ES3012533T3 - Novel mek-inhibitor for the treatment of viral and bacterial infections - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al medicamento PD-0184264 para su uso en un método de tratamiento de una infección viral o una coinfección viral y bacteriana. También se proporcionan composiciones que comprenden dichos inhibidores para su uso en el tratamiento de una infección viral y la prevención y/o el tratamiento de una coinfección bacteriana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo inhibidor de MEK para el tratamiento de infecciones víricas y bacterianas

Antecedentes de la invención

Los virus de la gripe A son los agentes causantes de enfermedades respiratorias graves que resultan en una morbilidad y mortalidad significativas. La mayoría de los casos mortales en el curso de una infección por el virus de la gripe son en realidad el resultado de una neumonía secundaria causada por diferentes bacterias, comoStaphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenza(Morenset al.,2008, Chertowet al.,2013). Los problemas más llamativos de la coinfección bacteriana son el aumento repentino de la patogenicidad (Iwaoet al.,2012, Paddocket al.,2012, Parkeret al.,2012) y un arsenal limitado de potentes agentes antiinfecciosos contra los diferentes patógenos. La alta variabilidad de los virus de la gripe y la continua aparición de nuevas cepas (Neumannet al.,2009; Taubenbergeret al.,2010; Parry, 2013), características específicas de las cepas bacterianas (Grundmannet al.2006, Moranet al.,2006, Gilletet al.,2007, Shiloet al.,2011), así como el rápido desarrollo de resistencia de ambos, virus de la gripe (Haydenet al.,1992, Brightetal., 2006, Pintoetal., 2006, De Clercqetal., 2007, Pintoet al.,2007) y bacterias (Grundmannet al.,2006, Moranet al.,2006, Shiloet al.2011) contra los fármacos/antibióticos disponibles son las principales razones de las malas opciones de tratamiento.

El documento WO 2001/076570 proporciona el concepto de tratamiento o prevención de infecciones causadas por virus de (-)ARN, en particular por virus de la gripe por medio de inhibidores de MEK. El documento WO 2014/056894 proporciona inhibidores de Me K específicos, tales como AZDD6244, AZDD8330, RDEAD119, GSKD1120212 (Trametinib), GDCD0973 (Cobimetinib), CID1040, PDD0325901, ROD5126766, MSC1936369 (AS-703026) para su uso en el tratamiento o la prevención de infecciones por el virus de la gripe. En el documento WO 2/173788, los inhibidores de MEK A1 se describen para su uso en un método para tratar el virus de la gripe y las coinfecciones bacterianas.

La pandemia de H1N1 en 2009 demuestra claramente que el virus de la gripe A (VGA) tiene un fuerte impacto en los sistemas de salud globales (Mackey y Liang, 2012; Montoet al.,2011; Robertson e Inglis, 2011). Esto se confirma por la pandemia de coronavirus 2019/2020 (Covid19). Además de la vacunación preventiva, solo unos pocos fármacos antivíricos están aprobados para la gripe y hasta la fecha ninguno es conocido para Covid19. Esto destaca la necesidad urgente de fármacos antivíricos eficaces adicionales para controlar mejor las infecciones. Sobre todo, en la fase inicial de una pandemia, cuando no hay vacunas disponibles, los fármacos antivíricos son el tratamiento independiente. Además, las apariciones de VGA que son resistentes a los fármacos antivíricos actualmente aprobados subrayan la necesidad urgente de fármacos antivíricos nuevos y ampliamente disponibles (Mosset al.,2010).

Sin embargo, aunque ya se conocen algunos inhibidores prometedores de MEK y se proporcionan para usar en el tratamiento o la prevención de infecciones víricas, en particular infecciones por el virus de la gripe, todavía hay una necesidad de proporcionar inhibidores de MEK adicionales, idealmente mejorados para tal aplicación.

Además, es de gran importancia que la terapia antivírica de las infecciones víricas se inicie tan pronto como sea posible después de la infección. Por ejemplo, la franja de tiempo para comenzar una terapia contra la gripe usando oseltamivir es solo de hasta 24 h. Muy a menudo, un paciente visita a un médico después de este período de tiempo, lo que hace que el tratamiento con tratamientos antivíricos estándar sea inútil. Además, los tratamientos antivíricos pueden estar contraindicados debido a posibles interacciones farmacológicas, especialmente en personas mayores, que a menudo tienen que tomar uno o más medicamentos de forma continua. Muy a menudo, no es fácil detener la toma de tales medicamentos. Como consecuencia, el marco de tiempo para comenzar una terapia antivírica ya se pasa antes de que estos pacientes sean adecuados para la terapia antivírica.

Haasbachet al.,ANTIVIRAL RESEARCH, ELSEVIER BV, NL, vol. 142, 2 de abril de 2017 divulgan el inhibidor de MEK CI-1040 para su uso contra la infección por el virus de la gripe. Sin embargo, el inhibidor de MEK PD-0184264 no se divulga en Haasbachet al.

En vista de la técnica anterior, está claro que existe la necesidad de nuevos compuestos y composiciones eficaces en el tratamiento de enfermedades víricas, en particular en enfermedades del tubo respiratorio causadas por virus de ARN tales como virus de la gripe (IV) o coronavirus (CoV), especialmente para el inicio tardío del tratamiento. Además, existe la necesidad de tratamiento de infecciones por virus, en donde el virus es resistente a la terapia antivírica, y para la prevención y/o tratamiento de coinfecciones bacterianas.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones está dispuesta únicamente a título informativo.

Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos métodos.

La solución del problema técnico es la provisión de PD-0184264, un metabolito de CI-1040 para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades víricas, tales como la gripe o la infección por coronavirus, infecciones bacterianas o una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica. Esta solución también se refleja en las realizaciones descritas a continuación y en las reivindicaciones, y se ilustra en los ejemplos y figuras. Los inventores de la presente solicitud descubrieron sorprendentemente que el metabolito PD-0184264 del inhibidor de MEK CI-1040 tiene una mayor actividad antivírica y antibacteriana que el propio CI-1040. Además, se demostró que PD-0184264 es eficaz incluso si el tratamiento se inicia más de 36 horas después de la infección, de modo que preferentemente, el sujeto ha sido sintomático de una infección vírica durante al menos 36 horas, al menos 48 horas o al menos 72 horas.

Preferentemente, el tratamiento se inicia al menos 36 horas y dentro de las 48 horas posteriores al inicio de la enfermedad.

Preferentemente, la infección vírica es causada por un virus de ARN de hebra positiva o negativa. Preferentemente, el virus de ARN de hebra negativa es virus de la gripe, más preferentemente el virus es virus de la gripe A (VGA) o virus de la gripe B (VGB), incluso más preferentemente, el virus de la gripe A se selecciona del grupo que consiste en H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 o H5N1 o el virus de la gripe B se selecciona del grupo que consiste en VGB tipo Yamagata y Victoria. Preferentemente, el virus de ARN de hebra positiva es un coronavirus tal como virus respiratorio agudo grave (SARS-CoV y SARS-CoV2) o coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS).

En algunas realizaciones, el virus es resistente al tratamiento antivírico, en donde más preferentemente el tratamiento antivírico es la administración de oseltamivir, zanamivir, peramivir, amantadina, rimantadina, favipiravir, baloxavir marboxil o pimodivir.

En una realización, el virus resistente al tratamiento antivírico es el H1N1 con la mutación H275Y.

Por lo tanto, el uso de PD-0184264 resuelve el problema técnico subyacente a la presente solicitud al proporcionar una opción de tratamiento más eficaz para infecciones víricas, en particular infecciones por el virus de la gripe, así como para infecciones víricas, en particular virus de la gripe, coinfecciones bacterianas, con una ventana de tratamiento ampliada que permite el inicio del tratamiento más de 36 horas y hasta al menos 72 horas después de que se identificaron los primeros síntomas.

Aunque el inhibidor de MEK CI-1040 ya es eficaz en el tratamiento o prevención de la infección por el virus de la gripe y la coinfección bacteriana o por el virus de la gripe, los inventores descubrieron que un metabolito (PD-0184264, fórmula 1) de CI-1040 es más eficaz para atacar el virus de la gripe o las coinfecciones que comprenden un virus de la gripe y una infección bacteriana que el propio CI-1040. PD-0184264 es uno de varios metabolitos del CI-1040 (Wabnitzet al.,2004, LoRussoet al.,2005), pero no se puede saber ni suponer que un metabolito sea más potente que el CI-1040. Para gran sorpresa de los inventores, de hecho descubrieron que un metabolito (PD-0184264, estructura 1 a continuación) es más eficaz y tiene un potencial terapéutico mayor que el CI-1040 como se muestra en los ejemplos. Esta propiedad de PD-0184264 no se podía esperar, ya que PD-0184264 realmente muestra un efecto inhibidor más débil sobre las cinasas MEKin vitroque CI-1040 (ver el Ejemplo 9). Además, los ensayosin vitromostraron un efecto antivírico más débil de PD-0184264 en comparación con CI-1040 (véase el Ejemplo 10) mientras que los ensayosin vivosorprendentemente mostraron un efecto antivírico mucho más fuerte de PD-0184264 en comparación con CI-1040 (ver Ejemplo 11).

Por consiguiente, la presente invención se refiere a PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad vírica de acuerdo con las reivindicaciones. Preferentemente, el virus que causa la enfermedad vírica es un virus de ARN. Cuando el virus de ARN es un virus de ARN de hebra negativa, es preferentemente virus de la gripe y más preferentemente virus de la gripe A o virus de la gripe B. Cuando el virus de ARN es un virus de ARN de hebra positiva, el virus es preferentemente un coronavirus tal como SARS, SARS-CoV2 o MERS.

Un aspecto no reivindicado de la divulgación se refiere a PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana. La infección bacteriana está mediada preferentemente por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enStaphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadalesy/oPasteurellaceae.

La presente invención se refiere además a PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un método para la prevención o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica de acuerdo con las reivindicaciones.

Preferentemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para su uso en un método para la prevención o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde la infección bacteriana está mediada por una bacteria que se selecciona del grupo que consiste enStaphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

Preferentemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para su uso en un método para la prevención o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde el virus es un virus de ARN de hebra negativa, preferentemente un virus de la gripe, más preferentemente virus de la gripe A o virus de la gripe B.

Preferentemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad vírica, en donde PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en combinación con un inhibidor de neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Preferentemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para su uso en un método para la prevención o tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en combinación con un inhibidor de neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización alternativa, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad vírica o en un método para la prevención o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde el inhibidor de neuraminidasa se selecciona de oseltamivir, oseltamivir fosfato, zanamivir, laninamivir o peramivir o una sal farmacéuticamente aceptable de este.

También se proporciona, pero no se reivindica, una composición farmacéutica que comprende PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor de neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Preferentemente, PD-0184264 es para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad vírica y/o en un método para el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde PD-0184264 se combina con uno o más inhibidores de MEK.

Preferentemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para su uso en el tratamiento de una infección vírica o en la prevención o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica en un sujeto, preferentemente un vertebrado, más preferentemente un ave o un mamífero, más preferentemente un ser humano.

Un aspecto no reivindicado de la divulgación se refiere a un método para tratar una enfermedad vírica en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto en necesidad del mismo. En una realización preferida, PD-0184264 se administra al sujeto una vez al día en una forma farmacéutica oral de 100 mg a 900 mg, preferentemente 600 mg.

Un aspecto no reivindicado de la divulgación se refiere a un método para tratar una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica en un sujeto, donde el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto en necesidad del mismo.

Preferentemente, el virus es un virus de ARN de hebra negativa, más preferentemente el virus es virus de la gripe y más preferentemente, el virus de la gripe es virus de la gripe A o virus de la gripe B.

Preferentemente, la infección bacteriana está mediada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enStaphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y Pasteurellaceae.

Breve descripción de las figuras

Las figuras muestran:

Figura 1:Tratamiento de ratones infectados con gripe A con PD-0184264 o CI-1040.

Los resultados del experimento del Ejemplo 1 se presentan como título de virus (log10) ufp/ml (izquierda) o % título de virus (derecha).

Figura 2:Gráfico que muestra el impacto de PD-0184264 y CI-1040 en el crecimiento bacteriano de MRSA. En diferentes puntos de tiempo, como se indica en el eje horizontal de la gráfica, se midieron las densidades ópticas de los cultivos bacterianos extracelulares como una indicación de crecimiento bacteriano, que se muestra en el eje vertical de la gráfica en % (DO600). Los datos representan el valor medio de tres réplicas biológicas descritas en el Ejemplo 2.

Figura 3:Inhibición del crecimiento bacteriano de MRSA con diferentes concentraciones de PD-0184264.

PD-0184264 se administró en diferentes concentraciones (como se indica) a un cultivo nocturno de S.aureusUSA300 (MRSA). Después de 6 horas, se probó la densidad óptica. Los datos mostrados en la figura representan un experimento de tres réplicas biológicas descritas en el Ejemplo 2.

Figura 4:El impacto de CI-1040 y PD-0184264 en el crecimiento bacteriano.

(A) Impacto de CI-1040 sobre el crecimiento bacteriano a diferentes concentraciones (B, C) Impacto de PD-0184264 sobre la cepa 6850 de S.aureus(B) o cepa USA300 (C) a diferentes concentraciones de Pd -184264.

