ES2998541T3

ES2998541T3 - Protein fiber production method

Info

Publication number: ES2998541T3
Application number: ES19866282T
Authority: ES
Inventors: Yunosuke ABE; Hirotada Ando; Koichi KOTAKA
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Spiber Inc
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2025-02-20
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: JP7454853B2; EP3859056B1; EP3859056C0; US12600754B2; EP4545558A2; EP3859056A4; EP3859056A1; CN112752872B; CN112752872A; EP4545558A3; JPWO2020067574A1; WO2020067574A1; US20210395317A1

Abstract

Se describe un método de producción de fibra de proteína que comprende un paso para poner en contacto una solución madre de hilado que contiene proteína y un solvente orgánico con una solución coagulante para coagular la proteína, en donde el contenido de proteína en la solución madre de hilado excede el 10 % en masa con base en la cantidad total de solución madre de hilado, y la solución coagulante contiene agua o una solución acuosa que tiene un pH entre 0,25 y 10,00 inclusive. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de fibra de proteína

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir una fibra de proteína.

Antecedentes de la técnica

Como método para producir una fibra de proteína que contiene una proteína estructural como componente principal, se conocen convencionalmente un método de hilado en húmedo y un método de hilado en húmedo en seco que incluyen la descarga de una disolución de hilado desde una boquilla en un baño de coagulación para coagular la disolución de hilado, formando de esta manera una fibra.

En el método de hilado en húmedo y el método de hilado en húmedo en seco de la fibra de proteína, se ha informado que una fibra de proteína se obtiene al utilizar, como disolución de hilado (solución de disolución), una solución de proteína en la que una proteína se disuelve en un solvente; al extruir la disolución de hilado desde una boquilla en un líquido de coagulación; y eliminar el solvente de la disolución de hilado para formar una fibra, formando de esta manera un hilo no estirado (véase, por ejemplo, Literatura de Patente 1, Literatura de Patente 2, Literatura No de Patente 1 y Literatura No de Patente 2). Los métodos y aparatos para preparar fibras de proteína (biofilamentos) a partir de proteínas de biofilamentos recombinantes se describen en la Literatura de Patente 3.

Como solvente utilizado para el líquido de coagulación en la producción de la fibra de proteína, se han utilizado generalmente alcoholes inferiores tales como metanol, etanol, y 2-propanol, y cetonas tales como acetona. Por ejemplo, se ha informado de un método que incluye disolver proteína de seda regenerada (fibroína de seda regenerada) en ácido fórmico e poner la disolución en un líquido de coagulación tal como alcohol inferior o acetona para formar fibra de fibroína de seda regenerada (Literatura no de Patente 1), un método que incluye disolver una fibroína de seda de araña que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de MaSp1 deNephila clavipesen hexafluoroisopropanol (HFIP) e introducir la disolución en un líquido de coagulación de metanol para formar una fibra de fibroína de seda de araña (Literatura No de Patente 2), y similares.

Lista de citas

Literatura de Patente

Literatura de Patente 1: JP 5540154 B

Literatura de Patente 2: JP 5584932 B

Literatura de Patente 3: US 2005/292120

Literatura No de Patente

Literatura No de Patente 1: Int. J. Biol. Macromol., vol.34, 2004, pp.89-105

Literatura No de Patente 2: PNAS, 10 de agosto de 2010, vol.107, No.32, pp.14059-14063

Resumen de la invención

Problema técnico

Cuando se produce una fibra de proteína al utilizar una proteína estructural de alto peso molecular, que es un material extremadamente útil en el futuro, por ejemplo, fibroína de seda, fibroína de seda de araña, queratina, y similares, mediante el método de hilado en húmedo y el método de hilado en húmedo en seco, el líquido de coagulación para formar dicha fibra de proteína es extremadamente limitado. Entre estos líquidos de coagulación, los alcoholes inferiores tales como el metanol, etanol y 2-propanol, y las cetonas tales como la acetona, que se pueden conseguir con un coste relativamente bajo y tienen una propiedad de formación de fibras, se utilizan generalmente como un líquido de coagulación para una proteína estructural.

Sin embargo, estos solventes de coagulación están designados como materiales peligrosos de Clase 4 según la Ley de Defensa contra Incendios y tienen un riesgo de explosión, incendio, y similares. Por lo tanto, es difícil considerar que estos solventes de coagulación sean adecuados como solvente de coagulación que se consume en gran cantidad en el proceso de producción desde el punto de vista de la seguridad. Se ha deseado una reducción adicional de la carga desde el punto de vista del coste de producción y la carga medioambiental. En vista de los problemas de la técnica convencional descrita anteriormente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir una fibra de proteína formada al utilizar un líquido de coagulación que contiene agua o una solución acuosa.

Solución al problema

Los presentes inventores llevaron a cabo estudios intensivos para resolver los problemas descritos anteriormente de la técnica convencional. Como resultado, los presentes inventores encontraron que se puede producir una fibra de proteína al combinar una disolución de hilado que contiene una proteína y un solvente orgánico con un líquido de coagulación que contiene agua o una solución acuosa de pH 0.25 o mayor y pH 10.00 o menor.

La invención es como se define en las reivindicaciones y cualesquier otros aspectos, configuraciones o realizaciones establecidos en el presente documento que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones son sólo para información.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención puede proporcionar un método para producir una fibra de proteína formada al utilizar un líquido de coagulación que contiene una solución acuosa. El uso de un líquido de coagulación que contiene una solución acuosa puede reducir el riesgo de explosión, incendio, y similares, el coste de producción, y la carga ambiental.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una vista esquemática que ilustra un ejemplo de una secuencia de dominio de una fibroína de araña.

La Fig. 2 es una vista esquemática que ilustra un ejemplo de una secuencia de dominio de una fibroína de araña.

La Fig. 3 es una vista esquemática que ilustra un ejemplo de una secuencia de dominio de una fibroína de araña.

La Fig. 4 es una vista explicativa que ilustra un ejemplo de un aparato de hilado para producir una fibra de proteína.

La Fig.5 es un gráfico que muestra un ejemplo del resultado de una prueba de propiedad de generación de calor que absorbe la humedad.

Descripción de las realizaciones

En adelante, se describirán en detalle las realizaciones de la presente divulgación.

[Método para producir fibra de proteína]

El método para producir una fibra de proteína de la presente realización incluye un proceso para poner una disolución de hilado que contiene una proteína y un solvente orgánico en contacto con un líquido de coagulación para coagular la proteína. En el presente documento, el contenido de proteína en la disolución de hilado es mayor del 10 % en masa en base a la cantidad total de la disolución de hilado. Además, el líquido de coagulación contiene agua o una solución acuosa de pH 0.25 o mayor y pH 10.00 o menor. El método para producir una fibra de proteína de la presente realización se puede realizar de acuerdo con un método de hilado conocido públicamente tal como hilado en húmedo e hilado en húmedo seco.

<Disolución de hilado>

La disolución de hilado de acuerdo con la presente realización contiene una proteína y un solvente orgánico. (Proteína)

La fibra de proteína producida de acuerdo con el método de producción de la presente realización contiene una proteína como componente principal. La proteína contenida en la disolución de hilado de la presente realización es una proteína producida artificialmente (proteína artificial), pero no es una proteína natural ni un producto purificado de la misma. El método para producir artificialmente una proteína no se limita particularmente. La proteína puede ser aquella producida por microorganismos o similares mediante una tecnología de recombinación genética, o puede ser aquella producida a través de síntesis.

La proteína puede ser, por ejemplo, una proteína estructural o una proteína estructural artificial derivada de la proteína estructural. La proteína estructural significa una proteína que forma o mantiene su estructura, forma y similares in vivo.

Los ejemplos de la proteína estructural incluyen proteína de seda de araña (fibroína de seda de araña, por ejemplo), proteína de seda, proteína de colágeno, proteína de resilina, proteína de elastina y proteína de queratina.

La proteína de seda de araña de la presente realización incluye proteína de seda de araña de origen natural y proteína de seda de araña modificada (en adelante, también denominada como “fibroína modificada”). El término “proteína de seda de araña de origen natural” como se utiliza en el presente documento significa una proteína de seda de araña que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una proteína de seda de araña de origen natural (fibroína de seda de araña, por ejemplo), y la “proteína de seda de araña modificada” o la “fibroína modificada” significa una proteína de seda de araña que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de la proteína de seda de araña de origen natural.

Los ejemplos de la proteína de seda de araña de origen natural incluyen las fibroínas de araña producidas por arañas, tales como las proteínas de seda de hilo de seguridad principal, las proteínas de seda flageliforme y las proteínas de las glándulas ampuladas menores. La seda de hilo de seguridad principal tiene una región repetitiva compuesta de regiones cristalinas y regiones no cristalinas (también denominada como región amorfa) y, por lo tanto, tiene una alta tensión y capacidad de estiramiento. La seda flageliforme de araña no tiene regiones cristalinas, pero tiene una región repetitiva compuesta de regiones amorfas. La seda flageliforme tiene una alta capacidad de estiramiento, aunque su tensión es inferior a la de la seda de hilo de seguridad principal.

La proteína de seda de hilo de seguridad principal se produce en las glándulas ampuladas mayores de las arañas y tiene la característica de ser excelente en cuanto a tenacidad. Los ejemplos de la proteína de seda de hilo de seguridad principal incluyen las espidroínas ampuladas mayores MaSp1 y MaSp2 derivadas deNephila clavipesy ADF3 y ADF4 derivadas deAraneus diadematus. ADF3 es una de las dos proteínas de seda de hilo de seguridad principal deAraneus diadematus. La proteína de seda de araña puede ser una proteína de seda de araña derivada de estas proteínas de seda de hilo de seguridad. La proteína de seda de araña derivada de ADF3 es relativamente fácil de sintetizar y tiene excelentes características en términos de resistencia, alargamiento y tenacidad.

La proteína de seda flageliforme se produce en las glándulas flageliformes de las arañas. Los ejemplos de la proteína de seda flageliforme incluyen proteínas de seda flageliforme derivadas deNephila clavipes.

Los ejemplos de la fibroína de araña producida por arañas incluyen proteínas de seda de araña producidas por arañas que pertenecen al géneroAraneus talescomoAraneus ventricosus, Araneus diadematus, Araneus pinguis, Araneus pentagrammicus,yAraneus nojimai; arañas que pertenecen al géneroNeoscona talescomoNeoscona scylla, Neoscona nautica, Neoscona adianta,yNeoscona scylloides; arañas que pertenecen al géneroPronus talescomoPronous minutes; arañas que pertenecen al géneroCyrtarachne talescomoCyrtarachne bufoyCyrtarachne inaequalis; arañas que pertenecen al géneroGasteracantha talescomoGasteracantha kuhliyGasteracantha mammosa; arañas que pertenecen al géneroOrdgarius talescomoOrdgarius hobsoniyOrdgarius sexspinosus; arañas que pertenecen al géneroArgiope talescomoArgiope amoena, Argiope minuta,yArgiope bruennich; arañas que pertenecen al géneroArachnura talescomoArachnura logio; arañas que pertenecen al géneroAcusilas talescomoAcusilas coccineus; arañas que pertenecen al géneroCytophora talescomoCyrtophora moluccensis, Cyrtophora exanthematica,yCyrtophora unicolor; arañas que pertenecen al géneroPoltys talescomoPoltys illepidus; arañas que pertenecen al géneroCyclosa talescomoCyclosa octotuberculata, Cyclosa sedeculata, Cyclosa vallata,yCyclosa atrata; y arañas que pertenecen al géneroChorizopes talescomoChorizopes nipponicus; y proteínas de seda de araña producidas por arañas que pertenecen al géneroTetragnatha talescomoTetragnatha praedonia, Tetragnatha maxillosa, Tetragnatha extensa,yTetragnatha squamata; arañas que pertenecen al géneroLeucauge talescomoLeucauge magnifwca, Leucauge blanda,yLeucauge subblanda; arañas que pertenecen al géneroNephila talescomoNephila clavateyNephila pilipes; arañas que pertenecen al géneroMenosira talescomoMenosira ornata; arañas que pertenecen al géneroDyschiriognatha talescomoDyschiriognatha tenera; arañas que pertenecen al géneroLatrodectus talescomoLatrodectus mactans, Latrodectus hasseltii, Latrodectus geometricus,yLatrodectus tredecimguttatus; y arañas que pertencen a la familiaTetragnathidae talescomo arañas que pertenecen al géneroEuprosthenops.

Ejemplos más específicos de la proteína de seda de araña producida por arañas incluyen fibroína-3 (adf-3) [derivada deAraneus diadematus] (No. de Acceso de GenBank AAC47010 (secuencia de aminoácidos), U47855 (secuencia base)), fibroína-4 (adf-4) [derivada deAraneus diadematus] (No. de Acceso de GenBank AAC47011 (secuencia de aminoácidos), U47855 (secuencia base)), espidroína de proteína de seda de hilo de seguridad 1 [derivada deNephila clavipes] (No. de Acceso de GenBank AAC04504 (secuencia de aminoácidos), U37520 (secuencia base)), espidroína ampulada mayor 1 [derivada deLatrodectus hesperus] (No. de Acceso de GenBank ABR68856 (secuencia de aminoácidos), EF595246 (secuencia base)), espidroína de proteína de seda de hilo de seguridad 2 [derivada deNephila clavata] (No. de Acceso de GenBank AAL32472 (secuencia de aminoácidos), AF441245 (secuencia base)), espidroína ampulada mayor 1 [derivada deEuprosthenops australis] (No. de Acceso de GenBank CAJ00428 (secuencia de aminoácidos), AJ973155 (secuencia base)), y espidroína ampulada mayor 2 [Euprosthenops australis] (No. de Acceso de GenBank CAM32249.1 (secuencia de aminoácidos), AM490169(secuencia base)), proteína de seda ampulada menor 1 [Nephila clavipes] (No. de Acceso de GenBank AAC14589.1(secuencia de aminoácidos)), proteína de seda ampulada menor 2 [Nephilaclavipes] (No. de Acceso de GenBank AAC14591.1 (secuencia de aminoácidos)), y proteína similar a espidroína ampulada menor [Nephilengys cruentata] (No. de Acceso de GenBank ABR37278.1 (secuencia de aminoácidos).

La proteína de seda de araña de la presente realización puede ser, por ejemplo, una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. En la proteína de seda de araña de la presente realización, una secuencia de aminoácidos (secuencia de terminal N y secuencia de terminal C) se puede agregar adicionalmente a cualquiera o ambos del lado de terminal N y lado de terminal C de la secuencia de dominio. La secuencia de terminal N y la secuencia de terminal C no se limitan a esto, sino que, normalmente, son regiones que no tienen repeticiones de motivos de aminoácidos caracterizados en fibroína, y cada una consiste en aminoácidos de aproximadamente 100 residuos.

El término “secuencia de dominio” como se utiliza en el presente documento es una secuencia de aminoácidos que produce una región cristalina (normalmente que corresponde al motivo (A)nde la secuencia de aminoácidos) y una región amorfa (normalmente, que corresponde a la REP de la secuencia de aminoácidos) específica a fibroína, y significa una secuencia de aminoácidos representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. En el presente documento, el motivo (A)nrepresenta una secuencia de aminoácidos que consiste principalmente en residuos de alanina, y el número de residuos de aminoácidos es 2 a 27. El número de residuos de aminoácidos del motivo (A)npuede ser 2 a 20, 4 a 27, 4 a 20, 8 a 20, 10 a 20, 4 a 16, 8 a 16, o 10 a 16. Además, la proporción del número de residuos de alanina relativo al número total de residuos de aminoácidos en el motivo (A)npuede ser 40 % o mayor, 60 % o mayor, 70 % o mayor, 80 % o mayor, 83 % o mayor, 85 % o mayor, 86 % o mayor, 90 % o mayor, 95 % o mayor, o 100 % (lo que significa que el motivo (A)nconsiste solo en residuos de alanina). Al menos siete de una pluralidad de motivos (A)nen la secuencia de dominio puede consistir en solo residuos de alanina. La REP representa una secuencia de aminoácidos que consiste en 2 a 200 residuos de aminoácidos. La REP puede ser una secuencia de aminoácidos que consiste en 10 a 200 residuos de aminoácidos, o puede ser una secuencia de aminoácidos que consiste en 10 a 40, 10 a 60, 10 a 80, 10 a 100, 10 a 120, 10 a 140, 10 a 160, o 10 a 180 residuos de aminoácidos. m representa un número entero de 2 a 300, o puede ser un número entero de 8 a 300, 10 a 300, 10 a 300, 20 a 300, 40 a 300, 60 a 300, 80 a 300, 10 a 200, 20 a 200, 20 a 180, 20 a 160, 20 a 140, o 20 a 120. Una pluralidad de motivos (A)npuede ser las mismas secuencias de aminoácidos o diferentes secuencias de aminoácidos. Una pluralidad de REPs puede ser las mismas secuencias de aminoácidos o diferentes secuencias de aminoácidos.

La proteína de seda de araña modificada (fibroína modificada) puede ser, por ejemplo, la obtenida al modificar una secuencia de aminoácidos derivada de fibroína de araña natural (por ejemplo, la obtenida al modificar la secuencia de genes de fibroína de araña natural clonada para modificar la secuencia de aminoácidos de la misma), o puede ser la obtenida mediante diseño y síntesis artificial en lugar de depender de fibroína de araña natural (por ejemplo, la que tiene una secuencia de aminoácidos deseada obtenida al sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos diseñada). Por cierto, en la presente realización, se utiliza preferiblemente como la fibroína modificada una fibroína de seda de araña modificada, que es excelente en cuanto a la propiedad de retención de calor, la propiedad de generación de calor por absorción de humedad y/o la capacidad de retardo de la llama.

La fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al realizar una modificación de la secuencia de aminoácidos correspondiente a, por ejemplo, la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos, con respecto a la secuencia de genes de la fibroína de araña de origen natural clonada. La sustitución, supresión, inserción, y/o adición de residuos de aminoácidos se puede realizar mediante un método conocido por los expertos en la técnica, como la mutagénesis dirigida al sitio. Específicamente, la modificación se puede realizar de acuerdo con un método descrito en la literatura, tal como Nucleic Acid Res.10, 6487 (1982) y Methods in Enzymology, 100, 448 (1983).

Ejemplos específicos de la fibroína modificada incluyen una fibroína modificada derivada de las principales proteínas de seda de hilo de seguridad producidas en las principales glándulas ampuladas de las arañas (primera fibroína modificada), una fibroína modificada que tiene un contenido reducido de residuo de glicina (segunda fibroína modificada), una fibroína modificada que tiene un contenido reducido de motivo (A)n(tercera fibroína modificada), una fibroína modificada que tiene un contenido reducido de residuo de glicina y un contenido reducido de motivo (A)n(cuarta fibroína modificada), una fibroína modificada que tiene una secuencia de dominio que incluye una región con un índice de hidropatía localmente alto (quinta fibroína modificada) y una fibroína modificada que tiene una secuencia de dominio que tiene un contenido reducido de residuo de glutamina (sexta fibroína modificada).

La fibroína modificada derivada de las principales proteínas de seda de hilo de seguridad producidas en las principales glándulas ampuladas de las arañas (primera fibroína modificada) incluye una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n- REP]m. En la primera fibroína modificada, en la Fórmula 1, n es preferiblemente un número entero de 3 a 20, más preferiblemente un número entero de 4 a 20, aún más preferiblemente un número entero de 8 a 20, incluso aún más preferiblemente un número entero de 10 a 20, aun preferiblemente adicionalmente un número entero de 4 a 16, particular y preferiblemente un número entero de 8 a 16, y lo más preferiblemente un número entero de 10 a 16. En la primera fibroína modificada, en la Fórmula 1, el número de residuos de aminoácidos que constituye la REP es preferiblemente 10 a 200, más preferiblemente 10 a 150, aún más preferiblemente 20 a 100, e incluso aún más preferiblemente 20 a 75. En la primera fibroína modificada, el número total de residuos de glicina, residuos de serina, y residuos de alanina incluidos en la secuencia de aminoácidos representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mes preferiblemente 40 % o mayor, más preferiblemente 60 % o mayor, y aún más preferiblemente 70 % o mayor, relativo al número total de residuos de aminoácidos.

La primera fibroína modificada puede ser una proteína que incluye unidades de una secuencia de aminoácidos representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]my cuya secuencia de terminal C es una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1 es idéntica a una secuencia de aminoácidos que consiste en 50 residuos de aminoácidos del terminal C de una secuencia de aminoácidos de ADF3 (GI: 1263287, NCBI). La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2 es idéntica a una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1 en la que 20 residuos de aminoácidos se han eliminado del terminal C. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3 es idéntica a una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1 en la que 29 residuos de aminoácidos se han eliminado del terminal C.

