ES3018258T3 - Preservation of cellular components from cells with a preservative - Google Patents

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Abstract

Esta invención se refiere a una solución conservante y a un método para conservar sangre entera para análisis celular y molecular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conservación de componentes celulares procedentes de células con un conservante
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional estadounidense 62/303886 en tramitación, titulada “Preservation of Circulating Tumor Cell RNA with a Whole Blood Preservative”, presentada el 4 de marzo de 2016.
Antecedentes
En la sangre completa se encuentran células raras incluyendo, pero sin limitarse a, células tumorales circulantes (“CTC”) y células de mieloma múltiple circulantes, y se han usado para evaluar a los pacientes para detectar cáncer. El dispositivo comercial CELLSEARCH® es un dispositivo regulado por la FDA que se vende en muchos países para aislar células raras tales como CTC y CMMC. Este dispositivo aísla las células raras a partir de la sangre e identifica fenotípicamente el tipo de célula que está presente usando obtención de imágenes y análisis mediante FISH. Además, en algunos casos, se ha usado el número de células para indicar si el cáncer de un paciente está empeorando o en remisión. Con la disponibilidad del análisis genómico, existe el deseo no sólo de identificar fenotípicamente las células, sino también de extraer el ADN y el ARN a partir de células raras aisladas y evaluar el genotipo de tales células raras.
Se sabe que las células raras son frágiles y su aislamiento a partir de sangre completa es una tarea compleja. A menudo, se extrae sangre de los pacientes y se envía a laboratorios. Si tal sangre no se conserva, no se aislarán células raras. Existen conservantes para sangre completa conocidos, tales como Cyto-Chex™ y CELLSAVE® (fabricados por Streck Laboratories Inc. y Janssen Diagnostics Inc., respectivamente), así como EDTA, formaldehído y glutaraldehído, que se usan para conservar CTC en sangre completa durante varios días. Sin embargo, cuando se desea extraer ácidos nucleicos a partir de células raras aisladas, las células que se conservan con esos conservantes tienen menores rendimientos de ácidos nucleicos aislados. Por tanto, sería beneficioso inventar un conservante que permita mayores rendimientos de ácidos nucleicos aislados. Esta necesidad se satisface mediante la siguiente invención.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Recuperación de células tumorales con diferentes conservantes.
Figura 2. Análisis de la recuperación de ARN.
Figura 3. Efecto de los diferentes conservantes sobre la expresión de genes.
Descripción detallada de la invención
La invención incluye un reactivo para conservar células procedentes de una muestra biológica para el posterior aislamiento de componentes celulares que comprende una cantidad eficaz de glioxal.
Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, células B, células T, subconjuntos de células inmunitarias y células raras. Las células preferidas son células B, células T y células raras. El término “células raras” significa una célula, una pequeña agrupación de células, o una clase de células y sus eventos asociados que no se detectan de manera fácil y fiable, ni se cuantifican con precisión, en muestras biológicas sin la aplicación a la muestra de alguna forma de concentración o enriquecimiento por selección positiva o negativa. Los ejemplos de células raras incluyen, pero no se limitan a, células tumorales circulantes (CTC), células de melanoma circulantes (CMC), células endoteliales circulantes (CEC), células de mieloma múltiple circulantes (CMMC), células fetales circulantes, células T específicas de antígeno, células madre de leucemia mieloide aguda, y células dendríticas. Las células raras preferidas son células tumorales circulantes (CTC), células de mieloma múltiple circulantes (“CMMC”), y células de mieloma circulantes (“CMC”). Las células particularmente preferidas son células tumorales circulantes (CTC). El término “muestra biológica” significa extractos que se producen de manera natural de un paciente. Los ejemplos de tales extractos incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, médula ósea, orina, derrames pleurales, saliva, líquido de ganglios linfáticos, y plasma. Las muestras biológicas preferidas son sangre completa y médula ósea; la muestra biológica particularmente preferida es sangre completa.
