ES3013292T3

ES3013292T3 - Method for the conversion of insects into insect pulp and nutrient streams, insect pulp obtainable by this method

Info

Publication number: ES3013292T3
Application number: ES20828568T
Authority: ES
Inventors: Aman Paul
Original assignee: Protix BV
Current assignee: Protix BV
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2025-04-11
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: PL4075994T3; HUE070919T2; EP4544917A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para convertir insectos en una corriente de nutrientes, como un puré, un puré hidrolizado enzimáticamente, una fracción grasa y una fracción proteica. La invención también se refiere al puré (hidrolizado) y a las fracciones obtenibles mediante dichos métodos, así como a su uso como alimento o pienso, o como ingrediente para los mismos. La invención también se refiere a un método para convertir larvas de insectos en una composición con propiedades antioxidantes. Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para convertir larvas de insectos en una composición antioxidante. Además, la invención se refiere a una composición con propiedades antioxidantes obtenible mediante dicho método, así como a su uso como ingrediente alimentario o de pienso para la salud. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la conversión de insectos en pulpa de insecto y corrientes de nutrientes, pulpa de insecto que se puede obtener por este método

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método para convertir larvas de mosca soldado negra en corrientes de nutrientes, tal como un puré o pulpa de larvas de mosca soldado negra. La invención se refiere además al puré que se puede obtener por dichos métodos y a su uso como producto alimenticio o de pienso. La invención también se refiere a un método para convertir larvas de mosca soldado negra en una composición con propiedades antioxidantes. Además, la invención se refiere a un pienso, alimento, ingrediente alimenticio o ingrediente de pienso para su uso en un método para la prevención y/o supresión del daño oxidativo celular.

Antecedentes de la invención

La gestión de residuos sólidos urbanos se considera uno de los problemas ambientales más inmediatos y graves que enfrentan los gobiernos urbanos. La gravedad de este reto aumentará en el futuro dadas las tendencias de rápida urbanización y crecimiento en población urbana. Actualmente, el reciclaje de material de residuos orgánicos sigue siendo bastante limitado, aunque este es, con diferencia, la mayor fracción de todos los residuos municipales generados.

Un enfoque bastante novedoso para la conversión de biorresiduos es mediante larvas de insecto, usando, por ejemplo, la mosca soldado negra(Hermetia illucens),la mosca doméstica(Musca domestica)y el gusano de la harina(Tenebrio molitorL.).Su popularidad está ligada a las oportunidades prometedoras de usar las larvas recolectadas como fuente de proteína y grasa para piensos o productos alimenticios para animales, proporcionando, por tanto, una valiosa alternativa a otras fuentes (animales) de proteína y grasa.

Aunque muchas personas detestan el consumo de insectos enteros, el uso de insectos como fuente de grasas y proteínas separadas, que se usan posteriormente en la preparación de alimentos y piensos es más aceptable. Sin embargo, para que los insectos se conviertan en una fuente de nutrientes comercialmente viable, su producción y procesamiento debe llevarse a cabo a gran escala y las corrientes de nutrientes obtenidas deben estar libres de sabores y cambios de color no deseados.

Aunque ya se están usando instalaciones de producción de insectos a gran escala, la preparación económica de corrientes de nutrientes de suficiente calidad sigue siendo un reto.

En la solicitud de patente internacional WO2014123420 se ha descrito un método general para obtener corrientes de nutrientes a partir de insectos o gusanos. A pesar del hecho de que los métodos descritos en la misma pueden proporcionar corrientes de nutrientes de suficiente calidad, sigue existiendo la necesidad de aumentar más el rendimiento de dichos métodos y la calidad de las corrientes de nutrientes obtenidas con los mismos.

La solicitud internacional con número de publicación internacional WO 2018/122294 A1, publicada el 5 de julio de 2018, se refiere a un método para recuperar simultáneamente en medio acuoso, de una biomasa que contiene lípidos y proteínas, una fracción lipídica y una fracción proteínica, en donde el método comprende una etapa de extracción para extraer la fracción lipídica y proteínica de la biomasa.

Los insectos se consumen comúnmente como alimento en muchas culturas en todo el mundo. En los países europeos, las proteínas de insecto están ganando aceptación rápida como ingredientes proteínicos de gran valor en dietas para animales. La Unión Europea ya ha aprobado la inclusión de proteínas de insecto en alimentos para mascotas y formulaciones de pienso para acuicultura. La harina de pollo y la harina de pescado son ingredientes comunes en alimentos para mascotas y preparaciones de pienso para acuicultura, respectivamente. Las proteínas de insecto se están viendo cada vez más como una alternativa a la harina de pollo y la harina de pescado en estos mercados. Entre todos los insectos que se producen a escala industrial, las larvas de mosca soldado negra(Hermetia illucens)han ganado especial atención debido a su capacidad para crecer en una amplia gama de residuos orgánicos y una composición nutritiva única. La idoneidad nutritiva de las proteínas de larvas de mosca soldado negra (BSF) en acuicultura y dietas para mascotas está bien establecida.

Las mascotas desarrollan una amplia gama de problemas de salud con la edad. El envejecimiento puede acelerar el daño por radicales libres en el cuerpo de una mascota que podría dar lugar a un mal funcionamiento del sistema cognitivo y locomotor. De manera similar, la agresión oxidativa en peces como resultado de la respuesta inmunitaria podría dar lugar a una salud comprometida. Los neutrófilos (glóbulos blancos) son responsables del mecanismo de defensa primario del cuerpo. Tras recibir la señal, los neutrófilos se precipitan al sitio de intrusión por microbios patógenos. Los neutrófilos entonces inactivan los patógenos por fagocitosis y liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS). La producción de ROS es crucial para la defensa del hospedador. Sin embargo, a largo plazo, la producción excesiva de ROS por los neutrófilos podría dañar las células animales y podría dar lugar a envejecimiento celular, cáncer, inmunidad reducida, etc. Las intervenciones alimentarias que pueden eliminar las ROS pueden ayudar a reducir el daño oxidativo en el cuerpo del animal y los problemas de salud resultantes. El campo necesita dichas intervenciones alimentarias.

La presente invención tiene como objetivo mejorar más el rendimiento y la calidad de las corrientes de nutrientes obtenidas a partir de insectos sobre los métodos conocidos en la técnica anterior. La invención se centra además en las corrientes de nutrientes obtenidas con dichos métodos.

Compendio de la invención y realizaciones de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método según la reivindicación 1 para convertir insectos en corrientes de nutrientes, que comprende o consiste en las etapas de:

a) proporcionar larvas de mosca soldado negra (frescas) y preparar una pulpa de las mismas; y

b) calentar la pulpa de larvas de mosca soldado negra durante 50-100 segundos a una temperatura de 80-93 °C,

c) enfriar la pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada de la etapa b) hasta una temperatura de 0-25 °C, con lo que se proporciona la corriente de nutrientes que consiste en pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada enfriada.

Opcionalmente, el método comprende una etapa adicional c2) después de la etapa c): someter la pulpa a una etapa de separación física, obteniendo de este modo una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos. El secado de la fracción proteínica revela harina de proteína obtenida de larvas de BSF.

Se ha encontrado que con el método de la presente invención es posible aumentar el rendimiento de grasa de las larvas de BSF procesadas. Sorprendentemente, se ha encontrado que usando la presente combinación de tiempotemperatura, se atrapa menos aceite con la fracción proteínica. Dado que el método de la invención da como resultado menos agregación de proteínas y formación de gránulos en la etapa b) y la etapa c2) de la invención, en comparación con métodos que aplican tiempos de calentamiento durante más de 100 segundos, tal como al menos 5 minutos, puede quedar atrapado menos aceite en y dentro de dichos agregados de proteínas (sin el deseo de quedar limitados a teoría alguna). También se ha encontrado que se reduce el cambio de color de la pulpa y de las fracciones nutritivas. El método de la presente invención también ahorra energía ya que se necesita considerablemente menos tiempo para calentar la pulpa como se ha sugerido anteriormente en la técnica anterior. Además, los autores de la invención encontraron que la pulpa de insecto calentada y la pulpa de insecto hidrolizada calentada tienen propiedades antioxidantes.

Preferiblemente, el método para convertir larvas de BSF en corrientes de nutrientes, comprende o consiste en las etapas de:

a) proporcionar larvas de BSF (frescas) y preparar una pulpa de las mismas;

b) calentar la pulpa durante 50-100 segundos a una temperatura de 80-93 °C

c) enfriar la pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada de la etapa b) hasta una temperatura de 0-25 °C

c2) someter la pulpa a una etapa de separación física obteniendo de este modo una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos, y comprende además una etapa a1) de tratar la pulpa mediante una enzima antes de la etapa b) (por ejemplo, hidrólisis enzimática de proteínas en la pulpa).

La pulpa podría tratarse por la enzima durante 0,5-3 horas, tal como de 1 a 2 horas a una temperatura de 40 °C a 70 °C, preferiblemente de 45 °C a 65 °C, más preferiblemente a una temperatura de 50 °C ± 2 °C o aproximadamente 50 °C. La enzima podría ser una proteasa tal como una peptidasa, preferiblemente la enzima es Flavourzyme. Se ha descubierto que esta etapa de tratamiento enzimático a1) antes de la etapa de calentamiento b) aumenta el contenido de aminoácidos libres y la digestibilidad del puré de larvas de BSF obtenido y mejora la separación de grasas de la pulpa y de la fracción proteínica en la siguiente etapa de separación c2) (se obtiene proteína con menos grasa/lípidos). Además, se ha establecido que la pulpa calentada obtenida después de la etapa b) y c) del método y la pulpa hidrolizada enzimáticamente calentada obtenida después de la etapa a1) y la etapa b) y la etapa c2) tienen ambas propiedades antioxidantes.

Un aspecto de la presente invención se refiere a puré de larvas de BSF calentado, obtenido con el método de la invención. Dicho puré de larvas de BSF calentado tiene sorprendentemente propiedades antioxidantes y es adecuado para su uso como pienso o alimento antioxidante o ingrediente del mismo.

Un aspecto de la presente invención se refiere a puré de larvas de BSF calentado, obtenido con el método de la invención. Dicho puré de insecto calentado tiene sorprendentemente propiedades antioxidantes y es adecuado para su uso como pienso o alimento o ingrediente del mismo que promueve la salud.

Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de dicho puré (pulpa) de larvas de mosca soldado negra como producto alimenticio o de pienso, o como ingrediente del mismo.

Un aspecto de la invención se refiere al uso de la pulpa de insecto como ingrediente alimenticio o como ingrediente de pienso, en donde la pulpa se puede obtener con el método de la invención, implicando el método o no la etapa de hidrólisis enzimática a1) antes de la etapa b) del método.

Un aspecto de la invención se refiere a la pulpa de insecto según la invención para su uso como pienso o ingrediente de pienso, en particular alimento para mascotas.

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria pueden funcionar en combinación y cooperación, salvo que se especifique lo contrario. Además, los rasgos característicos de la invención descrita en la presente memoria, por ejemplo, los rasgos definidos en el contexto de determinados aspectos y realizaciones, pueden funcionar en combinación y cooperación, salvo que se especifique lo contrario.

Además, las diversas realizaciones y rasgos característicos de las realizaciones, aunque se mencionen como "preferidas" o "p. ej." o "por ejemplo" o "en particular", deben interpretarse como maneras ejemplares en que puede implementarse la invención en lugar de como limitantes del alcance de la invención.

Los insectos son, por ejemplo, insectos frescos, preferiblemente insectos frescos. Insectos frescos debe entenderse como insectos vivos o insectos que se han sacrificado poco antes de proporcionarse a la etapa a) del método de la invención, tal como sacrificados en 1 minuto-3 horas antes de someterse a la etapa a). Los insectos frescos, por ejemplo, difieren de los insectos almacenados que se han sacrificado en un determinado momento y se han almacenado a, por ejemplo, temperatura ambiente, 0 °C-8 °C o a una temperatura por debajo de 0 °C durante más de 3 horas, tal como durante días a semanas a meses a años, antes de que dichos insectos almacenados se procesen. Uno de los beneficios de usar insectos frescos es que el riesgo y la posibilidad de crecimiento microbiano (adicional) en un lote de insectos frescos está ausente en comparación con un lote de insectos almacenados. El almacenamiento de insectos sacrificados alberga el riesgo de crecimiento microbiano antes de que los insectos almacenados se sometan al método. Además, el riesgo de descomposición enzimática de, por ejemplo, proteínas y grasas en insectos frescos sometidos al método es menor que cuando se usan insectos almacenados, lo que mejora la calidad del producto final, es decir, la corriente de nutrientes proporcionada con el método de la invención. La pulpa de insecto calentada también se menciona como puré o puré de insectos. El puré consiste en pulpa calentada, sin ningún otro componente añadido, tal como un líquido, tal como agua. Dicha pulpa puede usarse tal cual, por ejemplo, como alimento o pienso, o la pulpa puede aplicarse como constituyente de, por ejemplo, un producto de pienso tal como un pienso para perros. La pulpa puede aplicarse según se proporciona con el método de la invención, o la pulpa puede someterse a etapas posteriores del método, tales como secado hasta un determinado grado, proporcionando pulpa secada. Dicha pulpa secada se usa, por ejemplo, como producto de pienso o como ingrediente alimenticio o de pienso. Como los insectos enteros se someten a la formación de pulpa, sin ningún componente más, tal como agua añadida, el método mejora que se proporcione un producto, es decir, pulpa o puré de insecto, con un alto grado de libertad y posibilidades cuando se considera la elección de las posteriores etapas de procesamiento o los posteriores usos. Para algunas aplicaciones del puré, la corriente de nutrientes puede someterse a extracción de un componente de la pulpa, dilución en un líquido tal como agua, separación en fracciones adicionales, etc. Para algunas aplicaciones del puré, la corriente de nutrientes puede secarse, por ejemplo, cuando se considera, por ejemplo, la aplicación como ingrediente en pienso seco o productos alimenticios secos. Sorprendentemente, la capacidad de retener agua ("WHC") de la corriente de nutrientes proporcionada con el método de la invención, es decir, el puré, se aumenta en comparación con la pulpa de insecto obtenida con métodos conocidos en la técnica en que se calienta la pulpa de la etapa a) durante 5 minutos-30 minutos o incluso más (véase, por ejemplo, el método del documento WO2014123420). Es decir, la WHC de la pulpa de insecto calentada obtenida con el presente método de la invención es de 1,06 a 1,11 veces mayor, tal como aproximadamente 1,09 veces la WHC de la pulpa de insecto calentada obtenida con el método según el documento WO2014123420, en donde la pulpa de la etapa a) se calienta al menos 5 minutos, y hasta 30 minutos o más. La WHC se determina como el peso de agua que se pierde por la pulpa de insecto después de calentar la pulpa de insecto durante 80 minutos a 121 °C. Típicamente, la pulpa de insecto obtenida con el método convencional pierde tanto como un 17 % o más, tal como un 18 % o más de su peso debido a la pérdida de agua, durante el tratamiento térmico a 121 °C durante 80 minutos, basado en el peso de la pulpa de insecto antes de someterse a la evaluación de la WHC. Típicamente, la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención pierde solamente tan poco como un 9 %-13 % de su peso debido a la pérdida de peso, durante el tratamiento térmico a 121 °C durante 80 minutos, basado en el peso de la pulpa de insecto antes de someterse a la evaluación de la WHC. Es decir, la pulpa de insecto obtenida con el método convencional conserva típicamente aproximadamente un 82 % de su peso debido a la pérdida de agua, mientras que la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención conserva hasta incluso más de un 90 % o más de un 88 %, tal como hasta o más de un 89 % de su peso debido a la pérdida mínima de agua, lo que demuestra que la pulpa de insecto de la invención tiene una WHC mejorada y mayor que la WHC que se obtuvo aplicando un método convencional conocido en la técnica. El contenido de humedad de la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención es esencialmente igual que el contenido de humedad de pulpa de insecto obtenida mediante el método convencional conocido en la técnica (véase el ejemplo 1B, a continuación), es decir, aproximadamente un 70,6 %-71,7 % basado en el peso total de la pulpa de insecto.

Dicha alta WHC para la corriente de nutrientes proporcionada con el método de la invención es beneficiosa, por ejemplo, cuando la pulpa calentada se aplica como pienso o como ingrediente de pienso en aplicaciones de pienso para animales. Por ejemplo, la pulpa de insecto se aplica como un sustituto de la carne o como un sustituto parcial de la carne en pienso para animales, tal como pienso para gatos o perros. Es comúnmente conocido que un sustituto de la carne con una WHC relativamente alta, tal como la pulpa de insecto proporcionada por el método de la invención, se prefiere para aplicaciones de pienso en comparación con producto adicional con una menor WHC, tal como la pulpa de insecto que se puede obtener con métodos convencionales conocidos en la técnica. Se aplican las mismas consideraciones o similares para el uso de pulpa de insecto proporcionada con el método de la invención, cuando se consideran aplicaciones alimenticias para uso humano. Una mayor WHC, es decir, una WHC mejorada, se refiere, por ejemplo, a productos que consisten en o comprenden la pulpa de insecto de la invención, que tiene mejores rendimientos de procesamiento, mejores rendimientos de cocinado, más jugosidad del producto que consiste en o comprende el sustituto de la carne, es decir, al menos parcialmente la pulpa de insecto según la invención, una mejor funcionalidad proteínica, un color mejorado (color magro menos pálido), estructura más firme, menos purga en el producto apartado, menos pérdida por goteo del producto que consiste en o comprende la pulpa de insecto de la invención, en comparación con productos que consiste en o comprenden pulpa de insecto obtenida con un método convencional conocido en la técnica.

