ES3001561T3 - Pharmaceutical compositions containing clostridium difficile toxoids a and b - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que incluyen toxinas y/o toxoides de Clostridium difficile y a los métodos correspondientes. Las composiciones de la invención incluyen uno o más excipientes que aumentan la estabilidad y/o disminuyen la agregación de las toxinas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones farmacéuticas que contienen toxoides A y B deClostridium difficile
Campo de la invención
Esta invención se refiere a composiciones que incluyen toxoides deClostridium difficiley a métodos correspondientes.
Antecedentes de la invención
Las toxinas A y B deClostridium difficile (C. difficile)son las responsables de la enfermedad asociada conC. difficile(CDAD, por sus siglas en inglés), que se manifiesta como diarrea nosocomial y colitis pseudomembranosa (Kuijperet al.,Clinical Microbiology and Infection 12(Suppl. 6):2-18, 2006; Drudyet al.,International Journal of Infectious Diseases 11 (1):5-10, 2007; Warnyet al.,Lancet 366(9491): 1079-1084, 2005; Doveet al.,Infection and Immunity 58(2):480-488, 1990; Barrosoet al.,Nucleic Acids Research 18(13):4004, 1990). El tratamiento de las toxinas con formaldehído da como resultado los toxoides A y B correspondientes, que están completamente desactivados y conservan inmunogenicidad al menos parcial (Torreset al.,Infection and Immunity 63(12):4619-4627, 1995). Se ha mostrado que la vacunación que emplea ambos toxoides es eficaz en hámsteres, adultos sanos y pacientes con CDAD recurrente (Torreset al.,Infection and Immunity 63(12):4619-4627, 1995; Kotloffet al.,Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001; Sougioultziset al.,Gastroenterology 128(3):764-770, 2005; Torreset al.,Vaccine Research 5(3): 149-162, 1996). Además, la administración de toxoides tanto libres como ligados a sal de aluminio (adyuvante) conduce a respuestas inmunitarias apropiadas (Torreset al.,Vaccine Research 5(3): 149-162, 1996; Giannascaet al.,Infection and Immunity 67(2):527-538, 1999). La administración de ambos toxoides simultáneamente es más eficaz que la administración de proteínas individuales solas (Kimet al.,Infection and Immunity 55(12):2984-2992, 1987). Por lo tanto, ambos de toxoides A y B son candidatos para el desarrollo de vacunas. La mejora de su integridad conformacional y/o la reducción en su tendencia para agregarse es deseable para producir estabilidad en almacenamiento óptima. El documento WO 99/20304 A1 divulga métodos para prevenir y tratar una infección porClostridium difficile,que implican la administración percutánea de inmunoglobulina policlonal neutralizante de toxina deC. difficile,toxoides deC. difficileo combinaciones de los mismos. Changet al.,J. Pharm. Sci. 94(7): 1427-1444, 2005 divulgan mecanismos de estabilización de proteínas por azúcares en estado sólido. Wang, Int. J. Pharm. 203:1-60, 2000 divulga excipientes para la generación de productos farmacéuticos estabilizados.
Sumario de la invención
La invención proporciona una composición que comprende un toxoide deClostridium difficiley un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende un azúcar o alcohol de azúcar seleccionado de sorbitol, trehalosa y sacarosa, en una concentración del 10-20 %.
La invención también proporciona una composición como se ha descrito anteriormente, en donde dicho excipiente farmacéuticamente aceptable reduce o retrasa la agregación del toxoide en un 50 % o más, en relación con una composición que carece de dicho excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona una composición como se ha descrito anteriormente, en donde la composición comprende un toxoide de las toxinas A y B deC. difficile.
La invención también proporciona una composición como se ha descrito anteriormente, en donde la composición es una composición farmacéutica.
La invención también proporciona una composición como se ha descrito anteriormente, que comprende además un adyuvante, en donde, opcionalmente, el adyuvante es un compuesto de aluminio, preferentemente un compuesto de hidróxido de aluminio.
La invención también proporciona una composición como se ha descrito anteriormente para su uso en un método para prevenir o tratar la infección o enfermedad porC. difficileen un sujeto.
La invención proporciona composiciones, tales como composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones de vacunas), incluyendo un toxoide deClostridium difficile(por ejemplo, un toxoide de toxinas A y/o B deC. difficile;estando los toxoides A y B presentes en una relación de, por ejemplo, 5:1 a 1:5, por ejemplo, 3:2 (A:B)) y un excipiente farmacéuticamente aceptable, que reduce o retrasa la agregación del toxoide, y/o aumenta la estabilidad térmica de la toxina o toxoide, en relación con una composición que carece del excipiente farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, el excipiente farmacéuticamente aceptable reduce o retrasa la agregación del toxoide en un 50 % o más, en relación con una composición que carece del excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro ejemplo, el excipiente farmacéuticamente aceptable aumenta la estabilidad térmica del toxoide en 0,5 °C o más, en relación con una composición que carece del excipiente farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden incluir un adyuvante (por ejemplo, un compuesto de aluminio, tal como un hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o un compuesto de hidroxifosfato de aluminio). Las composiciones pueden estar en forma líquida, en forma de polvo seco, liofilizadas, secadas por pulverización o secadas con espuma.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en tampones, agentes de tonicidad, hidratos de carbono simples, azúcares, polímeros de hidratos de carbono, aminoácidos, oligopéptidos, poliaminoácidos, alcoholes polihídricos y éteres de los mismos, detergentes, lípidos, tensioactivos, antioxidantes, sales, seroalbúmina humana, gelatinas, formaldehído o combinaciones de los mismos. Se describe que, (i) el tampón se selecciona del grupo que consiste en citrato, fosfato, glicina, histidina, carbonato y bicarbonato, y está en una concentración de 5-100 mM; (ii) el agente de tonicidad es manitol, en una concentración de 1-50 mM; (iii) el azúcar se selecciona de sorbitol, trehalosa y sacarosa, en una concentración del 1-30%; (iv) el aminoácido, oligopéptido o poliaminoácido está presente en una concentración de hasta 100 mM; (v) el alcohol polihídrico se selecciona del grupo que consiste en glicerol, polietilenglicol y éteres de los mismos de peso molecular 200-10.000, en una concentración de hasta el 20 %; (vi) los detergentes y lípidos se seleccionan del grupo que consiste en desoxicolato de sodio, Tween 20, Tween 80 y pluronics, en concentraciones de hasta el 0,5 %; (vii) los polímeros de carbohidratos se seleccionan de dextrano y celulosa; (viii) las sales se seleccionan del grupo que consiste en cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y acetato de magnesio, hasta 150 mM; y (ix) el formaldehído está presente al 0,001-0,02 %.
Se describen excipientes, incluidos los enumerados en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 8 o Tabla 9. En otros ejemplos, las composiciones incluyen citrato de sodio o potasio, y/o fosfato de sodio o potasio, opcionalmente junto con sacarosa y/o formaldehído. Por lo tanto, en diversos ejemplos, las composiciones incluyen toxoides A y B deClostridium diffiále,citrato (o fosfato) de sodio o potasio 5-100 mM (por ejemplo, 10-30 mM o 20 mM), sacarosa al 2-20 % (por ejemplo, 2-10 % o 5 %) y formaldehído <0,020 % (por ejemplo, 0,016 %), a pH 5,5-8,5 (por ejemplo, 6,5-8,0 o 7,5). También se describe una combinación de sorbitol, dextrosa y/o Tween 80.
En el presente documento se divulgan métodos para elaborar composiciones que incluyen un toxoide deClostridium difficiley excipientes farmacéuticamente aceptables, que reducen o retrasan la agregación del toxoide y/o aumentan la estabilidad térmica del toxoide, en relación con una composición que carece de los excipientes farmacéuticamente aceptables. Estos métodos incluyen proporcionar un toxoide deClostridium difficiley mezclar el toxoide deClostridium difficilecon los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en el presente documento. Las composiciones pueden almacenarse en forma líquida o liofilizada, como se describe en el presente documento.
La invención proporciona además métodos para inducir una respuesta inmunitaria aC. difficileen un sujeto, que implican administrar al sujeto una composición como se describe en el presente documento. En un ejemplo, el paciente no tiene, pero corre el riesgo de desarrollar, la enfermedad porC. difficiley, en otro ejemplo, el paciente tiene una enfermedad porC. difficile. Además, la invención incluye el uso de las composiciones de la invención para inducir una respuesta inmunitaria aC. difficileen un sujeto, o para la preparación de medicamentos para su uso con este fin.
