ES3015164T3

ES3015164T3 - Photoprotective compositions containing malassezia-derived compounds and/or chemical analogs thereof

Info

Publication number: ES3015164T3
Application number: ES19721453T
Authority: ES
Inventors: Michael Einziger; Ann Marie Simpson
Original assignee: Versicolor Technologies LLC
Current assignee: Versicolor Technologies LLC
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2025-04-29
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: EP3774811A1; IL277940B1; US20190345140A1; TW201946621A; TW202432546A; US12497385B2; AU2019251579A1; PT3774811T; MX2020010800A; IL277940B2; AU2024266874A1; KR102866533B1; FI3774811T3; US11220491B2; KR20250148678A; EP4545147A2; CN113015731A; EP3774811B1; IL313054A; IL277940A

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para modular la pigmentación cutánea y tratar o prevenir el daño cutáneo, el eritema, el envejecimiento cutáneo, las quemaduras solares y la hiperpigmentación inducidos por rayos UV en un sujeto. Los compuestos, composiciones y métodos de la presente invención generalmente implican compuestos derivados de Malassezia, como malassezina e indirrubina, y/o análogos químicos de las mismas. Otras aplicaciones de los compuestos y composiciones descritos en este documento incluyen, entre otras, la mejora de la hiperpigmentación causada por un trastorno de hiperpigmentación, la inducción de la apoptosis de melanocitos y la modulación de la actividad del receptor de arilhidrocarburos (AhR), la melanogénesis, la producción de melanina, la biogénesis de melanosomas, la transferencia de melanosomas, la actividad de melanocitos y la concentración de melanina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones fotoprotectoras que contienen compuestos derivados de malassezia y/o análogos químicos de los mismos

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente invención reclama el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos No. 62/656,769, presentada el 12 de Abril de 2018, solicitud provisional de Estados Unidos No.62/668,007, presentada el 7 de Mayo de 2018, solicitud provisional de Estados Unidos No. 62/685,800, presentada el 15 de Junio de 2018, solicitud provisional de Estados Unidos No. 62/686,912, presentada el 19 de Junio de 2018, solicitud provisional de Estados Unidos No. 62/722,412, presentada el 24 de Agosto de 2018 y la solicitud provisional de Estados Unidos No. 62/742,657, presentada el 8 de Octubre de 2018.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos producidos o derivados de una levadura Malassezia, así como a sus análogos químicos, que tienen la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1. Los compuestos de la presente invención y las composiciones que contienen dichos compuestos tienen, entre otras propiedades beneficiosas, propiedades fotoprotectoras. También se contemplan métodos cosméticos para usar los compuestos y composiciones de la presente invención y los compuestos y composiciones de la presente invención para su uso en métodos terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Personas de todo el mundo utilizan agentes aclaradores de la piel para lograr una serie de objetivos cosméticos, que incluyen producir un efecto antienvejecimiento, corregir el daño solar y cumplir con ciertos estándares culturales de belleza. Muchos productos para aclarar la piel disponibles comercialmente, aunque son eficaces en diversos grados, contienen ingredientes nocivos, algunos de los cuales se han relacionado con el cáncer. Por tanto, existe la necesidad de nuevos agentes y formulaciones para aclarar la piel que exhiban niveles más altos de seguridad y/o eficacia que los agentes actualmente en el mercado.

Malasseziaes un género de levadura lipofílica que se encuentra comúnmente en la flora normal de la piel humana.Malasseziaes responsable de una serie de enfermedades de la piel, incluida la tiña versicolor (pitiriasis versicolor), la dermatitis seborreica y la dermatitis atópica.

El hábitat natural deM. furfures la epidermis superior. Sin embargo, la exposición a la luz ultravioleta destruye el organismo en su hábitat natural. Por lo tanto, los agentes de filtrado UV pueden ser necesarios para la supervivencia del organismo. Se han identificado dos de estos indoles que filtran los rayos UV producidos por el organismo: pitiriacitrina y pitirialactona. La pitiriacitrina, descrita por primera vez en Mayser et al., 2002, es sintetizada porM. furfur. Es un compuesto lipofílico amarillo estable que muestra una amplia absorción en el espectro UVA, UVB y UVC. Se ha aislado y patentado un compuesto similar del géneroParacoccuscomo agente protector contra los rayos UV. (Zhang et al., 2018).

Gambichler et al., 2007 investigaron el efecto protector UV de la pitiriacitrina en humanos utilizando métodos de pruebain vitroein vivo. La espectrofotometría de la crema de pitiriacitrina y el vehículo se realizó en el intervalo de longitud de onda de 290-400 nm. Se evaluaron la transmisión de rayos UV y el factor de protección solar ("SPF") para diferentes formulaciones de cremas. Usando colorimetría, los autores evaluaron el eritema y la pigmentación después de la irradiación de la piel protegida y no protegida con crema de sujetos sanos. La transmisión de UVB y UVA disminuyó al aumentar las concentraciones de pitiriacitrina. Un aumento de la concentración de pitiriacitrina de 1.25, 2.5 y 5 % se asoció con un ligero aumento de SPF de 1.4, 1.5 y 1.7, respectivamente. Las pruebasin vivoconfirmaron la validez del SPF de la crema de pitiriacitrina al 5 % determinadoin vitro. En general, el efecto protector UV de la pitiriacitrina fue muy débil, lo que sugiere que la pitiriacitrina probablemente sea solo un cofactor inferior en el desarrollo de hipopigmentación en las lesiones de pitiriasis versicolor alba después de la exposición al sol.

Se realizaron más estudios sobre los efectos de filtrado de rayos ultravioleta de la pitiriacitrina en la microflora de la piel humana. (Machowinski y otros, 2006). Los autores determinaron que la pitiriacitrina tiene un efecto protector de los rayos UV sobreCandida albicansy estafilococos sin toxicidad en los intervalos probados. Las propiedades de protección UV de la pitirialactona también se han confirmado en un modelo de levadura. (Mayser y otros, 2003). La pitirialactona parece ser responsable de la fluorescencia amarilla de Tinea Versicolor bajo el examen de Wood’s Light. US 2017/260133 A1 describe compuestos, composiciones y métodos para aclarar la piel que generalmente involucran compuestos producidos por una levadura Malassezia, y análogos químicos de estos.

Kramer, et al., “Malassezina, un nuevo agonista del receptor de arilhidrocarburo del pelo de Malassezia de levadura, induce apoptosis en los melanocitos humanos primarios", CHEMBIOCHEM, vol. 6, n.° 5, 2005 describe pitiriasis versicolor, una micosis muy frecuente de la piel humana, que a menudo está acompañada de despigmentaciones duraderas y el pelo de Malassezia de levadura, considerado como un agente causante, que es capaz de convertir triptófano en una variedad de alcaloides de indol, incluida malassezina, el compuesto activo que induce la apoptosis en melanocitos humanos.

US 2016/039754 A1 describe un método para fabricar diindolilmetanos e indolilo/pirrolilmetanos que incluye las etapas de entrar en contacto con un éter que comprende un resto arilopropargilo y un resto de anilina sustituido o no sustituido, protegido con amina con un indol sustituido o no sustituido o un pirrol sustituido o no sustituido, en presencia de un catalizador que contiene metal, durante un tiempo y a una temperatura para provocar una reacción en cascada de anulacón/arilación que produce un diindolilmetano o un indolilo/pirrolilmetano. Los compuestos resultantes son eficaces para modular la actividad de los receptores de arilhidrocarburo, para inhibir la actividad de PCSK9 y para estimular la secreción del péptido similar al glucagón 1 en mamíferos.

Winston-McPherson, et al., "Síntesis y evaluación biológica de 2,3 ’-diindolilmetanos como agonistas del receptor de arilohidrocarburo", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 24(16), 2014 describe el producto natural malassezina que es un agonista del receptor de arilohidrocarburo con un interesante esquema de 2,3 ’-diinoilmetano y la preparación y actividad de una serie de análogos de malassezina.

La tiña versicolor es una enfermedad de la piel no contagiosa causada por el crecimiento excesivo deMalasseziaque altera localmente los niveles de pigmentación. Las levadurasMalasseziatienen dos vías metabólicas para sintetizar pigmentos indol derivados de melanina y triptófano. La Malassezina y la indirubina son metabolitos de triptófano deMalasseziaque pueden contribuir a la despigmentación característica del sobrecrecimiento deMalassezia.

La invención descrita en la presente descripción utiliza compuestos que tienen la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producida por o derivada de la levaduraMalasseziacomo la base para composiciones seguras y eficaces de aclaramiento y oscurecimiento de la piel. También se describen malassezina, indirubina y sus análogos químicos, como base para composiciones seguras y eficaces de aclaramiento y oscurecimiento de la piel. También se describen en el presente documento composiciones fotoprotectoras que comprenden malassezina, indirubina y sus análogos químicos.

El alcance de la invención y por lo tanto de la protección se define por las reivindicaciones adjuntas. El objeto presentado en la siguiente descripción pero no abarcado por las reivindicaciones no pretende formar parte de la invención.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde:

X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O;

R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16y OR16;

R14es hidrógeno o R16;

R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, OR16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6;

R12es ‐COR<a>;

cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y,

R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden el compuesto de la presente invención, los compuestos y composiciones para su uso en métodos terapéuticos para aclarar la piel en un sujeto, modular la melanogénesis en un sujeto y modular la concentración de melanina en un sujeto, y métodos cosméticos para aclarar la piel en un sujeto y modular la melanogénesis en un sujeto que comprende poner en contacto al sujeto con los compuestos y composiciones.

Una modalidad de la presente invención es un compuesto para aclarar la piel. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto es un análogo químico de un compuesto producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la actividad de los melanocitos. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe un compuesto para agonizar el receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto es un análogo químico de un compuesto producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otra modalidad de la presente invención es un compuesto para mejorar la hiperpigmentación provocada por un trastorno de hiperpigmentación. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la producción de melanina. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la biogénesis del melanosoma. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

Otra modalidad de la presente invención es un compuesto para modular la transferencia de melanosomas. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levaduraMalassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe una composición que comprende una levaduraMalasseziay un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición. La composición comprende un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 aislado o aislable de una levaduraMalasseziay un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Otra modalidad de la presente invención es una composición. La composición comprende cualquiera de los compuestos que tienen la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1, incluidos los análogos, descritos en la presente y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones descritos en este documento.

Otra modalidad de la presente invención es un método para modular la actividad de los melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

También se describe un método para agonizar un receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones descritos en este documento.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para mejorar la hiperpigmentación causada por un trastorno de hiperpigmentación en un sujeto que lo necesita. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

Otra modalidad de la presente invención es cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente descripción para su uso en un método terapéutico para modular la producción de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para modular la biogénesis del melanosoma en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para modular la transferencia de melanosomas en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

También se describe un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde:

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo, y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 y R11 es metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describe un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo, y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 es metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describe un compuesto para aclarar la piel. El compuesto tiene la estructura de fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un compuesto para aclarar la piel. El compuesto tiene la estructura de fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto tiene la estructura de fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto tiene la estructura de fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un compuesto para agonizar el receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto tiene la estructura de fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un compuesto para agonizar el receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto tiene la estructura de fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe una composición. La composición comprende un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

También se describe una composición. La composición comprende un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un método para agonizar un receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe un método para agonizar un receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención es un compuesto. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

También se describe un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: R1, R4, R5, R6, R9, y R10se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO; R2y R3se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO, o R2y R3se combinan para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros; R7y R8se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO, o R7y R8se combinan para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros; R11y R12son independientemente hidrógeno o R13; y, cada R13es independientemente alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10no es hidrógeno, o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para aclarar la piel. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

También se describe un compuesto para aclarar la piel. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: R1, R4, R5, R6, R9, y R10se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO; R2y R3se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO, o R2y R3se combinan para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros; R7y R8se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO, o R7y R8se combinan para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros; R11y R12son independientemente hidrógeno o R13; y, cada R13es independientemente alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe un compuesto para aclarar la piel seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es un enlace covalente, CR5R6, O, o NR15; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, o OR16; R13, R14, y R15son independientemente hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, OR16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, –COR<a>, y R16; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, y OR16; o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un compuesto para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto se selecciona del grupo que consiste en:

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la melanogénesis. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno;R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, OR16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe un compuesto para modular la melanogénesis. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un compuesto para modular la melanogénesis. El compuesto se selecciona del grupo que consiste en:

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la concentración de melanina. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un compuesto para modular la concentración de melanina. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un compuesto para modular la concentración de melanina. El compuesto se selecciona del grupo que consiste en:

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición. La composición comprende un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe una composición que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

Modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel. Los métodos comprenden poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

Las modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, o OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

También se describe un método para modular la melanogénesis en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para modular la melanogénesis en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe un método para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para dar aclarar la piel que tiene una estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos que tiene una estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un compuesto para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) que tiene una estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un compuesto para modular la melanogénesis que tiene una estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un compuesto para modular la concentración de melanina que tiene una estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe una composición que comprende un compuesto que tiene una estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para modular la melanogénesis en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. Una modalidad adicional de la presente invención es una composición. La composición comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Las modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto el sujeto con uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición. La composición comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición para aclarar la piel. La composición comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe una composición para inducir la apoptosis de melanocitos. La composición comprende uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe una composición para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR). La composición comprende uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición para modular la melanogénesis. La composición comprende uno o más de los compuestos enumerados que forman parte del alcance de la reivindicación 1 en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Otra modalidad de la presente invención es una composición para modular la concentración de melanina. La composición comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos. Modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con la composición, la composición que comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto el sujeto con una composición, la composición que comprende uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto el sujeto con una composición, la composición que comprende uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Las modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con la composición, la composición que comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto el sujeto con la composición, la composición que comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

en donde:

X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16.

o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo,

y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

en donde:

R1, R4, R5, R6, R9, y R10se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO; R2y R3se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO, o R2y R3se combinan para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros; R7y R8se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, CN, R13, OR13, OCOR13y -CHO, o R7y R8se combinan para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros; R11y R12son independientemente hidrógeno o R13; y, cada R13es independientemente alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9. o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo,

y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Otra modalidad de la presente invención es una composición. La composición comprende un compuesto que forma parte del alcance de la reivindicación 1 enumerado en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéutica aceptable de este,

y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para tratar o prevenir el daño a la piel provocado por rayos UV en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para tratar o prevenir el eritema inducido por UV en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

Otra modalidad de la presente invención es un método para tratar o prevenir el envejecimiento de la piel inducido por UV en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para tratar o prevenir El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

Una modalidad adicional de la presente invención es un método para tratar o prevenir la hiperpigmentación inducida por UV en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel. Los métodos comprenden poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento. Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con los dibujos a color serán proporcionadas por la Oficina bajo petición y pago de la cuota necesaria.

La Figura 1A es un diagrama esquemático de las capas componentes de la piel. El diagrama de inserción muestra la composición celular de la epidermis y la dermis. La Figura 1B es un diagrama esquemático que muestra los posibles mecanismos de acción de los agentes causantes de hipopigmentación.

La Figura 2 es un conjunto de esquemas sintéticos para malassezina y derivados de malassezina: la Figura 2A: malassezina e indolo[3,2-b]carbazol; Figura 2B: compuestos I y IV; Figura 2C: compuesto II.

La Figura 3A es un gráfico resumido que muestra los valores de EC50de la inducción de anexina V para ciertos compuestos en células MeWo y WM115. Las Figuras 3B-3M son gráficos de líneas que muestran el porcentaje de MeWo (Figuras 3B-3G) o WM115 (Figuras 3H-3M) marcadas con anexina V después de la exposición a diversas concentraciones de los compuestos enumerados.

Las Figuras 4A-4D son gráficos que muestran niveles relativos de anexina V (%) en células MeWo y WM115 después de la exposición a diversas concentraciones de los compuestos enumerados durante 6, 24, 48 y 72 horas. Las Figuras 4E-4J son histogramas que muestran los resultados de las Figuras 4A-4D. Las Figuras 4K y 4L son histogramas que muestran el porcentaje de células MeWo (Figura 4K) y WM115 (Figura 4L) marcadas con anexina V después de 6 horas de exposición a los compuestos enumerados a las concentraciones mostradas.

Las Figuras 5A-5K son micrografías que muestran la morfología de las células MeWo después de 6 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 6A-6K son micrografías que muestran la morfología de las células MeWo después de 24 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 7A-7K son micrografías que muestran la morfología de las células MeWo después de 48 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 8A-8K son micrografías que muestran la morfología de las células MeWo después de 72 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 9A-9K son micrografías que muestran la morfología de las células WM115 después de 6 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 10A-10K son micrografías que muestran la morfología de las células WM115 después de 24 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 11A-11K son micrografías que muestran la morfología de las células WM115 después de 48 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 12A-12K son micrografías que muestran la morfología de las células WM115 después de 72 horas de tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684, CV-8685, CV-8688, DMSO, y estaurosporina.

Las Figuras 13A-13D son gráficos que muestran el porcentaje de células MeWo y WM115 viables que quedan después del tratamiento con diversas concentraciones de CV-8684 (Figura 13A), CV-8685 (Figura 13B), CV-8688 (Figura 13C), o estaurosporina (Figura 13D) durante 6, 24, 48, y 72 horas. La viabilidad celular se ensayó usando CellTiter-Glo®. Las Figuras 13E-13J son histogramas que muestran los resultados de las Figuras 13A-13D. La Figura 13K es un gráfico de resumen que compara los porcentajes de células MeWo y WM115 viables después de la exposición a las concentraciones enumeradas de malassezina, indolocarbazol, compuesto II y estaurosporina durante 24, 48 y 72 horas. Las Figuras 14A-14D son gráficos que muestran los niveles de liberación de lactato deshidrogenasa ("LDH") de las células MeWo y WM115 después del tratamiento con varias concentraciones de CV-8684 (Figura 14A), CV-8685 (Figura 14B), CV-8688 (Figura 14C), o estaurosporina (Figura 14D) durante 6, 24, 48, y 72 horas. Las Figuras 14E-14J son histogramas que muestran los resultados de las Figuras 14A-14D. Las Figuras 14K y 14L son histogramas que muestran los niveles de lactato deshidrogenasa después de exponer células MeWo (Figura 14K) y WM115 (Figura 14L) a las concentraciones enumeradas de malassezina, carbazol, compuesto II y estaurosporina durante 24 horas.

Las Figuras 15A-15E muestran datos sin procesar y gráficos de línea de la activación del receptor de arilhidrocarburo ("AhR") en células HepG2 transfectadas de manera estable con un plásmido del gen indicador de luciferasa sensible a AhR tras la exposición a diversas concentraciones de omeprazol (Figura 15A), CV-8684 (Figura 15B), CV-8685 (Figura 15C), CV-8686 (Figura 15D) y CV-8688 (Figura 15E). La Figura 15F muestra los valores de EC50para cada compuesto probado.

Las Figuras 16A-16K son fotografías de matrices MelanoDerm™ en el día 0 o el día 7 después de la exposición a ningún tratamiento (Figura 16A), agua desionizada estéril (Figura 16B), 1 % de ácido kójico (Figura 16C), 0.2 % de DMSO (Figura 16D), 0.05 % de DMSO (Figura 16E), 200 µM de CV-8684 (Figura 16F), 50 µM de CV-8684 (Figura 16G), 200 µM de CV-8686 (Figura 16H), 50 µM de CV-8686 (Figura 16I), 200 µM de CV-8688 (Figura 16J) y 50 µM de CV-8688 (Figura 16K).

Las Figuras 17A-17K son fotomicrografías aumentadas 15X de matrices MelanoDerm™ en el día 0 o el día 7 después de la exposición a ningún tratamiento (Figura 17A), agua desionizada estéril (Figura 17B), 1 % de ácido kójico (Figura 17C), 0.2 % de DMSO (Figura 17D), 0.05 % de DMSO (Figura 17E), 200 µM de CV-8684 (Figura 17F), 50 µM de CV-8684 (Figura 17G), 200 µM de CV-8686 (Figura 17H), 50 µM de CV-8686 (Figura 17I), 200 µM de CV-8688 (Figura 17J) y 50 µM de CV-8688 (Figura 17K).

Las Figuras 18A-18F son fotografías de piel de pez cebra expuesto a ningún tratamiento (Figura 18A), DMSO (Figura 18B), feniltiourea (“PTU”) (Figura 18C) y compuesto II a 2.5 µM (Figura 18D), 5 µM (Figura 18E) y 10 µM (Figura 18F). Las flechas rojas indican melanocitos normales.

Las Figuras 19A-19F son fotografías de pez cebra expuestos a ningún tratamiento (Figura 19A), DMSO (Figura 19B), feniltiourea (“PTU”) (Figura 19C) y compuesto II a 0.3 µM (Figura 19D), 1 µM (Figura 19E) y 3 µM (Figura 19F). Las flechas rojas indican melanocitos normales. Las flechas amarillas indican melanocitos anormalmente pequeños.

La Figura 20 es un gráfico de resumen que muestra la cantidad y el porcentaje de peces cebra con pigmentación cutánea disminuida después de la exposición a las afecciones enumeradas. Las últimas seis filas muestran los efectos de diversas concentraciones del compuesto II.

Las Figuras 21A-21E son fotografías del pez cebra tratado con ningún tratamiento (Figura 21A), DMSO (Figura 21B), PTU (Figura 21C), 0.5 µM (Figura 21D) y 1.5 µM (Figura 21E). Los paneles inferiores incluyen regiones de inversión de esquema de color.

Las Figuras 22A y 22B son histogramas que muestran la densidad de pigmentación medida por píxeles pigmentados/mm<3>(Figura 22A) y píxeles totales (Figura 22B) de fotografías de embriones de pez cebra, ejemplificadas en las Figuras 21A-21E.

Las Figuras 23A-23C son espectros de masas de CV-8684 en DMSO (Figura 23A), medio RPMI (Figura 23B) y DMEM (Figura 23C). Las Figuras 23D-23F son espectros de masas de CV-8686 en DMSO (Figura 23D), medio RPMI (Figura 23E) y DMEM (Figura 23F). Las Figuras 23G-23I son espectros de masas de CV-8688 en DMSO (Figura 23G), medio RPMI (Figura 23H) y DMEM (Figura 23I). La Figura 23J es un gráfico resumido que muestra el porcentaje de compuesto de prueba que queda en el disolvente indicado después de 2 horas de incubación.

Las Figuras 24A-24S muestran esquemas sintéticos para derivados de malassezina: Figura 24A: compuesto C (CV-8802); Figura 24B: compuesto K (CV-8803); Figura 24C: compuesto A (CV-8804); Figura 24D: compuesto E (AB12508); Figura 24E: compuesto A5 (CV-8819); Figura 24F: compuesto H (AB12509); Figura 24G: compuesto B (CV-8877); Figura 24H: compuesto B10; Figura 24I: compuesto AB11644; Figura 24J: O52 (AB12976); Figura 24K: Malassezia indol A (AB17011); Figura 24L: pitiriacitrina (AB17014); Figura 24M: AB17151; Figura 24N: compuesto VI (AB17225); Figura 24O: ácido malassezialáctico (AB17227); Figura 24P: AB12507; Figura 24Q: compuesto V (AB17219); Figura 24R: compuesto VIII (AB17220) y Figura 24S: compuesto VII (AB17221).

Las Figuras 25A-25D muestra tablas de datos que contienen los personajes de células positivas a anexina V a las 6 horas (Figura 25A), 24 horas (Figura 25B), 48 horas (Figura 25C) y 72 horas (Figura 25D) después de la exposición a los tratamientos mostrados.

Las Figuras 26A-26D muestran tablas de datos que contienen el pliegue de inducción de Caspasa 3/7 a las 6 horas (Figura 26A), 24 horas (Figura 26B), 48 horas (Figura 26C) y 72 horas (Figura 26D) después de la exposición a los tratamientos mostrados.

Las Figuras 27A-27B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 27A) y WM115 (Figura 27B) después de la exposición a AB12508 (compuesto E).

Las Figuras 28A-28B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 28A) y WM115 (Figura 28B) después de la exposición a una composición desconocida.

Las Figuras 29A-29B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 29A) y WM115 (Figura 29B) después de la exposición a CV-8803 (compuesto K).

Las Figuras 30A-30B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 30A) y WM115 (Figura 30B) después de la exposición a CV-8804 (compuesto A).

Las Figuras 31A-31B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 31A) y WM115 (Figura 31B) después de la exposición a CV-8684 (malassezina).

Las Figuras 32A-32B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 32A) y WM115 (Figura 32B) después de la exposición a CV-8685 (indolo[3,2- b]carbazol).

Las Figuras 33A-33B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 33A) y WM115 (Figura 33B) después de la exposición a CV-8686 (compuesto I).

Las Figuras 34A-34B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 34A) y WM115 (Figura 34B) después de la exposición a CV-8688 (compuesto II).

Las Figuras 35A-35B muestran los porcentajes de viabilidad celular restantes para las células MeWo (Figura 35A) y WM115 (Figura 35B) después de la exposición a estaurosporina.

La Figura 36A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de omeprazol. La Figura 36B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 36A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 37A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8684 (malassezina). La Figura 37B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 37A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 38A muestra lecturas de la actividad AhR de ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8685 (indolo[3,2-b]carbazol). La Figura 38B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 38A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 39A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8686 (compuesto I). La Figura 39B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 39A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 40A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de una composición desconocida. La Figura 40B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 40A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 41A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8803 (compuesto K). La Figura 41B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 41A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 42A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8804 (compuesto A). La Figura 42B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 42A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 43A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB12508 (compuesto E). La Figura 43B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 43A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 44A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8688 (compuesto II). La Figura 44B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 44A, mientras que el recuadro muestra la EC50 medida.

La Figura 45A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de omeprazol. La Figura 45B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 45A. La Figura 46A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de una composición desconocida. La Figura 46B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 46A.

La Figura 47A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de 2,3,7,8-tetraclorodibenzodioxina (TCDD). La Figura 47B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 47A.

La Figura 48A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8819 (compuesto A5). La Figura 48B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 48A.

La Figura 49A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8684 (malassezina). La Figura 49B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 49A.

La Figura 50A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB12508 (compuesto E). La Figura 50B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 50A.

La Figura 51A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8686 (compuesto I). La Figura 51B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 51A.

La Figura 52A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB12509 (compuesto H). La Figura 52B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 52A.

La Figura 53A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8688 (compuesto II). La Figura 53B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 53A.

La Figura 54A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8877 (compuesto B). La Figura 54B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 54A.

La Figura 55A muestra lecturas de la actividad AhR de ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8685 (indolo[3,2-b]carbazol). La Figura 55B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 55A.

La Figura 56A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones del compuesto B10. La Figura 56B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 56A.

La Figura 57A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de CV-8687 (compuesto IV). La Figura 57B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 57A.

La Figura 58A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de omeprazol. La Figura 58B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 58A. La Figura 59A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de TCDD. La Figura 59B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 59A.

La Figura 60A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de precursor de Malassezina. La Figura 60B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 60A.

La Figura 61A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB11644. La Figura 61B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 61A. La Figura 62A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de 3-metilcolantreno (3-MC). La Figura 62B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 62A.

La Figura 63A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB12976 (O52). La Figura 63B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 63A. La Figura 64A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB17011 (Malassezia Indol A). La Figura 64B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 64A.

La Figura 65A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB17014 (pitiriacitrina). La Figura 65B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 65A.

La Figura 66A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB17151. La Figura 66B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 66A. La Figura 67A muestra lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a diversas concentraciones de AB17225. La Figura 67B muestra un gráfico de líneas de los datos de la Figura 67A. La Figura 68 es una tabla que muestra los datos de viabilidad de MTT determinados a partir de sustratos MelanoDerm™ tratados con concentraciones variables de los compuestos mostrados.

La Figura 69 es una tabla que muestra los datos de concentración de melanina obtenidos a partir de sustratos de MelanoDerm™ tratados con concentraciones variables de los compuestos mostrados.

La Figura 70 muestra imágenes fotográficas macroscópicas representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a CV-8686 (compuesto I) y AB11644, tomadas en los días especificados, en los que las muestras fueron expuestas a los tratamientos mostrados.

La Figura 71 muestra imágenes fotográficas microscópicas (15X) representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a CV-8686 (compuesto I) y AB11644, tomadas en los días especificados, en los que las muestras se expusieron a los tratamientos mostrados.

La Figura 72 muestra imágenes fotográficas microscópicas (15X) representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a CV-8686 (compuesto I) y ácido kójico, tomadas en los días especificados, en los que las muestras se expusieron a los tratamientos mostrados.

La Figura 73 muestra imágenes fotográficas macroscópicas representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a CV-8686 (compuesto I) y ácido kójico, tomadas el día especificado, en las que las muestras fueron expuestas a los tratamientos mostrados.

La Figura 74 muestra imágenes fotográficas macroscópicas representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a CV-8686 (compuesto I) y ácido kójico, tomadas el día especificado, en las que las muestras fueron expuestas a los tratamientos mostrados.

La Figura 75 es una tabla que muestra la viabilidad tisular media y los datos de concentración de melanina determinados a partir de sustratos de MelanoDerm™ tratados con concentraciones variables de los compuestos mostrados. Cuando la designación del patrocinador está en blanco, la muestra tenía una composición desconocida. La Figura 76 muestra imágenes fotográficas macroscópicas representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a los tratamientos mostrados, tomadas el día especificado.

La Figura 77 muestra imágenes fotográficas macroscópicas representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a los tratamientos mostrados, tomadas el día 7 después del tratamiento. Cuando el nombre del compuesto está en blanco, la muestra tenía una composición desconocida.

La Figura 78 muestra imágenes fotográficas microscópicas (15X) representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a los tratamientos mostrados, tomadas el día especificado.

La Figura 79 muestra imágenes fotográficas microscópicas (15X) representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a los tratamientos mostrados, tomadas el día especificado. Cuando el nombre del compuesto está en blanco, la muestra tenía una composición desconocida.

Las Figuras 80-87 muestran imágenes fotográficas macroscópicas representativas de muestras de MelanoDerm™ expuestas a los tratamientos mostrados, tomadas el día 7. En las Figuras 85, donde el nombre del compuesto está en blanco, la muestra tenía una composición desconocida.

La Figura 88 es una tabla que muestra la viabilidad tisular media y los datos de concentración de melanina determinados a partir de sustratos de MelanoDerm™ tratados con concentraciones variables de los compuestos mostrados.

Las Figuras 89A-89X muestran histogramas de porcentaje de viabilidad y porcentaje de cambio de melanina de los melanocitos B16 siguiendo los tratamientos mostrados. En las Figuras 89M-89N, donde el nombre del compuesto está en blanco, la muestra tenía una composición desconocida.

Las Figuras 90A, 90C y 90E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 90A), células MeWo (Figura 90C) y células WM115 (Figura 90E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a estaurosporina. Las Figuras 90B, 90D y 90F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a yoduro de propidio (PI) (Figura 90B), células MeWo (Figura 90D) y células WM115 (Figura 90F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a estaurosporina.

Las Figuras 91A, 91C y 91E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 91A), células MeWo (Figura 91C) y células WM115 (Figura 90E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto H (AB12509). Las Figuras 91B, 91D y 91F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 91B), células MeWo (Figura 91D) y células WM115 (Figura 91F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto H (AB12509).

Las Figuras 92A, 92C y 92E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 92A), células MeWo (Figura 92C) y células WM115 (Figura 92E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a malassezina (CV-8684). Las Figuras 92B, 92D y 92F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a yoduro de propidio (PI) (Figura 92B), células MeWo (Figura 92D) y células WM115 (Figura 92F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a malassezina (CV-8684).

Las Figuras 93A, 93C y 93E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 93A), células MeWo (Figura 93C) y células WM115 (Figura 93E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto B (CV-8877). Las Figuras 93B, 93D y 93F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 93B), células MeWo (Figura 93D) y células WM115 (Figura 93F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto B (CV-8877).

Las Figuras 94A, 94C y 94E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 94A), células MeWo (Figura 94C) y células WM115 (Figura 94E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto I (CV-8686). Las Figuras 94B, 94D y 94F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 94B), células MeWo (Figura 94D) y células WM115 (Figura 94F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto I (CV-8686).

Las Figuras 95A, 95C y 95E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 95A), células MeWo (Figura 95C) y células WM115 (Figura 95E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto B10. Las Figuras 95B, 95D y 95F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 95B), células MeWo (Figura 95D) y células WM115 (Figura 95F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto B10.

Las Figuras 96A, 96C y 96E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 96A), células MeWo (Figura 96C) y células WM115 (Figura 96E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto II (CV-8688). Las Figuras 96B, 96D y 96F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 96B), células MeWo (Figura 96D) y células WM115 (Figura 96F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto II (CV-8688).

Las Figuras 97A, 97C y 97E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 97A), células MeWo (Figura 97C) y células WM115 (Figura 97E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al precursor de Malassezina. Las Figuras 97B, 97D y 97F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 97B), células MeWo (Figura 97D) y células WM115 (Figura 97F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al precursor de Malassezina.

Las Figuras 98A, 98C y 98E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 98A), células MeWo (Figura 98C) y células WM115 (Figura 98E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al indolo[3,2-b]carbazol (CV-8685). Las Figuras 98B, 98D y 98F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 98B), células MeWo (Figura 98D) y células WM115 (Figura 98F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al indolo[3,2-b]carbazol (CV-8685). Las Figuras 99A, 99C y 99E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 99A), células MeWo (Figura 99C) y células WM115 (Figura 99E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17151. Las Figuras 99B, 99D y 99F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 99B), células MeWo (Figura 99D) y células WM115 (Figura 99F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17151.

Las Figuras 100A, 100C y 100E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 100A), células MeWo (Figura 100C) y células WM115 (Figura 100E) a 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto IV (CV-8687). Las Figuras 100B, 100D y 100F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 100B), células MeWo (Figura 100D) y células WM115 (Figura 100F) a 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto IV (CV-8687).

Las Figuras 101A, 101C y 101E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 101A), células MeWo (Figura 101C) y células WM115 (Figura 101E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17011. Las Figuras 101B, 101D y 101F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 101B), células MeWo (Figura 101D) y células WM115 (Figura 101F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17011.

Las Figuras 102A, 102C y 102E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 102A), células MeWo (Figura 102C) y células WM115 (Figura 102E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB11644. Las Figuras 102B, 102D y 102F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 102B), células MeWo (Figura 102D) y células WM115 (Figura 102F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB11644.

Las Figuras 103A, 103C y 103E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 103A), células MeWo (Figura 103C) y células WM115 (Figura 103E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17014. Las Figuras 103B, 103D y 103F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 103B), células MeWo (Figura 103D) y células WM115 (Figura 103F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17014.

Las Figuras 104A, 104C y 104E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a Anexina V (Figura 104A), células MeWo (Figura 104C) y células WM115 (Figura 104E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a una composición desconocida. Las Figuras 104B, 104D y 104F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 104B), células MeWo (Figura 104D) y células WM115 (Figura 104F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a una composición desconocida.

Las Figuras 105A, 105C y 105E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 105A), células MeWo (Figura 105C) y células WM115 (Figura 105E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17225. Las Figuras 105B, 105D y 105F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 105B), células MeWo (Figura 105D) y células WM115 (Figura 105F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17225.

Las Figuras 106A, 106C y 106E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 106A), células MeWo (Figura 106C) y células WM115 (Figura 106E) a 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto A5 (CV-8819). Las Figuras 106B, 106D y 106F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a yoduro de propidio (PI) (Figura 106B), células MeWo (Figura 106D) y células WM115 (Figura 106F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto A5 (CV-8819).

Las Figuras 107A, 107C y 107E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 107A), células MeWo (Figura 107C) y células WM115 (Figura 107E) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB12976. Las Figuras 107B, 107D y 107F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas para yoduro de propidio (PI) (Figura 107B), células MeWo (Figura 107D) y células WM115 (Figura 107F) en 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB12976.

Las Figuras 108A, 108C y 108E muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a anexina V (Figura 108A), células MeWo (Figura 108C) y células WM115 (Figura 108E) a 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto E (AB12508). Las Figuras 108B, 108D y 108F muestran tablas de datos que contienen los porcentajes de células B16F1 positivas a yoduro de propidio (PI) (Figura 108B), células MeWo (Figura 108D) y células WM115 (Figura 108F), a 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto E (AB12508).

Las Figuras 109A, 109B y 109C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a estaurosporina.

Las Figuras 110A, 110B y 110C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para las células B16F1, las células MeWo y las células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a malassezina (CV-8684).

Las Figuras 111A, 111B y 111C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto I (CV-8686).

Las Figuras 112A, 112B y 112C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control del vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto II (CV-8688).

Las Figuras 113A, 113B y 113C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de Caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a indolo[3,2-b]carbazol (CV-8685).

Las Figuras 114A, 114B y 114C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto IV (CV-8687).

Las Figuras 115A, 115B y 115C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB11644.

Las Figuras 116A, 116B y 116C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de Caspasa 3/7 en comparación con el control del vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a una composición desconocida.

Las Figuras 117A, 117B y 117C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de Caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto A5 (CV-8819).

Las Figuras 118A, 118B y 118C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control del vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto E (AB12508).

Las Figuras 119A, 119B y 119C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control del vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto H (AB12509).

Las Figuras 120A, 120B, y 120C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de Caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto B (CV-8877).

Las Figuras 121A, 121B y 121C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de Caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al compuesto B10.

Las Figuras 122A, 122B y 122C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de Caspasa 3/7 en comparación con el control del vehículo para las células B16F1, las células MeWo y las células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición al precursor de Malassezina.

Las Figuras 123A, 123B y 123C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17151.

Las Figuras 124A, 124B y 124C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17011.

Las Figuras 125A, 125B y 125C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17014.

Las Figuras 126A, 126B y 126C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB17225.

Las Figuras 127A, 127B y 127C muestran tablas de datos que contienen el porcentaje de inducción de caspasa 3/7 en comparación con el control de vehículo para células B16F1, células MeWo y células WM115, respectivamente, a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a AB12976.

Las Figuras 128-129 son tablas que muestran la viabilidad media del tejido y los datos de concentración de melanina obtenidos de experimentos separados con sustratos MelanoDerm™ tratados con concentraciones variables de los artículos de prueba mostrados.

La Figura 130 muestra compuestos producidos porMalassezia.

Las Figuras 131-132 son tablas que muestran la viabilidad media del tejido y los datos de concentración de melanina obtenidos de experimentos separados con sustratos MelanoDerm™ tratados con concentraciones variables de los artículos de prueba/composiciones de prueba mostradas.

Las Figuras 133A-133B muestran esquemas de síntesis para AB17590 (Figura 133A) y AB17653, AB17654, AB17655, AB17656, AB17657, y AB17658 (Figura 133B).

La Figura 134 es un esquema que muestra una plantilla de tratamiento de la piel para pacientes de tipo de piel IV. Los valores indican la dosis de UV para un área determinada en mJ/cm<2>.

La Figura 135 es una tabla que muestra una escala Dualight para los tipos de piel I-VI.

La Figura 136 es una tabla que muestra las mediciones de melanina y eritema del Mexameter MX 16 el día 8 después de la irradiación del día 7.

La Figura 137 es una tabla que muestra las mediciones de melanina y eritema del Mexameter MX 16 el día 15 después de la irradiación del día 14.

La Figura 138 es una tabla que muestra una escala de eritema de valores numéricos asociados con varios grados de eritema.

La Figura 139 es una fotografía que muestra la piel de un sujeto 24 horas después de la irradiación con varios niveles de UV según la plantilla de tratamiento de la piel que se muestra en la Figura 7. La dosis mínima de eritema ("MED") fue de 120 mJ de UVB 24 horas después de la irradiación.

La Figura 140 es una fotografía que muestra los sitios de prueba en la piel de un sujeto el día 7.

La Figura 141 es una fotografía que muestra los sitios de prueba en la piel de un sujeto el día 8, 24 horas después de la irradiación con 120 mJ de UVB.