El término componentes celulares se refiere a constituyentes de células incluyendo, pero sin limitarse a, exosomas, microvesículas, y ácidos nucleicos. Los componentes celulares preferidos son exosomas y ácidos nucleicos, lo más preferiblemente ácidos nucleicos. El término “ácido nucleico” incluye ADN, ARN y todos los tipos de los mismos. Con respecto al ADN, los tipos de ADN incluyen, pero no se limitan a, cromosómico, mitocondrial y derivado de patógeno. Con respecto al ARN, los tipos de ARN incluyen ARN codificante y no codificante, ARNm, ARNt, ARNinc, ARNr, micro-ARN, ARNip, ARNnop, piARN, ARNpt (ARN pequeño derivado de ARNt), y ARNpr (ARN pequeño derivado de ADNr). El ácido nucleico preferido es ARN, y sus tipos preferidos son ARNt, ARNr, y ARNm.
La “cantidad eficaz” de glioxal es de desde aproximadamente el 0,1%del reactivo hasta aproximadamente el 0,5 %, más preferiblemente de aproximadamente el 0,2 %.
El reactivo puede comprender agentes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, fosfatos tales como fosfato de sodio dibásico heptahidratado y fosfato de potasio; sales tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, sal de disodio dihidratada; bases tales como hidróxido de sodio e hidróxido de calcio; polietilenglicol reticulado de pesos moleculares variables desde aproximadamente 1K hasta 35K; anticoagulantes tales como ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético; ácido 1,2-diaminociclohexanotetraacético, ácido etilenbis(oxietilenonitrilo)tetraacético, y sal de disodio de ácido etilendiaminotetraacético deshidratada. Los agentes adicionales preferidos se seleccionan de uno o más miembros del grupo que consiste en fosfato de sodio dibásico heptahidratado, fosfato de potasio monobásico, cloruro de sodio, sal de disodio dihidratada, hidróxido de sodio, polietilenglicol reticulado de peso molecular 20K, y sal de disodio de ácido etilendiaminotetraacético deshidratada. Además, la invención incluye un método para conservar componentes celulares que comprende: obtener una muestra biológica y añadir un reactivo que comprende una cantidad eficaz de glioxal, en el que dicho método conserva los componentes celulares durante un periodo de tiempo suficiente. Todos los términos mencionados anteriormente tienen los mismos significados e intervalos preferidos. La expresión “periodo de tiempo suficiente” significa el periodo de tiempo que comienza a partir de la extracción de la muestra biológica y que termina aproximadamente a las 96 horas, preferiblemente de 24 a 96 horas, lo más preferiblemente de 24 a 72 horas. El término “conservar” significa mantener los componentes celulares de modo que puedan aislarse.
Todavía además, la invención incluye un método de aislamiento de componentes celulares que comprende (a) obtener una muestra biológica, (b) añadir un reactivo que comprende una cantidad eficaz de glioxal, (c) conservar los componentes celulares durante un periodo de tiempo suficiente, (d) aislar las células a partir de la muestra biológica, (e) extraer los componentes celulares a partir de tales células. Todos los términos mencionados anteriormente tienen los mismos significados e intervalos preferidos.
Se conocen métodos de aislamiento de células a partir de muestras biológicas incluyendo, pero sin limitarse a, clasificación de células activadas por fluorescencia, filtración de células, microdisección láser, nanodiamantes fluorescentes, perlas magnéticas, y mircrofluídica. La elección de qué tipo de sistema de aislamiento debe usarse depende del tipo de células que van a aislarse. Con respecto al aislamiento de células raras tales como CTC y c Mm C, puede usarse el sistema comercial CELLSEARCH®, así como el sistema experimental (“Harpoon”, véanse los ejemplos del documento WO2015/058206 titulado “Microfluidic Sorting Using High Gradient Magnetic Fields”). Existen varios kits comerciales y métodos de investigación que pueden usarse para extraer componentes celulares a partir de muestras biológicas que son conocidos por los científicos, incluyendo, pero sin limitarse a, técnicas químicas, en fase sólida, electroforéticas, y fluorométricas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de disolución 3 de conservante.
La disolución de conservante denominada disolución 3 consiste en el anticoagulante glioxal y un conservante de células en tampón fosfato. La fórmula específica de la disolución 3 de conservante es la siguiente:
Se disolvieron 0,5 gramos de fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4'7H2O), 0,01 gramos de fosfato de potasio monobásico (KH<2>PO<4>), 4,1 gramos de cloruro de sodio, 46,0 gramos de sal de disodio de ácido etilendiaminotetraacético dihidratada (Na2EDTA2H2O), 3,6 gramos de polietilenglicol reticulado (PEG) de peso molecular 20K y 150 ml de glioxal (40 %) en 800 ml de agua con un mezclador. Después de disolverse todos los sólidos, se ajustó el pH a 7,0 usando hidróxido de sodio y después se ajustó el volumen final de disolución a 1000 ml mediante la adición de agua. Esta es una disolución 3 de conservante 30x, y se añaden 0,033 ml de disolución de conservante por ml de sangre completa para la conservación de células.
