ES2994101T3 - Composition comprising probiotics overexpressing clpb protein for use in the treatment of obesity - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la proteína bacteriana Clp B y a las bacterias que expresan Clp B y a su impacto en los trastornos alimentarios. La invención se refiere además a composiciones que comprenden antibióticos dirigidos contra al menos una bacteria que expresa Clp B, así como a probióticos que no expresan la proteína Clp B y a su uso en el tratamiento o la prevención de los trastornos alimentarios. La invención también se refiere a herramientas de diagnóstico para determinar si es probable que un sujeto responda a un método de tratamiento de los trastornos alimentarios y a métodos de inmunización contra los trastornos alimentarios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende probióticos que sobreexpresan la proteína CIpB para su uso en el tratamiento de la obesidad

Los trastornos de la conducta alimentaria aumentaron en todo el mundo tanto en hombres como en mujeres en los últimos 50 años. Hay pruebas que sugieren que, en particular, las personas del mundo occidental corren el mayor riesgo de desarrollarlas y el grado de occidentalización aumenta el riesgo. Con los avances recientes, los científicos comprenden cada vez más los procesos centrales del apetito. Se sabe que las interacciones entre los procesos de control motivacional, homeostático y autorregulador están implicadas en la conducta alimentaria, que es un componente clave en los trastornos de la conducta alimentaria.

La ciencia reciente ha descubierto otro regulador, el microbioma humano. Los avances de las tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento han permitido explorar el microbioma humano y, por lo tanto, dar un paso importante hacia la comprensión de las relaciones moleculares entre el hospedante y su microbiota. Este "segundo genoma", el microbioma, se ha descrito en un catálogo de más de 4-5 millones de genes putativos microbianos no redundantes y de 1 a 2000 especies bacterianas prevalentes. Cada individuo tiene al menos 160 especies compartidas y una serie de relaciones moleculares microbianas-hospedante bien equilibradas que definen a los grupos de individuos.

Se considera que comprender las características esenciales de las relaciones simbióticas entre las comunidades microbianas y su hospedante humano puede permitir predecir los fenotipos del hospedante, tales como el estado de salud, a partir de las características particulares de las comunidades indígenas.

La composición de la microbiota intestinal, por ejemplo, se ha asociado con fenotipos metabólicos del hospedante incluidas la obesidad y la diabetes, así como algunos trastornos neuropsiquiátricos que sugieren que las bacterias intestinales pueden influir en las funciones y el comportamiento controlados por el cerebro.

En este contexto, la determinación de los mecanismos moleculares que vinculan la microbiota con el comportamiento del hospedante aparece, por lo tanto, como un paso necesario para definir el papel de microorganismos específicos en la fisiología del hospedante.

Los mecanismos moleculares que están en el origen de los trastornos de la conducta alimentaria, incluidas la anorexia nerviosa (AN), la bulimia (BN) y el trastorno por atracón (BED, por sus siglas en inglés binge-eating disorder), son actualmente desconocidos. Los datos anteriores indicaban que las inmunoglobulinas (Ig) o los autoanticuerpos (auto-Ab) que reaccionan con la hormona estimulante de los melanocitos a (a-MSH) están implicados en la regulación de la alimentación y las emociones; sin embargo, se desconoce el origen de dichos auto-Ab.

Sinno et al. comentan que los auto-Ab de a-MSH extraídos por afinidad del plasma de ratas expuestas repetidamente a un estrés leve, pero no de ratas de control, pueden aumentar de forma aguda la ingesta de alimentos (Sinno et al., "Regulation of feeding and anxiety by a-MSH reactive autoantibodies".Psychoneuroendocrinology.Enero de 2009; 34(1): 140-149). Además, Harold et al. describen que el bloqueo de MC4-R por los auto-Ab de a-MSH puede favorecer el aumento de peso (Harold et al., "Altered energy balance causes selective changes in melanocortin-4(MC4-R), but not melanocortin-3 (MC3-R), receptors in specific hypothalamic regions: further evidence that activation of MC4-R is a physiological inhibitor of feeding".Diabetes.Febrero de 1999; 48(2): 267-71).

Los autores de la invención descubrieron, utilizando la proteómica, que la proteína chaperona ClpB de las bacterias intestinales comensalesE. coliK12 es un mimético conformacional de la hormona estimulante de los melanocitos a (a-MSH), un neuropéptido implicado en la regulación del metabolismo energético y las emociones. Tennoune et al. describen que E. coli K12 aumenta los niveles y la afinidad de las IgG reactivas con a-MSH en ratas Winstar sanas, sin ningún efecto significativo en la ingesta de alimentos, lo que sugiere que las diferentes propiedades de los auto-Ab de a-MSH pueden ser relevantes para la obesidad (Tennoune et al., "OP009 Commensal E. coli increase affinity of a-MSH-reactive immunoglobins and body weight in rats", 2013,Clinical Nutrition,vol. 32)

Los autores de la invención han demostrado que los ratones inmunizados con ClpB producen IgG anti-ClpB con reacción cruzada con la a-MSH, lo que influye en la ingesta de alimentos, el peso corporal, la ansiedad y la señalización del receptor 4 de la melanocortina. Además, muestran que la administración intragástrica crónica de E. coli en ratones disminuyó la ingesta de alimentos y estimuló la formación de anticuerpos reactivos con ClpB y a-MSH, mientras que E. coli deficiente en ClpB no afectó a la ingesta de alimentos ni a los niveles de anticuerpos. Por último, muestran que los niveles plasmáticos de IgG anti-ClpB con reacción cruzada con a-MSH son mayores en los pacientes con AN, BN y BED, y que las puntuaciones del Inventario 2 de TCA (trastornos de la conducta alimentaria) en pacientes con trastornos de la conducta alimentaria se correlacionan con la IgG e IgM anti-ClpB.

Por consiguiente, muestran que la proteína ClpB bacteriana, que está presente en varios microorganismos comensales y patógenos, puede ser responsable de la producción de auto-Ab con reacción cruzada con la a-MSH, asociado con alteraciones de la alimentación y las emociones en seres humanos con trastornos de la conducta alimentaria.

Además, se muestran mayores concentraciones plasmáticas de la proteína ClpB en pacientes que padecen trastornos de la conducta alimentaria.

Por lo tanto, la presencia de la proteína CIpB y/o de anticuerpos anti-CIpB puede estar relacionada con trastornos de la conducta alimentaria y con una desregulación del apetito y las emociones.

La presencia de la proteína ClpB y/o de anticuerpos anti-ClpB se ha correlacionado con los trastornos de la conducta alimentaria y la desregulación del apetito, a su vez, la reducción del nivel de la proteína ClpB y/o de los anticuerpos anti-ClpB puede dar como resultado la regulación del apetito y, por lo tanto, ser usado como tratamiento de los trastornos de la conducta alimentaria.

T ras haber demostrado los autores de la invención que la administración intragástrica de E. coli en ratones reducía la ingesta de alimento y la ganancia de peso corporal debidas a la presencia de la proteína ClpB en las bacterias, la invención se refiere además a una composición que comprende probióticos que sobreexpresan la proteína ClpB para su uso en el tratamiento de la obesidad.

Descripción detallada de la invención

Por consiguiente, la invención se refiere a una composición oral que comprende probióticos que sobreexpresan la proteína ClpB para su uso en el tratamiento de la obesidad, comprendiendo o consistiendo dicha proteína ClpB en una secuencia de aminoácidos de 80 a 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

"Obesidad" se refiere en el presente documento a una afección médica. en donde el sujeto tiene preferiblemente un IMC superior a 30.

Por "sobreexpresión" se entiende la expresión artificial de una proteína debido a la expresión de un gen en mayor cantidad, aquí la mayor expresión del gen que codifica la proteína ClpB.

Las bacterias que sobreexpresan la proteína ClpB se pueden preparar mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante transformación bacteriana con vectores que expresan el ADN de ClpB.

En una realización, la bacteria que sobreexpresa ClpB se selecciona de bacterias conocidas como bacterias no patógenas probióticas o comensales en seres humanos, p. ej.,Escherichia colino patógena.

Por "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de bacterias que permite la manifestación del efecto deseado. En particular, se entiende una cantidad de entre 1000 millones y 10.000 millones de UFC.día-1.

Los autores de la invención descubrieron, utilizando la proteómica, que la proteína chaperona ClpB de la bacteria intestinal comensalE. ColiK12 es un mimético conformacional de la hormona estimulante de melanocitos a (a-MSH), un neuropéptido implicado en la regulación del metabolismo energético y las emociones, y que la presencia de bacterias que expresan ClpB produce una desregulación del apetito.

Como se usa en el presente documento, "bacteria que expresaClpB'se refiere a bacterias que expresan la proteína chaperona ClpB.

La "chaperona de desagregación de proteínas", "proteína chaperona ClpB", "proteína ClpB" o "ClpB", también conocida como proteína de choque térmico F84.1, es un miembro de la familia Hsp100/ClpB de las ATPasas AAA+ hexaméricas. Esta familia comprende ATPasas Hsp100 bacterianas, fúngicas y vegetales, siendo ClpB el representante bacteriano. Como parte de un sistema de múltiples chaperonas inducido por el estrés, participa en la recuperación de la célula del daño inducido por calor, en cooperación con el sistema Hsp70 (DnaK, DnaJ y GrpE) en la desagregación de proteínas, un proceso crucial para la supervivencia celular en condiciones de estrés.

Durante el proceso de infección, los patógenos bacterianos encuentran condiciones de estrés generadas por la defensa del hospedante para eliminarlos y responden a esta defensa del hospedante aumentando la síntesis de proteínas de choque térmico y otras de estrés. En este contexto, la ClpB se ha descrito como un factor esencial para la termotolerancia adquirida y para la virulencia e infectividad de varias bacterias patógenas gram negativas y gram positivas, tales comoStaphylococcus aureus, Francisella turalensis, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica y Salmonella thyphimurium.

EnE. coliK12, la proteína chaperona ClpB, también conocida como proteína de choque térmico F84.1 o htpM, es una proteína de 857 aminoácidos.

Normalmente, la proteína chaperona ClpB comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la proteína chaperona ClpB deE. ColiK12 con SEQ ID NO: 1 (número de referencia del NCBI: NP_417083.1, disponible el 6 de noviembre de 2013 y/o número UniProtKB/Swiss-Prot: P63284, disponible el 6 de noviembre de 2013). Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la proteína chaperona ClpB comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de 80 a 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos es de 90 a 100 % idéntica, más preferiblemente de 95 a 100 %, lo más preferiblemente 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Por lo tanto, una bacteria que expresa ClpB se refiere a una bacteria que expresa o sobreexpresa la proteína chaperona CIpB tal como se definió anteriormente o un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de 80 a 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente de 95 a 100 %, lo más preferiblemente 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de consulta de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto sea idéntica a la secuencia de consulta, excepto que la secuencia del polipéptido objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de consulta, se puede insertar, eliminar o sustituir hasta 5 % (5 de 100) de los restos de aminoácidos de la secuencia objeto por otro aminoácido.

En el contexto de la presente solicitud, el porcentaje de identidad se calcula usando un alineamiento global (es decir, las dos secuencias se comparan a lo largo de toda su longitud). Los métodos para comparar la identidad de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica. El programa "needle", que utiliza el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970J. Mol. Biol.48:443-453) se puede usar por ejemplo para encontrar el alineamiento óptimo (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se considera su longitud total. El programa needle está disponible, por ejemplo, en el sitio de la red mundial ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad de acuerdo con la invención se calcula preferiblemente usando el programa EMBOSS:: needle (global) con un parámetro de "Apertura de hueco" igual a 10,0, un parámetro de "Extensión de hueco" igual a 0,5 y una matriz Blosum62.