La Figura 142 es una fotografía que muestra los sitios de prueba en la piel de un sujeto el día 14 después de una semana adicional de terapia con Malassezina. Las áreas de tratamiento se dosificaron con 120 mJ de UVB.

La Figura 143 es una fotografía que muestra los sitios de prueba en la piel de un sujeto el día 15, 24 horas después de la irradiación con 120 mJ de UVB. Se observa el eritema en el sitio del vehículo durante los días 7 y 9. También se observa un eritema de mínimo a leve en los sitios tratados con 1 % de Malassezina durante los días 14, 10 y 8, con rastros de eritema en los días 1 y 3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

También se describe el compuesto producido por una levadura deMalasseziaque tiene la estructura de la fórmula (I):

.

También se describe que el compuesto es un análogo químico de la malassezina.

También se describe el compuesto producido por una levadura de Malassezia que tiene la estructura de la fórmula (I):

.

También se describe un compuesto para modular la actividad de los melanocitos. El compuesto es un análogo químico de un compuesto producido por una levadura Malassezia, o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

.

También se describe un compuesto para agonizar el receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto es un análogo químico de un compuesto producido por una levadura Malassezia, o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

.

Otra modalidad de la presente invención es un compuesto para mejorar la hiperpigmentación provocada por un trastorno de hiperpigmentación. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levadura Malassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la producción de melanina. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levadura Malassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

También se describe que el compuesto producido por una levaduraMalasseziatiene la estructura de la fórmula (I):

.

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para modular la biogénesis del melanosoma. El compuesto es un análogo químico de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producido por una levadura Malassezia, o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.

.

También se describe una composición que comprende una levadura Malassezia y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición. La composición comprende un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 aislado o aislable de una levadura Malassezia y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

Otra modalidad de la presente invención es una composición. La composición comprende cualquiera de los compuestos que tienen la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 descrita en la presente y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

También se describe un método para agonizar un receptor de arilhidrocarburo (AhR). El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de los compuestos o composiciones descritos en este documento.

También se describe un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo, y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 y R11 es metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto que tiene una estructura de la fórmula (III):

También se describe el compuesto que es:

.

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para aclarar la piel. El compuesto tiene la estructura de fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo. También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto tiene la estructura de fórmula (II):

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos. El compuesto tiene la estructura de fórmula (III):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para agonizar el receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto tiene la estructura de fórmula (II):

También se describe un compuesto para agonizar el receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto tiene la estructura de fórmula (III):

También se describe una composición. La composición comprende un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II)

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

También se describe un método para agonizar un receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (II):

en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, y R11 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo; o una forma cristalina, un hidrato o una sal cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para agonizar un receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende: poner en contacto al sujeto con un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (III):

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

La presente invención es un compuesto. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

En un aspecto adicional de esta modalidad, Y es CR5R6; R5es hidrógeno, y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6, u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O).

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

En un aspecto adicional de esta modalidad, al menos uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11es alquilo C1-4.

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

En otro aspecto de esta modalidad, cada uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11es hidrógeno.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12CO2CH3.

En un aspecto adicional de esta modalidad, X es NH;Y es CR5R6; cada uno de R1, R3, R4, R7, R8, R9, R10, R11, y R13es hidrógeno; R2es hidrógeno o alquilo C1-4; R5es hidrógeno, y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6, u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O); y R12es –COR<a>.

En otro aspecto de esta modalidad, el compuesto se selecciona del grupo que consta de:

También se describe un compuesto que tiene la siguiente estructura:

También se describe el compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula (II),

,

También se describen R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9y R10que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-4.

Preferiblemente, uno o dos de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10son alquilo C1-4, y los grupos restantes son hidrógeno.

También se describe uno de R5y R10que es alquilo C1-4, y el otro que es hidrógeno.

También se describe uno de R1, R2, R3, R4, R6, R7, R8y R9que es alquilo C1-4, y los grupos restantes que son hidrógeno.

Preferentemente, R11y R12son cada uno de hidrógeno; y uno, dos, tres o cuatro de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9y R10son metilo, y los grupos restantes son hidrógeno.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe un compuesto para aclarar la piel. El compuesto tiene la siguiente fórmula:

,

También se describen R11y R12, cada uno de los cuales es hidrógeno; y uno, dos, tres o cuatro de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9y R10que son metilo, y los grupos restantes son hidrógeno.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9y R10que no es hidrógeno.

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos, el compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe el compuesto que tiene la siguiente estructura:

,

También se describe X que es NH.

También se describe Y que es CR5R6; R5que es hidrógeno y R6que es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6que se combinan para formar un grupo oxo (=O).

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

También se describe al menos uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11que es alquilo C1-4.

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

También se describen cada uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11que son hidrógeno.

También se describen R12que son –COR<a>o hidroxialquilo C1-4; y R<a>que son hidrógeno o alquilo C1-4.

Preferiblemente, R12es CHO, CH2OH, o C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Más preferiblemente, R12es CHO, CH2OH, o CO2CH3.

También se describe que X es NH; Y es CR5R6; cada uno de R1, R3, R4, R7, R8, R9, R10, R11y R13es hidrógeno; R2es hidrógeno o alquilo C1-4; R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O); R12es –COR<a>o hidroxialquilo C1-4; y R<a>es hidrógeno o alquilo C1-4.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe que, si R<a>es hidrógeno, Y es CR5R6y R13y R14son ambos hidrógeno, al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10y R11es R16; o, R5que se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, OR16, R16y cicloalquilo C3-6, o R5y R6que se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6.

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos, el compuesto que tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un compuesto para inducir la apoptosis de melanocitos seleccionada del grupo que consiste en:

También se describe el compuesto que tiene la siguiente estructura:

,

También se describe X que es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferiblemente, R12es CHO, CH2OH, o C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Más preferiblemente, R12es CHO, CH2OH, o CO2CH3.

También se describe que X es NH; Y que es CR5R6; cada uno de R1, R3, R4, R7, R8, R9, R10, R11y R13es hidrógeno; R2es hidrógeno o alquilo C1-4; R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O); R12es –COR<a>o hidroxialquilo C1-4; y R<a>es hidrógeno o alquilo C1-4.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describen que, si R<a>es hidrógeno, Y es CR5R6y R13y R14son ambos hidrógeno, al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10y R11es R16; o, R5que se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, OR16, R16y cicloalquilo C3-6, o R5y R6que se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6.

También se describe un compuesto para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR). El compuesto tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describen al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9y R10que no es hidrógeno.

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe un compuesto para modular la melanogénesis. El compuesto tiene la siguiente fórmula:

,

Preferiblemente, uno o dos de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10que son alquilo C1-4, y los grupos restantes son hidrógeno.

También se describe uno de R1, R2, R3, R4, R6, R7, R8y R9es alquilo C1-4, y los grupos restantes que son hidrógeno.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe un compuesto para modular la concentración de melanina. El compuesto tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición que comprende un compuesto. El compuesto tiene la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe una composición que comprende un compuesto. El compuesto tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe una composición que comprende un compuesto. El compuesto se selecciona del grupo que consiste en:

Modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel. Los métodos comprenden poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto que tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para aclarar la piel de un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe el compuesto que tiene la siguiente estructura:

,

También se describe X que es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferiblemente, R12es CHO, CH2OH, o C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Más preferiblemente, R12es CHO, CH2OH, o CO2CH3.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto que tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

También se describe el compuesto que tiene la siguiente estructura:

,

También se describe X que es NH.

También se describe Y que es CR5R6; R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O).

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describen X que es NH; Y que es CR5R6; cada uno de R1, R3, R4, R7, R8, R9, R10, R11y R13que es hidrógeno; R2que es hidrógeno o alquilo C1-4; R5que es hidrógeno y R6que es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6que se combinan para formar un grupo oxo (=O); y R12que es –COR<a>.

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto que tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

Las modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe un método para modular la melanogénesis en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto que tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para modular la melanogénesis en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, teniendo el compuesto la estructura de la siguiente fórmula:

en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y es CR5R6, R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16; o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.

El compuesto tiene la siguiente estructura:

,

En otro aspecto de esta modalidad, X es NH.

Preferiblemente, CR5R6es CH2, CHCH3, CHOCH3, C=O, o CH(C3H5).

Preferiblemente, R2es alquilo C1-4.

Más preferiblemente, R2es metilo.

Preferentemente, R12es C(=O)-O-(alquilo C1-4).

Con mayor preferencia, R12es CO2CH3.

También se describe un método para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto que tiene la siguiente fórmula:

,

También se describe el compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:

También se describe un método para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con un compuesto, el compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

También se describe una composición que comprende un primer compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de esta; y un segundo compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

También se describe que el sujeto se pone en contacto con un primer compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para inducir la apoptosis de melanocitos en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con uno o más de los compuestos enumerados en la Tabla 5 o la Figura 130, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. Las modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este. Una modalidad adicional de la presente invención es un compuesto para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto el sujeto con uno o más de los compuestos que forman parte de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

o un análogo químico, una forma cristalina, un hidrato o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición para modular la melanogénesis. La composición comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Otra modalidad de la presente invención es una composición para modular la concentración de melanina. La composición comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos. Modalidades adicionales de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel en un sujeto. Los métodos comprenden poner en contacto el sujeto con la composición, la composición que comprende uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

en donde:

X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; Y CR5R6; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16, y OR16; R13es hidrógeno; R14es hidrógeno o R16; R5y R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, O16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16.

y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

en donde:

y un vehículo, diluyente o portador cosmética o farmacéuticamente aceptable.

En modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones de la presente invención previene el eritema inducido por UV en un sujeto.

En modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones de la presente invención reduce la melanina epidérmica en un sujeto.

En modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones de la presente invención produce un efecto fotoprotector o protector UV en un sujeto.

En modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones de la presente invención filtra, absorbe o refleja los rayos UV.

En modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones de la presente invención previene la hiperpigmentación y/o promueve la hipopigmentación.

En modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones de la presente invención es un agente de protección solar, un agente fotoprotector y/o un agente protector de UV.

Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

También se describe un método para modular la actividad del receptor de arilhidrocarburo (AhR) en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones descritas en este documento. Otras modalidades de la presente invención son un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto y una composición para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

Una modalidad adicional de la presente invención es una composición para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina en un sujeto. El método comprende poner en contacto al sujeto con cualquiera de las composiciones que forman parte del alcance de las reivindicaciones descritas en la presente.

Definiciones

Como se usa en la presente, el término "compuesto" se refiere a dos o más átomos que están conectados por uno o más enlaces químicos. En la presente invención, los enlaces químicos incluyen, pero no se limitan a, enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Los enlaces covalentes de la presente invención incluyen enlaces simples, dobles y triples. Los compuestos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas orgánicas.

Los compuestos/moléculas orgánicos de la presente invención incluyen hidrocarburos lineales, ramificados y cíclicos con o sin grupos funcionales. El término "Cx-y" cuando se usa junto con un radical químico, tal como alquilo, alquenilo, alquinilo o alcoxi, pretende incluir grupos que contienen de x a y carbonos en la cadena. Por ejemplo, el término "alquilo Cx-y" significa grupos hidrocarburos saturados sustituidos o no sustituidos, incluidos los grupos alquilo de cadena lineal y alquilo de cadena ramificada que contienen de x a y carbonos en la cadena, incluidos grupos haloalquilo como trifluorometilo y 2,2,2-trifluoroetilo y similares. Los términos "alquenilo Cx-y" y "alquinilo Cx-y" se refieren a grupos alifáticos insaturados sustituidos o no sustituidos análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o triple, respectivamente.

El término "alifático", como se usa en este documento, significa un grupo compuesto por átomos de carbono e hidrógeno que no contiene anillos aromáticos. Por consiguiente, los grupos alifáticos incluyen grupos alquilo, alquenilo, alquinilo y carbociclilo.

Como se usa en la presente, el término “alquilo” significa grupos hidrocarburos acíclicos lineales y ramificados, por ejemplo "alquilo C1-C20" se refiere a grupos alquilo que tienen de 1-20 carbonos. Un grupo alquilo puede ser lineal o ramificado. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc- butilo, pentilo, isopentil terc-pentilhexilo, isohexilo y similares. Otros grupos alquilo serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica dado el beneficio de la presente descripción. Un grupo alquilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en la presente. Por ejemplo, un grupo alquilo puede estar sustituido con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes seleccionados independientemente) de halógeno, -CO2R', - COOH, -CN, -OH, -OR', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' o-SO2R', en donde cada instancia de R' es independientemente alquilo C1-C3. En modalidades, el alquilo es no sustituido. En las modalidades, el alquilo está sustituido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 grupos sustituyentes como se describe en la presente). Por ejemplo, el término "hidroxialquilo" se refiere a un grupo alquilo como se describe en el presente documento que comprende un sustituyente hidroxilo (-OH) e incluye grupos tales como -CH2OH.

Como se usa en este documento, "alquenilo" significa cualquier cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono insaturados que pueden ocurrir en cualquier punto estable a lo largo de la cadena, por ejemplo "alquenilo C2-C20" se refiere a un grupo alquenilo que tiene 2-20 carbonos. Por ejemplo, un grupo alquenilo incluye prop-2-enilo, but-2-enilo, but-3-enilo, 2-metilprop-2-enilo, hex-2-enilo, hex-5-enilo, 2,3-dimetilbut-2-enilo y similares. En modalidades, el alquenilo comprende 1, 2 o 3 dobles enlaces carbono-carbono. En modalidades, el alquenilo comprende un enlace doble carbono-carbono sencillo. En modalidades, se conjugan múltiples dobles enlaces (por ejemplo, 2 o 3). Un grupo alquenilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en la presente. Por ejemplo, un grupo alquenilo puede estar sustituido con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes seleccionados independientemente) de halógeno,-CO2R', - COOH, -CN, -OH, -OR', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' o-SO2R', en donde cada instancia de R' es independientemente alquilo C1-C3. En modalidades, el alquenilo es no sustituido. En modalidades, el alquenilo está sustituido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 grupos sustituyentes como se describe en el presente documento).

Como se usa en este documento, "alquinilo" significa cualquier cadena de hidrocarburo de configuración lineal o ramificada, que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono que se encuentran en cualquier punto estable a lo largo de la cadena, por ejemplo "alquinilo C2-C20" se refiere a un grupo alquinilo que tiene 2-20 carbonos. Ejemplos de un grupo alquinilo incluyen prop-2-inilo, but-2-inilo, but-3-inilo, pent-2-inilo, 3-metilpent-4-inilo, hex-2-inilo, hex-5-inilo, y similares. En modalidades, un alquinilo comprende un triple enlace carbono-carbono. Un grupo alquinilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en la presente. Por ejemplo, un grupo alquinilo puede estar sustituido con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes seleccionados independientemente) de halógeno,-CO2R', - COOH, -CN, -OH, -OR', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' o-SO2R', en donde cada instancia de R' es independientemente alquilo C1-C3. En modalidades, el alquinilo es no sustituido. En modalidades, el alquinilo está sustituido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 grupos sustituyentes como se describe en la presente).

Como se usa en este documento, el término "cicloalquilo" significa un grupo cíclico saturado, no aromático, por ejemplo "cicloalquilo C3-C10". En modalidades, un cicloalquilo es monocíclico. En modalidades, un cicloalquilo es policíclico (por ejemplo, bicíclico o tricíclico). En los grupos cicloalquilo policíclicos, los anillos individuales pueden estar condensados, formados por puentes o espirocíclicos. Los ejemplos de un grupo cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, norbornanilo, biciclo[3.2.1]octanilo, octahidropentalenilo y espiro[4.5]decanilo, y similares. El término "cicloalquilo" puede usarse indistintamente con el término "carbociclo". Un grupo cicloalquilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en la presente. Por ejemplo, un grupo cicloalquilo puede estar sustituido con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes seleccionados independientemente) de halógeno, -CO2R’, -CN, -OH, -OR’, -NH2, -NHR’, -N(R’)2, -SR’ o -SO2R’, donde cada instancia de R’ es independientemente alquilo C1-C3. En modalidades, el cicloalquilo no está sustituido. En modalidades, el cicloalquilo está sustituido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 grupos sustituyentes como se describe en la presente).

Como se usa en este documento, el término "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.

Como se usa en la presente, un "compuesto aromático", "aromático" o un compuesto que contiene un "anillo aromático" es un compuesto arilo o heteroarilo. El término "arilo", como se usa en la presente, incluye grupos aromáticos de anillosencillo sustituidos o no sustituidos en los que cada átomo del anillo es carbono. Preferiblemente, el anillo es un anillo de 3 a 8 miembros, más preferiblemente un anillo de 6 miembros. El término "arilo" también incluye sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos contiguos donde al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos arilo incluyen benceno, naftaleno, fenantreno, fenol, anilina y similares. El término "heteroarilo" incluye estructuras de anillo único aromático sustituidas o no sustituidas, preferiblemente anillos de 3 a 8 miembros, más preferiblemente anillos de 5 a 7 miembros, incluso más preferiblemente anillos de 5 a 6 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen al menos un heteroátomo, preferiblemente de uno a cuatro heteroátomos, más preferiblemente uno o dos heteroátomos. El término "heteroarilo" también incluye sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos contiguos en los que al menos uno de los anillos es heteroaromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos heteroarilo incluyen, por ejemplo, pirrol, furano, tiofeno, indol, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Ciertos compuestos incluyen al menos uno, preferiblemente dos, grupos indol así como al menos un grupo aldehído.

El término "sustituido" significa radicales que tienen al menos un sustituyente que reemplaza un átomo de hidrógeno en uno o más carbonos del esqueleto. Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita de que dicha sustitución está de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución da como resultado un compuesto estable, por ejemplo, que no experimentan espontáneamente una transformación tal como por reordenamiento, ciclación, eliminación y similares. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más e iguales o diferentes para los compuestos orgánicos apropiados.

Como se usa en la presente, el término "heterociclo" o "heterocíclico" significa un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico que contiene al menos un heteroátomo. Los heteroátomos incluyen, pero no se limitan a, oxígeno, nitrógeno y azufre.

Un anillo heterocíclico monocíclico consta, por ejemplo, de un anillo de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 miembros que contiene al menos un heteroátomo. Los ejemplos representativos de anillos heterocíclicos monocíclicos incluyen, pero no se limitan a, azetidinilo, azepanilo, aziridinilo, diazepanilo, 1,3-dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, 1,3-ditiolanilo, 1,3-ditianilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolinilo, isotiazolidinilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, oxadiazolinilo, oxadiazolidinilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, piperidinilo, piranilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tiadiazolinilo, tiadiazolidinilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, tiomorfolinilo, 1,1-dioxidotiomorfolinilo (tiomorfolina sulfona), tiopiranilo y tritianilo.

Un anillo heterocíclico bicíclico es, por ejemplo no limitativo, un anillo heterocíclico monocíclico condensado con un anillo arilo distal o el anillo heterocíclico monocíclico condensado con un anillo cicloalquilo distal o el anillo heterocíclico monocíclico condensado con un anillo cicloalquenilo distal o el anillo heterocíclico monocíclico condensado a un anillo heterocíclico monocíclico distal, o el anillo heterocíclico monocíclico condensado a un anillo heteroarilo monocíclico distal. Ejemplos representativos de anillos heterocíclicos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, 1,3-benzodioxolilo, 1,3-benzoditiolilo, 2,3-dihidro-1,4-benzodioxinilo, 2,3-dihidro-1-benzofuranilo, 2,3-dihidro-1-benzotienilo, 2,3-dihidro-1H-indolilo y 1,2,3,4-tetrahidroquinolinilo.

Un anillo heterocíclico tricíclico es, por ejemplo no limitativo, un anillo heterocíclico bicíclico fusionado a un grupo fenilo o el anillo heterocíclico bicíclico fusionado a un grupo cicloalquilo o el anillo heterocíclico bicíclico fusionado a un grupo cicloalquenilo o el anillo heterocíclico bicíclico fusionado a otro anillo monocíclico heterocíclico. Los ejemplos representativos de anillos heterocíclicos tricíclicos incluyen, entre otros, 2,3,4,4a,9,9a-hexahidro-1H-carbazolilo, 5a,6,7,8,9,9a- hexahidrodibenzo[b,d]furanilo y 5a,6,7,8,9,9a-hexahidrodibenzo[b,d]tienilo.

Los heterociclos de la presente invención pueden estar sustituidos con sustituyentes seleccionados independientemente de, por ejemplo no limitativo, alquenilo, alcoxi, alcoxialquilo, alcoxialquinilo, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilalquilo, alcoxi-NH=C(alquilo)-, alquilo, alquilcarbonilo, alquilcarbonilalquilo, alquilcarboniloxi, alquilsulfonilo, alquiltio, alquinilo, arilo, arilalcoxi, arilalquilo, arilcarbonilo, ariloxi, carboxi, carboxialquilo, ciano, cianoalquilo, cicloalquilo, carbonilo, cicloalquilalquilo, formilo, halógeno, haloalquilo, hidroxi, hidroxialquilo, hidroxicicloalquilo, mercapto, nitro, oxo, y fenilo. Como se usa en la presente, "modulación de la pigmentación de la piel" y variaciones gramaticales de la misma se refieren en general al brillo de la piel así como a los efectos de oscurecimiento de la piel de los compuestos y composiciones de la presente invención.

Como se usa en la presente, "aclarar la piel" y variaciones gramaticales del mismo se refieren generalmente a cualquier reducción real o percibida en la pigmentación de la piel. Se han utilizado métodos para aclarar la piel para reducir la pigmentación de las áreas hiperpigmentadas de la piel como resultado de la edad, la exposición al sol o un trastorno de hiperpigmentación. La aplicación de los compuestos y composiciones de la presente invención a, por ejemplo, la piel de un sujeto, puede reducir la pigmentación de modo que la piel parezca más clara o más blanca que antes de dicha aplicación. La pigmentación de la piel se puede evaluar de varias formas, incluidas, entre otras, evaluaciones visuales utilizando, por ejemplo, la escala cromática de von Luschan, la prueba de tipificación cutánea de Fitzpatrick (Fitzpatrick et al., 1988) y la escala de hiperpigmentación de Taylor (Taylor et al., 2005) y métodos de espectrofotometría de reflectancia (Zonios, et al., 2001). Por ejemplo, la prueba de tipificación cutánea de Fitzpatrick incluye seis tipos de piel (I-VI), y la piel tipo VI que se convierte en el tipo V o menos se ha "aclarado" como se usa el término en la presente. Como se analiza más adelante, el aclarado de la piel puede resultar debido a una serie de fenómenos, que incluyen, entre otros, la modulación de la actividad de los melanocitos, la inducción de la apoptosis de los melanocitos o la modulación de la actividad del receptor de arilhidrocarburos

Asimismo, como se usa aquí, "oscurecimiento de la piel" y variaciones gramaticales del mismo se refieren generalmente a cualquier aumento real o percibido en la pigmentación de la piel. Se han utilizado métodos de oscurecimiento de la piel para aumentar la pigmentación de las áreas hipopigmentadas de la piel que resultan, por ejemplo, de un trastorno de hipopigmentación. La aplicación de los compuestos y composiciones de la presente invención a, por ejemplo, la piel de un sujeto, puede aumentar la pigmentación de modo que la piel parezca más oscura que antes de dicha aplicación. Ciertos compuestos de la presente invención se producen, derivan de, se aíslan o son aislables de una levaduraMalassezia. Las levadurasMalasseziason levaduras del géneroMalasseziae incluyen, pero no se limitan a,Malassezia globosa,Malassezia restricta,Malassezia furfur,Malassezia sympodialis,Malassezia slooffiae,Malassezia obtusa,Malassezia pachydermatis,Malassezia dermatis,Malassezia japonica,Malassezia nana,Malassezia yamatoensis,Malassezia equine,Malassezia caprae, yMalassezia cuniculi. (Guého,et al., 1996; Gaitanis,et al., 2013). La levaduraMalasseziaforma parte de la flora cutánea humana normal y normalmente no produce efectos patógenos.

Sin embargo, la levaduraMalasseziapuede causar una serie de enfermedades, que incluyen, entre otras, pitiriasis versicolor (tanto las variedades hiperpigmentadas como hipopigmentadas), dermatitis seborreica, caspa, dermatitis atópica, foliculitis porMalassezia, psoriasis y papilomatosis confluente y reticulada. (Gaitanis,et al., 2013).

Como se usa en la presente, el término "análogo químico" se refiere a un compuesto que está estructuralmente relacionado con un compuesto original y contiene diferentes grupos funcionales o sustituyentes. Por ejemplo, los compuestos originales incluyen malassezina e indirubina, y los análogos químicos de malassezina e indirubina contienen ciertos grupos funcionales y sustituyentes que son distintos de malassezina e indirubina, respectivamente. Los análogos químicos de la presente invención pueden tener ventajas significativas sobre un compuesto original dado, incluido un perfil farmacocinético adecuado para uso cosmético o farmacéutico. En algunas modalidades, se genera un análogo químico a partir de una molécula parental mediante una o más reacciones químicas. En otras modalidades, se pueden usar esquemas de síntesis alternativos que no se originan con un compuesto original para generar análogos químicos de la presente invención.

Un compuesto de la presente invención es producido por una levaduraMalasseziasi, en el transcurso de su ciclo de vida, una levaduraMalasseziasintetiza, secreta, acumula o genera de otro modo el compuesto en condiciones de crecimiento apropiadas. La levaduraMalasseziasecreta diferentes compuestos dependiendo de con qué se suplementa su medio de crecimiento. (Nazzaro-Porro,et al., 1978). La presente invención incluye cualquier compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 producida por una levaduraMalasseziaen cualquier condición de cultivo.

Un compuesto de la presente invención se deriva de una levaduraMalasseziasi, en cualquier momento durante el transcurso del ciclo de vida de la levadura, el compuesto existió en la levadura.

La Malassezina es un ejemplo de un compuesto producido por una levaduraMalassezia. La Malassezina, también conocida como 2-(1H-indol-3-ilmetil)-1H-indol-3-carbaldehído, es un metabolito triptófano originalmente aislado deMalassezia furfur. La Malassezina es un agonista conocido del receptor de arilhidrocarburos (AhR), un receptor implicado en el crecimiento celular, la diferenciación y la expresión génica. (Wille et al., 2001). La Malassezina también induce la apoptosis en los melanocitos humanos primarios. (Krämer, et al., 2005). Recientemente, Winston-McPherson y sus colegas sintetizaron ciertos análogos químicos de malassezina, quienes examinaron la actividad agonista de AhR de los análogos. (Winston-McPherson,et al., 2014).

La indirubina es otro ejemplo de un compuesto producido por una levaduraMalassezia. La indirubina es un metabolito aislado deMalassezia furfur. La indirubina es un agonista conocido del receptor de arilhidrocarburos (AhR), un receptor implicado en el crecimiento celular, la diferenciación y la expresión génica.

Como se usa en este documento, el término "melanocito" se refiere a una célula dendrítica de la epidermis que normalmente sintetiza tirosinasa y, dentro de los melanosomas, el pigmento melanina. Los melanocitos pueden exhibir regulación positiva de ciertos genes, que incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: tirosinasa (albinismo oculocutáneo IA), factor de transcripción asociado a microftalmia, alfa-2-macroglobulina, proteína 1 relacionada con tirosinasa, familia de portadores de solutos 16, proteína GS3955, v-kit Hardy-Zuckerman 4 sarcoma felino, albinismo ocular 1, proteína Rag D, glucogenina 2, receptor acoplado a proteína G, familia C, albinismo oculocutáneo II, delecionado en cáncer de esófago 1, melan-A, SRY-box 10, ATPasa, Clase V, tipo 10C, metaloproteinasa de matriz 1, factor de crecimiento transformante latente beta b, cartucho de unión a ATP, subfamilia C, hidroxiprostaglandina deshidrogenasa 15, miembro 1 de la superfamilia transmembrana 7, glutaminil-péptido ciclotransferasa y otros genes identificados por Lee et al. (Lee,et al., 2013).

Los melanocitos, como muchos otros tipos de células, sufren muerte celular programada o apoptosis. Las vías de apoptosis de los melanocitos son conocidas por los expertos en la técnica (Wang, et al., 2014), y las vías de apoptosis generalmente han sido revisadas por Elmore (Elmore, 2007). La apoptosis de los melanocitos se induce, por ejemplo, al provocar la activación de determinadas vías de transducción de señales proapoptóticas o provocando la represión de determinadas vías antiapoptóticas en un melanocito. Se prevé que los compuestos o composiciones puedan activar/reprimir directamente una vía relacionada con la apoptosis interactuando directamente con una molécula de señalización de la vía o interactuando indirectamente con una molécula de la vía mediante la

La actividad de los melanocitos se puede modular de varias formas contempladas, que incluyen, pero no se limitan a, inducir la apoptosis de los melanocitos o alterar la expresión génica de los melanocitos, la motilidad celular, el crecimiento celular, la producción de melanina, la biogénesis de melanosomas o la transferencia de melanosomas.

Como se usa en la presente, los términos "modular", "modulación" y variaciones gramaticales de estos se refieren a un ajuste de una actividad o fenómeno biológico a un nivel deseado. Se prevé que la "modulación" de la presente invención incluye ajustes que aumentan o disminuyen los niveles de actividad o fenómeno biológico.

Como se usa en la presente, los términos "agonista", "agonizante" y variaciones gramaticales de estos se refieren a una molécula que desencadena (por ejemplo, inicia o promueve), mejora, estimula o activa parcial o totalmente una o más actividades biológicas. Los agonistas de la presente invención pueden interactuar con un receptor y activarlo, militando así una respuesta fisiológica o farmacológica característica de ese receptor. Los agonistas de la presente invención incluyen sustancias naturales así como sustancias sintéticas.

Como se usa en la presente, los términos "antagonista", "antagonizante" y variaciones gramaticales de estos se refieren a una molécula que suprime, inhibe o desactiva parcial o totalmente una o más actividades biológicas. Los antagonistas de la presente invención pueden unirse competitivamente a un receptor en el mismo sitio que un agonista, pero no activan la respuesta intracelular iniciada por la forma activa del receptor. Los antagonistas de la presente invención pueden inhibir las respuestas intracelulares de un agonista o agonista parcial.

Un receptor de arilhidrocarburo (AhR) es cualquier receptor de arilhidrocarburo que existe naturalmente en un sujeto como se describe en la presente. Los expertos en la técnica conocen los receptores de arilhidrocarburos. (Noakes, 2015). Los agonistas de los receptores de arilhidrocarburos incluyen, pero no se limitan a, compuestos relacionados con triptófano tales como quinurenina, ácido quinurénico, ácido cinabarínico y 6-formilindolo[3,2-b]carbazol (FICZ). La malassezina también se conoce como un agonista del receptor de hidrocarburos arilo. (Wille,et al., 2001).

Como se usa en el presente documento, los compuestos, composiciones y métodos de la presente invención se pueden usar para mejorar la hiperpigmentación causada por un trastorno de hiperpigmentación, por ejemplo, reduciendo el nivel de hiperpigmentación en áreas afectadas por un trastorno de hiperpigmentación, retardando la hiperpigmentación adicional o previniendo que se produzca una mayor hiperpigmentación. Sin embargo, debido a que todos los sujetos pueden no responder a un protocolo, régimen o procedimiento de dosificación particular, la mejora de la hiperpigmentación provocada por un trastorno de hiperpigmentación no requiere que la respuesta fisiológica deseada o el resultado se logre en todos y cada uno de los sujetos o la población de sujetos. Por consiguiente, un sujeto o una población de sujetos determinados pueden no responder o responder de manera inadecuada a la dosificación, pero otros sujetos o poblaciones de sujetos pueden responder y, por lo tanto, experimentar una mejora en su trastorno de hiperpigmentación.

Como se usa en este documento, el término "hiperpigmentación" es un trastorno cutáneo real o percibido de excesivo color oscuro. El deterioro de la piel puede ser real, por ejemplo, atribuido a la edad, la exposición excesiva al sol o una enfermedad o afección que produzca áreas de piel oscura. Las áreas oscuras de la piel pueden tener la forma de puntos, manchas o áreas relativamente grandes de color oscuro. El deterioro de la piel también se puede percibir, por ejemplo, una percepción por parte de un individuo de que el tono de su piel es demasiado oscuro. El individuo puede tener un deseo cosmético de aclarar el tono de la piel.

Los trastornos de hiperpigmentación son trastornos en los que la hiperpigmentación es el síntoma principal, así como trastornos en los que la hiperpigmentación ocurre como un síntoma secundario. Los trastornos de hiperpigmentación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos de hiperpigmentación congénita y trastornos de hiperpigmentación adquirida. Los trastornos de hiperpigmentación congénita de la presente invención incluyen, entre otros, los que implican hiperpigmentación epidérmica (nevo de células nevus, nevus de Spitz y nevus spilus), hiperpigmentación dérmica (nevus azul, nevus Ohta, melanosis dérmica, nevus Ito y mancha mongol), efélides, acropigmentation reticularis, spitzenpigment/acropigmentación y lentiginosis (lentiginosis generalizada, síndrome LEOPARD, lentiginosis con patrón heredado, complejo de Carney, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Laugier– Hunziker–Baran, y síndrome de Cronkhite–Canada). (Yamaguchi,et al., 2014). Los trastornos de hiperpigmentación adquiridos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, lentigos/lentigo seniles, melasma/cloasma, melanosis de Riehl, mácula melanótica labial, melanosis peneana/vulvovaginal, eritromelanosis folicularis faciei Kitamura, pigmentación inducida por UV (bronceado y petaloides de pigmentación actinica), pigmentación posinflamatoria (melanosis por fricción y dermatosis reseca), pigmentación inducida por sustancias químicas/fármacos (bifenilo policlorado, arsénico, 5-FU, bleomicina, ciclofosfamida, metotrexato, clorpromazina, fenitoína, tetraciclina y cloroquina), líneas de demarcación pigmentosa, deposición de material extraño (como caroteno, plata, oro, mercurio, bismuto y tatuajes). La hiperpigmentación relacionada con trastornos sistémicos incluye trastornos del metabolismo/enzimas (hemocromatosis, enfermedad de Wilson, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick, amiloidosis, ocronosis, acantosis nigricans y porfiria cutánea tardía), trastornos endocrinos (enfermedad de Addison, síndrome de Cushing e hipertiroidismo), trastornos nutricionales (pelagra, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad del vagabundo y prurigo pigmentosa), mastocitosis, enfermedades del colágeno, La hiperpigmentación también puede relacionarse con enfermedades infecciosas (sarampión, sífilis yMalasseziafurfur) y síndromes (enfermedad de von Recklinghausen, síndrome de Sotos, síndrome POEMS, síndrome de Naegeli, síndrome de Cantu, síndrome de McCune-Albright, síndrome de Watson y síndrome de Bloom). (Yamaguchi,et al., 2014).

La melanina es un pigmento producido naturalmente que da color a la piel y al cabello. En la Figura 1A se muestra un diagrama esquemático de la piel. La melanina es producida por melanocitos en orgánulos conocidos como melanosomas mediante un procedimiento conocido como melanogénesis. Un compuesto o composición de la presente invención modula la producción de melanina (a/k/a melanogénesis) en un sujeto, por ejemplo, modulando la biogénesis del melanosoma e inhibiendo directa o indirectamente la síntesis de melanina a nivel enzimático.

La biogénesis del melanosoma se produce a través de cuatro etapas: La etapa I se caracteriza por pre-melanosomas, que son esencialmente vacuolas no pigmentadas. En la etapa II, los premelanosomas desarrollan estrías en las que se deposita la melanina en la etapa III. La etapa IV da como resultado melanosomas maduros que son ricos en contenido de melanina. Los compuestos y composiciones de la presente invención modulan la biogénesis del melanosoma inhibiendo o atenuando los procedimientos biológicos que normalmente promueven cualquiera o todas estas etapas. (Wasmeier,et al., 2008).

La síntesis de melanina involucra principalmente tres enzimas: tirosinasa, proteína 1 relacionada con tirosinasa y dopacromo tautomerasa. Los factores adicionales que afectan el tráfico intracelular de estas enzimas incluyen, pero no se limitan a, BLOC-1, OA1 y SLC45A2. Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden modular la producción de melanina, por ejemplo, inhibiendo o atenuando la actividad de cualquiera de estas enzimas o factores. (Yamaguchi,et al., 2014).

Una vez que se han formado los melanosomas y se ha sintetizado la melanina, los melanosomas deben transferirse de los melanocitos epidérmicos a los queratinocitos de la piel y el cabello. Los melanosomas se originan cerca del núcleo de los melanocitos y se transportan a la periferia de los melanocitos a lo largo de microtúbulos y filamentos de actina. Los compuestos y composiciones de la presente invención modulan la transferencia de melanosomas interfiriendo con cualquiera de los procedimientos biológicos que dan como resultado el transporte de melanosomas desde la región perinuclear a la periferia de los melanocitos y hacia los queratinocitos adyacentes. En la Figura 1B se muestra un diagrama esquemático de la síntesis de melanina, el transporte de melanina y la apoptosis de los melanocitos.

La concentración de melanina puede modularse, por ejemplo, aumentando o disminuyendo la melanogénesis o promoviendo la degradación o eliminación de la melanina en un sujeto.

Un compuesto aislado de una levaduraMalasseziade la presente invención necesariamente existe, antes del aislamiento, en una levaduraMalasseziao es producido por una levaduraMalassezia. Por lo tanto, un compuesto aislado de una levaduraMalasseziase deriva de células de levadura reales. Los expertos en la técnica conocen protocolos estándar para extraer compuestos de material celular.

Un compuesto aislable de una levaduraMalasseziano necesita derivar de células de levadura reales. En cambio, las reacciones sintéticas pueden usarse para generar compuestos producidos en levadura sin la participación de células de levadura reales. Las reacciones de síntesis orgánica son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden usarse a este respecto.

Como se usa en este documento, el término "melanina epidérmica" se refiere a la melanina que se produce, transporta o se encuentra de otro modo en la epidermis.

Como se usa en este documento, el término "reducir" y las variaciones gramaticales del mismo significan causar una disminución en el nivel de un fenómeno biológico o especie dados. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la presente invención reducen la melanina epidérmica en un sujeto, lo que significa que los compuestos y composiciones de la presente invención provocan una disminución en el nivel de melanina epidérmica en el sujeto. El término "reducir" y las variaciones gramaticales del mismo pueden significar, por ejemplo, disminuir el nivel de un fenómeno o especie dados en al menos un 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %.

Como se usa en la presente, el término "poner en contacto" y las variaciones gramaticales del mismo se refieren a llevar dos o más materiales lo suficientemente cerca para que puedan interactuar. Por tanto, solo con fines ilustrativos, un compuesto de la presente invención puede ponerse en contacto con un melanocito, por ejemplo, interactuando con un receptor en la superficie del melanocito. De forma similar, una composición de la presente invención puede entrar en contacto con un sujeto humano, por ejemplo, aplicándose directamente sobre la piel del sujeto.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto" significa una célula, tejido, organismo o poblaciones de mamífero de los mismos. Los sujetos de la presente invención son preferiblemente humanos, incluidas células, tejidos y seres humanos, pero por lo demás incluyen primates, animales de granja, animales domésticos, animales de laboratorio y similares. Algunos ejemplos de animales agrícolas incluyen vacas, cerdos, caballos, cabras y similares. Algunos ejemplos de animales domésticos incluyen perros, gatos y similares. Algunos ejemplos de animales de laboratorio incluyen primates, ratas, ratones, conejos, cobayas y similares.

Como se usa en este documento, un sujeto "que necesita" una mejora en la hiperpigmentación causada por un trastorno de hiperpigmentación incluye sujetos con una necesidad real o percibida de mejora.