En el método según la invención, el método, después de la etapa b), comprende la etapa c):

c) enfriar la pulpa de insecto calentada de la etapa b) hasta una temperatura de 0 °C-25 °C, preferiblemente 2 °C-23 °C, lo más preferiblemente 4 °C-21 °C, con lo que se proporciona la corriente de nutrientes que consiste en pulpa de insecto calentada enfriada, en donde el insecto es larvas de BSF. Enfriar el puré calentado produce un producto estable, cuando se considera el aspecto macroscópico. Además, el tiempo de conservación de pulpa enfriada a, por ejemplo, 4 °C o a temperatura ambiente (17 °C-23 °C) o a temperatura ambiente es suficientemente alto para permitir el almacenamiento durante 1 -3 días, hasta que la corriente de nutrientes se someta a uso adicional tal como consumo como alimento o pienso o como ingrediente alimenticio o ingrediente de pienso, o etapas adicionales del proceso tal como una etapa de separación física. Además, almacenar y manipular dicha pulpa enfriada es más conveniente en comparación con pulpa a mayor temperatura.

Se prefiere el método según la invención, en donde el método, después de la etapa c), comprende la etapa c2):

c2) someter la pulpa a una etapa de separación física,

obteniendo de este modo una corriente de nutrientes que consiste en una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos. El corto periodo de tiempo de calentamiento de la pulpa o puré en la etapa b) permite una eficacia mejorada de la etapa de separación física c2) en comparación con métodos conocidos en la técnica, en donde la pulpa se calienta hasta 30 minutos. Dicho corto tiempo de calentamiento según el método de la invención de hecho provoca una separación mejorada de proteína y grada en la pulpa calentada. Además, con dicho corto tiempo de calentamiento en la etapa b), el consumo de tiempo se mejora enormemente, lo que contribuye a aumentar el recambio cuando se considera la conversión de insectos vivos en una corriente de nutrientes en el contexto de un proceso de producción a gran escala. En el mismo periodo de tiempo, pueden proporcionarse más lotes de corriente de nutrientes a partir de insectos frescos usando el método de la invención, en comparación con los presentes métodos. Además, con dicho corto tiempo de calentamiento en la etapa b) del método, el consumo de energía por el método de la invención se reduce significativamente en comparación con métodos conocidos en la técnica, que requieren, por ejemplo, un tiempo de calentamiento de 5 minutos a 30 minutos o más. Sorprendentemente, con el corto tiempo de calentamiento, aún la carga microbiana en la pulpa de la etapa a) está suficientemente reducida en la etapa b) del método de la invención. Sorprendentemente, con el corto tiempo de calentamiento, la separación de la pulpa en la fracción grasa, la fracción proteínica acuosa y la fracción que contiene sólidos se mejora después de someter la pulpa poco calentada de la etapa b) del método de la invención a la etapa de separación física. Además, la separación de grasa de la pulpa de insecto es óptimamente eficaz cuando la pulpa de insecto se calienta durante 100 segundos o menos a 90 °C, en comparación con la separación de grasa obtenible cuando se aplican tiempos de calentamiento más largos en la etapa b) del método (véase la figura 1), mientras dicha separación de grasa altamente eficaz ahora está acompañada por una gran ganancia de tiempo cuando se considera el tiempo requerido para pasteurizar la pulpa de insecto, y está acompañada por ahorro de la energía requerida para obtener pulpa de insecto con el método de la invención, ya que la pulpa de insecto ahora se calienta solamente durante 100 segundos o menos en la etapa b) del método. En métodos convencionales, la pulpa de insecto se calienta, por ejemplo, durante 5 minutos, 30 minutos o incluso hasta 1 hora. Los autores de la invención ahora establecieron que la separación óptima de la grasa se consigue cuando se aplican tiempos de calentamiento más cortos, con lo que se mejora el ritmo de producción de pulpa de insecto cuando se considera un proceso a escala industrial, y con lo que se mejora el volumen de producción de pulpa de insecto por unidad de tiempo, así como el volumen de producción de fracción grasa por unidad de tiempo, por ejemplo.

En el método, los insectos son larvas de mosca soldado negra.

En particular, en el método, las larvas de mosca soldado negra son entre 5 y 30 días de edad, preferiblemente entre 6 y 28 días, más preferiblemente 7-26 días, lo más preferiblemente 10 horas-4 días antes de que las larvas se transformen en prepupas, tal como 0,5-3,5 días antes de la transformación. En particular, en el método, las larvas de mosca soldado negra son entre 12 y 30 días de edad, preferiblemente entre 14 y 28 días, más preferiblemente 14-26 días, lo más preferiblemente 12 horas-3 días antes de que las larvas se transformen en prepupas, tal como 1-2 días antes de la transformación. Se prefiere el método en donde las larvas de mosca soldado negra son entre 12 y 30 días de edad, preferiblemente entre 14 y 28 días, más preferiblemente 14-26 días, lo más preferiblemente 12 horas-3 días antes de que las larvas se transformen en prepupas, tal como 1-2 días antes de la transformación. Típicamente, las larvas son de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 días de edad, tal como de 13, 14, 15, 16 o 17 días de edad, preferiblemente aproximadamente 14 días de edad.

Como se menciona anteriormente, se ha encontrado que, con el método de la presente invención, es posible aumentar el rendimiento de grasa a partir de larvas de mosca soldado negra (frescas) procesadas. Se ha encontrado sorprendentemente que usando la presente combinación de tiempo-temperatura queda atrapado menos aceite con la fracción proteínica. Como el método de la invención provoca menos agregación proteínica y formación de granulado en la etapa b) y la etapa c) de la invención, en comparación con métodos que aplican tiempos de calentamiento durante más de 100 segundos, tal como al menos 5 minutos o al menos 30 minutos, menos aceite puede quedar atrapado y dentro de dichos agregados proteínicos (sin el deseo de quedar limitados a teoría alguna). También se ha encontrado que se reduce el cambio de color de la pulpa y las fracciones nutritivas. El método de la presente invención también ahorra energía ya que se necesita considerablemente menos tiempo para calentar la pulpa como se ha sugerido previamente en la técnica anterior. Además, los autores de la invención encontraron que la pulpa de insecto calentada y la pulpa de insecto hidrolizada calentada tienen propiedades antioxidantes. Además, la capacidad de retener agua de la pulpa de insecto calentada obtenida con la etapa b) del método de la invención es mayor que la WHC conseguida cuando se aplican métodos conocidos en la técnica anterior, tal como el método del documento WO2014123420, en donde, después de la etapa a), la pulpa se calienta durante 5-30 minutos o más, produciendo una WHC que es aproximadamente un 6-13 % mayor que la WHC para la pulpa de insecto calentada obtenida con el método de la invención. Es decir, la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención conserva su agua, por ejemplo, tras calentamiento durante 80 minutos a 121 °C mejor (el peso residual después del tratamiento es al menos un 87 %, tal como un 87 %-91 %, basado en el peso de la pulpa de insecto antes del calentamiento según la evaluación de la WHC). En contraste, la pulpa de insecto obtenida con un método conocido en la técnica pierde más de un 18 % de su peso debido a la pérdida de agua, en comparación con el peso de dicho producto antes de someterse a la determinación de la WHC.

En determinadas realizaciones, en el método según la invención, la pulpa de insecto no se trata enzimáticamente antes del calentamiento en la etapa b). El puré de insecto calentado no hidrolizado es una corriente de nutrientes proporcionada por el método de la invención que es adecuado para su uso como producto de pienso sin etapas adicionales de procesamiento. Como alternativa, el puré de insecto calentado no hidrolizado es una corriente de nutrientes proporcionada por la etapa b) del método de la invención, que es un semiproducto adecuado como ingrediente para preparar un producto de pienso, tal como un pienso para perros.

En realizaciones alternativas, en el método según la invención, el método comprende además una etapa a1) de tratar la pulpa de insecto por una enzima antes de la etapa b).

Preferiblemente, cuando el método de la invención comprende además una etapa a1) de tratar la pulpa de insecto por una enzima antes de la etapa b), la pulpa se trata por la enzima durante 0,5 a 3 horas, preferiblemente 1 a 2 horas a una temperatura de 40 °C a 70 °C, preferiblemente a 45 °C hasta 65 °C, más preferiblemente a una temperatura de 50 °C ± 2 °C.

También preferiblemente, cuando el método de la invención comprende además una etapa a1) de tratar la pulpa de insecto por una enzima antes de la etapa b), la enzima es una proteasa tal como una peptidasa, preferiblemente una mezcla de al menos una proteasa y al menos una peptidasa, tal como Flavourzyme, y preferiblemente, la pulpa se trata por la enzima durante 0,5 a 3 horas, preferiblemente 1 a 2 horas a una temperatura de 40 °C a 70 °C, preferiblemente a 45 °C hasta 65 °C, más preferiblemente a una temperatura de 50 °C ± 2 °C.

Para proporcionar una corriente de nutrientes aplicando el método de la invención, las larvas de mosca soldado negra, tal como larvas de mosca soldado negra frescas tales como larvas de mosca soldado negra vivas, proporcionadas en la etapa a) del método, se reducen en tamaño para proporcionar la pulpa de insecto, también denominada puré o puré de insectos. Por ejemplo, una etapa adecuada de proporcionar la pulpa o puré de insectos en la etapa a) del método es picar los insectos frescos. Por tanto, preferiblemente, en el método según la invención, en la etapa a), se prepara una pulpa o puré picando los insectos frescos proporcionados en la etapa a), preferiblemente insectos frescos que se lavan en agua antes de proporcionarlos en la etapa a). Los insectos proporcionados en la etapa a) del método se lavan, por ejemplo, en agua poco antes de someterlos al método de la invención, por ejemplo, se lavan con agua una hora antes de someterlos a la etapa a) del método de la invención. Dichas larvas de mosca soldado negra lavadas preferiblemente son larvas de mosca soldado negra vivas. Picar los insectos frescos, tales como insectos frescos lavados, tiene varios beneficios. El picado es relativamente controlable fácilmente cuando se considera el tamaño de partícula promedio deseado de los restos de los insectos en la pulpa o puré. Además, el picado es un método rápido de reducir el tamaño de los insectos, que contribuye a un periodo de tiempo relativamente corto consumido por el método hasta proporcionar la corriente de nutrientes. Además, el picado es una etapa del método muy eficaz y rápida para sacrificar las larvas de mosca soldado negra. Por lo tanto, el picado también se prefiere desde la perspectiva del bienestar animal. Lavar los insectos antes de someter los insectos al método de la invención, por ejemplo, se prefiere cuando se considera la liberación y descarte de, por ejemplo, los restos de suministro adheridos a insectos. Usar insectos lavados en el método de la invención mejora además la calidad de la corriente de nutrientes que se puede obtener con el método. Si, por ejemplo, el suministro se queda adherido a los insectos, lavar los insectos antes de proporcionarlos en la etapa a) del método evita que el suministro quede incluido en la fracción sólida o en la pulpa de insecto.

Una corriente de nutrientes tal como pulpa de insecto calentada o fracciones obtenidas de la misma en la etapa c2) del método de la invención, tiene en particular características beneficiosas deseadas cuando, en la etapa a), los insectos se reducen a un tamaño de partícula promedio de los restos de los insectos en la pulpa en el intervalo entre 10 and 500 micrómetros. Las partículas de insecto de este intervalo de tamaño tienen una carga microbiana suficientemente baja después de someterse a la etapa b) del método y, después de la etapa b), la pulpa calentada se separa físicamente en las tres corrientes de nutrientes hasta un grado mejorado. Por lo tanto, se prefiere que, en el método, el tamaño de partícula promedio de los restos de los insectos en la pulpa de la etapa a) varíe entre 10 y 500 micrómetros.

Como se menciona, varios de los múltiples beneficios del método de la invención, cuando se consideran los presente métodos, es que la pulpa de insecto de la etapa a) puede calentarse durante un periodo de tiempo tan corto de modo que aún la reducción de la carga microbiana en el puré es suficiente y bastante, mientras al mismo tiempo la WHC se reduce en comparación con pulpa de insecto calentada según métodos convencionales, y mientras al mismo tiempo la pulpa de insecto calentada tiene una calidad mejorada cuando se considera el posterior grado de separación de la pulpa en una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos. Además, el método de la invención contribuye a ahorrar energía y a ahorrar cuando se considera el consumo de energía y el consumo de tiempo implicados cuando se compara proporcionar una determinada cantidad de corriente de nutrientes con el método de la invención con proporcionar la misma cantidad de una corriente de nutrientes proporcionada con un método convencional tal como el método del documento WO2014123420. Típicamente, el método de la invención ahorra tiempo y energía al aplicar la etapa b) del método durante al menos 45 segundos para alcanzar el nivel deseado de reducción en la carga microbiana, tal como al menos 50 segundos, 55 segundos, 60 segundos, 70 segundos, 80 segundos, 90 segundos. Los métodos actualmente conocidos en la técnica requieren calentar la pulpa durante al menos 5 minutos y más, tal como 30 minutos y más. Los autores de la invención establecieron que el tiempo de calentamiento en la etapa b) puede acortarse con un factor 2 a 30 o incluso mayor, mientras se mantiene el grado de carga microbiana reducida y mientras se mejora en grado al que la proteína y la grasa pueden separarse posteriormente y mientras se mejora obtener puré de insecto calentado con una WHC aumentada. Se prefiere particularmente un tiempo de calentamiento tan bajo como 80 segundos. El ahorro de energía es alto, el ahorro de tiempo es alto, la calidad del producto se mejora, por nombrar unas pocas ventajas en comparación con métodos conocidos en la técnica. Se prefiere el método según la invención, en donde, en la etapa b), la pulpa de insecto se calienta particularmente durante 75-85 segundos a una temperatura de 90 °C ± 2 °C. También se prefiere o se prefiere adicional el método según la invención, en donde, en la etapa b), la pulpa de insecto se calienta a una temperatura de 85 °C-90 °C. En particular, en el método según la invención, en donde, en la etapa b), la pulpa de insecto se calienta durante 60-95 segundos, particularmente durante 70-90 segundos, preferiblemente 75-85 segundos, tal como 78-82 segundos. Se prefiere particularmente el método en donde, en la etapa b), la pulpa de insecto se calienta durante 80 segundos ± 3 segundos a una temperatura de calentamiento de 90 °C ± 3 °C, e incluso más preferido, durante 80 segundos ± 2 segundos y/o a una temperatura de calentamiento de 90 °C ± 2 °C.

Considerando el método de la invención, en donde el método comprende la etapa c2) de someter la pulpa de insecto calentada de la etapa b) a una etapa de separación física, obteniendo de este modo una corriente de nutrientes que consiste en una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos, se prefiere que, en el método de la etapa c2), la etapa de separación física comprenda decantación y/o centrifugación. Los autores de la invención establecieron que una etapa de separación física que consiste en o comprende uno de estos métodos de separación o los dos, la corriente de nutrientes se obtiene en un corto periodo de tiempo y la separación se establece a un grado suficientemente alto.

Un aspecto de la invención es la pulpa de larvas de mosca soldado negra que se puede obtener por el método según la invención. Sorprendentemente, los autores de la invención establecieron que la pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada, enfriada en la etapa c) después del calentamiento, tal como hasta 2 °C-6 °C o 16 °C-22 °C, o cualquier temperatura intermedia, tiene una mayor WHC que la pulpa obtenida con métodos conocidos en la técnica tales como el método descrito en el documento WO2014123420, en donde, en la etapa b), la pulpa se calienta durante 5 minutos o más, tal como durante 30 minutos o incluso 1 h. La WHC expresada como pérdida de agua, del puré de larvas de mosca soldado negra obtenido con el método de la invención es de un 45 %-75 %, tal como un 50 %-65 % de la WHC del puré obtenido con métodos convencionales tales como el método del documento WO2014123420. Es decir, el método de la invención proporciona una corriente de nutrientes, es decir, pulpa de larvas de mosca soldado negra, que tiene una WHC de un 9 %-11 %, mientras la pulpa proporcionada con el método convencional tiene una WHC mayor de un 11 %, tal como mayor de un 12 % e incluso hasta un 17 % o mayor. El porcentaje de pérdida de agua se basa en el peso de la pulpa de larvas de mosca soldado negra antes de someterse a un tratamiento térmico durante 80 minutos a 121 °C. Dicha corriente de nutrientes de la invención, es decir, puré de insectos calentado enfriado, con una WHC aumentada proporciona varias ventajas en comparación con puré de insecto que tiene una menor WHC. Por ejemplo, cuando la pulpa se incorpora como ingrediente (componente de carne como un 100 % de sustituto de la carne, o en parte como un sustituto de la carne hasta un determinado grado) en una composición de pienso para animales, siendo la composición una composición que comprende carne, la mayor WHC del puré de la invención contribuye a características mejoradas del pienso o producto de pienso. Es decir, en comparación con un producto que comprende la pulpa de insecto obtenida con un método convencional conocido en la técnica, un producto que comprende la pulpa de insecto de la invención tendrá, debido a su WHC mayor y mejorada, uno cualquiera o más de: mejores rendimientos de procesamiento, mejores rendimientos de cocinado, más jugosidad del producto que consiste en o comprende el sustituto de la carne, es decir, al menos parcialmente la pulpa de insecto según la invención, una mejor funcionalidad proteínica, un color mejorado (color magro menos pálido), estructura más firme, menos purga en el producto apartado, menos pérdida por goteo del producto que consiste en o comprende la pulpa de insecto de la invención, por nombrar unas pocas ventajas de la pulpa de insecto según la invención que se refiere a una WHC mejorada. Se prefiere la pulpa de insecto de la invención, en donde la pulpa de insecto tiene una WHC en el intervalo de un 9 % en peso-menos de un 18 % en peso, basado en el peso total de la pulpa de insecto, en donde la WHC se expresa como el porcentaje en peso de gua que se libera de la pulpa de insecto durante una etapa de calentamiento a la que se somete la pulpa de insecto a una temperatura de 121 °C durante 80 minutos, basado en el peso total de la pulpa de insecto antes de someterse a esta etapa de calentamiento. Dicha pulpa de insecto tiene una WHC que está mejorada y es más alta (menos pérdida de agua cuando la pulpa se calienta) que la pulpa de insecto obtenida con métodos convencionales (pérdida de agua de un 18 % o más cuando la pulpa se somete a calor tal como 80 minutos a 121 °C; véase el ejemplo 1B a continuación). También se prefiere la pulpa de insecto de la invención, en donde la pulpa de insecto tiene una WHC en el intervalo de un 9 % en peso-menos de un 16 % en peso, basado en el peso total de la pulpa de insecto, en donde la WHC se expresa como el porcentaje en peso de agua que se libera de la pulpa de insecto durante una etapa de calentamiento a la que se somete la pulpa de insecto a una temperatura de 121 °C durante 80 minutos, basado en el peso total de la pulpa de insecto antes de someterse a esta etapa de calentamiento, preferiblemente un 9 % en peso-menos de un 14 % en peso, más preferiblemente un 10 % en pesomenos de un 13 % en peso, lo más preferiblemente un 10 % en peso-menos de un 12 % en peso.

