ES3011833T3

ES3011833T3 - Engineered tgf-beta monomers and their use for inhibiting tgf-beta signaling

Info

Publication number: ES3011833T3
Application number: ES17871472T
Authority: ES
Inventors: Andrew Hinck; Traian Sulea
Original assignee: National Research Council of Canada; University of Pittsburgh
Current assignee: National Research Council of Canada; University of Pittsburgh
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2025-04-08
Anticipated expiration: 2037-11-17
Also published as: US20210332096A1; JP2020500511A; JP7079779B2; PT3541409T; JP2023164748A; EP3541409A4; JP7623273B2; US20190359667A1; US11091523B2; EP3541409B1; US12428460B2; WO2018094173A1; EP3541409A1; JP2022033239A; CA3041727A1

Abstract

Se describen monómeros recombinantes del factor de crecimiento transformante (TGF)-β modificados para inhibir la dimerización y bloquear la señalización de TGF-β. Estos monómeros recombinantes carecen de la capacidad de unirse y reclutar el receptor de tipo I de TGF-β (ΤβΜ), pero conservan la capacidad de unirse al receptor de tipo II de TGF-β de alta afinidad (ΤβΜI) y, en algunos casos, presentan mutaciones que aumentan su afinidad por ΤβΜI. También se describen moléculas de ácido nucleico y vectores que codifican los monómeros recombinantes de TGF-β. Células aisladas, como los linfocitos T, pueden reprogramarse con un ácido nucleico o vector que codifica el monómero de TGF-β para secretarlo. También se describe el uso de los monómeros recombinantes de TGF-β o de las células que los producen para inhibir la señalización de TGF-β, por ejemplo, para tratar trastornos asociados con la señalización aberrante de TGF-β. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Monómeros de TGF-beta modificados y su uso para inhibir la señalización de TGF-beta

Campo

La presente divulgación se refiere a monómeros de factor de crecimiento transformante (TGF)- p recombinante humano seleccionados de TGF-p1, TGF-p2, y TGF-p3 modificados para inhibir la dimerización, conservando al mismo tiempo la capacidad de unirse al receptor de alta afinidad TGF-p tipo II (TpRII). Esta divulgación se refiere además al uso de monómeros de TGF-p recombinante humano para inhibir la señalización de TGF-p.

Antecedentes

TGF-p es una citocina multifuncional con diversos efectos biológicos sobre los procesos celulares, como la proliferación, la migración, la diferenciación y la apoptosis celular. Las tres isoformas de TGF-p de mamíferos, TGF-p1, -p2 y -p3, ejercen sus funciones a través de un complejo receptor de superficie celular compuesto por receptores de serina/treonina quinasa de tipo I (TpRI) y tipo II (TpRII). La activación del receptor induce tanto a las proteínas SMAD como a otras dianas posteriores, como Ras, RhoA, TAK1, MEKK1, PI3K y PP2A, para producir todo el espectro de respuestas de TGF-p (Roberts and Wakefield,Proc Natl Acad Set USA100:8621-8623, 2003; Derynck and Zhang,Nature425:577-584, 2003; Massagué,Cell134:215-230, 2008).

Las proteínas de TGF-p se sabe que favorecen la progresión de los trastornos fibróticos y determinados tipos de cáncer. En el contexto de los trastornos fibróticos, el TGF-p estimula considerablemente la expresión de proteínas de la matriz extracelular (MEC) La desregulación de la remodelación de la MEC puede llevar a la fibrosis patológica. El papel del TGF-p en el cáncer es polifacético. También se sabe que las isoformas de TGF-p , TGF-p1, - p2 y -p3 para suprimir la vigilancia inmunitaria del huésped y estimular las transiciones epiteliales a mesenquimales, impulsan la progresión del cáncer y la metástasis.

Resumen

La invención se define en las reivindicaciones. Cualquier característica que se divulgue en la presente especificación, pero que no se reivindique, no forma parte de la invención. Aquí se describen monómeros de TGF-p modificados que con capaces de bloquear la señalización de TGF-p . Los monómeros modificados inhiben la señalización de TGF-p impidiendo la dimerización de TGF-p y el reclutamiento de TpRI.

