ES3018014A1 - Preparación combinada para su uso en la mejora del estado muscular - Google Patents

Abstract

Preparación combinada para su uso en la mejora del estado muscular. La presente invención proporciona una preparación combinada que comprende dos composiciones que actúan de forma sinérgica para su uso en regeneración muscular, en el tratamiento y/o prevención de la atrofia muscular y de la sarcopenia en un sujeto, así como para la curación de heridas musculares, mejora del rendimiento muscular, de la senescencia muscular y en la reversión de la degeneración muscular preferiblemente asociada al envejecimiento.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación combinada para su uso en la mejora del estado muscular

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y alimentarias para su uso en la prevención o tratamiento de la degeneración y atrofia muscular, preferiblemente asociadas al envejecimiento, y en particular de la sarcopenia. Por lo tanto, la presente invención se encuadra dentro de los campos de la biotecnología, farmacia y alimentación, más particularmente dentro de las composiciones destinadas a la regeneración muscular y, en general, a la mejora del estado y del rendimiento muscular en un sujeto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los músculos son estructuras altamente especializadas y con un gran potencial de adaptación, en gran parte debido a que diferentes vías de señalización dan respuesta a estímulos como el ejercicio físico. Uno de los efectos del ejercicio físico es la mejora de diversas propiedades metabólicas, desde una reducción en los niveles de glucosa circulante, pasando por cambios en los tipos de fibras musculares, hasta la inducción de angiogénesis o regulación del sistema inmunológico. Además, la práctica de ejercicio físico previene el desarrollo de la resistencia a la insulina y de la diabetes tipo 2. Por otro lado, la sociedad está experimentando un envejecimiento, con una proporción cada vez mayor de personas mayores de 65 años. Este sector de la población presenta una reducción progresiva y generalizada del músculo esquelético, caracterizada por una disminución de la fuerza muscular y del rendimiento físico, proceso conocido como sarcopenia (Kalampouka, I., van Bekhoven, A. & Elliott, B. T., 2018, Front. Physiol. 9, 1 7).

La sarcopenia se asocia con discapacidad física, caídas, fracturas, morbilidad y mortalidad, mala calidad de vida, baja densidad mineral ósea y pérdida de fibras musculares (Pickering, M. E. & Chapurlat, R., 2020, Calcif. Tissue Int. 107, 203-211). La prevalencia de la sarcopenia en las edades de 40-49, 50-59, 60-69, 70-79 y más de 80 años es del 7%, 10,6%, 15,4%, 21,2% y 36,5%, respectivamente. La etiología de la sarcopenia es multifactorial y los mecanismos que subyacen a la fisiopatología de esta son complejos. Hay varios mecanismos propuestos para explicar la disminución de la masa muscular, que incluyen senescencia celular, estrés oxidativo, inflamación, la función alterada de las células satélite, disminución del número de unidades motoras, cambios en los niveles hormonales, acumulación de mutaciones en el ADN mitocondrial o la pérdida de miocitos por apoptosis mediada por caspasas (Cheema, N., Herbst, A., Mckenzie, D. & Aiken, J. M., 2015, Aging Cell 14, 1085-1093). Tradicionalmente se ha considerado que la estrategia más eficaz para el manejo de la sarcopenia es el entrenamiento físico, a través de ejercicios de resistencia (Cruz-Jentoft, A. J.etal.,2019, Age Ageing. 48, 16-31). Sin embargo, muchas personas mayores son sedentarias y no pueden o quieren hacer ejercicio, por lo que son necesarias nuevas estrategias para tratar esta patología.

Numerosas líneas de evidencia sugieren un papel significativo de la muerte celular programada (apoptosis) de miocitos en la sarcopenia y en el envejecimiento (Quadrilatero, J., Alway, S. E. & Dupont-Versteegden, E., 2011, Appl. Physiol. Nutr. Metab. 36, 608-617). Por tanto, una reducción de la apoptosis puede reducir la disminución de la masa y función muscular en sarcopenia. Varias citocinas, como el factor tumorógenico de necrosis alfa (TNF-a), la interleuquina 1 (IL1) o el interferóngamma (IFN-a), están implicados en la patogenia de pérdida muscular. En particular, se ha demostrado que niveles elevados de TNF-a conducen a la atrofia muscular, ya que TNF-a es un potente desencadenante del desgaste muscularin vitroein vivo,mediante la inhibición de la miogénesis y la inducción de apoptosis y proteólisis, a través de la activación del factor nuclear-B (NF-kB) (Gallo, D.et al.,2015, Endocrinology 156, 3239 3252).