Figura 5:La administración de PD-0184264 a células singulares o coinfectadas protege las células.

Se pretrataron células epiteliales pulmonares humanas (A549) con PD-0184264 (a las concentraciones indicadas) o disolvente (DMSO) y se infectaron con la cepa A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) del virus de la gripe humana. Dado el efecto antivírico y el fuerte efecto antibacteriano de PD-0184264 (figura 2 a 4), analizamos si esta característica del compuesto también podría observarse macroscópicamente con respecto a los efectos citopáticos de alteración celular (CPE) provocados por VGA (virus de la gripe A) y/o infección por S.aureus.Se observó una ligera interrupción de la monocapa celular después de una infección singular con el VGA(H1N1) (panel medio) o la cepa deS. aureus(panel superior). Este CPE se incrementó fuertemente después de la coinfección con ambos patógenos (panel inferior), pero se inhibió en la presencia de concentraciones crecientes de PD-0184264.

Figura 6:Comparación de la acción antibacteriana de PD-0184264 con los antibióticos comunes.

Para alinear las propiedades antibacterianas del inhibidor de MEK PD0184164 con la acción de un antibiótico común, tratamos las bacterias durante la noche con disolvente, los inhibidores de MEK U0126 y PD-0184264 o diferentes concentraciones del antibiótico gentamicina. En comparación con las bacterias tratadas con disolvente, la incubación con el inhibidor de MEK de primera generación U0126 solo dio como resultado una reducción menor en los títulos bacterianos, mientras que el tratamiento con PD-0184264 llevó a una reducción muy fuerte en la carga bacteriana. Esto fue cierto para ambas cepas bacterianas.

Figura 7:(A) Resultados de ensayos de tiempo de adición que comparan la acción antibacteriana de PD-0184264 con otros compuestos inhibidores de MEK o el antibiótico gentamicina.

(B) Resultados de una prueba de resistencia al inhibidor de MEK PD0184264 en S.aureusen comparación con el tratamiento con gentamicina, eritromicina o sin tratar.

Figura 8:Estructura de dominio de la cinasa bacteriana PknB (superior) (Raketteet al. 2012)y homologías de secuencia del sitio de autofosforilación de PknB con los sitios de activación de las cinasas de MAPA de mamíferos p38, JNK, y la diana ERK directa de MEK(Milleret al.2010).

Figura 9:Determinación del impacto del tratamiento inhibidor en la concentración inhibitoria mínima (MIC) de diferentes antibióticos.

Figura 10:Tolerancia al estrés de la cepa 6850 de S.aureusy la cepa USA300 de MRSA cuando se trata con PD-0184264.

Figura 11:El tratamiento con PD-0184264 altera el crecimiento de diferentes serotipos deStreptococcus pneumoniae.

(A) Efecto de PD-0184264 en cultivos de cepas TIGR4 deStreptococcus pneumoniae(serotipo 4) y D39 wt (serotipo 2) según lo medido por DO600; (B) Efecto de PD-0184264 en cultivos de cepas TIGR4 deStreptococcus pneumoniae(serotipo 4) y D39 wt (serotipo 2) mostrados en ufc/ml; (C): Efecto de PD-0184264 en cultivos deBacillus subtilismostrados en ufc/ml.

Figura 12:Tabla 1: antibióticos.

Figura 13:Las imágenes que muestran que el tratamiento de células con PD-0184264 disminuye fuertemente el CPE inducido por patógenos (efecto citopático) después de la infección y coinfección bacteriana singular(S. aureus)o vírica (gripe IV).

Figura 14:Gráfico que muestra los cambios en la carga bacteriana intracelulartras el tratamiento con CI-1040 (A) o PD-0184264 (B).

Se obtuvieron resultados comparables cuando se administraron CI-1040 o PD-0184264 en momentos posteriores durante la infección en curso (C).

Figura 15:Gráfico que muestra la viabilidad celular (A, B) y la ruptura de la membrana (C, D).

(A, B) muestran la viabilidad celular de A549 en presencia de concentraciones crecientes de PD-0184264. En (C) y (D), se realizó un ensayo de LDH para determinar la ruptura de membrana debido al tratamiento con inhibidores.

Figura 16:El ensayo de cinasa extracelular que muestra los efectos inhibidores de CI-1040 y PD-0184264 en la vía de MEK.

La actividad de las cinasas se mide mediante la determinación de la cantidad de proteína diana fosforilada ERK mediante un ensayo ELISA. Se realizaron tres series experimentales independientes que mostraron resultados similares. Aquí se presenta un experimento representativo.

Figura 17:Actividad antivírica de PD-0184264 contra el virus de la gripe H1N1pdm09 en un ensayoin vitro.(A) Las células A549 se infectaron con el virus (MdI = 0,001) para determinar la reducción del título del virus. (B) Las células A549 se infectaron con virus RBI (MdI = 0,001) y se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 |jM, 50 |jM, 10 |jM, 5 |jM, 1 |jM, 0,5 j M y 0,1 |jM) para determinar el valor de CE<50>. (C) Las células A549 se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 jiM, 50 jiM, 10 jiM, 5 jiM, 1 jiM, 0,5 jiM y 0,1 jiM) durante 24 h seguido de cuatro horas de tinción con WST para determinar el valor de CC<50>.

Figura 18:Reducciónin vivodel título de virus en el pulmón de ratones mediante PD-0184264.

Después de la infección por el virus H1N1pdm09, los ratones hembra C57BL/6 se trataron con 2,8, 8,4 o 25 mg/kg de PD-0184264 (panel izquierdo) o con 25, 75 o 150 mg/kg de CI-1400 (panel derecho) por vía oral. 24 h después de la infección, los animales se sacrificaron y el título del virus se determinó usando el método estándar.

Figura 19:PD-0184264 tiene una mejor biodisponibilidad que CI-1040.

(A) Los ratones NMRI macho se trataron con 75 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 75 mg/kg de PD-0184264 por vía intravenosa. Se recolectó sangre a los 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco. (B) Los ratones NMRI macho se trataron ya sea con 150 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 150 mg/kg de PD-0184264 por vía oral usando sonda oral. Se recolectó sangre a los 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco.

Figura 20:Supervivencia de ratones después del tratamiento con PD-0184264.

Ocho ratones hembra C57BL/6 se infectaron con infección por H1N1pdm09 y se trataron con 25 mg/kg de PD-0184264 (ATR-002, línea gris media) o con disolvente solo (línea gris clara) por vía oral. El tratamiento comenzó 24, 48 o 72 horas después de la infección durante cinco días como se indica en los gráficos (barra gris). Los ratones se tuvieron que sacrificar, cuando se encontró una reducción de peso corporal del 20 % (línea punteada gris). Se usó elsoftwareGraphpad Prism 8 para ilustrar ambas figuras. El valor depse determinó usando la prueba de Logrank (Mantel-Cox).

Descripción detallada de la invención

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión que cualquiera de la información proporcionada en la presente sea técnica anterior o relevante para las invenciones reivindicadas en la presente, o que cualquier publicación específica o implícitamente referenciada sea técnica anterior.

Dicho lo anterior, la presente invención se refiere a PD-0184264 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad vírica o en un método de prevención o tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una infección vírica de acuerdo con las reivindicaciones. Como se muestra en los ejemplos, PD-0184264 parece actuar sobre la cinasa bacteriana PknB y, por lo tanto, al menos en parte puede ejercer su efecto bacteriostático.

También, como se demostró en los ejemplos adjuntos, PD-0184264 muestra un efecto en escenarios de infección vírica y bacteriana, así como en escenarios de coinfección bacteriana y vírica. Este efecto es sorprendentemente más fuerte que el de CI-040, un inhibidor de MEK ya conocido en la técnica anterior para el tratamiento de infecciones bacterianas y víricas. Cuando se compara el efecto inhibidor de CI-1040 y PD-0184264 en una cinasa MEK como se muestra en el Ejemplo 9, en realidad, se esperaría lo contrario, ya que los inhibidores de MEK se utilizaron en la técnica anterior para lograr estos efectos.

Lo mismo ocurre cuando se compara el efecto antivírico de PD-0184264 y CI-1040 en ensayosin vitro.Aquí, CI-1040 es más eficaz que PD-0184264 como se puede ver en el Ejemplo 10. Específicamente, se necesita una concentración 10 veces mayor de PD-0184264 en un ensayoin vitropara lograr el mismo efecto inhibidor. Sorprendentemente, se encontró que a pesar de la inhibiciónin vitrodébil, PD-0184264 es superior a CI-1040in vivocomo se puede ver del Ejemplo 11. Como se muestra en la figura 18, ya 2,8 mg/kg de PD-0184264 muestran una reducción del título del virus, mientras que 25 mg/kg de PD-0184264 muestran una reducción de al menos el 90 % del título del virus en el pulmón. Por el contrario, CI-1040 muestra una reducción similar solo a 150 pM. Además, el Ejemplo 1 muestra una reducción del título de virus en el pulmón mediante PD-0184264. En el Ejemplo 1, los ratones se infectaron con un virus de la gripe y se trataron con 150 mg/kg, 75 mg/kg o 25 mg/kg de CI-1040 o PD-0184264, respectivamente. Como se muestra en la figura 1, ya 25 mg/kg de PD-0184264 tienen el mismo efecto que 150 mg/kg de CI-1040. Por lo tanto, para gran sorpresa de los inventores, PD-0184264 muestra un fuerte efecto antivíricoin vivo,aunque los datosin vitroprevios no proporcionaron ningún incentivo para continuar el trabajo con PD-0184264. Este efecto sorprendente se puede basar en una mayor biodisponibilidad de PD-0184264 en comparación con CI-1040, que se muestra en el Ejemplo 12.

Los ejemplos 2, 4 y 6-8 muestran adicionalmente el fuerte efecto antibacteriano de PD-0184264, también en comparación con CI-1040 y otros inhibidores de MEK. En el Ejemplo 2, se analiza el efecto de PD-0184264 en el crecimiento bacteriano. La figura 2 muestra que PD-0184264 inhibe el crecimiento de bacterias mientras que CI-1040 no tiene efecto en el crecimiento bacteriano. En la figura 3 se muestra que el crecimiento bacteriano es inhibido por PD-0184264 de una manera dependiente de la concentración que muestra una inhibición casi completa del crecimiento a partir de PD-018426450 pM. De manera similar, también la figura 4 muestra que el crecimiento bacteriano se inhibe por PD-0184264 de una manera dependiente de la concentración, ya que PD-0184264 10 pM muestra una reducción significativa del crecimiento, mientras que CI-1040 no tiene ningún efecto en el crecimiento bacteriano. En el Ejemplo 4, el efecto antibacteriano de PD-0184264 se compara con el inhibidor de MEK U0126 o el antibiótico gentamicina. La figura 6 muestra que PD-184264 tiene un efecto antibiótico similar a gentamicina mientras que el inhibidor de MEK U0126, conocido de la técnica anterior, no tiene efecto en el crecimiento bacteriano. Lo mismo ocurre con la figura 7A, en la cual se monitorea el curso del crecimiento bacteriano. En la figura 7B, se muestra adicionalmente que PD-0184264 no induce resistencia contra PD-0184264 mientras que las bacterias desarrollan fácilmente resistencias contra gentamicina y eritromicina. Por lo tanto, PD-0184264 no induce resistencia en bacterias. En el Ejemplo 6 se analizó la influencia de PD-0184264 en la sensibilidad de las bacterias a un antibiótico. Como se muestra en la figura 9 y la Tabla 2, el tratamiento con PD-0184264 de hecho condujo a un aumento en la susceptibilidad de las bacterias a diferentes antibióticos, que fue más prominente en el caso de penicilina y gentamicina. Además, la figura 10 muestra que PD-0184264 disminuye la tolerancia al estrés de las bacterias. El Ejemplo 7 proporciona evidencia de que el efecto de PD-0184264 no se limita a S.aureus,sino que también tiene un efecto en otras bacterias tal comoStreptococcus pneumoniae(véanse las figuras 11A y 11B) yBacillus subtilis(véase la figura 11C).

Los Ejemplos 3 y 8 subrayan la eficacia de PD-0184264 dentro del contexto de una coinfección bacteriana y vírica. El Ejemplo 3 analizó si la eficacia de PD-0184264 también podría observarse macroscópicamente con respecto a los efectos citopáticos de alteración celular (CPE) provocados por infección vírica y/o bacteriana. La figura 5 muestra que PD-0184264 reduce el efecto citopático provocado especialmente por una coinfección bacteriana y vírica de una manera dependiente de la concentración que muestra efectos ya en PD-018426415 pM. Lo mismo también se analizó en el Ejemplo 8, que muestra en la figura 13 nuevamente el efecto positivo de PD-0184264 en un escenario de coinfección bacteriana y vírica. El Ejemplo 8 analizó adicionalmente el efecto de PD-0184264 en el título bacteriano intracelular en un escenario de coinfección. La figura 14 muestra que PD-0184264 reduce el título bacteriano intracelular mientras que CI-1040 no tiene efecto. De manera adicional, el Ejemplo 8 y la figura 15 muestran que PD-0184264 no ejerce ningún efecto citotóxico.

Además, en el Ejemplo 13, se demostró que el tratamiento con PD-0184264 de ratones infectados con una cepa de la gripe H1N1 lleva a una diferencia significativa en la supervivencia, a pesar de que el fármaco se administró hasta 72 horas después de la infección (véase la figura 20).