La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, el uso de los excipientes descritos en el presente documento puede dar como resultado una mayor estabilidad física de los toxoides A y B deC. difficile,y/o una agregación reducida o retardada, que son importantes para la producción de productos farmacéuticos (por ejemplo, vacunas) que incluyen los toxoides. Además, el uso de las relaciones (por ejemplo, 3:2, A:B) y la adición de adyuvante justo antes de la administración (en lugar de en la formulación de la vacuna almacenada), puede dar como resultado una mayor inmunogenicidad.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Estudios de los efectos de los solutos sobre la estabilidad estructural del toxoide A (x) en presencia de trehalosa al 20 % (□), sacarosa al 20 % (■), sorbitol al 10 % (o), dextrosa al 10 % (•), glicerol al 20 % (A), tween 80 al 0,05 % (▲), pluronic F68 al 0,1 % (0): (a) señal de CD a 208 nm; (b) intensidad de emisión de ANS; (c) posición del pico de emisión de ANS; y (d) termograma de DSC. Los trazos térmicos representan un promedio de 2 mediciones, donde cada punto de datos tuvo un error estándar de menos de 0,5.
Figura 2. Estudios de los efectos de los solutos sobre la estabilidad estructural del toxoide B (x) en presencia de trehalosa al 20 % (□), sacarosa al 20 % (■), sorbitol al 10 % (o), dextrosa al 10 % (•), glicerol al 20 % (A), tween 80 al 0,05 % (▲), pluronic F68 al 0,1 % (0): (a) señal de CD a 208 nm; (b) intensidad de emisión de ANS; (c) posición del pico de emisión de ANS; y (d) termogramas de DSC. Los trazos térmicos representan un promedio de 2 mediciones. Cada punto de datos tuvo un error estándar de menos de 0,5.
Figura 3. Estudios del efecto de combinaciones de solutos sobre la estabilidad térmica del toxoide A (x) en presencia de sorbitol al 10 % y tween 80 al 0,05 % (□), dextrosa al 10 % y tween 80 al 0,05 % (■), sorbitol al 10 %, dextrosa al 10 % y tween 80 al 0,05 % (o), dextrosa al 10 % y sorbitol al 10 % (•): (a) monitorizado por la señal de CD a 208 nm y (b) D<o>a 350 nm. Los trazos térmicos representan un promedio de 2 mediciones, en las que cada punto de datos tuvo un error estándar de menos de 0,05.
Figura 4. Estudios de combinaciones de solutos y sus efectos sobre la estabilidad térmica del toxoide B (x) en presencia de sorbitol al 10 % y tween 80 al 0,05 % (□), dextrosa al 10 % y tween 80 al 0,05 % (■), sorbitol al 10 %, dextrosa al 10 % y tween 80 al 0,05 % (o), dextrosa al 10 % y sorbitol al 10 % (•): (a) monitorizado por la señal de CD a 208 nm y (b) DO a 350 nm. Los trazos térmicos representan un promedio de 2 mediciones, donde cada punto de datos tuvo un error estándar de menos de 0,05.
Figura 5. Estudios de las propiedades del tween 80 (□) en presencia de dextrosa al 10 % (■), sorbitol al 10 % (o), dextrosa al 10 % y sorbitol al 10 % (•) en función de la temperatura: Señal de CD a 208 nm de tween 80 al 0,05 % (a) y tween 80 al 0,1 % (b); DO a 350 nm para tween 80 al 0,05 % (c) y tween 80 al 0,1 % (d); diámetro basado en el número de MSD del diámetro hidrodinámico (cuadrado de color negro) y diámetro basado en el número lognormal (rombo de color negro) para tween 80 al 0,05 % (e) y tween 80 al 0,1 % (f). Los tamaños de >1 pm no son precisos dada la naturaleza de las mediciones DLS. Los trazos térmicos representan un promedio de 2 mediciones, donde cada punto de datos tuvo un error estándar de menos de 0,5.
Figura 6. Estudios del efecto de la concentración de soluto en el punto medio de la transición térmica (Tm) monitorizada con una señal de CD a 208 nm para el toxoide A (a) y el toxoide B (b) en presencia de sorbitol y tween 80 al 0,05 % (♦), dextrosa y tween 80 al 0,05 % (■), sorbitol, dextrosa y tween 80 al 0,05 % (A), sorbitol, dextrosa y tween 80 al 0,1 % (x), sorbitol y dextrosa (0).
Figura 7. El diámetro hidrodinámico en función de la temperatura para el toxoide A (a-c) y el toxoide B (d-f), donde los cuadrados de color negro representan el diámetro basado en el número de MSD y los romboides de color negro representan el diámetro basado en el número lognormal. Los tamaños de >1 pm no son precisos dada la naturaleza de las mediciones DLS. (a,d) proteína sola; (b,e) proteína en presencia de sorbitol al 10 % y dextrosa al 10 %; (c,f) proteína en presencia de sorbitol al 10 %, dextrosa al 10 % y tween 80 al 0,05 %. Los trazos térmicos representan un promedio de 2 mediciones, donde cada punto de datos tuvo un error estándar de menos de 0,5.
Figura 8. Estudios de unión de Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio): (a) isoterma de adsorción y (b) isoterma de desorción en presencia de NaCl 2 M para el toxoide A (0) y el toxoide B (A).
Figura 9. Estudio de la estructura secundaria del toxoide A mediante espectroscopia de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés) en un intervalo de pH de 5,5 a 7,5.
Figura 10. Estudio de la estructura secundaria del toxoide B mediante espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en un intervalo de pH de 5,5 a 7,5.
Figura 11. Estudio de la temperatura de fusión del toxoide A mediante espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en un intervalo de pH de 5,5-8,0.
Figura 12. Estudio de la temperatura de fusión del toxoide B mediante espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en un intervalo de pH de 5,0-7,5.
Figura 13. Estudio de la agregación a diferentes valores de pH en el tiempo a una temperatura de almacenamiento fija.
Figura 14. Estudio de la agregación dependiente de sales del toxoide A a 37 °C en el tiempo.
Figura 15. Estudio de la agregación dependiente de sales del toxoide B a 37 °C en el tiempo
Figura 16. Estudio de los parámetros de liofilización de formulaciones de vacunas.
Descripción detallada
La divulgación proporciona composiciones que incluyen toxoides deClostridium difficiley un excipiente farmacéuticamente aceptable que proporcionan propiedades beneficiosas a las composiciones. Por ejemplo, y como se describe más adelante, los excipientes incluidos en las composiciones de la divulgación pueden dar como resultado una mayor estabilidad de uno o más de los componentes toxoides de las composiciones y/o una agregación disminuida o retardada de los toxoides.
Los toxoides deC. difficileque se pueden incluir en las composiciones de la divulgación se pueden preparar usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar métodos que impliquen la inactivación con formaldehído (véase, por ejemplo, Kotloffet al.,Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001). Preferentemente, las composiciones incluyen tanto el toxoide A como el toxoide B, pero las composiciones que incluyen solo uno de estos toxoides también se incluyen en la divulgación.
Una cepa deC. difficilede ejemplo que se puede usar como fuente de toxinas es ATCC 43255 (VPI 10463). Los toxoides pueden estar presentes en las composiciones en relaciones variables, por ejemplo, 5:1 (A:B) a 1:5 (A:B). En ejemplos específicos, las relaciones pueden ser 2:1, 3:1 o 3:2 (A:B). La cantidad total de toxoide en las composiciones de la divulgación puede ser, por ejemplo, 100 ng-1 mg, 100 ng-500 |jg, 1-250 |jg, 10-100 |jg, 25-75 |jg o 50 |jg. Las composiciones pueden almacenarse opcionalmente en viales en dosis unitarias individuales.
Se describen composiciones, incluyendo uno o más compuestos tales como, por ejemplo, tampones (por ejemplo, citrato, fosfato, glicina, histidina, carbonato o bicarbonato; 5-100 mM; los ejemplos de sales de citrato que se pueden usar incluyen sodio, potasio, magnesio y cinc); agentes de tonicidad (por ejemplo, manitol; 1-50 mM); hidratos de carbono, tales como azúcares o alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol, trehalosa o sacarosa; 1-30 %) o polímeros de hidratos de carbono (por ejemplo, dextrano y celulosa); aminoácidos, oligopéptidos o poliaminoácidos (hasta 100 mM); alcoholes polihídricos (por ejemplo, glicerol, polietilenglicoles o éteres de los mismos, de peso molecular 200-10.000 y concentraciones de hasta el 20 %); detergentes, lípidos o tensioactivos (por ejemplo, Tween 20, Tween 80 o pluronics, con concentraciones de hasta el 0,5 %); antioxidantes; sales (por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio o acetato de magnesio, hasta 150 mM); albúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana); gelatinas; formaldehído (0,001-0,02 %); o combinaciones de los mismos.