Ejemplos más específicos de la primera fibroína modificada incluyen fibroínas modificadas que incluyen (1-i) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4, o (1-ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos obtenida por la siguiente mutación: en una secuencia de aminoácidos de ADF3 en la que una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) que consiste en un codón de inicio, una etiquetaHis10 y un sitio de reconocimiento de la proteasa HRV3C (proteasa 3C del rinovirus humano) se agrega al terminal N, la 1° a 13° regiones repetitivas se duplican aproximadamente y la traducción termina en el residuo de aminoácidos 1154°. La secuencia de aminoácidos de terminal C de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4 es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3.

La fibroína modificada de (1-i) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4.

La fibroína modificada que tiene un contenido reducido de residuo de glicina (segunda fibroína modificada) tiene una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un contenido reducido de residuo de glicina, en comparación con la fibroína de araña de origen natural. La segunda fibroína modificada puede tener una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que al menos uno o una pluralidad de residuos de glicina en REP se sustituyen con otro residuo de aminoácidos, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

La segunda fibroína modificada puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que, en al menos una secuencia de motivo seleccionada de GGX y GPGXX (donde G representa un residuo de glicina, P representa un residuo de prolina, y X representa un residuo de aminoácidos diferente de glicina) en REP, un residuo de glicina en al menos una o una pluralidad de las secuencias de motivo se sustituye con otro residuo de aminoácidos, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

En la segunda fibroína modificada, la proporción de la secuencia de motivo en la que el residuo de glicina se ha sustituido con otro residuo de aminoácidos puede ser 10 % o mayor relativa a la secuencia de motivo completa.

La segunda fibroína modificada incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, y puede tener una secuencia de aminoácidos en la que z/w es 30 % o mayor, 40 % o mayor, 50 % o mayor, o 50.9 % o mayor en un caso donde el número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en XGX (donde X representa un residuo de aminoácidos diferente de glicina) contenido en todas las REP en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio se define como z, y el número total de residuos de aminoácidos en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de domino desde la secuencia de dominio se define como w. El número de residuos de alanina relativo al número total de residuos de aminoácidos en el motivo (A)npuede ser 83 % o mayor, preferiblemente 86 % o mayor, más preferiblemente 90 % o mayor, aún más preferiblemente 95 % o mayor, e incluso aún más preferiblemente 100 % (lo que significa que el motivo (A)nconsiste solo en residuos de alanina).

La segunda fibroína modificada es preferiblemente una en la que se aumenta la relación de contenido de la secuencia de aminoácidos que consiste en XGX al sustituir un residuo de glicina del motivo GGX con otro residuo de aminoácidos. En la segunda fibroína modificada, la relación de contenido de la secuencia de aminoácidos que consiste en GGX en la secuencia de dominio es preferiblemente 30 % o menor, más preferiblemente 20 % o menor, aún más preferiblemente 10 % o menor, incluso aún más preferiblemente 6 % o menor, aun preferiblemente adicionalmente 4 % o menor, y particular y preferiblemente 2 % o menor. La relación de contenido de la secuencia de aminoácidos que consiste en GGX en la secuencia de dominio se puede calcular por el mismo método que el método de cálculo de la relación de contenido (z/w) de la secuencia de aminoácidos que consiste en XGX descrita a continuación.

El método de cálculo de z/w se describirá con más detalle. En primer lugar, en una fibroína de araña (fibroína modificada o fibroína de araña de origen natural) que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, una secuencia de aminoácidos que consiste en XGX se extrae de todas las REP contenidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio. El número total de residuos de aminoácidos que constituye XGX es z. Por ejemplo, en un caso donde se extraen 50 secuencias de aminoácidos que consisten en XGX (no hay superposición), z es 50 x 3 = 150. También, por ejemplo, en un caso donde X (X central) contenido en dos XGX existe como en un caso de la secuencia de aminoácidos que consiste en XGXGX, z se calcula al sustraer la porción superpuesta (en un caso de XGXGX, son 5 residuos de aminoácidos). w es el número total de residuos de aminoácidos contenido en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio. Por ejemplo, en un caso de la secuencia de dominio mostrada en la Fig.1, w es 4 50 4 100 4 10 4 20 4 30 = 230 (que excluye el motivo (A)nubicado en el lado más de terminal C). A continuación, z/w (%) se puede calcular al dividir z por w.

En la segunda fibroína modificada, z/w es preferiblemente 50.9 % o mayor, más preferiblemente 56.1 % o mayor, aún más preferiblemente 58.7 % o mayor, incluso aún más preferiblemente 70 % o mayor, y aun preferiblemente adicionalmente 80 % o mayor. El límite superior de z/w no se limita particularmente, sino que, por ejemplo puede ser 95 % o menor.

La segunda fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al sustituir y modificar al menos una parte de una secuencia base que codifica un residuo de glicina de la secuencia de genes de la fibroína de araña de origen natural codificada con el fin de codificar otro residuo de aminoácidos. En este momento, un residuo de glicina en el motivo GGX y motivo GPGXX se puede seleccionar como un residuo de glicina que se va a modificar, y la sustitución se puede realizar de tal manera que z/w sea 50.9 % o mayor. Alternativamente, la segunda fibroína modificada también se puede obtener, por ejemplo, al designar una secuencia de aminoácidos que satisface cada una de las realizaciones anteriores a partir de la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, y sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos diseñada. En cualquier caso, además de la modificación que corresponde a la sustitución de un residuo de glicina en REP con otro residuo de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, se puede realizar además la modificación de la secuencia de aminoácidos que corresponde a la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos.

El otro residuo de aminoácidos descrito anteriormente no se limita particularmente siempre que sea un residuo de aminoácidos distinto de un residuo de glicina, pero es preferiblemente un residuo de aminoácidos hidrófobo tal como un residuo de valina (V), un residuo de leucina (L), un residuo de isoleucina (I), un residuo de metionina (M), un residuo de prolina (P), un residuo de fenilalanina (F) y un residuo de triptófano (W); y un residuo de aminoácidos hidrófilo tal como un residuo de glutamina (Q), un residuo de asparagina (N), un residuo de serina (S), un residuo de lisina (K), y un residuo de ácido glutámico (E). Entre ellos, un residuo de valina (V), un residuo de leucina (L), un residuo de isoleucina (I) y un residuo de glutamina (Q) son más preferibles, y un residuo de glutamina (Q) es aún más preferible.

Ejemplos más específicos de la segunda fibroína modificada incluyen fibroínas modificadas que incluyen (2-i) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9, o (2-ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9.

Se describirá la fibroína modificada de (2-i). La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los GGX en REP de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10 que corresponde a la fibroína de araña de origen natural con GQX. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos obtenida al suprimir el motivo (A)ncada otras dos posiciones desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C desde la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, e insertar demás un [motivo (A)n-REP] antes de la secuencia de terminal C. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos obtenida al insertar dos residuos de alanina en el lado de terminal C de cada motivo (A)nde la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7, y además sustituir una parte de los residuos de glutamina (Q) con un residuo de serina (S), y suprimir una parte de aminoácidos en el lado de terminal N de tal manera que el peso molecular del mismo será aproximadamente el mismo como el de la SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar una etiquetaHisal terminal C de la secuencia que tiene cuatro regiones de repetición de 20 secuencias de dominio que existen en el residuo de aminoácidos establecido en la SEQ ID NO: 11 (donde se sustituyen varios residuos de aminoácidos en el lado de terminal C de la región).

El valor de z/w en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10 (que corresponde a la fibroína de araña de origen natural) es 46.8 %. Los valores de z/w de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8, y la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 son respectivamente 58.7 %, 70.1 %, 66.1 %, y 70.0 %. Adicionalmente, los valores de x/y en la relación de Giza (descrita más adelante) de 1:1.8 a 11.3 de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 9 son respectivamente 15.0 %, 15.0 %, 93.4 %, 92.7 %, y 89.3 %.

La fibroína modificada de (2-i) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9.

La fibroína modificada de (2-ii) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9. La fibroína modificada de (2-ii) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

Se prefiere que la fibroína modificada de (2-ii) tenga una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9, y z/w es 50.9 % o mayor en un caso donde el número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en XGX (donde X representa un residuo de aminoácidos diferente de glicina) incluido en REP se define como z, y el número total de residuos de aminoácidos de REP en la secuencia de dominio se define como w.

La segunda fibroína modificada puede incluir una secuencia de etiqueta en cualquiera o en ambos del terminal N y el terminal C. Esto permite aislar, inmovilizar, detectar y visualizar la fibroína modificada.

La secuencia de etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta de afinidad que utiliza afinidad específica (propiedad de unión, afinidad) con otra molécula. Un ejemplo específico de la etiqueta de afinidad incluye una etiqueta deHistidina (etiquetaHis). La etiquetaHises un péptido corto en el que están dispuestos aproximadamente de 4 a 10 residuos deHistidina, y tiene una propiedad de unirse específicamente a un ion metálico tal como el níquel, y por lo tanto se puede utilizar para el aislamiento de la fibroína modificada mediante cromatografía de metales quelantes. Un ejemplo específico de la secuencia de etiqueta puede ser, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12 (secuencia de aminoácidos que incluye una etiquetaHisy una secuencia bisagra)

Además, también se puede utilizar una secuencia de etiqueta tal como la glutatión-S transferasa (GST) que se une específicamente al glutatión, y una proteína de unión a maltosa (MBP) que se une específicamente a la maltosa.

Además, también se puede utilizar una “etiqueta de epítopo” que utiliza una reacción de anticuerpo antígeno. La adición de un péptido (epítopo) que exhibe antigenicidad como una secuencia de etiqueta permite que se una un anticuerpo contra el epítopo. Los ejemplos de la etiqueta de epítopo incluyen una etiqueta HA (secuencia de péptidos de hemaglutinina del virus de la influenza), una etiqueta myc y una etiqueta FLAG. La fibroína modificada se puede purificar fácilmente con alta especificidad utilizando una etiqueta de epítopo.

Más aún, es posible utilizar una secuencia de etiqueta que se puede escindir con una proteasa específica. La fibroína modificada escindida de la secuencia de etiqueta se puede recuperar al tratar una proteína adsorbida a través de la secuencia de etiqueta con proteasa.

Ejemplos más específicos de la segunda fibroína modificada que incluye una secuencia de etiqueta incluyen fibroínas modificadas que incluyen (2-iii) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15, o (2-iv) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15.

Las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, y SEQ ID NO: 15 son una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12 (que incluye una secuencia de etiquetaHisy una secuencia bisagra) al terminal N de cada una de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 9.

La fibroína modificada de (2-iii) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15.

La fibroína modificada de (2-iv) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15. La fibroína modificada de (2-iv) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n- REP]m. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

Se prefiere que la fibroína modificada de (2-iv) tenga una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15, y z/w es 50.9 % o mayor en un caso donde el número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en XGX (donde X representa un residuo de aminoácidos diferente de glicina) contenido en REP se define como z, y el número total de residuos de aminoácidos de REP en la secuencia de dominio se define como w.

La segunda fibroína modificada puede incluir una señal secretora para liberar la proteína producida en el sistema de producción de proteína recombinante al exterior de un huésped. La secuencia de la señal secretora se puede establecer de manera apropiada dependiendo del tipo de huésped.

La fibroína modificada que tiene un contenido reducido de motivo (A)n(tercera fibroína modificada) tiene una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un contenido reducido de motivo (A)n, en comparación con la fibroína de araña de origen natural. La secuencia de dominio de la tercera fibroína modificada puede tener una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que al menos se suprimen uno o una pluralidad de motivos (A)n, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

La tercera fibroína modificada puede tener una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que se suprime 10 a 40 % del motivo (A)nde la fibroína de araña de origen natural. La tercera fibroína modificada puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que al menos se suprime un motivo (A)ncada uno a tres motivos (A)ndesde el lado de terminal N al lado de terminal C, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

La tercera fibroína modificada puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que al menos se repiten dos supresiones del motivo (A)ny una supresión del motivo (A)nen este orden desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

La tercera fibroína modificada puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que al menos se suprime el motivo (A)ncada otras dos posiciones desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C.

La tercera fibroína modificada tiene una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, y puede tener una secuencia de aminoácidos en la que x/y es 20 % o mayor, 30 % o mayor, 40 % o mayor, o 50 % o mayor en un caso donde el número de residuos de aminoácidos en las REP de dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes se compara secuencialmente desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C, y el número de residuos de aminoácidos en REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1, el valor máximo del valor total del número de residuos de aminoácidos en las dos unidades [motivo (A)n-REP] donde la relación del número de residuos de aminoácidos en la otra REP es 1.8 a 11.3 se define como x, y el número total de residuos de aminoácidos de la secuencia de dominio se define como y. El número de residuos de alanina relativo al número total de residuos de aminoácidos en el motivo (A)npuede ser 83 % o mayor, preferiblemente 86 % o mayor, más preferiblemente 90 % o mayor, aún más preferiblemente 95 % o mayor, e incluso aún más preferiblemente 100 % (lo que significa que el motivo (A)nconsiste solo en residuos de alanina).

Se describirá un método para calcular x/y en más detalle con referencia a la Fig. 1. La Fig. 1 muestra una secuencia de dominio que excluye la secuencia de terminal N y la secuencia de terminal C de la fibroína de araña. La secuencia de dominio tiene una secuencia de motivo (A)n-primera REP (50 residuos de aminoácidos)-motivo (A)n-segunda REP (100 residuos de aminoácidos)-motivo (A)n-tercera REP (10 residuos de aminoácidos)- motivo (A)n-cuarta REP (20 residuos de aminoácidos)-motivo (A)n-quinta REP (30 residuos de aminoácidos)-motivo (A)ndesde el lado de terminal N (lado izquierdo).

Las dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes se seleccionan secuencialmente desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C para no superponerse. En este momento, puede existir una unidad [motivo (A)n-REP] no seleccionada. La Fig. 1 muestra un patrón 1 (una comparación entre la primera REP y la segunda REP, y una comparación entre la tercera REP y la cuarta REP), un patrón 2 (una comparación entre la primera REP y la segunda REP, y una comparación entre la cuarta REP y la quinta REP), un patrón 3 (una comparación entre la segunda REP y la tercera REP, y una comparación entre la cuarta REP y la quinta REP), y un patrón 4 (una comparación entre la primera REP y la segunda REP). Existen otros métodos de selección además de éste.

Posteriormente, el número de residuos de aminoácidos de cada REP en las dos unidades [motivo (A)n-REP] seleccionadas adyacentes se compara para cada patrón. La comparación se realiza al determinar la relación del número de residuos de aminoácidos de la otra REP en un caso donde una REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1. Por ejemplo, en el caso de comparar la primera REP (50 residuos de aminoácidos) y la segunda REP (100 residuos de aminoácidos), la relación del número de residuos de aminoácidos de la segunda REP es 100/50 = 2 en un caso donde la primera REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1. Del mismo modo, en el caso de comparar la cuarta REP (20 residuos de aminoácidos) y la quinta REP (30 residuos de aminoácidos), la relación del número de residuos de aminoácidos de la quinta REP es 30/20 = 1.5 en un caso donde la cuarta REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1.

En la Fig. 1, un conjunto de unidades [motivo (A)n-REP] en las que la relación del número de residuos de aminoácidos de la otra REP es 1.8 a 11.3 en un caso donde una REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1 se indica por una línea continua. De aquí en adelante, dicha relación se denomina como una relación de Giza. Un conjunto de unidades [motivo (A)n-REP] en las que la relación del número de residuos de aminoácidos de la otra REP es menor que 1.8 o mayor que 11.3 en un caso donde una REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1 se indica por una línea discontinua.

En cada patrón, se combina el número de todos los residuos de aminoácidos de dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes indicadas mediante líneas continuas (que incluyen no solo el número de residuos de aminoácidos de la REP sino también el número de residuos de aminoácidos del motivo (A)n). A continuación, se comparan los valores totales combinados, y el valor total del patrón cuyo valor total es el máximo (el valor máximo del valor total) se define como x. En el ejemplo mostrado en la Fig.1, el valor total del patrón 1 es el máximo.

A continuación, x/y (%) se puede calcular al dividir x por el número total de residuos de aminoácidos y de la secuencia de dominio.

En la tercera fibroína modificada, x/y es preferiblemente 50 % o mayor, más preferiblemente 60 % o mayor, aún más preferiblemente 65 % o mayor, incluso aún más preferiblemente 70 % o mayor, aun preferiblemente adicionalmente 75 % o mayor, y particular y preferiblemente 80 % o mayor. El límite superior de x/y no se limita particularmente, sino que puede ser 100 % o menor, por ejemplo. En un caso donde la relación de Giza es 1 : 1.9 a 11.3, x/y es preferiblemente 89.6 % o mayor; en un caso donde la relación de Giza es 1 : 1.8 a 3.4, x/y es preferiblemente 77.1 % o mayor; en un caso donde la relación de Giza es 1 : 1.9 a 8.4, x/y es preferiblemente 75.9 % o mayor; y en un caso donde la relación de Giza es 1 : 1.9 a 4.1, x/y es preferiblemente 64.2 % o mayor. En un caso donde la tercera fibroína modificada es una fibroína modificada en la que al menos siete de una pluralidad de motivos (A)nen la secuencia de dominio consiste en solo residuos de alanina, x/y es preferiblemente 46.4 % o mayor, más preferiblemente 50 % o mayor, aún más preferiblemente 55 % o mayor, incluso aún más preferiblemente 60 % o mayor, aun preferiblemente adicionalmente 70 % o mayor, y particular y preferiblemente 80 % o mayor. El límite superior de x/y no se limita particularmente, sino que solo se requiere que sea 100 % o menor.

La tercera fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al suprimir una o una pluralidad de secuencias que codifican el motivo (A)nde la secuencia de genes de la fibroína de araña de origen natural clonada de tal manera que x/y es 64.2 % o mayor. Alternativamente, la tercera fibroína modificada también se puede obtener, por ejemplo, al designar una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que uno o una pluralidad de motivos (A)nse suprimen de la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural de tal manera que x/y es 64.2 % o mayor, y sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos diseñada. En cualquier caso, además de la modificación que corresponde a supresión del motivo (A)nde la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, además de puede realizar la modificación de la secuencia de aminoácidos que corresponde a la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos.

Ejemplos más específicos de la tercera fibroína modificada incluyen las fibroínas modificadas que incluyen (3-i) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9, o (3-ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9. Se describirá la fibroína modificada de (3-i). La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18 es una secuencia de aminoácidos obtenida al suprimir el motivo (A)ncada otras dos posiciones desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C desde la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10 que corresponde a la fibroína de araña de origen natural, y además insertar un [motivo (A)n-REP] antes de la secuencia de terminal C. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los GGX en REP de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18 con GQX. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos obtenida al insertar dos residuos de alanina en el lado de terminal C de cada motivo (A)nde la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7, y además sustituir una parte de residuos de glutamina (Q) con un residuo de serina (S), y suprimir una parte de aminoácidos en el lado de terminal N de tal manera que el peso molecular del mismo es aproximadamente el mismo como el de la SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar una etiquetaHisal terminal C de la secuencia que tiene cuatro regiones de repetición de 20 secuencias de dominio que existen en el residuo de aminoácidos establecido en la SEQ ID NO: 11 (donde se sustituyen varios residuos de aminoácidos en el lado de terminal C de la región).

El valor de x/y en la relación de Giza de 1 : 1.8 a 11.3 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10 (que corresponde a la fibroína de araña de origen natural) es 15.0 %. Los valores de x/y de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18 y la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 son ambos 93.4 %. El valor de x/y de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8 es 92.7 %. El valor de x/y de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 es 89.3 %. Los valores de z/w de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 9 son respectivamente 46.8 %, 56.2 %, 70.1 %, 66.1 %, y 70.0 %. La fibroína modificada de (3-i) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9.

La fibroína modificada de (3-ii) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9. La fibroína modificada de (3-ii) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

Se prefiere que la fibroína modificada de (3-ii) tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9, y x/y es 64.2 % o mayor en un caso donde el número de residuos de aminoácidos en las REP de dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes se compara secuencialmente desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C, y el número de residuos de aminoácidos en REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1, el valor máximo del valor total del número de residuos de aminoácidos en las dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes donde la relación del número de residuos de aminoácidos en la otra REP es 1.8 a 11.3 (la relación de Giza es 1 : 1.8 a 11.3) se define como x, y el número total de residuos de aminoácidos de la secuencia de dominio se define como y.

