ES3018283T3 - Use of modified fc fragments in immunotherapy - Google Patents

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ES3018283T3 ES16747826T ES16747826T ES3018283T3 ES 3018283 T3 ES3018283 T3 ES 3018283T3 ES 16747826 T ES16747826 T ES 16747826T ES 16747826 T ES16747826 T ES 16747826T ES 3018283 T3 ES3018283 T3 ES 3018283T3
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Abstract

La invención se refiere al uso de fragmentos Fc de anticuerpos en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias, siendo dichos fragmentos Fc fragmentos Fc recombinantes aislados que tienen una afinidad modificada por al menos uno de los receptores Fc (FcR), particularmente una afinidad incrementada por el FcRn. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de fragmentos fc modificados en inmunoterapia
La presente invención se refiere a la inmunoterapia de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.
Técnica anterior de la invención:
La inmunoterapia, terapia que consiste en administrar anticuerpos exógenos a los pacientes, se utiliza actualmente ampliamente para el tratamiento de diversas patologías, en particular de enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias.
Para el tratamiento de estas enfermedades se proponen típicamente dos tipos de terapia a base de inmunoglobulinas: i) terapias a base de inmunoglobulinas intravenosas (IVIG), que consisten en administrar a los enfermos por vía intravenosa inmunoglobulinas (generalmente IgG) provenientes de pool de donaciones de plasma humano, y ii) terapias basadas en el uso de anticuerpos recombinantes (es decir, anticuerpos obtenidos por ingeniería genética). Estos últimos han permitido avances reales en el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, en particular debido a que ofrecen la posibilidad de librarse de los inconvenientes vinculados al uso de inmunoglobulinas de origen plasmático, en particular el riesgo de ruptura del suministro, y el riesgo de transmisión de patógenos eventualmente presentes en el plasma.
La presencia de fragmentos Fab en las inmunoglobulinas puede ser al origen de la aparición de reacciones adversas importantes en los pacientes tratados. Para evitar estos efectos secundarios, la solicitud de patente WO 2004/099374 divulga el uso de fragmentos Fc recombinantes aislados para el tratamiento de pacientes, en particular para pacientes que padecen una enfermedad autoinmune.
La solicitud EP 2233 500 describe fragmentos Fc que tienen una afinidad mejorada para FcRn con respecto a un fragmento Fc parental, y que comprenden al menos dos mutaciones.
Sin embargo, todavía es necesario optimizar estos fragmentos Fc, en particular de manera a aumentar su vida media y/o su eficacia terapéutica.
Sumario de la invención:
Los inventores proponen ahora utilizar fragmentos Fc que tienen una afinidad modificada para al menos uno de los receptores Fc (FcR) con respecto a un fragmento Fc parental. Según la invención, los fragmentos Fc están aislados, es decir, no están asociados a fragmentos Fab, ni conjugados o fusionados a ninguna otra proteína, polipéptido o péptido. En particular, no se trata de inmunoglobulinas completas.
La invención se refiere a una composición que comprende fragmentos Fc de anticuerpos, para su uso en el tratamiento de una enfermedad específica tal como se define en la reivindicación 1.
La invención se refiere también a composiciones para su utilización tal como se definen en una de las reivindicaciones 2 a 8.
Según aspectos preferidos, se trata de
• los fragmentos Fc tienen una combinación de mutaciones K334N/P352S/A378V/V397M con respecto a un fragmento Fc parental de IgG1 de tipo salvaje, preferiblemente en la que los fragmentos Fc consisten en la secuencia SEQ ID NO:19.
La invención también proporciona de manera más general una composición que comprende fragmentos Fc de anticuerpos, para su uso en el tratamiento de una enfermedad específica según la reivindicación 1.