Las proteínas que consisten en una secuencia de aminoácidos "al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica" a una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia. En el caso de sustituciones, la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de referencia puede corresponder a una secuencia homóloga derivada de otra especie que la secuencia de referencia.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras. Preferiblemente, las sustituciones son sustituciones conservadoras, en las que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido con propiedades estructurales y/o químicas similares. La sustitución corresponde preferiblemente a una sustitución conservadora, como se indica en la tabla siguiente.

Las bacterias que expresan ClpB son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden identificarse por cualquier técnica convencional.

En una realización, la bacteria que expresa ClpB se selecciona del grupo constituido por el géneroStaphylococcus aureus, Francisella turalensis, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salmonella thyphimurium, Escherichia Coli, Enterobacteriaceae, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Citrobacteryoungae, Salmonella bongoriySalmonella enterica.

La proteína ClpB comprende dos dominios de unión a nucleótidos (ATP1 y ATP2) y dos dominios de oligomerización (NBD1 y NBD2). El dominio N-terminal podría funcionar como un dominio que discrimina el sustrato, reclutando proteínas agregadas para el hexámero ClpB y/o estabilizando las proteínas unidas. El dominio NBD2 es responsable de la oligomerización, mientras que el dominio NBD1 estabiliza el hexámero probablemente de una manera dependiente del ATP. El movimiento del dominio superenrollado es esencial para la capacidad de la ClpB de rescatar proteínas de un estado agregado, probablemente separando las proteínas agregadas grandes, que están unidas entre los motivos superenrollados de las subunidades de ClpB adyacentes en el hexámero funcional.

Los autores de la invención identificaron que la proteína chaperona ClpB de bacterias intestinales comensalesE. coliK12 es un mimético conformacional de la hormona estimulante de melanocitos a (a-MSH), un neuropéptido implicado en la regulación del metabolismo energético y las emociones.

La "a-MSH", también conocida como "hormona estimulante de melanocitos a", "alfa-MSH", "a-MSH", alfamelanotropina, alfa-melanocortina o alfa-intermedina, es una hormona peptídica endógena natural de la familia de las melanocortinas, con una estructura de tridecapéptido. La secuencia de aminoácidos de la a-MSH preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SYSMEHFRWGKPV (SEQ ID NO: 3) (Gen Pept Sequence ID, PRF: 223274, disponible el 2 de diciembre de 2013). Sin embargo, existen tres tipos de hormona estimulante de melanocitos alfa que difieren en su estado de acetilos, la desacetil alfa MSH, que carece de un grupo acetilo; la monoacetil alfa MSH, en la que el grupo amino de la Ser-1 de la SEQ ID NO: 3 está acetilado; y la diacetil alfa MSH, en la que tanto el grupo amino como el hidroxi de la Ser-1 de la SEQ ID NO: 3 están acetilados. La a-MSH, como se usa en el presente documento, se refiere en particular a la a-MSH monoacetilada.

Está implicada de manera crítica en la regulación del equilibrio energético y en el aumento del gasto energético mediante la activación de los receptores de melanocortina tipo 4 (MC4R), que actúan tanto de forma central como periférica. Tanto en seres humanos como en ratones, los niveles plasmáticos de a-MSH se asocian con cambios en el peso corporal. Además, la a-MSH regula el estado de ánimo y las emociones aumentando la ansiedad.

"Mimético" se refiere a una proteína que imita a otra proteína. Esta imitación es posible ya que la proteína comparte ciertas características con la proteína que imita.

Un "mimético conformacional" se refiere a una proteína que comparte, al menos en parte, la misma conformación que otra proteína.

Los autores de la invención demostraron que la proteína ClpB comparte una homología de secuencia discontinua entre los aminoácidos 542 a 548 de la s Eq ID NO: 1 con la a-MSH, de secuencia de aminoácidos "RWTGIPV" (indicada en la SEQ ID NO: 2). Sin estar limitados por la teoría, esta conformación de la ClpB permite estimular la producción de anticuerpos dirigidos tanto contra la ClpB como contra la a-MSH.

Por lo tanto, la expresión "mimético conformacional" en el presente documento se refiere preferiblemente a la capacidad de estimular la producción de anticuerpos contra la ClpB, así como de auto-anticuerpos contra la a-MSH.

En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso del trastorno al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección.

"Prevenir" se refiere a las medidas adoptadas para prevenir la aparición del trastorno al que se aplica dicho término o, en las primeras etapas de un trastorno. La prevención se refiere además a la inhibición del desarrollo posterior de un trastorno al que se aplica dicho término.

En el contexto de la presente invención, un "sujeto" indica un mamífero humano o no humano, tal como un roedor (rata, ratón, conejo), un primate (chimpancé), un felino (gato) o un canino (perro). Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto según la invención puede ser, en particular, un hombre o una mujer.

Preferiblemente, el sujeto según la invención es mayor de 13 años.

Preferiblemente, el sujeto es una mujer.

Por "trastorno de la conducta alimentaria" (TCA) se entienden enfermedades psiquiátricas definidas según los criterios del Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales, 5a edición (DSM-5) y ediciones anteriores (DSM-4, etc.). Los hábitos alimentarios anormales pueden implicar una ingesta de alimentos insuficiente o excesiva en detrimento de la salud física y mental de una persona. La bulimia nerviosa (BN), la anorexia nerviosa (AN) y el trastorno por atracón (BED) son las formas específicas más comunes de trastornos de la conducta alimentaria. De acuerdo con los criterios del DSM-5, para que se le diagnostique anorexia nerviosa, una persona debe presentar: restricción persistente de la ingesta de energía que conduce a un peso corporal significativamente bajo (en el contexto de lo que se espera mínimamente para la edad, sexo, trayectoria del desarrollo y salud física), ya sea un miedo intenso a ganar peso o convertirse en obeso, o comportamiento persistente que interfiere con el aumento de peso (aunque tenga un peso significativamente bajo), alteración en la forma en que se experimenta el peso o forma corporal, influencia indebida de la forma y el peso corporal en la autoevaluación o falta persistente de reconocimiento de la gravedad del bajo peso corporal actual.

Según los criterios del DSM-5, para que se le diagnostique bulimia nerviosa, una persona debe presentar episodios recurrentes de atracones. Un episodio de atracón se caracteriza por las dos características siguientes: comer, en un período de tiempo discreto (p. ej., dentro de cualquier período de 2 horas), una cantidad de alimento que es definitivamente mayor a la que comería la mayoría de las personas durante un período de tiempo similar y en circunstancias similares y una sensación de falta de control sobre el consumo de alimentos durante el episodio (p. ej., una sensación de que no se puede dejar de comer o controlar qué o cuánto se come), conducta compensatoria inapropiada recurrente con el fin de evitar el aumento de peso, tales como vómitos autoinducidos, uso indebido de laxantes, diuréticos u otros medicamentos, ayuno o ejercicio excesivo. Tanto los atracones como las conductas compensatorias inapropiadas ocurren, en promedio, al menos una vez a la semana durante tres meses. La autoevaluación está excesivamente influenciada por la forma y el peso del cuerpo.

Según los criterios del DSM-5, para que se diagnostique trastorno por atracón, una persona debe presentar episodios recurrentes de atracones. Un episodio de atracón se caracteriza por las dos características siguientes: comer, en un período de tiempo discreto (p. ej., dentro de cualquier período de 2 horas), una cantidad de alimento que es definitivamente mayor a la que la mayoría de las personas comería durante un período de tiempo similar y en circunstancias similares, una sensación de falta de control sobre el consumo de alimentos durante el episodio (p. ej., una sensación de que no se puede dejar de comer o controlar qué o cuánto se come). Los episodios de atracones se asocian con tres o más de lo siguiente:

- comer mucho más rápido de lo normal;

- comer hasta sentirse incómodamente lleno;

- comer grandes cantidades de comida cuando no se siente hambre físicamente;

- comer solo por la vergüenza que se siente por la cantidad que se come;

- sentirse después disgustado consigo mismo, deprimido o muy culpable.

Los atracones se producen, en promedio, al menos una vez a la semana durante tres meses.

Otros tipos de trastornos de la conducta alimentaria incluyen otros trastornos de la conducta alimentaria o de la ingesta de alimentos especificados (OSFED, por sus siglas en inglés Other Specified Feeding or Eating Disorder).

Según los criterios del DSM-5, para que se le diagnostique que padece OSFED, una persona debe presentar una ingesta de alimentos o conductas alimentarias que produzcan angustia y deterioro clínicamente significativos en áreas de funcionamiento, pero que no cumpla con todos los criterios para ninguno de los demás trastornos de la ingesta de alimentos y conducta alimentaria. Luego, se puede asignar un diagnóstico que especifique una razón específica por la que la presentación no cumple con las características específicas de otro trastorno (p. ej., bulimia nerviosa de baja frecuencia). Los siguientes son otros ejemplos de OSFED:

- Anorexia nerviosa atípica: se cumplen todos los criterios, excepto que, a pesar de una pérdida de peso significativa, el peso de la persona esté dentro o por encima del intervalo normal;

- Trastorno por atracón (de baja frecuencia y/o duración limitada): se cumplen todos los criterios para el BED, excepto que con una frecuencia menor y/o durante menos de tres meses;

- Bulimia nerviosa (de baja frecuencia y/o duración limitada): se cumplen todos los criterios para la bulimia nerviosa, excepto que los atracones y la conducta compensatoria inapropiada se producen con una frecuencia menor y/o durante menos de tres meses;

- Trastorno por purga: conducta de purga recurrente para influir en el peso o la forma en ausencia de atracones;

- Síndrome de alimentación nocturna: episodios recurrentes de alimentación nocturna, alimentación después de despertarse del sueño o por consumo excesivo de alimentos después de la cena. El comportamiento no se explica mejor por las influencias ambientales o las normas sociales. El comportamiento causa angustia/deterioro significativos. La conducta no se explica mejor por otro trastorno de salud mental (p. ej., BED) o un trastorno de la ingesta de alimentos o conducta alimentaria no especificado (UFED). Según los criterios del DSM-5, esta categoría se aplica cuando las conductas causan angustia/deterioro del funcionamiento clínicamente significativos, pero no cumplen con todos los criterios de ninguno de los criterios de trastornos de la ingesta de alimentos o conducta alimentaria. Los médicos pueden utilizar esta categoría cuando un médico decide no especificar por qué no se cumplen los criterios, incluidas las manifestaciones en las que puede no haber información suficiente para hacer un diagnóstico más específico (p. ej., en el marco de urgencias).

En el contexto de la presente invención, un trastorno de la conducta alimentaria puede, por lo tanto, referirse a la lista de trastornos anteriormente mencionada.

El trastorno de la conducta alimentaria mencionado en el presente documento puede ser anorexia nerviosa (AN), bulimia nerviosa (BN), trastorno por atracón (BED), alimentación excesiva, hiperfagia o enfermedades consuntivas tales como la caquexia.

Por "apetito" se entiende el deseo de comer alimentos, que se siente como hambre. El apetito existe en todas las formas de vida superiores y sirve para regular la ingesta adecuada de energía para mantener las necesidades metabólicas. Está regulado por una estrecha interacción entre el tracto digestivo, el almacenamiento de energía tal como en el tejido adiposo y el hígado, y el cerebro. El apetito se evalúa en un sujeto midiendo la cantidad de alimento ingerido y evaluando el deseo del sujeto de comer.

