA); asparaginasa (I-asparaginasa); inhibidores de topoisomerasa tales como etopósido (VP-16); citocinas tales como interferón a-2a e interferón a-2b; derivados de podofilotoxina tales como tenipósido (VM-26); arabinosil citosina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, ciclofosfamida, uramustina, ifosfamida, melfalán, bendamustina, mostina y melfalán; nitrosoureas, tales como carmustina, fotemustina, lomustina, estreptozocina y semustina; agentes antineoplásicos basados en platino tales como carboplatino, cisplatino, tetranitrato de triplatino y oxaliplatino; antimetabolitos de folato, tales como pemetrexed, raltitrexed, edatrexato, denopterina y cladribina; análogos de nucleósidos tales como gemcitabina; antimetabolitos de nucleósidos de purina tales como clofarabina; antimetabolitos tales como (ácido N-((5-(((1,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolinil)metil)metilamino)-2-tienil)carbonil)-L-glutámico); antagonistas de glutamina tales como 6-diazo-5-oxo-L-norleucina; análogos de purina tales como fludarabina y tioguanina; profármacos tales como capecitabina y aminolevulinato de metilo; inhibidores mitóticos tales como vincristina, vinorelbina y vindesina; antraciclinas tales como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, valrrubicina e idarrubicina; antracenodionas tales como mitoxantrona; antibióticos glicopeptídicos tales como bleomicina; inhibidores de TNF tales como etanercept; ácido aminolevulínico; inhibidores de tirosina cinasa tales como dasatinib, imatinib, nilotinib, lapatinib, neratinib y erlotinib; inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico tales como gefitinib; inhibidores de proteína cinasa tales como sunitinib y vandetanib; agentes reductores de plaquetas tales como anagrelida; inhibidores de proteasoma tales como bortezomib; denileucina diftitox; pentostatina; pegaspargasa; alagebrium (3-fenacil-4,5-dimetiltiazolio; aminofilina; tripéptido de muramilo; y mifamurtida. En la técnica se conocen otros agentes terapéuticos.
Oligonucleótidos
De acuerdo con la invención, los oligonucleótidos se unen a la nanoconstrucción que incluye, pero sin limitación, ARNip, miARN, imitadores de miARN u oligómeros antisentido. Normalmente, los oligonucleótidos serán capaces de alterar, por ejemplo, reducir, la expresión de una proteína objetivo, por ejemplo, por iARN o efecto antisentido. Como alternativa, el oligonucleótido puede actuar como una sonda en una célula o tejido de interés. Los oligonucleótidos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, oligonucleótidos que silencian la expresión de PLK1, AKT1/BCL2, HER2, EPS8L1 o HSP47 tal como siPLKI, siAKT1/BCL2, siHER2, siEPS8L1, siHSP47 o miR-342-5P (véase, por ejemplo, Ejemplo XII y XX). En el presente documento se describen otros objetivos. El oligonucleótido puede unirse por cualquier medio. En algunas realizaciones, el ARNip cargado negativamente se une al polímero catiónico cargado positivamente en la nanopartícula, por ejemplo, MSNP, usando una interacción electrostática. Los oligonucleótidos pueden dirigirse a uno o más genes expresados en una célula cancerosa, tal como uno o más genes que codifican una proteína que promueve el crecimiento celular, la vascularización tumoral o el escape de la apoptosis. En algunas realizaciones, un único oligonucleótido puede dirigirse a una pluralidad de genes con potencia variable. En otras realizaciones, una pluralidad de oligonucleótidos puede dirigirse a un solo gen. En realizaciones adicionales, una pluralidad de oligonucleótidos puede dirigirse a una pluralidad de genes.
Los oligonucleótidos pueden estar presentes de aproximadamente el 1% al 10% en peso, por ejemplo, de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 4 % en peso. Por ejemplo, MSNP por ARNip (NP/ARNip) se usa en la relación en peso que varía entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 100:1 durante el proceso de unión, logrando una unión completa. La eficacia de la atenuación génica óptima se logra en NP/ARNip de 25-50 como se muestra en las Figuras 5A-5B. Por ejemplo, la MSNP-PEI-PEG (con o sin un agente de direccionamiento) puede cargarse con una o más secuencias de ARNip dirigidas hacia los genes diana tales como, pero sin limitación, siHER2, siAKT (isoformas 1,2, 3), siBCL2, siAKT1/BCL2 (un dúplex de ARNip en el que una hebra puede atenuar AKT1 y la otra puede atenuar BCL2, Tabla 1), siPLK1, siGRB7 y siEPS8L1. Las exploraciones de estos ARNip se muestran en las Figuras 24-26. Las nanopartículas también pueden cargarse con miARN tal como miR-342-5p en las mismas condiciones con ARNip (Figura 27A).
Las secuencias de ARNip ilustrativas usadas en el presente documento son siHER2, siAKT1/BCL2, el control de ARNip denominado siSCR y un ARNip contra la luciferasa denominado siLUC. Las secuencias específicas se muestran en la Tabla 1.
Tabla1:Secuencias de ARNi ilustrativas
ElsiHER2 a modo de ejemplo se seleccionó midiendo la eficacia y especificidad con la que redujo los niveles de ARNm de HER2 y el crecimiento en líneas celulares HER2+ pero no líneas celulares HER2-. La dosis de siHER2 requerida para inhibir el crecimiento celular en un 50 % (IG50) fue <5 nM en 19 de 20 líneas celulares HER2+ (14 de 20 células no respondieron a 30 pg/ml de trastuzumab).
El siHER2 ilustrativo seleccionado se unió a MSNP-PEI-PEG-Trastuzumab (T-NP) para crear una nanoconstrucción. La construcción aumenta la protección de ARNip contra la degradación enzimática en sangre (Figuras 6A-6E), potencia la absorción celular específica de tumor (Figuras 8A-8I) y logra más del 80 % de eficacia de atenuación de HER2 (Figura 9A). La nanoconstrucción optimizada produjo la muerte apoptótica en células de cáncer de mama HER2 positivas (HER2+) cultivadasin vitro(Figura 9C-D), pero no en células de cáncer de mama HER2 negativas (HER2-) o no de mama (Figura 10). Como se ve en las Figuras 16A-16B, una dosis de las nanopartículas siHER2 redujo los niveles de proteína HER2 en un 60 % en xenoinjertos de HCC1954 resistentes a trastuzumab en ratones y múltiples dosis intravenosas administradas durante 3 semanas inhibieron significativamente el crecimiento tumoral (p < 0,004) (Figuras 17A-17D). El material también tuvo un impacto terapéutico en otro modelo de tumor que se mostró resistente a trastuzumab (Figura 20).
Síntesis de nanoconstrucciones
Los componentes pueden unirse a nanopartículas u otros componentes por cualquier medio, incluida la unión covalente y electrostática. Se conocen en la técnica diversas químicas de conjugación y se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, uno o más de los componentes están unidos a la superficie de las nanopartículas. En otras realizaciones, uno o más de los componentes están unidos dentro de los poros de la nanopartícula (por ejemplo, MSNP). En realizaciones adicionales, uno o más de los componentes están unidos entre sí. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un agente de direccionamiento puede unirse covalentemente a un estabilizador, que está unido covalentemente al polímero catiónico (por ejemplo, a través de una amina), que a su vez se une electrostáticamente al exterior de la nanopartícula, y una molécula pequeña se une a la superficie interior de un poro. En algunas realizaciones, el poro tiene una primera abertura en una primera ubicación en la superficie exterior de la nanopartícula (por ejemplo, MSNP) y una segunda abertura diferente en una segunda ubicación en la superficie exterior de la nanopartícula. Los componentes adicionales pueden unirse en cualquier lugar a lo largo de la longitud del interior del poro.
Mientras que las nanopartículas, tal como las MSNP, pueden adquirirse comercialmente o crearse por cualquier método, en algunas realizaciones, las MSNP se forman combinando un primer tensioactivo con un segundo tensioactivo diferente para formar una primera mezcla, calentando la primera mezcla y añadiendo un precursor de sílice a la primera mezcla para formar una segunda mezcla, manteniendo la temperatura durante un período de tiempo para generar MSNP y recuperando las MSNP por centrifugación. Los tensioactivos se pueden eliminar mezclando la MSNP en un disolvente ácido en condiciones de reflujo. En algunas realizaciones, la primera mezcla puede calentarse antes de añadir el precursor de sílice. En otras realizaciones, la primera mezcla puede estar a temperatura ambiente y la segunda mezcla puede calentarse. Las MSNP resultantes pueden tener un tamaño de partícula uniforme o no uniforme con alta porosidad, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1A.
Por ejemplo, para formar MSNP uniformes, el cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) puede combinarse con trietanolamina (TEA) en agua y calentarse a 95 °C, mientras que se añade ortosilicato de tetraetilo como se muestra en el Ejemplo I. La variación de la cantidad de TEA mientras se mantiene constante la cantidad de CTAC puede usarse para alterar el tamaño de las MSNP resultantes. En algunas realizaciones, la cantidad de TEA está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 600 pl, aproximadamente 200 y aproximadamente 450 pl o aproximadamente 200 y aproximadamente 350 pl. Las MSN<p>no uniformes pueden crearse usando una base fuerte, tal como NaOH. Por ejemplo, se puede usar bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) como tensioactivo y se puede usar NaOH como catalizador de base como se muestra en el Ejemplo II.
Las nanopartículas de óxido de hierro se pueden comprar (por ejemplo, Feraheme) o sintetizar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo XXV. Las nanopartículas de oro y plata se pueden sintetizar siguiendo diversos protocolos publicados o se pueden comprar a proveedores como Sigma Aldrich, Nanocs, nanoComposix. Los nanotubos de carbono se pueden sintetizar siguiendo diversos protocolos publicados o se pueden comprar a proveedores como Sigma Aldrich, US Research nanomaterial y American Elements.
En algunas realizaciones, grupos funcionales tales como, pero sin limitación, tiol, amina, carboxilato o fosfonato se pueden añadir a las nanopartículas, por ejemplo, MSNP, durante la síntesis mediante el uso de uno o más reactivos, por ejemplo, organosilanos tales como, pero sin limitación, (3-aminopropil)trietoxisilano y (3aminopropil)trimetoxisilano). Los organosilanos pueden añadirse antes o después de que los tensioactivos se eliminen de las MSNP. Reactivos análogos y otros reactivos orgánicos, tales como el glutatión, ácido mercaptopropiónico, DMSA, PEG-tiol, ácido oleico y dextrano se pueden emplear para modificar nanopartículas de óxido de hierro, nanopartículas de plata, nanopartículas de oro y nanotubos de carbono. Las nanopartículas funcionalizadas también se pueden comprar directamente, por ejemplo, nanotubos de carbono que tienen la superficie modificada con ácido carboxílico, amida, ácido poliaminobenceno sulfónico, octadecilamina y PEG se pueden adquirir de Sigma Aldrich.
Las nanopartículas resultantes, por ejemplo, MSNP después de la modificación de la superficie, pueden ser de cualquier tamaño apropiado, por ejemplo, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm, de 40 nm a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 nm o aproximadamente 60 nm. Los tamaños hidrodinámicos a modo de ejemplo se muestran en las Figuras 1C, 2A, 3A y 21D para nanoconstrucciones finales con núcleos de MSNP y la Figura 38A para nanoconstrucciones finales con núcleos de óxido de hierro.
Formulaciones de nanoconstrucciones y métodos de uso
Pueden formularse nanoconstrucciones, como se conoce en la técnica, para uso terapéutico, diagnóstico o en investigación. Normalmente, tales formulaciones para terapia o diagnóstico incluyen las nanoconstrucciones suspendidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las nanoconstrucciones pueden emplearse para usoin vivooex vivo.Los efectos de los agentes contenidos en la nanoconstrucción pueden tener lugar intracelular o extracelularmente. En particular, se pueden emplear nanoconstrucciones para administrar oligonucleótidos a las células para modular, por ejemplo, reducir, la expresión de un gen. Las nanoconstrucciones también pueden emplearse para administrar marcadores u otros agentes intracelularmente o dentro de un sitio extracelular.
Las nanoconstrucciones pueden usarse inmediatamente después de la formulación o pueden almacenarse. En algunas realizaciones, las nanoconstrucciones pueden liofilizarse en estados secos usando un lioprotector, tal como un azúcar como trehalosa. Las condiciones óptimas de trehalosa y liofilización pueden preservar la nanoconstrucción en términos de tamaño de partícula y carga (Figuras 22A-B) y eficacia en términos de eficacia de atenuación génica (Figuras 22C-D) en comparación con material recién preparado. Las nanoconstrucciones de la invención son estables durante al menos 6 meses cuando se liofilizan (Figuras 23A-23E).
Los expertos en la materia determinarán fácilmente las cantidades eficaces de una nanoconstrucción para la administración terapéutica, dependiendo de factores clínicos y específicos del paciente.
Estas y otras cantidades de dosificación unitaria eficaces pueden administrarse en una sola dosis, o en forma de múltiples dosis diarias, dosis semanales o mensuales, por ejemplo, en un régimen de dosificación de dos veces por semana durante un ciclo de 3 semanas. En realizaciones adicionales, las dosis pueden administrarse junto con otros regímenes de tratamiento en cualquier régimen de dosificación apropiado dependiendo de factores clínicos y específicos del paciente. La cantidad, el momento y el modo de administración de las composiciones de la invención que comprenden una cantidad eficaz para el tratamiento de enfermedades de una nanoconstrucción se ajustarán de manera rutinaria de forma individual, dependiendo de factores tales como el peso, la edad, el género y estado del individuo, la agudeza de la enfermedad y/o síntomas relacionados, si la administración es profiláctica o terapéutica, y basándose en otros factores conocidos que afectan a la administración de fármacos, absorción, farmacocinética, incluida la vida media, y eficacia.