En una realización particular, la composición comprende fragmentos Fc de anticuerpos, que comprenden al menos una mutación de uno o más aminoácidos y/o que tienen N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), teniendo dichos N-glicanos de los fragmentos Fc una tasa de fucosilación menor que 65 %,
Leyenda de las figuras:
La figura 1 muestra alineaciones de secuencias de IgG 1 humana nativa que hacen referencia a las posiciones 216 a 447 (según el índice UE) con las secuencias de IgG2 humana correspondientes (SEQ ID NO: 7), IgG3 humana (SEQ ID NO: 8) e IgG4 humana (SEQ ID NO: 9). Las secuencias IgG1 se refieren al alotipo G1m1,17 (SEQ ID NO: 6) y al alotipo G1 m3 (SEQ ID NO: 10). El dominio “bisagra inferior CH2-CH3” de IgG1 comienza en la posición 226 (véase la flecha). El dominio CH2 está resaltado en gris y el dominio CH3 está en cursiva.
La figura 2 muestra representaciones esquemáticas de Fc IgG1 (A) y de scFc (B). Los CH2 se muestran en gris y los CH3 en blanco. Los puentes disulfuro se muestran en finas líneas punteadas grises. En scFc, los dos polipéptidos CH2-CH3 están unidos por un enlace peptídico que se muestra en líneas punteadas en negrita.
La figura 3 muestra las formas G0, G0F, G1 y G1F de las estructuras glicánicas susceptibles de estar presentes en los fragmentos Fc de la invención.
La figura 4 es un gráfico que muestra el porcentaje de lisis de glóbulos rojos Rhesus D+ mediado por células efectoras en presencia de un anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D (RhD), observado después de la adición de diferentes cantidades de inmunoglobulinas polivalentes (IgIV) o de fragmentos Fc recombinantes, no mutados o mutados (fragmento Fc que porta las mutaciones 315D/330V/361D/378V/434Y).
La figura 5 es un gráfico que muestra el porcentaje de lisis de glóbulos rojos Rhesus D+ mediado por células efectoras en presencia de un anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D (RhD), observado después de la adición de diferentes cantidades de inmunoglobulinas polivalentes (IgIV) o de fragmentos Fc recombinantes, no mutados o mutados (fragmento Fc que porta las mutaciones según la Tabla 1). rFc WT significa el fragmento Fc recombinante de tipo salvaje. Los controles positivos están representados por: IVIG (es decir, mezcla de anticuerpos plasmáticos extraídos del plasma humano; las IVIG es el tratamiento de referencia para la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) y las “IgG Mabs starting” que corresponden al fragmento Fc de herceptina (anticuerpo producido por vía transgénica en un mamífero, después sometido a digestión por papaína para generar el fragmento Fc).
La figura 6 muestra una prueba de unión in vitro que mide la afinidad (Kd) de los fragmentos Fc WT (de tipo salvaje) y mutados por FcRn humano (A) y por CD16aV (polimorfismo V en posición 158 de CD16) (B), evaluada por resonancia plasmónica de superficie (SPR) utilizando Biacore.
La Figura 7 muestra el mapa del vector pCEP4 utilizado para la expresión de la variante T5A-74, definida a continuación, y el mapa del vector OptiCHO para la expresión de la variante T5A-74.
Descripción detallada de la invención:
Definiciones
A lo largo de la presente descripción, la numeración de los restos en el fragmento Fc es la de la cadena pesada de inmunoglobulina según el índice EU o como se describe en Kabat et al., Séquences de protéines d'intéret immunologique, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), expresamente incorporado aquí como referencia. El “índice EU” o “índice UE o equivalente en Kabat” se refiere aquí a la numeración de restos del anticuerpo humano IgG1.
El término “inmunoglobulina” se refiere a la estructura que constituye la forma biológica en estado natural de un anticuerpo, que incluye las regiones (también denominadas fragmentos) constantes y variables. Una molécula de inmunoglobulina es una molécula cuya unidad básica es un heterotetrámero que consiste en dos cadenas pesadas de aproximadamente 50-70 kDa cada una (denominadas cadenas H para Heavy) y dos cadenas ligeras de aproximadamente 25 kDa cada una (denominadas cadenas L para Light), unidas entre sí por puentes disulfuro intra e intercatenarios.