La "desregulación del apetito" se refiere a un apetito anormal que incluye un aumento del apetito así como una disminución del apetito que está presente de forma permanente o se repite varias veces a la semana y, por lo tanto, contribuye a la anorexia nerviosa, bulimia nerviosa, caquexia, enfermedad consuntiva, alimentación excesiva, trastorno por atracón e hiperfagia.

La "anorexia" se refiere a la disminución de la sensación de apetito, lo que da como resultado una reducción del apetito. Aunque el término en publicaciones no científicas a menudo se usa indistintamente con anorexia nerviosa, existen muchas causas posibles para la disminución del apetito, algunas de las cuales pueden ser inofensivas, mientras que otras indican una afección clínica grave o representan un riesgo significativo.

La "anorexia nerviosa" (AN) se refiere en el contexto de la invención a un trastorno de la conducta alimentaria caracterizado por una restricción alimentaria desmedida que se caracteriza por la incapacidad de mantener un peso corporal de al menos el 85 % del peso corporal normal. Además, el sujeto que padece anorexia nerviosa tiene un miedo irracional a ganar peso, así como una autopercepción corporal distorsionada, donde el sujeto se ve a sí mismo con sobrepeso a pesar de la abrumadora evidencia de lo contrario.

Por consiguiente, una persona que padece anorexia nerviosa puede tener al menos uno de los rasgos psicológicos seleccionados del grupo que consiste en insatisfacción corporal, deseo de delgadez, perfeccionismo, ineficacia, desconfianza interpersonal, inseguridad social y anhedonia. Una persona que padece anorexia nerviosa puede tener al menos uno de los rasgos psicológicos seleccionados del grupo que consiste en insatisfacción corporal, deseo de delgadez y perfeccionismo. Una persona que padece anorexia nerviosa puede tener al menos uno de los rasgos psicológicos seleccionados del grupo que consiste en ineficacia, desconfianza interpersonal, inseguridad social y anhedonia.

Un sujeto que padece anorexia nerviosa puede tener un IMC inferior a 17.

El "IMC" o "índice de masa corporal" se define como la masa corporal del sujeto dividida por el cuadrado de su altura. Las fórmulas utilizadas universalmente en medicina producen una unidad de medida de kg/m2.

La "bulimia" o "bulimia nerviosa" es un trastorno de la conducta alimentaria que se caracteriza por atracones y purgas, o consumir una gran cantidad de alimentos en poco tiempo, seguido de un intento de eliminar uno mismo los alimentos consumidos (purgas), típicamente vomitando, tomando un laxante o diurético o haciendo ejercicio en exceso. Algunos sujetos pueden tender a alternar entre la bulimia nerviosa y la anorexia nerviosa. Los sujetos que padecen bulimia pueden caracterizarse por un intervalo de IMC normal, normalmente inferior a 25.

El "trastorno por atracón" o "BED" se refiere a un trastorno de la conducta alimentaria caracterizado por atracones que consisten en comer, en un período de tiempo discreto (p. ej., dentro de cualquier período de 2 horas), una cantidad de alimento que es mayor que la que la mayoría de las personas comería en un período de tiempo similar en circunstancias similares, y va acompañado de una sensación de pérdida de control. Los atracones se producen, en promedio, al menos dos veces por semana durante 6 meses. A diferencia de la bulimia, los atracones no están asociados con el uso recurrente de conductas compensatorias inapropiadas. Los sujetos que padecen BED están verdaderamente preocupados por los atracones. Además, los sujetos que padecen BED comen hasta sentirse físicamente incómodos y con náuseas debido a la cantidad de comida consumida y/o comen cuando están aburridos o deprimidos y/o comen grandes cantidades de comida incluso cuando no tienen realmente hambre y/o comen solos durante los períodos de comidas normales, debido a sentimientos de vergüenza por la comida y/o se sienten disgustados, deprimidos o culpables después del atracón. Los sujetos con trastorno por atracón actúan impulsivamente y sienten una falta de control sobre su alimentación. Además, los sujetos que padecen un trastorno por atracón tienen problemas para hacer frente al estrés, ansiedad, ira, tristeza, aburrimiento y preocupación.

Los sujetos que padecen BED pueden ser obesos y tener un IMC superior a 30.

"Comer en exceso" es el consumo de alimentos en exceso en relación con la energía que un organismo gasta (o expulsa por excreción), lo que lleva a la ganancia de peso. Comer en exceso a veces puede ser un síntoma de trastorno por atracón o bulimia. Las personas que comen en exceso de forma compulsiva dependen de la comida para consolarse cuando están estresadas, sufren episodios de depresión y tienen sentimientos de impotencia.

La "hiperfagia", también conocida como "polifagia", se refiere al hambre excesiva (compulsiva) o al aumento del apetito. La hiperfagia puede ser causada por trastornos tales como la diabetes, el síndrome de Kleine-Levin, los trastornos genéticos del síndrome de Prader-Willi y síndrome de Bardet Biedl.

La "enfermedad consuntiva" se refiere al proceso por el cual una enfermedad debilitante hace que el tejido muscular y graso se "consuma". La consunción se puede producir por una ingesta de energía extremadamente baja (p. ej., causada por una hambruna), pérdida de nutrientes a causa de una infección o a una combinación de ingesta baja y pérdida elevada.

La "caquexia" es un síndrome consuntivo asociado con la pérdida de peso y/o la atrofia muscular y/o la fatiga, la debilidad y la pérdida significativa del apetito, que puede ser producida por cáncer, SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, esclerosis múltiple, insuficiencia cardíaca congestiva, tuberculosis, polineuropatía amiloide familiar, envenenamiento por mercurio (acrodinia) y deficiencia hormonal. La caquexia, o consunción, como también se la denomina, se observa en varias enfermedades, tales como el SIDA, cáncer, después de fractura de cadera, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad pulmonar crónica tal como enfermedad del pulmón obstructiva crónica (COLD) y/o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), cirrosis hepática, insuficiencia renal y enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide y lupus sistémico, sepsis e infección grave. Además, la consunción también se observa en el envejecimiento

El principal signo de caquexia es la pérdida de peso, no solo del tejido adiposo sino también del tejido muscular e incluso del hueso. Este tejido no adiposo también se conoce como "masa corporal magra".

Además, hay pérdida de apetito, debilidad (astenia) y una disminución del nivel de hemoglobina (anemia).

La caquexia se encuentra en el estado terminal de muchas afecciones clínicas diferentes o en enfermedades crónicas tales como el cáncer, infecciones, SIDA, insuficiencia cardíaca congestiva, artritis reumatoide, tuberculosis, después de fractura de cadera, fibrosis quística y enfermedad de Crohn. También puede ocurrir en ancianos que no tienen ningún síntoma evidente de la enfermedad.

"Aumento del apetito" se refiere a un apetito en donde un sujeto tiene una ingesta de alimentos mayor que la que el cuerpo requiere. Esto puede producir o no ganancia de peso.

Por lo tanto, "apetito normal" se refiere a un sujeto que tiene una ingesta de alimentos que corresponde a la cantidad de alimento que el cuerpo requiere.

"Disminución del apetito" y/o "apetito reducido" se refiere a un apetito en donde un sujeto tiene una ingesta de alimentos menor que la que el cuerpo requiere. Esto puede producir o no pérdida de peso.

La "ingesta de alimentos" se puede medir utilizando una multitud de técnicas incluida la autocomunicación usando, p. ej., diarios o cuestionarios, la medición de la ingesta calórica de una comida tipo bufé, usando el pesaje de los alimentos antes de la ingestión o el pesaje y análisis de cantidades combinadas de alimentos. La ingesta de alimentos se puede medir por comidas, de manera diaria, semanal o mensual.

En una realización, la composición es para disminuir la ganancia de peso en el sujeto.

La composición puede usarse, por ejemplo, para disminuir el apetito, en donde el aumento del apetito se debe a un trastorno por atracón o a comer en exceso.

En una realización, la composición oral para usar según la invención da como resultado una disminución de al menos 1 % en la ingesta de alimentos, tal como una disminución del 2 %, más preferiblemente 3 % o 5 % o 7 %, e incluso más preferiblemente del 10 % por debajo de la ingesta promedio de alimentos antes del inicio del tratamiento.

En otra realización, la composición oral para usar conduce a una disminución de la ingesta de calorías independientemente de los cambios en la ingesta de alimentos, ya que la cantidad de alimento ingerido puede no estar directamente relacionada con las calorías ingeridas, ya que los diversos productos alimenticios, tales como grasas, carbohidratos y proteínas, contienen diferentes cantidades de calorías por cantidad de alimento.

En una realización de la invención, la composición oral para usar da como resultado una disminución de al menos 1 % en la ingesta de calorías, tal como una disminución del 2 %, más preferiblemente 3 % o 5 % o 7 %, e incluso más preferiblemente una disminución del 10 % en la ingesta de calorías por debajo de la ingesta promedio de calorías antes del inicio del tratamiento.

En una realización, la composición oral usada en el contexto de la invención es una composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas usadas en el contexto de la invención se diseñan preferiblemente para que sean apropiadas para el modo o vía de administración seleccionados, y se usan diluyentes, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes dispersantes, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares, según sea apropiado. Dichas composiciones pueden diseñarse de acuerdo con técnicas convencionales como se describe, por ejemplo, en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se administran por vía oral en la forma de una forma farmacéutica unitaria adecuada. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en muchas formas que incluyen comprimidos, cápsulas de gelatina duras o blandas, soluciones acuosas, suspensiones y liposomas y otras formulaciones de liberación lenta, tales como geles poliméricos conformados.

El modo de administración y las formas farmacéuticas están estrechamente relacionados con las propiedades de los agentes o composiciones terapéuticas que son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar mediante cualquier método conocido en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos, o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas composiciones farmacéuticas líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles) o conservantes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden contener excipientes tales como aromatizantes, colorantes, agentes antimicrobianos o conservantes.

El régimen de administración puede ser, por ejemplo, durante un período de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 días.

El intervalo de dosis depende de la composición que se va a administrar y se define anteriormente.

Como es bien sabido en la técnica médica, las dosis para cualquier sujeto dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, compuesto particular que se va a administrar, sexo, hora y vía de administración, estado de salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente.

El sobrepeso o el peso corporal demasiado bajo también pueden considerarse en ciertas culturas como una apariencia física que se considera menos atractiva.

En un ejemplo, una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz es al menos la dosis mínima, pero menos que una dosis tóxica, de un agente activo que es necesaria para conferir un beneficio terapéutico o beneficio a un sujeto. Dicho de otra manera, dicha cantidad para tratar trastornos de la conducta alimentaria, por ejemplo, es una cantidad que induce, mejora o produce de otro modo una mejora en el estado del sujeto, como la regulación de la ingesta de alimentos.

Por "probiótico" se entiende un aditivo alimentario que comprende una cantidad eficaz de un microorganismo, destinado a ser introducido en la dieta. Según la OMS, los probióticos son microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del hospedante (OMS, 2001).

Las bacterias que expresan ClpB son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden identificarse por cualquier técnica convencional.

En un ejemplo, la bacteria que expresa ClpB en la que se elimina la expresión de la proteína se selecciona del grupo constituido por bacterias conocidas como bacterias no patógenas probióticas o comensales en seres humanos, p. ej.,Escherichia colino patógena.