Las formulaciones de la invención se seleccionarán normalmente para aproximarse a un régimen de dosificación mínimo que sea necesario y suficiente para prevenir o aliviar sustancialmente los síntomas de la enfermedad, incluido cáncer, fibrosis e inflamación en el sujeto mamífero, incluyendo seres humanos. La dosificación terapéutica y el protocolo de administración a menudo incluirán una dosificación repetida a lo largo de varios días o incluso una o más semanas o años. Un régimen de tratamiento eficaz también puede implicar una dosificación profiláctica administrada en un día o en múltiples dosis por día que dura en el transcurso de días, semanas, meses o incluso años.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir además un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado para el modo particular de administración que se está empleando. Las formas de dosificación de las composiciones de la presente invención incluyen excipientes reconocidos en la técnica de la composición farmacéutica como adecuados para la preparación de unidades de dosificación como se ha analizado anteriormente. Tales excipientes incluyen, sin limitación intencionada, aglutinantes, cargas, lubricantes, emulsionantes, agentes de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, conservantes, tampones, agentes humectantes, disgregantes, agentes efervescentes y otros excipientes y aditivos convencionales y/u otros aditivos que pueden mejorar la estabilidad, suministro, absorción, semivida, eficacia, farmacocinética y/o farmacodinámica, reducir los efectos secundarios adversos o proporcionar otras ventajas para el uso farmacéutico.
Algunas nanoconstrucciones de la invención están diseñadas para administración parenteral, por ejemplo para administrarse por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intratumoral, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal, incluyendo soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que, como muchas otras composiciones contempladas de la invención, pueden contener opcionalmente antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y/o solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del sujeto mamífero; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y/o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis. Las composiciones y formulaciones adicionales de la invención pueden incluir polímeros para liberación prolongada después de la administración parenteral. Las preparaciones parenterales pueden ser soluciones, dispersiones o emulsiones adecuadas para tal administración. Los agentes objeto también pueden formularse en polímeros para una liberación prolongada después de la administración parenteral. Las formulaciones e ingredientes farmacéuticamente aceptables serán normalmente estériles o fácilmente esterilizables, biológicamente inertes y fáciles de administrar. Tales materiales son bien conocidos por los expertos en las técnicas de composición farmacéutica. Las preparaciones parenterales suelen contener agentes de tamponamiento y conservantes, y fluidos inyectables que son farmacéutica y fisiológicamente aceptables, tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares. Soluciones de inyección extemporáneas, emulsiones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. Las formulaciones farmacéuticas unitarias preferidas son las que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del (de los) ingrediente(s) activo(s).
En algunas realizaciones, el vehículo tópico utilizado para administrar la nanoconstrucción es una emulsión, gel o pomada. En otras realizaciones, los compuestos terapéuticos como se describen en el presente documento pueden formularse en una formulación de pulverización.
Las emulsiones, tales como cremas y lociones son un sistema disperso que comprende al menos dos fases inmiscibles, una fase dispersada en la otra como gotas que varían en diámetro de 0,1 pm a 100 pm. Normalmente se incluye un agente emulsionante para mejorar la estabilidad. Cuando el agua es la fase dispersa y un aceite es el medio de dispersión, la emulsión se denomina emulsión de agua en aceite. Cuando un aceite se dispersa como gotitas por toda la fase acuosa como gotitas, la emulsión se denomina emulsión de aceite en agua. Las emulsiones, tales como cremas y lociones que pueden usarse como portadores tópicos y su preparación se divulgan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Loyd V. Allen 22a ed. 2012), incorporado en el presente documento por referencia.
Las pomadas pueden ser una preparación homogénea, viscosa, semisólida, más comúnmente un aceite graso, espeso (aceite 80 % - agua 20 %) con una alta viscosidad. La pomada se puede usar como emoliente o para la aplicación de ingredientes activos a la piel para fines de protección, terapéuticos o profilácticos donde se desea un grado de oclusión.
Unacrema es una emulsión de aceite y agua en proporciones aproximadamente iguales. Penetra bastante bien en la capa externa del estrato córneo de la piel. La crema es generalmente más delgada que la pomada y mantiene su forma cuando se retira de su recipiente.
El vehículo de una pomada/crema se conoce como la base de pomada. La elección de una base depende de la indicación clínica de la pomada. Los diferentes tipos de bases de pomada incluyen, pero sin limitación: bases hidrocarbonadas, p. ej., parafina dura, parafina blanda, cera microcristalina y ceresina; bases de absorción, p. ej., lanolina, cera de abeja; bases solubles en agua, por ejemplo, macrogoles 200, 300 y 400; bases emulsionantes, p. ej., cera emulsionante, aceites vegetales, p. ej., aceite de oliva, aceite de coco, aceite de sésamo, aceite de almendras y aceite de cacahuete. Los compuestos terapéuticos se dispersan en la base y luego se dividen después de que el fármaco penetra en la herida. Las pomadas/cremas se pueden formular incorporando bases hidrófobas, hidrófilas o emulsionantes en agua para proporcionar preparaciones que son inmiscibles, miscibles o emulsionables con las secreciones de la piel. También pueden derivarse de bases de hidrocarburos grasos, de absorción, extraíbles en agua o solubles en agua. Por ejemplo, una base de crema/pomada puede contener el ingrediente activo, vaselina blanca, agua, alantoína, EDTA, alcohol estearílico, Brij 721, Brij 72, metilcelulosas, miristato de isopropilo, monooleato de sorbitán, estearato de polioxilo 40, hidroxitolueno butilado, propilenglicol, metilparabeno, propilparabeno, agua desionizada hasta el 100 % y tampón hasta pH neutro, entre otros ingredientes.
En otra realización, el portador tópico utilizado para administrar un compuesto de la invención es un gel, por ejemplo, un gel bifásico o un gel monofásico. Los geles son sistemas semisólidos que consisten en suspensiones de pequeñas partículas inorgánicas o grandes moléculas orgánicas interpenetradas por un líquido. Cuando la masa de gel comprende una red de pequeñas partículas inorgánicas discretas, se clasifica como un gel bifásico. En algunas realizaciones, el líquido puede ser agua u otro medio acuoso y la masa de gel se define como un hidrogel. Los hidrogeles pueden incluir, pero sin limitación, alginatos, poliacrilatos, poli(óxidos de alquileno) y/o poli N-vinil pirrolidona. El hidrogel también puede ser amorfo, es decir, un gel viscoso en oposición a un sólido tal como una formulación de carboximetilcelulosa que contiene un humectante tal como propilenglicol o glicerina. Los hidrogeles amorfos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, maltodextra-beta glucano, acemanano, carboximetilcelulosa, pectina, goma xantana, colágeno, queratina y miel.
Las nanoconstrucciones pueden envasarse en cápsulas biodegradables para administración oral. Como alternativa, se puede instalar una suspensión de nanoconstrucción dentro de la vejiga. Esto es similar a la quimioterapia intravesical, en la que el fármaco administrado a la vejiga entrará en contacto directo con las células cancerosas en el revestimiento de la vejiga.
También se entenderá que la divulgación en el presente documento abarca composiciones de diagnóstico para diagnosticar el nivel de riesgo, la presencia, la gravedad, o indicios de tratamiento de, o de otra manera manejar enfermedades que incluyen, pero sin limitación, enfermedades neoplásicas poniendo en contacto una nanoconstrucción marcada (por ejemplo, marcada isotópicamente, marcada con fluorescencia o marcada de otra manera para permitir la detección del compuesto marcado usando métodos convencionales) con un sujeto mamífero (por ejemplo, con una célula, tejido, órgano o individuo) en riesgo o que presenta uno o más síntomas de una enfermedad de proliferación celular, tal como un cáncer, y posteriormente detectando la presencia, ubicación, metabolismo y/o estado de unión (por ejemplo, detectando la unión a una pareja de unión no marcada implicada en la fisiología/metabolismo del receptor de células malignas) del compuesto marcado usando cualquiera de una amplia gama de ensayos conocidos y métodos de marcación/detección. En realizaciones ilustrativas, una nanoconstrucción se marca isotópicamente al tener uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los compuestos divulgados incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. El compuesto marcado isotópicamente se administra a continuación a un individuo u otro sujeto y posteriormente se detecta como se ha descrito anteriormente, proporcionando datos útiles de gestión diagnóstica y/o terapéutica, de acuerdo con técnicas convencionales.
Las nanoconstrucciones se definen por las reivindicaciones y pueden incluir diversos restos terapéuticos, tales como agentes de direccionamiento, oligonucleótidos y/o moléculas pequeñas, y pueden tener propiedades terapéuticas intrínsecas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la nanoconstrucción (por ejemplo, una nanoconstrucción que contiene una MSNP) puede ser un antioxidante. La nanoconstrucción antioxidante puede administrar ARNip que puede reducir genes profibróticos tales como HSP47 y NOX4 como se muestra en las Figuras 31A-31D, disminuyendo los efectos adversos de las citocinas proinflamatorias tales como TGF-beta. Esto ha demostrado ser eficaz para disminuir los marcadores fibróticos tales como COL I y alfa-SMAin vitroy en modelos de ratón de enfermedad fibrótica. Cantidades de dosificación unitaria efectivas adecuadas de los compuestos activos para su administración a sujetos mamíferos, incluyendo los seres humanos, pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia. Por ejemplo, para ARNip, la cantidad puede variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg de ARNip/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,75 mg de ARNip/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mg de ARNip/kg por dosis y cualquier subconjunto de los mismos.
Las nanoconstrucciones que contienen un lantánido y/o un colorante fluorescente pueden usarse como sondas fluorescentes, de espectrometría de masas, de PET y/o de IRM para aplicaciones tantoin vitrocomoin vivo. In vitro,tales nanoconstrucciones pueden usarse para detectar o cuantificar proteínas objetivo en muestras de tejido o células mediante inmunofluorescencia, citometría de flujo o citometría de masa (véase, por ejemplo, Ejemplo XXIV). En estas aplicaciones, los agentes de direccionamiento en la nanoconstrucción se unirán específicamente con los receptores de proteínas en las células (por ejemplo, EGFR o HER2 en células cancerosas).In vivo,las nanoconstrucciones marcadas con trazadores de PET, quelatos de gadolinio, o que contienen un núcleo de nanopartículas de óxido de hierro se pueden usar como agentes de contraste de PET o IRM (véase, por ejemplo, Ejemplo XXVI) para detectar enfermedades (por ejemplo, cáncer o inflamación). Además, las nanoconstrucciones pueden transfectarse en células de interés (por ejemplo, células madre o células inmunitarias) antes de que tales células se infundan a los pacientes. Esto permite la monitorización de estas células contenidas en nanoconstrucciones a lo largo del tiempo mediante métodos no invasivos, tales como formación de imágenes de fluorescencia, PET e IRM.
Las nanoconstrucciones preparadas de nanopartículas de óxido de hierro y de plata se pueden usar en el tratamiento de hipertermia. Se ha demostrado que los campos magnéticos alternos y la irradiación calientan tales nanopartículas, aumentando la temperatura de los tumores (por ejemplo, hasta 40 °C) en los que se acumulan las nanoconstrucciones. Esto puede potenciar la liberación de carga y/o inducir la muerte de células cancerosas.
Las propiedades intrínsecas de las nanoconstrucciones pueden tener beneficios terapéuticos para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la propiedad antioxidante de la nanoconstrucción (de MSNP) puede modular las especies reactivas de oxígeno en las células cancerosas, dando como resultado una migración e invasión disminuidas de células cancerosas (véase, por ejemplo, Figuras 34A-34H). Este efecto también se confirmó en un modelo de ratón de metástasis, ya que se observó que la propagación del tumor se atenuó en ratones tratados con nanoconstrucción (véase, por ejemplo, Figuras 35A-35H).
Además, grupos amina, por ejemplo, de PEI en nanoconstrucciones, se sabe que son quelantes de cobre altamente efectivos. Se cree que el cobre es un cofactor para la angiogénesis y, por lo tanto, la metástasis en el cáncer (Breweret al.,2000). Por lo tanto, la nanoconstrucción de PEI puede proporcionar un beneficio terapéutico similar al observado para el tetratiomolibdato (TM, un quelante de cobre) en su ensayo clínico en pacientes con tumores sólidos metastásicos (Breweret al,2000). En este ensayo, cinco de los seis pacientes tratados con TM tenían una deficiencia leve de cobre (por ejemplo, según se evaluó basándose en una concentración sérica más baja de ceruloplasmina, un biomarcador para el estado de cobre corporal total) y logró una enfermedad estable. También observamos ceruloplasmina sérica reducida de acuerdo con la metástasis de cáncer atenuada y la carga tumoral con nuestra nanoconstrucción (véase, por ejemplo, Ejemplo XXIII).
Además del cáncer y la fibrosis, las nanoconstrucciones son capaces de administrar oligonucleótidos a las células para alterar la expresión génica (por ejemplo, a través de interferencia de ARN) y, por lo tanto, también pueden usarse para tratar otras enfermedades que implican una expresión génica aberrante. Los ARNip ilustrativos que se pueden incorporar en nanoconstrucciones de la invención pueden dirigirse a los genes enumerados en la Tabla 2, por ejemplo, para tratar las enfermedades correspondientes mostradas en la misma.