Los resultados son comparables a los datos obtenidos con CI-1040 presentados en el documento de Haasbach (Haasbachet al.2017) y en experimentos adicionales realizados por el solicitante. En estos experimentos, se encontró que CI-1040 tiene una ventana de tratamiento ampliada sobre fármacos antivíricos conocidos, y específicamente Tamiflu (oseltamivir), lo que permite la administración en un período de tiempo en el que Tamiflu es ineficaz. Usando un modelo de ratón, los inventores demostraron que Cl-1040 puede reducir los títulos pulmonares del virus de la gripein vivo.Sorprendentemente, se encontró que la ventana de tratamiento para Cl-1040 se expandió a al menos 48 h después de la infección cuando el tratamiento con Tamiflu® no tiene efecto.

De acuerdo con la etiqueta de la FDA, el oseltamivir (Tamiflu®) está actualmente indicado para el tratamiento de la gripe en pacientes que han sido sintomáticos durante no más de 2 días. Esto corresponde a lo observado en el modelo de ratón en estudios previos, donde el oseltamivir ya no es efectivo si se administra más de 48 h después de la infección con el virus de la gripe. Por el contrario, PD-0184264 fue eficaz incluso 72 h después de la infección. Por lo tanto, se ha demostrado que PD-0184264, al igual que CI-1040, tiene una ventana de tratamiento más larga que oseltamivir. Por esta razón, es probable que los efectos observados en el modelo de ratón se puedan extrapolar a pacientes humanos, lo que significa que PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable o un derivado de este se puede administrar a pacientes más de 2 días después del inicio de los síntomas de una infección vírica. Esto también tiene sentido cuando el método de acción de CI-1040 y PD-0184264 se compara con el de oseltamivir. Como se mencionó anteriormente, se cree que el oseltamivir bloquea la elución de viriones de las células infectadas. Por esta razón, solo es eficaz si los viriones aún no han salido de la célula. Se encontró que CI-1040 y PD-0184264, por el contrario, bloquean la vía de MEK que es necesaria para la replicación vírica, de modo que los complejos de RNP víricos se retienen en el núcleo celular. Con respecto al modo de acción molecular de la inhibición de MEK, los inventores han demostrado previamente que la inhibición de la cinasa con el inhibidor prototipo U0126 lleva a un bloqueo del transporte citoplasmático nuclear de complejos RNP víricos (Pleschkaet al.,2001). Esto se podría confirmar para CI-1040 y PD-0184264. Se espera, con base en los datos en el Ejemplo 13 y otros estudios preliminares, que PD-0184264 tenga el mismo efecto que CI-1040, ya que es un metabolito de CI-1040 y se dirige a la misma vía que CI-1040.

Por lo tanto, los métodos y usos de la invención se refieren al tratamiento de una infección vírica en sujetos que han sido sintomáticos durante al menos 24 horas, al menos 36 horas o al menos 48 horas. Estos tiempos, por supuesto, incluyen todos los marcos de tiempo intermedios, tal como 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 horas para que el sujeto sea sintomático. En una realización preferida, el sujeto ha sido sintomático durante al menos 48 horas antes del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento se puede iniciar entre 36 y 48 horas después del inicio de la enfermedad. En este contexto, se debe señalar que "ser sintomático" e "inicio de la enfermedad" se pueden usar indistintamente. Sin embargo, el tratamiento también podría iniciarse al menos 60 h, al menos 72 h o al menos 96 h después de la infección. En los casos en que PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de este se administra cuando ya se encontró que un fármaco antivírico diferente es ineficaz, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de este se puede administrar después de 24 horas, cuando se ha completado el tratamiento con el fármaco antivírico anterior.

Además, es muy probable que, al igual que CI-1040, PD-0184264 también sea eficaz contra los virus de la gripe, que son resistentes al tratamiento antivírico. Esta es una característica de CI-1040 y PD-0184264 que resuelve un problema de muchos tratamientos antivíricos estándar y permite que CI-1040 y PD-0184264 se administren después de que el tratamiento con antivíricos estándar haya fallado. El tratamiento antivírico estándar como se usa en la presente se define como un tratamiento con un fármaco que se ha autorizado para su uso como un fármaco antivírico y que es eficaz para inhibir el desarrollo del patógeno vírico en cualquier paso de su ciclo de vida. Los ejemplos incluyen inhibidores de entrada, inhibidores de no recubrimiento, inhibidores de transcripción inversa, inhibidores de polimerasa, inhibidores de endonucleasa, inhibidores de maduración de proteínas, inhibidores de integrasa, inhibidores de transcripción, inhibidores de traducción, inhibidores de proteasa, inhibidores de ensamblaje de virión o inhibidores de liberación de virión. En el contexto de los virus de la gripe, hay dos enfoques estándar diferentes del tratamiento antivírico conocidos: los inhibidores de la neuraminidasa y los inhibidores de la proteína M2.

Por consiguiente, en una realización el virus es resistente al tratamiento antivírico. Como se describe en el presente documento, el tratamiento antivírico se puede relacionar con la administración de inhibidores de neuraminidasa, tales como oseltamivir, zanamivir, laninamivir y peramivir, y/o administración de inhibidores de M2 tales como amantadina y rimantadina. Por consiguiente, el tratamiento antivírico puede ser la administración de oseltamivir, zanamivir, amantadina y/o rimantadina. En otra realización, el tratamiento antivírico se refiere a la administración de oseltamivir, zanamivir, peramivir, amantadina, rimantadina, favipiravir, baloxavir marboxil y/o pimodivir.

PD-0184264 se puede usar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de las afecciones descritas en la presente. Como tal, el término "tratar" o "tratamiento" incluye la administración de PD-0184264 preferentemente en forma de un medicamento, a un sujeto que padece una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica con el propósito de perfeccionar o mejorar los síntomas que acompañan estas infecciones. De manera similar, se incluye la administración de PD-0184264, preferentemente en forma de un medicamento, a un sujeto que padece una infección bacteriana o con el propósito de perfeccionar o mejorar los síntomas que acompañan estas infecciones. Adicionalmente se incluye la administración de PD-0184264, preferentemente en forma de un medicamento, a un sujeto que padece una infección vírica o con el propósito de perfeccionar o mejorar los síntomas que acompañan estas infecciones. Una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, una enfermedad vírica y una infección bacteriana es una condición médica tratada o prevenida por PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable de este.

Además, el término "profilaxis" o "prevención" como se usa indistintamente en la presente, se refiere a cualquier procedimiento médico o de salud pública cuyo propósito es prevenir una condición médica descrita en la presente. Como se usa en la presente, los términos "prevenir", "prevención" y "prevenir" se refieren a la reducción en el riesgo de adquirir o desarrollar una condición dada, a saber, una coinfección que comprende una infección vírica y una infección bacteriana, una infección bacteriana sola o una infección vírica sola como se describe en la presente. También se entiende por "profilaxis" la reducción o inhibición de la recurrencia de una coinfección que comprende una infección por virus de la gripe y una infección bacteriana, una infección bacteriana sola o una infección vírica sola en un sujeto.

PD-0184264 de la presente invención es eficaz en el tratamiento de una coinfección como se muestra en los Ejemplos 3 y 8. Una "coinfección" como se usa en la presente comprende una enfermedad vírica, preferentemente una infección por virus de la gripe, y una infección bacteriana. Esta coinfección puede tener lugar mediante infección simultánea de un hospedador, por ejemplo, un sujeto y/o una sola célula con una bacteria y un virus de la gripe. También puede ser que un huésped, por ejemplo, un sujeto y/o célula se infecten simultáneamente con una o más partículas víricas y una o más bacterias. Sin embargo, esta coinfección también puede tener lugar secuencialmente. En tal caso, un sujeto y/o célula se infecta primero con una o más partículas víricas y más adelante en el tiempo el mismo sujeto y/o célula se infecta con una o más bacterias o viceversa. El período de tiempo entre las dos infecciones puede ser un período de tiempo de como máximo 14 días, 13 días, 12 días, 11 días, 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, 1 día, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1,5 horas o como mínimo 30minutos. En este sentido, debido a la ventana de tratamiento ampliada de PD-0184264, se espera una prevención más eficaz de infecciones bacterianas secundarias con administración extendida.

Tal situación también puede ser una superinfección, en la que una segunda infección se superpone a una anterior, especialmente por un agente microbiano diferente de origen exógeno o endógeno que es resistente al tratamiento utilizado contra la primera infección.

Dentro de la infección por virus de la gripe de la coinfección, la infección por virus de la gripe puede estar mediada por virus de la gripe A o virus de la gripe B, preferentemente el virus de la gripe A es H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 o H5N1. En una realización, el virus de la gripe A es H1N1. En otras realizaciones, el virus de la gripe A es H3N2, H5N1 y H7N9. En realizaciones adicionales, el virus de la gripe A es H3N2, H5N1, H1N1, H5N6, H7N2 y H7N9.

La presente invención también se refiere a una "infección bacteriana" que puede tener lugar en el entorno de una coinfección descrita anteriormente presente en un hospedador, por ejemplo, un sujeto y/o célula. La infección bacteriana puede estar mediada por cualquier bacteria; preferentemente está mediada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enStaphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

La infección bacteriana puede estar mediada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enStaphylococcus,preferentementeStaphylococcus aureus, Staphylococcus aureussensible a la meticilina y resistente a la meticilina,Staphylococcus aureusque expresa Panton-Valentine (PVL) y/oStreptococcaceae,preferentementeStreptococcus mitis, Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumonia, Legionella,preferentementeLegionella pneumophila, Pseudomonas,preferentementePseudomonas aeruginosa, Bacillus, preferentemente Bacillus subtilis, Chlamydophila,preferentementeChlamydophila pneumonia, Mycoplasma,preferentementeMycoplasma pneumonia, Klebsiella,preferentementeKlebsiella pneumonia, Moraxella,preferentementeMoraxella catarrhalis y/o Haemophilus influenza.Preferentemente, la bacteria se selecciona del grupo que consiste enStaphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia o Haemophilus influenza.Más preferentemente la bacteria esStaphylococcus aureus.

La "enfermedad vírica" o "infección vírica" a la que también se refiere esta invención puede tener lugar en el entorno de una coinfección descrita anteriormente o se puede presentar como la única infección presente en un hospedador, por ejemplo, un sujeto y/o célula. La enfermedad o infección vírica puede estar mediada por cualquier virus; preferentemente está mediada por un virus que causa infecciones del tubo respiratorio tal como un virus de ARN. Los virus preferidos son los virus de la gripe o los virus de coronavirus. Preferentemente, la infección por virus de la gripe está mediada por virus de la gripe A o virus de la gripe B, en donde se prefieren virus de la gripe A. Particularmente preferidos son los subtipos de virus de la gripeAH1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 y/o H5 N1. Preferentemente, la infección por coronavirus está mediada por SARS-CoV, SARS-CoV2 o MERS-CoV.

En una realización alternativa, PD-0184264 se administra en combinación con uno o más inhibidores de MEK. Los inhibidores de MEK comprenden, por ejemplo, U0126, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA 119, RO-5126766, RO-4987655, CI-1040, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059, ARRY-438162, ARRY 162, ARRY 300, PF-3644022 y PD184352. El inhibidor de MEK adicional se puede administrar simultánea, previa o posteriormente a PD-0184264.

Preferentemente, PD-0184264 es para su uso de los métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección de la presente invención, en donde PD-0184264 se combina con uno o más inhibidores que se dirigen al virus de la gripe o la bacteria. El PD-0184264 se puede administrar simultánea, previa o posteriormente al uno o más inhibidores que se dirigen al virus de la gripe.

En general, un inhibidor dirigido al virus de la gripe es cualquier inhibidor o medicamento efectivo en la terapia de la gripe. Se sabe que diferentes sustancias son eficaces para reducir una infección por el virus de la gripe. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, inhibidores contra la neuraminidasa vírica, compuestos que se dirigen a una proteína del canal iónico vírico (M2) y compuestos que se dirigen a la actividad de la polimerasa o endonucleasa vírica mediante la interferencia con un componente del complejo de polimerasa vírica: PB1, PB2, PA o NP. Mediante la invención también se prevén sales farmacéuticamente aceptables de los inhibidores. Un inhibidor preferido, sin embargo, es un inhibidor de MEK, particularmente PD 0184264 preferido, como se describe en la presente.

Los "inhibidores de MEK" inhiben la cascada de señalización mitogénica Raf/MEK/ERK en células o en un sujeto mediante la inhibición de la MEK (proteína cinasa cinasa activada por mitógeno). Esta cascada de señalización es secuestrada por muchos virus, en particular virus de la gripe, para impulsar la replicación vírica. Por lo tanto, el bloqueo específico de la vía Raf/MEK/ERK en el cuello de botella de MEK perjudica el crecimiento de virus, en particular virus de la gripe. Adicionalmente, los inhibidores de MEK muestran baja toxicidad y pocos efectos secundarios adversos en humanos. Tampoco hay tendencia a inducir resistencia vírica (Ludwig, 2009). Un inhibidor particularmente preferido es PD-0184264.