Los estudiosin vitrocon miocitos se postulan como una herramienta muy eficiente para caracterizar los posibles efectos de un compuesto bioactivo en la salud muscular (Yang, X., Zhang, Q., Gao, Z., Yu, C. & Zhang, L., 2018, Biomed. Pharmacother. 99, 184-190). Teniendo en cuenta que una baja tasa de renovación de miocitos subyace a la patogenia del músculo envejecido, es razonable plantear la hipótesis que en modelosin vitromusculares la tasa acelerada de apoptosis puede ser inducida por señales externas como el TNF-a o el peróxido de hidrógeno (H2O2).

En resumen, son necesarias nuevas aproximaciones y estrategias para el manejo de la degeneración muscular y la sarcopenia y, en general, para la mejora del estado y del rendimiento del estado muscular, particularmente asociado al envejecimiento.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una preparación combinada que comprende dos composiciones que actúan de forma sinérgica para su uso en regeneración muscular, en el tratamiento y/o prevención de la atrofia muscular y de la sarcopenia en un sujeto, así como en la curación de heridas musculares y en la reversión de la degeneración muscular preferiblemente asociada al envejecimiento.

La presente invención demuestra, mediante el uso de modelosin vitroque simulan dos escenarios diferentes: un estado óptimo de salud y un estado de degeneración muscular, que la preparación combinada a la que se refieren las reivindicaciones mejora de una forma sinérgica la capacidad de regeneración muscular revirtiendo la degeneración de los miocitos.

Los ejemplos de realización mostrados más adelante demuestran lo anterior y además, para llevarlos a cabo se ha simuladoin vitrouna digestión gastrointestinal (GID) de la preparación combinada de la invención, mediante su exposición a una serie de fluidos artificiales, en condiciones que simulan lo que ocurriría en el cuerpo humano tras la ingestión de la preparación combinada de la invención, en concreto para reproducir las condiciones de la boca, el estómago y los intestinos a las que son sometidos los alimentos durante el proceso digestivo, de manera que los resultados que aquí se muestran son extrapolables a lo que ocurriríain vivo.

Así, en un primer aspecto, la invención se refiere a una preparación combinada, “preparación combinada de la invención” , que comprende:

a. Una primera composición que comprende entre un 60 y un 75% de ácido hialurónico, más de un 10% de mucopolisacáridos y más de un 5% de colágeno (“primera composición”), y

b. Una segunda composición que comprende al menos un 90%de concentrado de proteína aislada de suero de leche y un contenido de grasa y de lactosa inferior al 0,2 % (“segunda composición”).

El término “preparación combinada” se refiere a una preparación en la que hay más de una composición, en este caso la primera composición indicada en (a) y la segunda composición indicada en (b). En la preparación combinada de la invención, ambas composiciones no necesitan encontrarse presentes como unión para poder encontrarse disponibles, sino que pueden estar separadas de manera que su aplicación pueda darse tanto simultáneamente como separada o secuencialmente. De esta manera, no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la posible separación física de ambas composiciones. Preferiblemente, la primera y segunda composición dentro de la preparación combinada se administran de manera simultánea.

En una realización preferida, el ácido hialurónico, los mucopolisacáridos y el colágeno de la primera composición se obtienen de cresta de gallo(Gallus gallus).Así, la primera composición de la invención es, preferiblemente, un extracto natural obtenido a partir de crestas de gallo y comprende una concentración de ácido hialurónico de entre el 60-75%, mucopolisacáridos (>10%) y colágeno (>5%). En una realización más preferida, el colágeno de la primera composición es colágeno hidrolizado. En una realización aún más preferida, los mucopolisacáridos son condroitín sulfato A y dermatán sulfato (condroitín sulfato B). En otra realización aún más preferida, la primera composición comprende una concentración de ácido hialurónico de entre el 60-75%, una concentración de mucopolisacáridos de más de un 10% (donde los mucopolisacáridos son condroitín sulfato A en una concentración entre el 0.40 y el 3% y condroitín sulfato B en una concentración entre el 8 y el 18%), una concentración de colágeno de más de un 5%, una concentración de fibra igual o inferior al 0.4%, aminoácidos libres en una concentración de entre el 0.2 y el 2% y proteína a una concentración entre el 12 y el 22%.