Se describen excipientes, incluyendo los que se enumeran en las Tablas 1, 2, 8 y 9, a continuación. En diversos ejemplos, los excipientes pueden ser aquellos que dan como resultado (i) una estabilidad térmica aumentada (por ejemplo, de al menos 0,5 °C, por ejemplo, 0,5-5 °C, 1-4 °C o 2-3 °C) según lo medido, por ejemplo, mediante los ensayos descritos a continuación (por ejemplo, calorimetría diferencial de barrido (DSC)), y/o (ii) una agregación disminuida o retardada del toxoide A, toxoide B o ambos toxoides A y B de, por ejemplo, el 50 % o más (por ejemplo, el 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, 99 % o más o el 100 %), según lo medido, por ejemplo, mediante los ensayos descritos a continuación. También se incluyen en el presente documento composiciones que incluyen agregados de toxoides.
Por lo tanto, los excipientes y tampones de ejemplo incluyen sorbitol (por ejemplo, 4-20 % o 5-10 %), trehalosa (por ejemplo, 4-20 % o 5-10 %) y sacarosa (por ejemplo, 1-20 % o 5-10 %). Se describen excipientes y tampones que incluyen citrato de sodio (por ejemplo, 0,01-0,2 M, por ejemplo, 0,02-0,1 M), tween 80 (por ejemplo, 0,05-0,1 %), dietanolamina (por ejemplo, 0,3 M), histidina (por ejemplo, 0,02-0,3 M), guanidina (por ejemplo, 0,3 M), dextrosa (por ejemplo, 5-20%), glicerol (por ejemplo, 20%), albúmina (por ejemplo, 1-2,5%), lactosa (por ejemplo, 10-20%), manitol (por ejemplo, 10 %), sacarosa (por ejemplo, 5-20 %), pluronic F-68 (por ejemplo, 0,1 %), 2-OH propil p-CD (por ejemplo, 5-10 %), dextrano T4O (por ejemplo, 0,03-0,08 mg/ml), Brij (por ejemplo, 0,01-0,1 %), lisina (por ejemplo, 0,3 M), Tween 20 (por ejemplo, 0,01-0,05 %) y ácido aspártico (por ejemplo, 0,15 M) (véanse las Tablas 1, 2, 8 y 9). Estos excipientes se pueden usar en las concentraciones enumeradas en las tablas. Como alternativa, las cantidades se pueden variar en, por ejemplo, 0,1-10 veces, como se entiende en la técnica. También se pueden incluir en las composiciones de la divulgación otros hidratos de carbono, alcoholes de azúcar, tensioactivos y aminoácidos que se conocen en la técnica.
Los excipientes y tampones se pueden usar individualmente o en combinación. Como ejemplo de una combinación, las composiciones pueden incluir citrato de sodio y sacarosa, que se ha demostrado que proporcionan beneficios con respecto a la estabilidad del toxoide. Las cantidades de estos componentes pueden ser, por ejemplo, 10-30 mM, 15 25 mM o 20 mM de citrato de sodio; y sacarosa al 1-20% o el 5-10%. Además de estos componentes, dichas composiciones pueden incluir una cantidad baja de formaldehído, tal como formaldehído al 0,001-0,020, 0,01-0,018 o el al 0,16 %. El pH de tal composición puede ser, por ejemplo, 5,5-8,0 o 6,5-7,5, y la composición puede almacenarse a, por ejemplo, 2-8 °C, en forma líquida o liofilizada. En variaciones de esta composición, el citrato de sodio puede reemplazarse por fosfato de sodio (10-30 mM, 15-25 mM o 20 mM) y/o la sacarosa puede reemplazarse por sorbitol (por ejemplo, 4-20 % o 5-10 %), o trehalosa (por ejemplo, 4-20 % o 5-10 %). Otras variaciones de las composiciones se incluyen en el presente documento e implican el uso de otros componentes enumerados en el presente documento. En función de lo anterior, una composición de ejemplo de la divulgación incluye citrato de sodio 20 mM, sacarosa al 5 % y formaldehído al 0,016 %, pH 7,5.
Se describen composiciones que incluyen sorbitol, dextrosa y Tween 80, que es una combinación que ha demostrado proporcionar beneficios con respecto a la agregación y la estabilidad (véase a continuación). Las cantidades de estos componentes pueden ser, por ejemplo, sorbitol al 5-15 %, 8-12 % o al 10 %; dextrosa al 5-15 %, 8-12 % o al 10 %; y Tween 80 al 0,01-1 %, 0,025-0,5 % o al 0,05-0,1 %. Se describe una composición en la que estos componentes están presentes en un 10 % (sorbitol y dextrosa) y un 0,05-0,1 % (Tween 80). En otro ejemplo, los excipientes son dextrosa (10 %) y sorbitol (10 %).
Las composiciones de la invención se pueden almacenar en forma líquida o seca, incluyendo esta última como ejemplos la forma en polvo liofilizada, la forma liofilizada, la forma secada por pulverización y la forma secada por espuma. Por lo tanto, además de uno o más excipientes, como se ha descrito anteriormente, las composiciones de la divulgación pueden incluir un medio líquido (por ejemplo, solución salina o agua), que puede estar tamponado con, por ejemplo, fosfato de sodio (por ejemplo, 5 mM) que contiene NaCl (por ejemplo, 150 mM). Un intervalo de pH de ejemplo de las composiciones de la divulgación es 5-10, por ejemplo, 5-9, 5-8, 5,5-9, 6-7,5 o 6,5-7. Además, las composiciones pueden incluir uno o más agentes estabilizantes. En otros ejemplos, las composiciones están en forma liofilizada, y dichas composiciones pueden reconstituirse mediante el uso de un medio líquido (por ejemplo, solución salina o agua) antes de la administración.
Las composiciones de la divulgación pueden incluir opcionalmente uno o más adyuvantes, además de los antígenos toxoides y el uno o más excipientes descritos anteriormente. Los adyuvantes que se pueden usar en la divulgación incluyen compuestos de aluminio, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y hidroxifosfato de aluminio. El antígeno se puede precipitar con, o adsorber sobre, el compuesto de aluminio usando métodos estándar. Como ejemplo específico, se puede usar alumbre (por ejemplo, Rehydragel LV®, Reheis, Inc., Berkeley Heights, Nueva Jersey; hasta, por ejemplo, 2 mg de AlOH/dosis, por ejemplo, aproximadamente 1,5 mg de AlOH/dosis; Alhydrogel® (por ejemplo, Alhydrogel® al 2 %; (adyuvante de hidróxido de aluminio)), Brenntag Biosectror, Frederickssund, Dinamarca (AOH<3>)). La cantidad de aluminio usada puede ser, por ejemplo, 100-850 pg/dosis, 200-600 pg/dosis o 300-600 pg/dosis.
Un enfoque de formulación incluido en la divulgación implica formular los toxoides y los excipientes juntos y a continuación añadir un adyuvante, tal como un adyuvante de alumbre, justo antes de la administración. Se ha encontrado que este enfoque aumenta la inmunogenicidad, como se describe más adelante. En otro enfoque, el adyuvante se incluye en la formulación antes del almacenamiento (ya sea en forma líquida o liofilizada). Los adyuvantes adicionales que se pueden usar en las composiciones y los métodos de la divulgación incluyen RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT), QS21 (Aquila), Bay (Bayer) y polifosfaceno (Virus Research Institute, Cambridge, MA; documento WO 95/2415).
La divulgación también incluye métodos para elaborar las composiciones descritas en el presente documento, que implican la producción de toxoides como se describe, por ejemplo, por Kotloffet al.,Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001, y la combinación de los toxoides con uno o más excipientes como se describe en el presente documento usando métodos estándar de formulación farmacéutica. Como se ha descrito anteriormente, las composiciones se pueden almacenar en forma líquida o liofilizada. La liofilización se puede realizar usando métodos estándar (véanse, por ejemplo, los ejemplos a continuación), y el material liofilizado se puede reconstituir en un líquido estéril (por ejemplo, agua, solución salina o una solución que incluya cualquier excipiente deseado), con o sin un adyuvante, antes de la administración.
Además, la divulgación incluye el uso de las composiciones en la prevención y el tratamiento de la infección o enfermedad porC. diffiále.Por lo tanto, la divulgación incluye la administración de las composiciones de la divulgación para prevenir o tratar la enfermedad asociada aC. difficile(CDAD), tal como CDAD recurrente, así como las características de la CDAD, incluyendo diarrea (por ejemplo, diarrea nosocomial) y colitis pseudomembranosa. Como se conoce en la técnica, la CDA<d>a menudo se asocia con el tratamiento de sujetos con antibióticos, tales como sujetos que están hospitalizados. Por lo tanto, las composiciones para su uso en los métodos de tratamiento de la divulgación se pueden usar en el tratamiento de dichos pacientes. Además, el tratamiento de acuerdo con la divulgación se puede combinar con un tratamiento con antibióticos (por ejemplo, vancomicina y/o metronidazol) y/o inmunoterapia pasiva (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.214.341). Los métodos de administración de la divulgación también se pueden usar en la generación de inmunoglobulina contraC. difficilepara su uso en la inmunización pasiva de pacientes (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.214.341).