Por "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de bacterias que permite la manifestación del efecto deseado, en el contexto de la invención, el tratamiento o la prevención de trastornos de la conducta alimentaria. En particular, se entiende una cantidad de entre 1000 millones y 10.000 millones de UFC.día-1.

A lo largo de toda la presente solicitud, el término "que comprende" debe interpretarse como que abarca todas las características mencionadas específicamente, así como las opcionales, adicionales, no especificadas. Como se usa en el presente documento, el uso del término "que comprende" también describe la realización en donde no están presentes características distintas de las características mencionadas específicamente (es decir, "que consiste en"). La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.

Secuencias

La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína chaperona ClpB de E. Coli K12 indicada con el número de referencia de NCBI NP_417083.1 e indicada con la entrada de Uni-Prot P63284.

La SEQ ID NO: 2 muestra los aminoácidos 542 a 548 de la secuencia de aminoácidos de la proteína chaperona ClpB de E. Coli K12 de la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la a-MSH del Homo sapiens indicada con la secuencia ID de Gen Pept, PRF: 223274.

La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de los cebadores de nucleótidos de ClpB.

La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de los cebadores de nucleótidos de ClpB.

Figuras

Figura 1: Identificación proteómica del mimetismo molecular entre proteínas de E. coli K12 y a-MSH.

(a) GE 2D de proteínas citoplasmáticas de E. coli. (b, c) Inmunotransferencias de proteínas de E. coli detectadas con IgG Rb anti-a-MSH, con preabsorción (c) o no (b) con a-MSH. Los círculos rojos rodean las manchas reconocidas específicamente por la IgG de a-MSH que se utilizaron para la identificación de proteínas. Los círculos en azul indican manchas no específicas. Las proteínas identificadas en las manchas 1-4 son isoformas de ClpB. (d) Alineamientos de secuencias de aminoácidos de a-MSH y ClpB usando el programa Stretcher. (e) Transferencia Western de la ClpB recombinante, revelado con IgG anti-a-MSH. Bandas 1 y 2, 20 y 10 pg de ClpB, respectivamente.

Figura 2. Inmunización con CIpB en ratones.

Los ratones inmunizados con ClpB (ClpB+Ady) se compararon con ratones que recibieron adyuvante (Ady), PBS o controles (Ctr). (a) Cambios en el peso corporal durante 32 días del estudio. La ingesta de alimentos y el patrón de alimentación se estudiaron durante las últimas 2 semanas en las jaulas BioDAQ. La ingesta diaria media de alimentos (b), el tamaño de las comidas (c) y el número de comidas (d) durante los últimos 10 días del estudio. (e) Ingesta de alimentos durante 24 h después de la inyección de a-MSH (100 gg.kg-1 de peso corporal, i.p.) o PBS. (f) Niveles plasmáticos de IgG reactiva con ClpB antes y después de la adsorción con a-MSH 10-6 M. (g) Afinidad de la IgG anti-ClpB mostrada como las constantes de equilibrio de disociación (valores de KD). (h) Niveles plasmáticos de IgG total reactiva con a-MSH. (i) Afinidad (KD) de la IgG anti-a-MSH. (j) Ensayo de cAMP en células 293 de riñón embrionario humano que sobreexpresan el MC4R después de la estimulación con a-MSH sola o junto con IgG (0,5 mg.ml-1) mezcladas de ratones inmunizados con ClpB o a los que se inyectó Ady. (k) El ensayo de cAMP se realizó con IgG empobrecida en IgG anti-a-MSH. (a) Análisis de varianza (ANOVA) de doble vía de mediciones repetidas antes de la inyección de a-MSH (100 gg.kg-1 de peso corporal, i.p.), Po0,0001, pruebas a posteriori de Bonferroni *a al menos, Po0,05 grupo ClpB frente a Ctr; *b al menos, Po0,05 grupo Ady frente a Ctr.; *c, Po0,05, prueba t de Student grupo ClpB frente a PBS; y *d, Po0,05, prueba t de Student grupo ClpB frente a Ctr. (b) An Ov A P=0,0002, pruebas a posteriori de Tukey ***Po0,001, **Po0,01, #Po0,05, prueba t de Student. (c) ANOVA P = 0,007, pruebas a posteriori de Tukey **Po0,01. (e) Prueba t de Student, *Po0,05. (f, g) ANOVA Po0,0001, pruebas a posteriori de Tukey ***Po0,001 ClpB Ady frente a otros grupos, prueba t de datos emparejados ##Po0,01, ###Po0,001. (h) ANOVA P =0,0002, pruebas a posteriori de Tukey ***Po0,001, *Po0,05; (i) Prueba de Kruskal-Wallis P =0,003, prueba a posteriori de Dunn **Po0,01, (media ±e.e.m., n=8) . (j)<a>N<o>VA P= 0.005, prueba a posteriori de Tukey *Po0,05; ANOVA P =0,04, prueba t de Student #Po0,05, aClpB frente a a-MSH, bClpB frente a Ady. (media ± e.e.m.; j, n =6, k, n=3).

Figura 3: Suplementación con E. coli en ratones.

Efectos de la administración por sonda intragástrica diaria (días 1-21) en ratones con E. coli K12 de tipo natural (WT), E. coli K12 deficiente en ClpB (AClpB) o medio LB en el peso corporal (a), la ingesta de alimentos (b), el tamaño de la comida (c) y el número de comidas (d). (e) Detección por PCR de un fragmento de 180 pares de bases del ADN de ClpB bacteriano, primera banda, marcador de peso molecular, segunda banda ADN de cultivos in vitro de E. coli K12 WT, tercera banda ADN de cultivos in vitro de E. coli K12 AClpB y las bandas restantes ADN de heces de ratones recogidas el día 21. Niveles plasmáticos de densidad óptica en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de IgM (f) e IgG (g) anti-ClpB antes y después de la adsorción con a-MSH 10-6 M.

Niveles plasmáticos de IgM (h) e IgG (i) anti-a-MSH. (j) Afinidad (constante de equilibrio) de la IgG anti-a-MSH. (a) Análisis de varianza (ANOVA) de doble vía con mediciones repetidas, P=0,3, prueba a posteriori de Bonferroni día 2, **Po0,01 control (Ctr) frente a E. coli WT. (b) ANOVA días 1-2 , P=0,0006, pruebas a posteriori de Tukey ***Po0,001, *Po0,05, E. coli W<t>frente a aCtr y bLB. (c) Prueba de Kruskal-Wallis (K-W) en la tercera semana P=0,0001, pruebas a posteriori de Dunn, ***Po0,001, **Po0,01, E. coli WT frente a aCtr, bLB y CAClpB. (d) ANOVA días 1-2 , P=0,006, pruebas a posteriori de Tukey **Po0,01, *Po0,05, prueba K-W de tercera semana Po0,0001, pruebas a posteriori de Dunn, ***Po0,001, **Po0,01, E. coli W<t>frente a aCtr, bLB y CAClpB. (f) Prueba K-W, antes de la adsorción P=0,02, pruebas a posteriori de Dunn *Po0,05, ANOVA después de adsorción, Po0,0001, pruebas a posteriori de Tukey **Po0,01, E. coli WT frente a otros grupos. (g) ANOVA antes de adsorción, P=0,01, pruebas a posteriori de Tukey *Po0,05, E. coli WT frente a otros grupos, prueba t de datos emparejados ##Po0,01. (h) Prueba t de Student, E. coli WT frente a otros grupos *Po0,05. (j) Prueba K-W P=0,02, prueba a posteriori de Dunn *Po0,05, prueba de Mann-Whitney, #Po0,05. (media ± e.e.m., n=8).

Figura 4. Anticuerpos anti-ClpB en pacientes con TCA.

Niveles plasmáticos de IgG (a) e IgM (b) anti-ClpB en mujeres sanas (control, Ctr) y en pacientes con AN, BN y BED. Niveles plasmáticos de IgG (c) e IgM (d) de ClpB antes y después de la adsorción con a-MSH 10-6 M. Porcentaje de IgG (e) e IgM (f) anti-ClpB con reacción cruzada con a-MSH. (b) Prueba t de Student, *Po0,05. (c, d) Pruebas t de datos emparejados, ***Po0,001, **Po0,01. (e) Prueba de Kruskal-Wallis Po0,0001, prueba a posteriori de Dunn, **Po0,01, prueba de Mann-Whitney #Po0,05. (f) Análisis de la varianza P = 0,02, prueba a posteriori de Tukey *Po0,05. (media ± e.e.m., Ctr, n=65, AN, n=27 BN, n=32 y BED, n=14).

Figura 5. Concentraciones plasmáticas de la proteína ClpB bacteriana en pacientes con trastornos de la conducta alimentaria y controles sanos (Ctr).

AN, anorexia nerviosa, BN, bulimia nerviosa, BED, trastorno por atracón. *p<0,05 Prueba t de Student de las concentraciones medias de ClpB frente a Ctr. Porcentaje ( %) de pacientes que tienen concentraciones de ClpB superiores a la media+2 desviaciones estándar (SD) respecto a los controles.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos demuestran que la proteína chaperona ClpB de bacterias intestinales comensalesE. coliK12 es un mimético conformacional de la hormona estimulante de melanocitos a (a-MSH), un neuropéptido implicado en la regulación del metabolismo energético y las emociones. También ponen de manifiesto un vínculo molecular entre las bacterias intestinales que expresan la ClpB y la regulación de la conducta motivada y las emociones mediante la producción de la proteína CIpB y anticuerpos anti-CIpB con reacción cruzada con la a-MSH. Además, respaldan la implicación de los microorganismos que expresan ClpB en el aumento de la producción de proteínas ClpB y anticuerpos de ClpB y en el establecimiento de una conducta alimentaria y emociones anormales.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Cultivo de E. coli K12 y extracción de proteínas

La cepa bacteriana utilizada en este estudio era E. coli K12, proporcionada por el laboratorio UMR 6270 de CNRS de la Universidad de Rouen, Francia. E. coli K12 se cultivó en 250 ml de caldo Luria Bertani (LB) (MP Biomedicals, Illkirch, Francia) a 37 °C durante 24 h. La extracción de proteínas se realizó como describen Marti et al.(PLoS ONE2011, e26030). En resumen, las bacterias se recogieron por centrifugación a 4000 g durante 30 minutos a 4 °C y el sedimento resultante se resuspendió en tampón de extracción (NaCl 300 mM y Tris-HCl 20 mM, pH 8). La suspensión se perturbó por sonicación (3 x 3 min, pulso 1 s encendido, 1 s apagado al 21 % de amplitud) y se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos a 4 °C. El líquido sobrenadante se recuperó y se ultracentrifugó a 4 °C durante 45 min a 60.000 g para separar adicionalmente las proteínas en fracciones citoplasmáticas (líquido sobrenadante) y de envoltura (sedimento). Las concentraciones de proteínas se midieron usando el kit 2-D Quant (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.).