En una realización particular, y a modo de ejemplos (lotes), la primera composición comprende los parámetros indicados a continuación:

Más preferiblemente, el proceso mediante el cual se obtiene esta primera composición comprende las etapas de: i) hidrólisis enzimática de las muestras biológicas aisladas de crestas de gallo utilizando una alcalasa comercial producida porBacillus licheniformis,ii) filtración, iii) concentración y iv) precipitación en presencia de NaCl. Tras la etapa de hidrólisis enzimática se inactivan las enzimas mediante un tratamiento por calor.

La segunda composición de la invención es, preferiblemente, un aislado de proteína de suero de leche bovina con un contenido en proteína entre, preferiblemente, el 86 y el 91%, más preferiblemente de al menos un 90%, respecto a materia seca, y un bajo contenido en lactosa (<0.2%) y grasa (<0.2%). El contenido en cenizas y humedad en la segunda composición es inferior a 4.5 y 5%, respectivamente.

En una realización particular de la preparación combinada de la invención, la primera composición es el producto comercial Mobilee® comercializado por Bioibérica.

En otra realización particular de la preparación combinada de la invención, la segunda composición es el producto comercial Lacprodan® DI-9213 comercializado por Arla Food Ingredients.

Los inventores de la presente invención han analizado diferentes concentraciones de la primera y la segunda composición dentro de la preparación combinada hasta obtener las concentraciones óptimas de cada una de ellas para ejercer un mayor efecto (superior al efecto que se obtendría adicionando los efectos de cada una de las dos composiciones empleadas por separado) y para minimizar la toxicidad celular sobre los miocitos. Así, en otra realización preferida, la primera composición se encuentra a una concentración de entre 0,004 y 1 mg/ml de preparación combinada y la segunda composición se encuentra a una concentración de entre 0,009 y 2 mg/ml de preparación combinada. En una realización más preferida, la primera composición se encuentra a una concentración de 0,006 mg/ml de preparación combinada y la segunda composición se encuentra a una concentración de 0,019 mg/ml de preparación combinada.

La preparación combinada de la invención puede encontrarse en forma líquida, sólida o semisólida (gel).

La preparación combinada de la invención puede formar parte de un producto alimentario o bien de una composición farmacéutica. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un producto alimentario, de ahora en adelante "producto alimentario de la invención”, o a una composición nutricional, que comprende la preparación combinada de la invención.

En una realización preferida del producto alimentario o composición nutricional de la invención, dicho producto alimentario o composición nutricional es un alimento, un suplemento dietético o nutricional, un ingrediente de un alimento funcional, un alimento medicinal (o alimento para usos médicos especiales) o un nutracéutico.

La composición nutricional o producto alimentario de la invención puede ser de uso/consumo humano o animal y se refiere a cualquier producto alimentario o composición nutricional que afecta beneficiosamente al cuerpo humano o animal mejorando el estado de salud muscular en el sentido indicado en la presente invención.

El término "suplemento” incluye, aunque de forma no limitante, los términos "suplemento dietético” , "suplemento nutricional” , "suplemento alimentario”, "suplemento alimenticio” y "complemento alimentario” , y se refiere a productos o preparaciones cuyo propósito es suplementar la dieta normal de un sujeto aportando nutrientes u otras sustancias con un efecto fisiológico y/o nutricional. En la presente invención, dichas sustancias son los componentes comprendidos en la primera y segunda composición de la preparación combinada.

Ejemplos de productos alimentarios incluyen, pero sin limitación, productos dietéticos, productos vegetales, productos cárnicos, snacks, bebidas, cereales, productos de panadería, galletas, productos lácteos, leches, leches fermentadas (como yogur o queso), helados, mantequillas, margarinas, etc.

En otra realización preferida, dicho producto alimentario se selecciona de la lista que consiste en: una bebida, incluyendo pero sin limitación las bebidas en polvo, batidos y bebidas de nutrición deportiva, un producto lácteo, una barrita proteica, cereales, una barrita de cereales, un gel, un zumo o una sopa.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante “composición farmacéutica de la invención”, que comprende la preparación combinada de la invención.