Se describen métodos para identificar excipientes que se pueden usar para generar composiciones que incluyen toxinas o toxoides deC. diffiáleque tienen propiedades mejoradas. Estos métodos implican ensayos de cribado, tales como los que se describen más adelante, que facilitan la identificación de condiciones que dan como resultado una agregación disminuida o retardada y/o una estabilidad aumentada de uno o más de los componentes de toxina y/o toxoides de las composiciones. Estos métodos incluyen ensayos de agregación y ensayos de estabilidad como se describe más adelante. Se describe además el uso de otros ensayos para identificar formulaciones deseables, incluyendo ensayos de solubilidad, inmunogenicidad y viscosidad.
Las composiciones de la divulgación se pueden administrar, por ejemplo, por vía percutánea (por ejemplo, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal) en cantidades y en pautas que los expertos en la técnica determinen como apropiadas. Por ejemplo, se pueden administrar 100 ng-1 mg, 100 ng-500 pg, 1-250 pg, 10-100 pg, 25-75 pg o 50 pg de toxoide. Para fines de profilaxis o terapia, la vacuna se puede administrar, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 veces. Cuando se administran múltiples dosis, las dosis se pueden separar entre sí, por ejemplo, de una semana a un mes. En otro ejemplo, se pueden administrar por vía intramuscular cuatro dosis de 50 pg cada una durante un período de ocho semanas.
Ejemplo I
Para identificar las condiciones que mejoran la estabilidad física de los toxoides A y B deClostridium diffiále,se realizó un cribado de compuestos estabilizantes. El cribado de 30 compuestos GRAS (generalmente considerados seguros) en diversas concentraciones y en varias combinaciones se realizó en dos partes. En primer lugar, se usó un ensayo de agregación de alto rendimiento para cribar compuestos que retrasan o previenen la agregación de toxoides en condiciones de estrés (los toxoides a pH 5-5,5 se incubaron a 55 °C durante 55 o 75 minutos). Los compuestos que estabilizaron ambas proteínas se estudiaron más a fondo para determinar su capacidad para retrasar el desdoblamiento en condiciones que conducían a un estado plegado presumiblemente de tipo natural (pH 6,5). La estabilidad térmica de los toxoides en la superficie del Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se controló con DSC y también mostró una mejora significativa en presencia de determinados excipientes. Se investigaron más a fondo los compuestos que inhibían eficazmente la agregación de ambos toxoides para determinar su capacidad para mejorar la estabilidad estructural de las proteínas. Para identificar agentes estabilizantes para los toxoides unidos a adyuvantes, se estudiaron más a fondo los excipientes seleccionados para determinar su capacidad para mejorar la estabilidad térmica de los toxoides unidos a adyuvantes. En conclusión, este estudio ha generado información sobre el comportamiento de los toxoides libres y unidos a adyuvantes en una variedad de condiciones (temperaturas y solutos) que se pueden usar para diseñar formulaciones farmacéuticas de estabilidad física mejorada.
Materiales y métodos experimentales
Materiales
Los toxoides A y B se produjeron en forma muy purificada usando métodos descritos previamente (Kotloffet al.,Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001). La concentración de las proteínas se determinó mediante absorbancia UV a 280 nm usando unidades de absorbancia de 1,173 para el toxoide A y 0,967 para el toxoide B en concentraciones de 1 mg/ml, respectivamente. Todos los reactivos usados fueron de calidad analítica y se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO). Se usó un tampón de fosfato de sodio (5 mM, pH 5,0, 5,5 y 6,5) que contenía NaCl 150 mM para los estudios de cribado de excipientes. Se usó un tampón de fosfato de sodio (5 mM, pH 6,5) que contenía NaCl 150 mM para los estudios de agitación y adyuvantes. Para el intercambio de tampón, la proteína se dializó a temperatura de refrigerador usando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer®, MWCO 10 kDa (Pierce, Rockford, IL).
Estudios de cribado de excipientes
Ensayo de agregación.Se cribaron aproximadamente 30 compuestos GRAS (generalmente considerados seguros) en 58 variaciones de concentración y en varias combinaciones para determinar su capacidad de inhibir la agregación de los toxoides. La agregación de la proteína se monitorizó mediante mediciones de densidad óptica a 350 nm (DO a 350 nm) usando un lector de placas de 96 pocillos (Spectra Max M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El ensayo de agregación se realizó a pH 5,5 para el toxoide A (1,2 mg/ml) y a pH 5,0 para el toxoide B (0,5 mg/ml) a 55 °C. En estas condiciones, las proteínas se desdoblan parcialmente y se asocian espontáneamente. Por lo tanto, se puede detectar potencialmente cualquier influencia estabilizante de los excipientes que perturbe estos dos procesos. La proteína se añadió a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía uno o más excipientes al pH correspondiente y las muestras se incubaron a 55 °C durante 75 minutos en el caso del toxoide A y durante 55 minutos para el toxoide B. La densidad óptica de las soluciones se controló a 350 nm cada 5 minutos. Los controles de soluciones de proteína sin compuestos añadidos y tampón solo con uno o más excipientes (blancos) se examinaron simultáneamente. Las mediciones se corrigieron para determinar el comportamiento intrínseco del tampón-excipiente restando los blancos antes del análisis de los datos. Cada muestra se evaluó por triplicado. El porcentaje de inhibición de la agregación se calculó empleando la siguiente expresión:
% de inhibición de la agregación = 100 - [LAAOODD33S50o((CE))x 100jl
Donde AOD<350>(E) representa el cambio en la DO a 350 nm de la proteína en presencia del excipiente y AOD<350>(C) el cambio en la DO a 350 nm de la proteína sin excipiente (Peeket al.,Journal of Pharmaceutical Sciences 96(1):44-60, 2006).
Estudios de estabilidad estructural.Las soluciones de toxoides se estudiaron a una concentración de 0,2 mg/ml para mediciones de CD y 0,1 mg/ml para análisis de fluorescencia y absorción UV. No se observó dependencia de la concentración en este intervalo. Cada muestra se evaluó por duplicado para asegurar la reproducibilidad de las mediciones.
Espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en el ultravioleta lejano.Los espectros de CD se adquirieron usando un espectropolarímetro Jasco J-810 equipado con un controlador de temperatura Peltier de 6 posiciones. Los espectros de CD se obtuvieron entre 260-190 nm con una velocidad de barrido de 20 nm/minuto, una acumulación de 2 y un tiempo de respuesta de 2 segundos. La señal de CD a 208 nm se monitorizó cada 0,5 °C en un intervalo de temperatura de 10 a 85 °C empleando una rampa de temperatura de 15 °C/hora para estudiar las transiciones térmicas (curvas de fusión) de las proteínas (en cubetas selladas con una longitud de trayectoria de 0,1 cm). La señal de CD se convirtió a elipticidad molar mediante el software Jasco Spectral Manager. La temperatura del punto medio de la transición térmica se obtuvo a partir de un ajuste sigmoideo de las curvas de fusión usando el software Origin.
Espectroscopia de fluorescencia del ANS.La accesibilidad de los sitios apolares en las proteínas se monitorizó mediante la emisión de fluorescencia de la sonda extrínseca 8-anilino-1-naftaleno sulfonato (ANS). Cada muestra contenía un exceso molar de ANS con respecto a la proteína de 20 veces. Los espectros de emisión se obtuvieron de 400 a 600 nm con un tamaño de paso de 2 nm y un tiempo de integración de 1 segundo después de la excitación con ANS a 372 nm. Los espectros de emisión se recopilaron cada 2,5 °C con 5 minutos de equilibrio en un intervalo de temperatura de 10 a 85 °C. El valor inicial del tampón ANS a cada pH correspondiente se restó de los espectros de emisión sin procesar. Las posiciones de los picos de los espectros de emisión se obtuvieron a partir de ajustes polinómicos usando el software Origin.
Espectroscopia de absorbancia UV de alta resolución.Los espectros de absorbancia UV de alta resolución se adquirieron usando un espectrofotómetro UV-visible Agilent 8453. La agregación de las proteínas se estudió mediante la monitorización de la DO a 350 nm cada 2,5 °C en un intervalo de temperatura de 10 a 85 °C con una incubación de 5 minutos (suficiente para alcanzar el equilibrio) a cada temperatura.
