ES3011462T3 - Methods for blocking a capture probe on a spatial array - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar la ubicación de un analito objetivo en una muestra biológica que incluyen el uso de desoxinucleotidil transferasa terminal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, composiciones y kits para bloquear una sonda de captura en una matriz espacial

Campo técnico

En la presente descripción se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar una ubicación de un analito diana en una muestra biológica que incluyen el uso de desoxinucleotidiltransferasa terminal.

Antecedentes

Las células dentro de un tejido tienen diferencias en la morfología y/o función celular debido a niveles variados de analitos (por ejemplo, expresión génica y/o proteica) dentro de las diferentes células. La posición específica de una célula dentro de un tejido (por ejemplo, la posición de la célula con relación a las células vecinas o la posición de la célula con relación al microentorno del tejido) puede afectar, por ejemplo, la morfología, diferenciación, destino, viabilidad, proliferación, comportamiento, señalización y diafonía de la célula con otras células en el tejido.

La heterogeneidad espacial se ha estudiado previamente mediante el uso de técnicas que típicamente proporcionan datos para unos pocos analitos en el contexto de tejido intacto o una porción de un tejido (por ejemplo, una sección de tejido), o proporcionan datos significativos de analitos de células aisladas, individuales, pero no proporcionan información con respecto a la posición de las células aisladas de la muestra biológica de origen (por ejemplo, un tejido).

Algunas técnicas para estudiar la heterogeneidad espacial de una muestra biológica pueden provocar que los analitos (por ejemplo, ácidos nucleicos) de la muestra biológica difundan hacia áreas adyacentes a la muestra biológica y se capturen en tales áreas adyacentes a la muestra biológica, o no tan cerca de la ubicación original del analito en la muestra biológica como se desea. La captura de analitos en áreas adyacentes a la muestra biológica en la matriz (por ejemplo, áreas que no cubiertas por la muestra biológica) puede conducir al desperdicio de recursos tales como, por ejemplo, costos innecesarios atribuidos a la secuenciación (por ejemplo, secuenciación de nueva generación) así como también a la disminución de la resolución y exactitud de la información espacial de la muestra biológica. Por lo tanto, los métodos para disminuir la incidencia de analitos capturados en áreas de la matriz adyacentes a la muestra biológica (por ejemplo, mediante la disminución de la captura de analitos en áreas no cubiertas por la muestra biológica), pueden mejorar la eficiencia, la conservación de recursos y la resolución de los resultados.

Resumen

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Esta solicitud generalmente presenta métodos para bloquear sondas de captura en una matriz (por ejemplo, una matriz espacial) que no están bajo o cubiertas por una muestra biológica colocada en la matriz. Los métodos descritos en la presente descripción incluyen métodos para bloquear sondas de captura en una matriz espacial mediante el uso de desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) y uno o más didesoxinucleótidos. Los métodos descritos en la presente descripción pueden proporcionar una mejora en la conservación de recursos (por ejemplo, una biblioteca reducida para la secuenciación) y una reducción y/o eliminación de la unión (por ejemplo, de analitos a porciones no deseadas de la matriz espacial (por ejemplo, porciones de la matriz que no están bajo o cubiertas por la muestra biológica) durante la realización de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción (por ejemplo, determinar una ubicación de un analito diana en una muestra biológica).

En la presente descripción se proporcionan métodos para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz; (b) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura; (c) eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz; (d) permeabilizar la muestra biológica, de manera que el dominio de captura de la primera sonda de captura se hibrida con el ácido nucleico diana de la muestra biológica; y (e) determinar (i) una secuencia correspondiente al código de barras espacial de la primera sonda de captura, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia correspondiente al ácido nucleico diana, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

En algunas modalidades, la etapa de eliminación incluye el uso de un tampón de lavado que incluye uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye solución salina tamponada con fosfato o citrato de sodio salino.

En algunas modalidades, la determinación en la etapa (e) incluye extender un extremo 3' de la sonda de captura de la primera área de la matriz mediante el uso del ácido nucleico diana como una plantilla. En algunas modalidades, la determinación en la etapa (e) incluye la secuenciación (i) del código de barras espacial de la sonda de captura de la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) todo o una porción del ácido nucleico diana, o un complemento del mismo. En algunas modalidades, la secuenciación es una secuenciación de alto rendimiento.

En algunas modalidades, la permeabilización incluye el uso de un agente de permeabilización seleccionado de un solvente orgánico, un detergente, una enzima y sus combinaciones. En algunas modalidades, el agente de permeabilización se selecciona del grupo que consiste en: una endopeptidasa, una proteasa, dodecilsulfato de sodio, terc-octilfeniléter de polietilenglicol, polisorbato 80, polisorbato 20, solución salina de N-lauroilsarcosina sódica, saponina, Tritón X-100™ y Tween-20™. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina o proteinasa K.

En la presente descripción también se proporcionan métodos que no forman parte de la invención para bloquear sondas de captura no cubiertas por una muestra biológica, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz; y (b) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura en la segunda área.

En algunas modalidades, el método incluye la etapa (c) permeabilizar la muestra biológica, de manera que el dominio de captura de la primera sonda de captura se hibrida con el ácido nucleico diana de la muestra biológica. En algunas modalidades, la etapa (c) incluye poner en contacto la muestra biológica con un agente de permeabilización, donde el agente de permeabilización se selecciona de un solvente orgánico, un detergente, una enzima y sus combinaciones. En algunas modalidades, el agente de permeabilización se selecciona del grupo que consiste en: una endopeptidasa, una proteasa, dodecilsulfato de sodio, tercoctilfeniléter de polietilenglicol, polisorbato 80, polisorbato 20, solución salina de N-lauroilsarcosina sódica, saponina, Tritón X-100™ y Tween-20™. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina o proteinasa K.

En algunas modalidades, el método incluye eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz antes de la permeabilización. En algunas modalidades, la etapa de eliminación incluye el uso de un tampón de lavado que incluye uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye solución salina tamponada con fosfato o citrato de sodio salino.

En algunas modalidades, la muestra biológica se fija y/o se tiñe antes de la etapa (a). En algunas modalidades, el método incluye, entre las etapas (a) y (b), fijar y/o teñir la muestra biológica.

En algunas modalidades, la etapa de fijación de la muestra biológica incluye el uso de un fijador seleccionado del grupo que consiste en: etanol, metanol, acetona, formaldehído, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído y sus combinaciones.

En algunas modalidades, la etapa de tinción de la muestra biológica incluye el uso de eosina y/o hematoxilina.

En algunas modalidades, la etapa de tinción de la muestra biológica incluye el uso de una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente y una de sus combinaciones.

En la presente descripción también se proporcionan métodos para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz, donde el dominio de captura de la primera sonda de captura se híbrida con un producto de ligazón; (b) extender el producto de ligazón hacia el extremo 5' de la primera sonda de captura mediante el uso de la primera sonda de captura como una plantilla; (c) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura; (d) eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz; y (e) determinar (i) una secuencia correspondiente al código de barras espacial de la primera sonda de captura, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia correspondiente al producto de ligazón, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

En algunas modalidades, la etapa de eliminación incluye el uso de un tampón de lavado que incluye uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye solución salina tamponada con fosfato o citrato de sodio salino.

En algunas modalidades, la extensión en la etapa (b) incluye extender un extremo 3' de la primera sonda de captura mediante el uso del producto de ligazón como una plantilla.

En algunas modalidades, la determinación en la etapa (e) incluye la secuenciación (i) del código de barras espacial de la primera sonda de captura, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción del producto de ligazón o un complemento del mismo. En algunas modalidades, la secuenciación es una secuenciación de alto rendimiento.

En la presente descripción también se proporcionan métodos que no forman parte de la invención para bloquear sondas de captura para disminuir el intercambio de códigos de barras y/o disminuir el uso de sondas de captura como plantillas de extensión, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz, donde el dominio de captura de la primera sonda de captura se hibrida con un producto de ligazón; (b) extender el producto de ligazón hacia el extremo 5' de la primera sonda de captura mediante el uso de la primera sonda de captura como una plantilla; y (c) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura.

En algunas modalidades, el método incluye eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz. En algunas modalidades, la etapa de eliminación incluye el uso de un tampón de lavado que incluye uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye solución salina tamponada con fosfato o citrato de sodio salino.

En algunas modalidades, la muestra biológica se fija y/o se tiñe antes de la etapa (a). En algunas modalidades, el método incluye, entre las etapas (a) y (b), fijar y/o teñir la muestra biológica.

En algunas modalidades, la etapa de fijación de la muestra biológica incluye el uso de un fijador seleccionado del grupo que consiste en: etanol, metanol, acetona, formaldehído, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído y sus combinaciones. En algunas modalidades, la etapa de tinción de la muestra biológica incluye el uso de eosina y/o hematoxilina.

En algunas modalidades, la etapa de tinción de la muestra biológica incluye el uso de una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente y una de sus combinaciones.

En algunas modalidades, el producto de ligazón se genera mediante la hibridación de una primera sonda y una segunda sonda con el ácido nucleico diana, donde la primera sonda y la segunda sonda se ligan para formar el producto de ligazón. En algunas modalidades, la primera sonda o la segunda sonda incluyen una secuencia de captura del analito que se hibrida con el dominio de captura de la primera sonda de captura.

En algunas modalidades, el uno o más didesoxinucleótidos es ddATP o ddTTP. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos a aproximadamente 25 mM del uno o más didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos a aproximadamente 1,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 1 mM del uno o más didesoxinucleótidos.

En algunas modalidades, la solución incluye C0CI2. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM de CoCh a aproximadamente 2 mM de CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,25 mM de CoCh.

En algunas modalidades, la solución incluye un tampón.

En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 90 minutos. En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza durante aproximadamente 60 minutos. En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C. En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de aproximadamente 37 °C.

En la presente descripción también se proporcionan kits que incluyen: (a) una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal; (b) uno o más didesoxinucleótidos; (c) un sustrato que incluye una pluralidad de sondas de captura, donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura; y (d) instrucciones para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.

En algunas modalidades, el kit incluye un fijador seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol, acetona, formaldehído, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído y sus combinaciones.

En algunas modalidades, el uno o más didesoxinucleótidos son ddATP y/o ddTTP. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos a aproximadamente 25 mM del uno o más didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos a aproximadamente 1,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 1 mM del uno o más didesoxinucleótidos.