La tercera fibroína modificada puede incluir la secuencia de etiqueta descrita anteriormente en cualquiera o ambos del terminal N y el terminal C.

Ejemplos más específicos de la tercera fibroína modificada que incluye una secuencia de etiqueta incluyen fibroínas modificadas que incluyen (3-iii) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15, o (3-iv) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15.

La fibroína modificada de (3-iii) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15.

La fibroína modificada de (3-iv) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15. La fibroína modificada de (3-iv) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n- REP]m. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

Se prefiere que la fibroína modificada de (3-iv) tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15, y x/y es 64.2 % o mayor en un caso donde el número de residuos de aminoácidos en las REP de dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes se compara secuencialmente desde el lado de terminal N hasta el lado de terminal C, y el número de residuos de aminoácidos en REP que tiene un número menor de residuos de aminoácidos se define como 1, el valor máximo del valor total del número de residuos de aminoácidos en las dos unidades [motivo (A)n-REP] adyacentes donde la relación del número de residuos de aminoácidos en la otra REP es 1.8 a 11.3 se define como x, y el número total de residuos de aminoácidos de la secuencia de dominio se define como y.

La tercera fibroína modificada puede incluir una señal secretora para liberar la proteína producida en el sistema de producción de proteína recombinante al exterior de un huésped. La secuencia de la señal secretora se puede establecer apropiadamente dependiendo del tipo de huésped.

La fibroína modificada que tiene un contenido reducido de residuo de glicina y un contenido reducido de motivo (A)n(cuarta fibroína modificada) tiene una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un contenido reducido de residuo de glicina, además de tener un contenido reducido de motivo (A)n, en comparación con la fibroína de araña de origen natural. La cuarta fibroína modificada puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que, además de la supresión de al menos uno o una pluralidad de motivos (A)n, al menos uno o una pluralidad de residuos de glicina en REP se sustituyen con otro residuo de aminoácidos, en comparación con la fibroína de araña de origen natural. Es decir, la cuarta fibroína modificada es una fibroína modificada que tiene la característica de tanto la fibroína modificada que tiene un contenido reducido de residuo de glicina (segunda fibroína modificada) como la fibroína modificada que tiene un contenido reducido de motivo (A)n(tercera fibroína modificada) descrito anteriormente. Realizaciones específicas de los mismos, y similares son como en las descripciones para la segunda fibroína modificada y la tercera fibroína modificada.

Ejemplos más específicos de la cuarta fibroína modificada incluyen fibroínas modificadas que incluyen (4-i) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, o SEQ ID NO: 57, o (4-ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, o SEQ ID NO: 57. Realizaciones específicas de la fibroína modificada que incluyen la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, o SEQ ID NO: 57 son como se describió anteriormente.

La fibroína modificada que incluye una secuencia de dominio que tiene una región con un índice de hidropatía localmente alto (quinta fibroína modificada) puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una región con un índice de hidropatía localmente alto, que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos en REP se sustituyen con un residuo de aminoácidos con un alto índice de hidropatía y/o uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos con un alto índice de hidropatía se insertan en REP, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

La región con índice de hidropatía localmente alto preferiblemente consiste en dos a cuatro residuos de aminoácidos consecutivos.

El residuo de aminoácidos descrito anteriormente con un alto índice de hidropatía es más preferiblemente un residuo de aminoácidos seleccionado de isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), y alanina (A).

En la quinta fibroína modificada, además de las modificaciones que corresponden a la sustitución de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos en REP con un residuo de aminoácidos con un alto índice de hidropatía y/o la inserción de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos con un alto índice de hidropatía en REP, en comparación con la fibroína de araña de origen natural, puede haber más modificaciones de una secuencia de aminoácidos que corresponde a la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

La quinta fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al sustituir uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófilos en REP (por ejemplo, residuos de aminoácidos que tienen un índice de hidropatía negativo) con un residuo de aminoácidos hidrófobo (por ejemplo, un residuo de aminoácidos que tiene un índice de hidropatía positivo), y/o insertar uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófobos en REP, de la secuencia de genes de la fibroína de araña de origen natural clonada. Alternativamente, la quinta fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al diseñar una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófilos en REP se sustituyen con un residuo de aminoácidos hidrófobo y/o uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófobos se insertan en REP, desde la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, y sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos diseñada. En cualquier caso, además de las modificaciones que corresponden a la sustitución de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófilos en REP con un residuo de aminoácidos hidrófobo, y/o la inserción de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófobos en REP, desde la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, se puede realizar además la modificación de la secuencia de aminoácidos que corresponde a la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos.

La quinta fibroína modificada incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, y puede tener una secuencia de aminoácidos en la que p/q es 6.2 % o mayor en un caso donde en todas las REP incluidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio, el número total de residuos de aminoácidos incluidos en una región donde el valor promedio de índices de hidropatía de cuatro residuos de aminoácidos consecutivos es 2.6 o mayor se define como p, y el número total de residuos de aminoácidos incluidos en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio se define como q.

Para el índice de hidropatía del residuo de aminoácidos, se utiliza un índice conocido públicamente (Índice de hidropatía: Kyte J, & Doolittle R (1982)“ A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp.105-132). Específicamente, el índice de hidropatía (de aquí en adelante, también denominado como “HI”) de cada aminoácido es como se muestra en la Tabla 1 a continuación.

[Tabla 1]

Se describirá en más detalle el método de cálculo de p/q. En el cálculo, se utiliza una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio representada por la Fórmula 1 [motivo (A)n-REP]m(de aquí en adelante también denominada como la “secuencia A”). En primer lugar, en todas las REP incluidas en la secuencia A, se calculan los valores promedio de los índices de hidropatía de cuatro residuos de aminoácidos consecutivos. El valor promedio de los índices de hidropatía se determina al dividir la suma total deHisde los residuos de aminoácidos respectivos incluidos en los cuatro residuos de aminoácidos consecutivos por 4 (número de residuos de aminoácidos). El valor promedio de los índices de hidropatía se determina par todos los cuatro residuos de aminoácidos consecutivos (cada uno de los residuos de aminoácidos se utiliza para calcular el valor promedio 1 a 4 veces). A continuación, se especifica una región donde el valor promedio de los índices de hidropatía de los cuatro residuos de aminoácidos consecutivos es 2.6 o mayor. Incluso en un caso donde un cierto residuo de aminoácidos corresponde a los “cuatro residuos de aminoácidos consecutivos que tienen un valor promedio de los índices de hidropatía de 2.6 o mayor” múltiples veces, el residuo de aminoácidos se incluye como un residuo de aminoácidos en la región. El número total de residuos de aminoácidos incluidos en la región es p. También, el número total de residuos de aminoácidos incluidos en la secuencia A es q.

Por ejemplo, en un caso donde los “cuatro residuos de aminoácidos consecutivos que tienen un valor promedio de los índices de hidropatía de 2.6 o mayor” se extraen de 20 lugares (sin superposición), en la región donde el valor promedio de los índices de hidropatía de cuatro residuos de aminoácidos consecutivos es 2.6 o mayor, se incluyen 20 de los cuatro residuos de aminoácidos consecutivos (sin superposición), y por lo tanto p es 20 x 4 = 80. Además, por ejemplo, en un caso donde dos de los “cuatro residuos de aminoácidos consecutivos que tienen un valor promedio de los índices de hidropatía de 2.6 o mayor” se superponen en un residuo de aminoácidos, en la región donde el valor promedio de los índices de hidropatía de los cuatro residuos de aminoácidos consecutivos es 2.6 o mayor, se incluyen siete residuos de aminoácidos (p = 2 x 4 - 1 = 7. “-1” es la deducción de superposición). Por ejemplo, en un caso de la secuencia de dominio mostrada en la Fig.2, existen siete “cuatro residuos de aminoácidos consecutivos que tienen un valor promedio de los índices de hidropatía de 2.6 o mayor” sin superposición, y por lo tanto p es 7 x 4 = 28. Por ejemplo, en un caso de la secuencia de dominio mostrada en la Fig.2, q es 4 50 4 40 4 10 4 20 4 30 = 170 (que no incluye el motivo (A)nubicado en el extremo del lado de terminal C). A continuación, p/q (%) se puede calcular al dividir p por q. En un caso de la Fig.2, p/q es 28/170 = 16.47 %.

En la quinta fibroína modificada, p/q es preferiblemente 6.2 % o mayor, más preferiblemente 7 % o mayor, aún más preferiblemente 10 % o mayor, incluso aún más preferiblemente 20 % o mayor, y aun preferiblemente adicionalmente 30 % o mayor. El límite superior de p/q no se limita particularmente, sino que, por ejemplo puede ser 45 % o menor.

La quinta fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al sustituir uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófilos en REP (por ejemplo, residuos de aminoácidos que tienen un índice de hidropatía negativo) con un residuo de aminoácidos hidrófobo (por ejemplo, un residuo de aminoácidos que tiene un índice de hidropatía positivo), y/o insertar uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos hidrófobos en REP, para satisfacer la condición de la p/q anterior, modificando de esta manera la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural clonada en una secuencia de aminoácidos que incluye una región con un índice de hidropatía localmente alto. Alternativamente, la quinta fibroína modificada también se puede obtener, por ejemplo, al diseñar una secuencia de aminoácidos que satisface la condición de la p/q anterior de la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, y sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos diseñada. En cualquier caso, además de las modificaciones que corresponden a la sustitución de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos en REP con un residuo de aminoácidos con un alto índice de hidropatía, y/o la inserción de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos con un alto índice de hidropatía en REP, en comparación con la fibroína de araña de origen natural, se puede realizar además la modificación que corresponde a la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos.

El residuo de aminoácidos con un alto índice de hidropatía no se limita particularmente, sino que es preferiblemente isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), y alanina (A), y más preferiblemente valina (V), leucina (L), e isoleucina (I).

Ejemplos más específicos de la quinta fibroína modificada incluyen fibroínas modificadas que incluyen (5-i) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 21, o (5-ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 21.

Se describirá la fibroína modificada de (5-i). La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 22 es una secuencia de aminoácidos obtenida al suprimir los residuos de alanina en el motivo (A)nde la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural de tal manera que el número de los residuos de alanina consecutivos es cinco. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19 es una secuencia de aminoácidos obtenida al insertar una secuencia de aminoácidos que consiste en tres residuos de aminoácidos (VLI) en dos sitios para cada REP en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 22, y suprimir una parte de aminoácidos en el lado de terminal C de tal manera que el peso molecular del mismo es aproximadamente el mismo como el de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 22. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 23 es una secuencia de aminoácidos obtenida al insertar dos residuos de alanina en el lado de terminal C de cada motivo (A)nde la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 22, además sustituir una parte de residuos de glutamina (Q) con un residuo de serina (S), y suprimir una parte de aminoácidos en el lado de terminal C de tal manera que el peso molecular del mismo es aproximadamente el mismo como el de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 22. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 20 es una secuencia de aminoácidos obtenida al insertar una secuencia de aminoácidos que consiste en tres residuos de aminoácidos (VLI) en un sitio para cada REP en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 23. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 21 es una secuencia de aminoácidos obtenida al insertar una secuencia de aminoácidos que consiste en tres residuos de aminoácidos (VLI) en dos sitios para cada REP en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 23.

La fibroína modificada de (5-i) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 21.

La fibroína modificada de (5-ii) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 21. La fibroína modificada de (5-ii) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor. Se prefiere que la fibroína modificada de (5-ii) tenga una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 21, y p/q es 6.2 % o mayor en un caso donde en todas las REP incluidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio, el número total de residuos de aminoácidos incluidos en una región donde el valor promedio de índices de hidropatía de cuatro residuos de aminoácidos consecutivos es 2.6 o mayor se define como p, y el número total de residuos de aminoácidos incluidos en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio se define como q.

La quinta fibroína modificada puede incluir una secuencia de etiqueta en cualquiera o ambos del terminal N y el terminal C.

Ejemplos más específicos de la quinta fibroína modificada que incluye una secuencia de etiqueta incluyen fibroínas modificadas que incluyen (5-iii) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26, o (5-iv) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26.

Las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26 son una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12 (que incluye una secuencia de etiquetaHisy una secuencia bisagra) al terminal N de cada una de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, y SEQ ID NO: 21.

La fibroína modificada de (5-iii) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26.

La fibroína modificada de (5-iv) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26. La fibroína modificada de (5-iv) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor. Se prefiere que la fibroína modificada de (5-iv) tenga una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26, y p/q es 6.2 % o mayor en un caso donde en todas las REP incluidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio, el número total de residuos de aminoácidos incluidos en una región donde el valor promedio de índices de hidropatía de cuatro residuos de aminoácidos consecutivos es 2.6 o mayor se define como p, y el número total de residuos de aminoácidos incluidos en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicado en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio se define como q.

La quinta fibroína modificada puede incluir una señal secretora para liberar la proteína producida en el sistema de producción de proteína recombinante al exterior de un huésped. La secuencia de la señal secretora se puede establecer apropiadamente dependiendo del tipo de huésped.

La fibroína modificada, que tiene una secuencia de dominio que tiene un contenido reducido de residuo de glutamina (sexta fibroína modificada), tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un contenido reducido de residuo de glutamina, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

En la sexta fibroína modificada, al menos un motivo seleccionado de un motivo GGX y un motivo GPGXX preferiblemente se incluye en la secuencia de aminoácidos de REP.

En un caso donde la sexta fibroína modificada incluye el motivo GPGXX en REP, el contenido de motivo GPGXX es usualmente 1 % o mayor, también puede ser 5 % o mayor, y preferiblemente 10 % o mayor. El límite superior del contenido de motivo GPGXX no se limita particularmente, y puede ser 50 % o menor, o también puede ser 30 % o menor.

En la presente especificación, el “contenido de motivo GPGXX” es un valor calculado por el siguiente método. El contenido de motivo GPGXX se calcula como s/t en un caso donde en todas las REP incluidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio en la fibroína de araña que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m- motivo (A)n, un número tres veces el número total de motivos GPGXX incluidos en esta región se define como s (es decir, un número que corresponde al número total de G y P en la motivo GPGXX), y el número total de residuos de aminoácidos en todas las REP que excluyen la secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio y que excluye además los motivos (A)nse define como t.

En el cálculo del contenido de motivo GPGXX, se utiliza la “secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio” como un objetivo. En “la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio” (la secuencia que corresponde a REP), una secuencia que tiene baja correlación con una característica de secuencia de fibroína de araña se incluye en alguno, y en un caso donde m es pequeño (es decir, la secuencia de dominio es corta), dicha secuencia afecta el resultado del cálculo del contenido del motivo GPGXX. La razón para dirigir la secuencia es eliminar esta influencia. Por cierto, en un caso donde el “motivo GPGXX” se ubica en el terminal C de REP, incluso cuando “XX” es “AA”, por ejemplo, se trata como el “motivo GPGXX”.

La Fig. 3 es una vista esquemática que ilustra la secuencia de dominio de fibroína de araña. El método de cálculo del contenido de motivo GPGXX se describirá específicamente con referencia a la Fig. 3. En primer lugar, en la secuencia de dominio de la fibroína de araña mostrada en la Fig.3 (tipo “[motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n”), todas las REP se incluyen en la “secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio” (la secuencia indicada por la “región A” en la Fig.3). Por lo tanto, el número de motivos GPGXX para calcular s es 7, y s es 7 x 3 = 21. Del mismo modo, todas las REP se incluyen en la secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio” (la secuencia indicada por “la región A” en la Fig.3). Por lo tanto, el número total t de residuos de aminoácidos en todas las REP que excluye además los motivos (A)ndesde la secuencia es 50 40 10 20 30 = 150. A continuación, s/t (%) se puede calcular al dividir s por t, y en un caso de la fibroína en la Fig.3, s/t es 21/150 = 14.0 %.

En la sexta fibroína modificada, el contenido de residuo de glutamina es preferiblemente 9 % o menor, más preferiblemente 7 % o menor, aún más preferiblemente 4 % o menor, y particular y preferiblemente 0 %. En la presente especificación, “el contenido de residuo de glutamina” es un valor calculado por el siguiente método.

El contenido de residuo de glutamina se calcula como u/t en un caso donde en todas las REP incluidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio (la secuencia corresponde a “la región A” en la Fig.3) en la fibroína de araña que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, el número total de residuos de glutamina incluido en esta región se define como u, y el número total de residuos de aminoácidos en todas las REP que excluyen la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio y que excluyen además los motivos (A)nse define como t. En el cálculo del contenido de residuo de glutamina, la razón para dirigir “la secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio” es la misma razón que la descrita anteriormente.

La sexta fibroína modificada puede tener una secuencia de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que se suprimen uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP, o se sustituyen con otro residuo de aminoácidos, en comparación con la fibroína de araña de origen natural.

El “otro residuo de aminoácidos” puede ser un residuo de aminoácidos diferente del residuo de glutamina, pero es preferiblemente un residuo de aminoácidos con un índice de hidropatía más alto que el del residuo de glutamina. El índice de hidropatía del residuo de aminoácidos es como se muestra en la Tabla 1.

Como se muestra en la Tabla 1, ejemplos del residuo de aminoácidos con un índice de hidropatía más alto que el del residuo de glutamina incluyen residuos de aminoácidos seleccionados de isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S), triptófano (W), tirosina (Y), prolina (P), eHistidina (H). Entre estos, el residuo de aminoácidos es más preferiblemente un residuo de aminoácidos seleccionado de isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), y alanina (A), y aún más preferiblemente un residuo de aminoácidos seleccionado de isoleucina (I), valina (V), leucina (L), y fenilalanina (F).

En la sexta fibroína modificada, la hidrofobicidad de REP es preferiblemente -0.8 o mayor, más preferiblemente -0.7 o mayor, aún más preferiblemente 0 o mayor, incluso aún más preferiblemente 0.3 o mayor, y particular y preferiblemente 0.4 o mayor. El límite superior de REP no se limita particularmente, y puede ser 1.0 o menor, o también puede ser 0.7 o menor.

En la presente especificación, “la hidrofobicidad de REP” es un valor calculado por el siguiente método. La hidrofobicidad de REP se calcula como v/t en un caso donde en todas las REP incluidas en una secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio (la secuencia que corresponde a la “región A” en la Fig.3) en la fibroína de araña que incluye la secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, la suma total de los índices de hidropatía de cada uno de los residuos de aminoácidos en esta región se define como v, y el número total de residuos de aminoácidos en todas las REP que excluyen la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio y que excluyen además los motivos (A)nse define como t. En el cálculo de la hidrofobicidad de REP, la razón para dirigir “la secuencia que excluye la secuencia del motivo (A)nubicada en el lado más de terminal C al terminal C de la secuencia de dominio desde la secuencia de dominio” es la misma razón que la descrita anteriormente.

En la secuencia de dominio de la sexta fibroína modificada, además de las modificaciones que corresponden a la supresión de uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP y/o la sustitución de uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP con otro residuo de aminoácidos, según se compara con la fibroína de araña de origen natural, puede tener modificación adicional de la secuencia de aminoácidos que corresponde a la sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos.

La sexta fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al suprimir uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP y/o sustituir uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP con otro residuo de aminoácidos, de la secuencia de genes de la fibroína de araña de origen natural clonada. Alternativamente, la sexta fibroína modificada se puede obtener, por ejemplo, al diseñar una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos en la que se suprimen uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP y/o uno o una pluralidad de residuos de glutamina en REP se sustituyen con otro residuo de aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos de la fibroína de araña de origen natural, y sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos diseñada.

Ejemplos más específicos de la sexta fibroína modificada incluyen fibroínas modificadas que incluyen (6-i) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 43, o (6-ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 43.

Se describirá la fibroína modificada de (6-i).

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410) es una secuencia de aminoácidos obtenida al realizar la modificación de aminoácidos para mejorar la productividad, tal como una modificación en la que una secuencia de aminoácidos que tiene residuos de alanina consecutivos en el motivo (A)nse modifica de tal manera que el número de residuos de alanina consecutivos se convierte en cinco, en base a la secuencia base y la secuencia de aminoácidos deNephila clavipes(No. de Acceso de GenBank: P46804.1, GI: 1174415) que es fibroína de origen natural. Mientras tanto, la modificación del residuo de glutamina (Q) no se realiza en Met-PRT410 y, por lo tanto, el contenido de residuo de glutamina de la misma es aproximadamente el mismo que el contenido de residuo de glutamina de la fibroína de origen natural.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27 (M_PRT888) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) con VL.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 28 (M_PRT965) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) con TS, y sustituir el Q restante con A. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 29 (M_PRT889) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) con VL, y sustituir el Q restante con I. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 30 (M_PRT916) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) con VI, y sustituir el Q restante con L. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31 (M_PRT918) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) con VF, y sustituir el Q restante con I. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34 (M_PRT525) es una secuencia de aminoácidos obtenida, con respecto a Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7), al insertar dos residuos de alanina en una región (A5) que tiene residuos de alanina consecutivos, suprimir dos secuencias de dominio en el lado de terminal C de tal manera que el peso molecular del mismo es aproximadamente el mismo como el de Met-PRT410, y sustituir los residuos de glutamina (Q) en 13 sitios con un residuo de serina (S) o un residuo de prolina (P).