Dispersión de luz dinámica.El diámetro hidrodinámico medio de las proteínas a pH 6,5 (solas y en presencia de excipientes) se analizó usando un instrumento de dispersión de luz dinámica (Brookhaven Instrument Corp., Holtzille, NY). El instrumento estaba equipado con un láser bombeado por diodo de 50 mW (A = 532 nm) y la luz dispersada se monitorizó a 90° con respecto al haz incidente. Las funciones de autocorrelación se generaron usando un autocorrelador digital (BI-9000AT). El diámetro hidrodinámico se calculó a partir del coeficiente de difusión mediante la ecuación de Stokes-Einstein usando el método de cumulantes (basado en números lognormales). Los datos se ajustaron a un algoritmo de mínimos cuadrados sin restricciones negativas para generar distribuciones multimodales (MSD). El instrumento estaba equipado con un baño de agua circulante con control de temperatura RTE111 (Neslab, Newington, NH) y se monitorizó el diámetro hidrodinámico en un intervalo de temperatura de 10 a 85 °C.
Calorimetría diferencial de barrido (DSC).La DSC se realizó usando un MicroCal VPDSC con muestreador automático (MicroCal, LLC; Northampton, MA). Se obtuvieron termogramas de toxoides (0,5 mg/ml) solos y en presencia de uno o más excipientes a una temperatura de 10-90 °C usando una velocidad de barrido de 60 °C/hora. Las celdas llenas se equilibraron durante 15 minutos a 10 °C antes de comenzar cada barrido. Los termogramas del tampón solo se restaron de cada barrido de proteínas antes del análisis.
Estudios de agitación.Se estudiaron soluciones de toxoides a una concentración de 0,4 mg/ml en presencia y ausencia de los excipientes. Las muestras de proteína (0,4 ml) se colocaron en tubos de centrífuga de 1,5 ml y se agitaron en un rotador (Thermomixer R, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) a 300 rpm durante 72 horas a una temperatura constante de 4 °C. La concentración de la proteína y la DO a 350 nm se midieron antes y después de la rotación para evaluar la adsorción a las paredes del recipiente y la agregación. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a una velocidad de 10.000 x g a 4 °C y se midieron la concentración y la DO a 350 nm del sobrenadante para detectar la formación de agregados insolubles. Las estructuras de las proteínas se evaluaron mediante CD. Cada muestra se midió por duplicado.
Estudios de adyuvantes
Adsorción en hidróxido de aluminio (Alhydrogel®) (adyuvante de hidróxido de aluminio).La capacidad de los toxoides para adsorberse en Alhydrogel® (Brenntag Biosectror, Frederickssund, Dinamarca; adyuvante de hidróxido de aluminio) a diversas concentraciones (0,025-1 mg/ml) se determinó mediante la construcción de una isoterma de unión. Las soluciones de proteína en presencia de 0,4 mg/ml de Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se agitaron en un rotador de tubos de extremo a extremo a temperatura de refrigerador durante 20 minutos. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 30 segundos para sedimentar el adyuvante. El valor de la concentración de la proteína restante en los sobrenadantes se usó para la construcción de curvas de unión. La capacidad de la proteína para unirse al Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) en presencia de excipientes se determinó mediante el mismo procedimiento. En este caso, se añadió el Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) a la solución de proteína-excipiente.
Desorción de toxoides del Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio).La desorción de las proteínas del Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se evaluó en presencia de NaCl 2 M. Los sedimentos de toxoide Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se prepararon como se ha descrito anteriormente. Los sedimentos se lavaron con tampón (pH 6,5) para eliminar la proteína presente en el sobrenadante antes de la adición de la solución de NaCl. Las soluciones de Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se agitaron en un rotador de tubos de extremo a extremo a temperatura de refrigerador durante 20 minutos. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 30 segundos para sedimentar el adyuvante. La concentración de la proteína en los sobrenadantes se usó para la construcción de isotermas de desorción.
Estabilidad de los toxoides unidos a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio).La estabilidad térmica de los toxoides unidos a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se monitorizó con DSC usando un MicroCal VP-AutoDSC (MicroCal, LLC, Northampton, MA). Los toxoides a 0,5 mg/ml se unieron a 0,4 mg/ml de Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) mediante el procedimiento descrito anteriormente. Los termogramas de los toxoides se obtuvieron de 10 a 90 °C con una velocidad de barrido de 60 °C/hora. Las muestras se equilibraron durante 15 minutos a 10 °C antes de cada barrido. Los termogramas del Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) solo se restaron de cada barrido de proteína/adyuvante antes del análisis.
Resultados y análisis
Estudios de cribado de excipientes
Para investigar la capacidad de los compuestos GRAS de prevenir/retrasar la agregación, los toxoides se incubaron solos y en presencia de excipientes en condiciones de estrés (incubación a 55 °C). La agregación de los toxoides se monitorizó en un modo de alto rendimiento monitorizando los cambios en la DO a 350 nm durante el tiempo de incubación. Los cambios de turbidez se usaron además para calcular el % de inhibición de la agregación y se resumen en la Tabla 1 para el toxoide A y la Tabla 2 para el toxoide B.
Los ensayos de agregación de alto rendimiento del toxoide A encontraron que más de la mitad de los excipientes retrasaron o previnieron los aumentos de la DO a 350 nm en el tiempo y provocaron una inhibición de la agregación del 90 % o más (Tabla 1). Entre los excipientes examinados, albúmina al 2,5 %, a-ciclodextrina al 2,5 %, tween 80 al 0,1 %, histidina 0,3 M y lisina 0,3 M condujeron a valores de DO a 350 nm instantáneamente altos, lo que sugiere que el toxoide A es insoluble en estas condiciones. La agregación del toxoide A también mejoró significativamente en presencia de otros 16 excipientes, entre los que la mezcla de arginina/glutamina 25 y 50 mM, arginina 0,3 M y prolina 0,3 M fueron especialmente potentes.
La inhibición de la agregación del toxoide B en un 90 % o más se produjo en presencia de 15 excipientes (Tabla 2). La presencia de histidina 0,3 M o citrato de sodio 0,2 M produjo valores de DO a 350 nm instantáneamente altos. Otros 20 compuestos indujeron la agregación de forma más gradual durante el tiempo monitorizado. Se observaron aumentos extremadamente altos de la DO a 350 nm en presencia de cloruro de calcio 0,015 M, ácido ascórbico 0,15 M y arginina 0,3 M.
En muchos casos, la agregación de ambos toxoides se facilitó por los mismos excipientes (Tablas 1 y 2). Por el contrario, 2-OH propil y-CD al 5%, tween 20 al 0,01 % y al 0,1 %, ácido aspártico 0,15 M y de guanidina 0,3 M facilitaron la agregación del toxoide B solo. Además, la agregación en presencia de cloruro de calcio 0,015 M fue mucho mayor para el toxoide B que para el toxoide A. Esto puede estar relacionado con la conocida mayor estabilidad térmica del dominio en el extremo C de la toxina A en presencia de cloruro de calcio (Demarestet al.,Journal of Molecular Biology 346(5): 1197-1206, 2005). Las diferencias entre los toxoides en sus respuestas a la agregación inducida por solutos están presumiblemente relacionadas con diferencias estructurales entre las toxinas correspondientes (Warnyet al.,Lancet 366(9491): 1079-1084, 2005; Justet al.,Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 152:23-47, 2005). Una ausencia de inositolfosfatos entre los compuestos estudiados sugiere que la agregación observada de los toxoides no implica escisión autocatalítica (Reinekeet al.,Nature (Londres, Reino Unido) 446(7134):415-419, 2007). La mayoría de los hidratos de carbono, detergentes y ciclodextrinas examinados inhibieron la agregación de los toxoides. Se encontró que los siguientes excipientes inhiben eficazmente la agregación de ambos toxoides: trehalosa al 20 %, sacarosa al 20 %, sorbitol al 10 %, dextrosa al 10 % y glicerol al 20 %.
