ES2998692T3 - Anti-met antibodies and uses thereof - Google Patents

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ES2998692T3
ES2998692T3 ES22706158T ES22706158T ES2998692T3 ES 2998692 T3 ES2998692 T3 ES 2998692T3 ES 22706158 T ES22706158 T ES 22706158T ES 22706158 T ES22706158 T ES 22706158T ES 2998692 T3 ES2998692 T3 ES 2998692T3
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ES22706158T
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English (en)
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Brian P Fiske
Nimish Gera
Alexander J Nichols
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Mythic Therapeutics Inc
Original Assignee
Mythic Therapeutics Inc
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Abstract

Se proporcionan aquí anticuerpos y usos de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-MET y usos de estos
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con número de serie 63/145.348, presentada el 3 de febrero de 2021.
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere al campo de la biotecnología, y más específicamente, a moléculas de unión a antígenos, tales como anticuerpos.
ANTECEDENTES
Los conjugados anticuerpo-fármaco se han diseñado para combatir una variedad de enfermedades. Una ventaja particular de este enfoque es la capacidad de los conjugados anticuerpo-fármaco de tener efectos citostáticos o citotóxicos. A pesar de los años de desarrollo, se desean mejores conjugados anticuerpo-fármaco. WO2017/201204 describe conjugados anticuerpo-fármaco que se unen al cmEt humano. US2016/161500 describe métodos para cribar un anticuerpo que incluyen medir la presencia o el nivel de unión antígeno-anticuerpo a varios pH y un conjugado anticuerpo-fármaco que contiene el anticuerpo seleccionado. WO2019/189453 describe agentes de unión a cMet monoclonales que se conjugan con toxinas de pirrolobenzodiazepina.
COMPENDIO
La presente invención se basa en el concepto de que pueden generarse anticuerpos que muestran una eficacia mejorada (por ejemplo, uno o más de un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) en la liberación de toxinas en una célula de mamífero diana, un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) en la destrucción de células de mamífero diana, y un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) en la administración endosómica). La presente invención proporciona un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionados del grupo de:
(i) SEQ ID NO 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO 9 y la SEQ ID NO: 10, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente;
(v) SEQ ID NO 13 y la SEQ ID NO 14, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO 15 y la SEQ ID NO 16, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO 17 y la SEQ ID NO 18, respectivamente
(viii) SEQ ID NO 19 y la SEQ ID NO 20, respectivamente
(ix) SEQ ID NO 21 y la SEQ ID NO 22, respectivamente
(x) SEQ ID NO 23 y la SEQ ID NO 24, respectivamente
(xi) SEQ ID NO 25 y la SEQ ID NO 26, respectivamente
(xii) SEQ ID NO 27 y la SEQ ID NO 28, respectivamente
(xiii) SEQ ID NO 29 y la SEQ ID NO 30, respectivamente
(xiv)SEQ ID NO 31 y la SEQ ID NO 32, respectivamente
(xv) SEQ ID NO 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente; y
(b) una secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 189 que comprende uno o más de los siguientes:
(i) una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108;
(ii) una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139;
(iii) una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y
(iv) una sustitución de alanina a una cisteína en la posición de aminoácido 1; y/o
una secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de uno cualquiera de los anticuerpos reivindicados en la presente descripción.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende al menos una dosis del anticuerpo como se reivindica en la presente descripción o la composición farmacéutica como se reivindica en la presente descripción.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la composición farmacéutica como se reivindica en la presente descripción para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el cáncer se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie y en donde se identifica que dicho sujeto tiene un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
En la presente descripción se proporcionan anticuerpos que incluyen: (a) un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionados del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente; y (b) una secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende uno o más de los siguientes: (i) una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; (ii) una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139, (iii) una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido<317; (iv) una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1; y/o una secuencia de>C<l de cadena>ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo<comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 35 y s>E<q ID NO: 41, respectivamente; (ii) s>E<q ID n>O:<43 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv)>S<e>Q<ID NO: 59 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID>NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 131 y<SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ i>D<NO: 147 y SEQ ID n>O:<153, respectivamente.>
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ iD NO: 148 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo<comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 37 y s>E<q ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID n>O:<45 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv)>S<e>Q<ID NO: 61 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID>NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ iD<NO: 149 y SEQ ID n>O:<153, respectivamente.>
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y<108; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína>en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 42, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 50, respectivamente;<(iii) SEQ ID NO: 51 y>S<e>Q<ID NO: 58, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 59 y>S<e>Q<ID NO: 66, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 75 y>S<e>Q<ID NO: 82, respectivamente; (vii)>SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 90, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 98, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 106, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 114, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 122, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 130, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 138, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a<serina en la posición de aminoácido 317; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende>una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y<cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 42, respectivamente; (ii) SEQ i>D NO: 44 y SEQ ID NO: 50, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 58, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 66, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 82, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 90, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 98, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 106, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 114, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 122, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 130, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 138, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido<139; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína>en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 42, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 50, respectivamente;<(iii) SEQ ID NO: 53 y>S<e>Q<ID NO: 58, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 61 y>S<e>Q<ID NO: 66, respectivamente; (v) s>E<q ID NO: 69 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 77 y>S<e>Q<ID NO: 82, respectivamente; (vii)>SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 90, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 98, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 106, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 114, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 122, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 130, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 138, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: aminoácido una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones 106 y 108; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ iD NO: 46 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 134 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 39 y<SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii)>S<e>Q<ID NO: 47 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 55 y>SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 135 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) NO: 72 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende además un fármaco citotóxico conjugado a uno o más de los siguientes: (a) una CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende uno o más de los siguientes: (i) la cisteína en la posición de aminoácido 103; (ii) la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105; (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109; y (iv) la cisteína en la posición de aminoácido 112; y/o (b) la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende además un agente citotóxico o citostático conjugado a la cisteína en la posición 98 de la SEQ ID NO: 158.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende además un agente citotóxico o citostático conjugado a la cisteína en la posición 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el agente citotóxico o citostático es una toxina conjugada, un radioisótopo, fármaco, o una molécula pequeña.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, (a) la tasa de disociación del anticuerpo a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es más rápida que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0; o (b) la constante de disociación (K<d>) del anticuerpo a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es mayor que la K<d>a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que comprende el anticuerpo: proporciona uno o más de: un aumento en la liberación de toxinas en una célula de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control; un aumento en la destrucción de células de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control; y un aumento en la administración endolisosómica en la célula de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que comprende el anticuerpo: da como resultado una reducción en el nivel de MET presentado en la superficie de una célula de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control; o no da como resultado una reducción detectable en el nivel de MET presentado en la superficie de la célula de mamífero diana.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo se degrada en una célula de mamífero diana después de la internalización del anticuerpo por una célula de mamífero diana. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la célula de mamífero diana es una célula cancerosa. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es citotóxico o citostático a la célula de mamífero diana. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene una avidez que da como resultado una mayor selectividad para las células cancerosas sobre las células no cancerosas.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene: reactividad cruzada con un MET de primate no humano y un MET humano; o reactividad cruzada con un MET de primate no humano, un MET humano, y uno o ambos de MET de rata y un MET de ratón. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la semivida del anticuerpo in vivo aumenta en comparación con la semivida de un anticuerpo de control in vivo.
También se proporcionan en la presente descripción composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. También se proporcionan en la presente descripción kits que incluyen al menos una dosis de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción. Cualquier referencia en esta descripción a métodos de tratamiento debe interpretarse como una referencia a los compuestos, composición farmacéutica y medicamentos correspondientes para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para reducir el volumen de un tumor en un sujeto, donde el tumor se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para inducir la muerte celular en una célula cancerosa en un sujeto, en donde la célula cancerosa tiene MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener una población de las células cancerosas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis o disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis adicional en un sujeto que tiene un cáncer, donde el cáncer se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
También se describen en la presente descripción anticuerpos que incluyen: (a) dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en: (i) la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 161 y la SEQ ID NO: 162, respectivamente; y (iii) SEQ ID NO: 163 y la SEQ ID NO: 164; respectivamente; y (b) una secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende una o más de las siguientes sustituciones: (i) una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de un aminoácido de treonina en las posiciones 106 y 108; (ii) una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139, (iii) una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; (iv) una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1; y/o una secuencia de C<l>de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición 98.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ iD NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 174 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y la secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 incluye una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 172, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 180, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 188, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y la secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 incluye una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 166 y Se Q ID NO: 172, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 174 y SEQ ID NO: 180, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 188, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y la secuencia de C<l>de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 incluye una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 172, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 180, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 188, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 168 y SEQ<i>D NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ<i>D NO: 176 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 187, respectivamente. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 169 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 177 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 185 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 incluye: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de: (i) la SEQ ID NO: 170 y SEQ iD NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ iD NO: 178 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 186 y SEQ ID NO: 187, respectivamente. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende además un fármaco citotóxico conjugado a uno o más de los siguientes: (a) una CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende uno o más de los siguientes: (i) la cisteína en la posición de aminoácido 103; (ii) la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105; (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109; (iv) la cisteína en la posición de aminoácido 112; y/o (b) la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende además un agente citotóxico o citostático conjugado a la cisteína en la posición 98 de la SEQ ID NO: 158. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende además un agente citotóxico o citostático conjugado a la cisteína en la posición 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el agente citotóxico o citostático es una toxina conjugada, un radioisótopo, fármaco, o una molécula pequeña. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es citotóxico o citostático a una célula de mamífero diana. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo se degrada en la célula de mamífero diana después de la internalización del anticuerpo por la célula de mamífero diana. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la célula de mamífero diana es una célula cancerosa. En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene una avidez que da como resultado una mayor selectividad para las células cancerosas sobre las células no cancerosas.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene: reactividad cruzada con un MET de primate no humano y un MET humano; o reactividad cruzada con un MET de primate no humano, un MET humano, y uno o ambos de MET de rata y un MET de ratón.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la semivida del anticuerpo in vivo aumenta en comparación con la semivida de un anticuerpo de control in vivo.
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la célula de mamífero diana es una célula cancerosa.
También se proporcionan en la presente descripción composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. También se proporcionan en la presente descripción kits que incluyen al menos una dosis de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para tratar un cáncer caracterizado por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie que incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para reducir el volumen de un tumor en un sujeto, donde el tumor se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para inducir la muerte celular en una célula cancerosa en un sujeto, en donde la célula cancerosa tiene MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener una población de las células cancerosas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis o disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis adicional en un sujeto que tiene un cáncer, donde el cáncer se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
Un “dominio de unión a antígenos” es uno o más dominios de proteínas (por ejemplo, formados a partir de aminoácidos de un único polipéptido o formados a partir de aminoácidos de dos o más polipéptidos (por ejemplo, el mismo o diferentes polipéptidos) que son capaces de unirse específicamente a uno o más antígenos diferentes. En algunos ejemplos, un dominio de unión a antígenos puede unirse a un antígeno o epítopo con especificidad y afinidad similares a los de los anticuerpos naturales. En algunas modalidades, el dominio de unión a antígenos puede ser un anticuerpo o un fragmento de este. En algunas modalidades, un dominio de unión a antígenos puede incluir una plantilla alternativa. En la presente descripción se describen ejemplos no limitantes de dominios de unión a antígenos. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de dominios de unión a antígenos. En algunos ejemplos, un dominio de unión a antígenos puede unirse a un único antígeno.
El término “anticuerpo” se usa en la presente descripción en su sentido más amplio e incluye ciertos tipos de moléculas de inmunoglobulina que incluyen uno o más dominios de unión a antígenos que se unen específicamente a un antígeno o epítopo. Un anticuerpo incluye específicamente, por ejemplo, anticuerpos intactos (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas, por ejemplo, IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana)), fragmentos de anticuerpos, y anticuerpos multiespecíficos. Un ejemplo de un dominio de unión a antígenos es un dominio de unión a antígenos formado por un dímero VH -VL. En la presente descripción se describen ejemplos adicionales de un anticuerpo. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de un anticuerpo.
La frase “vía endosómica/lisosómica” se refiere a una red de endosomas (endosomas tempranos, cuerpos multivesiculares, endosomas tardíos, y lisosomas) en el citoplasma de una célula de mamífero, en donde se ordenan las moléculas internalizadas a través de procesos de internalización mediada por células, por ejemplo, pinocitosis, micropinocitosis, endocitosis mediada por receptores, y/o fagocitos.
Una vez que los endosomas en la vía endosómica/lisosómica se purifican o se aíslan, los ensayos para una proteína diana (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente descripción) pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica (ELISA, inmunoelectrotransferencia, inmunofluorescencia, e inmunoprecipitación seguidos de un ensayo para la concentración de proteínas), y pueden usarse para determinar la concentración o el nivel relativo de la proteína diana en los endosomas. Como alternativa, pueden tomarse imágenes de los endosomas en la vía endosómica/lisosómica usando microscopía de inmunofluorescencia usando un anticuerpo marcado de manera detectable (por ejemplo, un anticuerpo marcado con fluoróforo, marcado con colorante, o marcado con GFP, por ejemplo, CellLight™ Early Endosome-GFP) que se une específicamente a una proteína característica presente en los endosomas (por ejemplo, EEA1 para endosomas tempranos) y un anticuerpo marcado con fluoróforo que se une específicamente a la proteína de interés (por ejemplo, un anticuerpo), y el nivel de la proteína diana en los endosomas puede determinarse mediante la cuantificación de la superposición en las emisiones de fluorescencia de los dos anticuerpos diferentes.
La frase “administración endolisosómica” se refiere a la tasa de acumulación a lo largo del tiempo o la acumulación total en un punto temporal específico de un anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) en la vía endosómica/lisosómica en una célula de mamífero (por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero diana ilustrativas descritas en la presente descripción).
Un ensayo ilustrativo para medir la administración endolisosómica de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción incluye aquellas que implican el marcado de un anticuerpos con un tinte fluorescente, seguido de la incubación del anticuerpo etiquetado con células y la medición de la fluorescencia celular como un indicador de la administración endolisosómica del anticuerpo (por ejemplo, como se describe generalmente en Wustner,Traffic7(6):699-715, 2006). Alternativamente, los tintes sensibles al pH que preferentemente fluorescen a pH ácido pero no a pH neutro pueden usarse para etiquetar cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, que luego pueden incubarse con células y la fluorescencia celular medida como un indicador de la administración del anticuerpo en compartimentos endolisosómicos ácidos.
El término “población” cuando se usa antes de un sustantivo significa dos o más del sustantivo específico. Por ejemplo, la frase “una población de células cancerosas” significa “dos o más células cancerosas”. En la presente descripción se describen ejemplos no limitantes de células cancerosas.
La frase “citostática a una célula” se refiere a una disminución directa o indirecta en la proliferación (división celular) de la célula (por ejemplo, una célula cancerosa)in vivooin vitro.Cuando un agente es citostático a una célula, el agente puede, por ejemplo, dar como resultado directa o indirectamente la detención del ciclo celular de la célula (por ejemplo, una célula cancerosa). En algunos ejemplos, un agente que es citostático a una célula puede reducir la cantidad de células en una población de las células que están en fase S (en comparación con la cantidad de células en una población de las células que están en fase S antes del contacto con el agente). En algunos ejemplos, un agente que es citostático a una célula puede reducir el porcentaje de las células en la fase S en al menos 20 %, al menos 40 %, al menos 60 %, o al menos 80 % (por ejemplo, en comparación con el porcentaje de células en una población de las células que están en la fase S antes del contacto con el agente).
La frase “citotóxico para una célula” se refiere al incentivo, directa o indirectamente, en la muerte (por ejemplo, necrosis o apoptosis) de la célula (por ejemplo, una célula de mamífero, por ejemplo, una célula cancerosa).
“Afinidad” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión a antígenos y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno o epítopo). A menos que se indique de cualquier otra manera, como se usa en la presente descripción, “afinidad” se refiere a la afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un dominio de unión a antígenos y un antígeno o epítopo. La afinidad de una molécula X por su compañera Y puede representarse mediante la constante de equilibrio de disociación (K<d>). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en la presente descripción. La afinidad puede determinarse, por ejemplo, usando tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) (por ejemplo, BIACORE®) o interferometría de biocapa (por ejemplo, FORTEBIO®). Los métodos adicionales para determinar la afinidad para un dominio de unión a antígenos y su antígeno o epítopo correspondiente se conocen en la técnica.
El término “epítopo” significa una porción de un antígeno que se une específicamente a un dominio de unión a antígenos a través de un conjunto de interacciones físicas entre: (i) todos los monómeros (por ejemplo, residuos de aminoácidos individuales, cadenas laterales de azúcar, y residuos de aminoácidos modificados de forma postraduccional) en la porción del dominio de unión a antígenos que se une específicamente al antígeno y (ii) todos los monómeros (por ejemplo, residuos de aminoácidos individuales, cadenas laterales de azúcar, residuos de aminoácidos modificados de forma postraduccional) en la porción del antígeno que se une específicamente al dominio de unión a antígenos. Los epítopos pueden consistir, por ejemplo, en residuos de aminoácidos accesibles a la superficie, cadenas laterales de azúcar, residuos de aminoácidos fosforilados, residuos de aminoácidos metilados, y/o residuos de aminoácidos acetilados y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero, pero no al segundo, puede perderse en presencia de disolventes desnaturalizantes. En algunas modalidades, un epítopo se define por una secuencia de aminoácidos lineal de al menos aproximadamente 3 a 6 aminoácidos, o aproximadamente 10 a 15 aminoácidos. En algunas modalidades, un epítopo se refiere a una porción de una proteína de longitud completa o una porción de esta que se define por una estructura tridimensional (por ejemplo, pliegue de proteínas). En algunas modalidades, un epítopo se define por una secuencia de aminoácidos discontinua que se une mediante pliegue de proteínas. En algunas modalidades, un epítopo se define por una secuencia de aminoácidos discontinua que se une por la estructura cuaternaria (por ejemplo, una hendidura formada por la interacción de dos cadenas polipeptídicas diferentes). Las secuencias de aminoácidos entre los residuos que definen el epítopo pueden no ser críticas para la estructura tridimensional del epítopo. Un epítopo conformacional puede determinarse y cribarse usando ensayos que comparan la unión de un anticuerpo con una versión desnaturalizada del antígeno, de manera que se genera un epítopo lineal. Un epítopo puede incluir residuos de aminoácidos que están directamente involucrados en la unión, y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente involucrados en la unión.
Los métodos para identificar un epítopo al cual se une específicamente un dominio de unión a antígenos se conocen en la técnica, por ejemplo, análisis basado en estructuras (por ejemplo, cristalografía de rayos X, RMN, y/o microscopía electrónica) (por ejemplo, en el antígeno y/o el complejo de dominio de unión antígeno-antígeno) y/o análisis basado en mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis de barrido de alanina, mutagénesis de barrido de glicina, y mutagénesis de barrido de homología) en donde los mutantes se miden en un ensayo de unión con un compañero de unión, muchos de los cuales se conocen en la técnica.
El término “parátopo” significa una porción de un dominio de unión a antígenos que se une específicamente a un antígeno a través de un conjunto de interacciones físicas entre: (i) todos los monómeros (por ejemplo, residuos de aminoácidos individuales, cadenas laterales de azúcar, residuos de aminoácidos modificados de forma postraduccional) en la porción del dominio de unión a antígenos que se unen específicamente al antígeno y (ii) todos los monómeros (por ejemplo, residuos de aminoácidos individuales, cadenas laterales de azúcar, residuos de aminoácidos modificados de forma postraduccional) en la porción del antígeno que se unen específicamente al dominio de unión a antígenos. Los parátopos pueden consistir, por ejemplo, en residuos de aminoácidos accesibles a la superficie y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. En algunas modalidades, un parátopo se refiere a una porción de un dominio de unión a antígenos de longitud completa o una porción de esta que se define por una estructura tridimensional (por ejemplo, pliegue de proteínas). En algunas modalidades, un parátopo se define por una secuencia de aminoácidos discontinua que se une mediante pliegue de proteínas. En algunas modalidades, un epítopo se define por una secuencia de aminoácidos discontinua que se une por la estructura cuaternaria (por ejemplo, una hendidura formada por la interacción de dos cadenas polipeptídicas diferentes). Las secuencias de aminoácidos entre los residuos que definen el parátopo pueden no ser críticas para la estructura tridimensional del parátopo. Un parátopo puede comprender residuos de aminoácidos que están directamente involucrados en la unión, y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente involucrados en la unión.
Los métodos para identificar un parátopo al cual se une específicamente un dominio de unión a antígenos se conocen en la técnica, por ejemplo, análisis basado en estructuras (por ejemplo, cristalografía de rayos X, RMN, y/o microscopía electrónica) (por ejemplo, en el dominio de unión a antígenos y/o el complejo dominio-antígeno de unión a antígenos) y/o análisis basado en mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis de barrido de alanina, mutagénesis de barrido de glicina, y mutagénesis de escaneo de homología) en donde los mutantes se miden en un ensayo de unión con un compañero de unión, muchos de los cuales se conocen en la técnica.
La frase “presente en la superficie de una célula de mamífero” significa (1) un antígeno que se une físicamente o se incorpora al menos parcialmente en la membrana plasmática de una célula de mamífero (por ejemplo, una proteína transmembrana, una proteína de membrana periférica, una proteína anclada a lípidos (por ejemplo, un anclaje GPI), una proteína N-miristolizada, o una proteína S-palmitoilada) o (2) un antígeno que se une de manera estable a su receptor cognado, donde el receptor cognado se une físicamente a la membrana plasmática de una célula de mamífero (por ejemplo, un ligando unido a su receptor cognado, donde el receptor cognado está físicamente unido a la membrana plasmática). Los métodos no limitantes para determinar la presencia de antígeno en la superficie de una célula de mamífero incluyen clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica, ensayos de fraccionamiento celular e inmunoelectrotransferencia.
La frase “anticuerpo de control” significa (i) un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a MET o un epítopo de MET presentado en la superficie de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de mamífero diana), donde una o ambas de las siguientes afirmaciones son verdaderas: (a) la tasa de disociación del primer dominio de unión a antígenos a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) no es más de 3 veces (por ejemplo, no más de 2,8 veces, no más de 2,6 veces, no más de 2,5 veces, no más de 2,4 veces, no más de 2,2 veces, no más de 2,0 veces, no más de 1,8 veces, no más de 1,6 veces, no más de 1,5 veces, no más de 1,4 veces, no más de 1,2 veces, no más de 1,0 veces, no más de 0,8 veces, no más de 0,6 veces, no más de 0,5 veces, no más de 0,4 veces, no más de 0,3 veces, no más de 0,2 veces, o no más de 0,1 veces) más rápida que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango<descrito en la presente); o (b) la constante de disociación>(K<d>)<del primer dominio de unión a antígenos a un pH de>aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) no es más de 3 veces (por ejemplo, no más de 2,8 veces, no más de 2,6 veces, no más de 2,5 veces, no más de 2,4 veces, no más de 2,2 veces, no más de 2,0 veces, no más de 1,8 veces, no más de 1,6 veces, no más de 1,5 veces, no más de 1,4 veces, no más de 1,2 veces, no más de 1,0 veces, no más de 0,8 veces, no más de 0,6 veces, no más de 0,5 veces, no más de 0,4 veces, no más de 0,3 veces, no más de 0,2<veces, o no más de 0,1 veces) mayor que la>K<d a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por>ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción); y/o (ii) telisotuzumab; (iii) emibetuzumab; y/o (iv) P3D12.
El término “espacio extracelular” significa el líquido exterior a la membrana plasmática de una célula de mamífero. Cuando una célula de mamífero esin vitro,el espacio extracelular puede ser un medio de cultivo líquido. Cuando una célula de mamífero esin vivo,el espacio extracelular puede ser, por ejemplo, plasma, suero, sangre, líquido intersticial o linfa.
El término “espacio endolisosómico” significa el líquido encapsulado por las vesículas y organelos que componen la vía endosómica/lisosómica en una célula de mamífero.
La frase “un nivel reducido” o “un nivel disminuido” puede ser una reducción o disminución de al menos un 1 % (por ejemplo, al menos 2 %, al menos 4 %, al menos 6 %, al menos 8 %, al menos 10 %, al menos 12 %, al menos 14 %, al menos 16 %, al menos 18 %, al menos 20 %, al menos 22 %, al menos 24 %, al menos 26 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 %) de reducción en comparación con un nivel o valor de referencia.
El término “potencia de destrucción de células” se refiere a la capacidad de un agente (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) de inducir, directa o indirectamente, la apoptosis y/o necrosis de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula cancerosa), medida como una tasa a lo largo del tiempo o en un punto cronológico relevante. Los métodos para determinar la potencia de destrucción celular de una célula se conocen en la técnica (por ejemplo, tinción con azul de tripano, microscopía, clasificación celular asistida por fluorescencia, y ensayos para detectar marcadores de apoptosis (por ejemplo, anexina V)). En ejemplos no limitantes, la potencia de destrucción celular puede medirse, por ejemplo, mediante la destrucción celular a una concentración única de un agente, mediante la IC50 del agente (es decir, la concentración del agente mediante la cual se alcanza la mitad de la potencia de destrucción celular máxima), o mediante la relación de la constante de disociación KD de un agente en células de mamífero dividida por su IC50. En algunos ejemplos no limitantes, las IC50 y/o las relaciones KD descritas en la presente descripción se comparan con aquellas de un anticuerpo de control (como se define en la presente descripción), y, opcionalmente, demuestran que los anticuerpos descritos en la presente descripción tienen una potencia de destrucción celular mayor en comparación con el anticuerpo de control.
El término “liberación de toxinas” se refiere a la capacidad de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de mamífero no cancerosa o una célula cancerosa) de internalizar (por ejemplo, a través de pinocitosis y/o endocitosis mediada por receptores) cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos o anticuerpos de control descritos en la presente descripción) que se conjugan con una toxina, y liberar posteriormente la toxina conjugada al anticuerpo, medida como una tasa a lo largo del tiempo 0 en un punto cronológico específico. La liberación de toxinas puede evaluarse usando una variedad de ensayos ilustrativos diferentes, por ejemplo, ELISA, inmunofluorescencia, ensayos de destrucción celular, ensayos de detención del ciclo celular, ensayos de daño en el ADN, espectrometría de masas, HPLC, y/o una toxina marcada con isótopos.
La frase “célula diana” o “célula de mamífero diana” o “célula diana de mamífero” significa una célula de mamífero que tiene al menos un MET presente en su superficie. En algunos ejemplos, una célula de mamífero diana puede ser una célula cancerosa. En algunas modalidades una célula de mamífero diana puede tener un total de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 10 a 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aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 50 a 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aproximadamente 100 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 4000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500, de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 4000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 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45.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente
20.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 4000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 8.000. 000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente
2000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 5000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 4000, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 3000, de aproximadamente 3000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 3000 a aproximadamente 9.000. 000, de aproximadamente 3000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 3000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 3000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente
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aproximadamente 35.000, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 4000 a aproximadamente 5000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente
5000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 3.000. 000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 65.000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 55.000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 45.000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 35.000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 25.000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 15.000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7500, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 65.000, aproximadamente 7500 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 55.000, aproximadamente 7500 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 45.000, aproximadamente 7500 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 35.000, aproximadamente 7500 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 25.000, aproximadamente 7500 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 7500 a aproximadamente 15.000, aproximadamente 7500 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 15.000 a
aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 5.000. 000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 20.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 210.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 25.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 50,000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 5.000. 000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 30.000 a
aproximadamente 400.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 35.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 7.000. 000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 40.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 45.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 2.000. 000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 45.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 50.000 a
aproximadamente 600.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 55.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 8.000. 000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 1.000. 000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 65.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 4.000. 000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 75.000, de aproximadamente 65.000 a aproximadamente 70.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 90.000, de aproximadamente 70.000 a aproximadamente 80.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 7.000. 000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 80.000
a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 90.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 4.000. 000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 100.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 10.000. 000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 3.000. 000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 200.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 10.000. 000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 3.000. 000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 400.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 9.000. 000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 2.000. 000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 400.000 a aproximadamente 600.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 7.000. 000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 600.000 a aproximadamente 800.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 4.000. 000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 2.000.000, de aproximadamente 800.000 a aproximadamente 1.000.000, de aproximadamente 1.000. 000,a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 7.000. 000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 2.000. 000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 4.000.000, de aproximadamente 2.000.000 a aproximadamente 3.000.000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 9.000. 000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 3.000.000 a aproximadamente 4.000. 000, de aproximadamente 4.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 4.000.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 4.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 4.000.000 a aproximadamente 7.000.000, de aproximadamente 4.000.000 a aproximadamente 6.000. 000, de aproximadamente 4.000.000 a aproximadamente 5.000.000, de aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 7.000. 000, de aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 6.000.000, de aproximadamente 6.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 6.000.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 6.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 6.000.000 a aproximadamente 7.000. 000, de aproximadamente 7.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 7.000.000 a aproximadamente 9.000.000, de aproximadamente 7.000.000 a aproximadamente 8.000.000, de aproximadamente 8.000.000 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 8.000.000 a aproximadamente 9.000. 000, o de aproximadamente 9.000.000 a aproximadamente 10.000.000 del MET presente en la membrana plasmática de la célula de mamífero diana.
La frase “densidad del antígeno” significa la cantidad de MET presente en la superficie de una célula de mamífero diana o la cantidad promedio de MET en la superficie de una población de un tipo particular de células de mamífero diana. Puede medirse, por ejemplo, usando el kit de esfera Quantibright o radioetiqueta (por ejemplo, el kit de cuantificación de fluorescencia de ficoeritrina de BD Biosciences PE, núm. de catálogo 340495).
La frase “aminoácido sustituido con una histidina” significa la sustitución de un residuo de aminoácido que no es histidina en una secuencia de polipéptidos de referencia con una histidina. En la presente descripción se describen métodos no limitantes para sustituir un residuo de aminoácido en un polipéptido de referencia con una histidina. Se conocen en la técnica métodos adicionales para sustituir un residuo de aminoácido en un polipéptido de referencia con una histidina.
La frase “aminoácido sustituido con una alanina” significa la sustitución de un residuo de aminoácido que es histidina en una secuencia de polipéptidos de referencia con una alanina. En la presente descripción se describen métodos no limitantes para sustituir una histidina en un polipéptido de referencia con una alanina. Se conocen en la técnica métodos adicionales para sustituir una histidina en un polipéptido de referencia con una alanina.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Los métodos y materiales se describen en la presente descripción para su uso en la presente invención; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. En caso de conflicto, regirá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.
Otras ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figuras. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
Figuras 1A-C: Internalización y administración endolisosómica de variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de EMIIBETUZUMAB y P3D12 en células Detroit 562.MYT4826 (EMIBETUZUMAB) y MYT4325 (P3D12), variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena pesada, se analizaron para detectar la internalización en células Detroit 562 usando un reactivo de marcado de anticuerpos rojo Incucyte Human FabFluor-pH en el punto cronológico indicado y la concentración final de ABPC. Los aumentos en veces en la internalización y la administración endolisosómica se indican mediante los números que se encuentran por encima de cada variante. Todas las variantes incluyen el formato de sustitución de TH y YTE.
Figura 2: Unión de variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de TELISOTUZUMAB a MET mediante interferometría de biocapa.Las variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena pesada de MYT4953, se capturaron en biosensores Fc antihumano y se asociaron con MET a un pH de 7,4. La disociación fue a pH 7,4 (traza negra) o de pH 5,4 (traza gris). Todas las variantes incluyen el formato de sustitución de TH y YTE.