Como se usa en la presente, los términos “tratar”, “que trata”, “tratamiento” y variaciones gramaticales de los mismos significan someter a un individuo sujeto a un protocolo, régimen, procedimiento o remedio, en el que se desea obtener una respuesta o resultado fisiológico en ese sujeto, por ejemplo, un paciente. En particular, los compuestos para su uso en métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse para retardar el desarrollo de síntomas de enfermedad o retrasar el inicio de la enfermedad o condición, o detener la progresión del desarrollo de enfermedad. Sin embargo, debido a que cada sujeto tratado puede no responder a un protocolo, régimen, procedimiento o remedio de tratamiento particular, el tratamiento no requiere que se logre la respuesta fisiológica deseada o el resultado en todos y cada uno de los sujetos o población de sujetos, por ejemplo, la población de pacientes. Por consiguiente, un sujeto o una población de sujetos determinados, por ejemplo, una población de pacientes, puede no responder o responder inadecuadamente al tratamiento.

Como se usa en la presente, los términos "prevenir", "que previene", "prevención" y variaciones gramaticales de los mismos significan que los compuestos de la presente invención son útiles cuando se administran a un paciente al que no se le ha diagnosticado posiblemente el trastorno o enfermedad en el momento de la administración, pero que normalmente se espera que desarrolle el trastorno o la enfermedad o que tenga un mayor riesgo de padecer el trastorno o la enfermedad. Los compuestos y composiciones de la invención, por ejemplo, retrasan el desarrollo del trastorno o los síntomas de la enfermedad, retrasan la aparición del trastorno o la enfermedad o evitan que el individuo desarrolle el trastorno o la enfermedad. La prevención también incluye la administración de los compuestos de la invención a aquellos individuos que se cree que están predispuestos al trastorno o enfermedad debido a la edad, antecedentes familiares, anomalías genéticas o cromosómicas y/o debido a la presencia de uno o más marcadores biológicos del trastorno o enfermedad.

Como se usa en la presente, el término "promover" y las variaciones gramaticales del mismo significan dejar, mejorar, permitir, facilitar, fomentar, estimular, inducir o ayudar de otro modo a lograrlo.

Como se usa en la presente, el término "producir" y las variaciones gramaticales del mismo significan hacer que suceda, ocurra o llegue a existir un resultado particular. A modo de ejemplo no limitativo, los compuestos y composiciones de la presente invención producen un efecto fotoprotector o protector UV en un sujeto.

Como se usa en la presente, el término "eritema" se refiere al enrojecimiento de la piel. El eritema puede deberse a dilatación y/o irritación de los capilares superficiales. El término "eritema inducido por rayos UV" se refiere al enrojecimiento de la piel que se desarrolla como resultado de la exposición a los rayos UV. Como se usa en la presente, "quemaduras solares" y variaciones gramaticales de las mismas se refieren a eritema inducido por UV causado por exposición a fuentes UV solares o artificiales (por ejemplo, camas de bronceado).

Como se usa en el presente documento, el término "hiperpigmentación" se refiere generalmente a un área de la piel en la que la pigmentación es mayor que la de un área adyacente de la piel (por ejemplo, una mancha de pigmento, mancha de la edad, lunar y similares). La hiperpigmentación de la presente invención incluye, pero no se limita a, hiperpigmentación regional por hiperactividad melanocítica, otra hiperpigmentación localizada por hiperactividad y proliferación melanocítica benigna, hiperpigmentación relacionada con enfermedades e hiperpigmentaciones accidentales tales como las debidas a fotosensibilización, composición genética, ingestión química, u otra exposición (por ejemplo, exposición a rayos ultravioleta), edad y cicatrización poslesional. Como se usa en la presente, "hiperpigmentación inducida por UV" se refiere a cualquier hiperpigmentación causada por la exposición a UV natural o artificial.

Como se usa en la presente, el término "hipopigmentación" se refiere generalmente a un área de la piel en la que la pigmentación es menor que la de un área adyacente de la piel. La hipopigmentación de la presente invención incluye, pero sin limitación, vitiligo, despigmentación, pitiriasis alba, hipopigmentación focal, hipopigmentación posinflamatoria, piebaldismo, albinismo, tiña versicolor, fotosensibilidad, leucismo, hipomelanosis, dermatitis atópica, psoriasis y similares.

Como se usa en la presente, "daño cutáneo inducido por UV" significa daño cutáneo resultante de la exposición a UV, incluidos UVA, UVB y UVC. El daño cutáneo inducido por UV de la presente invención incluye, pero no se limita a, arrugas, hiperpigmentación, displasias, queratosis actínica y cánceres de piel.

Como se usa en la presente, "envejecimiento de la piel inducido por UV" significa envejecimiento de la piel resultante de la exposición a los rayos UV, incluidos los rayos UVA, UVB y UVC. El envejecimiento de la piel inducido por rayos UV de la presente invención se manifiesta como, por ejemplo, arrugas, líneas finas, manchas de la edad, lunares, sequedad, delgadez o elasticidad reducida de la piel, tono desigual de la piel y otras reducciones en la luminosidad y textura de la piel, elasticidad, firmeza, flacidez y claridad causadas, en su totalidad o en parte, por la exposición a los rayos UV.

Como se usa en la presente, el término "fotoprotector" y variaciones gramaticales del mismo, cuando se usa para describir los efectos de los compuestos y composiciones de la presente invención, significa que el compuesto y las composiciones descritas en este documento previenen y/o mitigan el daño causado por la luz, particularmente la luz solar. Asimismo, los "agentes fotoprotectores" de la presente invención son aquellos compuestos y composiciones descritos aquí que previenen y/o mitigan el daño causado por la luz, particularmente la luz solar.

Como se usa en la presente, el término “protección contra UV” y variaciones gramaticales de este, cuando se usa para describir los efectos de los compuestos y composiciones de la presente invención, significa que el compuesto y las composiciones descritas en este documento previenen y/o mitigan el daño causado por luz ultravioleta (“UV”). Asimismo, los "agentes protectores de UV" de la presente invención son aquellos compuestos y composiciones descritos en la presente que previenen y/o mitigan el daño causado por los rayos UV. La luz ultravioleta de la presente invención incluye, por ejemplo, UVA (320-240 nm), UVB (290-320 nm) y UVC (200-290 nm).

Como se usa en la presente, el término "filtrar" y las variaciones gramaticales del mismo significan bloquear, reflejar, absorber o dispersar los rayos UV. Los "agentes de protección solar" de la presente invención incluyen todos los compuestos y composiciones de la presente invención que bloquean, reflejan, absorben o dispersan los rayos UV.

Como se usa en la presente, el término "absorber" y las variaciones gramaticales del mismo significan absorber UV o convertir UV en energía térmica. A modo de ejemplo no limitativo, los compuestos y composiciones de la presente invención pueden absorber UV y, como resultado, irradiar energía térmica a su entorno.

Tal como se usa en la presente, el término "reflejar" y las variaciones gramaticales del mismo, cuando se usan en el contexto de los rayos UV, significan arrojar o rebotar los rayos UV sin absorberlos.

Como se usa en la presente, el término "composición" significa una entidad que comprende uno o más compuestos de la presente invención, así como cualquier entidad que resulte, directa o indirectamente, de combinaciones de uno o más compuestos de la presente invención con otros ingredientes. Las composiciones de la presente invención se pueden usar como, por ejemplo, reactivos de investigaciónin vitrooin vivo. Las composiciones de la presente invención también se pueden aplicar directamente a la piel de un sujeto humano o no humano para obtener un efecto cosmético o farmacéutico. Adicionalmente, las composiciones de la presente invención comprenden uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Una composición de la presente invención puede administrarse de cualquier manera deseada y eficaz tanto para aplicacionesin vitrocomoin vivo: para ingestión oral o para administración parenteral u otra de cualquier manera apropiada, como intraperitoneal, subcutánea, tópica, intradérmica, inhalación, intrapulmonar, rectal, vaginal, sublingual, intramuscular, intravenoso, intraarterial, intratecal o intralinfático. Además, una composición de la presente invención puede administrarse junto con otras composiciones. Una composición de la presente invención puede encapsularse o protegerse de otro modo contra secreciones gástricas u otras, si se desea.

Las composiciones de la invención comprenden uno o más ingredientes activos mezclados con uno o más vehículos cosmética o farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros compuestos, ingredientes y/o materiales. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos y composiciones de la presente invención se formulan en formas de dosificación cosmética o farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los vehículos, diluyentes y portadores cosmética o farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen materiales adecuados para el contacto con los tejidos de humanos y no humanos sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas. Los vehículos, diluyentes y portadores cosmética o farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier sustancia sustancialmente no tóxica convencionalmente utilizable, por ejemplo, para la administración tópica, oral, peritoneal o subcutánea de cosméticos o productos farmacéuticos en los que los compuestos y composiciones de la presente invención permanecerán estables y biodisponible cuando se aplica, ingiere, inyecta o administra de otro modo a un sujeto humano o no humano. Los vehículos cosmética o farmacéuticamente aceptables adecuados para aplicación tópica son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen líquidos, cremas, aceites, lociones, ungüentos, geles o sólidos cosmética o farmacéuticamente aceptables, tales como cremas cosméticas de noche convencionales, cremas de base, bronceadores, protectores solares, lociones para manos, maquillaje y bases de maquillaje, mascarillas y similares. Los vehículos adecuados para una forma de dosificación seleccionada y una vía de administración prevista son bien conocidos en la técnica, y los vehículos aceptables para una forma de dosificación y un método de administración elegidos pueden determinarse utilizando el estado de la técnica.

Las composiciones de la presente invención pueden contener otros ingredientes convencionales en cosmética incluyendo perfumes, estrógenos, vitaminas A, C y E, alfa-hidroxi o alfa- ceto ácidos tales como los ácidos pirúvico, láctico o glicólico, lanolina, vaselina, aloe vera, metil o propil parabeno, pigmentos y similares. Los vehículos, diluyentes y portadores cosmética o farmacéuticamente aceptables no limitantes de la presente invención incluyen azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol), almidones, preparaciones de celulosa, fosfatos de calcio (por ejemplo, fosfato dicálcico, fosfato tricálcico e hidrógeno fosfato de calcio), citrato de sodio, agua, soluciones acuosas (por ejemplo, solución salina, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de lactato de Ringer), alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol propílico y alcohol bencílico), polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), ésteres orgánicos (por ejemplo, oleato de etilo y triglicéridos), polímeros biodegradables (por ejemplo, poliláctido-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos)), matrices elastoméricas, liposomas, microesferas, aceites (por ejemplo, maíz, germen, oliva, ricino, sésamo, semilla de algodón y maní), manteca de cacao, ceras (por ejemplo, ceras para supositorios), parafinas, siliconas, talco, silicilato y similares.

Las composiciones de la invención pueden, opcionalmente, contener ingredientes y/o materiales adicionales comúnmente usados en composiciones cosméticas. Estos ingredientes y materiales se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, (1) rellenos o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, almidón glicolato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio reticulada y carbonato de sodio; (5) agentes retardadores de la solución, tal como parafina; (6) aceleradores de absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicol sólido, y laurilsulfato de sodio; (10) agentes de suspensión, tales como alcoholes isostearílicos etoxilados, sorbitol de polioxietileno y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto; (11) agentes amortiguadores; (12) excipientes, tales como lactosa, azúcares con leche, polietilenglicol, grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, manteca de cacao, almidones, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, salicilato, óxido de zinc, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio, y poliamida en polvo; (13) diluyentes inertes, tales como agua u otros disolventes; (14) conservantes; (15) agentes tensoactivos; (16) agentes dispersantes; (17) agentes de liberación de control o de retardo en la absorción, tal como hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, polímeros biodegradables, liposomas, microesferas, monoestearato de aluminio, gelatina, y ceras; (18) agentes opacificantes; (19) adyuvantes; (20) agentes humectantes; (21) agentes emulsionantes y de suspensión; (22), agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, frutos secos, maíz, germen de trigo, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicol y ésteres de ácidos grasos de sorbitán; (23) propulsores, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano; (24) antioxidantes; (25) agentes que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, tales como azúcares y cloruro de sodio; (26) agentes espesantes; (27) materiales de revestimiento, tal como lecitina; y (28) agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Cada uno de esos ingredientes o materiales debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el sujeto. Los ingredientes y materiales adecuados para una forma de dosificación seleccionada y una vía de administración prevista son bien conocidos en la técnica, y los ingredientes y materiales aceptables para una forma de dosificación y un método de administración elegidos pueden determinarse utilizando el estado de la técnica.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, tabletas, polvos, gránulos, una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, emulsión líquida aceite en agua o agua en aceite, un elixir o jarabe, una pastilla, un bolo, un electuario o una pasta. Estas formulaciones se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de recubrimiento, mezclado, granulación o liofilización.

Se pueden preparar formas de dosificación sólidas para administración oral (cápsulas, tabletas, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), por ejemplo, mezclando el ingrediente o los ingredientes activos con uno o más vehículos cosmética o farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más rellenos, extensores, aglutinantes, humectantes, agentes desintegrantes, agentes retardadores de la solución, aceleradores de la absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes y/o agentes colorantes. Pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando un excipiente adecuado. Una tableta puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar usando un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante, tensoactivo o agente dispersante adecuados. Las tabletas moldeadas se pueden fabricar moldeándolos en una máquina adecuada. Las tabletas y otras formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, píldoras y gránulos, se pueden marcar o preparar opcionalmente con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación cosmética. También se pueden formular para que proporcionen una liberación lenta o controlada del ingrediente activo que contienen. Pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen el ingrediente activo solo, o preferentemente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. El ingrediente activo también puede estar en forma microencapsulada.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires cosmética o farmacéuticamente aceptables. Las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes adecuados comúnmente usados en la técnica. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones pueden contener agentes de suspensión.

Las composiciones de la presente invención para la administración rectal o vaginal pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar mezclando uno o más ingredientes activos con uno o más vehículos no irritantes adecuados que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derretirá en el recto o en la cavidad vaginal y liberará el compuesto activo. Las composiciones de la presente invención que son adecuadas para la administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen tales vehículos cosmética o farmacéuticamente aceptables que se sabe que son apropiados en la técnica.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches, gotas, emulsiones, suspensiones, aerosoles e inhalantes. Se pueden añadir a la formulación cualesquiera vehículos convencionales, auxiliares y opcionalmente otros ingredientes activos. Los auxiliares preferidos proceden del grupo que comprende conservantes, antioxidantes, estabilizadores, solubilizantes, vitaminas, colorantes, mejoradores del olor, formadores de película, espesantes y humectantes.

Las soluciones y emulsiones pueden comprender los vehículos convencionales, tales como disolventes, solubilizantes y emulsionantes, por ejemplo agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilglicol, aceites, en particular aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos de glicerol, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, o mezclas de estas sustancias.

Las emulsiones pueden existir en varias formas. Así, pueden ser, por ejemplo, una emulsión o microemulsión del tipo agua en aceite (W/O) o del tipo aceite en agua (O/W), o una emulsión múltiple, por ejemplo del tipo agua en aceite en agua (W/O/W).

Las composiciones según la invención también pueden presentarse en forma de preparaciones dispersas, exentas de emulsionantes. Pueden ser, por ejemplo, hidrodispersiones o emulsiones de Pickering.

Las suspensiones pueden comprender vehículos convencionales, tales como diluyentes líquidos, por ejemplo agua, etanol o propilenglicol, medios de suspensión, por ejemplo alcoholes isoestearílicos etoxilados, ésteres de polioxietilensorbitol y ésteres de polioxietilensorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias.

Las pastas, pomadas, geles y cremas pueden comprender vehículos convencionales, por ejemplo grasas animales y vegetales, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de estas sustancias.

Los aceites faciales y corporales pueden comprender los vehículos convencionales, tales como aceites sintéticos, tales como ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, aceites de silicona, aceites naturales, tales como aceites vegetales y extractos de plantas oleosas, aceites de parafina, aceites de lanolina o mezclas de estas sustancias.

Los aerosoles pueden comprender los propulsores convencionales, por ejemplo, clorofluorocarbonos, propano/butano o dimetiléter.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para administraciones parenterales comprenden uno o más compuestos en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles cosmética o farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones inyectables estériles o dispersiones justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, solutos adecuados que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido, o agentes de suspensión o espesantes. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensoactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes adecuados, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos. Además, se puede producir una absorción prolongada de la forma cosmética inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción.

En algunos casos, para prolongar el efecto, es deseable ralentizar su absorción por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr por el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con deficiente solubilidad en agua.

La velocidad de absorción del agente/fármaco activo depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una composición administrada por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo la composición activa en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se pueden preparar formando matrices de microencapsula del ingrediente activo en polímeros biodegradables. Dependiendo de la relación del ingrediente activo al polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del ingrediente activo. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias.

Las composiciones de la presente invención pueden presentarse en contenedores sellados de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada que requiere solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

En la presente invención, el término "forma cristalina" significa la estructura cristalina de un compuesto. Un compuesto puede existir en una o más formas cristalinas, que pueden tener diferentes características estructurales, físicas, farmacológicas o químicas. Se pueden obtener diferentes formas cristalinas usando variaciones en la nucleación, cinética de crecimiento, aglomeración y rotura. La nucleación se produce cuando se supera la barrera de energía de transición de fase, lo que permite que se forme una partícula a partir de una solución sobresaturada. El crecimiento de cristales es el agrandamiento de las partículas de cristal causado por la deposición del compuesto químico en una superficie existente del cristal. La tasa relativa de nucleación y crecimiento determina la distribución del tamaño de los cristales que se forman. La fuerza impulsora termodinámica tanto para la nucleación como para el crecimiento es la sobresaturación, que se define como la desviación del equilibrio termodinámico. La aglomeración es la formación de partículas más grandes a través de dos o más partículas (por ejemplo, cristales) que se pegan y forman una estructura cristalina más grande.

El término "hidrato", como se usa en la presente, significa una forma sólida o semisólida de un compuesto químico que contiene agua en un complejo molecular. El agua se encuentra generalmente en una cantidad estequiométrica con respecto al compuesto químico.

Como se usa en la presente, "sal cosmética o farmacéuticamente aceptable" se refiere a un derivado de los compuestos descritos en la presente en el que los compuestos se modifican haciendo sales ácidas o básicas de los mismos. Los ejemplos de sales cosmética o farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales Por ejemplo, tales sales incluyen sales de amoniaco, L-arginina, betaína, benetamina, benzatina, hidróxido de calcio, colina, deanol, dietanolamina (2,2'-iminobis(etanol)), dietilamina, 2-(dietilamino)-etanol, 2-aminoetanol, etilendiamina, N-etil-glucamina, hidrabamina, 1H-imidazol, lisina, hidróxido de magnesio, 4-(2-hidroxietil)-morfolina, piperazina, hidróxido de potasio, 1-(2-hidroxi-etil)-pirrolidina, hidróxido de sodio, trietanolamina (2,2',2"-nitrilotris(etanol)), trometamina, hidróxido de zinc, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido L-aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 2,5-dihidroxibenzoico, ácido 4-acetamido-benzoico, ácido (+)-canforico, ácido (+)-alcanfor-10-sulfónico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido decanoico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxi-etanosulfónico, ácido etilendiamonotetraacético, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galárico, ácido gentésico, ácido D-glucoheptónico, ácido D-glucónico, ácido D-glucurónico, ácido glutámico, ácido glutántico, ácido glutárico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfórico, glicina, ácido glicólico, ácido hexanoico, ácido hipúrico, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico ácido isobutírico, ácido DL-láctico, ácido lactobónico, ácido láurico, lisina, ácido maleico, ácido (-)-L-málico, ácido malónico, ácido DL-mandélico, ácido metanosulfónico, ácido galactárico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido octanoico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico (ácido embónico), ácido fosfórico, ácido propiónico, ácido (-)-L-piroglutámico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tánico, ácido (+)-L-tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico y ácido undecilénico. Se pueden formar otras sales cosmética o farmacéuticamente aceptables con cationes de metales como aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, zinc y similares.

Las sales cosmética o farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden sintetizarse a partir de un compuesto descrito en la presente que contiene un radical básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad suficiente de la base o ácido apropiado en agua o en un diluyente orgánico como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo, o un mezcla de los mismos.

Se prevé que los compuestos y composiciones de la presente invención puedan incluirse en composiciones cosméticas o farmacéuticas para aplicaciones tantoin vitrocomoin vivo.

Se prevé que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluidos uno o más compuestos enumerados dentro del alcance de la reivindicación 1 enumerado en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable del mismo, se puedan coadministrar. a un sujeto para realizar los propósitos de modulación de la pigmentación de la piel de la presente invención.

También se prevé que las composiciones de la presente invención pueden comprender uno o más de los compuestos que forman parte del alcance de la reivindicación 1 enumerados en la Tabla 5, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de estos.

Además, se prevé que los compuestos de la presente invención como se definen en la reivindicación1 incluyen compuestos producidos porMalassezia, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable del mismo. Además, se prevé que las composiciones y métodos de la presente invención pueden involucrar uno o más compuestos producidos porMalassezia, o un análogo químico, forma cristalina, hidrato o sal farmacéutica o cosméticamente aceptable del mismo.

Se prevé además que los métodos de la presente invención pueden implicar la coadministración de dos o más compuestos y/o composiciones de la presente invención para realizar los propósitos de modulación de la pigmentación de la piel descritos en la presente.

Los compuestos y composiciones coadministrados de la presente invención pueden, por ejemplo, ponerse en contacto con un sujeto sustancialmente al mismo tiempo o uno tras otro.

Las composiciones de la presente invención que contienen uno o más compuestos derivados deMalasseziao análogos químicos de los mismos pueden demostrar efectos sinérgicos sobre los compuestos componentes solos en varios criterios de eficacia, que incluyen, entre otros, la viabilidad media del tejido, la concentración de melanina, el brillo de la piel, el oscurecimiento de la piel y modulación de la melanogénesis o concentración de melanina.

La terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no pretende ser limitativa. Como se usa en la descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el”, “la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.

Para la enumeración de intervalos numéricos en la presente, se contempla explícitamente cada número intermedio entre ellos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo de 6.0-7.0, los números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 y 7.0 se contemplan explícitamente.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar más los métodos de la presente invención. Estos ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Aislamiento de compuestos producidos por Malassezia

La malassezina se aísla utilizando, por ejemplo, los procedimientos descritos en Wille et al., 2001. El protocolo se describe brevemente a continuación.

Medio

Se esteriliza un medio que consta de Tween 80 (30 ml), cicloheximida (0.5 g), cloranfenicol (0.05 g), agar (20 g) y un volumen de agua suficiente para una mezcla de 1000 ml y se mezcla con 0.3 % de L-triptófano estéril filtrado a una concentración de 0.3 % g a 50 °C. Las porciones de 10 ml se vierten en placas de petri de 10 cm y el pH se ajusta a 5.5 usando 0.1 M de HCl.

Cultivar Malassezia furfur y los compuestos aislantes producidos por el M. furfur

Malassezia furfurse frota en el medio descrito anteriormente y se incuba durante 14 días a 30 °C. El contenido de la placa de Petri se tritura y se extrae con acetato de etilo durante 12 horas. El extracto se filtra sobre lana de vidrio, se evapora a sequedad y se disuelve en metanol. A continuación, el extracto se fracciona mediante cromatografía en Sephadex LH-20 con metanol como eluyente. La separación adicional se realiza con cromatografía preparativa en capa fina con tolueno: formiato de etilo: ácido fórmico (10:5:3). Las zonas principales se dividen entre agua y acetato de etilo. Las fracciones se analizan para determinar la actividad de interés. Los compuestos de las fracciones de interés se aíslan mediante HPLC.

Síntesis de Malassezina y análogos químicos de Malassezina

La Malassezina se sintetiza de acuerdo con el protocolo establecido en Wille et al., 2001. Los análogos químicos de malassezina se sintetizan de acuerdo con nuevos protocolos de síntesis, así como los descritos en Winston-McPherson, et al., 2014.

Protocolos de detección

Los compuestos para aclarar la piel efectivos se evalúan usando protocolos de detección conocidos por los expertos en la técnica y métodos de detección novedosos. Por ejemplo, la malassezina y sus análogos químicos se evalúan mediante un bioensayo de tirosinasa, como se describió anteriormente. Se utilizan otros protocolos de detección que implican modelos de tejido in vivo e in vitro, incluidos los ensayos de unión del receptor de hidrocarburo de arilo (AhR).Bioensayo de tirosinasa

Los bioensayos de tirosinasa se realizan como se describe en Wille et al., 2001. Brevemente, L-DOPA se mezcla con enzima tirosinasa. La extinción se mide durante 1 minuto, lo que indica la formación de dopaquinona. Usando, por ejemplo, las fracciones discutidas anteriormente, estas fracciones se disuelven en DMSO y se agregan directamente a la reacción de tirosinasa, con DMSO puro como un control. La actividad inhibidora de la tirosinasa se mide como un aumento reducido de la extinción en comparación con el control.

Ensayo de unión del receptor de arilhidrocarburos

Los ensayos de unión de AhR se realizan de acuerdo con el protocolo descrito en, por ejemplo, Song, et al., 2002. Brevemente, los AhR humanos y murinos se expresanin vitrousando, por ejemplo, una reacción de sistemas de lisado de reticulocitos acoplados rápidamente TnT (Promega, Madison, WI). Los estudios de unión del ligando receptor utilizan la velocidad de sedimentación en gradientes de sacarosa como se describe en Karchner, et al., 1999.

Ensayo EROD

Los compuestos, composiciones y formulaciones de la presente invención también se evalúan usando el ensayo de etoxiresorufina-O-deetilasa (EROD) conocido por los expertos en la técnica. (Donato,et al., 1993; Whyte,et al., 2000; Willeet al., 2001).

Ensayos de apoptosis de melanocitos

Los compuestos candidatos se evalúan para determinar la actividad inductora de apoptosis en melanocitos. Los melanocitos epidérmicos humanos se cultivan en Medio 254 complementado con Suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS) (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA) o Medio basal de células dérmicas (ATCC, Manassas, VA). Los componentes adicionales de los medios de crecimiento de melanocitos humanos pueden incluir, entre otros, insulina (5 μg/ml), ácido ascórbico (50 μg/ml), L-glutamina (6 mM), epinefrina (1.0 μM) y cloruro de calcio (0.2 mM). Los cultivos de melanocitos humanos se mantienen a 37 °C en 5 % de CO2.

Los compuestos candidatos se diluyen en DMSO y se mezclan directamente en cultivos de melanocitos. Se utilizan como controles volúmenes equivalentes de DMSO puro. Los ensayos de citotoxicidad conocidos por los expertos en la técnica se realizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos de citotoxicidad que se utilizan en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ensayo de citotoxicidad verde CellTox™, ensayos de caspasa fluorescente Apo-ONE, ensayo de ApoTox-Glo™ y ensayos de Caspase-Glo® (Promega, Madison, WI). La detección de fluorescencia se logra usando FACS estándar o ensayos de microscopía conocidos por los expertos en la técnica, incluidos los descritos en Krämer, et al., 2005.

Se utilizan medios adicionales para evaluar la apoptosis, incluidos los análisis FACS para la anexina V e inmunoelectrotransferencia para la expresión de caspasa-9. La inmunoelectrotransferencia se realiza según métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Ensayos de xenoinjerto de ratón

Los modelos de xenoinjerto de ratón de piel humana se generan de acuerdo con protocolos conocidos en la técnica. (Black,et al., 1985; Manninget al., 1973; Reed,et al., 1973; Plenat,et al., 1992; Scottet al., 1998; Otulakowski,et al., 1994). Una vez establecidos, los modelos de xenoinjerto de ratón se exponen a compuestos de la presente invención y se observan cambios en la pigmentación en comparación con los controles. Los cambios en la pigmentación de la piel se evalúan usando varias escalas de pigmentación conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la prueba de tipificación cutánea de Fitzpatrick y la escala de hiperpigmentación de Taylor. (Taylor,et al., 2005).

Ensayos humanos

Los compuestos, composiciones y formulaciones de la presente invención se aplican a seres humanos, por ejemplo, sobre piel humana, y se comparan con sustancias de control. Los cambios en la pigmentación de la piel se evalúan usando varias escalas de pigmentación conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la prueba de tipificación cutánea de Fitzpatrick y la escala de hiperpigmentación de Taylor.

Ejemplo 2

Objetivo bioquímico de la Malassezina y sus análogos

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención exhiban, por ejemplo, inhibición de tirosinasa y actividad agonista de AhR comparable a malassezina. Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención exhiban, por ejemplo, una inhibición de tirosinasa más potente y un agonismo de AhR más fuerte en comparación con malassezina. Asimismo, se espera que algunos de los compuestos y composiciones de la presente invención sean inhibidores de tirosinasa y agonistas de AhR menos eficaces que malassezina. Tales compuestos, composiciones y formulaciones pueden tener perfiles de toxicidad más favorables en comparación con compuestosEjemplo 3

Eficacia in vitro

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención induzcan la apoptosis de los melanocitos y modulen la actividad de los melanocitos, la producción de melanina, la biogénesis de melanosomas y/o la transferencia de melanosomas al menos tan potente como malassezina. También se contempla que algunos de los compuestos y composiciones de la presente invención afectarán estos procedimientos biológicos de forma menos potente que malassezina. Tales compuestos y composiciones pueden tener perfiles de toxicidad más favorables en comparación con especies más potentes.

Ejemplo 4

Eficacia in vivo

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención sean al menos tan eficaces como malassezina para iluminar la piel y mejorar la hiperpigmentación causada por trastornos de hiperpigmentación. Se espera además que los compuestos y composiciones de la presente invención presenten perfiles farmacocinéticos favorables en términos de, por ejemplo, vida media y absorción. Ciertos compuestos exhibirán una vida media más larga, mientras que otros exhibirán una vida media más corta. De manera similar, ciertos compuestos exhibirán diferentes perfiles de absorción, con algunos compuestos que tardan más en absorberse completamente y otros que tardan menos tiempo en absorberse completamente.

Ejemplo 5

Síntesis de Malassezina y derivados de Malassezina

Se sintetizaron Malassezina ("CV-8684") y su derivado ciclado indolo[3,2-b]carbazol ("CV-8685") de acuerdo con el esquema mostrado en la Figura 2A.

Síntesis de (2-yodo-fenil)carbamato de terc-butilo, compuesto 1

A una solución de 2-yodo-anilina (25.0 g, 0.114 mol) en tetrahidrofurano (250 ml) a 0 °C se añadió LiHMDS (251.0 ml, 1 M en THF, 0.251 mol) lentamente mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 40 min. Después de 30 min de agitación a 0 °C, se añadió lentamente una solución de anhídrido BOC (27.0 g, 0.125 mol) en THF (50 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 ºC durante 40 min. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. Se añadió NH4Cl saturado (250 ml) para detener la reacción. La capa orgánica se separó y se lavó con agua (150 ml). La capa acuosa combinada se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml) y las capas se separaron. La capa de acetato de etilo se combinó con la capa orgánica original y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (0-5 % de acetato de etilo/hexanos). El compuesto1se obtuvo como un líquido amarillo claro (29.0 g, 80 %).

Síntesis del compuesto 2

Se añadió yoduro de cobre (0.95 g, 10 % mol) y PdCl2(PPh3)4(1.75 g, 5 % mol) a una solución desgasificada del compuesto1(16.0 g, 0.05 mol), propargil metil éter (4.25 g, 0.06 mol) en trietilamina (200 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción se completó (monitoreada por TLC usando 10 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (300 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto2se obtuvo como un líquido amarillo claro (13.0 g, 99 %).

Síntesis del compuesto 3

A un matraz secado al horno se añadió PtCl2 (0.26 g, 0.001 mol), Na2CO3 (1.6 g, 0.015 mol), indol (2.32 g, 0.02 mol) y compuesto2(2.6 g, 0.01 mol) en dioxano (120 ml). El matraz se desgasificó con nitrógeno, se selló y se calentó a 100 ºC durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 10 % de acetato de etilo/hexanos). El disolvente se evaporó a presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (200 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón.

Esta reacción se repitió usando el compuesto2(2.6 g, 0.01 mol) en lotes diferentes. Ambos lotes de compuestos brutos se combinaron y purificaron mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto3se obtuvo como un sólido de color marrón claro (3.8 g, 55 %).

Síntesis del compuesto 4

Se añadió carbonato de potasio (4.6 g, 0.0329 mol) a una solución del compuesto3(3.8 g, 0.0109 mol) en una mezcla de metanol (150 ml) y agua (50 ml) a temperatura ambiente. La suspensión resultante se calentó a reflujo durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua y salmuera, luego se secó (sulfato de sodio), se filtró y el disolvente se concentró al vacío para dar un sólido marrón. Compuesto bruto purificado mediante cromatografía en columna (20 % acetato de etilo/hexano. El compuesto4se obtuvo como un sólido de color naranja (2.2 g, 81 %).

Síntesis del compuestoMalassezina (CV-8684)

Se añadió dimetilformamida (20 ml) a un matraz seco de fondo redondo de dos bocas de 100 ml en argón a 0 ºC. Se añadió POCl3(0.75 g, 0.0048 mol) lentamente mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 10 min. Después de 30 minutos de agitación a 0 °C, se añadió lentamente una solución del compuesto4(1.0 g, 0.004 mol) en dimetilformamida (5 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 ºC durante 10 min. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (150 ml) y se agitó durante 1 hora. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron y lavaron con agua, NaCl saturado y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar un sólido marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (0-20 % de acetato de etilo/hexanos). Se obtuvo el compuestoMalassezina (CV-8684)como un sólido rosa claro (0.82 g, 74 %).

Pureza por HPLC: 97.8 % (% de área). Espectro de<1>H-RMN,<13>C consistente con la estructura. ESI-EM: Calculado para: C18H15N2O (M H)+: 275, encontrado: 275.2

Síntesis del compuestoindolo[3,2-b]carbazol (CV-8685).

Se añadió HCl concentrado (0.25 ml) a una solución demalassezina(0.75 g) en tetrahidrofurano (120 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 40 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. Se filtró el sólido, se lavó con tetrahidrofurano (20 ml) y se secó para darindolo[3,2-b]carbazol (CV-8685)sólido amarillo claro (0.55 g, 78 %).

Pureza por HPLC: 96.22 % (% de área). Espectro de<1>H-RMN,<13>C consistente con la estructura. ESI-EM: Calculado para: C18H13N2(M H)+: 257, encontrado: 257.5.

El compuesto I ("CV-8686") y el compuesto IV ("CV-8687") se sintetizaron de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 2B.

Síntesis del compuesto5

A un matraz secado al horno se añadió PtCl2 (1.0 g, 0.0038 mol), Na2CO3 (6.1 g, 0.057 mol), 6-metil indol (10.0 g, 0.076 mol) y el compuesto2(10.0 g, 0.038 mol) en dioxano (250 ml). El matraz se desgasificó con nitrógeno, se selló y se calentó a 100 ºC durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 10 % de acetato de etilo/hexanos). El disolvente se evaporó a presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (400 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón. Compuesto bruto purificado mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto5se obtuvo como un sólido de color marrón claro (6.5 g, 47 %).

Síntesis del compuesto6

Se añadió carbonato de potasio (7.4 g, 0.054 mol) a una solución del compuesto5(6.5 g, 0.018 mol) en una mezcla de metanol (150 ml) y agua (50 ml) a temperatura ambiente. La suspensión resultante se calentó a reflujo durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua y salmuera, luego se secó (sulfato de sodio), se filtró y el disolvente se concentró al vacío para dar un sólido marrón. Compuesto bruto purificado mediante cromatografía en columna (20 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto6se obtuvo como un sólido de color naranja (3.3 g, 72 %).

Síntesis del compuestocompuesto I (CV-8686)

Se añadió dimetilformamida (20 ml) a un matraz seco de fondo redondo de dos bocas de 100 ml en argón a 0 ºC. Se añadió lentamente POCl3(0.6 g, 0.0038 mol) mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 10 min. Después de 30 minutos de agitación a 0 °C, añadió lentamente una solución del compuesto6(1.0 g, 0.0038 mol) en dimetilformamida (5 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 ºC durante 10 min. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (150 ml) y se agitó durante 1 hora. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron y lavaron con agua, NaCl saturado y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar un sólido marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (0-20 % de acetato de etilo/hexanos). Se obtuvo elcompuesto I (CV-8686)como un sólido rosa claro (0.84 g, 75 %).

Pureza por HPLC: 97.01 % (% de área). Espectro de<1>H-RMN,<13>C consistente con la estructura. ESI-EM: Calculado para: C19H17N2O (M H)+: 289, encontrado: 289.1

Síntesis del compuestocompuesto IV (CV-8687)

Se añadió HCl concentrado (0.3 ml) a una solución delcompuesto I(1.0 g) en tetrahidrofurano (125 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 40 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. Se filtró el sólido, se lavó con tetrahidrofurano (20 ml) y se secó para dar elcompuesto IV (CV-8687)sólido amarillo claro (0.84 g, 89 %).

Pureza por HPLC: 98.4 % (% de área). Espectro de<1>H-RMN,<13>C consistente con la estructura. ESI-EM: Calculado para: C19H15N2(M H)+: 271, encontrado: 271.3.

El compuesto II ("CV-8688") se sintetizó de acuerdo con el esquema mostrado en la Figura 2C.

Síntesis del compuesto7

Se añadió yoduro de cobre (0.53 g, 10 % mol) y PdCl2(PPh3)4(1.0 g, 5 % mol) a una solución desgasificada del compuesto1(9.0 g, 0.03 mol), 3-metoxi-1-butino (2.8 g, 0. 035 mol) en trietilamina (150 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se completó (se controló por TLC usando 10 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (300 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto 7 se obtuvo como un líquido amarillo claro (7.0 g, 90 %).

Síntesis del compuesto8

A un matraz secado al horno se añadió PtCl2 (0.68 g, 0.0025 mol), Na2CO3 (4.0 g, 0.038 mol), indol (6.0 g, 0.05 mol) y compuesto7(10.0 g, 0.025 mol) en dioxano (250 ml). El matraz se desgasificó con nitrógeno, se selló y se calentó a 100 ºC durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 10 % de acetato de etilo/hexanos). El disolvente se evaporó a presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (400 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón. Compuesto bruto purificado mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto8se obtuvo como un sólido de color marrón claro (3.5 g, 77 %).

Síntesis del compuesto9

Se añadió carbonato de potasio (3.8 g, 0.027 mol) a una solución del compuesto8(3.3 g, 0.0091 mol) en una mezcla de metanol (75 ml) y agua (25 ml) a temperatura ambiente. La suspensión resultante se calentó a reflujo durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua y salmuera, luego se secó (sulfato de sodio), se filtró y el disolvente se concentró al vacío para dar un sólido marrón. Compuesto bruto purificado mediante cromatografía en columna (20 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto9se obtuvo como un sólido de color naranja (2.1 g, 88 %).

Síntesis del compuestocompuesto II (CV-8688)

Se añadió dimetilformamida (20 ml) a un matraz seco de fondo redondo de dos bocas de 100 ml en argón a 0 ºC. Se añadió POCl3(0.76 g, 0.005 mol) lentamente mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 10 min. Después de 30 minutos de agitación a 0 °C, se añadió lentamente una solución del compuesto9(1.3 g, 0.005 mol) en dimetilformamida (5 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 ºC durante 10 min. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (150 ml) y se agitó durante 1 hora. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron y lavaron con agua, NaCl saturado y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar un sólido marrón. El compuesto crudo cristalizó en cloroformo (25 ml). Se obtuvo elcompuesto II (CV-8688)como un sólido rosa claro (0.81 g, 53 %).

Pureza por HPLC: 98.94 % (% de área). Espectro de<1>H-RMN,<13>C consistente con la estructura. ESI-EM: Calculado para: C19H17N2O (M H)+: 289, encontrado: 289.0.