Tabla 2
Las nanoconstrucciones pueden usarse en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de mama. En algunas realizaciones, los tumores pueden ser resistentes a los anticuerpos monoclonales, inhibidores de molécula pequeña y/u otros agentes quimioterápicos, pero aún responden al ARNip administrado por nanoconstrucciones. En realizaciones adicionales, el ARNip se dirige a los mismos genes/proteínas a los que se dirigen los anticuerpos monoclonales y los inhibidores de moléculas pequeñas, pero la supresión de genes/proteínas con ARNip es superior a la de los anticuerpos o inhibidores de moléculas pequeñas y supera la resistencia del cáncer a los anticuerpos e inhibidores de moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, Ejemplo XIII).
En algunas realizaciones, se puede usar más de un agente terapéuti
nanoconstrucción. Por ejemplo, las Figuras 28A-28B muestran el efecto sinérgico o aditivo de la administración conjunta de trastuzumab (anticuerpo HER2), paclitaxel quimioterápico (PTX) y siHER2 en términos de destrucción de JIMT1, una célula de cáncer de mama HER2+ resistente a múltiples fármacos. En realizaciones adicionales, como se muestra en la figura 29, la carga de agentes quimioterápicos tales como paclitaxel (PTX) o doxorrubicina (DOX) no impacta negativamente en la capacidad del ARNip en la misma nanoconstrucción para silenciar los genes seleccionados como objetivo. La Figura 30 muestra la inhibición eficaz del crecimiento tumoral de HCC1954 en ratones tras el tratamiento con nanoconstrucción que contiene los tres agentes (T-siHER2-NP (PTX)).
Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento", "terapéutico" y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo. Se apreciará que, aunque no se excluye, tratar un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con los mismos se eliminen por completo.
Por "cantidad eficaz" se entiende la cantidad de un agente requerida para mejorar los síntomas de una enfermedad o detener la progresión de una enfermedad en relación con un sujeto no tratado o para marcar un objetivo, por ejemplo, proteína, célula o tejido, lo suficiente para la detección. La cantidad eficaz de un agente terapéutico activo para el tratamiento de una enfermedad o lesión varía dependiendo de la forma de administración, la edad, el peso corporal y el estado de salud general del sujeto.
Se pueden emplear fácilmente diversos ensayos y sistemas modelo para determinar la eficacia terapéutica en el tratamiento del cáncer, inflamación, fibrosis y otras enfermedades. Por ejemplo, la eficacia puede demostrarse usando un hemograma completo (CBC). Las mediciones tomadas en un CBC incluyen un recuento de glóbulos blancos (WBC), un recuento de glóbulos rojos (RBC), el ancho de distribución de glóbulos rojos, el hematocrito y la cantidad de hemoglobina. Algunos signos de cáncer que son visibles en un CBC incluyen un hematocrito bajo, una fuerte disminución en el número de plaquetas sanguíneas y un bajo nivel de neutrófilos. Una cantidad eficaz de una composición de la presente invención puede aumentar los niveles medidos en un hemograma completo en un 10 %, 20 %, 30 %, 50 % o aumento mayor, hasta un 75-90 % o un 95 % o más en comparación con individuos que no han sido tratados con las composiciones descritas en el presente documento. Las composiciones como se describen en el presente documento pueden ser eficaces para aumentar todo o algunas partes del hemograma completo en comparación con los tratados con placebo. Las cantidades eficaces también pueden mover la proteína sanguínea de un individuo hacia la categoría óptima para cada tipo de proteína.
La eficacia en el tratamiento de enfermedades neoplásicas también puede determinarse mediante una serie de métodos tales como, pero sin limitación, examen microscópico de células sanguíneas, aspiración y biopsia de médula ósea, análisis citogenético, biopsia, inmunofenotipado, estudios bioquímicos, análisis de biomarcadores tumorales en sangre, un hemograma completo, biopsia de ganglio linfático, frotis de sangre periférica, análisis visual de un tumor o lesión, o cualquier otro método de evaluación y/o diagnóstico de neoplasias malignas y progresión tumoral conocidos por los expertos en la materia.
La eficacia de las composiciones y métodos en el presente documento en el tratamiento del cáncer u otra enfermedad puede evaluarse mediante la detección de marcadores en la sangre dependiendo del cáncer específico.
Dentro de aspectos adicionales de la invención, se proporcionan formulaciones combinatorias para el tratamiento de enfermedades y métodos de administración coordinada que emplean una cantidad eficaz de una nanoconstrucción y uno o más agentes secundarios o adyuvantes que se formulan de manera combinatoria o se administran de manera coordinada con la nanoconstrucción para producir una composición combinada, de tratamiento de enfermedades multiactivas o método de tratamiento coordinado.
Las formulaciones combinatorias ilustrativas y los métodos de tratamiento coordinado en este contexto emplean la nanoconstrucción, en combinación con uno o más agentes antitumorales secundarios, o con uno o más agentes terapéuticos adyuvantes que son útiles para el tratamiento o profilaxis de la enfermedad seleccionada como objetivo (o asociada), afección y/o síntoma(s) en la formulación combinatoria seleccionada o régimen de tratamiento coordinado. Para la mayoría de las formulaciones combinatorias y métodos de tratamiento coordinados de la invención, se formula o administra coordinadamente una nanoconstrucción, en combinación con uno o más agentes terapéuticos complementarios, para producir una formulación combinada o un método de tratamiento coordinado que sea combinatoriamente eficaz o coordinadamente útil para tratar enfermedades neoplásicas y uno o más síntomas de una enfermedad o afección secundaria en el sujeto. Las formulaciones combinatorias ilustrativas y los métodos de tratamiento coordinado en este contexto emplean una nanoconstrucción, en combinación con uno o más agentes terapéuticos secundarios o complementarios seleccionados de, por ejemplo, agentes quimioterápicos, agentes antiinflamatorios, doxorrubicina, vitamina D3, citarabina, daunorrubicina, ciclofosfamida, gemtuzumab ozogamicina, idarrubicina, mercaptopurina, mitoxantrona, tioguanina, aldesleucina, asparaginasa, carboplatino, fosfato de etopósido, fludarabina, metotrexato, etopósido, dexametasona y trisalicilato de magnesio y colina. Además, las terapias secundarias pueden incluir, pero sin limitación, tratamiento de radiación, terapia hormonal y cirugía.
En realizaciones ilustrativas, una nanoconstrucción y otro agente estarán presentes cada uno en una cantidad de tratamiento/prevención de la enfermedad (es decir, en una dosis singular que por sí sola provocará un alivio detectable de los síntomas en el sujeto). Como alternativa, la formulación combinatoria puede comprender uno o ambos de nanoconstrucción y otro agente (en donde el otro agente no es una nanoconstrucción) en cantidad(es) de dosificación singular(es) subterapéutica(s), en donde la formulación combinatoria que comprende ambos agentes presenta una dosificación combinada de ambos agentes que es colectivamente eficaz para provocar la respuesta deseada.
Para poner en práctica los métodos de administración coordinada de la invención, se puede administrar una nanoconstrucción, simultánea o secuencialmente, en un protocolo de tratamiento coordinado con uno o más de los agentes terapéuticos complementarios contemplados en el presente documento. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un compuesto se administra de manera coordinada con otro agente y cualquier otro agente terapéutico secundario o adyuvante contemplado en el presente documento, usando formulaciones separadas o una formulación combinatoria como se ha descrito anteriormente (es decir, que comprende tanto una nanoconstrucción como otro agente). Esta administración coordinada puede realizarse de manera simultánea o secuencial en cualquier orden, y puede haber un período de tiempo mientras solo uno o ambos (o todos) los agentes terapéuticos activos ejercen individualmente y/o colectivamente sus actividades biológicas. En otra realización, tales métodos de tratamiento coordinado se derivan de protocolos para la administración de uno o más agentes quimioterápicos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por cualquier medio que logre su fin terapéutico o profiláctico previsto. Las vías de administración adecuadas para las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación, vías de administración convencionales, dispositivos y métodos que incluyen métodos inyectables tales como, pero sin limitación, vías intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intraarterial, subcutánea e intranasal. Los medios de administración adicionales comprenden la administración tópica.
Los aspectos y aplicaciones de la invención presentados en este caso se describen en los dibujos yDescripción de la invencióndetallada. A menos que se indique específicamente, se pretende que a las palabras y expresiones en la memoria descriptiva y las reivindicaciones se les dé su significado simple, ordinario y habitual para aquellos con conocimientos ordinarios en las técnicas aplicables.
En los siguientes ejemplos, y para fines de explicación, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de los diversos aspectos de la invención. Se entenderá, sin embargo, por los expertos en las técnicas pertinentes, que la presente invención puede ponerse en práctica sin estos detalles específicos. En otros casos, las estructuras y dispositivos conocidos se muestran o analizan de manera más general para evitar oscurecer la invención. Cabe señalar que existen muchas configuraciones, dispositivos y tecnologías diferentes y alternativos a los que se pueden aplicar las invenciones divulgadas. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de métodos divulgados. A la luz de esta divulgación, los expertos en la técnica reconocerán que serían posibles variaciones de estos ejemplos y otros ejemplos del método divulgado sin experimentación excesiva.
Ejemplos
Ejemplo I
Síntesis de núcleos de nanopartículas uniformes
La síntesis de sol-gel de núcleos de nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNP) se modificó a partir de informes anteriores (L. Panet al.,2012; I. Slowinget al.,2007). Para MSNP de 47 nm, nanopartícula (NP) (S-47), se mezclaron cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) 0,15 M y 350 pl de trietanolamina (TEA) en 125 ml de agua a 95 °C. Entonces, se añadieron 3 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) y la mezcla se agitó durante una hora. Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma Aldrich, Estados Unidos.
Después de la mezcla, los sedimentos se recuperaron de la suspensión por centrifugación, se lavaron con una gran cantidad de etanol y se secaron durante la noche. A continuación, las partículas se resuspendieron y se sometieron a reflujo en metanol ácido (HCl 0,6 M en metanol) durante la noche para eliminar CTAC y TEA. A continuación, las MSNP desnudas se lavaron con etanol y se secaron en un desecador durante la noche. El tamaño de MSNP (seco) se midió con TEM (Phillips/FEI CM120/Biotwin TEM, Hillsboro, OR) y el tamaño hidrodinámico con Zetasizer (ZS-90/Malvern, Malvern, Reino Unido). Variar la cantidad de TEA de 200-450 pl por 125 ml de solución de reacción mientras se mantiene constante la concentración de CTAC a 0,15 M dio como resultado MSNP de diferentes tamaños de partículas; por ejemplo, de 61 ± 7 nm a 47 ± 4 nm y 34 ± 3 nm (tamaño seco por TEM) como se muestra en la Figura 1A.
Se crearon múltiples lotes individuales de nanopartículas de sílice mesoporosas para determinar la reproducibilidad de la síntesis de nanopartículas. Como se muestra en la Tabla 3, el tamaño hidrodinámico del núcleo de MSNP S-47 es altamente reproducible, por ejemplo, con una desviación estándar relativa (RSD) del 2,4 % a partir de 6 lotes.
T l : R r i ili l ín i n n r í l .
continuación
Ejemplo II
Síntesis de núcleos de nanopartículas no uniformes
Las MSNP no uniformes (O-87) se sintetizaron en presencia de una base fuerte. Se disolvió bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) 6mM en 240 ml de solución acuosa de pH 11,0 (ajustado por NaOH 2 M). Cuando la temperatura se estabilizó a 80 °C, se añadieron 2,5 ml de TEOS y la reacción continuó durante 2 horas. Después de la mezcla, los sedimentos se recuperaron de la suspensión por centrifugación, se lavaron con una gran cantidad de etanol y se secaron durante la noche. A continuación, las partículas se resuspendieron y se sometieron a reflujo en metanol ácido (HCl 0,6 M en metanol) durante la noche para eliminar CTAB. A continuación, las MSNP desnudas se lavaron con etanol y se secaron en un desecador durante la noche. El tamaño de MSNP (seco) se midió con TEM (Phillips/FEI CM120/Biotwin TEM, Hillsboro, OR) y el tamaño hidrodinámico con Zetasizer (ZS-90/Malvern, Malvern, Reino Unido). Estos núcleos de nanopartículas no uniformes tenían un tamaño de 87 ± 14 nm (véase, por ejemplo, Figura 1A).
Las MSNP preparadas a partir de los Ejemplos I y II se recubrieron capa por capa con PEI reticulada o no reticulada, PEG y anticuerpo de direccionamiento. Las nanoconstrucciones se cargaron a continuación con carga de ARNip como se indica en los Ejemplos III-VI. La caracterización de las composiciones, el tamaño y la carga de las nanoconstrucciones se resumen en el Ejemplo VII. La Figura 1B proporciona una ilustración esquemática de tal decoración de superficie, y la figura 1C muestra el tamaño de diversas nanoconstrucciones que usan diferentes núcleos de MSNP; todos los cuales se modificaron en la superficie con PEI de 10 kDa (reticulada para MSNP S-34, S-47 y S-61; no reticulada para MSNP O-87), PEG de 5 kDa, trastuzumab (anticuerpo He R2) y ARNip, respectivamente. La Figura 1C indica que el núcleo de S-47 produjo el tamaño hidrodinámico más deseable de la nanoconstrucción final.