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 32 (M_PRT699) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en M_PRT525 (SEQ ID NO: 34) con VL.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 33 (M_PRT698) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en M_PRT525 (SEQ ID NO: 34) con VL, y sustituir el Q restante con I. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43 (Met-PRT966) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQ en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 (se agrega la secuencia de aminoácidos antes de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42 al terminal C de la misma) con VF, y sustituir el Q restante con I.

En todas las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, y SEQ ID NO: 43, el contenido de residuo de glutamina es 9 % o menor (Tabla 2).

[Tabla 2]

La fibroína modificada de (6-i) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 43.

La fibroína modificada de ((6-ii) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 43. La fibroína modificada de (6-ii) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

En la fibroína modificada de (6-ii), el contenido de residuo de glutamina es preferiblemente 9 % o menor. En la fibroína modificada de (6-ii), el contenido de motivo GPGXX es preferiblemente 10 % o mayor.

La sexta fibroína modificada puede incluir una secuencia de etiqueta en cualquiera o ambos del terminal N y el terminal C. Esto permite que la fibroína modificada se aísle, inmovilice, detecte y visualice.

Ejemplos más específicos de la sexta fibroína modificada que incluye una secuencia de etiqueta incluyen fibroínas modificadas que incluyen (6-iii) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56, o (6-iv) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56.

Las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, y SEQ ID NO: 44 son una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12 (que incluye una secuencia de etiquetaHisy una secuencia bisagra) al terminal N de cada una de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, y SEQ ID NO: 43. Dado que estas secuencias de aminoácidos se obtienen solo al agregar una secuencia de etiqueta en el terminal N, no cambia el contenido de residuo de glutamina, y en todas las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, y SEQ ID NO: 44, el contenido de residuo de glutamina es 9 % o menor (Tabla 3).

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55 (PRT1107) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir un residuo de serina (S) de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31 (Met-PRT918) con un residuo de alanina (A), un residuo de valina (V), un residuo de leucina (L), o un residuo de isoleucina (I), y además agregar una secuencia de etiqueta al terminal N de la misma.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56 (PRT1083) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir un residuo de prolina (P) de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31 (Met-PRT918) con un residuo de treonina (T) o un residuo de leucina (L), y agregar además una secuencia de etiqueta al terminal N de la misma.

[Tabla 3]

La fibroína modificada de (6-iii) puede consistir en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56.

La fibroína modificada de (6-iv) incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90 % o mayor con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56. La fibroína modificada de (6-iv) también es una proteína que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]mo la Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. La identidad de secuencia es preferiblemente 95 % o mayor.

En la fibroína modificada de (6-iv), el contenido de residuo de glutamina es preferiblemente 9 % o menor. En la fibroína modificada de (6-iv), el contenido de motivo GPGXX es preferiblemente 10 % o mayor.

La sexta fibroína modificada puede incluir una señal secretora para liberar la proteína producida en el sistema de producción de proteína recombinante al exterior de un huésped. La secuencia de la señal secretora se puede configurar de manera apropiada dependiendo del tipo de huésped.

La fibroína modificada también puede ser una fibroína modificada que tiene al menos dos o más características entre las características de la primera fibroína modificada, la segunda fibroína modificada, la tercera fibroína modificada, la cuarta fibroína modificada, la quinta fibroína modificada, y la sexta fibroína modificada.

La proteína de seda de araña puede ser una proteína de seda de araña hidrófila o una proteína de seda de araña hidrófoba. La proteína de seda de araña hidrófoba es una proteína de seda de araña en la que un valor (HI promedio) obtenido al determinar la suma total de los índices de hidropatía (HI) de todos los residuos de aminoácidos que constituyen la proteína de seda de araña y luego dividir la suma por el número total de residuos de aminoácidos es mayor que -0.8. La proteína de seda de araña hidrófoba tiene preferiblemente un HI promedio de -0.6 o mayor, más preferiblemente -0.4 o mayor, aún más preferiblemente -0.2 o mayor, y particular y preferiblemente 0 o mayor. El índice de hidropatía es como se muestra en la Tabla 1. La proteína de seda de araña hidrófila es una proteína de seda de araña que tiene un HI promedio anterior de -0.8 o menor. El índice de hidropatía (HI) promedio de la proteína relacionada con la presente realización es preferiblemente -1.3 o mayor, preferiblemente -1.0 o mayor, preferiblemente -0.8 o mayor, preferiblemente mayor que -0.8, preferiblemente -0.7 o mayor, preferiblemente -0.6 o mayor, más preferiblemente -0.5 o mayor, preferiblemente -0.4 o mayor, preferiblemente -0.3 o mayor, preferiblemente -0.2 o mayor, preferiblemente -0.1 o mayor, más preferiblemente 0 o mayor, más preferiblemente 0.1 o mayor, más preferiblemente 0.2 o mayor, aún más preferiblemente 0.3 o mayor, y particular y preferiblemente 0.4 o mayor.

El HI de cada una de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, y SEQ ID NO: 41 es como se muestra en la Tabla 4. En el cálculo del HI de cada secuencia de aminoácidos, el cálculo se realiza excluyendo una secuencia que no tiene relación con la fibroína modificada (es decir, una secuencia que corresponde a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12).

[Tabla 4]

Ejemplos de la proteína de seda de araña hidrófoba incluyen la secuencia de la primera fibroína modificada, la secuencia de la segunda fibroína modificada, la secuencia de la tercera fibroína modificada, la secuencia de la quinta fibroína modificada, y la secuencia de la sexta fibroína modificada. Ejemplos más específicos de la proteína de seda de araña hidrófoba incluyen proteínas de seda de araña que incluyen la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 43, o la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO: 44.

La proteína de seda de araña hidrófila puede ser, por ejemplo, la secuencia de la cuarta fibroína modificada descrita anteriormente. Ejemplos más específicos de la proteína de seda de araña hidrófila incluyen proteínas de seda de araña que incluyen la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 9, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 15, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, o SEQ ID NO: 47.

Se puede utilizar un tipo de la proteína de seda de araña descrita anteriormente solo, o se pueden utilizar dos o más tipos de la misma en combinación.

La proteína de seda de araña se puede producir, por ejemplo, al utilizar un huésped transformado con un vector de expresión que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña y una o una pluralidad de secuencias reguladoras ligadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico para expresar el ácido nucleico.

Un método para producir un ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña no se limita particularmente. El ácido nucleico se puede producir, por ejemplo, mediante un método de realización de clonación a través de la amplificación del gen que codifica la proteína de seda de araña natural mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un método de producción del ácido nucleico mediante síntesis química. El método de síntesis química de ácidos nucleicos no se limita particularmente, y el gen se puede sintetizar químicamente, por ejemplo, en base a la información de la secuencia de aminoácidos de la proteína de seda de araña obtenida de la base de datos web del NCBI, de acuerdo con un método de ligado de oligonucleótidos sintetizados automáticamente por AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare, Japón), y similares, por PCR, por ejemplo. En este momento, para facilitar la purificación y/o confirmación de la proteína de seda de araña, se puede sintetizar un ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se agrega una secuencia de aminoácidos que consiste en un codón de inicio y una etiquetaHis10 al terminal N.

La secuencia reguladora es una secuencia que controla la expresión de una proteína recombinante en un huésped (por ejemplo, un promotor, un potenciador, una secuencia de unión a ribosomas y una secuencia de terminación de la transcripción), y se puede seleccionar apropiadamente dependiendo del tipo de huésped. Como promotor, se puede utilizar un promotor inducible que funciona en una célula huésped y puede inducir la expresión de una proteína de seda de araña deseada. El promotor inducible es un promotor que puede controlar la transcripción mediante la presencia de un inductor (inductor de expresión), la ausencia de una molécula represora o factores físicos tales como el aumento o la disminución de la temperatura, presión osmótica, valor del pH o similares.

El tipo de vector de expresión, tal como un vector plasmídico, un vector viral, un vector cósmido, un vector fósmido o un vector cromosómico artificial, se puede seleccionar de forma apropiada dependiendo del tipo de huésped. Como vector de expresión, se utiliza adecuadamente un vector de expresión que se puede replicar de forma autónoma en una célula huésped o se puede incorporar en un cromosoma de un huésped y que contiene un promotor en una posición capaz de transcribir un ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña.

Se pueden utilizar adecuadamente tanto procariotas como eucariotas, tales como levaduras, hongos filamentosos, células de insectos, células animales y células vegetales como el huésped.

En un caso en el que se utiliza un procariota, tal como una bacteria, como huésped, el vector de expresión es preferiblemente un vector de expresión que se puede replicar de forma autónoma en el procariota, y contiene un promotor, una secuencia de unión a ribosomas, un ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña, y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector de expresión puede contener un gen que controla el promotor.

Los ejemplos del procariota incluyen microorganismos que pertenecen al géneroEscherichia,Brevibacillus,Serratia,Bacillus,Microbacterium, Brevibacterium,Corynebacterium, yPseudomonas. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroEscherichiaincluyenEcherichia coli, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroBrevibacillusincluyenBrevibacillus agri, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroSerratiaincluyenSerratia liquefacience, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroBacillusincluyenBacillus subtilis, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroMicrobacteriumincluyenMicrobacterium ammoniaphilum, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroBrevibacteriumincluyenBrevibacterium divaricatum, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroCorynebacteriumincluyenCorynebacterium ammoniagenes, y similares. Ejemplos del microorganismo que pertenece al géneroPseudomonasincluyenPseudomonas putida, y similares.

En un caso en el que se utiliza un procariota como huésped, los ejemplos de un vector en el que se introduce un ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña incluyen pBTrp2 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH), pGEX (fabricado por Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUBll0 y pNCO2 (JP 2002-238569 A).

Los ejemplos del huésped eucariota incluyen levaduras y hongos filamentosos (moho y similares). Los ejemplos de levadura incluyen levaduras pertenecientes al géneroSaccharomyces,PichiaySchizosaccharomyces. Los ejemplos de hongos filamentosos incluyen hongos pertenecientes al géneroAspergillus,PenicilliumyTrichoderma.

En un caso en el que se utiliza un eucariota como huésped, los ejemplos de un vector en el que se introduce un ácido nucleico que codifica la proteína de seda de araña incluyen YEpl3 (ATCC37115) y YEp24 (ATCC37051). Como método para introducir un vector de expresión en la célula huésped, se puede utilizar cualquier método siempre que introduzca ADN en la célula huésped. Los ejemplos de los mismos incluyen un método que utiliza iones de calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], un método de electroporación, un método de esferoplastos, un método de protoplastos, un método de acetato de litio y un método competente. Como método para expresar un ácido nucleico en un huésped transformado con un vector de expresión, se puede realizar producción secretora, expresión de proteína de fusión y similares, además de la expresión directa, de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, 2nd edition.

La proteína de seda de araña se puede producir, por ejemplo, cultivar un huésped transformado en un medio de cultivo, producir y acumular la proteína de seda de araña en el medio de cultivo y luego recolectar la proteína de seda de araña del medio de cultivo. El método para cultivar un huésped transformado en un medio de cultivo se puede realizar de acuerdo con un método comúnmente utilizado para cultivar un huésped.

En un caso en el que el huésped sea un procariota tal comoEscherichia colio un eucariota tal como una levadura, se puede utilizar cualquiera de un medio natural y un medio sintético como medio de cultivo siempre que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sal inorgánica o similar que pueda ser asimilada por el huésped y permita que el huésped sea cultivado de manera eficiente.

Se puede utilizar como fuente de carbono cualquier fuente de carbono que pueda ser asimilada por el huésped. Ejemplos de las mismas incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa y melaza, almidón e hidrolizados de almidón que los contienen, ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico, y alcoholes tales como etanol y propanol.

Ejemplos de la fuente de nitrógeno que se puede utilizar incluyen sales de amonio de ácidos inorgánicos u orgánicos tales como amoniaco, cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio, otros compuestos que contienen nitrógeno, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, licor de maceración de maíz, hidrolizado de caseína, torta de soja e hidrolizado de torta de soja, varias células bacterianas fermentadas y productos digeridos de los mismos.

Ejemplos de la sal inorgánica que se puede utilizar incluyen fosfato de monopotasio, fosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y carbonato de calcio.

Los procariotas tales comoEscherichia colio los eucariotas tales como la levadura se pueden cultivar, por ejemplo, bajo condiciones aeróbicas tales como un cultivo con agitación o un cultivo sumergido con agitación por aireación. La temperatura de cultivo es, por ejemplo, de 15 a 40 °C. El tiempo de cultivo usualmente es de 16 horas a 7 días. El pH del medio de cultivo durante el cultivo se mantiene preferiblemente entre 3.0 y 9.0. El pH del medio de cultivo se puede ajustar al utilizar un ácido inorgánico, un ácido orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato de calcio, amoníaco o similares.

Más aún, se pueden agregar antibióticos tales como ampicilina y tetraciclina, al medio de cultivo durante el cultivo según sea necesario. En el caso de cultivar un microorganismo transformado con un vector de expresión utilizando un promotor inducible como promotor, se puede agregar un inductor al medio de cultivo según sea necesario. Por ejemplo, en el caso de cultivar un microorganismo transformado con un vector de expresión utilizando un promotor lac, se puede agregar isopropil-β-D-tiogalactopiranósido o similar al medio, y en el caso de cultivar un microorganismo transformado con un vector de expresión utilizando un promotor trp, se puede agregar ácido indol acrílico o similar al medio de cultivo.

La proteína de seda de araña producida por un huésped transformado se puede aislar y purificar mediante un método comúnmente utilizado para el aislamiento y la purificación de proteínas. Por ejemplo, en un caso en el que la proteína de seda de araña se expresa en un estado disuelto en células, las células huésped se recuperan por centrifugación después de completar el cultivo, se suspenden en una solución tampón acuosa y luego se rompen utilizando un ultrasonicador, una prensa francesa, un homogeneizador Manton-Gaulin, un Dyno-Mill o similar para obtener un extracto libre de células. Se puede obtener una preparación purificada a partir del sobrenadante obtenido al centrifugar el extracto libre de células, de acuerdo con un método comúnmente utilizado para el aislamiento y purificación de proteínas, es decir, un método de extracción con solvente, un método de remoción de sales utilizando sulfato de amonio o similar, un método de desalinización, un método de precipitación utilizando un solvente orgánico, un método de cromatografía de intercambio aniónico que utiliza una resina como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa o DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha), un método de cromatografía de intercambio catiónico que utiliza una resina como S-sefarosa FF (fabricada por Pharmacia Corporation), un método de cromatografía hidrófoba que utiliza una resina como butilsefarosa y fenilsefarosa, un método de filtración en gel que utiliza un tamiz molecular, un método de cromatografía de afinidad, un método de cromatoenfoque, un método de electroforesis tal como la foresis de enfoque isoeléctrico y similares, solos o en combinación de los mismos.

Como cromatografía, se utiliza preferiblemente cromatografía en columna utilizando fenil-TOYOPEARL (Tosoh Corporation), DEAE-TOYOPEARL (Tosoh Corporation) y Sephadex G-150 (Pharmacia Biotech Inc.).

En un caso en el que la proteína de seda de araña se expresa con la formación de una materia insoluble en las células, de manera similar, las células huésped se recuperan, se rompen y se centrifugan para recuperar la materia insoluble de la proteína de seda de araña como una fracción precipitada. La materia insoluble recuperada de la proteína de seda de araña se puede solubilizar con un agente desnaturalizante de proteínas. Después de esta operación, se puede obtener una preparación purificada de la proteína de seda de araña mediante el mismo método de aislamiento y purificación como se describió anteriormente.

En un caso en el que la proteína de seda de araña se secreta extracelularmente, la proteína de seda de araña se puede recuperar de un sobrenadante de cultivo. Es decir, el sobrenadante de cultivo se obtiene al tratar un cultivo mediante una técnica tal como la centrifugación, y se puede obtener una preparación purificada a partir del sobrenadante de cultivo utilizando el mismo método de aislamiento y purificación como se describió anteriormente.

Una proteína estructural derivada del colágeno (proteína de colágeno) es, por ejemplo, una proteína estructural que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 3: [REP3]p(en la Fórmula 3, p representa un número entero de 5 a 300, REP3 representa una secuencia de aminoácidos que consiste en Gly-X-Y, X y Y cada uno representa un residuo de aminoácidos opcional diferente de Gly, y una pluralidad de REP3s pueden ser las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos). Específicamente, se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 45. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 45 es una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 46 (secuencia de etiqueta y secuencia bisagra) al terminal N de una secuencia de aminoácidos desde el 301° residuo hasta el 540° residuo que corresponde a las porciones y motivos repetidos de una secuencia parcial de colágeno humano tipo 4 (No. de Acceso de GenBank NCBI: CAA56335.1, GI: 3702452) obtenida de la base de datos NCBI. Como una proteína estructural derivada de colágeno, se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59.

Una proteína estructural derivada de resilina (proteína de resilina) incluye una proteína estructural que incluye una secuencia de dominio representada por la Fórmula 4: [REP4]q(en la Fórmula 4, q representa un número entero de 4 a 300, REP4 representa una secuencia de aminoácidos que consiste en Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro, J representa un residuo de aminoácidos opcional y es particular y preferiblemente un residuo de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en Asp, Ser, y Thr, U representa un residuo de aminoácidos opcional y es particular y preferiblemente un residuo de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en Pro, Ala, Thr, y Ser, y una pluralidad de REP4 puede ser las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos). Específicamente, se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 47. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 47 es una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 46 (secuencia de etiqueta y secuencia bisagra) al terminal N de una secuencia de aminoácidos desde el 19° residuo hasta el 321° residuo, obtenida al sustituir Thr del 87° residuo con Ser y sustituir Asn del 95° residuo con Asp en la secuencia de aminoácidos de resilina (No. de Acceso de GenBank NCBI: NP 611157, Gl: 24654243). Como una proteína estructural derivada de resilina, también se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 60.

Ejemplos de una proteína estructural derivada de proteína de elastina (proteína de elastina) incluyen proteínas estructurales que tienen secuencias de aminoácidos tales como No. de Acceso de GenBank NCBI AAC98395 (humanas), I47076 (de oveja), y NP786966 (de vaca). Específicamente, se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 48. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 48 es una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 46 (secuencia de etiqueta y secuencia bisagra) al terminal N de una secuencia de aminoácidos desde el 121° residuo hasta el 390° residuo de la secuencia de aminoácidos de No. de Acceso de GenBank NCBI AAC98395.

Como una proteína estructural derivada de queratina (proteína de queratina), se puede ejemplificar una queratina tipo I y similares deCapra hircus. Específicamente, se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 49 (secuencia de aminoácidos de No. de Acceso de GenBank NCBI ACY30466). La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 49 es una secuencia de aminoácidos obtenida al agregar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 46 (secuencia de etiqueta y secuencia bisagra) al terminal N de la secuencia de aminoácidos de No. de Acceso de GenBank NCBI ACY30466. Como una proteína estructural derivada de queratina, se puede ejemplificar una proteína estructural que incluye que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58. La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58 tiene una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir leucina o valina con alanina o glicina en una secuencia de aminoácidos que consiste en el 1° al 292° residuos de aminoácidos desde el terminal N de la SEQ ID NO: 49 para obtener una secuencia de aminoácidos, y además sustituir tres residuos de aminoácidos en el 1° a 246° residuos de aminoácidos desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos obtenida e insertar una secuencia de aminoácidos que consiste en GAAAAAG (SEQ ID NO: 62) en la misma.

La proteína de colágeno, la proteína de resilina, la proteína de elastina y la proteína de queratina pueden ser una proteína hidrófila o pueden ser una proteína hidrófoba. La proteína hidrófoba es una proteína en la que un valor (HI promedio) obtenido al determinar la suma total de los índices de hidropatía (HI) de todos los residuos de aminoácidos que constituyen la proteína y luego dividir la suma por el número total de residuos de aminoácidos es mayor que -0.8. La proteína hidrófoba tiene preferiblemente un HI promedio de -0.6 o mayor, más preferiblemente -0.4 o mayor, aún más preferiblemente -0.2 o mayor, y particular y preferiblemente 0 o más. El índice de hidropatía es como se muestra en la Tabla 1. La proteína hidrófila es una proteína que tiene el HI promedio anterior de -0.8 o menor.

