ES2995868T3 - Anti-ccr8 antibodies - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-CCR8, incluidas composiciones y métodos de uso de dichos anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CCR8

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a novedosos anticuerpos anti-CCR8 que comprenden (i) una cadena VH que comprende tres CDR; y (ii) una cadena VL que comprende tres CDR, en donde:

la CDR n.° 1 de VH es GFIFSNAVMY (Id. de sec. n.° 1);

la CDR n.° 2 de VH es RIKTKFNNYATYYADAVKG (Id. de sec. n.° 2);

la CDR n.° 3 de VH es GDRNKPFAY (Id. de sec. n.° 3);

la CDR n.° 1 de VL es RASTSVITLLH (Id. de sec. n.° 4);

la CDR n.° 2 de VL es GASNLES (Id. de sec. n.° 5); y

la CDR n.° 3 de VL es QQSWNDPYT (Id. de sec. n.° 6);

en donde el anticuerpo comprende una región constante Fc de IgGl que está afucosilada.

La invención proporciona además una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos anti-CCR8 que comprenden (i) una cadena VH que comprende tres CDR; y (ii) una cadena VL que comprende tres CDR, en donde: la CDR n.° 1 de VH es GFIFSNAVMY (Id. de sec. n.° 1);

la CDR n.° 2 de VH es RIKTKFNNYATYYADAVKG (Id. de sec. n.° 2);

la CDR n.° 3 de VH es GDRNKPFAY (Id. de sec. n.° 3);

la CDR n.° 1 de VL es RASTSVITLLH (Id. de sec. n.° 4);

la CDR n.° 2 de VL es GASNLES (Id. de sec. n.° 5); y

la CDR n.° 3 de VL es QQSWNDPYT (Id. de sec. n.° 6); y

en donde más del 80 % de los anticuerpos anti-CCR8 de la composición están afucosilados.

Antecedentes

Entre los tumores, los linfocitos T reguladores (Treg) son una población supresora clave conocida por prevenir las respuestas inmunitarias antitumorales. Una mayor presencia de Treg intratumorales se ha asociado con una peor evolución de los pacientes en varios tipos de cáncer (Shang y col., Nature Sci. Reports, 2015; Fridman y col., Nat Rev Clin Oncol. 2017; Bruni y col., Nat Rev Cancer. 2020). El receptor de quimioquinas 8 (CCR8) es una proteína de la superficie celular expresada de forma única por los Treg intratumorales en varios tipos de cánceres humanos (Plitas y col, Immunity 2016; De Simone y col., Immunity 2016). Esto convierte al CCR8 en una diana atractiva para mediar en el agotamiento intratumoral selectivo de los Treg mediante la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para potenciar la inmunidad antitumoral.

Documento WO2021/142002 anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al CCR8 humano, polinucleótidos y vectores que codifican el mismo y composiciones farmacéuticas que lo comprenden. El documento WO2020/138489 describe también un anticuerpo anti-CCR8 y el uso de dicho anticuerpo para tratar o prevenir cánceres. El documento EP3431105 describe una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende un anticuerpo contra CCR8.

Si bien se ha investigado durante mucho tiempo el agotamiento de los Treg, la mayoría de estos tratamientos tienen una eficacia limitada debido a la expresión de la diana sobre las poblaciones de linfocitos T efectores que se infiltran en el tumor y/o en los Treg fuera del entorno tumoral. Sigue existiendo una necesidad en la técnica de un agente terapéutico con anticuerpos monoclonales que desencadene la destrucción de los Treg inmunosupresores intratumorales sin agotar otras poblaciones clave de linfocitos T efectores en el microentorno tumoral o los Treg periféricos.

Resumen de la invención

Se ha comprobado que los anticuerpos monoclonales anti-CCR8 median en el agotamiento intratumoral selectivo de los Treg mediante la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Como CCR8 se expresa preferentemente en los Treg que se infiltran en el tumor y no se expresa en gran medida en los Treg de la sangre periférica ni en las poblaciones de linfocitos T efectores beneficiosas, un anticuerpo anti-CCR8 agotaría los Treg intratumorales y potenciaría la inmunidad antitumoral. Si bien la monoterapia con anticuerpos anti-CCR8 es eficaz de forma independiente, la eliminación específica de los Treg intratumorales proporciona un entorno respetuoso para enfoques terapéuticos combinados apropiados destinados a estimular simultáneamente la respuesta inmunitaria antitumoral. Por ejemplo, puede ser necesaria la combinación con un inhibidor del punto de regulación tal como un anti-PD-1 para impulsar por completo una potente inmunidad antitumoral tras el agotamiento de los Treg.

Por consiguiente, se proporciona la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal humanizado que se une específicamente a CCR8 y media en la ADCC de los Treg que expresan CCR8. El anticuerpo consiste estructuralmente en una cadena variable pesada y una cadena variable ligera que comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que se unen específicamente a CCR8. El anticuerpo incluye también una región constante de cadena pesada humana que comprende un fragmento cristalizable (Fc) y una región constante de cadena ligera. Estos elementos estructurales, codificados por la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, comprenden una composición farmacéutica eficaz para tratar tumores sólidos en un paciente tanto en monoterapia o junto con otros agentes terapéuticos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la unión de mAbs quiméricos de rata/hIgG1 específicos del CCR8 humano a células Jurkat que expresan CCR8 humano o de macaco.

La Fig. 2 muestra los resultados de los experimentos de agrupación de epítopos.

La Fig 3 muestra secuencias de las cadenas pesada y ligera de ABBV-514.

La Fig. 4A muestra las curvas de dosis-respuesta de unión de ABBV-514 afucosilado a células TALL-1 que expresan CCR8 endógeno o a células TALL-1 con CCR8 inactivado, así como a células precursoras Jurkat o células que sobreexpresan el CCR8 humano o de macaco. La Fig. 4B muestra una comparación de la unión de ABBV-514 fucosilado (WT PR-1925514) y de ABBV-514 afucosilado a células TALL-1.

Las Figs. 5A-D muestran datos de bioensayos con indicador ADCC para ABBV-514 fucosilado (WT PR-1925514) frente a ABBV-514 afucosilado.

La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo de ADCC con células efectoras NK purificadas y células diana TALL-1.

La Fig. 7 muestra los resultados de un ensayo indicador de beta-arrestina del CCR8 que muestra el efecto del ABBV-514 sobre la unión de CCL1 al CCR8.

7. Descripción detallada

Los Treg son un subconjunto de linfocitos T CD4+ con efectos inmunosupresores intratumorales. Los Treg suprimen la activación, la proliferación y la producción de citoquinas de los linfocitos T CD4+ y de los linfocitos T CD8+, evitando respuestas autoinmunes perjudiciales. Sin embargo, los Treg también inhiben la inmunidad tumoral, y los niveles altos de Treg intratumorales se han asociado con evoluciones negativas en varios tipos de cánceres.

