ES3002183T3 - A composition comprising s-arrestin peptides - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende péptidos derivados de S-Arrestina (arrestina retiniana, antígeno S, S-Ag). La composición o los péptidos pueden ser útiles en la prevención y/o supresión de la autoinmunidad S-Ag, lo que resulta útil en el tratamiento y/o prevención de la uveítis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Una composición que comprende péptidos de S-arrestina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende péptidos derivados de S-arrestina (arrestina retiniana, antígeno S, S-Ag). La composición o los péptidos pueden ser útiles en la prevención y/o la supresión de la autoinmunidad frente a S-Ag, lo que es útil en el tratamiento y/o la prevención de la uveítis.

Antecedentes de la invención

La uveítis describe un grupo de enfermedades asociadas con inflamación de la úvea. La úvea es una región del ojo situada entre la esclerótica y la retina, e incluye el iris, el cuerpo ciliar y la coroides. La úvea proporciona el principal suministro de sangre a la retina. Las enfermedades asociadas no se limitan a aquellas que afectan directamente a la úvea, y las estructuras adyacentes tales como la retina, el nervio óptico, el cristalino, el vítreo y la esclerótica pueden verse afectadas en manifestaciones de la uveítis.

Todas las formas de uveítis se caracterizan por un infiltrado celular inflamatorio, normalmente visualizado mediante un biomicroscopio. En 2010, se estimó que 285 millones de personas tenían una discapacidad visual; de estas, 39 millones eran ciegas y se estimó que el 10 % de los casos se debían a uveítis.(Global data on visual impairments, The World Health Report,OMS (2010) http://www.who.int/blindness/GLOBALDATAFINALforweb.pdf).

Los tratamientos actuales para la uveítis incluyen el uso de esteroides glucocorticoides y otros agentes inmunosupresores tales como metotrexato.

Sin embargo, en la técnica existe la necesidad de tratamientos alternativos para la uveítis. La presente invención aborda esta necesidad.

El documento WO 2018/127830 A1 describe péptidos de S-arrestina y usos terapéuticos de los mismos.

Compendio de aspectos de la invención

Los presentes inventores han descubierto que un "cóctel" de tres péptidos de S-Ag es particularmente eficaz en la supresión o prevención de la activación de células T específicas para S-Agex vivo.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende péptidos de S-Ag, en donde los péptidos de S-Ag consisten en los siguientes péptidos de S-Ag:

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKAFVEQVANWLKKK (SEQ ID NO: 1);

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK (SEQ ID NO: 2); y/o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK (SEQ ID NO: 3).

KKKAFVEQVANWLKKK (SEQ ID NO: 1) también se denomina 9K1K en el presente documento. KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK (SEQ ID NO: 2) también se denomina 17JK en el presente documento. KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK (SEQ ID NO: 3) también se denomina 15N3K en el presente documento.

La composición según la invención puede usarse en los aspectos terapéuticos de la invención descritos en el presente documento.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona la composición de la invención como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la uveítis en un sujeto.

Una composición peptídica según la invención comprende las secuencias de aminoácidos según la invención que se describen en el presente documento. En un aspecto, la composición peptídica comprende solo las secuencias de aminoácidos según la invención que se describen en el presente documento.

El sujeto puede expresar HLA-DR3. El sujeto puede expresar HLA-DR2.

La composición de la invención puede administrarse siguiendo un protocolo de dosis crecientes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende los siguientes péptidos de S-Ag:

la secuencia de aminoácidos KKKAFVEQVANWLKKK (SEQ ID NO 1);

la secuencia de aminoácidos KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK (SEQ ID NO: 2); y

la secuencia de aminoácidos KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK (SEQ ID NO 3);

que son adecuados para su administración simultánea, separada o secuencial en la prevención o el tratamiento de la uveítis.

Descripción de las figuras

Figura 1: El péptido 9K1K se carga correctamente en el MHC de clase IIin vivo.Se muestra la respuesta de las células T CD4+ específicas para el péptido hacia el péptido cargadoin vivoen células dendríticas. Se inyectaron 100 pg del péptido 9K1K por vía subcutánea en ratones transgénicos para HLA-DR2. 2 horas después de la inyección se diseccionaron los bazos y se aislaron células CD11c+ (células dendríticas). Estas células CD11c+ se cocultivaron con células CD4+ específicas para el péptido durante 72 h a 37 °C. Para evaluar la respuesta al péptido de las células T CD4+, se midió el IFN<y>en el sobrenadante de estos cultivos. (* p < 0,05, prueba U de Mann-Whitney)

Figura 2: El péptido 17JK se carga correctamente en el MHC de clase IIin vivo.Se muestra la respuesta de las células T CD4+ específicas para el péptido hacia el péptido cargadoin vivoen células dendríticas. Se inyectaron 100 pg del péptido 17JK por vía subcutánea en ratones transgénicos para HLA-DR3. 2 horas después de la inyección, se diseccionaron los bazos y se aislaron células CD11c+ (células dendríticas). Estas células CD11c+ se cocultivaron con células CD4+ específicas para el péptido durante 72 h a 37 °C. Para evaluar la respuesta al péptido de las células T CD4+, se midió el IFN<y>en el sobrenadante de estos cultivos. (*** p < 0,001, prueba U de Mann-Whitney)

Figura 3: El péptido 15N3K se carga correctamente en el MHC de clase IIin vivo.Se muestra la respuesta de las células T CD4+ específicas para el péptido hacia el péptido cargadoin vivoen células dendríticas. Se inyectaron 100 pg del péptido 15N3K por vía subcutánea en ratones transgénicos para HLA-DR3. 2 horas después de la inyección, se diseccionaron los bazos y se aislaron células CD11c+ (células dendríticas). Estas células CD11c+ se cocultivaron con células CD4+ específicas para el péptido durante 72 h a 37 °C. Para evaluar la respuesta al péptido de las células T CD4+, se midió el IFNy en el sobrenadante de estos cultivos. (*** p < 0,001, prueba U de Mann-Whitney)

Figura 4: 9K1K en solitario induce tolerancia hacia la proteína S-Ag en ratones DR2tg. Se inyectaron 0,1 pg/ml, 1 pg/ml y 10 pg/ml de 9K1K por vía subcutánea en el flanco de los ratones los días -15, -13 y -11, a lo que siguieron 3 inyecciones de 100 pg/ml los días -8, -6 y -4 (régimen de dosis crecientes). El día 0, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con el antígeno/CFA. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la inmunización para medir la activación de las células de GL y los esplenocitos tras la reestimulación con S-Ag. Como indicación de la activación de las células, se midió la concentración de IFNy en el sobrenadante del cultivo. Los datos representan la media ± EEM de la concentración de IFN<y>para los ratones tratados con PBS (líneas negras) y los ratones tratados con 9K1K (líneas grises). Se usó ANOVA de dos vías para medir los efectos globales del tratamiento sobre la activación de las células T. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y las diferencias significativas se indican en los gráficos (** p < 0,01; **** p < 0,0001). En los gráficos se indica el % de inhibición de la producción de IFNy en comparación con el grupo de control. (A) Tolerización contra S-Ag en GL. Producción de IFNy expresada como concentración de IFNy (pg/ml). (B) Tolerización contra S-Ag en el bazo. Producción de IFN<y>expresada como concentración de IFN<y>(pg/ml). GL, ganglios linfáticos. Datos representativos de 3 experimentos independientes.

Figura 5: 17JK en solitario induce tolerancia hacia la proteína S-Ag en ratones DR3tg. Se inyectaron 0,1 pg/ml, 1 pg/ml y 10 pg/ml de 17JK por vía subcutánea en el flanco de los ratones los días -15, -13 y -11, a lo que siguieron 3 inyecciones de 100 pg/ml los días -8, -6 y -4 (régimen de dosis crecientes). El día 0, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con el antígeno/CFA. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la inmunización para medir la activación de las células de GL y los esplenocitos tras la reestimulación con S-Ag. Como indicación de la activación de las células, se midió la concentración de IFNy en el sobrenadante del cultivo. Los datos representan la media ± EEM de la concentración de IFNy para los ratones tratados con PBS (líneas negras) y los ratones tratados con 17JK (líneas grises). Se usó ANOVA de dos vías para medir los efectos globales del tratamiento sobre la activación de las células T. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y las diferencias significativas se indican en los gráficos (** p < 0,01; *** p < 0,001). En los gráficos se indica el % de inhibición de la producción de IFN<y>en comparación con el grupo de control. (A) Tolerización contra S-Ag en GL. Producción de IFN<y>expresada como concentración de IFN<y>(pg/ml). (B) Tolerización contra S-Ag en el bazo. Producción de IFNy expresada como concentración de IFNy (pg/ml). GL, ganglios linfáticos. Datos representativos de 3 experimentos independientes.