Ejemplo 2: Estabilidad de las células tumorales circulantes en la sangre.
En este ejemplo, se sometió a prueba el efecto de la disolución de conservante sobre la conservación de células tumorales circulantes (CTC) hasta 96 horas. Las células tumorales circulantes (CTC) de origen epitelial están presentes en la sangre de pacientes con carcinoma con una frecuencia muy baja (< 10/ml de sangre) y se requiere enriquecimiento de células tumorales para la detección. Las selecciones positiva y negativa son dos tipos de métodos de enriquecimiento que se usan ampliamente. En la selección positiva, se usa un marcador específico presente en células tumorales raras para aislarlas de las células no diana en la sangre. En la selección negativa, las células no diana se separan de las células diana en la sangre. En este ejemplo, se usa el método de selección negativa para enriquecer las células tumorales y monitorizar la estabilidad de las células tumorales con sangre conservada usando la tecnología Harpoon. La tecnología Harpoon usa un chip que reduce el volumen de las células de un tubo Vacutainer de sangre periférica mediante eliminación basada en el tamaño de los glóbulos rojos (RBC) y las plaquetas seguida de enfoque inercial microfluídico y eliminación magnética de los glóbulos blancos (WBC) marcados con perlas magnéticas.
Se compara el rendimiento de la nueva disolución 3 de conservante con la disolución CellSave y sangre con EDTA sin conservante. La disolución de conservante CellSave se desarrolló para conservar las CTC en la sangre hasta 96 horas en el ensayo de CTC CellSearch. El ensayo de CTC CellSearch usa partículas magnéticas conjugadas con una molécula de adhesión celular antiepitelial (EpCAM) para enriquecer las CTC a partir de 7,5 ml de sangre (método de selección positiva).
Se añadieron las células tumorales cultivadas en tejido a sangre sana normal para imitar muestras de pacientes con cáncer para la evaluación de la disolución de conservante. Se agrupó la sangre de voluntarios sanos extraída directamente en tubos de conservante para sangre disponibles comercialmente (CellSave, Janssen Diagnostics) o EDTA (BD Biosciences) y se dividió en alícuotas en tubos cónicos de plástico de 15 ml. Se añadieron 33 ul de la disolución 3 de conservante 30x por ml de sangre con EDTA. Se añadió un número conocido (~1000 células/ml de sangre) de células tumorales cultivadas en tejido de próstata (Vcap) previamente marcadas (con CytoTrack Red (CTR)) a muestras de sangre (5,5 ml) con diferentes condiciones de conservación, se mezclaron y se almacenaron a temperatura ambiente. A las 0 (~2 h), 24, 48, 72 y 96 h se procesaron las muestras de sangre en el dispositivo de aislamiento de células Harpoon Alpha (Janssen Diagnostics). En diferentes puntos de tiempo, se añadieron anticuerpos de cóctel biotinilados (CD45 (concentración final de 1,5 ug/ml), CD16 (concentración final de 0,15 ug/ml) y CD66b (concentración final de 0,15 ug/ml)) a cada muestra de sangre y se mezclaron continuamente durante 30 min a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadieron 660 ul (120 ul/ml de sangre) de perlas de estreptavidina Dynal a las muestras de sangre y se mezclaron durante otros 30 min. Las muestras de sangre tratadas con anticuerpos y perlas Dynal se procesaron en el dispositivo de aislamiento Alpha con un chip de plástico de 1,3 V adherido a un megafiltro o 1,3M (megafiltro dentro del chip). El hemograma completo se realizó con el dispositivo de análisis de sangre Sysmex-XP300 (Sysmex Corporation) para las muestras de sangre completa antes del procesamiento en el sistema de dispositivo de aislamiento Alpha.