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intralesional, o intramuscular. Como ejemplos de preparaciones farmacéuticas se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.), semisólida (geles) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral, preferiblemente para administración oral. Preferiblemente, dicha composición está formulada para su administración oral, más preferiblemente se administra al sujeto a través de la dieta.

En otra realización preferida, dicha composición además comprende un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la preparación combinada de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibásico, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El "vehículo” , al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente. El término "vehículo" se refiere por tanto a un diluyente, coadyuvante, o portador con el que se debe administrar la preparación combinada de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con las composiciones comprendidas en la preparación combinada de la invención. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua, disolventes, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceites de ricino, polisorbatos, ésteres de sorbitano, éter sulfatos, sulfatos, betaínas, glucósidos, maltósidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxámeros, polioxietilenos, polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares.

Como muestran los ejemplos incluidos más adelante, la preparación combinada de la invención es de utilidad para reducir el tamaño de las heridas musculares y para la regeneración muscular (ver Figura 1). Además, en una situación de sarcopenia simuladain vitro(inducida por la exposición de miocitos a TNFa) ésta produce un fuerte e inesperado incremento en la expresión del genMyoD(ver Figura 2) lo que supone un impacto positivo en la regeneración muscular en situación de sarcopenia, mostrando un efecto sinérgico asociado al uso combinado de la primera y segunda composición dentro de la preparación combinada. En resumen, la preparación combinada de la invención tiene un efecto positivo y sinérgico sobre la regeneración muscular y la miogénesis.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento o, alternativamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento.

El término “medicamento” hace referencia a una sustancia usada para la prevención, alivio, tratamiento o curación de enfermedades, síndromes o condiciones clínicas en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprende la preparación combinada de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de preparación combinada de la invención que produzca el efecto deseado. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del sujeto.

El medicamento de la invención puede utilizarse tanto solo como en combinación con otros medicamentos o composiciones para promover o potenciar la regeneración muscular, la curación de heridas, y el tratamiento y/o prevención de la atrofia muscular o la sarcopenia en un sujeto. El medicamento de la presente invención puede ser empleado junto a otros principios activos o terapias a modo de terapia combinada. Los otros principios activos pueden formar parte de la misma composición o bien pueden ser proporcionados mediante una composición distinta, siendo administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

En otro aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en la regeneración muscular en un sujeto o, alternativamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para promover, mejorar o inducir la regeneración muscular en un sujeto, más preferiblemente en un proceso de envejecimiento y/o en un proceso de curación de heridas musculares.

En otro aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de la atrofia muscular en un sujeto o, alternativamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la atrofia muscular en un sujeto, más preferiblemente en un proceso de envejecimiento.

La “atrofia muscular” es un trastorno en el que se produce el desgaste o la pérdida del tejido muscular, disminuye el tamaño del músculo provocando que éste vaya perdiendo fuerza. Se produce por un desequilibrio entre la síntesis de proteínas y su degradación y como consecuencia, se deterioran las células nerviosas de los músculos esqueléticos. Esto provoca una parálisis progresiva que puede ser completa o parcial y que supone un deterioro de la capacidad funcional de la persona. El sujeto siente que su fuerza va disminuyendo y también su capacidad de movimiento. Tiene lugar un debilitamiento, encogimiento de los músculos y pérdida progresiva del tono muscular. En el contexto de la presente invención, la atrofia muscular puede ser debida a, pero sin limitación, causas fisiológicas, patológicas y neurogénicas.

La atrofia fisiológica es la atrofia muscular por inactividad, por la falta de uso de ciertos músculos como consecuencia, por ejemplo, de llevar una vida muy sedentaria. Los sujetos que padecen una enfermedad que les limite el movimiento o que permanezcan sentados mucho tiempo, entre otras, tienen más probabilidades de padecer de atrofia muscular.

La atrofia patológica puede ser causada por diversas enfermedades o darse en personas de edad avanzada como consecuencia del propio envejecimiento.