En algunas modalidades, la solución incluye CoCl2. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM de CoCh a aproximadamente 2 mM de CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,25 mM de CoCl2.

En algunas modalidades, la solución incluye un tampón. En algunas modalidades, el kit incluye un tampón de lavado que incluye uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye solución salina tamponada con fosfato. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye citrato de sodio salino.

Cuando los valores se describen en términos de intervalos, debe entenderse que la descripción incluye la descripción de todos los posibles subintervalos dentro de tales intervalos, así como también valores numéricos específicos que caen dentro de tales intervalos independientemente de si se indica expresamente un valor numérico específico o un subintervalo específico.

El término “cada uno”, cuando se usa en referencia a una recopilación de artículos, pretende identificar un artículo individual en la recopilación, pero no necesariamente se refiere a cada artículo en la recopilación, a menos que se indique expresamente de cualquier otra manera, o a menos que el contexto del uso indique claramente de cualquier otra manera.

Descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos ilustran ciertas modalidades de las características y ventajas de esta descripción. Estas modalidades no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera. Los símbolos de referencia similares en los dibujos indican elementos similares.

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de una sonda de captura con código de barras, como se describe en la presente descripción.

La Figura 2 muestra un diagrama de flujo de trabajo ilustrativo de un método para bloquear las sondas de captura adyacentes a una muestra biológica en una matriz espacial y determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica.

La Figura 3 muestra un diagrama de flujo de trabajo ilustrativo para mitigar la posibilidad de que las sondas de captura actúen como cebadores y determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica.

Descripción detallada

El resultado de la captura de analitos de ácidos nucleicos, o sustitutos de los mismos, en áreas adyacentes a una muestra biológica en una matriz (por ejemplo, áreas que no están bajo o cubiertas por la muestra biológica) puede conducir al desperdicio de recursos, tales como costos innecesarios atribuidos a la secuenciación (por ejemplo, secuenciación de nueva generación) y puede comprometer la resolución espacial. El bloqueo de uno o más dominios de captura de las sondas de captura en matrices espaciales (o porciones de las mismas) puede aumentar la eficiencia y/o disminuir la unión de analitos en matrices (o porciones de las mismas). En algunos casos, una o más sondas de captura (por ejemplo, el dominio de captura de las sondas de captura) pueden bloquearse mediante el uso de una desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos. En la presente descripción se proporcionan métodos, composiciones y kits para llevar a cabo estos métodos.

En la presente descripción se describen métodos para reducir las interacciones espaciales en una matriz espacial en áreas que no están bajo o cubiertas por una muestra biológica. Los métodos descritos en la presente descripción pueden mejorar la resolución de los resultados de la matriz espacial al reducir la unión de analitos de ácidos nucleicos o sustitutos de los mismos en áreas de la matriz que no se correlacionan con la ubicación original de la muestra biológica en la matriz. En algunos casos, los analitos de ácidos nucleicos de una muestra biológica pueden difundir (por ejemplo, lateralmente) hacia áreas de la matriz que no están cubiertas por la muestra biológica, lo que puede dar como resultado la unión de analitos al(a los) dominio(s) de captura de una o más sondas de captura no cubiertas por la muestra biológica. La captura de analitos en áreas adyacentes o cercanas a la muestra biológica aumenta los resultados de fondo y disminuye la resolución. El bloqueo del dominio de captura de las sondas de captura que son adyacentes o cercanas a la muestra biológica puede disminuir la unión no deseada y aumentar la resolución de la captura de dianas. Por lo tanto, la presente descripción presenta métodos, composiciones y kits que pueden reducir la captura de analitos de ácidos nucleicos en áreas adyacentes a o no cubiertas por la muestra biológica al evitar la unión de analitos a esas sondas de captura adyacentes o cercanas a la muestra biológica (por ejemplo, mediante el bloqueo del dominio de captura de las sondas de captura).

Los métodos descritos en la presente descripción también conservan recursos. Por ejemplo, en algunos casos, el análisis de los datos obtenidos a partir de analitos nucleicos capturados en una matriz (por ejemplo, una matriz espacial) puede incluir secuenciación. La unión no deseada de analitos de ácidos nucleicos al dominio de captura de una o más sondas de captura puede dar como resultado la secuenciación de analitos de ácidos nucleicos capturados en áreas no cubiertas por la muestra biológica. La captura de analitos de ácidos nucleicos no deseados (o sustitutos de los mismos) puede provocar ineficiencias de secuenciación aguas abajo, por ejemplo, una disminución en la cantidad de secuenciación de analito de ácido nucleico, debido a que la secuenciación de analitos capturados no deseados es ineficiente y costosa en reactivos y puede dar como resultado una disminución en la resolución espacial. La presente descripción proporciona soluciones para mejorar y/o evitar la captura de analitos de ácidos nucleicos no deseados (o sustitutos de los mismos) en una matriz.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen bloquear el dominio de captura de una o más sondas de captura ubicadas en áreas que no están bajo o cubiertas por una muestra biológica en una matriz mediante el uso de desoxinucleotidiltransferasa terminal y nucleótidos trifosfatos. La desoxinucleotidiltransferasa terminal puede transferir nucleótidos trifosfatos al extremo hidroxilo 3' de los oligonucleótidos. Por ejemplo, incorporar uno o más didesoxinucleótidos en el extremo 3' de una sonda de captura con desoxinucleotidiltransferasa terminal puede evitar la ligazón o extensiones por polimerasa, que incluyen la transcripción inversa.

En algunas modalidades, la desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se aplican a las porciones de la matriz que no están cubiertas por una muestra biológica antes de la permeabilización de la muestra biológica. De esta manera, se evita la extensión de las sondas de captura que no están bajo o cubiertas por la muestra. Esto puede reducir el desperdicio de recursos mediante la prevención de las lecturas de las sondas de captura en áreas adyacentes a la muestra biológica, y también reducir la localización errónea de analitos que pueden aparecer en los vacíos o espacios en la muestra biológica (por ejemplo, las vías respiratorias en muestras biológicas tales como el tejido pulmonar). En otras modalidades, aplicar la desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos después de la síntesis de la segunda cadena, pero antes de la amplificación, puede reducir o eliminar el intercambio de códigos de barras que resulta de sondas de captura que actúan como plantillas de extensión (por ejemplo, cebadores).

Como se usa en la presente descripción “intercambio de códigos de barras” o una “reacción de intercambio de códigos de barras” se refiere a moléculas con código de barras en exceso o adicionales (por ejemplo, sondas de captura que incluyen un código de barras espacial) que funcionan como plantillas de extensión. Como se usa en la presente descripción, las sondas de captura no cubiertas por la muestra biológica pueden funcionar como una plantilla de extensión e introducir un código de barras diferente (por ejemplo, un código de barras espacial) que la molécula plantilla original durante la amplificación tal como la síntesis de la segunda cadena. En algunos ejemplos, el intercambio de códigos de barras puede ocurrir durante la preparación de bibliotecas de secuenciación. El intercambio de códigos de barras y las reacciones de intercambio de códigos de barras se describen adicionalmente en el documento WO 2020/028882.

Las metodologías y composiciones de análisis espacial descritas en la presente descripción pueden proporcionar una gran cantidad de analito y/o datos de expresión para una variedad de analitos dentro de una muestra biológica con alta resolución espacial, mientras se retiene el contexto espacial nativo. Los métodos y composiciones de análisis espacial pueden incluir, por ejemplo, usar una sonda de captura que incluye un código de barras espacial (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la ubicación o posición de un analito dentro de una célula o una muestra de tejido (por ejemplo, una célula de mamífero o una muestra de tejido de mamífero) y un dominio de captura que es capaz de unirse a un analito (por ejemplo, una proteína y/o un ácido nucleico) producido por y/o presente en una célula. Los métodos y composiciones de análisis espacial también pueden incluir usar una sonda de captura que tiene un dominio de captura que captura un agente intermedio para la detección indirecta de un analito. Por ejemplo, el agente intermedio puede incluir una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un código de barras) asociada con el agente intermedio. Por lo tanto, la detección del agente intermedio es indicativa del analito en la muestra de células o tejido.

Los aspectos no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 10,774,374, 10,724,078, 10,480,022, 10,059,990, 10,041,949, 10,002,316, 9,879,313, 9,783,841, 9,727,810, 9,593,365, 8,951,726, 8,604,182, 7,709,198, publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 2020/239946, 2020/080136, 2020/0277663, 2020/024641, 2019/330617, 2019/264268, 2020/256867, 2020/224244, 2019/194709, 2019/161796, 2019/085383, 2019/055594, 2018/216161, 2018/051322, 2018/0245142, 2017/241911, 2017/089811, 2017/067096, 2017/029875, 2017/0016053, 2016/108458, 2015/000854, 2013/171621, WO 2018/091676, WO 2020/176788, Rodriques y otros, Science 363(6434):1463-1467, 2019; Lee y otros, Nat. Protoc. 10(3):442-458, 2015; Trejo y otros, PLoS ONE 14(2):e0212031, 2019; Chen y otros, Science 348(6233):aaa6090, 2015; Gao y otros, BMC Biol. 15:50, 2017; y Gupta y otros, Nature Biotechnol. 36:1197-1202, 2018; la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión genética espacial de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de junio de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de julio de 2020), ambas disponibles en el sitio web de documentación 10x Genomics Support y puede usarse en la presente descripción en cualquier combinación. El documento WO 2020/176788 se dirige a la obtención de perfiles de analitos biológicos con matrices de oligonucleótidos con código de barras espacial. El documento WO 2021/168278 se dirige a métodos para combinar la síntesis de ADNc de primera y segunda cadena para el análisis espacial.

El documento US 2021/158522 se dirige a sistemas y métodos para el análisis espacial de analitos mediante el uso de alineación fiducial. En la presente descripción se describen aspectos adicionales no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial.

Alguna terminología general que puede usarse en esta descripción puede encontrarse en la Sección (I)(b) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663. Típicamente, un “código de barras” es una etiqueta o identificador que transmite o es capaz de transmitir información (por ejemplo, información sobre un analito en una muestra, una perla y/o una sonda de captura). Un código de barras puede ser parte de un analito o independiente de un analito. Un código de barras puede unirse a un analito. Un código de barras particular puede ser único con relación a otros códigos de barras. A los efectos de esta descripción, un “analito” puede incluir cualquier sustancia, estructura, resto o componente biológico a analizar. El término “diana” puede referirse de manera similar a un analito de interés.