Los hidratos de carbono, sorbitol, glicerol y dos tensioactivos (0,05 %/Tween 80 al 0,1 % y pluronic F-68 al 0,1 %) mencionados anteriormente se estudiaron más a fondo para determinar su capacidad para estabilizar la estructura secundaria y terciaria de las proteínas a pH 6,5 monitorizando la fluorescencia del ANS, los cambios de la señal de CD tras el calentamiento y la DSC (figuras 1 y 2). El toxoide A en presencia de sacarosa al 20 % y trehalosa al 20 % produjo un inicio más temprano del cambio de estructura secundaria, mientras que el resto de los excipientes retrasaron la transición térmica en ~2 °C (figura 1a). Sorprendentemente, el toxoide B manifestó un inicio más temprano del cambio de estructura secundaria solo en presencia de sacarosa al 20 %, mientras que el resto de los excipientes retrasaron la transición térmica en ~1 °C (figura 2a). El inicio temprano del cambio de estructura secundaria de los toxoides en presencia de trehalosa y/o sacarosa podría explicarse por la estabilización del uno o más estados parcialmente desplegados por los solutos. Además, no se puede descartar la posibilidad de que los toxoides se desplieguen parcialmente al unirse a sus repeticiones de secuencia de reconocimiento de hidratos de carbono en el extremo C por los polisacáridos (Grecoet al.,Nature Structural & Molecular Biology 3(5):460-461, 2006). En el caso de la desestabilización estructural por el segundo mecanismo, la disimilitud del comportamiento de los dos toxoides en presencia de trehalosa podría estar relacionada con diferencias estructurales entre los toxoides (el dominio del extremo C posee 30 repeticiones en el toxoide A y 19 repeticiones en el toxoide B; Justet al.,Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 152:23-47, 2005). Es interesante apreciar que el monosacárido (dextrosa) tuvo un efecto estabilizante en la estructura secundaria de ambos toxoides. El despliegue inducido por la temperatura de ambos toxoides y la unión asociada de ANS no se vieron influenciados por la presencia de los compuestos (figura 1b, 2b). El efecto de los detergentes en el despliegue inducido por la temperatura de los toxoides se monitorizó con DSC y no pareció ser significativo (figura 1c, 2c y Tabla 3). Estas observaciones sugieren que los excipientes no estabilizan fuertemente la estructura de los toxoides mediante el mecanismo de exclusión preferencial ya descrito, sino que inhiben su agregación mediante otros mecanismos, tal como el bloqueo directo de las interacciones proteína/proteína que son responsables de la asociación de proteínas (Timasheff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(15):9721-9726, 2002; Timasheff, Advances in Protein Chemistry 51 (Linkage Thermodynamics of Macromolecular Interactions):355-432, 1998).
Para estudiar el efecto de una combinación de los agentes más activos sobre la estructura secundaria, los resultados de una mezcla de sorbitol, dextrosa y Tween 80 se caracterizaron mediante la monitorización de las transiciones térmicas de los toxoides con CD y agregación con DO a 350 nm (figuras 3 y 4). El calentamiento de soluciones de Tween 80 (0,05%o 0,1 %) solo o en presencia de sorbitol y/o dextrosa condujo a cambios en su estructura micelar, que se manifestaron por una disminución en la señal de CD y un aumento de la dispersión de la luz monitorizada por Do a 350 nm (figura 5). La concentración de los excipientes tuvo un efecto aproximadamente lineal sobre la temperatura de las transiciones térmicas (figura 6). Esto apoya la hipótesis de que los excipientes previenen la agregación al inhibir directamente la asociación de proteínas. Los efectos de los excipientes sobre la transición térmica se resumen en las Tablas 4 y 5. La combinación de dextrosa al 10 % y sorbitol al 10 % en presencia o ausencia de Tween 80 al 0,05 % tiende a retrasar el punto medio de la transición térmica de ambos toxoides en la mayor medida (~4 °C para el toxoide A y ~10 °C para el toxoide B) (figura 3). Esto puede explicarse por un efecto sinérgico y/o la mayor concentración total de los compuestos estabilizantes. En el caso del toxoide B, la temperatura de inicio de la transición no se retrasó en presencia de la combinación de agentes, pero el punto medio de la transición térmica se retrasó significativamente. Esto podría estar relacionado con un despliegue más gradual del toxoide B en presencia de los dos o más excipientes. El toxoide A manifestó un retraso significativo de la agregación (monitorizado con una DO a 350 nm) en presencia de compuestos estabilizantes (figura 4a). El diámetro hidrodinámico de los toxoides en presencia y ausencia de los excipientes también se monitorizó mediante DLS (figura 7). El toxoide A manifestó un inicio retardado del aumento del diámetro hidrodinámico observado previamente en presencia de los excipientes (figura 7a-c), mientras que se observó un efecto menor con el toxoide B (figura 7d-f). Estas observaciones sugieren que la combinación particular de posibles excipientes de vacunas ensayados aquí estabiliza la estructura de la proteína mediante un mecanismo de hidratación preferencial y una inhibición directa de la asociación de proteínas. El uso de dichos compuestos estabilizantes podría aumentar potencialmente la estabilidad física de los toxoides durante el almacenamiento.
Estudios de agitación
Se estudió el efecto de la agitación sobre la estabilidad física de los toxoides mediante la monitorización de la adsorción de proteínas a las paredes de los viales de almacenamiento, la formación de agregados insolubles y los cambios en la estabilidad térmica de las proteínas. Un cambio insignificante en la concentración de proteína, la DO a 350 nm y en las fusiones de CD en presencia y ausencia de los excipientes indicó que los toxoides no experimentan cambios físicos importantes tras la aplicación de este estrés basado en agitación.
Estudios de adyuvantes
Las isotermas de unión a adyuvante revelaron que los toxoides se unen de manera eficiente a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) a bajas concentraciones, con unión saturada a una concentración de proteína más alta (figura 8a). Los toxoides a razón de 0,5 mg/ml se unen en un 95 % o más a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio), lo que permite el uso de DSC para monitorizar directamente la estabilidad de la proteína en la superficie del adyuvante. La ausencia de desorción de toxoides tras la adición de NaCl 2 M indica que la interacción de los toxoides con Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) no es únicamente electrostática, como se observa a menudo en las interacciones de proteína/hidróxido de aluminio (figura 8b; Guptaet al.,Pharmaceutical Biotechnology 6:229-248, 1995; Seeberet al.,Vaccine 9(3):201-203, 1991; Whiteet al.,Developments in Biologicals (Basel, Suiza) 103(Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines):217-228, 2000).
Al unirse a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio), el toxoide A no manifiesta ningún cambio detectable en su estabilidad térmica, mientras que el toxoide B unido al adyuvante demuestra una disminución de la Tm de aproximadamente 1,4 °C. La fracción de toxoide unido a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) se reduce un poco en presencia de la mayoría de los excipientes (Tablas 6 y 7). Esto sugiere que los excipientes interfieren parcialmente con la unión del toxoide a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio), tal vez por interacción directa con la proteína y/o el adyuvante. La estabilidad térmica de las proteínas unidas a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) en presencia y ausencia de los excipientes se resume en la Tabla 6 para el toxoide A y la Tabla 7 para el toxoide B. La presencia de los excipientes perturbó la estabilidad térmica de los toxoides unidos a adyuvante, ya sea disminuyendo o aumentando la temperatura de transición. Se observó una disminución de la estabilidad térmica en ambos toxoides en presencia de sorbitol al 10 %, mientras que la presencia de sorbitol al 10 % y dextrosa al 10 % disminuye la estabilidad térmica del toxoide B solo. Además, Tween 80 tuvo un efecto estabilizante solo en el caso del toxoide B unido al adyuvante. Por otro lado, la dextrosa (10 %) tuvo un efecto estabilizante en la estabilidad térmica de ambos toxoides. Curiosamente, la combinación de los tres excipientes (sorbitol al 10%, dextrosa al 10%, con Tween 80 al 0,05 % o al 0,1 %) tiende a aumentar la transición térmica de ambos toxoides unidos a adyuvante en 3 4 °C.
Conclusiones
Un enfoque sistemático para el cribado de estabilizantes dio como resultado la identificación de excipientes que mejoraron la estabilidad térmica de los toxoides A y B deClostridium difficile.Los estudios de toxoides unidos a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) en presencia de excipientes seleccionados identificaron condiciones que produjeron una estabilidad física mejorada de las proteínas unidas al adyuvante. Este estudio también generó información sobre el comportamiento físico de los toxoides en una variedad de condiciones (temperatura, soluto) que se puede usar para diseñar formulaciones con una estabilidad de almacenamiento mejorada.
Ejemplo II
Se investigaron cambios adicionales en la formulación de la vacuna contra el toxoide deC. diffiáleen un esfuerzo por mejorar los perfiles de estabilidad e inmunogenicidad de la vacuna. Los datos preclínicos y clínicos generados con la vacuna hasta la fecha indicaron que sería importante aumentar los perfiles de estabilidad e inmunogenicidad para respaldar futuros estudios clínicos.
PH
La determinación de un pH que produjera la máxima estabilidad formó parte del esfuerzo de mejora de la formulación. Los estudios se realizaron en muestras líquidas mantenidas a -65 °C, 5 °C, 25 °C y 37 °C durante hasta 28 días con un pH que variaba entre 5,5-7,5. Se emplearon los siguientes métodos para establecer el perfil de estabilidad:
1. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD) (cambios en la estructura secundaria),
2. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD) (cambios en la temperatura de fusión, Tf), y
3. Espectrofotometría (DO350 nm) y SEC-HPLC (formación de agregados).
No se observaron cambios en la estructura secundaria en el espectro de CD para el toxoide A por encima de pH 6,0 ni para el toxoide B en todo el intervalo de pH ensayado (figura 9 y figura 10; Salnikovaet al.,J. Pharm. Sci. 97(9):3735-3752, 2008). Los datos del punto de fusión adquiridos a partir de las mediciones de CD revelaron que la estabilidad máxima de ambos toxoides se da a un pH superior a 7,0 (figura 11 y figura 12).