Ejemplo III
Unión de polietilenimina (PEI) a MSNP y métodos de reticulación
Las MSNP preparadas como se describe en los Ejemplos I y II se recubrieron con PEI agitando 10 mg de MSNP y 2,5 mg de PEI en solución de etanol durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, la PEI-MSNP se granuló. El material se sometió a continuación a la unión de PEG en el Ejemplo IV o a la reticulación de PEI primero antes de la unión de PEG. Para el método de reticulación de PEI, la PEI-MSNp se resuspendió en una solución de etanol que contenía 0 o 2,0 mg de PEI (10 kDa) y 0,1-0,5 mg/ml de DSP (DSP; ditiobis [propionato de succinimidilo]; reactivo de Lomant) como reticulante. La solución se agitó durante otros 40 minutos. Las partículas se sedimentaron, lavaron y resuspendieron en PBS (pH 7,2). Los tamaños hidrodinámicos de los materiales preparados bajo estas diversas condiciones de reticulación se muestran en la Figura 2A, en la que el uso de 0,1 mg/ml de DSP y 2 mg de PEI durante la reticulación produjo el tamaño más deseable (similar a ningún reticulante), mientras que la reticulación sola sin introducir 2 mg de p E i provoca agregados debido a la reticulación entre partículas.
Ejemplo IV
Unión de polietilenglicol (PEG) a MSNP
Se usó Mal-PEG-NHS para unir PEG en las nanopartículas (a través de un éster NHS). Para la carga de PEG, se conjugaron 50 mg de mal-PEG-NHS a la amina primaria de PEI-MSNP (10 mg como MSNP) del Ejemplo III (usando PEI-MSNP reticulada o no reticulada) en tampón PBS con agitación (20 h, TA).
Relaciones de PEG:MSNP.Para reducir el uso de Mal-PEG-NHS costoso, Mal-PEG-NHS puede disolverse primero en DMF o añadirse como un polvo seco directamente a la suspensión de PEI-MSNP en PBS para limitar la hidrólisis de NHS y mejorar la eficacia de carga de PEG y reducir el tiempo de reacción. Esto reduce el Mal-PEG-NHS en 5 veces a una relación en peso de 1:1 de Mal-PEG-NHS por MSNP y reduce el tiempo de reacción de 20 h a 1,5 h. Por ejemplo, se resuspendieron 10 mg de PEI-MSNP en 1 ml de PBS. Después, se añadieron 10 mg de Mal-PEG-NHS (como un polvo) a la solución de PEI-MSNP. A continuación, la mezcla se agitó en vórtex durante un minuto y se sometió a ultrasonidos durante cinco minutos para garantizar la resuspensión. A continuación, la mezcla se agitó adicionalmente durante 1,5 horas. Las nanoconstrucciones resultantes se recuperaron posteriormente por centrifugación y se lavaron como se ha mencionado anteriormente. Este método de polvo seco evita el uso de disolvente DMF potencialmente dañino y, por lo tanto, es preferible. Produce una carga de PEG similar (por ejemplo, aproximadamente el 18 %, Tabla 5) y protección de ARNip (Figura 6E) como aquellos que usan 5:1 de relación de Mal-PEG-NHS por MSNP (véanse las Figuras 6A-C). La eficacia de silenciamiento de luciferasa usando estos dos materiales para administrar ARNip contra luciferasa (siLUC) (método descrito en el Ejemplo VIII) también es la misma (Figura 3A).
Pesos moleculares de PEG.También se optimizaron diferentes pesos moleculares de PEG. Se probaron PEG con diferentes pesos moleculares (2, 5, 7,5 y 10kDa). La función de PEG es proporcionar una capa sigilosa a la nanopartícula, por lo tanto, una densidad más alta de carga de PEG (conformación similar a un cepillo) es más deseable que una densidad más baja de carga de PEG (conformación de bobina aleatoria). La Figura 3B muestra que el PEG de 2 kDa no es suficiente para evitar que las nanoconstrucciones de ARNip se agreguen en partículas más grandes. Un PEG de 5 kDa y superior parece evitar la agregación de manera efectiva. Las cantidades de PEG cargadas en nanoconstrucciones con 5, 7,5 y 10 kDa se cuantificaron con el TGA en el 18 %, 10 % y 12 % en masa, respectivamente. En molaridad, el PEG de 5 kDa tiene una carga aproximadamente tres veces mayor en las nanoconstrucciones que las contrapartes de 7,5 kDa o 10 kDa. La baja carga molar de los PEG de mayor peso molecular sugiere que la conformación de PEG no es similar a un cepillo en las cadenas de PEG de mayor peso molecular. El PEG de 5 kDa proporcionó la carga de PEG más alta, lo que sugiere una condición de sigilo similar a un cepillo óptima para nuestras nanoconstrucciones y se utilizó a lo largo de los estudios.
Ejemplo V
Conjugación de agentes de direccionamiento (anticuerpo, fragmento de anticuerpo, ácido fólico) en MSNP-PEI-PEG
Anticuerpo.La conjugación de anticuerpos de MSNP-PEI-PEG utilizó una reacción de tiol-maleimida modificada de la bibliografía (P. Yousefpouret al.,2011, M. N. Koopaeiet al.,2011). En primer lugar, el anticuerpo (por ejemplo, trastuzumab (T), cetuximab (C) o rituximab (R)) se tioló con reactivo de Traut (2-iminotiolano) en PBS (pH 8,0) con agitación con un exceso molar de 50 veces del reactivo de Traut durante 2 horas y luego se purificó por columna de centrifugación Zeba - PM -40.000 (Thermo Fisher Scientific). A continuación, el anticuerpo tiolado se mezcló con MSNP-PEI-PEG en una relación de masa de anticuerpo:nanopartícula de 1:1 a 1:50. La reacción se completó durante la noche a 4 °C en condiciones de agitación (300 rpm). El material se peletizó, se resuspendió en PBS y se lavó con una gran cantidad de PBS. La Figura 4A muestra el efecto de destrucción celular (método descrito en el Ejemplo XII) al administrar siHER2 (ARNip contra HER2) con T-NP que tiene diferente % en peso de trastuzumab. La Figura 4B muestra el grado de absorción celular (método descrito en el Ejemplo XI) de T-NP que tiene diferente % en peso de trastuzumab en la línea celular BT474 (HER2+). Se puede ver que la relación de masa de anticuerpo:nanopartícula de 1:20 y 1:10 puede mejorar igualmente la absorción celular de T-NP, pero la muerte celular comenzó a reducirse si se usaba muy poco anticuerpo. Para una compensación óptima de coste y eficacia, se seleccionó una relación de 1:10 y se usó en todo momento a menos que se especifique lo contrario.
Fragmento de anticuerpo (scFV).El fragmento de anticuerpo se puede conjugar a la nanopartícula de manera similar con el anticuerpo. Las bacterias que expresan un clon de scFv de HER2 (Poulet al.,2000) se cultivaron durante la noche seguido de expansión en el segundo día y estimulación con IPTG (tiogalactopiranósido) para producir proteína scFv. El cultivo se agrupó posteriormente y el scFv unido periplásmico se extrajo y se purificó en una columna de Ni-NTA de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de scFv se determinó usando un espectrómetro Nanodrop UV-Vis y la pureza se verificó mediante electroforesis en gel. La Figura 21A muestra la purificación exitosa de scFv de HER2 como se indica por la banda específica de 25 kD de scFv en la muestra purificada en comparación con el eluyente no purificado y de lavado. La Figura 21B muestra la verificación adicional de la identidad de scFv sondeando con un anticuerpo que reconoce específicamente la etiqueta de histidina 6x presente en el extremo c de la molécula de scFv. La Figura 21C muestra que el scFV de HER2 es específico de las células HER2+ (BT474, SKBR3, JIMT1) sobre células HER2- (MCF7 y m Da MB468). Los scFv se unen al extremo de la cadena de PEG en nanoconstrucciones acoplando cisteína del scFv al grupo maleimida en MSNP-PEI-PEG. La caracterización de proteínas indicó el 0,4 % en peso de scFV por nanopartícula. La Figura 21D muestra el tamaño de nanopartículas conjugadas con scFV de HER2 cargadas con un 3 % en peso de ARNip; el tamaño se midió en PBS. La Figura 21E muestra la eficacia de silenciamiento de luciferasa (experimento descrito en el Ejemplo VIII) de nanopartículas cargadas con diferente cantidad de scFV en solución (1 % o 4 %, ambas dando como resultado una carga del 0,4 % en peso de scFv por nanopartícula).
Ácido fólico.El éster NHS-PEG-ácido fólico (FA) se obtuvo comercialmente de Nanocs. NHS-PEG-FA se unió a las nanopartículas (a través de un éster NHS) de manera similar al Ejemplo IV. Se conjugaron 2,5 mg de NHS-PEG(5 kD)-FA con la amina primaria de PEI-MSNP reticulada (10 mg) del Ejemplo III en tampón PBS con agitación (1,5 horas, TA). Se añadió NHS-PEG(5 kD) (5-20 mg) para estabilizar adicionalmente (unirse con) la superficie activa de amina restante durante otra hora. La Figura 21D muestra el tamaño hidrodinámico de FA-siHER2-NP, y la Figura 21E muestra la eficacia de silenciamiento de luciferasa del material.
Ejemplo VI
Carga de ARNip en el agente de direccionamiento conjugado con MSNP-PEI-PEG o MSNP-PEI-PEG
La carga de ARNip se logró mezclando MSNP-PEI-PEG conjugado con trastuzumab (designado como T-NP) o MSNP-PEI-PEG (NP) y ARNip en una relación de masa de nanopartícula/ARNip (NP/ARNip) de 10 a 100 en solución de PBS (0,5 a 1 hora, temperatura ambiente, agitación a 200 rpm), lo que dio como resultado una unión completa (no quedó ARNip en el sobrenadante) según se monitorizó mediante el método fluorescente y electroforesis en gel (véase el Ejemplo VII). Asimismo, la carga de ARNip en scFV de HER2-NP y FA-NP se realizó de manera similar.
Ejemplo VII
Caracterización de nanoconstrucciones
Después de la modificación de la superficie, las nanoconstrucciones tenían un tamaño hidrodinámico de -100 nm para los tres materiales de núcleo de tamaño uniforme (S-34, S-47, S-61) y 200 nm para el material de núcleo de tamaño no uniforme (O-87) en agua como se muestra en la Tabla 4 y los histogramas de distribución de tamaño se muestran en la Figura 1C. Todos los materiales están cargados positivamente debido a la PEI. Todos los materiales tienen una distribución de tamaño bastante estrecha (PDI de aproximadamente 0,2) con la excepción de S-34. Las cargas de PEI y PEG se analizaron mediante análisis termogravimétrico (TGA Q50, TA Instruments, DE). Se usó el kit Pierce Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar la carga de anticuerpos o scFV en las nanoconstrucciones analizando los anticuerpos restantes (no unidos) en el sobrenadante. Asimismo, se usó el análisis fluorescente del ARNip marcado con Dylight677 restante en el sobrenadante para cuantificar la carga de ARNip y se confirmó mediante electroforesis en gel. La composición de dos materiales representativos se resume en la Tabla 5.
Tabla 4: Tamaño TEM tamaño hidrodinámico otencial zeta de seis nanoconstrucciones diferentes.
Tabla 5: Com osición de T-ARNi -NP
Ejemplo VIII
Eficacia de atenuación génica de ARNip en diversas nanoconstrucciones
La línea celular LM2-4luc+/H2N (que sobreexpresa luciferasa y HER2; J. M. du Manoiret al.,2006) se usó para la evaluación inicial de las nanopartículas para la eficacia de silenciamiento génico cuando se administra ARNip contra luciferasa (siLUC). Las células se sembraron en placas a 3000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Un día después de la siembra, las células se trataron con nanopartículas de siLUC. Las nanopartículas se cargaron con siLUC en una relación NP/ARNip de 25 o 50 en masa. Se aplicaron a cada pocillo a una dosis fija de siLUC 30 nM. El agente de transfección disponible comercialmente, DharmaFECT (Dharmacon, Lafayette, CO), con la misma dosis de siLUC sirvió como control positivo. Se usó ARNip no dirigido o aleatorizado (siSCR) en todo momento como control negativo. Después de la incubación durante la noche (~20 horas), las células se lavaron una vez para eliminar las nanoconstrucciones y se repusieron con un medio completo. A las 48 horas después del tratamiento, las células se lisaron y analizaron para determinar la actividad de luciferasa mediante el kit de ensayo Luciferase Glow (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y la concentración de proteínas mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific), siguiendo los protocolos del fabricante. La actividad de luciferasa del lisado se normalizó con la concentración de proteína correspondiente en el mismo pocillo y se informó como un porcentaje de los controles no tratado o con siSCR. Todos los tratamientos se realizaron con réplicas.
Relación de NP/ARNip.Se compararon diferentes nanoconstrucciones (cuatro tamaños de núcleo, cargados con PEI de 1,8 kDa o 10 kDa, reticulada o no reticulada) para determinar la eficacia de silenciamiento de luciferasa como se muestra en la Figura 5A y B para NP/ARNip de 25 y 50, respectivamente. La eficacia de silenciamiento se define como el nivel de luciferasa reducido debido al tratamiento con siLUC frente al control con siSCR. Los materiales con NP/ARNip de 50 ofrecieron una mejor eficacia de silenciamiento génico (por la misma dosis de siLUC) (Figura 5B) que aquellos con NP/ARNip de 25 (Figura 5A) debido al mayor número de nanopartículas a las que se expusieron las células. A continuación, se usaron materiales con una relación de masa de NP/ARNip de 50 a menos que se especifique lo contrario.
Tamaño de núcleo.Las partículas más pequeñas, sin reticulación tenían una eficacia de silenciamiento reducida en comparación con las partículas más grandes (por ejemplo, véase S-61 frente a O-87, ambos se modificaron con PEI de 10 kDa, designada como T-NP10 en la Figura 5).