Los analitos pueden clasificarse en términos generales en uno de dos grupos: analitos de ácidos nucleicos y analitos no ácidos nucleicos. Los ejemplos de analitos no ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitarse a, lípidos, carbohidratos, péptidos, proteínas, glicoproteínas (unidas a N o unidas a O), lipoproteínas, fosfoproteínas, variantes específicas de proteínas fosforiladas o acetiladas, variantes de amidación de proteínas, variantes de hidroxilación de proteínas, variantes de metilación de proteínas, variantes de ubiquitinación de proteínas, variantes de sulfatación de proteínas, proteínas virales (por ejemplo, cápside viral, envoltura viral, cubierta viral, accesorio viral, glicoproteínas virales, pico viral, etc.), proteínas extracelulares e intracelulares, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) localizarse en ubicación(ones) subcelular(es), incluidas, por ejemplo, orgánulos, por ejemplo, mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, cloroplastos, vesículas endocíticas, vesículas exocíticas, vacuolas, lisosomas, etc. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) ser péptidos o proteínas, incluidos sin limitación, anticuerpos y enzimas. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de analitos en la Sección (I)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. En algunas modalidades, un analito puede detectarse indirectamente, tal como mediante la detección de un agente intermedio, por ejemplo, un producto de ligazón o un agente de captura del analito (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con oligonucleótido), tales como los descritos en la presente descripción.

Una “muestra biológica” se obtiene típicamente del sujeto para su análisis mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, biopsia, cirugía y microscopía de captura láser (LCM), y generalmente incluye células del sujeto. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una sección de tejido. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una muestra biológica fijada y/o teñida (por ejemplo, una sección de tejido fijada y/o teñida). Los ejemplos no limitantes de tinciones incluyen tinciones histológicas (por ejemplo, hematoxilina y/o eosina) y tinciones inmunológicas (por ejemplo, tinciones fluorescentes). En algunas modalidades, pueden obtenerse imágenes de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra biológica fijada y/o teñida). Las muestras biológicas también se describen en la Sección (I)(d) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663.

En algunas modalidades, una muestra biológica se permeabiliza con uno o más reactivos de permeabilización. Por ejemplo, la permeabilización de una muestra biológica puede facilitar la captura del analito. Las condiciones y agentes de permeabilización ilustrativos se describen en la Sección (I)(d)(ii)(13) o la Sección de modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663.

Los métodos de análisis espaciales basados en matrices implican la transferencia de uno o más analitos de una muestra biológica a una matriz de elementos en un sustrato, donde cada elemento está asociado con una ubicación espacial única en la matriz. El análisis subsecuente de los analitos transferidos incluye determinar la identidad de los analitos y la ubicación espacial de los analitos dentro de la muestra biológica. La ubicación espacial de un analito dentro de la muestra biológica se determina basándose en el elemento al que está unido el analito (por ejemplo, directa o indirectamente) en la matriz, y la ubicación espacial relativa del elemento dentro de la matriz.

Una “sonda de captura” se refiere a cualquier molécula capaz de capturar (directa o indirectamente) y/o etiquetar un analito (por ejemplo, un analito de interés) en una muestra biológica. En algunas modalidades, la sonda de captura es un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas modalidades, la sonda de captura incluye un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial y/o un identificador molecular único (UMI)) y un dominio de captura). En algunas modalidades, una sonda de captura puede incluir un dominio de escisión y/o un dominio funcional (por ejemplo, un sitio de unión a cebador, tal como para secuenciación de nueva generación (NGS)). Ver, por ejemplo, la Sección (II)(b) (por ejemplo, las subsecciones (i)-(vi)) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. La generación de sondas de captura puede lograrse mediante cualquier método apropiado, que incluye los descritos en la Sección (II)(d)(ii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.

En algunas modalidades, puede detectarse más de un tipo de analito (por ejemplo, ácidos nucleicos y proteínas) de una muestra biológica (por ejemplo, simultánea o secuencialmente) mediante el uso de cualquier técnica en formato múltiple apropiada, tales como las descritas en la Sección (IV) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.

En algunas modalidades, la detección de uno o más analitos (por ejemplo, analitos proteicos) puede realizarse mediante el uso de uno o más agentes de captura del analito. Como se usa en la presente, un “agente de captura del analito” se refiere a un agente que interactúa con un analito (por ejemplo, un analito en una muestra biológica) y con una sonda de captura (por ejemplo, una sonda de captura unida a un sustrato o una característica) para identificar el analito. En algunas modalidades, el agente de captura del analito incluye: (i) un resto de unión al analito (por ejemplo, que se une a un analito), por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; (ii) código de barras del resto de unión al analito; y (iii) una secuencia de captura del analito. Como se usa en la presente, el término “código de barras del resto de unión al analito” se refiere a un código de barras que está asociado con, o de cualquier otra manera, identifica el resto de unión al analito. Como se usa en la presente, el término “secuencia de captura del analito” se refiere a una región o resto configurado para hibridarse, unirse, acoplarse o interactuar de cualquier otra manera con un dominio de captura de una sonda de captura. En algunos casos, un código de barras del resto de unión al analito (o una porción del mismo) puede eliminarse (por ejemplo, escindirse) del agente de captura del analito. Puede encontrarse una descripción adicional de los agentes de captura del analito en la Sección (II)(b)(ix) del documento WO 2020/176788 y/o en la Sección (M)(b)(viii) de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663.

Existen al menos dos métodos para asociar un código de barras espacial con una o más células vecinas, de manera que el código de barras espacial identifique la una o más células, y/o el contenido de la una o más células, como asociado con una ubicación espacial particular. Un método es promover analitos o sustitutos de analitos (por ejemplo, agentes intermedios) fuera de una célula y hacia una matriz con códigos de barras espaciales (por ejemplo, incluidas sondas de captura con códigos de barras espaciales). Otro método consiste en escindir sondas de captura con códigos de barras espaciales de una matriz y promover las sondas de captura con códigos de barras espaciales hacia y/o dentro o sobre la muestra biológica.

En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para cebar, replicar y, en consecuencia, producir productos de extensión opcionalmente con códigos de barra a partir de una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio (por ejemplo, un producto de ligazón o un agente de captura de analito), o una porción del mismo), o derivados de los mismos (ver, por ejemplo, la Sección (M)(b)(vii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663 con respecto a sondas de captura extendidas). En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para formar productos de ligazón con una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio, o una porción del mismo), para crear de esta manera productos de ligazón que sirven como sustitutos de una plantilla.

Como se usa en la presente, una “sonda de captura extendida” se refiere a una sonda de captura que tiene nucleótidos adicionales incorporados (es decir, añadidos) al extremo terminal (por ejemplo, extremo 3' o 5') de la sonda de captura, para extender de esta manera la longitud total de la sonda de captura. Por ejemplo, un “extremo 3' extendido” indica que se añadieron nucleótidos incorporados adicionales al nucleótido más cerca de 3' de la sonda de captura para extender la longitud de la sonda de captura, por ejemplo, mediante reacciones de polimerización usadas para extender moléculas de ácido nucleico, que incluyen la polimerización con plantilla catalizada por una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa o una transcriptasa inversa). En algunas modalidades, extender la sonda de captura incluye añadir a un extremo 3' de una sonda de captura una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de un analito o agente intermedio unido específicamente al dominio de captura de la sonda de captura. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de transcripción inversa. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de una o más ADN polimerasas. Las sondas de captura extendidas incluyen la secuencia de la sonda de captura y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura.

En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas se amplifican (por ejemplo, en solución a granel o en la matriz) para producir cantidades que son suficientes para el análisis aguas abajo, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas (por ejemplo, moléculas de ADN) actúan como plantillas para una reacción de amplificación (por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa).

Variantes adicionales de métodos de análisis espacial, que incluyen, en algunas modalidades, una etapa de obtención de imágenes, se describen en la Sección (II)(a) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Análisis de analitos capturados (y/o agentes intermedios o porciones de los mismos), por ejemplo, incluyendo extracción de muestras, extensión de sondas de captura, secuenciación (por ejemplo, de una sonda de captura extendida escindida y/o una molécula de ADNc complementaria a una sonda de captura extendida), la secuenciación en la matriz (por ejemplo, mediante el uso de, por ejemplo, enfoques de hibridación in situ o ligazón in situ), análisis temporal y/o captura de proximidad, se describe en la Sección (II)(g) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Algunas mediciones de control de calidad se describen en la Sección (II)(h) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica y/o médica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: la identificación de uno o más biomarcadores (por ejemplo, de diagnóstico, pronóstico y/o para la determinación de la eficacia de un tratamiento) de una enfermedad o trastorno; identificación de un candidato a diana farmacológica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno; identificación (por ejemplo, diagnóstico) de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno; identificación de la etapa y/o pronóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de un sujeto que tiene una mayor posibilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno; seguimiento de la progresión de una enfermedad o trastorno en un sujeto; determinación de la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de una subpoblación de pacientes para la cual un tratamiento es efectivo para una enfermedad o trastorno; modificación de un tratamiento de un sujeto con una enfermedad o trastorno; selección de un sujeto para la participación en un ensayo clínico; y/o selección de un tratamiento para un sujeto con una enfermedad o trastorno.

La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: identificación de perfiles de expresión del transcriptoma y/o proteoma (por ejemplo, en tejido sano y/o enfermo); identificación de múltiples tipos de analitos muy cercanos (por ejemplo, análisis del vecino más cercano); determinación de genes y/o proteínas regulados positivamente y/o negativamente en tejido enfermo; caracterización de microambientes tumorales; caracterización de respuestas inmunitarias tumorales; caracterización de tipos celulares y su colocalización en tejido; e identificación de variantes genéticas dentro de los tejidos (por ejemplo, basadas en los perfiles de expresión de genes y/o proteínas asociados con biomarcadores de enfermedades o trastornos específicos).

Típicamente, para los métodos basados en matrices espaciales, un sustrato funciona como un soporte para la unión directa o indirecta de sondas de captura a elementos de la matriz. Un “elemento” es una entidad que actúa como soporte o repositorio para varias entidades moleculares usadas en el análisis espacial. En algunas modalidades, algunos o todos los elementos de una matriz están funcionalizadas para la captura del analito. Se describen sustratos ilustrativos en la Sección (II)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Pueden encontrarse características y atributos geométricos ilustrativos de una matriz en las Secciones (II)(d)(i), (M)(d)(iii) y (II)(d)(iv) del documento WO 2020/176788 y/ o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.