Cada cadena está formada, en posición N-terminal, por una región o dominio variable, denominado VL para la cadena ligera, VH para la cadena pesada, y en posición C-terminal, por una región constante, formada por un único dominio denominado CL para la cadena ligera y tres o cuatro dominios denominados CH1, CH2, CH3, CH4, para la cadena pesada.
Sólo IgM e IgE tienen el dominio CH4.
Cada dominio comprende aproximadamente 110 aminoácidos y está estructurado de manera comparable. Las 2 cadenas pesadas están unidas por puentes disulfuro a nivel del CH2 y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un puente disulfuro entre el CH1 y el CL. La región que determina la especificidad del anticuerpo para el antígeno está portada por las partes variables, mientras que las partes constantes pueden interactuar con los receptores Fc (RFc) de las células efectoras o moléculas tales como las proteínas del complemento para inducir diferentes propiedades funcionales. El ensamblaje de las cadenas que forman un anticuerpo permite definir una estructura tridimensional característica en forma de Y, en la que
• la base de la Y corresponde a la región constante Fc; o fragmento Fc; que es reconocido por el complemento y los receptores Fc para mediar las funciones efectoras de la molécula, y
• los extremos de los brazos de la Y corresponden al respectivo ensamblaje de la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada, dichos extremos constituyen el fragmento Fab y determinan la especificidad del anticuerpo para el antígeno.
Más precisamente, existen cinco isotipos de cadena pesada (gamma, alfa, mu, delta y épsilon) y dos isotipos de cadena ligera (kappa y lambda, estando las cadenas lambda a su vez divididas en dos tipos: lambda 1 y lambda 2). Es la cadena pesada la que determina la clase de inmunoglobulina. Así, existen cinco clases de Ig: IgG para el isotipo Gamma, IgA para el isotipo Alfa, IgM para el isotipo Mu, IgD para el isotipo Delta, e IgE para el isotipo Epsilon.
Las cadenas ligeras kappa y lambda son compartidas por todas las clases y subclases. En el ser humano, la proporción de kappa y lambda producida está en una relación de 2 a 1.
Las inmunoglobulinas G (IgG) son las inmunoglobulinas más abundantes en el suero (75 a 80 % de los anticuerpos circulantes). Presentes en forma de monómeros, tienen la vida media sérica más larga de todas las inmunoglobulinas (aproximadamente 21 días).
Existen cuatro tipos de cadenas pesadas gamma, lo que determina cuatro subclases de IgG (IgG1 para gamma1, IgG2 para gamma2, IgG3 para gamma3, e IgG4 para gamma4). Estas cuatro subclases se diferencian por números y posiciones variables de los puentes disulfuro (Basic and Clinical Immunology, 8a ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71 y Capítulo 6).
Las cuatro subclases de IgG humana también se distinguen a nivel de sus actividades biológicas, a pesar de tener estructuras altamente homólogas (más del 95 % de homología de secuencia para las regiones Fc).
Por actividad biológica, se refiere en particular a la capacidad de la región constante de IgG de unirse: en particular las proteínas del complemento (la proteína C1q por ejemplo [Basic and Clinical Immunology, 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.)]) y/o a los receptores de IgG: RFcy (RFcyI, RFcyII, RFcyIII, Ravetch y Kinet, AnnualReview of Immunology, vol 9:457-492 (1991)).
En función del tipo de unión, se podrán activar diversos mecanismos de acción: opsonización, fagocitosis, ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) o CDC (Complement Dependent Cytotoxicity) por ejemplo. Véase Uananue y Benacerraf, Textbook of Immunology, 2a Edición, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)) para más detalles.