La proteína de colágeno hidrófoba, la proteína de resilina hidrófoba, la proteína de elastina hidrófoba y la proteína de queratina hidrófoba incluyen una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 49 descrita anteriormente.

La proteína de colágeno hidrófila, la proteína de resilina hidrófila, la proteína de elastina hidrófila y la proteína de queratina hidrófila incluyen una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 47.

El HI de cada una de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 es como se muestra en la Tabla 4. En el cálculo del HI de cada secuencia de aminoácidos, el cálculo se realizó excluyendo una secuencia que no tiene relación con la proteína de colágeno, proteína de resilina, proteína de elastina y proteína de queratina (es decir, una secuencia que corresponde a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12).

También, la proteína estructural contiene una proteína hidrófoba y un polipéptido que tiende a provocar la autoagregación en un solvente polar, y es preferiblemente una proteína hidrófoba. Un tipo de proteína estructural o proteína estructural derivada de la misma se puede utilizar solo, o se pueden utilizar dos o más tipos de las mismas en combinación. Al combinar dos o más tipos de proteínas estructurales, la hidrofobicidad total se puede ajustar a un valor deseado. La hidrofobicidad se puede calcular por el método descrito anteriormente.

(Solvente orgánico)

Como solvente orgánico de la disolución de hilado de acuerdo con la presente realización, se puede utilizar cualquier solvente orgánico que pueda disolver la proteína artificial. Los ejemplos del solvente orgánico incluyen hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetona (HFA), sulfóxido de dimetilo (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), 1,3-dimetil-2-imidazolidona (DMI), N-metil-2-pirolidona (NMP), acetonitrilo, N-óxido de N-metilmorfolina (NMO) y ácido fórmico. Se puede utilizar un tipo de estos solventes solo, o se pueden mezclar y utilizar dos o más tipos de los mismos. Por ejemplo, el solvente orgánico puede contener al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en ácido fórmico, DMSO y HFIP, puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en ácido fórmico, DMSO y HFIP, o también puede ser ácido fórmico. Estos solventes orgánicos pueden contener agua.

El contenido de proteína en la disolución de hilado de acuerdo con la presente realización es preferiblemente 10 a 40 % en masa, más preferiblemente 10 a 35 % en masa, más preferiblemente 12 a 35 % en masa, más preferiblemente 15 a 35 % en masa, más preferiblemente 15 a 30 % en masa, aún más preferiblemente 20 a 35 % en masa, y particular y preferiblemente 20 a 30 % en masa en base al 100 % en masa de la cantidad total de la disolución de hilado. Cuando el contenido de la proteína estructural es 10 % en masa o mayor, las fibras formadas en el baño de coagulación pueden reducir aún más la influencia de un flujo acompañante que se produce en el baño de coagulación, mejorando de esta manera la productividad. Cuando el contenido de proteína estructural es 40 % en masa o menor, la disolución de hilado se puede descargar de forma aún más estable desde la hilera, mejorando de esta manera la productividad.

(Promotor de disolución) La disolución de hilado de acuerdo con la presente realización puede contener además un promotor de disolución. La inclusión del promotor de disolución facilita la preparación de la disolución de hilado.

El promotor de disolución puede ser una sal inorgánica compuesta por el siguiente ácido de Lewis y base de Lewis. Los ejemplos de la base de Lewis incluyen iones de haluro. Los ejemplos del ácido de Lewis incluyen iones metálicos tales como iones de metales alcalinos y iones de metales alcalinotérreos de haluro. Los ejemplos de la sal inorgánica incluyen haluros de metales alcalinos, y haluros de metales alcalinotérreos. Los ejemplos específicos del haluro de metal alcalino incluyen cloruro de litio y bromuro de litio. Los ejemplos específicos del haluro de metales alcalinos incluyen cloruro de magnesio y cloruro de calcio. Se puede utilizar un tipo de promotor de disolución solo, o se pueden utilizar dos o más tipos de los mismos en combinación. Estas sales inorgánicas se pueden utilizar como promotor de disolución para proteína estructural contra ácido fórmico o DMSO, y el cloruro de litio y el cloruro de calcio son particularmente preferibles. La inclusión del promotor de disolución (las sales inorgánicas mencionadas anteriormente) en la disolución de hilado permite que la proteína estructural se disuelva en una alta concentración en la disolución de hilado. Con esto, se mejora aún más la eficiencia de producción de la fibra de proteína y se puede esperar una mejora en la calidad de la fibra de proteína, una mejora de las propiedades físicas tales como la tensión y similares.

El contenido del promotor de disolución puede ser 0.1 % en masa o mayor, 1 % en masa o mayor, 2 % en masa o mayor, 3 % en masa o mayor, 4 % en masa o mayor, 7 % en masa o mayor, 10 % en masa o mayor, o 15 % en masa o more; o puede ser 20 % en masa o menor, 16 % en masa o menor, 12 % en masa o menor, o 9 % en masa o menor en base a la cantidad total de la disolución de hilado

(Varios aditivos) La disolución de hilado puede contener además varios tipos de aditivos según sea necesario. Los ejemplos del aditivo incluyen un plastificante, un agente nivelador, un agente de reticulación, un agente de nucleación, un antioxidante, un absorbente ultravioleta, un agente colorante, un relleno y una resina sintética. El contenido del aditivo puede ser de 50 partes en masa o menor en base a 100 partes en masa de la cantidad total de proteína en la disolución de hilado.

La viscosidad de la disolución de hilado de acuerdo con la presente realización se puede ajustar apropiadamente dependiendo de la aplicación de la fibra que se va a producir, el método de hilado y similares. La viscosidad a 20 °C puede ser de 60,000 a 130,000 mPa·s, o 65,000 a 125,000 mPa·s, por ejemplo. La viscosidad a 35 °C puede ser, por ejemplo 500 a 35,000 mPa·s, 1,000 a 35,000 mPa·s, 3,000 a 30,000 mPa·s, 500 a 20,000 mPa·s, 500 a 15,000 mPa·s, 1,000 a 15,000 mPa·s, 1,000 a 12,000 mPa·s, 1,500 a 12,000 mPa·s, 1,500 a 10,000 mPa·s, o 1,500 a 8,000 mPa·s. La viscosidad a 40 °C puede ser, por ejemplo 500 a 35,000 mPa·s, 1,000 a 35,000 mPa·s, 5,000 a 35,000 mPa·s, 10,000 a 30,000 mPa·s, 12,000 a 30,000 mPa·s, o 12,000 a 28,000 mPa·s. La viscosidad a 70 °C puede ser, por ejemplo 1,000 a 6,000 mPa·s, o 1,500 a 5,000 mPa·s. La viscosidad de la disolución de hilado se puede medir al utilizar, por ejemplo, un “viscosímetro EMS” (nombre comercial) fabricado por Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd.

La disolución de hilado se puede agitar o sacudir durante un cierto período de tiempo para promover la disolución. En este momento, la disolución de hilado se puede calentar, según sea necesario, a una temperatura a la que la disolución de hilado se pueda disolver, dependiendo de la proteína estructural y el solvente que se vaya a utilizar. La solución de solución se puede calentar, por ejemplo a 30 °C o mayor, 40 °C o mayor, 50 °C o mayor, 60 °C o mayor, 70 °C o mayor, 80 °C o mayor, o 90 °C o mayor. Desde el punto de vista de prevenir la descomposición de la proteína artificial, la temperatura de calentamiento es preferiblemente 40 °C. El límite superior de la temperatura de calentamiento es, por ejemplo, una temperatura igual o menor que el punto de ebullición del solvente.

<Líquido de coagulación>

El líquido de coagulación de acuerdo con la presente realización contiene agua o una solución acuosa de pH 0.25 o mayor y pH 10.00 o menor. Esto permite proporcionar un método para producir una fibra de proteína con un riesgo reducido de explosión, incendio y similares, un coste de producción reducido y una carga medioambiental reducida. La solución acuosa puede ser una solución acuosa de sal, una solución acuosa ácida o una solución mezclada de una solución acuosa de sal y una solución acuosa ácida, puede ser una solución acuosa de sal o una solución mezclada de una solución acuosa de sal y una solución acuosa ácida, o puede ser una solución acuosa de sal. En el presente documento, la solución mezclada de una solución acuosa de sal y una solución acuosa de ácido no se limita a una solución en la que se mezclan una solución acuosa de sal y una solución acuosa de ácido. La solución mezclada incluye una solución en la que se agrega un ácido a una solución acuosa de sal, una solución en la que se agrega una sal a una solución acuosa de ácido y una solución en la que una sal y un ácido se disuelven en agua.

(Solución acuosa de ácido)

Los ejemplos de la solución acuosa de ácido incluyen soluciones acuosas de ácido carboxílico y similares. Los ejemplos específicos del ácido carboxílico incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido cítrico y ácido oxálico. Se puede utilizar un tipo de estos solventes solo, o se pueden mezclar dos o más tipos de los mismos y utilizarlos como una solución acuosa. La solución acuosa de ácido puede ser, por ejemplo, una solución acuosa de ácido cítrico o una solución acuosa de ácido fórmico.

(Solución acuosa de sal)

Los ejemplos de la solución acuosa de sal incluyen una solución acuosa de sal de una sal orgánica o una sal inorgánica, y una solución acuosa mezclada de una sal orgánica y una sal inorgánica.

Los ejemplos de la sal orgánica incluyen carboxilato y similares. Los ejemplos específicos del carboxilato incluyen un formiato, un acetato, un propionato, un citrato y un oxalato. La sal orgánica puede ser, por ejemplo, un formiato, un acetato y un citrato.

Los ejemplos específicos del formiato incluyen formiato de amonio, formiato de potasio, formiato de sodio, formiato de litio, formiato de magnesio y formiato de calcio.

Los ejemplos específicos del acetato incluyen acetato de amonio, acetato de potasio, acetato de sodio, acetato de litio, acetato de magnesio y acetato de calcio.

Ejemplos específicos del propionato incluyen propionato de amonio, propionato de potasio, propionato de sodio, propionato de litio, propionato de magnesio y propionato de calcio.

Ejemplos específicos del citrato incluyen citrato de amonio, citrato de potasio, citrato de sodio, citrato de litio, citrato de magnesio y citrato de calcio. Por ejemplo, el citrato puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en citrato de amonio, citrato de potasio, citrato de sodio, citrato de magnesio y citrato de calcio. El citrato puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en citrato de amonio, citrato de potasio y citrato de sodio. El citrato puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en citrato de potasio y citrato de sodio. El citrato puede ser citrato de sodio.

Ejemplos específicos del oxalato incluyen oxalato de amonio, oxalato de potasio, oxalato de sodio, oxalato de litio, oxalato de magnesio y oxalato de calcio. El carboxilato es más preferiblemente un carboxilato de sodio, y los ejemplos específicos del carboxilato de sodio incluyen formiato de sodio, acetato de sodio, propionato de sodio y oxalato de sodio.

Los ejemplos específicos de la sal inorgánica incluyen una sal normal, una sal ácida y una sal básica.

Ejemplos específicos de la sal normal incluyen un sulfato, un cloruro, un nitrato, una sal de yoduro, un tiocianato y un carbonato.

Ejemplos específicos del sulfato incluyen sulfato de amonio, sulfato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de litio, sulfato de magnesio y sulfato de calcio. Por ejemplo, el sulfato puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio y sulfato de calcio. El sulfato puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en sulfato de amonio y sulfato de sodio. El sulfato puede ser sulfato de sodio.

Ejemplos específicos del cloruro incluyen cloruro de amonio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de litio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio y cloruro de guanidinio. Por ejemplo, el cloruro puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cloruro de amonio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de litio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio y cloruro de guanidinio. El cloruro puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cloruro de amonio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de litio, cloruro de calcio y cloruro de magnesio. El cloruro puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cloruro de potasio, cloruro de sodio y cloruro de calcio. El cloruro puede incluir al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cloruro de sodio y cloruro de calcio. El cloruro puede ser cloruro de sodio.

Los ejemplos específicos del nitrato incluyen nitrato de amonio, nitrato de potasio, nitrato de sodio, nitrato de litio, nitrato de magnesio y nitrato de calcio.

Los ejemplos específicos de la sal de yoduro incluyen yoduro de amonio, yoduro de potasio, yoduro de sodio, yoduro de litio, yoduro de magnesio y yoduro de calcio.

Los ejemplos específicos del tiocianato incluyen tiocianato de amonio, tiocianato de potasio, tiocianato de sodio, tiocianato de litio, tiocianato de magnesio, tiocianato de calcio y tiocianato de guanidina.

Los ejemplos específicos del carbonato incluyen carbonato de amonio, carbonato de potasio, carbonato de sodio, carbonato de litio, carbonato de magnesio y carbonato de calcio.

Los ejemplos específicos de la sal ácida incluyen un hidrógeno sulfato, un hidrógeno fosfato y un bicarbonato. Los ejemplos específicos del hidrógeno sulfato incluyen el hidrógeno sulfato de amonio, hidrógeno sulfato de potasio, hidrógeno sulfato de sodio, hidrógeno sulfato de litio, hidrógeno sulfato de magnesio e hidrógeno sulfato de calcio.

Los ejemplos específicos del fosfato de hidrógeno incluyen dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno fosfato de dipotasio, dihidrógeno fosfato de amonio, dihidrógeno fosfato de amonio, hidrógeno fosfato de diamonio, dihidrógeno fosfato de magnesio, hidrógeno fosfato de dimagnesio, dihidrógeno fosfato de calcio y e hidrógeno fosfato de dicalcio.

Los ejemplos específicos del bicarbonato incluyen el bicarbonato de amonio, bicarbonato de potasio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de litio, bicarbonato de litio, bicarbonato de magnesio y bicarbonato de calcio. Los ejemplos específicos de la sal básica incluyen cloruro de hidróxido de calcio y cloruro de hidróxido de magnesio.

Se puede utilizar un tipo de los ácidos, soluciones acuosas de ácidos, sales y soluciones acuosas de sales anteriores solos, o se pueden mezclar y utilizar dos o más tipos de los mismos.

Ejemplos de la solución acuosa mezclada de sal en la que se mezclan dos o más tipos de sales o soluciones acuosas de sal incluyen una solución acuosa mezclada de las sales orgánicas, una solución acuosa mezclada de las sales inorgánicas y una solución acuosa mezclada de la sal orgánica y la sal inorgánica. El agua salobre y el agua de mar son particularmente preferibles desde el punto de vista de la reducción del coste de producción. Se sabe que el agua salobre y el agua de mar contienen principalmente cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y sulfato de calcio.

Preferiblemente, el líquido de coagulación contiene preferiblemente una solución acuosa de sal y, más preferiblemente, el líquido de coagulación es una solución acuosa de sal. La inclusión de sal puede mejorar aún más la tasa de eliminación de solvente. La sal incluye preferiblemente al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en un carboxilato, un sulfato, un cloruro, un fosfato de hidrógeno y un bicarbonato. La sal incluye más preferiblemente al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en un carboxilato, un sulfato y un cloruro. La sal incluye particular y preferiblemente al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en un sulfato y un cloruro. La inclusión de estas sales puede mejorar aún más la propiedad de formación de fibras y, por lo tanto puede mejorar aún más el alargamiento de la fibra que se va a obtener.

El carboxilato es más preferiblemente carboxilato de sodio. El sulfato es más preferiblemente sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio y sulfato de calcio. El cloruro es más preferiblemente cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de calcio. El bicarbonato es más preferiblemente bicarbonato de sodio. La solución acuosa mezclada es particular y preferiblemente agua salobre y agua de mar. El uso de estas sales y soluciones acuosas mixtas puede reducir aún más el coste de producción, además del efecto de mejorar la propiedad de formación de fibras.

El contenido de la sal puede ser de 0.1 % en masa o mayor, 0.3 % en masa o mayor, 0.5 % en masa o mayor, 0.7 % en masa o mayor, 1 % en masa o mayor, 1.3 % en masa o mayor, 1.5 % en masa o mayor, 1.7 % en masa o mayor, 2 % en masa o mayor, 2.3 % en masa o mayor, 2.5 % en masa o mayor, 2.7 % en masa o mayor, 3 % en masa o mayor, 4 % en masa o mayor, 5 % en masa o mayor, 7 % en masa o mayor, 10 % en masa o mayor, 15 % en masa o mayor, o 20 % en masa o mayor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación. El límite superior del mismo puede ser 25 % en masa o menor, o menor que o igual a la solubilidad. El contenido de la sal puede ser, por ejemplo, 0.3 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 1 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 3 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 8 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 10 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 1 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 3 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 8 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 10 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 15 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, o 16 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación. El contenido de la sal es, por ejemplo, preferiblemente 0.05 mol/l o mayor, puede ser 0.05 mol/l o mayor y 5.5 mol/l o menor, puede ser 0.1 mol/l o mayor y 5.0 mol/l o menor, puede ser 0.1 mol/l o mayor y 4.5 mol/l o menor, o puede ser 0.1 mol/l o mayor y 4.0 mol/l o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación.

El contenido de la sal en el caso de utilizar cloruro de sodio puede ser, por ejemplo, 0.1 mol/l o mayor y 5.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 4.5 mol/l o menor, o 0.1 mol/l o mayor y 4.0 mol/l o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación.

El contenido de la sal en el caso de utilizar cloruro de potasio puede ser, por ejemplo, 0.1 mol/l o mayor y 3.9 mol/l o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación.

El contenido de la sal en el caso de utilizar cloruro de calcio puede ser, por ejemplo, 0.1 mol/l o mayor y 14.3 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 13.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 12.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 11.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 10.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 9.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 8.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 7.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 6.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 5.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 4.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 3.0 mol/l o menor, o 0.1 mol/l o mayor y 2.0 mol/l o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación. El contenido de la sal en el caso de utilizar sulfato de sodio puede ser, por ejemplo, 0.1 mol/l o mayor y 3.4 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 3.0 mol/l o menor, 0.1 mol/l o mayor y 2.5 mol/l o menor, o 0.1 mol/l o mayor y 2.0 mol/l o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación. El contenido puede ser, por ejemplo, 3 % en masa o mayor y 28 % en masa o menor, 3 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 3 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, o 8 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación. El contenido del sulfato de sodio relativo a la cantidad total del líquido de coagulación es preferiblemente 10 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, preferiblemente 11 % en masa o mayor y 19 % en masa o menor, más preferiblemente 11 % en masa o mayor y 18 % en masa o menor, aún más preferiblemente 12 % en masa o mayor y 18 % en masa o menor, y particular y preferiblemente 12 % en masa o mayor y 17 % en masa o menor. Cuando el contenido del sulfato de sodio relativo a la cantidad total del líquido de coagulación es 10 % en masa o mayor, se puede obtener se puede obtener una tasa de coagulación suficiente, lo que permite evitar el aumento de costes debido a la inversión en instalaciones. Cuando el contenido de sulfato de sodio relativo a la cantidad total del líquido de coagulación es del 20 % en masa o menor, se puede evitar la ruptura del hilo que se produce en la interfaz entre la solución de disolución y el hilo coagulado (haz de fibras) causada por la coagulación rápida de la solución de disolución. El contenido de agua relativo a la cantidad total del líquido de coagulación en el caso anterior es preferiblemente del 60 % en masa o mayor y del 80 % en masa o menor, y más preferiblemente del 60 % en masa o mayor y del 70 % en masa o menor desde el punto de vista de mejorar la eficiencia de recuperación del solvente. La concentración de la solución acuosa de sulfato de sodio en un caso de uso de sulfato de sodio es preferiblemente 10 % en masa o mayor y 22 % en masa o menor, preferiblemente 10 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, más preferiblemente 12 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, aún más preferiblemente 14 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, y particular y preferiblemente 16 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor. Cuando la concentración de la solución acuosa de sulfato de sodio es 10 % en masa o mayor, se puede obtener una tasa de coagulación suficiente, permitiendo de esta manera evitar el aumento de costes debido a la inversión en instalaciones. Cuando el contenido de la solución acuosa de sulfato de sodio es 22 % en masa o menor, se puede evitar la ruptura del hilo que ocurre en la interfaz entre la solución de disolución y el hilo coagulado (haz de fibras) causada por la coagulación rápida de la solución de disolución.

El contenido de la sal en el caso de utilizar citrato de sodio puede ser, por ejemplo, 0.1 mol/l o mayor y 1.6 mol/l o menor, o 0.1 mol/l o mayor y 1.3 mol/l o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación.