Los estados de agregación de los toxoides A y B en un intervalo de pH de 6-7,5 variaron poco en el intervalo de < 60 °C, cuando se analizaron por SEC-HPLC para la formación de agregados (% de monómero) y el % de recuperación de área. Sin embargo, las diferencias en los estados de agregación se hicieron más evidentes en todo el intervalo de pH cuando las temperaturas eran elevadas (particularmente superiores a 5 °C), y los valores de pH más bajos tendían hacia mayores cambios en los niveles de agregación. Esto va acompañado de un aumento de la densidad óptica a 350 nm a valores de pH más bajos, como se describe en Salnikovaet al.,J. Pharm. Sci. 97(9):3735-3752, 2008.
Cuando se evaluó la agregación a diferentes valores de pH en el tiempo a una temperatura de almacenamiento fija (<-60 °C) (figura 13), los resultados indicaron de nuevo que los estados de agregación eran muy estables a temperaturas ultrabajas, con una sugerencia de que la agregación se promovía a niveles de pH más bajos (< pH 7,0). Teniendo en cuenta estos datos, el pH nominal para el almacenamiento de la vacuna a granel se estableció en 7,5.
Fuerza iónica
La determinación de la fuerza iónica que produce la máxima estabilidad también formó parte del esfuerzo de mejora de la formulación. Los estudios se realizaron en muestras líquidas mantenidas a -65 °C, 5 °C, 25 °C y 37 °C durante hasta 28 días en un tampón de citrato de sodio 20 mM, pH 7,25, con concentraciones variables (0-300 mM) de cloruro de sodio. También se ensayó la sustitución de NaCl por sacarosa al 5 %. Los métodos empleados para establecer el perfil de estabilidad fueron Se C-HPLC, SDS-PAGE y el aspecto visual.
No se observó ninguna diferencia clara mediante SDS-PAGE ni mediante el aspecto visible. El análisis por SEC-HPLC mostró claramente la agregación del toxoide B a concentraciones de sal más altas. La agregación del toxoide A pareció depender del tiempo y la temperatura, y el único efecto notable se observó con NaCl 50 mM. Los datos indican que se debe añadir cloruro de sodio 0-50 mM o sacarosa al 5 % para lograr la máxima estabilidad de los toxoides (figura 14 y figura 15).
Cambio de tampón y adición de excipientes
Se realizó un estudio preliminar para evaluar el efecto del tampón y del excipiente en la estabilidad de los toxoides. Los datos procedentes del análisis por HPLC-SEC demostraron que el tampón de citrato de sodio con sorbitol como excipiente proporcionó la mayor estabilidad, según lo determinado por el porcentaje de recuperación de los toxoides en el tiempo, como se muestra en la Tabla 8 y en la Tabla 9.
Evaluación de preparaciones liofilizadas
Para seleccionar una formulación liofilizada que fuera estable para los ensayos clínicos de fase II, se empleó un ensayo de inmunogenicidad en hámster, porque es el ensayo preclínico que demuestra la mayor sensibilidad a los cambios del producto que se relacionan con la inmunogenicidad clínica. Los datos de los estudios preliminares condujeron a un estudio de cribado de excipientes basado en citrato de sodio como tampón y sorbitol como excipiente estabilizante. Se introdujo sacarosa como excipiente estabilizante en reemplazo del sorbitol en las formulaciones liofilizadas debido a las bajas Tg' y los largos tiempos de liofilización observados en las formulaciones de sorbitol. También se realizó un segundo estudio de cribado de liofilización/excipiente usando tampón de fosfato de potasio y trehalosa basándose en datos de un estudio paralelo. A partir de estos estudios y de los datos de los experimentos anteriores, surgieron tres formulaciones principales, una líquida y dos liofilizadas.
Se prepararon formulaciones liofilizadas y se evaluó su estabilidad en condiciones aceleradas y en tiempo real. Los toxoides A y B se almacenaron por separado para estudiar más de cerca sus perfiles de estabilidad individuales. A continuación se presentan los datos de aspecto y de inmunogenicidad en hámster de una formulación (liofilizada, citrato 20 mM, sacarosa al 5 %, formaldehído al 0,016 %, pH 7,5) después del almacenamiento a -65, 5 o 42 °C durante tres meses. Se observa una ligera o nula diferencia en el aspecto entre las formulaciones al inicio del estudio y después del almacenamiento a -65, 5 o 42 °C durante 3 meses (Tabla 10 y Tabla 11). Además, la respuesta inmunitaria del hámster no es significativamente diferente entre las formulaciones almacenadas a 5 °C y 42 °C durante 7 meses, o entre las mismas formulaciones con y sin formaldehído. El almacenamiento a 42 °C es una condición de alto estrés y, debido a que no se observan cambios durante el almacenamiento, los resultados implican que la formulación probablemente será estable durante mucho más tiempo a temperaturas más bajas. Sin embargo, un análisis estadísticamente sólido de los datos destinados a estimar la semivida requiere que se observe algún cambio cuantificable de modo que se pueda calcular una tasa. Como no se ha observado ningún cambio hasta la fecha, no se puede calcular una tasa real. A la luz de estos datos, se planea usar una formulación de producto farmacológico liofilizado que consiste en toxoides A y B deC. difficileen citrato 20 mM, sacarosa al 5 %, formaldehído al 0,016 %, pH 7,5, almacenado a 2-8 °C.
Las formulaciones usadas en los estudios de estabilidad detallados en este informe se prepararon usando el ciclo de liofilización resumido en la Tabla 12. Este ciclo produjo tortas sólidas, de color blanco y elegantes, pero estaba al borde de completar el secado primario, según lo determinado por la lectura de vacío de Pirani que disminuye hasta igualar la lectura de vacío manométrico (figura 16). Se realizaron los siguientes cambios críticos en el ciclo de liofilización para abordar esta preocupación y crear un proceso más escalable:
1. La temperatura de almacenamiento se redujo a -35 °C para garantizar que la sustancia farmacológica permaneciera congelada durante el secado primario a mayor escala,
2. El secado primario se extendió a 4000 minutos para garantizar la finalización del secado primario a mayor escala, y
3. El vacío se aumentó a 100 mT para acelerar el secado y permitir un proceso más escalable.
El ciclo de liofilización transferido a Althea Technologies, Inc. para el procesamiento de lotes clínicos GMP se describe en la Tabla 13.
Resumen de propiedades fisicoquímicas y biológicas
A continuación se resumen las propiedades fisicoquímicas y biológicas clave de la vacuna determinadas experimentalmente.
Químicamente, la vacuna está compuesta por formas inactivadas (toxoides) de las toxinas A y B deC. difficilepresentes en una relación de 3:2, respectivamente. Las toxinas A y B deC. difficileson proteínas grandes, 308 kDa y 270 kDa, respectivamente, que son similares pero distintas en estructura.
Físicamente, la vacuna se presenta como una solución de >90 % de pureza sin evidencia de agregación medible.
Bioquímicamente, los toxoides A y B de la vacuna son inmunológicamente reactivos a sus respectivos anticuerpos específicos de toxina A o B en un análisis de transferencia de Western.
Biológicamente, la vacuna es inmunogénica en hámsteres, provocando respuestas de anticuerpos séricos consistentes y dependientes de la dosis. Los toxoides A y B de la vacuna carecen de actividad citotóxica. El componente del toxoide A de la vacuna conserva cierta actividad de unión al receptor, como la observada para la toxina A natural.
La vacuna se presenta como una forma liofilizada en un tampón compuesto por citrato de sodio 20 mM, pH 7,5, sacarosa al 5 %, formaldehído al 0,016 %. El producto se almacena a 2-8 °C.
Estudios de cribado de liofilización
Para cribar formulaciones liofilizadas, se empleó una inmunogenicidad en hámster para la evaluación. La liofilización se realizó en un FTS LyoStar II. La congelación se logró reduciendo la temperatura de almacenamiento lo suficiente como para forzar la temperatura del producto por debajo de la Tg'. El secado primario comenzó haciendo vacío y manteniéndolo hasta que se hubiera sublimado el agua libre. A continuación, la temperatura de almacenamiento se aumentó para comenzar el secado secundario y se mantuvo para secar aún más el producto eliminando el agua adsorbida. Las formulaciones se sometieron a condiciones de estabilidad a temperaturas de 5, 25 y 42 °C.
Tabla 1.Efecto de los excipientes GRAS sobre la agregación del toxoide A. Los compuestos que retrasan/previenen la agregación tienen un % positivo de valores de inhibición de la agregación; los compuestos que inducen la agregación tienen un % negativo de valores de inhibición de la agregación.