Figura 6: 15N3K en solitario induce tolerancia hacia la proteína S-Ag en ratones DR3tg. Se inyectaron 0,1 pg/ml, 1 pg/ml y 10 pg/ml de 15N3K por vía subcutánea en el flanco de los ratones los días -15, -13 y -11, a lo que siguieron de 3 inyecciones de 100 pg/ml los días -8, -6 y -4 (régimen de dosis crecientes). El día 0, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con el antígeno/CFA. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la inmunización para medir la activación de las células de GL y los esplenocitos tras la reestimulación con S-Ag. Como indicación de la activación de las células, se midió la concentración de IFNy en el sobrenadante del cultivo . Los datos representan la media ± EEM de la concentración de IFNy para los ratones tratados con PBS (líneas negras) y los ratones tratados con 15N3K (líneas grises). Se usó ANOVA de dos vías para medir los efectos globales del tratamiento sobre la activación de las células T. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y las diferencias significativas se indican en los gráficos (* p < 0,05; **** p < 0,0001). En los gráficos se indica el % de inhibición de la producción de IFN<y>en comparación con el grupo de control. (A) Tolerización contra S-Ag en GL. Producción de IFNy expresada como concentración de IFNy (pg/ml). (B) Tolerización contra S-Ag en el bazo. Producción de IFNy expresada como concentración de IFNy (pg/ml). GL, ganglios linfáticos. Datos representativos de 3 experimentos independientes.

Figura 7: El tratamiento con el cóctel de péptidos ATX975 reduce la activación de las células inmunitarias inducida por S-Ag en ratones DR3tg más eficazmente que el tratamiento con 17JK o 15N3K en solitario. Se inyectaron 0,015 nmol, 0,15 nmol y 1,5 nmol de péptido por vía subcutánea en el flanco de los ratones los días -15, -13 y -11 respectivamente, a lo que siguieron 3 inyecciones de 15 nmol de péptido los días -8, -6 y -4 (programa de dosis crecientes). Para el tratamiento con el cóctel (ATX975) que contenía los 3 péptidos, estas dosis se administraron por péptido (para alcanzar una dosis máxima total de 45 nmol de péptido). El día 0, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con el antígeno/CFA. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la inmunización para medir la activación de los esplenocitos tras la reestimulación con S-Ag. Los datos representan la media ± EEM de la concentración de IFNy para los ratones tratados con el control (líneas negras) y los ratones tratados con los péptidos (líneas grises). Se usó ANOVA de dos vías para medir los efectos globales del tratamiento sobre la activación de las células T. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y las diferencias significativas se indican en los gráficos (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 en comparación con el grupo de control; # p < 0,05, #### p < 0,0001 en comparación con el grupo de ATX975). En los gráficos se indica el % de inhibición de la producción de IFNy en comparación con el grupo de control. (A) Tolerización contra S-Ag en el bazo. Producción de IFN-y expresada como concentración de IFNy (pg/ml). (B) Tolerización contra S-Ag en el bazo. Producción de IFN-y expresada como concentración de IFN<y>(pg/ml).

Figura 8: El tratamiento con el cóctel de péptidos ATX975 reduce la activación de las células inmunitarias inducida por S-Ag en ratones DR2tg más eficazmente que el tratamiento con 9K1K en solitario. Se inyectaron 0,015 nmol, 0,15 nmol y 1,5 nmol de péptido por vía subcutánea en el flanco de los ratones los días -15, -13 y -11 respectivamente, a lo que siguieron 3 inyecciones de 15 nmol de péptido los días -8, -6 y -4 (programa de dosis crecientes). Para el tratamiento con el cóctel (ATX975) que contenía los 3 péptidos, estas dosis se administraron por péptido (para alcanzar una dosis máxima total de 45 nmol de péptido). El día 0, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con el antígeno/CFA. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la inmunización para medir la activación de los esplenocitos tras la reestimulación con S-Ag. Los datos representan la media ± EEM de la concentración de IFNy para los ratones tratados con el control (líneas negras) y los ratones tratados con los péptidos (líneas grises). Se usó ANOVA de dos vías para medir los efectos globales del tratamiento sobre la activación de las células T. Se utilizó la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y las diferencias significativas se indican en los gráficos (* p < 0,05; ** p < 0,01). En los gráficos se indica el % de inhibición de la producción de IFNy en comparación con el grupo de control. Tolerización contra S-Ag en el bazo. Producción de IFNy expresada como concentración de IFNy (pg/ml).

Figura 9: Diversos patrones de unión péptido-MHC IIin vitropara los péptidos 9K1, 17JK y 15N3K. Se evaluó la unión de los péptidos 9K1, 17JK y 15N3K a HLA-DRA1*0101, DRB1*0101 (DR1), DRB1*1501 (DR2), DRB1*0301 (DR3), DRB1*0401 (DR4), DRB1 *1101 (DR11), DRB1*0405 (DR4*05) y DRB1*0901 (DR9) recombinantesin vitro.Se presentan los valores de CI50 (pM) y se codifican mediante colores para cada molécula de HLA-DR. Los valores bajos (verde) indican una unión fuerte, los valores altos (rojo) indican una unión (más) débil.

Figura 10: Las variantes del péptido 15N3K son apítopos. La capacidad de variantes del péptido 15N3K para comportarse como apítopos (es decir, unirse a una molécula del MHC II y ser presentados a una célula T por una célula presentadora de antígenos sin experimentar procesamiento antigénico) se analizó mediante un ensayo APIPS. Se inmunizaron ratones DR3tg con S-Ag y se generaron hibridomas. Se cultivaron 5 x 104 células de hibridoma específicas para S-Ag con 5 x 104 células APC comerciales frescas o fijadas (VAVY). Los cultivos se estimularon con 10 o 25 pg/ml del péptido, como se indica en el gráfico. La activación de las células T se midió mediante ELISA para IL-2 en sobrenadantes recogidos después de 48 horas. El gráfico representa la media de las mediciones duplicadas ± EEM.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una opción terapéutica nueva y alternativa para el tratamiento y/o la prevención de la uveítis. Como se demuestra en la presente solicitud, una combinación de péptidos con las secuencias SEQ ID NO: 1,2 y 3 induce tolerancia hacia S-Ag en un modelo de tolerancia en ratones transgénicos HLA-DR.

La presente invención queda definida por las reivindicaciones.

Como tal, el primer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende una pluralidad de péptidos de S-Ag, concretamente los péptidos de la invención que se definen en el presente documento, concretamente los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 1, 2 y 3.

S-arrestina

La S-arrestina (también conocida como arrestina retiniana, antígeno S o S-Ag) es una proteína fotorreceptora soluble expresada en la retina y la glándula pineal. Se sabe que está implicada en la desensibilización de la cascada de transducción fotoactivada y se aisló por primera vez de su unión a rodopsina activada. La estructura cristalina muestra dos dominios de láminas p antiparalelas unidas por una región bisagra, así como una hélice a corta en la parte posterior del pliegue aminoterminal.

La forma fotoactivada del pigmento visual rodopsina (Rh*) interactúa con la proteína G retiniana transducina para iniciar así el intercambio de una molécula de GDP por GTP en la subunidad a de la transducina. En su forma de unión a GTP, la transducina se disocia de Rh* y activa una fosfodiesterasa de GMP cíclico (PDE), mediante la unión a sus dos subunidades inhibidoras PDEy. El resultado es una rápida disminución en la concentración del transmisor interno GMP cíclico. Dado que la interacción entre Rh* y transducina dura sólo aproximadamente 1 ms, una única Rh* puede interaccionar posteriormente con cientos de moléculas de transducina. El número de recambio para la PDE puede ser del orden de varios miles de GMPc hidrolizados por PDE por segundo. Así pues, para una limitación de la respuesta a la luz, así como para una recuperación rápida, es esencial una eliminación rápida y eficaz de Rh*, antes de que pueda activar demasiadas moléculas de PDE. Esta inactivación de Rh* se logra en dos etapas: la fosforilación de Rh* reduce su capacidad para catalizar el intercambio de nucleótidos de la transducina y la posterior unión de la arrestina a P-Rh* la protege completamente de cualquier interacción con la transducina.