La solución acuosa contenida en el líquido de coagulación de la presente realización se puede seleccionar del grupo que consiste en, por ejemplo, una solución acuosa de ácido carboxílico, una solución acuosa de bicarbonato, una solución acuosa de formiato, una solución acuosa de acetato, una solución acuosa de cloruro, una solución acuosa de sulfato, una solución acuosa de fosfato de hidrógeno, una solución acuosa de citrato, agua salobre, agua de mar y una solución mezclada de los mismos. La solución acuosa contenida en el líquido de coagulación de la presente realización se puede seleccionar del grupo que consiste, por ejemplo, en solución acuosa de formiato de sodio, solución acuosa de cloruro de sodio, solución acuosa de sulfato de sodio, solución acuosa de fosfato de hidrógeno y potasio, solución acuosa de cloruro de calcio, solución acuosa de citrato de sodio, agua salobre, agua de mar y una solución mezclada de las mismas.

El líquido de coagulación antes del contacto con la disolución de hilado puede contener o no un solvente orgánico. Incluso en un caso en el que el líquido de coagulación antes del contacto con la disolución de hilado no contiene solvente orgánico, puede haber un caso en el que el solvente orgánico se disuelva de la disolución de hilado en contacto con el líquido de coagulación en el líquido de coagulación en un proceso de poner la disolución de hilado en contacto con el líquido de coagulación. El contenido del solvente orgánico contenido en el líquido de coagulación (que incluye un caso en el que el solvente orgánico se disuelve desde la disolución de hilado en contacto con el líquido de coagulación hasta el líquido de coagulación) es preferiblemente 0 % en masa o mayor y 40 % en masa o menor, 0 % en masa o mayor y 30 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 30 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 25 % en masa o menor, 0 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 5 % en masa o mayor y 15 % en masa o menor, 10 % en masa o mayor y 40 % en masa o menor, 15 % en masa o mayor y 40 % en masa o menor, 20 % en masa o mayor y 40 % en masa o menor, 10 % en masa o mayor y 30 % en masa o menor, 10 % en masa o mayor y 20 % en masa o menor, 0 % en masa o mayor y 10 % en masa o menor, 0 % en masa o mayor y 5 % en masa o menor, y 0 % en masa o mayor y 2 % en masa o menor, en base al 100 % en masa de la masa total del líquido de coagulación (en un caso donde el solvente orgánico se disuelve desde la disolución de hilado hasta el líquido de coagulación, el contenido total del líquido de coagulación antes del contacto con la disolución de hilado y el solvente orgánico disuelto desde la disolución de hilado hasta el líquido de coagulación). Cuando el contenido del solvente orgánico está dentro del rango descrito anteriormente, el efecto de la invención de la presente solicitud se exhibe notablemente. El contenido de solvente orgánico contenido en el líquido de coagulación puede ser del 10 % en masa o mayor y del 40 % en masa o menor, del 15 % en masa o mayor y del 40 % en masa o menor, o del 20 % en masa o mayor y del 40 % en masa o menor, en base al 100 % en masa de la masa total del líquido de coagulación. Cuando el contenido de solvente orgánico está dentro del rango descrito anteriormente, la propiedad de formación de fibras de la proteína estructural se mejora aún más. Como solvente orgánico, es preferible el ácido fórmico, DMSO o HFIP, y el ácido fórmico es más preferible.

El pH de la solución acuosa contenida en el líquido de coagulación puede ser de 0.25 a 10.00, o de 0.25 a 9.50.

El pH de la solución acuosa ácida en el líquido de coagulación puede ser, por ejemplo, menor que 0.25 a 7.00, menor que 0.50 a 7.00, menor que 1.00 a 7.00, menor que 1.50 a 7.00, menor que 2.00 a 7.00, o menor que 3.00 a 7.00.

El pH de la solución acuosa de sal en el líquido de coagulación puede ser, por ejemplo, de 0.50 a 10.00, 1.00 a 10.00, 2.00 a 10.00, 3.00 a 10.00, 3.50 a 10.00, 4.00 a 10.00, 4.50 a 10.00, 5.00 a 10.00, 5.50 a 10.00, 6.00 a 10.00, 6.50 a 10.00 o 6.50 a 9.50.

El contenido de agua o de la solución acuosa en el líquido de coagulación es preferiblemente del 60 % en masa o mayor, más preferiblemente del 70 % en masa o mayor, más preferiblemente del 80 % en masa o mayor, aún más preferiblemente del 90 % en masa o mayor, y particular y preferiblemente del 95 % en masa o mayor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación. Cuando el contenido de agua o de la solución acuosa está dentro del rango descrito anteriormente, la propiedad de formación de fibras de la proteína estructural se mejora aún más. El contenido de agua o de la solución acuosa en el líquido de coagulación puede ser, por ejemplo, del 60 % en masa o mayor y 100 % en masa o menor, 70 % en masa o mayor y 100 % en masa o menor, 80 % en masa o mayor y 100 % en masa o menor, o 95 % en masa o mayor y 100 % en masa o menor, en base a la cantidad total del líquido de coagulación.

El líquido de coagulación puede contener ácido fórmico. El contenido de ácido fórmico relativo a la cantidad total del líquido de coagulación es preferiblemente de 15 a 25 % en masa, más preferiblemente 16 a 25 % en masa, aún más preferiblemente 16 a 24 % en masa y particular y preferiblemente de 18 a 24 % en masa desde el punto de vista de mejorar la eficiencia de recuperación del solvente.

La temperatura del líquido de coagulación puede ser temperatura ambiente, 0 °C a 90 °C, 0 °C a 80 °C, 5 °C a 80 °C, 10 °C a 80 °C, 15 °C a 80 °C, 20 °C a 80 °C, 25 °C a 80 °C, 30 °C a 80 °C, 40 °C a 80 °C, 50 °C a 80 °C, 60 °C a 80 °C, 70 °C a 80 °C, 20 °C a 70 °C, 30 °C a 70 °C, 40 °C a 70 °C, 50 °C a 70 °C, 20 °C a 60 °C, 30 °C a 60 °C, 40 °C a 60 °C, o 50 °C a 60 °C. El límite inferior de la temperatura del líquido de coagulación puede ser igual o mayor que el punto de fusión del solvente orgánico contenido en la disolución de hilado. El límite superior de la temperatura puede ser igual o menor que el punto de ebullición del solvente orgánico contenido en la disolución de hilado. Al establecer la temperatura del líquido de coagulación a una temperatura más alta, se puede aumentar la tasa de eliminación de solvente de la disolución de hilado. También, la temperatura del líquido de coagulación es preferiblemente de 55 °C a 65 °C, más preferiblemente 45 °C a 55 °C, y aún más preferiblemente 35 °C a 45 °C. Cuando la temperatura del líquido de coagulación es de 35 °C o mayor, se puede obtener una tasa de eliminación de solvente apropiada, permitiendo de esta manera mejorar aún más la productividad. Cuando la temperatura del líquido de coagulación es de 65 °C o menor, se puede evitar el ablandamiento rápido causado por la solución de disolución que se calienta en el líquido de coagulación. El líquido de coagulación puede contener además el promotor de disolución descrito anteriormente que se puede agregar a la disolución de hilado.

[Proceso de hilado]

El método para producir una fibra de proteína de acuerdo con la presente realización se puede producir mediante un método de hilado en húmedo conocido públicamente y un método de hilado en húmedo en seco. Es decir, en el proceso de hilado, la disolución de hilado se pone en contacto con el líquido de coagulación para coagular la proteína. El método para producir una fibra de proteína de la presente realización, que incluye el proceso de hilado, se puede realizar, por ejemplo, utilizando el aparato de hilado mostrado en la Fig.4.

La Fig. 4 es una vista explicativa que ilustra un ejemplo de un aparato de hilado para producir una fibra de proteína. El aparato de hilado 10 mostrado en la Fig. 4 es un ejemplo del aparato de hilado para hilado en húmedo y tiene un aparato de extrusión 1, un baño de coagulación 20, un baño de lavado (baño de estirado) 21 y un aparato de secado 4 desde el lado den dirección ascendente en este orden.

El aparato de extrusión 1 tiene un tanque de almacenamiento 7 que almacena una disolución de hilado (solución de disolución) 6. El baño de coagulación 20 almacena un líquido de coagulación 11. La disolución de hilado 6 se extruye desde una boquilla 9 provista en el líquido de coagulación 11 mediante una bomba de engranajes 8 adherida a la porción del extremo inferior del tanque de almacenamiento 7. La disolución de hilado 6 extruida se suministra (introduce) al líquido de coagulación 11 en el baño de coagulación 20. El solvente se elimina de la disolución de hilado 6 en el líquido de coagulación 11, y la proteína de seda de araña se coagula. La proteína de seda de araña coagulada se introduce en un baño de lavado 21, se lava con una solución de lavado 12 en el baño de lavado 21 y luego se envía al aparato de secado 4 mediante un primer rodillo de presión 13 y un segundo rodillo de presión 14 provistos en el baño de lavado 21. En este momento, cuando la velocidad de rotación del segundo rodillo de presión 14 se hace más rápida que la velocidad de rotación del primer rodillo de presión 13, por ejemplo, se obtiene una fibra de proteína 36 estirada en una relación que corresponde a la relación de velocidad de rotación. La fibra de proteína estirada en la solución de lavado 12 se saca del baño de lavado 21, se seca al momento de pasar a través del interior del aparato de secado 4 y luego se enrolla mediante una bobinadora. De esta manera, en el aparato de hilado 10, la fibra de proteína finalmente se enrolla como un rollo enrollado 5 mediante la bobinadora. Por cierto, los números de referencia 18a a 18g son guías de hilo.

La temperatura del líquido de coagulación 11 no se limita particularmente, sino que puede ser de 80 °C o menor, 70 °C o menor, 60 °C o menor, 50 °C o menor, 40 °C o menor, 30 °C o menor, 25 °C o menor, 20 °C o menor, 10 °C o menor, o 5 °C o menor. La temperatura es preferiblemente de 0 °C o mayor desde el punto de vista de la trabajabilidad, el coste de refrigeración y similares. Adicionalmente, la temperatura del líquido de coagulación 11 se puede ajustar, por ejemplo, al utilizar el aparato de hilado 10 que tiene el baño de coagulación 20 que incluye un intercambiador de calor en su interior y un dispositivo de circulación de refrigerante. Por ejemplo, se permite que un medio enfriado, que se ha enfriado a una temperatura predeterminada mediante el dispositivo de circulación de refrigerante, fluya a través del intercambiador de calor proporcionado en el baño de coagulación. Por lo tanto, la temperatura se puede ajustar a una temperatura dentro del rango anterior mediante intercambio de calor entre el líquido de coagulación 11 y el intercambiador de calor. En este caso, se puede lograr un enfriamiento más eficiente haciendo circular, como medio, un solvente utilizado para el líquido de coagulación 11.

Se puede proporcionar una pluralidad de baños de coagulación que almacenan el líquido de coagulación. La proteína estructural artificial coagulada extraída del baño de coagulación o del baño de lavado se puede enrollar tal cual mediante la bobinadora, o se puede secar dejándola pasar a través del aparato de secado y luego enrollándola mediante la bobinadora.

La distancia por la que la proteína estructural artificial coagulada pasa a través del líquido de coagulación puede ser cualquier distancia siempre que el solvente se pueda eliminar de manera eficiente. La distancia se puede determinar dependiendo, por ejemplo, de la velocidad de extrusión (velocidad de descarga) de la disolución de hilado desde la boquilla. El tiempo de residencia de la proteína estructural artificial coagulada (o disolución de hilado) en el líquido de coagulación se puede determinar dependiendo de la distancia que recorra la proteína estructural artificial coagulada a través del líquido de coagulación, la velocidad de extrusión de la disolución de hilado desde la boquilla y similares.

[Proceso de estirado]

El método para producir una proteína estructural artificial de la presente realización puede incluir además un proceso de estirado de la fibra de proteína estructural artificial coagulada (proceso de estirado). Los ejemplos del método de estirado incluyen estirado con calor húmedo, estirado con calor seco y similares. El proceso de estirado se puede realizar, por ejemplo, en el baño de coagulación 20 o en el baño de lavado 21. El proceso de estirado también se puede realizar al aire.

El estirado en el baño de lavado 21 puede ser estirado en agua caliente, en una solución en la que se agrega un solvente orgánico al agua caliente o similar, es decir, estirado con calor húmedo. La temperatura para el estirado con calor húmedo es preferiblemente de 50 a 90 °C. Cuando esta temperatura es de 50 °C o mayor, el diámetro de poro del hilo se puede hacer pequeño de manera estable. También, cuando la temperatura es de 90 °C o menor, el ajuste de la temperatura es fácil y, por lo tanto, se mejora la estabilidad del hilado. La temperatura es más preferiblemente de 75 a 85 °C.

El estirado por calor húmedo se puede realizar en agua caliente, en una solución en la que se agrega un solvente orgánico o similar al agua caliente, o en un vapor calentado. La temperatura puede ser, por ejemplo, de 40 a 200 °C, 50 a 180 °C, 50 a 150 °C, o 75 a 90 °C. La relación de estirado en el estirado por calor húmedo puede ser, por ejemplo, de 1 a 30 veces, 2 a 25 veces, 2 a 20 veces, 2 a 15 veces, 2 a 10 veces, 2 a 8 veces, 2 a 6 veces, o 2 a 4 veces, con respecto a al hilo no estirado (o al hilo preestirado). Sin embargo, la relación de estirado no está limitada siempre que se puedan obtener características tales como un grosor de fibra deseado y propiedades mecánicas.

El estirado con calor seco se puede realizar al utilizar un aparato como una placa calefactora de tipo de contacto y un horno de tipo sin contacto, pero no se limita particularmente a los mismos. Se puede utilizar cualquier aparato que aumente la temperatura de la fibra a una temperatura deseada y permita el estirado a una relación de estirado predeterminada. La temperatura para el estirado con calor seco puede ser, por ejemplo, de 100 °C a 270 °C, 140 °C a 230 °C, 140 °C a 200 °C, 160 °C a 200 °C, o 160 °C a 180 °C.

La relación de estirado en el proceso de estirado con calor seco puede ser, por ejemplo, de 1 a 30 veces, puede ser 2 a 30 veces, puede ser 2 a 20 veces, puede ser 3 a 15 veces, preferiblemente 3 a 10 veces, más preferiblemente 3 a 8 veces, y aún más preferiblemente 4 a 8 veces, con respecto al hilo no estirado (o hilo preestirado). Sin embargo, la relación de estirado no está limitada siempre que se puedan obtener características tales como un grosor de fibra deseado y propiedades mecánicas.

El proceso de estirado puede ser un proceso que realiza cada uno de los estirados con calor húmedo y estirados con calor seco por separado, o un proceso que realiza estos estirados en múltiples etapas o en combinación. Es decir, como proceso de estirado, el estirado con calor húmedo y el estirado con calor seco se pueden combinar apropiadamente y realizar de la siguiente manera: el estirado con calor húmedo se realiza en una primera etapa de estirado y luego el estirado con calor seco se realiza en una segunda etapa de estirado, o el estirado con calor húmedo se realiza en una primera etapa de estirado, luego el estirado con calor húmedo se realiza en una segunda etapa de estirado y, además, el estirado con calor seco se realiza, por ejemplo en una tercera etapa de estirado.

El límite inferior de la relación de estirado final de la fibra de proteína estructural artificial sometida al proceso de estirado puede ser preferiblemente cualquiera de 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces y 9 veces, con respecto al hilo no estirado (o hilo preestirado). El límite superior de la relación de estirado final de la fibra de fibroína modificada sometida al proceso de estirado puede ser preferiblemente cualquiera de 40 veces, 30 veces, 20 veces, 15 veces, 14 veces, 13 veces, 12 veces, 11 veces y 10 veces. La relación de estirado final puede ser, por ejemplo, de 3 a 40 veces, 3 a 30 veces, 5 a 30 veces, 5 a 20 veces, 5 a 15 veces o 5 a 13 veces. Sin embargo, la relación de estirado no está limitada siempre que se puedan obtener características tales como un grosor de fibra deseado y propiedades mecánicas.

En el proceso de hilado, la forma de la hilera, la forma del orificio, el número de orificios no se limita particularmente, y se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de un diámetro de fibra deseado, el número de hilos individuales y similares.

Se puede aplicar un agente de aceite a un hilo no estirado (o hilos preestirados) o hilo estirado, según sea necesario, con el fin de impartir una propiedad antiestática, convergencia y lubricidad, o similar antes o después del secado. El tipo de agente de aceite aplicado y la cantidad de aplicación del mismo, y similares, no están particularmente limitados, y se pueden ajustar apropiadamente teniendo en cuenta la aplicación de uso de la fibra, el tratamiento de la fibra, y similares.

En un caso en el que la forma del orificio de la hilera es una forma circular, el diámetro del orificio de la hilera puede ser 0.01 mm o mayor y 0.6 mm o menor, por ejemplo. Cuando el diámetro del orificio es 0.01 mm o mayor, se puede reducir la pérdida de presión y, por lo tanto, se puede suprimir el coste de la instalación. Cuando el diámetro del orificio es 0.6 mm o menos, se puede reducir la necesidad de la operación de estirado para minimizar el diámetro de la fibra. Por lo tanto, se puede reducir la posibilidad de causar rupturas en el estirado durante un período desde la descarga hasta el bobinado.

La temperatura de la disolución de hilado cuando pasa a través de la hilera y la temperatura de la hilera no están particularmente limitadas. Las temperaturas se pueden ajustar apropiadamente dependiendo de la concentración y viscosidad de la disolución de hilado que se va a utilizar, el tipo de solvente orgánico y similares. Las temperaturas son preferiblemente de 30 °C a 100 °C desde el punto de vista de prevenir el deterioro de la proteína estructural, por ejemplo. También, el límite superior de la temperatura es preferiblemente una temperatura que no alcance el punto de ebullición de un solvente que se va a utilizar, desde el punto de vista de reducir las posibilidades de aumento de presión debido a la volatilización del solvente y la obstrucción en el conducto debido a la solidificación de la disolución de hilado. Esto mejora la estabilidad del proceso.

El método de producción de acuerdo con la presente realización puede incluir además un proceso de filtración de la disolución de hilado antes de descargarla (proceso de filtración) y/o un proceso de desespumado de la disolución de hilado antes de descargarla (proceso de desespumado).

(Evaluación de las propiedades físicas de la fibra)

La medición y evaluación de las propiedades físicas de la fibra de proteína estructural artificial se puede realizar de la siguiente manera.

La finura y el alargamiento de la resistencia de las fibras muestreadas aleatoriamente se miden al utilizar “FAVIMAT”, que es un instrumento de medición del alargamiento de la resistencia de un solo hilo, fabricado por Textechno en un entorno con una temperatura de 20 °C y una humedad relativa del 65 %, y se calcula el valor promedio. Las condiciones para la medición del alargamiento de la resistencia se establecen preferiblemente de la siguiente manera: capacidad de la celda de carga: 210 cN, longitud de calibre: 20 mm y velocidad de tracción: 10 mm/min. Una resistencia cuando la fibra se rompe se define como resistencia a la ruptura [g/d], y un alargamiento cuando la fibra se rompe se define como alargamiento a la ruptura [%]. También, un valor obtenido al multiplicar el valor numérico de un área encerrada por una curva de tensión-deformación donde el eje horizontal es la deformación [%] y el eje vertical es la tensión [g/d], y el eje horizontal, por la densidad [kg/m<3>] se define como tenacidad [MJ/m<3>]. Se prefiere que el valor medido se calcule como, por ejemplo, el valor promedio del número de muestras n = 10.

(Evaluación de la contracción de la fibra)

La fibra de proteína estructural artificial tiene características de contracción al ponerse en contacto (humectación) con agua de menos del punto de ebullición. Preferiblemente, dicha contracción es lo menos posible en la fibra de proteína estructural artificial.

La contracción se puede evaluar, por ejemplo, utilizando la relación de contracción como un indicador obtenido por el siguiente método.