Aquí se presenta un monómero de TGF-p humano recombinante seleccionado entre TGF-p1, TGF-p2, y TGF-p3 que incluye una sustitución de cisteína por serina en el residuo del aminoácido 77; una supresión de los residuos de los aminoácidos 52-71; y la sustitución de al menos un aminoácido relativa a un monómero de TGF-p de tipo salvaje que aumenta la carga neta del monómero de TGF-p recombinante humano, donde

(a) para un monómero de TGF-p2, la sustitución de al menos un aminoácido se selecciona entre una sustitución de leucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51 y una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de la SEQ ID NO: 2;

(b) para un monómero TGF-p1, la sustitución de al menos un aminoácido se selecciona entre una sustitución de isoleucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51, una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 y una sustitución de alanina por serina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 75 de la SEQ ID NO: 1; o

(c) para un monómero de TGF-p3, la sustitución de al menos un aminoácido se selecciona entre una sustitución de leucina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51, una sustitución de alanina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 72 y una sustitución de alanina por aspartato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de la SEQ ID NO: 3, donde los monómeros de TGF-p1, TGF-p2, y TGF-p3 de tipo salvaje tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano incluye además al menos una sustitución de aminoácidos relativa a un monómero de TFG-p2 de tipo salvaje que aumenta la afinidad del monómero de TGF-p por el receptor de TGF-p de tipo II (TpRII), donde al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la afinidad del monómero por TpRII comprende una sustitución en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 de la SEQ ID NO: 2, o cualquier combinación de dos o más residuos de los mismos.

El monómero de TGF-p es un monómero de TGF-p1, TGF-p2 o TGF-p3 humano. En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano es un monómero de TGF-p2 humano.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p2 recombinante humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la carga neta del monómero que comprende:

una sustitución de leucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51 de SEQ ID NO: 2;

una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de SEQ ID NO: 2; o

tanto una sustitución de leucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51 como una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p2 recombinante humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la afinidad del monómero por TpRII comprende al menos una sustitución en el residuo 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37, y al menos una sustitución en el residuo 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p2 recombinante humano al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la afinidad del monómero por TpRII comprende una lisina por arginina en el residuo 25, una arginina por lisina en el residuo 26, una leucina por valina en el residuo 89, una isoleucina por valina en el residuo 92, una asparagina por arginina en el residuo 94, una treonina por lisina en el residuo 95, una isoleucina por valina en el residuo 98; o cualquier combinación de dos o más de ellas.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p2 recombinante humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la afinidad del monómero por TpRII comprende una lisina por arginina en el residuo 25, una arginina por lisina en el residuo 26, una leucina por valina en el residuo 89, una isoleucina por valina en el residuo 92, una asparagina por arginina en el residuo 94, una treonina por lisina en el residuo 95, una isoleucina por valina en el residuo 98.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p2 recombinante humano comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano es un monómero de TGF-p1 humano.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p1 recombinante humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la carga neta del monómero que comprende:

una sustitución de isoleucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51 de SEQ ID NO: 1;

una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de SEQ ID NO: 1; una sustitución de alanina por serina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 75 de SEQ ID NO: 1; o

una sustitución de isoleucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51, una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 y una sustitución de alanina por serina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 75 de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p1 recombinante humano comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano es un monómero de TGF-p3 humano.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p3 recombinante humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos que aumenta la carga neta del monómero que comprende:

una sustitución de leucina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51 de SEQ ID NO: 3;

una sustitución de alanina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 72 de SEQ ID NO: 3;

una sustitución de alanina por aspartato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de SEQ ID NO: 3; o

una sustitución de leucina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51, una sustitución de alanina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 72 y una sustitución de alanina por aspartato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de SEQ ID NO: 3.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p3 recombinante humano comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano está PEGilado, o el cual está glucosilado o hiperglucosilado.

También se proporcionan proteínas de fusión que incluyen un monómero de TGF-p recombinante humano y una proteína heteróloga, particularmente donde la proteína heteróloga comprende una etiqueta de proteínas, o donde la proteína heteróloga comprende un dominio Fc,

o donde la proteína heteróloga comprende albúmina o un polipéptido de unión a albúmina,

o donde la proteína heteróloga comprende un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una fracción diana,

o donde la proteína de fusión es un polipéptido de cadena simple,

o donde la proteína de fusión forma un polipéptido dimérico,

o donde la proteína de fusión es heterodimérica,

o donde la proteína de fusión es multimérica.