La secuencia de aminoácidos de la S-Ag humana madura se indica a continuación (SEQ ID NO: 4).

Base de datos UniProt P10523 (https://www.uniprot.org/)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

M A A S G K T S K S E P N H V I F K K I S R D K S V T I Y L G N R D Y I D H V S Q V Q P V D G W L

6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

V D P D L V K G K K V Y V T L T C A F R Y G Q E D I D V I G L T F R R D L Y F S R V Q V Y P P V G A

1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0

A S T P T K L Q E S L L K K L G S N T Y P F L L T F P D Y L P C S V M L Q P A P Q D S G K S C G V D

1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0

F E V K A F A T D S T D A E E D K I P K K S S V R L L I R K V Q H A P L E M G P Q P R A E A A W Q F

2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0

E M S D K P L H L A V S L N K E I Y F H G E P I P V T V T V T N N T E K T V K K I K A F V E Q V A N

2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0

W L Y S S D Y Y V K P V A M E E A Q E K V P P N S T L T K T L T L L P L L A N N R E R R G I A L D

3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0

G K I K H E D T N L A S S T I I K E G I D R T V L G I L V S Y Q I K V K L T V S G F L G E L T S S E

3 6 0 3 7 0 3 8 0 3 9 0 4 0 0

V A T E V P F R L M H P Q P E D P A K E S Y Q D A N L V F E E F A R H N L K D A G E A E E G K R D K

N D V D E

Uveítis

Clínicamente, la uveítis se clasifica comúnmente como una de las siguientes, en función de la parte del ojo principalmente afectada: uveítis anterior, uveítis intermedia, uveítis posterior o panuveítis.

La uveítis anterior es la forma más común de uveítis e incluye iridociclitis e iritis. La iritis es la inflamación de la cámara anterior y el iris, mientras que la iridociclitis incluye inflamación en el cuerpo ciliar.

La uveítis intermedia(pars planitis)se refiere comúnmente a vitritis, la inflamación de células en la cavidad vítrea, asociada con la deposición de material inflamatorio en la parte plana.

La uveítis posterior (corioretinitis) es la inflamación de las regiones de la retina y la coroides.

La uveítis panuveítis es un término general que se refiere a la inflamación que afecta a todas las capas de la úvea. La uveítis también puede clasificarse como infecciosa o no infecciosa, siendo más común la uveítis relacionada con enfermedades autoinmunitarias (es decir, principalmente no infecciosa) en los países desarrollados. Los modelos animales comunes usados para estudiar la uveítis también están inducidos por autoinmunidad, lo que demuestra una asociación clara entre las dos. Se predice que el 25-30 % de la uveítis está asociado con enfermedades autoinmunitarias o autoinflamatorias sistémicas.

En un aspecto de la invención, la uveítis es uveítis no infecciosa.

Tolerancia

Los epítopos de células T desempeñan un papel central en la respuesta inmunitaria adaptativa a cualquier antígeno, ya sea propio o extraño. El papel central desempeñado por los epítopos de células T en enfermedades de hipersensibilidad (que incluyen la alergia y el rechazo de trasplantes) ha sido demostrado mediante el uso de modelos experimentales. Es posible inducir enfermedades autoinmunes o alérgicas mediante la inyección de péptidos sintéticos (basados en la estructura de epítopos de células T) en combinación con un adyuvante.

Por el contrario, se ha observado que es posible inducir tolerancia inmunogénica hacia antígenos particulares mediante la administración de epítopos peptídicos en forma soluble. Se ha demostrado que la administración de péptidos solubles es un medio eficaz de inhibición de la enfermedad en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo de la esclerosis múltiple (EM)) (Metzler y Wraith (1993)Int. Immunol.5: 1159-1165; Liu y Wraith (1995)Int. Immunol.7: 1255-1263; Anderton y Wraith (1998)Eur. J. Immunol.28: 1251-1261); y en modelos experimentales de artritis, diabetes y uveorretinitis (revisado en Anderton y Wraith (1998), cita anterior). Esto también se ha demostrado como medio para tratar la enfermedad en curso en EAE (Anderton y Wraith (1998), cita anterior).

La tolerancia es la falta de respuesta a un antígeno. La tolerancia a autoantígenos es una característica esencial del sistema inmunitario que, cuando se pierde, puede dar lugar a una enfermedad autoinmunitaria. El sistema inmunitario adaptativo debe mantener la capacidad de responder a una enorme variedad de agentes infecciosos evitando al mismo tiempo el ataque autoinmunitario de los autoantígenos contenidos dentro de sus propios tejidos. Esto se controla en gran medida mediante la selección negativa de linfocitos T de alta afinidad en el timo (tolerancia central). Sin embargo, no todos los autoantígenos se expresan en el timo, por lo que la muerte de los timocitos autorreactivos queda incompleta. Por tanto, existen además mecanismos mediante los cuales los linfocitos T autorreactivos maduros pueden adquirir tolerancia en los tejidos periféricos (tolerancia periférica). Una revisión de los mecanismos de tolerancia central y periférica se proporciona en Andertonet al.(1999)Immunological Reviews169: 123-137. Véase también Wraith (2016)Nature530: 422-423.

Los datos disponibles sugieren que la uveítis puede resultar de la generación de células T autorreactivas a partir de proteínas retinianas, incluida S-Ag, que provocan inflamación y causan una enfermedad crónica. La composición de la presente invención es capaz de inducir tolerancia a autoantígenos tales como S-Ag, de manera que cuando se administra a un sujeto, puede restablecer la tolerancia a la proteína S-Ag y reducir la respuesta inmunitaria patógena.

Apítopos

En una respuesta inmunitaria adaptativa, los linfocitos T son capaces de reconocer epítopos de un antígeno proteico. Las APC captan antígenos proteicos y los degradan en fragmentos peptídicos cortos. Un péptido puede unirse a un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) dentro de la célula y ser transportado a la superficie celular. Cuando se presenta en la superficie celular junto con una molécula del MHC, el péptido puede ser reconocido por una célula T (a través del receptor de células T (TCR)), en cuyo caso el péptido es un epítopo de células T.

Un epítopo es por tanto un péptido derivable de un antígeno que es capaz de unirse al surco de unión a péptidos de una molécula del MHC y de ser reconocido por una célula T.

El epítopo mínimo es el fragmento más pequeño derivable de un epítopo, que es capaz de unirse al surco de unión a péptidos de una molécula del MHC de clase I o II y de ser reconocido por una célula T. Para una región inmunogénica dada, normalmente es posible generar un “conjunto anidado” de péptidos solapantes que actúan como epítopos, todos los cuales contienen el epítopo mínimo, pero difieren en las regiones flanqueantes.

Del mismo modo, es posible identificar el epítopo mínimo para una combinación particular de molécula del MHC y célula T midiendo la respuesta a péptidos truncados. Por ejemplo, si se obtiene una respuesta al péptido que comprende los restos 1-15 en la colección solapante, pueden usarse conjuntos truncados en ambos extremos (es decir, 1-14, 1 -13, 1-12 etc. y 2-15, 3-15, 4-15 etc.) para identificar el epítopo mínimo.

Los presentes inventores han determinado previamente que existe una relación entre la capacidad de un péptido para unirse a una molécula del MHC y ser presentado a una célula T sin procesamiento adicional, y la capacidad del péptido para inducir toleranciain vivo(documento WO 02/16410). Si un péptido es demasiado largo para unirse al surco de unión a péptidos de una molécula del MHC sin procesamiento adicional (por ejemplo, recorte), o se une en una conformación inapropiada, entonces no será tolerogénicoin vivo.Si, por otra parte, el péptido es de un tamaño y conformación apropiados para unirse directamente al surco de unión del péptido MHC y ser presentado a una célula T, entonces puede predecirse que este péptido es útil para la inducción de tolerancia.