Generalmente, los analitos y/o agentes intermedios (o porciones de los mismos) pueden capturarse cuando se pone en contacto una muestra biológica con un sustrato que incluye sondas de captura (por ejemplo, un sustrato con sondas de captura incrustadas, manchadas, impresas, fabricadas sobre el sustrato, o un sustrato con elementos (por ejemplo, perlas, pocillos) que comprende sondas de captura). Como se usa en la presente descripción, “contactar”, “contactado” y/o “que entra en contacto”, una muestra biológica con un sustrato se refiere a cualquier contacto (por ejemplo, directo o indirecto) de manera que las sondas de captura pueden interactuar (por ejemplo, unirse covalente o no covalentemente (por ejemplo, hibridar)) con analitos de la muestra biológica. La captura puede lograrse activamente (por ejemplo, mediante el uso de electroforesis) o pasivamente (por ejemplo, mediante el uso de difusión). La captura de analitos se describe con más detalle en la Sección (II)(e) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.

En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la unión y/o introducción de una molécula (por ejemplo, un péptido, un lípido o una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial) a una muestra biológica (por ejemplo, a una célula en una muestra biológica). En algunas modalidades, una pluralidad de moléculas (por ejemplo, una pluralidad de moléculas de ácido nucleico) que tienen una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras espaciales) se introducen en una muestra biológica (por ejemplo, en una pluralidad de células en una muestra biológica) para usar en análisis espacial. En algunas modalidades, después de unir y/o introducir una molécula que tiene un código de barras a una muestra biológica, la muestra biológica puede separarse físicamente (por ejemplo, disociarse) en células individuales o grupos de células para su análisis. Algunos de estos métodos de análisis espacial se describen en la Sección (III) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la detección de múltiples oligonucleótidos que se hibridan con un analito. En algunos casos, por ejemplo, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de ligazón con plantilla de ARN (RTL). Los métodos de RTL se han descrito anteriormente. Ver, por ejemplo, Credley otros, Nucleic Acids Res.21 de agosto de 2017;45(14):e128. Típicamente, RTL incluye la hibridación de dos oligonucleótidos con secuencias adyacentes en un analito (por ejemplo, una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm). En algunos casos, los oligonucleótidos son moléculas de ADN. En algunos casos, uno de los oligonucleótidos incluye al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3' y/o el otro oligonucleótido incluye un nucleótido fosforilado en el extremo 5'. En algunos casos, uno de los dos oligonucleótidos incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(A), una secuencia no homopolimérica). Después de la hibridación con el analito, una ligasa (por ejemplo, la ligasa SplintR) liga los dos oligonucleótidos juntos, creando un producto de ligazón. En algunos casos, los dos oligonucleótidos se hibridan con secuencias que no son adyacentes entre sí. Por ejemplo, la hibridación de los dos oligonucleótidos crea un espacio entre los oligonucleótidos hibridados. En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa) puede extender uno de los oligonucleótidos antes de la ligazón. Después de la ligazón, el producto de ligazón se libera del analito. En algunos casos, el producto de ligazón se libera mediante el uso de una endonucleasa (por ejemplo, ARNasa H). El producto de ligazón liberado puede capturarse a continuación mediante sondas de captura (por ejemplo, en lugar de la captura directa de un analito) en una matriz, opcionalmente amplificarse y secuenciarse, para determinar de este modo la ubicación y opcionalmente la abundancia del analito en la muestra biológica.

Durante el análisis de información espacial, se obtiene información de secuencia para un código de barras espacial asociado con un analito, y la información de secuencia puede usarse para proporcionar información sobre la distribución espacial del analito en la muestra biológica. Pueden usarse varios métodos para obtener la información espacial. En algunas modalidades, sondas de captura específicas y los analitos que capturan están asociados con ubicaciones específicas en una matriz de elementos en un sustrato. Por ejemplo, pueden asociarse códigos de barras espaciales específicos con ubicaciones de matriz específicas antes de la fabricación de la matriz, y las secuencias de los códigos de barras espaciales pueden almacenarse (por ejemplo, en una base de datos) junto con información de ubicación de matriz específica, de modo que cada código de barras espacial se asigne de forma única a una ubicación particular de la matriz.

Alternativamente, pueden depositarse códigos de barras espaciales específicos en ubicaciones predeterminadas en una matriz de elementos durante la fabricación, de manera que en cada ubicación, solo esté presente un tipo de código de barras espacial, de modo que los códigos de barras espaciales estén asociados de forma única con un único elemento de la matriz. Cuando sea necesario, las matrices pueden decodificarse mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción de modo que los códigos de barras espaciales se asocien de forma única con las ubicaciones de los elementos de la matriz, y este mapeo puede almacenarse como se describió anteriormente.

Cuando se obtiene información de secuencia para sondas y/o analitos de captura durante el análisis de la información espacial, las ubicaciones de las sondas de captura y/o analitos pueden determinarse al hacer referencia a la información almacenada que asocia de forma única cada código de barras espacial con una ubicación de elementos de la matriz. De esta manera, las sondas de captura específicas y los analitos capturados se asocian con ubicaciones específicas en la matriz de elementos. Cada ubicación de elemento de matriz representa una posición con relación a un punto de referencia de coordenadas (por ejemplo, una ubicación de matriz, un marcador fiducial) para la matriz. En consecuencia, cada ubicación de elemento tiene una “dirección” o ubicación en el espacio de coordenadas de la matriz.

Algunos flujos de trabajo ilustrativos de análisis espacial se describen en la sección modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663. Ver, por ejemplo, la modalidad ilustrativa que comienza con “En algunos ejemplos no limitantes de los flujos de trabajo descritos en la presente descripción, la muestra puede sumergirse...” del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Ver también, por ejemplo, la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión genética espacial de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de junio de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de julio de 2020).

En algunas modalidades, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de hardware y/o software dedicado, tal como cualquiera de los sistemas descritos en las Secciones (M)(e)(ii) y/o (V) de los documentos WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663, o cualquiera de uno o más de los dispositivos o métodos descritos en las secciones Control Slide for Imaging, Methods of Using Control Slides and Substrates for Systems of Using Control Slides and Substrates for Imaging, y/o Sample and Array Alignment Devices and Methods, Informational labels del documento WO 2020/123320.

Los sistemas adecuados para realizar análisis espacial pueden incluir componentes tales como una cámara (por ejemplo, una celda de flujo o una cámara que pueda sellarse, hermética) para contener una muestra biológica. La muestra biológica puede montarse, por ejemplo, en un soporte para muestras biológicas. Pueden conectarse una o más cámaras de fluido a la cámara y/o al soporte para muestras a través de conductos de fluido, y los fluidos pueden suministrarse a la cámara y/o al soporte para muestras a través de bombas fluídicas, fuentes de vacío u otros dispositivos acoplados a los conductos de fluido que crean un gradiente de presión para impulsar el flujo de fluido. También puede conectarse una o más válvulas a conductos de fluido para regular el flujo de reactivos desde los depósitos hasta la cámara y/o el soporte para muestras.

Los sistemas pueden incluir opcionalmente una unidad de control que incluye uno o más procesadores electrónicos, una interfaz de entrada, una interfaz de salida (tal como una pantalla) y una unidad de almacenamiento (por ejemplo, un medio de almacenamiento de estado sólido tal como, pero sin limitarse a, un medio de almacenamiento magnético, óptico u otro de estado sólido, persistente, grabable y/o regrabable). Opcionalmente, la unidad de control puede conectarse a uno o más dispositivos remotos a través de una red. La unidad de control (y componentes de la misma) generalmente puede realizar cualquiera de las etapas y funciones descritas en la presente descripción. Cuando el sistema está conectado a un dispositivo remoto, el dispositivo (o dispositivos) remotos puede realizar cualquiera de las etapas o características descritas en la presente descripción. Los sistemas pueden incluir opcionalmente uno o más detectores (por ejemplo, CCD, CMOS) usados para capturar imágenes. Los sistemas también pueden incluir opcionalmente una o más fuentes de luz (por ejemplo, basadas en LED, basadas en diodos, láseres) para iluminar una muestra, un sustrato con elementos, analitos de una muestra biológica capturada en un sustrato y diversos medios de control y calibración.

Los sistemas pueden incluir opcionalmente instrucciones de software codificadas y/o implementadas en uno o más medios de almacenamiento tangibles y componentes de hardware tales como circuitos integrados de aplicaciones específicas. Las instrucciones de software, cuando son ejecutadas por una unidad de control (y en particular, un procesador electrónico) o un circuito integrado, pueden hacer que la unidad de control, circuito integrado u otro componente que ejecuta las instrucciones de software realice cualquiera de las etapas o funciones del método descritos en la presente descripción.

En algunos casos, los sistemas descritos en la presente descripción pueden detectar (por ejemplo, registrar una imagen) la muestra biológica en la matriz. En la solicitud PCT núm. 2020/061064 se describen métodos ilustrativos para detectar la muestra biológica en una matriz.

Antes de transferir analitos desde la muestra biológica hasta la matriz de elementos en el sustrato, la muestra biológica puede alinearse con la matriz. La alineación de una muestra biológica y una matriz de elementos que incluyen sondas de captura pueden facilitar el análisis espacial, que puede usarse para detectar diferencias en la presencia y/o nivel de analito dentro de diferentes posiciones en la muestra biológica, por ejemplo, para generar un mapa tridimensional de la presencia y/o nivel del analito. En la solicitud PCT núm. 2020/053655 se describen métodos ilustrativos para generar un mapa bi- y/o tridimensional de la presencia y/o nivel de analito, y los métodos de análisis espacial se describen generalmente en el documento W o 2020/061108.

En algunos casos, un mapa de presencia y/o nivel de analito puede alinearse con una imagen de una muestra biológica mediante el uso de uno o más marcadores fiduciales, por ejemplo, objetos colocados en el campo de visión de un sistema de obtención de imágenes que aparecen en la imagen producida, como se describe en la sección Substrate Attributes, Control Slide for Imaging del documento WO 2020/123320, solicitud PCT núm.

2020/061066. Los marcadores fiduciales pueden usarse como punto de referencia o escala de medición para la alineación (por ejemplo, para alinear una muestra y una matriz, para alinear dos sustratos, para determinar la ubicación de una muestra o matriz en un sustrato con relación a un marcador fiducial) y/o para mediciones cuantitativas de tamaños y/o distancias.