La atrofia neurogénica, que es la clase de atrofia muscular más grave y que suele manifestarse de manera más repentina, se produce por una enfermedad o lesión en los nervios que conectan los músculos. Y puede aparecer como consecuencia de enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), por lesión de la médula espinal o por el síndrome de Guillain-Barré, pero también puede ser consecuencia de situaciones como la desnutrición, el uso a largo plazo de corticoides, artritis, enfermedades de los músculos, etc.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de la sarcopenia en un sujeto o, alternativamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la sarcopenia en un sujeto.

La “sarcopenia” es una afección que se caracteriza por la pérdida de masa, fuerza y funcionamiento de los músculos en sujetos de avanzada edad. Los signos y síntomas incluyen debilidad, cansancio, falta de energía, problemas de equilibrio y dificultades para caminar y mantenerse de pie. La pérdida de masa muscular o la debilidad en ocasiones provocan caídas, rotura de huesos y otras lesiones graves que afectan la capacidad de la persona para cuidar de sí misma. Es posible que la edad avanzada, hacer muy poco o nada de ejercicio y una nutrición inadecuada aumenten el riesgo de sarcopenia. Los sujetos con cáncer también pueden presentar sarcopenia.

El término “tratamiento” tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; (ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

El término “prevención” tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de la enfermedad o condición clínica, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.

El término “sujeto” se refiere a un ser humano o a un animal no humano, preferiblemente a un mamífero no humano, de cualquier sexo o edad. El sujeto al que se refiere la presente invención puede ser, por ejemplo, aunque sin limitarnos, un rumiante tal como oveja, cabra o ganado, dromedario, camello, llama, canguro, cerdos, aves de corral tales como pavo, pato, codorniz, ganso, paloma, pollo, gallina o gallo, caballos, así como animales de compañía tales como perros o gatos. En una realización particular, el sujeto al que se refiere la presente invención es un ser humano, más preferiblemente un ser humano de más de 40 años de edad, preferiblemente de más de 49, más de 50, más de 59, más de 60, más de 69, más de 70, más de 79, o más de 80 años de edad.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.Tamaño de la herida a las 24 h en función de los diferentes tratamientos. Datos expresados como media ± SEM. * p < 0.05 vs. Vehículo (medio de cultivo celular en ausencia de los tratamientos). Imágenes representativas de la capacidad de regeneración en el momento de realizar la herida (paneles superiores, 0 h) y al cabo de 24 h de los tratamientos (paneles inferiores). WP: Lacprodan® DI-9213.

Figura 2.La combinación de Mobilee® Lacprodan® DI-9213 (WP) incrementa significativamente y de forma sinérgica la expresión del genMyoDcomo marcador de miogénesis en situación sarcopénica (+TNFa). Datos expresados como media ± SEM.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la preparación combinada de la invención.

EJEMPLO 1. DISEÑO EXPERIMENTAL

El diseño experimental incluye el uso de cultivosin vitrode miocitos L6, una línea celular de músculo esquelético bien establecida para el estudio de la función muscular.

Previamente, los ingredientes se sometieron a digestión gastrointestinalin vitro,para obtener la fracción digerida que se empleó para realizar los experimentos.

A continuación, se realizó una prueba de viabilidad celular para determinar el rango de concentraciones de Mobilee® que toleran los miocitos, permitiendo seleccionar los 3 niveles de concentración de Mobilee® así como la fracción proteica de Lacprodan® DI-9213 (WP) (baja, media y alta), para finalmente llegar a aquellas concentraciones con un mayor efecto para las siguientes determinaciones.

Para dar respuesta a los objetivos planteados, el experimento se dividió en dos subapartados:

S1. Los miocitos se cultivaron en condición basal donde se examinó el impacto del tratamiento de interés en una situación que simulaba un óptimo estado de salud, analizando la migración celular y la miogénesis.

S2. Los miocitos se cultivaron en una situación que simulaba una condición de enfermedad (sarcopenia) donde se examinó el impacto de Mobilee® combinado con WP en la migración celular, la miogénesis y la atrofia muscular.