Por tanto, es posible investigar la capacidad tolerogénica de un péptido investigando si puede unirse a una molécula del MHC y ser presentado a una célula T sin procesamiento antigénico adicionalin vitro.

Los apítopos (epítopos independientes de procesamiento antigénico) de S-Ag son capaces de unirse a una molécula del MHC de clase II y estimular una respuesta de las células T específicas para S-Ag sin procesamiento antigénico adicional. Puede predecirse que dichos apítopos causan tolerancia a S-Ag, mediante el método basado en reglas descrito en el documento WO 02/16410.

Los péptidos que se unen a moléculas del MHC de clase I tienen normalmente de 7 a 13, más usualmente de 8 a 10 aminoácidos de longitud. La unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos mediante contactos entre átomos de la cadena principal del péptido y sitios invariantes en el surco de unión a péptidos de todas las moléculas del MHC de clase I. Existen sitios invariantes en ambos extremos del surco que se unen a los extremos amino y carboxilo del péptido. Las variaciones en la longitud del péptido se acomodan mediante un retorcimiento del armazón peptídico, a menudo en restos de prolina o glicina que permiten flexibilidad.

Los péptidos que se unen a moléculas del MHC de clase II tienen normalmente entre 8 y 20 aminoácidos de longitud, más usualmente entre 10 y 17 aminoácidos de longitud y pueden ser más largos (por ejemplo, de hasta 40 aminoácidos). Estos péptidos se encuentran en una conformación extendida a lo largo del surco de unión a péptidos del MHC II que (a diferencia del surco de unión a péptidos del MHC de clase I) está abierto en ambos extremos. El péptido se mantiene en su sitio principalmente por contactos de átomos de la cadena principal con restos conservados que recubren el surco de unión a péptidos.

En una realización preferida, el péptido derivado de S-Ag es capaz de unirse a una molécula del MHC de clase II sin procesamiento adicional.

Péptidos

El término "péptido" se usa en el sentido normal para indicar una serie de restos, normalmente L-aminoácidos, conectados entre sí, normalmente por enlaces peptídicos entre los grupos a-amino y carboxilo de aminoácidos adyacentes. El término incluye péptidos modificados y análogos peptídicos sintéticos.

El péptido de la presente invención puede prepararse mediante métodos químicos(Peptide Chemistry, A practical Textbook.Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlín). Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse mediante técnicas en fase sólida (Roberge J. Y.et al.(1995)Science269: 202-204), separarse de la resina y purificarse mediante cromatografía líquida preparativa de alto rendimiento (por ejemplo, Creighton (1983)Proteins Structures And Molecular Principles,W. H. Freeman and Co., Nueva York NY). La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, con el sintetizador de péptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

El péptido puede prepararse alternativamente por técnicas recombinantes o por escisión de un polipéptido más largo. Por ejemplo, el péptido puede obtenerse por escisión de la proteína del antígeno S, que puede ir seguida de la modificación de uno o ambos extremos. La composición de un péptido puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, por el procedimiento de degradación de Edman).

Para fines prácticos, existen otras características diversas que puede mostrar el péptido. Por ejemplo, es importante que el péptido sea suficientemente establein vivopara ser terapéuticamente útil. La semivida del péptidoin vivopuede ser de al menos 10 minutos, 30 minutos, 4 horas o 24 horas.

Los péptidos usados en la presente invención son los siguientes:

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKAFVEQVANWLKKK (SEQ ID NO: 1);

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK (SEQ ID NO: 2); y

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK (SEQ ID NO: 3).

La identidad de la secuencia puede evaluarse mediante cualquier método conveniente. Sin embargo, para determinar el grado de identidad de secuencia entre secuencias, son útiles programas informáticos que realizan múltiples alineamientos de secuencias, por ejemplo, Clustal W (Thompsonet al.,(1994)Nucleic Acids Res.,22: 4673-4680). Programas que comparan y alinean pares de secuencias como ALIGN (Myerset al.,(1988)CABIOS,4: 1-17), FASTA (Pearsonet al.,(1988)PNAS,85: 2444-2448; Pearson (1990),Methods Enzymol.,183: 63-98) y BLAST con huecos (Altschulet al.,(1997)Nucleic Acids Res.,25: 3389-3402) también son útiles para este propósito. Además, el servidor Dali en el Instituto Europeo de Bioinformática ofrece alineamientos basados en la estructura de secuencias de proteínas (Holm (1993)J. Mol. Biol.,233: 123-38; Holm (1995)Trends Biochem. Sci.,20: 478-480; Holm (1998)Nucleic Acid Res.,26: 316-9).

Pueden determinarse múltiples alineamientos de secuencias y cálculos de porcentajes de identidad mediante los parámetros de BLAST convencionales (usando secuencias de todos los organismos disponibles, matriz Blosum 62, penalización por huecos: existencia 11, extensión 1).

Alternativamente, es posible usar el programa y los parámetros siguientes. Programa: Align Plus 4, versión 4.10(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite).Comparación de ADN: comparación global, matriz de puntuación lineal estándar, penalización por no coincidencia = 2, penalización por hueco abierto = 4, penalización por hueco extendido = 1. Comparación de aminoácidos: comparación global, matriz de puntuación BLOSUM 62.

Por tanto, en el presente documento se describen variantes de las secuencias indicadas o dadas, siempre que la variante conserve la actividad funcional del original, es decir, las variantes sean funcionalmente equivalentes, en otras palabras, tengan o exhiban la actividad del péptido original que se define en el presente documento. Tales variantes pueden comprender sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos (incluidos truncamientos en uno o ambos extremos) de la secuencia original, por ejemplo, de uno o más, por ejemplo, de 1 a 14 aminoácidos.

También se incluyen derivados funcionalmente equivalentes en donde uno o más de los aminoácidos están derivatizados químicamente, por ejemplo, sustituidos con un grupo químico.

El péptido puede comprender entre 8 y 30 aminoácidos, por ejemplo, de 8 a 25 aminoácidos, de 8 a 20 aminoácidos, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 12 aminoácidos. En un aspecto, el péptido puede tener, por tanto, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos de longitud.

El péptido es un apítopo, es decir, capaz de unirse a una molécula del MHCin vitro e in vivoy ser presentado a una célula T sin procesamiento antigénico.

Solubilidad

La solubilidad puede ser una consideración importante en la inducción de tolerancia mediada por péptidos.

La solubilidad puede mejorarse mediante la incorporación de aminoácidos adicionales que pueden ser glicina (G), lisina (K) y/o ácido glutámico (E) en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener, por ejemplo, uno, dos o tres aminoácidos adicionales en los extremos N y/o C. Los aminoácidos adicionales pueden seleccionarse de entre glicina (G), lisina (K) y/o ácido glutámico (E). Pueden añadirse diferentes combinaciones de estos aminoácidos a los péptidos.

Por ejemplo, un péptido puede tener uno, dos o tres restos de lisina (K) en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener uno, dos o tres restos de glicina (G) en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener uno, dos o tres restos de ácido glutámico (E) en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener un resto de glicina y un resto de lisina en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener un resto de glicina y dos restos de lisina en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener un resto de ácido glutámico y un resto de lisina en ambos extremos N y C.

Un péptido puede tener un resto de ácido glutámico y dos restos de lisina en ambos extremos N y C.

Por ejemplo, los aminoácidos adicionales pueden comprender un espaciador de glicina o lisina, seguido de los pares de aminoácidos KK, KE, EK o EE en uno o ambos extremos.

El péptido puede tener un espaciador de glicina en ambos extremos, seguido de combinaciones de dos aminoácidos adicionales que pueden ser lisina (K) y/o ácido glutámico (E) en ambos extremos N y C. La posible combinación en un extremo dado puede ser por tanto GKK, GKE, GEK o GEE.

El péptido puede tener la fórmula general:

XXG - péptido original - GXX

Un péptido puede tener tres restos de lisina (K) adicionales en ambos extremos N y C.