Métodos para reducir la captura de ácidos nucleicos diana no deseados o sustitutos de los mismos en una matriz

Las matrices espaciales proporcionan a los investigadores las herramientas para identificar la expresión genética, las ubicaciones de las proteínas y/u otra actividad celular de manera espacial. Los beneficios de correlacionar las relaciones biológicas espaciales con enfermedades y trastornos hacen, y seguirán haciendo avanzar muchos campos del estudio científico. Sin embargo, las mejoras en la resolución de las relaciones espaciales entre las activaciones celulares y las enfermedades y trastornos mejorarían esos datos. Por ejemplo, cuando una muestra biológica (por ejemplo, una sección de tejido) colocada en una matriz espacial se permeabiliza para liberar ácidos nucleico diana, algunos de los ácidos nucleicos de la muestra biológica pueden, mediante difusión, moverse hacia áreas de la matriz donde no hay muestra biológica (por ejemplo, sección de tejido), por ejemplo adyacente a o no cubierta por la muestra biológica, donde puede ocurrir la captura de analitos de ácidos nucleicos no deseados. Este tipo de captura de ácidos nucleicos no deseados o sustitutos de los mismos puede disminuir la resolución de los datos espaciales deseados. Además, la captura de ácidos nucleicos no deseados puede provocar ineficiencias de secuenciación aguas abajo; una disminución en la cantidad de secuenciación de ácido nucleico diana debido a que la secuenciación de ácidos nucleicos capturados no deseados o sustitutos de los mismos es ineficiente y costosa en reactivos. La presente descripción proporciona soluciones para mejorar y/o evitar la captura de ácidos nucleicos no deseados en una matriz en áreas adyacentes a y/o no cubiertas por la muestra biológica.

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra una sonda de captura ilustrativa, como se describe en la presente descripción. Como se muestra, la sonda de captura 102 está opcionalmente acoplada a un elemento 101 por un dominio de escisión 103, tal como un enlazador disulfuro. La sonda de captura puede incluir una secuencia funcional 104 que sea útil para su procesamiento subsecuente. La secuencia funcional 104 puede incluir toda o una parte de la secuencia de unión de células de flujo específica del secuenciador (por ejemplo, una secuencia P5 o P7), toda o una parte de una secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, un sitio de unión al cebador R1, un sitio de unión al cebador R2), o sus combinaciones. La sonda de captura también puede incluir un código de barras espacial 105. La sonda de captura también puede incluir una secuencia de identificador molecular único (UMI) 106. Mientras que la Figura 1 muestra el código de barras espacial 105 como ubicado aguas arriba (5') de la secuencia UMI 106, debe entenderse que las sondas de captura en donde la secuencia UMI 106 está ubicada aguas arriba (5') del código de barras espacial 105 también son adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 107 para facilitar la captura de un analito diana. En algunas modalidades, la sonda de captura comprende una o más secuencias funcionales adicionales que pueden ubicarse, por ejemplo entre el código de barras espacial 105 y la secuencia UMI 106, entre la secuencia UMI 106 y el dominio de captura 107, o después del dominio de captura 107. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de un analito de ácido nucleico. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una sonda conectada descrita en la presente descripción. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de control de captura presente en un agente de captura del analito. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a un oligonucleótido de férula. Tal oligonucleótido de férula, además de tener una secuencia complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura, puede tener una secuencia de un analito de ácido nucleico, una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada descrita y/o una secuencia de control de captura descrita en la presente descripción.

Las secuencias funcionales generalmente pueden seleccionarse para compatibilidad con cualquiera de una variedad de sistemas de secuenciación diferentes, por ejemplo, Ion Torrent Proton o PGM, instrumentos de secuenciación Illumina, PacBio, Oxford Nanopore, etc., y los requisitos de los mismos. En algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para compatibilidad con sistemas de secuenciación no comercializados. Ejemplos de tales sistemas y técnicas de secuenciación, para los cuales pueden usarse secuencias funcionales adecuadas, incluyen (pero no se limitan a) secuenciación Ion Torrent Proton o PGM, secuenciación Illumina, secuenciación PacBio SMRT y secuenciación Oxford Nanopore. Además, en algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para que sean compatibles con otros sistemas de secuenciación, incluidos sistemas de secuenciación no comercializados.

En algunas modalidades, el código de barras espacial 105 y secuencias funcionales 104 es común a todas las sondas unidas a un elemento determinado. En algunas modalidades, la secuencia UMI 106 de una sonda de captura unida a un elemento dado es diferente de la secuencia UMI de una sonda de captura diferente unida al elemento dado.

Los métodos en la presente descripción describen el bloqueo de un dominio de captura de una o más sondas de captura mediante el uso de desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) y uno o más didesoxinucleótidos. La TdT puede transferir uno o más didesoxinucleótidos al extremo hidroxilo 3' del dominio de captura de una sonda de captura lo que evita reacciones de ligazón o extensión por polimerasa (por ejemplo, reacciones de transcripción inversa).

En algunas modalidades, los métodos en la presente descripción describen el bloqueo de un dominio de captura de una o más sondas de captura mediante la aplicación de TdT y uno o más didesoxinucleótidos a la matriz antes de la permeabilización de la muestra biológica. Esto puede evitar la extensión del dominio de captura mediante transcripción inversa de una o más sondas de captura que no están cubiertas por la muestra biológica (por ejemplo, en áreas no cubiertas por la muestra biológica). El bloqueo del dominio de captura puede conservar recursos, reducir las lecturas de secuenciación desperdiciadas y reducir la localización errónea de transcritos que aparecen en los vacíos o espacios o desgarros del tejido (por ejemplo, las vías respiratorias que pueden encontrarse en las secciones de tejido pulmonar).

En la presente descripción se proporcionan métodos para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz; (b) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura; (c) eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz; (d) permeabilizar la muestra biológica, de manera que el dominio de captura de la primera sonda de captura se hibrida con el ácido nucleico diana de la muestra biológica; y (e) determinar (i) una secuencia correspondiente al código de barras espacial de la primera sonda de captura, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia correspondiente al ácido nucleico diana, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

En la presente descripción también se proporcionan métodos que no forman parte de la invención para bloquear sondas de captura no cubiertas por una muestra biológica, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz; y (b) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura en la segunda área.

En algunas modalidades, una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se aplica a la matriz para evitar el intercambio de códigos de barras que puede resultar de sondas de captura que actúan como plantillas de extensión. Por ejemplo, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos puede aplicarse a la matriz después de extender un extremo 3' de la primera sonda de captura y/o después de generar una segunda cadena de ácido nucleico complementaria al ADNc.

En algunas modalidades, una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se aplica a una muestra biológica en una matriz y se elimina antes de la permeabilización del tejido.

En la presente descripción también se proporcionan métodos para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz, donde el dominio de captura de la primera sonda de captura se hibrida con un producto de ligazón; (b) extender el producto de ligazón hacia el extremo 5' de la primera sonda de captura mediante el uso de la primera sonda de captura como una plantilla; (c) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura; (d) eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz; y (e) determinar (i) una secuencia correspondiente al código de barras espacial de la primera sonda de captura, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia correspondiente al producto de ligazón, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

En la presente descripción también se proporcionan métodos que no forman parte de la invención para bloquear sondas de captura para disminuir el intercambio de códigos de barras y/o disminuir el uso de sondas de captura como plantillas de extensión, el método incluye: (a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, donde: una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura se incluye en la primera área de la matriz; y una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz, donde el dominio de captura de la primera sonda de captura se hibrida con un producto de ligazón; (b) extender el producto de ligazón hacia el extremo 5' de la primera sonda de captura mediante el uso de la primera sonda de captura como una plantilla; y (c) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de la segunda sonda de captura.

La muestra biológica puede ser cualquiera de las muestras biológicas descritas en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de tejido. En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de tejido recién congelada. En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de tejido fijada (por ejemplo, fijada por cualquiera de los fijadores descritos en la presente descripción). En algunas modalidades, la muestra biológica es una sección de tejido. En algunas modalidades, la sección de tejido es una sección de tejido recién congelada. En algunas modalidades, la sección de tejido es una sección de tejido fijada (por ejemplo, fijada por cualquiera de los fijadores descritos en la presente descripción). En otras modalidades, la muestra biológica es una muestra clínica (por ejemplo, sangre total, células sanguíneas, tejido en cultivo, células en cultivo o una suspensión celular). En algunas modalidades, la muestra biológica es un organoide, células madre embrionarias, células madre pluripotentes o cualquiera de sus combinaciones. Los ejemplos no limitantes de un organoide incluyen un organoide cerebral, un organoide intestinal, un organoide estomacal, un organoide lingual, un organoide tiroideo, un organoide tímico, un organoide testicular, un organoide hepático, un organoide pancreático, un organoide epitelial, un organoide pulmonar, un organoide renal, un gastruloide, un organoide cardiaco, un organoide retiniano o cualquiera de sus combinaciones. En otras modalidades ilustrativas, la muestra biológica puede incluir células enfermas, células fetales, células inmunitarias, macromoléculas celulares, orgánulos, polinucleótidos extracelulares o cualquiera de sus combinaciones.

Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico diana incluyen analitos de ADN tales como ADN genómico, ADN metilado, secuencias de ADN metilado específicas,<a>D<n>fragmentado, ADN mitocondrial, productos de PCR sintetizados in situ y ADN viral.

Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico diana incluyen además analitos de ARN tales como diversos tipos de ARN codificante y no codificante. Los ejemplos de los diferentes tipos de analitos de ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), A<r>N de transferencia (ARNt), microARN (miARN) y ARN viral. El ARN puede ser un transcrito (por ejemplo, presente en una sección de tejido). El ARN puede ser pequeño (por ejemplo, menor que 200 bases de ácido nucleico de longitud) o grande (por ejemplo, ARN mayor que 200 bases de ácido nucleico de longitud). Los ARN pequeños incluyen principalmente ARN ribosómico (ARNr) 5.8S, ARNr 5S, ARN de transferencia (ARNt), microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN nucleolar pequeño (ARNnp), ARN de interacción Piwi (ARNp), ARN derivado de ARNt pequeño (ARNatp) y ARN derivado de ADNr pequeño (ARNarp). El ARN puede ser ARN bicatenario o ARN monocatenario. El ARN puede ser ARN circular. El ARN puede ser un ARNr bacteriano (por ejemplo, ARNr 16s o ARNr 23s). El ARN puede ser de un virus de ARN, por ejemplo, virus de ARN del Grupo III, IV o V del sistema de clasificación Baltimore. El ARN puede ser de un retrovirus, tal como un virus del Grupo VI del sistema de clasificación Baltimore.