El producto del dispositivo de aislamiento de células Harpoon que contiene células tumorales se contó usando la cámara de recuento de Nageotte. En resumen, se tiñeron 400 ul del producto con 1 ul de Vybrant DyeCycle Green (Life Technologies) durante 5 min a TA. Se pipetearon 105 ul del producto teñido con Vybrant DyeCycle Green en una cámara de Nageotte, después se colocó el cubreobjetos sin perturbar las células y se dejó reposar durante 2-5 minutos antes del recuento en el microscopio de fluorescencia (Nikon). Las células fluorescentes verdes (canal FITC) se contaron como número total (células tumorales añadidas WBC) de células en el producto de IFD y las células tumorales añadidas previamente marcadas con CTR como células fluorescentes rojas. El número total de células tumorales presentes en el producto se calculó en función del volumen de producto. El porcentaje de recuperación de células tumorales se calculó usando el número de células tumorales añadidas de la siguiente manera:
Los resultados de este estudio se muestran en la figura 1 y la tabla 1. La figura 1 muestra el porcentaje de recuperación de células tumorales en función del tiempo de almacenamiento de la sangre. Tal como se esperaba, la recuperación de células tumorales a partir de la sangre almacenada con EDTA disminuye y la recuperación de células tumorales es del 49 % en el punto de tiempo de 48 horas. Existe una tendencia a la disminución de la recuperación de células tumorales en la sangre con CellSave a lo largo del tiempo. Sin embargo, se sabe que las células tumorales son estables en la sangre con CellSave basándose en el ensayo CellSearch. Es posible que algunas de las células tumorales procedentes de la sangre con CellSave se pierdan en la plataforma Harpoon por motivos que deben determinarse. Por otro lado, no hay tendencias a la recuperación de células tumorales con la disolución 3 de conservante, y la recuperación de células tumorales siempre está por encima del 80 % hasta las 72 horas. Los datos muestran que las células tumorales son estables en la sangre conservada con la disolución 3 de conservante y la sangre conservada es compatible con la tecnología Harpoon.
Tabla 1: Resumen del porcentaje de recuperación de células tumorales con diferentes conservantes para sangre.
Ejemplo 3: Recuperación de ARN a partir de sangre tratada con diferentes conservantes y su integridad.
Además de la enumeración de células tumorales, la caracterización molecular de las células tumorales también es importante para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, los fijadores existentes conservan las células de una manera que daña los ácidos nucleicos. Estos fijadores modifican el ARN/ADN a través de reticulación, lo que da como resultado un rendimiento y una calidad bajos de los ácidos nucleicos. Por tanto, es importante desarrollar métodos de fijación que conserven las células, así como el ADN y el ARN, para permitir el análisis celular y molecular.
En este ejemplo, se comprueba mediante electroforesis la recuperación de ARN a partir de sangre tratada con conservantes y su integridad. Antes de eso, se extrajo sangre completa de donantes sanos en tubos con EDTA y se expuso a diversos conservantes durante 24 horas. Se extrajo ARN a partir de las muestras usando el kit de protección de sangre animal de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad de ARN se evaluaron mediante el análisis del ARN extraído en el dispositivo de bioanálisis Agilent 2100. Algunos conservantes que se usan actualmente fijan las células sanguíneas de una manera que dificulta la extracción de ARN (y ADN) a partir de muestras conservadas. La extracción se vuelve ineficiente tras la conservación y también se ve comprometida la integridad de los ácidos nucleicos recuperados. La figura 2 muestra que el tratamiento durante 24 horas con formaldehído al 1 % o glutaraldehído al 1 % dio como resultado una recuperación muy deficiente de ARN en comparación con la recuperación obtenida a partir de muestras no tratadas con conservantes (EDTA a las 0 h y EDTA a las 24 h) o muestras tratadas durante 24 horas con disolución 3 1X. La integridad del ARN recuperado también se vio comprometida tras el tratamiento con formaldehído al 1 % o glutaraldehído al 1 % en comparación con los controles de EDTA y el tratamiento con disolución 31X (obsérvese la ausencia de bandas aparentes para los ARN ribosómicos 28S y 18S dentro del recuadro de línea de puntos). Obsérvese también que las muestras de sangre tratadas con disolución 3 produjeron muestras de ARN con el rendimiento y la integridad más altos a las 24 horas (recuadro de línea negra continua). Este ejemplo muestra claramente que el tratamiento con disolución 3 permite la recuperación de una mayor cantidad/calidad de ARN en comparación con formaldehído al 1 % y glutaraldehído al 1 %. Si bien la sangre sin conservación (muestra con EDTA a las 24 h) produjo ARN de una cantidad/calidad comparable a las obtenidas tras el tratamiento con disolución 3, debe observarse que sólo se requiere un análisis detallado de la expresión de muchos genes individuales para evaluar el impacto de la ausencia de conservación (EDTA) sobre las mediciones de expresión de genes. Tal análisis se presenta en el ejemplo 4. Ejemplo 4: Estabilidad de marcadores de ARN en sangre conservada con diferentes conservantes.