Ejemplo 6

Morfología celular

La morfología celular típica después de varios tratamientos se muestra en las Figuras 5A-5K, 6A-6K, 7A-7K, 8A-8K, 9A-9K, 10A-10K, 11A-11K y 12A-12K. La morfología de ambas líneas celulares se vio afectada significativamente por 100 µM de CV-8684 y CV-8688, así como por el tratamiento con estaurosporina a las 6 horas. CV-8685 pareció afectar solamente a WM115 a 100 µM.

Ejemplo 7

Actividad inductora de apoptosis de Malassezina y derivados de Malassezina - ensayos preliminares de anexina V

Materiales y reactivos

El kit de ensayo de anexina V-FITC se adquirió de Beyotime Biotechnology, el medio RPMI 1640 y el medio Eagle modificado de Dulbecco ("DMEM") se adquirieron de Gibco, el suero fetal bovino ("FBS") se adquirió de Invitrogen, antibiótica antimicótica estabilizada (100x) se compró a Sigma, y 0.25 % de tripsina-EDTA (1X), rojo de fenol se compró a Invitrogen.

Cultivo celular

Las células MeWo (ATCC® HTB-65™) y WM115 (ATCC® CRL-1675) se compraron en ATCC (Manassas, VA) y se mantuvieron en lo siguiente: para MeWo: DMEM suplementado con 10 % de FBS; para WM115: RPMI 1640 suplementado con 10 % de FBS (10 % de FBS, 1 % de solución antibiótica antimicótica estabilizada).

Resumen del estudio

En las etapas intermedias de la apoptosis, la fosfatidilserina (“PS”) se transloca desde el interior al exterior de la valva de la membrana celular, exponiendo al PS al entorno extracelular, donde puede detectarse. Los conjugados de anexina V altamente fluorescentes proporcionan métodos de detección rápidos y fiables para estudiar la externalización de PS. Durante el primer conjunto de estudios, tanto las células MeWo como las WM115 se trataron con compuestos de prueba a 10 dosis a partir de 100 µM con una dilución de 3 veces. Se utilizó estaurosporina como control positivo. Después del tratamiento de 6 horas, se evaluó la apoptosis celular usando un ensayo de anexina V. Los compuestos de prueba evaluados fueron CV-8684, CV-8685, CV-8686, CV-8687, y CV-8688.

Procedimientos de ensayo

Para la siembra de células, se recolectaron las células y se determinó el número de células usando el contador de células Countess®. A continuación, las células se diluyeron con medio de cultivo hasta la densidad deseada. Se añadieron 40 µl de suspensión celular por pocillo al número requerido de pocillos en una placa de 384 pocillos (Corning 3712 - placa de fondo transparente). La densidad celular final fue de 6,000 células/pocillo. Después de la siembra en placa, las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2durante la noche.

Para la preparación de la placa de fuente de compuesto, cada compuesto de prueba se disolvió en DMSO hasta una solución madre 10 mM. Se realizó una dilución en serie de 3 veces usando un manipulador de líquidos EVO200™ (TECAN) para generar diez concentraciones del compuesto de prueba. Se empleó DMSO al 0.1 % como control (negativo) de vehículo. La placa fuente de compuesto se centrifugó luego a temperatura ambiente a 1,000 RPM durante 1 minuto y se agitó usando un agitador de placas durante 2 minutos.

Para el tratamiento del compuesto, se transfirieron 40 nl de compuesto desde la placa fuente del compuesto a la placa de cultivo de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos Echo550 (LabCyte Inc.). Después de 6 horas de incubación, las placas se retiraron de la incubadora para su detección.

Para el ensayo preliminar de anexina V, las placas se retiraron de la incubadora y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se eliminó el medio de cultivo. Se añadieron a cada pocillo 20 µl de anexina V-FITC premezclada y solución de trabajo de tinte Hoechst33342. A continuación, las células se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las placas se sellaron y centrifugaron durante 1 minuto a 1,000 RPM para eliminar las burbujas. Posteriormente, la placa se leyó utilizando un lector de placas Acumen eX3. La actividad relativa se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Actividad (%) = 100 % x (Conteoanexina V/Conteocélula total), y se calculó la EC50usando GraphPad Prism (v.5.01).

Resultados

En la detección preliminar discutida anteriormente, CV-8688 aumentó marcadamente la tinción de Anexina V de las células MeWo, con una EC50de 908.57 nM. La estaurosporina, el control positivo, aumentó considerablemente la tinción de Anexina V en ambas líneas celulares. (Figuras 3A-3M).

Ejemplo 8

Actividad inductora de apoptosis de Malassezina y derivados de Malassezina – evaluación adicional mediante ensayos de anexina V

Resumen del estudio

Para investigar más a fondo el impacto de los compuestos de prueba en la apoptosis, se llevaron a cabo múltiples lecturas, que cubren diferentes etapas de la apoptosis, tanto en células MeWo como WM115. Ambos tipos de células se trataron con compuestos de prueba a 3 dosis (100 µM, 10 µM y 1 µM). Se utilizó estaurosporina como control positivo. Después del período de tratamiento deseado (6, 24, 48 o 72 horas), se evaluó la apoptosis midiendo los porcentajes de células que demostraban la unión de la anexina V después de la exposición a los compuestos de prueba. Los compuestos de prueba evaluados fueron CV-8684, CV-8685 y CV-8688.

Procedimientos de ensayo

La siembra celular se realizó como se discutió anteriormente con las siguientes excepciones: la densidad celular final fue de 4,000 células/pocillo para detecciones de 6 horas y 24 horas, mientras que se usaron 2,000 células/pocillo para detecciones de 48 horas y 72 horas. Para cada punto de tiempo, se prepararon placas de fondo transparente de 384 pocillos (Corning 3712) y placas de fondo blancas sólidas (Corning 3570). Las placas se incubaron como se discutió anteriormente.

Para la preparación de la placa fuente de compuesto, cada compuesto de prueba se disolvió en DMSO hasta 10 mM de una solución madre. Dos concentraciones adicionales fueron generaciones por dilución de 10 veces a 1 mM y 0.1 mM. Se usó estaurosporina como control positivo y 1 % de DMSO como control de vehículo (negativo). La placa de origen del compuesto se centrifugó a temperatura ambiente a 1,000 rpm durante 1 minuto y se agitó usando un agitador de placas durante 2 minutos.

Se transfirieron 400 nL de compuesto de prueba desde la placa de origen del compuesto a placas de cultivo de 384 pocillos usando el manipulador de líquidos Echo550. Después de 6, 24, 48 y 72 horas, las placas se retiraron de la incubadora para las detecciones.

Para el ensayo de anexina V, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS. Se añadieron 20 µl de solución de trabajo de anexina V-FITC premezclada a cada pocillo. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las placas se leyeron usando Acumen eX3 para contar el número de células positivas a FITC. La actividad relativa se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Actividad relativa (%) = 100 % x (Conteomuestra/conteovehículo).Resultados

CV-8684 indujo apoptosis a la concentración más alta probada después de 6 horas de tratamiento en células MeWo y WM115. CV-8685 mostró el efecto de inducción dentro de 24 horas de tratamiento en WM115, mientras que 48 horas de tratamiento parecieron provocar apoptosis en ambos tipos de células. Finalmente, CV-8688 mostró el efecto de inducción dentro de las 6 horas posteriores al tratamiento de una manera dependiente de la dosis en ambos tipos de células. (Figuras 4A-4L).

Ejemplo 9

Viabilidad celular después de la exposición a Malassezina y derivados de Malassezina – ensayos CellTiter-Glo®Procedimientos de ensayo

El ensayo CellTiter-Glo® 2.0 se adquirió de Promega. La siembra celular, la preparación de la placa fuente del compuesto y la exposición de las células a los compuestos de prueba se realizaron como se describe en el Ejemplo 8.

Para el ensayo CellTiter-Glo®, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los reactivos CellTiter-Glo® se descongelaron y equilibraron a temperatura ambiente antes del experimento. A continuación, se añadieron 40 µl de reactivo CellTiter-Glo® a cada pocillo para la detección (en una proporción de 1:1 con respecto al medio de cultivo). A continuación, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se leyeron usando un lector de placas EnSpire (PerkinElmer). La actividad restante se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Actividad restante (%) = 100 % x (Lummuestra- Lumbkg)/(Lumvehículo- Lumbkg).

Resultados

CV-8684 mostró inhibición de la viabilidad celular dependiente de la dosis en ambas líneas celulares probadas, aunque el efecto inhibidor pareció ser más potente en las células MeWo. CV-8685 mostró el efecto inhibidor sobre la viabilidad de las células WM115 de una manera dependiente de la dosis solo después de un tratamiento de 24 horas. CV-8688 inhibió la viabilidad de ambos tipos de células de una manera dependiente de la dosis. La estaurosporina, el control positivo, ejerció una inhibición del 100 % de la viabilidad celular en ambas líneas celulares después de un tratamiento de 24 horas. (Figuras 13A-13K).

Ejemplo 10

Citotoxicidad de Malassezina y derivados de Malassezina –ensayos de liberación de lactato deshidrogenasaResumen del estudio

El ensayo de LDH mide cuantitativamente la lactato deshidrogenasa ("LDH") liberada al medio por las células dañadas como biomarcador de citotoxicidad y citólisis.

Procedimientos de ensayo

El ensayo de integridad de membrana homogénea CytoTox-ONE™ se adquirió de Promega. La siembra celular, la preparación de la placa fuente del compuesto y la exposición de las células a los compuestos de prueba se realizaron como se describe en el Ejemplo 8.

Para el ensayo de liberación de LDH, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, las placas se centrifugaron a 1,000 rpm durante 1 minuto. Se transfirieron 20 µl de medio de cultivo celular a una nueva placa sólida negra de 384 pocillos. Luego, se agregaron 20 µl de CytoTOX-ONE™ en cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, se añadieron 10 µl de solución de parada a cada pocillo y las placas se agitaron a 500 rpm durante 1 minuto. Las placas se leyeron usando una longitud de onda de excitación de 560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en EnSpire. La actividad relativa se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Actividad relativa (%) = 100 % x (Lummuestra– Lumbkg)/(Lumvehículo– Lumbkg).

Resultados

CV-8684 no indujo una liberación significativa en ninguna línea celular después de 72 horas de incubación. CV-8685 mostró un efecto de inducción dependiente de la dosis sobre la liberación de LDH de las células WM115, pero no MeWo, después de un tratamiento de 24 horas. CV-8688 indujo la liberación de LDH a la concentración más alta probada. (Figuras 14A-14L).

Ejemplo 11

Potencial de activación del receptor de arilhidrocarburos de Malassezina y derivados de MalassezinaProcedimientos de ensayo

Las células HepG2-AhR-Luc se adquirieron de Pharmaron, el sistema de ensayo de luciferasa One-Glo se adquirió de Promega, el DMEM se adquirió de Hyclone y la penicilina/estreptomicina se adquirió de Solabio.

Los medios de cultivo para células HepG2 transfectadas de manera estable se prepararon complementando DMEM con glucosa alta y L-glutamina, así como 10 % de FBS.

Se cultivaron células HepG2-AhR-Luc en matraces T-75 a 37 °C, 5 % de CO2y 95 % de humedad relativa. Se permitió que las células alcanzaran un 80-90 % de confluencia antes de la separación y división.

Las células cultivadas se aclararon con 5 ml de PBS. Se aspiró el PBS, se añadieron 1.5 ml de tripsina al matraz y las células se incubaron a 37 ºC durante aproximadamente 5 minutos o hasta que las células se desprendieron y flotaron. La tripsina se inactivó añadiendo un exceso de medio que contenía suero.

La suspensión celular se transfirió a un tubo cónico y se centrifugó a 120 g durante 10 minutos para sedimentar las células. Las células se resuspendieron en un medio de siembra a una densidad adecuada. Se transfirieron 40 µl de células a una placa de cultivo de 384 pocillos (5 x 10<3>células/pocillo). Las placas se colocaron en la incubadora a 37 °C durante 24 horas.

Posteriormente, se prepararon soluciones madre de compuestos de prueba y control positivo de omeprazol. Se transfirieron 40 nl de soluciones de compuesto a la placa de ensayo usando Echo550. A continuación, la placa se volvió a colocar en la incubadora para el tratamiento del compuesto.

Posteriormente, después de 24 horas de tratamiento, se sacó la placa de la incubadora y se dejó enfriar a temperatura ambiente. En cada pocillo se añadieron 30 µl de reactivo One-Glo igual al del medio de cultivo. Se permitió que las células se lisaran durante al menos 3 minutos y luego se midieron en un luminómetro.

Las respuestas a las dosis se representaron gráficamente utilizando el análisis de regresión no lineal en XLfit, y también se calcularon los valores de EC50.

Resultados

Los resultados del ensayo de AhR-Luciferasa se muestran en las Figuras 15A-15F.

Ejemplo 12

Ensayos MelanoDerm™

Resumen del estudio

El propósito de este estudio es evaluar la posible irritación dérmica del artículo de prueba para el modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas para la selección de dosis para un estudio posterior. La toxicidad se determinará midiendo la conversión relativa de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) en los tejidos tratados con el artículo de prueba en comparación con los tejidos tratados con el control negativo/solvente. En este estudio se utilizará el modelo de piel MelanoDerm™ proporcionado por MatTek Corporation (Ashland, MA). El tejido MelanoDerm™ consiste en queratinocitos epidérmicos normales derivados de seres humanos (NHEK) y melanocitos (NHM) que han sido cultivados para formar un modelo multicapa altamente diferenciado de la epidermis humana. Los NHM dentro de los cocultivos experimentan una melanogénesis espontánea que conduce a tejidos de diferentes niveles de pigmentación. Los cultivos se cultivan en insertos de cultivo celular en la interfaz aire-líquido, lo que permite la aplicación tópica de moduladores cutáneos. El modelo MelanoDerm™ exhibe características morfológicas y ultraestructurales similares a las in vivo. Los NHM localizados en la capa de células basales de los tejidos MelanoDerm™ son dendríticos y producen espontáneamente gránulos de melanina que pueblan progresivamente las capas del tejido. Por tanto, el sistema de prueba se puede utilizar para seleccionar materiales que puedan inhibir o estimular la producción de melanina en relación con los controles negativos.

El diseño experimental de este estudio consiste en la determinación del pH del artículo de prueba puro si es posible (y/o solución de dosificación según corresponda) y un ensayo definitivo para determinar la viabilidad relativa del tejido después de exposiciones repetidas. El modelo de piel MelanoDerm™ estará expuesto al artículo de prueba durante un total de 7 días. El artículo de prueba se aplicará tópicamente al modelo de piel MelanoDerm™ cada 48 horas (dentro de un plazo de 48±2 horas desde el tratamiento anterior). La toxicidad del artículo de prueba será determinada por la reducción de MTT con enzima microsomal dependiente de NAD(P)H (y, en menor grado, por la reducción de succinato deshidrogenasa de MTT) en tejidos de control y tratados con artículo de prueba. (Berridgeet al., 1996). Los datos se presentarán en forma de supervivencia relativa (conversión de MTT en relación con el control negativo).

Materiales

El medio de mantenimiento MelanoDerm™ (EPI-100-LLMM) y el modelo de piel MelanoDerm™ (MEL-300-A) fueron suministrados por MatTek Corporation. Sigma suministró 1 % de ácido kójico preparado en agua desionizada estéril) y MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 2 mM de L-glutamina (medio de adición MTT) fue suministrado por Quality Biological. Aldrich suministró isopropanol. La solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco libre de Ca++ y Mg++ estéril (CMF-DPBS) fue suministrada por Invitrogen o equivalente. El agua desionizada estéril fue suministrada por Quality Biological o equivalente. El DMSO fue suministrado por CiVenti Chem.

Procedimientos de ensayo

Los artículos de prueba generalmente se probarán puro o según lo indique el Patrocinador (consulte el Anexo 1 del Protocolo). Se aplicarán diez microlitros (10 μl) o 25 μl de cada artículo de prueba directamente sobre el tejido para cubrir la superficie superior. Dependiendo de la naturaleza del artículo de prueba (líquidos, geles, cremas, espumas, etc.), puede ser necesario el uso de un dispositivo dosificador, malla u otra ayuda para permitir la distribución uniforme del artículo de prueba sobre la superficie del tejido.

En los días de la dosificación, cada artículo de prueba se diluirá al menos 200 veces usando el volumen apropiado de EPI-100-LLMM (o un disolvente alternativo según se determine durante la prueba de solubilidad). Se preparará una nueva dilución en EPI-100-LLMM para cada dosificación. La dilución final a realizar para la preparación de la solución de dosificación se determinará a partir de la evaluación de solubilidad anterior y se documentará en el libro de trabajo del estudio.

El DMSO diluido al 0.5 % (v/v) en EPI-100-LLMM se utilizará como control de vehículo y se dosificará en los tejidos (dosis de 10 μl y 25 μl) según el mismo procedimiento utilizado para los artículos de prueba y los controles de ensayo. Los artículos de prueba se aplicarán por vía tópica al tejido MelanoDerm™ cada 48 horas (dentro de un plazo de 48±2 horas desde el tratamiento anterior) durante una prueba de 7 días. Se aplicarán a cada tejido diez y 25 microlitros, respectivamente, de cada artículo de prueba. Se aplicarán a cada tejido veinticinco microlitros de los controles positivo y negativo, respectivamente.

Si es posible, se determinará el pH del artículo de prueba líquido puro (y/o la solución de dosificación según corresponda). El pH se determinará usando papel de pH (por ejemplo, con un intervalo de pH de 0 – 14 para estimar y/o un intervalo de pH de 5 – 10 para determinar un valor más preciso). Los incrementos de pH típicos en el papel de pH de intervalo más estrecho son aproximadamente de 0.3 a 0.5 unidades de pH. El incremento máximo en el papel de pH es de 1.0 unidades de pH.

El ensayo definitivo incluirá un control negativo y un control positivo. Los tejidos MelanoDerm™ designados para el control negativo del ensayo se tratarán con 25 μl de agua desionizada estéril. Se utilizarán veinticinco microlitros de 1 % de ácido kójico (preparado en agua desionizada estéril y filtrado en el momento de la preparación) para dosificar los tejidos designados El 1 % de ácido kójico se almacenará en un tubo cubierto con papel de aluminio hasta que se use dentro de las 2 horas posteriores a la preparación. Los tiempos de exposición de los controles negativo y positivo serán idénticos a los utilizados para los artículos de prueba.

Es necesario evaluar la capacidad de cada artículo de prueba para reducir directamente el MTT. Se preparará una solución de MTT de 1.0 mg/ml en medio de adición de MTT como se describe a continuación. Se agregarán aproximadamente 25 μl del artículo de prueba a 1 ml de la solución de MTT y la mezcla se incubará en la oscuridad a 37 °C ± 1 °C durante una a tres horas. Un control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril, se analizará al mismo tiempo. Si el color de la solución MTT se vuelve azul/violeta, se presume que el artículo de prueba ha reducido el MTT. Los materiales de prueba insolubles en agua pueden mostrar reducción directa (oscurecimiento) solo en la interfaz entre el artículo de prueba y el medio.

Es posible que la prueba de reducción directa MTT para los artículos de prueba se haya realizado previamente en un estudio independiente. En tales casos, los resultados de la prueba de reducción directa MTT se pueden utilizar para este estudio específico y se hará referencia al estudio inicial.

Exposición de tejidos: Al menos 16 horas después de iniciar los cultivos, se fotografiarán dos tejidos MelanoDerm™ (considerados no tratados en el día 0) con una cámara digital para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos en el tiempo cero del ensayo. Los procedimientos exactos utilizados para recopilar imágenes de los tejidos se especificarán en el libro de trabajo del estudio y en el informe. Los tejidos MelanoDerm™ se enjuagarán con CMF- DPBS, se secarán en papel absorbente estéril y se eliminarán el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se transferirán a los pocillos que contienen MTT apropiados después del enjuague y se procesarán en el ensayo MTT como se describe en la sección Ensayo MTT.

Al menos 16 horas después de iniciar los cultivos, los tejidos se moverán a una nueva placa de 6 pocillos que contiene 0.9 ml de EPI-100-LLMM fresco y precalentado. La prueba se llevará a cabo durante un período de 7 días. Se tratarán dos tejidos por vía tópica el primer día y cada 48 horas (en un plazo de 48 /- 2 horas desde el tratamiento anterior) con 10 y 25 microlitros, respectivamente, de cada artículo de prueba. El medio se actualizará diariamente (dentro de un plazo de 24 /- 2 horas desde la realimentación anterior); los tejidos se trasladarán a una nueva placa de 6 pocillos que contiene 0.9 ml de EPI-100-LLMM fresco y precalentado.

Se tratarán dos tejidos por vía tópica el primer día y cada 48 horas (en un plazo de 48 /- 2 horas desde el tratamiento anterior) con 25 μl de controles positivos y negativos, respectivamente. El medio se actualizará diariamente (dentro de un plazo de 24 /- 2 horas desde la realimentación anterior); los tejidos se trasladarán a una nueva placa de 6 pocillos que contiene 0.9 ml de EPI-100-LLMM fresco y precalentado. Los tejidos se incubarán a 37±1 °C en atmósfera humidificada de 5±1 % CO2 en aire (condiciones estándar de cultivo) para los tiempos de exposición adecuados.

En los días de la dosificación, el tejido MelanoDerm™ primero se enjuagará suavemente tres veces con ~ 500 μl de CMF-DPBS para eliminar cualquier artículo de prueba residual. Luego, los tejidos se trasladarán a una nueva placa de 6 pocillos que contiene 0.9 ml de EPI-100-LLMM fresco precalentado y se dosificará con el artículo de prueba apropiado, control negativo o positivo. Los tejidos se incubarán a 37±1 °C en atmósfera humidificada de 5±1 % CO2 en aire (condiciones estándar de cultivo) para los tiempos de exposición adecuados. El procedimiento de enjuague exacto se documentará en el libro de trabajo del estudio.

Al final de la prueba de 7 días, los tejidos MelanoDerm™ dosificados con el control negativo o positivo, y con cada artículo de prueba, se fotografiarán con una cámara digital para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos en el final del ensayo (día 7). Los procedimientos exactos utilizados para recopilar imágenes de los tejidos se especificarán en el libro de trabajo del estudio y en el informe. Luego, la viabilidad de los tejidos se determinará mediante la reducción de MTT como se indica a continuación.

Ensayo MTT: Una solución madre 10X de MTT preparado en PBS (filtrado en el momento de la preparación del lote) se descongelará y se diluirá en medio de adición de MTT tibio para producir la solución de 1.0 mg/ml no más de dos horas antes de su uso. Se agregarán trescientos μl de la solución de MTT a cada pocillo designado de una placa de 24 pocillos previamente etiquetada.

Después del tiempo de exposición, cada tejido MelanoDerm™ designado para el ensayo MTT se enjuagará con CMF-DPBS, se secará en papel absorbente estéril y se eliminará el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se transferirán a los pocillos que contienen MTT apropiados después del enjuague. Las placas de 24 pocillos se incubarán en condiciones estándar durante 3 ± 0.1 horas.

Después de 3 ± 0.1 horas, los tejidos MelanoDerm™ se secarán en papel absorbente estéril, se eliminarán el exceso de líquido y se transferirán a una placa de 24 pocillos preetiquetada que contiene 2.0 ml de isopropanol en cada pocillo designado. Las placas se cubrirán con para-película y se conservarán en el frigorífico (2-8 °C) hasta que se recoja el último tiempo de exposición. Si es necesario, las placas pueden almacenarse durante la noche (o hasta 24 horas después de cosechar el último tiempo de exposición) en el refrigerador antes de extraer el MTT. Luego, las placas se agitarán durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Al final del período de extracción, el líquido dentro de los insertos de cultivo celular se decantará en el pocillo del que se tomó el inserto de cultivo celular. La solución de extracto se mezclará y se transferirán 200 μl a los pocillos correspondientes de la placa de 96 pocillos. Se agregarán doscientos μl de isopropanol a los pocillos designados como blancos. La absorbancia a 550 nm (OD550) de cada pocillo se medirá con un lector de placas Vmax de Molecular Devices (con la función AUTOMIX encendida).

En los casos en los que se demuestre que el artículo de prueba reduce el MTT, solo los artículos de prueba que permanecen unidos al tejido después del enjuague, dando como resultado una señal de reducción de MTT falsa, presentan un problema. Para demostrar que el posible artículo de prueba residual no está actuando para reducir directamente el MTT, se realiza una verificación funcional en el ensayo definitivo para demostrar que el material de prueba no se une al tejido y conduce a una señal de reducción de MTT falsa.

Para determinar si el artículo de prueba residual está actuando para reducir directamente el MTT, se usa un tejido de control muerto por congelación. El tejido muerto por congelación se prepara en el IIVS colocando tejidos MelanoDerm™/EpiDerm™ (Melanoderm™ sin melanocitos) sin tratar en el congelador a -20 °C al menos durante la noche, descongelando a temperatura ambiente y luego volviendo a congelar. Una vez sacrificado, el tejido puede almacenarse indefinidamente en el congelador. Los tejidos muertos por congelación pueden recibirse ya preparados de MatTek Corporation y almacenarse en el congelador a –20 ºC hasta su uso. Para probar la reducción del artículo de prueba residual, los tejidos muertos se tratan con el artículo de prueba de la manera normal. Todos los procedimientos de ensayo se realizarán de la misma manera que para el tejido viable. Al menos un control muerto tratado con agua desionizada estéril (control muerto negativo) se probará en paralelo ya que se espera una pequeña cantidad de reducción de MTT a partir del NADH residual y las enzimas asociadas dentro del tejido muerto.

Si se observa poca o ninguna reducción de MTT en el control muerto tratado con el artículo de prueba, la reducción de MTT observada en el tejido viable tratado con el artículo de prueba puede atribuirse a las células viables. Si hay una reducción apreciable de MTT en el control muerto tratado (en relación con la cantidad en el tejido viable tratado), se deben tomar medidas adicionales para tener en cuenta la reducción química o el artículo de prueba puede considerarse no comprobable en este sistema. Los valores de OD550 de los controles muertos se analizarán como se describe a continuación.

Los datos de absorbancia sin procesar se capturarán y guardarán como un archivo de impresión y se importarán a una hoja de cálculo de Excel. Se calculará el valor medio de OD550 de los pocillos en blanco. El valor medio corregido de la OD550 de los controles negativos se determinará restando el valor medio de la OD550 de los pocillos en blanco de sus valores medios de la OD550. Los valores de OD550 corregidos de las exposiciones de los artículos de prueba individuales y las exposiciones de los controles positivos se determinarán restando de cada uno el valor de OD550 medio de los pocillos en blanco. Todos los cálculos se realizarán utilizando una hoja de cálculo de Excel. Aunque los algoritmos discutidos se realizan para calcular el análisis de punto final a nivel de grupo de tratamiento, los mismos cálculos se pueden aplicar a las réplicas individuales.

Exposición del artículo de prueba corr. OD550 = exposición del artículo de prueba OD550 – OD550 medio del blanco

Si se utilizan controles muertos (KC), se realizarán los siguientes cálculos adicionales para corregir la cantidad de MTT reducida directamente por los residuos del artículo de prueba. El valor sin procesar de OD550 para el control muerto del control negativo se restará de los valores de OD550 sin procesar de cada uno de los controles muertos tratados con el artículo de prueba, para determinar los valores netos de OD550 de los controles muertos tratados con el artículo de prueba.

OD550 neto para cada artículo de prueba KC = Artículo de prueba OD550 sin procesar KC – Control negativo de OD550 sin procesar KC

Los valores de OD550 neto representan la cantidad de MTT reducido debido a una reducción directa de los residuos del artículo de prueba en tiempos de exposición específicos. En general, si el valor neto de la OD550 es mayor que 0.150, la cantidad neta de reducción de MTT se restará de los valores corregidos de la OD550 de los tejidos tratados viables para obtener un valor final de la OD550 corregida. Estos valores finales de OD550 corregidos se utilizarán luego para determinar el % de viabilidades de control.

OD550 corregido final = artículo de prueba OD550 corregido (viable) – artículo de prueba OD550 neto (KC)

Finalmente, se realizará el siguiente % de cálculos de control:

% de viabilidad = [(OD550 final corregido del artículo de prueba o control positivo) / (OD550 medio corregido del control negativo)] x 100

Resultados

Los resultados del ensayo MelanoDerm™ se muestran en las Figuras 16A-16K. Los tejidos tratados con Malassezina, compuesto I y compuesto II demostraron una pigmentación reducida el día 7 del experimento. Las Figuras 17A-17K muestran imágenes aumentadas 15X de muestras de MelanoDerm™ expuestas al tratamiento indicado.

Ejemplo 13

Ensayos de pez cebra

Procedimientos de ensayo

Compuestos: Los compuestos serán proporcionados por el patrocinador del estudio como solución Madre Maestra (MS) en la concentración soluble más alta en agua/PBS o DMSO.

Procedimientos estándar para la recolección de embriones: El pez cebra Phylonix AB se generará mediante apareamiento natural o utilizando un sistema de producción masiva de embriones (MEPS, Aquatic Habitats). Se generarán aproximadamente 50 peces cebra por hembra de pez cebra. El pez cebra se mantendrá a 28 °C en agua de pescado. El pez cebra se limpiará (se eliminará el pez cebra muerto) y se clasificará por etapa de desarrollo. Debido a que el pez cebra se nutre de un saco vitelino adherido, no se requiere alimentación durante los 6 días posteriores a la fertilización (dpf).

Solubilidad del compuesto: Solución Madre Maestra (MS) (utilizando la concentración más alta) se diluirá en DMSO puro en soluciones sub-maestra (SS) es decir: 10, 50, 100, 200, 300 mM, etc. Agua de pescado [200 mg de sal marina instantánea del océano (sistemas de acuario) por litro de agua desionizada; pH 6.6 – 7.0 mantenido con regulador neutro 2.5 mg/litro (Seachem Laboratories Inc.); conductividad 850 – 950 μS], suministrado por Phylonix, se dispensará en un recipiente de prueba, 4 ml/recipiente.

Para generar la solución del compuesto de prueba (TS), se agregarán 4 μl de cada SS directamente al agua de pescado. Ejemplo: 4 μl de 10 mM SS añadidos al agua de los peces generarán 10 μM TS; La concentración final de DMSO será del 0.1 %. Alternativamente, para obtener las mismas concentraciones finales de TS y DMSO, se pueden agregar 10 μl de SS a 10 ml/recipiente de agua de pescado. Para los ensayos que pueden tolerar DMSO hasta un 1 %, se pueden utilizar 40 μl de SS para generar 100 μM de TS. Si se utilizan 10 ml de agua de pescado, el volumen de SS debe aumentarse proporcionalmente para obtener las mismas concentraciones finales de TS y DMSO. La solución se incubará a 28 °C durante el tiempo especificado para cada ensayo y se examinará visualmente a diario para detectar la presencia de precipitación.

Concentración máxima tolerable (MTC): MTC (LC10) se utilizará como criterio estándar para la letalidad del compuesto, determinada utilizando 10 concentraciones de compuesto. Después de determinar la concentración más alta de compuesto soluble, el patrocinador del estudio seleccionará 10 concentraciones.

Treinta ~ 2 dpf de pez cebra AB de tipo salvaje Phylonix corionado se distribuirán en pocillos de microplacas de 6 pocillos que contienen 4 ml/pocillo de agua de pescado y DMSO a una concentración que oscila entre el 0.1-1 %, según la solubilidad del compuesto.

10 concentraciones (es decir: 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 y 500 µM (o hasta la concentración permitida por la solubilidad del compuesto), se probarán inicialmente. Si es necesario, se probarán concentraciones adicionales mayores (hasta 2000 μM) o menores (hasta 0.001 μM).

El pez cebra se incubará con cada concentración de compuesto de prueba en la oscuridad a 28 ºC durante 3 días. El pez cebra no tratado y tratado con 0.1-1 % de DMSO se utilizará como controles de ensayo y de vehículo. Para calcular el % de letalidad, después del tratamiento, el número de peces cebra muertos se contará diariamente y se eliminará. A 5 dpf, los animales muertos se contarán para calcular el % de letalidad (= número total de peces cebra muertos/30). Tenga en cuenta que si el pez cebra muerto se desintegra, el número de peces cebra muertos se deducirá al contar el número de peces cebra vivos.

Para estimar MTC, se generarán curvas de letalidad trazando el % de letalidad frente a la concentración utilizando el software EXCEL. Para obtener la media y la SD de MTC, los experimentos se realizarán 3 veces.

Evaluar visualmente el efecto del compuesto sobre la pigmentación de la piel del pez cebra: Las células pigmentarias de la piel del pez cebra, incluidos los xantóforos, iridóforos y melanóforos (melanocitos), se originan en las células de la cresta neural. En el pez cebra, las células precursoras del pigmento de la piel diferenciadas expresan pigmento a ~ 24 hpf. El foco de este estudio son los melanocitos que expresan melanina, el pigmento negro de la superficie de la piel. Los melanocitos aparecen inicialmente como pequeñas manchas de color negro en la región dorsal de la cabeza. A medida que se desarrolla el pez cebra, el número de parches aumenta y se fusiona para formar bandas que se extienden hasta la región de la cola. En contraste, el pez cebra albino mutante exhibe una pigmentación de piel escasa. Los compuestos se administrarán a 2 dpf, para evaluar si los compuestos detienen el procedimiento continuo de pigmentación embrionaria, que se completa con 5 dpf. Se probarán tres concentraciones, MTC, 50 % MTC y 25 % MTC, para cada compuesto.

Se tratarán treinta y dos dpf de pez cebra AB de tipo salvaje Phylonix autoguiado con cada concentración de compuesto durante 3 días. Se utilizará como controles el pez cebra sin tratar y tratado con 0.1 % de DMSO. Control positivo: feniltiourea (PTU, 0.03 %).

El pez cebra se examinará visualmente a diario utilizando un microscopio óptico de disección; el pez cebra tratado con compuesto y PTU se comparará con el pez cebra de control no tratado y tratado con vehículo. El número de peces cebra que presenten una disminución de la pigmentación se contará diariamente y se expresará como % de los animales de prueba; se proporcionará una imagen representativa. Para identificar la concentración óptima del compuesto y el tiempo de tratamiento para la disminución de la pigmentación, se generará una curva cinética representando el porcentaje de pez cebra que presenta una disminución de la pigmentación de la piel frente al tiempo (dpf). Se utilizará la prueba exacta de Fisher para determinar si el efecto compuesto es significativo (P <0.05).

Se realizará una evaluación visual adicional del efecto del compuesto sobre la pigmentación de la piel del pez cebra después del tratamiento con: 0.1, 1 y 3 µM. Se tratarán treinta y dos dpf de pez cebra AB de tipo salvaje Phylonix autoguiado con cada concentración de compuesto durante 3 días. Se utilizará como controles el pez cebra sin tratar y tratado con 0.1 % de DMSO. Control positivo: feniltiourea (PTU, 0.003 %). El pez cebra se examinará visualmente a diario utilizando un microscopio óptico de disección; el pez cebra tratado con compuesto y PTU se comparará con el pez cebra de control no tratado y tratado con vehículo.

En 5 dpf, número de peces cebra que exhiben una pigmentación reducida y se expresará como % de los animales de prueba; se proporcionará una imagen representativa. Para identificar la concentración óptima del compuesto y el tiempo de tratamiento para la disminución de la pigmentación, se generará una curva cinética representando el porcentaje de pez cebra que presenta una disminución de la pigmentación de la piel frente a la concentración. Se utilizará la prueba exacta de Fisher para determinar si el efecto compuesto es significativo (P <0.05).

Cuantificar el efecto del compuesto sobre la pigmentación de la piel del pez cebra:Según los resultados de la evaluación visual, utilizaremos las condiciones óptimas (concentración, tiempo de tratamiento del compuesto) para cuantificar el efecto del compuesto sobre la pigmentación de la piel del pez cebra.

Se tratarán veinte peces cebra AB de tipo salvaje Phylonix en la etapa óptima determinada por los resultados de la evaluación visual con la concentración óptima de compuesto. Se utilizará como controles el pez cebra sin tratar y tratado con 0.1 % de DMSO. Control positivo: feniltiourea (PTU, 0.03 %).

La imagen de la vista dorsal del pez cebra entero se capturará con una cámara SPOT a 2X. La región dorsal de la cabeza y el tronco se definirá como región de interés (ROI) mediante la función de selección de Adobe Photoshop. La pigmentación de la piel negra en la ROI se resaltará utilizando la función de resaltado de Photoshop. La señal de pigmento total (PS) en píxeles se determinará mediante la función de histograma de Photoshop.

Si el compuesto afecta el crecimiento del pez cebra, la longitud del cuerpo (L) y el ancho del tronco (W) serán más pequeños, lo que afectará el área de ROI y el PS final. Por lo tanto, normalizaremos la medición de la señal final (FS) usando FS = PS/LxW.

Se espera que el pez cebra no tratado y tratado con vehículo exhiba FS similar para demostrar que el vehículo no tiene efecto. Se espera que el pez cebra tratado con PTU muestre un FS bajo para validar el ensayo. El pez cebra tratado con el compuesto se comparará con el pez cebra de control tratado con vehículo.

Para determinar si el efecto del compuesto es significativo (P <0.05), el FS medio para el pez cebra tratado con compuesto se comparará con el FS medio del pez cebra tratado con vehículo usando la prueba t de Student.

Se realizará una cuantificación adicional del efecto del compuesto sobre la pigmentación de la piel del pez cebra después del tratamiento con: concentración de compuesto de 0.5 y 1.5 µM.

Se tratarán veinte peces cebra AB de tipo salvaje Phylonix de 2 dpf con una concentración de compuesto de 0.5 y 1.5 μM. Se utilizará como controles el pez cebra sin tratar y tratado con 0.1 % de DMSO. Control positivo: feniltiourea (PTU, 0.003 %).

La imagen de la vista dorsal del pez cebra entero se capturará con una cámara SPOT a 2X. La región de la cabeza dorsal se definirá como región de interés (ROI) utilizando la función de selección de Adobe Photoshop. La pigmentación de la piel negra en la ROI se resaltará utilizando la función de resaltado de Photoshop. La señal de pigmento total (PS) en píxeles se determinará mediante la función de histograma de Photoshop.

Si el compuesto afecta el crecimiento del pez cebra, la longitud del cuerpo (L) será más corta y el ancho del tronco (W) será más pequeño, lo que afectará el área de ROI y el PS final. Por lo tanto, normalizaremos la medición de la señal final (FS) usando FS = PS/LxW.

Se espera que el pez cebra no tratado y tratado con vehículo muestre FS similar para confirmar que no hay efecto del vehículo. Se espera que el pez cebra tratado con PTU muestre un FS bajo, validando el ensayo. El pez cebra tratado con el compuesto se comparará con el pez cebra de control tratado con vehículo.

Resultados

Los resultados de la evaluación visual para el pez cebra expuesto al compuesto II se muestran en las Figuras 18A-18F y las Figuras 19A-19F. En la Figura 20 se muestra un gráfico que resume los resultados de la parte de evaluación visual del estudio.

Las regiones de evaluación cuantitativa de interés y los resultados para el pez cebra expuestos al compuesto II se muestran en las Figuras 21A-21E y Figura 22A-22B.

Ejemplo 14

Estabilidad de Malassezina y derivados de Malassezina en DMSO y medios de cultivo celular

Los compuestos ensayados se prepararon a 100 µM en DMSO y medio de cultivo. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y se analizaron mediante LC-EM. El área del pico se usó para evaluar el compuesto que queda en el disolvente.

Resultados

Los resultados de LC-EM se muestran en las Figuras 23A-23J. Los resultados indican que los compuestos son estables en medio de cultivo después de 2 horas de incubación.

Ejemplo 15

Síntesis de Malassezina y derivados de Malassezina

Malassezina (CV-8684), su derivado ciclado indolo[3,2-b]carbazol (CV-8685), compuesto I (CV-8686), compuesto IV (CV-8687), compuesto II (CV-8688) y el precursor de Malassezina se sintetizó de acuerdo con los protocolos descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 15/455,932, publicada como Publicación de Patente de los Estados Unidos No.2017/0260133 A1.