En algunas modalidades, el ácido nucleico diana puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 mutaciones que provocan enfermedades (por ejemplo, mutaciones que provocan cáncer). En algunas modalidades, el ácido nucleico diana incluye un polimorfismo de un solo nucleótido, amplificación génica o translocación, eliminación o inserción cromosómica.

El método de la invención incluye eliminar la solución residual (por ejemplo, lavar la matriz mediante el uso de cualquiera de los métodos para eliminar soluciones descritos en la presente descripción) de la muestra biológica antes de la permeabilización. En algunas modalidades, la muestra biológica puede fijarse (por ejemplo, la muestra biológica puede fijarse mediante el uso de cualquiera de las técnicas descritas en la presente descripción o conocidas en la técnica). En algunas modalidades, la fijación de la muestra biológica incluye el uso de un fijador tal como etanol, metanol, acetona, formaldehído, formalina, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído o cualquiera de sus combinaciones. En algunas modalidades, una muestra biológica fijada es una muestra de tejido fijada con formalina e incrustada en parafina. En algunas modalidades, una muestra biológica fijada es una sección de tejido fijada con formalina e incrustada en parafina. En algunas modalidades, la muestra biológica puede fijarse (por ejemplo, después de la etapa (a) o entre las etapas (a) y (b), la muestra biológica puede fijarse mediante el uso de cualquiera de las técnicas descritas en la presente descripción o conocidas en la técnica).

En algunas modalidades, la muestra biológica puede teñirse y/o se pueden obtener imágenes de esta mediante el uso de cualquiera de las técnicas descritas en la presente descripción o conocidas en la técnica (por ejemplo, la muestra biológica puede teñirse y/o se pueden obtener imágenes de esta después de la etapa (a), o entre las etapas (a) y (b)). En algunas modalidades, la tinción incluye etiquetas ópticas como se describe en la presente descripción, que incluyen, pero sin limitarse a, etiquetas detectables fluorescentes (por ejemplo, fluoróforos), radioactivas (por ejemplo, radioisótopos), quimioluminiscentes (por ejemplo, un compuesto quimioluminiscente), un compuesto bioluminiscente, calorimétricas o colorimétricas. En algunas modalidades, la tinción incluye un anticuerpo fluorescente dirigido a un analito diana (por ejemplo, proteínas de superficie celular o intracelulares) en la muestra biológica. En algunas modalidades, la tinción incluye una tinción inmunohistoquímica dirigida a un analito diana (por ejemplo, proteínas de superficie celular o intracelulares) en la muestra biológica. En algunas modalidades, la tinción incluye una tinción química, tal como hematoxilina y eosina (H&E) o ácido peryódico-Schiff (PAS). En algunas modalidades, la tinción de la muestra biológica incluye el uso de una tinción biológica que incluye, pero sin limitarse a, naranja de acridina, marrón Bismarck, carmín, azul Coomassie, violeta de cresilo, DAPI, eosina, bromuro de etidio, fucsina ácida, hematoxilina, tinciones Hoechst, yodo, verde de metilo, azul de metileno, rojo neutro, azul Nilo, rojo Nilo, tetróxido de osmio, yoduro de propidio, rodamina, safranina o cualquiera de sus combinaciones. En algunas modalidades, puede transcurrir un tiempo significativo (por ejemplo, días, meses o años) entre la tinción y/o la obtención de imágenes de la muestra biológica.

En algunas modalidades, la determinación incluye extender un extremo 3' de la sonda de captura de la primera área de la matriz mediante el uso del ácido nucleico diana como una plantilla. En algunas modalidades, la determinación incluye la secuenciación (i) del código de barras espacial de la primera sonda de captura de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) todo o una porción del ácido nucleico diana, o un complemento del mismo. En algunas modalidades, la determinación incluye la secuenciación (i) del código de barras espacial de la primera sonda de captura de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) todo o una porción de un producto de ligazón o un complemento del mismo.

En algunas modalidades, la permeabilización de la muestra biológica incluye poner en contacto la muestra biológica con un agente de permeabilización. En algunas modalidades, el agente de permeabilización incluye el uso de un solvente orgánico, un detergente, una enzima o sus combinaciones. El agente de permeabilización puede incluir: una endopeptidasa, una proteasa dodecilsulfato de sodio (SDS), terc-octilfeniléter de polietilenglicol, polisorbato 80 y polisorbato 20, solución salina de N-lauroilsarcosina sódica, saponina, Triton X-100™ y Tween-20™. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina o proteinasa K.

En algunas modalidades, se obtienen imágenes de la muestra biológica antes de la permeabilización.

Primera y segunda áreas

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, una matriz puede tener una primera área sobre la cual se dispone una muestra biológica y una segunda área que es adyacente a (por ejemplo, no cubierta por) la muestra biológica. Por ejemplo, algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluyen disponer una muestra biológica sobre una matriz (por ejemplo, cualquiera de las matrices ilustrativas descritas en la presente descripción), donde la matriz tiene una primera área cubierta por la muestra biológica y una segunda área no cubierta por la muestra biológica.

En algunos ejemplos, la primera área puede representar una porción de la matriz que está cubierta por la muestra biológica, por ejemplo, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 10 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 55 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 45 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 35 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 15% aaproximadamente 95%de aproximadamente 15 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente15 % aaproximadamente 85 % de aproximadamente 15 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 15 % a aproximadamente 65 % de aproximadamente 15 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 55 % de aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 45 % de aproximadamente 15 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 35 % de aproximadamente 15 % a aproximadamente 30 %, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 % de aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 99 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 20 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 55 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 45 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 35 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % de aproximadamente 20 % a aproximadamente 25 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 99 % de aproximadamente 25 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 90 % de aproximadamente 25 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 80 % de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 25 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 % de aproximadamente 25 % a aproximadamente 55 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 50 % de aproximadamente 25 % a aproximadamente 45 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 % de aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 30 % de aproximadamente 30 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 95 % de aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 85 % de aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 30 % a aproximadamente 65 % de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 55 % de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 45 % de aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 35 % de aproximadamente 35 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 95 % de aproximadamente 35 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 85 % de aproximadamente 35 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 35 % a aproximadamente 65 % de aproximadamente 35 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 55 % de aproximadamente 35 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 45 % de aproximadamente 35 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 99 % de aproximadamente 40 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 % de aproximadamente 40 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 % de aproximadamente 40 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 40 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 % de aproximadamente 40 % a aproximadamente 55 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 % de aproximadamente 40 % a aproximadamente 45 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 99 % de aproximadamente 45 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 90 % de aproximadamente 45 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 80 % de aproximadamente 45 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 45 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 % de aproximadamente 45 % a aproximadamente 55 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 50 % de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 95 % de aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 85 % de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 50 % a aproximadamente 65 % de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 55 % de aproximadamente 55 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 95 % de aproximadamente 55 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 85 % de aproximadamente 55 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 55 % a aproximadamente 65 % de aproximadamente 55 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 99 % de aproximadamente 60 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 % de aproximadamente 60 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 % de aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente a 60 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 99 % de aproximadamente 65 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 90 % de aproximadamente 65 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 80 % de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 70 % de aproximadamente 70 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 70% aaproximadamente 95 %, de aproximadamente 70% aaproximadamente 90 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95%, o aproximadamente 95 % a aproximadamente 99 %, del área total de la matriz cubierta por la muestra biológica.

La segunda área representa una porción de la matriz que no está cubierta por la muestra biológica.

Solución de desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos

La solución de desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos puede incluir un tampón. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,5 mM de los didesoxinucleótidos a aproximadamente 25 mM de los didesoxinucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 24,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 24 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 23,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 23 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 22,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 22 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 21,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 21 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 20,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 20 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 19,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 19 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 18,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 18 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 17,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 17 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 16,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 16 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 15,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 15 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 14,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 14 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 13,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 13 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 12,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 12 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 11,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 11 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 9,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 9 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 8,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 8 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 7,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 7 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 6,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 6 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 5,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 4,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 4 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 3,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 3 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,5 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM o aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1 mM). En algunas modalidades, el tampón es un tampón de reacción. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,02 mM a aproximadamente 2,0 mM de los didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 1 mM de los didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es ddATP y/o ddTTP. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es ddCTP y/o ddGTP. En algunas modalidades, los didesoxinucleótidos incluyen una mezcla de ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP.

En algunas modalidades, la solución de desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos puede incluir CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM de CoCh a aproximadamente 2 mM de CoCh, (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1,8 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1,6 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1,4 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1,2 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1,0 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,8 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,6 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,4 mM, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,2 mM). En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,25 mM de CoCh. La enzima TdT también puede utilizar otros cofactores catiónicos divalentes tales como Mg+2, Mn+2y Zn+2 (por ejemplo, sales de los cationes divalentes). Un experto en la técnica comprenderá que la velocidad de la actividad enzimática de TdT puede depender de uno o ambos del nucleótido y/o el cofactor que se usan en la reacción.

Contacto de la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos

En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se añade automáticamente (por ejemplo, mediante un dispositivo por ejemplo, un robot) o manualmente (por ejemplo, con pipeta) a la segunda área de la matriz. En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se añade gota a gota mediante una pipeta. En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se añade para ponerla en contacto con toda o una porción de la segunda área de la matriz. En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se añade a toda o una porción de una superficie de la muestra biológica que no se orienta ni se pone en contacto con la matriz. En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se añade a toda la matriz.

En algunas modalidades, la solución se añade verticalmente por encima de la segunda área de la matriz. En algunas modalidades, la solución está presente en forma líquida, de manera que la segunda área está cubierta por la solución.

En algunas modalidades, la segunda área de la matriz puede ponerse en contacto con la solución durante, por ejemplo, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 90 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 80 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 70 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 60 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 50 minutos o de aproximadamente 50 minutos a aproximadamente 1 hora. En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza durante aproximadamente 60 minutos.