EJEMPLO 2. DIGESTIÓN GASTROINTESTINAL SIMULADA IN VITRO

La digestión gastrointestinal simulada in vitro (GID, por sus siglas en inglés) es un método estandarizado que permite analizar los cambios en las propiedades fisicoquímicas de un ingrediente o matriz alimentaria cuando se expone secuencialmente a una serie de fluidos artificiales que simulan las condiciones de la boca, el estómago y el intestino delgado. Cada producto se evaluó por triplicado. El procedimiento de GID consta de tres pasos para imitar el proceso digestivo en la boca, el estómago (digestión gástrica) y el intestino delgado (digestión duodenal dinámica). Se simula el ambiente fisiológico humano, teniendo en cuenta las condiciones de temperatura, pH, fuerza iónica, actividad enzimática y agitación, siguiendo los protocolos descritos por Ortegaetal.(Ortega, N., Maciá, A., Romero, M. P., Reguant, J. & Motilva, M. J., 2011, Food Chem.doi:10.1016/j.foodchem.2010.05.105).

Brevemente, cada ingrediente se mezcla con una solución salina de tampón fosfato (pH 6.9 con 0.04% NaCl y 0.004% de CaCh) y posteriormente se calienta a 37°C durante 10 minutos. Durante todo el procedimiento, manteniendo las muestras en agitación magnética y a temperatura controlada (37°C).

1. La fase oral se simuló añadiendo 10 mg de a-amilasa (100-300 ud/g) en una solución de tampón de fosfato (pH 6.9 con NaCl al 0.04% y CaCh al 0.004%) a los diferentes productos, incubando durante 5 min.

2. Para reproducir la fase gástrica, el pH se estableció en 2.0 ± 0.1, para ello se añadió una solución de pepsina porcina en HCl 0.01 N. Esta mezcla se agitó en una incubadora durante 2 h a 37°C.

3. Para la digestión duodenal se ajustó el pH a 6.5 añadiendo NaHCO3. Luego, se agregó jugo duodenal, incluyendo sales biliares y pancreatina y se agitó por otras 2 h a 37°C.

4. Finalmente, para el proceso de dialización, se llevó a cabo una diálisis de 12 KDa de tamaño de partícula durante 8 h a 37°C.

Transcurrido este periodo, se procedió a liofilizar tanto el producto dializado como la parte no dializada (asemejándose a la porción que se dirige a colon). Una vez las diferentes digestiones y dializaciones fueron totalmente liofilizadas, se procedió a su pesaje para resuspender el producto digerido y dializado para los siguientes tratamientos, y ser expresado como miligramos de producto digerido y liofilizado por mililitro de medio de cultivo (mg/ml).

EJEMPLO 3. ENSAYO DE CITOTOXICIDAD

La prueba de viabilidad celular permitirá evaluar el rango de concentración de Mobilee® que toleran los miocitos, permitiendo seleccionar los diferentes niveles de concentración a testar.

Brevemente, las células L6 se cultivaron en DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) con alto contenido de glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, penicilina 100 U/ml y solución de estreptomicina 100 jg /m l, en una atmósfera humidificada de aire al 95% y CO2al 5% a 37°C hasta que las células alcanzaron aproximadamente un 70-80% de confluencia cuando se realizaron los tratamientos y las diferentes determinaciones. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo MTT. Las células se trataron con ocho diluciones en serie (dilución %) de las concentraciones de stock iniciales de los productos digeridos durante 24 h. Después de los tratamientos, se aspiró el medio de cultivo y se agregó la solución de MTT (0,5 mg/mL) durante 2h. Después de la incubación, el sobrenadante se reemplazó con DMSO (100 |<j>L por pocillo) y se incubaron durante 15 minutos para disolver los cristales de formazán, y la absorbancia se determinó a 570 nm.

EJEMPLO 4. EFECTO DEL TRATAMIENTO EN SITUACIÓN SALUDABLE (S1) Y EN UN MODELO IN VITRO DE SARCOPENIA (S2)

El siguiente ensayo se llevó a cabo siguiendo el mismo protocolo en cada uno de los dos bloques.

-ENSAYO DE MIGRACIÓN

Para evaluar el efecto del tratamiento sobre la recuperación y regeneración muscular, se analizó la migración de las células en condición basal. Las células se cultivaron hasta una confluencia aproximada del 80%, se rascó el pozo de cultivo con una punta de pipeta estéril para eliminar una sección lineal de células. Inmediatamente se fotografió el tamaño del rasguño (referencia inicial), y se trataron las células durante 24h, realizando microfotografías a las 4h, 24h y 48h de los tratamientos. El tamaño del rasguño se cuantificó con el software ImageJ.