Reticulación.En la figura 5, la reticulación de hecho aumentó la eficacia de silenciamiento (por ejemplo, T-NP10C frente a T-NP10 en S-61). El tamaño de núcleo más pequeño (S-34) dio como resultado la agregación (Figura 1C) y menos eficacia de silenciamiento (Figura 5A). El mejor tamaño hidrodinámico (Figura 1C) y la mejor eficacia de silenciamiento (Figura 5) se lograron con S-47, modificado con PEI de 10 kDa y con reticulación (véase T-NP10C en S-47) y se usa en todo el documento y se denomina "T-NP" a menos que se especifique lo contrario.
Además, cuando se compara con el poliplejo de PEI-ARNip (sin núcleo de MSNP), T-NP fue superior en términos de tamaño y eficacia de silenciamiento de luciferasa, como se muestra en la Figura 7A y B, respectivamente.
Ejemplo IX
Capacidad de tamponamiento de nanoconstrucciones de PEI reticulada
Las nanopartículas internalizadas finalmente terminan en vesículas lisosomales perinucleares. Los ARNip deben escapar de estas vesículas al citosol para silenciar la expresión. El aumento de la capacidad de tamponamiento de las nanopartículas pequeñas para aumentar la liberación endosomal de ARNip basándose en el principio del efecto de esponja de protones se logró mediante la reticulación de PEI.
Como se describe en el Ejemplo III, la condición de reticulación de PEI óptima era 0,1 mg/ml de DSP con 2 mg de PEI (libre) añadidos a la solución de unión. Para medir la capacidad de tamponamiento de materiales reticulados y no reticulados, las nanopartículas se suspendieron a 0,2 mg/ml en NaCl 150 mM (pH 9, pH ajustado con NaOH 0,05 M). Tras la estabilización a pH 9,0, se añadieron 5 pl de HCl 0,05 M y la solución se agitó continuamente. Al alcanzar el estado estacionario, se registró el pH y se añadió de nuevo el ácido. El proceso se repitió hasta que el pH se estabilizó en aproximadamente 3,0. A continuación, se informó el pH de la solución como una función de la cantidad de ácido añadido.
La Figura 2B muestra las capacidades de tamponamiento de nanopartículas con PEI de 1,8 kDa reticulada (T-NP18C), PEI de 10 kDa reticulada (T-NP10C) y PEI de 10 kDa no reticulada (T-NP10) en NaCl 150 mM. Como se muestra en la Figura 2B, las nanopartículas tenían una capacidad de tamponamiento del orden de T-NP10C > T-NP10 > T-NP18C. La reticulación de la PEI en la nanoconstrucción crea más aminas secundarias y terciarias que producen una mayor capacidad de tamponamiento que las aminas primarias y promueven un mayor escape endosomal de ARNip basándose en la teoría del efecto de esponja de protones. Esto concuerda bien con la eficacia superior de silenciamiento génico de los materiales reticulados descritos en el Ejemplo VIII.
Ejemplo X
Ensayo de protección sérica
Las nanopartículas de ARNip se incubaron con suero humano al 50 % v/v en PBS durante un período de tiempo específico (0, 0,5, 1,2, 4, 8, 24 y 48 horas) a 37 °C con agitación continua. Al final de cada punto de tiempo, la muestra se mezcló con proteinasa K (200 pg/ml) y se congeló a -80 °C para detener la reacción enzimática. Para el análisis, las muestras se descongelaron y se mezclaron con SDS al 1,0 % en peso para liberar ARNip de las nanopartículas. A continuación, la muestra se mezcló con una cantidad igual de tampón de carga 2X y se cargó en un gel de TBE-urea al 15% (BioRad). El gel funcionó a 100 V durante los primeros 20 minutos y a 150 V durante otra hora. A continuación, el gel se tiñó con SyBR Gold (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante y se observó en una cámara UV. La intensidad de banda se analizó mediante el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). La fracción de ARNip intacto se informó como una función del tiempo que las nanopartículas de ARNip estuvieron en suero al 50 %. Estos resultados se compararon con los obtenidos para siHER2 libre sin nanopartículas.
La Figura 6A muestra la cantidad de siHER2 intacto que sobrevivió a la degradación enzimática medida por electroforesis en gel. La cuantificación de siHER2 correspondiente basándose en la intensidad y ubicación de la banda se muestra en la Figura 6B. Sin las nanopartículas, el siHER2 desnudo se degradó en 0,5 horas (observado como bandas desplazadas hacia un peso molecular más bajo), y su vida media fue de aproximadamente 1 hora, de acuerdo con informes anteriores para otros ARNip (A. Manteiet al.,2008; DM Dykxhoornet al.,2006). T-siHER2-NP18C protegió totalmente siHER2 al menos 8 horas, mientras que T-siHER2-NP10C protegió totalmente siHER2 al menos 24 horas. El ARNip en ambas plataformas de nanopartículas experimentó mucha menos degradación que en la nanopartícula basada en ciclodextrina que se sometió a ensayos clínicos y mostró eficacia antitumoral (M. E. Davis, 2009). El ARNip en dicho material experimentó una degradación del 50 % en 12 horas y del 70 % en 24 horas en condiciones de suero al 50 % (DW Bartlettet al.,2007).
La mayor protección de ARNip para T-siHER2-NP10C en comparación con T-siHER2-NP18C es probable que se deba al mayor contenido de PEG de T-siHER2-NP10C, por ejemplo, el 18,2 % frente al 6,1 % (Tabla 5). PEG proporciona un efecto de bloqueo estérico (Z. Zhanget al.,2007; R. Gref, 2000) que reduce la degradación enzimática de ARNip (S. Maoet al.,2006). En un experimento separado (Figura 6C), sin p Eg , el ARNip en PEI-MSNP se degradó más rápido que el ARNip desnudo, ya que la PEI cargada positivamente reclutó más enzimas cargadas negativamente para degradar el ARNip. Además, sin PEG estérico, se observó una agregación significativa de la nanoconstrucción cargada con ARNip (Figura 6D). El efecto estérico de PEG también reduce la unión de proteínas sanguíneas a las nanopartículas (R. Gref, 2000).
Ejemplo XI
Análisis de absorción celular
Las células se recogieron y se resuspendieron en 1 millón de células/150 pl/tubo. Cada tubo se mezcló con 150 pl de nanoconstrucciones de siSCR (etiquetadas con Alexa-488) en PBS (que contenían 100 pg de nanopartículas). Tras la adición de nanoconstrucción, las células se colocaron en un balancín en la incubadora de células (37 °C, 5 % de CO2) durante 0,5 o 2,0 horas. A continuación, las células se lavaron (centrifugar a 115 g, 5 min) con 1 ml de tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato 1X (libre de Ca/Mg++) EDTA 1 mM HEPES 25 mM pH 7,0 FBS al 1 % (inactivado por calor) tres veces. A continuación, las células se resuspendieron en 550 pl de tampón FACS, se transfirieron a un tubo de 5 ml y se mantuvieron en hielo hasta el análisis. Para células teñidas con anticuerpo libre (para fines de activación), la marcación de anticuerpos se realizó en hielo y en condiciones de balanceo. Las células se tiñeron con anticuerpo primario (trastuzumab o rituximab: 2 pg por tubo) durante una hora, se lavaron con PBS, se tiñeron con anticuerpo secundario (Anti-human Alexa 488: 2 pg por tubo) durante 45 minutos, luego se lavaron 2 veces con PBS y se resuspendieron en 550 pl de tampón FACS antes del análisis. Todos los tubos se contratiñeron para ADN celular con 2 pl de DRAQ5 5 mM (señalización celular) durante 15 minutos en hielo. Todos los tubos (excepto las células marcadas con anticuerpos para fines de activación) se incubaron con 500 pl de azul de tripano (0,4 % en PBS) para extinguir la fluorescencia fuera de las células y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Se analizaron 10.000 eventos (células) para cada muestra. La intensidad se procesó con el software FlowJo (NIH, Bethesda, MD).
Se evaluó la especificidad con la que las nanoconstrucciones conjugadas con trastuzumab fueron absorbidas por células que sobreexpresan la proteína HER2. La nanoconstrucción contenía un ARNip aleatorizado y conjugado con trastuzumab (designado en lo sucesivo en el presente documento como T-siSCR-NP18C y T-siSCR-Np10C) o con rituximab que se dirige a CD20 (designado como R-siSCR-NP18C y R-siSCR-NP10C). La absorción celular de T-siSCR-NP10C y T-siSCR-NP18C en células de cáncer de mama HER2+, Bt 474 y SKBR3, y la línea celular HER2- MCF-7 se midió a las 0,5 o 2,0 horas después de la exposición a las nanoconstrucciones. El siSCR se etiquetó con el indicador fluorescente, Alexa 488, para que estos experimentos permitan el análisis cuantitativo de la absorción de siSCR. R-siSCR-NP10C y R-siSCR-NP18C sirvió como control negativo puesto que las células BT474, SKBR3 y MCF-7 no sobreexpresan CD20. La cantidad de siSCR marcado con Alexa 488 dentro de las células individuales se midió usando citometría de flujo. La Figura 8A-C muestra que T-siSCR-NP10C se absorbieron eficazmente (>90 %) en células HER2+ (BT474 y SKBR3), pero no en células HER2- (MCF7) y esa absorción aumentó al extender el tiempo de exposición de 0,5 h a 2 h. Además, la absorción de T-siSCR-NP10Cfue mayor que T-siSCR-NP18C. R-siSCR-NP10Cy R-siSCR-NP18C no se absorbieron de manera eficaz por ninguna de las líneas celulares, lo que indica la capacidad de T para promover la absorción celular para las células HER2+. La Figura 8D ilustra la expresión de la proteína HER2 en las tres líneas celulares que se están evaluando. La Figura 8E-G muestra la intensidad promedio de la señal de siSCR etiquetada con Alexa 488 por célula y puede observarse la misma tendencia. Esto confirma que las nanoconstrucciones conjugadas con trastuzumab entran en las células principalmente por un mecanismo de endocitosis mediado por el receptor HER2 y no por endocitosis de adsorción de partículas cargadas positivamente como se informa para PEI-MSNP (H. Zhang,et al.,2011).
Como otro ejemplo, se usó cetuximab (anticuerpo anti-EGFR) como agente de direccionamiento en la nanoconstrucción, denominado C-NP, de manera similar a T-NP. C-NP también mostró absorción preferencial en células EGFR+ sobre células EGFR- (Figuras 8H-I).
Ejemplo XII
Atenuación de la proteína HER2 y viabilidad celular
Se sembraron células de cáncer de mama HER2+ (BT474, SKBR3 y HCC1954) en una placa de 96 pocilios durante 24 horas antes del tratamiento. Las nanoconstrucciones se cargaron con siHER2 o siSCR en NP/ARNip 50. La dosis de ARNip se fijó en 60 nM. Los medios se cambiaron a medios completos después de la incubación durante la noche. Tres días después del tratamiento con nanoconstrucciones, las células se fijaron y analizaron para determinar la expresión de la proteína HER2 mediante inmunofluorescencia. Los niveles de ARNm de HER2 y de ARNm de p-actina se analizaron 48 horas después del tratamiento usando el sistema de reactivos Quantigene 2.0 (Panomics) siguiendo el protocolo del fabricante. El nivel de ARNm de HER2 se normalizó a continuación con ARNm de p-actina (gen constitutivo) y se informó como el porcentaje del control con siSCR. La viabilidad celular y la apoptosis se analizaron cuatro días después del tratamiento usando el ensayo luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) y los sistemas de ensayo Caspase-Glo® 3/7 (Promega), respectivamente. La actividad caspasa se normalizó con la viabilidad celular. Ambos se informaron como un porcentaje del control no tratado.
La eficiencia de T-siHER2-NP10C en la inhibición de los niveles de ARNm de HER2 y la expresión de la proteína HER2 en las líneas celulares de cáncer de mama HER2+, BT474, SKBR3 y HCC1954. Como se muestra en la Figura 9A, T-siHER2-NP10C redujo los niveles de HER2 en un 81-93 % en comparación con T-siSCR-NP10C. Como se muestra en la Figura 9B, hubo una reducción del 44 % en el ARNm de HER2 en relación con el control con siSCR. El ensayo de Caspasa 3 y 7 escindida para marcadores apoptóticos muestra que la actividad apoptótica fue tres veces mayor después del tratamiento con T-siHER2-NP10C que con T-siSCR-NP10C (Figura 9C). Esto es consistente con la viabilidad celular reducida (usando un ensayo de nivel de ATP celular) que se muestra en la Figura 9D.
El tratamiento con T-siSCR-NP10C redujo los niveles de HER2 y eliminó las células de cáncer de mama HER2+, lo que indica que el anticuerpo (T) en la nanoconstrucción no solo sirve como un agente de direccionamiento celular sino que también tiene un efecto terapéutico. La Figura 11, por ejemplo, muestra que los niveles de HER2 en BT474 se redujeron en un 41 % con T-siSCR-NP10C (debido al efecto de T) y en un 87 % con el T-siHER2-NP10C (debido al efecto de T y siHER2) en comparación con los controles no tratados. Asimismo, la Figura 9D muestra que la viabilidad celular se redujo un 59 % por T-siSCR-NP10C y un 86 % por T-siHER2-NP10C.
La viabilidad celular después del tratamiento con T-siHER2-NP10C también se midió en un panel de células de cáncer de mama HER2+, células de mama HER2- y células no de mama HER2-. La Figura 10 muestra que el tratamiento con T-siHER2-NP10C redujo mucho la viabilidad de las células de cáncer de mama HER2+ (BT474, SKBR3, HCC1954 y JIMT-1), mientras que tiene poco impacto en las células de mama HER2- (MCF-7, MDA-M<b>-231, MDA-MB-468, MCF-10a) y células no de mama HER2- (HepG2 y HEK-293). El efecto de destrucción celular dependía de los niveles de proteína HER2 de las células (Recuadro de la Figura 10).