Un aspecto de la invención se refiere a una pulpa de larvas de mosca soldado negra según la invención para su uso como alimento, pienso, ingrediente alimenticio o ingrediente de pienso, en particular pienso para mascotas, tal como pienso para perros, por ejemplo, pienso seco para perros (por ejemplo, croquetas). Cuando la pulpa de insecto se aplica como alimento o producto de pienso o como un ingrediente para un alimento o producto de pienso, el producto tiene una WHC mayor en comparación con un producto en que se aplica la pulpa de insecto que se proporciona usando un método para proporcionar pulpa de insecto según métodos establecidos tal como se describe en el documento WO2014123420. Como se menciona, la pulpa de insecto con una WHC mayor es en particular beneficioso cuando el alimento o producto alimenticio es un producto que comprende o consiste en un sustituto de la carne. La WHC mayor contribuye a una mayor tendencia a permanecer humedecido y jugoso cuando se expone a aire seco o aire humedecido, y la WHC mayor contribuye a más absorción de agua y mejorada cuando el producto se pone en contacto con agua. Dicho producto se encogerá menos en comparación con un producto que comprende o consiste en puré de insectos con una WHC menor, cuando el producto se somete a calentamiento, cocinado, secado, etc.

Un aspecto de la invención se refiere a un producto alimenticio o producto de pienso que comprende o consiste en la pulpa de larvas de mosca soldado negra que se puede obtener con el método de la invención, en donde el método comprende la etapa a1) o en donde el método no comprende la etapa a1).

Un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la pulpa de larvas de mosca soldado negra de la invención o un derivado de la misma, para su uso en un método para la prevención y/o supresión del daño oxidativo celular. La pulpa de insecto se somete o no a la etapa a1) del método, que implica el tratamiento enzimático de la pulpa proporcionada con la etapa a).

Se prefiere la composición para su uso en un método para la prevención y/o supresión del daño oxidativo celular según la invención, en donde la composición es un ingrediente de pienso o un producto de pienso. Por ejemplo, la composición para su uso es un pienso para peces o un pienso para perros.

Definiciones

El término"insectos"como se usa en la presente memoria se refiere a insectos en cualquier etapa de desarrollo, tales como insectos adultos, larvas de insectos, prepupas y pupas de insectos.

El término "insectos frescos" como se usa en la presente memoria tiene su significado convencional y se refiere a insectos vivos o insectos que se han sacrificado poco antes de proporcionarlos en la etapa a) del método de la invención, tal como sacrificados en 1 minuto-3 horas antes de someterse a la etapa a). Los insectos frescos, por ejemplo, difieren de los insectos almacenados en que se han sacrificado en un determinado momento y almacenado, por ejemplo, a temperatura ambiente, 0 °C-8 °C o a una temperatura por debajo de 0 °C durante más de 3 horas tal como durante días a semanas a meses a años, antes de que dichos insectos almacenados se procesen. Típicamente, los insectos frescos son larvas de mosca soldado negra vivas.

El término"eclosión"como se usa en la presente memoria tiene su significado convencional y se refiere al proceso de las larvas jóvenes que salen del huevo.

El término"larvas"como se usa en la presente memoria tiene su significado convencional y se refiere al estadio juvenil de insectos holometábolos, tales como larvas de moscas soldado negras.

El término"cría"o"neonato"como se usa en la presente memoria tiene su significado convencional y se refiere a larvas que acaban de eclosionar de los huevos.

El término"prepupa"como se usa en la presente memoria se refiere a la última etapa larvaria en donde el contenido de quitina de las larvas ha aumentado significativamente.

El término"pupa"como se usa en la presente memoria tiene su significado convencional y se refiere a la etapa de la vida de los insectos en donde la metamorfosis de larva a insecto adulto, tal como moscas soldado negras.

El término"pulpa"o"pulpa de insecto" o "puré' o "puré de larvas" o "puré de insecto"como se usa en la presente memoria todos tienen el mismo significado y se refiere al producto obtenido después de la reducción mecánica del tamaño de los insectos a un tamaño de menos de 0,5 mm.

El término"corriente de nutrientes"como se usa en la presente memoria tiene su significado convencional y se refiere a corrientes que contienen nutrientes, tales como grasas, proteínas y material derivado de proteínas, carbohidratos, minerales y/o quitina. En el contexto de la presente invención, la quitina también se considera un nutriente. En el contexto de la presente invención, el puré de insecto o pulpa de insecto obtenido con el método de la invención también se considera un nutriente.

El término"propiedad antioxidante"tiene su significado científico normal y aquí se refiere a un compuesto o una composición, tal como el puré y el puré hidrolizado de la invención y que se puede obtener con el método de la invención, que consiste en o comprende un antioxidante con actividad antioxidante, tal como una respuesta antiinflamatoria. Típicamente, dicha respuesta antiinflamatoria es una respuesta a la respuesta inflamatoria inducida por, por ejemplo, especies reactivas de oxígeno, por ejemplo, en las células de un mamífero tal como una mascota o un sujeto humano, o en las células de un pez. Se hace referencia, por ejemplo, a los capítulos 1, 5 y 6 del libro "Antioxidants in Food: Practical Applications" (Jan Pokorny, Nedyalka Yanishlieva y Michael Gordon (editores), 2001, Cambridge: CRC Press, Woodhead Publishing Ltd. ISBN 1 85573 463 X, CRC Press, ISBN 0-8493-1221-1). Un antioxidante es un compuesto con actividad antioxidante o una composición con actividad antioxidante o una composición que comprende un compuesto con actividad antioxidante, tal como actividad contra el daño oxidativo resultante de la respuesta inmunitaria del hospedador. Un antioxidante, por ejemplo, inhibe la oxidación. La oxidación, por ejemplo, especies reactivas de oxígeno, en un sujeto, por ejemplo, inducen daño celular (oxidativo).

El término"promover la salud", tal como en "alimento que promueve la salud", "actividad que promueve la salud", "propiedad que promueve la salud" y "potencial promotor de la salud", tiene su significado científico normal y aquí se refiere al efecto de un compuesto o una composición, tal como el puré hidrolizado o el puré de la invención o que se puede obtener con el método de la invención, sobre la salud de un animal tal como un mamífero tal como un animal de compañía o un sujeto humano, cuando dicho compuesto o composición se consume por el animal. El consumo del compuesto o composición con potencial promotor de la salud contribuye a o apoya o promueve o aumenta o mantiene el estado de salud del animal tal como un mamífero tal como un animal de compañía o un sujeto humano. Se hace referencia, por ejemplo, a los capítulos 1, 5 y 6 del libro "Antioxidants in Food: Practical Applications" (Jan Pokorny, Nedyalka Yanishlieva y Michael Gordon (editores), 2001, Cambridge: CRC Press, Woodhead Publishing Ltd. ISBN 1 85573463 X, CRC Press, ISBN 0-8493-1221-1).

Con el término "secar" o "secado" en el contexto de la invención, se entiende que el producto obtenido tras el secado y el producto secado tienen un contenido de humedad que es de un 20 % o menos basado en el peso total del producto obtenido tras el secado o el proceso secado, preferiblemente un 15 % o menos, más preferiblemente un 10 % o menos, lo más preferiblemente un 5 % o menos, tal como un 0,5 %-20 %, un 1 %-18 %, un 2 %-16 %, un 3 %-14 %, un 4 %-12 % o un 6 %-8 %. Típicamente, el producto que está secado, por ejemplo, la pulpa de insecto, la fracción proteínica acuosa, la combinación de la fracción que contiene sólidos y la fracción proteínica acuosa, tiene un contenido de humedad antes del secado de al menos un 20 % basado en el peso total del producto antes del secado, tal como al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 45 %.

La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a determinados dibujos, pero la invención no se limita a ello, sino solamente por las reivindicaciones. Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Los términos son intercambiables en circunstancias apropiadas y las realizaciones de la invención pueden funcionar en secuencias distintas de las descritas o ilustradas en la presente memoria.

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria pueden funcionar en combinación y cooperación, salvo que se especifique lo contrario. Además, los rasgos característicos de la invención descrita en la presente memoria, por ejemplo, rasgos característicos descritos en el contexto de determinados aspectos y realizaciones, pueden funcionar en combinación y cooperación, salvo que se especifique lo contrario.

Además, las diversas realizaciones y rasgos característicos de realizaciones, aunque se mencionen como "preferidos" o "p. ej." o "por ejemplo" o "en particular" deben interpretarse como maneras ejemplares en que puede implementarse la invención en lugar de como limitantes del alcance de la invención.

El término "comprender", como se usa en las reivindicaciones, no debe interpretarse restringido a los elementos o etapas enumerados posteriormente; no excluye otros elementos o etapas. Tiene que interpretarse que especifica la presencia de los rasgos característicos, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se refiere, pero no excluye la presencia o adición de uno o más rasgos característicos, números enteros, etapas o componentes diferentes, o grupos de los mismos. Por tanto, el alcance de la expresión "un método que comprende la etapa A y la etapa B" no debe limitarse a métodos que consisten únicamente en las etapas A y B, más bien, con respecto a la presente invención, las etapas enumeradas únicamente del método son A y B, y además la reivindicación debe interpretarse como incluyendo equivalentes de esas etapas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta la separación de grasa de la pulpa de larvas de BSF en función del tiempo de calentamiento de la pulpa.

La figura 2 representa la influencia del tiempo de calentamiento del puré de larvas de BSF sobre el color de la pulpa de insecto.

Figura 3A: Contenido de aminoácidos libres en puré de larvas de BSF y en puré de larvas de BSF que se sometió a peptidasa al 0,1 % en peso o al 0,5 % en peso basado en el peso total del puré.

Figura 3B: Digestibilidad con pepsina del puré de larvas de BSF y del puré de larvas de BSF que se sometió a peptidasa al 0,1 % en peso o al 0,5 % en peso basado en el peso total del puré.

Figura 3C: Contenido de lípidos (grasa) en harina de proteína aislada de puré de larvas de BSF y de puré de larvas de BSF que se sometió a peptidasa al 0,1 % en peso o al 0,5 % en peso basado en el peso total del puré.

Figura 4: Actividad eliminadora de radicales DPPH de PureeX™ de BSF (BSF-P), puré hidrolizado de BSF (BSF-HP), harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) después de 30 min de incubación (n = 3).

Figura 5: Actividad eliminadora de radicales DPPH de PureeX™ de BSF (BSF-P), puré hidrolizado de BSF (BSF-HP), harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) después de 60 min de incubación (n = 3).

Figura 6: Actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS de PureeX™ de BSF (BSF-P), puré hidrolizado de BSF (BSF-HP), harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) después de 30 min de incubación (n = 3).

Figura 7: Actividad de modulación de la respuesta de MPO de PureeX™ de BSF (BSF-P), puré hidrolizado de BSF (BSF-HP), harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) usando ensayo de S<i>E<f>ED (n = 3).

Figura 8: Actividad de modulación de la respuesta de MPO de PureeX™ de BSF (BSF-P), puré hidrolizado de BSF (BSF-HP), harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) usando medición clásica (n = 3).

Figura 9: Actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos de Puree XTM de BSF (BSF-P), puré hidrolizado de BSF (BSF-HP), harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) (n = 3).

Figura 10: Actividad eliminadora de radicales ABTS de WSEP realizada en metanol. Los resultados son la media ± DT de tres ensayos independientes por triplicado.

Figura 11: Capacidad de retención de agua (WHC) de la corriente de nutrientes que consiste en pulpa de insecto obtenida con el método de la invención (barra derecha; muestra 2). Se hace una comparación con la WHC de la pulpa de insecto obtenida con el método según el documento WO2014123420 (barra izquierda; muestra 1), en donde, en la etapa similar b), la pulpa de insecto proporcionada en la etapa a) se caliente durante 30 minutos. La temperatura de calentamiento fue 90 °C para ambas pulpas de insecto durante la etapa de calentamiento. La capacidad de retención de agua se representa como el porcentaje de pérdida de agua después de un tratamiento térmico de la pulpa de insecto obtenida con la etapa b) de los métodos, durante 80 minutos a 121 °C. Es decir, se determinó el peso de la pulpa de insecto antes y después del tratamiento térmico, y se representa en gráfico la diferencia de peso como el porcentaje de pérdida de agua que se presenta como la capacidad de retención de agua. Las barras de error representan la desviación típica (DT).

Descripción detallada de realizaciones

A lo largo de la descripción, los ejemplos, las realizaciones, las reivindicaciones, los términos "puré" y "pulpa" tienen el mismo significado.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para convertir insectos en corrientes de nutrientes, que comprende o consiste en las etapas de:

a) proporcionar larvas de mosca soldado negra y preparar una pulpa de las mismas; y

b) calentar la pulpa de larvas de mosca soldado negra durante 50-100 segundos a una temperatura de 80 °C-93 °C, c) enfriar la pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada de la etapa b) hasta una temperatura de 0 °C-25 °C, obteniendo de este modo un puré (pulpa) de insecto. Las corrientes de nutrientes son un puré de insecto obtenido después del calentamiento de la pulpa preparada a partir de larvas de mosca soldado negra (BSF,black soldier fly).Opcionalmente, el método comprende una etapa adicional c2) después de la etapa c): someter la pulpa a una etapa de separación física obteniendo de este modo una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos. El secado de la fracción proteínica revela comida proteínica obtenida de larvas de BSF.

Las larvas de BSF proporcionadas en la etapa a) del método son preferiblemente larvas de BSF frescas, por ejemplo, larvas de BSF vivas (lavadas) tales como larvas de mosca soldado negra vivas.

c) enfriar la pulpa de insecto calentada de la etapa b) hasta una temperatura de 0 °C-25 °C, más preferiblemente 2 °C-23 °C, lo más preferiblemente 4 °C-21 °C,

con lo que se proporciona la corriente de nutrientes que consiste en pulpa de insecto calentada enfriada. El insecto es larvas de mosca soldado negra.

c2) someter la pulpa de insecto calentada a una etapa de separación física,

obteniendo de este modo una corriente de nutrientes que consiste en una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos.

La pulpa de insecto tratada con enzima, tal como larvas picadas, y la pulpa de insecto (control) sin tratamiento enzimático (por ejemplo, larvas picadas que no se hidrolizaron enzimáticamente), por ejemplo, se calientan hasta 90 °C y la pulpa se mantiene, por ejemplo, a esta temperatura durante 80 segundos. El puré de insecto obtenido puede someterse a pruebas para medir el contenido de aminoácidos libres y la digestibilidad. Puede obtenerse harina de proteína de la pulpa de larvas de BSF calentada, y de la pulpa calentada después del tratamiento enzimático antes de la etapa de calentamiento. Por ejemplo, se obtiene la harina de proteína cuando se someten lotes de pulpa de larvas de BSF calentada que primero se sometió a hidrólisis enzimática de las proteínas usando Flavourzyme al 0,1 % en peso o al 0,5 % en peso antes de la etapa de calentamiento a 90 °C, por ejemplo, por etapas de separación de proteínas de la pulpa, evaporación, secado y molienda. Es parte de la invención que la grasa se separe de la fracción proteínica en mayor medida cuando, antes de calentar el puré de larvas de BSF, se trata enzimáticamente, en comparación con el puré de larvas de BSF que no se trata enzimáticamente antes del calentamiento. Según la invención, se obtiene un grado dependiente de la dosis de separación de grasa de la proteína, cuando se considera la cantidad de enzima aplicada. Por tanto, según la invención, el tratamiento enzimático de, por ejemplo, larvas de BSF picadas, usando Flavourzyme antes de la etapa de calentamiento aumenta el contenido de aminoácidos libres y aumenta la digestibilidad con pepsina del puré de larvas hidrolizado obtenido, y como resultado, el puré obtenido que comprende proteína hidrolizada tiene un mejor sabor (el contenido de aminoácidos libres se refiere a un sabor atractivo, apetitoso cuando los animales y los seres humanos consumen un producto que comprende aminoácidos libres), es muy digerible y tiene propiedades antioxidantes (véanse los resultados de las pruebas, más adelante en el presente documento), según la invención. Además, el tratamiento enzimático de la pulpa de larvas de BSF mejora la separación de grasa en la siguiente etapa de separación después de la hidrólisis enzimática y el tratamiento térmico de la pulpa digerida enzimáticamente, lo que aumenta la extracción de grasa de la harina de proteína, en comparación con la separación de grasa de la fracción proteínica obtenida con puré de larvas que no se sometió a una etapa de hidrólisis enzimática antes de calentar a 90 °C, según la invención.

Aunque en la técnica anterior se describen métodos para separar corrientes de nutrientes de pulpa de insecto, hasta ahora no se ha reconocido que un tratamiento relativamente suave, es decir, tratamientos de temperatura/tiempo relativamente bajos y cortos podrían dar como resultado un aumento del rendimiento de grasa. A este respecto, se hace referencia al documento WO2014/123420 en donde se describe un método para separar corrientes de nutrientes, pero en donde se consideró que, para aumentar el rendimiento de grasa obtenida de la pulpa de insecto, debían usarse combinaciones de temperatura/tiempo relativamente largas y altas.