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida

Para la electroforesis bidimensional (2D) en gel de poliacrilamida (PAGE), se añadieron 400 pg de extracto de proteínas de E. coli K12 al tampón de isoelectroenfoque (urea 7 M, tiourea 2 M y anfolitos al 0,5 %, pH 4-7, DTT 20 mM, TBP 2 mM, CHAPS al 2 % y azul de bromofenol al 0,005 %) y se solubilizó durante 60 min a temperatura ambiente con una ligera agitación. La separación en gel de la primera dimensión se llevó a cabo usando la tira ReadyStrip IPG (18 cm, pH 4-7 NL, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francia). Después de 24 h de rehidratación pasiva de la tira con un tampón de isoelectroenfoque, la muestra de proteína se añadió a las tiras mediante una copa de carga colocada a 1,5 cm del cátodo. El isoelectroenfoque se realizó con el sistema Ettan iPGphor 3 (GE Healthcare, Orsay, Francia) en cuatro etapas (31.500 Vh): 500 V durante 1 h, gradiente a 1000 V, gradiente a 10.000 V y 10.000 V durante 2 h. Tras dos etapas de equilibrio con DTT al 2 % y yodoacetamida al 2,5 %, respectivamente, se realizó la segunda dimensión, es decir, una SDS-PAGE (gel de poliacrilamida al 10 %, 20 cm x 18 cm x 1 mm) en un sistema de electroforesis vertical Ettan Daltsix (GE Healthcare) con 12 mA por gel. Tras la SDS-PAGE, el gel 2D se fijó durante 2 h en ácido ortofosfórico al 2 % (vol:vol) y en metanol al 50 % (vol:vol) a temperatura ambiente. A continuación, los geles se enjuagaron con agua y las manchas de proteína se visualizaron mediante tinción con CBB G-250 (Bio-Rad) (34 % (vol:vol) metanol, sulfato de amonio al 17 % (p/vol), ácido ortofosfórico al 2 % (vol:vol) y 0,66 g de CBB G-250 por litro).

Inmunotransferencia

Tras la 2D-PAGE, las proteínas citoplasmáticas de E. coli se transfirieron a una membrana PVDF Hybond-ECL (GE Healthcare) mediante un método de transferencia en seco (Trans Blot Cell, Bio-Rad, EE. UU.) y una corriente constante de 0,8 mA.cm-2 del tamaño de la membrana durante 2 h. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con leche al 5 % (p:vol) (Regilait, Francia) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Tris 10 mmol.l-1, pH 8 y NaCl 150 mM.I-1) más Tween 20 al 0,05 % (vol:vol). Después de los lavados, las membranas se incubaron durante una noche a 4 °C con IgG policlonal antia-MSH de conejo (1:1000, Peninsula Laboratories, San Carlos, California, EE. UU.), seguidas de lavados e incubación con Ig policlonales de cerdo conjugadas con peroxidasa de rábano picante (1:3000; Dako, Trappes, Francia). Las inmunotransferencias se revelaron mediante el sistema de detección ECL (GE Healthcare) y se escanearon con ImageScanner II (GE Healthcare) previamente calibrados usando un marcador de escala de grises (Kodak) y digitalizados con el software Labscan 6.00 (GE Healthcare). El mismo procedimiento se realizó tras la adsorción de IgG anti-a-MSH de conejo con péptido a-MSH 10-6 M (Bachem AG, Bubendorf, Suiza) durante la noche a 4 °C.

Identificación de proteínas

Las manchas de las proteínas de interés se escindieron de los geles 2D teñidos con CBB G-250 utilizando el Ettan Spot Picker (GE Healthcare), y la digestión automatizada de las proteínas en gel se realizó en el Ettan Digester (GE Healthcare). A continuación, los extractos de proteínas se resuspendieron en 10 pl de acetonitrilo al 5 % (vol:vol) /ácido fórmico al 0,1 % (vol:vol) y luego se analizaron con un sistema nano-LC1200 acoplado a un espectrómetro de masas 6340 Ion Trap equipado con una fuente de Nanospray y una interfaz HPLC-chip cube (Agilent Technologies, Courtaboeuf, Francia). En resumen, los péptidos se enriquecieron y se desalaron en una columna trampa RPC18 de 40 nl y se separaron en una columna C18 Zorbax (tamaño de poros de 30 nm, tamaño de partículas 5 pm)) (43 mm de largo x 75 pm de diámetro interior; Agilent Technologies). Se usó un gradiente lineal de 9 min (acetonitrilo al 3-80 % en ácido fórmico al 0,1 %) a una velocidad de flujo de 400 nl.min-1, y el eluyente se analizó con un espectrómetro de masas Ion Trap. Para la identificación de proteínas, se extrajeron las listas de picos de MS/MS y se compararon con las bases de datos de proteínas utilizando el motor de búsqueda MASCOT Daemon versión 2.2.2 (Matrix Science). Las búsquedas se realizaron con los siguientes parámetros específicos: especificidad enzimática, tripsina; se permite una escisión omitida; sin modificaciones fijas; modificaciones variables, oxidación de metionina, carbamidometilación de cisteína, fosforilación de serina, tirosina y treonina; monoisotópico; carga peptídica, 2+ y 3+; tolerancia de masa para iones precursores, 1,5 Da; tolerancia de masa para fragmentaciones, 0,6 Da; ESI-TRAP como instrumento; taxonomía, E. coli; Base de datos del Centro nacional para la información biotecnológica (NCBI) (NCblnr 20120531 (18280215 secuencias, 6265275233 restos); Bethesda, MD, EE. UU.). Las coincidencias de proteínas se validaron automáticamente si cumplían uno de los siguientes criterios: identificación con al menos dos péptidos de clasificación alta (negrita y rojo), cada uno con una puntuación MASCOT de 454 (Po0,01), o al menos dos péptidos de clasificación alta, cada uno con una puntuación MASCOT de 447 (Po0,05). Para evaluar las tasas de falsos positivos, todas las búsquedas iniciales en las bases de datos se realizaron utilizando la opción "señuelo" de MASCOT. Los resultados se consideraron relevantes si la tasa de falsos positivos no superaba nunca el 1 %.

Identificación de proteínas del OFFGEL

La separación de proteínas de E. coli K12 de alta resolución en 24 fracciones se realizó en el fraccionador 3100 OFFGEL usando el kit OFFGEL pH3-10 (Agilent Technologies). La preparación y el ensamblaje de muestras de proteínas (400 gg) de todas las partes de los sistemas OFFGEL se hicieron de acuerdo con los procedimientos descritos en la Guía de inicio rápido de Agilent. El fraccionamiento de OFFGEL se realizó utilizando el programa estándar OG24PRO con parámetros de corriente máxima limitada (8000 V, 50 gA y 200 mW) hasta alcanzar 64 kVh después de 30 h. Al final del experimento, todas las fracciones se transfirieron a un pocillo profundo de 0,8 ml (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Francia) y se almacenaron a -20 °C. Nueve fracciones que contenían proteínas recuperadas de la parte central del OFFGEL se estudiaron mediante transferencia Western utilizando IgG anti-a-MSH de conejo (Peninsula Laboratories), seguida de la identificación de las proteínas como se describió anteriormente.

Inmunización y conducta en ratones

Todos los protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. y las directivas de la UE, y los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités Éticos Institucionales. Ratones C57BI6 macho de dos meses de edad (Janvier Laboratories, L'Arbresle, Francia) se aclimataron al animalario durante 1 semana con ciclo de luz-oscuridad de 12 h, las luces se encendían a las 07:00 horas y se mantuvo cada uno en jaulas estándar para ratones (n = 8). Los ratones se alimentaron a voluntad con pienso comprimido estándar para roedores (dieta RM1, SDS, Reino Unido) con agua potable siempre disponible y se manipularon diariamente sujetándolos suavemente y midiendo el peso corporal. Durante la aclimatación, los ratones se distribuyeron entre cuatro jaulas para obtener un peso corporal medio similar por ratón por jaula. Después de 1 semana de aclimatación, los ratones de cada jaula se asignaron a uno de cuatro grupos de estudio y recibieron los siguientes tratamientos: (i) Grupo 1, inmunización con ClpB (n = 8): Proteína ClpB (Delphi Genetics, Gosselies, Bélgica) 50 gg por ratón en 200 gl de PBS con adyuvante completo de Freund (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) 1:1 (vol:vol), por vía intraperitoneal (i.p.); (ii) Grupo 2, controles de inyección de adyuvante (n = 8): 200 gl de adyuvante completo de Freund en PBS (1:1 (vol:vol), i.p.); (iii) Grupo 3, controles de inyección de PBS (n = 8): 200 gl de PBS (i.p.); y (iv) Grupo 4, controles intactos (n = 8): no recibieron inyecciones y, a continuación, todos los ratones se devolvieron a sus jaulas de mantenimiento. Quince días después, los ratones recibieron una inmunización de refuerzo y los siguientes tratamientos: (i) Grupo 1 (n = 8), proteína ClpB (Delphi Genetics) 50 gg por ratón en 200 gl de PBS con adyuvante incompleto de Freund (Sigma) 1:1 (vol:vol) i.p.; (ii) Grupo 2 (n = 8): 200 gl de adyuvante incompleto de Freund en PBS (1:1 (vol:vol), i.p.); (iii) Grupo 3, (n = 8): 200 gl de PBS (i.p.); y iv) Grupo 4, (n = 8): no recibieron inyecciones. Al día siguiente del refuerzo, los ratones se pusieron individualmente en las jaulas para ratones BioDAQ (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, EE. UU.), cada una equipada con un monitor de alimentación automático. Los alimentos (Serlab, Montataire, Francia) y el agua potable estaban disponibles a voluntad y el peso corporal se midió a diario. Después de 3 días de aclimatación a las jaulas BioDAQ, los ratones recibieron los siguientes tratamientos: Los grupos 1, 2 y 3 (cada uno n = 8), es decir, los ratones que habían sido inmunizados con ClpB, a los que se inyectó adyuvantes y PBS, respectivamente, recibieron una inyección aguda de péptido a-MSH (Bachem AG), 100 gg.kg-1 de peso corporal en 100 gl de PBS (i.p.) a las 10:00 horas. Los ratones de control (n = 8) recibieron solo PBS (i.p.). Los datos de alimentación se vigilaron y analizaron continuamente utilizando el visor de datos BioDAQ 2.3.07 (Research Diets). Para el análisis del patrón de comidas, el intervalo entre comidas se estableció en 300 s.

Tras el estudio de alimentación, los ratones se pusieron en jaulas de mantenimiento de ratones individuales con comida y agua disponibles a voluntad, y se analizó la actividad locomotora y la ansiedad en las pruebas de laberinto en O (Med Associate, Inc., St Albans, VT, EE. UU.) realizadas durante 2 días consecutivos. Dos horas después de la prueba del laberinto en O, los ratones se sacrificaron por decapitación en una guillotina y la sangre del tronco se recogió en tubos que contenían EDTA. El plasma se separó por centrifugación a 3500 r.p.m. (1,4 g) durante 10 min a 4 °C y se almacenó a -80 °C antes del ensayo.

Pruebas de actividad locomotora y ansiedad

Después del estudio de alimentación en las jaulas BioDAQ, se analizó la actividad locomotora de los ratones utilizando un monitor de actividad animal Versamax (AccuScan Instruments, Inc., Columbus, OH, EE. UU.). Al día siguiente después de la prueba de actividad locomotora, se analizó la ansiedad en todos los ratones en un laberinto en O elevado. El laberinto en O elevado es una variación del laberinto en cruz elevado más utilizado, validado farmacológicamente para las pruebas de ansiedad en roedores. La ventaja del laberinto en O es que carece del cuadrado central ambiguo del laberinto en cruz tradicional. El laberinto en O consistía en una plataforma infrarroja circular (120 cm de diámetro exterior) elevada 80 cm por encima del suelo, que tiene dos segmentos abiertos y dos cerrados de plástico gris. Los segmentos cerrados estaban rodeados por paredes que se extendían 20 cm por encima de la superficie del laberinto y estaban cubiertos con una tapa negra de plexiglás para infrarrojo. Cada prueba comenzaba poniendo el ratón en uno de los dos segmentos cerrados. La prueba duraba 5 minutos y se grababa usando una cámara de vídeo colocada sobre el laberinto en O y el software de seguimiento de vídeo EthoVision (Noldus IT, Wageningen, Países Bajos). Se analizaron las mediciones de distancia y tiempo que pasaban en los segmentos abiertos y cerrados. Entre cada prueba con ratones, el laberinto en O se limpió con etanol al 30 %.