Un "inhibidor de neuraminidasa" es un fármaco antivírico dirigido al virus de la gripe, que funciona bloqueando la función de la proteína neuraminidasa vírica, evitando así que el virus se libere de las células hospedadoras infectadas, ya que los virus recién producidos no pueden brotar de la célula en la que se han replicado. También se comprenden sales farmacéuticamente aceptables de un inhibidor de neuraminidasa. Los inhibidores de neuraminidasa preferidos son oseltamivir, zanamivir, peramivir, laninamivir o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas sustancias, tal como oseltamivir fosfato, oseltamivir carboxilato, etc. Los inhibidores de la neuraminidasa más preferidos son oseltamivir fosfato, zanamivir, oseltamivir o peramivir.

Los compuestos que se dirigen a la proteína del canal iónico vírico (M2) son, por ejemplo, amantadina y/o rimantadina, mientras que el compuesto que se dirige a la actividad de la polimerasa o endonucleasa mediante la interferencia con un componente del complejo de polimerasa vírica, PB1, PB2, PA o NP son, por ejemplo, el bloqueador de NP nucleozina o el inhibidor de polimerasa T-705 (Favipiravir).

De manera adicional, PD-0184264 se puede combinar con uno o más inhibidores que se dirigen a la bacteria. El Ejemplo 6 muestra que PD-0184264 aumenta la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos. Un inhibidor dirigido a la bacteria puede ser cualquier inhibidor eficaz para reducir la infección bacteriana. En la presente invención, se prefiere fuertemente PD 0184264 como un inhibidor dirigido a la bacteria, pero otro inhibidor dirigido a la bacteria conocido por el artesiano experto es un antibiótico. Los antibióticos preferidos se pueden obtener de la tabla 1 (figura 12). Por lo tanto, en una realización, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en los antibióticos como se enumeran en la tabla 1 (figura 12). En una realización adicional, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en la clase de antibióticos como se enumera en la tabla 1 (figura 12). En otra realización, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en el nombre genérico de los antibióticos como se enumeran en la tabla 1 (figura 12). Más preferidos son los antibióticos seleccionados de gentamicina, rifampicina, lisostafina, eritromicina, levofloxacina, vancomicina, teicoplanina, penicilina y oxacilina.

El "sujeto", que puede ser tratado por los inhibidores, en particular inhibidores de MEK, o combinaciones de inhibidores de la presente invención es preferentemente un vertebrado. En el contexto de la presente invención, el término "sujeto" incluye un individuo que necesita un tratamiento de una coinfección como se describe en la presente o una infección bacteriana o vírica sola. Preferentemente, el sujeto es un paciente que padece una coinfección o una infección bacteriana o vírica sola o que está en riesgo de padecerla. Preferentemente, el paciente es un vertebrado, más preferentemente un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, ratones y ratas. Preferentemente, un mamífero es un ser humano, caballo, perro, gato, vaca, cerdo, ratón, rata, etc., particularmente preferido, es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano, que opcionalmente tiene más de 1 año y menos de 14 años, entre las edades de 50 y 65, entre las edades de 18 o 50, o más de 65 años. En otras realizaciones, el sujeto es un sujeto humano, que se selecciona del grupo que consiste en sujetos que tienen al menos 50 años, sujetos que residen en centros de atención crónica, sujetos que tienen trastornos crónicos del sistema pulmonar o cardiovascular, sujetos que requirieron seguimiento médico regular u hospitalización durante el año anterior debido a enfermedades metabólicas crónicas, disfunción renal, hemoglobinopatías o inmunosupresión, sujetos con menos de 14 años, sujetos entre 6 meses y 18 años que reciben terapia con aspirina a largo plazo, y mujeres que estarán en el segundo o tercer trimestre del embarazo durante la temporada de gripe.

En el método de la invención, PD-0184264 se puede administrar por vía oral, intravenosa, intrapleural, intramuscular, tópica o por inhalación. Preferentemente, PD-0184264 se administra mediante inhalación, por vía tópica u oral. En una realización preferida, PD-0184264 se administra una vez al día en una dosificación oral entre 100 mg y 900 mg, preferentemente 600 mg, durante 7 a 21 días.

Específicamente, como se describe en el Ejemplo 14, se administró PD-0184264 con una dosis inicial de 100 mg y hasta tres pasos de escalamiento en siete brazos, después de una pauta de dosis ascendente individual/dosis ascendente múltiple (SAD/MAD). El esquema de administración fue de una dosis de PD-0184264, escalando de 100 mg a 900 mg (SAD), seguido de siete dosis de PD-0184264, escalando de 100 mg a 600 mg al día durante siete días (MAD). Cada cohorte de dosis se consideró segura por el Comité de Revisión de Seguridad (src), con liberación permitida para la siguiente dosis más alta (hasta SAD 900 mg y MAD 600 mg, respectivamente). El perfil farmacocinético observado respalda la pauta prevista de una vez al día para el desarrollo clínico posterior.

Solo se observaron pocos acontecimientos adversos en total y no se observaron acontecimientos adversos graves durante el ensayo. Por lo tanto, se considera que PD-0184264 es seguro y bien tolerable. La exposición farmacocinética y la determinación de la inhibición de MEK se verificaron y confirman el mantenimiento de los niveles sanguíneos clínicamente relevantes.

La presente invención también contempla diferentes composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas. La presente invención se refiere a una composición que comprende PD-0184264 para su uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica. La presente invención se refiere de manera similar a una composición que comprende PD-0184264 para su uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana y/o enfermedad vírica. También se proporciona en la presente invención una composición que comprende PD-0184264 y uno o más inhibidores que se dirigen al virus, en particular virus de la gripe, y/o la bacteria para su uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una infección vírica, en particular infección por virus de la gripe. Además, la presente invención se refiere a una composición que comprende PD-0184264 y uno o más inhibidores que se dirigen a la bacteria para su uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana o infección vírica.

Como se mencionó anteriormente, la composición que comprende PD-0184264 y eventualmente uno o más inhibidores que se dirigen a la bacteria y/o uno o más inhibidores que se dirigen al virus, en particular el virus de la gripe, puede ser una composición farmacéutica. Una realización preferida de la composición farmacéutica comprende PD-0184264 y un inhibidor dirigido al virus de la gripe, en particular un inhibidor de neuraminidasa. En otra realización, la composición farmacéutica comprende PD-0184264 un inhibidor de MEK adicional. Preferentemente, estas composiciones comprenden además un portador, preferentemente un portador farmacéuticamente aceptable. La composición puede estar en forma de suspensiones o tabletas administrables por vía oral, aerosoles nasales, preparaciones para dispositivos de inhalación, preparaciones inyectables estériles (por vía intravenosa, intrapleural, intramuscular), por ejemplo, como suspensiones o supositorios acuosos u oleaginosos inyectables estériles.

La composición farmacéutica para el uso de la invención y que comprende PD-0184264 y opcionalmente uno o más inhibidores que se dirigen a un virus de la gripe y/o uno o más inhibidores que se dirigen a una bacteria se administra a un paciente que es un mamífero o ave. Los ejemplos de mamíferos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un ratón, una rata, una vaca, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, un gato, un caballo, una cobaya, un canino, un hámster, un visón, una foca, una ballena, un camello, un chimpancé, un macaco de la India y un ser humano, con un ser humano preferido. Ejemplos de aves adecuadas incluyen, pero no se limitan a, un pavo, un pollo, un ganso, un pato, una cerceta, un ánade real, un estornino, un ánade rabudo del norte, una gaviota, un cisne, ave de Guinea o ave acuática, por nombrar algunos. Los pacientes humanos son una realización particular de la presente invención.

El inhibidor o inhibidores se administran preferentemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. La "cantidad terapéuticamente eficaz" para PD-0184264 o cada compuesto/inhibidor activo puede variar con factores que incluyen, pero no se limitan a, la actividad del compuesto utilizado, la estabilidad del compuesto activo en el cuerpo del paciente, la severidad de las condiciones a ser aliviadas, el peso total del paciente tratado, la ruta de administración, la facilidad de absorción, distribución y excreción del compuesto por el cuerpo, la edad y sensibilidad del paciente a ser tratado, acontecimientos adversos y similares, como será evidente para un artesano experto. La cantidad de administración se puede ajustar a medida que los diversos factores cambian con el tiempo.

Los inhibidores, métodos y usos descritos en la presente son aplicables tanto a la terapia humana como a aplicaciones veterinarias. Los compuestos descritos en la presente, en particular, PD-0184264 y opcionalmente uno o más inhibidores que se dirigen a un virus de la gripe y/o uno o más inhibidores que se dirigen a una bacteria que tiene la actividad terapéutica deseada se pueden administrar en un portador fisiológicamente aceptable a un sujeto, como se describe en la presente. Dependiendo de la manera de introducción, los compuestos se pueden formular de una variedad de maneras como se analiza más adelante. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar de aproximadamente 0,1-100 % en peso. Los agentes se pueden administrar solos o en combinación con otros tratamientos. El Ejemplo 1 muestra que 25 y 75 mg/kg de PD-0184264 son efectivosin vivomediante administración oral. Por consiguiente, PD-0184264 se puede administrar en una dosificación en el intervalo de 10 a 100 mg/kg de PD-0184264, preferentemente en el intervalo de 25 a 75 mg/kg de PD-0184264. La administración preferida es como una dosificación una vez al día entre 100 y 900 mg, incluyendo cualquier cantidad de dosificación intermedia tal como 200, 300, 400, 500, 600, 700 y 800 mg. En una realización preferida, la administración es una vez al día y la dosificación es de 600 mg administrados por vía oral. PD-0184264 se puede administrar durante un período de tiempo de 1 a 21 días consecutivos o más, preferentemente durante 7 a 14 días.

Los compuestos farmacéuticos en el método de la presente invención se pueden administrar en cualquier forma farmacéutica unitaria adecuada. Las formulaciones orales adecuadas pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, suspensión, jarabe, goma de mascar, oblea, elixir y similares. Se pueden incluir portadores farmacéuticamente aceptables tal como aglutinantes, excipientes, lubricantes y agentes edulcorantes o saborizantes en las composiciones farmacéuticas orales. Si se desea, también se pueden incluir agentes convencionales para modificar gustos, colores y formas de las formas especiales.

Para formulaciones inyectables, las composiciones farmacéuticas pueden estar en polvo liofilizado en mezcla con excipientes adecuados en un vial o tubo adecuado. Antes de su uso en la clínica, los fármacos se pueden reconstituir mediante la disolución del polvo liofilizado en un sistema de disolvente adecuado para formar una composición adecuada para inyección intravenosa o intramuscular.

La combinación de PD-0184264 con un agente antivírico tal como un inhibidor de neuraminidasa, tal como oseltamivir, lleva a un efecto sinérgico. Este efecto sinérgico puede ser un aumento del efecto antivírico que resulta, por ejemplo, en una titulación reducida del virus o una ventana terapéutica prolongada. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264, así como una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de neuraminidasa elegido del grupo de oseltamivir, oseltamivir fosfato, laninamivir, zanamivir y peramivir.

En una realización, la composición puede estar en una forma administrable por vía oral (por ejemplo, tableta o cápsula o jarabe, etc.) con una cantidad terapéuticamente eficaz (por ejemplo, de 0,1 mg a 2000 mg, de 0,1 mg a 1000 mg, de 0,1 mg a 500 mg, de 0,1 mg a 500 mg, de 0,1 mg a 200 mg, de 30 mg a 300 mg, de 0,1 mg a 75 mg, de 0,1 mg a 30 mg) del inhibidor de neuraminidasa como se describió anteriormente.

En realizaciones adicionales, PD-0184264 es para su uso en los métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección de la presente invención, en donde PD-0184264 reduce tanto la infección vírica como bacteriana, cuando se pone en contacto con un sistema de pruebain vitro,en donde el sistema de prueba comprende células cultivadas infectadas con

a) un virus de la gripe

b) una bacteria

en comparación con el sistema de pruebain vitroantes de entrar en contacto. En otra realización, PD-0184264 es para su uso en los métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana de la presente invención, en donde PD-0184264 reduce la infección bacteriana, cuando se pone en contacto con un sistema de pruebain vitro,en donde el sistema de prueba comprende células cultivadas infectadas con una bacteria, cuando se compara con el sistema de pruebain vitroantes del contacto.

Como tal, un aspecto no reivindicado de la divulgación también se refiere a un sistema de pruebain vitro,en donde el sistema de prueba comprende células cultivadas infectadas con

a) un virus de la gripe y

b) una bacteria.

En esta línea, un aspecto no reivindicado de la divulgación también proporciona un sistema de pruebain vitro,en donde el sistema de pruebain vitrocomprende células cultivadas infectadas con una bacteria.

En los casos donde el sistema de pruebain vitroincluye una infección vírica y bacteriana, nuevamente, estas infecciones pueden tener lugar de forma secuencial o simultánea.

Una "célula cultivada" o "células cultivadas" son células, que no están presentes en su entorno natural, por ejemplo, dentro de una planta o animal. Más bien, una célula cultivada puede ser un cultivo celular primario, que comprende células aisladas de su entorno natural o una línea celular. Preferentemente, las células cultivadas son células epiteliales pulmonares humanas. Preferentemente, las células cultivadas se siembran a una densidad de aproximadamente 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 10 x 105, 11 x 105, más preferentemente 8 x 105 células en 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml, 3 ml, 3,5 ml, 4 ml de medio tal como DMEM. Lo más preferido es una densidad de 8 x 105 en 2 ml de DMEM.