Figuras 3A a 3C: Unión de variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de P3D12 a MET mediante interferometría de biocapa. MYT4312, MYT4313, y MYT4325, variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena pesada, se capturaron en biosensores Fc antihumano y se asociaron con MET a un pH bajo o pH alto, como se especifica en las figuras. Todas las variantes incluyen el formato de sustitución de TH y YTE.
Figuras 4A a 4D: Unión de variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de P3D12 y emibetuzumab a MET mediante interferometría de biocapa.MYT5344, MYT5351, MYT5367, y MYT4826, variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de cadenas ligera y pesada emparejadas, que combinan variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de cadena ligera o variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena ligera con variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de cadena pesada o variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena pesada, se capturaron en biosensores Fc antihumano y se asociaron con MET a un pH de 7,4. La disociación fue a pH 7,4 (traza negra) o de pH 5,4 (traza gris). Todas las variantes incluyen el formato de sustitución de TH y YTE.
Figura 5: Tabla de diferentes anticuerpos evaluados con las secuencias de cadena ligera y pesada variables enumeradas.
Figura 6: Internalización y administración endolisosómica de variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de variantes MYT en células Detroit 562
MYT4826 , MYT4827, MYT4837, MYT4325, MYT5351, MYT4312, MYT5309, MYT4849, MYTH4888, MYT5344, MYT4313, MYT5367, MYT4942, MYT4953, y MYT4940, variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena pesada, se analizaron para detectar la internalización en células Detroit 562 usando un reactivo de marcado de anticuerpos rojo Incucyte Human FabFluor-pH en el punto cronológico indicado y la concentración final del anticuerpo. Los aumentos en veces en la internalización y la administración endolisosómica se indican mediante los números que se encuentran junto a cada variante. Todas las variantes incluyen el formato de sustitución de TH y YTE.
Figuras 7A-G: Unión de variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina a MET mediante interferometría de biocapa
MYT4940, MYT4942, MYT4888, MYT4827, MYT4837, MYT4849, y MYT5309, variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de cadenas ligera y pesada emparejadas, que combinan variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de cadena ligera o variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena ligera con variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de cadena pesada o variantes de escaneo de alanina y escaneo de histidina de combinación de cadena pesada, se capturaron en biosensores Fc antihumano y se asociaron con MET a un pH de 7,4. El rastro negro representa el pH 7,4, el rastro rojo representa la asociación a 7,4 y después la disociación a un pH 6,4, y el rastro naranja representa el pH 6,4 Todas las variantes incluyen el formato de sustitución TH e YTE.
DESCRIPCION DETALLADA
La información técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la descripción de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier información técnica adicional que no entre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención.
Se describen en la presente descripción anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a MET o un epítopo de MET presentado en la superficie de una célula de mamífero diana, donde: (a) la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es más rápida que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0; y/o (b) la constante de disociación (K<d>) a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es mayor que la K<d>a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. En algunos ejemplos de estos anticuerpos, el anticuerpo se degrada en la célula de mamífero diana después de la internalización del anticuerpo por la célula de mamífero diana. Algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden incluir además una toxina conjugada, radioisótopo, fármaco, o molécula pequeña (por ejemplo, un fluoróforo o tinte).
También se describen anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a MET o un epítopo de MET presentado en la superficie de una célula de mamífero diana; y una toxina conjugada, radioisótopo, fármaco, o molécula pequeña, donde: (a) la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es más rápida que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0; y/o la constante de disociación (K<d>) a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es mayor que la K<d>a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0; y (b) una composición que incluye el anticuerpo proporciona uno o más (por ejemplo, dos o tres) de: un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) en la liberación de toxinas en la célula de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control; un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) en la destrucción de células de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control; y un aumento (por ejemplo, una cantidad detectable) en la administración endolisosómica en la célula de mamífero diana en comparación con una composición que comprende la misma cantidad de un anticuerpo de control. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera de telisotuzumab y/o más sustituciones en el dominio CH1-CH2-CH3 de cadena pesada y/o el dominio C<l>de telisotuzumab. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo incluye un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera de emibetuzumab y una o más sustituciones de aminoácidos en el dominio CH1-CH2-CH3 pesado y/o el dominio C<l>de emibetuzumab. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo incluye un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera de anti-cMET P3D12 y una o más sustituciones de aminoácidos en el dominio CH1-CH2-CH3 pesado y/o el dominio C<l>de P3D12-cMet.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionados del grupo de: (i) la Se Q ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; (iii) SEQ iD NO: 9 y SEQ ID No : 10, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 11 y Se Q ID NO: 12, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente; y (b) una secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende uno o más de los siguientes: (i) una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; (ii) una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139, (iii) una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; (iv) una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1; y/o una secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 43 y SEQ<i>D NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 57, respectivamente (iv) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) s Eq ID NO: 67 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) Se Q ID NO: 75 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 153, respectivamente. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 44 y SEQ iD NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 52 y s Eq ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 60 y S<e>Q ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ ID N<o>: 148 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 53 y Se Q ID NO: 57, respectivamente (iv) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv). la SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153, respectivamente. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y la secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 42, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 50, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 58, respectivamente (iv) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 66, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 82, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 90, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 98, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 106, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 114, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 122, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 130, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 138, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o (xv) la SEQ ID No : 147 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a<serina en la posición de aminoácido 317; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende>una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ
ID NO: 36 y SEQ ID NO: 42, respectivamente;(ii) SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 50, respectivamente; (iii) SEQ ID
NO: 52 y SEQ ID NO: 58, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 66, respectivamente; (v) SEQ ID
NO: 68 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 82, respectivamente; (vii) SEQ ID
NO: 84 y SEQ ID NO: 90, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 98, respectivamente; (ix) SEQ ID
NO: 100 y SEQ ID NO: 106, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 114, respectivamente; (xi) SEQ
ID NO: 116 y SEQ ID NO: 122, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 130, respectivamente; (xiii)
SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 138, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 146, respectivamente;
<o (xv) la SEQ ID>N<o>:<148 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.>
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y
108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido
<139; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína>en la posición de aminoácido 98. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 42, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 50, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 58, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 66, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 82, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 90,<respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 98, respectivamente; (ix)>S<e>Q<ID NO: 101 y SEQ ID NO: 106,>respectivamente; (x) SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 114, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO:
122, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 130, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 133 y SEQ ID
<NO: 138, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o (xv) la SEQ ID>N<o>:<149 y>
SEQ ID NO: 154, respectivamente.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y
108; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i)<la SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 46 y SEQ i>D<NO: 49, respectivamente; (iii)>
SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v)
SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii)
SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix)
SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 134 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y
108; una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 47<y SEQ iD NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 55 y>S<e>Q<ID NO: 57, respectivamente; (iv)>S<e>Q<ID NO: 63 y>
<SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v)>S<e>Q<ID NO: 71 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 79 y>
SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 95 y
SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO:
127 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 135 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID
<NO: 143 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ ID>N<o>:<151 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.>
En algunos ejemplos de cualquiera de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 65, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 129, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 137, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 144 y<SEQ ID NO: 145, respectivamente; o (xv) la SEQ i>D<NO: 152 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.>
En algunas modalidades, (a) la tasa de disociación del anticuerpo a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 no es más rápida que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a<aproximadamente 8,0; o (b) la constante de disociación>(K<d>)<del anticuerpo a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 es mayor que la>K<d a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0.>
En estos ejemplos, el anticuerpo comprende (a) dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en: (i) la SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 160,<respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 161 y>S<e>Q<ID NO: 162, respectivamente; (iii) SEQ ID n>O:<163 y SEQ ID NO:>164; respectivamente; (b) una secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende una o más de las siguientes sustituciones: (i) una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de un aminoácido de treonina en las posiciones 106 y 108; (ii) una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139, (iii) una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y (iv) una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1; y/o<una secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína>en la posición 98.
En tales ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una<treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la s>E<q ID NO: 155 o SEQ ID n>O:<189. En algunos>ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 171,<respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID n>O:<181 y SEQ ID NO:>187, respectivamente.
En algunos ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317. En algunos ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 174 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
En algunos ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una<treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157>comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunos ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 172, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 180, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 188, respectivamente.
En algunos ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a cisteína en la posición de<aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y la secuencia de>C<l>de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunos ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 166 y SEQ ID<NO: 172, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 174 y SEQ ID n>O:<180, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 182 y>SEQ ID NO: 188, respectivamente.
En algunos ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de<treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y la secuencia de>C<l de cadena ligera de la SEQ ID>NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98. En algunos ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 172, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 180, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 188, respectivamente.
En tales ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En tales ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 168 y<SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 176 y>S<e>Q<ID NO: 179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID NO:>184 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
En algunos ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a cisteína en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunos ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO: 169 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 177 y SEQ ID NO:<179, respectivamente; o (iii) la SEQ ID n>O:<185 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.>
En algunos ejemplos, la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1. En algunos ejemplos, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera son: (i) la SEQ ID NO:<170 y SEQ ID NO: 171, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 178 y SEQ ID n>O:<179, respectivamente; o (iii) la SEQ>ID NO: 186 y SEQ ID NO: 187, respectivamente.
También se proporcionan en la presente descripción composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. También se proporcionan en la presente descripción métodos para tratar a un sujeto que lo necesita que incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción al sujeto.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye el anticuerpo (p. ej., cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) puede proporcionar un aumento (p. ej., un aumento detectable) (p. ej., al menos un aumento de 1 %, al menos un aumento de 2 %, al menos un aumento de 5 %, al menos un aumento de 10 %, al menos un aumento de 15 %, al menos un aumento de 20 %, al menos un aumento de 25 %, al menos un aumento de 30 %, al menos un aumento de 35 %, al menos un aumento de 40 %, al menos un aumento de 45 %, al menos un aumento de 50 %, al menos un aumento de 55 %, al menos un aumento de 60 %, al menos un aumento de 65 %, al menos un aumento de 70 %, al menos un aumento de 75 %, al menos un aumento de 80 %, al menos un aumento de 85 %, al menos un aumento de 90 %, al menos un aumento de 95 %, al menos un aumento de 100 %, al menos un aumento de 120 %, al menos un aumento de 140 %, al menos un aumento de 160 %, al menos un aumento de 180 %, al menos un aumento de 200 %, al menos un aumento de 250 %, al menos un aumento de 300 %, al menos un aumento de 350 %, al menos un aumento de 400 %, al menos un aumento de 450 %, al menos un aumento de 500 %, al menos un aumento de 1000 %, al menos un aumento de 2000 %, al menos un aumento de 3000 %, al menos un aumento de 4000 %, al menos un aumento de 5000 %, al menos un aumento de 6000 %, al menos un aumento de 7000 %, al menos un aumento de 8000 %, al menos un aumento de 9000 %, o al menos un aumento de 10,000 %, o un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10,000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 25 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 10,000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 250 %,
un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 2% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 2% a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 2% a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 2% aaproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 2% aaproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 25 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 20 %, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 15%, un aumento de aproximadamente 2% a aproximadamente 10%, un aumento de aproximadamente 2 % a aproximadamente 5 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 5% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 5% a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 5% a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, un aumento de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, un aumento de aproximadamente 10% a aproximadamente 10.000%, un aumento de aproximadamente 10% a aproximadamente
9000 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 10% a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 10% a aproximadamente 6000%, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 10% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 10% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 8000%, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 200%, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 100%, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 95%, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 85 %,
un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 80%, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 75%, un aumento de aproximadamente 15% a aproximadamente 70%, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 30 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 %, un aumento de aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 %, un aumento de aproximadamente 20% a aproximadamente 10.000%, un aumento de aproximadamente 20% a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 20% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 20% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, un aumento de aproximadamente 20 % a aproximadamente 25 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente
400 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 25% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 25 % a aproximadamente 30 %, un aumento de aproximadamente 30% a aproximadamente 10.000%, un aumento de aproximadamente 30% a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 30% aaproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 30% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 30% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 30 % a aproximadamente 35 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente
6000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 35% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 35% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente 35 % a aproximadamente 40 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 40% a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 40% a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 100%, un aumento de aproximadamente 40% a aproximadamente 95%, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 40 % a aproximadamente 45 %, un aumento de aproximadamente
45 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 45% a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 45% a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 100%, un aumento de aproximadamente 45% a aproximadamente 95%, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 45 % a aproximadamente 50 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 50% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 50 %
a aproximadamente 55 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 55% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 55 % a aproximadamente 60 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 60% a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 60% aaproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 8o %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 60 % a aproximadamente 65 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 65% a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 65% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 65% a aproximadamente 100%, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 65 % a aproximadamente 70 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 70% a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 2000 %,
un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 75% a aproximadamente 100%, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 10,000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 80% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 80% aaproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 80% aaproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 85 %
a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 85% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, un aumento de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 90% a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 90% a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 140 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 120 %, un aumento de aproximadamente 90 % a aproximadamente 100%, un aumento de aproximadamente 90% a aproximadamente 95%, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 1000%, un aumento de aproximadamente 95% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 95% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 95 % a aproximadamente 100 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 7000%, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente
100% a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 400%, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 100 % a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 100% a aproximadamente 120%, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 120 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 200%, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 160%, un aumento de aproximadamente 120% a aproximadamente 140%, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 10.000%, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 140 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 140 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 140 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 140 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 140 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 200%, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 180%, un aumento de aproximadamente 140% a aproximadamente 160 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente
160% a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 400%, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 160% a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 200 %, un aumento de aproximadamente 160 % a aproximadamente 180 %, un aumento de aproximadamente 180 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 8000%, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 180 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 180 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 180 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 180 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 180% a aproximadamente 200%, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 200 % a aproximadamente 250 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 250 % a aproximadamente 300 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 300 %
a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 300% aaproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 300 % a aproximadamente 350 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 350 % a aproximadamente 400 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 400 % a aproximadamente 450 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 450 % a aproximadamente 500 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 500 % a aproximadamente 1000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 10.000%, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 1000 % a aproximadamente 2000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 2000 % a aproximadamente 3000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 3000 % a aproximadamente 4000 %, un aumento de aproximadamente 4000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 4000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 4000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 4000 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 4000 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 4000 % a aproximadamente 5000 %, un aumento de aproximadamente 5000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 5000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 5000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 5000 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 5000 % a aproximadamente 6000 %, un aumento de aproximadamente 6000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 6000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 6000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 6000 % a aproximadamente 7000 %, un aumento de aproximadamente 7000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 7000 % a aproximadamente 9000 %, un aumento de aproximadamente 7000 % a aproximadamente 8000 %, un aumento de aproximadamente 8000 % a aproximadamente 10.000 %, un aumento de aproximadamente 8000 % a aproximadamente 9000 %, o un aumento de aproximadamente 9000 % a aproximadamente 10.000 %) en la liberación de toxinas en la célula de mamífero diana (p. ej., cualquiera de las células de mamífero diana descritas en la presente descripción) en comparación con una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción). En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye el anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) puede proporcionar un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) (por ejemplo, al menos un aumento de 0,1 veces, al menos un aumento de 0,2 veces, al menos un aumento de 0,3 veces, al menos un aumento de 0,4 veces, al menos un aumento de 0,5 veces, al menos un aumento de 0,6 veces, al menos un aumento de 0,7 veces, al menos un aumento de 0,8 veces, al menos un aumento de 0,9 veces, al menos un aumento de 1,0 veces, al menos un aumento de 1,2 veces, al menos un aumento de 1,4 veces, al menos un aumento de 1,5
veces, un aumento de al menos 1,6 veces, un aumento de al menos 1,8 veces, un aumento de al menos 2,0 veces, un aumento de al menos 2,2 veces, un aumento de al menos 2,4 veces, un aumento de al menos 2,5 veces, un aumento de al menos 2,6 veces, un aumento de al menos 2,8 veces, un aumento de al menos 3,0 veces, un aumento de al menos 3,5 veces, un aumento de al menos 4,0 veces, un aumento de al menos 4,5 veces, un aumento de al menos 5,0 veces, un aumento de al menos 5,5 veces, un aumento de al menos 6,0 veces, un aumento de al menos 6,5 veces, un aumento de al menos 7,0 veces, un aumento de al menos 7,5 veces, un aumento de al menos 8,0 veces, un aumento de al menos 8,5 veces, un aumento de al menos 9,0 veces, un aumento de al menos 9,5 veces, un aumento de al menos 10 veces, un aumento de al menos 15 veces, un aumento de al menos 20 veces, un aumento de al menos 25 veces, un aumento de al menos 30 veces, un aumento de al menos 35 veces, un aumento de al menos 40 veces, un aumento de al menos 45 veces, un aumento de al menos 50 veces, un aumento de al menos 55 veces, un aumento de al menos 60 veces, un aumento de al menos 65 veces, un aumento de al menos 70 veces, un aumento de al menos 75 veces, un aumento de al menos 80 veces, un aumento de al menos 85 veces, un aumento de al menos 90 veces, un aumento de al menos 95 veces, o un aumento de al menos 100 veces, o aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,1
veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,7 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 0,3 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 0,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 0,7 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 0,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 0,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,2 veces a aproximadamente un aumento de 0,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 0,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 0,7 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 0,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,3 veces a aproximadamente un aumento de 0,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces,
aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 0,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 0,7 veces, aproximadamente un aumento de 0,4 veces a aproximadamente un aumento de 0,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces,
aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 0,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,5 veces a aproximadamente un aumento de 0,7 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces, aproximadamente un aumento de 0,6 veces a aproximadamente un aumento de 0,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces,
aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,7 veces a aproximadamente un aumento de 0,9 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a
aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 0,8 veces a aproximadamente un aumento de 1,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,0 veces a aproximadamente un aumento de 1,2 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2
veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,2 veces a aproximadamente un aumento de 1,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,4 veces a aproximadamente un aumento de 1,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,6 veces a aproximadamente un aumento de 1,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 1,8 veces a aproximadamente un aumento de 2,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a 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aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 2,0 veces a aproximadamente un aumento de 2,2 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,2 veces a aproximadamente un aumento de 2,4 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 2,4 veces a aproximadamente un aumento de 2,6 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,6 veces a aproximadamente un aumento de 2,8 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces,
aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 2,8 veces a aproximadamente un aumento de 3,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,0 veces a aproximadamente un aumento de 3,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 3,5
veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 3,5 veces a aproximadamente un aumento de 4,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,0 veces a aproximadamente un aumento de 4,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 4,5 veces a aproximadamente un aumento de 5,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces,
aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,0 veces a aproximadamente un aumento de 5,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 5,5 veces a aproximadamente un aumento de 6,0 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 6,0 veces a aproximadamente un aumento de 6,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 6,5 veces a aproximadamente un aumento de 7,0 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 7,0 veces a aproximadamente un aumento de 7,5 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 7,5 veces a aproximadamente un aumento de 8,0 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 8,0 veces a aproximadamente un aumento de 8,5 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 8,5 veces a aproximadamente un aumento de 9,0 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces
a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 9,0 veces a aproximadamente un aumento de 9,5 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 9,5 veces a aproximadamente un aumento de 10 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un aumento de 10 veces a aproximadamente un aumento de 20 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un
aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un
aumento de 20 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un
aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 20 veces a aproximadamente un aumento de 30 veces, aproximadamente un
aumento de 30 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 30 veces
a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 30 veces a aproximadamente un
aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 30 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 30 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un
aumento de 30 veces a aproximadamente un aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 30 veces a aproximadamente un aumento de 40 veces, aproximadamente un aumento de 40 veces a aproximadamente un
aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 40 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 40 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un
aumento de 40 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 40 veces a aproximadamente un aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 40 veces a aproximadamente un
aumento de 50 veces, aproximadamente un aumento de 50 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 50 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un
aumento de 50 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 50 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 50 veces a aproximadamente un
aumento de 60 veces, aproximadamente un aumento de 60 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 60 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un
aumento de 60 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un aumento de 60 veces a aproximadamente un aumento de 70 veces, aproximadamente un aumento de 70 veces a aproximadamente un
aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 70 veces a aproximadamente un aumento de 90 veces, aproximadamente un aumento de 70 veces a aproximadamente un aumento de 80 veces, aproximadamente un
aumento de 80 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces, aproximadamente un aumento de 80 veces
a aproximadamente un aumento de 90 veces, o aproximadamente un aumento de 90 veces a aproximadamente
un aumento de 100 veces) en la liberación de toxinas en la célula de mamífero diana (por ejemplo, cualquiera de
las células de mamífero diana descritas en la presente descripción) en comparación con una composición que
incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que
incluye el anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) puede proporcionar un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) (por ejemplo, un aumento de al menos 1 %, un
aumento de al menos 2 %, un aumento de al menos 5 %, un aumento de al menos 10 %, un aumento de al menos
15 %, un aumento de al menos 20 %, un aumento de al menos 25 %, un aumento de al menos 30 %, un aumento
de al menos 35 %, un aumento de al menos 40 %, un aumento de al menos 45 %, un aumento de al menos 50 %,
un aumento de al menos 55 %, un aumento de al menos 60 %, un aumento de al menos 65 %, un aumento de al
menos 70 %, un aumento de al menos 75 %, un aumento de al menos 80 %, un aumento de al menos 85 %, un
aumento de al menos 90 %, un aumento de al menos 95 %, un aumento de al menos 100 %, un aumento de al
menos 120 %, un aumento de al menos 140 %, un aumento de al menos 160 %, un aumento de al menos 180 %,
un aumento de al menos 200 %, un aumento de al menos 250 %, un aumento de al menos 300 %, un aumento de
al menos 350 %, un aumento de al menos 400 %, un aumento de al menos 450 %, un aumento de al menos 500 %,
un aumento de al menos 1000 %, un aumento de al menos 2000 %, un aumento de al menos 3000 %, un aumento
de al menos 4000 %, un aumento de al menos 5000 %, un aumento de al menos 6000 %, un aumento de al menos
7000 %, un aumento de al menos 8000 %, un aumento de al menos 9000 %, o un aumento de al menos 10.000 %,
o un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10.000 % (por ejemplo, o cualquiera de los subrangos
de este rango descrito en la presente descripción)) en la destrucción de células de mamífero diana (por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero diana ilustrativas descritas en la presente descripción) en comparación con
una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que
incluye el anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) puede proporcionar un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) (por ejemplo, al menos un aumento de 0,1 veces,
al menos un aumento de 0,2 veces, al menos un aumento de 0,3 veces, al menos un aumento de 0,4 veces, al
menos un aumento de 0,5 veces, al menos un aumento de 0,6 veces, al menos un aumento de 0,7 veces, al menos
un aumento de 0,8 veces, al menos un aumento de 0,9 veces, al menos un aumento de 1,0 veces, al menos un
aumento de 1,2 veces, al menos un aumento de 1,4 veces, al menos un aumento de 1,5 veces, al men aumento de 1,6 veces, al menos aumento de 1,8 veces, al menos un aumento de 2,0 veces, al men aumento de 2,2 veces, al menos aumento de 2,4 veces, al menos un aumento de 2,5 veces, al men aumento de 2,6 veces, al menos aumento de 2,8 veces, al menos un aumento de 3,0 veces, al men aumento de 3,5
veces, al menos un aumento de 4,0 veces, al menos un aumento de 4,5 veces, al menos un aumento de 5,0 veces, al menos un aumento de 5,5 veces, al menos un aumento de 6,0 veces, al menos un aumento de 6,5 veces, al menos un aumento de 7,0 veces, al menos un aumento de 7,5 veces, al menos un aumento de 8,0 veces, al menos un aumento de 8,5 veces, al menos un aumento de 9,0 veces, al menos un aumento de 9,5 veces, al menos un aumento de 10 veces, al menos un aumento de 15 veces, al menos un aumento de 20 veces, al menos un aumento de 25 veces, al menos un aumento de 30 veces, al menos un aumento de 35 veces, al menos un aumento de 40 veces, al menos un aumento de 40 veces, al menos un aumento de 45 veces, al menos un aumento de 50 veces, al menos un aumento de 55 veces, al menos un aumento de 60 veces, al menos un aumento de 65 veces, al menos un aumento de 70 veces, al menos un aumento de 80 veces, al menos un aumento de 85 veces, al menos un aumento de 90 veces, al menos un aumento de 95 veces, o al menos un aumento de 100 veces, o aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces (o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción)) en la eliminación de células de mamífero diana (por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero diana ilustrativas descritas en la presente descripción) en comparación con una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, al entrar en contacto con células de mamíferos diana que presentan MET en su superficie) da como resultado una disminución (por ejemplo, una disminución de al menos 1 %, una disminución de al menos 5 %, una disminución de al menos 10 %, una disminución de al menos 15 %, una disminución de al menos 20 %, una disminución de al menos 25 %, una disminución de al menos 30 %, una disminución de al menos 35 %, una disminución de al menos 40 %, una disminución de al menos 45 %, una disminución de al menos 50 %, una disminución de al menos 55 %, una disminución de al menos 60 %, una disminución de al menos 65 %, una disminución de al menos 70 %, una disminución de al menos 75 %, una disminución de al menos 80 %, una disminución de al menos 85 %, una disminución de al menos 90 %, una disminución de al menos 95 %, o una disminución de al menos 99 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 %, o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) de IC<50>(para la destrucción de células de mamífero diana) en comparación con la IC<50>para una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control descritos en la presente descripción) (por ejemplo, al entrar en contacto con las mismas células de mamífero diana).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, al entrar en contacto con células de mamífero diana que presentan MET en su superficie) puede proporcionar un aumento (por ejemplo, un aumento de al menos 0,1 veces, un aumento de al menos 0,2 veces, un aumento de al menos 0,4 veces, un aumento de al menos 0,6 veces, un aumento de al menos 0,8 veces, un aumento de al menos 1 vez, un aumento de al menos 2 veces, un aumento de al menos 5 veces, un aumento de al menos 10 veces, un aumento de al menos 15 veces, un aumento de al menos 20 veces, un aumento de al menos 25 veces, un aumento de al menos 30 veces, un aumento de al menos 35 veces, un aumento de al menos 40 veces, un aumento de al menos 45 veces, un aumento de al menos 50 veces, un aumento de al menos 55 veces, un aumento de al menos 60 veces, un aumento de al menos 65 veces, un aumento de al menos 70 veces, un aumento de al menos 75 veces, un aumento de al menos 80 veces, un aumento de al menos 85 veces, un aumento de al menos 90 veces, un aumento de al menos 95 veces, o un aumento de al menos 100 veces, o un aumento de aproximadamente 0,1 veces a aproximadamente 500 veces (o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) en la relación de K<d>en células de mamífero diana que presentan MET en su superficie a un pH neutro (un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0) a IC<50>con el pH neutro en las mismas células diana, por ejemplo, en comparación con un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye el anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) puede proporcionar un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) (por ejemplo, un aumento de al menos 1 %, un aumento de al menos 2 %, un aumento de al menos 5 %, un aumento de al menos 10 %, un aumento de al menos 15 %, un aumento de al menos 20 %, un aumento de al menos 25 %, un aumento de al menos 30 %, un aumento de al menos 35 %, un aumento de al menos 40 %, un aumento de al menos 45 %, un aumento de al menos 50 %, un aumento de al menos 55 %, un aumento de al menos 60 %, un aumento de al menos 65 %, un aumento de al menos 70 %, un aumento de al menos 75 %, un aumento de al menos 80 %, un aumento de al menos 85 %, un aumento de al menos 90 %, un aumento de al menos 95 %, un aumento de al menos 100 %, un aumento de al menos 120 %, un aumento de al menos 140 %, un aumento de al menos 160 %, un aumento de al menos 180 %, un aumento de al menos 200 %, un aumento de al menos 250 %, un aumento de al menos 300 %, un aumento de al menos 350 %, un aumento de al menos 400 %, un aumento de al menos 450 %, un aumento de al menos 500 %, un aumento de al menos 1000 %, un aumento de al menos 2000 %, un aumento de al menos 3000 %, un aumento de al menos 4000 %, un aumento de al menos 5000 %, un aumento de al menos 6000 %, un aumento de al menos 7000 %, un aumento de al menos 8000 %, un aumento de al menos 9000 %, o un aumento de al menos 10.000 %, o un aumento de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10.000 % (por ejemplo, o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción)) en la administración endolisosómica en las células de mamífero diana (por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero diana ilustrativas descritas en la presente descripción) en comparación con una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye el anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) puede proporcionar un aumento (por ejemplo, un aumento detectable) (por ejemplo, al menos un aumento de 0,1 veces, al menos un aumento de 0,2 veces, al menos un aumento de 0,3 veces, al menos un aumento de 0,4 veces, al menos un aumento de 0,5 veces, al menos un aumento de 0,6 veces, al menos un aumento de 0,7 veces, al menos un aumento de 0,8 veces, al menos un aumento de 0,9 veces, al menos un aumento de 1,0 veces, al menos un aumento de 1,2 veces, al menos un aumento de 1,4 veces, al menos un aumento de 1,5 veces, al menos un aumento de 1,6 veces, al menos un aumento de 1,8 veces, al menos un aumento de 2,0 veces, al menos un aumento de 2,2 veces, al menos un aumento de 2,4 veces, al menos un aumento de 2,5 veces, al menos un aumento de 2,6 veces, al menos un aumento de 2,8 veces, al menos un aumento de 3,0 veces, al menos un aumento de 3,5 veces, al menos un aumento de 4,0 veces, al menos un aumento de 4,5 veces, al menos un aumento de 5,0 veces, al menos un aumento de 5,5 veces, al menos un aumento de 6,0 veces, al menos un aumento de 6,5 veces, al menos un aumento de 7,0 veces, al menos un aumento de 7,5 veces, al menos un aumento de 8,0 veces, al menos un aumento de 8,5 veces, al menos un aumento de 9,0 veces, al menos un aumento de 9,5 veces, al menos un aumento de 10 veces, al menos un aumento de 15 veces, al menos un aumento de 20 veces, al menos un aumento de 25 veces, al menos un aumento de 30 veces, al menos un aumento de 35 veces, al menos un aumento de 40 veces, al menos un aumento de 45 veces, al menos un aumento de 50 veces, al menos un aumento de 55 veces, al menos un aumento de 60 veces, al menos un aumento de 65 veces, al menos un aumento de 70 veces, al menos un aumento de 75 veces, al menos un aumento de 80 veces, al menos un aumento de 85 veces, al menos un aumento de 90 veces, al menos un aumento de 95 veces, o al menos un aumento de 100 veces, o aproximadamente un aumento de 0,1 veces a aproximadamente un aumento de 100 veces (o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción)) en la administración endolisosómica en la célula de mamífero diana (por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero diana ilustrativas descritas en la presente descripción) en comparación con una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control ilustrativos descritos en la presente descripción).
En ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la célula de mamífero diana no expresa un receptor FcRn, o expresa un nivel menor (por ejemplo, un nivel detectablemente menor) (por ejemplo, una reducción de al menos 1 %, una reducción de al menos 2 %, una reducción de al menos 5 %, una reducción de al menos 10 %, una reducción de al menos 15 %, una reducción de al menos 20 %, una reducción de al menos 25 %, una reducción de al menos 30 %, una reducción de al menos 35 %, una reducción de al menos 40 %, una reducción de al menos 45 %, una reducción de al menos 50 %, una reducción de al menos 55 %, una reducción de al menos 60 %, una reducción de al menos 65 %, una reducción de al menos 70 %, una reducción de al menos 75 %, una reducción de al menos 80 %, una reducción de al menos 85 %, una reducción de al menos 90 %, una reducción de al menos 95 %, o una reducción de al menos 99 % del nivel) del receptor FcRn en comparación con una célula de control que expresa FcRn (por ejemplo, HUVEC - ThermoFisher #C0035C). En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la célula de mamífero diana es una célula cancerosa. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es citotóxico o citostático a la célula de mamífero diana.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, una composición que incluye cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, al administrar a un sujeto) da como resultado menos (por ejemplo, una disminución de 1 % a aproximadamente una disminución de 99 %, o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) de una reducción en el nivel de MET presentado en la superficie de la célula diana en comparación con una composición que incluye la misma cantidad de un anticuerpo de control (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de control descritos en la presente descripción). En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la composición no da como resultado una reducción detectable en el nivel del MET presentado en la superficie de la célula de mamífero diana.
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene reactividad cruzada con un MET de primate no humano y un MET humano. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene reactividad cruzada con un MET de primate no humano, un MET humano, y uno o ambos de MET de rata y un MET de ratón. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene reactividad cruzada con un MET de primate no humano, un MET humano, un MET de rata, y un MET de ratón. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el anticuerpo tiene reactividad cruzada con un MET de ratón y un MET de rata. En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, el dominio de unión a antígenos se une a un epítopo de MET que está presente en la superficie de células de un mono del viejo mundo.
Algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden incluir además un segundo dominio de unión a antígenos (por ejemplo, cualquiera de los dominios de unión a antígenos ilustrativos descritos en la presente descripción). Los aspectos no limitantes de estos métodos se describen a continuación, y pueden usarse en cualquier combinación sin limitación. Aspectos adicionales de estos métodos se conocen en la técnica.
MET o epítopo de MET
El protooncogén MET, receptor tirosina cinasa (MET) es un antígeno tumoral que se conoce en la técnica, y es el objetivo de los anticuerpos terapéuticos en oncología (Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000). La secuencia del MET humano maduro puede encontrarse en la SEQ ID NO: 1. La secuencia del ADNc que codifica el MET humano maduro puede encontrarse en la SEQ ID NO: 2. La secuencia del dominio extracelular de MET puede encontrarse en la<s>E<q>ID NO: 3. La secuencia del ADNc que codifica el dominio extracelular de MET puede encontrarse en la SEQ ID NO: 4.
Propiedades ilustrativas de los anticuerpos
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (por ejemplo, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,6, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,4, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,3, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,2, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,1, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,6, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,4, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,3, de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 4,2, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,6, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,4, de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 4,3, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 4,6, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 4,4, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 4,6, de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 4,6, de aproximadamente
4,6 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 4,9, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,1, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 5,2, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,3, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,4, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente
5,4 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 5,6, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 5,8, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 5,9, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 6,1 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,1 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 6,1 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 6,1 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 6,4, o de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,5) es más rápida (por ejemplo, al menos
5 % más rápida, al menos 10 % más rápida, al menos 15 % más rápida, al menos 20 % más rápida, al menos
25 % más rápida, al menos 30 % más rápida, al menos 35 % más rápida, al menos 40 % más rápida, al menos
45 % más rápida, al menos 50 % más rápida, al menos 55 % más rápida, al menos 60 % más rápida, al menos
65 % más rápida, al menos 70 % más rápida, al menos 75 % más rápida, al menos 80 % más rápida, al menos
85 % más rápida, al menos 90 % más rápida, al menos 95 % más rápida, al menos 100 % más rápida, al menos
120 % más rápida, al menos 140 % más rápida, al menos 160 % más rápida, al menos 180 % más rápida, al menos 200 % más rápida, al menos 220 % más rápida, al menos 240 % más rápida, al menos 260 % más rápida, al menos 280 % más rápida, al menos 300 % más rápida, al menos 320 % más rápida, al menos 340 % más rápida, al menos 360 % más rápida, al menos 380 % más rápida, al menos 400 % más rápida, al menos 420 % más rápida, al menos 440 % más rápida, al menos 460 % más rápida, al menos 480 % más rápida, al menos 500 % más rápida, al menos 1000 % más rápida, al menos 2000 % más rápida, al menos 3000 % más rápida, al menos 4000 % más rápida, al menos 5000 % más rápida, al menos 6000 % más rápida, al menos 7000 % más rápida, al menos 8000 % más rápida, al menos 9000 % más rápida, o al menos 10.000 % más rápida, o de aproximadamente 5 % más rápida a aproximadamente 10.000 % más rápida, de aproximadamente 5 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, de aproximadamente 5 % más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 5 %
más rápida a aproximadamente 7000 % más rápida, de aproximadamente 5 % más rápida a aproximadamente
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más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 7000 % más rápida, de aproximadamente 160% más rápida a aproximadamente 6000% más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 5000 % más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 4000 % más rápida, de aproximadamente 160% más rápida a aproximadamente 3000 % más rápida, de aproximadamente 160% más rápida a aproximadamente 2000% más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 1000 % más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 500 % más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 480 % más rápida, de aproximadamente 160 % más rápida a aproximadamente 460 % más rápida, de aproximadamente 160% más rápida a aproximadamente 440% más rápida, de aproximadamente 160% más rápida a aproximadamente 420% más rápida, de aproximadamente 160% más rápida a aproximadamente 400 % más rápida, de aproximadamente 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aproximadamente 4000 % más rápida, de aproximadamente 2000 % más rápida a aproximadamente 3000 % más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 10.000% más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 7000 % más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 6000 % más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 5000 % más rápida, de aproximadamente 3000 % más rápida a aproximadamente 4000 % más rápida, de aproximadamente 4000 % más rápida a aproximadamente 10.000% más rápida, de aproximadamente 4000 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, de aproximadamente 4000 % más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 4000 % más rápida a aproximadamente 7000 % más rápida, de aproximadamente 4000 % más rápida a aproximadamente 6000 % más rápida, de aproximadamente 4000 % más rápida a aproximadamente 5000 % más rápida,
de aproximadamente 5000 % más rápida a aproximadamente 10.000 % más rápida, de aproximadamente 5000 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, de aproximadamente 5000 % más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 5000 % más rápida a aproximadamente 7000 % más rápida, de aproximadamente 5000 % más rápida a aproximadamente 6000 % más rápida, de aproximadamente 6000 % más rápida a aproximadamente 10.000 % más rápida, de aproximadamente 6000 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, de aproximadamente 6000 % más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 6000 % más rápida a aproximadamente 7000 % más rápida, de aproximadamente 7000 % más rápida a aproximadamente 10.000% más rápida, de aproximadamente 7000 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, de aproximadamente 7000 % más rápida a aproximadamente 8000 % más rápida, de aproximadamente 8000 % más rápida a aproximadamente 10.000% más rápida, de aproximadamente 8000 % más rápida a aproximadamente 9000 % más rápida, o de aproximadamente 9000 % más rápida a aproximadamente 10.000% más rápida) que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por. ejemplo., de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,0 ¡a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,6 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,6 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,6 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,6 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,8 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,8 a aproximadamente 7,9, o de aproximadamente 7,9 a aproximadamente 8,0).
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la constante de disociación (Kd) a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) es mayor (por ejemplo, detectablemente mayor) (por ejemplo, al menos 5 % mayor, al menos 10 % mayor, al menos 15 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 25 % mayor, al menos 30%mayor, al menos 35%mayor, al menos 40%mayor, al menos 45%mayor, al menos 50%mayor, al menos 55 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 65 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 85 % mayor, al menos 90 % mayor, al menos 95 % mayor, al menos 100 % mayor, al menos 120 % mayor, al menos 140 % mayor, al menos 160 % mayor, al menos 180 % mayor, al menos 200 % mayor, al menos 220 % mayor, al menos 240 % mayor, al menos 260 % mayor, al menos 280 % mayor, al menos 300 % mayor, al menos 320 % mayor, al menos 340 % mayor, al menos 360 % mayor, al menos 380 % mayor, al menos 400 % mayor, al menos 420 % mayor, al menos
440 % mayor, al menos 460 % mayor, al menos 480 % mayor, al menos 500 % mayor, al menos 1000 % mayor, al menos 2000 % mayor, al menos 3000 % mayor, al menos 4000 % mayor, al menos 5000 % mayor, al menos 6000 % mayor, al menos 7000 % mayor, al menos 8000 % mayor, al menos 9000 % mayor, o al menos 10.000 % mayor, o de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 260 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 200% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 180% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 140% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 120% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 95 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 90 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 85 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 80 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 60 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 50 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 45 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 40 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 35 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 30 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 25 % mayor, de aproximadamente 5 % mayor a aproximadamente 20% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 15% mayor, de aproximadamente 5% mayor a aproximadamente 10% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 460% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 440% mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 420 % mayor,
de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 380% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 360% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 320% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 300% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 260% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 240% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 220% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 200% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 180% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 140% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 120% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 95% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 90% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 85% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 80% mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 60 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 50 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 45 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 40 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 35 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 30 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 25 % mayor, de aproximadamente 10 % mayor a aproximadamente 20 % mayor, de aproximadamente 10% mayor a aproximadamente 15 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 500% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 460% mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 440% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 380% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 320% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 260% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 220% mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 200% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 180% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 140% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 120% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 95% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 90 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 85% mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 80% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 60 %
mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 15 % mayor a aproximadamente 50% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 45% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 40% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 35% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 30 % mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 25% mayor, de aproximadamente 15% mayor a aproximadamente 20 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 480 % mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 420 % mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 360 % mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 300 % mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 260 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 240 % mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 200 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 180% mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 140% mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 120% mayor de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 95 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 90 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 85 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 80 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 60% mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 50 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 45 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 40 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 35 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 30 % mayor, de aproximadamente 20 % mayor a aproximadamente 25 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 500 % mayor de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 25 %
mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 320 % mayor de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 260 % mayor de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 200 % mayor de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 180% mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 140% mayor de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 120% mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 95 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 90 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 85 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 80 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 60 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 50 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 45 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 40 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 35 % mayor, de aproximadamente 25 % mayor a aproximadamente 30 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 260 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 200 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 180% mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 140% mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 120% mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 95 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 90 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 85 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 80 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 60 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 50 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 45 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a
aproximadamente 40 % mayor, de aproximadamente 30 % mayor a aproximadamente 35 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 35% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 500 % mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 440 % mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 380 % mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 320 % mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 260 % mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 200 % mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 180% mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 160% mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 140% mayor de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 120% mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 100% mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 95 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 90 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 85 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 80 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 75 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 70 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 65 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 60 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 55 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 50 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 45 % mayor, de aproximadamente 35 % mayor a aproximadamente 40 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 40% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 40% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 260 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 40 % mayor a aproximadamente 200 %
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mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 260 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 200 % mayor a aproximadamente 220 % mayor, de aproximadamente 220% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 220% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 220% mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 220% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 260 % mayor, de aproximadamente 220 % mayor a aproximadamente 240 % mayor, de aproximadamente 240% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 240% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 240% mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 240% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 240 %
mayor a aproximadamente 320%mayor, de aproximadamente 240%mayor a aproximadamente 300%mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 240 % mayor a aproximadamente 260% mayor, de aproximadamente 260% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 260 % mayor a aproximadamente 280 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 280% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 280 % mayor a aproximadamente 300 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 300% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 300 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 300 %
mayor a aproximadamente 320 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 320 % mayor a aproximadamente 340 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 340% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 440%mayor, de aproximadamente 340%mayor a aproximadamente 420%mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 340 % mayor a aproximadamente 360 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 360% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 360 % mayor a aproximadamente 380 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 380 %
mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 380 % mayor a aproximadamente 400 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 400% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 440 % mayor, de aproximadamente 400 % mayor a aproximadamente 420 % mayor, de aproximadamente 420% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 420% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 420% mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 420% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 420 % mayor a aproximadamente 440% mayor, de aproximadamente 440% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 440 % mayor a aproximadamente 460 % mayor, de aproximadamente 460% mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 460% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 460% mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 460% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 460 % mayor a aproximadamente 480 % mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 480% mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 480 %
mayor a aproximadamente 3000%mayor, de aproximadamente 480%mayor a aproximadamente 2000%mayor, de aproximadamente 480 % mayor a aproximadamente 1000 % mayor, de aproximadamente 480% mayor a aproximadamente 500 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 500 % mayor a aproximadamente 1000% mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 1000% mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 1000% mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 1000 % mayor a aproximadamente 2000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 2000 % mayor a aproximadamente 3000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 3000 % mayor a aproximadamente 4000 % mayor, de aproximadamente 4000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 4000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 4000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 4000 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 4000 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 4000 % mayor a aproximadamente 5000 % mayor, de aproximadamente 5000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 5000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 5000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 5000 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 5000 % mayor a aproximadamente 6000 % mayor, de aproximadamente 6000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 6000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 6000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 6000 % mayor a aproximadamente 7000 % mayor, de aproximadamente 7000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 7000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, de aproximadamente 7000 % mayor a aproximadamente 8000 % mayor, de aproximadamente 8000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor, de aproximadamente 8000 % mayor a aproximadamente 9000 % mayor, o de aproximadamente 9000 % mayor a aproximadamente 10.000 % mayor) que la Kd a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción).
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (p. ej., cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) es más rápida (p. ej., al menos 0,2 veces más rápida, al menos 0,3 veces, al menos 0,4 veces, al menos 0,5 veces, al menos 0,6 veces, al menos 0,7 veces, al menos 0,8 veces, al menos 0,9 veces, al menos 1,0 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2,0 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3,0 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4,0 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5,0 veces, al menos 5,5 veces, al menos 6,0 veces, al menos 6,5 veces, al menos 7,0 veces, al menos 7,5 veces, al menos 8,0 veces, al menos 8,5 veces, al menos 9,0 veces, al menos 9,5 veces, al menos 10,0 veces, al menos 10,5 veces, al menos 11,0 veces, al menos 11,5 veces, al menos 12,0 veces, al menos 12,5 veces, al menos 13,0 veces, al menos 13,5 veces, al menos 14,0 veces, al menos 14,5 veces, al menos 15,0 veces, al menos 15,5 veces, al menos 16,0 veces, al menos 16,5 veces, al menos 17,0 veces, al menos 17,5 veces, al menos 18,0 veces, al menos 18,5 veces, al menos 19,0 veces, al menos 19,5 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces, al menos 50 veces, al menos 55 veces, al menos 60 veces, al menos 65 veces, al menos 70 veces, al menos 75 veces, al menos 80 veces, al menos 85 veces, al menos 90 veces, al menos 95 veces, o al menos 100 veces más rápida o de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 15 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 10 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 5 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 2 veces más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 1 vez más rápida, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 0,5 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 15 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 10 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 5 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 2 veces más rápida, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 1 vez más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 15 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 10 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 5 veces más rápida, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 2 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 2
veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 15 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces más rápida, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 15 veces más rápida, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 10 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 15 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 20 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 30 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 40 veces más rápida, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 50 veces más rápida, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 60 veces más rápida, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 70 veces más rápida, de aproximadamente 70 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 70 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, de aproximadamente 70 veces a aproximadamente 80 veces más rápida, de aproximadamente 80 veces a aproximadamente 100 veces más rápida, de aproximadamente 80 veces a aproximadamente 90 veces más rápida, o de aproximadamente 90 veces a aproximadamente 100 veces más rápida) que la tasa de disociación a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por ejemplo, o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción).
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la constante de disociación (Kd) a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (p. ej., cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) es mayor (p. ej., detectablemente mayor) (p. ej., al menos 0,2 veces mayor, al menos 0,3 veces, al menos 0,4 veces, al menos 0,5 veces, al menos 0,6 veces, al menos 0,7 veces, al menos 0,8 veces, al menos 0,9 veces, al menos 1,0 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2,0 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3,0 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4,0 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5,0 veces, al menos 5,5 veces, al menos 6,0 veces, al menos 6,5 veces, al menos 7,0 veces, al menos 7,5 veces, al menos 8,0 veces, al menos 8,5 veces, al menos 9,0 veces, al menos 9,5 veces, al menos 10,0 veces, al menos 10,5 veces, al menos 11,0 veces, al menos 11,5 veces, al menos 12,0 veces, al menos 12,5 veces, al menos 13,0 veces, al menos 13,5 veces, al menos 14,0 veces, al menos 14,5 veces, al menos 15,0 veces, al menos 15,5 veces, al menos 16,0 veces, al menos 16,5 veces, al menos 17,0 veces, al menos 17,5 veces, al menos 18,0 veces, al menos 18,5 veces, al menos 19,0 veces, al menos 19,5 veces, al menos 20 veces mayor, al menos 25 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 35 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 45 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 55 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 65 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 75 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 85 veces mayor, al menos
90 veces mayor, al menos 95 veces mayor, o al menos 100 veces mayor, o de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 10 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 8 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 5 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 2 veces mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 1 vez mayor, de aproximadamente 0,2 veces a aproximadamente 0,5 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 10 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 8 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 5 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 2 veces mayor, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 1 vez mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente
100 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 40 veces
mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 10 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 8 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 5 veces mayor, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 2 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente
60 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente
20 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces mayor, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente
100 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente
50 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 5 veces
a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 10 veces mayor, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 8 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 8 veces a aproximadamente 10 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 15 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 20 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 25 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a
aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 30 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 30 veces a aproximadamente 40 veces mayor, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 40 veces a aproximadamente 50 veces mayor, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 50 veces a aproximadamente 60 veces mayor, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 60 veces a aproximadamente 70 veces mayor, de aproximadamente 70 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 70 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 70 veces a aproximadamente 80 veces mayor, de aproximadamente 80 veces a aproximadamente 100 veces mayor, de aproximadamente 80 veces a aproximadamente 90 veces mayor, de aproximadamente 90 veces a aproximadamente 100 veces mayor), que la K<d>a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción).
En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la Kd a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) está entre aproximadamente 1 pM a aproximadamente 5 TM (p. ej., de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 700 pM,
de aproximadamente aproximadamente 650 pM, de aproximadamente aproximadam de aproximadamente aproximadamente 550 pM, de aproximadamente aproximadam de aproximadamente aproximadamente 450 pM, de aproximadamente aproximadam de aproximadamente aproximadamente 350 pM, de aproximadamente aproximadam de aproximadamente aproximadamente 250 pM, de aproximadamente aproximadam de aproximadamente aproximadamente 150 pM, de aproximadamente aproximadam de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 5 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 4 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 3 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 2 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 2 TM, de 2 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 2 pM
a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 900 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 800 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 700 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 600 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 500 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 400 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 300 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 200 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 100 aproximadamente 2 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 30 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 5 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 4 pM, de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 3 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 5 pM a
aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 210 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 190 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 170 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 150 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 130 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 900 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 800 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 700 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 600 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 500 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 400 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 300 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 200 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 100 aproximadamente 5 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 30 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente
10 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente
950 pM, de aproximadamente aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente
70 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 30 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 30 pM, de aproximadamente 15 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 30 pM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
210 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 3 aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
95 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
85 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
75 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
65 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
55 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
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35 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
25 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente
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30 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente
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30 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente
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30 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente
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30 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente
30 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente
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40 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente
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40 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente
40 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente
180 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 70
pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente
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70 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente
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70 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente
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pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 70
pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente
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70 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente
70 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 80
pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente
80 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 75 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 65 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 55 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 45 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 35 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 25 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 15 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 5 nM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 900 pM,
de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 800
pM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente
700 pM, de aproximadamente aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 8 aproximadam 600 pM, de aproximadamente aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 8 aproximadam 500 pM, de aproximadamente aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 8 aproximadam 400 pM, de aproximadamente aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 8 aproximadam 300 pM, de aproximadamente aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 8 aproximadam 200 pM, de aproximadamente aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 8 aproximadam 100 pM, de aproximadamente aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 9 aproximadam 5 TM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 1
TM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente
250 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadam 230 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadam 210 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 90 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 100 pM a
aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 150 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 150 pM
a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 250 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 80 nM,
de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 450 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 350 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 750 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 650 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 550 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 130
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550 pM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente
2 TM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente
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de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 150
nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente
130 nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 600
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600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente e aproximadamente 600 pM a aproximadamente aproximadamente 600 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente
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de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 650
pM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 2
TM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente
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130 nM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 700
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700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente e aproximadamente 700 pM a aproximadamente aproximadamente 700 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 700 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente
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de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 500
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de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 130
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pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente
800 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 850 pM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 95 nM,
de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 900 pM a aproximadamente 950 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 4
nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 4 nM
a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 10 nM
a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 10
nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente
10 nM a aproximadamente
nM, de aproximadamente aproximadamente 45 nM, de aproximadamente nM a aproximada nM, de aproximadamente aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximada nM, de aproximadamente aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximada nM, de aproximadamente aproximadamente 15 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 1 TM,
de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 15 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 30 nM aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximada 50 nM, de aproximadamente 30 nM aproximadamente 45 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximada 40 nM, de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 35 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximada 5 TM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 1
TM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
250 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
230 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
210 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
190 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
170 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
150 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
130 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
110 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente
95 nM, de aproximadamente aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximada 85 nM, de aproximadamente aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximada 75 nM, de aproximadamente aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximada 65 nM, de aproximadamente aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximada 55 nM, de aproximadamente aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximada 45 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 2
TM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 500
nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
240 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
220 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
200 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
180 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
160 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
140 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
120 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
100 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
90 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente
80
nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 70
nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 65 nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 60
nM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 55 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 5
TM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 1 TM,
de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 250
nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
230 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
210 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
190 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
170 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
150 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
130 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
110 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente
95 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximada 85 nM, de aproximadamente 60 nM aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximada 75 nM, de aproximadamente 60 nM aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 60 nM a aproximada 65 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 70 nM a aproximadam TM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 500
nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente
240 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente
220 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente
200 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente
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210 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente
190 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 80 nM a aproximadamente 85 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 90 mM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 90 nM
a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 90 nM a aproximadamente 95 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 110 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 110 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 120 nM a aproximadamente 130 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 130 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 140 nM a aproximadamente 150 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 150 nM a
aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 160 nM a aproximadamente 170 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 180 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 180 nM a aproximadamente 190 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 190 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 210 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 220 nM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 220 nM a aproximadamente 230 nM, de aproximadamente 230 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 230 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 230 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 230 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 230 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 230 nM a aproximadamente 240 nM, de aproximadamente 240 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 240 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 240 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 240 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 240 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 250 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 250 nM a aproximadamente 2 TM, de aproximadamente 250 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 250 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 500 nM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 500 nM a aproximadamente 2 TM,
de aproximadamente 500 nM a aproximadamente 1 TM, de aproximadamente 1 TM a aproximadamente 5 TM, de aproximadamente 1 TM a aproximadamente 2 TM, o de aproximadamente 2 TM a aproximadamente 5 TM). En algunas modalidades de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la Kd a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5 (por ejemplo, cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) puede ser mayor que 1 nM (por ejemplo, entre aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 900 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 700 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 300 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 90 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 70 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 30<j>M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 20<j>M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 j M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 5 j M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 4 j M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 2 j M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 j M, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 900 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 800 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 700 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 600 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 400<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 300<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 90<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 60 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 40<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 30<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 10 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 5<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 4<j>M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 2 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 1 j M, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 900 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 800 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 700 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 600 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 40 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 30 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 10 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 5 j M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 4<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 2<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 1<j>M, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 900 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 800 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 700 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 600 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 90<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 70 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 50<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 40<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 30<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 5<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 4<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 2 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 1 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 900 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 800 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 700 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 600 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 70 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 60 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 40 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 30 j M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 20<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 5<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 4<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 2<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 1<j>M, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 900 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 800 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 700 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 600 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 400<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 300<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 90<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 40 j M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 30 j M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 10<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 5<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 4<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 2<j>M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 1 j M, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 900 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 800 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 700 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 600 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 80 nM, de aproximadamente 20
nM a aproximadamente 70 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 30 nM; de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 50<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 40 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 30 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 20<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 10<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 5 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 4 j M, de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 3<j>M, de aproximadamente 1<j>M a aproximadamente 2<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 70 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 60 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 50<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 40<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 30 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 10 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 5 j M, de aproximadamente 2 j M a aproximadamente 4<j>M, de aproximadamente 2<j>M a aproximadamente 3<j>M, de aproximadamente 5<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 5<j>M a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 5<j>M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 70 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 60 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 40 j M, de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 30<j>M, de aproximadamente 5<j>M a aproximadamente 20<j>M, de aproximadamente 5<j>M a aproximadamente 10 j M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 400<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 300<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 90<j>M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 70 j M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 50<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 40<j>M, de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 30<j>M, de aproximadamente 10 j M a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 300<j>M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 20 j M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 50<j>M,
de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 40<j>M, de aproximadamente 20<j>M a aproximadamente 30<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 30 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 30 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 30 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 30 j M a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 90<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 30<j>M a aproximadamente 60 j M, de aproximadamente 30 j M a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 30 j M a aproximadamente 40 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 40<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 40<j>M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 40<j>M a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 40<j>M a aproximadamente 60 j M, de aproximadamente 40 j M a aproximadamente 50 j M, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 400<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 300<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 50 j M a aproximadamente 70<j>M, de aproximadamente 50<j>M a aproximadamente 60<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 60 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 60 j M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 60 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 60 j M a aproximadamente 200<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 100<j>M, de aproximadamente 60<j>M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 60 j M a aproximadamente 80 j M, de aproximadamente 60 j M a aproximadamente 70 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 70<j>M a aproximadamente 400<j>M, de aproximadamente 70<j>M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 70 j M a aproximadamente 80<j>M, de aproximadamente 80<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 80<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 80<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 80<j>M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 80 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 80 j M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 80<j>M a aproximadamente 400<j>M, de aproximadamente 80<j>M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 80 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 80 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 80 j M a aproximadamente 90 j M, de aproximadamente 90 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 90<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 90<j>M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 90 j M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 90 j M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 90<j>M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 90<j>M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 90 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 90 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 90 j M a aproximadamente 100 j M, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 100<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 100 |jM a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente
500 j M, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 100 j M a aproximadamente 200 j M, de aproximadamente 200<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 200<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 200<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 200<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 200<j>M a aproximadamente 600<j>M, de aproximadamente 200<j>M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 200 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 200 j M a aproximadamente 300 j M, de aproximadamente 300 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 300 j M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 300<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 300<j>M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 300 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 300 j M a aproximadamente 500 j M, de aproximadamente 300 j M a aproximadamente 400 j M, de aproximadamente 400<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 400<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 400 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 400 j M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 400 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 400 j M a aproximadamente 500<j>M, de aproximadamente 500<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 500<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 500<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 500<j>M a aproximadamente 700 j M, de aproximadamente 500 j M a aproximadamente 600 j M, de aproximadamente 600<j>M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 600<j>M a aproximadamente 900<j>M, de aproximadamente 600<j>M a aproximadamente 800<j>M, de aproximadamente 600<j>M a aproximadamente 700<j>M, de aproximadamente 700 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 700 j M a aproximadamente 900 j M, de aproximadamente 700 j M a aproximadamente 800 j M, de aproximadamente 800 j M a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 800 j M a aproximadamente 900 j M, o de aproximadamente 900 j M a aproximadamente 1 mM).
Puede usarse una variedad de métodos diferentes conocidos en la técnica para determinar los valores Kd de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética, un ensayo de unión al filtro, resonancia de plasmones superficiales, un ensayo de cinética de unión biomolecular, un ensayo de unión in vitro en células que expresan antígenos, etc.).
En algunas modalidades, la semivida de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la semivida del anticuerpo in vivo aumenta (por ejemplo, un aumento detectable) relativamente a un anticuerpo de control (por ejemplo, el mismo anticuerpo pero sin incluir las sustituciones o inserciones de aminoácidos en la CH1-CH2-CH3 de la cadena pesada o cualquiera de las sustituciones de aminoácidos en el dominio Cl). En algunas modalidades, una o más sustituciones de aminoácidos pueden aumentar la semivida de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. Los ejemplos no limitantes de sustituciones de aminoácidos que pueden aumentar la semivida del anticuerpo in vivo incluyen una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 y/o una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189. En algunas modalidades, la semivida del anticuerpo in vivo aumenta (p. ej., un aumento detectable) (p. ej., una disminución de al menos 1 %, una disminución de al menos 5 %, una disminución de al menos 10 %, una disminución de al menos 15 %, una disminución de al menos 20 %, una disminución de al menos 25 %, una disminución de al menos 30 %, una disminución de al menos 35 %, una disminución de al menos 40 %, una disminución de al menos 45 %, una disminución de al menos 50 %, una disminución de al menos 55 %, una disminución de al menos 60 %, una disminución de al menos 65 %, una disminución de al menos 70 %, una disminución de al menos 75 %, una disminución de al menos 80 %, una disminución de al menos 85 %, una disminución de al menos 90 %, una disminución de al menos 95 %, o una disminución de al menos 99 %, o una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15%, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 5% aaproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 5% aaproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, una disminución de aproximadamente 10% a aproximadamente 99%, una disminución de aproximadamente 10% a aproximadamente 95%, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 10% a aproximadamente 75%, una disminución de aproximadamente 10% a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 15 %
a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente
95 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 35% aaproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 99 %,
una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 85 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, o una disminución de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99 %) en comparación con la semivida de un anticuerpo de control (p. ej., el mismo anticuerpo pero sin incluir las sustituciones o inserciones de aminoácidos en CH1-CH2-CH3 de la cadena pesada o cualquiera de las sustituciones de aminoácidos en el dominio CL).
En algunos ejemplos de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, la semivida del anticuerpoin vivodisminuye (por ejemplo, una disminución detectable) (por ejemplo, una disminución de al menos 1 %, una disminución de al menos 5 %, una disminución de al menos 10 %, una disminución de al menos 15 %, una disminución de al menos 20 %, una disminución de al menos 25 %, una disminución de al menos 30 %, una disminución de al menos 35 %, una disminución de al menos 40 %, una disminución de al menos 45 %, una disminución de al menos 50 %, una disminución de al menos 55 %, una disminución de al menos 60 %, una disminución de al menos 65 %, una disminución de al menos 70 %, una disminución de al menos 75 %, una disminución de al menos 80 %, una disminución de al menos 85 %, una disminución de al menos 90 %, una disminución de al menos 95 %, o una disminución de al menos 99 %, o una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 1% aaproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente
1% a aproximadamente 15%, una disminución de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, una disminución de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, una disminución de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 20 %
a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 20 % a aproximadamente 25 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 25% aaproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 25% aaproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 25 % a aproximadamente 30 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 30 % a aproximadamente 35 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 35 % a aproximadamente 40 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente
50 %, una disminución de aproximadamente 40 % a aproximadamente 45 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 45 % a aproximadamente 50 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 50 % a aproximadamente 55 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 55 % a aproximadamente 60 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 60 % a aproximadamente 65 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 65 % a aproximadamente 70 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 75 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 75% aaproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 75% aaproximadamente 80 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, una disminución de aproximadamente 85 % a aproximadamente
99 %, una disminución de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, una disminución de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, una disminución de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 %, una disminución de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, o una disminución de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99 %) en comparación con la semivida de un anticuerpo de control (p. ej., el mismo anticuerpo pero sin incluir las sustituciones o inserciones de aminoácidos en CH1-CH2-CH3 de la cadena pesada o cualquiera de las sustituciones de aminoácidos en el dominio CL).