El CCR8 es un receptor de quimioquinas con el motivo C-C que consiste en una proteína transmembrana de siete pasos que media la quimiotaxia y las interacciones entre células en el contexto de las respuestas inmunitarias de los linfocitos T auxiliares de tipo 2 (Th2) y el tráfico de linfocitos T hacia la piel. Los ratones deficientes en CCR8 son viables, fértiles y en gran medida normales, excepto que no pueden generar respuestas Th2 sólidas en determinados modelos preclínicos asociados a Th2 (Chensue y col., J Exp Med 5, 2001). El ligando asociado principalmente con CCR8 es CCL1, aunque el CCL18 (humano) y el CCL8 (de murino) también son ligandos de este receptor.

Los Treg que expresan CCR8 que se infiltran en los tumores muestran un fenotipo altamente activado e inmunosupresor. Los estudios de tumores en ratones inactivados génicamente para CCR8 indican que la pérdida de la expresión del CCR8 no influye en el reclutamiento de Treg en el microentorno tumoral, el estado de activación o la capacidad supresora (Van Damme y col., J Immunother Cancer. 9(2), 2021). Más bien, la expresión de CCR8 es un marcador de los Treg muy supresores. Por lo tanto, el agotamiento de los Treg que expresan CCR8 proporciona ventajas antitumorales.

Los anticuerpos sustitutos específicos del CCR8 median en el agotamiento intratumoral selectivo de los Treg a través de la ADCC. Además, los anticuerpos sustitutos anti-CCR8 potencian significativamente la frecuencia de los linfocitos T efectores CD8+ específicos del tumor en circulación. Estos efectos se correlacionan con la eficacia en modelos de tumores singénicos en ratones. (Campbell y col., Cancer Research 81, 2021).

Los presentes inventores han desarrollado anticuerpos monoclonales terapéuticos, tal como se define en las reivindicaciones, que se unen específicamente al CCR8 expresado en la superficie de las células, por ejemplo, los Treg intratumorales. El anticuerpo está compuesto por dos cadenas variables, una pesada y una ligera, tal como se define en las reivindicaciones. En cada cadena variable hay tres CDR que permiten que el anticuerpo se una al CCR8, como se define en las reivindicaciones. En ambas cadenas variables hay un total de seis CDR diferentes, tal como se define en las reivindicaciones. Además, el anticuerpo contiene una región constante de cadena pesada humana que comprende una Fc humana de tipo inmunoglobulina G1 (IgG1), tal como se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos anti-CCR8 descritos comprenden una región constante Fc de IgG1 que está afucosilada y demuestrain vitrouna funcionalidad, inmunoseguridad y propiedades similares a las de los fármacos.

El anticuerpo comprende una región constante Fc de IgG1 que está afucosilada. La afucosilación se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas en la materia. Véanse, por ejemplo, Mol Cancer Ther (2020) 19 (5): 1102-1109) y PNAS (2013)110(14) 5404-5409. Por ejemplo, la producción de anticuerpos en líneas de células con defecto en la formación de GDP-fucosa debido, por ejemplo, a una deficiencia de GDP-manosa 4,6-deshidratasa; la producción de anticuerpos en células que tienen niveles reducidos de fucosiltransferasa; la producción de anticuerpos en células que tienen niveles reducidos del transportador de GDP-fucosa; la producción de anticuerpos en células que sobreexpresan la p-1,4-manosilglucoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT-III); o la producción de anticuerpos en células que expresan una GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) bacteriana. Las células utilizadas para producir los anticuerpos anti-CCR8 afucosilados de la invención pueden ser células CHO modificadas mediante ingeniería genética para expresar Pseudomonas RMD. El grado de afucosilación de los anticuerpos se puede determinar mediante técnicas conocidas en la materia.

Para obtener anticuerpos anti-CCR8 que reaccionen de forma cruzada con el CCR8 humano y el de macaco, se evaluó la capacidad de los anticuerpos quiméricos de ratón-humano (rata/hlgG1) para unirse a las células Jurkat que sobreexpresan el CCR8 humano o de macaco. Los resultados se analizaron mediante citometría de flujo llevada a cabo mediante técnicas conocidas en la materia. Como resultado, el anticuerpo anti-CCR8 final reacciona de forma cruzada con el CCR8 humano y de macaco y media en la ADCC en ambas especies, pero no se une al CCR8 de ratón, rata o conejo.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo afucosilado de la invención tiene una mayor afinidad por activar los receptores de la IgG, así como una mayor actividad en los ensayos de ADCC con linfocitos citolíticos purificados o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en comparación con una forma fucosilada de ese anticuerpo. La actividad ADCC de los anticuerpos anti-CCR8 se puede demostrar usando técnicas de bioensayo de ADCC conocidas en la materia. Por ejemplo, en líneas indicadoras de variantes alélicas humanas de FcYRIIIa V158 o F158 cultivadas simultáneamente con células Jurkat humanas o de macaco que expresan el CCR8, los anticuerpos anti-CCR8 activaron la ADCC medida mediante la inducción de luminiscencia utilizando técnicas conocidas en la materia.

Además, los anticuerpos descritos en la presente descripción interfieren con la eficacia de otros ligandos naturales, como CCL1, que también se unen al CCR8, pero solo a valores de CE50 sustancialmente más elevados que para la unión o la actividad de ADCC. Este ensayo se llevó a cabo mediante técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, mediante ensayos indicadores de beta-arrestina.

Como se usa en la presente descripción, el término “ anticuerpo” (Ab) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a CCR8, como se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos anti-CCR8 de la descripción, como se definen en las reivindicaciones, se unen al CCR8 humano en los Treg y, de este modo, modulan el sistema inmunitario. Los anticuerpos anti-CCR8 de la descripción, como se define en las reivindicaciones, comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables, en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR). Como se conoce en la materia, la posición/límite de aminoácidos que delimita una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y las diversas definiciones conocidas en la materia. Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden verse como posiciones híbridas hipervariables en el sentido de que estas posiciones pueden considerarse dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras que se considera que están fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también pueden encontrarse en regiones hipervariables extendidas. La descripción proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones híbridas hipervariables. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, en gran parte adoptando una configuración de hoja p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las regiones FR y contribuyen, con las CDR de la otra cadena, a la formación del sitio de unión de los anticuerpos a la diana. Véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987).

Los anticuerpos que se definen en las reivindicaciones pueden ser policlonales, monoclonales, estar modificados mediante ingeniería genética y/o modificados de cualquier otra manera de forma natural que incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, etc. En diversas realizaciones, los anticuerpos comprenden toda o una porción de una región constante de un anticuerpo. Los anticuerpos anti-CCR8 descritos en la presente descripción comprenden una IgG1 como se define en las reivindicaciones. Como se usa en la presente descripción, la “ región constante” de un anticuerpo incluye la región constante natural, los alotipos o las variantes.

La región constante ligera de un anticuerpo anti-CCR8 puede ser una región ligera kappa (k) o una región lambda (A). Una región ligera A puede ser una cualquiera de los subtipos conocidos, por ejemplo, A1, A2, A3 o A4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CCR8 comprende una región ligera kappa (<k>).

El término “ anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente descripción, no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. Un anticuerpo monoclonal se deriva de un solo clon, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o fago, por cualquier medio disponible o conocido en la materia. Los anticuerpos monoclonales útiles con la presente descripción pueden prepararse mediante el uso de una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, que incluyen el uso de tecnologías de hibridomas, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas.