La Figura 9A muestra que T-siHER2-NP10C fue más eficaz que T-siHER2-NP18C (Figura 12A) a una dosis equivalente de ARNip. Sin embargo, la Figura 12B muestra que duplicar la dosis de T-siHER2-NP18C podría reducir los niveles de proteína HER2 en un 79-83 % en SKBR3 y HCC1954.
En general, T-siHER2-NP10C demostró una mejor eficacia de atenuación de HER2 y destrucción de células cancerosas que T-siHER2-NP18C. Alentadoramente, la T-siHER2-NP10C (Figura 9A) superó a DharmaFECT disponible comercialmente en todas las líneas celulares (Figura 12C).
Ejemplo XIII
Superar el cáncer resistente a fármacos con siHER2
También se evaluó la eficacia de T-siHER2-NP10C en líneas celulares HER2+ intrínsecamente resistentes a trastuzumab (HCC1954 y JIMT1), en una línea celular HER2+ parental (BT474) que responde a trastuzumab y lapatinib y en BT474-R, una línea celular derivada que se hizo resistente a lapatinib mediante un tratamiento a largo plazo con lapatinib 1 pM. La Figura 13A muestra que las células BT474-R respondieron mucho menos a trastuzumab en comparación con BT474 parental. Sin embargo, la Figura 13B muestra que tanto las líneas celulares sensibles como las resistentes a trastuzumab respondieron de manera similar con respecto a la acción de siHER2 (véase T-siHER2-NP10C frente a control con T-siSCR-NP10C). Esto indica que siHER2 en la nanoconstrucción puede superar la resistencia del cáncer a trastuzumab. Mientras tanto, la Figura 13C muestra que BT474-R fue menos sensible a T-siSCR-NP10C que BT474, lo que indica que las células BT474-R eran de hecho resistentes a trastuzumab (en las nanoconstrucciones).
Ejemplo XIV
Compatibilidad sanguínea (hemólisis, coagulación y agregación plaquetaria)
La T-siHER2-NP18C y T-siHER2-NP10C se evaluaron para determinar la hemólisis, trombogénesis y agregación plaquetaria, y los resultados se compararon con productos de nanopartículas aprobados por la FDA: Abraxane (nanopartículas de paclitaxel-albúmina) y Feraheme (nanopartículas de óxido de hierro utilizadas como agente de contraste de IRM). Las nanopartículas se probaron a 1X y 5X del nivel en sangre humana previsto. Los estudios de compatibilidad sanguínea se realizaron siguiendo o con una modificación menor de los protocolos publicados del Laboratorio de Caracterización de Nanotecnología (Frederick, MD).
Hemólisis.Se recogió sangre humana en presencia de EDTA y se eliminó el suero. Los glóbulos rojos se suspendieron a 1 * 109 células por ml y se expusieron a nanopartículas (concentraciones finales de 70 o 350 pg/ml para 1X o 5X, respectivamente) durante 4 horas y 37 °C. Después de la centrifugación, se midió la absorbancia de la hemoglobina en los sobrenadantes (a 542 nm) y se usó para cuantificar el porcentaje de hemólisis. Se utilizó Abraxane (Celgene) a 94 pg/ml para 1X y 470 pg/ml para 5X. Como se muestra en la Figura 14A, T-siHER2-NP18C y T-siHER2-NP10C no causaron hemólisis de glóbulos rojos en ninguna de las dosis, mientras que la lisis sanguínea completa se logró con Triton-X al 0,025 % (el control positivo).
Ensayo de coagulación (trombogénesis).Se obtuvo plasma pobre en plaquetas (PPP) después de una centrifugación en dos etapas de sangre aislada (diluida en citrato de sodio al 3,2%, 1:10). Después del primer centrifugado a (2150 g, 10 min), se recogió la porción superior de plasma (-75 % del volumen total) sin perturbar el plasma en la parte inferior. La porción recogida se centrifugó de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos y la porción superior (-75 % del volumen total) se recogió como PPP. Las nanoconstrucciones se mezclaron con 0,15 ml de PPP hasta la concentración final de 70 o 350 pg/ml. Los tubos se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Después de 30 minutos de incubación, Se añadieron 0,05 ml de reactivo APTT-xl y se incubaron durante 3 minutos en el analizador de coagulación KC-4 de Trinity Biotech. Después de esto, se añadió CaCh 8,3 mM y se registró el tiempo hasta el inicio de la coagulación. Se usó Abraxane a dosis 1X y 5X como control. Asimismo, Feraheme (AMA<g>Pharmaceuticals) a 102 pg/ml para 1X y 510 pg/ml para 5X, también se usó en paralelo. La Figura 14B muestra que las nanoconstrucciones y Abraxane no afectaron al tiempo de coagulación del plasma pobre en plaquetas, ya que todos tardaron aproximadamente 37 s. Solo Feraheme prolongó el tiempo de coagulación, de acuerdo con los efectos secundarios conocidos relacionados con la coagulación anómala informada anteriormente (M. H. Schwenk 2010).
Ensayo de agregación plaquetaria.Se obtuvo plasma rico en plaquetas (PRP) después de una centrifugación de sangre aislada (diluida en citrato de sodio al 3,2 %, 1:10). La sangre aislada se centrifugó a 200 g durante 20 minutos. El sobrenadante (que contiene PRP) se recogió y se mantuvo a temperatura ambiente antes del tratamiento. Después de una incubación de 1 min a 37 °C (línea de base), las reacciones se iniciaron mediante la adición de nanopartículas (70 o 350 pg/ml) o péptido relacionado con el colágeno (CRP; 100 pg/ml) y se monitorizó durante tres minutos para determinar la densidad óptica a través de un agregómetro (Chrono-log Corp). Abraxane a 1X y 5X como se ha indicado anteriormente también se usó como punto de referencia. La Figura 14C muestra que las nanopartículas y Abraxane no desencadenaron la agregación plaquetaria mientras que un péptido relacionado con el colágeno utilizado como control positivo desencadenó la agregación inmediatamente.
Ejemplo XV
Respuesta inmunitaria--ensayo de liberación de citocinas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
Se realizó un ensayo de liberación de citocinas de PBMC de acuerdo con las recomendaciones y el método del Laboratorio de Caracterización de Nanotecnología (NCL) de NCl para estudios inmunológicos de nanopartículas. El ensayo basado en célulasin vitroevaluó la producción de citocinas por PBMC (200.000 células/pocillo) después de una exposición de 24 horas a los materiales de prueba. Los materiales de prueba incluyeron nanoconstrucciones con y sin siHER2 para investigar el impacto potencial de la respuesta inmunitaria mediada por ARNip. Después de la incubación, los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron y analizaron para determinar IL-1p, IL-6, IFN-a y TNF-a mediante una matriz de perlas de citometría (Milliplex Magnetic Bead) siguiendo el protocolo del fabricante. Abraxane y Feraheme se usaron como referencia de fármaco, ya que no existe ningún fármaco de nanoconstrucción basado en ARNip en el mercado.
El efecto de T-siHER2-NP18C y T-siHER2-NP10C en la respuesta inmunitaria se evaluó tras el tratamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de sangre humana con estas nanoconstrucciones. Se ha informado que las PBMC responden a la transfección de ARNip con una inducción dependiente de TLR 7/8 específica de secuencia de IFN-a y TNF-a (R. Broeringet al.,201; M. Zamanian-Daryoush, 2008). El agonista de TLR7/8, R848, se usó como control positivo directo ya que TLR7 y TLR8 están ubicados dentro de los endosomas (A. Chaturvedi, S. K. Pierce, 2009) donde se espera que residan nanoconstrucciones y ARNip. Las figuras 15A-F muestran que ni T-siHER2-NP18C ni T-siHER2-NP10C aumentó los niveles de IL-6 y TNF-a en el nivel 1X o 5X, mientras que Abraxane aumentó significativamente ambas citocinas al nivel 5X. Ambas nanoconstrucciones aumentaron algo los niveles de IFN-a e IL-1p, pero no en la medida observada para Abraxane para IL-1p y Feraheme para IFN-a. La respuesta inmunitaria no fue significativamente diferente para nanoconstrucciones con o sin ARNip, lo que sugiere que la respuesta no era específica de ARNip. Por último, la respuesta inmunológica de PBMC a T-siHER2-NP10C no fue significativamente diferente que aquella a T-siHER2-NP18C.
Ejemplo XVI
Ensayo de endotoxina (coágulo-gel LAL) de nanoconstrucciones
Para garantizar la esterilidad de nuestra producción de material, T-siHER2-NP18C y T-siHER2-NP10C se analizaron para determinar lipopolisacáridos o LPS (endotoxina), producidos por contaminación bacteriana gramnegativa. Se ha descubierto que aproximadamente el 35 % de las nanopartículas clínicamente relevantes portan este contaminante (R. M. Cristet al.,2013). Las dos nanoconstrucciones se probaron junto con Abraxane como referencia de fármaco de la FDA. Todas fueron negativas para endotoxina (Figuras 15E y F). Esto sugiere una ventaja de la modificación capa por capa, ya que las etapas de lavado secuenciales promueven la esterilización del producto resultante.
Ejemplo XVII
Modelos de tumores de ratón y estudios de eficacia in vivo
Se realizaron estudios de silenciamiento génicoin vivoen modelos de tumores de ratón ortotópicos; Se implantaron 4 x 106 células HCC1954 (a menos que se especifique lo contrario) en las almohadillas de grasa mamaria de ratones SCID de 5 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) y se dejaron crecer hasta un tamaño promedio de aproximadamente 250 mm3. A continuación, los ratones se agruparon y se procedió a recibir una única inyección (vena de la cola) de las nanoconstrucciones (T-siHER2-NP10C o T-sísCr -NP10C, 1,25 mg/kg de ARNip) o el control con PBS. Los tumores se recogieron cuatro días después del tratamiento y se analizaron para determinar la expresión de la proteína HER2 mediante inmunofluorescencia como se muestra en la Figura 16A y se cuantificaron en la Figura 16B. La Figura 16B muestra que los niveles de proteína HER2 en los tumores HCC1954 se redujeron en un 59% en comparación con el control con solución salina (p < 0,0013) y en un 47 % en comparación con el tratamiento con el control con T-siSCR-NP10C (p < 0,015). Cabe señalar que el 23 % (p = 0,27 frente al control con solución salina) de la reducción de HER2 en el control con siSCR probablemente se deba a trastuzumab en las nanoconstrucciones.
La Figura 17A muestra que 5 inyecciones intravenosas en la vena de la cola de T-siHER2-NP10C (1,25 mg de siHER2/kg), durante un período de tres semanas inhibió significativamente el crecimiento tumoral, mientras que T-siSCR-NP10C produjo poco efecto. Esta respuesta es digna de mención ya que se ha establecido que HCC1954 es resistente a cisplatino (I. Beyeret al.,2012), trastuzumab (I. Beyeret al.,2012) y pertuzumab (F. Henjes,et al.,2012)in vitroy/o en ratones. La resistencia de HCC1954in vivoa trastuzumab y una combinación de trastuzumab/paclitaxel se confirmó en nuestro laboratorio en las Figuras 17B-D.
T-siHER2-NP10C (núcleo S-47, aproximadamente 100 nm de tamaño, Figura 17A) mostró una mejor eficacia de inhibición del crecimiento tumoral que las partículas más grandes no reticuladas (T-ARNip-NP10, con núcleo O-87, aproximadamente 200 nm de tamaño, Figura 18) en el mismo modelo de tumor HCC1954 (n=11/grupo) incluso a la mitad de la dosis de ARNip (es decir, 1,25 mg/kg en la Figura 17A frente a 2,5 mg/kg en la Figura 18).
Las nanoconstrucciones sin trastuzumab (siHER2-NP10C) también inhiben el crecimiento tumoral en el modelo de tumor HCC1954 como se muestra en la Figura 19. Los ratones con tumor se trataron con siHER2-NP (n = 8), T-siSCR-NP (n=7), o control con solución salina (n=5) a la dosis de siHER2 o siSCR de 1,25 mg/kg y una relación de NP/ARNip de 50 en los días especificados con flechas. Esto se debe a la administración pasiva, basándose en el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) de los tumores para las nanoconstrucciones, seguido de la absorción de nanoconstrucciones cargadas positivamente a las células cancerosas, produciendo un efecto de inhibición del crecimiento tumoral.
En otro ejemplo, BT474-TRgf (variante de BT474 desarrollada para ser resistente a trastuzumab mediante pases en serie de las células en ratones, Franciaet al.,2012) se usó para evaluar la eficacia de T-siHER2-NP. Aunque las células BT474-TRgf eran resistentes a trastuzumabin vitro(Figura 20A) y en un modelo de ratón con tumor (Figura 20B), respondieron al tratamiento con T-siHER2-NP en el modelo tumoral (Figura 20B). La dosis de siHER2 era de 1,25-2,5 mg/ARNip y 5 animales por grupo de tratamiento.
Ejemplo XVIII
Liofilización de nanoconstrucciones para almacenamiento a largo plazo
Se añadieron suspensiones de nanoconstrucción (T-NP o NP) en Tris HCl 0,1 M (pH 7,4) a una solución de trehalosa para lograr una concentración final de 10 mg/ml de MSNP y un 0-25 % en peso de trehalosa por nanopartícula. La suspensión bien mezclada se congeló lentamente desde temperatura ambiente hasta -55 °C en un liofilizador. A esto le siguió un secado primario y secundario. El secado primario (-40 °C, 100 pBar, 24 h) fue para sublimar los cristales de hielo formados durante la etapa de congelación. El secado secundario (20 °C, 20 pBar, 12 h) fue para eliminar las moléculas de agua unidas en la superficie de la nanoconstrucción. Los productos terminados estaban en forma de polvo en botellas selladas y almacenables.