Conjugación
En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden conjugarse con un fármaco (por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico, una molécula pequeña), una toxina, o un radioisótopo. En la técnica, se conocen ejemplos no limitantes de fármacos, toxinas y radioisótopos (por ejemplo, que se sabe que son útiles para el tratamiento del cáncer).
En algunas modalidades, al menos un polipéptido de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción se conjuga con la toxina, el radioisótopo, o el fármaco a través de un enlazador escindible. En algunas modalidades, el enlazador escindible incluye un sitio de escisión de proteasa. En algunas modalidades, el enlazador escindible se escinde en el anticuerpo una vez que se transporta al lisosoma o endosoma tardío por la célula de mamífero diana. En algunas modalidades, la escisión del enlazador activa funcionalmente el fármaco o toxina.
En algunas modalidades, al menos un polipéptido de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción se conjuga con la toxina, el radioisótopo, o el fármaco a través de un enlazador no escindible. En algunas modalidades, la toxina conjugada, radioisótopo, o fármaco se libera durante la degradación lisosómica y/o endosómica tardía del anticuerpo.
Los ejemplos no limitantes de enlazadores escindibles incluyen: enlazadores de hidrazona, enlazadores de péptidos, enlazadores de disulfuro, y enlazadores de tioéter. Ver, por ejemplo, Carter et al.,Cáncer J.14(3):154-169, 2008; Sanderson et al.,Clin. Cáncer Res.11(2 Pt1):843-852, 2005; Chari et al.,Acc. Chem. Res.41(1):98-107, 2008; Oflazoglu et al.,Clin. Cáncer Res.14(19): 6171-6180, 2008; y Lu et al.,Int. J. Mol. Sci.17(4): 561,2016. Los ejemplos no limitantes de enlazadores no escindibles incluyen: enlazadores de alcano de maleimida y enlazador de ciclohexano de meleimida (MMC) (véase, por ejemplo, aquellos descritos en McCombs et al.,AAPS J.17(2):339-351,2015).
En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción es citotóxico o citostático a la célula de mamífero diana.
En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos para proporcionar un sitio de conjugación (por ejemplo, conjugado con un fármaco, una toxina, un radioisótopo). En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden tener un sitio de conjugación. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden tener dos sitios de conjugación. En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden tener tres o más sitios de conjugación. Un ejemplo no limitante de una sustitución de aminoácidos para producir un sitio de conjugación (por ejemplo, un sitio de conjugación “bisagra triple”) se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2017/0348429. Por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o la SEQ ID NO: 189 pueden proporcionar un sitio de conjugación de “bisagra triple” en cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 puede proporcionar un sitio de conjugación para cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157 puede proporcionar un sitio de conjugación para cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción.
Los aminoácidos de cisteína de origen natural también pueden proporcionar una conjugación (por ejemplo, conjugada con un fármaco, una toxina, un radioisótopo). En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden tener un fármaco, una toxina, o un radioisótopo conjugado en uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) sitios de conjugación de origen natural. En algunas modalidades, la cisteína en la posición de aminoácido 103 de la SEQ ID NO: 155 o 189 es un sitio de conjugación de origen natural. En algunas modalidades, la cisteína en la posición de aminoácido 109 de la SEQ ID NO: 155 o 189 es un sitio de conjugación de origen natural. En algunas modalidades, la cisteína en la posición de aminoácido 112 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ 189 es un sitio de conjugación de origen natural. En algunas modalidades, la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157 es un sitio de conjugación de origen natural.
En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden tener un fármaco, una toxina, o un radioisótopo conjugado en uno o más (por ejemplo, dos, tres, o cuatro) sitios de conjugación de origen natural, por ejemplo, la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 de la SEQ ID 155 o SEQ 189, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157. En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados en la presente descripción pueden tener un fármaco, una toxina, o un radioisótopo conjugado en uno o más (por ejemplo, dos, tres, o cuatro) sitios de conjugación de origen natural y uno o más (por ejemplo, dos, o tres) sitios de conjugación modificados genéticamente (por ejemplo, modificados genéticamente por sustituciones de aminoácidos, deleciones, adiciones, etc.).
La conjugación a través de cisteínas modificadas genéticamente se logra mediante métodos conocidos en la técnica. Brevemente, el anticuerpo que contiene cisteína modificada genéticamente se prepara para conjugarse mediante tratamiento con un agente reductor, por ejemplo, tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), o 2-mercaptoetanol (BME). En la reacción de reducción, el reactivo reductor con enlaces disulfuro en el anticuerpo, rompe los disulfuros intercadena y retira las caperuzas de disulfuro de las cisteínas modificadas genéticamente. Una etapa de reoxidación opcional, lograda por la exposición de la solución al aire, o un agente oxidante tal como el ácido deshidroascórbico, permite la reformación de los enlaces disulfuro intercadena, dejando las cisteínas modificadas genéticamente con un grupo reactivo de tiolato. La conjugación con una funcionalidad de maleimida en la carga útil de enlazador, la maleimida-vc-MMAE, se logra mediante reacción con la carga útil en solución amortiguada, que contiene un cosolvente tal como etanol, dimetilacetamida (DMA) o dimetilsulfóxido (DMSO). La solución de anticuerpo conjugado en bruto se purifica mediante cromatografía de exclusión por tamaño, o métodos de filtración selectivos, tales como la filtración de flujo tangencial. En esta etapa, la carga residual no reaccionada, el agente reductor y los agentes oxidantes se eliminan de la mezcla de reacción, y el producto ADC conjugado puede transferirse a un amortiguador de formulación deseable.
La conjugación a través de cisteínas en bisagra se logra mediante métodos similares, usando anticuerpos con, o sin, sitios de conjugación de cisteína modificados genéticamente adicionales. Brevemente, el anticuerpo se prepara para conjugarse mediante tratamiento con un agente reductor, por ejemplo, tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) o ditiotreitol (DTT). La resistencia y concentración reductora del agente reductor se seleccionan de manera que algunos o todos los enlaces disulfuro intercadena se reducen dejando cisteínas libres para la conjugación. La solución puede conjugarse directamente en presencia de un agente reductor en exceso. La conjugación con una funcionalidad de maleimida en la carga útil de enlazador, la maleimida-vc-MMAE, se logra mediante reacción con la carga útil en solución amortiguada, que contiene un cosolvente tal como etanol, dimetilacetamida (DMA) o dimetilsulfóxido (DMSO). La carga útil de enlazador no reaccionada puede volverse no reactiva mediante la adición de una molécula de tiolato de sacrificio tal como acetilcisteína. La solución de anticuerpo conjugado en bruto puede purificarse además mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de modo mixto tal como cromatografía de hidroxiapatita de cerámica. El aislamiento de las fracciones de cromatografía permite la selección de la relación entre el anticuerpo y la carga útil deseada y la eliminación del anticuerpo no reaccionado, los agregados y fragmentos de proteínas, y los productos secundarios de reacción relacionados con la carga útil. El conjugado anticuerpo purificado del fármaco puede purificarse además y por cromatografía de exclusión por tamaño, o métodos de filtración selectivos, tales como la filtración de flujo tangencial. En esta etapa, el producto ADC conjugado también puede transferirse a un amortiguador de formulación deseable.
En algunos ejemplos, puede hacerse un conjugado de anticuerpo que comprende un anticuerpo unido a la monometil auristatina E (MMAE) a través de un enlazador valina-citrulina (vc) (en adelante, MET-IgG-DC). La conjugación de la construcción de proteínas de unión a antígenos con vcMMAE comienza con una reducción parcial de la MET-IgG seguida de una reacción con maleimidocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE (vcMMAE). La MET-IgG (10 mg/ml) se reduce parcialmente al agregar TCEP (los equivalentes molares de TCEP:mAb son 2:1) seguido de incubación a 4 °C durante toda la noche. La reacción de reducción luego se calienta hasta 25 °C. Para conjugar todos los tioles, se agrega vcMMAE a una relación molar de vcMMAE:Cys reducida final de 1:10. La reacción de conjugación se lleva a cabo en presencia de 10 % v/v de dimetilacetamida (DMA) y se permite que continúe a 25 °C durante 60 minutos.
En algunos ejemplos, un conjugado de anticuerpo (ADC) que comprende la IgG de unión a MET (en adelante, MET-IgG) descrita en la presente descripción unida a monometil auristatina E (MMAE) mediante un enlazador de valina-citrulina (vc) (en adelante, MET-IgG-DC). La conjugación de la construcción de proteínas de unión a antígenos con vcMMAE comienza con una reducción parcial de la MET-IgG seguida de una reacción con maleimidocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE (vcMMAE). La MET-IgG (10 mg/ml) se reduce al agregar DTT (los equivalentes molares de DTT:mAb son 100:1) seguido de incubación a 25 °C durante toda la noche. La MET-IgG reducida (10 mg/ml) se vuelve a oxidar mediante la exposición a DHAA (los equivalentes molares de DHAA:mAb son 10:1) seguido de una incubación a 25 °C durante 2 horas. Para conjugar todos los tioles, se agrega vcMMAE a una relación molar de vcMMAE:mAb final de 4:1. La reacción de conjugación se lleva a cabo en presencia de 10 % v/v de DMA y se permite que continúe a 25 °C durante 3 horas.
Expresión de un anticuerpo en una célula
También se describen en la presente descripción métodos para generar una célula recombinante que expresa un anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción) que incluyen: introducir en una célula un ácido nucleico que codifica el anticuerpo para producir una célula recombinante; y cultivar la célula recombinante en condiciones suficientes para la expresión del anticuerpo. En algunas modalidades, la etapa de introducción incluye introducir en una célula un vector de expresión que incluye un ácido nucleico que codifica el anticuerpo para producir una célula recombinante.
Cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción puede producirse a partir de cualquier célula, por ejemplo, una célula eucariota o una célula procariota. Como se usa en la presente descripción, el término “célula eucariota” se refiere a una célula que tiene un núcleo distinto unido a la membrana. Tales células pueden incluir, por ejemplo, células de mamífero (por ejemplo, de roedor, de primate no humano, o humanas), insectos, hongos, o células vegetales. En algunas modalidades, la célula eucariota es una célula de levadura, tal comoSaccharomyces cerevisiae.En algunas modalidades, la célula eucariota es una eucariota más alta, tal como células de mamífero, ave, planta, o insecto. Como se usa en la presente descripción, el término “célula procariota” se refiere a una célula que no tiene un núcleo distinto unido a la membrana. En algunas modalidades, la célula procariota es una célula bacteriana.
Los métodos de cultivo de células son bien conocidos en la técnica. Las células pueden mantenersein vitroen condiciones que favorezcan la proliferación, diferenciación y crecimiento. Brevemente, las células pueden cultivarse al poner en contacto una célula (por ejemplo, cualquier célula) con un medio de cultivo celular que incluye los factores de crecimiento y complementos necesarios para apoyar la viabilidad y el crecimiento celular.
Los métodos para introducir ácidos nucleicos y vectores de expresión en una célula (por ejemplo, una célula eucariota) se conocen en la técnica. Los ejemplos no limitantes de métodos que pueden usarse para introducir un ácido nucleico en una célula incluyen lipofección, transfección, electroporación, microinyección, transfección con fosfato de calcio, transfección basada en dendrímeros, transfección con polímero catiónico, compresión celular, sonoporación, transfección óptica, impalección, administración hidrodinámica, magnetofección, transducción vírica (por ejemplo, transducción adenovírica y lentivírica) y transfección de nanopartícula.
Se describen en la presente descripción métodos que incluyen además el aislamiento de los anticuerpos a partir de una célula (por ejemplo, una célula eucariota) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, precipitación con polietilenglicol, cromatografía de intercambio iónico (anión o catión), cromatografía basada en interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad por metales, cromatografía de afinidad a ligandos, y cromatografía de exclusión por tamaño).
Métodos de tratamiento
Se proporcionan en la presente descripción métodos para tratar un cáncer caracterizado por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción o cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para reducir el volumen de un tumor en un sujeto, en donde el tumor se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción o cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el volumen de al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5) tumor (por ejemplo, tumor sólido) o ubicación del tumor (por ejemplo, un sitio de la metástasis) se reduce (por ejemplo, una reducción detectable) en al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 8 %, al menos 10 %, al menos 12 %, al menos 14 %, al menos 16 %, al menos 18 %, al menos 20 %, al menos 22 %, al menos 24 %, al menos 26 %, al menos 28 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 %) de reducción en comparación con el tamaño del al menos un tumor (por ejemplo, tumor sólido) antes de la administración del anticuerpo.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para inducir la muerte celular en una célula cancerosa en un sujeto, en donde la célula cancerosa tiene MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción o cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas. En algunas modalidades, la muerte celular que se induce es necrosis. En algunas modalidades, la muerte celular que se induce es apoptosis.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es un tumor primario.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es una metástasis.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es un tumor que no infiltra linfocitos T. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es un tumor que infiltra linfocitos T.
Se proporcionan en la presente descripción métodos para disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis o disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis adicional en un sujeto que tiene un cáncer, en donde el cáncer se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, que incluyen: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción o cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas. En algunas modalidades, disminuye el riesgo de desarrollar una metástasis o el riesgo de desarrollar una metástasis adicional (por ejemplo, una disminución detectable) en al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 8 %, al menos 10 %, al menos 12 %, al menos 14 %, al menos 16 %, al menos 18 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % en el sujeto en comparación con el riesgo de que un sujeto que tenga un cáncer similar, pero no se administró ningún tratamiento o se administró un tratamiento que no incluye la administración de ninguno de los anticuerpos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es un tumor que no infiltra linfocitos T. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es un tumor que infiltra linfocitos T. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el compartimento celular es parte de la vía endosómica/lisosómica. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el compartimento celular es un endosoma.
El término “sujeto” se refiere a cualquier mamífero. En algunas modalidades, el sujeto o “sujeto adecuado para el tratamiento” puede ser un canino (por ejemplo, un perro), felino (por ejemplo, un gato), equino (por ejemplo, un caballo), ovino, bovino, porcino, caprino, primate, por ejemplo, un simio (p. ej., un mono (por ejemplo, tití, mono babuino), o un simio (por ejemplo, un gorila, chimpancé, orangután o gibón), o un humano; o roedor (por ejemplo, un ratón, una cobaya, un hámster, o una rata). En algunas modalidades, el sujeto o “sujeto adecuado para el tratamiento” puede ser un mamífero no humano, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en seres humanos (por ejemplo, animales murinos, lapinos, porcinos, caninos o primates) pueden emplearse.
Como se usa en la presente descripción, el tratamiento incluye reducir la cantidad, frecuencia, o gravedad de uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, o cinco) signos o síntomas de un cáncer en un paciente que tiene un cáncer (por ejemplo, cualquiera de los cánceres descritos en la presente descripción). Por ejemplo, el tratamiento puede incluir reducir la progresión del cáncer, reducir la gravedad de un cáncer o reducir el riesgo de reaparición de un cáncer en un sujeto que tiene el cáncer.
En la presente descripción se describen métodos para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto (por ejemplo, cualquiera de los sujetos descritos en la presente descripción) que incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción (por ejemplo, en comparación con el crecimiento del tumor sólido en el sujeto antes del tratamiento o el crecimiento de un tumor sólido similar en un sujeto diferente que recibe un tratamiento diferente o que no recibe ningún tratamiento).
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el crecimiento de un tumor sólido es el crecimiento primario de un tumor sólido. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el crecimiento de un tumor sólido es el crecimiento recurrente de un tumor sólido. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el crecimiento de un tumor sólido es el crecimiento metastático de un tumor sólido. En algunas modalidades, el tratamiento da como resultado una disminución de aproximadamente 1 % a una disminución de aproximadamente 99 % (o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción) en el crecimiento de un tumor sólido en el sujeto (por ejemplo, en comparación con el crecimiento del tumor sólido en el sujeto antes del tratamiento o el crecimiento de un tumor sólido similar en un sujeto diferente que recibe un tratamiento diferente o que no recibe ningún tratamiento). El crecimiento de un tumor sólido en un sujeto puede evaluarse mediante una variedad de métodos de obtención de imágenes diferentes, por ejemplo, tomografía de emisión de positrones, tomografía computarizada de rayos X, tomografía axial computarizada, e imagenología por resonancia magnética.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis 0 desarrollar una metástasis adicional durante un período de tiempo en un sujeto identificado como un sujeto como un cáncer (por ejemplo, cualquiera de los tipos de cáncer ilustrativos descritos en la presente descripción) que incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las proteínas descritas en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción (por ejemplo, en comparación con un sujeto con un cáncer similar y que recibe un tratamiento diferente o no recibe ningún tratamiento). En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, la metástasis o metástasis adicional es una o más a un hueso, ganglios linfáticos, cerebro, pulmón, hígado, piel, pared torácica que incluye hueso, cartílago y tejido blando, cavidad abdominal, mama contralateral, tejido blando, músculo, médula ósea, ovarios, glándulas suprarrenales, y páncreas.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el periodo de tiempo es de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 años (por ejemplo, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 8 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 8 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 3 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 8 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 8 meses, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 8 meses, de aproximadamente 5 meses a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 8 meses, de aproximadamente 8 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 8 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 8 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 8 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 8 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 8 meses a aproximadamente 10 meses, de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 1,5 años, de aproximadamente 1,5 años a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 1,5 años a aproximadamente 2,5 años, de aproximadamente 1,5 años a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 2 años a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 2 años a aproximadamente 2,5 años, o de aproximadamente 2,5 años a aproximadamente 3 años).
En algunas modalidades, el riesgo de desarrollar una metástasis o desarrollar una metástasis adicional durante un período de tiempo en un sujeto identificado como sujeto con un cáncer disminuye en aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % (por ejemplo, o cualquiera de los subrangos de este rango descrito en la presente descripción), por ejemplo, en comparación con el riesgo en un sujeto que tiene un cáncer similar que recibe un tratamiento diferente o no recibe ningún tratamiento.
Los ejemplos no limitantes de cáncer incluyen: leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), carcinoma corticosuprarrenal, cáncer de ano, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células basales, tumor cerebral, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de mama, tumor bronquial, linfoma de Burkitt, carcinoma de origen primario desconocido, tumor cardíaco, cáncer de cuello uterino, cordoma, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), neoplasia mieloproliferativa crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, carcinoma ductal, tumor embrionario, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, histiocitoma fibroso, sarcoma de Ewing, cáncer ocular, tumor de células germinales, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cáncer de cabeza y cuello, leucemia de células pilosas, cáncer hepatocelular, histiocitosis, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, tumor de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer laríngeo, leucemia, cáncer de labios y cavidad oral, cáncer de hígado, carcinoma lobular in situ, cáncer de pulmón, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con carcinoma de origen primario desconocido, carcinoma de tracto de la línea media que implica el gen NUT, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, carcinomas broncopulmonares no microcíticos, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, papilomatosis, paraganglioma, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitomas, tumor de la hipófisis, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de la pelvis renal y el uréter, retinoblastoma, tumor rabdoide, cáncer de las glándulas salivales, síndrome de Sézary, cáncer de piel, carcinoma microcítico, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumor de la médula espinal, cáncer de estómago, linfoma de linfocitos T, tumor teratoide, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de la uretra, cáncer uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, y el tumor de Wilms. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de cáncer.
En algunas modalidades, al paciente se le administra además uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, uno o más de un agente quimioterápico, una citocina recombinante o proteína interleucina, un inhibidor de cinasas, y un inhibidor del punto de control). En algunas modalidades, el uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran al paciente aproximadamente al mismo tiempo que se administran al paciente cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, el uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran al paciente después de la administración de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción al paciente. En algunas modalidades, el uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran al paciente antes de la administración de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción al paciente.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el cáncer es un cáncer sólido (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de próstata, o carcinomas broncopulmonares no microcíticos).
Avidez
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de estos son multivalentes, y por lo tanto comprenden más de un sitio de unión. Generalmente, la medida de la fuerza de unión total de un anticuerpo en su sitio de unión se denomina avidez. Generalmente, los términos “avidez de pliegue” y “selectividad” pueden referirse a la diferencia de pliegue entre la afinidad de un anticuerpo y la avidez de un anticuerpo, por ejemplo, como se observa al medir la resistencia de unión total de un anticuerpo en una línea celular con alta expresión diana (avidez; por ejemplo, una célula cancerosa, por ejemplo, células Detroit-562) en comparación con la resistencia de unión total de un anticuerpo en una línea celular con una baja expresión diana (afinidad, por ejemplo, una célula no cancerosa, por ejemplo, células HUVEC). Generalmente, la avidez se determina mediante cuatro factores: la afinidad de unión (por ejemplo, la resistencia de la unión en un sitio de unión individual); la valencia (por ejemplo, la cantidad total de sitios de unión); la disposición estructural (por ejemplo, la estructura del antígeno y el anticuerpo); y la densidad de antígeno (por ejemplo, la cantidad de antígenos por célula).
En la presente descripción se proporcionan métodos para disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis o disminuir el riesgo de desarrollar una metástasis adicional en un sujeto que tiene un cáncer, donde el cáncer se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie, el método que comprende, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción a un sujeto identificado como un sujeto con un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden tener un aumento de al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 100 %, al menos 105 %, al menos 110 %, al menos 115 %, al menos 120 %, al menos 125 %, al menos 130 %, al menos 135 %, al menos 140 %, al menos 145 %, al menos 150 %, al menos 155 %, al menos 160 %, al menos 165 %, al menos 170 %, al menos 175 %, al menos 180 %, al menos 185 %, al menos 190 %, al menos 195 %, o al menos 200 % al menos 205 %, al menos 210 %, al menos 215 %, al menos 220 %, al menos 225 %, al menos 230 %, al menos 235 %, al menos 240 %, al menos 245 %, al menos 250 %, al menos 255 %, al menos 260 %, al menos 265 %, al menos 270 %, al menos 275 %, al menos 280 %, al menos 285 %, al menos 290 %, al menos 295 %, al menos 300 %, al menos 305 %, al menos 310 %, al menos 315 %, al menos 320 %, al menos 325 %, al menos 330 %, al menos 335 %, al menos 340 %, al menos 345 %, al menos 350 %, al menos 355 %, al menos 360 %, al menos 365 %, al menos 370 %, al menos 375 %, al menos 380 %, al menos 385 %, al menos 390 %, al menos 395 %, o al menos 400 %, en la selectividad para una célula cancerosa en comparación con una célula no cancerosa.
Composiciones
También se proporcionan en la presente descripción composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que incluyen al menos uno de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) pueden disponerse en un vial estéril o una jeringa precargada.
En algunas modalidades, las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) se formulan para diferentes vías de administración (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, o intratumoral). En algunas modalidades, las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato). Las administraciones únicas o múltiples de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden administrarse a un sujeto dependiendo de, por ejemplo: la dosificación y frecuencia según sea necesario y tolerado por el paciente. Una dosificación de la composición farmacéutica debe proporcionar una cantidad suficiente de anticuerpo para tratar o mejorar eficazmente afecciones, enfermedades, o síntomas.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para tratar a un sujeto que tiene un cáncer (por ejemplo, cualquiera de los tipos de cáncer descritos en la presente descripción) que incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una de cualquiera de las composiciones o composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción.
Kits
También se proporcionan en la presente descripción kits que incluyen cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, los kits pueden incluir instrucciones para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, los kits pueden incluir al menos una dosis de cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, los kits pueden proporcionar una jeringa para administrar cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción.
La invención se describe además en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Generación de aglutinantes de MET y genomodificación de la dependencia de unión del pHLos anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET se generan usando dos métodos. En el primer enfoque, los anticuerpos monoclonales publicados contra MET se usan como una plantilla inicial para la introducción de mutaciones adicionales que permiten la genomodificación de la unión dependiente del pH a MET y i) la acumulación endolisosómica mejorada de una toxina conjugada, así como ii) el reciclado mejorado de MET a la superficie celular. El segundo enfoque implica el descubrimiento de anticuerpos de novo específicos para MET a través de métodos de visualización de anticuerpos de genotecas o genotecas sin tratamiento previo con composiciones de CDR definidas y cribado en condiciones diseñadas para la selección de anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET. En cualquier caso, los residuos de histidina desempeñan un papel importante en la genomodificación de proteínas de unión dependientes del pH.
Los residuos de histidina se protonan al menos parcialmente a un pH inferior a 6,5 debido a su pKa de 6,0. Por lo tanto, si una cadena lateral de histidina en un dominio de unión a antígenos participa en una interacción de unión electrostática con su antígeno, comenzará a tener una carga positiva a un pH igual o inferior a 6,5. Esto podría debilitar o mejorar la afinidad de unión de la interacción a un pH inferior a 6,5, en función de la carga correspondiente del epítopo de antígeno y las interacciones con este. Por lo tanto, la introducción sistemática de histidinas en regiones determinantes de complementariedad de anticuerpos (CDR) en una genoteca de anticuerpos u otra genoteca de aglutinantes (por ejemplo, una genoteca de scFv) puede usarse para identificar sustituciones que afectarán la interacción de un dominio de unión a antígenos con un antígeno a valores de pH más bajos. Por lo tanto, el primer enfoque implica el escaneo de histidina de secuencias de regiones variables de anticuerpos monoclonales publicados para identificar variantes dependientes del pH.
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Brevemente, para un subconjunto de las secuencias de anticuerpos, las CDR en cada cadena se identifican usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos contenidos en una o ambas de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para modificar genéticamente variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada y/o cadena ligera se sustituyen sistemáticamente con una histidina, una a la vez. En los casos en que el residuo de CDR inicial es una histidina, se muta a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena pesada/ligera se generan por cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena pesada o cadena ligera, y b) la cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de unión a MET inicial), respectivamente, usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir un período de expresión de proteínas, los sobrenadantes de cultivo celular se recolectan, cuantifican, y la dependencia del pH de la variante se evalúa usando interferometría de biocapa (BLI, por sus siglas en inglés) u otros métodos conocidos en la técnica. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se normalizan a un nivel de expresión de anticuerpos de 50 pg/ml, y se capturan en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se establece un valor inicial usando un amortiguador de cinética 1<x>(Forte Bio), y el sensor se asocia con 100 nM de MET en PBS 1X a pH 7,4 durante 300 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expone a PBS 1X a pH 5,5 o pH 7,4 durante 300-500 segundos. Se examinan las curvas de la fase de asociación y disociación para el anticuerpo inicial y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,5 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) disociación mejorada (es decir, valores de koff más altos) a pH 5,5 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial, y b) disociación reducida a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,5 en la variante en sí misma del anticuerpo y con el anticuerpo inicial. Las variantes que muestran una disociación mejorada a pH 5,5 o una disociación reducida a pH 7,4, o ambas, se seleccionan para análisis adicionales. También se observa que si bien algunas mutaciones de histidina y alanina obliteran la unión a MET, otras se toleran con poco (p. ej., menos de 1 cambio múltiplo en la KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET. Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes de histidina y variantes de alanina sin cambios se observan como posiciones que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera. Las variantes seleccionadas para análisis adicional se expresan a mayor escala y se purifican usando cromatografía de afinidad de la proteína A. La cinética de unión (kon y koff) del anticuerpo inicial purificado y los anticuerpos variantes se miden a pH 5,5 y pH 7,4 usando Biacore (GE Healthcare). La relación de la tasa de disociación del anticuerpo (koff a pH 7,4 dividida por koff a pH 5,5) también se usa como una evaluación cuantitativa de la unión dependiente del pH; de manera similar, la constante de disociación KD se calcula tanto a pH 5,5 como a pH 7,4 como a koff dividido por kon y la relación de la constante de disociación del anticuerpo (KD a pH 7,4 dividida por KD a pH 5,5) también se usa como una evaluación cuantitativa de la unión dependiente del pH. Los anticuerpos con una tasa de relación de disociación menor que la del anticuerpo inicial y/o una relación de constante de disociación menor que la del anticuerpo inicial se seleccionan para una evaluación adicional de las sustituciones combinatorias. Las posiciones de aminoácido favorables de histidina y/o alanina también pueden combinarse para mejorar la dependencia del pH; esto puede hacerse, por ejemplo, combinando de manera combinada o racional las sustituciones de histidina y/o alanina en una cadena pesada o ligera determinada que mejora individualmente la dependencia del pH, por ejemplo, combinando de manera combinada o racional las cadenas pesada y ligera modificadas de tal manera que las sustituciones de histidina y/o alanina están presentes en ambas cadenas, o combinaciones de estas. Tales variantes combinatorias se generan y se prueban/analizan para determinar la dependencia del pH diferencial usando los métodos y protocolos descritos en la presente descripción, u otros conocidos por la técnica. Las variantes de anticuerpos que tienen la tasa más baja de relaciones de disociación y/o relaciones de constante de disociación se seleccionan como candidatos para un análisis adicional (en adelante denominados “anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET”).
El segundo método para la selección de anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET implica cribar genotecas para identificar anticuerpos de novo dependientes del pH específicos para MET o anticuerpos que podrían servir como plantillas para la modificación genética de la unión dependiente del pH como se describe en la presente descripción. Pueden usarse dos tipos de genotecas para estas selecciones: genotecas de anticuerpos de visualización de fagos/levaduras sin tratamiento previo (por ejemplo, Fab, scFv, VHH, VL, u otras conocidas por la técnica) o genotecas de visualización de fagos/levaduras donde las CDR se han mutado para expresar un subconjunto de residuos de aminoácidos. Las genotecas se criban contra dominios extracelulares de MET recombinantes solubles usando métodos conocidos en la técnica con selección positiva para variantes que se unen débilmente (por ejemplo, se eluyen de esferas) a pH 5,0 y se unen fuertemente (por ejemplo, se unen a esferas) a pH 7,4. Se realizan tres rondas de selecciones. La ronda final de aglutinantes se criba usando ELISA para la unión a MET humano y MET cyno y MET de ratón o mediante intensidad de fluorescencia media en el análisis por citometría de flujo. Si se desean más aglutinantes con reactividad cruzada de cyno o murino, la ronda de selección final puede realizarse en MET cyno o MET murino. Las proteínas de unión seleccionadas se subclonan en vectores de expresión de mamíferos y se expresan como proteínas IgG completas o fusiones Fc en células Expi293. El análisis de BLI se realiza como se describe en la presente descripción para la selección de variantes aglutinantes dependientes del pH y se confirma usando Biacore.
Ejemplo 2. Demostración in vitro de la unión dependiente del pH a MET, la liberación dependiente del pH de MET, la administración endolisosómica mejorada en células MET+ y el aumento de la densidad de antígenos de MET en células MET+ después de la exposición a anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con los anticuerpos de control específicos para MET.
Como se describe en la presente descripción, los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET exhiben la propiedad deseable de la unión a MET reducida a pH ácido (por ejemplo, pH 5,0, pH 5,5), pero una unión mejorada a pH más alto (por ejemplo, pH 7,4), que mejora su acumulación en endolisosomas en condiciones fisiológicas.