Sin embargo, el uso de combinaciones de temperatura/tiempo largas y altas tiene un efecto negativo en la calidad de las corrientes de nutrientes, en particular la fracción grasa obtenida. Por ejemplo, si la pulpa de insecto se calienta durante un tiempo relativamente largo a una temperatura relativamente alta, se produce cambio de color de la pulpa. Además, puesto que la fracción grasa de los insectos procesados contiene una cantidad relativamente alta de ácidos grasos insaturados, la grasa se vuelve rancia. Esto da lugar a sabores desagradables de la fracción grasa y limita su alcance de uso.

Con el método de la presente invención estos problemas se superan en gran medida. En primer lugar, con el método de la presente invención, el cambio de color de la pulpa de larvas de BSF se reduce enormemente. Una ventaja sorprendente adicional del presente método es que la fracción grasa obtenida de la pulpa de larvas de BSF es menos rancia que las fracciones grasas obtenidas con métodos conocidos en la técnica. Además, el rendimiento de grasa de los insectos procesados también es considerablemente mayor. Sin el deseo de quedar limitados a teoría alguna, se supone que, cuando se usan métodos conocidos, una parte considerable de grasa queda atrapada dentro de proteínas desnaturalizadas. Usando condiciones de tratamiento más suaves se puede evitar este atrapamiento de grasa, dando como resultado un rendimiento más alto de grasa de la pulpa de insecto. Además, se producen reacciones de Maillard con las proteínas en menor grado debido al corto tiempo de calentamiento a temperatura suave.

Se prefiere el método según la invención, en donde las larvas de mosca soldado negra tienen entre 12 y 30 días de edad, preferiblemente entre 14 y 28 días, más preferiblemente 14-26 días, lo más preferiblemente 12 horas-3 días antes de que las larvas se transformen en prepupas, tal como 1-2 días antes de la transformación.

Se prefiere el método según la invención, en donde la pulpa no se trata enzimáticamente antes del calentamiento.

Se prefiere el método según la invención, en donde el método comprende además una etapa a1) de tratamiento de la pulpa por una enzima antes de la etapa b).

Se prefiere el método según la invención, en donde el método comprende además una etapa a1) de tratamiento de la pulpa por una enzima antes de la etapa b) y en donde la pulpa se trata por la enzima durante 0,5 a 3 horas, preferiblemente 1 a 2 horas a una temperatura de 40 °C a 70 °C, preferiblemente a 45 °C a 65 °C, más preferiblemente a una temperatura de 50 °C ± 2 °C.

Se prefiere el método según la invención, en donde el método comprende además una etapa a1) de tratamiento de la pulpa por una enzima antes de la etapa b) y en donde la enzima es una proteasa tal como una peptidasa, preferiblemente una mezcla de al menos una proteasa y al menos una peptidasa, tal como Flavourzyme.

Se prefiere el método según la invención, en donde, en la etapa a), se prepara una pulpa picando los insectos.

Se prefiere el método según la invención, en donde el tamaño promedio de partícula de los restos de los insectos en la pulpa de la etapa a) varía entre 10 y 500 micrómetros.

Se prefiere el método según la invención, en donde, en la etapa b), la pulpa se calienta particularmente durante 75-85 segundos a una temperatura de 90 °C ± 2 °C.

Se prefiere el método según la invención, en donde la etapa de separación física comprende decantación y/o centrifugación.

Se prefiere el método según la invención, en donde la fracción proteínica acuosa y la fracción que contiene sólidos se secan juntas después de la etapa (c), preferiblemente mediante secado por pulverización, más preferiblemente secado en lecho fluido.

Se prefiere el método según la invención, en donde la fracción proteínica acuosa y la fracción que contiene sólidos se secan por separado después de la etapa c2), en donde la fracción proteínica acuosa se seca preferiblemente mediante secado por pulverización, secado en lecho fluido, liofilización o secado por refracción, o una combinación de los mismos.

Como resultado de la etapa de separación, es decir, la etapa c2), se obtiene una fracción grasa, una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos. De esta manera, el método da como resultado directamente varias corrientes de nutrientes. Aunque la separación de las diferentes fracciones es habitualmente el objetivo final de la presente invención, también hay aplicación en donde es ventajoso usar la pulpa de insecto obtenida después de la etapa b). Por tanto, la presente invención también se refiere a un método como se describe anteriormente, pero que solamente implica las etapas a) y b). Después de ello, la pulpa puede almacenarse, envasarse y posiblemente usarse tal cual como ingrediente alimenticio o de pienso. La presente invención, por tanto, también se refiere a la pulpa de insecto que se puede obtener o se obtiene por las etapas a) y b) de dicho método.

Los insectos usados para preparar la pulpa de insecto son preferiblemente larvas de insecto, preferiblemente larvas de insectos holometábolos. Las larvas se convierten preferiblemente en una pulpa de insecto antes de que se conviertan en prepupas. Aunque es posible usar prepupas para preparar pulpa de insecto, su contenido de quitina es relativamente alto en comparación con larvas "normales" antes de su transformación en prepupas, lo que las hace menos adecuadas como fuente de nutrientes para consumo humano o animal. Se usan larvas de la mosca soldado negra, y lo más preferiblemente las larvas se han cultivado, pero aún no han alcanzado la etapa de prepupa. Típicamente, se les ha permitido crecer en condiciones normales de crecimiento durante 10-30 días, preferiblemente 12-28 días, más preferiblemente 14-24 días después de la eclosión, tal como 14, 16, 18, 20, 22 días. Para el objetivo de un rendimiento máximo de corrientes de nutrientes procedentes de las larvas, se prefiere que las larvas se sometan al método de la invención poco antes de la transformación de las larvas a la fase de prepupa.

Por lo tanto, es ventajoso someter larvas al método de la invención de 12 horas a 3 días antes de que las larvas comiencen a transformarse en prepupas, preferiblemente de 1 día a 2 días antes de la transformación en prepupas. Las larvas de mosca soldado negra, tienen su mayor tamaño, conteniendo cantidades máximas de proteína y grasa en comparación con las etapas anteriores y posteriores en el ciclo de vida de las larvas, poco antes de la fase de transformación en prepupas. Además, las larvas que comienzan a transformarse en prepupas cambian de color de amarillo claro a gris/pardo cuando se consideran larvas de mosca soldado negra, lo que no se desea cuando se desea proteína blanca/amarilla de color claro. La pulpa de insecto y la proteína derivada de la misma que tiene un color más oscuro, parduzco/grisáceo debido a la aplicación de prepupas en el método de la invención, se percibe como un producto con calidad inferior en comparación con un producto de color más claro con un aspecto blanco/amarillo. A este respecto, se observa que las opciones y preferencias mencionadas a continuación se llevan a cabo con pulpa de insecto derivada de dichas larvas de mosca soldado negra.

La preparación de una pulpa a partir de los insectos, como se menciona en la etapa a) del método de la presente invención, puede realizarse de diferentes maneras. Una opción es aplastar los insectos para obtener una pulpa. Preferiblemente, se usa picado, corte o molienda para preparar la pulpa. Esto da como resultado un material de partida homogéneo de consistencia viscosa. La reducción de tamaño puede realizarse convenientemente en un molino microcortador, aunque también pueden usarse otras técnicas adecuadas. Durante esta etapa, el tamaño de partícula de los insectos, preferiblemente larvas, que permanecen en la pulpa es preferiblemente de menos de 500 micrómetros, preferiblemente entre 10 y 500 micrómetros (el tamaño más grande determinado usando un microscopio). El tamaño de partícula puede controlarse mediante la selección de una combinación específica de cuchilla y placa y velocidad de rotación en caso de un molino microcortador. También es posible utilizar un tamiz (por ejemplo, hecho de acero inoxidable) y empujar los insectos a través de la misma. En principio, un tamaño de partícula restante pequeño es ventajoso ya que facilita la extracción de grasa de la pulpa, sin embargo, un tamaño de partícula demasiado pequeño podría crear una emulsión que hace más difícil separar la grasa y la proteína en las siguientes etapas del proceso. Por tanto, el tamaño de partícula es preferiblemente mayor de 10 micrómetros. Preferiblemente, el tamaño promedio de partícula (d32; volumen/promedio) varía entre 10 y 500 micrómetros.

En la siguiente etapa, la etapa b), la pulpa se calienta hasta una temperatura de 80 °C-93 °C. El calentamiento garantiza que la mayoría de las grasas se licua para preparar una mezcla adecuada para la siguiente etapa de separación. Preferiblemente, el calentamiento se efectúa en condiciones de mezcla para promover la separación de diferentes fases, tales como la fase acuosa y la fase grasa. Para evitar el cambio de color (por ejemplo, mediante la formación de productos de reacción de Maillard) y la oxidación de la grasa y para mejorar el rendimiento de grasa, la pulpa se calienta únicamente a dicha temperatura durante un tiempo relativamente corto, es decir, durante 50 a 100 segundos. Preferiblemente, la pasta se calienta particularmente durante 75-85 segundos a una temperatura de 90 °C ± 2 °C.

Después de calentar la pulpa hasta la temperatura mencionada anteriormente, la pulpa se somete preferiblemente a una etapa de separación física, es decir, la etapa c2) del método de la presente invención. Durante esta etapa, las diversas corrientes de nutrientes (tales como grasa y proteína) se separan al menos parcialmente entre sí. Sin embargo, como se explica anteriormente, el rendimiento de grasa es considerablemente mayor con el método de la presente invención que con los métodos conocidos en la técnica. Además, también ha mejorado la calidad de las corrientes de nutrientes. Preferiblemente, las corrientes de nutrientes obtenidas son una fracción que contiene grasa, una fracción acuosa que contiene proteína y una fracción que contiene sólidos. La separación física incluye preferiblemente decantación, centrifugación o una combinación de estos métodos. Preferiblemente, la separación física se realiza a una presión normal (atmosférica).

La grasa puede separarse por medio de decantación, y la mezcla restante se separa adicionalmente en una fracción proteínica acuosa y una fracción que contiene sólidos por decantación o centrifugación. Sin embargo, también es posible obtener las fracciones que contienen grasa, proteína y sólidos en un orden diferente, o simultáneamente, por ejemplo, usando un decantador de 3 fases. Una ventaja de un método simultáneo de este tipo es que las tres corrientes de nutrientes se obtienen con un mínimo de etapas y, por tanto, con pérdidas mínimas del producto. La reducción del número de etapas de separación también tiene ventajas cuando se usa en un proceso continuo.

Se prefiere que, en el método de la presente invención, primero se separe una fracción grasa, por ejemplo, por decantación, y la mezcla restante no se separe adicionalmente, sino que se someta a secado. La mezcla restante combina, por lo tanto, tanto la fracción sólida como la fracción proteínica acuosa. En esta realización, las fases no grasas preferiblemente se secan adicionalmente para producir material secado. El material secado es rico en proteínas y contiene tanto el material rico en proteínas de la fracción proteínica acuosa como la fracción que contiene sólidos. Puesto que es posible con el método de la presente invención separar mejor la grasa de la proteína, se obtiene un producto de mayor calidad. Además, con el método de la presente invención se evita en gran medida el cambio de color (de la proteína) debida a reacciones de Maillard, mejorando de este modo la calidad del producto obtenido. El secado puede realizarse mediante diferentes métodos, tales como secado al aire, secado en lecho fluido, secado en tambor, secado en disco, secado rápido, liofilización, secado por refracción o preferiblemente por medio de secado por pulverización.

Se prefiere además que, en el método de la invención, la fracción proteínica acuosa y la fracción que contiene sólidos se sequen por separado después de la etapa c2). Debido a las condiciones de calentamiento relativamente suaves, al menos una parte de las proteínas presentes en la fracción proteínica acuosa habrá conservado su funcionalidad. Sería beneficioso no perder dicha funcionalidad durante el secado posterior. Por tanto, en dichas circunstancias, se prefiere secado en lecho fluido o secado por pulverización o liofilización o secado por refracción.

Un aspecto de la presente invención se refiere a puré de larvas de BSF calentado, obtenido con el método de la invención. Dicho puré de insecto calentado tiene sorprendentemente propiedades antioxidantes y es adecuado para su uso como pienso o alimento o ingrediente del mismo antioxidante.

Un aspecto de la presente invención se refiere a puré de larvas de BSF calentado, obtenido con el método de la invención. Dicho puré de larvas de BSF tiene sorprendentemente propiedades antioxidantes y es adecuado para su uso como pienso o alimento o ingrediente del mismo que promueve la salud.

Un aspecto de la invención se refiere al uso de la pulpa de larvas de BSF como ingrediente alimenticio o ingrediente de pienso, en donde la pulpa se puede obtener con el método de la invención, implicando el método o no la etapa de hidrólisis enzimática a1) antes de la etapa b) del método.

Un aspecto de la invención se refiere la pulpa de insecto según la invención para su uso como pienso o ingrediente de pienso, en particular alimento para mascotas.

Un aspecto de la invención se refiere la pulpa de insecto según la invención para su uso en un método para la prevención y/o supresión del daño oxidativo celular.

Los autores de la invención establecieron y analizaron sorprendentemente la actividad antioxidantein vitrode proteínas e hidrolizados de proteína de mosca soldado negra usando modelos de eliminación de radicales (ensayos de DPPH y ABTS), modelos enzimáticos que implican respuesta a mieloperoxidasas (ensayos clásicos y SIEFED), y un modelo celular que implica respuesta de neutrófilos. Se usaron harina de pescado y harina de pollo comerciales como referencias industriales en ejemplos comparativos. Los resultados de las pruebas y las comparaciones realizadas por los autores de la invención revelan que la harina de pescado y la harina de pollo ofrecen de poca a ninguna ventaja en términos de supresión del daño oxidativo que se produce como resultado de la respuesta de neutrófilos y mieloperoxidasa. Además, la harina de pescado y la harina de pollo también presentan comportamiento prooxidante en algunos de los ensayos y modelos de prueba usados. Los resultados muestran que las proteínas de mosca soldado negra (como parte de puré de larvas (hidrolizadas)) son eficaces para proteger contra el daño celular resultante de la respuesta de neutrófilos y mieloperoxidasa del hospedador. Por lo tanto, los derivados de mosca soldado negra (puré, puré hidrolizado) ensayados por los autores de la invención muestran ventajas sobre la harina de pollo y la harina de pescado para su inclusión en formulaciones de alimento/pienso para mascotas y pienso para acuicultura, tal como el uso como ingrediente de pienso.

Los autores de la invención establecieron que los hidrolizados de proteínas de BSF tienen una proporción significativa de proteínas <1000 Da. Esto incluye una mezcla de péptidos de cadena corta y aminoácidos libres. Se sabe que algunos péptidos de cadena corta y aminoácidos libres poseen actividad antioxidante. Estas moléculas pueden eliminar activamente ROS y radicales libres. Firmensyah y Abduh [3] evaluaron la actividad eliminadora de DPPH (2,2-difenil-1 -picrilhidrazilo) de hidrolizados de proteína de BSF. Zhuet al.[4] evaluaron la actividad eliminadora de radicales DPPH, ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), superóxido e hidroxilo de hidrolizados de proteína de BSF. Hasta la fecha, no se han realizado estudios, por lo que saben los autores de la invención, que establecieran la actividad antioxidante del hidrolizado de proteína de BSF usando modelos enzimáticos y celulares fundamentales, que muestren la sorprendente alta actividad antioxidante y la sorprendentemente alta protección contra la agresión y/o el daño oxidativo por el puré de larvas de BSF y el puré de larvas de BSF hidrolizado. Por lo tanto, antes de la invención establecida actualmente, el potencial antioxidante de los hidrolizados de proteína de BSF se entiende poco a nivel fundamental y aún no se había descrito, ni anticipado, ni esperado. Según la invención, investigaciones detalladas sobre la actividad antioxidantein vitrode las proteínas y los hidrolizados de proteína de BSF desbloquean nuevas aplicaciones de estos derivados de proteína para mejorar la salud animal.

Los autores de la invención desentrañaron el potencial antioxidante sorprendentemente alto de proteínas e hidrolizados de proteína de BSF, usando: (1) modelos de eliminación de radicales que implican DPPH y ABTS; (2) modelos enzimáticos que implican respuesta a mieloperoxidasas; y (2) un modelo celular que implica respuesta de neutrófilos. Se usaron harina de pollo y harina de pescado como referencias industriales en ejemplos comparativos para comparación con las actividades antioxidantes del puré de larvas de BSF (hidrolizado) según la invención.

Los autores de la invención establecieron sorprendentemente que el puré de insecto calentado a 90 °C durante 40 s tiene cantidades relativamente altas de ácidos grasos libres (aprox. 70 %). Véase, por ejemplo, el ejemplo 4, que se refiere a someter larvas de mosca soldado negra picadas al método de la invención. El calentamiento del puré justo durante 40 s es ineficaz en la desactivación de la lipasa. Mientras que, se observan bajas cantidades de ácidos grasos libres cuando el puré se calienta durante 80 s, lo que indica la suficiencia de este tiempo para la inactivación enzimática a 90 °C. En tiempos de calentamiento de más de 80 segundos, tal como hasta 300 segundos o 1800 segundos, el contenido de ácidos grasos aumenta en comparación con el bajo contenido de ácidos grasos obtenido cuando el puré de larvas de mosca soldado negra se calienta durante 80 segundos. Por lo tanto, para obtener una fracción proteínica que comprende un contenido de ácidos grasos libres relativamente bajo con el método de la invención, el tiempo de calentamiento en el método de la invención debe ser mayor de 40 segundos y menor de 300 segundos, tal como 50 100 segundos, o un tiempo de calentamiento seleccionado de 60-90 segundos, o 70-85 segundos, tal como aproximadamente 80 segundos. El tiempo de calentamiento preferido es de aproximadamente 90 °C o 90 °C ± 2 °C.