En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 15 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 10 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 4 aproximadamente 10 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 3 aproximadamente 10 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 2 aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 1 aproximadamente 15 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 4 aproximadamente 15 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 3 aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 2 aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 4 aproximadamente 20 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 3 aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 4 aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 45 °C. En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C. En algunas modalidades, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de aproximadamente 37 °C.

Eliminación de la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos de la segunda área de la matriz

En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se elimina con pipeta. En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se elimina por capilaridad (por ejemplo, con un papel absorbente). En algunas modalidades, la solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos se elimina mediante lavado (por ejemplo, mediante el uso de un tampón de lavado). En algunas modalidades, puede añadirse un tampón de lavado para ponerlo en contacto con la primera y/o la segunda área de la matriz luego eliminarse con pipeta, capilaridad u otros métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, puede usarse una combinación de métodos de eliminación.

En algunas modalidades, las etapas de contacto y eliminación pueden repetirse (por ejemplo, al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces o más). En algunas modalidades, se puede realizar una etapa de secado después del lavado (por ejemplo, secado al aire).

En algunas modalidades, el tampón de lavado se añade automáticamente (por ejemplo, por un robot) o manualmente (por ejemplo, con pipeta). En algunas modalidades, el tampón de lavado se añade verticalmente por encima de la matriz. En algunas modalidades, el tampón de lavado se añade verticalmente por encima de la segunda área de la matriz. En algunas modalidades, el tampón de lavado se añade gota a gota mediante una pipeta. En algunas modalidades, el tampón de lavado se añade para ponerlo en contacto con toda o una porción de la segunda área de la matriz. En algunas modalidades, el tampón de lavado se añade a toda o una porción de una superficie de la muestra biológica que no se orienta ni se pone en contacto con la matriz. En algunas modalidades, se añade un tampón de lavado a toda la matriz que incluye la primera y la segunda área. En algunas modalidades, el tampón de lavado es tampón TE 1X, tampón TAE 1X, tampón TBE 1X, citrato salino sódico o PBS. En algunas modalidades, el tampón de lavado contiene un tampón (por ejemplo, Tris, MOPS, HEPES, MES o cualquier otro tampón conocido en la técnica), agentes quelantes (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) y/o iones metálicos (por ejemplo, Mg2+). En algunas modalidades, el tampón de lavado puede tener un pH que es aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9,0, aproximadamente 9,5, o aproximadamente 10,0, o de aproximadamente 5,0 a 5,5, de aproximadamente 5,5 a 6,0, de aproximadamente 6,0 a 6,5, de aproximadamente 6,5 a 7,0, de aproximadamente 7,0 a 7,5, de aproximadamente 7,5 a 8,0, de aproximadamente 8,0 a 8,5, de aproximadamente 8,5 a 9,0, de aproximadamente 9,0 a 9,5, o de aproximadamente 9,5 a 10,0.

En algunas modalidades, la segunda área de la matriz se pone en contacto con el tampón de lavado durante de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 1 minuto, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 30 segundos, de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 10 segundos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 30 segundos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 50 minutos, o de aproximadamente 50 minutos a aproximadamente 1 hora, a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 15 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 10 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 15 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 20 ° a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C, o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C.

Kits

En la presente descripción también se proporcionan kits que incluyen una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal; uno o más didesoxinucleótidos, un sustrato (por ejemplo, una matriz) que incluye una pluralidad de sondas de captura, donde las sondas de captura incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura; e instrucciones para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.

En algunas modalidades, el kit puede incluir uno o más fijadores (por ejemplo, cualquiera de los fijadores descritos en la presente descripción) para fijar la muestra biológica y/o conservar la estructura de la muestra biológica. Los ejemplos no limitantes de un fijador incluyen etanol, metanol, acetona, formaldehído (por ejemplo, formaldehído al 2 %), formalina, paraformaldehído-Tritón, glutaraldehído, o cualquiera de sus combinaciones.

En algunas modalidades, el kit incluye aproximadamente 0,5 mM de los didesoxinucleótidos a aproximadamente 25 mM de los didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es ddATP. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es ddTTP. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es ddGTP. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es ddCTP. En algunas modalidades, el didesoxinucleótido es una mezcla de ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,5 mM del didesoxinucleótido a aproximadamente 1,5 mM del didesoxinucleótido. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 1 mM del didesoxinucleótido.

En algunas modalidades, la solución incluye CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM de CoCh a aproximadamente 2 mM de CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,25 mM de CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2 mM de MgCh.

En algunas modalidades, la solución incluye un tampón. En algunas modalidades, el kit incluye un tampón de lavado que incluye uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado es solución salina tamponada con fosfato.

Composiciones

La presente descripción también presenta composiciones para bloquear sondas de captura en un área (por ejemplo, una segunda área) de una matriz no cubierta por una muestra biológica. Por lo tanto, en la presente descripción se proporcionan composiciones que incluyen una muestra biológica dispuesta en una matriz en una primera área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura está comprendida en la primera área de la matriz; donde una segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz; y una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos dispuestos en la segunda área de la matriz.

En la presente descripción también se proporcionan composiciones que incluyen una muestra biológica dispuesta en una matriz en una primera área, donde la primera área incluye una pluralidad de sondas de captura, donde una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la primera sonda de captura está comprendida en la primera área de la matriz; una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos en una segunda área de la matriz; la segunda área de la matriz que incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz y la segunda sonda de captura en la segunda área se extiende con uno o más didesoxinucleótidos.

En la presente descripción también se proporcionan composiciones que incluyen una matriz que incluye una primera área y una segunda área, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura distribuidas a través de la primera y segunda áreas, donde la primera área incluye una primera sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura; una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos dispuestos en la segunda área de la matriz; donde la segunda área de la matriz incluye una segunda sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda sonda de captura se extiende con uno o más didesoxinucleótidos. En algunas modalidades de esta composición, la primera sonda de captura se hibrida con un ácido nucleico diana de una muestra biológica o un sustituto del mismo (por ejemplo, un producto de ligazón). En algunas modalidades de esta composición, la primera sonda de captura se extiende (por ejemplo, por ligazón o transcripción inversa) para incluir además el complemento inverso de un ácido nucleico diana de una muestra biológica o un sustituto del mismo (por ejemplo, un producto de ligazón).

En algunas modalidades, la composición incluye un tampón de lavado. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye uno o más de un solvente, un ácido, una base y un tampón. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye solución salina tamponada con fosfato. En algunas modalidades, el tampón de lavado incluye citrato de sodio salino.

En algunas modalidades, la pluralidad de sondas de captura incluye uno o más dominios funcionales, un dominio de escisión, un identificador molecular único o una de sus combinaciones.

En algunas modalidades, la composición incluye un solvente orgánico, un detergente, una enzima o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, la composición incluye un agente de permeabilización tal como, pero sin limitarse a, una endopeptidasa, una proteasa, dodecilsulfato de sodio, terc-octilfeniléter de polietilenglicol, polisorbato 80 y polisorbato 20, solución salina de N-lauroilsarcosina sódica, saponina, Triton X-100™ y Tween-20™. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina. En algunas modalidades, la endopeptidasa es proteinasa K.

En algunas modalidades, la composición incluye uno o más fijadores. En algunas composiciones, el fijador incluye etanol, metanol, acetona, formaldehído, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, la composición incluye una o más tinciones. En algunas modalidades, la composición incluye una tinción de hematoxilina y/o eosina. En algunas modalidades, la tinción incluye una o más de una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente o una de sus combinaciones.

En algunas modalidades, los didesoxinucleótidos incluyen ddATP. En algunas modalidades, los didesoxinucleótidos incluyen ddTTP. En algunas modalidades, los didesoxinucleótidos incluyen ddGTP. En algunas modalidades, los didesoxinucleótidos incluyen ddCTP. En algunas modalidades, los didesoxinucleótidos incluyen una mezcla de ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,5 mM de los didesoxinucleótidos a aproximadamente 25 mM de los didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,5 mM de los didesoxinucleótidos a aproximadamente 1,5 mM de los didesoxinucleótidos. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 1 mM de los didesoxinucleótidos.

En algunas modalidades, la solución incluye CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM de CoCh a aproximadamente 2 mM de CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye aproximadamente 0,25 mM de CoCh. En algunas modalidades, la solución incluye de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2 mM de MgCh.

En algunas modalidades, una sonda de captura de la primera área se hibrida con un ácido nucleico diana. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es ADN. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es ARN. En algunas modalidades, el ARN es ARNm.

En algunas modalidades, una sonda de captura de la primera área se hibrida con un producto de ligazón (por ejemplo, un producto de ligazón como se describe en la presente descripción). En algunas modalidades, el producto de ligazón incluye una secuencia de captura del analito. En algunas modalidades, la sonda de captura se hibrida con la secuencia de captura del analito del producto de ligazón.

Ejemplos

Ejemplo 1: Un método para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica.

La Figura 2 es un diagrama de flujo de trabajo ilustrativo 230 de un método para bloquear las sondas de captura no cubiertas por una muestra biológica en una matriz espacial y determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica. En 232 el método ilustrativo incluye disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área de la matriz, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura colectivamente a través de la primera área y una segunda área. En la primera área, una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura. La segunda área es adyacente a la primera área. Por ejemplo, la segunda área es un área de la matriz no cubierta por la muestra biológica. La segunda área de la matriz también incluye una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área es adyacente a la muestra biológica dispuesta en la matriz (por ejemplo, no cubierta por la muestra biológica).

Para bloquear las sondas de captura en la segunda área de la matriz, se aplica una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos a la segunda área de la matriz. En 234, el método ilustrativo 230 describe poner en contacto la matriz (por ejemplo, la segunda área de la matriz) con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan en el dominio de captura de las sondas de captura en la segunda área. Por ejemplo, una solución ilustrativa que incluye 1,5 pl de ddATP 1 mM, 7,5 pl de CoCh a 0,25 mM, 7,5 |jl de tampón de reacción de la desoxinucleotidiltransferasa terminal 10X, agua y 6 pl de desoxinucleotidiltransferasa terminal a 1 U/pl de desoxinucleotidiltransferasa terminal (NEB) se añade a una matriz y la matriz se incuba a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos. Sin embargo, se entiende que también pueden utilizarse otros desoxinucleótidos y cofactores catiónicos divalentes tales como Mg+2, Mn+2 y Zn+2 (por ejemplo, sales de los cationes divalentes). Después de la incubación, la solución residual se elimina de la matriz. La solución residual se elimina de la matriz mediante enjuague con un tampón. Por ejemplo, si la muestra biológica es una muestra biológica recién congelada, la matriz se enjuaga con tampón de citrato salino sódico (SSC) 0,1X seguido de agua. Si la muestra biológica es una muestra biológica fijada con formalina e incrustada en parafina, la matriz se enjuaga con SSC 2X seguido de agua.