En este ejemplo se comprueba la eficacia de los conservantes para sangre mediante la monitorización de la expresión de un panel de genes (tabla 2) en muestras de sangre enriquecidas con Harpoon a lo largo del tiempo. Tabla 2: Lista de genes monitorizados durante los exámenes de formulaciones de conservante.
Las muestras para el análisis de ARN se procesaron de la siguiente manera. Se prepararon diez alícuotas de 5,5 ml de EDTA y cinco alícuotas de 5,5 ml de sangre con CellSave de cada uno de los cuatro donantes sanos. A todos los tubos se les añadieron 500 células VCAP. Para cada donante, cinco alícuotas de sangre con EDTA se trataron con 182 ul (33 ul/ml de sangre) de la disolución 3 de conservante. Un tubo de sangre de cada donante y condición de fijación (EDTA únicamente, disolución 3 y CellSave) se procesó en el dispositivo de aislamiento de células Harpoon Alpha inmediatamente (t=0) y 24, 48, 72 y 96 horas después de la preparación de la muestra. Se centrifugó el resultado procedente de Harpoon y se eliminó todo el sobrenadante excepto ~65 ul. Se añadieron seiscientos cincuenta pl de tampón RLT de Qiagen al sedimento celular y se congelaron las muestras a -80 °C.
a) Se extrajo el ARN usando el kit de extracción de ARN/ADN/proteína All Prep de Qiagen según las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones a continuación:
b) Se descongelaron las muestras y se añadieron dos volúmenes ddH<2>O.
c) Se añadió proteinasa K y se incubó la muestra a 55 °C durante 10 min.
d) Se añadió la mitad del volumen de etanol absoluto y se aplicó la muestra a minicolumnas RNeasy de Qiagen. e) Se continuó el procesamiento según el protocolo del fabricante, incluyendo un tratamiento con ADNasa en columna y una elución final en 30 ul de agua.
f) Se sometieron a transcripción inversa 5,0 ul (16,7 % de la muestra total) de cada muestra usando el protocolo y kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (n.° de cat. de Life Technologies: 4368814).
g) Se amplificaron previamente 12,5 ul de ADNc usando el kit de amplificación previa (n.° de cat. de Life Technologies: 4384266) y cebadores para las dianas de la tabla a continuación.
h) Se realizó qPCR para las dianas de la tabla a continuación usando 3,2 ul de la reacción de amplificación previa en el chip Fluidigm HD Biomark 96.96 Dynamic Array.
Los resultados de este estudio se muestran en la figura 3 y la tabla 3. El mejor conservante debe mantener un perfil de expresión que sea lo más cercano posible a la muestra no fijada en el nivel inicial (EDTA a las 0 h). La figura 3 muestra el valor promedio de expresión relativa de los cuatro donantes más/menos la desviación estándar para los marcadores específicos de la línea celular cancerosa. Los niveles de genes específicos del cáncer disminuyen con el tiempo en las muestras de sangre extraídas en tubos con EDTA que no contienen ningún conservante adicional. El conservante CellSave mejoró la estabilidad del ARN para algunos genes, mientras que otros genes no se estabilizaron. La formulación de la disolución 3 de conservante mejoró drásticamente la estabilidad de los ARN específicos del cáncer hasta las 96 horas. La variabilidad que se observó entre las muestras de sangre extraídas de diferentes donantes, que puede deberse a diferencias en la eficiencia de enriquecimiento, también fue más pequeña en las muestras tratadas con la disolución 3.