Los péptidos modificados pueden tener por tanto 6 aminoácidos más (3 en cada extremo) que los péptidos originales. Los péptidos pueden tener alternativamente la fórmula general:

KKK - péptido original - KKK

KK - péptido original - KK

K - péptido original - K

GK - péptido original - KG

GKK - péptido original - KKG

KKG - péptido original - GKK

EK - péptido original - KE

EKK - péptido original - KKE

GKE - péptido original - EKG

GEK - péptido original - KEG

El péptido modificado puede ser más soluble que el péptido original (no modificado). El péptido modificado puede tener una solubilidad 2, 3, 4 o 5 veces mayor que el péptido original. El péptido puede ser soluble a concentraciones de hasta 0,5 mg/ml, 1 mg/ml o 5 mg/ml.

Como se analiza en el presente documento, los péptidos modificados pueden tener 2, 4 o 6 aminoácidos más (1,2 o 3 en cada extremo) que los péptidos originales.

En el aspecto más preferido, la modificación es la inclusión de KKK en ambos extremos N y C.

El péptido modificado puede ser más soluble que el péptido original (no modificado). El péptido modificado puede tener una solubilidad 2, 3, 4 o 5 veces mayor que el péptido original. El péptido puede ser soluble a concentraciones de hasta 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 5 mg/ml o mayores, por ejemplo, de 8 mg/ml. El péptido modificado puede ser soluble a una concentración de 4 mg/ml.

Composición

Los péptidos de S-Ag están en forma de composición, preferiblemente una composición farmacéutica.

Una composición peptídica según la invención comprende las secuencias de aminoácidos según la invención que se describen en el presente documento. En un aspecto, la composición peptídica comprende solo las secuencias de aminoácidos según la invención que se describen en el presente documento, es decir, no comprende péptidos adicionales distintos de aquellos según la invención.

En un aspecto de la descripción que no forma parte de la invención analizada en el presente documento, como primera etapa se identifica un sujeto que tiene o presenta riesgo de padecer uveítis.

Los péptidos o la composición según la presente invención pueden ser para uso profiláctico o terapéutico.

Cuando se administran para uso profiláctico, los péptidos o la composición pueden reducir o prevenir la generación de una respuesta inmunitaria a S-Ag. El nivel de la respuesta inmunitaria es menor que el que se obtendría si el sujeto no hubiera sido tratado con la composición.

El término "reducir" indica que se observa una reducción parcial en la respuesta inmunitaria, tal como una reducción del 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en la respuesta que se habría observado si el sujeto no hubiera sido tratado con la composición (o en la respuesta observada en un sujeto no tratado durante el mismo período de tiempo). El término "prevenir" indica que no se observa ninguna respuesta inmunitaria apreciable a S-Ag.

Cuando se administran para uso terapéutico, los péptidos o la composición pueden suprimir una respuesta inmunitaria a S-Ag ya existente. El término "suprimir" indica una reducción en el nivel de una respuesta inmunitaria existente en comparación con el nivel antes del tratamiento con los péptidos o los niveles que se habrían observado en el mismo punto temporal de no haberse administrado el tratamiento.

El tratamiento con la composición de la presente invención puede causar una reducción en el nivel de cualquiera de los siguientes o de todos ellos:

i) autoanticuerpos contra S-Ag

ii) células T CD4+ proinflamatorias específicas para S-Ag

iii) células B que secretan autoanticuerpos contra S-Ag.

La detección de todos los factores puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, tales como ELISA, citometría de flujo, etc.

El tratamiento con la composición de la presente invención puede causar también o alternativamente anergia en células T CD4+ específicas para S-Ag. La anergia puede detectarse, por ejemplo, mediante la exposición posterior a S-Agin vitro.

Formulación

La composición puede ser una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Dicha formulación puede estar, por ejemplo, en una forma adecuada para su administración por vía intradérmica o subcutánea

La composición puede prepararse como un inyectable, ya sea como solución líquida o como suspensión; también puede prepararse una forma sólida adecuada para solución o suspensión en un líquido antes de la inyección. Alternativamente, el péptido puede encapsularse en un vehículo o unirse a la superficie de un vehículo, por ejemplo, una nanopartícula. Los ingredientes activos pueden mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos.

Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes y/o agentes tamponantes del pH. Las sales tamponantes incluyen fosfato, citrato o acetato. Para el ajuste del pH puede usarse ácido clorhídrico y/o hidróxido sódico. Para la estabilización, pueden usarse disacáridos tales como sacarosa o trehalosa.

En la composición, la proporción relativa de los péptidos puede ser de aproximadamente 1:1:1. Alternativamente, las proporciones relativas de cada péptido pueden modificarse, por ejemplo, si se observa que un péptido funciona mejor que los otros en tipos de HLA particulares.

Después de la formulación, la composición puede incorporarse en un recipiente estéril que luego se sella y almacena a baja temperatura, por ejemplo, a 4 °C, o puede liofilizarse.

Convenientemente, la composición se prepara como polvo liofilizado (criodesecado). La liofilización permite el almacenamiento a largo plazo en una forma estabilizada. Los procedimientos de liofilización son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html. Antes de la liofilización, se usan comúnmente agentes de carga, tales como manitol, dextrano o glicina.

La composición puede administrarse de una manera conveniente, tal como por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, intranasal, intradérmica o en supositorios o por implantación (por ejemplo, mediante moléculas de liberación lenta).

La composición puede administrarse ventajosamente por vía intranasal, subcutánea o intradérmica. En un aspecto, la administración puede ser mediante parches transdérmicos.

El péptido o la composición que se describen en el presente documento se administran normalmente en una "cantidad eficaz"; es decir, una cantidad eficaz para provocar uno cualquiera o más efectos terapéuticos o profilácticos, entre otros. Los expertos en la técnica podrán determinar, mediante experimentación rutinaria, una cantidad eficaz y no tóxica para incluir en una composición farmacéutica o para administrar para obtener el resultado deseado. En general, el péptido o la composición que se describen en el presente documento pueden administrarse de manera compatible con la vía de administración y las características físicas del receptor (incluido su estado de salud) y de tal manera que provoquen el efecto o efectos deseados (es decir, sean terapéuticamente eficaces y/o protectores). Por ejemplo, la dosificación apropiada de una composición puede depender de una variedad de factores que incluyen, pero no se limitan a las características físicas de un sujeto (por ejemplo, edad, peso, sexo) y otros factores que pueden ser reconocidos por los expertos en la técnica. Otros ejemplos ilustrativos de consideraciones generales que pueden tenerse en cuenta al determinar, por ejemplo, una dosificación apropiada de las composiciones, son analizadas por Gennaro (2000,"Remington: The Science and Practice of Pharmacf,20.a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; y Gilmanetal.,(eds), (1990),“Goodman And Gilman's: The PharmacologicalBases of Therapeutics",Pergamon Press).

El péptido y la composición de la invención pueden usarse para tratar a un sujeto humano. El sujeto puede tener uveítis. El sujeto puede tener células T autorreactivas para S-Ag.

El sujeto puede expresar un haplotipo HLA que está asociado con una predisposición a producir excesivas células T específicas para S-Ag. Los métodos para determinar el haplotipo HLA de un individuo son conocidos en la técnica. En un aspecto, el sujeto tiene un gen HLA seleccionado de entre los siguientes: A29, B51, B27, DR8, DR4, DP5, DR4, DQA3, DR3, DR2, DR51 y DR17 (véase Mattapalllilet a l, J. Immunol.2011, 187: 1977-1985).

Protocolo de dosis crecientes

En una realización preferida, los péptidos o la composición de la invención pueden administrarse al sujeto mediante un protocolo de "dosis crecientes", en donde se administra una pluralidad de dosis al sujeto en concentraciones ascendentes. Dicho enfoque se ha usado, por ejemplo, para péptidos de la fosfolipasa A2 en aplicaciones inmunoterapéuticas contra la alergia al veneno de las abejas (Mülleret al.(1998)J. Allergy Clin. Immunol.101: 747 754 y Akdiset a l,(1998)J. Clin. Invest.102: 98-106).