En algunas realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano o la proteína de fusión comprende un agente de radioterapia, un agente citotóxico para quimioterapia o un fármaco. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende un agente para la obtención de imágenes, un colorante fluorescente o una etiqueta de proteína fluorescente. También se proporcionan composiciones que incluyen un monómero de TGF-p recombinante humano o la proteína de fusión aquí descrita y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, se proporcionan métodosin vitropara inhibir la señalización de TGF-p en una célula mediante el contacto de la célula con un monómero de TGF-p recombinante humano, una proteína de fusión o composición aquí divulgada. En otras realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano, la proteína de fusión o la composición se utilizan para inhibir la señalización de TGF-p en una célula mediante el contacto de la célula con un monómero de TGF-p recombinante humano, una proteína de fusión o una composición aquí divulgada. En algunas realizaciones, el uso incluye además administrar el monómero del TGF-p recombinante humano, la proteína de fusión o la composición a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado con una señalización de TGF-p aberrante.

En otras realizaciones, el monómero de TGF-p recombinante humano, la proteína de fusión, o la composición son o se usan para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante en un sujeto, comprendiendo administrar al sujeto el monómero de TGF-p recombinante humano, la proteína de fusión o la composición aquí divulgados, particularmente donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno fibrótico,

o donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de piel,

o donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es una enfermedad ocular, o donde la enfermedad o trastorno asociado a la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno genético del tejido conectivo. También se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico, particularmente donde el ácido nucleico está enlazado operablemente a un promotor, y vectores que codifican un monómero de TGF-p recombinante humano aquí divulgado. Además, se proporcionan células aisladas, como linfocitos T aislados, que comprenden el vector o la molécula del ácido nucleico que codifica el monómero de TGF-p.

Se proporciona además una célula aislada para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante en un sujeto mediante la administración al sujeto de una célula aislada (como una célula T) que comprende los ácidos nucleicos o vectores divulgados, particularmente donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno fibrótico,

o donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es una enfermedad ocular, o donde la enfermedad o trastorno asociado a la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno genético del tejido conectivo.

Lo anterior y otros objetos, características y ventajas de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y con referencia a las ilustraciones acompañantes.

Breve descripción de las ilustraciones

FIG. 1A-1F:Estructura del complejo de señalización de TGF-p y secuencias de las variantes de TGF-p modificadas que carecen de la hélice-a interfacial. (FIG. 1 A). Representación ilustrada del complejo de señalización de TGF-p formado entre el homodímero de TGF-p3 humano y los dominios de unión al ligando extracelulares de los receptores humanos de TGF-p tipo I y tipo II, TpRI y TpRII (PDB 2PJY) (Groppe et al., Mol Cell 29, 157-168, 2008). Se muestran los enlaces disulfuro, incluido el único disulfuro entre cadenas que conecta los monómeros de TGF-p. Los monómeros de TGF-p se describen como manos izquierdas enroscadas, con el talón formado por una hélicea de 3-1/2 vueltas (a3) y los cuatro dedos formados por las hebras-p que se extienden desde el nudo de cistina que estabiliza cada monómero. (FIG. IB). Vista ampliada que ilustra las interacciones de empaquetamiento formadas por residuos hidrófobos que emanan de la hélice-a del talón de un monómero de TGF-p3 con residuos hidrófóbicos de la región de la palma del monómero de TGF-p3 opuesto. (FIG. IC). Vista ampliada que ilustra las interacciones iónicas, unión de hidrógeno e hidrofóbicas que estabilizan TpRI en la interfaz compuesta formada por ambos monómeros de TGF-p3 y TpRII. (FIG. ID). Alineación de la secuencia de TGF-p1, -p2, y -p3 con variantes monoméricas en las que Cys77, que normalmente forma el enlace disulfuro entre cadenas, se sustituye por serina (mTGF-p2 y mTGF-p3) o mini variantes monoméricas en las que Cys77 se ha sustituido por serina, los residuos 52-71 se han eliminado y se han sustituido 2 o 3 residuos adicionales (mmTGF-p1, mmTGF-p2, y mmTGF-p3). A la derecha se muestra la carga neta calculada de los monómeros correspondientes a pH 7,0. (FIG. IE). Alineación de la secuencia de TGF-p1, -p3, -p2, mmTGF-p2, y mmTGF-p2-7M en la región de unión de TpRII. Los residuos en la interfaz de unión TpRII se indican mediante sombreado. Los residuos sustituidos en mmTGF-p2-7M relativos a mmTGF-p2 se indican mediante recuadros, e incluyen K25R, I92V y N94R, que anteriormente se demostró que eran necesarios y suficientes para la unión de TpRII de alta afinidad (Baardsneset al., Biochemistry48:2146-2155, 2009; De Crescenzoet al., J Mol Biol355:47-62, 2006). (FIG. IF) Interfaz entre TGF-p3 y TpRII.