Excipiente, Concentración<% de inhibición de la>xcipiente, Concentración % de inhibición deagregaciónE
la agregación Albúmina al 2,5 % 103* Glicerol al 10 % 88 a Ciclodextrina al 2,5 % 101* 2-OH propil<y>-CD al 10 % 81 Tween 80-0,1 % 100* Tween 20-0,05 % 73 Dietanolamina 0,3 M 100 Tween 80-0,05 % 67 Citrato de sodio 0,1 M 100 Ácido aspártico 0,15 M 65 Sorbitol al 10 % 100 Tween 20-0,1 % 64 Histidina 0,3 M 100* Pluronic F-68 al 0,05 % 50 Sacarosa al 10 % 100 Tween 20-0,01 % 37 Trehalosa al 10 % 100 Sulfato de dextrano, 0,04 mg/ml 30 Guanidina 0,3 M 99 Brij 35 al 0,05 % 26 Sorbitol al 20 % 99 Sulfato de dextrano, 0,004 mg/ml 16 Dextrosa al 20 % 99 2-OH propil<y>-CD al 5 % 10 Dextrosa al 10 % 99 Albúmina al 5 % 9 Trehalosa al 20 % 99 Brij 35 al 0,01 % -2 Citrato de sodio 0,2 M 99 Cloruro de calcio 0,015 M -7 Glicerol al 20 % 98 Pluronic F-68 al 0,01 % -14 Tween 80-0,01 % 98 Gelatina al 5 % -46 Albúmina al 1 % 98 Ácido málico 0,15 M -52 Lactosa al 20 % 98 Ácido láctico 0,15 M -72 Manitol al 10% 97 Gelatina al 2,5 % -74 Sacarosa al 20 % 97 Ácido glutámico 0,15 M -77 Pluronic F-68 al 0,1 % 96 Dextrano, T40, 0,003 mg/ml -87 2-OH propil p-CD al 10 % 96 Glicina 0,3 M -88 2-OH propil p-CD al 5 % 96 Sulfato de dextrano, 0,1 mg/ml -88 Dextrano, T4O, 0,08 mg/ml 95 Ácido ascórbico 0,15 M -99 Brij 35 al 0,1 % 95 Prolina 0,3 M -112 Dextrano, T40, 0,03 mg/ml 93 Arginina 0,3 M -265 Lactosa al 10 % 92 Arg/Glu 50 mM cada uno -426 Lisina 0,3 M 89* Arg/Glu 25 mM cada uno -463
Las incertidumbres son del orden de ±1 %. *DO a 350 nm inicial alta.
Tabla 2.Efecto de los excipientes GRAS sobre la agregación del toxoide B. Los compuestos que retrasan/previenen la agregación tienen un % positivo de valores de inhibición de la agregación; los compuestos que inducen la agregación tienen un % negativo de valores de inhibición de la agregación.______________________________________________ Excipiente, Concentración<% de inhibición de la>
agregaciónExcipiente, Concentración % de inhibición de la agregación a Ciclodextrina al 2,5 % 100 Dextrano, T40, 0,03 mg/ml 35 Histidina 0,3 M 100* Dextrano, T40, 0,08 mg/ml 25 Tween 80-0,1 % 100 2-OH propil<y>-CD al 10 % 12 Tween 80-0,05 % 100 Brij 35 al 0,05 % 10 Albúmina al 1 % 99 Pluronic F-68 al 0,05 % 6 Dextrosa al 20 % 99 Glicerol al 10 % 4 Albúmina al 5 % 98 Sulfato de dextrano, 0,04 mg/ml 3
Citrato de sodio 0,2 M 98*<Sulfato de dextrano,>
0,004 mg/ml2 (continuación)
Excipiente, Concentración<% de inhibición de la>
agregaciónExcipiente, Concentración % de inhibición de la agregación Trehalosa al 20 % 98 Tween 20-0,05 % 0 Citrato de sodio 0,1 M 97 2-OH propil<y>-CD al 5 % -5 Sorbitol al 20 % 97 Tween 20-0,01 % -5 Sacarosa al 20 % 96 Pluronic F-68 al 0,01 % -8 Dietanolamina 0,3 M 96 Tween 20-0,1 % -13 Dextrosa al 10 % 95 Brij 35 al 0,01 % -25 Sorbitol al 10 % 92 Glicina 0,3 M -26 Albúmina al 2,5 % 87 Gelatina al 2,5 % -36
2-OH propil p-CD al 5 % 79 Sulfato de dextrano, 0,1 mg/ml -38
2-OH propil p-CD al 10 % 78 Arg/Glu 50 mM cada uno -39 Manitol al 10% 76 Ácido glutámico 0,15 M -41 Sacarosa al 10 % 71 Arg/Glu 25 mM cada uno -42 Glicerol al 20 % 71 Ácido aspártico 0,15 M -50 Trehalosa al 10 % 69 Gelatina al 5 % -56 Pluronic F-68 al 0,1 % 68 Prolina 0,3 M -57 Brij 35 al 0,1 % 63 Dextrano, T40, 0,003 mg/ml -59 Lactosa al 20 % 52 Ácido láctico 0,15 M -80 Ácido málico 0,15 M 44 Guanidina 0,3 M -96 Tween 80-0,01 % 40 Cloruro de calcio 0,015 M -141 Lactosa al 10 % 39 Ácido ascórbico 0,15 M -223 Lisina 0,3 M 37 Arginina 0,3 M -280
Las incertidumbres son del orden de ±1 %. *DO a 350 inicial alta nm.
Tabla 3.Efecto de los solutos (detergentes) sobre la estabilidad térmica del toxoide A y B. La estabilidad térmica (Tm) se controló mediante DSC. La Tm es la temperatura correspondiente a la posición máxima del pico de la transición térmica.
Tabla 4.Efecto de los excipientes en el punto medio de la temperatura de transición térmica (Tm) del toxoide A. La transición térmica se monitorizó mediante la señal de CD a 208 nm en función de la temperatura. Cada medición se r liz r li i n n in r i m r ~ ° .
continuación
Tabla 5.Efecto de los excipientes en el punto medio de la temperatura de transición térmica (Tm) del toxoide B. La transición térmica se monitorizó mediante la señal de CD a 208 nm en función de la temperatura. Cada medición se r liz r li i n n in ri m r ~ ° .
continuación
Tabla 6.Estabilidad térmica del toxoide A unido a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) en presencia y ausencia de uno o más excipientes (a menos que se especifique lo contrario). La estabilidad térmica (Tm) se monitorizó mediante DSC, donde la Tm indica la temperatura correspondiente a la posición del pico de la transición térmica. El porcentaje de toxoide unido al adyuvante se midió en cada condición con una incertidumbre del 1 %. Cada condición i r li .
Tabla 7.La estabilidad térmica del toxoide B unido a Alhydrogel® (adyuvante de hidróxido de aluminio) en presencia y ausencia de uno o más solutos (a menos que se especifique lo contrario). La estabilidad térmica (Tm) se monitorizó mediante DSC. La Tm indica la temperatura correspondiente a la posición del pico de la transición térmica. El porcentaje de proteína unida al adyuvante se midió en cada condición con una incertidumbre del 1 %. Cada condición
Tabla 8
Toxoide A
Estabilidad de 2 meses
% de recuperación de toxoides
Tabla 9
Toxoide B
Estabilidad de 2 meses
% de recuperación de toxoides
Tabla 10. As ecto de una formulación liofilizada des ués del almacenamiento a diferentes tem eraturas
Tabla 11. Inmunogenicidad de una formulación liofilizada después del almacenamiento a diferentes temperaturas (valores de IgG anti toxina A y B en suero en hámsteres).
H<2>CO = formaldehído
Tabla 12.
Tabla 13.
El uso de formas en singular en el presente documento, tales como "un/uno/una" y "el/la", no excluye la indicación de la forma en plural correspondiente, a menos que el contexto indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, si una reivindicación indica el uso de "una" toxina, toxoide o excipiente, también puede interpretarse que incluye el uso de más de una toxina, toxoide o excipiente, a menos que se indique lo contrario. Dentro de las siguientes reivindicaciones se encuentran otras realizaciones.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un toxoide deClostridium diffiáley un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende
un azúcar o alcohol de azúcar seleccionado de sorbitol, trehalosa y sacarosa, en una concentración del 10-20 %. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho excipiente farmacéuticamente aceptable reduce o retrasa la agregación del toxoide en un 50 % o más, en relación con una composición que carece de dicho excipiente farmacéuticamente aceptable.
3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde la composición comprende un toxoide de las toxinas A y B deC. difficile.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición es una composición farmacéutica.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un adyuvante, en donde, opcionalmente, el adyuvante es un compuesto de aluminio, preferentemente un compuesto de hidróxido de aluminio.
6. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método para prevenir o tratar una infección o enfermedad porC. difficileen un sujeto.
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