La tabla 3 muestra las mediciones de expresión de genes para la totalidad de genes y muestras evaluados en este experimento. Los niveles de expresión de genes específicos de células cancerosas disminuyeron con el tiempo en muestras con EDTA no fijadas, mientras que CellSave y la disolución 3 de conservante estabilizaron las mediciones de expresión de genes. La estabilización fue la mejor en la disolución 3 y es particularmente obvia después de 96 horas de incubación. Algunos genes específicos de leucocitos, tales como los genes CD3 y CD8, disminuyen con el tiempo en sangre con EDTA no fijada y sangre conservada con CellSave. La mayoría de los genes específicos de leucocitos aumentan con respecto a EDTA a las 0 h en sangre tratada con la disolución 3 de conservante. Esto puede explicarse por un aumento observado en el arrastre de leucocitos durante el enriquecimiento con Harpoon usando sangre en la disolución 3 de conservante.
Estos resultados sugieren que la disolución 3 de conservante impide la degradación de los ARNm presentes en las células cancerosas durante hasta 96 horas después de la extracción de sangre. También permite una recuperación eficiente del ARN a partir de las muestras tratadas. Se observó que la disolución 3 de conservante interfiere con la eficiencia del agotamiento de glóbulos blancos en la plataforma Harpoon. Tal interferencia dio como resultado un aumento de la señal procedente de los genes expresados en glóbulos blancos en las muestras analizadas. Sin embargo, es importante señalar que tal aumento de la señal se observó en todas las muestras tratadas con la nueva formulación de conservante mencionada y se mantuvo estable entre las muestras procesadas usando la plataforma Harpoon a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas después de la extracción de sangre. Esto sugiere nuevamente que la disolución 3 es muy eficaz para conservar el<a>R<n>en las muestras tratadas.
Tabla 3: Mediciones de expresión de genes para todos los genes medidos en muestras tratadas con los conservantes indicados durante los periodos de tiempo indicados. Los valores de expresión de genes se calculan con respecto a la expresión en el nivel inicial, EDTA a t=0. Las muestras en las que las expresiones de genes cambiaron en 3 o más ciclos con respecto al nivel inicial también se destacan mediante flechas f o j.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Reactivo para conservar células procedentes de una muestra biológica para el posterior aislamiento de componentes celulares que comprende una cantidad eficaz de glioxal, fosfato de sodio dibásico heptahidratado, fosfato de potasio monobásico, cloruro de sodio, hidróxido de sodio, polietilenglicol reticulado de peso molecular 20K, y sal de disodio de ácido etilendiaminotetraacético dihidratada.
  2. 2. Reactivo según la reivindicación 1, en el que la cantidad eficaz de glioxal es de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,5 % de glioxal, preferiblemente de aproximadamente el 0,2 % de glioxal.
  3. 3. Método para conservar componentes celulares que comprende poner en contacto una muestra biológica con el reactivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha muestra biológica comprende células y en el que dicho método conserva los componentes celulares de dichas células durante un periodo de tiempo suficiente.
  4. 4. Método según la reivindicación 3, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre completa y médula ósea, preferiblemente en el que la muestra biológica es sangre completa.
  5. 5. Método según la reivindicación 3, en el que los componentes celulares son ácidos nucleicos, preferiblemente ARN codificante.
  6. 6. Método según la reivindicación 3, en el que el periodo de tiempo suficiente es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 96 horas o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 72 horas.
  7. 7. Método de aislamiento de componentes celulares que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica con el reactivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra biológica comprende células; (b) conservar los componentes celulares procedentes de las células durante un periodo de tiempo suficiente, (c) aislar las células a partir de la muestra biológica, y (d) extraer los componentes celulares a partir de tales células.
  8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que los componentes celulares se seleccionan del grupo que consiste en ARNm, ARNt, ARNinc, ARNr, micro-ARN, ARNip, ARNnop, piARN, ARNpt, y ARNpr.
  9. 9. Método según la reivindicación 7, en el que el periodo de tiempo suficiente es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 96 horas o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 72 horas.
  10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en el que las células se seleccionan de células tumorales circulantes (CTC), células endoteliales circulantes (CEC), células de mieloma múltiple circulantes (CMMC), células fetales circulantes, células T específicas de antígeno, células madre de leucemia mieloide aguda, y células dendríticas.
ES17712583T 2016-03-04 2017-03-03 Preservation of cellular components from cells with a preservative Active ES3018258T3 (en)

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