Sorprendentemente, los autores de la invención establecieron que se observa un índice de peróxido más alto para una duración de calentamiento de menos de 50 segundos, tal como aproximadamente 40 s, cuando la pulpa de insecto picada, tal como el puré obtenido con larvas de mosca soldado negra picadas, se somete a las etapas del método de la invención, aunque con una duración de la etapa de calentamiento de menos de 50 segundos (desviándose con ello del método de la invención). Las altas cantidades de ácidos grasos libres que podrían participar en la oxidación enzimática que da lugar a la producción de hidroperóxidos, obtenidas cuando el puré o la pulpa se calienta durante 40 segundos, es la base de la aparición de la cantidad relativamente alta de peróxidos. Sin embargo, cuando la pulpa o puré de insecto obtenido de larvas de mosca soldado negra, se somete al método de la invención, con una etapa de calentamiento de 80 s de tratamiento, se obtiene un índice de peróxido relativamente menor, en comparación con el valor obtenido cuando se calienta durante menos de 50 segundos. El calentamiento del producto (por ejemplo, puré de larvas) durante un periodo más largo de 100 segundos o menos según el método de la invención, tal como durante 300 segundos o 1800 segundos, tiene un efecto sobre la oxidación de la grasa en el sentido de que el índice de peróxido aumenta en comparación, por ejemplo, con el índice de peróxido cuando el puré o la pulpa se calienta durante un tiempo de 80 segundos. Por lo tanto, para obtener una fracción proteínica que comprende un índice de peróxido relativamente bajo usando el método de la invención, el tiempo de calentamiento en el método de la invención debe ser más largo de 40 segundos y más corto de 300 segundos, tal como 50-100 segundos, o un tiempo de calentamiento seleccionado de 60-90 segundos, o 70-85 segundos, tal como aproximadamente 80 segundos. El tiempo de calentamiento preferido es de aproximadamente 90 °C o 90 °C ± 2 °C.

Sorprendentemente, los autores de la invención establecieron que la fracción proteínica obtenida con o proporcionada por el método de la invención tiene actividad eliminadora de radicales. La actividad eliminadora de radicales es mayor que la actividad eliminadora de radicales obtenible con pienso para peces convencional suministrado a peces, cuando el estado de oxidación de la carne de pescado se evalúa después de suministra el pienso para peces que comprende una serie de dosis de proteína de larvas de mosca soldado negra obtenida con el método de la invención (dosis más baja: 0 % de proteína de larvas de BSF en el pienso; dosis más alta: 100 % de proteína de larvas de BSF; también se sometieron a prueba un 25 % y un 50 %, basado en la masa total del pienso para peces suministrado a peces). Véase también la sección de ejemplos, a continuación en el presente documento, el ejemplo 5. La actividad eliminadora de radicales ABTS de la carne de pescado después de que los peces se alimentaran previamente con pienso que comprende o consiste en proteína obtenida con el método de la invención (denominada polvos de extracto soluble en agua (WSEP)) se comparó con la actividad eliminadora de radicales de la carne de pescado después de que los peces se alimentaran previamente con pienso convencional que carece de la fracción proteínica de larvas de mosca soldado negra obtenida con el método de la invención. Para todas las muestras, el aumento de la concentración dio como resultado un aumento de los valores medios de inhibición (que muestran el comportamiento antioxidante del pienso suministrado cuando se evalúa la actividad eliminadora de radicales en la carne de pescado). Emáx (inhibición máxima obtenida durante la prueba) estuvo en el siguiente orden: HI-25 > HI-100 > HI-50 > HI-0 (todos obtenidos a 0,2 mg/ml, concentración final), en referencia a pienso para peces que comprende un 25, 100, 50 y 0 % en peso de proteína de larvas de BSF obtenida con el método de la invención, respectivamente, basado en la masa total del pienso suministrado. Este resultado muestra que a la dosis de la muestra HI-25, se obtiene la mayor actividad eliminadora de radicales ABTS. Por otra parte, las muestras HI-0 presentan menos actividad eliminadora de radicales ABTS. Según se evalúa usando el ensayo de ABTS, todas las muestras de proteína obtenidas aplicando el método de la invención con larvas de mosca soldado negra, presentan actividad antioxidante de una manera dependiente de la dosis. Las muestras HI-25 muestran la actividad antioxidante más alta.

En resumen, con el método de la presente invención se ha hecho posible obtener corrientes de nutrientes valiosas a partir de larvas de BSF, incluyendo puré. Estas corrientes no están contaminadas por productos químicos exógenos y tienen un origen puramente biológico. Las corrientes de nutrientes aisladas tales como el puré de insecto obtenido con el método, tal como el puré de insecto calentado enfriado obtenido con el método, pueden usarse en la preparación de alimentos, piensos o productos farmacéuticos. Además, dependiendo de la aplicación prevista, las corrientes de nutrientes obtenidas pueden procesarse adicionalmente, por ejemplo, para aislar ingredientes específicos, tales como proteína hidrolizada, aminoácidos o ácidos grasos específicos.

Se prefiere el método para convertir insectos en corrientes de nutrientes según la invención, en donde, en la etapa b), la pulpa se calienta particularmente a una temperatura de 80 °C-93 °C, preferiblemente 85 °C-90 °C. Una realización es el método para convertir insectos en corrientes de nutrientes según la invención, en donde, en la etapa b), la pulpa se calienta durante 60-95 segundos, particularmente durante 70-90 segundos, preferiblemente 75-85 segundos, tal como 78-82 segundos. Como se ha dicho, los autores de la invención establecieron que, aplicando el método de procesamiento de larvas de mosca soldado negra de la invención, en la etapa a) del método, se obtiene una corriente de nutrientes que comprende una corriente de fracción proteínica acuosa obtenida de larvas de mosca soldado negra como fuente de proteínas, que es una fracción proteínica acuosa que tiene rasgos característicos y características estructurales sorprendentemente mejoradas, en comparación con la proteína obtenida de dichas larvas aplicando un método de procesamiento alternativo de larvas de mosca soldado negra conocido en la técnica, tal como el método descrito en líneas generales en la solicitud de patente europea EP2953487, en la sección de ejemplos de la misma, en particular el ejemplo 1, página 12, línea 8-13 y página 13, línea 3-5. En particular, el tiempo de calentamiento relativamente corto de 100 segundos o menos de 100 segundos, en la etapa b) del método de la invención, se considera esencial para obtener pulpa de larvas mejorada en la etapa b) y posteriormente para obtener una fracción proteínica acuosa mejorada en la etapa c2) del método. Los autores de la invención han descubierto que, usando la combinación de tiempo-temperatura se atrapa menos aceite dentro de la fracción proteínica acuosa, proporcionando con ello una fuente de proteínas más pura en la etapa c2) del método de la invención, en comparación con fuentes de proteínas proporcionadas usando medios y métodos alternativos actuales para aislar una fracción proteínica de larvas de mosca soldado negra como fuente de proteínas. También se ha encontrado que el cambio de color de la pulpa (de proteína) calentada en la etapa b) del método, debido a reacciones de Maillard, se evita en gran medida, mejorando de este modo la calidad del producto obtenido, por ejemplo, la pulpa calentada en la etapa b) y la fracción proteínica acuosa en la etapa c2) del método de la invención. Por ejemplo, se obtiene fracción proteínica acuosa con contenido de grasa reducido cuando larvas de mosca soldado negra picadas se calientan durante 80 segundos a 90 °C, o durante 75-85 segundos a una temperatura de 90 °C ± 2 °C. En el documento EP2953487, el tiempo de calentamiento es de al menos 5 minutos e incluso 30 minutos. Además, el tiempo de calentamiento relativamente corto de como máximo 100 segundos, preferiblemente aproximadamente 70-90 segundos, de la pulpa de larvas de mosca soldado negra picadas (proporcionada en la etapa a) del método) da como resultado pulpa de insecto calentada menos granulada y menos agregada en la etapa b) del método en comparación con tiempos de calentamiento más largos aplicados en los métodos actuales conocidos en la técnica. La pulpa de larvas menos granulada después de la etapa b) del método es beneficiosa para, por ejemplo, la hidrólisis enzimática de la proteína comprendida por la pulpa y, en general, una pulpa de insecto menos granulada y agregada y la fracción proteínica posterior contribuyen a resultados de separación mejorados y a facilidad mejorada de procesamiento de la pulpa y la proteína. Por ejemplo, la granulación reduce la eficacia enzimática ya que la materia en partículas es menos accesible para las moléculas enzimáticas. Aplicando las etapas del método de procesamiento de larvas como parte del método de la invención, el corto tiempo de calentamiento da como resultado una composición de proteínas que consiste en agrupaciones de proteínas, agregados, partículas más pequeñas o incluso (principalmente) monómeros de proteínas y/o multímeros pequeños, en comparación con los agregados de proteínas y partículas más grandes obtenidas cuando la pulpa de larvas de mosca soldado negra se somete a calentamiento durante más de 100 segundos, tal como durante 5 minutos hasta 30 minutos. Además, la grasa queda atrapada dentro de los grupos de pulpa de proteínas relativamente grandes y los agregados de fracciones proteínicas después de calentar la pulpa de insecto durante tiempos más largos de 100 segundos, por ejemplo, a 90 °C.

La presente invención se ilustrará adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos y realizaciones

Ejemplo 1A

Se recogieron larvas (mosca soldado negra) vivas y lavadas de 14 días de edad después de la eclosión (5 kg) justo antes de someterlas a picado usando la picadora y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Para cada experimento se picaron 100 g de larvas frescas. Se calentaron 100 g de larvas picadas hasta 90 °C (usando una placa caliente y con agitación continua) y el producto se mantuvo a esta temperatura durante 0, 40, 80, 120, 300, 600 y 1800 s. La pulpa (puré) de insecto obtenida se dejó enfriar hasta temperatura ambiental (temperatura ambiente). Como alternativa, la pulpa (puré) de insecto obtenida se dejó enfriar hasta 3 °C-7 °C.

Se recogieron aproximadamente 30 g de larvas calentadas en 3 tubos centrifugables y se centrifugaron a 3200G durante 5 minutos. La fracción grasa se extrajo después de la centrifugación y se recogió usando una pipeta Pasteur y se pesó para calcular el % de separación de grasa (del peso total del puré en base húmeda).

La separación de grasa en función del tiempo se proporciona en la tabla 1 a continuación y en la figura 1. De esto resulta evidente que, tras la centrifugación de la pulpa de insecto sin calentar, no se obtuvo grasa, pero que aumentó de manera constante hasta un tiempo de calentamiento de 80 segundos. Después de esto permaneció estable hasta un tiempo de calentamiento de 600 segundos, después de lo que la separación de grasa comenzó a disminuir. Los resultados sorprendentes muestran que, a diferencia de lo esperado en la técnica, se pueden usar tiempos de calentamiento relativamente cortos de 10 minutos o menos para la eliminación más eficaz de la grasa de la pulpa de insecto calentada. Además, debido a los tiempos de calentamiento reducidos, se produjo menos cambio de color de la pulpa de insecto calentada, lo que da lugar a un producto (y corrientes de nutrientes derivadas) con una calidad más alta. En la figura 2 se representa la influencia del tiempo de calentamiento sobre el color de la pulpa de insecto. Además, el corto tiempo de calentamiento da como resultado una pulpa de insecto menos granulada y menos agregada en comparación con tiempos de calentamiento más largos de más de 600 segundos (véase, por ejemplo, la figura 2).

Tabla 1: separación de grasa en función del tiempo de calentamiento (a 90 °C)

Ejemplo 1B

Materia prima

Similar al procedimiento aplicado para el ejemplo 1A, se usaron larvas (mosca soldado negra) vivas y lavadas de 14 días de edad después de la eclosión como punto de partida para los diferentes tratamientos, es decir, aplicación del método de la invención y aplicación de un método convencional según el documento WO2014123420.

Métodos

Generación de muestras

Se proporcionó pulpa de insecto usando el método de la invención, y usando el método convencional según el documento WO2014123420, en donde, en la etapa b), la pulpa se calentó durante 30 minutos. Cada tratamiento se realizó por duplicado (n = 4), según los dos métodos. La etapa a) fue igual que en el método de la invención, en el ejemplo 1B.

Proporcionar pulpa de insecto según el método convencional del documento WO2014123420 o según el método de la invención

Se lavaron BSFL (larvas de mosca soldado negra) de catorce días de edad con agua corriente y después se picaron inmediatamente usando una mezcladora (etapa a) común de los dos métodos comparados). Después, las muestras se pasteurizaron usando la micrococina durante 30 minutos a 90 °C (según el método convencional, etapa b); muestra 1) o durante 80 segundos a 90 °C (según el método de la invención, etapa b); muestra 2). Las muestras se pusieron en el frigorífico (4 °C), con lo que se proporcionó pulpa de insecto calentada enfriada.

Materia seca y contenido de humedad

Para determinar del contenido de materia seca, en primer lugar, se determinó el contenido de humedad según EC-152/2009. Después, se calculó la materia seca restando el contenido de humedad de la masa inicial de la muestra. El contenido de materia seca para ambas muestras 1 y 2 (véase la figura 11) fue similar y fue de aproximadamente un 29 % basado en el peso total de la pulpa de insecto después de someterlas a la etapa b) de los dos métodos.

Capacidad de retención de agua (WHC)

Se midió el peso de la muestra al inicio de la prueba. A continuación, todas las muestras se trataron adicionalmente con calor a 121 °C durante 80 minutos. Después, las cajas de muestras se mantuvieron inclinadas a un ángulo de 30° desde la referencia horizontal durante 2 minutos. Después, se drenó la liberación de agua de las muestras y se registró el peso del producto de pulpa de insecto residual después de la eliminación del agua. Se usa el porcentaje de pérdida de agua como representación de la WHC de la muestra.

Análisis de datos

El promedio y la desviación típica se realizaron para cada una de las cuatro réplicas (n = 4) usando Microsoft Excel.

Análisis estadístico

Se usó la prueba de latpara comparar el diferente tratamiento según los diferentes parámetros. La configuración de la prueba usada fue cola = 2 y tipo = 3. Se usó Microsoft Excel para realizar este análisis. Un valor dep<0,05 se consideró significativamente diferente.

Resultados

El contenido de humedad para la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención (muestra 2) y para la pulpa de insecto obtenida con el método convencional (muestra 1) fue esencialmente igual: 71,7 % y 70,6 %, respectivamente, con desviaciones típicas de un 0,7 % y un 1,6 %, respectivamente, basado en el peso total de la pulpa de insecto.

Para la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención, aplicando la etapa a), b) y c), la capacidad de retención de agua (WHC) expresada como la pérdida de peso de agua después del tratamiento térmico, en comparación con el producto antes del tratamiento térmico para evaluar la WHC, fue aproximadamente un 40 % menor que la WHC de la pulpa de insecto obtenida al someter la pulpa de la etapa a) a un calentamiento a 90 °C durante 30 minutos según el método del documento WO2014123420. Véase la figura 11. La WHC expresada como la pérdida de peso de agua después del tratamiento térmico de la pulpa de insecto obtenida con el método según la invención es de aproximadamente un 11 %, mientras que la WHC de la pulpa de insecto obtenida con el método convencional es de aproximadamente un 18 %. Es decir, el peso de la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención fue de aproximadamente un 89 % después del tratamiento térmico a 121 °C durante 80 minutos, en comparación con el peso de la pulpa de insecto antes del inicio del calentamiento. En contraste, el peso de la pulpa de insecto obtenida con el método convencional disminuyó hasta aproximadamente un 82 % después del tratamiento térmico a 121 °C durante 80 minutos, en comparación con el peso de la pulpa de insecto antes del inicio del calentamiento. Por tanto, la WHC de la pulpa de insecto obtenida con el método de la invención mejoró en un 7 %.

Ejemplo 2

Un puré de larvas de BSF, también denominado PureeX™ de BSF (BSF-P) y el puré hidrolizado (BSF-HP) obtenido por hidrólisis enzimática del puré de larvas de BSF, se prepararon mediante Protix B.V. (Dongen, Países Bajos) en octubre de 2019. El puré y el puré digerido enzimáticamente se obtuvieron según el siguiente método. Se recogieron larvas de mosca soldado negra vivas y lavadas de 14 días de edad (después de la eclosión) justo antes de someterse a la picadora para picar las larvas (proporcionando con ello pulpa de larvas (también denominado puré)) y posteriormente se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Para cada experimento, las larvas se picaron frescas. Las larvas picadas se trataron con Flavourzyme al 0,1 % o al 0,5 %, basado en la masa de las larvas picadas, durante 0,5-3 horas, por ejemplo, de 1 a 2 horas, a 45 °C a 65 °C (±2 °C) con agitación continua. El lote de puré de larvas de BSF hidrolizado aplicado en el ejemplo 2 se obtuvo por hidrólisis enzimática durante 1 hora a 50 °C (±2 °C). Flavourzyme (Novozymes, Dinamarca) es una combinación de aminopeptidasas que tienen actividades endopeptidasa y exopeptidasa. Las larvas picadas tratadas con enzima y las larvas de control sin tratamiento enzimático, se calentaron hasta 90 °C y el producto se mantuvo a esta temperatura durante 80 segundos. El puré de insectos obtenido se usó para medir el contenido de aminoácidos libres (figura 3A: contenido de aminoácidos libres (n = 1), sometido a prueba en puré) y digestibilidad con pepsina (figura 3B: digestibilidad (n = 1), sometido a prueba en puré). Se obtuvo harina de proteína de la pulpa de larvas de BSF calentada, y de los dos lotes de pulpa de larvas de BSF calentada que primero se sometió a hidrólisis enzimática de las proteínas usando Flavourzyme al 0,1 % en peso o al 0,5 % en peso antes de la etapa de calentamiento a 90 °C, por ejemplo, por etapas de separación de proteínas de la pulpa, evaporación, secado y molienda. El porcentaje de separación de grasa se midió durante la etapa de separación (figura 3C: % de separación de grasa (n = 3), sometido a prueba durante la etapa de separación para preparar harina de proteína). En todos los experimentos realizados, se observó un efecto dependiente de la dosis, cuando se considera la cantidad de enzima aplicada. Por tanto, el tratamiento enzimático de larvas picadas usando Flavourzyme antes de la etapa de calentamiento aumenta el contenido de aminoácidos libres y aumenta la digestibilidad con pepsina del puré de larvas hidrolizado obtenido y, como resultado, el puré obtenido que comprende proteína hidrolizada tiene un mejor sabor (el contenido de aminoácidos libres se refiere a un sabor atractivo, apetitoso cuando los animales y los seres humanos consumen un producto que comprende aminoácidos libres), es altamente digerible y tiene propiedades antioxidantes (véanse los resultados de las pruebas, a continuación en el presente documento). Además, el tratamiento enzimático de la pulpa de larvas de BSF mejora la separación de grasa en la siguiente etapa de separación después de la hidrólisis enzimática y el tratamiento térmico de la pulpa digerida enzimáticamente, lo que aumenta la extracción de grasa de la harina de proteína, en comparación con la separación de grasa de la fracción proteínica obtenida con el puré de larvas que no se sometió a una etapa de hidrólisis enzimática antes de calentar a 90 °C.