Todas las nanoconstrucciones liofilizadas con un contenido de trehalosa del 0-10%retuvieron el tamaño y la carga promedio de la nanoconstrucción recién preparada después de 1 min de sonicación como se muestra en la Figura 22A-B, respectivamente. Sin embargo, las condiciones del 0 % de trehalosa produjeron una distribución de tamaño mayor (no mostrada). Después de unirse con siLUC o siHER2, los materiales liofilizados todavía produjeron un rendimiento muy comparable con los materiales homólogos recién preparados (del mismo lote) en términos de capacidad de silenciamiento de luciferasa (Figura 22A, con siLUC) y viabilidad celular de las células BT474 (Figura 4B, con siHER2). Algunas excepciones también son evidentes en la Figura 22D. Las condiciones del 0 % de trehalosa produjeron T-NP que era más tóxica para las células que el material recién preparado. Por lo tanto, basándose en la distribución de tamaño y la eficacia, el 5 % de trehalosa, el aditivo más bajo que produjo la misma eficacia que la contraparte recién preparada, se seleccionó para futuros procesos de liofilización y evaluación de almacenamiento a largo plazo.
Además, T-NP liofilizadas con el 5 % de trehalosa y almacenadas a de -20 °C a 37 °C fueron monitoreadas por sus propiedades durante un tiempo de almacenamiento de 24 semanas. Las figuras 23A-23E muestran que cuando se almacenó a -20 °C, T-NP mantuvieron (A) tamaño hidrodinámico, (B) potencial zeta, (C) carga de ARNip, (D) eficacia de silenciamiento de luciferasa y (E) eficacia de eliminación de células cancerosas similar a las nanopartículas recién preparadas (frescas) del mismo lote. Los datos indican que -20 °C es la mejor temperatura de almacenamiento para conservar todas las propiedades del material fresco durante al menos 24 semanas (6 meses). Se lograron resultados similares con NP sin T.
Ejemplo XIX
Reproducibilidad y escalabilidad de la producción de nanoconstrucciones
Se sabe que muchas plataformas de nanopartículas tienen problemas con la reproducibilidad de lote a lote, especialmente a mayor escala. La producción de núcleos de MSN<p>a través de la química sol-gel y la modificación de la superficie capa por capa permite una producción muy reproducible y escalable de la nanoconstrucción. Se crearon múltiples lotes individuales de nanopartículas de sílice mesoporosas para determinar la reproducibilidad de la síntesis de nanopartículas. Como se muestra en la Tabla 6, el tamaño, la carga y la eficacia de silenciamiento se correlacionaron estrechamente con una desviación estándar relativa (RSD) del 2,4 % de los tamaños de partícula de 6 lotes, lo que indica que la síntesis de material es altamente reproducible. Se ha logrado un aumento de escala desde 300 mg/lote hasta 6 g/lote (por ejemplo, simplemente aumentando la solución de reacción de 125 ml a 2,5 l durante la síntesis de nanopartículas), que produjo propiedades de material similares con los lotes más pequeños.
Tabla 6. Reproducibilidad de la síntesis de nanoconstrucciones antes y después de la modificación de la su erficie.
Ejemplo XX
ARNip adicional dirigido a genes más allá de HER2 para tratar el cáncer.
La selección inicial buscaba evaluar la eficacia de los ARNip individuales en cáncer de mama HER2+. ARNip contra AKT (isoformas 1, 2, 3), BCL2, PLK1, GRB7 y EPS8L1, todos se compararon con la secuencia de siHER2 previamente optimizada. Se eligieron cuatro líneas celulares, que representan cáncer de mama HER2+ resistente a trastuzumab (HCC1569, HCC1954, JIMT1) y cáncer de mama HER2+ sensible (BT474). Para cada gen, las secuencias de ARNip también se variaron (Hs_AKT1_5 FlexiTube siRNA (SI002991450), Hs_AKT1_8 FlexiTube siRNA (SI00287742), Hs_AKT1_10 FlexiTube siRNA (SI02757244) y Hs_AKT1_11 FlexiTube siRNA (SI02758406) para AKT1 demostrado ser eficaz por Qiagen) (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) como sea posible. Los datos representativos para BT474 se muestran en la Figura 24A.
También se evaluó ARNip de direccionamiento dual contra AKT1/BCL2 (por ejemplo, un dúplex de ARNip tiene una cadena dirigida a AKT1 y la otra cadena dirigida a BCL2) (Tabla 1). Las figuras 24A-24B confirman la eficacia de eliminación de células (A) y la actividad de atenuación de proteínas (B) del ARNip de doble direccionamiento.
En las cuatro líneas celulares probadas, ninguno de los ARNip de AKT1 o BCL2 individuales funcionó mejor que el siAKT1/BCL2 (ARNip de doble direccionamiento) o siPLK1. Por lo tanto, los tres ARNip seleccionados del cribado inicial son siHER2, siAKT1/BCL2 y siPLK1. La Figura 25 muestra la viabilidad celular 4 días después de la exposición a los ARNip en el intervalo de dosis indicado (0,01 - 30 nM). El ARNip dirigido a PLK1 demostró ser el más potente de todos los ARNip en cada línea celular respectiva; la CI50 (dosis que inhibe el 50 % del crecimiento) de siPLK1 es de aproximadamente 0,2 nM para 3 de las 4 líneas celulares estudiadas.
El panel de células se amplió para incluir cáncer de mama triple negativo, ER+ y células no de mama. Como se muestra en la Figura 26, siPLK1 sigue siendo el más potente entre los tres ARNip evaluados. (Figura 26). Sin embargo, siPLK1 era tóxico para células no objetivo (por ejemplo, células no seleccionadas como objetivo en la Figura 26) cuando se administraba con DharmaFECT comercial. La especificidad del tratamiento se puede lograr para las células de cáncer de mama (HCC1954) sobre las células epiteliales de mama normales (MCF-10A) cuando el siPLK1 se administra con las nanoconstrucciones (T-NP), en comparación con DharmaFECT, como se muestra en las Figuras 27 A y B, respectivamente.
La Figura 27A también muestra la capacidad de T-NP para administrar miméticos de miARN (miR342-5p, obtenido de GE Dharmacon (Lafayette, CO, EE. UU.) y provocando la eliminación de células cancerosas pero no de MCF-10A.
Ejemplo XXI
Cribado de ARNip en combinación con paclitaxel.
Las células se trataron primero con ARNip 30 nM (y DharmaFECT comercial) seguido de tratamiento con paclitaxel 5 nM 24 horas después. La viabilidad celular se determinó 3 días después. Como se muestra en la Tabla 7, la combinación de ARNip con paclitaxel mejoró la reducción general en la viabilidad celular en comparación con paclitaxel solo (Aleatorio Paclitaxel, fila superior). El % de mejora por diversos ARNip con paclitaxel sobre paclitaxel solo también se resumió en la Tabla 7. De forma abreviada, la atenuación de HER2 tuvo el mayor impacto en la toxicidad de paclitaxel en BT474 (que tiene el nivel más alto de HER2). Para otras células, la mejor eficacia se logró con paclitaxel siPLK1. El efecto de paclitaxel combinado con siAKT1/BCL2 o siEPS8L1 también fue significativo. La mejor mejora por siAKT1/BCL2 (38-41 %) pareció ser con células basales, HCC1954, BT549 y HCC70. EPS8L1 está implicada en la señalización de EGFR y actúa en la migración celular. Como resultado, la eficacia de EPS8L1 no se restringió a las células HER2+ y demostró ser eficaz en las dos líneas celulares triple negativas probadas (ambas con EGFR alto).
Tabla 7: Cribado de ARNip dirigido a HER2, PLK1, AKT1/BCL2 y EPS8L1 en combinación con el fármaco uimioterá ico aclitaxel.
continuación
Ejemplo XXII
Administración de otras cargas por nanoconstrucciones
Administración de péptidos.La Figura 28A muestra la capacidad de las nanopartículas para cargar y administrar pequeños péptidos en las células. MSNP-PEI-PEG (PEI no reticulada) se cargó con péptido GALA (PM de 3 kDa) mediante interacción electrostática de la misma manera que el ARNip. GALA se mezcló con nanoconstrucciones de ARNip (GALA 13-130 nM y 10mg/l de nanoconstrucciones) durante 20 minutos en PBS (temperatura ambiente, agitación a 300 rpm). GALA claramente mejoró la eficacia de silenciamiento de las nanoconstrucciones, debido a su capacidad como péptido formador de poros para potenciar el escape endosomal de las nanoconstrucciones de ARNip (Liet al.,2004).
Co-administración de anticuerpo, ARNip y agentes quimioterápicos.Las nanoconstrucciones (MSNP-PEI-PEG o NP) también pueden coadministrar anticuerpos, ARNip y fármacos quimioterápicos a las células cancerosas. La Figura 28B muestra los efectos de trastuzumab (T), siHER2 y/o paclitaxel (PTX) cargados en la nanoconstrucción en células JIMT-1. La combinación de paclitaxel y trastuzumab en la misma nanopartícula fue muy potente, que enmascaró el efecto de siHER2. La carga de PTX se logró mezclando 3 mg de PTX con una solución de etanol que contenía 10 mg de MSNP-PEI durante la etapa de reticulación descrita en el Ejemplo III. La carga de doxorrubicina (DOX) se realizó mezclando 3 mg de DOX con 10 mg de MSNP en agua durante la noche. A continuación, MSNP-Dox se centrifugó y se resuspendió en etanol para la carga posterior de PEI, PEG y trastuzumab como se describe en el ejemplo III-V. Para confirmar que la T-NP cargada con fármaco aún puede administrar ARNip y provocar la atenuación génica de manera efectiva. Se evaluaron las NP cargadas con fármaco (paclitaxel (PTX) o doxorrubicina (DOX)) con o sin trastuzumab para determinar su capacidad de administrar siLUC y provocar la atenuación génica de luciferasa. La Figura 29 muestra que los fármacos no afectaron negativamente a la eficacia de atenuación génica de los materiales. Además, la combinación de paclitaxel, trastuzumab y siHER2 muestra una mayor eficacia en la inhibición del crecimiento tumoralin vivoque la combinación libre de trastuzumab y paclitaxel como se muestra en la Figura 30.
Ejemplo XXIII
Nanoconstrucción antioxidante y/o quelante de cobre para la administración de ARNip
Otra ventaja de la nanoconstrucción basada en MSNP es que la MSNP puede reducir las especies reactivas de oxígeno (ROS) en células activadas por menadiona como se muestra en la Figura 31A. La reducción de ROS se atribuyó al núcleo de MSNP y no al recubrimiento de PEI-PEG catiónico. Esto se confirmó por el hallazgo (en un sistema sin células) en la Figura 31B de que el núcleo de MSNP desnudo mostraba una mayor capacidad de eliminación de radicales libres de DPPH que el MSNP recubierto con una capa de PEI-PEG. La Figura 31B también muestra que la PEI libre no tenía capacidad de eliminación de ROS. Obsérvese que DPPH es un radical libre estable que se usa normalmente para evaluar la capacidad de eliminación de ROS de los antioxidantes. Debido a las propiedades antioxidantes, el MSNP-PEI-PEG podría reducir los efectos de la citocina proinflamatoria TGF-beta al inhibir NOX4, HSP47, COL I y alfa-SMA como se muestra en la Figura 31C. Asimismo, la Figura 31D muestra que la nanoconstrucción podría reducir los marcadores profibróticos tales como HSP47, COL I y/o alfa-SMA, desencadenado por bleomicina. Fibroblasto Bleo denota fibroblastos dérmicos murinos recogidos del modelo de ratón con esclerodermia inducida por bleomicina. Por lo tanto, la nanoconstrucción tiene el potencial de tratar la fibrosis como se confirmó en un modelo de ratón fibrótico creado por el tratamiento con bleomicina de la piel de ratón como se muestra en las Figuras 32A-32G (Morryet al.,2015). El programa de tratamiento se describe en la Figura 32A. Se observó una reducción en la fibrogénesis de la piel con el tratamiento con nanoconstrucción de siSCR, pero se mejoró con la nanoconstrucción de siHSP47. Esto se evidenció por la reducción en el espesor de la piel (Figuras 32B-C), HSP47 (D), NOX4 (E), alfa-SMA (F) y COL I(G) en comparación con ratones tratados con bleomicina.
Además, se descubrió que NOX4 se sobreexpresa en la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama, tumores de mama primarios y tumores de ovario. La sobreexpresión de NOX4 en células epiteliales de mama normales podría dar como resultado senescencia celular, la resistencia a la muerte celular programada y la transformación tumorigénica de las células (K. A. Graham, 2010), estableciendo la utilidad terapéutica del portador de MSNP como reductor de NOX además de los agentes terapéuticos que administra.