El término anticuerpo “ quimérico” como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como un anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulina humana, típicamente elegidas de un molde de inmunoglobulina humana.

Las formas “ humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) comprenden sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana.

Los “ anticuerpos humanos” incluyen los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen los anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulina humana o a partir de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas funcionales. Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la materia, que incluyen los métodos de presentación en fagos mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana.

Los anticuerpos anti-CCR8 de la descripción incluyen las moléculas de anticuerpo de longitud completa (intactas).

Los anticuerpos anti-CCR8 que se definen en las reivindicaciones pueden ser anticuerpos cuyas secuencias se han modificado para alterar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CCR8 descritos en la presente descripción incluyen anticuerpos que se han modificado para adquirir o mejorar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante con respecto a un anticuerpo no modificado, por ejemplo, para potenciar las interacciones con F<cy>R (véase, por ejemplo, la solicitud de patente US-2006/0134709) o para potenciar la capacidad del anticuerpo para mediar en la ADCC. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CCR8 de la descripción que se define en las reivindicaciones puede tener una región constante que se una a FcyRt, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y/o FcyRIIIB con mayor afinidad que la región constante no modificada correspondiente. Un anticuerpo anti-CCR8 de la descripción que se define en las reivindicaciones puede ser uno que tenga una región Fc modificada y medie en una respuesta ADCC potenciada, en donde la respuesta ADCC se potencia con respecto a un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables (es decir, VH y VL) y una región Fc de la IgG1 natural (es decir, CL, CH1, CH2 y CH3 naturales). Las modificaciones de Fc con capacidad de potenciar la ADCC, tales como mutaciones en la secuencia de aminoácidos, son conocidas en la materia y pueden incluir los siguientes conjuntos de mutaciones: S239D/I332E; F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L; S239D/I332E/A330L; y S298A/E333A/K334A.

Los anticuerpos anti-CCR8 que comprenden una región constante de la IgG4 humana pueden comprender la mutación S228P, que se ha notificado que previene el intercambio de brazos Fab. Véase, por ejemplo, Silva, JP y col. Journal of Biological Chemistry, 290(9), 5462-5469 (2015).

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CCR8 que se definen en las reivindicaciones incluyen modificaciones que aumentan o disminuyen sus afinidades de unión al receptor de Fc fetal, FcRn, por ejemplo, mediante la mutación del segmento de la región constante de la inmunoglobulina en regiones concretas involucradas en las interacciones con FcRn. En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-CCR8 de tipo IgG se muta de manera que al menos uno de los residuos de aminoácidos 250, 314 y 428 de la región constante de la cadena pesada se sustituye solo o en cualquier combinación de los mismos. Para la posición 250, el residuo de aminoácido de sustitución puede ser cualquier residuo de aminoácido que no sea treonina, que incluyen, aunque no de forma limitativa, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 314, el residuo de aminoácido de sustitución puede ser cualquier residuo de aminoácido que no sea leucina, que incluyen, aunque no de forma limitativa, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 428, los residuos de aminoácidos de sustitución puede ser cualquier residuo de aminoácidos que no sea metionina, que incluyen, aunque no de forma limitativa, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Una sustitución ilustrativa conocida por modificar la función efectora Fc es la sustitución Fc M428L, que puede ocurrir en combinación con la sustitución Fc T250Q. Se identifican combinaciones específicas adicionales de sustituciones de aminoácidos adecuadas en la Tabla 1 de la patente US-7-217-797. Tales mutaciones aumentan la unión a FcRn, que protege al anticuerpo de la degradación y aumenta su vida media.

Los anticuerpos anti-CCR8 con alta afinidad por el CCR8 humano pueden ser convenientes para sus usos terapéuticos y de diagnóstico. En consecuencia, la presente descripción contempla los anticuerpos que tienen una alta afinidad de unión por el CCR8 humano. En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-CCR8 se unen al CCR8 humano con una afinidad de al menos aproximadamente 100 nM, pero pueden presentar mayor afinidad, por ejemplo, de al menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, o incluso mayor. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen al CCR8 humano con una afinidad en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 nM o una afinidad que varía entre cualquiera de los valores anteriores.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CCR8, como se define en las reivindicaciones, que comprende dos conjuntos de seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) diferentes, dos conjuntos de dos regiones variables diferentes, dos cadenas pesadas completas, dos cadenas ligeras completas y una región constante de la cadena pesada humana.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se define en las reivindicaciones es un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa recombinante, afucosilado y humanizado que se une al receptor de quimioquinas 8.

El anticuerpo comprende seis CDR que comprenden las siguientes secuencias:

CDR-H1: GFIFSNAVMY (Id. de sec. n.° 1)

CDR-H2: RIKTKFNNYATYYADAVKG (Id. de sec. n.° 2)

CDR-H3: GDRNKPFAY (Id. de sec. n.° 3)

CDR-L1: RASTSVITLLH (Id. de sec. n.°4)

CDR-L2: GASNLES (Id. de sec. n.° 5)

CDR-L3: QQSWNDPYT (Id. de sec. n.° 6)

El anticuerpo de esta descripción comprende una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como Id. de sec. n.° 1, una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 2; una CDR-H3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como Id. de sec. n.° 3, una CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como Id. de sec. n.° 4, una CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 5; y una CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 6; y comprende una región constante Fc de IgG que está afucosilada.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de esta descripción comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como Id. de sec. n.° 7:

EVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFIFSNAVMYWVRQA SGKGLEWVARIKTKFNNYAT YYADAVKGRFTISRDDSKNM VYLQMNSLKTEDTAVYYCTA GDRNKPFAYWGQGTLVTVSS (Id. de sec. n.°7); y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como Id. de sec. n.° 8: ETVVTQSPATLSLSPGERAT LSCRASTSVITLLHWFQQKP GQAPRLLIHGASNLESRVPA RFSGSGTDFTLTISSLEP EDFATYFCQQSWNDPYTFGQ GTKLEIK (Id. de sec. n.° 8).

En algunas realizaciones, el anticuerpo de esta descripción comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 9 (las regiones constantes están ennegrita;el dominio pesado variable está subrayado; las CDR estánsubrayadas en negrita y cursiva(descritas como Id. de sec. n.° 1 3, respectivamente, en orden de aparición)):

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFIFSNAVMYWVRQASGKGLEWVARIKTKFNNYATYYADAVKGRFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAGDRNKPFAYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(secuencia de longitud completa descrita como Id. de sec. n.° 9) y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como Id. de sec. n.°10 (las regiones constantes están ennegrita; el dominio ligero variable está subrayado: las CDR estánsubrayadas en negrita y cursiva(secuencias de CDR descritas como Id. de sec. n.° 4-6, respectivamente, en orden de aparición)):

ETVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASTSVITLLHWFQQKPGQAPRLLIHGASNLESRVPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQSWNDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(secuencia de longitud completa descrita como Id de sec. n.° 10).