Por otro lado, para reproducirin vitroel microambiente celular que se da en la sarcopenia, las células se trataron con TNFa 15 ng/mL, durante 24 h y con sus respectivos tratamientos.

-DETERMINACIÓN DEL PROCESO DE MIOGÉNESIS Y ATROFIA MUSCULAR

Las alteraciones en algunas vías moleculares pueden ser críticas en el desarrollo tanto de lesiones por daño muscular como en la sarcopenia. La expresión de genes que codifican proteínas implicadas en el proceso de miogénesis o atrofia muscular se evaluó mediante extracción de RNA y qRT-PCR. Después de los tratamientos, se aspiró el medio, se lavaron las células con PBS y se lisaron con 200 ^l de reactivo TRIZOL y se extrajo el RNA, cuantificando la concentración y pureza mediante NanoDropND-1000. Se eliminó el DNA contaminante mediante tratamiento con DNasa. Después del aislamiento de RNA, se realizó la retrotranscripción del mRNA a cDNA mediante la transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen). La expresión génica se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando el conjunto de cebadores indicado abajo y normalizado al gen ciclofilina A PPIA, como genhousekeeping.Las diferencias entre Cts del gen estudiado y el gen de referencia se calcularon con el método 2-AACt, obteniendo los cambios relativos en la expresión génica mediante fluorescencia de SYBR Green.

Se analizó, en particular, el genMyoD1que regula la diferenciación de las células musculares y también participa en la regeneración muscular.

Las secuencias de la pareja de oligonucleótidos usada para la determinación de la expresión génica deMyoDIfueron, en sentido 5 '-3 ': cebador directo GGAGACATCCTCAAGCGATGC (SEQ ID NO: 1) y cebador inverso GCACCTGGTAAATCGGATTG (SEQ ID NO: 2).

EJEMPLO 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para cada parámetro se realizó una exploración inicial para descartar puntos discrepantes dentro de los grupos. Para ello se empleó la prueba estadística de Grubbs, utilizando el software GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA). Todos los datos se expresan como medias ± error estándar de la media (SEM). Para analizar diferencias en los diferentes parámetros se utilizó un análisis de la variabilidad de una vía (One Way ANOVA). Se definió un nivel de probabilidad p<0.05 como estadísticamente significativo. Los niveles por debajo de 0.1 se definieron como tendencias a la significación.

EJEMPLO 6. RESULTADOS

DIGESTIÓN GASTROINTESTINAL SIMULADAIN VITRO

Se procedió a la digestión simuladain vitrode los diferentes productos a las dosis indicadas en la Tabla 1.

Tabla 1. Dosis máximas humanas y cantidades seleccionadas y escaladas para la digestión simuladain vitropara los diferentes productos de interés.

A continuación de la digestión en las diferentes fases (oral, gástrica e intestinal) se procedió a realizar la fase simulada de absorción intestinal mediante el uso de una diálisis con un poro de 12 KDa, obteniendo, por un lado, una parte no liofilizada que se asemeja a la fracción colónica que se almacenó, y por otro lado, la parte liofilizada de la digestión que se asemeja a la fracción absorbida en el intestino, obteniendo los siguientes rendimientos después de la liofilización (Tabla 2).

Tabla 2. Rendimientos de las digestiones simuladasin vitrode los productos después de las diferentes fases de digestión oral, gástrica e intestinal, de la simulación del proceso de absorción mediante diálisis y de la liofilización del producto dializado.

A partir de los digeridos y liofilizados, se procedió a realizar los ensayos de citotoxicidad (MTT). Estos ensayos proporcionaron un rango de concentraciones en las que se observaba toxicidad y además un rango de concentraciones de trabajo con los diferentes productos. Las concentraciones citotóxicas de los productos digeridos se muestran en la Tabla 3, y se expresaron como miligramos de producto digerido, dializado y liofilizado por mililitro de medio de cultivo.

Tabla 3. Análisis de la citotoxicidad de los productos digeridos expresados en porcentaje de los miocitos tratados con el vehículo. En la parte superior de cada producto, se expresan las concentraciones utilizadas (mg/mL).

De los ensayos de citotoxicidad, se pudieron extraer tres niveles de concentración de uso (concentración alta, media y baja) para los productos digeridos (Tabla 4) y que fueron aplicados en los siguientes estudios de proliferación.