Síntesis del compuesto C (CV-8802)

Síntesis del compuesto10

Como se muestra en la Figura 24A, a una solución de 2-yodo-4-metilanilina (10 g, 0.0429 mol) en tetrahidrofurano (200 ml) a 0 °C se añadió NaHMDS (94.42 ml, 1 M en THF, 0.0944 mol) lentamente manteniendo la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 30 min. Después de 30 min de agitación a 0 °C, se añadió lentamente una solución de anhídrido BOC (10.29 g, 0.0472 mol) en THF (50 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 30 min. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. Se añadió NH4Cl saturado (200 ml) para detener la reacción. La capa orgánica se separó y se lavó con agua (200 ml). La capa acuosa combinada se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml) y las capas se separaron. La capa de acetato de etilo se combinó con la capa orgánica y se concentró al vacío para dar un aceite marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (0-5 % de acetato de etilo/hexanos). El compuesto10se obtuvo como un líquido amarillo claro (13.1 g, 91 %).

Síntesis del compuesto11

Se añadió but-3-in-2-ol (25 ml, 0.319 mol) disuelto en DMF (100 ml) a NaH (19.2 g, 0.478 mol) en DMF (100 ml) a 0 ºC. Se añadió DMS (45.2 ml, 0.478 mol) a la mezcla de reacción durante un período de 30 minutos y se agitó a 0 ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora, luego se enfrió a 10 ºC y se añadió ácido acético (19.2 ml, 0.319 mol) durante un período de 10 minutos y se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con agua (600 ml) y se extrajo con éter dietílico (400 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El compuesto deseado se eliminó por destilación a 64-68 ºC para obtener 7 g de compuesto11puro (23 % de rendimiento).

Síntesis del compuesto12

Se añadió yoduro de cobre (0.34 g, 0.0018 mol) y PdCl2(PPh3)4(0.6323 g, 0.0009 mol) a una solución desgasificada del compuesto10(6.0 g, 0.018 mol), compuesto11(1.81 g, 0.0216 mol) en trietilamina (100 ml) a temperatura ambiente y se agitó durante 6 horas. La reacción se completó (se controló por TLC usando 10 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (200 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado (100 ml) y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para producir un aceite marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto12se obtuvo como un líquido amarillo claro (4.8 g, 96 %).

Síntesis del compuesto13

Se cargó un matraz de fondo redondo con PtCl2 (0.44 g, 0.00166 mol), Na2CO3 (2.64 g, 0.0249 mol), indol (3.89 g, 0.0332 mol) y compuesto12(4.8 g, 0.0166 mol) en dioxano (200 ml). El matraz se desgasificó con nitrógeno, se selló y se calentó a 100 °C durante la noche. El disolvente se evaporó a presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (300 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua (200 ml), NaCl saturado (200 ml) y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar un aceite marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (10 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto13se obtuvo como un sólido de color marrón claro (2.04 g, 34 %).

Síntesis del compuesto14

Se añadió carbonato de potasio (2.3 g, 0.0166 mol) a una solución del compuesto13(2.0 g, 0.0055 mol) en una mezcla de metanol (30 ml) y agua (10 ml) a temperatura ambiente. La suspensión resultante se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se concentró al vacío. El residuo se tomó en acetato de etilo (100 ml) y se lavó con agua (100 ml) y salmuera (100 ml), luego se secó (sobre sulfato de sodio), se filtró y el disolvente se concentró al vacío para dar un sólido marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (20 % de acetato de etilo/hexano). El compuesto14se obtuvo como un sólido blanquecino (0.8 g, 54 %).

Síntesis delcompuesto C

Se añadió dimetilformamida (5 ml) a un matraz seco de fondo redondo de dos bocas de 100 ml en argón a 0 ºC. Se añadió POCl3(246 mg, 1.6058 mol) lentamente mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 10 min. Después de 30 minutos de agitación a 0 °C, se añadió lentamente una solución del compuesto14(400 mg, 1.459 mol) en dimetilformamida (2 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 ºC durante 10 min. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se completó la reacción (monitoreada por TLC utilizando 20 % de acetato de etilo/hexanos). La mezcla de reacción se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (100 ml) y se agitó durante 1 hora. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron y lavaron con agua (100 ml), NaCl saturado (100 ml) y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar un sólido marrón. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (0-20 % de acetato de etilo/hexanos).

En algunos experimentos, el resultado de este protocolo fue una composición que comprendía uno o más del compuesto C, el compuesto C1 y el compuesto C2 ("una composición desconocida").

Síntesis del compuesto K (CV-8803)

Como se muestra en la Figura 24B, la solución de Malassezina (40 mg, 0.146 mmol) en MeOH (5 ml) se enfrió a 0 °C. A esta solución se añadió NaBH4(27.6 mg, 0.729 mmol) a 0 °C y se agitó vigorosamente. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se calienta a temperatura ambiente y se elimina el metanol mediante rotavapor. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (20 ml) y se lavó con 20 % de ácido acético en agua (20 ml) y salmuera (20 ml). Las capas orgánicas se separaron y secaron sobre sulfato de sodio anhidro. Los sólidos se separaron por filtración y el filtrado se concentró para obtener 34 mg delcompuesto K.

Síntesis del compuesto A (CV-8804)

Como se muestra en la Figura 24C, la solución del compuesto II (120 mg, 0.417 mmol) en MeOH (5 ml) se enfrió a 0 °C. A esta solución se añadió NaBH4(78.75 mg, 2.083 mmol) a 0 °C y se agitó vigorosamente. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se calienta a temperatura ambiente y se elimina el metanol mediante rotavapor. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (20 ml) y se lavó con 20 % de ácido acético en agua (20 ml) y salmuera (20 ml). Las capas orgánicas se separaron y secaron sobre sulfato de sodio anhidro. Los sólidos se separaron por filtración y el filtrado se concentró para obtener 101 mg delcompuesto A.

Síntesis del compuesto E (AB12508)

Como se muestra en la Figura 24D, al indol1(10 g, 85.4 mmol) en MeOH (350 ml) se añadió ciclopropil aldehído2(2.5 g, 35.6 mmol), seguido de una solución acuosa 1 N de HCl (178 ml) y se calentó a 70 °C durante 1 hora. Se eliminó el disolvente y se extrajo con DCM (2x), se secó sobre Na2SO4y se concentró. El aislamiento del material a través de FCC dio como resultado 2.47 g de un sólido de color naranja claro como una mezcla isomérica 1.0:0.73 (2:3’:3:3’).

La mezcla anterior (1.44 g, 5.0 mmol) en DMF (10 ml) se añadió a POCl3(947 mg, 6.0 mmol) en DMF (15 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Luego se templó con NaHCO3(sat), se extrajo con EtOAc (2x), se secó sobre Na2SO4y se purificó mediante FCC y luego prep-HPLC. Se obtuvo un sólido de color verde claro (286 mg) después de la liofilización.

[M+H]+ = 315; [M-H]-= 313.<1>H RMN (CDCl3): 10.34 (s, 1H), 8.37 (bs, 1H), 8.33 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 8.23 (bs, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.40 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.24-7.29 (m, 2H), 7.16-7.23 (m, 3H), 6.97 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 4.45 (d,J= 8.7 Hz, 1H), 1.48-1.59 (m, 1H), 0.84-0.93 (m, 1H), 0.62-0.71 (m, 1H), 0.47-0.60 (m, 2H).

Síntesis del compuesto A5 (CV-8819)

Síntesis del compuesto3

Como se muestra en la Figura 24E, la solución de 1-(fenilsulfonil)indol (1, 1 g, 0.00389 mol) en THF (20 ml) se enfrió a -78 °C. A esto se añadiót-BuLi (2.52 ml, 0.00428 mol) y se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción se calentó lentamente a 0 °C. Después de alcanzar 0 °C, la mezcla de reacción se enfrió de nuevo a -78 °C. A esta mezcla se añadió una solución de N-BOC-3-Formil indol (0.953 gm, 0.00389 mol) en THF (5 ml) durante un período de 30 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 0 °C y se inactivó con agua (5 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se lavó con agua (100 ml) y salmuera (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (250 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante cromatografía en columna (0-15 % de acetato de etilo en hexanos). Las fracciones deseadas se combinaron y concentraron para obtener 1.7 g de compuesto3puro como un sólido blanquecino (rendimiento 87 %).

Síntesis del compuesto4

A la solución del compuesto3(500 mg, 0.996 mmol) en DMSO (5 ml) se añadió IBX (334.6 mg, 1.195 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (25 ml) y se lavó con agua (2 x 25 ml) y salmuera (25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron (se obtuvieron 444 mg, rendimiento del 89 %). La mezcla de reacción bruta es suficientemente pura y se llevó al siguiente paso sin purificación.

Síntesis del compuesto5

La solución del compuesto4(110 mg, 0.22 mmol), TBAF (1 M en THF) (220 µl, 0.22 mmol) y THF (3 ml) se calentó a reflujo durante 1 hora y se enfrió a temperatura ambiente. Los volátiles se eliminaron mediante rotavapor y se diluyeron con acetato de etilo (25 ml) y se lavaron con agua (25 ml) y salmuera (25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante cromatografía en columna (0-10 % de acetato de etilo en hexanos). Las fracciones deseadas se combinaron y concentraron para obtener 60 mg del compuesto5puro en forma de un sólido blanquecino (rendimiento del 75 %). Síntesis del compuesto6

La solución del compuesto5(500 mg, 1.388 mmol), CMMC (472.2 mg, 2.79 mmol) en dicloroetano (10 ml) se calentó a 50 °C durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en agua helada (50 ml), se lavó con NaOH 0.5 M (15 ml) y salmuera (25 ml) y se extrajo con diclorometano (25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante cromatografía en columna (0-20 % de acetato de etilo en hexanos). Las fracciones deseadas se combinaron y concentraron para obtener 198 mg del compuesto6puro en forma de un sólido blanquecino (rendimiento del 36.5 %).

Síntesis delcompuesto A5

Se disolvió el compuesto6(198 mg, 0.5103 mmol) en metanol (5 ml). A esta solución se añadió K3PO4(216.37 mg, 1.021 mmol) y se mantuvo a reflujo durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y los volátiles se eliminaron mediante rotavapor. El residuo se disolvió en acetato de etilo (25 ml) y se lavó con agua (2 x 25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. Los sólidos obtenidos se agitaron en éter dietílico (10 ml) vigorosamente durante 1 hora y se filtraron para obtener elcompuesto A5(97 mg, rendimiento del 66 %).

Síntesis del compuesto H (AB12509)

Como se muestra en la Figura 24F, se agregón-Butillitio (2.5M en hexano, 5.5 ml, 13.7 mmol) gota a gota a una solución de 1-fenilsulfonilindol2(3.05 g, 11.9 mmol) en THF seco (75 mL) a -78 °C. Después de agitar la solución durante 1 hora a temperatura ambiente, la solución se enfrió de nuevo a -78 °C y se añadió lentamente 3-formil indol1(3.35 g, 13.7 mmol) en THF seco (45 ml). La reacción se calentó a temperatura ambiente durante la noche. Luego, se añadió MeI (15 eq, 11.1 ml) y la mezcla de reacción se calentó hasta 50 °C durante 9 horas. Se templó con H2O, se extrajo con EtOAc, se secó sobre Na2SO4y se concentró. FCC (SiO2, 5 % de EtOAc/hexanos) proporcionó 4.02 g de3en forma de un sólido esponjoso blanco.

A una solución de bisindol3(2 g, 3.9 mmol) en THF (20 ml) se añadió TBAF (1 M en THF, 5.9 ml, 1.5 eq) y se calentó a 70 °C durante 14 horas. Se templó con NH4Cl saturado, se extrajo con EtOAc (2x), se lavó con H2O y salmuera. En este punto, se agregaron 22 ml de DMF y la mayor parte del EtOAc se eliminó a presión reducida. La mezcla cruda se utilizó en el siguiente paso.

El crudo anterior se añadió lentamente durante 1.5 horas a una solución de POCl3(3.6 ml, 10 eq) en DMF (20 ml) a temperatura ambiente. Una vez completada la adición, la reacción se agitó durante 30 min más, luego se templó con NaHCO3saturado a 0 °C, se extrajo con EtOAc (3x), se lavó con salmuera y se concentró. FCC (SiO2, 15 % EtOAc/hex) proporcionó 881 mg de bisindol5como un sólido amarillo brillante.

A una solución de bisindol5(350 mg) en MeOH:H2O (9:1, 17.4 ml) se añadió K2CO3(456 mg, 3,5 eq) y se calentó hasta 75 °C durante 1 hora. Se eliminó el disolvente, el material se diluyó con agua, se extrajo con DCM (2x) y se concentró. La mezcla bruta se purificó mediante Prep-HPLC (10-100 % H2O/CH3CN, 20 ml/min, 30 min) y se liofilizó para producir 134 mg deAB12509como un sólido blanco.

Síntesis del compuesto B (CV-8877)

Síntesis del compuesto7

Como se muestra en la Figura 24G, la solución del compuestoII(1 g, 0.0034 mol) en THF (10 ml) se enfrió a 0 °C. A esta solución se añadió anhídrido BOC (1.51 g, 0.0069 mol) y DMAP (848 mg, 0.0069 mol) y se agitó a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 15 horas. Los volátiles se eliminaron mediante rotavapor. El residuo se diluyó con acetato de etilo (100 ml) y se lavó con HCl 1N (50 ml), bicarbonato de sodio acuoso saturado (50 ml) y salmuera (50 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante cromatografía en columna (0-10 % de acetato de etilo en hexanos). Las fracciones deseadas se combinaron y concentraron para obtener 1.4 g de compuesto7puro en forma de un sólido blanquecino (rendimiento 83 %).

Síntesis del compuesto8

Se enfrió una solución del compuesto7(250 mg, 0.512 mmol) ent-BuOH (10 ml) a 0 °C. A esta solución se añadió 2-metil-2-buteno (10 ml) seguido de la adición de NaClO2(1.5 g), NaH2PO4(1.5 g) y agua (10 ml). La mezcla de reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente y se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2(25 ml) y se lavó con agua (50 ml) y salmuera (25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron para obtener 235 mg del compuesto8(91 % de rendimiento). La mezcla de reacción bruta es suficientemente pura y se llevó al siguiente paso sin purificación.

Síntesis del compuesto9

A una solución del compuesto8(100 mg, 0.198 mmol) en acetona (10 ml) a 0 °C, se añadió K2CO3(83 mg, 0.595 mmol) y yoduro de metilo (30.97 mg, 0.218 mmol). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (25 ml) y se lavó con agua (25 ml) y salmuera (25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron para obtener 91 mg del compuesto9(89 % de rendimiento). La mezcla de reacción bruta es suficientemente pura y se llevó al siguiente paso sin purificación.

Síntesis delcompuesto B

Se disolvió el compuesto9(70 mg, 0.135 mmol) en metanol (5 ml). A esta solución se añadió K3PO4(57.3 mg, 0.27 mmol) y se mantuvo a reflujo durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y los volátiles se eliminaron mediante rotavapor. El residuo se disolvió en acetato de etilo (25 ml) y se lavó con agua (2 x 25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. Los sólidos obtenidos se agitaron en éter dietílico (10 ml) vigorosamente durante 1 hora y se separaron por filtración para obtener elcompuesto B(25 mg, rendimiento 58 %).

Síntesis del compuesto B10

Como se muestra en la Figura 24H, el compuesto8(21 mg, 0.041 mmol) se disolvió en metanol (3 ml). A esta solución se añadió K3PO4(17.6 mg, 0.083 mmol) y se mantuvo a reflujo durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y los volátiles se eliminaron mediante rotavapor. El residuo se disolvió en acetato de etilo (25 ml) y se lavó con agua (2 x 25 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna (70-100 % de acetato de etilo en hexanos) y se obtuvieron 7 mg delcompuesto B10(rendimiento del 55 %).

Síntesis de AB11644

Como se muestra en la Figura 24I, a una solución de indol1(1.0 g, 8.54 mmol) en CH3CN (11.5 ml) y aldehído2(294 mg, 4.16 mmol), se agregó I2(210 mg, 0.85 mmol) y la mezcla se agitó durante 17 horas a temperatura ambiente. La reacción se templó con Na2SO3, se extrajo con EtOAc (2x), se secó sobre Na2SO4, se purificó mediante FCC (SiO2, 10 % de EtOAc/hexanos), luego Prep-HPLC y se liofilizó para producir 106 mg de bisindol3simétrico como un sólido blanco .

[M-H]<->= 385.<1>H RMN (CDCl3): 7.90 (bs, 2H), 7.49 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 7.33 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 7.15 (t,J= 7.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 7.00 (t,J= 7.0 Hz, 2H), 3.98 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 1.52-2.00 (m, 1H), 0.60-0.66 (m, 2H), 0.36-0.41 (m, 2H).

Síntesis de O52 (AB12976)

Como se muestra en la Figura 24J, a una solución del compuesto1(3.8 g) en DCM 38 ml) se añadió TEA, DMAP y luego Boc2O a 0 °C. La mezcla se calentó a temperatura ambiente (18-23ºC) y se agitó durante 4 horas. La mezcla se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA = 30:1~20:1~10:1~5:1) para dar el compuesto2(6 g, 96 %) como un aceite amarillo.

A una solución del compuesto2(6.6 g, 25.7 mmol, 1.0 eq) en acetona/H2O (264 ml/64 ml) se añadió NMO (4.5 g, 38.6 mmol, 1.5 eq), OsO4(0.197 g, 2.57 mmol, 0.03 eq). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente (18-23 °C). La mezcla se templó con Na2S2O3(200 ml) y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con EA (300 ml*3). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron con Na2SO4y se concentraron para dar el compuesto3crudo (9 g) en forma de un aceite marrón, que se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.

A una solución del compuesto3(9.3 g, 31.9 mmol, 1.0 eq) en MeCN (80 ml) se añadió TEA (9.68 g, 95.9 mmol, 3.0 eq), luego n-C4F9SO2F (14.45 g, 47.9 mmol, 1.5 eq) a 0 °C. La mezcla se calentó a temperatura ambiente (20-25 °C) y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. A la mezcla se añadió agua (80 ml) y se extrajo con EA (150 ml*3). Las fases orgánicas se combinaron y se secaron con Na2SO4. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA=10:1~5:1~3:1) para dar el compuesto4(5 g, 57 %) en forma de un aceite amarillo.

A una solución del compuesto5(1.84 g, 15.7 mmol, 1.0 eq) en DCM (18 ml) se añadió gota a gota MeMgBr (3 M) (10.47 ml, 31.4 mmol, 2.0 eq) a 0 °C y la solución se agitó durante 30 min. Luego, la solución se enfrió a -20 °C y se añadió el compuesto4(3 g, 10.99 mmol, 0.7 eq) en DCM (18 ml). La mezcla se agitó durante 3 horas a -20 °C, luego se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. La reacción se templó con NH4Cl (acuoso) (50 ml) y se extrajo con DCM (50 ml*2). Las fases orgánicas se combinaron y se secaron con Na2SO4. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA=10:1-5:1-3:1) para dar el compuesto6(3.2 g, 74 %) en forma de un aceite ligeramente amarillo.

A una solución del compuesto6(3.2 g, 8.21 mmol, 1.0 eq) en DCM (300 ml) se añadió Dess-Martin (9.05 g, 21.33 mmol, 2.6 eq). La mezcla se calentó a 45 °C y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se templó con NaHCO3saturado (60 ml) y Na2S2O3(60 ml). Se separaron la fase orgánica y la capa acuosa y la capa acuosa se extrajo con Et2O (100 ml*2). Las fases orgánicas se combinaron y se secaron con Na2SO4. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA = 10:1-5:1-3:1) para dar el compuesto7(2.3 g, 71 %) como un sólido amarillo anaranjado.

A una solución del compuesto7(830 mg, 2.14 mmol, 1.0 eq) en DCM (16 ml) se añadió TFA (4.876 g, 42.8 mmol, 20 eq) a 0 °C. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1.5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se disolvió con DCM (15 ml). Se agregó una solución acuosa de bicarbonato de sodio a la solución hasta que no aparezcan burbujas. La solución se extrajo con DCM (30 ml*3). Las fases orgánicas se combinaron y se secaron con Na2SO4. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE:EA=20:1-10:1-5:1-3:1-2:1) para dar el compuestoAB12976(140 mg, 22 %) como un sólido marrón.

TLC: PE:EA=, Rf (7) =0.4, Rf (AB12976) =0.1;<1>H RMN (400 MHz, cdcl3) δ 8.08 (s, 2H), 7.47 (d,J= 7.8 Hz, 2H), 7.31 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 7.20 (t,J= 7.5 Hz, 2H), 7.11 (dd,J= 7.8, 7.1 Hz, 2H), 6.97 (d,J= 1.8 Hz, 2H), 3.90 (s, 4H).<13>C RMN (101 MHz, cdcl3) δ 207.34, 136.12, 127.30, 123.33, 122.17, 119.67, 118.69, , 111.25, 108.57, 38.58.

Síntesis de Malassezia Indol A (AB17011)

Como se muestra en la Figura 24K, a una solución del compuesto1(20 g, 0.106 mol, 1.0 eq) en DCM (20 ml) se añadió sucesivamente Boc2O (24.4 g, 0.112 mol, 1.056 eq), DMAP (646 mg, 5.29 mmol, 0.05 eq) y TEA (534 mg, 5.29 mmol, 0.05 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para producir el compuesto2(24 g, 78 %).

A una solución del compuesto2(5 g, 17.30 mmol, 1.0 eq) y DBU (13.17 g, 86.51 mmol, 5.0 eq) en MeCN (50 ml) se añadió P-ABSA (8.3 g, 34.60 mmol, 2.0 eq) a 0 °C. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 100 min. El análisis de TLC de la mezcla de reacción mostró conversión completa al producto deseado. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para producir el compuesto3(3.5 g, 63 %).

A una solución del compuesto3(100 mg, 0.316 mmol, 1.0 eq) en MeOH (6 ml) se añadió una solución de LiOH (7 mg, 0.316 mmol, 1.0 eq) en H2O (0.32 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida para producir el compuesto4bruto, que se usó directamente para el siguiente paso.

A una solución del compuesto4bruto del paso anterior en DMSO (2 ml) se añadió HATU (156 mg, 0.410 mmol, 1.3 eq) en atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadieron el compuesto4a(81 mg, 0.316 mmol, 1.0 eq) y DIEA (123 mg, 0.950 mmol, 3.0 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para producir el compuestoAB10758(58 mg, 49 %).

A una solución agitada del compuestoAB10758(161.3 mg, 0.432 mmol, 1.0 eq) en MeOH (5 ml) se añadió una solución de LiOH·H2O (90.6 mg, 2.16 mmol, 5.0 eq) en H2O (1 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se liofilizó para producir el compuestoAB17011(forma de sal de Li, 108 mg, cuant.) como un sólido amarillo claro.

Síntesis de pitiriacitrina (AB17014)

Como se muestra en la Figura 24L, a una solución del compuesto1(5 g, 42.74 mmol, 1.0 eq) en Et2O anhidro (20 ml) se añadió lentamente COCl2(6.5 g, 0.201 mol, 2.2 eq) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 1 hora a 0 °C, la mezcla se dejó a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 0.5 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida para producir el compuesto2crudo (9 g, 100 %).

A una solución de compuesto crudo2(8 g, 38.28 mmol, 1.0 eq) en EA anhidro (30 ml) se añadió una solución de Bu3SnH (11.1 g, 38.28 mmol, 1.0 eq) en EA anhidro (30 ml) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 0.5 horas a 0 °C, la mezcla se dejó a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.

El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se diluyó con PE (80 ml) y se filtró. La torta de filtración se lavó con PE para producir el compuesto3(3 g, 45 %).

A una solución del compuesto3a(1.53 g, 7.51 mmol, 1.3 eq) y TsOH (1.29 g, 7.51 mmol, 1.3 eq) en MeOH (10 ml) se añadió el compuesto3(1 g, 5.78 mmol, 1.0 eq). La mezcla se agitó a 50 °C durante 2 horas. El análisis LCMS de la mezcla de reacción mostró una conversión completa al producto deseado. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice y prep-TLC (PE: acetona = 4:1) para producir el compuestoAB17014(261 mg, 9 %) como un sólido amarillo.

<1>H RMN (400 MHz, dmso) δ 12.05 (d, J = 52.6 Hz, 1H), 9.24 (s, 1H), 8.55 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 8.39 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 8.29 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.61 – 7.50 (m, 2H), 7.28 (dd, J = 9.3, 5.1 Hz, 4H).

Síntesis de AB17151

Como se muestra en la Figura 24M, a una mezcla del compuesto1(40.0 g, 341 mmol, 1.0 eq) en MeOH (1400 ml) se añadió el compuesto2(9.95 g, 142 mmol, 0.417 eq), seguido de una solución acuosa 1N de HCl (712 ml) y la mezcla se calentó a 70 °C durante 1 hora. Luego, el MeOH se eliminó al vacío y el residuo se disolvió con DCM. La mezcla se lavó con agua y el agua se extrajo con DCM. La fase orgánica combinada se secó con Na2SO4y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 20:1-5:1) para dar el compuesto3(7 g, 72 %) en forma de un sólido ligeramente anaranjado.

A una mezcla de compuesto3(7.0 g, 24.5 mmol, 1.0 eq) en DMF (48.6 ml) se añadió una solución de POCl3(3.78 g, 24.5 mmol, 1.0 eq) en DMF (59.8 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente (13-18 °C) y se agitó durante la noche. Luego, la mezcla se templó con NaHCO3(sat), se extrajo con EtOAc (2 x 110 ml), se secó sobre Na2SO4y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 7:1) y luego prep-HPLC para darAB12508(4.4 g, 57 %) como un sólido de color verde claro.

Una mezcla deAB12508(4.5 g, 14.33 mmol, 1.0 eq), Boc2O (14.06 g, 64.5 mmol, 4.5 eq), DMAP (388.5 mg, 1.433 mmol, 0.1 eq) y TEA (7.24 g, 71.65 mmol, 5.0 eq) en DCM (100 ml) se calentó a 50 °C durante 3 horas. Luego, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente (13-18 °C) y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 100:1~30:1) para dar el compuesto4(5.4 g, 73 %).

A una mezcla del compuesto4(5.4 g, 10.5 mmol, 1.0 eq) en THF (50 ml) se añadió H2O (20 ml), NaH2PO4(4.586 g, 29.4 mmol, 2.8 eq) y NaClO2(2.85 g, 31.5 mmol, 3.0 eq) a temperatura ambiente (13-18 °C). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se controló mediante TLC. Luego, la mezcla se extrajo con EA (3 x 50 ml), se secó sobre Na2SO4y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 50:1-10:1) para dar el compuesto5(2.5 g, 45 %).

A una mezcla de compuesto5(2.5 g, 4.717 mmol, 1.0 eq) y K2CO3(0.976 g, 7.075 mmol, 1.5 eq) en DMF (20 ml) se añadió CH3I (1.0 g, 7.075 mmol, 1.5 eq) a temperatura ambiente (13-18 °C). La mezcla se agitó a 60 °C durante 1 hora. La reacción se controló mediante TLC. Luego, la mezcla se diluyó con agua (20 ml). La mezcla se extrajo con EA (3 x 50 ml), se secó sobre Na2SO4y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 100:1-10:1) para dar el compuesto6(1.8 g, 70 %).

Se agitó una mezcla del compuesto6(1.8 g, 3.3 mmol, 1.0 eq) en HCl/MeOH 3.0 M (20 ml) a 60 °C durante 2 horas. La reacción se controló mediante TLC. Luego, el MeOH se eliminó al vacío y el residuo se disolvió con DCM. La mezcla se lavó con agua y el agua se extrajo con DCM. La fase orgánica combinada se secó con Na2SO4y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 20:1-5:1) para dar el compuestoAB17151(810 mg, impuro), que se trituró con PE/EA (5 ml) para dar el compuestoAB17151. (680 mg, 60 %) como un sólido blanquecino.

<1>H RMN (400 MHz, dmso) δ 11.56 (s, 1H), 10.98 (s, 1H), 7.92 (dd, J = 6.2, 3.1 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.30 (ddd, J = 8.0, 4.7, 3.1 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.11 – 7.05 (m, 2H), 7.00 – 6.95 (m, 1H), 6.80 (ddd, J = 8.0, 7.0, 1.0 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 1.71 – 1.62 (m, 1H), 0.73 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 0.44 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 0.38 – 0.26 (m, 2H).

Síntesis del compuesto VI (AB17225)

Como se muestra en la Figura 24N, a una solución agitada del compuesto1(600 mg, 2.308 mmol, 1.0 eq) en MeOH (10 ml) se añadió sucesivamente MeSO3H (27 mg, 0.281 mmol, 0.12 eq) y ortoacetato de trietilo (935 mg, 5.772 mmol, 2.5 eq) en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El análisis LCMS de la mezcla de reacción mostró una conversión completa al producto deseado. Luego la mezcla se filtró y la torta de filtrado se lavó con MeOH dos veces para producir el compuestoAB17225(500 mg, 76 %) en forma de un sólido blanco.

1H RMN (400 MHz, dmso) δ 11.03 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 8.20 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.11 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.35 (d, J = 2.3 Hz, 3H), 3.00 (s, 3H).

Ácido malassezialáctico (AB17227)

Como se muestra en la figura 24O, a la mezcla del compuesto1(15.0 g, 57.5 mmol, 1.0 eq) en dioxano (200 ml) se añadió indol (13.5 g, 115.0 mol, 2.0 eq), Tris(pentafluorofenil)fosfina (6.1 g, 11.4 mmol, 0.2 eq), Na2CO3(9.1 g, 86.2 mmol, 1.5 eq) y PtCl2(1.5 g, 5.7 mmol, 0.1 eq). El matraz se desgasificó con nitrógeno, se selló y se calentó a 100 °C durante la noche. La reacción se controló mediante TLC. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se diluyó con acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua, NaCl saturado. La solución se concentró al vacío. El compuesto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (PE: EA, 200:1~100:1) para dar el compuesto2(8.3 g, 46.7 %) como un sólido marrón.

A una solución del compuesto2(7.4 g, 21.4 mmol, 1.0 eq) en MeOH (350 ml) y agua (125 ml) se añadió K2CO3(11.8 g, 85.6 mmol, 4.0 eq) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a 90 ºC durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se concentró al vacío. Luego, el residuo se disolvió en acetato de etilo (500 ml) y se lavó con agua y salmuera. La solución se concentró al vacío. El compuesto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (P:E, 50:1~20:1~PE:EA:DCM, 10:1:1) para dar el compuesto3(4.1 g, 77.9 %) como un sólido amarillo.

A una solución del compuesto3(2.8 g, 11.4 mmol, 1.0 eq) e Yb(CF3SO2)3(2.1 g, 3.4 mmol, 0.3 eq) en DCE (40 ml) en N2. A la mezcla se añadió el compuesto4(1.4 g, 13.7 mmol, 1.2 eq) en N2. La mezcla se agitó a 80 °C durante 2 horas. La reacción se controló mediante TLC. La reacción se inactivó con Na2CO3(40 ml) y la solución se acidificó con HCl 2M. La solución se extrajo con DCM (3 x 40 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (40 ml), se secaron (Na2SO4) y se concentraron para dar el compuesto5bruto (2.45 g, 90.7 %) como un sólido rosa.

A una solución del compuesto5(690 mg, 1.95 mmol, 1.0 eq) en MeOH (40 ml) y agua (10 ml) se añadió NaOH (0.15 g, 3.9 mmol, 2.0 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2.5 horas. La reacción se controló mediante TLC. La reacción se secó (Na2SO4) y se concentró. El residuo se acidificó con HCl 2M. La solución se extrajo con DCM (3 x 150 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (150 ml), se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo se purificó por pre-HPLC para darAB17227(330 mg, 51 %) como un sólido de color púrpura.

TLC: DCM:MeOH=10:1, Rf(5)=0.9, Rf(AB17227)=0.2

<1>H RMN (400 MHz, DMSO) δ 10.84(s, 1H), 10.57 (s, 1H), 7.49-7.43(dd, J1=8.0Hz, J2=7.2Hz, 2H), 7.32-7.30(d, J = 8.0Hz, 1H), 7.20-7.18(d, J = 7.6Hz, 1H), 7.10-7.09 (m, 1H), 7.05-7.01(m, 1H), 6.95-6.87(m, 3H), 4.19-4.10(m, 3H), 3.17-3.12(m, 1H), 2.98-2.94(m, 1H).

Síntesis de AB12507

Como se muestra en la Figura 24P, a una solución del compuesto1(25 g, 357 mmol, 1.0 eq) en THF (250 ml) se añadió NaH (17 g, 428.4 mmol, 1.2 eq) en DMF (200 ml) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. Después de 30 minutos, se añadió a la mezcla sulfato de dimetilo (81 g, 642 mmol, 1.8 eq) a 0 °C. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se añadió lentamente ácido acético. El producto se destiló directamente de la mezcla de reacción. Se obtuvo el compuesto2(25 g, 83 %).

A una solución del compuesto3(20 g, 86 mmol, 1.0 eq) en THF (200 ml) se añadió 2M NaHMDS (94.6 mL, 189.2 mmol, 2.2 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 minutos. A la mezcla se añadió Boc2O (21 g, 94.6 mmol, 1.1 eq) en THF (200 ml) a 0 °C durante 40 min. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se añadió a la mezcla NH4Cl saturado, se extrajo con EA (3 x 200 ml) y se lavó la mezcla de reacción con agua. La capa orgánica se lavó con solución salina. El residuo se secó sobre Na2SO4y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA, 60:1-50:1) para dar el compuesto4(18 g, 83 %).

Se añadió CuI (57 mg, 0.3 mmol, 0.1 eq) y PdCl2(PPh3)4(105 g, 0.15 mmol, 0.05 eq) a una solución desgasificada del compuesto4(1.0 g, 3 mmol, 1.0 eq) en TEA (10 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas en atmósfera de nitrógeno. La reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se diluyó con EA (3 x 10 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío para dar como un aceite marrón. El compuesto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (PE/EA, 60:1-50:1) para dar el compuesto5(900 mg, 100 %).

Una solución del compuesto5(5 g, 17 mmol, 1.0 eq), PtCl2(900 mg, 1.7 mmol, 0.1 eq), Na2CO3(2.7 g, 25.5 mmol, 1.5 eq) e indol (4.0 g, 34 mmol, 2.0 eq) en dioxano (50 ml) se calentó a reflujo a 100 °C durante 12 horas en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se controló mediante TLC. El disolvente se evaporó a presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con EA (3 x 50 ml), la mezcla de reacción se lavó con agua, NaCl saturado y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (PE/EA, 50:1-40:1) para dar el compuesto6(3 g, 80 %).

A una solución del compuesto6(3 g, 8 mmol, 1.0 eq) en metanol (75 ml) y agua (25 ml) se añadió K2CO3(3.8 g, 0.027 mol) a temperatura ambiente. La suspensión resultante se calentó a reflujo durante la noche. La reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua y salmuera, luego se secó (sulfato de sodio), se filtró y el disolvente se concentró al vacío. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (PE/EA, 50:1-20:1) para dar el compuesto7(1.5 g, 75 %).

Se agitó una solución de POCl3(73 mg, 0.48 mmol, 1.2 eq) en DMF (1 ml) a 0 °C durante 30 min. A la mezcla se añadió el compuesto7(100 mg, 0.4 mmol, 1.0 eq) en DMF (1 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (2 ml) y se agitó durante 1 hora. La mezcla resultante se extrajo con EA (2 x 2 ml). Las capas orgánicas se combinaron y lavaron con agua, NaCl saturado y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante Prep-TLC para darAB12507(60 mg, 50 %).

Síntesis del compuesto V (AB17219)

Como se muestra en la Figura 24Q, a una solución del compuesto1(20 g, 91.32 mmol, 1.0 eq) en THF (200 ml) se añadió lentamente NaHMDS (2 M en THF, 94.6 ml, 0.201 mol, 2.2 eq) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. Después de agitarse durante 0.5 h a 0 °C, se añadió lentamente una solución de (Boc)2O (21 g, 0.100 mol, 1.1 eq) en THF (40 ml) a 0 °C. La mezcla se dejó a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se templó con NH4Cl saturado (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA = 100 %-30: 1) para producir el compuesto2(18 g, 62 %) como un aceite amarillo.

A una solución de compuesto2(1 g, 3.13 mmol, 1.0 eq) y compuesto2a(0.24 g, 3.43 mmol, 1.1 eq) en TEA (10 ml) se añadió sucesivamente CuI (60 mg, 0.316 mmol, 0.1 eq) y Pd(PPh3)2Cl2(44 mg, 0.0627 mmol, 0.02 eq) a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA = 100 %-50:1) para producir el compuesto3(720 mg, 93 %) como un aceite amarillo.

A una solución del compuesto3(1 g, 3.83 mmol, 1.0 eq) en dioxano (25 ml) se añadió 10 % de PtCl2(0.1 g, 0.376 mmol, 0.1 eq), 5-metilo indol (1 g, 7.63 mmol, 2.0 eq), Tris (pentafluorofenil) fosfina (407 mg, 0.765 mmol, 0.2 eq) y Na2CO3(0.61 g, 5.75 mmol, 1.5 eq) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a 100 °C durante 16 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA = 100 %-6:1) para producir el compuesto4(500 mg, 93 %) como un aceite amarillo.

A una solución del compuesto4(785 mg, 2.18 mmol, 1.0 eq) en MeOH/H2O (20 ml/10 ml) se añadió K2CO3(1.2 g, 8.70 mmol, 4.0 eq). La mezcla se agitó a 90 °C durante 16 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE: EA = 100 %-6:1) para producir el compuesto5(360 mg, 93 %).

A una solución agitada del compuesto5(0.85 g, 3.27 mmol, 1.0 eq) en MeOH (10 ml) se agregó posteriormente MeSO3H (38 mg, 0.39 mmol, 0.12 eq) y ortoacetato de trietilo (1.32 g, 8.18 mmol, 2.5 eq) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. Luego, la mezcla se filtró y la torta del filtro se lavó con MeOH para producir el compuestoAB17219(700 mg, 75 %) en forma de un sólido amarillo claro.

<1>H RMN (400 MHz, dmso) δ 11.01 (s, 1H), 10.76 (s, 1H), 8.21 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 19.3 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.12 (s, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.47 (s, 3H).

Síntesis del compuesto VIII (AB17220)

Como se muestra en la Figura 24R, a una solución de CrO3(39 g, 0.39 mol, 20.0 eq) en H2O (58 ml) se añadió lentamente una solución del compuesto1(5.0 g, 19.53 mmol, 1.0 eq) en AcOH (58 ml) a -5 °C. La mezcla se agitó a 0-5 °C durante 2 horas. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró una conversión completa en el producto deseado. La mezcla se filtró y la torta del filtro se lavó con EtOH y H2O. Luego, la mezcla se filtró para producir el compuesto2impuro (1.652 g, 29 %).

A una solución del compuesto2impuro (1.9 g, 6.64 mmol, 1.0 eq) en Ac2O (160 ml) se añadió polvo de Zn (4.34 g, 66.77 mmol, 10.0 eq) y AcONa (1.35 g, 9.96 mmol, 1.5 eq). La mezcla se agitó a 160 °C durante 0.5 horas. La mezcla se filtró y se lavó sucesivamente con Ac2O hirviendo y acetona. Luego, la mezcla se filtró para producir el compuestoAB17220(417 mg, 16 %).

<1>H RMN (400 MHz, dmso) δ 11.35 (s, 2H), 8.00 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 20.4, 7.7 Hz, 4H), 7.17 (s, 2H), 2.64 (s, 6H).