En una realización, el anticuerpo de la descripción comprende una cadena ligera según la Id. de sec. n.° 10 y una cadena pesada que tiene la lisina C-terminal truncada, por ejemplo, una cadena pesada según la Id. de sec. n.° 9 con la lisina C-terminal truncada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFIFSNAVMYWVRQASGKGLEWVARIKTKFNNYATY YADAVKGRFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAGDRNKPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(secuencia con la lisina terminal truncada descrita como Id. de sec. n.° 11 )

La cadena pesada del anticuerpo de esta descripción puede estar codificada por la siguiente secuencia de nucleótidos (secuencia de longitud completa descrita como Id. de sec. n.° 12):

A TOGA A TTCGGGCTGA GC7'(i (i( ' 7'(i 17 C ( ' 7’G G7'GGC( A TCC7’GA A GGGCG TGCA GTGGGAAGT

CCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAAGCTGTCTTG

TGCCGCCAGCGGCTTCATCTTCAGCAACGCCGTGATGTACTGGGTCCGACAGGCCTCTGG

CAAAGGCCTGGAATGGGTCGCCAGAATCAAGACCAAGTTCAACAACTACGCCACCTACT

ACGCCGACGCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACATGGT

GTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACAGCCG

GCGACAGAAACAAGCCCTTTGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCTG

CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT

GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA

CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC

CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG

CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG

TGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC

CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAATGA

Péptido de señalización de la secreción encursiva;incluye el codón de detención final (TGA); la región constante está ennegrita;las CDR están subrayadas.

La cadena ligera del anticuerpo de esta descripción puede estar codificada por la siguiente secuencia de nucleótidos (secuencia de longitud completa descrita como Id. de sec. n.° 13):

A TOGA CA TGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGA CTTCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCA GCA G

^7’GCGAGACAGTGGTCACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGC CACACTGAGCTGTAGAGCCAGCACCAGCGTGATCACACTGCTGCACTGGTTCCAGCAGA AGCCTGGACAGGCTCCCAGACTGCTGATTCACGGCGCCAGCAACCTGGAAAGCAGAGTG CCTGCCAGATTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATAAGCAGCCTG GAACCTGAGGACTTCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGAGCTGGAACGACCCCTACACCTTTGGCCAGGGC ACC AAGCTGGAAATC AAGCGAACTGT GGCTGC ACCATCTGTCTT CAT C TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGTTAG

Péptido de señalización de la secreción encursiva;incluye el codón de detención final (TAG); la región constante está ennegritalas CDR están subrayadas.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se define en las reivindicaciones comprende una región constante de la cadena pesada humana que comprende el dominio CH1 humano, el dominio bisagra humano, el dominio CH2 humano y el dominio CH3 humano. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada codificada comprende una porción Fc, en donde la porción Fc es un isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM humano. En una realización, la Fc es una IgG1 y el alotipo es z distinto de a. En una realización, la cadena ligera es una cadena ligera kappa.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se define en las reivindicaciones comprende una región constante Fc de IgG1 que está afucosilada. La afucosilación se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la producción de anticuerpos en líneas de células con defecto en la formación de GDP-fucosa debido, por ejemplo, a una deficiencia de GDP-manosa 4,6-deshidratasa; la producción de anticuerpos en células que tienen niveles reducidos de fucosiltransferasa; la producción de anticuerpos en células que tienen niveles reducidos del transportador de GDP-fucosa; la producción de anticuerpos en células que sobreexpresan la |3-1,4-manosilglucoproteína 4-|3-N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT-III); o la producción de anticuerpos en células que expresan una GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) bacteriana. Las células utilizadas para producir los anticuerpos anti-CCR8 afucosilados de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, son células CHO modificadas mediante ingeniería genética para expresar Pseudomonas RMD. El grado de afucosilación de los anticuerpos se puede determinar mediante técnicas conocidas en la materia. Típicamente, el anticuerpo está afucosilado en un 70 % o más, un 80 % o más, un 90 % o más, o aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 %. Preferiblemente, el grado de afucosilación es igual o superior al 80 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo está afucosilado en un 70 % o más, un 80 % o más, un 90 % o más, o aproximadamente un 100 % en la posición ASN-300 (UE: ASN-297). La afucosulación se puede determinar mediante técnicas de ensayo de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), en las que el grado de afucosilación se determina mediante la separación dependiente de la polaridad de los anticuerpos fragmentados.

En una realización, las especies totales de glicanos afucosilados se determinan mediante el análisis de los glicanos unidos a N liberados por HILIC con detección fluorescente. Los glicanos se liberan usando la péptido N-glucosidasa F (PNGasaF) y posteriormente se marcan con una etiqueta fluorescente. Los glicanos unidos a N marcados fluorescentemente se analizan mediante HILIC con detección de fluorescencia. El porcentaje de especies de glicanos afucosilados se determina basándose en la suma de las áreas de pico de todos los picos de glicanos afucosilados en relación con el área de pico total de todos los picos de glicanos en el cromatograma. Todos los picos con una abundancia relativa del 0,5 % o más se incluyen en la determinación del porcentaje de especies de glicanos afucosilados.

7.1. Polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-CCR8, sistemas de expresión y métodos para fabricar los anticuerpos

La presente descripción abarca moléculas de polinucleótido que codifican genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina para anticuerpos anti-CCR8, vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células hospedadoras con capacidad de producir los anticuerpos anti-CCR8 que se definen en las reivindicaciones.

Puede prepararse un anticuerpo anti-CCR8 que se define en las reivindicaciones mediante la expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula hospedadora se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina del anticuerpo de manera que las cadenas ligeras y pesadas se expresan en la célula hospedadora y, opcionalmente, se secretan en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras, de cuyo medio pueden recuperarse los anticuerpos.

Para generar polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos anti-CCR8, se obtienen primero fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse mediante amplificación y modificación del ADN de línea germinal o ADNc que codifica secuencias variables de cadena ligera y pesada, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL relacionados con el anticuerpo anti-CCR8, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de la cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante del anticuerpo o un enlazador flexible. El término “ operativamente ligado” , como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en el marco.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud completa que une operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Se conocen en la materia las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana (véase, por ejemplo, Kabat, E.A. y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de los Estados Unidos, Publicación NIH con n.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación mediante la PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en determinadas realizaciones es una IgG1 o IgG4. Para un gen del fragmento Fab de la cadena pesada, el ADN que codifica VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante de la cadena pesada CH1.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como también en un gen de cadena ligera de Fab) ligando operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana se conocen en la materia (véase, por ejemplo, Kabat y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de los Estados Unidos, Publicación NIH con n.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero en determinadas realizaciones es una región constante kappa.

Para expresar los anticuerpos anti-CCR8 que se definen en las reivindicaciones, los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de longitud total o parcial, obtenidos como se describió anteriormente, se insertan en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, el término “ ligado operativamente” pretende significar que un gen de anticuerpo está ligado en un vector de manera que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector cumplen su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligadura de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera o pesada relacionadas con el anticuerpo anti-CCR8, el vector de expresión ya puede transportar secuencias de la región constante del anticuerpo. Por ejemplo, una solución para convertir las secuencias VH y VL relacionadas con el anticuerpo monoclonal anti-CCR8 en genes de anticuerpos de longitud completa es insertarlos en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH está unido operativamente al segmento o segmentos CH dentro del vector y el segmento VL está unido operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señalización que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido de señalización se una en el marco al extremo amino terminal del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido de señalización puede ser un péptido de señalización de la inmunoglobulina o un péptido de señalización heterólogo (es decir, un péptido de señalización de una proteína que no sea la inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la descripción llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula hospedadora. El término “ secuencia reguladora” pretende incluir los promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, las señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena de los anticuerpos.