Ensayo de autoanticuerpos de ClpB y a-MSH

Los niveles plasmáticos de auto-Ab que reaccionan con ClpB, a-MSH y la hormona adrenocorticotrópica se midieron usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de acuerdo con un protocolo publicado (Fetissov SO.,Methods Biol Mol2011). En resumen, la proteína ClpB (Delphi Genetics), la a-MSH o los péptidos de hormona adrenocorticotrópica (Bachem AG) se aplicaron como recubrimiento en placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Rochester, NY, E<e>. UU.) utilizando 100 pl y una concentración de 2 pg.ml-1 en tampón de NaHCO3 100 mM, pH 9,6, durante 72 h a 4 °C. Las placas se lavaron (5 min tres veces) en PBS con Tween 200 al 0,05 %, pH 7,4, y luego se incubaron durante una noche a 4 °C con 100 pl de plasma de ratón diluido 1:200 en PBS para determinar los niveles de auto-Ab libres o se diluyeron 1:200 en NaCl 3 M disociativo y tampón de glicina 1,5 M, pH 8,9, para determinar los niveles totales de auto-Ab. Las placas se lavaron (tres veces) y se incubaron con 100 pl de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (1:2000) o anti-IgM de ratón (1:1000) conjugado con fosfatasa alcalina (AP), todos obtenidas de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, EE. UU.). Tras el lavado (tres veces), se añadieron 100 pl de solución de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) como sustrato de AP. Después de 40 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se detuvo añadiendo NaOH 3 N. La densidad óptica se determinó a 405 nm usando un lector de microplacas Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwán). Los valores de densidad óptica del blanco resultantes de la lectura de las placas sin la adición de muestras de plasma se restaron de los valores de densidad óptica de las muestras. Cada determinación se realizó por duplicado. La variación entre los valores duplicados era inferior a 5 %. Se usó un protocolo similar para medir las IgG e IgM anti-ClpB en el plasma humano (1:400) usando los correspondientes anticuerpos anti-IgG o IgM humana conjugados con AP (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.).

Absorciones de anticuerpos de ClpB con a-MSH

Las muestras de plasma de ratones, diluidas a 1:200 en PBS, o de seres humanos, diluidas a 1:400 en PBS, se preincubaron con péptido a-MSH 10-6 M (Bachem AG) durante una noche a 4 °C antes de añadir las muestras a placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) recubiertas con proteína ClpB (Delphi Genetics). Los anticuerpos IgG e IgM reactivos con ClpB se detectaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas utilizando los correspondientes anticuerpos anti-ratón o anti-humano conjugados con AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), como se describió anteriormente. El porcentaje de anticuerpos de ClpB con reacción cruzada con la a-MSH se calculó respecto a los niveles de anticuerpos anti-ClpB detectados sin absorción en cada muestra de plasma individual, igual al 100 %.

Purificación de IgG del plasma

La purificación de IgG y el ensayo de afinidad se realizaron de acuerdo con un protocolo publicado (Legrand et al., Protoc Exch 2014, doi:10.1038/protex2014.004). La extracción de las globulinas del plasma se realizó mediante acidificación y separación del plasma en una columna C18 SEP (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, EE. UU.), luego se mezclaron 500 pl de plasma de ratón con 500 pl de tampón A (ácido trifluoroacético al 1 % en agua). La columna se activó en 1 ml de tampón B (acetonitrilo al 60 % en ácido trifluoroacético al 1 %) mediante centrifugación de 3 min a 700 r.p.m. y se enjuagó tres veces con 3 ml de tampón A. Se añadió plasma diluido (1:1 en tampón A) a la columna y el efluente (1 ml) se guardó (congelado a -20 °C) para la purificación adicional de la IgG. La IgG total se purificó de los efluentes de las muestras de plasma de ratón utilizando el kit del gel Melon (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.). Los efluentes plasmáticos diluidos 1:4 en el tampón de purificación del kit se añadieron sobre gel Melon lavado depositado en una columna. La columna se centrifugó 1 min a 6000 r.p.m., y el efluente que contenía IgG se guardó y se congeló a -20 °C antes de la liofilización. Las IgG liofilizadas se reconstituyeron en el tampón HBS-EP (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.). Para el experimento de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), las IgG purificadas de ocho ratones del grupo de ClpB y del control con adyuvante se combinaron, respectivamente, en dos grupos que se dividieron en dos partes. Una parte se usó directamente en el ensayo de cAMP y la otra se purificó adicionalmente usando cromatografía de afinidad para a-MSH (Bachem AG) como recubrimiento sobre perlas UltraLink activadas (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Los efluentes de IgG empobrecidos en IgG de a-MSH se guardaron, se liofilizaron y se diluyeron en PBS.

Ensayo de cinética de afinidad

La cinética de afinidad de la IgG de ratón para ClpB y a-MSH se determinó mediante un análisis de interacción bioespecífica basado en el fenómeno de resonancia del plasmón superficial en un instrumento BIAcore 1000 (GE Healthcare). La a-MSH (Bachem AG) o proteína ClpB (Delphi Genetics) se diluyeron hasta 0,5 mg.ml-1 en tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 5,0 (GE Healthcare), y se acoplaron covalentemente sobre los chips sensores CM5 (GE Healthcare) usando el kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare). Todas las medidas se realizaron en los mismos chips recubiertos con a-MSH o ClpB. Para el análisis cinético de afinidad, se realizó un método multiciclo con cinco diluciones en serie de cada muestra de IgG: 3360, 1680, 840, 420 y 210 (nmol), incluyendo un duplicado de 840 nmol y una muestra del blanco (solo tampón HBS-EP). Cada ciclo incluía 2 min de inyección de analito y 5 min de disociación con velocidad de flujo de 30 gl.min-1 a 25 °C.

Entre las inyecciones de cada muestra, la superficie de unión se regeneró con NaOH 10 mM, que daba como resultado el mismo nivel inicial del sensograma. Los datos cinéticos de afinidad se analizaron utilizando el programa BiaEvaluation 4.1.1 (GE Healthcare). Para ajustar los datos cinéticos, se utilizó el modelo 1:1 de Langmuir y los valores de la muestra se corrigieron restando los valores del blanco.

Ensayo de cAMP in vitro

La línea celular estable de células 293 de riñón embrionario humano que expresan MC4R humano se generó usando una tecnología de transducción lentiviral y se adquirió en Amsbio (Oxon, Reino Unido). La alta expresión del ARNm del MC4R en las células transfectadas se validó mediante PCR de transcripción inversa en Amsbio y en nuestro laboratorio. La presencia del transgén en las células antes de cada experimento se verificó mediante la visualización en un microscopio de fluorescencia de la proteína fluorescente verde, cuyo gen se insertó en el mismo con el lentivector MC4R pero con un promotor diferente. El péptido a-MSH (Bachem<a>G) se diluyó en el tampón de inducción: PBS, IBMX 500 gM, RO 20-1724 100 gM (Sigma), MgCl220 mM hasta las concentraciones finales de 2, 1, 750, 500, 250, 100, 75, 50 y 10 nM correspondientes a las dosis de a-MSH de 0,6, 3, 4,5, 6, 15, 30, 45, 60 y 120 pmol, respectivamente, y también se incluyó una muestra de blanco. Después de descongelar, las células se cultivaron en frascos de cultivo tisular de 250 ml (BD-Falcon, Beckton-Dickinson, Bedford, MA, EE. UU.) en el medio Eagle modificado de Dulbecco, 4,5 g.l-1 de glucosa (Eurobio, Courtaboeuf, Francia) complementado con (L-glutamina 2 mM, suero de ternero fetal al 10 %, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y penicilina-estreptavidina al 1 %) en incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C, 5 % de CO2 durante 8-10 días. El día del experimento, las células de riñón embrionario humano 293 con MC4R cultivadas se trataron con tripsina-EDTA al 0,25 % (Sigma-Aldrich) y los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS para obtener 5000 células por pocillo (10 gl) en una placa de 96 micropocillos blancos de bioluminiscencia no tratados (Nunc, Roskilde, Dinamarca). La producción de cAMP se midió usando el kit de ensayo bioluminiscente cAMP-Glo Max (Promega, Madison, Wl, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con diferentes concentraciones de péptido a-MSH solo o a-MSH junto con mezclas de IgG de ratón de grupos inmunizados con ClpB o de control de adyuvante, y que se añadieron a las células justo antes de la a-MSH. Las diluciones seriadas del patrón de cAMP (proporcionado por el kit) se ensayaron en la misma microplaca. Se añadió a cada pocillo solución de detección de cAMP, luego las células se homogeneizaron mediante agitación y se centrifugaron 2 min a 1000 rpm y luego se incubaron durante 20 minutos a 23 °C. Se añadió el sustrato reactivo Kinase-Glo a cada pocillo y, después de 10 min de incubación a 23 °C, se leyó la luminiscencia con un instrumento de bioluminiscencia (Safas Spectrometer, Mónaco). Se realizaron tres ensayos para cada dilución en pocillos separados y se repitieron en dos días distintos, lo que dio como resultado n = 6 para cada punto de la curva de activación de cAMP cuando se usaron IgG nativas. Después de agotarse la IgG nativa de la fracción de IgG anti-a-MSH, se realizó el mismo experimento con cada concentración de a-MSH e IgG como se describió anteriormente.

Administración por sonda de E. coli en ratones

Ratones C57BI6 macho de un mes de edad (Janvier Laboratories) se aclimataron al animalario durante 1 semana y se mantuvieron como se describió anteriormente. Los ratones se distribuyeron en cuatro grupos (n = 8 en cada uno) de la siguiente manera: (i) con administración por sonda de 108 bacterias E. coli K12; (ii) con administración por sonda de 108 bacterias E. coli K12 deficientes para ClpB; (iii) con administración por sonda de únicamente medio LB; y (iv) controles que no recibieron ningún tratamiento. La cepa mutante para ClpB se generó en el laboratorio de Bernd Bukau (ZMBH, Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania) y el Dr. Axel Mogk la proporcionó amablemente junto con la correspondiente bacteria E. coli de tipo natural (WT). Los ratones se pusieron individualmente en las jaulas BioDAQ (Research Diets) y se les administraron por sonda intragástrica diariamente antes del inicio de la fase oscura durante 21 días 0,5 ml de medio LB con o sin bacterias. Durante el último día de administración por sonda, se recogieron y congelaron las heces de los ratones. Después de la administración por sonda, los ratones se sacrificaron por decapitación y se recogió la sangre del tronco en tubos que contenían EDTA. El plasma se separó por centrifugación a 3500 r.p.m. (1,4 g) durante 10 min a 4 °C y se almacenó a -80 °C antes del ensayo. Los niveles plasmáticos de IgG e IgM anti-ClpB y anti-a-MSH se analizaron como se describió anteriormente.