FIG. 2A-2D:Estructura de mmTGF-p2. (FIG. 2A). Espectro de 1H-15N HSQC asignado de mmTGF-p2 registrado en 10 mM de fosfato de sodio, 10 mM CHAPS, 5% 2H2O, pH 4,70, 37°C, 800 MHz. Las señales de amida del esqueleto asignadas se indican mediante su número de residuo y un código de aminoácido de una letra. (FIG. 2B). Superposición de la estructura cristalina de 1,8 A de mmTGF-p2 con uno de los monómeros de la estructura cristalina de 1,8 A de TGF-p2 (PDB 2TGI). Se indican las principales características estructurales, junto con el lazo modificado en mmTGF-p2 que ocupa el lugar de la hélice (a3) de la palma en TGF-p2. (FIG. 2C). Superposición de las dos cadenas de mmTGF-p2 (cadena A y B) de la unidad asimétrica cristalográfica. Otros detalles como en la FIG. 2B. (FIG. 2D). Superposición de mmTGF-p2 y TGF-p2 como en la FIG. 2B, pero con las posiciones alineadas restringidas a los residuos 18-45 y 61-87 en los dedos 1/2 y 3/4, respectivamente.

FIG. 3A-3H:Propiedades de unión de mmTGF-p2 y mmTGF-p2-7M. (FIG. 3A y 3B) Sensorgramas de resonancia plasmónica superficial (SPR) para la inyección de una serie de diluciones dobles de 0,047-12 ^M de TpRII sobre TGF-p2 inmovilizado (FIG. 3 A) o mmTGF-p2 (FIG. 3B). (FIG. 3C-3H) Sensorgramas SPR para la inyección de una serie de diluciones dobles de 0,012 - 3 |jM de TpRII (FIG. 3C y 3D), 0,008 - 1,024 |jM de TpRI (FIGS. 3E y 3F), o 0,008 - 1,024 |JM de TpRII en presencia de 2 ^M de TpRII tanto en la solución tampón como en las muestras inyectadas (FIG. 3G y 3H) sobre avi-TGF-p3 inmovilizado (FIG. 3C, 3E y 3G) o avi-mmTGF-p2-7M (FIG. 3D, 3F y 3H). Los sensorgramas mostrados en las FIG. 3C, 3D y 3G se ajustaron a un modelo de unión 1:1; se muestran los datos brutos y la curva ajustada. TGF-p2 y mmTGF-p2 se inmovilizaron mediante acoplamiento directo de aminas basado en carboiimida en la superficie del sensor, mientras que avi-TGF-p3 o avi-mmTGF-p2-7M se inmovilizaron capturando las proteínas biotiniladas enzimáticamente en la superficie del chip del sensor recubierto de estreptavidina a alta densidad (aprox. 8000 unidades de respuesta (RU)).

FIG. 4A-4D:Solubilidad de TGF-p2 y variantes monoméricas. (FIG. 4A y 4C) TGF-p2 y mTGF-p2 (FIG. 4A), y mmTGF-p2 y mmTGF-p2-7M (FIG. 4C), se diluyeron a partir de una solución madre concentrada en 100 mM de ácido acético en PBS a 7,4 (pH neutro) o en 100 mM de ácido acético (pH ácido) y se midió la dispersión de la luz a 340 nm. (FIG. 4B y 4D) Las muestras de TGF-p2 y mTGF-p2 (FIG. 4B), y mmTGF-p2 y mmTGF-p2-7M (FIG. 4D) diluidas en PBS o en 100 mM de ácido acético se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 x g y se midió la absorbancia de proteínas a 280 nm.