Además de los genes de las cadenas de los anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la descripción pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospedadoras en las que se ha introducido el vector. Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Las diversas formas del término “transfección” pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares.

Es posible expresar los anticuerpos de la descripción en células hospedadoras procariotas o eucariotas. En determinadas realizaciones, la expresión de los anticuerpos se realiza en células eucariotas, por ejemplo, células hospedadoras de mamíferos, de secreción óptima de un anticuerpo inmunitariamente activo y plegado adecuadamente. Las células hospedadoras de mamíferos ilustrativas para expresar los anticuerpos recombinantes de la descripción incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) (incluidas las células DHFR-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células NSO de mieloma, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células hospedadoras de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo mediante el uso de métodos estándar de purificación de proteínas. Las células hospedadoras también pueden usarse para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones del procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifique la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo anti-CCR8 de esta descripción.

La tecnología de ADN recombinante también puede usarse para eliminar parte o todo el ADN que codifica una o ambas cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para la unión a CCR8 humana. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncado también están incluidas en los anticuerpos de la descripción.

Para la expresión recombinante de un anticuerpo anti-CCR8 de la descripción, la célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la descripción, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos o cada uno de ellos puede contener un marcador seleccionable independiente. Alternativamente, puede usarse un solo vector que codifique polipéptidos de cadena pesada y ligera.

Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una o más porciones de un anticuerpo anti-CCR8, pueden introducirse otras alteraciones o mutaciones en la secuencia codificante, para generar, por ejemplo, polinucleótidos que codifican anticuerpos con diferentes secuencias de CDR, anticuerpos con afinidad reducida al receptor de Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.

Los anticuerpos anti-CCR8 tal como se definen en las reivindicaciones también pueden producirse mediante síntesis química o mediante el uso de una plataforma exenta de células.

7.2. Purificación de anticuerpos anti-CCR8

Una vez producido un polipéptido de la descripción mediante expresión recombinante, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la materia para la purificación de una proteína. Una vez aislado, un anticuerpo anti-CCR8 puede purificarse adicionalmente.

7.3. Composiciones

Los anticuerpos que se definen en las reivindicaciones pueden proporcionarse como una composición adecuada para su administración a un sujeto. En algunas realizaciones, la composición de anticuerpos es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de anticuerpos anti-CCR8 y un portador farmacéuticamente aceptable, tal como se define en las reivindicaciones. La pluralidad de anticuerpos anti-CCR8 de la composición farmacéutica está afucosilada. Típicamente, la pluralidad de anticuerpos está afucosilada en un 80 % o más, en un 90 % o en aproximadamente en 99 % o aproximadamente en un 100 %. Preferiblemente, el grado de afucosilación es igual o superior al 90 %. En algunas realizaciones, la pluralidad de anticuerpos está afucosilada en un 80 % o más, un 90 % o más, o aproximadamente un 100 % en la posición ASN-300 (UE: ASN-297). El grado de afucosilación de los anticuerpos se puede determinar mediante técnicas conocidas en la materia. La afucosilación se puede determinar mediante técnicas de ensayo de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), en las que el grado de afucosilación se determina mediante la separación dependiente de la polaridad de los anticuerpos fragmentados. En una realización, las especies totales de glicanos afucosilados se determinan mediante el análisis de los glicanos unidos a N liberados por HILIC con detección fluorescente. Los glicanos se liberan usando la péptido N-glucosidasa F (PNGasaF) y posteriormente se marcan con una etiqueta fluorescente. Los glicanos unidos a N marcados fluorescentemente se analizan mediante HILIC con detección de fluorescencia. El porcentaje de especies de glicanos afucosilados se determina basándose en la suma de las áreas de pico de todos los picos de glicanos afucosilados en relación con el área de pico total de todos los picos de glicanos en el cromatograma. Todos los picos con una abundancia relativa del 0,5 % o más se incluyen en la determinación del porcentaje de especies de glicanos afucosilados.

7.4. Resumen de las propiedades de los anticuerpos sujeto

Las propiedades de los anticuerpos sujeto, ilustradas aunque no de forma limitativa mediante ABBV-514, incluyen las siguientes:

Unión de alta afinidad a CCR8, por ejemplo, una CE50 media de unión FACS de 2 |jg/ml o inferior, 1 |jg/ml o inferior, de 0,3 a 0,7 jg/ml, de 0,4 a 0,6 jg/ml, aproximadamente 0,5 jg/m l o 0,55 jg/m l determinada con el CCR8 expresado de forma endógena en células TALL-1 (T-ALL humana adulta; RRID: CVCL 1736); o una CE50 media de unión FACS a CCR8 humano sobreexpresado en células Jurkat de 2 jg/m l o menos, 1 jg/m l o menos, de 0,3 a 0,8 jg/m, de 0,4 a 0,7 jg/ml, aproximadamente 0,5 jg/m l o 0,6 jg/ml; o una CE50 media de unión FACS a CCR8 expresada en Treg con niveles bajos de CD45RA en sangre humana de 2 jg/m l o menos, 1 jg/m l o menos, de 0,2 a 0,6 jg/ml, de 0,3 a 0,5 jg/ml, aproximadamente 0,5 jg/m l o 0,48 jg/ml.

Unión de alta especificidad al CCR8 humano, por ejemplo, sin unión específica FACS a las células TALL-1 inactivadas génicamente de CCR8 o a las células Jurkat precursoras.

Reactividad cruzada con el CCR8 de macaco, por ejemplo, CE50 media de unión FACS al CCR8 de macaco sobreexpresado en células Jurkat de 5 jg/m l o inferior, 3 jg /m o inferior, 2 jg/m l o inferior, aproximadamente 1,5 jg/ml o 1,82 jg/ml; o al CCR8 expresado en Treg con niveles bajos de CD45RA en sangre de macaco de 5 jg/m l o inferior, 3 jg/m l o inferior, 2 jg/m l o inferior, aproximadamente 1,5 jg/m l o 1,62 jg/ml.

Poca capacidad para bloquear la interacción de CCL1/CCR8, por ejemplo, una CE50 de la actividad de bloqueo de CCL1/CCR8 al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, entre 30 y 70 veces mayor, al menos 50 veces mayor o al menos aproximadamente 50 veces mayor que la CE50 de unión al CCR8 humano.

Capacidad mejorada para inducir ADCC con respecto a un anticuerpo con las mismas regiones variables y una IgG1 fucosilada natural.

Unión mejorada a los receptores Fcy con respecto a un anticuerpo con las mismas regiones variables y una IgG1 fucosilada natural.

Buena inmunoseguridad determinada mediante un ensayo de liberación de citoquinas.

7.5. Métodos de uso

El anticuerpo que se define en las reivindicaciones puede usarse para tratar pacientes que tienen tumores sólidos. Se puede administrar una composición que comprende anticuerpos anti-CCR8 a un sujeto que lo necesite.