Estas células cultivadas se infectan con un virus y una bacteria o, en otras realizaciones, con una bacteria sola. Como ya se describió anteriormente, una coinfección puede tener lugar de manera secuencial o simultánea. Por ejemplo, las células cultivadas se pueden infectar primero con el virus de la gripe y 30 minutos después con bacteria/bacteria. También es posible agregar adicionalmente un antibiótico al cultivo después de 3 horas, para retirar las bacterias extracelulares. En tal escenario, el antibiótico se volvería a lavar. En otras realizaciones, las células solo se infectan con una bacteria.

La expresión "poner en contacto" como se usa en la presente se refiere al acercamiento espacial de una célula que comprende un virus de la gripe y una bacteria a PD-0184264. Esto puede significar, por ejemplo, que se aplica un inhibidor al medio en el que se ubican las células cultivadas mediante una jeringa.

En una realización, la reducción de la infección vírica es una reducción en unidades formadoras de placa (ufp)/ml y la reducción en la infección bacteriana es una reducción en unidades formadoras de colonias (ufc)/ml. Las "unidades formadoras de placa" son una medida del número de partículas capaces de formar placas por volumen de unidad, tal como partículas de virus. Es una medición funcional en lugar de una medición de la cantidad absoluta de partículas: las partículas víricas que son defectuosas o que no infectan su célula diana no producirán una placa y, por lo tanto, no se contarán. Por ejemplo, una solución del virus de la gripe con una concentración de 1000 ufp/pl indica que 1 pl de la solución lleva suficientes partículas de virus para producir 1000 placas infecciosas en una monocapa celular. En el caso de la presente invención, un cultivo celular tratado con un inhibidor muestra un número reducido de unidades formadoras de placa en un cultivo después del tratamiento, en comparación con un cultivo antes del tratamiento con PD-0184264.

Una posible "reducción en unidades formadoras de placa (ufp)/ml" se analiza de la siguiente manera. En primer lugar, las células cultivadas, que están coinfectadas con un virus de la gripe y una bacteria, se analizan para determinar su capacidad de generar unidades formadoras de placa (ufp)/ml, por ejemplo, succionando algunas células de la placa de Petri y colocándolas en placas para contar las placas bacterianas que se formarán. Este resultado luego se compara con el número de unidades formadoras de placa (ufp)/ml generadas por células del mismo cultivo después de que se aplicó el inhibidor. Si el número de unidades formadoras de placa (ufp)/ml se reduce después del tratamiento con un inhibidor en comparación con el número generado antes de la aplicación del inhibidor, hay una reducción en las unidades formadoras de placa.

Las "unidades formadoras de colonias (ufc)/ml" estiman el número de bacterias viables en una muestra. Existen diferentes métodos. Por ejemplo, para generar unidades formadoras de colonias, se distribuye una muestra (por ejemplo, células cultivadas en un volumen pequeño) a través de la superficie de una placa de agar nutritivo y se deja secar antes de la incubación para su recuento. Una bacteria viable se define como la capacidad de multiplicarse a través de la fisión binaria en las condiciones controladas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo; cuando se cuentan colonias, es incierto si la colonia surgió de una célula o 1000 células. Por lo tanto, los resultados se informan como ufc/ml (unidades formadoras de colonias por mililitro) para líquidos y ufc/g (unidades formadoras de colonias por gramo) para sólidos para reflejar esta incertidumbre (en lugar de células/ml o células/g).

Las "unidades formadoras de colonias (ufc)/ml" se pueden analizar de la siguiente manera. En primer lugar, las células cultivadas, que están coinfectadas con un virus de la gripe y una bacteria o con una bacteria sola, se analizan para determinar su capacidad de generar unidades formadoras de colonias (ufc)/ml, por ejemplo, succionando algunas células de la placa de Petri y colocándolas en placas para su recuento. Este resultado luego se compara con el número de unidades formadoras de colonias (ufc)/ml generadas por células del mismo cultivo después de que se aplicó el inhibidor. Si el número de unidades formadoras de colonias (ufc)/ml se reduce al número generado antes de la aplicación del inhibidor, hay una reducción.

En general, el experto en la técnica conoce estas técnicas bien conocidas de análisis de infecciones bacterianas y víricas. La forma en que se pueden medir las unidades formadoras de placa (ufp)/ml y las unidades formadoras de colonias (ufc)/ml se describe adicionalmente en la literatura (Tuchscherret al.2011, Hrinciuset al.2010).

A los efectos de la invención, el compuesto activo como se define anteriormente también incluye la o las sales farmacéuticamente aceptables de este. La expresión "sales farmacéutica o cosméticamente aceptables", como se usa en la presente, significa aquellas sales de compuestos de la invención que son seguras y eficaces para la forma de administración deseada. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tal como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

Se debe señalar que, como se usa en la presente, las formas singulares "un", "una" y "la/el", incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos reactivos diferentes.

A menos que se indique lo contrario, se entenderá que el término "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento de la serie.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tal como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero establecido o paso o grupo de números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o paso o grupo de número entero o paso. Cuando se usa en la presente, el término "que comprende" se puede sustituir con el término "que contiene" o, a veces, cuando se usa en la presente con la expresión "que tiene".

Cuando se usa en la presente "que consiste en" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en la presente, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o pasos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como que limitan el alcance de la invención. Los ejemplos se incluyen para propósitos de ilustración y la presente invención está limitada solo por las reivindicaciones.

Ejemplo 1: El tratamiento de ratones con PD-0184264 lleva a la reducción del título de virus en el pulmón

Se infectaron ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad (cinco por grupo) con 1,5 x 105 ufp (5x MLD50) de la cepa del virus de la gripe A/Regensburg/D6/2009, (RB1, H1N1pdm09). Comenzando una hora antes de la infección, los ratones se trataron con 150 mg/kg de CI-1040; 75 mg/kg de CI-1040, 25 mg/kg de CI-1040, 75 mg/kg de PD0184264, 25 mg/kg de PD0184264 o disolvente (control): 50 pl de DMSO/150 pl de Cremophor/800 pl de PBS en un intervalo de 8 horas. Todos los animales recibieron un volumen de 200 pl por vía oral. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la infección y los pulmones se pesaron, se transfirieron a un tubo de matriz de lisis D (MP Bio) y BSS (solución salina amortiguada) en una cantidad del volumen de 10 veces del pulmón se aplicó a las muestras. Los órganos se trituraron usando FastPrep FP 120 (Savant). Para retirar los desechos celulares, los homogeneizados se centrifugaron durante 15 min a 2000 rpm y el sobrenadante se recolectó. La determinación del título de virus en homogeneizados se realizó usando el ensayo de placa AVICEL®. Los resultados se presentan en la figura 1 como título de virus (log10) ufp/ml (izquierda) o % título de virus (derecha). El título del virus fue determinado por dos investigadores de forma independiente. Se presentaron los valores medios de todas las titulaciones.

Ejemplo 2: La administración de CI-040 o PD-0184264 exhibe efectos inhibidores en el crecimiento bacteriano incluyendo MRSAin vitro

Para investigar el efecto de CI-1040 o PD-0184264 en el crecimiento de bacterias en general, se complementó un cultivo nocturno libre de células de la cepa de MRSA S.aureus(USA300) con 50 pM de ya sea CI-1040 o de PD 0184264 o el mismo volumen (40 pl) de DMSO, que sirve como disolvente (figura 2). El crecimiento bacteriano se monitoreó durante 360 minutos. p D-0184264 tuvo un fuerte impacto en el crecimiento bacteriano, que estuvo casi completo ausente durante todo el período de observación. CI-1040 inhibió ligeramente los crecimientos de MRSA comenzando 120 minutos después del inicio del experimento, en comparación con el control de disolvente como se puede ver en la figura 2. Esto indica que PD-0184264 pero también CI-1040 además de bloquear MEK en las células también bloquea un componente bacteriano responsable del crecimiento bacteriano.

Para la investigación de las concentraciones de PD-0184264 necesarias para inhibir el crecimiento bacteriano, PD-0184264 se administró en diferentes concentraciones (como se indica en la figura 3) a un cultivo nocturno de S.aureusUSA300 (MRSA). Las bacterias MRSA se incubaron con diferentes concentraciones del inhibidor de MEK que varían de 0 a 100 pM y el crecimiento bacteriano se monitoreó seis horas después del cultivo. La concentración necesaria para inhibir el 50 % de los crecimientos bacterianos estaba en el intervalo de 15-25 pM.

Estos datos podrían verificarse en un entorno experimental ligeramente diferente, determinando los títulos bacterianos reales en lugar de la DO en puntos de tiempo posteriores después del tratamiento. Se estableció un cultivo durante el día de S.aureus6850 a 20 ufc/ml y se trató con diferentes concentraciones de CI-1040 como se indica durante la noche a 37 °C y 5 % de CO<2>. Luego, se midió la densidad óptica (DO600). El cultivo restante se lavó con PBS y las diluciones en serie se objetaron a las placas de agar BHI. Los títulos bacterianos se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml). Los resultados representan la media DT de tres experimentos biológicos independientes con dos réplicas técnicas que se muestran en la figura 4A. Además, los cultivos durante el día de S.aureus6850 (figura 4B) o la cepa de MRSA USA300 (figura 4C) se establecieron a 20 ufc/ml y se trataron con diferentes concentraciones de<p>D-0184264 como se indica durante la noche a 37 °C y 5 % de CO<2>. Por la mañana, se midió la densidad óptica (DO600). Los cultivos restantes se lavaron una vez con p Bs y las diluciones en serie se objetaron a las placas de agar BHI. Los títulos bacterianos se determinaron utilizando el contador de colonias "protocolos" y se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml) en una escala logarítmica. Los resultados representan la media ± DT de tres experimentos biológicos independientes con dos réplicas técnicas. La significación estadística se analizó mediante ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Tanto CI-1040 (figura 4A) como PD-0184264 (figura 4B, C) también fueron eficaces en estos ensayos contra S.aureuscepa 6850 (figura 4A, B) y MRSA cepa USA 300 (figura 4C). Se pudo detectar una reducción muy fuerte de títulos de hasta 1,5-2 órdenes de una magnitud con 20 pM de PD-0184264 (figura 4B, C).

Ejemplo 3: La administración de PD-0184264 a células singulares o coinfectadas protege las células de los efectos citopáticos de VGA y/o S.aureus

Dado el efecto antivírico y el fuerte efecto antibacteriano de PD-0184264 (figura 2 a 4 Ejemplo 2), analizamos si esta característica del compuesto también podría observarse macroscópicamente con respecto a los efectos citopáticos de alteración celular (CPE) provocados por VGA (virus de la gripe A) y/o infección por S.aureus.Se pretrataron células epiteliales pulmonares humanas (A549) con PD-0184264 (a las concentraciones indicadas) o disolvente (DMSO) y se infectaron con la cepa A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) del virus de la gripe humana a una multiplicidad de infección (Mdl = 0,001) a 37 °C. Después de 30 min, se retiró la dilución del virus, se enjuagaron las células con PBS y se complementaron con medio de invasión DMEM/INV (que contiene albúmina sérica humana al 1 %, HEPES 25 nM) con o sin S.aureus6850 (MdI = 0,1) en presencia de las concentraciones indicadas del inhibidor o control con disolvente. 3 h después de la infección bacteriana, las células se trataron con DMEM/FBS que contenía FBS al 10 %, 2 |jg/ml de lisostafina durante 20 min para retirar las bacterias extracelulares. Después de un lavado adicional con p Bs , las células se complementaron con medio de infección DMEM/BA (0,2 % de BA, MgCh 1 mM, CaCl20,9 mM, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina) que contiene inhibidor o disolvente. Después de un período de incubación de 24 h a 37 °C, se examinó la morfología celular mediante microscopía de luz. Como se muestra en la figura 5, se observó una ligera interrupción de la monocapa celular después de una infección singular con VGA (H1N1) o la cepa de S.aureus6850. Este CPE se incrementó fuertemente después de la coinfección con ambos patógenos (panel inferior). Sin embargo, con el aumento de las cantidades del inhibidor de MEK, este fenotipo se podría revertir de una manera dependiente de la concentración, ya que la monocapa celular se mantuvo intacta y las células tenían una forma menos redonda. Este efecto protector celular de PD-0184264 refleja perfectamente sus propiedades antivíricas y antibacterianas (figura 5).

Ejemplo 4: Comparación de la acción antibacteriana de PD-0184264 con los antibióticos comunes

Para alinear las propiedades antibacterianas del inhibidor de MEK PD0184164 con la acción de un antibiótico común, tratamos las bacterias durante la noche con disolvente, los inhibidores de MEK U0126 y PD-0184264 o diferentes concentraciones del antibiótico gentamicina. Los cultivos durante el día de S.aureus6850 o la cepa de MRSA USA300 se establecieron a 20 ufc/ml y se trataron como se indica durante la noche con los inhibidores de MEK U0126 y PD-0184264 o el antibiótico gentamicina a 37 °C y 5 % de CO2. Por la mañana, se midió la densidad óptica (DO600). Los cultivos restantes se lavaron una vez con PBS y las diluciones en serie se objetaron a las placas de agar BHI. Los títulos bacterianos se determinaron utilizando el contador de colonias "protocolos" y se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml). Los resultados que se muestran en la figura 6 representan la media ± DT de tres experimentos biológicos independientes con dos réplicas técnicas. La significación estadística se analizó mediante ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. En comparación con las bacterias tratadas con disolvente, la incubación con el inhibidor de MEK de primera generación U0126 dio como resultado solo una reducción menor en los títulos bacterianos, mientras que el tratamiento con PD-0184264 llevó a una reducción muy fuerte en la carga bacteriana como se muestra anteriormente en la figura 4. Esto fue cierto para ambas cepas bacterianas. Como se esperaba, el crecimiento de ambas cepas bacterianas fue fuertemente inhibido por el tratamiento con gentamicina con concentraciones superiores a 1 jg/ml, aunque la acción antibacteriana del antibiótico fue mayor en el caso de S.aureus6850. A 0,5 jg/m l de gentamicina no se pudo detectar ninguna reducción en los títulos bacterianos para ambas cepas. En resumen, el impacto del inhibidor de MEK PD-0184264 en el crecimiento bacteriano fue casi tan eficiente como las bajas concentraciones del antibiótico gentamicina.