Las propiedades antioxidantes de las nanopartículas acopladas con siPLK1 pueden provocar efectos de tratamiento en la metástasis del cáncer de mama. Las Figuras 33A-33D muestran la atenuación de PLK1in vitro(A-B), detención del ciclo celular G2/M (C) y eliminación de células cancerosas (D) inducida por siPLK1-NP. Las Figuras 34A-34H muestran que la propiedad antioxidante de las nanopartículas puede eliminar<r>O<s>en células cancerosas (A) sin efecto de toxicidad (B), resultando en una disminución de la expresión de NOX (C), disminución de la migración de células cancerosas (en el ensayo de cicatrización) (D-E) y disminución de la invasión de células cancerosas (F-H) que fue más eficaz que un NAC antioxidante establecido a 2-10 mM (H). La nanoconstrucción T-siSCR-NP también limitó la propagación tumoralin vivocomo se muestra en la Figura 35B, ya que se encontraron células cancerosas principalmente en el sitio primario establecido de este modelo (pulmón), en comparación con ratones no tratados donde las señales tumorales se pueden encontrar en otros órganos distantes similares a los sitios de metástasis del cáncer de mama humano. Cuando se combina con siPLK1, T-siPLK1-NP dio como resultado la inhibición del crecimiento tumoral en los pulmones (Figuras 35B-D, F y H) y la posterior supervivencia prolongada en ratones más allá del tratamiento con T-siSCR-NP (G). También se observó la atenuación de PLK1 en los tumores (Figura 35E).
Se sabe que los grupos amina, por ejemplo, de PEI en nanoconstrucciones, son quelantes de cobre altamente efectivos, que es un cofactor para la angiogénesis y, por lo tanto, la metástasis en el cáncer (Breweret al.,2000). De acuerdo con nuestros datos, la metástasis de cáncer y la carga tumoral más bajas se lograron con T-siPLK1 - NP (Figura 35, estudio a corto plazo), que coincidía con la ceruloplasmina sérica más baja (un biomarcador para el estado de cobre corporal total) en los ratones correspondientes (Figura 36).
Ejemplo XXIV
Carga de lantánidos y colorantes fluorescentes en MSNP
Se prepararon MSNP que contenían grupos fosfonato añadiendo metilfosfonato de 3-trihidroxisililpropiloin situdurante la síntesis de MSNP descrita en el Ejemplo I y el Ejemplo II. Específicamente, se disolvieron 500 mg de CTAB en 240 ml de agua (ajustada por NaOH 2 M). Después de estabilizar la temperatura a 80 °C, se añadieron 2,5 ml de TEOS a la solución en condiciones de agitación. Después de 15 minutos, se añadieron 635 pl de fosfonato de 3-(trihidroxilsilil)propilmetilo. La reacción continuó durante 2 horas y los sedimentos se recuperaron de la suspensión mediante centrifugación, se lavaron con una cantidad abundante de etanol y se secaron durante la noche. A continuación, las partículas se resuspendieron y se sometieron a reflujo en metanol ácido (HCl 0,6 M en metanol) durante la noche para eliminar CTAB. A continuación, las fosfonato-MSNP resultantes se lavaron con etanol y se secaron en un desecador durante la noche.
Para la carga de lantánidos, se suspendieron en agua 5 mg/ml de MSNP. A continuación, se mezclaron 0,01-100 mg/l de lantánidos con la suspensión de MSNP. La mezcla se agitó durante dos horas. A continuación, el material se lavó con una gran cantidad de agua y el material se secó. Las MSNP pueden sufrir modificaciones en la superficie (por ejemplo, carga de PEI, PEG, anticuerpo como se ha mencionado anteriormente) y pueden usarse como una sonda fluorescente o una sonda para espectrometría de masas.
Para la caracterización, MSNP de peso seco conocido se mezcló con HNO 10 M para la lixiviación ácida de los lantánidos. El lixiviado se sometió a continuación a un ensayo de lantánidos con ICP-MS. La cantidad de cada lantánido cargado en la nanopartícula (como % en peso) se muestra en la Figura 37A. La Figura 37B muestra que la nanoconstrucción también puede cargarse con colorantes fluorescentes (en la capa de PEI) y/o un anticuerpo (tal como un anticuerpo anti-HER2), que reconoce proteínas HER2 en las células objetivo.
Ejemplo XXV
Nanoconstrucciones preparadas a partir de otros núcleos inorgánicos (por ejemplo, NP de óxido de hierro)
Como alternativa a las nanopartículas de sílice, pueden usarse nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4) (ION). La modificación de la superficie de tales nanopartículas se puede realizar usando métodos similares a los descritos para MSNP. Por ejemplo, se puede preparar una partícula llamada DMSA-ION. Específicamente, ION se prepararon mediante una reacción a alta temperatura de tris(acetilacetonato)hierro(III) en presencia de tensioactivos estabilizadores - 1,2-hexadecanodiol, ácido láurico y lauril amina - en éter bencílico. El aducto se purificó con etanol y hexano para obtener el precursor ION-ácido láurico. Las nanopartículas precursoras se sometieron a continuación a una reacción de intercambio de ligandos de ácido láurico hidrófobo a ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (DMSA) hidrófilo que hace que las nanopartículas sean solubles en agua. El DMSA-ION final se purificó magnéticamente con agua, etanol y acetona. ION de < 10 nm por TEM (Yantaseeet al,2007).
A pH neutro, DMSA tiene una carga negativa que permite que el ligando se una electrostáticamente a la polietilenimina (PEl) cargada positivamente. La modificación de PEI permite que las nanopartículas se unan con ARNip cargado negativamente. En un entorno de pH bajo del compartimento intracelular, DMSA se protona y libera la PEI unida que a su vez libera el ARNip. La evaluación de nanoconstrucción basada en ION para la administración de anticuerpo, ARNip, agente quimioterápico y/o colorantes se realizará de manera similar a la nanoconstrucción de MSNP. Sus ventajas son el tamaño pequeño para una fácil acumulación de tumores, biocompatible y compatible con IRM.
En este ejemplo, las nanopartículas de óxido de hierro se han modificado en superficie de manera similar a la MSNP usando los métodos mencionados anteriormente con una modificación menor. Específicamente, se dispersaron nanopartículas de óxido de hierro (Ferumoxitol o Feraheme comercialmente disponibles y aprobados por la FDA) en solución de etanol y se añadió PEI (10 kDa) a la solución a una concentración del 25 o 33 % en peso de PEI (10 kDa) por óxido de hierro. La mezcla se agitó posteriormente, se centrifugó y se lavó dos veces con PBS. A continuación, se añadió mal-PEG(5 kDa)-NHS seca en una relación en masa 1:1 de óxido de hierro a PEI en PBS. La solución resultante se agitó durante dos horas a temperatura ambiente y posteriormente se lavó en PBS. El agente de direccionamiento (trastuzumab, T) se incorporó de la misma manera que el Ejemplo V. La carga de ARNip se logró mezclando las nanoconstrucciones resultantes con ARNip durante 1 hora antes de la caracterización. El tamaño hidrodinámico final de la nanoconstrucción fue de aproximadamente 50-100 nm en promedio como se muestra en la Figura 38A para el material preparado con el 25 % en peso de PEI (llamado F1) o el 33 % en peso de PEI (llamado F2). Las nanoconstrucciones exhibieron un índice de polidispersidad inferior a 0,15 y un potencial de aproximadamente 10-20 mV medido en agua, que aumentó desde -50 mV del ION (Feraheme).
Ejemplo XXVI
Nanoconstrucciones de óxido de hierro para la administración de ARNip y agente de contraste de IRM.
Las nanoconstrucciones que contienen nanopartículas de óxido de hierro se pueden usar para administrar ARNip y lograr un silenciamiento génico eficaz. Las nanoconstrucciones de óxido de hierro sintetizadas mediante el método del Ejemplo XXV se cargaron con siLUC 50 nM a una relación de masa de nanoconstrucción por siLUC de 10 y se usaron para tratar células LM2-4luc+/H2N que expresan luciferasa similar al Ejemplo VIII. Se logró una buena eficacia de atenuación de luciferasa (40-50 %) como se muestra en la Figura 38B.
Las nanoconstrucciones basadas en óxido de hierro pueden servir como un agente de contraste de IRM. La relaxividad T2 se calculó IRM T2 (instrumento de IRM Bruker BioSpin 11.75T de animales pequeños (diámetro interior horizontal de 31 cm), software Paravision 5.1) a medida que aumentan las concentraciones de Fe en PBS. Los valores de T2 se encontraron usando el software Imaged y se representaron gráficamente como 1/T2 (1/s) frente a Fe (mM) para producir la relaxividad (coeficiente R2) como la pendiente (Figura 38C). La Figura 38C muestra que la nanoconstrucción T-F2 final (conjugada con trastuzumab y cargada con siHER2) tiene un coeficiente R2 mejorado de 2-3 veces, en comparación con ION no modificado (Ferumoxitol). Por lo tanto, la nanoconstrucción de óxido de hierro tiene el potencial de servir como herramienta de diagnóstico (sonda de IRM). Además, dado que los materiales son magnéticos, pueden usarse potencialmente para la administración guiada magnéticamente de agentes terapéuticosin vivoo en humanos.
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende:
(a) nanoconstrucciones multicapa que comprenden un polímero catiónico unido a una superficie exterior de una nanopartícula, en donde el polímero catiónico está reticulado y es de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 30 % en peso de la nanoconstrucción, en donde la nanopartícula comprende sílice, silicio, óxido de hierro, plata o un nanotubo de carbono, en donde la nanoconstrucción tiene un diámetro hidrodinámico de desde 10 hasta 200 nm, y en donde la nanoconstrucción multicapa comprende además un estabilizador unido al polímero catiónico o nanopartícula, en donde el estabilizador evita la agregación de la nanoconstrucción en solución;
(b) un agente terapéutico, en donde el agente terapéutico es al menos un tipo de oligonucleótido unido electrostáticamente al polímero catiónico; y
(c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la nanopartícula es una nanopartícula de sílice, una nanopartícula de silicio, una nanopartícula de óxido de hierro, una nanopartícula de plata o un nanotubo de carbono.
3. La composición farmacéutica de cualquier reivindicación anterior, en donde la nanoconstrucción está liofilizada, preferiblemente con trehalosa, preferiblemente en donde la trehalosa es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 % en peso de la nanoconstrucción.
4. La composición farmacéutica de cualquier reivindicación anterior, en donde el polímero catiónico:
(a) es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25%, o del 10% al 30%, en peso de la nanoconstrucción;
(b) se selecciona del grupo que consiste en polietilenimina, quitosano, polipropilenimina, polilisina, poliamidoamina, poli(alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(N-isopropilacrilamida-co-acrilamida), poli(N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico), dietilaminoetil-dextrano, poli-(bromuro de N-etil-vinilpiridinio), poli(metacrilato de (dimetilamino)etilo) y poli(etilenglicol)-co-poli(cloruro de metacrilato de trimetilaminoetilo); y/o
(c) se reticula haciendo reaccionar el polímero catiónico en la superficie de la nanopartícula con un reticulante en presencia de polímero catiónico en solución.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el estabilizador:
(a) es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 %, opcionalmente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 25 %, en peso de la nanoconstrucción; y/o
(b) se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, dextrano, ácido polisiálico, ácido hialurónico (HA), polivinilpirrolidona (PVP), poli(alcohol vinílico) (PVA) y poliacrilamida (PAM).
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde las nanoconstrucciones multicapa comprenden además:
(a) una molécula pequeña o una proteína, o
(b) un agente de direccionamiento.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el al menos un tipo de oligonucleótido:
(i) es ARNip, preferiblemente en donde el ARNip se dirige a uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en HER2, AKT1, AKT2, AKT3, EPS8L1, GRB7, AR, Myc, VEGF, VEGF-R1, RTP801, proNGF, queratina K6A, Bcl-2, PLK1, LMP2, LMP7, MECL1, RRM2, PKN3, Survivina, HIF1a, Furina, KSP, eiF-4E, p53, p-catenina, ApoB, PCSK9, HSP47, CFTR, CTGF, SNALP, nucleocápsidas de VRS, CD47, PD-L1 y CTLA-4; y/o
(ii) comprende dos o más ARNip diferentes cargados en la nanoconstrucción.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en donde la molécula pequeña:
(i) es un agente quimioterápico, inhibidor de molécula pequeña o un polipéptido; o
(ii) es un marcador, preferiblemente un lantánido, un colorante fluorescente, una nanopartícula de oro, un punto cuántico, un trazador de tomografía por emisión de positrones (PET), un agente de contraste de formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) o un isótopo radiactivo.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en donde el agente de direccionamiento es un anticuerpo, un anticuerpo scFv, un aficuerpo, un aptámero, un péptido o molécula de direccionamiento pequeña.
10. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, formulada como una suspensión estéril acuosa para administración parenteral.
11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, formulada como una suspensión estéril no acuosa para administración parenteral.
12. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la composición es una emulsión, un gel o una pomada.
13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el polímero catiónico se reticula usando un enlace escindible.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde el enlace escindible es un enlace disulfuro escindible.
15. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para su uso en un método de administración de un agente a un sitio en un sujeto humano u otro sujeto mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende el agente al sujeto humano u otro sujeto mamífero en condiciones para administrar la nanoconstrucción al sitio, preferiblemente una célula.
16. La composición farmacéutica para su uso en el método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la nanoconstrucción:
(a) se administra en condiciones de manera que la célula internaliza la nanoconstrucción;
(b) reduce las especies reactivas de oxígeno, cobre biodisponible y/o nivel de expresión de NOX en el sujeto; y/o (c) modula un efecto adverso de una o más citocinas.
17. La composición farmacéutica para su uso en el método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde al sujeto: (a) se le diagnostica cáncer, y la cantidad eficaz es una cantidad terapéuticamente eficaz, y/o
(b) se le diagnostica o está en riesgo de fibrosis o inflamación.
18. La composición farmacéutica para su uso en el método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el agente terapéutico es un ácido nucleico capaz de modular la expresión de una proteína objetivo, preferiblemente un ARNip, miARN, imitador de miARN u oligómero antisentido, y se reduce la expresión de la proteína objetivo.
19. La composición farmacéutica para su uso en el método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el agente terapéutico es un agente quimioterápico, un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo, un péptido y/o una citocina.
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