En el modelo de ratón Pan02 resistente a PD-1, una combinación de anticuerpos dirigidos a CCR8 y PD-1 mostró una eficacia in vivo mejorada en comparación con la monoterapia con cualquiera de los anticuerpos. La reducción de los Treg inmunosupresores de CCR8+ puede crear sinergias con el bloqueo del ligando 1 de PD-1/PD (PD-L1) para promover una respuesta más fuerte de los linfocitos T CD8+ efectores y mejorar la inmunidad antitumoral. En una realización, la composición que comprende anticuerpos anti-CCR8 se administra como parte de una terapia combinada que comprende la administración de un anticuerpo dirigido a PD-1 o PD-L1. En una realización, la composición que comprende anticuerpos anti-CCR8 se administra como una terapia combinada con pembrolizumab, budigalimab, nivolumab, cemiplimab o dostarlimab. En una realización, la composición que comprende anticuerpos anti-CCR8 se administra como una terapia combinada con atezolizumab, avelumab y durvalumab.

8. Ejemplos

Los Ejemplos siguientes, en los que se resaltan determinadas características y propiedades de las realizaciones ilustrativas de los anticuerpos y los fragmentos de unión que se describen en la presente descripción, se proporcionan con fines ilustrativos.

8.1. Ejemplo 1: Producción de hibridomas de rata

Las ratas se inmunizaron con 2 vectores de ADNc de CCR8 humano de longitud completa diferentes (6 ratas para cada vector). Se aislaron células de ganglios linfáticos y se fusionaron con NS0 para generar hibridomas. Tras la expansión, los sobrenadantes de los hibridomas se examinaron para determinar su unión al CCR8 humano o de macaco (“ cyno” o “cy” ) sobreexpresado en células HEK293. Se expresaron 46 mAb quiméricos de rata/hlgG1 mediante la producción de anticuerpos de alto rendimiento y se confirmó que 21 se unían al CCR8 humano (Fig. 1). Se seleccionaron cuatro mAb quiméricos AC-254290, AC-254532, AC-254546 y AC-254259 para la humanización completa basándose en la mayor reactividad cruzada de macaco en las líneas Jurkat que sobreexpresan CCR8.

8.2. Ejemplo 2: Cartografía de epítopos mediante unión competitiva a huCCR8

Se ensayaron los anticuerpos quiméricos seleccionados para determinar su unión al CCR8 humano en células Jurkat mediante ensayos de cartografía de epítopos celulares junto con anticuerpos contra el CCR8 humano de BD Biosciences (clon 433H) y Biolegend (clon L263G8). Se notificó que ambos anticuerpos comerciales se generaron inmunizando ratones con transfectantes de CCR8 humanos, y ninguno de los dos presenta reacción cruzada con el CCR8 de macaco. Se ensayaron los anticuerpos por pares con células teñidas con concentraciones saturantes del anticuerpo 1 , se lavaron y a continuación se tiñeron con el anticuerpo 2 o viceversa.

Los mAb AC-254290 y AC-254532 interfirieron con la unión en cualquier orden, lo que sugiere que se unen al mismo epítopo (epítopo A) (Fig. 2). El AC-254546 muestra una interferencia moderada en la unión al epítopo con el AC-254290 y el a C-254532, pero no hay evidencia de unión al mismo epítopo; por lo tanto, el AC-254546 se une al epítopo B, que es único pero cercano al epítopo A. El AC-254259 no mostró interferencia de unión con ningún otro anticuerpo y es probable que sea un epítopo único (epítopo C). El clon 433H de BD Biosciences tenía la misma unión al epítopo que el AC-254290 y alguna interferencia en la unión con AC-254532, AC-254546 y al clon de Biolegend L263G8 y, por lo tanto, está agrupado con el epítopo A. Según los datos de interferencia con el clon 433H de BD Biosciences y los demás anticuerpos, el clon L263G8 de Biolegend se agrupa como epítopo D, que es único pero próximo al epítopo A aunque no al epítopo B.

8.3. Ejemplo 3: Humanización de quimeras Fc de dominio variable de rata/IgG1 humana

Los cuatro anticuerpos quiméricos AC-254290, AC-254532, AC-254546 y AC-254259 se humanizaron (i) identificando la secuencia de los anticuerpos de roedores; (ii) identificando las CDR y los marcos de los anticuerpos; (iii) creando un modelo de estructura de VH-VL; (iv) identificando un resto de marco para la retromutación, a fin de mantener la función del anticuerpo de los roedores; (v) seleccionando germoplasma humano con elevada identidad, estructuras convencionales de CDR más similares y con menos retromutaciones necesarias; y (iv) generando una secuencia de VH/VL injertando la CDR e incorporando las retromutaciones seleccionadas.

Se crearon cuatro anticuerpos humanizados para cada anticuerpo seleccionado. El AC-254290 requería soluciones basadas en secuencias y estructuras para la humanización. El injerto directo de la CDR dio como resultado un anticuerpo que tenía una mala unión a las células Jurkat que expresaban el CCR8 humano. Se ensayaron las retromutaciones basadas en una estructura/interfaz VH/VL prevista para roedores. El triplete de restos antes de la HCDR3 era CTA, que es atípico. La posición 94 (la A en CTA) es casi siempre una arginina (R). Dos versiones humanizadas con CTR presentaron una unión deficiente a células Jurkat que expresaban el CCR8 humano, con valores de CE<50>de 3,96 y 5,61 |jg/ml. Por el contrario, dos versiones humanizadas con CTA anteriores a la HCDR3 (CTAGDRNKPFAY (Id. de sec. n.° 14)), una de las cuales era AC-264700, demostraron una fuerte unión, con valores de CE<50>de 0,2559 y 0,2302 jg/ml, comparándose favorablemente con el anticuerpo AC-254290 precursor (CE<50>de 0,4538 jg/ml).

Se evaluaron los anticuerpos humanizados para determinar su capacidad para unirse al CCR8 humano o de macaco. Se determinaron las CE<50>ensayando 8 concentraciones de anticuerpo a partir de 30 jg/m l con diluciones 5 veces para determinar su unión a las células Jurkat que sobreexpresan el CCR8 humano o de macaco. Tras incubación con los anticuerpos CCR8 de ensayo, las células se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo, se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo.

AC-254259 y AC-254532 presentaron una unión reducida al CCR8 de macaco y una elevada unión no específica a las células HEK293, respectivamente. AC-264711 (AC-254546 humanizado) y el AC-264700 (AC-254290 humanizado) se adelantaron debido a su unión superior a la diana, la ausencia de unión no específica y los requisitos limitados de ingeniería responsable.