Ejemplo 3 (no según la invención)

2. Materiales y métodos

2.1. Reactivos

Todos los reactivos eran de calidad analítica. El dimetilsulfóxido, metanol, etanol, cloruro de calcio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, peróxido de hidrógeno y Tween-20 se adquirieron de Merck (VWR, Leuven, Bélgica). El nitrito de sodio, seroalbúmina bovina, 12-miristato 13-acetato de forbol y Percoll™ se adquirieron de Sigma (Bornem, Bélgica). Los extractos y soluciones acuosas se prepararon en agua Milli-Q obtenida usando el sistema de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, EE. UU.). Las soluciones de ácido bicinconínico y sulfato de cobre (II) se adquirieron de Sigma (Steinheim, Alemania). Se adquirió papel de filtro Whatman de calidad 4 (270 mm) de Amersham (Buckinghamshire Reino Unido). El sistema de filtro de vacío desechable de 30 ml Sterlip se adquirió de Millipore (Bedford, EE. UU.). El 2,2-d ifenil-1 -picrilhidrazilo y el ácido 2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) se adquirieron de Aldrich (Darmstadt, Alemania). La 8-amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazina-1,4(2H,3H)diona (L-012) se adquirió de Wako Chemicals (Neuss, Alemania).

2.2. Materias primas

Se adquirieron harina de pollo (CM) y harina de pescado (FM) de una tienda virtual en septiembre de 2019. La composición química de ambos ingredientes declarada por el proveedor se indica en la tabla 2.

Tabla 2. Composición química de harina de pollo y harina de pescado (como base, proporcionada por el proveedor).

Se prepararon BSF-P y puré hidrolizado BSF-HP mediante Protix B.V. (Dongen, Países Bajos) en octubre de 2019. (1). El BSF-P fue "carne" picada de BSF (puré, pulpa) pasteurizada suministrada congelada a -20 °C. El BSF-P también es la materia prima para producir harina de proteína de BSF (ProteinX™). (2). El BSF-HP fue carne (puré) de BSF Se hidrolizada y pasteurizada también suministrada congelada a -20 °C. (3). La composición química de los dos ingredientes BSF-P y BSF-HP fue como se indica en la tabla 3.

Tabla 3. Composición química de puré calentado y puré hidrolizado calentado de derivados de proteína de BSF (como base, proporcionada por el proveedor).

1BSF-P: PureeX™ de BSF; 2BSF-HP: puré hidrolizado de BSF; aValores medios basados en el intervalo establecido en Protix.

Se prepararon extractos solubles en agua para CM, FM, BSF-P y BSF-HP. Estos productos (100 g cada uno) se disolvieron con seis volúmenes de agua Milli-Q en función de sus respectivos contenidos de materia seca (por ejemplo, el BSF-P tenía un contenido de materia seca de un 33,3 % y se diluyó con 200 ml de agua Milli-Q) y se agitaron durante 2 h en un agitador magnético. Después de la centrifugación (1000 x g durante 30 min a 4 °C), se retiró la capa de grasa superior y se filtró el sobrenadante usando un filtro Whatman (calidad 4). La etapa de centrifugación y filtración se repitió de nuevo para eliminar todos los residuos no solubles. Finalmente, el sobrenadante se filtró usando un filtro Sterlip (50 ml, 0,22 gm) y se liofilizó durante un periodo de dos días para obtener los polvos de extractos solubles en agua respectivos. Los cuatro extractos solubles en agua se almacenaron en un desecador (a 18 °C) hasta su uso posterior.

2.3. Cuantificación de proteínas

El contenido total de proteínas de los cuatro extractos solubles en agua se analizó usando el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA)[5],La curva de calibración se obtuvo usando seroalbúmina bovina (BSA) como patrón a concentraciones: 0, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mg/ml. Se usaron para el análisis soluciones madre de extractos solubles en agua de 3 mg/ml. Se preparó una solución de ensayo disolviendo 4900 gl de BCA (49/50) y 100 gl de sulfato de cobre (II) (1/50). Se añadieron soluciones madre de muestra (10 gl) y solución de ensayo (200 gl) en pocillos de una placa de 96 pocillos. Esta placa se incubó a 37 °C durante 30 min y se midió la absorbancia a 450 nm usando un Multiscan Ascent (Fisher Scientific, Asse, Bélgica).

2.4. Ensayo de DPPH

La actividad eliminadora de radicales DPPH se analizó según el protocolo de Brand-Willamset al. [6],con algunas modificaciones. La solución de ensayo de DPPH se preparó disolviendo 10,5 mg de DPPH en 40 ml de etanol. La solución de ensayo se preparó fresca y se almacenó en la oscuridad hasta su uso posterior. La solución de trabajo de DPPH se preparó diluyendo la solución de ensayo con 10 veces etanol (para obtener una absorbancia de 0,6 a 0,8 a 517 nm). La solución de trabajo de DPPH (1920 gl) se mezcló con 20 gl de diluciones de muestras (cuatro extractos solubles en agua en agua Milli-Q) para obtener una concentración final de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml. La disminución de la absorbancia después de 30 y 60 min de incubación en la oscuridad se registró a 510 nm usando un espectrofotómetro HP 8453 UV-vis (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). En lugar de diluciones de muestra, se usó solamente agua Milli-Q en el caso del control.

2.5. Ensayo de ABTS

La actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS se analizó según el protocolo de Arnaoet al. [7],con algunas modificaciones. La solución de ensayo de ABTS se preparó disolviendo 7,0 mmol/l de ABTS y 2,45 mmol/l de persulfato de potasio en agua Milli-Q. La solución de ensayo se mantuvo durante la noche en oscuridad a temperatura ambiente. La solución de trabajo de ABTS se preparó diluyendo con metanol para obtener la absorbancia entre 0,7 y 0,8 a 734 nm. Se mezcló solución de trabajo de ABTS (1920 gl) con 20 gl de diluciones de muestras (cuatro extractos solubles en agua en agua Milli-Q) para obtener una concentración final de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml. La disminución de la absorbancia después de 30 min de incubación en la oscuridad se registró a 734 nm usando un espectrofotómetro HP 8453 UV-vis (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). En lugar de diluciones de muestra, se usó solamente agua Milli-Q en el caso del control.

2.6. Actividad de mieloperoxidasa (MPO) usando extracción inmunológica específica seguida de ensayo de detección enzimática (SIEFED)

El ensayo SIEFED es un método certificado desarrollado por Francketal. [8 ]para la detección específica de MPO de origen animal. La solución de MPO se preparó diluyendo MPO humana en solución salina tamponada con fosfato 20 mM (a pH 7,4), 5 g/l de BSA y Tween-20 al 0,1 %. Las diluciones de la muestra a la concentración final de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml se incubaron durante 10 min (a 37 °C) con solución de MPO a una concentración final de 25 ng/ml. Después de la incubación, las mezclas se cargaron en los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos recubierta con anticuerpos policlonales de conejo (3 gl/ml) contra MPO equina y se incubaron durante 2 h a 37 °C en la oscuridad. Después de lavar los pocillos, se midió la actividad de las enzimas capturadas por los anticuerpos añadiendo peróxido de hidrógeno (10 gM), NO<2>- (10 mM) y rojo Amplex™ (40 gM). La oxidación de rojo Amplex™ en el aducto fluorescente resorufina se supervisó durante 30 min a 37 °C con Fluorosckan Ascent (Fisher Scientific, Asse, Bélgica). En lugar de diluciones de muestra, se usó solamente agua Milli-Q en el caso del control.

2.7. Actividad de mieloperoxidasa (MPO) usando medición clásica

La solución de MPO se preparó como se menciona en la sección 2.6. Las diluciones de muestra a la concentración final de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml se incubaron durante 10 min (a 37 °C) con solución de MPO a una concentración final de 25 ng/ml. Después de la incubación, la mezcla (100 gl) se transfirió inmediatamente a una placa de microvaloración de 96 pocillos. Esto estuvo seguido de la adición de 10 gl de NO<2>- (10 mM) y 100 gl de mezcla de rojo Amplex™ y peróxido de hidrógeno (a las concentraciones mencionadas en la sección 2.6). La oxidación de rojo Amplex™ en el aducto fluorescente resorufina se supervisó durante 30 min a 37 °C con Fluorosckan Ascent (Fisher Scientific, Asse, Bélgica) inmediatamente después de la adición de la mezcla revelado. En lugar de diluciones de muestra, se usó solamente agua Milli-Q en el caso del control.

2.8. Actividad antioxidante celular

La preparación de las soluciones de neutrófilos y 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) se realizó según Paulet al.

[2]. La actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos de las muestras se analizó usando el protocolo de Tsumbuet al. [1],La suspensión de neutrófilos (1 millón de células/143 gl de PBS) se cargó en pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos y se incubó durante 10 min (a 37 °C en oscuridad) con solución salina tamponada con fosfato de muestras a concentraciones finales de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml. Después de la incubación, se añadieron 25 gl de cloruro de calcio (10 gM) y 20 gl de L-012 (100 gM) a los pocillos. Los neutrófilos se activaron con 10 gl de PMA (16 gM) inmediatamente antes de supervisar la respuesta de quimioluminiscencia de los neutrófilos durante 30 min a 37 °C usando Fluorosckan Ascent (Fisher Scientific, Asse, Bélgica). En lugar de diluciones de muestra, se usó solamente solución salina tamponada con fosfato en el caso del control.

2.9. Análisis estadísticos

Todos los análisis se realizaron por triplicado. Para la cuantificación de proteínas, se calculó la ecuación de una curva ajustada y el valor de R al cuadrado usando regresión lineal. Las relaciones entre la concentración y la inhibición obtenidas para los ensayos antioxidantes fueron de naturaleza no monótona. Para abordar esto, se usó la técnica de regresión de suavizado de puntos de dispersión estimados localmente (LOESS) para modelar la relación[9],Los modelos se ajustaron usando el programa estadístico R[10],Estos modelos requieren un parámetro de amplitud que define la sensibilidad de suavizado de las regresiones locales. Mediante inspección visual, se encontró que un valor de parámetro de amplitud de 0,4 era adecuado para todas las curvas de relación de concentración e inhibición. Se encontraron concentraciones con un porcentaje de inhibición previsto de interés, tal como CI<50>(concentración a la que se alcanza el 50 % de inhibición), usando los modelos ajustados en combinación con una rutina de búsqueda numérica.

3. Resultados

3.1. Cuantificación de proteínas

Se establecen la curva de calibración obtenida usando BSA, la ecuación de la curva y el valor de R al cuadrado. La densidad óptica de las muestras y la concentración relativa de proteínas (calculada usando la ecuación de la curva) se mencionan en la tabla 3. La solución de extracto de BSF-P (3 mg/ml) presenta la más alta, por otro lado, la solución de BSF-HP presenta las concentraciones de proteína más bajas entre las soluciones probadas usando el ensayo de ácido bicinconínico.

Tabla 4. Cuantificación de proteínas usando el ensayo de ácido bicinconínico

1BSF-P: PureeX™ de BSF; 2BSF-HP: puré hidrolizado de BSF; 3FM: harina de pescado; 4CM: harina de pollo.

3.2. Ensayo de DPPH

La actividad eliminadora de radicales de DPPH de las cinco muestras después de 30 y 60 minutos de incubación se indica en la figura 4 y la figura 5, respectivamente. El gráfico muestra los valores medidos, así como las curvas ajustadas obtenidas de LOESS. La CM presentó comportamiento prooxidante a todas las concentraciones ensayadas después de 30, así como 60 minutos de incubación. Mientras que la FM mostró comportamiento prooxidante a cuatro de cinco concentraciones probadas después de 30 min de incubación y a todas las concentraciones ensayadas después de 60 min de incubación. La CI<50>de BSF-HP después de 60 min de incubación se indica en la tabla 5. No fue posible calcular la CI<50>para otras muestras (después de 30 o 60 min de incubación) porque las muestras presentaron actividad prooxidante o no se logró una inhibición del 50 % durante el ensayo. La Emáx (inhibición máxima lograda durante el ensayo) de todas las muestras también se indican en la tabla 6 y están en el siguiente orden: BSF-HP > BSF-P > FM y BSF-HP > BSF-P después de 30 y 60 minutos de incubación, respectivamente.

Tabla 5. CI<50>(mg/ml) de actividad antioxidante de muestras obtenidas utilizando diferentes ensayos

1BSF-P: PureeX™ de BSF; 2BSF-HP: puré hidrolizado de BSF; 3FM: harina de pescado; 4CM: harina de pollo; aMPO: mieloperoxidasa; bCAA: actividad antioxidante celular usando modelo de neutrófilos; cNE: no estimado porque no se logró una inhibición del 50 % en las concentraciones ensayadas; dPO: no se estimó porque la muestra presentó actividad prooxidante en las concentraciones ensayadas.

Tabla 6. Emáx de actividad antioxidante (% de inhibición) de muestras obtenidas utilizando diferentes ensayos