Una pluralidad de números de fibras de proteína estructural artificial que tienen una longitud de aproximadamente 30 cm se agrupan para formar un haz de fibras con una finura de 150 denier. Se adhiere un peso de 0.8 g de plomo sobre este haz de fibras y se encoge sumergiéndolo en este estado en agua a 40 °C durante 90 segundos. A continuación, se saca cada haz de fibras del agua y se seca con el peso de 0.8 g de plomo colocado sobre él. A continuación, se mide la longitud de cada haz de fibras después del secado. La relación de contracción se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación. Tenga en cuenta que L0representa la longitud de una fibra antes del contacto con el agua (después del hilado) (en este caso, 30 cm) y LDrepresenta la longitud de una fibra después del contracción (fibra seca después del tratamiento de impregnación con agua). Ecuación: relación de contracción [%] = {l - (LD/L0)} x 100

[Producto]

La fibra de proteína de acuerdo con la presente realización se puede aplicar, como fibras (fibra larga, fibra corta, monofilamento o multifilamento, por ejemplo) o hilos (hilo hilado, hilo retorcido, hilo de falsa torsión, hilo procesado, hilo de filamento combinado o hilo mezclado, por ejemplo), a una tela tejida, una tela de punto, una tela trenzada o una tela tal como una tela no tejida, papel y algodón, y similares. También, la fibra de proteína de acuerdo con la presente realización se puede aplicar a aplicaciones de alta resistencia tales como cuerdas, suturas quirúrgicas, hemostáticos, topes flexibles para componentes eléctricos y materiales fisiológicamente activos para implantación (por ejemplo, ligamento artificial y banda aórtica). Estos se pueden producir mediante un método conocido públicamente.

Ejemplos

A continuación, la presente invención se describirá más específicamente en base a Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los siguientes Ejemplos.

Los ejemplos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones son sólo informativos.

[Producción de proteína estructural artificial]

(1) Producción de vector de expresión

En base a la secuencia base y la secuencia de aminoácidos de la fibroína derivada deNephila clavipes(No. de Acceso de GenBank: P46804.1, GI:1174415), se diseñó una proteína estructural artificial que tiene la SEQ ID NO: 44 (fibroína modificada) (de aquí en adelante, también denominada como “PRT966”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 15 (de aquí en adelante, denominada como “PRT799”), y una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 37 (de aquí en adelante, denominada como “PRT918”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 50 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT705”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 51 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT826”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 52 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT853”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 53 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT1103”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 54 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT1104”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 55 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT1107”), una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 56 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT1083”), y una fibroína modificada que tiene la SEQ ID NO: 57 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT1125”) También, como una proteína estructural artificial, una proteína de queratina que tiene la SEQ ID NO: 58 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT855”), una proteína de colágeno que tiene la SEQ ID NO: 59 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT537”), una proteína de resilina que tiene la SEQ ID NO: 60 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT366”), y un interferón γ que tiene la SEQ ID NO: 61 (de aquí en adelante, también denominada como “PRT662”).

Por cierto, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 44 tiene una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir todos los QQs con VF, sustituir el Q restante con I en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 (se agrega la secuencia de aminoácidos antes de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42 al terminal C de la misma), con el fin de mejorar la hidrofobicidad, y agregar además la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12 al terminal N de la misma.

También, la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 15 tiene una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir, insertar, y suprimir los residuos de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la fibroína derivada deNephila clavipes, con el fin de mejorar la productividad, y agregar además la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12 (secuencia de etiqueta y secuencia bisagra) al terminal N de la misma.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53 (PRT1103) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir un residuo de tirosina (Y) de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410) con un residuo de fenilalanina (F), sustituir una gran parte de los residuos de serina (S) con un residuo de alanina (A) o un residuo de glicina (G), y agregar además una secuencia de etiqueta al terminal N de la misma.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54 (PRT1104) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir una gran parte de los residuos de serina (S) de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 con un residuo de alanina (A) o un residuo de glicina (G), y agregar además una secuencia de etiqueta al terminal N de la misma.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55 (PRT1107) es una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir un residuo de serina (S) de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31 (Met-PRT918) con un residuo de alanina (A), un residuo de valina (V), un residuo de leucina (L), o un residuo de isoleucina (I), y agregar además una secuencia de etiqueta al terminal N de la misma.

La secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58 (PRT855) tiene una secuencia de aminoácidos obtenida al sustituir leucina o valina con alanina o glicina en una secuencia de aminoácidos que consiste en el 1° al 292° residuos de aminoácidos desde el terminal N de PRT798 (SEQ ID NO: 49) para obtener una secuencia de aminoácidos, y además sustituir tres residuos de aminoácidos en el 1° a 246° residuos de aminoácidos desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos obtenida e insertar una secuencia de aminoácidos que consiste en GAAAAAG (SEQ ID NO: 62) en la misma.

A continuación, se sintetizan los ácidos nucleicos que codifican las proteínas estructurales artificiales diseñadas PRT966, PRT799, PRT918, PRT826, PRT853, PRT1104, PRT705, PRT1125, PRT1103, PRT1107, y PRT1083 (fibroínas modificadas), PRT855 (proteína de queratina), PRT537 (proteína de colágeno), PRT366 (proteína de resilina), e interferón γ (PRT662). En cada uno de los ácidos nucleicos, se agregó un sitio NdeI al extremo 5’ del mismo, y se agregó un sitio EcoRI en dirección descendente del codón de terminación del mismo. Cada ácido nucleico se clonó en un vector de clonación (pUC118). A continuación, el ácido nucleico se escindió mediante tratamiento con enzimas de restricción con NdeI y EcoRI, y luego se recombinó en un vector de expresión de proteína pET-22b(+), obteniendo de esta manera un vector de expresión.

(2) Expresión de proteína estructural artificial

Se transformó laEscherichia coliBLR(DE3) con el vector de expresión obtenido en (1). LaEscherichia colitransformada se cultivó en 2 ml de un medio de cultivo LB que contenía ampicilina durante 15 horas. La solución de cultivo se agregó a 100 ml de un medio de cultivo de semilla que contenía ampicilina (Tabla 5) de tal manera que la OD600alcanzara 0.005. La temperatura de la solución de cultivo se mantuvo a 30 °C, y el cultivo en matraz se realizó (durante aproximadamente 15 horas) hasta que la OD600alcanzara 5, obteniendo de esta manera una solución de cultivo de semilla.

[Tabla 5] Medio de cultivo de semilla

La solución de cultivo de semillas se agregó a un fermentador de jarra al que se habían añadido 500 ml de un medio de producción (Tabla 6) de tal manera que la OD600alcanzara 0.05. El cultivo se realizó manteniendo la temperatura de la solución de cultivo a 37 °C y manteniendo el pH constante a 6.9.

Además, la concentración de oxígeno disuelto en la solución de cultivo se mantuvo al 20 % de la concentración de saturación de oxígeno disuelto.

[Tabla 6] Medio de producción

Inmediatamente después de que la glucosa en el medio de producción se consumió por completo, se agregó una solución de alimentación (455 g/1 l de glucosa, 120 g/1 l de Extracto de Levadura) a una tasa de 1 ml/min. El cultivo se realizó manteniendo la temperatura de la solución de cultivo a 37 °C y manteniendo el pH constante a 6.9. Además, la concentración de oxígeno disuelto en la solución de cultivo se mantuvo al 20 % de la concentración de saturación de oxígeno disuelto, y el cultivo se realizó durante 20 horas. Después de esto, se agregó isopropil-β-tiogalactopiranósido 1 M (IPTG) a la solución de cultivo de tal manera que la concentración final del mismo fuera 1 mM, induciendo de esta manera la expresión de la fibroína modificada 20 horas después de la adición de IPTG, la solución de cultivo se centrifugó para recuperar las células bacterianas. Se realizó SDS-PAGE utilizando las células bacterianas preparadas a partir de las soluciones de cultivo antes y después de la adición de IPTG, y la expresión de una proteína estructural artificial deseada se confirmó por la aparición de una banda de un tamaño de fibroína modificado deseado dependiendo de la adición de IPTG.

(3) Purificación de la proteína estructural artificial

Las células bacterianas recuperadas 2 horas después de la adición de IPTG se lavaron con tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7.4). Las células bacterianas después del lavado se suspendieron en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7.4) que contenía aproximadamente PMSF1 mM, y las células se rompieron con un homogeneizador de alta presión (fabricado por GEA Niro Soavi). Las células rotas se centrifugaron para obtener un precipitado. El precipitado obtenido se lavó con tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7.4) hasta que la pureza del precipitado se volvió alta. El precipitado después del lavado se suspendió en tampón de guanidina 8 M (clorhidrato de guanidina 8 M, dihidrógeno fosfato de sodio 10 mM, NaCl 20 mM, Tris-HCl 1 mM, pH 7.0) de tal manera que la concentración del mismo fuera de 100 mg/ml, y se disolvió al agitar con un agitador durante 30 minutos a 60 °C. Después de la disolución, se realizó diálisis con agua utilizando un tubo de diálisis (tubo de celulosa 36/32, fabricado por Sanko Junyaku Co., Ltd.). La proteína blanca agregada obtenida después de la diálisis se recuperó por centrifugación, el contenido de agua se eliminó mediante un secador por congelación y se recuperó un polvo liofilizado. De esta forma se obtuvieron fibroínas modificadas (PRT966, PRT799, PRT918PRT826, PRT853, PRT1104, PRT705, PRT1125, PRT1103, PRT1107 y PRT1083), PRT855 (proteína de queratina), PRT537 (proteína de colágeno), PRT366 (proteína de resilina) y PRT662 (interferón γ).

[Evaluación de la propiedad de formación de fibras (líquido de coagulación)]

(1-1) Preparación de la solución de disolución

En primer lugar, se mezclaron el 26 % en masa de una fibroína modificada (PRT966) obtenida en el proceso de producción de la proteína estructural artificial y el 74 % en masa de ácido fórmico como solvente para disolver (fabricado por Asahi Chemical Co., Ltd., pureza: 98 %) y se disolvieron al calentar la mezcla con un calentador de bloque de aluminio ajustado a 70 °C durante 1 hora con agitación. La solución obtenida se desespumó mediante filtración con un filtro metálico que tenía una abertura de 1 µm, y de este modo se obtuvo una solución de disolución.

(1-2) Prueba de descarga de la solución de disolución

La solución de disolución obtenida en (1-1) se cargó en una jeringa de 10 ml y luego se descargó desde una boquilla que tenía un diámetro de boquilla de 0.2 µm en el líquido de coagulación, para coagular la fibroína modificada a temperatura ambiente. La fibra cruda coagulada se enrolló a una velocidad lineal de 2.39 m/min. Se observó la fibra cruda obtenida y se determinó visualmente la propiedad de formación de fibra. La velocidad de extrusión de la solución de disolución fue de 0.075 ml/min. El tipo de líquido de coagulación utilizado es el que se muestra en la Tabla 7. Por cierto, el agua salobre se recoge del estuario de la ciudad de Sakata, prefectura de Yamagata, y el agua de mar se recoge del océano de la ciudad de Kamo, prefectura de Yamagata. La concentración de agua salobre y agua de mar [% en peso] indica un valor aproximado de la concentración de todos los solutos. Las soluciones mixtas de los Ejemplos de Prueba 26 a 28 son una solución preparada en base a la suposición de que el ácido fórmico que está en contacto con la solución acuosa de cloruro de sodio en la disolución de hilado se disuelve en la solución acuosa, y la proporción de la masa total del líquido de coagulación (solución mezclada) se hace de tal manera que el contenido de la solución acuosa de cloruro de sodio sea de 60 % en masa a 80 % en masa, y el contenido de ácido fórmico sea de 20 % en masa a 40 % en masa. La solución acuosa de ácido fórmico del Ejemplo de Prueba 29 se preparó en base a la suposición de que el ácido fórmico que está en contacto con agua en la disolución de hilado se disuelve en agua, y la proporción de la masa total del líquido de coagulación (solución mezclada) se hizo de tal manera que el contenido de agua fuera de 80 % en masa y el contenido de ácido fórmico fuera de 20 % en masa.

El resultado de la evaluación de la propiedad de formación de fibras se mostró en la Tabla 7. El criterio de evaluación de la propiedad de formación de fibras es el siguiente.

Θ: Se forma fibra. La fibra obtenida es flexible y homogénea.

O: Se forma fibra. La fibra obtenida es flexible.

Δ: Se forma fibra.

X: No se forma fibra.

[Tabla 7]

Como se muestra en la Tabla 7, en el caso de utilizar agua, una solución acuosa ácida, una solución acuosa de sal y una solución mezclada, se podrían formar fibras flexibles (Ejemplos de Prueba 1 a 26). En el caso de utilizar una solución acuosa de sal como líquido de coagulación, se podrían formar fibras flexibles y homogéneas, y se demostró una propiedad de formación de fibras extremadamente buena (Ejemplos de Prueba 4 a 26). En particular, se puede reducir una gran cantidad de los costes de producción al utilizar, como líquido de coagulación, agua, una solución acuosa de cloruro de sodio, agua salobre y agua de mar, que son recursos abundantes y económicos. El resultado también muestra que, incluso en el caso en el que el solvente orgánico que está en contacto con el líquido de coagulación en la disolución de hilado se disuelve en el líquido de coagulación, se podrían formar fibras flexibles (Ejemplos de Prueba 27 a 30). En particular, en un caso en el que un líquido de coagulación en el que se ha disuelto ácido fórmico fuera una solución acuosa de cloruro de sodio, se podrían formar fibras flexibles y homogéneas (Ejemplos de Prueba 28 a 30).

[Evaluación de la propiedad de formación de fibras (proteína)]

(2-1) Preparación de la solución de disolución

En primer lugar, se agrega un 26 % en masa de cada fibroína modificada (PRT966, PRT826, PRT853, PRT1104, PRT705, PRT1125, PRT1103, PRT1107 y PRT1083), proteína de queratina (PRT855), proteína de colágeno (PRT537), proteína de resilina (PRT366) o interferón γ (PRT662), producida en el proceso de producción de la proteína estructural artificial, o un 26 % en masa de MEDIGELATIN, que es una proteína estructural disponible comercialmente (fabricada por Nippi, Inc.), albúmina de clara de huevo o caseína, y un 74 % en masa de ácido fórmico como solvente para disolver o un 74 % en masa de una solución de sulfóxido de dimetilo que contiene cloruro de litio (concentración de cloruro de litio: 4.0 % en masa) se mezclaron y se disolvieron al calentar la mezcla con un calentador de bloque de aluminio ajustado a 70 °C durante 1 hora con agitación. La solución obtenida se desespumó mediante filtración con un filtro de metal que tiene una abertura de 1 µm, y de este modo se obtuvo una solución de disolución. La solución de disolución preparada se muestra en la Tabla 8.

(2-2) Prueba de descarga de la solución de disolución

La solución de disolución obtenida en (2-1) se cargó en una jeringa de 10 ml, y luego se descargó desde una boquilla que tiene un diámetro de boquilla de 0.2 µm en el líquido de coagulación (solución acuosa de sulfato de sodio con una concentración del 30 %, o agua), para coagular la fibroína modificada a temperatura ambiente. Se observó la fibra cruda obtenida y se determinó visualmente la propiedad de formación de fibra. La velocidad de extrusión de la solución de disolución fue de 0.075 ml/min. El criterio de evaluación de la propiedad de formación de fibra es el siguiente. El resultado de la evaluación de la propiedad de formación de fibra se mostró en la Tabla 8. Por cierto, el HI promedio en la Tabla 8 es un valor calculado al determinar la suma total de los índices de hidropatía (HI) de todos los residuos de aminoácidos que constituyen la proteína estructural, y luego dividir la suma por el número total de residuos de aminoácidos. El HI promedio es un valor obtenido al calcular el índice de hidropatía de la secuencia de aminoácidos establecida en la lista de secuencias (una secuencia que incluye una secuencia de etiqueta y una secuencia de bisagra).

�: Se forma fibra y la coagulabilidad es buena.

�.: Se forma fibra, pero la coagulabilidad es baja.

X: La solución de disolución se gelifica o la disolución del soluto es imposible.

[Tabla 8]

Como se muestra en la Tabla 8, en el caso de utilizar una solución acuosa de sulfato de sodio como líquido de coagulación, se formaron fibras en todas las proteínas estructurales que tenían un valor de HI promedio de -1.229 a 0.95, y por lo tanto se confirmó que estas proteínas estructurales tenían la propiedad de formación de fibras (Ejemplos de Prueba 83 a 109). Además, en un caso de uso de agua como líquido de coagulación, se formaron fibras en fibroínas modificadas que tenían un valor de HI promedio de 0.466 a 0.95, y por lo tanto se confirmó que estas fibroínas modificadas tenían la propiedad de formación de fibras (Ejemplos de Prueba 107 a 109). El resultado muestra que, en el caso de utilizar una solución acuosa de sulfato de sodio como líquido de coagulación, se formaron fibras independientemente del tipo de proteína estructural, y se exhibió una excelente propiedad de formación de fibras.

[Producción y evaluación de fibra de proteína estructural artificial]

(1) Preparación de la solución de disolución

Se preparó una solución de disolución siguiendo el mismo procedimiento que en la solución de disolución preparada en la evaluación de la propiedad de formación de fibra, excepto que la concentración de la fibroína modificada (PRT966) fue del 26 % en masa y la concentración del ácido fórmico fue del 74 % en masa. (2) Hilado en húmedo

La solución de disolución preparada se cargó en un tanque de reserva y se descargó, con una bomba de engranajes, desde una boquilla monoagujero que tenía un diámetro de 0.2 mm en un baño de coagulación utilizando un aparato de hilado de sobremesa, formando de esta manera un hilo original. A continuación, el hilo original coagulado se estiró en un baño de lavado con agua. Después de lavar y estirárselo en el baño de lavado con agua, el hilo obtenido se secó utilizando una placa de calor seco, y la fibra de fibroína modificada obtenida (fibra de proteína artificial) se enrolló mediante un aparato de hilado de sobremesa. Las condiciones para el hilado en húmedo son las siguientes, y los líquidos de coagulación utilizados son los que se muestran en la Tabla 9.

Diámetro de la boquilla de extrusión: 0.2 mm

Temperatura del líquido de coagulación: temperatura ambiente

Relación de estirado en el baño de lavado con agua: 3.5 a 5.5 veces

Temperatura del baño de lavado con agua: 40 °C

Temperatura de secado: 60 °C

(3) Evaluación de las propiedades físicas de la fibra de proteína estructural artificial

Las propiedades físicas de las fibras obtenidas en (2) anterior se midieron mediante el siguiente método. La finura y el alargamiento de la resistencia de diez fibras muestreadas al azar se midieron al utilizar “FAVIMAT”, que es un instrumento de medición de elongación de la resistencia del hilo único, fabricado por Textechno en un entorno de una temperatura de 20 °C y una humedad relativa del 65 % (número de muestra = 10), y se calculó el valor promedio. Las condiciones para la medición de la elongación por resistencia se establecieron de la siguiente manera: capacidad de la celda de carga: 210 cN, longitud de calibre: 20 mm y velocidad de tracción: 10 mm/min. La resistencia cuando la fibra se rompió se definió como resistencia a la ruptura [g/d], y la elongación cuando la fibra se rompió se definió como elongación a la ruptura [%]. Además, un valor obtenido al multiplicar el valor numérico de un área encerrada por una curva de tensión-deformación donde el eje horizontal es la deformación [%] y el eje vertical es la tensión [g/d], y el eje horizontal, por la densidad [kg/m<3>] se definió como tenacidad [MJ/m<3>]. La densidad de la fibroína modificada (PRT966) fue de 1.34 [g/cm<3>]. Los resultados de la evaluación de las propiedades mecánicas de las respectivas fibras de fibroína modificada se muestran en las Tablas 9, 10, 11 y 12. El valor de elongación en las Tablas 9 y 10 es un valor relativo cuando el valor de elongación en la ruptura de la fibra de fibroína modificada del Ejemplo Comparativo 2 (una fibra producida al utilizar metanol al 100 % para un baño de coagulación) se toma como 100. Por cierto, para la elongación en la ruptura del Ejemplo de Prueba 33 (solución acuosa de cloruro de potasio) y el Ejemplo de Prueba 36 (solución acuosa de sulfato de sodio) en la Tabla 9, y la elongación en la ruptura en la Tabla 10, se mostró un valor cuando la temperatura del baño de coagulación era de 60 °C.

El valor de tenacidad en las Tablas 11 y 12 es un valor relativo cuando la tenacidad de la fibra de fibroína modificada del Ejemplo Comparativo 3 (una fibra producida al utilizar metanol al 100 % para un baño de coagulación) se toma como 100. Por cierto, para el valor relativo de la tenacidad del Ejemplo de Prueba 44 (solución acuosa de cloruro de potasio) y el Ejemplo de Prueba 47 (solución acuosa de sulfato de sodio) en la Tabla 11, y el valor relativo de la tenacidad en la Tabla 12, se mostró un valor cuando la temperatura del baño de coagulación era de 60 °C.