Síntesis del compuesto VII (AB17221)

Como se muestra en la Figura 24S, una mezcla de compuesto1(348 mg, 2.1 mmol, 2.1 eq), compuesto2(246 mg, 1 mmol, 1 eq), Aliquat (20 mg, 0.05 eq), carbonato de potasio ac (773 mg, 5.6 mg, 2 M), Pd(PPh3)4(23 mg, 0.02 mmol, 0.02 eq) y dioxano (7 ml) se desgasificaron tres veces. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche. Después de enfriar, la mezcla de reacción se templó con HCl acuoso 1N (15 ml). Las precipitaciones resultantes se centrifugaron y lavaron con MeOH/H2O (1:1, 10 ml x 2). El producto resultante se secó al vacío.

Luego, una mezcla del compuesto3(30 mg, 0.073 mmol) y trietilfosfito (122 mg, 0.73 mmol, 10 eq), se desgasificó tres veces y se calentó a 152ºC durante 48 horas. Después de enfriar, la mezcla de reacción se añadió a una solución de 0.5 ml de EtOH y 0.2 ml de H2O. Las precipitaciones resultantes se centrifugaron y lavaron con EtOH/H2O (1:1, 0.3 ml x 2). El producto resultante se secó al vacío y se purificó mediante prep-HPLC para darAB17221(9.4 mg).

Ejemplo 16

Actividad inductora de apoptosis de Malassezina y derivados de Malassezina

Reactivos

El kit Alexa Fluor 488 de anexina V/apoptosis de células muertas, suero bovino fetal (FBS) y 0.25 % de tripsina-EDTA (1x), rojo fenol se adquirieron de Invitrogen. El ensayo Caspase-Glo 3/7 se adquirió de Promega. El medio RPMI 1640 y el medio Eagle modificado de Dulbecco se adquirieron de Gibco. La solución antibiótica antimicótica (100x) se adquirió de Sigma.

Las líneas celulares MeWo (ATCC® HTB-65™), WM115 (ATCC® CRL-1675) y B16F1 (ATCC® CRL-6323) se adquirieron en ATCC y se mantuvieron en los siguientes medios de cultivo: medio de cultivo para MeWo y B16F1: DMEM suplementado con 10 % de FBS; medio de cultivo para WM115: RPMI 1640 complementado con 10 % de FBS.Métodos experimentales

Se recogieron las células y se determinó el número de células usando un contador de células Countess. Las células se diluyeron con medio de cultivo hasta la densidad deseada. La densidad celular final fue de 4,000 células/pocillo durante un tratamiento de 6 horas y 24 horas, y de 2,000 células/pocillo durante un tratamiento de 48 horas y 72 horas. Para el ensayo de anexina V, se emplearon placas de fondo transparente de 384 pocillos (Corning 3712), mientras que se utilizaron placas de fondo blanco sólido de 384 pocillos (Corning 3570) para los ensayos de Caspasa-Glo. Todas las placas se cubrieron con una tapa y se colocaron a 37 °C y 5 % de CO2durante la noche para la unión de las células. Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO a 30 mM de solución madre. Se realizaron diluciones de 10 veces para generar concentraciones de 3 mM and 0.3 mM. Se emplearon 0.9 mM como control positivo, y se empleó DMSO como un control negativo (NC). Se transfieren 132.5 nl de compuestos desde la placa de origen del compuesto a la(s) placa(s) de cultivo celular de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos Echo550. Después del tiempo de incubación indicado, las placas se retiraron de la incubadora para su detección.

Para el ensayo de anexina V, se retiraron las placas de la incubadora y se extrajo el medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces con 40 ul de PBS y se añadieron por pocillo 15 ul de anexina V-FITC premezclada y solución de trabajo de tinte Hoechst 33342. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se sellaron y se centrifugaron durante 1 minuto a 1,000 rpm para eliminar las burbujas. Las placas se leyeron usando ImageXpress Nano.

Para el ensayo Caspasa-Glo, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los reactivos Caspasa-Glo 3/7 también se descongelaron y equilibraron a temperatura ambiente antes del experimento. El reactivo Caspasa-Glo se agregó a los pocillos requeridos en una proporción de 1:1 al medio de cultivo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se leyeron usando el lector de placas EnSpire™. La inducción múltiplo se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Inducción múltiplo = Lummuestra/LumNC.

Resultados del ensayo de anexina V

Las tablas de datos que contienen los porcentajes de células positivas a anexina V a 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a los tratamientos se muestran en las Figuras 24A-25D. Los datos de un conjunto separado de experimentos se muestran en las Figuras 90A-108F.

Los datos de tinción con anexina V mostraron que 100 uM de Malassezina inducía la muerte celular en las tres líneas celulares. La Malassezina fue un inductor de apoptosis más potente en las células WM115 y B16F1 en comparación con MeWo, aunque la respuesta en las células WM115 fue más lenta que en las células MeWo y B16F1.

Resultados del ensayo de caspasa 3/7

Las tablas de datos que contienen el número de veces de inducción de Caspasa 3/7 a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la exposición a los tratamientos se muestran en las Figuras 26A-26D. Los datos de un conjunto separado de experimentos se muestran en las Figuras 109A-127C.

Caspasa 3/7 activada por Malassezina en células WM115 y MeWo a 100 uM. La Malassezina desencadenó la vía de la caspasa 3/7 más rápidamente en las células WM115 que en las células MeWo, lo que coincidió con los datos de tinción con anexina V.

Ejemplo 17

Viabilidad celular después de la exposición a Malassezina y derivados de Malassezina

Reactivos

El ensayo CellTiter-Glo® 2.0 se adquirió de Promega.

Métodos experimentales

Para el ensayo CellTiter-Glo, los compuestos de prueba se prepararon en 10 mM de una solución de DMSO. Los compuestos se diluyeron en serie en 12 concentraciones. Se dispensaron 40 ul de células de una suspensión de 100,000 células/ml en cada pocillo de una placa de 384 pocillos (Corning 3570). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2y 95 % de humedad. Se añadieron los compuestos de prueba, con DMSO como control de vehículo. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2y 95 % de humedad durante 6, 24 o 48 horas, y se añadieron 40 ul de reactivo CellTiter-Glo a los pocillos para evaluar la viabilidad celular.

Resultados

Los porcentajes de viabilidad celular para las células MeWo y WM115 después de la exposición a AB12508 (compuesto E), una composición desconocida, CV-8803 (compuesto K), CV-8804 (compuesto A), CV-8684 (malassezina), CV-8685 (indolo[3,2-b]carbazol), CV-8686 (compuesto I), CV-8688 (compuesto II) y estaurosporina se muestran en las Figuras 27A-27B, Figuras 28A-28B, Figuras 29A-29B, Figuras 30A-30B, Figuras 31A-31B, Figuras 32A-32B, Figuras 33A-33B, Figuras 34A-34B y Figuras 35A-35B, respectivamente. Todos los datos de las muestras expuestas a los compuestos de prueba se normalizaron al control de vehículo correspondiente con el mismo tiempo de incubación.

Ejemplo 18

Posteriormente, se prepararon soluciones madre de compuestos de prueba y control positivo de omeprazol. Las soluciones compuestas se transfirieron a la placa de ensayo usando Echo550. A continuación, la placa se volvió a colocar en la incubadora para el tratamiento del compuesto.

Resultados

Las lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a varias concentraciones de omeprazol, CV-8684 (malassezina), CV-8685 (indolo[3,2-b]carbazol), CV-8686 (compuesto I), una composición desconocida, CV-8803 (compuesto K), CV-8804 (compuesto A), AB12508 (compuesto E) y CV-8688 (compuesto II) se muestran en las Figuras 36A-36B, 37A-37B, 38A-38B, 39A-39B, 40A-40B, 41A-41B, 42A-42B, 43A-43B, y 44A-44B, respectivamente.

Las lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a varias concentraciones de omeprazol, una composición desconocida, 2,3,7,8-tetraclorodibenzodioxina (TCDD), CV-8819 (compuesto A5), CV-8684 (malassezina), AB12508 (compuesto E), CV-8686 (compuesto I), AB12509 (compuesto H), CV-8688 (compuesto II), CV-8877 (compuesto B), CV-8685 (indolo[3,2-b]carbazol), compuesto B10 y CV-8687 (compuesto IV) se muestran en las Figuras 45A-45B, 46A-46B, 47A-47B, 48A-48B, 49A-49B, 50A-50B, 51A-51B, 52A-52B, 53A-53B, 54A-54B, 55A-55B, 56A-56B, y 57A-57B, respectivamente.

Las lecturas de la actividad AhR de los ensayos de HepG2-AhR-Luciferasa tras la exposición a varias concentraciones de omeprazol, TCDD, precursor de Malassezina, AB11644, 3-metilcolantreno (3-MC), AB12976 (O52), AB17011 (Malassezia indol A), pitiriacitrina, AB17151, y AB17225 se muestran en las Figuras 58A-58B, 59A-59B, 60A-60B, 61A-61B, 62A-62B, 63A-63B, 64A-64B, 65A-65B, 66A-66B, y 67A-67B, respectivamente.

Los resultados de dos conjuntos de experimentos se resumen en las Tablas 1 y 2 a continuación.

T l 1

T l 2

Ejemplo 19

Ensayos MelanoDerm™

Resumen del estudio 1

El propósito de este estudio fue evaluar la acción potencial de los artículos de prueba como moduladores de la melanogénesis cutánea en el modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas. Los tratamientos fueron los siguientes: 7 días de tratamiento en días alternos (7TD); 7 días de tratamiento en días alternos seguidos de 7 días sin tratamiento (recuperación) (7TD+7NTD); y 14 días de tratamiento en días alternos (14TD). El estudio también evaluó la irritación dérmica potencial inducida por cada artículo de prueba medida por la conversión de MTT por los tejidos MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas a los artículos de prueba, durante los períodos de tratamiento especificados en el protocolo.

El ensayo de conversión de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazolio), que mide la reducción de la enzima microsomal dependiente de NAD(P)H de MTT (y en menor medida, la succinato deshidrogenasa reducción de MTT) a un precipitado de formazán azul, se utilizó para evaluar el metabolismo celular después de la exposición a un artículo de prueba. (Berridgeet al., 1996). La toxicidad de los artículos de prueba para el tejido, que es evidencia de una posible irritación dérmica, se determinó midiendo la supervivencia relativa: la conversión de MTT en relación con los tejidos tratados con el control negativo.

Materiales y métodos

Recepción del modelo de piel MelanoDerm™

Tras la recepción del kit para la piel MelanoDerm™ (MatTek Corporation), las soluciones se almacenaron según lo indicado por el fabricante. Los tejidos MelanoDerm™ se almacenaron a 2-8 °C hasta su uso. El día de la recepción (el día antes de la dosificación), el medio de mantenimiento MelanoDerm™ (EPI-100-LLMM) se calentó a aproximadamente 37 °C. Se tomaron alícuotas de nueve décimas de ml de EPI-100-LLMM en los pocillos apropiados de las placas de 6 pocillos. Las placas de 6 pocillos se etiquetaron para indicar los artículos de prueba o controles y sus volúmenes de dosis y condiciones de exposición (designados para los puntos finales de MTT y melanina). Se inspeccionó cada tejido MelanoDerm™ en busca de burbujas de aire entre el gel de agarosa y el inserto de cultivo celular antes de abrir el paquete sellado. No se utilizaron tejidos con burbujas de aire que cubrían más del 50 % del área del inserto de cultivo celular. Los contenedores de envío de 24 pocillos se sacaron de la bolsa de plástico y sus superficies se desinfectaron con etanol al 70 %. Los tejidos MelanoDerm™ se transfirieron asépticamente a las placas de 6 pocillos. Los tejidos MelanoDerm™ se incubaron a 37±1 °C en una atmósfera humidificada de 5±1 % de CO2en aire (condiciones de cultivo estándar) durante la noche (al menos 16 horas).

Al menos 16 horas después de la incubación de los tejidos a partir de la fecha de recepción, los ocho tejidos MelanoDerm™ designados para el MTT (2 tejidos, denominados "día sin tratar" 0 a los efectos de este informe) y ensayos de melanina (3 tejidos), respectivamente, se fotografiaron con una cámara digital (cámara CANON, PowerShot SX130IS, enfoque óptico de 12x, ajuste manual) para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos al comienzo del ensayo. Estas imágenes macroscópicas se tomaron de la parte inferior de los tejidos MelanoDerm™, que se invirtieron para mostrar mejor la melanina. También se tomaron fotografías con una cámara Infinity 2 conectada a un microscopio Nikon Eclipse TE 2000U invertido (aumento de 15x y 60x, respectivamente). Los tejidos MelanoDerm™ sin tratar se aclararon luego suavemente con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco libre de Ca++ y Mg++ estéril (CMF-DPBS), se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminaron del exceso de líquido. A continuación, se transfirieron dos tejidos a los pocillos que contenían MTT apropiados durante 3±0.1 horas para el punto final de viabilidad de MTT (consulte la sección “ensayo de MTT”). Se extrajeron tres tejidos MelanoDerm™ sin tratar del inserto de cultivo celular con un bisturí estéril, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C para el análisis de melanina posterior (consulte la sección “ensayo de melanina”).

Preparación del artículo de prueba

Los artículos de prueba, CV-8686 y AB11644, se proporcionaron como soluciones madre (~100 mM cada una) en DMSO. Los artículos de prueba se administraron al sistema de prueba como una dilución de 50 µM y 200 µM en EPI-100-LLMM estéril. El artículo de prueba DMSO (control de vehículo) se administró al sistema de prueba como una dilución al 0.2 % en EPI-100-LLMM estéril.

Cada uno de los artículos de prueba se preparó usando el procedimiento siguiente: partiendo de las concentraciones de solución madre proporcionadas, primero se diluyeron 2 µl de cada artículo de prueba con el volumen apropiado de EPI-100-LLMM hasta una concentración final de 200 µM. Se añadieron 250 uL de la dilución de 200μM (que corresponde a cada artículo de prueba) a 750 μL de EPI-100-LLMM para preparar la dilución de 50 μL usada en el estudio. Las diluciones del artículo de prueba se agitaron con vórtice durante al menos 1 minuto, se calentaron a 37°±1 °C (en un baño de agua) durante 15 minutos y se agitaron nuevamente con vórtice durante al menos 1 minuto antes de la aplicación sobre los tejidos a un volumen de 25 μl.

El control de disolvente, DMSO, se diluyó (v/v) con EPI-100-LLMM hasta una concentración final del 0.2 %. El control de disolvente diluido se agitó con vórtice durante al menos 1 minuto antes de la aplicación sobre los tejidos a un volumen de 25 µl.

Evaluación de la reducción del artículo de prueba directa de MTT

Cada dilución del artículo de prueba se añadió a una solución de MTT (Sigma) de 1.0 mg/ml en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) caliente que contenía L-glutamina (medio de adición de MTT) 2 mM para evaluar su capacidad para reducir directamente el MTT. Se agregaron aproximadamente 25 μl de cada artículo de prueba a 1 ml de la solución de MTT y las mezclas se incubaron en condiciones de cultivo estándar durante aproximadamente una hora. Al mismo tiempo se analizó un control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril (Quality Biological). Si el color de la solución MTT se volvió azul/violeta, se suponía que el artículo de prueba había reducido el MTT.

No se observó que los artículos de prueba, CV-8686, AB11644 y DMSO redujeran MTT directamente en ausencia de células viables.

Determinación del pH

El pH de cada artículo de prueba se midió usando papel de pH (EMD Millipore Corporation). Inicialmente, cada artículo de prueba se añadió a un papel de pH con un intervalo de pH de 0-14 en incrementos de 1.0 unidades de pH para aproximarse a un intervalo de pH estrecho. A continuación, cada artículo de prueba se añadió a papel de pH con un intervalo más estrecho de 5-10 unidades de pH con incrementos de 0.5 unidades de pH, para obtener un valor de pH más preciso. Se midió el pH de cada artículo de prueba para cada dosis aplicada sobre los tejidos (días 0, 2, 4, 6, 10, 12, 14, según fuera apropiado).

Ensayo definitivo

Tratamiento del artículo de prueba: Grupo 7TD = ensayo de 7 días (tratamiento en días alternos)

Se trataron tópicamente ocho tejidos MelanoDerm™ cada 48±2 horas con el artículo de prueba (CV-8686 y AB11644 a las concentraciones especificadas) a un volumen de dosificación de 25 ul, durante un período de 7 días. Se trataron tópicamente dos tejidos MelanoDerm™ cada 48±2 horas con cada uno de control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril (Quality Biological) y control positivo (1 % de ácido kójico preparado en agua desionizada estéril), respectivamente, durante una prueba de 7 días. La solución de ácido kójico se filtró en el momento de la preparación y se almacenó en un tubo cubierto con papel de aluminio hasta su uso (2 horas desde la preparación). Los tejidos se trataron con los artículos de prueba y los controles de ensayo, respectivamente, cada 48±2 horas durante un período de 7 días. A continuación, los tejidos expuestos se incubaron en condiciones de cultivo estándar.

Tratamiento del artículo de prueba: 7TD+7NTD = 7 días de tratamiento en días alternos seguidos de 7 días sin tratamiento (recuperación)

Se trataron tópicamente ocho tejidos MelanoDerm™ cada 48±2 horas con el artículo de prueba (CV-8686 a las concentraciones especificadas en el protocolo) a un volumen de dosificación de 25 ul, durante un período de 7 días. Los tejidos se trataron con el artículo de prueba cada 48±2 horas durante un período de 7 días. Después de los primeros 7 días de tratamiento en días alternos, los tejidos se cultivaron durante un período adicional de 7 días sin tratamiento agregado tópicamente. Los tejidos se "alimentaron" diariamente como se detalla a continuación. A continuación, los tejidos expuestos se incubaron en condiciones de cultivo estándar.

Tratamiento del artículo de prueba: Grupo 14TD = 14 días de tratamiento en días alternos

Se trataron tópicamente ocho tejidos MelanoDerm™ cada 48±2 horas con el artículo de prueba (CV-8686 y DMSO a las concentraciones especificadas en el protocolo) a un volumen de dosificación de 25 ul, durante un período de 7 días. Se trataron tópicamente dos tejidos MelanoDerm™ cada 48±2 horas con cada uno de control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril (Quality Biological) y control positivo (ácido kójico al 1 % preparado en agua desionizada estéril), respectivamente, durante una prueba de 14 días. La solución de ácido kójico se filtró en el momento de la preparación y se almacenó en un tubo cubierto con papel de aluminio hasta su uso (2 horas desde la preparación). Los tejidos se trataron con los artículos de prueba y los controles de ensayo, respectivamente, cada 48±2 horas durante un período de 14 días. A continuación, los tejidos expuestos se incubaron en condiciones de cultivo estándar.

Los tejidos MelanoDerm™ tratados se "volvieron a alimentar" a diario. Los tejidos se golpearon suavemente para asegurar la distribución uniforme de los controles aplicados tópicamente. A continuación, los tejidos tratados se colocaron en nuevas placas de 6 pocillos previamente etiquetadas que contenían 0.9 ml de EPI-100-LLMM precalentado (~37 °C) y se devolvieron a la incubadora y permanecieron en condiciones de cultivo estándar.

Después de cada 48±2 horas de tiempo de exposición, los tejidos MelanoDerm™ se enjuagaron suavemente tres veces con ~ 500 μl de DPBS libre de Ca++ Mg++ para eliminar cualquier artículo de prueba residual. Los tejidos se colocaron primero en nuevas placas de 6 pocillos preetiquetados que contenían 0.9 ml de EPI-100-LLMM precalentado (~37 °C) y luego se dosificaron con el artículo de prueba apropiado, control negativo o positivo como se discutió anteriormente. Al final de cada ensayo individual (7TD; 7TD+7NTD; y 14TD, respectivamente), los tejidos de cada grupo de tratamiento (artículo de prueba, control negativo y control positivo) se enjuagaron suavemente con DPBS libre de Ca++Mg++, se secaron en papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Luego, los tejidos se fotografiaron usando una cámara digital (cámara CANON, PowerShot SX130IS, enfoque óptico de 12x, ajuste manual) para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos al comienzo del ensayo. Estas imágenes macroscópicas se tomaron de la parte inferior de los tejidos MelanoDerm™, que se invirtieron para mostrar mejor la melanina. Se tomaron fotografías microscópicas utilizando una cámara Infinity 2 conectada a un microscopio Nikon Eclipse TE 2000U invertido (aumento de 15x y 60x, respectivamente).

A continuación, se aclararon tres tejidos de cada grupo de tratamiento con CMF-DPBS, se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos se retiraron del inserto usando bisturís estériles, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C durante la noche para el análisis de melanina posterior como se describe en la sección del ensayo de melanina. A continuación, se enjuagaron suavemente dos tejidos MelanoDerm™ de cada grupo de tratamiento (artículo de prueba, control negativo y control positivo) con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco libre de Ca++ y Mg++ estéril (CMF-DPBS), se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminaron los excesos de líquido. A continuación, los tejidos se transfirieron a los pocillos que contenían MTT apropiados durante aproximadamente 3 horas para el punto final de viabilidad de MTT (véase la sección de Ensayo de MTT).

Ensayo MTT

Se preparó una solución de 1.0 mg/ml de MTT en medio de adición de MTT tibio no más de 2 horas antes de su uso. Después del tiempo de exposición apropiado, los tejidos MelanoDerm™ designados para el punto final de MTT se enjuagaron ampliamente con CMF-DPBS y se decantó el medio de lavado. Se añadieron 0.3 ml de reactivo MTT a los pocillos designados en una placa de 24 pocillos previamente etiquetada. Los tejidos MelanoDerm™ se transfirieron a los pocillos apropiados después del enjuague. Las placas se incubaron durante aproximadamente tres horas en condiciones de cultivo estándar.

Después del período de incubación con solución de MTT, los tejidos MelanoDerm™ se secaron en papel absorbente estéril, se eliminaron el exceso de líquido y se transfirieron a una placa de 24 pocillos preetiquetada que contenía 2.0 ml de isopropanol en cada pocillo designado. A continuación, las placas se agitaron durante al menos dos horas a temperatura ambiente.

Al final del período de extracción, el líquido dentro de los insertos de cultivo celular se decantó en el pocillo del que se tomó el inserto de cultivo celular. La solución de extracto se mezcló y se transfirieron 200 μl a dos pocillos de una placa de 96 pocillos designados para cada muestra y se colocaron 200 μl de isopropanol en los dos pocillos designados como blancos. La absorbancia a 550 nm (OD550) de cada pocillo se midió con un lector de placas Vmax Molecular Devices. Ensayo de melanina

El día de la extracción de melanina, los tejidos extirpados se descongelaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se agregaron 250 μl de resoluble a cada tubo de microcentrífuga y los tubos se incubaron durante al menos 16 horas a 60±2 °C junto con los estándares de melanina en un baño seco. Junto con las muestras, se mezclaron 25 μl de cada dilución de artículo de prueba preparada el mismo día con 250 μl de resoluble y se incubaron durante al menos 16 horas a 60±2 °C en un baño seco (solo para fines de R&D). Se preparó una solución madre estándar de melanina de 1 mg/ml disolviendo la melanina en resoluble. Se preparó una serie de patrones de melanina a partir de 1 mg/ml. La serie estándar se preparó agregando 0.6 ml de la solución madre estándar de melanina de 1 mg/ml a 1.2 ml de resoluble y luego haciendo una serie de cinco diluciones más (factor de dilución de 3). Se utilizó resoluble como el estándar cero.

Al menos 16 horas después de iniciar la extracción de melanina, los tubos que contienen las muestras (que representan la melanina extraída de los tejidos de MelanoDerm™), las diluciones del artículo de prueba se mezclaron con resoluble y los estándares se enfriaron a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron 200 μL de muestras a las placas adecuadas de una placa de 96 pocillos. Los 200 μL de estándares y blancos se transfirieron a los pocillos adecuados de una placa de 96 pocillos en duplicado. 200 μL de diluciones del artículo de prueba y medio EPI-100-LLMM se transfirieron a los pocillos adecuados de una placa de 96 pocillos en una placa simple solamente. La absorbancia a 490 nm (OD490) de cada pocillo se midió con un lector de placas Vmax Molecular Devices.

Presentación de datos

Datos MTT – día 0

Se capturaron los datos de absorbancia sin procesar. Se calculó el valor medio de OD550 de los pocillos en blanco. El valor de OD550 corregido del tejido no tratado se determinó restando el valor de OD550 medio de los pocillos en blanco de los valores de OD550 del tejido sin tratar. Los valores de % de viabilidad individuales se tabularon para cada tejido individual dividiendo el valor de OD550 corregido individual por la media de todos los valores de OD550 calculados para el tejido no tratado. Se calculó un % de viabilidad media global. Finalmente, el valor medio de viabilidad de los tejidos no tratados se representó en un gráfico de barras (con ± 1 barra de error de desviación estándar).

Datos MTT - día 7, día 14

Se capturaron los datos de absorbancia sin procesar. Se calculó el valor medio de OD550 de los pocillos en blanco. El valor medio corregido de la OD550 del control negativo se determinó restando el valor medio de la OD550 de los pocillos en blanco de sus valores medios de la OD550. Los valores de OD550 corregidos de la exposición del artículo de prueba individual, las exposiciones de control positivo y las exposiciones de control negativo se determinaron restando de cada uno el valor de OD550 medio de los pocillos en blanco.

Tiempo de exposición del artículo de prueba corr. OD550 = tiempo exposición del artículo de prueba OD550 – OD550 medio del blanco

El siguiente porcentaje de cálculos de control se realizó para los tejidos tratados con el artículo de prueba y los tejidos tratados con el control positivo:

% de viabilidad = [(OD550 final corregido del artículo de prueba o control positivo) / (OD550 media corregida del control negativo/solvente)] x 100

El siguiente porcentaje de cálculos de control se realizaron para los tejidos tratados con el artículo de prueba, donde el artículo de prueba era DMSO (control de disolvente):

% de viabilidad = [(OD550 final corregida del artículo de prueba (control de disolvente)) / (OD550 media corregida del control negativo)] x 100

El % individual de valores de control se promedió para calcular el % medio de control por cada artículo de prueba o control positivo. Se calculó un promedio general de la viabilidad de MTT. Finalmente, los valores medios de viabilidad se trazaron en un gráfico de barras (con ± 1 barra de error de desviación estándar).

Datos de melanina

Se capturaron los datos de absorbancia sin procesar. Se determinó el valor de OD490 de cada estándar de melanina. El valor medio de OD490 de cada estándar de melanina se utilizó para preparar una curva estándar. El valor de OD490 corregido de cada concentración estándar de melanina se determinó restando el valor de OD490 del pocillo blanco del valor de OD490 de la concentración estándar de melanina. La curva estándar se representó como la concentración de los estándares en mg/ml (eje y) frente a la absorbancia corregida correspondiente (valor de OD490). La cantidad de melanina en el artículo de prueba o en los tejidos tratados con control positivo se interpoló matemáticamente a partir de la curva estándar (cuadrática).

Resultados y discusión

Los artículos de prueba, CV-8686, DMSO y AB11644, se probaron en un ensayo de detección de modulador de melanogénesis utilizando el modelo de tejido asiático MelanoDerm™ para evaluar su potencial de irritación dérmica y su impacto en la melanogénesis después de exposiciones repetidas. Se probaron los siguientes períodos de tratamiento: 7 días de tratamiento en días alternos (7TD); 7 días de tratamiento en días alternos seguidos de 7 días sin tratamiento (recuperación) (7TD+7NTD); y 14 días de tratamiento en días alternos (14TD).

Los artículos de prueba se administraron al sistema de prueba como diluciones v/v preparadas en EPI-100-LLMM estéril. Los artículos de prueba CV-8686 y AB11644 se administraron al sistema de prueba como diluciones de 200 µM y 50 µM. El artículo de prueba, DMSO (control de vehículo), se administró al sistema de prueba como una dilución al 0.2 % (v/v). Cada dilución de los artículos de prueba se aplicó tópicamente a cinco tejidos MelanoDerm™ (dos designados para el criterio de valoración MTT y tres para el criterio de valoración de la melanina). Los tejidos se trataron con 25 μl de cada artículo de prueba cada 48±2 horas durante cada período de prueba individual. El control negativo (agua desionizada estéril) y el control positivo (1 % de ácido kójico preparado en agua desionizada estéril) se aplicaron tópicamente a cinco tejidos MelanoDerm™ cada uno (dos designados para el punto final de MTT y tres para el punto final de melanina) y se trataron con 25 μl cada 48±2 horas durante un período de 7 y 14 días, respectivamente.

Las Figuras 68-69 resumen la viabilidad tisular media y los resultados de concentración de melanina para los artículos de prueba, el control negativo y el control positivo. Las Figuras 70-74 contienen fotografías macroscópicas y microscópicas representativas (solo aumento de 15x) de los tejidos tomadas para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos el día 0, el día 7 y el día 14. Se consideran representativos de los tejidos replicados dentro de cada grupo de tratamiento y relevantes para la interpretación de datos posterior. Las imágenes macroscópicas son indicativas de la producción total de melanina en los tejidos y su distribución en la superficie de los tejidos. Las imágenes microscópicas proporcionan una visión general del estado fisiológico de los melanocitos con respecto a la producción de melanina, la presencia de dendritas o cualquier cambio morfológico asociado con el tratamiento del artículo de prueba/controles.

La evaluación de la viabilidad del tejido se utilizó para evaluar la posible irritación dérmica de los artículos de prueba a los tejidos de MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas durante los períodos especificados en el protocolo. La viabilidad de los tejidos tratados con los artículos de prueba fue relativamente alta (>75 % en todos los casos, durante el período de tratamiento 7TD), lo que indica una citotoxicidad mínima o nula inducida por los artículos de prueba en el modelo de tejido. Se observó una respuesta a la dosis para los artículos de prueba CV-8686 y AB11644 en los que el tejido tratado con la concentración más alta (200 µM) tenía una viabilidad ligeramente menor en comparación con los tejidos tratados con los compuestos preparados como diluciones de 50 µM. La viabilidad de los tejidos disminuyó progresivamente con tiempos de exposición más largos (7TD+7NTD; y período de tratamiento 14TD); además, la viabilidad de los tejidos tratados con el control positivo del ensayo, 1 % de ácido kójico, fue de 119.0 % para el período de prueba 7TD y disminuyó a 48.8 % para el período de prueba 14TD. Estos resultados indican que el modelo de tejido es capaz de discriminar las acciones de diversas concentraciones de los artículos de prueba sobre la viabilidad.

La evaluación de la producción de melanina por los tejidos tratados con los artículos de prueba después de exposiciones repetidas durante los períodos de tiempo especificados en el protocolo se utilizó para evaluar el potencial de los artículos de prueba como moduladores de la melanogénesis cutánea. El control positivo, 1 % de ácido kójico, redujo la concentración de melanina a 23.3 μg/ml en los tejidos tratados con el control positivo (7TD) en comparación con los tejidos tratados con el control negativo (55.8 μg/ml). El control positivo, 1 % de ácido kójico, redujo la concentración de melanina a 29.1 μg/ml en los tejidos tratados con el control positivo (14TD) en comparación con los tejidos tratados con el control negativo (174.0 μg/ml). La concentración de melanina determinada para los tejidos tratados con DMSO fue de 135.8 μg/ml (14TD), lo que indica que el control del vehículo no afecta la producción de melanina por sí solo. La concentración de melanina en los tejidos tratados con el artículo de prueba fue menor en comparación con los tejidos tratados con el control negativo (acentuada durante el período 14TD). En general, los resultados objetivos obtenidos al realizar el ensayo de melanina están respaldados por las observaciones subjetivas basadas en el análisis de las fotografías macroscópicas y microscópicas tomadas durante el estudio.

Los artículos de prueba, CV-8686, DMSO y AB11644, no redujeron MTT directamente en ausencia de células viables. Por lo tanto, no se realizó un experimento de control muerto.

Resumen del estudio 2

El propósito de este estudio fue evaluar la acción potencial de los artículos de prueba como moduladores de la melanogénesis cutánea en el modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas, durante 7 días de tratamiento. El estudio también evaluó la irritación dérmica potencial inducida por cada artículo de prueba, medida por la conversión de MTT por los tejidos MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas a los artículos de prueba, durante el período de tratamiento de 7 días.

El ensayo de conversión de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio), que mide la reducción de la enzima microsomal dependiente de NAD(P)H de MTT (y en menor medida, la succinato deshidrogenasa reducción de MTT) a un precipitado de formazán azul, se utilizó para evaluar el metabolismo celular después de la exposición a un artículo de prueba 1. La toxicidad de los artículos de prueba para el tejido, que es evidencia de una posible irritación dérmica, se determinó midiendo la supervivencia relativa: la conversión de MTT en relación con los tejidos tratados con el control negativo.

Materiales y métodos

Recepción del modelo de piel MelanoDerm™

Tras la recepción del kit para la piel MelanoDerm™ (MatTek Corporation), las soluciones se almacenaron según lo indicado por el fabricante. Los tejidos MelanoDerm™ se almacenaron a 2-8 °C hasta su uso. El día de la recepción (el día anterior a la dosis), se calentó el medio de mantenimiento MelanoDerm™ (EPI-100-LLMM) hasta aproximadamente 37 °C. Se dividieron en alícuotas de 0.9 ml de EPI-100-LLMM en los pocillos apropiados de las placas de 6 pocillos. Las placas de 6 pocillos se etiquetaron para indicar los artículos de prueba o controles y sus volúmenes de dosis y condiciones de exposición (designados para los puntos finales de MTT y melanina). Se inspeccionó cada tejido MelanoDerm™ en busca de burbujas de aire entre el gel de agarosa y el inserto de cultivo celular antes de abrir el paquete sellado. No se utilizaron tejidos con burbujas de aire que cubrían más del 50 % del área del inserto de cultivo celular. Los contenedores de envío de 24 pocillos se sacaron de la bolsa de plástico y sus superficies se desinfectaron con etanol al 70 %. Los tejidos MelanoDerm™ se transfirieron asépticamente a las placas de 6 pocillos. Los tejidos MelanoDerm™ se incubaron a 37±1 °C en una atmósfera humidificada de 5±1 % de CO2 en aire (condiciones de cultivo estándar) durante la noche (al menos 16 horas).

Al menos 16 horas después de la incubación de los tejidos a partir de la fecha de recepción, cinco tejidos MelanoDerm™ designados para el MTT (2 tejidos, denominados "día sin tratar" 0 para los fines de este informe) y parámetros de valoración de melanina (3 tejidos), respectivamente, se enjuagaron suavemente con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco libre de Ca++ y Mg++ estéril (CMF-DPBS), se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminó del exceso de líquido. A continuación, los tejidos se fotografiaron con una cámara digital (cámara CANON, PowerShot SX130IS, enfoque óptico de 12x, ajuste manual y un Ricoh WG-50, modo microscopio, enfoque de 1 cm) para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos al comienzo del ensayo. Estas imágenes macroscópicas se tomaron de la parte inferior de los tejidos MelanoDerm™, que se invirtieron para mostrar mejor la melanina. También se tomaron fotografías con una cámara Infinity 2 conectada a un microscopio Nikon Eclipse TE 2000U invertido (aumento de 15x y 60x, respectivamente).

A continuación, se transfirieron dos MelanoDerm™ sin tratar a los pocillos que contenían MTT apropiados durante 3±0.1 horas para el punto final de viabilidad de MTT. Se extrajeron tres tejidos MelanoDerm™ sin tratar del inserto de cultivo celular con un bisturí estéril, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C para el análisis de melanina posterior (consulte la sección Ensayo de melanina).

Preparación del artículo de prueba

Los artículos de prueba, Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819) y O52 (AB12976), fueron preparados diluyendo las concentraciones de la solución madre con EPI-100-LLMM a concentraciones finales de 200 μM y 500 μM. El artículo de prueba, compuesto I (CV-8686), se preparó diluyendo la concentración de solución madre a 500 µM. Todas las diluciones se agitaron con vórtice durante al menos 1 minuto y luego se calentaron en un baño de agua a 37º ± 1 °C durante 15 minutos. A continuación, las diluciones se agitaron de nuevo con vórtice durante al menos 1 minuto antes de dosificarlas sobre los tejidos. El artículo de prueba y el control de disolvente, DMSO, se prepararon como una dilución al 0.5 % (v/v) en EPI-100-LLMM. La dilución del artículo de prueba se agitó con vórtice durante al menos 1 minuto y luego de nuevo durante al menos 1 minuto antes de aplicarse sobre los tejidos. El artículo de prueba, formulación del compuesto I, se probó sin dilución (puro).

Evaluación de la reducción del artículo de prueba directa de MTT

La concentración más alta de cada artículo de prueba que se diluyó se añadió a una solución de MTT (Sigma) de 1.0 mg/ml en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) caliente que contenía L-glutamina (medio de adición de MTT) 2 mM para evaluar su capacidad para reducir directamente MTT. Se agregaron aproximadamente 25 μl de cada artículo de prueba a 1 ml de la solución de MTT y las mezclas se incubaron en condiciones de cultivo estándar durante aproximadamente una hora. Al mismo tiempo se analizó un control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril (Quality Biological). Si el color de la solución MTT se volvió azul/violeta, se suponía que el artículo de prueba había reducido el MTT.

Los artículos de prueba, DMSO, compuesto I (CV-8686), Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819), O52 (AB12976) y la formulación del compuesto I, no se observó que redujeran el MTT directamente en ausencia de células viables.

Determinación del pH

El pH de cada artículo de prueba y el control positivo se midieron usando papel de pH (EMD Millipore Corporation). Inicialmente, cada artículo de prueba o el control positivo se añadió a un papel de pH con un intervalo de pH de 0-14 en incrementos de 1.0 unidades de pH para aproximarse a un intervalo de pH estrecho. A continuación, cada artículo de prueba o el control positivo se añadió a papel de pH con un intervalo más estrecho de 0-6 o 5-10 unidades de pH con incrementos de 0.5 unidades de pH, para obtener un valor de pH más preciso. Se midió el pH de cada artículo de prueba o el control positivo para cada dosis aplicada sobre los tejidos (días 0, 2, 4, 6) según fuera apropiado.

Ensayo definitivo

Tratamiento del artículo de prueba

Cinco tejidos MelanoDerm™ se trataron tópicamente cada 48±2 horas con los artículos de prueba, control de disolvente (DMSO), compuesto I (CV-8686), Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819), O52 (AB12976), y formulación del compuesto I, a las concentraciones especificadas a un volumen de dosificación de 25 ul, durante un período de 7 días. Se trató tópicamente un tejido MelanoDerm™ cada 48±2 horas con el control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril (Quality Biological). Cinco tejidos MelanoDerm™ se trataron tópicamente cada 48±2 horas con el control positivo (1 % de ácido kójico preparado en agua desionizada estéril) para una prueba de 7 días. La solución de ácido kójico se filtró en el momento de la preparación y se almacenó en un tubo cubierto con papel de aluminio hasta su uso (2 horas desde la preparación). Los tejidos se trataron con los artículos de prueba y los controles de ensayo, respectivamente, cada 48±2 horas durante un período de 7 días. A continuación, los tejidos expuestos se incubaron en condiciones de cultivo estándar.

Después de cada 48±2 horas de tiempo de exposición, los tejidos MelanoDerm™ se enjuagaron suavemente tres veces con ~ 500 μl de DPBS libre de Ca++ Mg++ para eliminar cualquier artículo de prueba residual. Luego, los tejidos se colocaron en nuevas placas de 6 pocillos previamente etiquetadas que contenían 0.9 ml de EPI-100-LLMM precalentado (~37 °C) y luego se dosificaron con el artículo de prueba apropiado, control negativo o positivo como se discutió anteriormente.