*C: Concentración a la que se consigue Emáx; 1BSF-P: PureeX™ de BSF; 2BSF-HP: puré hidrolizado de BSF; 3FM: harina de pescado; 4CM: harina de pollo; aMPO: mieloperoxidasa; bCAA: actividad antioxidante celular usando modelo de neutrófilos; CPO: No se estimó porque la muestra presentó actividad prooxidante en las concentraciones ensayadas. ;3.3. Ensayo de ABTS;;La actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS de muestras después de 30 minutos de incubación se muestra en la figura 6 (valores medidos, así como curvas ajustadas obtenidas de LOESS). Todas las muestras presentaron un patrón de inhibición similar, es decir, el % de inhibición aumentó en función del aumento de la concentración. La CI<50>de las muestras se mencionan en la tabla 5 y se encuentran en el orden siguiente: FM > CM > BSF-HP > BSF-P. Cuanto menor es la CI<50>, mayor es la actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS. La Emáx (inhibición máxima lograda durante el ensayo) de todas las muestras se indican en la tabla 6 y están en el siguiente orden: BSF-P > BSF-HP > FM > CM. ;;3.4. Actividad de mieloperoxidasa (MPO) usando extracción inmunológica específica seguida de ensayo de detección enzimática (SIEFED);;La actividad de modulación de la respuesta de MPO de muestras obtenidas usando el ensayo SIEFED se muestra en la figura 7 (valores medidos, así como curvas ajustadas obtenidas de LOESS). El BSF-HP mostró un fuerte comportamiento de inhibición, con >75 % de inhibición a una concentración de 0,20 mg/ml. La CI<50>de las muestras se mencionan en la tabla 5 y están en el siguiente orden: BSF-HP. La Emáx de las muestras se muestran en la tabla 6, y están en el siguiente orden: BSF-HP > BSF-P. La FM y CM muestran comportamiento prooxidante a todas las concentraciones ensayadas. Por otra parte, Emáx para BSF-P fue <50 %. ;;3.5.Actividad de mieloperoxidasa (MPO) usando ensayo clásico;;La actividad de modulación de la respuesta de MPO de muestras obtenidas usando el ensayo clásico se indica en la figura 8 (valores medidos, así como curvas ajustadas obtenidas de LOESS). La CM y FM presentaron comportamiento prooxidante a todas las concentraciones ensayadas. La Emáx de todas las muestras ensayadas se indican en la tabla 6. El BSF-P y BSF-HP presentaron Emáx >75 %. La CI<50>de las muestras se mencionan en la tabla 5 y están en el siguiente orden: BSF-P > BSF-HP. ;;3.5.Actividad antioxidante celular;;La actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos (valores medidos, así como curvas ajustadas obtenidas de LOESS) y Emáx de las muestras se muestran en la figura 9 y en la tabla 6, respectivamente. Todas las muestras ensayadas presentaron Emáx >0 %. La FM y CM presentaron Emáx <40 %. La CM presentó comportamiento prooxidante a 3 de las 5 concentraciones ensayadas. La CI<50>de las muestras se mencionan en la tabla 5. El BSF-P y BSF-HP tienen los mismos valores numéricos de CI<50>. ;;4. Debate ;;4.1. Cuantiíicación de proteínas;;La concentración de proteínas de los cuatro extractos solubles en agua estimada usando el ensayo de ácido bicinconínico se muestra en la tabla 4. Considerando las similitudes del patrón de aminoácidos entre las proteínas de mosca soldado negra, la FM y CM, el contenido de proteínas de cuatro extractos solubles en agua está en el siguiente orden: BSF-P > CM > FM > 45,5 % > BSF-HP. ;;4.2. Actividad eliminadora de radicales DPPH;;Los ensayos de DPPH y ABTS se usan comúnmente para analizar el potencial antioxidante de productos alimenticios y de pienso. La actividad eliminadora de radicales DPPH representa la capacidad de una muestra de donar un átomo de hidrógeno (denominada transferencia de átomos de hidrógeno) o electrones (denominada transferencia de electrones individuales) para estabilizar los radicales libres. La CI<50>y Emáx del ensayo de DPPH para todas las muestras ensayadas se mencionan en la tabla 5 y la tabla 6, respectivamente. Después de 30 min de incubación, todas las muestras ensayadas presentan Emáx <50 % (mostrando BSF-HP la Emáx más alta). Por otro lado, después de 60 min de incubación, solo BSF-HP presenta Emáx >50 %. El BSF-HP se fabrica por hidrólisis controlada de proteínas de mosca soldado negra y contiene al menos un 24 % de proteínas <1000 Da (véase la tabla 3). Por otro lado, BSF-P contiene al menos un 6 % de proteínas <1000 Da. Los autores de la invención no pudieron encontrar ninguna documentación representativa para la distribución de peso molecular de FM y CM. Sin embargo, según la bibliografía, la FM y CM contienen un 2,2 % y 1,1 % de aminoácidos libres (de proteínas totales), respectivamente [Li, P.; Wu, G. Composition of amino acids and related nitrogenic nutrients in feedstuffs for animal diets.Amino Acids2020, 1-20, doi:10.1007/s00726-020-02833-4.]. Lo que se traduce en que FM y CM contienen al menos un 2,2 % y 1,1 % de proteínas <1000 Da, respectivamente. La capacidad de los materiales proteínicos de eliminar radicales libres depende de la distribución del peso molecular de las proteínas. Las proteínas con péptidos de bajo peso molecular podrían eliminar los radicales libres de manera más eficaz. La actividad eliminadora de radicales libres de moléculas proteínicas está también influenciada por: (1). La composición de aminoácidos: los aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, Tyr, Phe, Pro, Ala, His y Leu) tienen una actividad eliminadora de radicales superior en comparación con los aminoácidos hidrófilos; (2). La secuencia de aminoácidos: los péptidos de naturaleza anfífila podrían mejorar la actividad eliminadora de radicales de una muestra. Los análisis químicos han indicado que Tyr presenta comportamiento antioxidante mediante el mecanismo de transferencia de átomos de hidrógeno. Por otro lado, aminoácidos tales como Cys, Trp e His presentan comportamiento antioxidante mediante el mecanismo de transferencia de electrones individuales. ;;La FM y CM presentan comportamiento prooxidante a la mayoría de las concentraciones ensayadas después de 30 min, así como 60 min de incubación (véase la figura 4 y la figura 5). Este comportamiento surge principalmente del procesamiento térmico. Tanto para FM como para CM, el procesamiento térmico comúnmente implica calentar el producto en bruto a altas temperaturas durante 15 a 20 minutos. En Noruega, durante la producción de harina de pescado, los peces capturados silvestres se someten a calentamiento a temperaturas >70 °C durante un tiempo >20 min para lograr reducciones 100 log<10>de los recuentos deEnterobacteriaceaeySalmonella.Dichas condiciones de procesamiento térmico estrictas pueden dar como resultado la oxidación de grasas y proteínas. La harina de pescado contiene lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados que son más susceptibles a la oxidación térmica. Comúnmente se añaden antioxidantes a la harina de pescado para prevenir la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados (también visibles en la tabla 1). La oxidación inducida por calor de aminoácidos da lugar al desarrollo de productos de oxidación de amplia gama. El comportamiento prooxidante de los subproductos de oxidación de aminoácidos ya es conocido. Pueden dar como resultado una amplia gama de problemas de salud en el cuerpo de un animal. Todos los derivados de proteína de mosca soldado negra (puré, puré hidrolizado) usados y analizados por los autores de la invención se procesaron térmicamente a temperaturas <100 °C durante un tiempo <1,5 min (por ejemplo, a 90 °C durante 80 segundos). Estas combinaciones de tiempo-temperatura de procesamiento térmico de la presente invención se adoptaron para garantizar un daño mínimo a los nutrientes (proteínas y grasa) y la inactivación adecuada de la microbiota patógena. Esto implica que el comportamiento prooxidante de FM y CM surge principalmente debido al método de producción riguroso. ;;En uno de los estudios recientes [3], los investigadores hicieron hidrolizado de proteína de BSF usando enzima bromelaína. El hidrolizado de proteína derivado de bromelaína también se sometió a prueba para actividad eliminadora de radicales DPPH, que dio como resultado la CI<50>de 8,4 mg/ml. La actividad eliminadora de radicales DPPH de este hidrolizado de proteína derivada de bromelaína fue mucho menor cuando se comparó con la actividad de productos tales como BSF-HP (CI<50>0,18 mg/ml después de 60 min de incubación). La mayor actividad de BSF-HP encontrada por los autores de la invención podría surgir de los atributos de composición (como se debatió anteriormente en esta sección) y la calidad de la propia materia prima. Se informa que Protix produce proteínas de insecto en instalaciones certificadas GMP+ y SecureFeed, en condiciones de HACCP. ;;4.3. Actividad de eliminación de radicales catiónicos ABTS;;La eliminación de radicales catiónicos ABTS indica la capacidad de la muestra de donar electrones y estabilizar los radicales libres. La CI<50>del ensayo de ABTS de todas las muestras se indican en la tabla 5. Están en el siguiente orden: FM > CM > BSF-HP > BSF-P. Cuanto mayor es la CI<50>, menor es la actividad antioxidante. En este ensayo, incluso la FM y CM presentan actividad antioxidante. Parece que los extractos de FM y CM pueden ser eficaces cuando el o los radicales libres se pueden estabilizar usando un mecanismo de transferencia de electrones individuales. Sin embargo, todavía presentan una menor actividad eliminadora en comparación con la sorprendente alta actividad eliminadora del puré de larvas de BSF derivado de BSF y el puré de larvas de BSF hidrolizado. ;;La dependencia de la actividad eliminadora de radicales en el peso molecular de la proteína ya se explica en la sección 4.2. En Protix, los autores de la invención establecieron que BSF-P y BSF-HP tienen exactamente la misma composición de aminoácidos. Sin embargo, debido a la hidrólisis de proteínas, la cantidad de proteínas <1000 Da es mayor en BSF-HP que en BSF-P. Por lo tanto, es algo sorprendente que el valor de CI<50>de BSF-P fuera ligeramente menor en comparación con BSF-HP. Esto podría explicarse por el mecanismo de hidrólisis. La hidrólisis enzimática se logra a través de exo- y endopeptidasa. La exopeptidasa escinde el enlace peptídico terminal, por otra parte, la endopeptidasa escinde el enlace peptídico no terminal. En ambos casos, la secuencia de aminoácidos está alterada. La capacidad eliminadora de radicales de los péptidos resultantes mediante transferencia de electrones individuales también depende de la naturaleza anfífila de las moléculas proteínicas. Es posible que los péptidos en BSF-HP sean de naturaleza menos anfífila, lo que da como resultado una menor actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS de BSF-HP en comparación con BSF-P. ;;Zhuet al.[4] desarrollaron hidrolizado de proteína de BSF usando una amplia gama de enzimas comerciales. Los hidrolizados se fraccionaron adicionalmente en el siguiente grupo: grupo 1 (<3000 Da), grupo 2 (de 3000 a 10000 Da) y grupo 3 (>10000 Da) usando ultrafiltración. La actividad de estos fraccionamientos hidrolizados también se investigó para determinar la actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS. Se usó ácido ascórbico como molécula de referencia en el ejemplo. Curiosamente, el fraccionamiento de mejor rendimiento y el ácido ascórbico pudieron inhibir un 85,67 % y un 92,11 % del radical catiónico ABTS a una concentración de 0,05 mg/ml, respectivamente. Los autores de la presente invención ahora establecieron sorprendentemente que el BSF-P ya presenta Emáx de eliminación de radicales catiónicos ABTS tan alta como 89 (a 0,2 mg/ml). Esto muestra que fraccionar BSF-P revela fracciones que tienen un potencial antioxidante muy fuerte. ;;4.4. Actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos;;Las fuertes actividades de eliminación de radicales libres de los derivados de BSF son evidentes a partir de la sección 4.2 y 4.3. Además, todas las muestras también se sometieron a prueba para determinar la actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos. Los neutrófilos son glóbulos blancos presentes en el cuerpo de los animales (incluyendo seres humanos, mascotas, peces, aves de corral y cerdos). Participan en la defensa primaria contra patógenos. Cuando microbios patógenos entran en el cuerpo del animal, los neutrófilos se precipitan al sitio de infestación e inician la defensa. Durante la granulación, los neutrófilos liberan una amplia gama de enzimas oxidantes que incluyen NADPH oxidasa, que es responsable de la producción de anión superóxido y subproductos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno). El anión superóxido puede reaccionar adicionalmente con el radical óxido nítrico para producir peroxinitrito. Este proceso genera también un radical hidroxilo (por reacción de peróxido de hidrógeno con ion metálico). Esta batería de reacciones oxidativas es crucial para la defensa del animal hospedador. Sin embargo, estas ROS generadas durante la defensa del hospedador pueden reaccionar con enzimas, proteínas, lípidos, etc. de las células corporales y dar como resultado el desarrollo de diferentes problemas de salud (por ejemplo, envejecimiento celular, cáncer, etc.). El ensayo de neutrófilos realizado en esta investigación determina la capacidad de moléculas proteínicas de eliminar las ROS producidas como resultado de la actividad de los neutrófilos. Se usó PMA para activar la proteína cinasa C presente en neutrófilos, lo que da como resultado la producción de NADPH oxidasa responsable de catalizar la producción de ROS. La producción de ROS en el sistema se acopla con quimioluminiscencia amplificada con lucigenina. La capacidad de la muestra proteínica de eliminar ROS (particularmente anión superóxido) está marcada por una quimioluminiscencia disminuida. ;;Según el conocimiento de los autores de la invención, este es el primer análisis de actividad de modulación de la respuesta de neutrófilosin vitrode puré de larvas de BSF derivado de BSF y puré de larvas de BSF hidrolizado. La CM presentó comportamiento prooxidante a 3 de las 5 concentraciones ensayadas, y Emáx de solo un 5 % a 0,2 mg/ml (véase la figura 9 y la tabla 6). La CM se usa comúnmente en preparaciones de alimentos para mascotas. Sin embargo, los resultados de las pruebas comparativas en los ejemplos y realizaciones de la invención indican que la inclusión de CM ofrece poco o ningún beneficio en relación con la eliminación de las ROS producidas por los neutrófilos. Además, la inclusión de CM podría incluso dar como resultado daño inflamatorio a las células hospedadoras. El daño inflamatorio repetitivo de las células caninas o felinas podría traducirse en afecciones tales como envejecimiento acelerado, función cognitiva lenta, etc. ;;Por otra parte, la FM presenta un comportamiento antioxidante suave en este ensayo, con Emáx de un 22 % (véase tabla 6). A 0,2 mg/ml, la FM presenta inhibición de un 5 %. El medio de cría en acuicultura (es decir, agua) ofrece un tampón continuo de bacterias patógenas. Por lo tanto, los organismos de acuicultura están en riesgo constante de invasión bacteriana patógena. Esto da como resultado una amplia gama de problemas de salud, incluyendo inmunidad reducida, envejecimiento, etc. Los ejemplos comparativos de los autores de la presente invención destacan la insuficiencia de FM para suprimir el daño inflamatorio por la actividad de neutrófilos repetitiva. Esto se traduce a menudo en un aumento del coste que se produce como resultado del uso de antibióticos y complementos nutricionales. El BSF-P presenta Emáx y CI<50>de un 59,57 % y 0,15 mg/ml respectivamente (véase la tabla 6). Además, el BSF-HP también presenta actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos comparable a BSF-P (véase la tabla 5). ;4.5. Actividad de modulación de la respuesta de MPO (SIEFED y ensayo clásico);;Se conoce el mecanismo general de la respuesta de neutrófilos. La trampa extracelular de neutrófilos contiene varias moléculas requeridas para inactivar microbios patógenos. La enzima MPO presente en la trampa extracelular de neutrófilos puede producir ácido hipocloroso a partir de peróxido de hidrógeno e ion cloruro. Adicionalmente, la MPO puede oxidar la tirosina en el radical libre tirosilo. Ambos productos de oxidación de MPO (ácido hipocloroso y radical libre tirosilo) son cruciales para inactivar patógenos. De nuevo, la interacción repetitiva de estas moléculas con células animales da como resultado daño inflamatorio. En un cuerpo animal, MPO-Fe(III) (forma activa) reacciona con peróxido de hidrógeno para formar radical catión n oxoferrilo (forma Cpl). La forma Cpl se convierte de nuevo en MPO-Fe(III) acoplado con ion cloruro que se transforma en ácido hipocloroso. Sin embargo, en el presente experimento, la reducción de retorno de la forma Cpl a MPO-Fe(III) se logró en 2 etapas. Primero, la reducción de Cpl en MPO-Fe(IV)=O mediante transferencia de electrones a través de iones nitrito. A continuación, se realizó el aprovisionamiento de electrones (mediante reacción de oxidación de rojo Amplex™ en resorufina) que convierte la forma MPO-Fe(IV)=O en MPO-Fe(III). Las moléculas proteínicas podrían prevenir el daño oxidativo resultante de MPO, ya sea reaccionando directamente con la forma Cpl y terminando la halogenación, o donando hidrógeno (transferencia de átomos de hidrógeno) a ROS producidas como consecuencia de la actividad de MPO. La actividad de modulación de la respuesta de MPO se analizó usando el ensayo clásico y SIEFED. El ensayo clásico mide la capacidad de la muestra de formar complejos con la forma Cpl y estabilizar las ROS. Mientras que en el ensayo SIEFED, la MPO se une a anticuerpos policlonales de conejo (y el resto de los compuestos se eliminan por lavado), por lo que mide puramente la capacidad de las muestras de formar complejos con la forma Cpl. ;Al igual que con la actividad de modulación de la respuesta de neutrófilos, la actividad de modulación de la respuesta de MPO del puré de larvas de BSF derivado de BSF y el puré de larvas de BSF hidrolizado también está siendo establecida por los autores de la invención por primera vez, después de proporcionar el puré según el método de la invención. La FM y CM presentan comportamiento prooxidante en ambos ensayos (véanse las figuras 7 y 8). La presencia de productos de reacción oxidativa en FM y CM (como consecuencia del proceso de producción) que pueden iniciar la respuesta prooxidante ya se ha analizado en la sección 4.2. Las investigacionesin vitrodetalladas realizadas por los autores de la invención indican que la inclusión de FM y CM en dietas para animales puede dar como resultado daño inflamatorio. ;En el ensayo clásico, los derivados de BSF presentan un potencial antioxidante sorprendentemente fuerte, con CI<50>en el siguiente orden: BSF-P > BSF-HP. En el ensayo SIEFED, el BSF-P no alcanzó el 50 % de inhibición (incluso a la concentración más alta ensayada). Por tanto, mientras que BSF-P es más eficaz en la estabilización de ROS, BSF-HP tiene una eficacia más alta en la formación de complejos con la forma Cpl de MPO. Estas observaciones muestran que los dos derivados de BSF son adecuados para su uso como ingrediente en formulaciones de alimentos para mascotas y acuicultura para suprimir eficazmente los daños inflamatorios resultantes de la actividad de MPO. ;Los derivados de la proteína de BSF ofrecen una ventaja antioxidante sobre FM y CM. ;Ejemplo 4 (no según la invención);Oxidación de la grasa como consecuencia de los tiempos de calentamiento del puré ;Introducción ;La pasteurización es crucial para la producción de proteína de insecto procesada. El tiempo de calentamiento óptimo y las combinaciones óptimas de temperatura de calentamiento son importantes para: ;(1) . inactivación de patógenos; y ;(2) . conservar la calidad nutricional de los alimentos. ;Con respecto a la calidad de la grasa (de proteínas de insecto), la combinación de tiempo de pasteurización x temperatura es significativa para: ;(1) . inactivación de la SN-1,3-lipasa intestinal: si no se inactiva, esta enzima podría hidrolizar los triglicéridos en ácidos grasos libres (presentes en la posición SN-1,3 de los triglicéridos) y 2-monoglicéridos. ;(2) . Oxidación de lípidos: el calentamiento podría dar como resultado la oxidación (no enzimática) de ácidos grasos poliinsaturados. Los ácidos grasos libres formados debido a la actividad lipasa también podrían experimentar oxidación (enzimática) a través de lipoxigenasas. Estos dos procesos de oxidación dan como resultado la formación de compuestos primarios (por ejemplo, hidroperóxidos) y productos de oxidación secundarios (por ejemplo, aldehídos y cetonas). Estas reacciones tienen un efecto adverso sobre la calidad sensitiva de los alimentos y también sobre la salud de los animales consumidores. ;En este actual ejemplo 4 se establece el grado de formación de FFA en puré pasteurizado (para analizar la inactivación de la lipasa) y el desarrollo de hidroperóxidos como consecuencia de los tiempos de calentamiento. ;Materiales y métodos ;Se recogieron aproximadamente 5 kg de larvas de mosca soldado negra vivas de una unidad de cría (Protix, Países Bajos). Estas larvas se lavaron a fondo para eliminar todas las impurezas visibles. Se usaron 300 g de larvas lavadas por tratamiento. Las larvas se picaron para obtener una suspensión suave (puré) y se pasteurizaron según los tratamientos indicados en la tabla 7. El puré de larvas pasteurizado se congeló inmediatamente (hasta -20 °C). Estas muestras congeladas se descongelaron posteriormente y se analizaron para determinar el contenido de ácidos grasos libres y los índices de peróxido. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. ;Tabla 7. Descripción de los tratamientos de pasteurización usados en el ejemplo 4. ;; ; Resultados ;;Los contenidos de ácidos grasos libres y los índices de peróxido obtenidos para los tratamientos respectivos se mencionan en la tabla 8. ;;Tabla 8. Ácidos grasos libres e índices de peróxido obtenidos para los tratamientos respectivos ;; ;; Resultados expresados en la media ± D.T. (n = 2) ;;Como se puede ver en la tabla 8, ese puré de insectos calentado a 90 °C durante 40 s tiene cantidades relativamente altas para ácidos grasos libres (aprox. 70 %). El calentamiento del puré justo durante 40 s es ineficaz en la desactivación de la lipasa. Mientras que se observan bajas cantidades de ácidos grasos libres cuando el puré se calienta durante 80 s, lo que indica la suficiencia de este tiempo para la inactivación enzimática a 90 °C. En tiempos de calentamiento de más de 80 segundos (tratamiento 4 y 5 en la tabla 7 y la tabla 8), el contenido de ácidos grasos aumenta en comparación con el bajo contenido de ácidos grasos obtenido cuando el puré de larvas de mosca soldado negra se calienta durante 80 segundos. Por lo tanto, para obtener una fracción proteínica que comprende un contenido de ácidos grasos libres relativamente bajo, el tiempo de calentamiento en el método de la invención debe ser más largo de 40 segundos y más corto de 300 segundos, tal como 50-100 segundos, o un tiempo de calentamiento seleccionado de 60-90 segundos, o 70-85 segundos, tal como aproximadamente 80 segundos. El tiempo de calentamiento preferido es de aproximadamente 90 °C o 90 °C ± 2 °C. ;;También se observa un índice de peróxido más alto para una duración de calentamiento de 40 s. Esto podría explicarse por las altas cantidades de ácidos grasos libres que podrían participar en la oxidación enzimática que da lugar a la producción de hidroperóxidos. Sin embargo, en el caso de un tratamiento de 80 s, se obtiene un índice de peróxido más bajo. El calentamiento del producto tiene además un efecto sobre la oxidación de la grasa en el sentido de que el índice de peróxido para el tratamiento 4 y el tratamiento 5 está aumentado en comparación con el índice de peróxido para el tratamiento 3, es decir, un tiempo de calentamiento de 80 segundos. Por lo tanto, para obtener una fracción proteínica que comprenda un índice de peróxido relativamente bajo, el tiempo de calentamiento en el método de la invención debe ser más largo de 40 segundos y más corto de 300 segundos, tal como 50-100 segundos, o un tiempo de calentamiento seleccionado de 60-90 segundos, o 70-85 segundos, tal como aproximadamente 80 segundos. El tiempo de calentamiento preferido es de aproximadamente 90 °C o 90 °C ± 2 °C. ;;Conclusión ;;El calentamiento de las larvas de insecto picadas a 90 °C durante 80 s es suficiente para la inactivación enzimática, evita la formación de ácidos grasos libres y evita la formación de peróxidos. ;;Ejemplo 5;;Actividad antioxidante de las muestras de pescado después de alimentar a los peces con complemento de pienso ;La actividad antioxidante de muestras de filete de pescado se investigó usando la técnica de antirradicales (ABTS). Se prepararon extractos de proteína de larvas de mosca soldado negra solubles en agua, denominados HI-0, HI-25, HI-50 y HI-100, en agua destilada y se usaron a diferentes concentraciones. En el ensayo de ABTS, el porcentaje de inhibición a la concentración máxima ensayada fue en el siguiente orden: HI-25 > HI-100 > HI-50 > HI-0. En el ensayo de ABTS, la muestra de filete HI-25 alcanzó una CI50 >50 %. En conclusión, dentro de la serie de concentraciones ensayada, la muestra HI-25 tenía la máxima actividad eliminadora de radicales ABTS entre todas las muestras de filete de pescado ensayadas. ;;Usando el ensayo de ABTS, se evaluó la actividad de muestras de carne de pescado con respecto a la actividad reductora de radicales de la proteína mosca soldado negra obtenida con el método de la invención. ;Materiales y métodos ;;Dietas ;;Se produjo ProteinX (harina alta en proteínas deHermetia illucens)usada en este estudio según el método de la invención y se proporcionó por Protix (Países Bajos). Se formularon dos dietas isonitrogenadas, isolipídicas e isoenergéticas con harina de pescado (20,6 %) o ProteinX (32 %) como fuente principal de proteínas. Ambas dietas se produjeron por Research Diet Services (Países Bajos). Se añadió diamol a ambas dietas como marcador inerte para las mediciones de digestibilidad. Se formaron cuatro tratamientos suministrando uno de ambos piensos, o mezclando ambos piensos en una proporción determinada. ;;Los tratamientos alimenticios se denominaron: ;;HI0 (100 % de pienso basado en harina de pescado); ;;HI25 (75 % de pienso basado en harina de pescado mezclado con 25 % de pienso basado en ProteinX); ;;HI50 (ambos piensos mezclados en una proporción igual; 50 % de pienso basado en harina de pescado mezclado con 50 % de pienso basado en ProteinX); y ;;HI100 (100 % de pienso basado en ProteinX). ;;La composición aproximada de los cuatro tratamientos alimenticios se presenta en la tabla 9. ;;La composición aproximada de ProteinX y de los cuatro tratamientos alimenticios experimentales se determinó por los laboratorios DISAFA y se presenta en la tabla 9. Las muestras de pienso se trituraron usando un molino de corte (MLI 204; Bühler AG, Uzwil, Suiza) y se analizaron para determinar el contenido de materia seca (AOAC n.° 934.01), el contenido de proteína bruta (AOAC n.° 984.13), el contenido de cenizas (AOAC n.° 942.05) y el extracto de éter (a Oa C n.° 2003.05), se analizaron según AOAC International. El contenido de proteína bruta se calculó como:nitrógeno* 6,25