Unión dependiente del pH a MET en células
Para demostrar que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET se unen a MET en la superficie celular a un pH neutro, se realiza un ensayo de unión a la superficie celular. Se ensambla un panel de células humanas que son MET+ (p. ej., Hs 746T ATCC núm. de cat. HTB-135, NCI-H441 ATCC núm. de cat. HTB-174, NCI-H820 ATCC núm. de cat. HTB-181). En la técnica se conocen métodos para identificar y cuantificar la expresión génica (por ejemplo, MET) de una línea celular dada, e incluyen, por ejemplo, consultar la Enciclopedia de la línea celular del cáncer (CCLE; https://portals.broadinstitute.org/ccle) para determinar el nivel de expresión y/o el estado de mutación de un gen determinado en una línea celular tumoral), rtPCR, micromatrices, o análisis de secuenciación de ARN, o tinción celular con anticuerpos conocidos en la técnica (por ejemplo, Telisotuzumab o Tecnología de señalización celular Met (D1C2) XP mAb de conejo núm. de cat. 8198, o anticuerpo HGFR/c-MET humano R&D Systems Clone#95106 núm. de cat. MAB3582 para MET). Las células se siembran a aproximadamente 5-10.000 por pocillo en 150 pl de medio de cultivo a pH 7,4 y se incuban a 37 °C durante 5 minutos en varias dosis (por ejemplo, una serie de dilución doble) de 1 pM a 1 pM con uno de los siguientes anticuerpos: un anticuerpo de control conocido específico para MET (por ejemplo, un anticuerpo, telisotuzumab, emibetuzumab, hucMET27Gv1,3, o P3D12), el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET, y un mAb de control de isotipo negativo adecuado (por ejemplo, anticuerpo recombinante de control de isotipo IgG1 humano purificado Biolegend, núm. de cat. 403501). Antes del inicio del experimento, las propiedades de unión de todos los anticuerpos se validan usando métodos conocidos por la técnica. Después de la incubación de 5 minutos, las células se fijan con 4 % de formaldehído (20 min a temperatura ambiente) y se incuban con un anticuerpo secundario adecuado marcado con fluoróforo (por ejemplo, anticuerpo secundario Fc de lgG1 antihumana de ratón ThermoFisher, Alexa Fluor 488, núm. de cat. A-10631) durante 60 minutos. Los reactivos no unidos se lavan con una serie de lavados de PBS, y los paneles celulares se toman usando microscopía confocal. Tras el análisis de las imágenes, se puede observar una fluorescencia significativa en la superficie de las células unidas con el anticuerpo de control conocido específico para MET, así como el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET, pero se puede observar poca unión superficial para el control negativo de isotipo. Para aislar el efecto del pH en la unión a la superficie, el mismo experimento se repite dos veces, con la incubación del anticuerpo primario que tiene lugar a un pH secuencialmente menor (por ejemplo, pH 6,5 y 5,5 y 5,0). El análisis de las imágenes de microscopía confocal resultantes puede mostrar una fluorescencia significativa en la superficie de las células unidas con todos los mAb evaluados, excepto el control negativo de isotipo, y que esta fluorescencia disminuye para el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET a medida que disminuye el pH. Alternativamente, las células se analizan para determinar la intensidad fluorescente media mediante citometría de flujo usando métodos conocidos en la técnica. Una constante de disociación KD en células a pH neutro de los anticuerpos analizados se determina mediante métodos de regresión no lineales conocidos en la técnica (por ejemplo, un gráfico de Scatchard). Tomados en conjunto, los resultados pueden mostrar que el proceso de modificación genética por pH da como resultado la creación de un anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET que es dependiente del pH en sus propiedades de unión y que se une de manera más eficaz a un pH neutro en comparación con un pH más ácido. Otros métodos para evaluar la dependencia del pH de los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, usar citometría de flujo para medir la unión a la superficie del anticuerpo.
Liberación dependiente del pH de MET en células
Para demostrar que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET son capaces de liberar MET a un pH bajo después de la unión a un pH neutro, se realiza una variante del ensayo de unión a la superficie celular descrito anteriormente usando métodos conocidos por la técnica (por ejemplo, como se describe generalmente en Gera N. (2012) PLoS ONE 7(11): e48928). Brevemente, se recolecta una línea celular MET+ adecuada (número de pasaje menor a 25) y se preparan 50.000 células por pocillo en una microplaca de 96 pocillos con fondo en U. Se evalúan tres condiciones: unión y tinción secundaria con pH 7,4, unión y tinción secundaria con pH 5,0, y unión con pH 7,4, seguida de liberación con pH 5,0 durante 30 minutos y tinción secundaria con pH 7,4. Se evalúan tanto anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET como anticuerpos de control específicos para MET. Las células se lavan dos veces con 200 pl de amortiguador FACS (PBS 1x que contiene 3 % de suero fetal bovino) a pH 7,4 o 5,0 dependiendo de la condición que se esté evaluando. Las muestras de proteína purificada se diluyen en amortiguador FACS del pH adecuado y se agregan a las células y se dejan unirse durante una hora en hielo. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las condiciones de pH 7,4 y pH 5,0 se lavan dos veces como antes, y luego se agregan 100 pl de Fc AF488 antihumano de rata secundario (BioLegend 410706) u otro anticuerpo adecuado, diluido 1:50, o mAb-AF488 de ratón anti Myc-Tag (Cell Signaling Technologies 2279S) diluido 1:50 en amortiguador FACS del pH adecuado, y se incuba durante 30 minutos en hielo. La condición de liberación de pH 5,0 se lava dos veces con amortiguador FACS con pH 7,4 y luego se resuspende en 100 pl de amortiguador FACS con pH 5,0 y se incuba en hielo durante 30 minutos, seguido de una tinción secundaria en amortiguador FACS con pH 7,4, como se describe para las otras condiciones. Las placas se lavan dos veces como antes y se resuspenden en 1 % de paraformaldehído en el amortiguador FACS adecuado para fijarlas para el análisis de citometría de flujo. Todas las condiciones se leen en un citómetro de flujo (Accuri C6, BD Biosciences). La unión se observa como un cambio en la señal FLl (como una intensidad de fluorescencia media) en comparación con el secundario solo. Tras el análisis de los datos, se puede determinar que tanto el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET así como el anticuerpo de control específico para MET se unen eficazmente a la superficie de las células MET+ a pH neutro, pero el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET se une de manera deficiente a pH 5,0; de manera similar, se puede determinar que el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET se une eficazmente a pH 7,4, pero después se libera/separa de MET a pH 5,0.
Administración endolisosómica mejorada en células MET+ de anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con anticuerpos de control específicos para MET (pHrodo)
Para verificar y demostrar que los anticuerpos específicos para MET logran la localización endolisosómica después de la captación celular, se realiza un ensayo de internalización usando métodos conocidos por la técnica (por ejemplo, Mahmutefendic et al., Int. J. Biochem. Cell Bio., 2011). Brevemente, como se describe en la presente descripción, un panel de células humanas que expresan altamente MET se ensambla usando métodos conocidos por la técnica. Las células se preparan en placas, se lavan tres veces con PBS, y se incuban a 37 grados C durante 60 minutos en medio a pH neutro, con concentraciones agregadas de 2 microgramos por mililitro de un anticuerpo de control conocido específico para MET (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET y un mAb de control de isotipo negativo adecuado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En un subconjunto de células, la validación de la intemalización de anticuerpos y la localización endosómica se realiza usando métodos conocidos por la técnica; por ejemplo, las células se fijan en 4 % de formaldehído como se describe en la presente descripción, permeabilizado usando TWEEN 20 u otros métodos conocidos por la técnica (Jamur MC et al (2010) Permeabilization of cell membranes, Methods Mol Biol. 588:63-6), teñido adicionalmente con un marcador endosómico, por ejemplo, un anticuerpo fluorescente RAB11 (anticuerpo RAB11, Alexa Fluor 488, 3H18L5 ABfinity™ Monoclonal de conejo), teñido con un anticuerpo secundario antihumano marcado con fluorescencia adecuado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), y se toman imágenes usando microscopía fluorescente confocal, como se describe en la presente descripción. El análisis de las imágenes confocales puede usarse para mostrar que tanto el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET así como el anticuerpo de control específico para MET se internalizan y se acumulan en los endolisosomas.
Para demostrar que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET logran una acumulación endolisosómica mejorada con relación a un anticuerpo de control específico para MET, se realiza un ensayo de internalización basado en pHrodo usando un anticuerpo de control conocido específico para MET (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) así como también el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET. El ensayo hace uso de pHrodo™ iFL (P36014, ThermoFisher), un tinte cuya fluorescencia aumenta con un pH decreciente, de manera que su nivel de fluorescencia fuera de la célula a un pH neutro es menor que su nivel de fluorescencia dentro del entorno de pH ácido de los endolisosomas. Brevemente, una línea celular MET+ adecuada (menor que pasaje 25) se suspende en su medio recomendado (por ejemplo, mediante bancos de células o bases de datos de bancos de células ATCC, DSMZ, o ExPASy Cellosaurus) y se prepara en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2.000.000 de células/ml, 1 ml por pocillo. Mientras se mantienen las células en hielo, se agrega 1 ml de anticuerpo marcado con pHrodo iFL 2x (preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante) a cada pocillo, el pocillo se pipetea/mezcla cinco veces y la placa se incuba en un entorno protegido de la luz durante 45 minutos, en hielo. También se incuba una placa idéntica, pero separada, en hielo que se entiende como un control negativo sin internalización. Después de esta incubación, la placa experimental se traslada a una incubadora a 37 °C, la placa de control negativo se mantiene en hielo para ralentizar o bloquear la internalización, y las muestras se toman en puntos cronológicos designados para crear un curso cronológico de internalización. Las muestras se colocan en una placa de 96 pocillos con fondo en U, y la internalización se inactiva mediante la adición de 200 pl/pocillo de amortiguador FACS helado. Las placas se centrifugan a 2000xg durante 2 minutos, se resuspenden en 200 pl de amortiguador FACS helado, se centrifugan nuevamente y se resuspenden en amortiguador FACS por segunda vez. Finalmente, las muestras se cargan en un citómetro de flujo para la lectura de la fluorescencia de pHrodo celular usando longitudes de onda de excitación y emisión compatibles con los máximos de excitación y emisión del tinte pHrodo iFL Red (566 nm y 590 nm, respectivamente). Tras la finalización del experimento de citometría de flujo y el análisis de los datos, se puede observar que las células tratadas con anticuerpo modificado genéticamente con pH específico para MET tienen una señal de pHrodo iFL más alta en relación con un anticuerpo de control conocido específico para MET, lo que indica que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET logran una acumulación endolisosómica mejorada en relación con un anticuerpo de control específico para MET.
Alternativamente, para demostrar que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET logran una acumulación endolisosómica mejorada con relación a un anticuerpo de control específico para MET, se realiza una variación del experimento descrito anteriormente. Las células MET+ se preparan, se lavan tres veces con PBS y se incuban a 37 °C durante 60 minutos en medios con pH neutro con concentraciones agregadas de 2 pg/ml de anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET o anticuerpo de control específico para MET. Después de la incubación, las células se lavan tres veces con PBS, se fijan y se permeabilizan, y se tiñen con un panel de anticuerpos seleccionados adecuadamente que se unen a marcadores endosómicos tardíos así como a lisosomas (por ejemplo, RAB7, y LAMP1; tecnología de señalización celular, kit de muestra de anticuerpo marcador de endosoma núm. 12666; AbCam, anticuerpo anti-LAMP2 [GL2A7], ab13524). Después de la tinción con anticuerpos primarios, las células se tiñen con una mezcla adecuada de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (por ejemplo, anticuerpo secundario de IgG antihumana de cabra (H&L) (Alexa Fluor 647) núm. de cat. A-21445, e IgG anticonejo de cabra H&L Abcam (Alexa Fluor 488), núm. de cat. ab150077), se capturan imágenes usando microscopía de fluorescencia confocal, y se visualizan y cuantifican regiones de colocalización de señal a partir de anticuerpos específicos para MET y marcadores endosómicos. Tras el análisis de los datos, puede revelarse que hay un aumento de la colocalización de la señal de anticuerpos endolisosómicos y específicos para MET en los pocillos tratados con los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con los pocillos tratados con anticuerpo de control específico para MET y, por lo tanto, puede demostrarse que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET logran una acumulación endolisosómica mejorada en relación con el anticuerpo de control específico para MET.
Aumento de la densidad del antígeno de MET en células MET+ después de la exposición a anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con anticuerpos de control específicos para MET
Para demostrar que el tratamiento de las células con anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET no da como resultado una reducción detectable del nivel de MET en la superficie de las células expuestas a los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET, o que dicho tratamiento da como resultado una reducción menor del nivel de MET en la superficie de las células expuestas al anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET en comparación con un anticuerpo de control específico para MET, se realiza un estudio de densidad de antígenos usando citometría de flujo. Brevemente, las células 4,0x10A5 que expresan MET se preparan por pocillo en una placa de 96 pocillos en un medio de 100 pl. Las células se tratan con una titulación de 1 pM a 1 pM de i) anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET, ii) un primer anticuerpo de control específico para MET, iii) un control de isotipo adecuado, y iv) un control no tratado. Las células se incuban durante 2 horas a 37 °C, en cuyo punto todas las células se incuban con 200 nM de un anticuerpo de control secundario marcado con fluoróforo específico para MET (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que tiene un epítopo diferente (según lo determinado por, por ejemplo, estudios de unión competitiva en células) que el primer anticuerpo de control específico para MET o los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET durante 30 minutos a 4 °C. Después de esta incubación de 30 minutos, la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) de todas las células se lee usando, por ejemplo, citometría de flujo, usando métodos conocidos por un experto en la técnica. En paralelo, se genera una curva estándar cuantitativa que puede usarse para cuantificar la presencia de MET en la superficie de las células tratadas como una función de la MFI usando un kit de cuantificación disponible comercialmente (por ejemplo, kit de cuantificación de fluorescencia de ficoeritrina BD Biosciences PE, núm. de cat. 340495); la curva estándar cuantitativa se crea siguiendo las instrucciones del fabricante. Otros métodos para determinar la cantidad absoluta de MET en la superficie celular se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de reactivos radioisotópicamente etiquetados. Tras el análisis de los datos, puede revelarse que al menos una concentración de anticuerpos, las células tratadas con un anticuerpo de control específico para MET experimentan una reducción del nivel de MET en su superficie, mientras que las células tratadas con anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET experimentan una reducción significativamente menor o ninguna reducción en absoluto, tanto en relación con el isotipo como con los controles no tratados.
Ejemplo 3. Conjugación de anticuerpos modificados genéticamente por pH y de control específicos para MET a fármacos citotóxicos
Se realiza un conjugado de anticuerpo (ADC) que comprende la IgG de unión a MET (en adelante, MET-IgG) descrita en la presente descripción unida a monometil auristatina E (MMAE) mediante un enlazador de valinacitrulina (vc) (en adelante, MET-IgG-DC). La conjugación de la construcción de proteínas de unión a antígenos con vcMMAE comienza con una reducción parcial de la MET-IgG seguida de una reacción con maleimidocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE (vcMMAE). La MET-IgG (20 mg/ml) se reduce parcialmente al agregar TCEP (los equivalentes molares de TCEP:mAb son 2:1) seguido de incubación a 0 °C durante toda la noche. La reacción de reducción luego se calienta hasta 20 °C. Para conjugar todos los tioles, se agrega vcMMAE a una relación molar de vcMMAE:Cys reducida final de 1:15. La reacción de conjugación se lleva a cabo en presencia de 10 % v/v de DMSO y se permite que continúe a 20 °C durante 60 minutos.
Después de la reacción de conjugación, se agrega el exceso de N(acetil)-cisteína libre (2 equivalentes frente a la carga de vcMMAE) para inactivar el vcMMAE no reaccionado para producir el aducto Cys-Val-Cit-MMAE. Se permite que la reacción de inactivación de Cys continúe a 20 °C durante aproximadamente 30 minutos. La mezcla de reacción inactivada de Cys se purifica según se indica a continuación. El método de conjugación anterior también puede usarse para conjugar la maleimidocaproilo monometilauristatina F (mcMMAF) a una construcción de proteína de unión a antígenos.
El MET-IgG-DC se purifica usando un método de purificación por lotes. La mezcla de reacción se trata con la cantidad adecuada de resina Bu-HIC lavada con agua (ToyoPearl; Tosoh Biosciences), es decir, se agregan siete pesos de resina a la mezcla. La mezcla de resina/reacción se agita durante el tiempo adecuado, y se monitorea mediante cromatografía de interacción hidrófoba analítica para la eliminación de productos conjugados farmacológicos, se filtra a través de un filtro de polipropileno grueso, y se lava con dos volúmenes de lecho de un amortiguador (0,28 M de cloruro de sodio, 7 mM de fosfato de potasio, pH 7). El filtrado y los enjuagues combinados se combinan y analizan para determinar el perfil del producto mediante HIC HPLC. El filtrado combinado y los enjuagues se intercambian con amortiguador mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) a 15 mM de histidina, pH 6 con 10 diavolúmenes de 15 nM de amortiguador de histidina.
Puede usarse un protocolo similar para conjugar toxinas de ADN tales como SG3249 y SGD-1910 a MET-IgG (véase Tiberghien AC et al (2016) Design and Synthesis of Tesirine, a Clinical Antibody-Drug Conjugate Pyrrolobenzodiazepine Dimer Payload, ACS Med Chem Lett 7:983-987). En resumen, para SG3249, MET-IgG (15 mg, 100 nanomoles) se diluye en 13,5 ml de amortiguador de reducción que contiene 10 mM de borato de sodio con pH 8,4, 2,5 mM de EDTA y una concentración final de anticuerpos de 1,11 mg/ml. Se agrega una solución de 10 mM de TCEP (1,5 equivalente molar/anticuerpo, 150 nanomoles, 15 microlitros) y la mezcla de reducción se calienta a 37 °C durante 1,5 horas en una incubadora. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agrega SG3249 como una solución de DMSO (5 equivalentes molares/anticuerpos, 500 nanomoles, en 1,5 ml de DMSO). La solución se mezcla durante 1,25 horas a temperatura ambiente, luego la conjugación se inactiva mediante la adición de N-acetil cisteína (1 micromol, 100 microlitros a 10 mM), y se inyecta en un AKTA™ Pure FPLC usando una columna GE Healthcare HiLoadTM 26/600 empaquetada con Superdex 200 PG, y eluida con 2,6 ml/min de solución salina amortiguadora de fosfato con filtro estéril (PBlib). Las fracciones correspondientes al pico de monómero MET-IgG-DC se agrupan, se concentran usando un filtro de centrifugación Amicon Ultracell 50KDa MWCO de 15 mL, se analizan y se filtran de forma estéril. El análisis por UHPLC en un sistema de prominencia Shimadzu usando una columna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 de 150 x 2,1 mm que eluye con un gradiente de agua y acetonitrilo en una muestra reducida de MET-IgG-DC a 280 nm y 330 nm (específico de SG3249) puede mostrar una mezcla de cadenas ligeras y pesadas unidas a varias moléculas de SG3249, coherente con una relación de fármaco por anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés) de 1 a 4 moléculas de SG3249 por cada anticuerpo. El análisis por UHPLC en un sistema de prominencia Shimadzu usando una columna Phenomenex Yarra 3u SEC-3000 de 300 mm x 4,60 mm que eluye con amortiguador de SEC con filtro estéril que contiene 200 mM de fosfato de potasio con pH 6,95, 250 mM de cloruro de potasio y 10 % de isopropanol (v/v) en una muestra de MET-IgG-DC a 280 nm puede mostrar una pureza de monómero mayor que 90 % sin ninguna impureza detectada. El análisis por UHPLC SEC permite la determinación del rendimiento final de MET-IgG-DC mayor que 30 %.
Alternativamente, los métodos para conjugar toxinas a anticuerpos a través de residuos de lisina se conocen en la técnica (por ejemplo, ver Catcott KC et al (2016) Microscale screening of antibody libraries as maytansinoid antibody-drug conjugates, MAbs 8:513-23). Además, pueden usarse métodos similares a los anteriores para conjugar fármacos y toxinas a formatos no IgG con enlaces disulfuro, tales como Vh-Fcs.
Ejemplo 4. Demostración de citotoxicidad mejorada de ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET en células MET+ en comparación con un ADC de control específico para METLa actividad citotóxica de ambos ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET (por ejemplo, un MET-IgG-DC modificado genéticamente por pH) y ADC de anticuerpo de control específico para m Et (por ejemplo, un MET-IgG-DC de anticuerpo de control) se evalúa por separado en un panel de líneas celulares MET+ que expresan una variedad de densidades de antígeno (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y una línea celular MET- (por ejemplo, T-47D ATCC núm. de cat. HTB-133), seleccionada usando los métodos descritos en la presente descripción, y, opcionalmente, células que expresan MET transgénico, por ejemplo, células HEK293 transfectadas con MET usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, kit del sistema de expresión Expi293™ ThermoFisher número de catálogo: A14635). Para los fines de validación, antes de su uso, todas las líneas celulares se prueban para determinar la expresión de MET usando métodos conocidos por la técnica, por ejemplo, qPCR, citometría de flujo, ARNm RPKM, y tinción de anticuerpos usando anticuerpos anti-MET conocidos por la técnica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) seguido de la visualización de la tinción usando microscopia fluorescente, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ELISA, u otro método conocido en la técnica. Para evaluar la citotoxicidad de los compuestos, las células se siembran a aproximadamente 10-40.000 por pocillo en 150 microlitros de medio de cultivo, luego se tratan con dosis clasificadas de compuestos de 1pM a 1 |<j>M en cuadruplicados al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se llevan a cabo durante 96 horas después de la adición de los compuestos de prueba. Se agregan cincuenta microlitros de tinte de resazurina a cada pocillo durante las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. La reducción del colorante se determina mediante espectrometría de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitación y emisión de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el análisis, el grado de reducción de la resazurina por parte de las células tratadas se compara con el de las células de control no tratadas, y se determina el porcentaje de citotoxicidad. Alternativamente, se usa un kit WST-8 para medir la citotoxicidad según las instrucciones del fabricante (por ejemplo, Dojindo Molecular Technologies núm. de cat. CCK-8). IC50, la concentración a la cual se observa la destrucción semi-máxima, se calcula usando métodos de ajuste de curva conocidos en la técnica. Tras el análisis de los datos, se puede determinar que los ADC de anticuerpo modificado genéticamente por pH y de control específicos para MET son sustancialmente citotóxicos para una o más líneas celulares MET+, pero menos tóxicos para las células MET-. También puede determinarse que los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET son más citotóxicos para una o más líneas celulares MET+ que los ADC de anticuerpo de control específicos para MET porque: a) muestran una mayor profundidad de destrucción en una o más concentraciones o, b) muestran una IC50 menor o, c) muestran una mayor relación de su constante de disociación KD en las células a pH neutro (como se describe en la presente descripción) dividida por su IC50 en esas mismas células.
Además, la actividad citotóxica de los anticuerpos específicos para MET puede medirse en un ensayo de ADC secundario. Los ensayos de ADC secundarios se conocen en la técnica (por ejemplo, Moradec núm. de cat. aHFc-NC-MMAF y núm. de cat. aHFc-CL-MMAE, y las instrucciones del fabricante asociadas). Brevemente, el ensayo se realiza como en el párrafo anterior, excepto que el anticuerpo específico para MET se sustituye por el a Dc específico para MET, y para evaluar la citotoxicidad de los compuestos, las células se siembran a aproximadamente 10-40.000 por pocillo en 150 microlitros de medio de cultivo, después se tratan con dosis calificadas de anticuerpo específico para MET de 1 pM a 1 j M (concentración final en medio de cultivo, habiéndose premezclado con 100 nM, concentración final en medio de cultivo, del reactivo de ADC secundario Moradec núm. de cat. aHFc-NC-MMAF y preincubado a 37 °C durante 30 minutos antes de la adición de la mezcla al medio de cultivo) en cuadruplicados al inicio del ensayo.
La actividad citotóxica de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET y los ADC de anticuerpo de control específicos para conjugados de MET, así como los anticuerpos específicos para MET en un ensayo de ADC secundario, se miden adicionalmente mediante un ensayo de proliferación celular que emplea el siguiente protocolo (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al., Cancer Res. 62:5485-5488, 2002):
1. Una alícuota de 100 microlitros de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (por ejemplo, células MET+ como se describe en la presente descripción) en medio se deposita en cada pocillo de una placa de paredes opacas de 96 pocillos.
2. Los pocillos de control se preparan con medio y sin células.
3. El ADC específico para MET se agrega a los pocilios experimentales en un rango de concentraciones de 1pM-1uM y se incuba durante 1-5 días. Alternativamente, en un ensayo de ADC secundario, 100 nM de reactivo de ADC secundario (concentración final en medio de cultivo, Moradec núm. de cat. aHFc-NC-MMAF) y anticuerpo específico para MET en un rango de concentraciones de 1pM-1uM (concentración final en medio de cultivo) se mezclan previamente y se incuban previamente a 37 °C durante 30 min antes de la adición de la mezcla al medio de cultivo y se incuban durante 1-5 días.
4. Las placas se equilibran a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
5. Se agrega un volumen de reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pocillo.
6. El contenido se mezcla durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
7. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia.
8. La luminiscencia se registra e informa en los gráficos como RLU = unidades de luminiscencia relativas.
Ejemplo 5. Demostración de liberación de toxinas mejorada de ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET en células MET+ en comparación con un ADC de control específico para METLos ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET (por ejemplo, un MET-IgG-DC modificado genéticamente por pH) también pueden demostrar un aumento de la liberación de toxinas en células MET+ en comparación con un ADC de anticuerpo de control específico para MET (por ejemplo, un MET-IgG-DC de anticuerpo de control). Después del tratamiento de células MET+ con ADC de anticuerpo de control y modificado genéticamente por pH específico para MET como se describe en la presente descripción, se usa un método LC-MS/MS para cuantificar la MMAE no conjugada (es decir, liberada) en células MET+ tratadas (Singh, A.P. y Shah, D.K. Drug Metabolism and Disposition 45,11 (2017): 1120-1132). Se usa un sistema LC-MS/MS con interfase de electrospray y espectrómetro de masas de cuadrupolo triple. Para la detección de la MMAE, se usa una columna de amida XBridge BEH (Waters, Milford, MA) con la fase móvil A como agua (con 5 mM de formiato de amonio y 0,1 % de ácido fórmico) y la fase móvil B como 95:5 de acetonitrilo/agua (con 0,1 % de ácido fórmico y 1 mM de formiato de amonio), usando un gradiente a una velocidad de flujo de 0,25 ml/min a 40 °C. La duración total de la ejecución cromatográfica es de 12 minutos, donde se monitorean dos escaneos MRM (718,5/686,5 y 718,5/152,1 amu). Se usa MMAE deuterada (d8) (MCE MedChem Express, Monmouth Junction, NJ) como estándar interno. Primero, se deriva una ecuación para cuantificar la MMAE no conjugada en una muestra biológica al dividir el área del pico para cada estándar de fármaco por el área del pico obtenida para el estándar interno. Luego, las relaciones del área del pico resultante se grafican como una función de las concentraciones estándar, y los puntos de datos se ajustan a la curva mediante regresión lineal. Se incluyen tres muestras de QC en los rangos inferior, medio y superior de la curva estándar para evaluar la capacidad predictiva de la curva estándar desarrollada. Las curvas estándar obtenidas se usan luego para deducir las concentraciones observadas de MMAE en una muestra biológica. Para la medición de la concentración de MMAE, las muestras celulares tratadas se sedimentan y se reconstituyen en medios frescos hasta una concentración final de 0,25 millones de células/100 pL. Las muestras se enriquecen con d8-MMAE (1 ng/ml) antes de realizar la lisis celular agregando un volumen doble de metanol helado seguido de un ciclo de congelación-descongelación de 45 minutos a -20 °C. El lisado celular final se obtiene centrifugando las muestras a 13,000 rpm durante 15 minutos a 4 °C, seguido de la recolección del sobrenadante. Para la preparación de los estándares y las muestras de QC, se enriquece una suspensión celular nueva (0,25 millones/100 pl) con concentraciones conocidas de MMAE y estándar interno (d8-MMAE) antes de un procedimiento similar a la lisis celular mencionada anteriormente. Los lisados celulares resultantes después se evaporan y reconstituyen en la fase móvil B antes de la inyección en LC-MS/MS. Se observa que la concentración de MMAE no conjugada en lisados de células MET+ tratadas con ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET es mayor que en células MET+ tratadas con ADC de anticuerpo de control específico para MET.
En el caso de las toxinas inhibidoras de la tubulina, la liberación de toxinas también se evalúa mediante el monitoreo de la viabilidad celular y la fase del ciclo celular. Las células MET+ ~2,0x10A5 se preparan en una placa de fondo plano de 96 pocillos y se tratan con ADC de anticuerpo de control y modificado genéticamente por pH específico para MET como se describe en la presente descripción. Después del tratamiento, las células se transfieren a una placa inferior de 96 círculos, y la placa se centrifuga a 400 rcf durante 2 minutos para decantar el sobrenadante. Las células decantadas se tiñen con eFluor 660 vivo/muerto. Luego, las células se centrifugan y se lavan con amortiguador FACS (PBS con 2 % de FBS), después de lo cual se analiza la distribución del ciclo celular con un kit de ADN BD Cycletest™ Plus (núm. de cat. 340242). Brevemente, las células se resuspenden en 76 ul de solución A y se incuban durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se agrega 61 pl de solución B, y las células se incuban durante otros 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se agregan 61 pl de solución C fría, y las células se vuelven a incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la última etapa de incubación, las células se analizan mediante citometría de flujo (sin lavado) a una velocidad de flujo de 10 pl/seg. Se puede observar un aumento de la detención de la fase G2/M con la exposición a ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con ADC de anticuerpo de control específico para MET.
Para las toxinas que dañan el ADN (por ejemplo, pirrolobenzodiacepina o “PBD”), el daño en el ADN se evalúa mediante la medición de la histona fosforilada H2AX (yH2AX). H2AX normalmente está fosforilada en respuesta a roturas de doble cadena en el ADN; sin embargo, el aumento de los niveles de yH2AX también puede observarse como resultado del tratamiento con toxinas de reticulación de ADN tales como PBD o cisplatino (Huang, X. et al.
2004, Cytometry Part A 58A, 99-110). Las células MET+ se tratan con ADC de anticuerpo modificado genéticamente por pH y de control específico para MET como se describe en la presente descripción. Después del tratamiento, las células se enjuagan con PBS y luego se fijan en suspensión en 1 % de formaldehído sin metanol (Polysciences, Warrington, PA) en PBS a 0 °C durante 15 min. Las células se resuspenden en 70 % de etanol durante al menos 2 h a -20 °C. Luego, las células se lavan dos veces en PBS y se suspenden en 0,2 % de Triton X-100 (Sigma) en 1 % (p/v) de una solución de BSA (Sigma) en PBS durante 30 minutos para suprimir la unión a Ab no específicos. Las células se centrifugan nuevamente (200 g, 5 min) y el sedimento celular se suspende en 100 |jl de 1 % de BSA que contiene 1:800 Ab policlonal de antihistona yH2a X diluida (Trevigen, Gaithersburg, MD). Las células se incuban después durante la noche a 4 °C, se lavan dos veces con PBS y se resuspenden en 100 j l de fragmento F(ab')2 conjugado de FITC diluido 1:30 de inmunoglobulina de cerdo anticonejo (DAKO, Carpinteria, CA) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células luego se contratiñen con 5 jg/m l de PI (Molecular Probes, Eugene, OR) disuelto en PBS que contiene 100 jg/m l de RNasa A libre de DNasa (Sigma), durante 20 min a temperatura ambiente. La fluorescencia celular de la señal FITC<y>H2AX y la contratinción de PI se miden usando citometría de flujo usando métodos conocidos en la técnica. Al comparar células dentro de la misma etapa del ciclo celular (en función del contenido de ADN total), se puede observar que las células MET+ tratadas tienen un aumento de señal FITC yH2AX en relación con las células MET+ no tratadas (que sirven como valor inicial). Además, se puede observar que las células MET+ tratadas con ADC modificado genéticamente por pH específico para MET tienen un mayor aumento en los niveles de<y>H2AX con respecto al valor inicial que las células tratadas con un ADC de anticuerpo de control específico para MET. Además del ensayo<y>H2AX, la reticulación del ADN puede evaluarse más directamente con un ensayo Comet (Chandna, S. (2004) Cytometry 61A, 127-133).