Para comparar adicionalmente la acción antibacteriana de PD-0184264 con otros compuestos inhibidores de MEK o el antibiótico gentamicina, se realizaron ensayos de tiempo de adición (figura 7A). Se dividió un cultivo nocturno de S.aureus6850 en seis subcultivos que contenían 15 ml de medio de BHI junto con el disolvente DMSO solo o con uno de los inhibidores de MEK U0126 y PD-0184264 o dos concentraciones diferentes del antibiótico gentamicina (0,5 o 2 jg/ml). Inmediatamente después de la adición de los diferentes compuestos, se midió la DO600 y las diluciones en serie se objetaron a las placas de agar BHI para calcular los títulos bacterianos. Los cultivos restantes se incubaron adicionalmente a 37 °C con 5 % de CO2 en la presencia de las sustancias o disolvente solo. Este procedimiento se repitió dos veces a las 3 h y 6 h después de la inoculación. Los títulos bacterianos se determinaron utilizando el contador de colonias "protocolos" y se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml). El tratamiento con el inhibidor de MEK PD-0184264 mostró la inhibición más fuerte del crecimiento bacteriano en comparación con todos los demás compuestos. Luego, se realizó un intercambio de medio y los cultivos se incubaron adicionalmente sin la adición de ninguna sustancia. Todos los cultivos alcanzaron la turbidez del cultivo previamente tratado con disolvente, lo que indica que el inhibidor de MEK PD-0184264 exhibe una acción bacteriostática en lugar de bactericida.

El desarrollo de resistencia contra una variedad de antibióticos de uso común se presenta regularmente y representa un problema importante en las clínicas. Para evaluar si el inhibidor de MEK PD0184264 provoca el desarrollo de resistencia enS. aureus, los cultivos se trataron constantemente durante casi tres semanas en la presencia del inhibidor, gentamicina, eritromicina o se dejaron sin tratar. Específicamente, los cultivos se cultivaron durante 24 h en presencia o ausencia de las sustancias, se midió la DO600 y luego los cultivos se establecieron a 20 ufc/ml y se cultivaron nuevamente durante 24 h. Este procedimiento se repitió durante 17 días. Los datos representan la media DT de tres experimentos independientes. La significación estadística se analizó mediante ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (*p<0,05; **p<0,01; ** *p<0,001; ****p<0,0001). Como se observó para la gentamicina, el desarrollo de resistencia se presentó durante la primera semana de tratamiento en contraste con el antibiótico macrólido eritromicina. Sobre todo, el tratamiento con el inhibidor de MEK no indujo resistencia (ver los resultados que se muestran en la figura 7B).

Ejemplo 5: La cinasa bacteriana PknB puede ser una diana de PD-0184264 en bacterias

Se supone que el inhibidor PD-0184264 es específico para la cinasa MEK que existe en mamíferos. Su efecto antibacteriano directo plantea la pregunta sobre el modo de acción en procariotas, es decir, ¿hay un componente bacteriano similar a m Ek , que también podría ser específicamente dirigido por PD-0184264? En este punto, la serina bacteriana/treonina cinasa PknB entró en el foco de investigación. Esta cinasa muestra una alta similitud estructural y funcional con las serina/treonina cinasas celulares, más precisamente para cinasas MAP tal como p38, JNK y ERK (Milleret al.,2010, Raketteet al.2012) (figura 8), que son dianas MEK en células de mamíferos. Curiosamente, se demostró que la cinasa se activa por autofosforilación, lo que sugiere fuertemente que presenta una actividad similar a MEK.

Ejemplo 6: PD-0184264 aumenta la sensibilidad deStaphvlococcus aureusa los antibióticos y reduce la resistencia al estrés bacteriano

Debido a la expresión de tres dominios de unión a penicilina (PASTA) (véase la figura 8, panel superior), PknB está involucrado en la regulación de la susceptibilidad a los antibióticos. Se podría demostrar que la falta de la cinasa da como resultado una mayor susceptibilidad a diferentes antibióticos, especialmente una variedad de p-lactámicos (Tamberet al.2010). Para investigar si el tratamiento de bacterias con el inhibidor de MEK PD-0184264 puede tener un impacto en la cinasa bacteriana y da como resultado un fenotipo similar a la inactivación de la cinasa, los cultivos bacterianos se trataron durante la noche con disolvente (DMSO) o 20 pM de PD-0184264 y luego se usaron para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de diferentes antibióticos. Los cultivos durante el día de S.aureus6850 se establecieron a 20 ufc/ml y se trataron con disolvente (DMSO o el inhibidor de MEK PD-0184264 durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2. Por la mañana, se midió la densidad óptica (DO600). En resumen, los cultivos tratados con disolvente e inhibidor se lavaron una vez con PBS y las diluciones 1:1 se objetaron a las placas de agar BHI. Poco después de la inoculación, se colocaron tiras de prueba MIC para diferentes antibióticos (Thermo Fischer Scientific) en el medio de la placa y luego se incubaron durante 18 a 24 h a 37 °C. Después de 18 h de incubación a 37 °C, las concentraciones de MIC se determinaron mediante análisis visual de las placas. La concentración, a la que ya no era visible ninguna inhibición del crecimiento, se denominó como MIC para cada antibiótico individual. El tratamiento con PD-0184264 de hecho condujo a un aumento en la susceptibilidad de las bacterias a diferentes antibióticos, que fue más prominente en el caso de penicilina y gentamicina (figura 9, Tabla 2). Este resultado está en perfecta concordancia con los datos publicados generados con la cepa mutante, la cual carece de la cinasa (Tamberet al.2010).

Tabla 2: Determinación de MIC después del tratamiento nocturno con PD0184264

El aumento observado en la susceptibilidad a los antibióticos tras el tratamiento con PD-0184264, que coincide con el fenotipo de las bacterias que carecen de la cinasa (Tamberet al.2010), sugiere fuertemente que PknB podría ser dirigido directamente por el inhibidor. Como se sabe que la cinasa juega un papel importante en la resistencia al estrés bacteriano, se monitoreó el crecimiento bacteriano bajo estrés por calor después del tratamiento de la bacteria con el inhibidor PD-0184264. S.aureuscepa 6850 y MRSA cepa USA300 se trataron durante la noche con ya sea disolvente o 20 pM de PD-0184264. Al día siguiente, se prepararon subcultivos con la misma cantidad de bacterias (confirmados por DO600 y recubrimiento en agar BHI) y se incubaron adicionalmente a 42 °C durante 6 h. Los títulos bacterianos se calcularon luego mediante la colocación en placas de diluciones en serie en placas de agar BHI. Como se muestra en la figura 10, las bacterias tratadas con PD-0184264 se deterioraron fuertemente en estas condiciones en comparación con los patógenos tratados con disolvente. Esto se observa tanto para la cepa sensible a meticilina 6850 (barras negras) como para la cepa de MRSA USA300 (barras grises). El deterioro de la tolerancia al estrés en presencia del inhibidor es otra indicación de que PD-0184264 se dirige directamente a la cinasa PknB, que es un mediador importante de la resistencia al estrés. En resumen, los datos proporcionan pruebas circunstanciales sólidas de que PD-0184264 provoca su acción antibacteriana mediante la inhibición de la cinasa bacteriana PknB.

Ejemplo 7: La administración de PD-0184264 exhibe efectos inhibidores en el crecimiento deStreptococcus pneumoniaeyBacillus subtilis

Además de S.aureus,hay otras bacterias que se sabe que causan neumonía bacteriana secundaria después de infecciones por el virus de la gripe (IV) en pacientes. El patógeno más abundante en este contexto esStreptococcuspneumoniae.Estas bacterias representan la causa más común de neumonía adquirida en la comunidad. En contraste con S.aureus,las infecciones secundarias conStreptococcus pneumoniaese presentan más bien en una fase tardía después de IV y, por lo tanto, corresponden al término de neumonía posgripal.

Al igual que S.aureus,la mayoría de las cepas deStreptococcus pneumoniaeexpresan serina/treonina cinasas similares a eucariotas, tal como PknB, que se conservan altamente entre diferentes géneros.

Adicionalmente, estas cinasas comparten una alta homología con las cinasas MAP celulares (por ejemplo, ERK, JNK, p38). Los resultados mostrados en los Ejemplos 2-6 obtenidos con diferentes cepas de S.aureusya demostraron un efecto inhibidor del tratamiento con PD-0184264 en el crecimiento bacteriano, que apuntaba hacia la implicación de cinasas bacterianas, tal como PknB en el fenotipo observado. Sorprendentemente, también existe un homólogo de S.aureusPknB enStreptococcus pneumonia,lo que sugiere que estas bacterias también pueden ser sensibles a PD-0184264. Por lo tanto, se analizó el impacto de PD-0184264 en diferentes cepas de neumonía porStreptococci.Las cepas deStreptococcus pneumoniaese pueden dividir en diferentes serotipos, que difieren en su virulencia y patogenicidad general. Para probar un efecto independiente del serotipo o la cepa, se utilizaron las cepas encapsuladas D39 y TIGR4, que son virulentas, pero pertenecen a diferentes serotipos. Se encontró que el tratamiento con PD-0184264 altera el crecimiento de diferentes serotipos deStreptococcus pneumoniae.Específicamente, los cultivos durante el día de las cepas deStreptococcus pneumoniaeTIGR4 (serotipo 4) y D39 wt (serotipo 2) se establecieron en una densidad óptica (DO600) de 1, se diluyeron 1:2000 en medio BHI y se trataron durante la noche con disolvente (DMSO) o diferentes concentraciones del inhibidor específico de MEK PD0184264 (PD; metabolito activo de CI-1040) como se indica. Luego, la DO600 se midió nuevamente (los resultados se muestran en la figura 11A) y las series de dilución se objetaron a las placas de agar BHI para determinar los títulos bacterianos (los resultados se muestran en figura 11B). Como resultado, se podría demostrar que ambos serotipos son sensibles a PD-0184264 (figura 11 A, B).

Lo mismo es cierto paraBacillus subtilis,para el cual también se observó una fuerte disminución en los recuentos bacterianos viables en la presencia de PD-0184264 10 pM y la abolición completa a concentraciones más altas (véanse resultados en la figura 11C). Específicamente, para evaluar un efecto antibacteriano potencial enB. subtilis,los cultivos durante la noche deB. subtilisse incubaron con disolvente o diferentes concentraciones del inhibidor de MEK PD-0184264 (como se indica) durante 18 h. Después, la carga bacteriana se determinó mediante la medición de la DO600 y la colocación en placas de diluciones en serie en placas de agar BHI. Los datos que se muestran en la figura 11 representan la media DT de tres experimentos independientes.

En resumen, estos datos indican una amplia aplicabilidad de PD-0184264 en tratamientos antibacterianos.

Ejemplo 8: PD-0184264 pero no CI-1040 disminuye los títulos bacterianos intracelulares

La infección por el virus de la gripe (IV) resulta en una expresión mejorada de citocinas antivíricas, sobre todo los IFN de tipo I que activan respuestas antivíricas posteriores críticas y también pueden potenciar infecciones bacterianas posteriores. Para ver si el tratamiento con CI-1040 o PD-0184264 sensibilizaría las células para una infección secundaria por S.aureus,los cultivos celulares de células epiteliales basales alveolares humanas inmortalizadas (A549) se infectaron con gripe IV y S.aureusen la presencia o ausencia de los inhibidores. Específicamente, las células A549 se pretrataron durante 1 h con 10 pM del inhibidor de MEK específico PD-0184264 o DMSO como control de disolvente. Luego, las células se enjuagaron con PBS y se infectaron con el virus de la gripe (IV) (MdI como se indica) durante 30 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se infectaron con S.aureus6850 (MdI como se indica) en presencia o ausencia del inhibidor durante 3 h. Para evitar el crecimiento excesivo bacteriano, se realizó un paso de lavado con antibióticos con lisostafina (2 pg/ml) durante 20 min a 37 °C para retirar bacterias no internalizadas. Luego, las células se lavaron una vez y se incubaron adicionalmente hasta 24 h p.i. en la presencia del inhibidor o disolvente. Al final del período de incubación, la monocapa celular se analizó mediante microscopía de luz. El examen microscópico reveló que la superinfección con ambos patógenos dio como resultado un efecto citopático altamente aumentado (CPE) en comparación con las infecciones singulares (figura 13, panel superior). El CPE se abolió completamente en presencia de PD-0184264 (figura 13, panel inferior) que indica una replicación vírica reducida.