FIG. 5A-5E:Estructura del complejo mmTGF-p2-7M y mmTGF-p2-7M:TpRN. (FIG. 5 A) Espectro de 1H-15N HSQC asignado de mmTGF-p2-7M registrado en 10 mM de fosfato de sodio, 10 mM CHAPS, 5% 2H2O, pH 4,70, 37°C, 800 MHz. Las señales de amida del esqueleto asignadas se indican mediante su número de residuo y un código de aminoácido de una letra. (FIG. 5B) Superposición de la estructura cristalina de 1.8 A mmTGF-p 2-7M con uno de los monómeros de la estructura cristalina de 1.8 A de TGF-p2 (PDB 2TGI). Se indican las principales características estructurales, junto con el lazo modificado en mmTGF-p2 que ocupa el lugar de la hélice (a3) de la palma en TGF-p2. (FIG. 5C) Superposición de tres cadenas de mmTGF-p2-7M (cadena A, B, y C) de la unidad asimétrica cristalográfica. La línea discontinua corresponde al segmento que falta en la región del lazo modificado en la cadena C debido a la débil densidad de los electrones. Otros detalles como en la FIG. 5B. (FIG. 5D) Superposición de la estructura cristalina de 1.8 A del complejo mmTGF-p2-7M:TpRII con uno de los monómeros de TGF-p3 y su TpRII unido a partir de la estructura cristalina 3.0 A del complejo TGF-p3:TpRII:TpRI (PDB 2PJY, monómero de TGF-p3 y TpRII; TpRI no se muestra a efectos de claridad). Se representa el lazo modificado en mmTGF-p2 que ocupa el lugar de la hélice de la palma (a3) en TGF-p2. (FIG. 5E) Superposición como en la FIG.

5B, pero ampliado para mostrar la casi identidad de las interacciones hidrofóbicas y de unión de hidrógeno/electrostáticas críticas que se ha demostrado previamente que son esenciales para la unión TGF-p3:TpRII de alta afinidad.

FIG. 6A-6B:Actividad de señalización de TGF-p1 y variantes. (FIG. 6A) La actividadrepórterde la luciferasa TGF-p para TGF-p1, mTGF-p3, y mmTGF-p2-7M se muestra en círculos de líneas continuas, cuadrados y triángulos, respectivamente. Las líneas fijas corresponden a las curvas ajustadas para derivar la EC50 (mmTGF-p2-7M no se ajustó debido a la falta de actividad de señalización de esta variante). (FIG. 6B) Actividadrepórterde la luciferasa TGF-p para células tratadas con una concentración subsaturante de TGF-p1 (8 pM) con concentración creciente de la variante monomérica indicada de TGF-p añadida (mTGF-p3 y mmTGF-p2-7M se muestran en cuadrados abiertos y triángulos cerrados, respectivamente). Las líneas continuas corresponden a las curvas ajustadas para mTGF-p3 para derivar la EC50 y la curva ajustada para mTGF-p2-7M para derivar la IC50.

FIG. 7A-7B:Ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) para el ensamblaje mediado por ligando de complejos TpRI:TpRII. (FIG. 7A) Estructura del complejo TGF-p3:TpRII:TpRI con etiquetas C-terminales y proteínas donantes y aceptoras marcadas con fluorescencia que se asocian con las etiquetas. TpRII tiene una etiqueta C-terminal de hexahistidina (His6) y está unida por un anticuerpo anti-hexahistidina marcado Tb3+-criptato (Cisbio, Bedford, MA). TpRI tiene un avitag C-terminal biotinilado y está unido a estreptavidina marcada XL655 (Cisbio, Bedford, MA). El único residuo de lisina en el avitag C-terminal de TpRI que está biotinilado se etiqueta como "K-B". (FIG. 7B) Valores de TR-FRET AF para muestras que constan de los componentes indicados añadidos - en todos los casos el tampón consistía en 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,4 con 2 nM de anticuerpo con etiqueta de anti-hexahistidina marcado Tb3+-criptato y 30 nM de estreptavidina marcada XL665. TR-FRET AF corresponde a la relación entre la emisión del aceptor (XL665) a 665 nm con respeto a la emisión del donante (Tb3+- criptato) a 490 nm.