Además, como se describe en la presente descripción, los anticuerpos modificados genéticamente por pH y de control pueden analizarse usando los métodos en este ejemplo sin conjugación directa mediante la realización de un ensayo de ADC secundario en lugar del uso de ADC conjugados primarios.
Ejemplo 6. Demostración de la disminución de la semivida de anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con un anticuerpo de control específico para MET en animales con tumores
Uno de los aspectos sorprendentes de los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET descritos por la invención puede ser su capacidad para facilitar una mayor disociación de anticuerpo de MET dentro del endosoma o lisosoma que resulta en una semivida en suero reducida con relación a los anticuerpos de control específicos para MET o anticuerpos que no son específicos para MET en animales con tumores. Esta disminución de la semivida en suero se debe a la frecuencia mejorada con la que los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET se eliminan de la circulación debido a su internalización celular mejorada mediante células tumorales una vez que se unen a MET, lo que puede observarse con el tiempo a través de una disminución en la concentración sérica de anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET no unido en animales con tumores. Para demostrar estas propiedades, se realiza una serie de estudios animales en ratones con tumores usando anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET y anticuerpo de control específico para MET usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Gupta, P., et al. (2016), mAbs, 8:5, 991-997). Brevemente, para llevar a cabo estudios en ratones, se administra un único bolo intravenoso (por ejemplo, 5 mg/kg) de anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET o anticuerpo de control específico para MET a través de la vena de la cola a dos grupos de ratones NOD SCID (por ejemplo, Jackson Labs NOD.CB17-Prkdcscid/J núm. de referencia: 001303) xenoinjertados con una línea celular MET+ (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). Los ratones xenoinjertados se preparan cultivando 1-5 millones de células MET+ in vitro e inoculando por vía subcutánea en el flanco derecho del ratón. El tamaño de los tumores coincide en 300 mm3. Las mediciones de la longitud (L) y el ancho (W) de los tumores se toman por medio de un calibrador electrónico y el volumen se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación: V=L*WA2/2. Las muestras de sangre se obtienen mediante sangrados retroorbitales de cada grupo en cada uno de los siguientes puntos cronológicos: 15 m, 30 m, 1 h, 8 h, 24 h, y 3 d, 7 d, 10 d, 14 d, 17 d, 21 d y 28 d. Las muestras se procesan para recolectar suero, y las concentraciones de anticuerpos se cuantifican usando ELISA u otros métodos conocidos por la técnica (por ejemplo, ensayo de PAC o ensayo de MAC; Fischer, S.K. et al. (2012), mAbs, 4:5, 623-631, utilizando, por ejemplo, anticuerpo IgG antihumano Jackson ImmunoResearch Labs, núm. de cat. 109-006 006). Las concentraciones de anticuerpos de los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET y de anticuerpo de control específicos para MET se grafican como una función de tiempo. Tras el análisis de los datos, puede observarse que el anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET tiene una semivida en suero significativamente más corta con respecto al anticuerpo de control específico para MET, lo que demuestra de esta manera la capacidad de la dependencia del pH del anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET para facilitar una disociación mejorada dentro del endosoma o del lisosoma en relación con otros aglutinantes similares (por ejemplo, anticuerpo de control específico para MET) que se unen al mismo antígeno pero que difieren en su dependencia de pH.
Además, la semivida de los ADC de anticuerpo de control y modificado genéticamente por pH específico para MET puede evaluarse usando los métodos anteriores mediante la sustitución de ADC de anticuerpo de control y modificado genéticamente por pH específico para MET para los anticuerpos de control y modificados genéticamente por pH específicos para MET (es decir, estudiar los anticuerpos después de la conjugación a un fármaco o toxina, como se describe en la presente descripción).
Ejemplo 7. Aumento de la potencia de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET frente a un ADC de anticuerpo de control específico para MET en modelos de xenoinjertos de ratónLa actividad antitumoral mejorada de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET contra los tumores MET+ puede demostrarse en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de células MET+. Para los experimentos, 1-5 millones de células MET+ se cultivan in vitro y se inoculan por vía subcutánea por ratón en el flanco derecho de ratones hembra inmunodeficientes (por ejemplo, SCID-Beige o NOD scid). El tamaño de los tumores coincide con 100-200 mm3 y se administran por vía intraperitoneal (IP) (1 dosis administrada cada ~4-7 días para un total de ~2-6 dosis). Las mediciones de la longitud (L) y el ancho (W) de los tumores se toman por medio de un calibrador electrónico y el volumen se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación: V=L*WA2/2. Se administra un bolo (por ejemplo, 5 mg/kg) de ADC modificado genéticamente por pH específico para MET o ADC de anticuerpo de control específico para MET a través de la vena de la cola. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI, por sus siglas en inglés) y el retraso del crecimiento tumoral (TGD, por sus siglas en inglés) y la supervivencia mejoran significativamente con la administración de ADC modificado genéticamente por pH específico para MET en comparación con la administración de un ADC de anticuerpo de control específico para MET en el mismo régimen.
Opcionalmente, la diseminación de las células tumorales a los diversos tejidos se determina en animales sacrificados. La metástasis se mide de acuerdo con Schneider, T., et al., Clin. Exp. Metas. 19 (2002) 571-582. Brevemente, los tejidos se extraen y las secuencias de Alu humana se cuantifican mediante PCR en tiempo real. Los niveles más altos de ADN humano, cuantificados mediante PCR en tiempo real, corresponden a niveles más altos de metástasis. Los niveles de secuencias de Alu humanas (correlacionados con la invasión de células tumorales en el tejido secundario) son significativamente menores en los animales tratados con ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET, correspondientes a la reducción de la metástasis, en comparación con los ratones tratados con ADC de anticuerpo de control específico para MET en el mismo régimen. Alternativamente, la actividad antitumoral mejorada del ADC modificado genéticamente por pH específico para MET puede mostrarse en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes MET+ (por ejemplo, disponibles de The Jackson Laboratory).
Ejemplo 8. Creación de un anticuerpo biespecífico de MET biespecífico modificado genéticamente por pH y demostración de propiedades ilustrativas en comparación con un anticuerpo biespecífico de controlPara crear un anticuerpo modificado genéticamente por pH específico para MET con propiedades de toxicidad e internalización modificadas, se construye un anticuerpo biespecífico que se une a dos epítopos diferentes en MET. Se conoce en la técnica que los anticuerpos biparatópicos pueden mostrar un aumento de la internalización dependiente del antígeno, y por lo tanto son útiles para aplicaciones tales como conjugados anticuerpo-fármaco (por ejemplo, ver Li et al (2016) A Biparatopic HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate Induces Tumor Regression in Primary Models Refractory to or Ineligible for HER2-Targeted Therapy, Cancer Cell 29:117-29). Brevemente, un anticuerpo biespecífico biparatópico de MET x MET modificado genéticamente por pH específico para MET se ensambla usando pares de cadena ligera/cadena pesada de dos anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para<m>E<t>, cada uno de los cuales se une a un epítopo distinto en MET que no se superpone con el otro epítopo. Se descubre un conjunto de anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET que se unen a epítopos no superpuestos, por ejemplo, usando los métodos descritos en la presente descripción, u otros conocidos por un experto en la técnica. Brevemente, se seleccionan dos aglutinantes sobre la base de que se unen a epítopos sustancialmente diferentes en MET, según lo determinado por, por ejemplo, un ensayo de competencia de unión como en Abdiche YN et al (2009) Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors, Anal Biochem 386:172-80. Alternativamente, brevemente, como se describe en la presente descripción, los sobrenadantes de cultivo celular de células transfectadas con un primer anticuerpo específico para MET se normalizan a un nivel de expresión de anticuerpos de 50 pg/ml, y se capturan en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se establece un valor inicial usando amortiguador de cinética 1X (Forte Bio), y el sensor se asocia con 50 nM de MET en PBS 1X (que se ha mezclado y preincubado durante 30 min a 37 °C con un sobrenadante de transfección de un segundo anticuerpo específico para MET o el sobrenadante de transfección del primer anticuerpo específico para MET, ambos normalizados a 50 ug/mL) a un pH de 7,4 durante 300 segundos para generar una curva de asociación. Si la tasa de asociación en presencia del segundo anticuerpo específico para MET es significativamente más rápida (según la calcula el software del instrumento, o según lo observado por un nivel elevado de asociación con el tiempo) que la tasa de asociación en presencia del primer anticuerpo específico para MET, entonces se considera que el segundo anticuerpo específico para MET se une a un epítopo no superpuesto de MET. Opcionalmente, cada anticuerpo se criba para determinar sus propiedades de internalización cuando se une a su epítopo en una célula que expresa MET, y se seleccionan anticuerpos con buena internalización. Se conoce en la técnica los ensayos para determinar la tasa de internalización de una molécula presente en la superficie de una célula. Véase, por ejemplo, Wiley y otros (1991) J. Biol. Chem. 266: 11083-11094; y Sorkin y Duex (2010) Curr. Protoc. Cell Biol. Capítulo, Unidad-15.14; Vainshtein y otros (2015) Pharm Res. 32: 286-299. Una vez seleccionados, las construcciones de cadena pesada y ligera con mutaciones modificadas genéticamente para el emparejamiento de cadena pesada y ligera (Spiess et al., “Alternative molecular formats and therapeutic applications of bispecific antibodies,” 2015) se sintetizan para ambos grupos. Los anticuerpos biespecíficos específicos para MET se producen mediante coexpresión de plásmidos de cadena pesada y ligera correspondientes en, por ejemplo, células Expi293. Los sobrenadantes de cultivo celular se cosechan y se someten a purificación de proteína A. Los anticuerpos heterodiméricos específicos para MET se separan de especies homodiméricas a través de etapas de purificación adicionales tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, y cromatografía de modo mixto. Los anticuerpos biparatópicos biespecíficos purificados MET x MET modificados genéticamente por pH, específicos para MET se caracterizan mediante espectrometría de masas para confirmar la pureza y ausencia de especies homodiméricas y cromatografía de exclusión por tamaño para confirmar la presencia de especies monoméricas de construcción de proteínas de unión a antígenos. Para el anticuerpo del producto, la unión al MET se confirma mediante análisis de Biacore. Otros métodos de producción de anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica y también podrían usarse para crear un anticuerpo biespecífico, por ejemplo, los anticuerpos biparatópicos biespecíficos MET x MET específicos para MET descritos en la presente descripción (por ejemplo, Labrijn et al (2014) “Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1” Nature Protocols 9:2450-2463, al cual se accedió en http://www.nature.com/nprot/journal/v9/n10/abs/nprot.2014.169.html), los cuales serán evidentes para un experto en la técnica. Alternativamente, en lugar de un anticuerpo MET x MET específico para MET, un anticuerpo MET x BINDER modificado genéticamente por pH específico para MET puede construirse usando métodos similares evidentes para un experto en la técnica, donde BlNDER es cualquier anticuerpo que se ha publicado en la técnica o descubierto usando métodos como los que se conocen en la técnica o los de la presente descripción (por ejemplo, métodos basados en la visualización o basados en la inmunización).
A continuación, pueden demostrarse propiedades ilustrativas de anticuerpos MET x MET modificados genéticamente por pH específicos para MET usando los métodos descritos en la presente descripción, en donde el control adecuado es un anticuerpo de control anticuerpo monoespecífico o biespecífico específico para MET. Brevemente, se puede demostrar que, en comparación con un control, los anticuerpos MET x MET modificados genéticamente por pH específicos para MET: a) se unen de manera dependiente del pH a las células, por ejemplo, se unen a un pH neutro, pero no a un pH ácido y b) se liberan de las células de manera dependiente del pH, por ejemplo, se unen a un pH neutro y se liberan a un pH ácido y c) muestran una acumulación endolisosómica mejorada en células MET+ y d) muestran un aumento de la densidad del antígeno MET después de la exposición a células MET+ y e) cuando se conjugan a una toxina, muestran un aumento de la citotoxicidad a las células MET+ y f) cuando se conjugan a una toxina, muestran un aumento de la liberación de toxinas cuando se incuban con células MET+ y g) muestran una disminución de la semivida cuando se exponen al antígeno MET en un modelo animal relevante y h) cuando se conjugan a una toxina, muestran un aumento de la eficacia en un modelo de xenoinjerto de ratón de células MET+. De manera similar, pueden demostrarse las propiedades ilustrativas de anticuerpos MET x BINDER modificados genéticamente por pH específicos para MET usando los métodos descritos en la presente descripción, donde el control adecuado es un anticuerpo de control anticuerpo biespecífico MET x BINDER específico para MET.
Ejemplo 9. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las c Dr en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena pesada, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 384. Brevemente, se diluyeron 15 |jL de sobrenadante de cultivo celular en 185 jL de PBST 1x pH 7,4 para cargar en las puntas del sensor. Esto dio como resultado una concentración alta de 41,1 jg/ml, una concentración baja de 13,7 jg/m l y una concentración promedio de 26,5 jg/ml. Se capturó entonces el sobrenadante diluido en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H, núm. de lote LC11SE2008) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional. También se observó que si bien algunas mutaciones de histidina y alanina obliteraron la unión a MET, otras se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET.
Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena pesada que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 10. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 195 |jl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones) y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT2040). También se observó que algunas mutaciones de histidina y alanina se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET. Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena ligera que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 11. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las c Dr en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 9 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena pesada, y b) la cadena ligera del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 195 |jl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H)) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones) y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 12. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las<c>D<r>en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 10 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena ligera, y b) la cadena pesada del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 j l de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300 600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 13. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjúgate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en las cadenas pesada y ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada y ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en los Ejemplos 9-12 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina se generaron por cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera o una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) una variante de secuencia de cadena pesada o variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadena pesada y ligera emparejadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (MYT3463, MYT3477, MYT3491, MYT3603, MYT3604, MYT3606, MYT3607, MYT3608, MYT3609, MYT3610, MYT3611, MYT3612, MYT3614, MYT3615, MYT4211, MYT4212, MYT4214, MYT4217, y MYT4220).
Ejemplo 14. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las c Dr en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 9 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas que contiene la bisagra triple (TH, por sus siglas en inglés) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) a BbV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente, y b) la cadena ligera del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (ATCC CCL-138). Las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocilios y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una mejor administración endolisosómica (en comparación con el anticuerpo inicial), por ejemplo, como se muestra en la Figura 1, se seleccionaron para un análisis adicional. La dependencia del pH de las variantes seleccionadas se evaluó mediante el uso de interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4 o pH 5,4, durante 300-600 segundos. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación a pH 5,4 y pH 7,4 del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), por ejemplo, como se muestra en la Figura 2 se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 15. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos Telisotuzumab (SEQ ID NO: 159 de cadena pesada, SEQ ID NO: 160 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 10 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente que contiene la bisagra triple (TH) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) A<b>BV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (ATCC CCL-138). Las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (Hi FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones).
Ejemplo 16. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” solicitud de patente de EE. Uu . US 2020/0061204 A 1 (2020)). Seleccionamos Emibetuzumab (SEQ ID NO: 161 de cadena pesada, SEQ ID NO: 162 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena pesada, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Se capturó entonces el sobrenadante diluido en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas pesada que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT2319). También se observó que si bien algunas mutaciones de histidina y alanina obliteraron la unión a MET (por ejemplo, MYT2341), otras se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET.
Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena pesada que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 17. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” solicitud de patente de EE. Uu . US 2020/0061204 A 1 (2020)). Seleccionamos Emibetuzumab (SEQ ID n O: 161 de cadena pesada, SEQ ID NO: 162 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 195 |jl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con la ABPC inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT3978). También se observó que algunas mutaciones de histidina y alanina se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET. Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena ligera que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 18. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” solicitud de patente de EE. Uu . US 2020/0061204 A 1 (2020)). Seleccionamos Emibetuzumab (SEQ ID NO: 161 de cadena pesada, SEQ ID NO: 162 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las<c>D<r>en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 16 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena pesada, y b) la cadena ligera del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 j l de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (es decir, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial
(sin sustituciones), y b) disociación reducida a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesada que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT2850, MYT2861).
Ejemplo 19. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” solicitud de patente de EE. U<u>. US 2020/0061204 A 1 (2020)). Seleccionamos Emibetuzumab (SEQ ID<n>O: 161 de cadena pesada, SEQ ID NO: 162 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las<c>D<r>en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 17 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena ligera, y b) la cadena pesada del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300 600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT4326).
Ejemplo 20. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” solicitud de patente de EE. UU. US 2020/0061204 A1 (2020)). Seleccionamos Emibetuzumab (SEQ ID<n>O: 161 de cadena pesada, SEQ ID NO: 162 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en las cadenas pesada y ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada y ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en los Ejemplos 16 - 19 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina se generaron por cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera o una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) una variante de secuencia de cadena pesada o variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes emparejadas de cadena pesada y ligera que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT3999, MYT4001, MYT4007, MYT4010, MYT4011, MYT4012, MYT4013, MYT4014, MYT4015, MYT4016, MYT4017, MYT4018, MYT4019, MYT4023, MYT4032, MYT4034, MYT4040).
Ejemplo 21. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” solicitud de patente de EE. Uu . US 2020/0061204 A 1 (2020)). Seleccionamos Emibetuzumab (SEQ ID NO: 161 de cadena pesada, SEQ ID NO: 162 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las c Dr en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 16 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas que contiene la bisagra triple (TH) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (ATCC Cc L-138). Las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones).
Ejemplo 22. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Hicks, SW y Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof” solicitud de patente internacional W<o>2020/014306 A1 (2020)). Seleccionamos hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225 de cadena pesada, SEQ ID NO: 235 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc M<p>(1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena pesada, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 |jl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PB<s>T 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpoantígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional. También se observó que si bien algunas mutaciones de histidina y alanina obliteraron la unión a MET, otras se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET.
Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena pesada que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 23. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Hicks, SW y Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof” solicitud de patente internacional W o 2020/014306 A1 (2020)). Seleccionamos hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225 de cadena pesada, SEQ ID NO: 235 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc M<p>(1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 j l de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBsT 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpoantígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones) y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional. También se observó que algunas mutaciones de histidina y alanina se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET. Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena ligera que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 24. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Hicks, SW y Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof” solicitud de patente internacional W<o>2020/014306 A1 (2020)). Seleccionamos hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225 de cadena pesada, SEQ ID NO: 235 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc Mp (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 22 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena pesada, y b) la cadena ligera del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBsT 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpoantígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones) y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 25. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Hicks, SW y Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof” solicitud de patente internacional W<o>2020/014306 A1 (2020)). Seleccionamos hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225 de cadena pesada, SEQ ID NO: 235 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 23 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena ligera, y b) la cadena pesada del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 j l de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT4230).
Ejemplo 26. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Hicks, SW y Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof solicitud de patente internacional W<o>2020/014306 A1 (2020)). Seleccionamos hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225 de cadena pesada, SEQ ID NO: 235 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc Mp (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 22 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas que contiene la bisagra triple (TH) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (AT<c>C CCL-138). Las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones).
Ejemplo 27. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Hicks, SW y Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof” solicitud de patente internacional Wo 2020/014306 A1 (2020)). Seleccionamos hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225 de cadena pesada, SEQ ID NO: 235 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc Mp (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 23 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente que contiene la bisagra triple (TH) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) ABBV399, a c-Met Antibody-Drug Conjúgate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (AT<c>C CCL-138). Las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una mejor administración endolisosómica (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional. La dependencia del pH de las variantes seleccionadas se evaluó mediante el uso de interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4 o pH 5,4, durante 300-600 segundos. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación a pH 5,4 y pH 7,4 del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 28. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena pesada, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Se capturó entonces el sobrenadante diluido en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas pesada que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT3698 y MYT3701). También se observó que algunas mutaciones de histidina y alanina se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET. Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena pesada que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 29. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, los residuos de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera se sustituyeron sistemáticamente con una histidina, uno a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con solo una mutación de histidina o alanina en una CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 |jl de sobrenadante de cultivo celular en 195 |jl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones) y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT3735, y MYT3740). También se observó que algunas mutaciones de histidina y alanina se toleraron con poco (por ejemplo, menos de 1 cambio múltiplo en la constante de disociación KD o tasa de disociación) o sin cambio en la cinética de unión a MET. Especialmente debido a que la histidina es un aminoácido grande con carga positiva, estas variantes sin cambios se observaron como posiciones en la cadena ligera que pueden tolerar una amplia gama de mutaciones y conducir a anticuerpos con diferentes secuencias pero propiedades de unión similares, una designación que no es evidente de otra manera.
Ejemplo 30. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 28 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena pesada, y b) la cadena ligera del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H)) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X a pH 7,4 durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST pH 5,4 en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones) y b) menor disociación a pH 7,4 (es decir, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), como se muestra en las Figuras 3A-3B se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT4313).
Ejemplo 31. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 29 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadena ligera, y b) la cadena pesada del anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300 600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT4247).
Ejemplo 32. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en las cadenas pesada y ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada y ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en los Ejemplos 28-31 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina se generaron por cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera o una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) una variante de secuencia de cadena pesada o variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4 o pH 5,4, durante 300-600 segundos. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de cadena pesada y ligera emparejadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), por ejemplo, como se muestra en la Figura 4A-4B, se seleccionaron para un análisis adicional (por ejemplo, MYT5342, MYT5343, MYT5344, MYT5345, MYT5346, MYT5350, MYT5351, MYT5352, MYT5353, MYT5354, MYT5355, MYT5356, MYT5357, MYT5359, MYT5360, MYT5366, MYT5367, MYT5369, MYT5370, MYT5372, MYT5373, MYT5375, MYT5376, y MYT5381).
Ejemplo 33. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena pesada se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena pesada que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 28 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena pesada se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas que contiene la bisagra triple (TH) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) ABBV399, a c-Met Antibody-Drug Conjúgate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente, y b) la cadena ligera de anticuerpo inicial correspondiente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (At Cc CCL-138). Brevemente, las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una mejor administración endolisosómica (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional. La dependencia del pH de las variantes seleccionadas se evaluó mediante el uso de interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4 o pH 5,4, durante 300-600 segundos. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación a pH 5,4 y pH 7,4 del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas pesadas que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 34. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como una plantilla para diseñar la unión dependiente del pH (Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559). Seleccionamos P3D12 (SEQ ID NO: 163 de cadena pesada, SEQ ID NO: 164 de cadena ligera) como un anticuerpo monoclonal de unión a MET para genomodificación por pH mediante escaneo de histidina. Brevemente, las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Para generar variantes de secuencia dependientes del pH, las mutaciones de aminoácidos individuales dentro de las CDR de cadena ligera que se habían seleccionado previamente para un análisis adicional en el Ejemplo 29 se combinaron sistemáticamente dos o más a la vez. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina en las CDR de cadena ligera se generaron mediante la cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) la cadena pesada de anticuerpo inicial correspondiente que contiene la bisagra triple (TH) y mutaciones YTE descritas en (Wang J et al (2017) A<b>BV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) y (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180) respectivamente usando métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, se purificaron usando esferas magnéticas de proteína A (Genscript L00273), y se evaluaron para determinar la administración endolisosómica en células Detroit 562 (ATCC CCL-138). Brevemente, las células Detroit 562 (ATCC; CCL-138) se recolectaron y resuspendieron en medio EMEM (ATCC; 30-2003) 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, se diluyeron las células a 100.000 células/ml y 100 ul se sembraron en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Después se diluyeron los anticuerpos primarios en medios de cultivo nativos a 20nM y después se mezclaron 1:1 con el reactivo de etiquetado de anticuerpos rojos FabFluor-pH humano 60nM (Sartorius; 4722). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición a las células. Las placas se colocaron inmediatamente en el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 para la adquisición y el análisis de imágenes. Se examinó la administración endolisosómica del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre la administración endolisosómica mejorada debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una mejor administración endolisosómica (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional. La dependencia del pH de las variantes seleccionadas se evaluó mediante el uso de interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpoantígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4 o pH 5,4, durante 300-600 segundos. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación a pH 5,4 y pH 7,4 del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones). Las variantes de combinaciones de cadenas ligeras que mostraron una disociación mejorada a pH 5,4 o una disociación reducida a pH 7,4 o ambas (en comparación con el anticuerpo inicial), se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 35. Reformateo de anticuerpos anti-MET
Se generaron variantes anti-MET modificadas genéticamente por pH seleccionadas como moléculas de IgG1 de tipo silvestre (por ejemplo, en los Ejemplos 9-13, 16-20, 22-25, y 28-32) y como moléculas de IgG1 que contienen las mutaciones de la bisagra triple (TH), como se describe en (Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000), y las mutaciones YTE, como se describe en (Dall, WF et al “ Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002); 169:5171-5180), mediante la transfección de células Expi293 con un plásmido que codifica la región pesada variable fusionada genéticamente a Fc de IgG1 humana con o sin las mutaciones T<h>e YTE. La cotransfección de células Expi293 con a) una secuencia de cadena pesada que consiste en una región de cadena pesada variable y regiones constantes correspondientes ya sea al isotipo de IgG1 humana de tipo silvestre o a la misma secuencia excepto con mutaciones de TH e YTE, y b) una secuencia de cadena ligera, mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAG<e>, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 pl de sobrenadante de cultivo celular en 195 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 pl de sobrenadante de cultivo celular en 175 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 pl de sobrenadante de cultivo celular en 100 pl de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación para cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre tres criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 en comparación con su correspondiente anticuerpo inicial, b) disociación reducida a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma, y c) comparación de los anticuerpos de IgG1 humana de tipo silvestre y sus variantes que contienen TH e YTE. La IgG1 humana de tipo silvestre y los anticuerpos de IgG1 humana reformateados que contienen las mutaciones TH e YTE mostraron curvas de asociación y disociación ampliamente similares. A partir de estos datos, llegamos a la conclusión de que las propiedades deseables de nuestras secuencias de dominio variable de variante, que incluyen, pero no se limitan a, dependencia del pH y administración endolisosómica, se conservan ya sea en el formato de IgG1 o en el formato de IgG1 con las mutaciones TH e YTE.
Ejemplo 36. Caracterización de la intemalización celular y administración endolisosómica de anticuerpos anti-MET modificados genéticamente por pH
Se analizaron variantes de anticuerpos anti-MET genomodificados por pH seleccionadas de los Ejemplos 9-13, 16 20, 22-25, y 28 - 31 para determinar la internalización y la administración endolisosómica en células U-87 MG (MET+), células SNU-5 (MET+), células NCI-H1373 (MET+), células NCI-H1573 (MET+) y/o células Detroit 562 (MET+). Se recolectaron células U-87 MG (ATCC HTB-14), células Detroit 562 (ATCC CCL-138), células NCI-H1373 (ATCC CRL-5866), células NCI-H1573 (ATCC CRL-5877) o células SNU-5 (ATCC CRL-5973) y se volvieron a suspender en medio de EMEM (U-87 MG y Detroit 562, ATCC; 30-2003), medio de IMDM (SNU-5, ATCC; 30 2005), o medio de RPMI (NCI-H1373 y NCI-H1573, ATCC 30-2001) más 5% (NCI-H1573), 10 % (U-87 MG, Detroit 562, NCI-H1373) o 20% (SNU-5) de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, las células se diluyeron a 2.000.000 células/ml y se sembraron 50 pl/pocillo en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos (Genesee Scientific; 25-109). Las variantes de anticuerpo anti-MET modificadas genéticamente por pH, anticuerpos de anticuerpo inicial, control de isotipo de IgG1 de control (BP0297, Bioxcell), y control de vehículo se diluyeron en medio de cultivo nativo y después se mezclaron 1:1 con una relación molar de 3x de reactivo de etiquetado de IgG humana Zenon pHrodo iFL (ThermoFisher; Z25611). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 1:1 de células para obtener un volumen final de 100 pL. La mezcla de células, variantes de anticuerpos anti-MET, y reactivo de etiquetado de IgG humana Zenon pHrodo iFL se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 1-24 horas. Después de la incubación, se agrega a cada pocillo 100 pL de amortiguador de citometría de flujo (FC) frío (solución salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7,4 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 % (v/v) HI FBS. Las células se centrifugaron después a 4 °C durante 2 min a 2000 rpm, se lavaron con 200 pL de amortiguador de FC frío y se resuspendieron en 100 pL de amortiguador de FC frío. Se detectó una intensidad de fluorescencia verde media usando un citómetro de flujo BD Accuri C6. Los datos se analizaron usando el software de análisis Flowjo. pHrodo verde es un tinte sensible al pH que fluoresce en el entorno de pH bajo de los endosomas y lisosomas y, por lo tanto, puede usarse para cuantificar la internalización de anticuerpos y la administración endolisosómica. La internalización y administración endolisosómica de anticuerpos iniciales anti-MET y variantes en concentraciones, en U-87 mg (MET+), Detroit 562 (MET+), SNU-5 (MET+), NCI-H1573 (MET+), o células NCI-H1373 (MET+), se midieron mediante la intensidad de fluorescencia media de pHrodo verde. Varias variantes de anticuerpos anti-MET modificadas genéticamente por pH mostraron un aumento de la intensidad de fluorescencia media en relación con sus anticuerpos iniciales correspondientes, lo que demuestra que el aumento de la disociación a un pH más bajo conduce a una internalización mejorada y a la administración endolisosómica dentro de las células, como lo demuestra el aumento de la fluorescencia o el aumento de la fluorescencia en comparación con el control de isotipo de IgG1. El aumento de la administración endolisosómica se cuantifica para cada variante de anticuerpo anti-MET modificada genéticamente por pH en la parte superior de cada barra como una relación de: la intensidad de fluorescencia media de la variante menos la intensidad de fluorescencia media del control de IgG, entonces, todos divididos por la intensidad de fluorescencia media del anticuerpo inicial correspondiente de la variante menos la intensidad de fluorescencia media del control de IgG. Por ejemplo, MYT2040, MYT3609, MYT3611, y MYT3615, variantes de anticuerpos contra el telisotuzumab, muestran un aumento de la internalización y la administración endolisosómica en relación con telisotuzumab (MYT0886). Por ejemplo, MYT2319, MYT2850, MYT2861, y MYT4326, variantes de anticuerpos de emibetuzumab, muestran una mayor internalización y administración endolisosómica con relación a emibetuzumab. Por ejemplo MYT3698, MYT3735, MYT3740, MYT4247, y MYT4325, una variante de anticuerpo de P3D12, muestra un aumento de la internalización y la administración endolisosómica con relación a P3D12. Tales variantes de anticuerpos anti-MET modificadas genéticamente por pH con intensidad de fluorescencia media aumentada en relación con sus anticuerpos iniciales se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 37. Estabilidad térmica de los mAb anti-MET
La temperatura de fusión de la proteína (Tm) se midió a través del uso de fluorimetría diferencial de barrido (DSF). La DSF visualiza el desdoblamiento de proteínas al medir la señal fluorescente de la molécula Sypro Orange (Thermo Scientific núm. de cat. S6650) mientras una proteína se despliega debido al calentamiento. A medida que una proteína se desdobla, expone más regiones hidrófilas al tinte Sypro Orange, que a su vez se une a estas regiones hidrófilas, lo que resulta en un aumento de la señal. La Tm para una proteína se calcula como la mitad máxima de la transición de desdoblado y puede visualizarse mediante el trazado del primer derivado de la señal Sypro Orange y la búsqueda de un máximo local de este gráfico derivado. 20 pl de muestras de proteína en 1xPBS, pH 7,4, se mezclaron con 5 pl de mezcla maestra Sypro Orange 25X, dando como resultado una concentración final de Sypro Orange 5x. Las muestras se agregaron a placas PCR de 96 pocillos (Thermo Scientific núm. de cat. AB-2400/W) y sellado con cubiertas ópticas (Thermo Scientific núm. de cat. 4360954). La placa de PCR se insertó en una máquina de PCR en tiempo real (Thermo Scientific Quant Studio 3) y la temperatura de la placa se estabilizó durante 3 minutos a 25 °C antes de aumentar a 95 °C en incrementos de 0,2 °C, estabilizándose durante 1 segundo antes de medir la señal de Sypro Orange. Se determinaron los valores de la temperatura de fusión (Tm) para los anticuerpos iniciales anti-MET y las variantes. Varias variantes muestran valores de temperatura de fusión similares a los de sus anticuerpos iniciales, lo que confirma que las variantes creadas mediante modificación genética por pH pueden retener las estabilidades térmicas funcionalmente adecuadas en comparación con sus correspondientes anticuerpos iniciales (por ejemplo, emibetuzumab, hucMET27Gv1,3 o P3D12). Todas las variantes analizadas tuvieron temperaturas de fusión mayores o iguales a la temperatura de fusión de su anticuerpo inicial correspondiente (por ejemplo, mirvetuximab) menos 10 °C y por lo tanto se seleccionaron para un análisis adicional.