Condiciones de los peces y de cría

El ensayo de alimentación animal se realizó en la Instalación Experimental del Departamento de Ciencias Agrícolas, Forestales y Alimentarias de la Universidad de Turín (Italia). El protocolo experimental se diseñó según las directrices de las leyes europeas e italianas actuales sobre el cuidado y uso de animales experimentales (directiva europea 86 609/EEC, puesta en vigor en Italia con D.L. 116/92). El protocolo experimental se aprobó por el Comité Ético de la Universidad de Turín (protocolo n.° 143811).

Se obtuvieron truchas arcoíris juveniles de un criadero privado (Troticoltura Bassignana, Cuneo, Italia) y se distribuyeron aleatoriamente en 12 tanques de fibra de vidrio (n = 3) (50 peces por tanque). Los tanques se abastecieron de agua de pozo artesiano (13 ±1 °C) en un sistema de flujo continuo a un caudal de 8 l/min. El oxígeno disuelto se midió cada noche y varió entre 7,6 y 8,7 mg/l. Los peces se aclimataron a la configuración experimental durante cuatro semanas durante las que se suministró una dieta comercial a un 1,6 % del peso corporal total por tanque. Después de la aclimatación, los peces se alimentaron restrictivamente con un tratamiento alimenticio durante 133 días, 113 días a una relación fija de un 1,4 %, seguido de 20 días a una relación fija de un 1,1 %. Se supervisó la ingestión de pienso en cada administración. El pienso se distribuyó a mano dos veces al día, 6 días a la semana. La biomasa de cada tanque se pesó en bloque cada 14 días para corregir la tasa de suministro diaria. La mortalidad se comprobó diariamente.

Muestreo:

Al final del ensayo, los peces se mantuvieron en ayunas durante un día, y 9 peces/tratamiento (3 peces/tanque) por tratamiento se sacrificaron por sobredosis de anestesia (MS-222 - PHARMA<q>Ltd, Reino Unido; 500 mg/l) y se pesaron individualmente. Se recogieron los filetes derechos de cada pescado y se sellaron al vacío, se congelaron (-20 °C) y posteriormente se liofilizaron.

Preparación de la muestra:

Se recibieron muestras de pescado (en forma de polvo). Las muestras se mantuvieron en un congelador (-20 °C) hasta su procesamiento posterior. Se prepararon polvos de extractos solubles en agua (WSEP) de muestras respectivas según el protocolo de Mouithys-Mickaladet al.(2020). Se almacenaron los WSEP en un desecador (a 18 °C) hasta experimentaciones posteriores. Las soluciones madre del WSEP se prepararon disolviendo hasta una concentración final de 20 mg/ml en agua Milli-Q, cuya solución madre se diluirá después a la mitad para obtener 10, 5, 2,5 y 1,25 mg/ml, sucesivamente.

Actividad eliminadora de radicales ABTS

La actividad eliminadora de radicales de las muestras de WSEP hacia el catión radical ABTS se analizó según el método de Arnaoet al.(2001). La solución madre de ABTS se preparó disolviendo completamente 7,0 mmol/l de ABTS y 1,35 mmol/l de persulfato de potasio en agua Milli-Q. La solución de prueba se mantuvo durante la noche en oscuridad (a 18 °C) para que la reacción se completara. La solución de trabajo de ABTS se preparó diluyendo la solución madre con alcohol metílico para obtener una absorbancia entre 0,7 y 0,8 mm a 734 nm. Se mezcló solución de trabajo de ABTS (1920 pl) con 20 pl de soluciones de WSEP (obtenidas disolviendo WSEP en agua Milli-Q) para obtener una concentración final de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml. La disminución de la absorbancia después de 30 min de incubación en la oscuridad se midió a 734 nm usando un espectrofotómetro HP 8453 UV-vis. En lugar de la dilución de WSEP, solo se usó agua Milli-Q en el caso del control. Las repeticiones con concentraciones crecientes de diferentes muestras se realizaron como se describe por Paul (2007) y se transfirieron a un dispositivo de múltiples pocillos (placa de 96 pocillos) con un volumen final de 200 pl (198 pl de disolvente y 2 pl de WSEP). Asimismo, después de un periodo de incubación de 30 min, la absorbancia se leyó a 740 nm usando un lector Multiskan Ascent (Thermo Fisher Scientific).

Resultados

La actividad eliminadora de radicales ABTS de muestras de WSEP se indica en la figura 10: se muestra la actividad eliminadora de radicales ABTS de WSEP realizada en metanol. Los resultados son la media ± DT de tres ensayos independientes por triplicado. Para todas las muestras, el aumento de la concentración dio como resultado un aumento de los valores medios de inhibición (lo que indica comportamiento antioxidante). La Emáx (inhibición máxima obtenida durante el ensayo) estuvo en el siguiente orden: HI-25 > HI-100 > HI-50 > HI-0 (todos obtenidos a 0,2 mg/ml, concentración final). Este resultado indica que las muestras HI-25 presentan la actividad eliminadora de radicales ABTS más alta. Por otra parte, las muestras HI-0 presentan la mínima actividad eliminadora de radicales ABTS. Finalmente, las muestras HI-25 presentaron valores medios de inhibición >50 % (se alcanzó CI<50>).

Observación final

Según se evalúa usando el ensayo ABTS, todas las muestras de proteína obtenidas aplicando el método de la invención con larvas de mosca soldado negra, presentan actividad antioxidante de una manera dependiente de la dosis. Las muestras HI-25 muestran la actividad antioxidante más alta.

Referencias

1. Tsumbu, C.N.; Deby-Dupont, G.; Tits, M.; Angenot, L.; Frederich, M.; Kohnen, S.; Mouithys-Mickalad, A.; Serteyn, D.; Franck, T. Polyphenol content and modulatory activities of some tropical dietary plant extracts on the oxidant activities of neutrophils and myeloperoxidase.Int J Mol Sci2012, 13, 628-650, doi:10.3390/ijms13010628.

2. Paul, A. Field border flowering strips as a source of valuable compounds, Gembolox Agro-Bio Tech University of Liege, Gembolox, Bélgica, 2017.

3. Firmensyah, M.; Abduh, M.Y. Production of protein hydrolysate containing antioxidant activity from Hermetia illucens.Heliyon2019, 5, e02005, doi:10.1016/j.heliyon.2019.e02005.

4. Zhu, D.; Huang, X.; Tu, F.; Wang, C.; Yang, F. Preparation, antioxidant activity evaluation, and identification of antioxidant peptide from black solder fly (Hermetia illucens L.) larvae.J. Food Biochem.2020, e13186, doi:10.1111/jfbc.13186.

5. Smith, P.K.; Krohn, R.I.; Hermanson, G.T.; Mallia, A.K.; Gartner, F.H.; Probzano, M.D.; Fujimoto, E.K.; Goeke, N.M.; Olson, B.J.; Klenk, D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal. Biochem.1985, 150, 76-85, doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7.

6. Brand-Williams, W.; Cuvelier, M.E.; Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity.LWT -Food Science and Technology1995, 28, 25-30, doi:10.1016/S0023-6438(95)80008-5.

7. Arnao, M.B.; Cano, A.; Acosta, M. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity.Food Chemistry2001,73, 239-244, doi:10.1016/S0308-8146(00)00324-1.

8. Franck, T.; Kohnen, S.; Boudjeltia, K.Z.; Van Antwerpen, P.; Bosseloir, A.; Niesten, A.; Gach, O.; Nys, M.; Deby-Dupont, G.; Serteyn, D. A new easy method for specific measurement of active myeloperoxidase in human biological fluids and tissue extracts.Talanta2009, 80, 723-729, doi:10.1016/j.talanta.2009.07.052.

9. Zhang, H.; Holden-Wiltse, J.; Wang, J.; Liang, H. A Strategy to Model Nonmonotonic Dose-Response Curve and Estimate IC50.PLOS ONE2013, 8, e69301, doi:10.1371/journal.pone.0069301.

10. R Core Equipment R:A language andenvironment forstatisticalcomputing;R Foundation for Statistical Computing: Viena, Austria, 2017.

11. Mouithys-Mickalad, A., Schmitt, E., Dalim, M., Franck, T., Tome, N.M., van Spankren, M., Serteyn, D., Paul, A., 2020. Black Soldier Fly (Hermetia illucens) Larvae Protein Derivatives: Potential to Promote Animal Health. Animals 10, 941. https://doi.org/10.3390/ani10060941.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para convertir larvas de mosca soldado negra en una corriente de nutrientes, que comprende o consiste en las etapas de:

a) proporcionar larvas de mosca soldado negra y preparar una pulpa de las mismas,

b) calentar la pulpa de larvas de mosca soldado negra durante 50-100 segundos a una temperatura de 80 °C-93 °C,

c) enfriar la pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada de la etapa b) hasta una temperatura de 0 °C-25 °C, con lo que se proporciona la corriente de nutrientes que consiste en pulpa de larvas de mosca soldado negra calentada enfriada.

2. Método según la reivindicación 1, en donde el enfriamiento es hasta una temperatura de 2 °C-23 °C, preferiblemente 4 °C-21 °C.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde las larvas de mosca soldado negra tienen entre 12 y 30 días de edad, preferiblemente entre 14 y 28 días, más preferiblemente 14-26 días, lo más preferiblemente 12 horas-3 días antes de que las larvas se transformen en prepupas, tal como 1-2 días antes de la transformación.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la pulpa de larvas de mosca soldado negra no se trata enzimáticamente antes del calentamiento en la etapa b).

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que comprende además una etapa a1) de tratamiento de la pulpa de larvas de mosca soldado negra por una enzima antes de la etapa b).

6. Método según la reivindicación 5, en donde la pulpa se trata por la enzima durante 0,5 a 3 horas, preferiblemente 1 a 2 horas a una temperatura de 40 °C a 70 °C, preferiblemente de 45 °C a 65 °C, más preferiblemente a una temperatura de 50 °C ± 2 °C.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde la enzima es una proteasa tal como una peptidasa, preferiblemente una mezcla de al menos una proteasa y al menos una peptidasa, tal como Flavourzyme.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde, en la etapa a), se prepara una pulpa picando las larvas de mosca soldado negra proporcionadas en la etapa a), preferiblemente larvas de mosca soldado negra que se lavan en agua antes de proporcionarlas en la etapa a).

9. Método según la reivindicación 8, en donde el tamaño promedio de partícula (d32; volumen/promedio) de los restos de larvas de mosca soldado negra en la pulpa de la etapa a) varía entre 10 y 500 micrómetros.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde, en la etapa b), la pulpa de larvas de mosca soldado negra se calienta durante 75-85 segundos a una temperatura de 90 °C ± 2 °C.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde, en la etapa b), la pulpa de larvas de mosca soldado negra se calienta a una temperatura de 85 °C-90 °C y/o en donde, en la etapa b), la pulpa de larvas de mosca soldado negra se calienta durante 60-95 segundos, particularmente durante 70-90 segundos, preferiblemente 75-85 segundos, tal como 78-82 segundos.

12. Pulpa de larvas de mosca soldado negra que se puede obtener por un método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la pulpa de larvas de mosca soldado negra tiene una capacidad de retención de agua (WHC) en el intervalo de un 9 % en peso-menos de un 18 % en peso, preferiblemente en el intervalo de un 9 % en pesomenos de un 16 % en peso, basado en el peso total de la pulpa de larvas de mosca soldado negra, en donde la WHC se expresa como el porcentaje en peso de agua que se libera de la pulpa de larvas de mosca soldado negra durante una etapa de calentamiento a la que se somete la pulpa de larvas de mosca soldado negra a una temperatura de 121 °C durante 80 minutos, basado en el peso total de la pulpa de larvas de mosca soldado nagra antes de someterla a esta etapa de calentamiento, preferiblemente un 9 % en peso-menos de un 14 % en peso, más preferiblemente un 10 % en peso-menos de un 13 % en peso, lo más preferiblemente un 10 % en peso-menos de un 12 % en peso.

13. Uso de la pulpa de larvas de mosca soldado negra según la reivindicación 12 como pienso, alimento, ingrediente alimenticio o ingrediente de pienso.

14. Composición que comprende o consiste en pulpa de larvas de mosca soldado negra según la reivindicación 12, para su uso en un método para la prevención y/o supresión del daño oxidativo celular.

15. Producto alimenticio o producto de pienso que comprende o consiste en la pulpa de larvas de mosca soldado negra de la reivindicación 12.