FIG. 8:Alineación de las secuencias de aminoácidos de TGF-ps usadas en este estudio. Las secuencias están numeradas en la figura de forma que el primer residuo tras la metionina N-terminal es el residuo 1

FIG. 9A-9B:Probabilidades de estructura secundaria y tiempos de relajación del esqueleto 15N T2 para mmTGF-p2. (FIG. 9A) Las probabilidades de estructura secundaria se calcularon basadas en el esqueleto de átomos de HN, NH, Ca, y Co y la cadena lateral de Cp usando el programa PECAN. Las probabilidades de la hebra- p y de la hélicea se representan como valores positivos y negativos, respectivamente. (FIG. 9B) Tiempos de relajación de 15N T2 representados como una función del número de residuos. Las estructuras secundarias mostradas sobre cada gráfico corresponden a las de la estructura cristalina de TGF-p2 (PDB 2TGI).

FIG. 10A-10B:Probabilidades de estructura secundaria y tiempos de relajación del esqueleto 15N T2 para mmTGF-p2-7M. (FIG. 10A) Las probabilidades de estructura secundaria se calcularon en base a los átomos de HN, NH, Ca, y Co y la cadena lateral de Cp de usando el programa PECAN. Las probabilidades de la hebra-p y de la hélice-a se representan como valores positivos y negativos, respectivamente. (FIG. 10B) Tiempos de relajación de 15N T2 representados como una función del número de residuos. Las estructuras secundarias mostradas sobre cada gráfico corresponden a las de la estructura cristalina de TGF-p2 (PDB 2TGI).

FIG. 11:Ajuste por elementos finitos de un modelo monómero-dímero reversible en el experimento de velocidad de sedimentación de mTGF-p3. Los datos experimentales con el ajuste de elementos finitos superpuesto se muestran en la parte superior, los residuos se muestran en la parte inferior.

FIG. 12:Ajuste por elementos finitos de un modelo monómero-dímero reversible en el experimento de velocidad de sedimentación de mmTGF-p2. Los datos experimentales con el ajuste de elementos finitos superpuesto se muestran en la parte superior, los residuos se muestran en la parte inferior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un monómero de factor de crecimiento transformante humano recombinante (TGF)-p seleccionado de TGF-pi, TGF-p2, y TGF-p3, que comprende:

(i) una sustitución de cisteína por serina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 77 de SEQ ID NO: 2;

(ii) una supresión de la hélice a3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 52-71 de SEQ ID NO: 2; y (iii) al menos una sustitución de aminoácidos relativa a un monómero de TGF-p de tipo salvaje que aumenta la carga neta del monómero de TGF-p recombinante, donde

(c) para un monómero de TGF-p3, la sustitución de al menos un aminoácido se selecciona entre una sustitución de leucina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51, una sustitución de alanina por glutamato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 72 y una sustitución de alanina por aspartato en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de la SEQ ID NO: 3,

donde los monómeros de TGF-p1, TGF-p2, y TGF-p3 de tipo salvaje tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

2. El monómero de TGF-p recombinante humano de la reivindicación 1, que comprende además al menos la sustitución de un aminoácido en relación con un monómero de TFG-p2 de tipo salvaje que aumenta la afinidad del monómero de TGF-p recombinante por el receptor de TGF-p de tipo Ii (TpRII), donde la sustitución de al menos un aminoácido que aumenta la afinidad del monómero por TpPRIl comprende una sustitución en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 de SEQ ID NO: 2, o cualquier combinación de dos o más residuos de los mismos.

3. El monómero de TGF-p recombinante humano de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, que es un monómero de TGF-p2 humano.

4. El monómero TGF-p2 recombinante humano de la reivindicación 3, donde la sustitución de al menos un aminoácido que aumenta la carga neta del monómero comprende:

tanto una sustitución de leucina por arginina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 51 como una sustitución de alanina por lisina en un residuo de aminoácido correspondiente al residuo 74 de la SEQ ID NO: 2.