8.4. Ejemplo 4: Diseño mediante ingeniería genética de la sensibilidad del AC-264700

AC-264700 tenía motivos DS en HCDR2 y en LCDR1 en los aminoácidos 61 a 62 y 27 a 28, respectivamente (kabat), que presentan un riesgo de isomerización, y un motivo DP en las posiciones de aminoácidos 94-95 (kabat) de LCDR3, que eran sujeto de una posible fragmentación. La sensibilidad de DS en HCDR2 se mutó a DA según la experiencia con anticuerpos anteriores. La eliminación del motivo DP rompió la unión, pero la fragmentación de los anticuerpos que retenían el motivo DP no se manifestó en los ensayos de estrés. Se crearon veintidós anticuerpos variantes de LCDR1 DS y se evaluaron sus propiedades de unión mediante citometría de flujo frente a las células Jurkat huCCR8 o cyCCR8 con sobreexpresión. La unión no específica a las células Jurkat precursoras se evaluó mediante citometría de flujo. Se seleccionaron diez de las variantes de anticuerpos para su posterior caracterización basándose en propiedades funcionales y similares a las de los fármacos favorables. Se eligieron dos por adelantado en función de su combinación general de propiedades que incluyen la unión, la reducción de la autointeracción, la falta de no especificidad, la reactividad cruzada con macaco y la actividad en el bioensayo indicador de ADCC de la variante V del hFcyRIIIa (Promega).

Se evaluó la capacidad de unión de las moléculas candidatas utilizando citometría de flujo mediante métodos conocidos frente a huCCR8 o cyCCR8 sobreexpresados en la superficie de las células Jurkat. Se ensayaron los anticuerpos ilustrativos para determinar su capacidad para autointeractuar, unirse a huCCR8 y cyCCR8, su capacidad para llevar a cabo la ADCC utilizando el bioensayo indicador y su unión no específica a las células HEK293. AC-277357 tenía una capacidad de unión superior de las células Jurkat huCCR8 y cyCCR8 en comparación con los anticuerpos precursores y otros anticuerpos candidatos (Tabla 1). La puntuación de la autointeracción AC-SINS para cada candidato fue <1. A 100 jg/ml, los máximos de unión no específica oscilaron entre 97 y 144 GMFI. A 10 jg/ml, los máximos de unión no específica oscilaron entre 94 y 111 GFMI. A 1 jg/ml, los máximos de unión no específica oscilaron entre 87 y 102 GMFI. AC-277357 tuvo el máximo de unión no específica más bajo para las células HEK293 con 100 jg/ml, una unión más fuerte a las células Jurkat huCCR8 y cyCCR8 y la mayor inducción de plegado de señal con las células Jurkat huCCR8 y cyCCR8 diana en el bioensayo del indicador de ADCC. Además, AC-277357 tuvo una de las puntuaciones de autointeracción más bajas en comparación con el anticuerpo original.

Tabla 1: Comparación de las variantes del AC-264700

AC-264700 AC-277357 AC-277371 AC-277483 Anticuerpo

Mutación DS D 27^T D 27^G S 28^A CE<50>del

huCCR8 (nM)2,33 1,51 1,87 2,90 Unión a células Jurkat hu/cy CCR8

CE<50>del

cyCCR8 (nM)5,27 2,37 4,83 5,93

8.5. Ejemplo 5: Diseño mediante ingeniería genética de la sensibilidad del AC-264711

AC-264711 tenía un motivo NS en los aminoácidos 60-61 (kabat) de la región HCDR2, lo que suponía un riesgo de desaminación. Además, el resto M100c de HCDR3 mostró altos niveles de oxidación durante los ensayos de esfuerzo.

Se ensayaron las variantes candidatas del AC-264711 con mutaciones NS para eliminar la sensibilidad y determinar su capacidad de autointeractuar, unirse de forma no específica a las células HEK293, unirse a las células Jurkat huCCR8 y cyCCR8 e inducir la señal en el bioensayo del indicador ADDC, con células Jurkat que expresan el huCCR8 como dianas. Se toleró la eliminación del motivo NS. Se crearon veintinueve variantes de NS y se evaluaron sus propiedades de unión mediante citometría de flujo frente a las células Jurkat precursoras y las células Jurkat huCCR8 o cyCCR8 sobreexpresadas. Se ensayaron cinco anticuerpos con los mejores perfiles de unión y propiedades similares a las de los fármacos en el bioensayo del indicador de ADCC y los tres anticuerpos con la mejor combinación de propiedades, AC-275889, AC-275896 y AC-275898, se ensayaron por adelantado para detectar las mutaciones del M100c a fin de prevenir la oxidación.

Se generaron variantes de AC-275889, AC-275896 y AC-275898 con mutaciones M100c y se ensayaron en los mismos ensayos que los mutantes NS. Los datos de estos ensayos se utilizaron para priorizar ocho anticuerpos para llevar a cabo los ensayos de propiedades similares a las de los fármacos. AC-291774 y AC-291790 obtuvieron las puntuaciones AC-SINS de autointeracción más altas, con 8,38 y 6,75, respectivamente. Los candidatos restantes obtuvieron puntuaciones AC-SINS comparables que oscilaban entre 1,73 y 2,79. AC-275896 y AC-275898 tuvieron la mayor unión no específica a las células HEK293 con 1780 y 1065, GFMI, respectivamente. AC-291790, AC-275889 y AC-275898 tenían máximos de unión no específica de 335, 148 y 141, respectivamente. A 10 y 1 |jg/ml, todas las moléculas candidatas tenían máximos de unión no específica comparables que oscilaban de 61 a 67 y de 57 a 60, respectivamente. AC-291774 y AC-291790 tuvieron la unión no específica más baja, como lo indica la unión a las células Jurkat precursoras y la cromatografía de interacción hidrófoba, a la vez que mantuvieron una potente unión a las células Jurkat que expresaban huCCR8 y cyCCR8 y valores de CE50 y una señal indicadora de la inducción del plegado de ADCC comparables con las células Jurkat que expresaban tanto huCCR8 como cyCCR8 en comparación con AC-275889, AC-275896 y AC-275896275898 (Tabla 2).

Tabla 2. Ensayos in vitro de variantes de AC-264711

8.6. Ejemplo 6: Selección final de anticuerpos candidatos

Se seleccionaron AC-277357, AC-277371, AC-291774 y AC-291790 para evaluarse adicionalmente en experimentos adicionales de propiedades similares a fármacos y de inmunoseguridad in vitro. Para generar una variante afucosilada para su caracterización, las células que expresaban AC-277357 se transfectaron con un plásmido para llevar a cabo la expresión en Pseudomonas de la enzima GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD), que convierte un intermedio en la síntesis de novo de la fucosa en un producto sin salida, lo que da como resultado en la producción de AC-277357 afucosilada.

Se evaluaron las moléculas candidatas para determinar la actividad de unión a Jurkat huCCR8, Jurkat cyCCR8 y TALL-1, la actividad de ADCC de hPBMC con TALL-1 como dianas, la actividad de ADCC en células efectoras F158 con huCCR8 que sobreexpresan células Jurkat como dianas y células efectoras V158 con células Jurkat que sobreexpresan huCCR8 como dianas. AC-277357 (también denominado PR-1925514) mostró una unión mejorada a los niveles endógenos de expresión de CCR8 en las células TALL-1 y la versión afucosilada fue más activa en los ensayos de ADCC en células primarias (datos no mostrados). AC-277357/PR-1925514 se une más potentemente al CCR8 en los Treg humanos y tiene un mejor perfil en los ensayos de liberación de citoquinas que el AC-291774 (también denominado PR-1928444) (datos no mostrados). Se eligió AC-277357/PR-1925514 con una Fc IgG1 humana afucosilada como el anticuerpo principal porque tenía el mejor perfil funcional y de inmunoseguridad in vitro (IVIS), así como excelentes propiedades similares a las de los fármacos.