En un aspecto, el protocolo de dosis crecientes puede comprender administrar al sujeto un péptido tolerogénico en las siguientes dosis:

día 1: una primera dosis de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 pg;

día 14 ± 7 días: una segunda dosis de aproximadamente 35-65 pg;

día 28 ± 7 días: una tercera dosis de aproximadamente 80-120 pg;

día 42 ± 7 días: una cuarta dosis de aproximadamente 300-500 pg;

día 56 ± 7 días: una quinta dosis de aproximadamente 300-1800 pg;

día 70 ± 7 días: una sexta dosis de aproximadamente 300-1800 pg;

día 84 ± 7 días: una séptima dosis de aproximadamente 300-1800 pg;

día 98 ± 7 días: una octava dosis de aproximadamente 300-1800 pg;

día 112 ± 7 días: una novena dosis de aproximadamente 300-1800 pg; y

día 126 ± 7 días: una décima dosis de aproximadamente 300-1800 pg.

En un aspecto de la invención que se describe en el presente documento, la quinta a décima dosis pueden ser de aproximadamente 600-1500 pg.

La referencia a "± 7 días" pretende referirse al día establecido (es decir, el día establecido después de la primera administración del péptido, que se toma como día 1) en donde la administración puede ocurrir hasta siete días antes, inclusive, o hasta siete días después, inclusive, del día establecido. Como tal, la administración puede tener lugar 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 días antes, o 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después del día indicado.

En un aspecto de la invención descrita en el presente documento, la referencia a "± 7 días" es preferiblemente de ± 3 días. Es decir, la administración puede tener lugar hasta tres días antes, inclusive, o hasta tres días después, inclusive, del día establecido. Como tal, la administración puede tener lugar 3, 2 o 1 días antes, o 1, 2 o 3 días después del día establecido.

El péptido puede administrarse en las dosis siguientes:

día 1: una primera dosis de aproximadamente 25 pg;

día 14: una segunda dosis de aproximadamente 50 pg;

día 28: una tercera dosis de aproximadamente 100 pg;

día 42: una cuarta dosis de aproximadamente 400 pg;

día 56: una quinta dosis de aproximadamente 800 pg;

día 70: una sexta dosis de aproximadamente 800 pg;

día 84: una séptima dosis de aproximadamente 800 pg;

día 98: una octava dosis de aproximadamente 800 pg;

día 112: una novena dosis de aproximadamente 800 pg; y

día 126: una décima dosis de aproximadamente 800 pg.

En un aspecto, la quinta a décima dosis pueden ser alternativamente de aproximadamente 400 pg.

En un aspecto alternativo, la quinta a décima dosis pueden ser alternativamente de aproximadamente 1600 pg. Como tal, el péptido puede administrarse en las siguientes dosis:

día 1: una primera dosis de aproximadamente 25 pg;

día 14: una segunda dosis de aproximadamente 50 pg;

día 28: una tercera dosis de aproximadamente 100 pg;

día 42: una cuarta dosis de aproximadamente 400 pg;

día 56: una quinta dosis de aproximadamente 400 pg;

día 70: una sexta dosis de aproximadamente 400 pg;

día 84: una séptima dosis de aproximadamente 400 pg;

día 98: una octava dosis de aproximadamente 400 pg;

día 112: una novena dosis de aproximadamente 400 pg; y

día 126: una décima dosis de aproximadamente 400 pg.

Alternativamente, el péptido puede administrarse en las siguientes dosis:

día 1: una primera dosis de aproximadamente 25 gg;

día 14: una segunda dosis de aproximadamente 50 gg;

día 28: una tercera dosis de aproximadamente 100 gg;

día 42: una cuarta dosis de aproximadamente 400 gg;

día 56: una quinta dosis de aproximadamente 1600 gg;

día 70: una sexta dosis de aproximadamente 1600 gg;

día 84: una séptima dosis de aproximadamente 1600 gg;

día 98: una octava dosis de aproximadamente 1600 gg;

día 112: una novena dosis de aproximadamente 1600 gg; y

día 126: una décima dosis de aproximadamente 1600 pg.

En un aspecto adicional de la invención que se describe en el presente documento, se administra una undécima dosis de aproximadamente 300-1800 pg, preferiblemente de aproximadamente 600-1500 pg, preferiblemente de aproximadamente 1200 pg, más preferiblemente de aproximadamente 400, 800 o 1600 pg, el día 140 ± 7 días, preferiblemente el día 140 ± 3 días, más preferiblemente el día 140. En un aspecto preferido, la dosis es de aproximadamente 800 gg.

En un aspecto aún más preferido, se administra una duodécima dosis de aproximadamente 300-1800 gg, preferiblemente de aproximadamente 600-1500 gg, preferiblemente de aproximadamente 1200 gg, más preferiblemente de aproximadamente 400, 800 o 1600 gg, el día 154 ± 7 días, preferiblemente el día 154 ± 3 días, más preferiblemente el día 154. En un aspecto preferido, la dosis es de aproximadamente 800 gg.

En un aspecto preferido adicional, se administra una decimotercera dosis de aproximadamente 300-1800 gg, preferiblemente de aproximadamente 600-1500 gg, preferiblemente de aproximadamente 1200 gg, más preferiblemente de aproximadamente 400, 800 o 1600 gg, el día 168 ± 7 días, preferiblemente el día 168 ± 3 días, más preferiblemente el día 168. En un aspecto preferido, la dosis es de aproximadamente 800 gg.

En un aspecto preferido adicional, se administra una decimocuarta dosis de aproximadamente 300-1800 gg, preferiblemente de aproximadamente 600-1500 gg, preferiblemente de aproximadamente 1200 gg, más preferiblemente de aproximadamente 400, 800 o 1600 gg, el día 182 ± 7 días, preferiblemente el día 182 ± 3 días, más preferiblemente el día 182. En un aspecto preferido, la dosis es de aproximadamente 800 gg.

Pueden administrarse dosis adicionales como se describe anteriormente según se requiera durante un periodo, por ejemplo, de un mes a veinte años, por ejemplo, durante un periodo de un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, un año, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, seis años, siete años, ocho años, nueve años, diez años, once años, doce años, trece años, catorce años, quince años, dieciséis años, diecisiete años, dieciocho años, diecinueve años o veinte años. Cualquiera de las enseñanzas en el presente documento con respecto al "método" de la invención es igualmente aplicable a los "usos" abarcados por la invención.

Kit

Los péptidos derivados de S-Ag pueden administrarse juntos, en forma de composición o cóctel mixto. Sin embargo, puede haber circunstancias en las que es preferible proporcionar los péptidos por separado en forma de kit, para su administración simultánea, separada, secuencial o combinada.

Por ejemplo, el kit puede comprender los péptidos en recipientes separados. El contenido de los recipientes puede combinarse o no antes de la administración.

El kit también puede comprender medios de mezclado y/o administración (por ejemplo, un vaporizador para administración por vía intranasal; o una jeringa y una aguja u otro dispositivo médico para dosificación por vía subcutánea/intradérmica). El kit también puede comprender instrucciones de uso.

La composición farmacéutica o el kit de la invención pueden usarse para tratar y/o prevenir una enfermedad tal como uveítis, como se analiza en el presente documento.

En particular, la composición/kit puede usarse para suprimir o prevenir la producción de linfocitos T CD4+ específicos para S-Ag (o autoanticuerpos contra S-Ag)in vivo.La composición/kit puede usarse para tratar y/o prevenir la uveítis en un sujeto.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Los péptidos 9K1K, 17JK y 15N3K se cargan correctamente en moléculas del MHC II en células dendríticasin vivo

Cuando se inyectaron 100 pg del péptido 9K1K en ratones DR2tg o cuando se inyectaron los péptidos 17JK o 15N3K en ratones DR3tg, estos péptidos pudieron detectarse en células dendríticas (células CD11c+) en el bazo de estos ratones 2 h después de la inyección. Como indicador se usó la activación (producción de IFNy) de las células T CD4+ específicas para los péptidos por las células CD11c+ aisladas.

En la figura 1, la figura 2 y la figura 3 puede apreciarse claramente que las células CD11c+ aisladas del bazo de ratones a los que se inyectó 9K1K, 17JK o 15N3K, respectivamente, inducen una activación significativa de las células T CD4+, en comparación con las células CD11c+ del bazo de ratones de control a los que se inyectó PBS. Estos resultados demuestran que los péptidos 9K1K, 17JK y 15N3K alcanzan las células dendríticas en órganos linfáticos secundarios. Además, estos péptidos se unen a las moléculas del MHC II en estas células dendríticas en la conformación correcta. Como consecuencia, estos péptidos pueden inducir tolerancia.