Tabla 4. Selección de las concentraciones alta-media-baja de los productos digeridos derivados del estudio de citotoxicidad.

A continuación, se realizaron pruebas de proliferación para verificar por un lado la ausencia de citotoxicidad con las concentraciones altas, medias y bajas identificadas de los productos digeridos, corroborando la ausencia de citotoxicidad con las tres concentraciones. Referente a la proliferación, solo se observó una tendencia a incrementar significativamente la proliferación en los miocitos tratados con las concentraciones más bajas (Tabla 5).

Tabla 5. Efectos sobre la proliferación de los miocitos con los diferentes productos digeridos a las concentraciones alta (panel superior), media (panel central) y baja (panel inferior) derivados de los estudios de citotoxicidad.

Fruto de la combinación de los resultados de citotoxicidad y de proliferación, se seleccionaron las dosis de uso de los diferentes productos y de las combinaciones de Mobilee® con la WP para las siguientes determinaciones que se llevaron a cabo (Tabla 6).

Tabla 6. Selección de las dosis a usar en las siguientes determinaciones fruto de los estudios de citotoxicidad y de proliferación, expresados como miligramos de producto digerido, dializado y liofilizado por mililitro de medio de cultivo.

MIGRACIÓN CELULAR

Una de las propiedades más apreciadas para la regeneración muscular es la capacidad de reducir el tamaño de las heridas musculares. Así, un método ampliamente aceptado es el descratch,por el que se realiza una herida a un cultivo confluente de miocitos y se monitoriza el tiempo que tarda a recuperarse completamente de la herida. Así en el presente estudio se observó que Mobilee® tiende a disminuir el tamaño de herida, aunque de forma no significativa, WP no produce dicha reducción y Mobilee® en combinación con la WP induce una reducción significativa del área de la herida (Figura 1).

MIOGÉNESIS

La expresión deMyoDmostró una tendencia a aumentar con la combinación de Mobilee® WP en la situación basal aunque de forma no significativa (Figura 2). Esta tendencia a incrementar se corroboró en la situación sarcopénica producida por la exposición a TNFa. Además, en la situación sarcopénica por TNFa, se observa un fuerte incremento en la expresión deMyoDcon la combinación de Mobilee® con la WP (Figura 2), sugiriendo un impacto positivo y sinérgico en la regeneración muscular en situación de sarcopenia.

En conclusión, la combinación propuesta por la presente invención (Mobilee® y WP) presenta efectos beneficiosos sobre la regeneración muscular y la miogénesis en situación de sarcopenia. Se puede afirmar por tanto que el tratamiento con la combinación Mobilee® y WP promueve la regeneración muscular y la miogénesis.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una preparación combinada que comprende:

a. Una primera composición que comprende entre un 60 y un 75% de ácido hialurónico, más de un 10% de mucopolisacáridos y más de un 5% de colágeno, y

b. Una segunda composición que comprende al menos un 90%de concentrado de proteína aislada de suero de leche y un contenido de grasa y de lactosa inferior al 0,2 %.

2. Preparación combinada de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ácido hialurónico, los mucopolisacáridos y el colágeno de la primera composición se obtienen de cresta de gallo.

3. Preparación combinada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la primera composición se encuentra a una concentración de entre 0,004 y 1 mg/ml de preparación combinada y la segunda composición se encuentra a una concentración de entre 0,009 y 2 mg/ml de preparación combinada.

4. Preparación combinada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la primera composición se encuentra a una concentración de 0,006 mg/ml de preparación combinada y la segunda composición se encuentra a una concentración de 0,019 mg/ml de preparación combinada.

5. Producto alimentario que comprende la preparación combinada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Producto alimentario de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicho producto alimentario es un alimento, un suplemento dietético o nutricional, un ingrediente de un alimento funcional, un alimento medicinal o un nutracéutico.

7. Producto alimentario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, donde dicho producto es una bebida, un producto lácteo, una barrita proteica, cereales, una barrita de cereales, un gel, un zumo o una sopa.

8. Composición farmacéutica que comprende la preparación combinada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha composición está formulada para su administración oral.

10. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que además comprende un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso como medicamento.

12. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso en la regeneración muscular en un sujeto.

13. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la atrofia muscular en un sujeto.

14. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la sarcopenia en un sujeto.

15. Composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el sujeto es un ser humano.