Al final del período de exposición de 7 días, los tejidos de cada grupo de tratamiento (artículo de prueba, control negativo, control positivo y control de disolvente), se enjuagaron suavemente con DPBS libre de Ca++ Mg++, se secaron en seco sobre esterilización, papel absorbente y eliminó el exceso de líquido. A continuación, los tejidos se fotografiaron con una cámara digital (cámara CANON, PowerShot SX130IS, enfoque óptico de 12x, ajuste manual y un Ricoh WG-50, modo microscopio, enfoque de 1 cm) para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos. al comienzo del ensayo. Estas imágenes macroscópicas se tomaron de la parte inferior de los tejidos MelanoDerm™, que se invirtieron para mostrar mejor la melanina. Se tomaron fotografías microscópicas utilizando una cámara Infinity 2 conectada a un microscopio Nikon Eclipse TE 2000U invertido (aumento de 15x).

Para cada concentración de artículo de prueba, el control positivo y el control de disolvente, se enjuagaron luego dos tejidos con CMF-DPBS, se secaron en seco sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Para el control negativo, el único tejido se enjuagó con CMF-DPBS, se secó sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos se retiraron del inserto usando bisturíes estériles, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C durante la noche para el análisis de melanina posterior.

Dos tejidos MelanoDerm™ de los artículos de prueba, DMSO, compuesto I (CV-8686), Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819) (500 μM), O52 (AB12976) (500 μM), formulación del compuesto I y control positivo, y tres tejidos MelanoDerm™ para los artículos de prueba, compuesto A5 (CV-8819) (200 μM) y O52 (AB12976) (200 µM), se enjuagaron luego suavemente con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco libre de Ca++ y Mg++ estéril (CMF-DPBS), se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. A continuación, los tejidos se transfirieron a los pocillos que contenían MTT apropiados durante aproximadamente 3 horas para el punto final de viabilidad de MTT.

Ensayo MTT

Después del período de incubación con solución de MTT, los tejidos MelanoDerm™ se secaron en papel absorbente estéril, se eliminó el exceso de líquido y se transfirieron a una placa de 24 pocillos preetiquetada que contenía 2.0 ml de isopropanol en cada pocillo designado. Luego, las placas se agitaron durante al menos dos horas a temperatura ambiente.

El día de la extracción de melanina, los tejidos extirpados se descongelaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos. Se agregaron 250 μl de resoluble a cada tubo de microcentrífuga y los tubos se incubaron durante al menos 16 horas a 60±2 °C junto con los estándares de melanina en un baño seco. Se preparó una solución madre estándar de melanina de 1 mg/ml disolviendo la melanina en resoluble. Se preparó una serie de patrones de melanina a partir de la solución madre de 1 mg/ml. La serie estándar se preparó agregando 0.6 ml de la solución madre estándar de melanina de 1 mg/ml a 1.2 ml de resoluble y luego haciendo una serie de cinco diluciones más (factor de dilución de 3). Se utilizó resoluble como el estándar cero.

Al menos 16 horas después de iniciar la extracción de melanina, los tubos que contenían las muestras (que representan la melanina extraída de los tejidos MelanoDerm™) y los estándares se enfriaron a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron 200 μL de muestras a los pocillos adecuados de una placa de 96 pocillos. 200 μL de estándar y blanco se transfirieron a los pocillos adecuados de una placa de 96 pocillos en duplicado. La absorbancia a 490 nm (OD490) de cada pocillo se midió con un lector de placas Vmax Molecular Devices.

Presentación de datos

Datos MTT – día 0

Se capturaron los datos de absorbancia sin procesar. Se calculó el valor medio de OD550 de los pocillos en blanco. El valor de OD550 corregido de cada tejido no tratado se determinó restando el valor de OD550 medio de los pocillos en blanco de los valores de OD550 del tejido sin tratar. Los valores de % de viabilidad individuales se tabularon para cada tejido individual dividiendo el valor de OD550 corregido individual por la media de todos los valores de OD550 calculados para los tejidos no tratados. Se calculó un % de viabilidad media global. Finalmente, el valor medio de viabilidad de los tejidos no tratados se representó en un gráfico de barras (con ± 1 barra de error de desviación estándar).

MTT - día 7

Se capturaron los datos de absorbancia sin procesar. Todos los cálculos se realizaron utilizando una hoja de cálculo Excel®. Se calculó el valor medio de OD550 de los pocillos en blanco. El valor medio corregido de la OD550 del control negativo se determinó restando el valor medio de la OD550 de los pocillos en blanco de sus valores medios de la OD550. Los valores de OD550 corregidos de la exposición del artículo de prueba individual, las exposiciones de control positivo y la exposición de control negativo se determinaron restando de cada uno el valor de OD550 medio de los pocillos en blanco.

Datos de melanina

Se capturaron los datos de absorbancia sin procesar. Se determinó el valor de OD490 de cada estándar de melanina. El valor medio de OD490 de cada estándar de melanina se utilizó para preparar una curva estándar. El valor de OD490 corregido de cada concentración estándar de melanina se determinó restando el valor de OD490 del pocillo blanco del valor de OD490 de la concentración estándar de melanina. La curva estándar se representó como la concentración de los estándares en mg/ml (eje y) frente a la absorbancia corregida correspondiente (valor de OD490). La cantidad de melanina en el artículo de prueba, tejidos tratados con control positivo o tejido tratado con control negativo se interpoló matemáticamente a partir de la curva estándar (cuadrática).

Resultados y discusión

Los artículos de prueba, DMSO, compuesto I (CV-8686), Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819), O52 (AB12976) y la formulación del compuesto I, se probaron en un ensayo de selección de modulador de melanogénesis utilizando el modelo de tejido asiático MelanoDerm™ para evaluar su potencial de irritación dérmica y su impacto en la melanogénesis después de exposiciones repetidas, durante un período de exposición de 7 días.

Los artículos de prueba se administraron al sistema de prueba puros o como diluciones v/v preparadas en EPI-100-LLMM estéril. Se administraron los artículos de prueba Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819) y O52 (AB12976) al sistema de prueba en diluciones de 500 μM y 200 μM. El artículo de prueba, compuesto I (CV-8686), se administró al sistema de prueba como una dilución de 500 µM. El artículo de prueba, DMSO (control de vehículo), se administró al sistema de prueba como una dilución al 0.5 % (v/v). El artículo de prueba, formulación del compuesto I, se probó puro. Cada dilución de los artículos de prueba se aplicó por vía tópica a cinco tejidos MelanoDerm™, con dos (o tres para el compuesto A5 (CV-8819) (200 μM) y O52 (AB12976) (200 μM) designados para el criterio de valoración MTT, y dos para el punto final de melanina, con la excepción del compuesto A5 (CV-8819) (200 µM) y O52 (AB12976) (200 µM)). Los tejidos se trataron con 25 μl de cada artículo de prueba cada 48±2 horas durante cada período de prueba individual. El control positivo (1 % de ácido kójico preparado en agua desionizada estéril) se aplicó tópicamente a cinco tejidos MelanoDerm™ cada uno (dos designados para el punto final de MTT y dos para el punto final de melanina) y se trataron con 25 μl cada 48±2 horas durante un período de 7 días.

La Figura 75 resume la viabilidad tisular media y los resultados de concentración de melanina para los artículos de prueba, el control negativo y el control positivo. Las Figuras 76-87 contienen fotografías macroscópicas y microscópicas representativas (solo aumento de 15x) de los tejidos tomadas para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos el día 0 y el día 7. Se consideran representativos de los tejidos replicados dentro de cada grupo de tratamiento y relevantes para la interpretación de datos posterior. Las imágenes macroscópicas son indicativas de la producción total de melanina en los tejidos y su distribución en la superficie de los tejidos. Las imágenes microscópicas proporcionan una visión general del estado fisiológico de los melanocitos con respecto a la producción de melanina, la presencia de dendritas o cualquier cambio morfológico asociado con el tratamiento del artículo de prueba/controles.

La evaluación de la producción de melanina por los tejidos tratados con los artículos de prueba después de exposiciones repetidas durante el período de tiempo de 7 días se utilizó para evaluar el potencial de los artículos de prueba como moduladores de la melanogénesis de la piel. El control positivo, 1 % de ácido kójico, redujo la concentración de melanina a 22.01 μg/ml en los tejidos tratados con el control positivo en comparación con los tejidos tratados con el control con disolvente (53.82 μg/ml). En general, los resultados objetivos obtenidos al realizar el ensayo de melanina están respaldados por las observaciones subjetivas basadas en el análisis de las fotografías macroscópicas y microscópicas tomadas durante la modalidad del estudio.

Los artículos de prueba, DMSO, compuesto I (CV-8686), Malassezina (CV-8684), compuesto B (CV-8877), compuesto E (AB12508), compuesto H (AB12509), una composición desconocida, compuesto A5 (CV-8819), O52 (AB12976) y la formulación del compuesto I no redujeron el MTT directamente en ausencia de células viables. Por lo tanto, no se realizó un experimento de control muerto.

Los artículos de prueba redujeron la concentración de melanina en sus respectivos tejidos en comparación con los tejidos tratados con DMSO a niveles comparables a los obtenidos para los tejidos tratados con control positivo. Por ejemplo, la concentración de melanina en los tejidos tratados con el artículo de prueba, compuesto B (CV-8877) (500 μM) fue de 25.99 μg/ml y la concentración en los tejidos tratados con el artículo de prueba, compuesto E (AB12508) (500 μM) fue de 25.26 μg/ml en comparación con la concentración en los tejidos tratados con el control positivo del ensayo (22.01 μg/ml).

Estudios adicionales

Los resultados de Melanoderm™ para AB17151, compuesto B10, precursor de Malassezina, AB17011, AB17014, DMSO, CV-8484, compuesto E, y ácido kójico se muestran en la Figura 88.

Ejemplo 20

Potencial de melanogénesis de Malassezina y derivados de Malassezina

El propósito de este estudio fue observar e informar la melanogénesis y la viabilidad de los melanocitos B16 expuestos a malassezina y derivados de malassezina.

Materiales y reactivos

Los medios de placa incluían DMEM sin L-glutamina, FBS, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Los medios de ensayo incluyeron DMEM sin rojo fenol y L-glutamina, FBS, penicilina/estreptomicina, L-glutamina y aMSH. Otros reactivos incluyeron ácido kójico, DMSO y MTT. Las células ensayadas fueron células B16 (ATCC CRL-6475).

Protocolo

Los melanocitos B16 se cultivaron hasta un 70 % de confluencia y se recolectaron. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 4000 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, los artículos de prueba y los controles se diluyeron en medio de ensayo B16. Se aspiró el medio durante la noche y se aplicaron 200 ul de artículos de prueba y controles. Las células se incubaron a 37 °C y CO2al 10 % durante 72 horas. Después de 72 horas de incubación, se leyó la absorbancia a 540 nm. El medio se retiró y se reemplazó con 100 ul de medio en placa que contenía 1 mg/ml de MTT y se incubó durante 2 horas a 37 °C y CO2al 10 %. El medio MTT se retiró y se reemplazó con 200 ul de 95 % de etanol/5 % de isopropanol y se dejó agitar durante 15 minutos. A continuación, se leyó la absorbancia de MTT a 570 nm.

Resultados

El cambio porcentual en la melanina y los resultados de viabilidad se muestran en las Figuras 89A-89X.

Ejemplo 21

Formulaciones de Malassezina y derivados de Malassezina

Formulación de 0.1 % de Malassezina

Se formuló una composición de 0.1 % de Malassezina utilizando los siguientes ingredientes: agua, triglicérido caprílico/cáprico, glicerina, manteca de Butyrospermum parkii (karité), heptil undecilenato, cetearil olivate, alcohol cetílico, dimetil isosorbida, dimeticona, sorbitán olivate, malassezina, escualeno, glicirrizato de dipotasio, disuccinato de etilendiamina trisódico, goma de esclerotio, goma de xantano, caprilil glicol, clorfenesina y fenoxietanol.

La composición resultante era una crema opaca, viscosa, blanquecina con pH 5.72 y viscosidad de 14,000 cps.

Formulación de0.1 % de compuesto I

Se formuló una composición de 0.1 % de compuesto I usando los mismos ingredientes descritos anteriormente para la formulación de 0.1 % de Malassezina con compuesto I en lugar de Malassezina.

La composición resultante era una crema opaca, viscosa, blanquecina con pH 5.66 y viscosidad de 14,000 cps.

Formulación de 1 % de Malassezina

Se formuló una composición de 1 % de Malassezina utilizando los siguientes ingredientes: agua, dimetil isosorbida, aceite de oliva gliceret-8 ésteres, glicerina, coco alcanos, copolímero de acrilato de hidroxietilo/acriloildimetil taurato de sodio, malassezina, tocoferol, pentilenglicol, cococaprilato/caprato, hidróxido de sodio, EDTA disódico, caprilil glicol, clorfenesina y fenoxietanol.

La composición resultante era una crema opaca, viscosa, blanquecina con pH 6.27 y viscosidad de 2,000 cps.

Formulación de1 % de compuesto I

Se formuló una composición de 1 % de compuesto I usando los mismos ingredientes descritos anteriormente para la formulación de 1 % de Malassezina con compuesto I en lugar de Malassezina.

La composición resultante era una crema opaca, viscosa, blanquecina con pH 6.00 y viscosidad de 30,000 cps.

Formulación del compuesto II

Se formuló una composición del compuesto II usando los siguientes ingredientes: agua, triglicérido caprílico/cáprico, glicerina, manteca de Butyrospermum parkii (karité), heptil undecilenato, pentilenglicol, cetearil olivato, alcohol cetílico, dimeticona, sorbitán olivato, compuesto II, glicirrizato de dipotasio, escualeno, goma de esclerotio, goma de xantano, disuccinato de etilendiamina trisódico, hidróxido de sodio, caprilil glicol, clorfenesina y fenoxietanol.

La composición resultante era un líquido semi-viscoso opaco con un color blanquecino, pH de 5.80 y viscosidad de 8,000 cps.

Ejemplo 22

Actividad inductora de apoptosis de indirubina y derivados de indirubina

Reactivos

Alexa Fluor 488 anexina V/Kit de apoptosis de células muertas, suero fetal bovino (FBS), 0.25 % de tripsina-EDTA (1x), ensayo Caspasa-Glo 3/7, medio RPMI 1640, medio Eagle modificado de Dulbecco y solución antibiótica antimicótica (100x ).

Las líneas celulares MeWo (ATCC® HTB-65™), WM115 (ATCC® CRL-1675) y B16F1 (ATCC® CRL-6323) se mantienen en los siguientes medios de cultivo: medio de cultivo para MeWo y B16F1: DMEM suplementado con 10 % de FBS; medio de cultivo para WM115: RPMI 1640 complementado con 10 % de FBS.

Métodos experimentales

Se recolectan las células y se determina el número de células usando un contador de células Countess. Las células se diluyen con medio de cultivo hasta la densidad deseada. La densidad celular final puede ser, por ejemplo, 4,000 células/pocillo durante un tratamiento de 6 horas y 24 horas, y 2,000 células/pocillo durante un tratamiento de 48 horas y 72 horas. Para el ensayo de anexina V, se emplean placas de fondo transparente de 384 pocillos (Corning 3712), mientras que para los ensayos de Caspasa-Glo se utilizan placas sólidas de fondo blanco de 384 pocillos (Corning 3570). Todas las placas se cubrieron con una tapa y se colocaron a 37 °C y 5 % de CO2durante la noche para la fijación de la célula.

Los compuestos de prueba se disuelven en DMSO a 30 mM de solución madre. Se realizan diluciones de 10 veces para generar concentraciones de 3 mM and 0.3 mM. Se emplean 0.9 mM como control positivo, y se emplea DMSO como un control negativo (NC). Se transfiere 132.5 nl de compuestos desde la placa de origen del compuesto a la(s) placa(s) de cultivo celular de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos Echo550. Después del tiempo de incubación indicado, las placas se retiran de la incubadora para su detección.

Para el ensayo de anexina V, las placas se retiraron de la incubadora y se retiró el medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces con 40 uL de PBS y se añadieron por pocillo 15 ul de anexina V-FITC premezclada y solución de trabajo de tinte Hoechst 33342. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se sellaron y se centrifugaron durante 1 minuto a 1,000 rpm para eliminar las burbujas. Las placas se leyeron con ImageXpress Nano. Para el ensayo Caspasa-Glo, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los reactivos Caspasa-Glo 3/7 también se descongelaron y equilibraron a temperatura ambiente antes del experimento. El reactivo Caspasa-Glo se agrega a los pocillos requeridos en una proporción de 1:1 al medio de cultivo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se leyeron con el lector de placas EnSpire™. La inducción de pliegue se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: Inducción múltiplo = Lummuestra/LumNC.

Resultados del ensayo de anexina Vy del ensayo de caspasa 3/7

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluida la indirubina y sus análogos químicos, induzcan la muerte celular. Se espera que los análogos químicos de indirubina exhiban, por ejemplo, una actividad inductora de apoptosis más potente en comparación con la indirubina. Asimismo, se espera que ciertos análogos químicos de indirubina demuestren, por ejemplo, una actividad inductora de apoptosis menos eficaz en comparación con la indirubina. Dichos compuestos pueden tener perfiles de toxicidad más favorables en comparación con compuestos más potentes.

Ejemplo 23

Viabilidad celular después de la exposición a indirubina y derivados de indirubina

Reactivos

Ensayo CellTiter-Glo® 2.0.

Métodos experimentales

Para el ensayo CellTiter-Glo, los compuestos de prueba se preparan en una solución de DMSO 10 mM. Los compuestos se diluyeron en serie en 12 concentraciones. Se dispensaron 40 ul de células de una suspensión de 100,000 células/ml en cada pocillo de una placa de 384 pocillos (Corning 3570). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2y 95 % de humedad. Se añaden los compuestos de prueba, con DMSO como control de vehículo. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2y 95 % de humedad durante 6, 24 o 48 horas, y se añadieron 40 ul de reactivo CellTiter-Glo a los pocillos para evaluar la viabilidad celular.

Resultados

Ejemplo 24

Potencial de activación del receptor de arilhidrocarburo de indirubina y derivados de indirubinaProcedimientos de ensayo

Los medios de cultivo para células HepG2 transfectadas de manera estable se preparan complementando DMEM con glucosa alta y L-glutamina, así como 10 % de FBS.

Las células HepG2-AhR-Luc se cultivan en matraces T-75 a 37 °C, 5 % de CO2y 95 % de humedad relativa. Se permite que las células alcanzaran un 80-90 % de confluencia antes de la separación y división.

Las células cultivadas se aclararon con 5 ml de PBS. Se aspiró el PBS, se añaden 1.5 ml de tripsina al matraz y las células se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 5 minutos o hasta que las células se desprendieron y flotaron. La tripsina se inactivó añadiendo un exceso de medio que contiene suero.

La suspensión celular se transfiere a un tubo cónico y se centrifugó a 120 g durante 10 minutos para sedimentar las células. Las células se resuspenden en un medio de siembra a una densidad adecuada. Se transfieren 40 µl de células a una placa de cultivo de 384 pocillos (5 x 10<3>células/pocillo). Las placas se colocaron en la incubadora a 37 °C durante 24 horas.

Posteriormente, se prepararon soluciones madre de compuestos de prueba y control positivo de omeprazol. Las soluciones compuestas se transfirieron a la placa de ensayo usando Echo550. Luego, la placa se volvió a colocar en la incubadora para el tratamiento del compuesto.

Posteriormente, después de 24 horas de tratamiento, la placa se retiró de la incubadora y se dejó enfriar a temperatura ambiente. En cada pocillo se añadieron 30 µl de reactivo One-Glo igual al del medio de cultivo. Se dejó que las células se lisaran durante al menos 3 minutos y luego se midieron en un luminómetro.

Las respuestas a las dosis se graficaron utilizando el análisis de regresión no lineal en XLfit, y también se calcularon los valores de EC50.

Resultados

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluida la indirubina y sus análogos químicos, modulen la actividad AhR. Se espera que los análogos químicos de indirubina exhiban, por ejemplo, una actividad agonista de AhR más potente en comparación con la indirubina. Asimismo, se espera que ciertos análogos químicos de indirubina demuestren, por ejemplo, una actividad agonista de AhR menos eficaz en comparación con la indirubina.

Ejemplo 25

Ensayos MelanoDerm™

El propósito de este estudio fue evaluar la acción potencial de los artículos de prueba como modulador de la melanogénesis de la piel en el modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas de artículos de prueba. En segundo lugar, el propósito de este estudio fue evaluar la posible irritación dérmica del artículo de prueba en el modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas. La toxicidad se determinó midiendo la conversión relativa de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) en los tejidos tratados con el artículo de prueba en comparación con los tejidos tratados con el control negativo/solvente. El impacto potencial en la producción de melanina se determinó midiendo la concentración de melanina producida por los tejidos tratados con el artículo de prueba en comparación con los tejidos tratados con control negativo/solvente.

Identificación de sustancias de prueba y controles de ensayo

Tabla 3

Arí l r r n f rm il i

Tabla 4

Los controles del ensayo incluyen: control positivo – 1 % de ácido kójico; control negativo – agua estéril desionizada; y control de disolvente – DMSO (dimetil sulfóxido) preparado en EPI-100-LLMM.

Para este estudio, no se utilizó un control negativo. En su lugar, se utilizó el control de disolvente (17AA70) para corregir los datos pertenecientes a los tejidos tratados con el control positivo y el artículo de prueba, respectivamente.

Adicionalmente, el artículo de prueba y los controles se aplicaron a grupos de 4 tejidos, de los cuales se usaron 2 para el criterio de valoración de Viabilidad tisular (MTT) y 2 para el criterio de valoración de Melanina, respectivamente.

Sistema de pruebas

En este estudio se utilizó el modelo de piel MelanoDerm™ proporcionado por MatTek Corporation (Ashland, MA). El tejido MelanoDerm™ consiste en queratinocitos epidérmicos normales derivados de seres humanos (NHEK) y melanocitos (NHM) que han sido cultivados para formar un modelo multicapa altamente diferenciado de la epidermis humana. Los NHM dentro de los cocultivos experimentan una melanogénesis espontánea que conduce a tejidos de diferentes niveles de pigmentación. Los cultivos se cultivaron en insertos de cultivo celular en la interfaz aire-líquido, lo que permitió la aplicación tópica de moduladores cutáneos. El modelo MelanoDerm™ exhibe características morfológicas y ultraestructurales similares ain vivo. Los NHM localizados en la capa de células basales del tejido MelanoDerm™ son dendríticos y producen espontáneamente gránulos de melanina que pueblan progresivamente las capas del tejido. Por tanto, el sistema de prueba se utiliza para seleccionar materiales que puedan inhibir o estimular la producción de melanina en relación con los controles negativos.

Diseño y metodología experimental

El diseño experimental de este estudio consistió en la determinación del pH del artículo de prueba puro si es posible (y/o solución de dosificación según corresponda) y un ensayo definitivo para determinar la viabilidad relativa del tejido y la acción potencial del artículo de prueba como un modulador de melanogénesis de la piel al modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas. Los artículos de prueba se expusieron al modelo de piel MelanoDerm™ durante un total de 7 días. Los artículos de prueba se aplicaron tópicamente al modelo de piel MelanoDerm™ cada 48 horas (dentro de un período de tiempo de 48+2 horas desde el tratamiento anterior). La toxicidad de los artículos de prueba se determinó mediante la reducción de MTT con enzima microsomal dependiente de NAD(P)H (y, en menor grado, mediante la reducción de succinato deshidrogenasa de MTT) en tejidos de control y tratados con artículo de prueba. Los datos se presentaron en forma de supervivencia relativa (conversión de MTT en relación con el control negativo/solvente). El impacto potencial en la producción de melanina se evaluó determinando la concentración de melanina producida en los tejidos tratados con el artículo de prueba en comparación con los tejidos tratados con control negativo/solvente. Los datos se presentaron en forma de concentración de melanina producida por los tejidos tratados con el artículo de prueba determinada usando una curva estándar de melanina. Alternativamente, los datos pueden presentarse como cambio porcentual en la concentración de melanina en relación con los tejidos tratados con control negativo/solvente.

Los métodos utilizados son una modificación de los procedimientos proporcionados por MatTek Corporation.

Medios y reactivos

El medio de mantenimiento MelanoDerm™ (EPI-100-LLMM) se adquirió de MatTek Corporation. El modelo de piel MelanoDerm™ (MEL-300-A) se adquirió de MatTek Corporation. Se compró 1 % de ácido kójico (preparado en agua desionizada estéril) de Sigma. El MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) se adquirió de Sigma. El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene L-glutamina 2 mM (medio de adición MTT) se adquirió en Quality Biological. El disolvente de extracción (isopropanol) se adquirió de Aldrich. La solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco libre de Ca++ y Mg++ estéril (CMF-DPBS) se adquirió de Invitrogen. La melanina se adquirió de Sigma. Se adquirió agua desionizada estéril de Quality Biological. El resoluble se adquirió de Perkin Elmer.

Preparación y entrega del artículo de prueba

A menos que se especifique lo contrario dentro de este protocolo, se aplicaron veinticinco microlitros de cada artículo de prueba directamente sobre el tejido para cubrir la superficie superior. Dependiendo de la naturaleza del artículo de prueba (líquidos, geles, cremas, espumas, etc.), el uso de un dispositivo de dosificación, malla u otra ayuda para permitir la distribución uniforme del artículo de prueba sobre la superficie del tejido puede haber sido necesario.

Vía de administración

Los artículos de prueba se aplicaron tópicamente al tejido MelanoDerm™ cada 48 horas (dentro de un período de tiempo de 48+2 horas desde el tratamiento anterior) durante una prueba de 7 días. Se aplicaron veinticinco microlitros de cada artículo de prueba a cada tejido. Se aplicaron a cada tejido veinticinco microlitros de los controles positivo y negativo/solvente, respectivamente.

Determinación del pH

Se determinó el pH del artículo de prueba líquido puro (y/o solución de dosificación según fuera apropiado), si era posible. El pH se determinó usando papel de pH (por ejemplo, con un intervalo de pH de 0 – 14 para estimar y/o un intervalo de pH de 5 – 10 para determinar un valor más preciso). Los incrementos de pH típicos en el papel de pH de intervalo más estrecho fueron aproximadamente de 0.3 a 0.5 unidades de pH. El incremento máximo en el papel de pH fue de 1.0 unidades de pH.

Controles

El ensayo definitivo incluyó un control negativo, un control positivo y un control de disolvente (DMSO). Los tejidos MelanoDerm™ designados para el control negativo del ensayo se trataron con 25 µl de agua desionizada estéril. Se usaron veinticinco microlitros de 1 % de ácido kójico (preparado en agua desionizada estéril y filtrado en el momento de la preparación) para dosificar los tejidos designados para el control positivo del ensayo. El 1 % de ácido kójico se almacenó en un tubo cubierto con papel de aluminio hasta su uso dentro de las 2 horas posteriores a la preparación. Los tiempos de exposición del negativo/solvente y del control positivo fueron idénticos a los utilizados para los artículos de prueba. Los tejidos no tratados también se utilizaron como controles.

Evaluación de la reducción del artículo de prueba directa de MTT

Fue necesario evaluar la capacidad de cada artículo de prueba para reducir directamente el MTT. Se preparó una solución de MTT de 1.0 mg/ml en medio de adición de MTT. Se agregarán aproximadamente 25 μl del artículo de prueba a 1 ml de la solución de MTT y la mezcla se incubará en la oscuridad a 37 °C ± 1 °C durante una a tres horas. Al mismo tiempo, se analizó un control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril. Si el color de la solución MTT se volvió azul/violeta, se suponía que el artículo de prueba había reducido el MTT. Los materiales de prueba insolubles en agua pueden haber mostrado una reducción directa (oscurecimiento) solo en la interfaz entre el artículo de prueba y el medio. Recepción de MelanoDerm™

Tras la recepción del kit para la piel MelanoDerm™, las soluciones se almacenaron según lo indicado por el fabricante. Los tejidos MelanoDerm™ se almacenaron a 2-8 °C hasta su uso.

El día de la recepción (el día antes de la dosificación), se extrajo un volumen apropiado de medio de mantenimiento MelanoDerm™ (EPI-100-LLMM) y se calentó a 37±1 °C. Se dividieron en alícuotas de nueve décimas partes (0.9) ml de EPI-100-LLMM/pocillo en los pocillos apropiados de las placas de 6 pocillos. Se inspeccionó cada tejido MelanoDerm™ en busca de burbujas de aire entre el gel de agarosa y el inserto de cultivo celular antes de abrir el paquete sellado. No se utilizaron tejidos con burbujas de aire superiores al 50 % del área del inserto de cultivo celular. Los contenedores de envío de 24 pocillos se sacaron de la bolsa de plástico y la superficie se desinfectó con etanol al 70 %. Se transfirió asépticamente un número apropiado de tejidos MelanoDerm™ desde los contenedores de envío de 24 pocillos a las placas de 6 pocillos. Los tejidos MelanoDerm™ se incubaron a 37±1 °C en una atmósfera humidificada de 5±1 % de CO2 en aire (condiciones de cultivo estándar) durante la noche (al menos 16 horas) para aclimatar los tejidos. Después de abrir la bolsa, cualquier tejido sin usar que quedaba en el agar de envío en el momento de la transferencia de tejido se gasificó brevemente con una atmósfera de 5 % de CO2/95 % de aire, y la bolsa se selló y se almacenó a 2-8 °C para su uso posterior.

Ensayo definitivo

Exposición de tejidos: Al menos 16 horas después de iniciar los cultivos, se fotografiaron cinco tejidos MelanoDerm™ (considerados no tratados en el día 0) con una cámara digital para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos en el tiempo cero del ensayo. Se enjuagaron dos tejidos MelanoDerm™ con CMF-DPBS, se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se transfirieron a los pocillos que contenían MTT apropiados después del enjuague y se procesaron en el ensayo de MTT. Se enjuagaron tres tejidos MelanoDerm™ con CMF-DPBS, se secaron en papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se retiraron del inserto de cultivo celular utilizando bisturís estériles, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C para el análisis de melanina posterior.

Al menos 16 horas después de iniciar los cultivos, el resto de los tejidos se transfirieron a una nueva placa de 6 pocillos que contenía 0.9 ml/pocillo de EPI-100-LLMM fresco precalentado. El ensayo se llevó a cabo durante un período de 7 días. Se trataron cinco tejidos por vía tópica el primer día y cada 48 horas (en un plazo de 48+2 horas desde el tratamiento anterior) con 25 μl, de cada artículo de prueba. El medio se renovó a diario (en un plazo de 24+2 horas desde la realimentación anterior); los tejidos se transfirieron a una nueva placa de 6 pocillos que contenía 0.9 ml/pocillo de EPI-100-LLMM fresco y precalentado.

Se trataron cinco tejidos por vía tópica el primer día y cada 48 horas (en un plazo de 48+2 horas desde el tratamiento anterior) con 25 μl de controles positivos y negativos/solvente, respectivamente. El medio se renovó a diario (en un plazo de 24+2 horas desde la realimentación anterior); los tejidos se transfirieron a una nueva placa de 6 pocillos que contenía 0.9 ml/pocillo de EPI-100-LLMM fresco y precalentado. Los tejidos se incubaron a 37±1 °C en atmósfera humidificada de 5±1 % CO2 en aire (condiciones estándar de cultivo) para los tiempos de exposición adecuados.

En los días de la dosificación, el tejido MelanoDerm™ primero se enjuagó suavemente tres veces usando ~500 μl de CMF-DPBS por enjuague para eliminar cualquier artículo de prueba residual. El CMF-DPBS se pipeteó suavemente en el pocillo y luego se extrajo con un aspirador estéril. Luego, los tejidos se trasladarán a una nueva placa de 6 pocillos que contiene 0.9 ml de EPI-100-LLMM fresco precalentado y se dosificará con el artículo de prueba apropiado, control negativo o positivo. Los tejidos se incubaron a 37±1 °C en atmósfera humidificada de 5±1 % CO2en aire (condiciones estándar de cultivo) para los tiempos de exposición adecuados.

Al final de la prueba de 7 días, los tejidos MelanoDerm™ tratados con el control negativo/disolvente o positivo, y con cada artículo de prueba, se fotografiaron con una cámara digital para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos en el final del ensayo (día 7). Luego, se determinó la viabilidad de dos tejidos tratados con el control positivo y negativo, respectivamente, y con cada artículo de prueba, mediante reducción de MTT. Al final de la prueba de 7 días, se determinó la melanina producida por tres tejidos tratados con cada artículo de prueba, el control positivo y negativo/solvente, respectivamente.

Ensayo MTT: Se descongeló una solución madre 10X de MTT preparada en PBS (filtrada en el momento de la preparación del lote) y se diluyó en medio de adición MTT tibio para producir la solución de 1.0 mg/ml no más de dos horas antes de su uso. Se agregaron trescientos μl de la solución de MTT a cada pocillo designado de una placa de 24 pocillos premarcada.

Después del tiempo de exposición, cada tejido MelanoDerm™ designado para el ensayo MTT se enjuagó con CMF-DPBS (uso de atomizador aceptable para esta etapa), se secó en papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se transfirieron a los pocillos que contenían MTT apropiados después del enjuague. Las placas de 24 pocillos se incubaron en condiciones estándar durante 3±0.1 horas.

Después de 3 ± 0.1 horas, los tejidos MelanoDerm™ se secarán en papel absorbente estéril, se eliminarán el exceso de líquido y se transferirán a una placa de 24 pocillos preetiquetada que contiene 2.0 ml de isopropanol en cada pocillo designado. Las placas se cubrieron con para-película y se almacenaron en el frigorífico (2-8 °C) hasta cosechar el último tiempo de exposición. Si es necesario, las placas se almacenaron durante la noche (o hasta 24 horas después de cosechar el último tiempo de exposición) en el refrigerador antes de extraer el MTT. Luego, las placas se agitaron durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Al final del período de extracción, el líquido dentro de los insertos de cultivo celular se decantó en el pocillo del que se tomó el inserto de cultivo celular. La solución de extracto se mezcló y se transfirieron 200 μl a los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos. Se agregaron doscientos μl de isopropanol a los pocillos designados como blancos. La absorbancia a 550 nm (OD550) de cada pocillo se midió con un lector de placas Vmax Molecular Devices.

Ensayo de melanina: Al final de los tiempos de exposición apropiados, los tejidos MelanoDerm™ designados para el ensayo de melanina se enjuagaron suavemente al menos tres veces usando ~500 μl de CMF-DPBS por enjuague para eliminar cualquier artículo de prueba residual o exceso de rojo de fenol del medio de cultivo, se secó sobre papel absorbente estéril y eliminó el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se fotografiaron usando una cámara digital al final del ensayo. Los tejidos MelanoDerm™ se retiraron del inserto de cultivo celular utilizando bisturís estériles, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C para el análisis de melanina posterior.

El día del ensayo de extracción de melanina, los tejidos extirpados se descongelaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se agregó 250 μl de resoluble a cada tubo de microcentrífuga y los tubos se incubaron durante al menos 16 horas a 60±2 °C. Se preparó una solución madre estándar de melanina de 1 mg/ml disolviendo la melanina en soluble. Se preparó una serie de patrones de melanina a partir de la solución madre de 1 mg/ml que oscilaba entre 0 mg/ml y 0.33 mg/ml. La serie estándar se preparó agregando 0.6 ml de la solución madre estándar de melanina de 1 mg/ml a 1.2 ml de resoluble y luego haciendo una serie de cinco diluciones más (factor de dilución de 3). Se utilizó resoluble como el estándar cero. La serie de estándares melanina y resoluble se incubaron durante al menos 16 horas a 60+2ºC.

Al menos 16 horas después de iniciar la extracción de melanina, los tubos que contenían las muestras (que representan la melanina extraída de los tejidos MelanoDerm™) y los estándares se enfriaron a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron 200 μL de muestras (pocillos simples) o estándares (pocillos duplicados) a los pocillos adecuados de una placa de 96 pocillos en duplicado. Se agregaron doscientos μl de resoluble a los pocillos designados como blancos en pocillos duplicados. Se midió la absorbancia a 490 nm (OD490) de cada pocillo con un lector de placas Molecular Devices Vmax (con la función Automezcla seleccionada).

Controles muertos para la evaluación de la reducción del artículo de prueba residual de MTT

Para demostrar que el posible artículo de prueba residual no estaba actuando para reducir directamente el MTT, se realizó una verificación funcional en el ensayo definitivo para demostrar que el material de prueba no se unió al tejido y condujo a una señal de reducción de MTT falsa.

Para determinar si el artículo de prueba residual estaba actuando para reducir directamente el MTT, se utilizó un tejido de control muerto por congelación. El tejido muerto por congelación se preparó colocando tejidos MelanoDerm™/EpiDerm™ (Melanoderm™ sin melanocitos) sin tratar en el congelador a -20 ºC al menos durante la noche, descongelando a temperatura ambiente y luego volviendo a congelar. Una vez sacrificado, el tejido puede almacenarse indefinidamente en el congelador. Los tejidos muertos por congelación pueden recibirse ya preparados de MatTek Corporation y almacenarse en el congelador a -20 °C hasta su uso. Para probar la reducción del artículo de prueba residual, los tejidos muertos se trataron con el artículo de prueba de la manera normal. Todos los procedimientos de ensayo se realizaron de la misma manera que para el tejido viable. Al menos un control muerto tratado con agua desionizada estéril (control muerto negativo) se probaron en paralelo ya que se espera una pequeña cantidad de reducción de MTT a partir del NADH residual y las enzimas asociadas dentro del tejido muerto.

Si se observa poca o ninguna reducción de MTT en el control muerto tratado con el artículo de prueba, la reducción de MTT observada en el tejido viable tratado con el artículo de prueba puede atribuirse a las células viables. Si hubo una reducción apreciable de MTT en el control muerto tratado (en relación con la cantidad en el tejido viable tratado), se deben tomar medidas adicionales para tener en cuenta la reducción química o el artículo de prueba puede considerarse no comprobable en este sistema.

Análisis de datos

Se calculó el valor medio de OD550 de los pocillos en blanco. El valor medio corregido de la OD550 del control negativo/disolvente se determinó restando el valor medio de la OD550 de los pocillos en blanco de sus valores medios de la OD550. Los valores de OD550 corregidos de las exposiciones de los artículos de prueba individuales y las exposiciones de los controles positivos se determinaron restando de cada uno el valor de OD550 medio de los pocillos en blanco. Todos los cálculos se realizaron utilizando una hoja de cálculo de Excel. Aunque los algoritmos discutidos se realizan para calcular el análisis de punto final a nivel de grupo de tratamiento, los mismos cálculos se pueden aplicar a las réplicas individuales.

Exposición del artículo de prueba corr. OD550= Exposición del artículo de prueba OD550– media del blanco OD550Si se usaron controles muertos (KC), se realizaron los siguientes cálculos adicionales para corregir la cantidad de MTT reducida directamente por los residuos del artículo de prueba. El valor sin procesar de OD550 para el control muerto del control negativo se restó de los valores de OD550 sin procesar de cada uno de los controles muertos tratados con el artículo de prueba, para determinar los valores netos de OD550 de los controles muertos tratados con el artículo de prueba.

OD550neto para cada artículo de prueba KC = artículo de prueba OD550sin procesar KC - OD550sin procesar control negativo/de disolvente KC

OD550corregido final = artículo de prueba OD550corregido (viable) – artículo de prueba OD550neto (KC) Finalmente, se realizará el siguiente % de cálculos de control:

% de viabilidad = [(OD550final corregido del artículo de prueba o control positivo)/(OD550media corregida de los controles negativo/solvente)] x 100

Análisis de melanina: Los datos de absorbancia sin procesar se capturaron, se guardaron como un archivo de impresión y se importaron a una hoja de cálculo de Excel. Se determinó el valor de OD490 de cada muestra de prueba (que representa la melanina extraída de los tejidos MelanoDerm™ no tratados en el día 0, los tejidos MelanoDerm™ tratados con cada artículo de prueba, los controles negativo/solvente o positivo en el día 7) y de los estándares de melanina. El valor de OD490 corregido para las muestras de prueba y cada estándar de melanina se determinó restando el valor de OD490 medio de los pocillos en blanco. La curva estándar se representó como la concentración de los estándares en mg/ml (eje y) frente a la absorbancia corregida correspondiente. La cantidad de melanina en cada tejido individual se interpoló a partir de la curva estándar (lineal). Finalmente, se calculó el promedio de la concentración de melanina para cada artículo de prueba o grupos de tratamiento de control, respectivamente.