Ejemplo 2 - El tratamiento con un solo péptido induce tolerancia de células T específicas para S-Ag

Previamente se demostraron los efectos tolerogénicos de los péptidos 9K1K, 17JK y 15N3K por separado y estos resultados se confirman en estos experimentos, en los que se trataron ratones transgénicos HLA-DR según el programa de dosis crecientes con uno de los péptidos en solitario.

En el primer experimento (figura 4), los ratones DR2tg recibieron el péptido 9K1K o PBS, como se describe en la sección de métodos. El tratamiento previo con este apítopo modificado redujo la activación de las células inducida por S-Ag en el 77 % y el 70 % en los ganglios linfáticos (figura 4A) y el bazo (figura 4B), respectivamente.

Para confirmar la capacidad tolerogénica de 17JK, se trataron ratones DR3tg con este apítopo modificado o PBS. Este experimento demostró que el pretratamiento con 17JK reduce la activación de las células inducida por S-Ag en el 78 % y el 84 % en los ganglios linfáticos (figura 5A) y el bazo (figura 5B), respectivamente.

El pretratamiento de ratones DR3tg con el péptido 15N3K dio como resultado una reducción de la activación de las células inducida por S-Ag en el 61 % y el 72 % en los ganglios linfáticos (figura 6A) y el bazo (figura 6B), respectivamente, en comparación con los ratones de control tratados con PBS.

Ejemplo 3 - El tratamiento peptídico combinado induce tolerancia en células T específicas para S-Ag

El hallazgo de que un tratamiento con los péptidos individuales 9K1K, 17JK o 15N3K reduce la activación inmunitaria específica para S-Ag en ratones DRtg, condujo a investigar si un tratamiento combinado, con la administración de los péptidos como cóctel, podría reducir también la respuesta específica para S-Ag. Los ratones DR3tg y DR2tg se trataron con ATX975 según el programa de dosis crecientes y se inmunizaron con una emulsión que contenía los tres antígenos en CFA. Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8 para ratones DR3tg y DR2tg, respectivamente.

Tras el tratamiento con ATX975 de ratones DR3tg (figura 7), la activación de las células inducida por S-Ag se redujo en el 95 % y el 89 % en el bazo en dos experimentos independientes. La inducción de tolerancia por ATX975 fue mucho más pronunciada en comparación con la inducción de tolerancia por el tratamiento con el péptido 17JK en solitario (reducción del 80 % y el 52 % de la activación de las células inducida por S-Ag en el bazo en dos experimentos independientes) o el péptido 15N3K en solitario (reducción del 74 % de la activación de las células inducida por S-Ag en el bazo).

Cuando se trataron ratones DR2tg con ATX975 (figura 8), la activación de las células inducida por S-Ag se redujo en el 78 % en el bazo de los ratones tratados en comparación con los ratones de control. Esta inducción de tolerancia fue más pronunciada que la reducción del 51 % de la activación de las células inducida por S-Ag que se observa después del tratamiento con 9K1K en solitario.

Estos datos indican claramente un efecto aditivo de los péptidos individuales cuando se combinan en un tratamiento con un cóctel peptídico en ratones DRtg.

Ejemplo 4 - En un ensayo de unión péptido-MHC IIin vitro,los péptidos 9K1K, 17JK y 15N3K demuestran diversos patrones de unión

La figura 9 representa los valores de CI50 (pM) de los péptidos 9K1K, 17JK y 15N3K que se unen a las moléculas de HLA-DR indicadas, en competición con un péptido competidor conocido. Los valores deben compararse sólo dentro de cada molécula de HLA-DR. Los valores bajos de CI50 (verde) indican la unión más fuerte para cada molécula de HLA-DR. Los valores más altos para cada molécula de HLA-DR (rojo) indican la unión más débil para esa molécula de HLA-DR. Los valores intermedios se indican en naranja. Estos resultados demuestran que los 3 péptidos 9K1K, 17JK y 15N3K tienen diferentes perfiles de unión a las moléculas HLA-DR investigadas. Por tanto, la combinación de los péptidos en un tratamiento de cóctel hace que el tratamiento sea menos restringido para un cierto tipo de HLA-DR.

Conclusiones

Se ha identificado el cóctel de péptidos ATX975 que puede contener 3 péptidos de la proteína S-Ag y es capaz de inducir tolerancia hacia S-Ag en ratones transgénicos HLA-DR.

Ejemplo 5 - Las variantes del péptido 15N3K se comportan como apítopos

Los apítopos (epítopos independientes de procesamiento antigénico) son capaces de unirse a una molécula del MHC II y estimular una respuesta de las células T específicas para SAg sin procesamiento antigénico adicional. Se probaron variantes del péptido 15N3K (SEQ ID NO: 3) para determinar su capacidad para unirse a una molécula del MHC II y ser presentadas a un hibridoma de células T sin procesamiento antigénico adicional en un ensayoin vitrocon un sistema de presentación independiente del procesamiento antigénico (APIPS). En otras palabras, se probaron péptidos que consistían en partes de péptido 15N3K y péptidos con diversos grados de identidad de secuencia con el péptido 15N3K para determinar su capacidad para comportarse como apítopos.

Los péptidos ensayados se presentan en la tabla siguiente:

La respuesta de las células T a cada uno de estos péptidos en el ensayo APIPS, medida por la secreción de IL-2, se muestra en la figura 10. Todos los péptidos, excepto tres, son apítopos.

Materiales y Métodos

Ratones

En la identificación de los péptidos y el desarrollo de los apítopos se usaron ratones transgénicos HLA-DR para asegurar que el motivo de unión del péptido al MHC de clase II es exactamente el necesario para el tratamiento de tolerización en pacientes con uveítis.

Los ratones DR3tg se criaron en condiciones exentas de patógenos específicos externamente en Charles River, Reino Unido, o Innoser, Bélgica. La cepa DR3tg fue creada originalmente por Strausset al.(Strausset al.,1994,Immunogenetics3, 104-108). En resumen, las construcciones genómicas usadas fueron un fragmentoNdeIde 6 kb de un clon genómico de HLA-DRA en pUC13 y un fragmentoClaIxSalIde 24 kb I de cos 4.1, un cósmido (pTCF) que contiene el genBde DRB1*0301. Se usó una solución que contenía 1-2 pg/ml de cada construcción para la coinyección en óvulos fertilizados de donantes (C57BL/6 x DBA/2)F1 apareadas con machos C57BL/6. La progenie se crio después en el fondo genético C57BL/6 inactivado para IA-p (ratones AB0) que carece de la expresión de moléculas del MHC de clase II de ratón. Estos ratones DR3tg expresan la molécula HLA-DRB1*0301 pero no la molécula del MHC-II de ratón. Los ratones se mantuvieron por retrocruzamiento con C57BL/6 y con B10.Q. Los ratones transgénicos se identificaron mediante análisis por transferencia de Southern de ADN de la cola digerido conEcoRIe hibridado con un fragmentoBamHIde 1,35 kb del ADNc de DRA y un fragmentoBamHIde 1,25 kb del ADNc de DRB1*0301.

Los ratones DR2tg se criaron en condiciones exentas de patógenos específicos externamente en Charles River, Reino Unido, o Innoser, Bélgica. Los ratones transgénicos para HLA-DR2 (DR2tg) se obtuvieron originalmente de Lars Fugger (Madsenet al.,1999). En resumen, los ADNc de las cadenas DRa y DRp (DRA*0101 y DRB1*1501) se expresaron mediante el vector de expresión pDOI-5 que contiene un promotor de MHC II de ratón. Las construcciones se inyectaron en óvulos fertilizados de apareamientos (DBA/2xC57BL/6)F1. Los ratones se retrocruzaron en el fondo genético C57BL/6 inactivado para IA-p (ratones AB0) que carece de la expresión de moléculas del MHC de clase II de ratón. Los ratones DR2tg expresan la molécula HLA-DRB1*1501 pero no la molécula del MHC de ratón.