Como se muestra en la Tabla 9, en todas las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa de carboxilato (una solución acuosa de citrato de sodio y una solución acuosa de formiato de sodio), una solución acuosa de cloruro (una solución acuosa de cloruro de potasio, una solución acuosa de cloruro de sodio, y una solución acuosa de cloruro de calcio), una solución acuosa de sulfato (una solución acuosa de sulfato de sodio y una solución acuosa de sulfato de amonio), una solución acuosa de hidrógeno fosfato (tampón) y una solución mezclada (agua salobre y agua de mar) (Ejemplos de Prueba 31 a 40) y la fibra de fibroína modificada producida al utilizar agua como líquido de coagulación (Ejemplo de Prueba 41), se observó un efecto de mejora adicional de la elongación en comparación con la fibra de fibroína modificada producida al utilizar metanol como líquido de coagulación (Ejemplo Comparativo 2), y se pudo obtener un resultado excelente inesperado.

Como se muestra en la Tabla 10, en todas las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa mezclada de una solución acuosa de cloruro de sodio y ácido fórmico (Ejemplos de Prueba 43 a 44), y las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa mezclada de agua y ácido fórmico (Ejemplos de Prueba 45 a 46), se observó un efecto de mejora adicional de la elongación en cualquier relación de mezcla, en comparación con la fibra de fibroína modificada producida al utilizar metanol como líquido de coagulación (Ejemplo Comparativo 2), y se pudo obtener un resultado excelente inesperado. Este resultado muestra que, incluso en un caso en el que el ácido fórmico en la disolución de hilado se disuelve en un líquido de coagulación de agua (Ejemplo de Prueba 41) y un líquido de coagulación de una solución acuosa de cloruro de sodio (Ejemplo de Prueba 42), se observa un efecto excelente de mejora de la elongación.

Como se muestra en la Tabla 11, en todas las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa de carboxilato (una solución acuosa de citrato de sodio y una solución acuosa de formiato de sodio), una solución acuosa de cloruro (una solución acuosa de cloruro de potasio y una solución acuosa de cloruro de sodio), una solución acuosa de sulfato (una solución acuosa de sulfato de sodio y una solución acuosa de sulfato de amonio), un tampón de sal de agua y ácido fosfórico, y una solución mezclada (agua salobre y agua de mar) (Ejemplos de Prueba 47 a 56) y la fibra de fibroína modificada producida al utilizar agua como líquido de coagulación (Ejemplo de Prueba 56), se observó un efecto de mejora adicional del valor de tenacidad, en comparación con la fibra de fibroína modificada producida al utilizar metanol como líquido de coagulación (Ejemplo Comparativo 3), y se pudo obtener un resultado excelente inesperado.

Como se muestra en la Tabla 12, en todas las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa mezclada de una solución acuosa de cloruro de sodio y ácido fórmico (Ejemplos de Prueba 58 a 59), y la fibra de fibroína modificada producida al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa mezclada de agua y ácido fórmico (Ejemplos de Prueba 60 a 61), se observó un efecto de mejora adicional del valor de tenacidad en cualquier relación de mezcla, en comparación con la fibra de fibroína modificada producida al utilizar metanol como líquido de coagulación (Ejemplo Comparativo 3), y se pudo obtener un excelente resultado inesperado. Este resultado muestra que, incluso en un caso en el que el ácido fórmico en la disolución de hilado se disuelve en un líquido de coagulación de agua (Ejemplo de Prueba 41) y un líquido de coagulación de una solución acuosa de cloruro de sodio (Ejemplo de Prueba 34), se observa un excelente efecto de mejora del valor de tenacidad.

(4) Evaluación de la contracción de la fibra de proteína estructural artificial

Las longitudes de las fibras de fibroína modificada obtenidas en el (2) anterior se ajustaron a aproximadamente 30 cm y se agruparon, y esto se utilizó como un haz de fibras de fibroína con una finura de 150D. Se adhirió un peso de 0.8 g de plomo a cada uno de los haces de fibras de fibroína, y el haz de fibras se encogió al sumergir el haz de fibras en este estado en agua a 40 °C durante 90 segundos. A continuación, cada haz de fibras se sacó del agua y se secó con el peso de 0.8 g de plomo adherido al mismo. A continuación, se midió la longitud de cada haz de fibras después del secado. La relación de contracción se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación. Tenga en cuenta que L0representa la longitud de una fibra de fibroína modificada antes del contacto con el agua (después del hilado) (en el presente documento, 30 cm), y LDrepresenta la longitud de una fibra después de la contracción (fibra seca después del tratamiento de impregnación con agua).

Ecuación: relación de contracción [%] = {1-(LD/L0)} x 100

La relación de contracción de cada una de las fibras de fibroína modificada se muestra en las Tablas 11 y 12. El valor de la relación de contracción en las Tablas 13 y 14 se mostró como un valor relativo cuando el valor de la relación de contracción (17.0 %) de la fibra de fibroína modificada del Ejemplo Comparativo 4 (una fibra producida al utilizar metanol para un baño de coagulación) se toma como 100. Por cierto, para la relación de contracción del Ejemplo de Prueba 64 (solución acuosa de cloruro de potasio) y el Ejemplo de Prueba 73 (solución acuosa de sulfato de sodio) en la Tabla 13, y la relación de contracción en la Tabla 14, se mostró un valor cuando la temperatura del baño de coagulación era de 60 °C.

Como se muestra en la Tabla 13, en todas las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa de carboxilato (una solución acuosa de citrato de sodio y una solución acuosa de formiato de sodio), una solución acuosa de cloruro (una solución acuosa de cloruro de potasio y una solución acuosa de cloruro de sodio), una solución acuosa de sulfato (una solución acuosa de sulfato de sodio y una solución acuosa de sulfato de amonio), una solución acuosa de sal de agua y ácido fosfórico, y una solución mezclada (agua salobre y agua de mar) (Ejemplos de Prueba 62 a 76) y la fibra de fibroína modificada producida al utilizar agua como líquido de coagulación (Ejemplo de Prueba 77), se observó un efecto excelente de reducción de la relación de contracción relativa al agua, en comparación con la fibra de fibroína modificada producida al utilizar metanol como líquido de coagulación (Ejemplo Comparativo 4), y se obtuvo un resultado excelente inesperado.

En particular, se puede obtener un efecto de mejora de la elongación (véase la Tabla 9), un efecto de mejora de la tenacidad (véase la Tabla 11) y un efecto de reducción de la contracción relativa al contenido de agua (véase la Tabla 13), además de una gran reducción en el coste de producción, al utilizar, como líquido de coagulación, agua, una solución acuosa de cloruro de sodio, una solución acuosa de sulfato de sodio, agua salobre y agua de mar, que son recursos abundantes y económicos.

Como se muestra en la Tabla 14, en todas las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa mezclada de una solución acuosa de cloruro de sodio y ácido fórmico (Ejemplos de Prueba 78 a 80), y las fibras de fibroína modificada producidas al utilizar, como un líquido de coagulación, una solución acuosa mezclada de agua y ácido fórmico (Ejemplos de Prueba 81 a 82), se observó un efecto excelente de reducción de la relación de contracción relativa al agua en cualquier relación de mezcla, en comparación con la fibra de fibroína modificada producida al utilizar metanol como líquido de coagulación (Ejemplo Comparativo 4), y se obtuvo un resultado excelente inesperado. Este resultado muestra que, incluso en un caso en el que el ácido fórmico en la disolución de hilado se disuelve en un líquido de coagulación de agua (Ejemplo de Prueba 77) y un líquido de coagulación de una solución acuosa de cloruro de sodio (Ejemplo de Prueba 65), se observa un efecto excelente de reducción de la relación de contracción relativa al agua.

Ejemplo de referencia 1: prueba de combustión de fibroína modificada

Se agregó un polvo liofilizado de la fibroína modificada (PRT799) a una solución de sulfóxido de dimetilo de cloruro de litio (concentración: 4.0 % en masa) de tal manera que la concentración fuera del 24 % en masa, y luego se disolvió al mezclar utilizando un agitador durante 3 horas. Después, se eliminaron las materias insolubles y las espumas para obtener una solución de fibroína modificada (disolución de hilado).

La disolución de hilado obtenida se calentó a 90 °C y se filtró con un filtro metálico que tenía una abertura de 5 µm. Después de esto, el filtrado se dejó reposar en una jeringa de acero inoxidable de 30 ml para eliminar las espumas. La disolución de hilado resultante se descargó desde una boquilla sólida que tenía un diámetro de aguja de 0.2 mm en un baño de coagulación de metanol al 100 % en masa. La temperatura de descarga fue de 90 °C. Después de completar la coagulación, el hilo original obtenido se enrolló y se secó de forma natural para obtener una fibra de fibroína modificada (fibra de materia prima).

Se produjo un tejido de punto (grosor: 180 denier, número de calibre: 18) al tejer en forma circular un hilo retorcido obtenido al retorcer las fibras de materia prima al utilizar una máquina de tejer circular. Se cortaron 20 g del tejido de punto obtenido y se utilizaron como pieza de prueba.

La prueba de combustión se realizó de acuerdo con el “método de prueba de una resina sintética en partículas o de bajo punto de fusión” especificado en el Aviso No.50 de la Oficina de Regulación de Materiales Peligrosos (31 de mayo de 1995). La prueba se realizó bajo condiciones de una temperatura de 22 °C, una humedad relativa del 45 % y una presión atmosférica de 1,021 hPa. El resultado de la medición (concentración de oxígeno (%), tasa de combustión (%) y tasa de combustión convertida (%)) se muestra en la Tabla 15.

[Tabla 15]

Como resultado de la prueba de combustión, el valor del índice de oxígeno limitante (LOI) del tejido de punto obtenido al tejer las fibras de fibroína modificada (PRT799) fue de 27.2. Se sabe generalmente que un valor de LOI de 26 o más es retardante de llama. El resultado muestra que la fibroína modificada es excelente en cuanto a retardancia de llama.

Ejemplo de referencia 2: evaluación de la propiedad de generación de calor por absorción de humedad de la fibroína modificada

Se agregó un polvo liofilizado de una fibroína modificada a una solución de sulfóxido de dimetilo de cloruro de litio (concentración: 4.0 % en masa) de tal manera que la concentración fuera del 24 % en masa, y luego se disolvió al mezclar con un agitador durante 3 horas. A continuación, se eliminaron las materias insolubles y las espumas para obtener una solución de fibroína modificada (disolución de hilado).

La disolución de hilado obtenida se calentó a 60 °C y se filtró con un filtro de metal que tenía una abertura de 5 µm. A continuación, el filtrado se dejó reposar en una jeringa de acero inoxidable de 30 ml para eliminar las espumas. La disolución de hilado resultante se descargó desde una boquilla sólida que tenía un diámetro de aguja de 0.2 mm en un baño de coagulación de metanol al 100 % en masa. La temperatura de descarga fue de 60 °C. Después de completar la coagulación, el hilo original obtenido se enrolló y se secó de forma natural para obtener una fibra de fibroína modificada (fibra de materia prima).

A modo de comparación, se prepararon fibras de lana, fibras de algodón, fibras de tencel, fibras de rayón y fibras de poliéster disponibles en el comercio como fibra de materia prima.

Se produjo un tejido de punto al tejer por trama cada una de las fibras de materia prima al utilizar una máquina de tejer por trama. El grosor y el número de calibre del tejido de punto formado mediante el uso de fibras PRT918 o fibras PRT799 se muestran en la Tabla 16. El grosor y el número de calibre de cada uno de los tejidos de punto formados al utilizar otras fibras de materia prima se ajustaron de tal manera que tuvieran un factor de cobertura aproximadamente igual al del tejido de punto de la fibra de fibroína modificada. Los detalles son los siguientes.

[Tabla 16]

Se enfrentaron dos piezas de tejido de punto, cada una de ellas cortada con un tamaño de 10 cm x 10 cm, y se cosieron entre sí cuatro lados de las mismas para preparar una pieza de prueba (muestra). La pieza de prueba se dejó reposar en un entorno de baja humedad (temperatura: 20 ± 2 °C, humedad relativa: 40 ± 5 %) durante 4 horas o más, y luego se transfirió a un entorno de alta humedad (temperatura: 20 ± 2 °C, humedad relativa: 90 ± 5 %). Luego, se realizó la medición de la temperatura con un sensor de temperatura adherido al centro del interior de la pieza de prueba durante 30 minutos a intervalos de 1 minuto.

A partir del resultado de la medición, la máxima generación de calor por absorción de humedad se determinó de acuerdo con la siguiente ecuación A.

Ecuación A: máxima generación de calor por absorción de humedad = {(valor máximo de una temperatura de muestra cuando una muestra se coloca en un entorno de baja humedad hasta que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio, y luego se transfiere a un entorno de alta humedad) - (una temperatura de muestra cuando una muestra se coloca en un entorno de baja humedad hasta que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio, y luego se transfiere a un entorno de alta humedad)}(°C)/peso de la muestra (g)

La Fig.5 es un gráfico que muestra un ejemplo del resultado de una prueba de propiedad de generación de calor por absorción de humedad. En el eje horizontal del gráfico, un punto de tiempo en el que la muestra se transfiere de un entorno de baja humedad a un entorno de alta humedad se define como 0, y el eje horizontal representa un período de tiempo durante el cual la muestra se deja reposar en un entorno de alta humedad (min). El eje vertical del gráfico representa una temperatura medida con un sensor de temperatura (temperatura de la muestra). En el gráfico mostrado en la Fig.5, el punto indicado por M corresponde al valor máximo de la temperatura de la muestra.

El resultado del cálculo de la máxima generación de calor por absorción de humedad de cada uno de los tejidos de punto se muestra en la Tabla 16.

[Tabla 17]

La Tabla 17 muestra que las fibroínas modificadas (PRT918 y PRT799) tienen una generación máxima de calor por absorción de humedad alta en comparación con los materiales existentes, y por lo tanto son excelentes en la propiedad de generación de calor por absorción de humedad.

Ejemplo de referencia 3: evaluación de la propiedad de retención de calor de la fibroína modificada

Se agregó un polvo liofilizado de una fibroína modificada a una solución de sulfóxido de dimetilo de cloruro de litio (concentración: 4.0 % en masa) de tal manera que la concentración fuera del 24 % en masa, y luego se disolvió al mezclar con un agitador durante 3 horas. Después, se eliminaron las materias insolubles y las espumas para obtener una solución de fibroína modificada (disolución de hilado).

La disolución de hilado obtenida se calentó a 60 °C y se filtró con un filtro de metal que tenía una abertura de 5 µm. Después, se dejó reposar el filtrado en una jeringa de acero inoxidable de 30 ml para eliminar las espumas. La disolución de hilado resultante se descargó desde una boquilla sólida que tenía un diámetro de aguja de 0.2 mm en un baño de coagulación de metanol al 100 % en masa. La temperatura de descarga fue de 60 °C. Después de completar la coagulación, el hilo original obtenido se enrolló y se secó de forma natural para obtener una fibra de fibroína modificada (fibra de materia prima).

A modo de comparación, se prepararon fibras de lana, fibras de seda, fibras de algodón, fibras de rayón y fibras de poliéster disponibles en el comercio como fibra de materia prima.

Se produjo un tejido de punto al tejer por trama cada una de las fibras de materia prima al utilizar una máquina de tejer por trama. El recuento de hilos, el número de hilos retorcidos, el número de calibre y el peso base del tejido de punto formado al utilizar fibras PRT966 o fibras PRT799 se muestran en la Tabla 18. Cada uno de los tejidos de punto formados al utilizar otras fibras de materia prima se ajustó de tal manera que tuviera un factor de cobertura aproximadamente igual al del tejido de punto de la fibra de fibroína modificada. Los detalles son los siguientes.

[Tabla 18]

La propiedad de retención de calor se evaluó al utilizar un comprobador KES-F7 THERMO LABO II, fabricado por Kato Tech Co., Ltd., de acuerdo con un método de contacto seco (un método en base a la suposición de que la piel y la ropa están en contacto directo en un estado seco). Se utilizó una pieza de tejido de punto cuadrado cortado con un tamaño de 20 cm x 20 cm como pieza de prueba (muestra). La pieza de prueba se colocó sobre una placa calefactora ajustada a una temperatura predeterminada (30 °C), y la cantidad de calor (a) disipada a través de la pieza de prueba se midió bajo una condición de una velocidad del viento de 30 cm/s en un túnel de viento. La cantidad de calor (b) disipada en un estado en el que la pieza de prueba no estaba ajustada se determinó bajo la misma condición como se describió anteriormente. Luego, se calculó la relación de retención de calor (%) de acuerdo con la siguiente Ecuación B.

Ecuación B: relación de retención de calor (%) = (1-a/b) x 100

A partir del resultado de la medición, se determinó el índice de retención de calor de acuerdo con la siguiente Ecuación C.

Ecuación C: índice de retención de calor = relación de retención de calor (%)/peso base de la muestra (g/m<2>) El resultado del cálculo del índice de retención de calor se muestra en la Tabla 18. Un índice de retención de calor más alto se puede evaluar como un material que tiene una propiedad de retención de calor excelente.

[Tabla 19]

La Tabla 19 muestra que las fibroínas modificadas (PRT966 y PRT799) tienen un alto índice de retención de calor en comparación con los materiales existentes y, por lo tanto, son excelentes en la propiedad de retención de calor.

Como se muestra en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, cuando la fibroína modificada es una fibroína de seda de araña modificada, la propiedad de retención de calor, la propiedad de generación de calor por absorción de humedad y/o la resistencia al fuego pueden mejorarse aún más. Se puede obtener una fibra que tiene una propiedad superior de retención de calor, propiedad de generación de calor que absorbe la humedad y/o retardancia de llama, tenacidad y elongación, y que además tiene una relación de contracción reducida relativa al contenido de agua, al utilizar una fibroína de seda de araña modificada como proteína y al utilizar agua o una solución acuosa de pH 0.25 o mayor y pH 10.00 o menor como líquido de coagulación (en particular, una solución acuosa de cloruro de sodio, una solución acuosa de sulfato de sodio, una solución acuosa de sulfato de amonio, una solución acuosa de cloruro de potasio, una solución acuosa de cloruro de calcio, una solución acuosa de formiato de sodio, una solución acuosa de citrato de sodio, una solución acuosa de ácido fórmico, una solución acuosa mezclada de ácido fórmico, agua salobre y agua de mar) para formar una fibra.

Lista de signos de referencia

1 Aparato de extrusión

2 Aparato de producción de hilo no estirado

3 Aparato de estirado por calor húmedo

4 Aparato de secado

6 Disolución de hilado

10 Aparato de hilado

20 Baño de coagulación

21 Baño de lavado

36 Fibra de proteína

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una fibra de proteína (36), el método comprende:

poner una disolución de hilado (6) que contiene una proteína y un solvente orgánico en contacto con un líquido de coagulación (11) para coagular la proteína, en el que el contenido de la proteína en la disolución de hilado (6) es mayor del 10 % en masa en base a una cantidad total de la disolución de hilado (6), y

el líquido de coagulación (11) contiene una solución acuosa de pH 0.25 o mayor y pH 10.00 o menor, en el que la solución acuosa se selecciona del grupo que consiste en solución acuosa de citrato de sodio, solución acuosa de formiato de sodio, solución acuosa de cloruro de sodio, solución acuosa de cloruro de calcio, solución acuosa de sulfato de sodio, solución acuosa de hidrógeno fosfato de potasio, agua salobre, agua de mar y una solución mezclada de los mismos, y en el que el contenido de la sal en el líquido de coagulación (11) es 25 % en masa o menor en base a la cantidad total del líquido de coagulación (11).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el contenido de la solución acuosa en el líquido de coagulación (11) es 60 % en masa o mayor en base a la cantidad total del líquido de coagulación (11).

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la solución acuosa es una solución acuosa de sal, una solución acuosa ácida, o una solución mezclada de las mismas.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la solución acuosa ácida es una solución acuosa de ácido carboxílico.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en el que el contenido de sal en el líquido de coagulación (11) es 0.1 % en masa o mayor en base a la cantidad total del líquido de coagulación (11).

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el contenido del solvente orgánico disuelto a partir de la disolución de hilado (6) en contacto con el líquido de coagulación (11) en el líquido de coagulación (11) es 40 % en masa o menor en base al 100 % en masa del contenido total de la solución acuosa de sal en el líquido de coagulación (11) y el solvente orgánico disuelto en el líquido de coagulación (11).

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el índice de hidropatía promedio de la proteína es mayor que -1.3.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína incluye al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína de seda de araña, proteína de seda, proteína de colágeno, proteína de resilina, proteína de elastina y proteína de queratina.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteína es proteína de queratina o proteína de seda de araña.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína es proteína de seda de araña.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el solvente orgánico incluye al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en ácido fórmico y sulfóxido de dimetilo.