Ensayo de ADN de ClpB

Se extrajo ADN de los cultivos de las cepas WT y mutantes para ClpB, y también se purificó de las heces de ratones utilizando el QIAampR DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Francia). Las bacterias se disolvieron en agua y se hirvieron a 100 °C durante 5 minutos, después de 1 min de centrifugación a 11.000 rpm, el líquido sobrenadante que contenía el ADN se almacenó a -20 °C. Con la herramienta de diseño de cebadores del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), se diseñaron los siguientes cebadores de nucleótidos que amplifican la región de ADN de 180 pares de bases que codifica el fragmento de proteína ClpB que contiene un epítopo similar a la a-MSH identificado (Figura 1e), directo: 5'-GCAGCTCGAAGGCAAAACTA-3' (S<e>Q ID NO: 4) e inverso: 5'-ACCGCTTCGTTCTGACCAAT-3' (<s>E<d>ID NO: 5) (Invitrogen Custom Primers, Cergy Pontoise, Francia). La PCR se realizó en un termociclador con tubos MicroAmp (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). La reacción se llevó a cabo en un volumen de 50 gl que contenía 25 gl de Go Taq Green Master Mix 2 x (Promega), 1 gl (20 pmol) de cada cebador, 21 gl de agua bidestilada y 1 gl de ADN bacteriano. Las condiciones de PCR eran las siguientes: 3 min a 94 °C seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 1,5 min. Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1 % (Sigma), con el tamaño esperado de 180 pares de bases y la especificidad validada utilizando la cepa mutante para ClpB.

Concentraciones plasmáticas de la proteína ClpB bacteriana

Las concentraciones plasmáticas de la ClpB bacteriana se midieron usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con el siguiente protocolo. Las IgG anti-ClpB policlonales de conejo, generadas habitualmente por Delphi Genetics (Gosselies, Bélgica), se aplicaron como recubrimiento sobre placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Rochester, NY) utilizando 100 gl y una concentración de 2 gg/ml en tampón de NaHCO3 100 mM, pH 9,6 durante 24 h a 4 °C. Las placas se lavaron (5 min x 3) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Tween 200 al 0,05 %, pH 7,4. La proteína ClpB recombinante, generada habitualmente por Delphi Genetics, como patrón, se diluyó en serie a 5, 10, 25, 50, 70, 100 y 150 pM en el tampón de muestra (PBS, azida sódica al 0,02 %, pH 7,4) y se añadió a los pocillos por duplicado. Las muestras de plasma de pacientes con trastornos de la conducta alimentaria y controles sanos (1:25 en tampón de muestra) se añadieron a los pocillos restantes por duplicado y los patrones de ClpB y las muestras de plasma se incubaron 2 h a temperatura ambiente (TA). Las placas se lavaron (5 min x 3) en PBS con Tween 200 al 0,05 %, pH 7,4. La IgG anti-ClpB monoclonal de ratón (1:500 en tampón de muestra), generada habitualmente por Delphi Genetics y cribada previamente para no tener reactividad cruzada con la a-MSH, se añadió a los pocillos y se incubó durante 90 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron (5 min x 3) en PBS con Tween 200 al 0,05 %, pH 7,4. Se añadieron los anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón conjugados con fosfatasa alcalina (1:2000 en tampón de muestra) de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA) a los pocillos y se incubaron durante 90 min a TA. Las placas se lavaron (5 min x 3) en PBS con Tween 200 al 0,05 %, pH 7,4 y después se añadieron 100 gl de solución de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, St. Louis, MO) como sustrato de fosfatasa alcalina. Después de 40 min de incubación a temperatura ambiente, la reacción se detuvo añadiendo NaOH 3 N. La densidad óptica (DO) se determinó a 405 nm usando un lector de microplacas Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwán). Los valores de DO del blanco resultantes de la lectura de las placas sin adición de muestras de plasma o diluciones de patrón de proteína ClpB se restaron de los valores de DO de la muestra. Las concentraciones plasmáticas de ClpB se calcularon basándose en la DO de la curva de calibración de ClpB y se ajustaron para la dilución plasmática.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron y los gráficos se representaron usando el GraphPad Prism 5.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). La normalidad se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante el análisis de varianza o la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con las pruebas a posteriori de Tukey o Dunn, respectivamente, de acuerdo con los resultados de normalidad. Los cambios en el peso corporal se analizaron con mediciones repetidas de doble vía, análisis de varianza y las pruebas a posteriori de Bonferroni. Los grupos individuales se compararon usando la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney de acuerdo con los resultados de normalidad. Los efectos de la absorción de los anticuerpos de ClpB con a-MSH se analizaron mediante una prueba t de datos emparejados. Los coeficientes de correlación de Pearson o Spearman se calcularon de acuerdo con la normalidad de la variable. La producción de cAMP se analizó mediante un ajuste de regresión no lineal (log (a-MSH) frente a la respuesta de cAMP normalizada), cuya ecuación era Y = 100/(1+10(logEC50-X) x Pendiente). Los datos se muestran como media ± e.e.m., y para todas las pruebas, Po0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Identificación proteómica de miméticos bacterianos de a-MSH

Para identificar las proteínas bacterianas con imitación molecular de la a-MSH, se desarrolló una estrategia de investigación basada en la tecnología proteómica. La proteína total se extrajo de los cultivos de E. coli K12, la fracción citoplasmática se resolvió mediante electroforesis en gel 2D (Figura 1a) y se transfirió a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno). Para aumentar la probabilidad de detección de múltiples epítopos similares a la a-MSH en las proteínas bacterianas, la membrana se reveló con IgG policlonal anti-a-MSH. Se encontraron 13 manchas de proteínas inmunopositivas (Figura 1b), entre las cuales las manchas 1-8 desaparecían después de la preadsorción de anticuerpos con a-MSH 10-6 M (Figura 1c), lo que confirma epítopos miméticos específicos de a-MSH. Mediante espectrometría de masas, las manchas de proteínas 1, 2, 3 y 4, que presentaban la tinción más fuerte similar a la a-MSH, se identificaron como isoformas de la proteína de choque térmico denominada ClpB, una proteína de 857-aa, chaperona de desagregación de proteínas de 857 aminoácidos o ClpB, MW 95526 (peso molecular: 95526 Da, número de acceso: NP_417083.1, SEQ ID NO: 1). Las manchas 5-8 similares a a-MSH teñidas con menos intensidad (con las puntuaciones más altas de MASCOT de 880, 877, 874 y 800, respectivamente) eran isoformas de la proteína chaperonina GroEl, 548-aa, (peso molecular: 57293 Da; número de acceso: YP_001732912.1). También se utilizó una estrategia alternativa de separación de proteínas de E. coli, utilizando un fraccionador OFFGEL seguido de electroforesis en gel unidimensional y transferencia Western con IgG anti-a-MSH con preadsorción o no con a-MSH (datos no mostrados). Una banda era reconocida específicamente por la IgG anti-a-MSH y se descubrió que contenía la proteína CIpB (con la puntuación MASCOT más alta de 1065). Basándose en estos resultados, se seleccionó la CIpB como proteína diana para una mayor validación de su mimetismo molecular con la a-MSH. Para analizar la homología de la secuencia de aminoácidos entre la a-MSH y la ClpB bacteriana, ambas secuencias se alinearon en el programa Emboss Stretcher que utiliza el algoritmo de Needleman-Wunsch (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Los alineamientos pusieron de manifiesto un sitio de la proteína ClpB que presentaba una homología de secuencia discontinua de 5 aa con la a-MSH (Figura 1d). Este epítopo putativo similar a la a-MSH se encontraba en un bucle interhelicoidal de la estructura de la proteína ClpB, lo que indica que está expuesto en la superficie de la proteína, es decir, accesible a la unión de los auto-Ab. La transferencia Western de la proteína ClpB recombinante revelada con IgG anti-a-MSH mostraba una banda de 96 kDa (Figura 1e), lo que confirma que la proteína ClpB contiene epítopo(s) similar(es) a la a-MSH. Estos resultados muestran que la presencia de homología de secuencia de al menos cinco aminoácidos consecutivos, según el concepto de mimetismo molecular, no es una condición obligatoria para que las proteínas bacterianas sean reconocidas por la reacción cruzada de la IgG con un neuropéptido.

Inmunización de ratones con ClpB

Para investigar si la ClpB de E. coli puede inducir auto-Ab de reacción cruzada con la a-MSH, influyendo en la alimentación y la ansiedad, los ratones se inmunizaron con la proteína ClpB bacteriana recombinante. Los ratones que recibieron ClpB junto con adyuvante o adyuvante solo presentaron un peso corporal más bajo durante unos días después de las inyecciones (Figura 2a). Sin embargo, 4 semanas después, los ratones inmunizados con ClpB tenían un peso corporal mayor (+5 %) frente a los controles (Figura 2a). La ingesta media diaria de alimento, medida durante los últimos 10 días del experimento, también era mayor (+13 %) en los ratones inmunizados con ClpB en comparación con otros grupos (Figura 2b). El aumento de la ingesta de alimentos se debía al aumento del tamaño de las comidas (Figura 2c), ya que el número de comidas no cambió (Figura 2d), lo que indica que la inmunización con ClpB interfería con los mecanismos de saciedad más que con los del hambre. Esto concuerda con la función conocida de la a-MSH de inducir saciedad. Para validar más la relevancia de la inmunización con ClpB para el efecto anorexígeno de la a-MSH, los ratones recibieron inyección i.p. de a-MSH. En las 24 horas siguientes, la ingesta de alimentos y el peso corporal no se vieron afectados en los ratones inmunizados con ClpB (Figura 2e), lo que indica que no eran sensibles al efecto anorexígeno de la a-MSH administrada que estaba presente en ratones no inmunizados. Tras los experimentos de alimentación, se estudiaron la actividad locomotora y el comportamiento relacionado con la ansiedad en ratones en las pruebas de campo abierto y laberinto en O. La actividad locomotora total y el tiempo pasado en las áreas abiertas frente a las fronterizas no difirieron significativamente entre los grupos de estudio (datos no mostrados). Sin embargo, en los brazos cerrados del laberinto en O, los ratones inmunizados con ClpB se movieron una distancia más corta en comparación con los controles (datos no mostrados) y pasaron menos tiempo en comparación con todos los demás grupos (datos no mostrados), lo que indica una disminución de la ansiedad. Para confirmar la eficacia de la inmunización, se analizaron los niveles plasmáticos de IgG anti-ClpB y se midió su afinidad. En ratones inmunizados con ClpB, se encontró un fuerte aumento en los niveles de IgG anti-ClpB (Figura 2f) con afinidades más bajas (Figura 2g), de acuerdo con la reciente inducción de IgG. También se encontraron mayores niveles plasmáticos de IgG reactiva con la a-MSH en ratones inmunizados con ClpB (Figura 2h); estas IgG se caracterizaron de manera similar por afinidades menores por la a-MSH, en comparación con los controles (Figura 2i). La adsorción en plasma de ratón con a-MSH redujo significativamente los niveles plasmáticos de IgG anti-ClpB, lo que confirmaba que una fracción, pero no toda la IgG anti-ClpB, tenían reacción cruzada con a-MSH (Figura 2f). Los niveles plasmáticos de auto-Ab IgM de a-MSH no diferían significativamente entre los grupos (datos no mostrados). También se analizó si la inmunización con ClpB puede inducir auto-Ab con reacción cruzada con la hormona adrenocorticotrópica, un péptido 39-aa que contiene la secuencia de a-MSH. No se encontraron diferencias significativas en la IgG plasmática reactiva con la hormona adrenocorticotrópica (no se muestran los datos), lo que muestra la selectividad del mimetismo conformacional entre ClpB y a-MSH.