8.7. Ejemplo 7: Ensayos de unión y potencia funcional

Se cribaron los anticuerpos mediante citometría de flujo de un solo punto para evaluar la unión a las líneas de células Jurkat que sobreexpresaban el CCR8 humano o de macaco. Se determinaron las CE50 analizando ocho concentraciones de anticuerpo a partir de 30 |jg/ml con diluciones de 5 veces para determinar su unión a las células Jurkat CCR8 humanas, Jurkat CCR8 de macaco y Jurkat precursoras mediante citometría de flujo. Tras incubación con los anticuerpos CCR8 de ensayo, las células se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo, se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo.

El kit básico de la variante V del FcyRIIIa humano o el modelo de propagación celular de la variante F del FcyRIIIa humano se adquirieron de Promega y se usaron según las instrucciones. Las líneas de células Jurkat diana que sobreexpresaban el CCR8 humano o de macaco o las células Jurkat precursoras de control se lavaron una vez en tampón de ensayo ADCC, se diluyeron a 6 x 106 células por ml en tampón de ensayo ADCC y se sembraron en placas de ensayo (Costar) de 96 pocillos de paredes blancas a 25 j l por pocillo. Se diluyeron los anticuerpos a una concentración final 3x en el tampón de ensayo ADCC para su adición a 25 j l por pocillo (se ensayaron diluciones 1:5 veces en 7 puntos que oscilaban entre 1 jg/m l y 0,000064 jg/ml). Las células efectoras (que expresan de forma estable la variante FcyRIIIa V158 humana, la variante FcyRIIIa F158 humana o la F<cy>RIV de ratón y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de la luciferasa de luciérnaga) se descongelaron y se añadieron en una proporción final entre el efector y el objetivo de 1:2,5. Tras la incubación a 37 °C, se mezcló el reactivo BioGlo (Promega) al 5 % de CO2 durante 6 horas y se añadió según las instrucciones y se midió la señal de luminiscencia.

8.8. Ejemplo 8: Curvas de respuesta a la dosis para ABBV-514

Se evaluaron las versiones fucosiladas y afucosiladas (renombradas como ABBV-514) del AC-277357/PR-1925514 para determinar la unión celular a las líneas de células Jurkat que sobreexpresan el CCR8 humano o de macaco y a las células TALL-1 que expresan niveles endógenos de CCR8. Se evaluó la unión celular mediante citometría de flujo usando métodos similares a los descritos anteriormente. Además, se evaluó la unión de las líneas de control Jurkat precursoras (sin expresión de CCR8) y TALL-1 inactivadas génicamente de CCR8 (KO). ABBV-514 mostró unión al CCR8 humano y de macaco sobreexpresado en células Jurkat, pero no a las células Jurkat precursoras o CCR8 KO TALL-1 (Fig. 4A). ABBV-514 también se unió al CCR8 endógeno en las células TALL-1 de forma similar a la del AC-277357/PR-1925514 fucosilado (WT) (Fig. 4B).

Tanto WT PR-1925514 como ABBV-514 fucosilados median en la ADCC, medida mediante la inducción de luminiscencia en un bioensayo basado en células indicadoras de FcyRIIIa humanas utilizando líneas indicadoras de variantes alélicas de FcyRIIIa V158 (Figs. 5A, 5C) o F158 (Figs.5B, 5D) cultivadas simultáneamente con células Jurkat que sobreexpresan CCR8 humano (Figs. 5A, 5B) o de macaco (Figs. 5C, 5D). El cambio de veces en la luminiscencia en comparación con los cultivos simultáneos no tratados se presenta como la media ± SEM de 2-5 experimentos independientes. El ABBV-514 mostró una mayor actividad de ADCC, como lo indica el bioensayo indicador de la ADCC en comparación con el WT PR-1925514 fucosilado. A fines comparativos con las concentraciones expresadas en jg/ml, una concentración de 1 jg/m l de anticuerpo equivale a 6,76 nM.

8.9. Ejemplo 9: Datos del ensayo ADCC de células primarias para ABBV-514

Se evaluó adicionalmente la actividad del ABBV-514 en un ensayo ADCC basado en la citotoxicidad celular utilizando células TALL-1 como diana y linfocitos citolíticos (NK) primarios humanos como efector. Se usaron seis fuentes donantes de linfocitos citolíticos (NK) como células diana y se evaluó la muerte celular de las células TALL-1 diana mediante citometría de flujo utilizando métodos similares a los descritos anteriormente. ADCC mediada por ABBV-514 de células TALL-1 que expresaban CCR8 en las seis muestras de células NK donantes (Fig. 6). Se evaluó la actividad de ADCC en cultivos de sangre humana completa mediante citometría de flujo utilizando los procedimientos adaptados descritos anteriormente. Después de 48 horas, se analizó un cultivo de sangre humana completa con ABBV-514 para evaluar la fracción de Treg con bajo contenido de CD45RA del total de linfocitos CD45+ hematopoyéticos. Los Treg con bajo contenido de CD45RA incluyen linfocitos vivos CD45+, CD3+, CD4+, CD25+, con bajo contenido de CD127, Foxp3+ y con bajo contenido de CD45RA, que se sabe que están enriquecidas en la expresión de CCR8. Se evaluaron los datos de células sanguíneas completas humanas de 11 donantes sanos. En cada donante, el ABBV-514 disminuyó la cantidad porcentual de Treg con bajo contenido de CD45RA de los linfocitos CD45+ vivos (datos no mostrados).

8.10. Ejemplo 10: Evaluación del bloqueo del ligando CCL1 por ABBV-514

Se usó un ensayo indicador de beta-arrestina del CCR8 para determinar si ABBV-514 bloqueaba la interacción del CCR8 con su ligando, CCL1 (Fig. 7). Se observó la inhibición de la activación del indicador mediada por CCL1 en presencia del ABBV-514 solo a concentraciones de anticuerpo sustancialmente más altas que aquellas en las que se observó actividad de unión o ADCC, observándose una CE50 del bloqueo del CCL1 a 23,1 |jg/ml.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Un anticuerpo anti-CCR8 que comprende (i) una cadena VH que comprende tres CDR; y (ii) una cadena VL que comprende tres CDR, en donde:

   la CDR n.° 1 de VH es GFIFSNAVMY (Id. de sec. n.° 1);

   la CDR n.° 2 de VH es RIKTKFNNYATYYADAVKG (Id. de sec. n.° 2);

   la CDR n.° 3 de VH es GDRNKPFAY (Id. de sec. n.° 3);

   la CDR n.° 1 de VL es RASTSVITLLH (Id. de sec. n.° 4);

   la CDR n.° 2 de VL es GASNLES (Id. de sec. n.° 5); y

   la CDR n.° 3 de VL es QQSWNDPYT (Id. de sec. n.° 6);

   en donde el anticuerpo comprende una región constante Fc de IgGl que está afucosilada.

   El anticuerpo anti-CCR8 de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 7 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 8.

   El anticuerpo anti-CCR8 de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 9, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como Id. de sec. n.° 10.

   Una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos anti-CCR8 según la reivindicación 1, en donde más del 80 % de los anticuerpos anti-CCR8 de la composición están afucosilados.