Los descubrimientos en la presente descripción contrastan con modificaciones genéticas similares en otros antígenos tales como CLEC12a y otras dos dianas en donde múltiples variantes por diana mostraron una disociación mejorada a pH bajo, sin embargo, a pesar de las propiedades de unión favorables dependientes del pH de estas variantes (que específicamente se unieron a CLEC12a y las otras dos dianas), tuvieron menos del 10 % de aumento en la internalización celular y la administración endolisosómica en comparación con el anticuerpo inicial correspondiente (por ejemplo, el anticuerpo inicial). Estas variantes (que se unieron específicamente a CLEC12a y las otras dos dianas) también tuvieron características biofísicas similares (por ejemplo, expresión de anticuerpos, estabilidad térmica, afinidad a pH 7,4 etc.) al anticuerpo inicial correspondiente (por ejemplo, el anticuerpo inicial) que confirma que esto no era específico de las propiedades biofísicas de la variante evaluada (es decir, las propiedades biofísicas no relacionadas con la disociación mejorada de pH 5,4).
Ejemplo 38. Caracterización de las sustituciones de dominio constante de MYT5351
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc Mp (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT5351 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 35 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 41); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 4)1; sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 42); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 36 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 42); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 42); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera de SEQ NO: 41).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 39. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4313
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4313 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 7, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 8. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 49); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 49); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 49); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 50); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 44 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 50); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 50); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 49); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 49); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera de la SEQ NO: 49).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 40. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4325
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4325 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 9, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 10. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 57); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 51 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 57); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 57); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 58); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 52 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 58); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 53 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 58); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 57); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 57); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera de la SEQ NO: 57).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 41. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4826
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4826 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 11, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 12. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 59 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 65); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 60 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 65); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 65); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 66); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 60 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 66); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 66); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 62 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 65); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 63 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 65); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 64 y una cadena ligera de la SEQ NO: 65).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 42. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4837
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4837 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 13, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 67 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 73); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 73); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 73); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 67 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 74); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 68 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 74); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 74); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 70 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 73); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 71 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 73); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 72 y una cadena ligera de la SEQ NO: 73).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 43. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4849
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4849 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 15, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 16. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 75 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 81); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 76 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 81); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 77 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 81); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 75 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 82); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 76 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 82); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 77 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 82); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 78 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 11); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 79 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 81); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 80 y una cadena ligera de la SEQ NO: 81).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 44. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4942
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4942 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 18. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 83 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 89); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 84 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 89); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 85 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 89); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 83 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 90); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 84 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 90); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 85 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 90); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 86 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 89); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 87 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 89); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 88 y una cadena ligera de la SEQ NO: 89).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 45. Caracterización de sustituciones del dominio constante de MYT5309
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc M<p>(1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT5309 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 20. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 91 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 97); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 97); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 93 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 97); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 91 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 98); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 92 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 98); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 93 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 98); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 94 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 97); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 95 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 97); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 96 y una cadena ligera de la SEQ NO: 97).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 46. Caracterización de sustituciones del dominio constante de MYT5344
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc M<p>(1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT5344 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 21, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 22. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 99 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 105); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 100 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 105); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la s Eq ID NO: 101 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 105); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 106); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 100 y una cadena ligera de la SeQ ID NO: 106); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 101 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 106); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 105); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 103 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 105); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 104 y una cadena ligera de la SEQ NO: 105).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 47. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT5367
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT5367 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 107 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 113); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 108 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 113); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la<s>E<q>ID NO: 109 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 113); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 107 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 114); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 108 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 114); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 109 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 114); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 110 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 113); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 111 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 113); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 112 y una cadena ligera de la SEQ NO: 113).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 48. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4827
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4827 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 115 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 121); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 116 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 121); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la s Eq ID NO: 117 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 121); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 115 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 122); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 116 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 122); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 117 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 122); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 121); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 119 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 121); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 120 y una cadena ligera de la SEQ NO: 121).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 49. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4312
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc M<p>(1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4312 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 27, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 123 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 129); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 124 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 129); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la s Eq ID NO: 125 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 129); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 123 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 130); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 124 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 130); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 125 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 130); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 126 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 129); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 127 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 129); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 128 y una cadena ligera de la SEQ NO: 129).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 50. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4953
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4953 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 29, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 30. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 131 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 137); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 132 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 137); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la s Eq ID NO: 133 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 137); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 131 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 138); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 132 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 138); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 138); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 134 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 137); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 135 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 137); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 136 y una cadena ligera de la SEQ NO: 137).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 51. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4940
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4940 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 31, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 32. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 139 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 145); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 140 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 145); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la s Eq ID NO: 141 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 145); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 139 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 146); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 140 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 146); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 141 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 146); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 142 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 145); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 143 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 145); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 144 y una cadena ligera de la SEQ NO: 145).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 52. Caracterización de sustituciones de dominio constante de MYT4888
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc M<p>(1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Por lo tanto, MYT4888 incluye un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 33, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 34. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 147 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 153); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 148 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 153); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la<s>E<q>ID NO: 149 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 147 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 154); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 148 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 154); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 149 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 154); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 150 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 151 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 152 y una cadena ligera de la SEQ NO: 153).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 53. Caracterización de las sustituciones del dominio constante de telisotuzumab
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Las variaciones de telisotuzumab que incluyen sustituciones de dominio constante incluyen un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 159 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 160. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 165 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 171); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 166 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 171); sustitución de bisagra triple y sustitución de YTE (cadena pesada de la SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 171); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 165 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 172); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 166 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 172); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la Se Q ID NO: 167 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 172); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 168 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 171); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 169 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 171); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 170 y una cadena ligera de la SEQ NO: 171).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 54. Caracterización de sustituciones del dominio constante de emibetuzumab
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Las variaciones de emibetuzumab que incluyen sustituciones de dominio constante incluyen un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 161 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 162. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 173 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 179); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 174 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 179); sustitución de bisagra triple y sustitución de y Te (cadena pesada de la s Eq ID NO: 175 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 179); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 173 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 180); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 174 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 180); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la S<e>Q ID NO: 175 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 180); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 176 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 179); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 177 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 179); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 178 y una cadena ligera de la SEQ NO: 179).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 55. Caracterización de sustituciones del dominio constante anti-cMET de P3D12
Como se describió anteriormente, el escaneo de histidina se realizó donde las CDR en la cadena ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. Se seleccionaron determinados dominios de cadena variable pesada y dominios de cadena variable ligera para la experimentación adicional.
Adicionalmente, se conocen varios métodos para conjugar un agente citotóxico o citostático a un anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación es posible en las posiciones de aminoácidos de origen natural y/o al introducirse (por ejemplo, aminoácidos modificados genéticamente). Como se describe en la presente descripción, se conocen varios métodos para introducir sitios de conjugación en un anticuerpo.
Algunos ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos modificados genéticamente incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: una sustitución para producir un sitio de conjugación de “bisagra triple” (por ejemplo, una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 genera el sitio de conjugación de triple bisagra, una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189, y/o una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos de sitios de conjugación de aminoácidos de origen natural incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la cisteína en la posición de aminoácido 103, la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105, (iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109, y/o la cisteína en la posición de aminoácido 112 y/o la cisteína en la posición de aminoácido 107 de la SEQ ID NO: 157.
Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir regiones constantes modificadas. Por ejemplo, una o más sustituciones, inserción, y/o deleciones de aminoácidos pueden introducirse (por ejemplo, modificadas genéticamente) en los dominios constantes (por ejemplo, pesada constante y/o ligera constante) de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Las sustituciones de aminoácidos en la región constante pueden tener efectos variables sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, extender la semivida del anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen lo siguiente: una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139 (por ejemplo, sustitución de “YTE”) y una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317 (por ejemplo, sustitución de “LS”).
Las variaciones de anti-cMET de P3D12 que incluyen sustituciones de dominio constante incluyen un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 163 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 164. Varias regiones constantes modificadas (por ejemplo, una región constante pesada modificada, una región constante ligera modificada) pueden combinarse con cadenas variables descritas en la presente descripción (por ejemplo, la SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, respectivamente). Lo siguiente representa las siguientes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras como tales: solo conjugación de bisagra triple (cadena pesada de la SEQ ID NO: 181 y cadena ligera de la SEQ ID NO: 187); conjugación de bisagra triple y sustitución de LS (cadena pesada: SEQ ID NO: 182 y una cadena ligera: SEQ ID NO: 187); sustitución de bisagra triple y sustitución de y Te (cadena pesada de la SEQ ID NO: 183 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 187); conjugación de bisagra triple y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ ID NO: 181 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 188); una sustitución de bisagra triple y sustitución de LS y sustitución de V205 (cadena pesada de la SEQ NO: 182 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 188); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de V205C (cadena pesada de la S<e>Q ID NO: 183 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 188); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 184 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 187); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de LS y una sustitución de A118C (una cadena pesada de la SEQ ID NO: 185 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 187); una sustitución de bisagra triple y una sustitución de YTE y una sustitución de A118C (cadena pesada de la SEQ ID NO: 186 y una cadena ligera de la SEQ NO: 187).
Las combinaciones anteriores pueden evaluarse mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 56. Mejora en la afinidad de unión selectiva de anticuerpos modificados genéticamente por pHLa medición de la afinidad de los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET se realizó mediante análisis de FACS en líneas celulares con rangos de expresión de cMET; células Detroit-562 (ATCC; CCL-138), NCI-H1975 (ATCC CRL-5908) y HUVEC (C2519A, Lonza). Las líneas celulares seleccionadas para este estudio se obtuvieron de fuentes comerciales y se cultivaron usando las condiciones recomendadas por el fabricante. Todas las líneas celulares se cultivaron al recibirlas, se expandieron y se crioconservaron en un número de pasaje similar para su uso en los experimentos de afinidad. Brevemente, las células 1,0x10A5 que expresan MET se preparan por pocillo en una placa de 96 pocillos en un medio de 100 pl. Las células se lavan dos veces con 200 pl de amortiguador FACS (1x PBS que contiene 3 % de suero fetal bovino) a pH 7,4. Las muestras de proteína purificada se diluyen en amortiguador FACS a pH 7,4, para una titulación de 100 nM a 1 pM, y se agregan a las células y se dejan unirse durante 2 horas en hielo. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las células se lavan dos veces como antes, y después se agregan 100 pl de AF488 antihumano de cabra secundario (anticuerpo secundario policlonal con adsorción cruzada de IgG), diluido 1:200, en amortiguador FACS con pH 7,4, y se incuba durante 1 hora en hielo. Las placas se lavan dos veces. La unión se lee en un citómetro de flujo (Accuri C6, BD Biosciences). La unión se observa como un cambio en la señal FLl (como una intensidad de fluorescencia media) en comparación con el secundario solo.
Los anticuerpos originales que se unen a las células Detroit-562, que expresan altos niveles de MET, y las células HUVEC, que expresan niveles más bajos de MET, mostraron una afinidad similar. Inesperadamente, los anticuerpos modificados genéticamente con pH específicos para MET se unen más fuertemente a las células diana con niveles de expresión de MET más altos, Detroit-562, que a las células diana con expresión de MET más baja, células HUVEC. La afinidad por la serie de artículos de prueba contra varias líneas celulares se presenta en la Tabla 1. Por lo tanto, las construcciones de anticuerpos modificados genéticamente mediante pH se diferencian de los compuestos originales en su avidez, lo que puede esperarse que se traduzca en una mayor selectividad a células diana de alta expresión en el tratamiento de neoplasias malignas que sobreexpresan<c>ME<t>, con una unión reducida a hepatocitos normales para los anticuerpos seleccionados.
Tabla 1.
Ejemplo 57. Demostración del aumento de la semivida de ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET en comparación con un ADC de control específico para MET
Otro aspecto de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET descritos por la invención puede ser su capacidad para facilitar el aumento de la semivida sérica con relación a los ADC de anticuerpos de control específicos para MET. Para demostrar estas propiedades, se realiza una serie de estudios animales en monos cynomolgus usando ADC modificado genéticamente por pH específico para MET y ADC de anticuerpos de control específico para MET usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Gupta, P., et al. (2016), mAbs, 8:5, 991-997). A los monos hembra (3 por artículo de prueba) se les administra un bolo de ADC modificado genéticamente con pH específico para MET o ADC de anticuerpo de control específico para MET a una dosis de 2,7 mg/kg mediante inyección en la vena safena. Alternativamente, se administran varias dosis diferentes de proteína de unión a MET en un grupo de varios monos. Las muestras de sangre se obtienen a través de la vena periférica o la vena femoral en los siguientes puntos cronológicos: antes de la dosis, 15 minutos, 12 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 10 días, 14 días, 17 días, 21 días y 28 días después de la dosis. Las muestras de sangre se analizan para detectar la presencia de ADC modificado genéticamente por pH específico para MET o ADC de anticuerpo de control específico para MET usando métodos conocidos por la técnica (por ejemplo, ELISA).
Las concentraciones de anticuerpos de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET y ADC de anticuerpo de control específicos para MET se grafican como una función de tiempo. Tras el análisis de los datos, se puede observar que el ADC modificado genéticamente por pH específico para MET tiene una semivida sérica significativamente más prolongada en relación con el ADC de anticuerpo de control específico para MET, lo que demuestra la estabilidad sérica y el perfil de exposición mejorados.
Ejemplo 58. Aumento de la potencia de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET frente a un ADC de anticuerpo de control específico para MET en modelos de xenoinjertos de ratónLa actividad antitumoral mejorada de los ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET contra los tumores MET+ puede demostrarse en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de células MET+. Para los experimentos, 5 millones de células de adenocarcinoma de pulmón humano H1375 (núm. de pieza) o células de adenocarcinoma de pulmón humano H1975 (núm. de pieza) se cultivan in vitro y se inoculan por vía subcutánea por ratón en el flanco derecho de ratones hembra inmunodeficientes (por ejemplo, núm. de pieza CB.17 SCID Jax frente a Charles river). Además, se cultivan 10 millones de células de carcinoma faríngeo humano Detroit 562 (núm. de pieza) in vitro e inoculadas por vía subcutánea por ratón en el flanco derecho de ratones desnudos atímicos hembra (NCr nu/nu, núm. de pieza Jax/vs charles river). Los tamaños de los xenoinjertos H1375 y H1975 coinciden con los tumores en 100-150 mm3 y 125-175 mm3 para los xenoinjertos Detroit-562. Las mediciones de la longitud (L) y el ancho (W) de los tumores se toman por medio de un calibrador electrónico y el volumen se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación: V=L*WA2/2. Se administra un bolo (4 mg/kg) de ADC modificado genéticamente por pH específico para MET o 2 o 4 mg de ADC de anticuerpo de control específico para MET a través de la vena de la cola. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI, por sus siglas en inglés) y el retraso del crecimiento tumoral (TGD, por sus siglas en inglés) y la supervivencia mejoran significativamente con la administración de ADC modificado genéticamente por pH específico para MET en comparación con la administración de un ADC de anticuerpo de control específico para MET en el mismo régimen.
Opcionalmente, las muestras de sangre se obtienen mediante sangrados mandibulares de cada grupo en cada uno de los siguientes puntos cronológicos: 2d, 7d, 14d. Las muestras se procesan para recolectar suero, y las concentraciones de anticuerpos se cuantifican usando ELISA u otros métodos conocidos por la técnica (por ejemplo, ensayo de PAC o ensayo de MAC; Fischer, S.K. et al. (2012), mAbs, 4:5, 623-631, utilizando, por ejemplo, anticuerpo IgG antihumano Jackson ImmunoResearch Labs, núm. de cat. 109-006-006). Las concentraciones de anticuerpos de los anticuerpos modificados genéticamente por pH específicos para MET y de anticuerpo de control específicos para MET se grafican como una función de tiempo.
Opcionalmente, la diseminación de las células tumorales a los diversos tejidos se determina en animales sacrificados. La metástasis se mide de acuerdo con Schneider, T., et al., Clin. Exp. Metas. 19 (2002) 571-582. Brevemente, los tejidos se extraen y las secuencias de Alu humana se cuantifican mediante PCR en tiempo real. Los niveles más altos de ADN humano, cuantificados mediante PCR en tiempo real, corresponden a niveles más altos de metástasis. Los niveles de secuencias de Alu humanas (correlacionados con la invasión de células tumorales en el tejido secundario) son significativamente menores en los animales tratados con ADC modificados genéticamente por pH específicos para MET, correspondientes a la reducción de la metástasis, en comparación con los ratones tratados con ADC de anticuerpo de control específico para MET en el mismo régimen. Alternativamente, la actividad antitumoral mejorada del ADC modificado genéticamente por pH específico para MET puede mostrarse en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes MET+ (por ejemplo, disponibles de The Jackson Laboratory).
Ejemplo 59. Caracterización de la internalización celular y administración endolisosómica de anticuerpos anti-MET modificados genéticamente por pH
Se analizaron variantes de anticuerpos anti-MET modificados genéticamente por pH seleccionadas para determinar la intemalización y la administración endolisosómica en células U-87 MG (MET+), células<s>NU-5 (MET+), células NCI-H1373 (MET+), células NCI-H1573 (MET+) y/o células Detroit 562 (MET+). Se recolectaron células U-87 MG (ATCC HTB-14), células Detroit 562 (ATCC CCL-138), células NCI-H1373 (ATCC CRL-5866), células NCI-H1573 (ATCC CRL-5877) o células SNU-5 (ATCC CRL-5973) y se volvieron a suspender en medio de EMEM (U-87 MG y Detroit 562, ATCC; 30-2003), medio de IMDM (SNU-5, ATCC; 30-2005), o medio de RPMI (NCI-H1373 y NCI-H1573, ATCC 30-2001) más 5% (NCI-H1573), 10 % (U-87 MG, Detroit 562, NCI-H1373) o 20 % (SNU-5) de suero bovino fetal inactivado por calor GenClone (HI FBS) (Genesee Scientific; 25-514H). Los recuentos celulares se determinaron usando tinción con azul de tripano y el contador de células automatizado Countess II FL (Thermofisher; AMQAF1000). Después, las células se diluyeron a 2.000.000 células/ml y se sembraron 50 pl/pocillo en placas de cultivo de células de fondo plano de 96 pocillos (Genesee Scientific; 25-109). Las variantes de anticuerpo anti-MET modificadas genéticamente por pH, anticuerpos de anticuerpo inicial, control de isotipo de IgG1 de control (BP0297, Bioxcell), y control de vehículo se diluyeron en medio de cultivo nativo y después se mezclaron 1:1 con una relación molar de 3x de reactivo de etiquetado de IgG humana Zenon pHrodo iFL (ThermoFisher; Z25611). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 1:1 de células para obtener un volumen final de 100 pL. La mezcla de células, variantes de anticuerpos anti-MET, y reactivo de etiquetado de IgG humana Zenon pHrodo iFL se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 1 24 horas. Después de la incubación, se agregan 100 pL de amortiguador de citometría de flujo (FC) helado (solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), pH 7,4 2mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 % (v/v) HI FBS a cada pocillo. Después se centrifugaron las células a 4 °C durante 2 min a 2000 rpm, se lavaron con 200 pL de amortiguador de FC helado y se volvieron a suspender en 100 pL de amortiguador de FC helado. La intensidad de fluorescencia verde media se detectó mediante el uso de un citómetro de flujo BD Accuri C6. Los datos se analizaron mediante el uso del software de análisis Flowjo. Verde pHrodo es un tinte sensible al pH que fluoresce en el entorno de pH bajo de los endosomas y lisosomas y, por lo tanto, puede usarse para cuantificar la internalización de anticuerpos y la administración endolisosómica. La internalización y la administración endolisosómica de los anticuerpos iniciales anti-MET y las variantes a concentraciones, en células U-87 MG (MET+), Detroit 562 (MET+), SNU-5 (MET+), NCI-H1573 (MET+), o NCI-H1373 (MET+), se midieron mediante la intensidad de fluorescencia media del verde pHrodo. Varias variantes de anticuerpos anti-MET genomodificadas por pH mostraron un aumento de la intensidad de fluorescencia media en relación con sus correspondientes anticuerpos iniciales, lo que demuestra que el aumento de la disociación a un pH más bajo conduce a una internalización y una administración endolisosómica mejoradas dentro de las células, como lo demuestra el aumento de la fluorescencia o el aumento de la fluorescencia en comparación con el control de isotipo de IgG1. El aumento en la administración endolisosómica se cuantifica para cada variante de anticuerpo anti-MET modificada genéticamente por pH en la parte superior de cada barra como una relación de: la intensidad de fluorescencia media de la variante menos la intensidad de fluorescencia media del control de IgG, después se divide el total por la intensidad de fluorescencia media del anticuerpo inicial correspondiente de la variante menos la intensidad de fluorescencia media del control de IgG.
MYT4826, MYT4827, MYT4837, MYT4325, MYT5351, MYT4312, MYT5309, MYT4849, MYTH4888, MYT5344, MYT4313, MYT5367, MYT4942, MYT4953, y MYT4940 muestran una mayor internalización y administración endolisosómica en relación con sus anticuerpos de control respectivos.
Por ejemplo, MYT2040, MYT3609, MYT3611, y MYT3615, variantes de anticuerpos de telisotuzumab, muestran una mayor internalización y administración endolisosómica con relación a telisotuzumab (MYT0886). Por ejemplo, MYT2319, MYT2850, MYT2861, y MYT4326, variantes de anticuerpos de emibetuzumab, muestran una mayor internalización y administración endolisosómica con relación a emibetuzumab. Por ejemplo MYT3698, MYT3735, MYT3740, MYT4247, y MYT4325, una variante de anticuerpo de P3D12, muestra un aumento de la internalización y la administración endolisosómica con relación a P3D12. Tales variantes de anticuerpos anti-MET modificadas genéticamente por pH con intensidad de fluorescencia media aumentada en relación con sus anticuerpos iniciales se seleccionaron para un análisis adicional.
Ejemplo 60. Construcción y cribado de anticuerpos de MET modificados genéticamente por pH
Se han descrito múltiples anticuerpos monoclonales de unión a MET en la bibliografía y pueden usarse como plantilla para genomodificar la unión dependiente del pH [Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]. Seleccionamos los anticuerpos monoclonales de unión al MET MYT4940, MYT4942, MYT4888, MYT4827, MYT4837, MYT4849 y MYT5309 para la modificación genética por pH a través de la exploración de histidina. Brevemente, las CDR en las cadenas pesada y ligera se identificaron usando los métodos descritos por Kabat et al. (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing) e IMGT (Lefranc MP (1999) "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Iglike domains" The Immunologist 7, 132-136), y para cada CDR, los residuos que forman parte de cualquiera de las definiciones de CDR de Kabat e IMGT se denominaron residuos de CDR. En los casos donde el residuo de CDR inicial era una histidina, se mutaba a una alanina. Las variantes de anticuerpos con dos o más mutaciones de histidina o alanina se generaron por cotransfección de células Expi293 con a) una variante de secuencia de cadena ligera o una variante de secuencia de combinaciones de cadenas ligeras, y b) una variante de secuencia de cadena pesada o variante de secuencia de combinaciones de cadenas pesadas usando métodos conocidos por la técnica. Después de permitir cuatro días de expresión de proteínas, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular, cuantificados mediante análisis SDS-PAGE, y se evaluó la dependencia del pH de la variante usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 96e. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en función del nivel de expresión cualitativa de la variante determinada por el examen visual de los geles SDS-PAGE, se diluyeron 5 j l de sobrenadante de cultivo celular en 195 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores altos, se diluyeron 25 j l de sobrenadante de cultivo celular en 175 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores medios y 100 j l de sobrenadante de cultivo celular en 100 j l de PBST 1x, pH 7,4 para los expresores bajos para cargar en las puntas del sensor. Los sobrenadantes diluidos se capturaron después en un sensor Fc antihumano (Forte Bio). Se estableció un valor inicial usando PBST 1X (50 mM de amortiguador de fosfato de potasio 150mM de NaCl 0,05 % de Tween 20) a pH 7,4, y el sensor se asoció con 50 nM de MET (cMET, Sino Biological núm. de cat. 10692-H08H) en PBST 1X a pH 7,4 durante 120 segundos para generar una curva de asociación. En la fase de disociación, el complejo anticuerpo-antígeno del sensor se expuso a PBST 1X, a pH 7,4, durante 300-600 segundos. El valor inicial, la asociación y la disociación se repitieron usando 1xPBST, pH 5,4, en todas partes en una condición separada. Se ejecutó una condición adicional con valor inicial y asociación usando 1xPBST, pH 7,4 y disociación usando 1xPBST, pH 5,4. Se examinaron las curvas de la fase de asociación y disociación del anticuerpo inicial (sin sustituciones) y cada variante de anticuerpo correspondiente a pH 5,4 y pH 7,4 para informar sobre dos criterios: a) mayor disociación (por ejemplo, valores de koff más altos) a pH 5,4 debido a la sustitución de histidina o alanina en comparación con el anticuerpo inicial (sin sustituciones), y b) menor disociación a pH 7,4 (por ejemplo, valores de koff más bajos) en comparación con pH 5,4 en la variante del anticuerpo en sí misma y con el anticuerpo inicial (sin sustituciones).