Efectos de la IgG de ratón en la señalización del MC4R

Para determinar el impacto de la IgG de reacción cruzada con a-MSH inducida por la inmunización con ClpB en la señalización del MC4R, se estudiaron sus efectos en la producción de cAMP inducida por la a-MSH en las células que expresan el MC4R. Se encontró que las concentraciones de cAMP eran más bajas cuando la a-MSH se preincubaba con IgG de ratones inmunizados con ClpB, en comparación con la a-MSH sola o la a-MSH preincubada con IgG de ratones a los que se les había inyectado adyuvante, con una reducción de 8-10 % en las dos concentraciones más altas de a-MSH (Figura 2j). Tras el agotamiento de la IgG reactiva con la a-MSH de las IgG mezcladas, la IgG restante de los ratones inmunizados con ClpB no mostró ningún efecto en la liberación de cAMP inducida por la a-MSH (Figura 2k), lo que indica que la IgG con reacción cruzada con la a-MSH en ratones inmunizados con ClpB era responsable de reducir la producción de cAMP en respuesta a la a-MSH. La reducción en la activación y señalización del MC4R puede, por lo tanto, explicar el aumento de la ingesta de alimentos y la disminución de la ansiedad observada en los ratones inmunizados con ClpB.

Administración intragástrica de E. coli en ratones

Para comprobar si E. coli puede inducir una respuesta inmunogénica contra la proteína ClpB, dando como resultado la producción de auto-Ab anti-ClpB con reacción cruzada con la a-MSH, se administraron diariamente a ratones cepas WT y AClpB de E. coli K12 por sonda intragástrica durante 3 semanas. A otro grupo de ratones se les administró por sonda solo el medio de cultivo bacteriano y el grupo de control no recibió ningún tratamiento. Los primeros días de administración por sonda estuvieron acompañados de una disminución del peso corporal y de la ingesta de alimentos en los ratones que recibieron E. coli WT, que luego volvieron gradualmente a los niveles de control (Figuras 3a y b). De nuevo, durante la última semana de administración por sonda, el patrón de alimentación se vio afectado en los ratones que recibían E. coli WT, que mostraban una disminución en el tamaño de la comida pero un aumento en el número de comidas (Figuras 3c y d). Sorprendentemente, los ratones que recibieron E. coli AClpB no diferían significativamente de los controles en cuanto al aumento de peso corporal, la ingesta de alimentos o el patrón de alimentación en ningún punto de tiempo. Estos datos respaldan la implicación específica de la ClpB bacteriana en la disminución aguda de la ingesta de alimentos del hospedante, así como en la regulación crónica del patrón de alimentación tras la infección por E. coli. Como se esperaba, el ADN de la ClpB era más abundante en las heces de los ratones que recibieron E. coli WT, aunque se detectó nivel bajo del mismo en algunos ratones de control (Figura 3e). Después de 3 semanas de administración por sonda, los niveles plasmáticos tanto de IgM como IgG anti-ClpB eran elevados en los ratones que recibieron E. coli WT en comparación con los controles y los grupos de E. coli AClpB (Figuras 3f y g). La adsorción en plasma con a-MSH reducía los niveles de IgG anti-ClpB en ratones alimentados por sonda con E. coli WT (Figura 3g), lo que indica la presencia de IgG anti-ClpB con reacción cruzada con a-MSH. Es interesante que los niveles plasmáticos de la clase IgM de los auto-Ab anti-ClpB aumentaron tras la adsorción con a-MSH, lo que sugiere que la a-MSH producía la disociación de los inmunocomplejos de IgM de a-MSH con reacción cruzada con la ClpB, que aumentaron en ratones alimentados por sonda con E. coli WT (Figura 3f). Los niveles plasmáticos de IgM anti-a-MSH también aumentaron con la administración de E. coli WT en comparación con todos los demás grupos (Figura 3h), mientras que la IgG anti-a-MSH reactiva solo aumentó ligeramente sin alcanzar significación (Figura 3i). Sin embargo, el análisis cinético de afinidad de la IgG de a-MSH puso de manifiesto valores más bajos de las constantes de equilibrio de disociación en ratones alimentados por sonda con E. coli (Figura 3j), sin cambios significativos en las tasas de asociación o disociación (datos no mostrados). Estos cambios, incluido el aumento de los niveles de la clase IgM de auto-Ab reactivos con la a-MSH, podría reflejar una respuesta inmunitaria contra la ClpB en comparación con un nuevo antígeno. De hecho, los niveles bajos o indetectables de ADN de la ClpB en las heces de ratones que no recibieron E. coli WT indican que los microorganismos que expresan la ClpB no eran comensales intestinales principales en los ratones estudiados. Por lo tanto, a diferencia de los ratones inmunizados con ClpB, que mostraron niveles elevados de IgG anti-a-MSH de baja afinidad, asociados con mayor tamaño de la comida y ganancia de peso corporal, los ratones con administración por sonda de E. coli mostraron mayor producción tanto de IgM como IgG reactivas anti-a-MSH, con afinidades mayores asociadas con la disminución del tamaño de la comida y el peso corporal.

Anticuerpos anti-ClpB en pacientes con TCA

Cuando se validó la capacidad de la proteína ClpB de E. coli para estimular la producción de auto-Ab con reacción cruzada con a-MSH, a continuación se determinó la relevancia de la ClpB bacteriana para los TCA mediante el estudio de los anticuerpos anti-ClpB en pacientes con AN, BN o BED. Se encontró que tanto la IgG como la IgM anti-ClpB eran fácilmente detectables en el plasma de pacientes con TCA, así como de sujetos sanos, sin diferencias significativas en sus niveles medios (Figuras 4a y b). Sin embargo, había una alta variabilidad en todos los grupos de estudio, lo que indica una historia individual diferente al encontrarse con antígenos similares a ClpB. Para verificar si los anticuerpos anti-ClpB humanos tenían reacción cruzada de forma similar con la a-MSH, las muestras de plasma se sometieron a adsorción de a-MSH 10-6 M, lo que condujo a una reducción significativa de los niveles detectables de IgG e IgM anti-ClpB en todos los grupos de estudio (Figuras 4c y d). Además, los niveles relativos de IgG anti-ClpB con reacción cruzada con a-MSH eran mayores en los tres grupos de pacientes con TCA, en particular en BN y BED frente a los controles sanos (Figura 4e). Se encontraron niveles elevados de IgM anti-ClpB con reacción cruzada con a-MSH en la AN en comparación con la BN (Figura 4f). Para determinar más la relevancia de las IgG e IgM anti-ClpB para los TCA, se estudió si sus niveles plasmáticos pueden correlacionarse con rasgos conductuales de los pacientes con TCA y controles medidos por el EDI-2. Se encontró que en los controles, la IgG de ClpB se correlacionaba inversamente con el intervalo normal de algunos rasgos psicológicos, pero en los pacientes con AN

los niveles de IgG de ClpB se correlacionaban positivamente con los rasgos psicopatológicos centrales, tales como la insatisfacción corporal y el deseo de delgadez (Tabla 1). Además, en los pacientes con AN y BED, las puntuaciones de la subescala EDI-2 se correlacionaban con la IgM de ClpB de manera opuesta, siendo negativas en la AN pero positivas en la BED (Tabla 1). Sin embargo, en los pacientes con BED, la IgM de ClpB se correlacionaba negativamente con la edad, lo que sugiere que los niveles más altos de IgM anti-ClpB se asociaban con la forma aguda de la enfermedad. Sorprendentemente, las correlaciones encontradas en los pacientes con AN entre la IgG o IgM de ClpB y el deseo de delgadez o la desconfianza interpersonal, respectivamente, se parecían mucho a las correlaciones entre los mismos rasgos psicológicos y las IgG o IgM reactivas con la a-MSH encontradas en un grupo diferente de pacientes con AN en un estudio anterior.

Tabla 1. Correlaciones significativas entre los niveles plasmáticos de IgG e IgM anti-ClpB y los rasgos psicológicos en pacientes con trastornos de la conducta alimentaria y controles (contr.) analizadas mediante el Inventario de trastornos de la conducta alimentaria-2. Todos los r de Spearman *p<0,05, **p<0,01, excepto el r de Pearson *p<0,05 para el perfeccionismo. (n=65 Contr., n=27 AN y n=14 BED).

IgG de ClpB (Contr.) Temores de Regulación de impulsos Inseguridad social

madurez r= -0,31 * r= -0,26 * r= -0,26 *

IgG de ClpB (AN) Insatisfacción Deseo de delgadez r= Perfeccionismo r=

corporal r= 0,4 * 0,35 * 0,38 *

IgM de ClpB (AN) Ineficacia r= -0,42 * Desconfianza Inseguridad social Anhedonia r= interpersonal r= -0,58 **

r= -0,52 ** -0,35 *

IgM de ClpB (BED) Bulimia r= 0,53 * Perfeccionismo r= 0.6 * Edad r= -0,74 **

Concentraciones plasmáticas de la proteína CIpB bacteriana

Se detectó la proteína CIpB en muestras de plasma de todos los sujetos del estudio en el intervalo de 10 pM a 180 pM, con un nivel medio de aproximadamente 30 pM en los controles sanos. Los niveles plasmáticos medios de ClpB eran significativamente elevados en todos los grupos de pacientes con trastornos de la conducta alimentaria, incluidos AN, BN y BED (consulte la Figura 5). Al aplicar los criterios comunes de cambios relevantes para el diagnóstico en las concentraciones iguales o superiores a 2 desviaciones estándar, el 21,7 % de los pacientes con AN, 32 % con BN y 25 % con BED mostraron niveles elevados de ClpB plasmático.

Conclusión

Los resultados ponen de manifiesto un vínculo molecular entre las bacterias intestinales que expresan la ClpB y la regulación de la conducta motivada y las emociones por medio de la producción de la proteína ClpB y anticuerpos anti-ClpB con reacción cruzada con la a-MSH. Demuestra que alteraciones específicas de la microbiota intestinal pueden conducir a anomalías conductuales y emocionales, como las observadas en los pacientes con TCA. Los hallazgos de los mayores niveles de proteína ClpB y de IgG anti-ClpB con reacción cruzada con la a-MSH en pacientes con TCA y las correlaciones de los anticuerpos anti-ClpB con los rasgos psicopatológicos de los pacientes respaldan la implicación de los microorganismos que expresan ClpB en el aumento de producción de anticuerpos contra la ClpB y el establecimiento de conducta alimentaria y emociones anormales.

En conclusión, los resultados identifican a la ClpB como una proteína responsable del origen de los auto-Ab con reactividad cruzada con la a-MSH, asociada con rasgos psicopatológicos en pacientes con TCA y, por lo tanto, que los microorganismos que expresan ClpB son un nuevo objetivo específico para el diagnóstico y el tratamiento de los TCA.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una composición oral que comprende probióticos que sobreexpresan la proteína CIpB para usar en el tratamiento de la obesidad, comprendiendo o consistiendo dicha proteína ClpB en una secuencia de aminoácidos de 80 a 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

2. La composición oral para usar según la reivindicación 1, en donde los probióticos son bacterias comensales no patógenas en seres humanos.

3. La composición oral para usar según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde los probióticos son Escherichia coli comensales no patógenas.

4. La composición oral para usar según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde los probióticos son bacterias que sobreexpresan la proteína ClpB, se preparan mediante transformación bacteriana con vectores que expresan el ADN de ClpB.

5. La composición oral para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, siendo dicha composición una composición farmacéutica.