Para ver si el tratamiento con PD-0184264 y con CI-1040 fue comparable, las células A549 se pretrataron con CI-1040 10 pM, PD-0184264 o disolvente (DMSO) durante 60 min y luego se infectaron con gripe IV (H7N7) a un MdI de 0,001 a 37 °C. Los resultados se muestran en la figura 14A y14B, respectivamente. De manera alternativa, las células se dejaron sin tratar (DMSO) y se infectaron con IV (H1N1) a un MdI de 0,01 a 37 °C. Después de 30 min, se retiró la dilución del virus, se enjuagaron las células con PBS y se complementaron con medio de invasión con o sin S.aureus6850 (6850) (MdI de 0,1) en presencia de CI-1040 10 pM, p D-0184264 o control con disolvente. 3 h después de la infección bacteriana, las células se trataron con lisostafina (2 pg/ml) durante 20 min para retirar las bacterias extracelulares. Luego, las células se lavaron y complementaron con medio de infección que contiene el inhibidor o disolvente. Después de un período de incubación total de 24 h (infección postvírica), se analizaron los títulos bacterianos intracelulares. Los resultados representan la media DT de tres experimentos individuales. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparaciones múltiples de Tukey (*p <0,05; *p <0,01; **p <0,001; **p <0,0001). Como se puede ver en la figura 14A, el tratamiento con C i-1040 no sensibilizó las células para una infección secundaria con S.aureus yaque no se pudieron detectar cambios en la carga bacteriana intracelular. Sorprendentemente, la administración de PD-0184264 incluso dio como resultado títulos bacterianos intracelulares reducidos como se puede ver en la figura 14B. Se obtuvieron resultados comparables cuando se administraron CI-1040 o PD-0184264 en momentos posteriores durante la infección en curso como se muestra en la figura 14C.

Para descartar que la reducción en la replicación bacteriana vírica e intracelular fuera el resultado de un efecto citotóxico de PD-0184264 en las células A549, se monitoreó la viabilidad celular en presencia de concentraciones crecientes durante 24 y 48 horas. Adicionalmente, se realizó un ensayo de LDH para determinar la ruptura de membrana debido al tratamiento con inhibidores. Se demostró que el tratamiento de células A549 con PD-0184264 no induce toxicidad celular. Las células A549 se trataron durante 24 (como se muestra en la figura 15A y 15C) o 48 (como se muestra en la figura 15B y 15D) horas con concentraciones crecientes de PD-0184264 (1, 5, 10, 20, 50 o 100|jM). Después de los tiempos de incubación, se tomaron sobrenadantes para la medición de la liberación de LDH (que se muestra en la figura 15C y 15D) usando el kit de ensayo de citotoxicidad CytoSelect LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Adicionalmente, las células viables se contaron mediante tinción con azul tripán. La viabilidad celular se normalizó a células tratadas con DMSO y se muestra como el porcentaje de viabilidad. Los datos muestran la media DT de tres experimentos independientes. La significación estadística se calculó mediante ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (*p<0,05; **p<0,01; 27 **p<0,001).

Ejemplo 9: Determinación de los valores de Ck<n>para CI-1040 y PD-0184264

Las alícuotas del inhibidor se disolvieron en DMSO al 100 % (solución madre 10 mM). Para analizar los valores de CI<50>, se prepararon las siguientes diluciones en serie en una placa de microtitulación: 50<j>M, 25<j>M, 5<j>M, 2,5<j>M, 0,5<j>M, 0,25<j>M, 0,05<j>M, 0,025<j>M, 0,005<j>M. Se agregaron 1 j l de cada dilución a 4 j l de la mezcla de reacción de cinasa, lo que produjo las siguientes concentraciones de prueba: 1<j>M, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM.

Se mezclaron 3 j l de c-Raf1 activo, 2 j l de MEK1wt y 3 j l de ERK2wt de soluciones de proteína purificadas con amortiguador de cinasa y 1 j l de DMSO o DMSO/inhibidor (volumen final de 45 jl). La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esta preincubación, asegurando la unión del inhibidor a la proteína MEK, la reacción de cinasa se inició mediante la adición de 5 j l de ATP 10 mM y mezclando con la pipeta. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 26 °C Thermo mezclador (Eppendorf) a 500 rpm. Para detener la reacción de cinasa, se agregaron 5,5 j l de una solución de SDS al 20 % y esta mezcla se incubó posteriormente durante 10 min a 50 °C. Cada muestra luego se diluyó con 190 j l de amortiguador de bloqueo (1 % de BSA en TBST). Se adicionaron 100 j l de cada muestra a los pocillos recubiertos con anticuerpo anti-ERK de una placa de microtitulación de 96 pocillos.

Las muestras de reacción de cinasa (100 jl/pocillo) se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente en el anticuerpo anti-ERK recubierto y BSA bloqueó los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las placas se lavaron posteriormente 3 x 5 min con 100 j l de amortiguador de lavado TBST. Para detectar ERK fosforilado, se agregó un anticuerpo anti-fosfo-ERK (p44/p42) (1:3000, 100 jl/pocillo en amortiguador de bloqueo) y se incubó durante la noche a 4 °C.

Después de tres etapas de lavado (3 x 100 jl/pocillo), se adicionó un anticuerpo específico de IgG antirratón conjugado con HRP (1:1000 en TBST) y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 100 jl/pocillo de sustrato de peroxidasa ABTS después de tres pasos de lavado adicionales (3 x 100 jl/pocillo TBST) y se incubaron durante 30 minutos a 30 °C. La reacción del sustrato se detuvo mediante la adición de 2,5 j l de<s>D<s>al 20 %. La densidad óptica (DO) de la mezcla se mide a una longitud de onda de 405 nm en un lector de ELISA.

El ensayo de cinasa libre de células reveló que se necesita 12,5 veces menos CI-1040 (figura 16) para inhibir el 50 % de la actividad de MEK en comparación con PD-0184264 que en realidad es un inhibidor más débil de la cinasa MEK. Por lo tanto, nadie habría esperado los fuertes efectos antivíricos y antibacterianos de PD-0184264. Sin embargo, como se muestra en los ejemplos anteriores, PD-0184264 exhibe una actividad antivírica y antibacteriana más fuerte en comparación con CI-1040in vivo.

Ejemplo 10: Actividad antivírica de PD-0184264 en un ensayoin vitro

Fármacos

CI-1040 [2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro benzamida; Lote: CC-5395.0-16] y PD-0184264 (PD0184264) [ácido 2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-3,4-difluorobenzoico; lote: CC-5595.4-10] se sintetizaron en ChemCon GmbH (Freiburg, Alemania). Para los experimentos de cultivo celular, se preparó una solución madre 10 mM de CI-1040 (M = 478,66 g/mol) y PD-0184264 (M = 409,55 g/mol) en DMSO (Merck-Millipore; Alemania).

Virus y células

Se realizaron experimentos de inhibición de virus con la cepa del virus de la gripe A RB1 [A/Regensburg/D6/09 (H1N1pdm09)] con un MdI de 0,001.

Ensayo de inhibición del virus de descendencia

Las células A549 se infectaron con RB1 durante 30 minutos a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se aspiró la dilución del virus y las células se enjuagaron con PBS y se complementaron con 500 pl de IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove)/BA (albúmina bovina) - medio (0,2 % de BA, MgCh 1 mM, CaCl2 0,9 mM, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina) y 0,6 pl de tripsina tratada con TPCK en presencia de CI-1040 10 pM o diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 pM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM y 0,1 pM, concentración final de DMSO = 1 %) durante 24 h a 37 °C en 5 % de CO2. El control de disolvente fue IMDM/BA-medio con DMSO al 1 %. Los sobrenadantes de cultivo celular se recolectaron para determinar los títulos de virus de descendencia en células MDCK II usando el ensayo de placa AVICEL®, como se describió anteriormente (Haasbachet al.2011, Matrosovichet al.2006).

Ensayo WST

Se sembraron células A549 en una placa de tejido de fondo plano de 96 pocillos (Greiner, Alemania) y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 pM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM y 0,1 pM) disueltas en 100 pl de IMDM (ThermoFisher, Alemania) complementado con 5 % de concentración de DMSO final en suero fetal de ternera (Sigma-Aldrich; Alemania) = 1 % y el cultivo se realizó a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 h. A continuación, se añadieron 10 pl de reactivo WST-1 (Roche, Alemania) al medio de cultivo y se incubó durante cuatro horas. Durante este tiempo, la sal de tetrazolio estable WST-1 se escindió a un formazan soluble mediante células metabólicamente activas en el cultivo. Después de este período de incubación, el tinte de formazan formado se cuantificó con lector de ELISA a 405 nm. La absorbancia medida se correlacionó directamente con el número de células viables.

Resultados

La actividad antivírica de PD-0184264 contra RB1 se investigó en el ensayo de inhibición de virus estándar (figura 17A). Se encontró una reducción del 98,87 ± 0,03 % del título del virus cuando las células se trataron con 100 pM de PD-0184264(p>0,0001). Se encontró una reducción similar con PD-018426450 pM (91,50 ± 2,08 %;p>0,0001). Por el contrario, solo se encontró una reducción débil del título de virus, cuando se usó PD-0184264 10 pM (58,97 ± 4,45%). 1 pM de PD-0184264 resultó en casi ninguna reducción del virus de descendencia. Por lo tanto, en comparación con la reducción de virus con CI-1040 10 pM (96,78 ± 0,65 %;p>0,0001), se necesita una concentración casi 10 veces mayor de PD-0184264 para lograr una reducción similar del virus de la gripe de la descendencia. Esto también está en línea con el valor de CE<50>para PD-0184264 en comparación con CI-1040. Para PD-0184264, el valor de CE<50>es 0,804 pM (figura 17B). En otro trabajo, el valor de CE<50>para CI-1040 contra RB1 se podría determinar como 0,026 pM (Haasbachet al.2017). El valor de PD-0184264 CC50 de >1576 (figura 17C) es mayor en comparación con CI-1040 (>312,3 pM; Haasbachet al.2017). Por lo tanto, PD-0184264 tiene un S.I. = 1960 (índice de selectividad).

Resumen/Análisis

Los resultados demuestran una actividad antivírica reducida de PD-0184264 en cultivo celular, es decir,in vitro,en comparación con CI-1040. Se requiere casi una concentración 10 veces mayor de PD-0184264 para lograr la misma reducción de virus que con CI-1040 en un ensayoin vitro.La diferencia de valor de CE<50>entre estos dos compuestos es aún más pronunciada. Aquí, el valor de CE<50>de PD-0184264 es 31 veces mayor en comparación con el valor de CE<50>de CI-1040 (Haasbachet al.2017). El S.I. de PD-0184264 contra RB1 en células A549 también se reduce en comparación con el desarrollo de CI-1040.

Ejemplo 11: Reducciónin vivodel título de virus en el pulmón de ratones mediante PD-0184264

(A) Después de la infección por H1N1pdm09, los ratones hembra C57BL/6 se trataron con 2,8, 8,4 o 25 mg/kg de PD-0184264 (lado izquierdo) o con 25, 75 o 150 mg/kg de CI-1400 (lado izquierdo) por vía oral. 24 h después de la infección, los animales se sacrificaron y el pulmón se tomó para preparar una suspensión al 10 %. El título del virus se determinó usando el método estándar. La titulación del virus de ratones tratados con los dos inhibidores de MEK se comparó con la titulación del virus de ratones tratados con disolvente (Control) solo. La titulación del virus en los pulmones de los ratones de control se estableció en 100 % (barra negra). Se usó elsoftwareGraphpad Prism 7 para ilustrar ambas figuras.

Fármacos

CI-1040 [2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-(ciclopropil-metoxi)-3,4-difluoro-benzamida; Lote: CC-5395.0-16] y PD-0184264 (PD0184264) [ácido 2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-3,4-difluorobenzoico; lote: CC-5595.4-10] se sintetizaron en ChemCon GmbH (Freiburg, Alemania).

Para la aplicación oral de 25 mg/kg, se disolvieron 2,5 mg de PD-0184264 en 50 |jl de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) y se diluyeron adicionalmente con 0,15 ml de Cremophor EL (Merck-Millipore, Alemania) y 0,8 ml de PBS (Gibco, Alemania). Para la aplicación de 8,4 mg/kg y 2,8 mg/kg, 0,84 mg o 0,28 mg de PD-0184264 se disolvieron con 50 j l de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) y se diluyeron adicionalmente con 0,15 ml de Cremophor EL/0,8 ml de PBS. Se disolvieron 202,5 mg de CI-1040 en 0,5 ml de DMSO/0,15 ml de Cremophor EL/0,8 ml de PBS y se diluyeron adicionalmente con Cremophor EL y PBS.

Animales

Se utilizaron ratones C57Bl/6 hembra de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania) con un peso corporal de 21,0-24,0 g en la administración para estudios antivíricos. Los animales se alimentaron normalmente. El agua potable estaba disponible a voluntad.

Aplicación del fármaco

Los fármacos se administraron usando una dosis única en el día de prueba 1 por sonda oral. La velocidad de aplicación fue de 15 s por dosis con un volumen de administración de 200 jl.