Después de eliminar la solución, la muestra biológica se permeabiliza. En 236, el método ilustrativo 230 incluye permeabilizar la muestra biológica, de manera que el dominio de captura de la sonda de captura de la primera área de la matriz se hibrida con el ácido nucleico diana de la muestra biológica.

Se lleva a cabo una determinación de una secuencia correspondiente al código de barras espacial de las sondas de captura en la primera área. La secuencia se genera con secuenciación de alto rendimiento. En 238, el método ilustrativo 230 incluye el procesamiento del analito capturado por extensión del extremo 3' de la sonda de captura mediante el uso del analito capturado como una plantilla para generar un ADNc de primera cadena, generar un ADNc de segunda cadena que incluye una copia del ADNc de primera cadena, el complemento del código de barras espacial de la sonda de captura, y otras secuencias que se encuentran en la sonda de captura, preparación de biblioteca del ADNc de segunda cadena para generar una biblioteca de secuenciación y determinar (i) una secuencia correspondiente al código de barras espacial de la sonda de captura de la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia correspondiente al ácido nucleico diana, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

Los métodos descritos en este ejemplo también pueden usarse para la captura de sustitutos de analitos que incluyen, pero sin limitarse a, productos de ligazón (por ejemplo, un producto de ligazón como se define en la presente descripción) y oligonucleótidos que incluyen códigos de barras de restos de unión al analito y secuencias de captura del analito. Por ejemplo, un producto de ligazón puede ser un sustituto de un ácido nucleico diana, donde una o más sondas se hibridan con el ácido nucleico diana y al menos una sonda incluye una secuencia de captura del analito que puede hibridarse con un dominio de captura de una sonda de captura. En algunos ejemplos, cuando dos sondas se hibridan con el ácido nucleico diana, las dos sondas pueden ligarse entre sí, de esta manera se genera un producto de ligazón (por ejemplo, un sustituto del ácido nucleico diana). En otros ejemplos, los oligonucleótidos que incluyen códigos de barras de restos de unión al analito y secuencias de captura del analito pueden conjugarse con un resto de unión al analito (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo). La secuencia de captura del analito puede hibridarse con el dominio de captura de una sonda de captura y el código de barras del resto de unión al analito identifica el analito (por ejemplo, proteína) unido al resto de unión al analito.

Ejemplo 2: Un método para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica.

La Figura 3 es un diagrama de flujo de trabajo ilustrativo 340 de un método para mitigar la posibilidad de capturar sondas que actúan como cebadores y determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica. En 342 el método ilustrativo incluye disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área de la matriz, donde la matriz incluye una pluralidad de sondas de captura colectivamente a través de la primera área y una segunda área. En la primera área, una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura. La segunda área es adyacente a la primera área. Por ejemplo, la segunda área es un área de la matriz que no está cubierta por la muestra biológica. La segunda área de la matriz incluye una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura, donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz.

La muestra biológica se permeabiliza 344 para permitir que la sonda de captura se hibride con un ácido nucleico diana. En 344, el método ilustrativo 340 describe la permeabilización de la muestra biológica y la hibridación del ácido nucleico diana, o sustituto del mismo, al extremo 3' de la sonda de captura (por ejemplo, el dominio de captura) de la primera área de la matriz. La incubación con reactivos de extensión puede producir ADN con código de barras espacial a partir de los analitos capturados.

En 346, las sondas de captura se extienden en la matriz. Los reactivos de extensión (por ejemplo, ADN polimerasa y tampón) se añaden a la muestra biológica en la matriz para generar un ADNc (por ejemplo, un ADNc de segunda cadena) que contiene un código de barras espacial complementario a la sonda de captura de la matriz.

Para evitar el intercambio de códigos de barras que resulta de sondas de captura que actúan como plantillas de extensión, puede añadirse a la matriz una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal (por ejemplo, después de la extensión de la sonda de la primera cadena, por ejemplo, transcripción inversa). En 348, el método ilustrativo 340 incluye poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que incluye desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que uno o más didesoxinucleótidos se incorporan al dominio de captura de las sondas de captura en la segunda área. Una solución ilustrativa incluye 1,5 pl de ddATP 100 mM, 7,5 pl de CoCh a 0,25 mM, 7,5 pl de tampón de reacción de la desoxinucleotidiltransferasa terminal 10X, agua y 6 pl de desoxinucleotidiltransferasa terminal a 1 U/pl de desoxinucleotidiltransferasa terminal (NEB). Se entiende que también pueden utilizarse otros desoxinucleótidos y cofactores catiónicos divalentes tales como Mg+2, Mn+2 y Zn+2 (por ejemplo, sales de los cationes divalentes). La solución se incuba en la matriz a 37 °C durante 10 minutos. Después de la incubación, la solución residual se elimina de la matriz. La matriz se enjuaga con tampón de citrato salino sódico 2X.

Se determina una determinación de una secuencia correspondiente al código de barras espacial, o un complemento del mismo, de las sondas de captura en la primera área. La secuencia se genera con secuenciación de alto rendimiento. En 350, el método ilustrativo 340 incluye generar bibliotecas de secuenciación a partir de sondas de ADN y determinar (i) una secuencia correspondiente al código de barras espacial de la sonda de captura de la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia correspondiente al ácido nucleico diana, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

Los métodos descritos en este ejemplo también pueden usarse para la captura de un producto de ligazón (por ejemplo, un producto de ligazón como se define en la presente descripción). Por ejemplo, un producto de ligazón puede ser un sustituto de un ácido nucleico diana, donde una o más sondas que se hibridan con el ácido nucleico diana, se ligan entre sí, y al menos una sonda incluye una secuencia de captura del analito que puede hibridarse con un dominio de captura de una sonda de captura.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica, el método comprende:

(a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área, en donde la matriz comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde:

una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende un código de barras espacial y un dominio de captura, en donde la sonda de captura está comprendida en la primera área de la matriz; y

una segunda área de la matriz comprende una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que comprenden un código de barras espacial y un dominio de captura, en donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz;

(b) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que comprende desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que un didesoxinucleótido se incorpora en el dominio de captura de la sonda de captura comprendida en la segunda área de la matriz;

(c) eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz;

(d) permeabilizar la muestra biológica, de manera que el dominio de captura de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz se hibrida con el ácido nucleico diana de la muestra biológica;

(e) extender un extremo 3' de la sonda de captura de la primera área de la matriz mediante el uso del ácido nucleico diana como una plantilla, de esta manera se genera una sonda de captura extendida; y

(f) determinar (i) una secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia del ácido nucleico diana, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la eliminación en la etapa (c) comprende el uso de un tampón de lavado que comprende uno o más de: un solvente, un ácido, una base y un tampón.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el tampón de lavado comprende solución salina tamponada con fosfato o citrato de sodio salino.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la determinación en la etapa (f) comprende la secuenciación (i) del código de barras espacial de la sonda de captura de la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) todo o una porción del ácido nucleico diana, o un complemento del mismo.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la permeabilización comprende el uso de un agente de permeabilización seleccionado del grupo que consiste en: una endopeptidasa, una proteasa dodecilsulfato de sodio, terc-octilfeniléter de polietilenglicol, polisorbato 80, polisorbato 20, solución salina de N-lauroilsarcosina sódica, saponina, Triton X-100™ y Tween-20™.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además fijar, teñir y/o obtener imágenes de la muestra biológica.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la etapa de tinción de la muestra biológica comprende el uso de eosina y/o hematoxilina; o el uso de una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en: un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente y una de sus combinaciones.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el didesoxinucleótido es ddATP o ddTTP.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la solución comprende de aproximadamente 0,5 mM del uno o más didesoxinucleótidos a aproximadamente 25 mM del uno o más didesoxinucleótidos.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la solución comprende además CoCh, preferentemente en donde el CoCh es de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2 mM.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la etapa de contacto se realiza durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 90 minutos y/o a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la muestra biológica es una sección de tejido.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el método comprende además amplificar la sonda de captura extendida para producir cantidades que son suficientes para el análisis aguas abajo.

14. Un método para determinar una ubicación de un ácido nucleico diana en una muestra biológica, el método comprende:

(a) disponer una muestra biológica sobre una matriz en una primera área en la matriz, en donde la primera área en la matriz comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde:

una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende un código de barras espacial y un dominio de captura; y

una segunda área de la matriz comprende una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura que comprenden un código de barras espacial y un dominio de captura, en donde la segunda área no está cubierta por la muestra biológica dispuesta en la matriz;

(b) poner en contacto la segunda área de la matriz con una solución que comprende desoxinucleotidiltransferasa terminal y uno o más didesoxinucleótidos, de manera que un didesoxinucleótido se incorpora en el dominio de captura de la sonda de captura comprendida en la segunda área de la matriz;

(c) eliminar la solución residual de la segunda área de la matriz;

(d) hibridar el dominio de captura de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz con un producto de ligazón de la muestra biológica, en donde el producto de ligazón se genera mediante la hibridación de una primera sonda y una segunda sonda con el ácido nucleico diana, en donde la primera sonda y la segunda sonda se ligan para formar el producto de ligazón;

(e) extender el producto de ligazón hacia el extremo 5' de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz mediante el uso de la sonda de captura como plantilla; y

(f) determinar (i) una secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) toda o una porción de una secuencia del producto de ligazón, o un complemento del mismo, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la ubicación del ácido nucleico diana en la muestra biológica.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la extensión en la etapa (e) comprende además extender un extremo 3' de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz mediante el uso del producto de ligazón como una plantilla.

16. El método de la reivindicación 14 o 15, en donde la determinación en la etapa (f) comprende la secuenciación (i) del código de barras espacial de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz, o un complemento del mismo, y (ii) todo o una porción del producto de ligazón, o un complemento del mismo.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde la muestra biológica se fija con un fijador seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol, acetona, formaldehído, paraformaldehído-Triton, glutaraldehído y sus combinaciones.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en donde la primera sonda o la segunda sonda comprende una secuencia de captura que se hibrida con el dominio de captura de la sonda de captura comprendida en la primera área de la matriz.