Resultados

La Figura 128 resume la viabilidad tisular media y los resultados de la concentración de melanina para los artículos de prueba, el control positivo y los tejidos sin tratar. Los resultados preliminares sugieren que ciertas formulaciones aplicadas a los compuestos de carbazol de la presente invención pueden exhibir independientemente efectos de brillo de la piel moderados que amortiguan la actividad de oscurecimiento de la piel de los carbazoles.

La Figura 129 resume la viabilidad tisular media y los resultados de concentración de melanina para los artículos de prueba y tejidos no tratados observados en un experimento separado. Los tratamientos combinados que comprenden, por ejemplo, malassezina e indirubina, exhibieron efectos de brillo de la piel más efectivos que cualquier compuesto por sí solo.

Ejemplo 26

Potencial de melanogénesis de la indirubina y los derivados de indirubina

El propósito de este estudio es observar y reportar la melanogénesis y la viabilidad de los melanocitos B16 expuestos a indirubina y derivados de indirubina.

Materiales y reactivos

Los medios de placa incluirán DMEM sin L-glutamina, FBS, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Los medios de análisis incluirán DMEM sin rojo fenol y L-glutamina, FBS, penicilina/estreptomicina, L-glutamina y aMSH. Otros reactivos incluirán ácido kójico, DMSO y MTT. Las células probadas serán células B16 (ATCC CRL-6475).

Protocolo

Los melanocitos B16 se cultivan hasta un 70 % de confluencia y se recogen. Las células se siembran en placas de 96 pocillos a una densidad de 4000 células/pocillo y se dejan adherir durante la noche. Al día siguiente, los artículos de prueba y los controles se diluyeron en medio de ensayo B16. Se aspira el medio durante la noche y se aplican 200 ul de artículos de prueba y controles. Las células se incubaron a 37 °C y 10 % de CO2durante 72 horas. Después de 72 horas de incubación, se lee la absorbancia a 540 nm. El medio se retira y se reemplaza con 100 ul de medio en placa que contiene 1 mg/ml de MTT y se incuba durante 2 horas a 37 °C y 10 % de CO2. El medio MTT se retira y se reemplaza con 200 ul de 95 % de etanol/5 % de isopropanol y se dejó agitar durante 15 minutos. Luego se lee la absorbancia de MTT a 570 nm.

Resultados

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluida la indirubina y sus análogos químicos, inhiban la melanogénesis. Se espera que los análogos químicos de indirubina muestren, por ejemplo, una actividad inhibidora de la melanogénesis más potente en comparación con la indirubina. Asimismo, se espera que ciertos análogos químicos de la indirubina demuestren, por ejemplo, una actividad inhibidora de la melanogénesis menos eficaz en comparación con la indirubina.

Ejemplo 27

Eficacia in vitro

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención induzcan la apoptosis de los melanocitos y modulan la actividad de los melanocitos, la producción de melanina, la biogénesis de melanosomas y/o la transferencia de melanosomas al menos tan potente como la indirubina. También se contempla que algunos de los compuestos y composiciones de la presente invención afectarán a estos procedimientos biológicos de forma menos potente que la indirubina. Tales compuestos y composiciones pueden tener perfiles de toxicidad más favorables en comparación con especies más potentes.

Ejemplo 28

Eficacia in vivo

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención sean al menos tan efectivos como la indirubina para modular la pigmentación de la piel, incluyendo aclarar la piel y mejorar la hiperpigmentación/hipopigmentación causada por diversos trastornos. Se espera además que los compuestos y composiciones de la presente invención presenten perfiles farmacocinéticos favorables en términos de, por ejemplo, vida media y absorción. Ciertos compuestos exhibirán una vida media más larga, mientras que otros exhibirán una vida media más corta. De manera similar, ciertos compuestos exhibirán diferentes perfiles de absorción, con algunos compuestos que tardan más en absorberse completamente y otros que tardan menos tiempo en absorberse completamente.

Ejemplo 29

Designaciones de compuestos

La tabla 5 a continuación muestra las estructuras y los nombres de los compuestos

T l

Ejemplo 30

Actividad inductora de apoptosis de las composiciones que contienen compuestos derivados de Malassezia y/o sus análogos químicos

Reactivos

Alexa Fluor 488 anexina V/Kit de apoptosis de células muertas, suero fetal bovino (FBS), 0.25 % de tripsina-EDTA (1x), ensayo Caspasa-Glo 3/7, medio RPMI 1640, medio Eagle modificado de Dulbecco y solución antibiótica antimicótica (100x).

Métodos experimentales

Las composiciones de ensayo se disuelven en DMSO, EPI-100-LLMM o cualquier disolvente apropiado y se pueden preparar de acuerdo con las instrucciones de las Tablas 2-7 a continuación. Los expertos en la técnica conocen bien los disolventes apropiados.

Resultados del ensayo de anexina Vy del ensayo de caspasa 3/7

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluidas las composiciones #1-5, induzcan la muerte celular. Se espera que las composiciones de la presente invención muestren, por ejemplo, una actividad inductora de apoptosis más potente en comparación con al menos un compuesto componente solo. Asimismo, se espera que las composiciones de la presente invención demuestren, por ejemplo, una actividad inductora de apoptosis menos eficaz en comparación con al menos un compuesto componente solo. Tales composiciones pueden tener perfiles de toxicidad más favorables en comparación con composiciones más potentes.

Ejemplo 31

Viabilidad celular después de la exposición a las composiciones que contienen compuestos derivados de Malassezia y/o sus análogos químicos

Reactivos

Ensayo CellTiter-Glo® 2.0.

Métodos experimentales

Resultados

Ejemplo 32

Potencial de activación de los receptores de arilhidrocarburos de las composiciones que contienen compuestos derivados de Malassezia y/o sus análogos químicos

Procedimientos de ensayo

Posteriormente, se preparan soluciones madre de compuestos de prueba, composiciones de prueba y control positivo de omeprazol. Las soluciones de compuestos y composiciones se transfieren a la placa de ensayo usando Echo550. A continuación, la placa se vuelve a colocar en la incubadora para el tratamiento del compuesto/composición.

Resultados

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluidas las composiciones #1-5, modularán la actividad de AhR. Se espera que las composiciones de la presente invención muestren, por ejemplo, una actividad agonista de AhR más potente en comparación con al menos un compuesto componente solo. Asimismo, se espera que las composiciones de la presente invención demuestren, por ejemplo, una actividad agonista de AhR menos eficaz en comparación con al menos un compuesto componente solo. También se espera que las composiciones de la presente invención muestren, por ejemplo, una actividad antagonista de AhR más potente en comparación con al menos un compuesto componente solo. Asimismo, también se espera que las composiciones de la presente invención demuestren, por ejemplo, una actividad antagonista de AhR menos eficaz en comparación con al menos un compuesto componente solo.

Ejemplo 33

Ensayos MelanoDerm™

Identificación de sustancias de prueba y controles de ensayo

Tabla 6

Arí l r r n f rm il i

Tabla 7

m ii n 1

Tabla 8

m ii n 2

Tabla 9

m ii n

Tabla 10

m ii n 4

Tabla 11

m ii n

Los controles del ensayo incluyen: control positivo – malassezina (CV-8684) (500 µM) (17AJ41) y control de disolvente – DMSO (dimetilsulfóxido) preparado en EPI-100-LLMM.

Adicionalmente, el artículo de prueba y los controles se aplicaron a grupos de 4 tejidos, de los cuales se usaron 2 para el criterio de valoración de Viabilidad tisular (MTT) y 2 para el criterio de valoración de Melanina, respectivamente.Sistema de pruebas

Diseño y metodología experimental

El diseño experimental de este estudio consistió en la determinación del pH del artículo de prueba puro si es posible (y/o solución de dosificación según corresponda) y un ensayo definitivo para determinar la viabilidad relativa del tejido y la acción potencial del artículo de prueba como un modulador de melanogénesis de la piel al modelo de piel MelanoDerm™ después de exposiciones repetidas. Los artículos de prueba se expusieron al modelo de piel MelanoDerm™ durante un total de 7 días. Los artículos de prueba se aplicaron tópicamente al modelo de piel MelanoDerm™ cada 48 horas (dentro de un período de tiempo de 48±2 horas desde el tratamiento anterior). La toxicidad de los artículos de prueba se determinó mediante la reducción de MTT con enzima microsomal dependiente de NAD(P)H (y, en menor grado, mediante la reducción de succinato deshidrogenasa de MTT) en tejidos de control y tratados con artículo de prueba. Los datos se presentaron en forma de supervivencia relativa (conversión de MTT en relación con el control negativo/solvente). El impacto potencial en la producción de melanina se evaluó determinando la concentración de melanina producida en los tejidos tratados con el artículo de prueba en comparación con los tejidos tratados con control negativo/solvente. Los datos se presentaron en forma de concentración de melanina producida por los tejidos tratados con el artículo de prueba determinada usando una curva estándar de melanina. Alternativamente, los datos pueden presentarse como cambio porcentual en la concentración de melanina en relación con los tejidos tratados con control negativo/solvente.

Medios y reactivos

Preparación y entrega del artículo de prueba

A menos que se especifique lo contrario dentro de este protocolo, se aplicaron veinticinco microlitros de cada artículo de prueba directamente sobre el tejido para cubrir la superficie superior. Dependiendo de la naturaleza del artículo de prueba (líquidos, geles, cremas, espumas y similares), puede haber sido necesario el uso de un dispositivo de dosificación, malla u otra ayuda para permitir la distribución uniforme del artículo de prueba sobre la superficie del tejido. Vía de administración

Determinación del pH

Controles

El ensayo definitivo incluyó un control negativo, un control positivo y un control de disolvente (DMSO) o un control positivo y un control de disolvente (DMSO). Los tejidos MelanoDerm™ designados para el control negativo/solvente del ensayo se trataron con 25 µl de agua desionizada estéril o DMSO. Los tejidos designados para el control positivo del ensayo se trataron con 25 μl de 1 % de ácido kójico, Malassezina (CV-8684) (17AJ41) 500 μM o composición #2. El 1 % de ácido kójico se almacenó en un tubo cubierto con papel de aluminio hasta su uso dentro de las 2 horas posteriores a la preparación. Los tiempos de exposición del negativo/solvente y del control positivo fueron idénticos a los utilizados para los artículos de prueba. Los tejidos no tratados también se utilizaron como controles.

Evaluación de la reducción del artículo de prueba directa de MTT

Fue necesario evaluar la capacidad de cada artículo de prueba para reducir directamente el MTT. Se preparó una solución de MTT de 1.0 mg/ml en medio de adición de MTT. Se agregarán aproximadamente 25 μl del artículo de prueba a 1 ml de la solución de MTT y la mezcla se incubará en la oscuridad a 37 °C ± 1 °C durante una a tres horas. Un control negativo, 25 μl de agua desionizada estéril, o un control de disolvente, 25 μl de DMSO se analizaron simultáneamente. Si el color de la solución MTT se volvió azul/violeta, se suponía que el artículo de prueba había reducido el MTT. Los materiales de prueba insolubles en agua pueden haber mostrado una reducción directa (oscurecimiento) solo en la interfaz entre el artículo de prueba y el medio.

Recepción de MelanoDerm™

Ensayo definitivo

Exposición de tejidos: Al menos 16 horas después de iniciar los cultivos, se fotografiaron cinco tejidos MelanoDerm™ (considerados no tratados en el día 0) con una cámara digital para ayudar en la evaluación visual del grado de pigmentación de los tejidos en el tiempo cero del ensayo. Se enjuagaron dos tejidos MelanoDerm™ con CMF-DPBS, se secaron sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se transfirieron a los pocillos que contenían MTT apropiados después del enjuague y se procesaron en el ensayo de MTT. Se enjuagaron dos o tres tejidos MelanoDerm™ con CMF-DPBS, se secaron en seco sobre papel absorbente estéril y se eliminó el exceso de líquido. Los tejidos MelanoDerm™ se retiraron del inserto de cultivo celular utilizando bisturís estériles, se colocaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml etiquetado y se almacenaron a <-60 °C para el análisis de melanina posterior.

Al menos 16 horas después de iniciar los cultivos, el resto de los tejidos se transfirieron a una nueva placa de 6 pocillos que contenía 0.9 ml/pocillo de EPI-100-LLMM fresco precalentado. El ensayo se llevó a cabo durante un período de 7 días. Se trataron cuatro o cinco tejidos por vía tópica el primer día y cada 48 horas (dentro de un período de tiempo de 48+2 horas desde el tratamiento anterior) con 25 μl, de cada artículo de prueba. El medio se renovó a diario (en un plazo de 24+2 horas desde la realimentación anterior); los tejidos se transfirieron a una nueva placa de 6 pocillos que contenía 0.9 ml/pocillo de EPI-100-LLMM fresco y precalentado.

Se trataron cuatro o cinco tejidos por vía tópica el primer día y cada 48 horas (en un plazo de 48+2 horas desde el tratamiento anterior) con 25 μl de controles positivos y negativos/solvente, respectivamente. El medio se renovó a diario (en un plazo de 24+2 horas desde la realimentación anterior); los tejidos fueron transferidos a una

nueva placa de 6 pocillos que contiene 0.9 ml/pocillo de EPI-100-LLMM fresco y precalentado. Los tejidos se incubaron a 37±1 °C en atmósfera humidificada de 5±1 % CO2 en aire (condiciones estándar de cultivo) para los tiempos de exposición adecuados.

Análisis de datos

Resultados

La Figura 131 resume la viabilidad tisular media y los resultados de concentración de melanina para los artículos de prueba, composiciones de prueba, control positivo y control de disolvente. Los compuestos que comprenden las composiciones #1 y #2 demostraron efectos sinérgicos cuando se combinaron en una única composición.

La Figura 132 resume la viabilidad tisular media y los resultados de concentración de melanina para los artículos de prueba, composiciones de prueba, control positivo y control de disolvente. Los compuestos que comprenden las composiciones #2, #3, #4 y #5 demostraron efectos sinérgicos

Ejemplo 34

Potencial de melanogénesis de composiciones que contienen compuestos derivados de Malassezia y/o análogos químicos de estos

El propósito de este estudio es observar y reportar la melanogénesis y la viabilidad de los melanocitos B16 expuestos a composiciones que contienen compuestos derivados deMalasseziay/o análogos químicos de los mismos.

Materiales y reactivos

Protocolo

Los melanocitos B16 se cultivan hasta un 70 % de confluencia y se recogen. Las células se siembran en placas de 96 pocillos a una densidad de 4000 células/pocillo y se dejan adherir durante la noche. Al día siguiente, los artículos de prueba, las composiciones de prueba y los controles se diluyen en medio de ensayo B16. Se aspira el medio durante la noche y se aplican 200 ul de artículos de prueba y controles. Las células se incubaron a 37 °C y 10 % de CO2durante 72 horas. Después de 72 horas de incubación, se lee la absorbancia a 540 nm. El medio se retira y se reemplaza con 100 ul de medio en placa que contiene 1 mg/ml de MTT y se incuba durante 2 horas a 37 °C y 10 % de CO2. El medio MTT se retira y se reemplaza con 200 ul de 95 % de etanol/5 % de isopropanol y se dejó agitar durante 15 minutos. Luego se lee la absorbancia de MTT a 570 nm.

Resultados

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención, incluidas las composiciones #1-5, inhiban la melanogénesis. Se espera que las composiciones de la presente invención muestren, por ejemplo, una actividad inhibidora de la melanogénesis más potente en comparación con al menos un compuesto componente. Asimismo, se espera que determinadas composiciones demuestren, por ejemplo, una actividad inhibidora de la melanogénesis menos eficaz en comparación con al menos un compuesto componente.

Ejemplo 35

Eficacia in vitro

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención induzcan la apoptosis de los melanocitos y modulan la actividad de los melanocitos, la producción de melanina, la concentración de melanina, la biogénesis de melanosomas y/o la transferencia de melanosomas. También se contempla que algunos de los compuestos y composiciones de la presente invención afectarán a estos procedimientos biológicos de forma menos potente. Tales compuestos y composiciones pueden tener perfiles de toxicidad más favorables en comparación con especies más potentes.

Ejemplo 36

Eficacia in vivo

Se espera que los compuestos y composiciones de la presente invención modulan la pigmentación de la piel, incluida la aclaración de la piel y la mejora de la hiperpigmentación/hipopigmentación causada por diversos trastornos. Se espera además que los compuestos y composiciones de la presente invención presenten perfiles farmacocinéticos favorables en términos de, por ejemplo, vida media y absorción. Ciertos compuestos exhibirán una vida media más larga, mientras que otros exhibirán una vida media más corta. De manera similar, ciertos compuestos exhibirán diferentes perfiles de absorción, con algunos compuestos que tardan más en absorberse completamente y otros que tardan menos tiempo en absorberse completamente.

Ejemplo 37

Síntesis de análogos químicos de Malassezina e indirubina

Síntesis de AB17590

Como se muestra en la Figura 133A, a una solución del compuesto1a(25.0 g, 0.357 mol, 1.0 eq) en tetrahidrofurano (250 ml) se añadió bromuro de etinilmagnesio (0.5 M en THF, 1.07 l, 0.535 mol, 1.5 eq) a 0 °C y la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Luego, la mezcla se templó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0-10 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto1b(9.5 g, 27 %). TLC:PE:EA = 20:1, 254 nm; Rf(compuesto1a) = 0.3; Rf(compuesto1b) = 0.7.

A una mezcla de compuesto1b(9.5 g, 98.96 mmol, 1.0 eq) en tetrahidrofurano (100 ml) se añadió 60 % de una solución de hidruro de sodio (4.7 g, 0.119 mol, 1.2 eq) en dimetilformamida (50 ml) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. Después de 30 minutos, se añadió sulfato de dimetilo (22.4 g, 0.178 mol, 1.8 eq) a 0 °C. Después de la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y luego se añadió lentamente ácido acético (1 ml). El producto se destiló directamente de la mezcla de reacción. De este modo se obtuvo el compuesto1c(10.0 g, rendimiento del 91 %).

A una solución de compuesto1(8.0 g, 24.02 mmol, 1.0 eq) y compuesto1c(2.9 g, 26.43 mmol, 1.1 eq) en trietilamina (80 ml) se añadió yoduro cuproso (456 mg, 2.40 mmol, 0.1 eq) y Pd(PPh3)2Cl2(337 mg, 0.480 mmol, 0.02 eq) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0~10 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto2(7.0 g, 92 %). TLC: PE: EA=10:1, 254 nm; Rf(compuesto1) =0.8; Rf(compuesto2) =0.6.

A un matraz secado en horno se añadió una mezcla de dicloruro de platino (694 mg, 2.06 mmol, 0.1 eq), carbonato de sodio (3.3 g, 30.95 mmol, 1.5 eq), tris(pentafluorofenil)fosfina (2.2 g, 4.13 mmol, 0.2 eq), 6-metil indol (4.8 g, 41.27 mmol, 2.0 eq) y compuesto2(6.5 g, 20.63 mmol, 1.0 eq) en dioxano (650 ml). El matraz se desgasificó con nitrógeno, se selló y se calentó a 100 °C durante 16 horas. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. El disolvente se concentró a presión reducida. El residuo se diluyó con acetato de etilo y se extrajo con agua, salmuera saturada. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0~10 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto3(3.0 g, 36 %). TLC: PE: EA=10:1, 254 nm; Rf(compuesto2) =0.6; Rf(compuesto3) =0.2.

A una solución del compuesto3(3.0 g, 7.50 mmol, 1.0 eq) en tetrahidrofurano (30 ml) se añadió metanolato de sodio (5 M en MeOH, 6.0 ml, 29.98 mmol, 4.0 eq) a 0 ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0~10 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto 4 (1.5 g, 66 %). TLC: PE: EA=5:1, 254 nm; Rf(compuesto3) =0.7; Rf(compuesto4) =0.4.

Se añadió dimetilformamida (10 ml) a un matraz seco de fondo redondo de tres bocas de 500 ml en argón a 0 °C. Luego se añadió lentamente oxicloruro de fósforo (1.2 g, 7.60 mmol, 1.2 eq) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 10 min. Después de agitar a 0 °C durante 30 min, se añadió lentamente una solución del compuesto4(1.9 g, 6.33 mmol, 1.0 eq) en dimetilformamida (20 ml) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 5 °C durante 10 min. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Una vez completada la reacción (controlada por TLC usando 20 % de acetato de etilo en hexanos), la mezcla de reacción se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (50 ml) y se agitó durante 1 horas. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera saturada y se secaron sobre sulfato de sodio. El disolvente se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (10-50 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para obtener el compuesto5(1.8 g, 89 %). TLC: PE: EA=1:1, 254 nm; Rf(compuesto4) =0.8; Rf(compuesto5) =0.5.

A una solución del compuesto5(1.8 g, 5.49 mmol, 1.0 eq) en tetrahidrofurano (20 ml) se añadió dicarbonato de di-tercbutilo (3.0 g, 13.72 mmol, 2.5 eq) y 4-dimetilaminopiridina (1.4 g, 11.25 mol, 2.05 eq) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se diluyó con acetato de etilo y se lavó con ácido clorhídrico 1 N, bicarbonato de sodio acuoso saturado (300 ml) y salmuera (300 ml). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0-10 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para obtener el compuesto6(2.4 g, 82 %). TLC: PE: EA=10:1, 254 nm; Rf(compuesto5) =0.1; Rf(compuesto6) =0.5.

A una solución del compuesto6(2.4 g, 4.55 mmol, 1.0 eq) en terc-butanol (60 ml) se añadió 2-metil-2-buteno (30 ml) seguido de la adición de clorito de sodio (8.2 g, 90.91 mmol, 20.0 eq), fosfato de sodio monobásico (14.2 g, 90.91 mmol, 20.0 eq) y agua (60 ml) a 0 °C. La mezcla se calentó lentamente a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (100 ml) y se separó. La capa orgánica se lavó con agua (80 ml), salmuera (80 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el compuesto7bruto (2.5 g, 99 %). TLC: PE: EA=2:1, 254 nm; Rf(compuesto6) =0.7; Rf(compuesto7) =0.3.

A una solución del compuesto7(2.5 g, 4.60 mmol, 1.0 eq) en dimetilformamida (30 ml) se añadió carbonato de potasio (952 mg, 6.89 mmol, 1.5 eq) y yoduro de metilo (978 mg, 6.89 mmol, 1.5 eq) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (100 ml) y se lavó con agua (100 ml) y salmuera (100 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (5-17 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para obtener el compuesto8(2.3 g, 89 %). TLC: PE: EA=5:1, 254 nm; Rf(compuesto7) =0.1; Rf(compuesto8) =0.6.

Se agitó una mezcla del compuesto8(1.3 g, 2.33 mmol, 1.0 eq) en ácido clorhídrico (3 M en EA, 30 ml) a temperatura ambiente durante 16 h. La reacción se controló mediante TLC. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (10-25 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuestoAB17590(502 mg, 61 %) en forma de un sólido amarillo. TLC: PE: EA=3:1, 254 nm; Rf(compuesto8) =0.8; Rf(compuestoAB17590) =0.5; LC-MS: 359 (M+1)<+>;<1>H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, J = 19.7 Hz, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 15.7, 8.6 Hz, 2H), 5.04 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.42 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 0.78 – 0.68 (m, 1H), 0.62 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 0.54 – 0.41 (m, 2H).

Síntesis de AB17653

Como se muestra en la figura 133B, una mezcla de compuesto1(721 mg, 3.20 mmol, 1.0 eq), compuesto1a(560 mg, 3.20 mmol, 1.0 eq) y carbonato de sodio (866 mg, 8.17 mmol, 2.55 eq) en metanol (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró y la torta del filtro se lavó con metanol y agua para producir el compuestoAB17653(979 mg, 89 %) como un sólido rojo. TLC:PE/EA = 3/1, 254 nm; Rf(compuesto1) = 0.6; Rf(compuestoAB17653) = 0.4; LC-MS: 338.95 (M-1)-;<1>H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ11.01 (d, J = 21.5 Hz, 2H), 8.64 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 8.8, 4.6 Hz, 2H).

Síntesis de AB17654

Como se muestra en la Figura 133B, una mezcla de compuestoAB17653(979 mg, 2.88 mmol, 1.0 eq) e hidrocloruro de hidroxilamina (520 mg, 7.49 mmol, 2.6 eq) en piridina (30 ml) se agitó a 120 °C durante 2 horas en nitrógeno atmósfera. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante LCMS. Una vez completada la reacción, la mezcla se concentró a presión reducida y se añadió HCl 1 N hasta que apareció el sólido. La mezcla se filtró y la torta de filtrado se disolvió en NaOH 1 N. Luego se añadió HCl 3N para ajustar el pH = 5 y se filtró. La torta del filtro se lavó con HCl 1 N para producir el compuestoAB17654(500 mg, 48 %) en forma de un sólido rojo. LC-MS: 357.95 (M+1)<+>;<1>H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 13.59 (s, 1H), 11.71 (s, 1H), 10.82 (s, 1H), 8.53 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.19 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.42 – 7.35 (m, 2H), 7.11 – 6.96 (m, 3H).

Síntesis de AB17655

Como se muestra en la Figura 133B, una mezcla de compuesto2(637 mg, 3.86 mmol, 1.0 eq), compuesto1a(676 mg, 3.86 mmol, 1.0 eq) y carbonato de sodio (1044 mg, 9.84 mmol, 2.55 eq) en metanol (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró y la torta del filtro se lavó con metanol y agua para producir el compuestoAB17655(1027 mg, 95 %) como un sólido rojo. LC-MS: 281.05 (M+1)<+>;<1>H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ11.06 (s, 1H), 10.86 (s, 1H), 8.54 (dd, J = 10.5, 2.7 Hz, 1H), 7.67 – 7.53 (m, 2H), 7.41 – 7.38 (m, 1H), 7.09 – 6.98 (m, 2H), 6.85 (dd, J = 8.5, 4.8 Hz, 1H).

Síntesis de AB17656

Como se muestra en la Figura 133B, una mezcla de compuestoAB17655(1027 mg, 3.67 mmol, 1.0 eq) e hidrocloruro de hidroxilamina (663 mg, 9.54 mmol, 2.6 eq) en piridina (30 ml) se agitó a 110 °C durante 2 horas en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante LCMS. Una vez completada la reacción, la mezcla se concentró a presión reducida y se añadió HCl 1 N hasta que apareció el sólido. La mezcla se filtró y la torta de filtrado se disolvió en NaOH 1 N. Luego se añadió HCl 3N para ajustar el pH = 5 y se filtró. La torta del filtro se lavó con HCl 1 N para producir el compuestoAB17656(500 mg, 48 %) en forma de un sólido rojo. LC-MS: 296.00 (M+1)<+>;<1>H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ13.60 (s, 1H), 11.77 (s, 1H), 10.69 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.20 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 7.02 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.83 (d, J = 4.9 Hz, 1H).

Síntesis de AB17657

Como se muestra en la Figura 133B, una mezcla de compuesto3(362 mg, 2.46 mmol, 1.0 eq), compuesto1a(431 mg, 2.46 mmol, 1.0 eq) y carbonato de sodio (666 mg, 6.28 mmol, 2.55 eq) en metanol (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró y la torta del filtro se lavó con metanol y agua para producir el compuesto4(606 mg, 93 %). TLC:PE/EA = 1/1, 254 nm; Rf(compuesto3) = 0.7; Rf(compuesto4) = 0.5.

Se agitó una mezcla de compuesto4(606 mg, 2.31 mmol, 1.0 eq) e hidrocloruro de hidroxilamina (418 mg, 6.01 mmol, 2.6 eq) en piridina (20 ml) a 120 °C durante 2 horas en una atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se concentró a presión reducida y se añadió HCl 1 N hasta que apareció el sólido. La mezcla se filtró y la torta de filtrado se disolvió en NaOH 1 N. Luego se añadió HCl 3N para ajustar el pH = 5 y se filtró. La torta de filtrado se lavó con HCl 1 N para producir el compuestoAB17657(500 mg, 78 %) en forma de un sólido marrón. TLC:PE/EA = 1/1, 254 nm; Rf(compuesto4) = 0.5; Rf(compuestoAB17657) = 0.4; LC-MS: 278.10 (M+1)<+>;<1>H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ13.60 (s, 1H), 11.77 (s, 1H), 10.69 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.20 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 7.02 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.83 (d, J = 4.9 Hz, 1H).

Síntesis de AB17658

Como se muestra en la Figura 133B, una mezcla de compuesto5a(337 mg, 1.73 mmol, 1.0 eq), compuesto5b(554 mg, 1.73 mmol, 1.0 eq) e hidróxido de potasio (1114 mg, 3.46 mmol, 2.0 eq) en acetonitrilo (10 ml) se agitó a 35 °C durante 1.5 horas en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para producir el compuesto5c(436 mg, 99 %). TLC:PE/EA = 1/1, 254 nm; Rf(compuesto5a) = 0.8; Rf(compuesto5c) = 0.5.

Una mezcla de compuesto5(330 mg, 1.72 mmol, 1.0 eq), compuesto5c(436 mg, 1.72 mmol, 1.0 eq) y carbonato de sodio (465 mg, 4.38 mmol, 2.55 eq) en metanol (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró y la torta del filtro se lavó con metanol y agua para producir el compuesto6(617 mg, 93 %). TLC:PE/EA = 1/1, 254 nm; Rf(compuesto5) = 0.5; Rf(compuesto6) = 0.4.

Se agitó una mezcla de compuesto6(617 mg, 1.60 mmol, 1.0 eq) e hidrocloruro de hidroxilamina (290 mg, 4.17 mmol, 2.6 eq) en piridina (20 ml) a 110 °C durante 2 horas en una atmósfera de nitrógeno. El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se concentró a presión reducida y se añadió HCl 1 N hasta que apareció el sólido. La mezcla se filtró y la torta de filtrado se disolvió en NaOH 1 N. Luego se añadió HCl 3N para ajustar el pH = 5 y se filtró. La torta del filtro se lavó con HCl 1 N para producir el compuestoAB17658(500 mg, 78 %) en forma de un sólido rojo. TLC:PE/EA = 1/1, 254 nm; Rf(compuesto6) = 0.4; Rf(compuestoAB17658) = 0.3; LC-MS: 402.95 (M+1)<+>;<1>H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ11.86 (s, 1H), 11.39 (s, 1H), 9.40 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.6 Hz, 1H).

Ejemplo 38

Evaluación in vivo de las propiedades fotoprotectoras de Malassezina, otros compuestos derivados de Malassezia y sus análogos químicos

Formulación de 1 % de Malassezina

La formulación de 1 % de Malassezina utilizada en este estudio contenía los siguientes ingredientes: Agua (aqua) -65.939 %; Isosorbida de dimetilo – 20.000 %; Ésteres de gliceret-8 de aceite de oliva – 3.000 %; Glicerina – 2.991 %; Alcanos de coco – 2.700 %; Copolímero de taurato de acriloildimetil sódico / acrilato de hidroxietilo – 1.700 %; Malassezina – 1.000 %; Pentilenglicol – 1.000 %; Fenoxietanol – 0.640 %; Coco-caprilato / Caprato – 0.300 %; Caprilil glicol – 0.200 %; Clorfenesina – 0.160 %; Isostearato de sorbitán – 0.140 %; Tocoferol – 0.100 %; Polisorbato 60 – 0.080 %; y EDTA disódico – 0.050 %.

Diseño experimental

En este estudio de prueba de concepto se incluyó a una mujer de 39 años con piel tipo IV.

El día 1 del experimento, se evaluó al sujeto para determinar la dosis mínima de eritema ("MED") utilizando un dispositivo UVB Dualight de banda ancha dirigido. Se colocó una plantilla de 6 cuadrados en la parte inferior izquierda de la espalda (1.5 cm x 1.5 cm) del sujeto de prueba. Ver la Figura 134.

Las dosis de la fotoprueba MED para el tipo de piel del sujeto se enumeran en la Figura 135 e unidades mJ/cm<2>. Veinticuatro horas después de la irradiación, el sujeto regresó para la evaluación MED. Como se muestra en la Figura 139, la MED del sujeto fue de 120 mJ.

Posteriormente, el sujeto aplicó 1 % de Malassezina en el cuadrado de prueba superior de la espalda derecha dos veces al día durante 7 días. Se trató un segundo cuadrado inferior derecho dos veces al día desde el día 4 al día 7, y un tercer cuadrado medial para una aplicación el día 7. El vehículo producto se aplicó durante 7 días dos veces al día en la espalda izquierda. Ver la Figura 140. El sujeto regresó al centro de investigación para ser irradiado el día 7. Ver la Figura 136. Cada sitio de prueba se irradió con 120 mJ de exposición a UVB. El sujeto regresó en 24 horas para la evaluación de fototoxicidad/fotoprotección. Ver la Figura 141.

El sujeto continuó el experimento, recibiendo 1 % de Malassezina durante un total de 14 días. Las Figuras 142-143 muestran regiones de la piel del sujeto expuestas a los siguientes tratamientos: en el sitio 14, se aplicó 1 % de Malassezina dos veces al día durante 14 días; en el sitio 10, se aplicó 1 % de Malassezina dos veces al día durante 11 días; en el sitio 8, se aplicó 1 % de Malassezina dos veces al día durante 8 días; en el sitio 3, se aplicó 1 % de Malassezina dos veces al día durante 3 días; en el sitio 1, se aplicó una vez 1 % de Malassezina; y, en los sitios del vehículo, se aplicó vehículo dos veces al día durante 7 y 9 días, respectivamente.

Resultados

Como se muestra en la Figura 141, 24 horas después de la exposición a UVB, el sujeto exhibió 1 más a 2 más eritema en el sitio de prueba del vehículo. Consulte la Figura 138 para ver la escala de eritema. Por el contrario, se observó menos eritema (leve) en el sitio de tratamiento de 7 días con 1 % de Malassezina. La evaluación de los sitios tratados durante 3 días mostró eritema mínimo y ninguno para el sitio de aplicación de 1 día. Se tomaron medidas de colorimetría de cada sitio utilizando el Mexameter MX16 y se apoyaron las observaciones clínicas. Se observaron lecturas máximas de eritema en el sitio del vehículo seguido por el sitio tratado con Malassezina durante 7 días. Los valores más bajos se observaron para el sitio del día 3 y del día 1 de Malassezina, respectivamente. Ver la Figura 136. El sujeto continuó el experimento y regresó para repetir la irradiación UVB a los 14 días con interpretación el día 15. Ver la Figura 142. La evaluación clínica el día 15 reveló un eritema moderado en el sitio del vehículo el día 7 y significativamente menor el día 9. Ver la Figura 143. Se observó menos eritema (leve) en los sitios tratados con 1 % de Malassezina, incluidos los sitios del día 14, día 10 y día 8. Se observó un eritema mínimo en los sitios de 1 % de Malassezina durante los días 1 y 3. Se tomaron lecturas de colorimetría de cada sitio para medir el eritema y el índice de melanina. Los resultados apoyaron las observaciones clínicas de menos eritema en los sitios tratados con 1 % de Malassezina. Ver la Figura 137.

Se tomaron biopsias del sitio del vehículo a los 9 días y de los sitios tratados con 1 % de Malassezina durante los días 1 y 3. Las muestras se analizaron para determinar la hematoxilina y eosina, la tinción de Fontana Masson y MART I para la cuantificación de melanocitos y estudios affymetrix.

Diagnóstico: (A) Piel - día 1 tratada (1 % de Malassezina): Estrato córneo de tejido de cesta, melanocitos de apariencia normal (confirmada por tinción con inmunoperoxidasa con Mart-1) y melanina epidérmica (confirmada por tinción con inmunoperoxidasa con Fontana Masson).

Diagnóstico: (B) Piel - día 3 tratada (1 % de Malassezina): Estrato córneo de tejido de cesta, menos melanocitos dendríticos (confirmado por tinción de inmunoperoxidasa con MART-1/Melan A) en comparación con C y D, y con una ligera disminución de melanina epidérmica, como áreas de salto (confirmado por tinción de inmunoperoxidasa con Fontana Masson).

Diagnóstico: (C) Piel - vehículo: Melanocitos epidérmicos de apariencia normal (confirmada por tinción con inmunoperoxidasa con Mart-1) y melanina epidérmica (confirmada por tinción con inmunoperoxidasa con Fontana Masson).

Diagnóstico: (D) Piel - normal: Melanocitos epidérmicos de apariencia normal (confirmada por tinción con inmunoperoxidasa con Mart-1) y melanina epidérmica (confirmada por tinción con inmunoperoxidasa con Fontana Masson).

Conclusiones

Los resultados de este estudio de prueba de concepto demuestran las propiedades de protección contra los rayos ultravioleta de Malassezina.

Se prevé que estudios adicionales en los que participen pacientes adicionales demostrarán propiedades de protección UV equivalentes o más eficaces de Malassezina. También se prevé que estudios adicionales dilucidarán las vías de señalización molecular asociadas con la fotoprotección inducida por malassezina.

DOCUMENTOS

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un compuesto que tiene la estructura de la siguiente fórmula:

, en donde: X se selecciona del grupo que consiste en NR14y O; R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, CN, hidroxilo, R16y OR16; R14es hidrógeno o R16; R5and R6se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, OR16, R16, y cicloalquilo C3-6, o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O) o un cicloalquilo de C3-6; R12es –COR<a>; cada R16es independientemente formilo, alquilo C1-9, alquenilo C2-9, o alquinilo C2-9; y, R<a>se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo y OR16; o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O).
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: al menos uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11es alquilo C1-4o en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11es hidrógeno.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: X es NH; o cada uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11es hidrógeno; o R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O).
5. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1, o una forma cristalina, hidrato, o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de este.
6. La composición de la reivindicación 5, en donde: R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O).
7. La composición de la reivindicación 5, en donde: al menos uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11es alquilo C1-4o en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11es hidrógeno.
8. La composición de la reivindicación 5, en donde: X es NH; o cada uno de R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10y R11es hidrógeno; o R5es hidrógeno y R6es hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6u O-(alquilo C1-4); o R5y R6se combinan para formar un grupo oxo (=O).
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o la composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compuesto es:

, o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.
10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o la composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compuesto es:

, o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.
11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o la composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compuesto es: , o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.
12. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o la composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compuesto es:

o una forma cristalina, hidrato o sal cosmética o farmacéuticamente aceptable de esta.
13. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 9-12, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, para su uso en un método terapéutico para aclarar la piel de un sujeto, el método que comprende poner en contacto al sujeto con el compuesto o composición, o una forma cristalina, hidrato, o sal farmacéuticamente aceptable del compuesto.
14. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 9-12, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, para su uso en un método terapéutico para modular la melanogénesis de un sujeto, el método que comprende poner en contacto al sujeto con el compuesto o composición, o una forma cristalina, hidrato, o sal farmacéuticamente aceptable del compuesto.
15. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 9-12, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, para su uso en un método terapéutico para modular la concentración de melanina de un sujeto, el método que comprende poner en contacto al sujeto con el compuesto o composición, o una forma cristalina, hidrato, o sal farmacéuticamente aceptable del compuesto.
16. Un método cosmético para aclarar la piel en un sujeto, el método cosmético que comprende poner en contacto al sujeto con el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 9-12, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, o una forma cristalina, hidrato, o sal cosméticamente aceptable del compuesto.
17. Un método cosmético para modular la melanogénesis en un sujeto, el método cosmético que comprende poner en contacto al sujeto con el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 9-12, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, o una forma cristalina, hidrato, o sal cosméticamente aceptable del compuesto.