5. El monómero de TGF-p2 recombinante humano de la reivindicación 2, donde la sustitución de al menos un aminoácido que aumenta la afinidad del monómero por TpRII comprende al menos una sustitución en el residuo 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37, y al menos una sustitución en el residuo 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99.

6. El monómero de TGF-p2 recombinante humano de la reivindicación 5, donde la sustitución de al menos un aminoácido que aumenta la afinidad del monómero por TpRII comprende una lisina por arginina en el residuo 25, una arginina por lisina en el residuo 26, una leucina por valina en el residuo 89, una isoleucina por valina en el residuo 92, una asparagina por arginina en el residuo 94, una treonina por lisina en el residuo 95, una isoleucina por valina en el residuo 98; o cualquier combinación de dos o más de ellos.

7. El monómero de TGF-p2 recombinante humano de la reivindicación 6, que comprende una lisina por arginina en el residuo 25, una arginina por lisina en el residuo 26, una leucina por valina en el residuo 89, una isoleucina por valina en el residuo 92, una asparagina por arginina en el residuo 94, una treonina por lisina en el residuo 95, y una isoleucina por valina en el residuo 98.

8. El monómero de TGF-p2 recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.

9. El monómero de TGF-p recombinante humano de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es un monómero de TGF-p1 humano.

10. El monómero TGF-p1 recombinante humano de la reivindicación 9, donde la sustitución de al menos un aminoácido que aumenta la carga neta del monómero comprende:

11. El monómero de TGF-p1 recombinante humano de la reivindicación 9 o reivindicación 10, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

12. El monómero de TGF-p recombinante humano de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es un monómero de TGF-p3 humano.

13. El monómero TGF-p3 recombinante humano de la reivindicación 12, donde la sustitución de al menos un aminoácido que aumenta la carga neta del monómero comprende:

14. El monómero de TGF-p3 recombinante humano de la reivindicación 12 o reivindicación 13, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

15. El monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que está PEGilado, o que está glicosilado o hiper-glicosilado.

16. Una proteína de fusión que comprende el monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y una proteína heteróloga,

particularmente donde la proteína heteróloga comprende una etiqueta de proteína,

o donde la proteína heteróloga comprende un dominio Fc,

o donde la proteína de fusión es un polipéptido de cadena simple,

o donde la proteína de fusión forma un polipéptido dimérico,

o donde la proteína de fusión es heterodimérica,

o donde la proteína de fusión es multimérica.

17. El monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o la proteína de fusión de la reivindicación 16, que comprende un agente de radioterapia, un agente citotóxico para quimioterapia, o un fármaco,

o la proteína de fusión de la reivindicación 16, que comprende un agente para la obtención de imágenes, un colorante fluorescente o una etiqueta de proteína fluorescente.

18. Una composición que comprende el monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o la proteína de fusión de la reivindicación 16, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. El monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16, o la composición de la reivindicación 18 para el uso en la inhibición de la señalización de TGF-p en una célula, que comprende contactar la célula con el monómero de TGF-p recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16, o la composición de la reivindicación 18.

20. El monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16, o la composición de la reivindicación 18 para el uso de la reivindicación 19, que comprende además administrar el monómero de TGF-p recombinante, la proteína de fusión o la composición a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante.

21. El monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16, o la composición de la reivindicación 18 para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el monómero de TGF-p recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16, o la composición de la reivindicación 18,

particularmente donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno fibrótico,

o donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es una enfermedad ocular,

o donde la enfermedad o trastorno asociado a la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno genético del tejido conectivo.

22. Un métodoin vitropara inhibir la señalización de TGF-p en una célula, que comprende poner en contacto la célula con el monómero de TGF-p recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16, o la composición de la reivindicación 18.

23. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica el monómero de TGF-p recombinante humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-15,

particularmente donde el ácido nucleico está operablemente enlazado a un promotor.

24. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 21.

25. Una célula aislada que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 23, o el vector de la reivindicación 24,

particularmente donde la célula es un linfocito T.

26. Una célula aislada según la reivindicación 25, donde la célula aislada es para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con señalización de TGF-p aberrante en un sujeto, comprendiendo administrar al sujeto la célula aislada,

o donde la enfermedad o trastorno asociado con la señalización de TGF-p aberrante es un trastorno genético del tejido conectivo.