Ensayo de titulación del virus pulmonar

Los ratones se sacrificaron 24 h después de la infección y los pulmones se pesaron, se transfirieron a un tubo de matriz de lisis D (MP Bio) y BSS se aplicó en una cantidad del volumen de 10 veces del pulmón. Los órganos se trituraron usando FastPrep FP 120 (Savant). Para retirar los desechos celulares, los homogeneizados se centrifugaron durante 15 min a 2000 rpm y el sobrenadante se recolectó. La determinación del título de virus en homogeneizados se realizó usando el ensayo de placa AVICEL® como se describió anteriormente (Haasbachet al.2011, Mastrosovichet al.2006).

Resumen/Análisis

La figura 18 muestra los resultados de los experimentos. En comparación con el experimento de control, solo las concentraciones de 75 mg/kg o más de CI-1040 mostraron algún efecto en la reducción del título del virus. Por el contrario, PD-0184264 ya mostró una reducción del título del virus en el pulmón a una concentración de 2,8 mg/kg a aprox. 70 %. A una concentración de 8,4 mg/kg, el título del virus se reduce a una cantidad de aprox. 20 %, mientras que a 25 mg/kg el título del virus se reduce a aprox. 10 %. Por lo tanto, se necesita una concentración 6 veces menor de PD-0184264 para lograr un efecto similar a 150 mg/kg de CI-1040, lo que subraya el alto potencial de PD-0184264 para los efectos antivíricos.

Ejemplo 12: PD-0184264 tiene una mayor biodisponibilidad en comparación con CI-1040

(A) Los ratones NMRI macho se trataron con 75 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 75 mg/kg de PD-0184264 por vía intravenosa. Se recolectó sangre a los 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco. (B) Los ratones NMRI macho se trataron con ya sea 150 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 150 mg/kg de PD-0184264 por vía oral usando sonda oral. Se recolectó sangre a los 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco. Cada punto de datos representa el valor medio de tres muestras de plasma. Se usó elsoftwareGraphpad Prism 7 para ilustrar ambas figuras.

Fármacos

CI-1040 [2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-(ciclopropil-metoxi)-3,4-difluoro benzamida; Lote: CC-5395.0-15] y PD-0184264 (PD0184264) [ácido 2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-3,4-difluorobenzoico; lote: CC-5595.4-10] se sintetizaron en ChemCon GmbH (Freiburg, Alemania). Para la aplicación i.v., se disolvieron 30,65 mg de CI-1040 en 0,075 ml de DMSO (Sigma-Aldrich, Suiza) y se diluyeron adicionalmente con 0,225 ml de Cremophor EL (Merck-Millipore, Alemania) y 2,7 ml de PBS (Gibco, Alemania). Se disolvieron 34,88 mg de PD-0184264 en 0,075 ml de DMSO y se diluyeron adicionalmente con 0,225 ml de Cremophor EL/2,7 ml de PBS. Para la aplicación oral, se disolvieron 202,5 mg de CI-1040 en 0,5 ml de DMSO/1,5 ml de Cremophor EL/8,0 ml de PBS. Se disolvieron 81,0 mg de PD-0184264 en 0,2 ml de DMSO/0,6 ml de Cremophor EL/3,2 ml de PBS.

Animales

Se utilizaron ratones NMRI macho de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania) con un peso corporal de 23,9-36,5 g en la administración para estudios farmacocinéticos. Los animales se alimentaron normalmente. El agua potable estaba disponible a voluntad.

Toma de muestras de sangre y preparación de plasma

Los experimentos se realizaron en LPT GmbH (Hamburgo, Alemania). Se recolectó suficiente sangre entera - tomada bajo anestesia con isoflurano - para obtener al menos 2 x 100 |jl de plasma de Li-Heparina de 3 animales por grupo y punto de tiempo en los siguientes momentos: 0 (antes de la dosis), 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración. Las muestras de sangre entera se enfriaron al instante usando un sistema Iso-Therm-Rack (Eppendorf AG, Alemania) hasta la centrifugación dentro de las 0,5 horas después de la extracción. Inmediatamente después de la centrifugación, las muestras se almacenaron a 20 °C hasta un análisis adicional. El análisis de plasma se realizó usando procedimientos estándar en Prolytic GmbH (Frankfurt, Alemania).

Aplicación del fármaco

Los fármacos se administraron usando ya sea una dosis individual en el día de prueba 1 por sonda oral o por inyección en bolo intravenoso en una vena de la cola. La velocidad de inyección fue de 15s/dosis con un volumen de administración de 200 jl.

Resultados

Los experimentos farmacocinéticos revelaron que se encontró una mayor exposición de PD-0184264 después de i.v. (figura 19A) y mediante aplicación por vía oral (figura 19B) en el plasma de ratones en comparación con Cl-1040 con valores de AUC de 1953,68 jg*h/ml de PD-0184264, que son mucho más altos que los valores de CI-1040. Cabe señalar que a las ocho horas después de la aplicación i.v. y después de la aplicación por vía oral de CI-1040 casi no se detectó ningún fármaco en el plasma. Por el contrario, después de la aplicación por vía oral de PD-0184264 2 en el punto de datos de 8 h, aún se encontró una alta concentración.

Compendio/Análisis

La diferencia drástica en la exposición plasmática para PD-0184264 y CI-1040 después de la aplicación i.v. individual ya da lugar a la suposición de que CI-1040 podría degradarse rápidamente. Los inventores asumieron que el fármaco disminuye de manera monoexponencial. En general, esta suposición es válida. A bajas concentraciones, el fármaco usualmente disminuye de manera monoexponencial. Y la constante de la velocidad de eliminación terminal no cambia con el tiempo o con diferentes concentraciones del fármaco circulante. Sin embargo, en este punto no sabemos si otros procesos como un círculo enterohepático juegan un papel significativo en la fase terminal del perfil farmacocinético.

En conjunto, PD-0184264 muestra una alta actividad antivírica que CI-1040in vivo,que se puede basar en la mayor biodisponibilidad del fármaco.

Ejemplo 13: PD-0184264 tiene una ventana de tratamiento ampliada

Fármaco y aplicación de fármaco

Para la aplicación oral de 25 mg/kg, se disolvieron 10 mg de PD-0184264 en 50 j l de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) y se diluyeron adicionalmente con 0,15 ml de Cremophor EL (Merck-Millipore, Alemania) y 0,8 ml de PBS (Gibco, Alemania). Para la aplicación del disolvente, se diluyeron 50 j l de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) con 0,15 ml de Cremophor EL (Merck-Millipore, Alemania) y 0,8 ml de PBS (Gibco, Alemania). Los fármacos se administraron usando una dosis de dos veces al día por sonda oral con un intervalo de tiempo de ocho horas. El tratamiento comenzó 24, 48 o 72 horas después de la infección. La velocidad de aplicación fue de 15 s/dosis con un volumen de administración de 50 jl.

Animales

Se utilizaron ratones C57Bl/6 hembra de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania) con un peso corporal de 17,0-21,0 g en la administración para los estudios de supervivencia. Los animales se alimentaron normalmente. El agua potable estaba disponible a voluntad.

Infección por virus

Para la infección, los animales se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de 200 j l de ketamina/rompun. Se mezclaron cantidades iguales de una solución madre de rompun al 2 % (Bayer) y una solución madre de 10 % de ketamina (Sanofi) en una proporción de 1:10 con PBS. Se infectaron ratones por vía intranasal con 3 x 105 ufp de cepa A/Regensburg/D6/2009 Gripe H1N1pdm09 (5 x MLD50). Se diluyeron dosis adecuadas de virus en 50 j l de BSS y se inocularon 25 j l en cada fosa nasal. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Tuebingen.

Observación clínica

De acuerdo con las normas de las autoridades reguladoras, los animales se observaron y pesaron diariamente. Antes del inicio de los síntomas clínicos se observaron ratones dos veces al día y tres veces al día después del inicio de la enfermedad. Los ratones se tuvieron a sacrificar, cuando se encontró una reducción del 20 % del peso corporal. Ninguno de los animales murió en la jaula, todos fueron sacrificados por tratamiento con CO2 seguido de dislocación del cuello.

Resultados

Los ratones hembra C57BL/6 se infectaron con H1N1pdm09. El tratamiento con 25 mg/kg de PD-0184264 comenzó 24, 48 o 72 horas después de la infección. Los ratones que funcionaron como controles recibieron el disolvente solo. Estos animales se tuvieron que sacrificar entre los días cuatro y ocho después de la infección, porque mostraron una reducción de peso corporal de >20 %. Cuando el tratamiento comenzó 24 horas después de la infección, dos de cada ocho animales se tuvieron que sacrificar en el día diez, mientras que se protegieron seis de cada ocho ratones. No hubo diferencia en la reducción de peso corporal, sin embargo, el día diez después de la infección, los ratones volvieron a aumentar de peso hasta el final del período de observación. La diferencia entre el disolvente y los ratones tratados con PD-0184264 con respecto a la supervivencia fue estadísticamente significativa (prueba de Mantel-Cox de rango logarítmico P = 0,0001). Cuando el tratamiento comenzó 48 horas después de la infección, tres de cada ocho animales se tuvieron que sacrificar entre los días ocho y diez, y se protegieron cinco de cada ocho ratones. Una vez más, no hubo diferencia en la reducción de peso corporal. El día 9 después de la infección, los ratones volvieron a aumentar de peso hasta el final del período de observación. La diferencia en la supervivencia nuevamente fue significativa (prueba de Mantel-Cox de rango logarítmico P = 0,0004). La diferencia en la supervivencia también fue significativa (prueba de Logrank Mantel-Cox P = 0,0002), incluso el tratamiento comenzó hasta 72 horas después de la infección. Aquí, seis de cada ocho animales se tuvieron que sacrificar entre los días siete y diez, mientras que se protegieron dos de cada ocho ratones. A partir del día nueve después de la infección, los ratones aumentaron su peso corporal.

Compendio/Análisis

El tratamiento con 25 mg/kg de PD-0184264 de ratones infectados con H1N1pdm09 lleva a una diferencia significativa en la supervivencia, a pesar de que el fármaco se administró hasta 72 horas después de la infección.

Ejemplo 14: Ensayos clínicos de fase I sobre PD-0184264 en sujetos humanos sanos

Se realizó un estudio aleatorizado, con enmascaramiento doble, comparativo con placebo de aumento de la dosis y se demostró la seguridad y tolerabilidad de PD-0184264 en 70 voluntarios sanos. Siguió un diseño adaptativo con una dosis inicial de 100 mg y hasta tres etapas de aumento de la dosis en siete grupos, después de una pauta posológica ascendente individual/dosis ascendente múltiple (SAD/MAD). El esquema de administración fue de una dosis de PD-0184264, aumentando gradualmente de 100 mg a 900 mg (SAD), seguido de siete dosis de PD-0184264, aumentando gradualmente de 100 mg a 600 mg al día durante siete días (MAD). Cada cohorte de dosis se consideró segura por el Comité de Revisión de Seguridad (src), con liberación permitida para la siguiente dosis más alta (hasta SAD 900 mg y MAD 600 mg, respectivamente). El perfil farmacocinético observado respalda la pauta prevista de una vez al día para el desarrollo clínico posterior.

Solo se observaron pocos acontecimientos adversos en total y no se observaron acontecimientos adversos graves durante el ensayo. Por lo tanto, se considera que PD-0184264 es seguro y bien tolerable. La exposición farmacocinética y la determinación de la inhibición de MEK se verificaron y confirman el mantenimiento de los niveles sanguíneos clínicamente relevantes.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en un método de tratamiento de una enfermedad vírica, en donde el sujeto ha sido sintomático a la infección vírica durante al menos 36 horas, al menos 48 horas o al menos 72 horas cuando se ha iniciado el tratamiento.

2. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, para usar, además, en la prevención o el tratamiento de una coinfección bacteriana.

3. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la infección vírica es una infección del tubo respiratorio causada por un virus de ARN de hebra negativa o positiva.

4. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el virus de ARN de hebra negativa es un virus de la gripe, preferentemente en donde el virus es el virus de la gripe A o virus de la gripe B y, además, preferentemente en donde el virus de la gripe A se selecciona del grupo que consiste en H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 o H5N1, preferentemente en donde el virus de la gripe B se selecciona del grupo que consiste en Yamagata o Victoria de tipo VGB.

5. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la infección vírica está causada por un virus de ARN de hebra positiva, preferentemente en donde el virus es un coronavirus, más preferentemente en donde el virus es SARS-CoV, SARS-CoV2 o MERS.

6. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el virus es resistente al tratamiento antivírico estándar.

7. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el tratamiento antivírico estándar es administración de oseltamivir, zanamivir, peramivir, amantadina, rimantadina, favipiravir, baloxavir marboxil y/o pimodivir.

8. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el virus es el virus A H1N1 con la mutación H275Y.

9. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el sujeto se ha tratado con un fármaco antivírico estándar antes de la administración de PD-0184264.

10. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra junto con un inhibidor de neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el inhibidor de neuraminidasa se selecciona de oseltamivir, oseltamivir fosfato, zanamivir, laninamivir o peramivir, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

12. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en un sujeto, preferentemente un vertebrado, más preferentemente un ser humano.

13. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde PD-0184264 se administra a un sujeto humano una vez al día en una dosis de 100 a 900 mg, preferentemente de 600 mg.

14. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde PD-0184264 se administra a un sujeto humano en 1 a 21 días consecutivos, preferentemente 7 a 14 días consecutivos.

15. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde PD-0184264 se administra a un sujeto humano en una forma farmacéutica oral.