Apéndice de secuencia
MET humano maduro (SEQ ID NO: 1) ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQD CSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDC VVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAF ESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLAR QIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNS SGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLD SHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWT QQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKH FNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTP AQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQ HRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEA VKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLL LLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSC RQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLL DNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNP TVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWM ALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKA EMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
ADNc que codifica el MET humano maduro (SEQ ID NO: 2) GAGTGTAAAGAGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATATGAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCG GAAACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTT AAATGAGGAAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGCCTGTGCTGGAACACCCAGATTGTTTCCC ATGTCAGGACTGCAGCAGCAAAGCCAATTTATCAGGAGGTGTTTGGAAAGATAACATCAACATGGCTCTAGTT GTCGACACCTACTATGATGATCAACTCATTAGCTGTGGCAGCGTCAACAGAGGGACCTGCCAGCGACATGTC TTTCCCCACAATCATACTGCTGACATACAGTCGGAGGTTCACTGCATATTCTCCCCACAGATAGAAGAGCCCA GCCAGTGTCCTGACTGTGTGGTGAGCGCCCTGGGAGCCAAAGTCCTTTCATCTGTAAAGGACCGGTTCATCA ACTTCTTTGTAGGCAATACCATAAATTCTTCTTATTTCCCAGATCATCCATTGCATTCGATATCAGTGAGAAGG CTAAAGGAAACGAAAGATGGTTTTATGTTTTTGACGGACCAGTCCTACATTGATGTTTTACCTGAGTTCAGAG ATTCTTACCCCATTAAGTATGTCCATGCCTTTGAAAGCAACAATTTTATTTACTTCTTGACGGTCCAAAGGGAA ACTCTAGATGCTCAGACTTTTCACACAAGAATAATCAGGTTCTGTTCCATAAACTCTGGATTGCATTCCTACAT GGAAATGCCTCTGGAGTGTATTCTCACAGAAAAGAGAAAAAAGAGATCCACAAAGAAGGAAGTGTTTAATATA CTTCAGGCTGCGTATGTCAGCAAGCCTGGGGCCCAGCTTGCTAGACAAATAGGAGCCAGCCTGAATGATGA CATTCTTTTCGGGGTGTTCGCACAAAGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCAATGGATCGATCTGCCATGTGTGC ATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATT TTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGACACTTCTGAGAAATTCATCAGGCTGTGAAGCGCGCC GTGATGAATATCGAACAGAGTTTACCACAGCTTTGCAGCGCGTTGACTTATTCATGGGTCAATTCAGCGAAGT CCTCTTAACATCTATATCCACCTTCATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAATCTTGGGACATCAGAGGGTCGC TTCATGCAGGTTGTGGTTTCTCGATCAGGACCATCAACCCCTCATGTGAATTTTCTCCTGGACTCCCATCCAG TGTCTCCAGAAGTGATTGTGGAGCATACATTAAACCAAAATGGCTACACACTGGTTATCACTGGGAAGAAGAT CACGAAGATCCCATTGAATGGCTTGGGCTGCAGACATTTCCAGTCCTGCAGTCAATGCCTCTCTGCCCCACC CTTTGTTCAGTGTGGCTGGTGCCACGACAAATGTGTGCGATCGGAGGAATGCCTGAGCGGGACATGGACTC AACAGATCTGTCTGCCTGCAATCTACAAGGTTTTCCCAAATAGTGCACCCCTTGAAGGAGGGACAAGGCTGA CCATATGTGGCTGGGACTTTGGATTTCGGAGGAATAATAAATTTGATTTAAAGAAAACTAGAGTTCTCCTTGG AAATGAGAGCTGCACCTTGACTTTAAGTGAGAGCACGATGAATACATTGAAATGCACAGTTGGTCCTGCCAT GAATAAGCATTTCAATATGTCCATAATTATTTCAAATGGCCACGGGACAACACAATACAGTACATTCTCCTATG TGGATCCTGTAATAACAAGTATTTCGCCGAAATACGGTCCTATGGCTGGTGGCACTTTACTTACTTTAACTGG AAATTACCTAAACAGTGGGAATTCTAGACACATTTCAATTGGTGGAAAAACATGTACTTTAAAAAGTGTGTCAA ACAGTATTCTTGAATGTTATACCCCAGCCCAAACCATTTCAACTGAGTTTGCTGTTAAATTGAAAATTGACTTA GCCAACCGAGAGACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAAGATCCCATTGTCTATGAAATTCATCCAACCAAATCTT TTATTAGTGGTGGGAGCACAATAACAGGTGTTGGGAAAAACCTGAATTCAGTTAGTGTCCCGAGAATGGTCA TAAATGTGCATGAAGCAGGAAGGAACTTTACAGTGGCATGTCAACATCGCTCTAATTCAGAGATAATCTGTTG TACCACTCCTTCCCTGCAACAGCTGAATCTGCAACTCCCCCTGAAAACCAAAGCCTTTTTCATGTTAGATGGG ATCCTTTCCAAATACTTTGATCTCATTTATGTACATAATCCTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCAGTGATGATC TCAATGGGCAATGAAAATGTACTGGAAATTAAGGGAAATGATATTGACCCTGAAGCAGTTAAAGGTGAAGTGT TAAAAGTTGGAAATAAGAGCTGTGAGAATATACACTTACATTCTGAAGCCGTTTTATGCACGGTCCCCAATGA CCTGCTGAAATTGAACAGCGAGCTAAATATAGAGTGGAAGCAAGCAATTTCTTCAACCGTCCTTGGAAAAGTA ATAGTTCAACCAGATCAGAATTTCACAGGATTGATTGCTGGTGTTGTCTCAATATCAACAGCACTGTTATTACT ACTTGGGTTTTTCCTGTGGCTGAAAAAGAGAAAGCAAATTAAAGATCTGGGCAGTGAATTAGTTCGCTACGAT GCAAGAGTACACACTCCTCATTTGGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTAAGCCCAACTACAGAAATGGTT TCAAATGAATCTGTAGACTACCGAGCTACTTTTCCAGAAGATCAGTTTCCTAATTCATCTCAGAACGGTTCATG CCGACAAGTGCAGTATCCTCTGACAGACATGTCCCCCATCCTAACTAGTGGGGACTCTGATATATCCAGTCC ATTACTGCAAAATACTGTCCACATTGACCTCAGTGCTCTAAATCCAGAGCTGGTCCAGGCAGTGCAGCATGTA GTGATTGGGCCCAGTAGCCTGATTGTGCATTTCAATGAAGTCATAGGAAGAGGGCATTTTGGTTGTGTATATC ATGGGACTTTGTTGGACAATGATGGCAAGAAAATTCACTGTGCTGTGAAATCCTTGAACAGAATCACTGACAT AGGAGAAGTTTCCCAATTTCTGACCGAGGGAATCATCATGAAAGATTTTAGTCATCCCAATGTCCTCTCGCTC CTGGGAATCTGCCTGCGAAGTGAAGGGTCTCCGCTGGTGGTCCTACCATACATGAAACATGGAGATCTTCGA AATTTCATTCGAAATGAGACTCATAATCCAACTGTAAAAGATCTTATTGGCTTTGGTCTTCAAGTAGCCAAAGG CATGAAATATCTTGCAAGCAAAAAGTTTGTCCACAGAGACTTGGCTGCAAGAAACTGTATGCTGGATGAAAAA TTCACAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTCTTGCCAGAGACATGTATGATAAAGAATACTATAGTGTACACAACA AAACAGGTGCAAAGCTGCCAGTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAGTCTGCAAACTCAAAAGTTTACCACCAAGT CAGATGTGTGGTCCTTTGGCGTGCTCCTCTGGGAGCTGATGACAAGAGGAGCCCCACCTTATCCTGACGTAA ACACCTTTGATATAACTGTTTACTTGTTGCAAGGGAGAAGACTCCTACAACCCGAATACTGCCCAGACCCCTT ATATGAAGTAATGCTAAAATGCTGGCACCCTAAAGCCGAAATGCGCCCATCCTTTTCTGAACTGGTGTCCCG GATATCAGCGATCTTCTCTACTTTCATTGGGGAGCACTATGTCCATGTGAACGCTACTTATGTGAACGTAAAA TGTGTCGCTCCGTATCCTTCTCTGTTGTCATCAGAAGATAACGCTGATGATGAGGTGGACACACGACCAGCC TCCTTCTGGGAGACATCA
Dominio extracelular de MET (SEQ ID NO: 3) ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQD CSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDC VVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAF ESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLAR QIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNS SGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLD SHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWT QQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKH FNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTP AQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQ HRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEA VKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT ADNc que codifica el dominio extracelular de MET (SEQ ID NO: 4) GAGTGTAAAGAGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATATGAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCG GAAACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTT AAATGAGGAAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGCCTGTGCTGGAACACCCAGATTGTTTCCC ATGTCAGGACTGCAGCAGCAAAGCCAATTTATCAGGAGGTGTTTGGAAAGATAACATCAACATGGCTCTAGTT GTCGACACCTACTATGATGATCAACTCATTAGCTGTGGCAGCGTCAACAGAGGGACCTGCCAGCGACATGTC TTTCCCCACAATCATACTGCTGACATACAGTCGGAGGTTCACTGCATATTCTCCCCACAGATAGAAGAGCCCA GCCAGTGTCCTGACTGTGTGGTGAGCGCCCTGGGAGCCAAAGTCCTTTCATCTGTAAAGGACCGGTTCATCA ACTTCTTTGTAGGCAATACCATAAATTCTTCTTATTTCCCAGATCATCCATTGCATTCGATATCAGTGAGAAGG CTAAAGGAAACGAAAGATGGTTTTATGTTTTTGACGGACCAGTCCTACATTGATGTTTTACCTGAGTTCAGAG ATTCTTACCCCATTAAGTATGTCCATGCCTTTGAAAGCAACAATTTTATTTACTTCTTGACGGTCCAAAGGGAA ACTCTAGATGCTCAGACTTTTCACACAAGAATAATCAGGTTCTGTTCCATAAACTCTGGATTGCATTCCTACAT GGAAATGCCTCTGGAGTGTATTCTCACAGAAAAGAGAAAAAAGAGATCCACAAAGAAGGAAGTGTTTAATATA CTTCAGGCTGCGTATGTCAGCAAGCCTGGGGCCCAGCTTGCTAGACAAATAGGAGCCAGCCTGAATGATGA CATTCTTTTCGGGGTGTTCGCACAAAGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCAATGGATCGATCTGCCATGTGTGC ATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATT TTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGACACTTCTGAGAAATTCATCAGGCTGTGAAGCGCGCC GTGATGAATATCGAACAGAGTTTACCACAGCTTTGCAGCGCGTTGACTTATTCATGGGTCAATTCAGCGAAGT CCTCTTAACATCTATATCCACCTTCATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAATCTTGGGACATCAGAGGGTCGC TTCATGCAGGTTGTGGTTTCTCGATCAGGACCATCAACCCCTCATGTGAATTTTCTCCTGGACTCCCATCCAG TGTCTCCAGAAGTGATTGTGGAGCATACATTAAACCAAAATGGCTACACACTGGTTATCACTGGGAAGAAGAT CACGAAGATCCCATTGAATGGCTTGGGCTGCAGACATTTCCAGTCCTGCAGTCAATGCCTCTCTGCCCCACC CTTTGTTCAGTGTGGCTGGTGCCACGACAAATGTGTGCGATCGGAGGAATGCCTGAGCGGGACATGGACTC AACAGATCTGTCTGCCTGCAATCTACAAGGTTTTCCCAAATAGTGCACCCCTTGAAGGAGGGACAAGGCTGA CCATATGTGGCTGGGACTTTGGATTTCGGAGGAATAATAAATTTGATTTAAAGAAAACTAGAGTTCTCCTTGG AAATGAGAGCTGCACCTTGACTTTAAGTGAGAGCACGATGAATACATTGAAATGCACAGTTGGTCCTGCCAT GAATAAGCATTTCAATATGTCCATAATTATTTCAAATGGCCACGGGACAACACAATACAGTACATTCTCCTATG TGGATCCTGTAATAACAAGTATTTCGCCGAAATACGGTCCTATGGCTGGTGGCACTTTACTTACTTTAACTGG AAATTACCTAAACAGTGGGAATTCTAGACACATTTCAATTGGTGGAAAAACATGTACTTTAAAAAGTGTGTCAA ACAGTATTCTTGAATGTTATACCCCAGCCCAAACCATTTCAACTGAGTTTGCTGTTAAATTGAAAATTGACTTA GCCAACCGAGAGACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAAGATCCCATTGTCTATGAAATTCATCCAACCAAATCTT TTATTAGTGGTGGGAGCACAATAACAGGTGTTGGGAAAAACCTGAATTCAGTTAGTGTCCCGAGAATGGTCA TAAATGTGCATGAAGCAGGAAGGAACTTTACAGTGGCATGTCAACATCGCTCTAATTCAGAGATAATCTGTTG TACCACTCCTTCCCTGCAACAGCTGAATCTGCAACTCCCCCTGAAAACCAAAGCCTTTTTCATGTTAGATGGG ATCCTTTCCAAATACTTTGATCTCATTTATGTACATAATCCTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCAGTGATGATC TCAATGGGCAATGAAAATGTACTGGAAATTAAGGGAAATGATATTGACCCTGAAGCAGTTAAAGGTGAAGTGT TAAAAGTTGGAAATAAGAGCTGTGAGAATATACACTTACATTCTGAAGCCGTTTTATGCACGGTCCCCAATGA CCTGCTGAAATTGAACAGCGAGCTAAATATAGAGTGGAAGCAAGCAATTTCTTCAACCGTCCTTGGAAAAGTA ATAGTTCAACCAGATCAGAATTTCACA
Región variable de cadena pesada MYT5351 (SEQ ID NO: 5)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSS
Región variable ligera MYT5351 (SEQ ID NO: 6)
QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSHSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada MYT4313 (SEQ ID NO: 7)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4313 (SEQ ID NO: 8)
QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada MYT4325 (SEQ ID NO: 9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4325 (SEQ ID NO: 10)
QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada MYT4826 (SEQ ID NO: 11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4826 (SEQ ID NO: 12)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT4837 (SEQ ID NO: 13)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4837 (SEQ ID NO: 14) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT4849 (SEQ ID NO: 15) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4849 (SEQ ID NO: 16) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIHLHWYQQKPGKAPKLLIYHTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT4942 (SEQ ID NO: 17) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4942 (SEQ ID NO: 18) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT5309 (SEQ ID NO: 19) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT5309 (SEQ ID NO: 20) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQHYSGYPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT5344 (SEQ ID NO: 21) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT5344 (SEQ ID NO: 22) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSHYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada MYT5367 (SEQ ID NO: 23) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT5367 (SEQ ID NO: 24) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSHYHPTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada MYT4827 (SEQ ID NO: 25) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4827 (SEQ ID NO: 26) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK
R eg ión va ria b le de cad en a pe sada M Y T 4312 (S E Q ID NO: 27 )
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4312 (SEQ ID NO: 28) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada MYT4953 (SEQ ID NO: 29) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4953 (SEQ ID NO: 30) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT4940 (SEQ ID NO: 31) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4940 (SEQ ID NO: 32) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada MYT4888 (SEQ ID NO: 33) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera MYT4888 (SEQ ID NO: 34) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Bisagra triple de cadena pesada MYT5351 (SEQ ID NO: 35) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5351 mutación LS (SEQ ID NO: 36) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5351 mutación YTE (SEQ ID NO: 37) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Q * *
Bisagra triple de cadena pesada MYT5351 y A118C (SEQ ID NO: 38) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5351 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 39) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5351 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 40) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Q * *
Cadena ligera MYT5351 (SEQ ID NO: 41) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSHSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT5351 (V205C) (SEQ ID NO: 42) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSHSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4313 (SEQ ID NO: 43) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4313 mutación LS (SEQ ID NO: 44) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4313 mutación YTE (SEQ ID NO: 45) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
B isa g ra tr ip le de cad en a p e sad a M Y T 4313 y A 118 C (S E Q ID NO: 46 )
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4313 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 47) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4313 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 48) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena ligera MYT4313 (SEQ ID NO: 49) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4313 V205C (SEQ ID NO: 50) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4325 (SEQ ID NO: 51) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4325 mutación LS (SEQ ID NO: 52) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4325 mutación YTE (SEQ ID NO: 53) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
B isa g ra tr ip le de cad en a p e sad a M Y T 4325 y A 118 C (S E Q ID NO: 54)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena pesada MYT4325 (bisagra triple mutación LS y A118C) (SEQ ID NO: 55) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada MYT4325 (bisagra triple mutación YTE y A118C) (SEQ ID NO: 56) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena ligera MYT4325 (SEQ ID NO: 57) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4325 V205C (SEQ ID NO: 58) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4826 (SEQ ID NO: 59) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada MYT4826 (bisagra triple mutación LS) (SEQ ID NO: 60) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4826 mutación YTE (SEQ ID NO: 61) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4826 solo y A118 (SEQ ID NO: 62) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P IE K T IS K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G *
Bisagra triple de cadena pesada MYT4826 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4826 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 64) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera MYT4826 (SEQ ID NO: 65) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4826 V205C (SEQ ID NO: 66) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4837 (SEQ ID NO: 67) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4837 mutación LS (SEQ ID NO: 68) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Cadena pesada MYT4837 (bisagra triple mutación YTE (SEQ ID NO: 69) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4837 y A118C (SEQ ID NO: 70) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
B isa g ra tr ip le de cad en a pe sada M Y T 4837 m u tac ión LS y A 118 C (S E Q ID NO: 71) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Cadena pesada MYT4837 (bisagra triple mutación YTE y A118C) (SEQ ID NO: 72) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera MYT4837 (SEQ ID NO: 73) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4837 V205C (SEQ ID NO: 74) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4849 (SEQ ID NO: 75) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4849 mutación LS (SEQ ID NO: 76) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4849 mutación YTE (SEQ ID NO: 77) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4849 y A118C (SEQ ID NO: 78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4849 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P IE K T IS K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V L H E A L H S H Y T Q K S L S L S P G **
Bisagra triple de cadena pesada MYT4849 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 80) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera MYT4849 (SEQ ID NO: 81) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIHLHWYQQKPGKAPKLLIYHTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4849 V205C (SEQ ID NO: 82) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIHLHWYQQKPGKAPKLLIYHTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4942 (SEQ ID NO: 83) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4942 mutación LS (SEQ ID NO: 84) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4942 mutación YTE (SEQ ID NO: 85) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4942 y A118C (SEQ ID NO: 86) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4942 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 87) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
B isa g ra tr ip le de cad en a p e sad a M Y T 4942 m u tac ión Y T E y A 118 C (S E Q ID NO: 88) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Cadena ligera MYT4942 (SEQ ID NO: 89) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4942 V205C (SEQ ID NO: 90) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT5309 (SEQ ID NO: 91) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5309 mutación LS (SEQ ID NO: 92) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT5309 mutación YTE (SEQ ID NO: 93) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT5309 y A118C (SEQ ID NO: 94) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5309 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 95) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT5309 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 96) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P IE K T IS K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G **
Cadena ligera MYT5309 (SEQ ID NO: 97) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQHYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT5309 V205C (SEQ ID NO: 98) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQHYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT5344 (SEQ ID NO: 99) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5344 mutación LS (SEQ ID NO: 100) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5344 mutación YTE (SEQ ID NO: 101) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5344 y A118C (SEQ ID NO: 102) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5344 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 103) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5344 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 104) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKHSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena ligera MYT5344 (SEQ ID NO: 105) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSHYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT5344 V205C (SEQ ID NO: 106) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSHYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT5367 (SEQ ID NO: 107) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5367 mutación LS (SEQ ID NO: 108) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5367 mutación YTE (SEQ ID NO: 109) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5367 y A118C (SEQ ID NO: 110) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT5367 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 111) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT5367 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 112) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP Cadena ligera MYT5367 (SEQ ID NO: 113) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSHYHPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT5367 V205C (SEQ ID NO: 114) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSHYHPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4827 (SEQ ID NO: 115) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4827 mutación LS (SEQ ID NO: 116) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4827 mutación YTE (SEQ ID NO: 117) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4827 y A118C (SEQ ID NO: 118) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4827 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 119) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4827 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 120) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera MYT4827 (SEQ ID NO: 121) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4827 V205C (SEQ ID NO: 122) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4312 (SEQ ID NO: 123) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4312 mutación LS (SEQ ID NO: 124) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4312 mutación YTE (SEQ ID NO: 125) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4312 y A118C (SEQ ID NO: 126) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4312 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 127) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada MYT4312 (bisagra triple mutación YTE y A118C) (SEQ ID NO: 128) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena ligera MYT4312 (SEQ ID NO: 129) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
C a d e n a lige ra M Y T 4312 V 205 C (S E Q ID NO: 130)
QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4953 (SEQ ID NO: 131) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4953 mutación LS (SEQ ID NO: 132) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4953 mutación YTE (SEQ ID NO: 133) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4953 y A118C (SEQ ID NO: 134) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4953 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 135) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4953 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 136) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCHRSEITHEFDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Cadena ligera MYT4953 (SEQ ID NO: 137) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4953 V205C (SEQ ID NO: 138) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC** Bisagra triple de cadena pesada MYT4940 (SEQ ID NO: 139) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Cadena pesada MYT4940 (bisagra triple mutación LS) (SEQ ID NO: 140) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4940 mutación YTE (SEQ ID NO: 141) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4940 y A118C (SEQ ID NO: 142) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Bisagra triple de cadena pesada MYT4940 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 143) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4940 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 144) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD CHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Cadena ligera MYT4940 (SEQ ID NO: 145) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4940 V205C (SEQ ID NO: 146) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Bisagra triple de cadena pesada MYT4888 (SEQ ID NO: 147) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4888 mutación LS (SEQ ID NO: 148) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4888 mutación YTE (SEQ ID NO: 149) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4888 y A118C (SEQ ID NO: 150) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Bisagra triple de cadena pesada MYT4888 mutación LS y A118C (SEQ ID NO: 151) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada MYT4888 mutación YTE y A118C (SEQ ID NO: 152) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLHDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena ligera MYT4888 (SEQ ID NO: 153) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera MYT4888 V205C (SEQ ID NO: 154) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Dominio constante de cadena pesada (SEQ ID NO: 155) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Dominio constante de cadena pesada A118C (SEQ ID NO: 156) CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Dominio constante de cadena ligera (SEQ ID NO: 157) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Dominio constante de cadena ligera V205C (SEQ ID NO: 158) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Región variable de cadena pesada de telisotuzumab (SEQ ID NO: 159) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS
Región variable de cadena ligera de telisotuzumab (SEQ ID NO: 160) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada de emibetuzumab (SEQ ID NO: 161) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera de emibetuzumab (SEQ ID NO: 162) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK
Región variable de cadena pesada anti-cMET de P3D12 (SEQ ID NO: 163) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSS
Región variable de cadena ligera anti-cMET de P3D12 (SEQ ID NO: 164) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK
Bisagra triple de cadena pesada de telisotuzumab (SEQ ID NO: 165) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada de telisotuzumab LS (SEQ ID NO: 166) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada de telisotuzumab YTE (SEQ ID NO: 167) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG** Bisagra triple de cadena pesada de telisotuzumab y A118C (SEQ ID NO: 168) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Bisagra triple de cadena pesada de telisotuzumab LS y A118C (SEQ ID NO: 169) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Bisagra triple de cadena pesada de telisotuzumab YTE y A118C (SEQ ID NO: 170) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera de telisotuzumab (SEQ ID NO: 171) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera de telisotuzumab V205C (SEQ ID NO: 172) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Cadena pesada de emibetuzumab con bisagra triple (SEQ ID NO: 173) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada de emibetuzumab con bisagra triple y LS (SEQ ID NO: 174) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Cadena pesada de emibetuzumab con bisagra triple e YTE (SEQ ID NO: 175) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena pesada de emibetuzumab con bisagra triple y A118C (SEQ ID NO: 176) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada de emibetuzumab con bisagra triple y LS y A118C (SEQ ID NO: 177) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG**
Cadena pesada de emibetuzumab con bisagra triple e YTE y A118C (SEQ ID NO: 178) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDC HCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera de emibetuzumab (SEQ ID NO: 179) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera de emibetuzumab V205C (SEQ ID NO: 180) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Cadena pesada anti-cMET de P3D12 con bisagra triple (SEQ ID NO: 181) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena pesada anti-cMET de P3D12 con bisagra triple y LS (SEQ ID NO: 182) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada anti-cMET de P3D12 con bisagra triple e YTE (SEQ ID NO: 183) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena pesada anti-cMET de P3D12 con bisagra triple y A118C (SEQ ID NO: 184) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP Cadena pesada anti-cMET de P3D12 con bisagra triple y LS y A118C (SEQ ID NO: 185) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG*
Cadena pesada anti-cMET de P3D12 con bisagra triple e YTE y A118C (SEQ ID NO: 186) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DCHCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Cadena ligera anti-cMET de P3D12 (SEQ ID NO: 187) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**
Cadena ligera anti-cMET de P3D12 V205C (SEQ ID NO: 188) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC**
Dominio constante de cadena pesada (SEQ ID NO: 189) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG**
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 190) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 191) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 3 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 192) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 193) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 194) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDYWGQGTLVTVSS
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 3 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 195) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDYWGQGTLVTVSS
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 4 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 196) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDHWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 5 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 197) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDYWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 6 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 198) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDYWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 7 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 199) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDHWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 8 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 200) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITHEFDYWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 9 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 201) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 10 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 202) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITHEFDYWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 11 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 203) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 12 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 204) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITHEFDHWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 205) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 206) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 3 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 207) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 4 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 208) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 5 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 209) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 6 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 210) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 7 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 211)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSHLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 8 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 212) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 9 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 213) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 10 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 214) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTREHGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 215) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIHLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 216) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPNRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 217) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPHRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 3 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 218) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPNRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 4 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 219) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 5 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 220) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 6 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 221) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPHRRHTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 7 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 222) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPHRRGTTYNQKFEGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSS
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 223) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVHSGYPLTFGGGTKVEIK
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de Emibetuzumab (SEQ ID NO: 224) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQVYSGHPLTFGGGTKVEIK
Cadena pesada de IgG de hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 225)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVATINSNGVSIYYPDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEITTEMDYWGQGTLVTVSS
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de hucMET27Gv13 (SEQ ID NO: 226) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSHIHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQSNEEHLTFGQGTKVELK
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 227) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMAWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSS
Cadena pesada de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 228) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYPLMDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 229) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTHTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 2 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 230) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTHTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSS
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 3 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 231) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTAD KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSS
Cadena ligera de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 232) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSSYPHTFGSGTKLEIK
Combinaciones de cadenas ligeras de la variante de escaneo núm. 1 de histidina de IgG de P3D12 (SEQ ID NO: 233) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTIS SLEAEDAASYFCHQWSHHHPTFGSGTKLEIK
Combinaciones de cadenas pesadas de la variante de escaneo núm. 13 de histidina de IgG de Telisotuzumab (SEQ ID NO: 234) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAHSEITHEFDHWGQGTLVTVSS
Cadena ligera de IgG de hucMET27Gv1.3 (SEQ ID NO: 235) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFIHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQSNEEPLTFGQGTKVELK

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionados del grupo de:
(i) S<e>Q ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, respectivamente;
(xv) SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente; y
(b) una secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende uno o más de los siguientes:
(i) una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108;
(ii) una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139;
(iii) una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y
(iv) una sustitución de alanina a cisteína en la posición de aminoácido 1;
y/o
una secuencia de C<l>de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o s Eq ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108.
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 41, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 49, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 57, respectivamente
(iv) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 65, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 73, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 81, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 89, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 97, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 105, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 121, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 137, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende:
una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y
una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317.
5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 41, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 49, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 57, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 73, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 81, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 89, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 97, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 105, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 137, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende:
una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y
una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 41, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 49, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 57, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 65, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 73, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 81, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 89, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 97, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 105, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 121, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 137, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o
(xv) . la SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y
la secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 42, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 50, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 58, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 66, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 74, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 82, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 90, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 98, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 106, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 114, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 122, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 130, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 138, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
10. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y
una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y
la secuencia de C<l>de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 42, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 50, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 58, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 66, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 74, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 82, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 90, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 98, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 106, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 114, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 122, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 130, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 138, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 comprende: una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y
una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y
la secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 37 y SEQ<i>D NO: 42, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 50, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 58, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 66, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 74, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 82, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 90, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 98, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 106, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 114, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 122, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 130, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 138, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 146, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 154, respectivamente.
14. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o Se Q ID NO: 189 comprende:
una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108; y
una sustitución de alanina a una cisteína en la posición de aminoácido 1.
15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en donde el anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 38 y SEQ iD NO: 41, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 49, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 57, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 65, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 81, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 89, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 97, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 105, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 121, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 134 y SEQ ID NO: 137, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
16. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o S<e>Q ID NO: 189 comprende:
una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108;
una sustitución de metionina a leucina en la posición de aminoácido 311 y una sustitución de asparagina a serina en la posición de aminoácido 317; y
una sustitución de alanina a una cisteína en la posición de aminoácido 1.
17. El anticuerpo de la reivindicación 16, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 41, respectivamente;
(ii) SEQ<i>D NO: 47 y SEQ ID<n>O: 49, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 65, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 73, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 81, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 89, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 97, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 105, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 121, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 135 y SEQ ID NO: 137, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
18. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 155 o Se Q ID NO: 189 comprende:
una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105 y la deleción de una treonina en las posiciones de aminoácido 106 y 108;
una sustitución de metionina a tirosina en la posición de aminoácido 135, una sustitución de serina a treonina en la posición de aminoácido 137, y una sustitución de treonina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 139; y
una sustitución de alanina a una cisteína en la posición de aminoácido 1.
19. El anticuerpo de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo de:
(i) SEQ ID NO: 40 y SEQ Id NO: 41, respectivamente;
(ii) SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, respectivamente;
(iii) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57, respectivamente;
(iv) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 65, respectivamente;
(v) SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89, respectivamente;
(viii) SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105, respectivamente;
(x) SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113, respectivamente;
(xi) SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121, respectivamente;
(xii) SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 129, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 137, respectivamente;
(xiv) SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 145, respectivamente; o
(xv) SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 153, respectivamente.
20. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-19, en donde el anticuerpo se conjuga con un fármaco citotóxico, en donde el anticuerpo comprende:
(a) la secuencia de CH1-CH2-CH3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 189 que comprende la o las sustituciones y/o deleciones de aminoácidos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2-19, en donde el fármaco citotóxico se conjuga con uno o más de los siguientes:
(i) la cisteína en la posición de aminoácido 103;
(ii) la cisteína de una sustitución de lisina a cisteína en la posición de aminoácido 105;
(iii) la cisteína en la posición de aminoácido 109;
(iv) la cisteína en la posición de aminoácido 112; y/o
(b) una secuencia de Cl de cadena ligera de SEQ ID NO: 157 en donde el fármaco citotóxico se conjuga con la cisteína en la posición de aminoácido 107; y/o
(c) una secuencia de Cl de cadena ligera de la SEQ ID NO: 157 que comprende una sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98 en donde el fármaco citotóxico se conjuga con la cisteína de la sustitución de valina a cisteína en la posición de aminoácido 98.
21. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 y 20, en donde el anticuerpo comprende además un agente citotóxico o citostático conjugado a la cisteína en la posición 98 de la SEQ ID NO: 158.
22. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una cualquiera de los anticuerpos de las reivindicaciones 1-21.
23. Un kit que comprende al menos una dosis del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 o la composición farmacéutica de la reivindicación 22.
24. La composición farmacéutica de la reivindicación 22 para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el cáncer se caracteriza por tener una población de células cancerosas que tienen MET o un epítopo de MET presentado en su superficie y en donde se identifica que dicho sujeto tiene un cáncer caracterizado por tener la población de células cancerosas.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022001286A (es) * 2019-07-30 2022-07-19 Mythic Therapeutics Inc Construcciones de proteínas de unión a antígenos y usos de estas.
RS66266B1 (sr) 2021-02-03 2024-12-31 Mythic Therapeutics Inc Anti-met antitela i njihova primena
US20240197906A1 (en) 2022-12-11 2024-06-20 Mythic Therapeutics, Inc. ANTI-cMET ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND THERAPEUTIC USES THEREOF
WO2025245128A1 (en) 2024-05-20 2025-11-27 Mythic Therapeutics, Inc. Antibody drug conjugates and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5652138A (en) 1992-09-30 1997-07-29 The Scripps Research Institute Human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
KR102057826B1 (ko) * 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
CN102149825B (zh) 2008-07-08 2015-07-22 Abbvie公司 前列腺素e2双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
PA8849001A1 (es) * 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
US8545839B2 (en) 2008-12-02 2013-10-01 Pierre Fabre Medicament Anti-c-Met antibody
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BR112012008833A2 (pt) 2009-10-15 2015-09-08 Abbott Lab imunoglobulinas de dominio variavel duplo e usos das mesmas
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JP5932670B2 (ja) 2010-03-11 2016-06-08 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102174106B (zh) 2011-03-17 2013-04-10 朱进 抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用
JP2015502397A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用
EP2825553B1 (en) 2012-03-14 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
ES2913205T3 (es) 2014-05-13 2022-06-01 Bioatla Inc Proteínas biológicas activas condicionalmente
KR20160069363A (ko) * 2014-12-08 2016-06-16 삼성전자주식회사 항체 선별 방법
EP3262217A4 (en) 2015-02-24 2018-07-18 BioAtla LLC Conditionally active biological proteins
WO2016161390A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
IL296285A (en) 2015-07-06 2022-11-01 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
KR20260018979A (ko) 2016-02-05 2026-02-09 젠맵 에이/에스 개선된 내재화 특징을 갖는 다중특이적 항원-결합 분자
SI3626273T1 (sl) * 2016-05-17 2021-04-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Konjugati protitelesa proti CMET in zdravila ter postopki za njihovo uporabo
AU2017320874B2 (en) 2016-08-31 2024-03-07 Bioatla, Llc Conditionally active polypeptides and methods of generating them
MX420249B (es) 2016-09-29 2025-02-10 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Agentes de unión monoclonales de cmet, conjugados de fármaco de los mismos y usos de los mismos.
JP6709340B2 (ja) 2016-11-16 2020-06-10 イーライ リリー アンド カンパニー エクソン１４スキッピング変異（複数可）またはエクソン１４スキッピング表現型を有するがんの併用療法
HRP20210922T1 (hr) 2016-11-23 2021-09-03 Eli Lilly And Company Konjugati protutijela protiv met s lijekom
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
US11690919B2 (en) 2017-01-17 2023-07-04 The Texas A&M University System Endolysosomal targeting conjugates for improved delivery of cargo molecules to the endolysosomal compartment of target cells
US10799597B2 (en) 2017-04-03 2020-10-13 Immunomedics, Inc. Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy
EP3774923A4 (en) * 2018-03-28 2021-12-29 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Drug conjugates of cmet monoclonal binding agents, and uses thereof
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
CN113365664A (zh) 2018-10-29 2021-09-07 梅尔莎纳医疗公司 具有含肽接头的半胱氨酸工程化的抗体-药物缀合物
MX2022001286A (es) 2019-07-30 2022-07-19 Mythic Therapeutics Inc Construcciones de proteínas de unión a antígenos y usos de estas.
RS66266B1 (sr) 2021-02-03 2024-12-31 Mythic Therapeutics Inc Anti-met antitela i njihova primena
US20240197906A1 (en) 2022-12-11 2024-06-20 Mythic Therapeutics, Inc. ANTI-cMET ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND THERAPEUTIC USES THEREOF

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US20240101688A1 (en) 2024-03-28
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