Los estudios con animales fueron aprobados por el comité ético para experimentos con animales (ECD) de la Universidad de Hasselt y se realizaron con los estándares de cuidados más altos en una instalación exenta de patógenos.

Antígenos

Todos los péptidos individuales fueron sintetizados por Genscript (Piscataway, EE.UU.) y almacenados en una solución madre de 20 mg/ml en DMSO (Sigma-Aldrich) o 4 mg/ml en PBS (Lonza) a -80 °C. Los péptidos se sintetizaron con una amina N-terminal libre y una amida C-terminal. La S-Ag humana (S-arrestina) se produjo en células HEK293F (QBiologicals, grupo Eurofins Amatsi, Gante, Bélgica).

Ensayo de carga del MHC de clase IIin vivo

Se inyectaron 100 pg del péptido en 100 pl de PBS por vía subcutánea (s.c.) en el flanco de ratones DR3tg o DR2tg. Los animales de control recibieron una inyección s.c. de 100 pl de PBS. Después de 2 horas, se recogieron los bazos y se prepararon suspensiones de células individuales. Las células CD11c+ se seleccionaron positivamente mediante microperlas para CD11c según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Se alcanzaron purezas medias de >92 %. Se cocultivaron 1 x 105 células CD11c+ con 1 x 105 células CD4+ en placas de 96 pocillos de fondo redondo en medio X-vivo 15 (complementado con L-glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina y 50 U/ml de estreptomicina, Lonza, y p-mercaptoetanol 50 mM, Gibco). Estas células CD4+ se aislaron de ratones DR3tg o DR2tg inmunizados por vía subcutánea en la base de la cola con 50 pg del péptido emulsionado en CFA (péptido/CFA). Diez días después de la inmunización, se recogieron los ganglios linfáticos de drenaje (GL) y los bazos. Se aislaron células de GL y esplenocitos y las células T CD4+ se aislaron mediante selección negativa mediante el kit de aislamiento para CD4 de ratón Magnisort (ThermoFisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas, se recogió el sobrenadante de estos cocultivos y se analizó la activación de las células T CD4+ mediante ELISA para IFNy (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). En un experimento paralelo, se evaluaron las respuestas de las células T CD4+ hacia el péptido añadidoin vitropara asegurarse de que las células T reconocían los péptidos presentados por las células CD11c+.

Experimento de tolerizaciónex vivo

Se inyectaron 0,015 nmol, 0,15 nmol y 1,5 nmol de péptido por vía subcutánea en la región del flanco de ratones DR3tg o DR2tg los días -15, -13 y -11, respectivamente (programa de dosis crecientes), a lo que siguieron 3 inyecciones de 15 nmol de péptido los días -8, -6 y -4. Las dosis indicadas son para tratamientos con péptidos individuales, para el tratamiento con el cóctel que contiene los 3 péptidos incluidos en ATX975, estas dosis se administraron por péptido (para alcanzar una dosis máxima total de 45 nmol de péptido). Los ratones de control recibieron la misma dosis de un péptido no relevante capaz de unirse a HLA-DR2 o HLA-DR3, dependiendo de la cepa de ratón usada. El día 0, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con 150 pg de antígeno (50 pg de cada péptido 30-méro que contenía el epítopo respectivo) emulsionado en CFA (péptido/CFA). Diez días después de la inmunización, se recogieron los ganglios linfáticos de drenaje (GL) y los bazos. Se aislaron células de GL y esplenocitos y se cultivaron en medio X-vivo 15 (complementado con L-glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina y 50 U/ml de estreptomicina, Lonza, y p-mercaptoetanol 50 mM, Gibco) en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Para investigar la activación de las células inducida por el antígeno, se cultivaron 0,5 x 106 células/pocillo (200 pl/pocillo) durante 72 horas con diferentes concentraciones de antígeno (0-25 pg/ml) o con 12,5 pg/ml de derivado proteico purificado (PPD; control de cebado; AJ Vaccines, Copenhague, Dinamarca). Después de 72 horas, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -80 °C hasta su análisis posterior. La concentración de IFNy en el sobrenadante se evaluó mediante ELISA para citocinas (R&D Systems, Abingdon, RU) para medir la activación de las células.

Secuencias peptídicas

Ensayo de unión péptido-MHC de clase II

La unión de los péptidos 9K1, 17JK y 15N3K a HLA-DRA1*0101, DRB1*0101 (DR1), DRB1*1501 (DR2), DRB1*0301 (DR3), DRB1*0401 (DR4), DRB1 *1101 (DR11), DRB1*0405 (DR4*05) y DRB1*0901 (DR9) recombinantes fue realizado por Prolmmmune (Oxford, Reino Unido) mediante su ensayo de unión REVEAL para MHC de clase II sin células.

Ensayo del sistema de presentación independiente del procesamiento antigénico (APIPS)

Se probaron clones de hibridoma específicos para el antígeno para determinar su reactividad frente a péptidos presentados por células (APC) fijadas o no fijadas (frescas). Se cultivaron 5 x 104 células con 10 pg/ml y 25 pg/ml de péptido y 5 x 104 de APC fijadas o frescas. Para fijar las células APC, estas se incubaron con paraformaldehído al 0,5 % (Merck, Darmstadt, Alemania) (pH 7) durante 5 min a temperatura ambiente (TA). La reacción de fijación se detuvo añadiendo glicina 0,4 M (Sigma-Aldrich) y lavando las células en RPMI-FCS al 10 %. Después de 48 h, se midió la producción de IL-2 inducida por el antígeno mediante ELISA (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende péptidos de S-arrestina (S-Ag), en donde los péptidos de S-Ag consisten en los siguientes péptidos de S-Ag:

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKAFVEQVANWLKKK (SEQ ID NO: 1);

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK (SEQ ID NO: 2); y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK (SEQ ID NO: 3).

2. La composición según la reivindicación 1, en donde los péptidos son capaces de unirse a una molécula del MHCin vitroy ser presentados a una célula T sin procesamiento antigénico.

3. La composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso terapéutico.

4. La composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la uveítis en un sujeto.

5. La composición para su uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde el sujeto expresa HLA-DR3.

6. La composición para su uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde el sujeto expresa HLA-DR2.

7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde la composición se administra siguiendo un protocolo de dosis crecientes.

8. La composición para su uso según la reivindicación 7, en donde el protocolo de dosis crecientes comprende las siguientes dosis:

día 1: una primera dosis de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 pg;

día 14 ± 7 días: una segunda dosis de aproximadamente 35-65 pg;

día 28 ± 7 días: una tercera dosis de aproximadamente 80-120 pg;

día 42 ± 7 días: una cuarta dosis de aproximadamente 300-500 pg;

día 56 ± 7 días: una quinta dosis de aproximadamente 600-1500 pg;

día 70 ± 7 días: una sexta dosis de aproximadamente 600-1500 pg;

día 84 ± 7 días: una séptima dosis de aproximadamente 600-1500 pg;

día 98 ± 7 días: una octava dosis de aproximadamente 600-1500 pg;

día 112 ± 7 días: una novena dosis de aproximadamente 600-1500 pg; y

día 126 ± 7 días: una décima dosis de aproximadamente 600-1500 pg.

9. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde

la primera dosis es de aproximadamente 25 pg; y/o

la segunda dosis es de aproximadamente 50 pg; y/o

la tercera dosis es de aproximadamente 100 pg; y/o

la cuarta dosis es de aproximadamente 400 pg.

10. La composición para su uso según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde

una undécima dosis de aproximadamente 600-1500 pg se administra el día 140 ± 7 días; y/o

una duodécima dosis de aproximadamente 600-1500 pg se administra el día 154 ± 7 días; y/o

una decimotercera dosis de aproximadamente 600-1500 pg se administra el día 168 ± 7 días.

11. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la quinta, sexta, séptima, octava, novena y décima, y opcionalmente la undécima, duodécima y decimotercera dosis son cada una de aproximadamente 800 pg.

12. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en donde la administración de la composición es por vía intradérmica.

13. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde la composición se administra a un ser humano.

14. Un kit que comprende los péptidos S-Ag que se definen en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

15. El kit de la reivindicación 14 para administración simultánea, separada o secuencial en la prevención o el tratamiento de la uveítis.