Por “fragmento Fc”, se entiende la región constante de una inmunoglobulina de longitud completa excluyendo el primer dominio de la región constante de inmunoglobulina. Así, el fragmento Fc se refiere a los dos últimos dominios constantes (CH2-CH3) de IgA, IgD, IgG y a los tres últimos dominios constantes (CH2-CH3-CH4) de IgE e IgM, y a la bisagra flexible N-terminal de estos dominios. Para IgA e IgM, el fragmento Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, el fragmento Fc incluye los dominios CH2, CH3 y la región de bisagra inferior entre CH1 y CH2. En otras palabras, la región Fc de una IgG1 está formada por la bisagra inferior CH2-CH3, es decir, la porción a partir del aminoácido C226 hasta el extremo carboxiterminal, indicándose la numeración según el índice EU o equivalente en Kabat. Se pueden determinar dominios análogos para otras subclases de IgG a partir de la alineación de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas o fragmentos de cadenas pesadas de las subclases de IgG con las de la IgG1 humana (véase la Figura 1). El fragmento Fc utilizado según la invención puede comprender además una parte de la región de bisagra superior, aguas arriba de la posición 226 (según el índice EU). En este caso, preferentemente, se utiliza un fragmento Fc de una IgG1 humana que comprende parte de la región situada entre las posiciones 216 a 226. En este caso, el fragmento Fc de una IgG1 humana se refiere a la porción a partir del aminoácido 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 o 225 hasta el extremo carboxiterminal. Por “fragmento Fc” también se refiere a un fragmento scFc para “single chain Fc”. Por “fragmento scFc” se entiende un fragmento Fc de cadena simple, obtenido por fusión genética de dos monómeros Fc unidos por un enlace polipeptídico. El scFc se pliega naturalmente en una región Fc dimérica funcional.
Por “fragmento Fc parental” o “polipéptido parental” como se utiliza aquí, se entiende un polipéptido de referencia entre las regiones Fc de tipo salvaje o variantes que posiblemente porten otras mutaciones distintas de la considerada. Por “tipo salvaje o WT” se entiende aquí una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, es decir, que es de origen natural, incluidas las variaciones alélicas, y que no se ha modificado intencionalmente mediante técnicas de biología molecular tal como la mutagénesis. Por ejemplo, las regiones Fc de “tipo salvaje” se refieren en particular a la región Fc de IgG1 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 (alotipo G1m1,17), la región Fc de IgG2 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2, la región Fc de IgG3 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3, la región Fc de IgG4 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 y la región Fc de IgG1 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 5 (alotipo G1m3).
Los fragmentos Fc utilizados en la invención están en forma de monómero, es decir, no están fusionados ni conjugados entre sí.
Por “afinidad modificada” se entiende una afinidad disminuida o aumentada con respecto a un fragmento Fc parental.
Por “FcRn” o “receptor Fc neonatal” como se utiliza aquí, se entiende una proteína que se une a la región Fc de IgG y está codificada al menos en parte por un gen FcRn. El FcRn puede provenir de cualquier organismo, incluidos, sin limitarse a, humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Como se conoce en la técnica, la proteína FcRn funcional comprende dos polipéptidos, a menudo denominados con el nombre de cadena pesada y cadena ligera. La cadena ligera es beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el gen FcRn. A menos que se indique lo contrario aquí, FcRn o proteína FcRn se refiere al complejo de la cadena a con beta-2-microglobulina. En el ser humano, el gen que codifica FcRn se denomina FCGRT.
Por “aumento de la unión a FcRn” como se utiliza aquí, se entiende el aumento de la afinidad de unión,in vivooin vitro, del fragmento Fc mutado para FcRn, con respecto al polipéptido parental. La capacidad del fragmento Fc mutado para unirse a un receptor FcRn se puede evaluarin vitromediante una prueba ELISA, como se describe por ejemplo en la solicitud de patente WO2010/106180.
La expresión “vida media” se refiere, en la presente invención, al tiempo que tarda el fragmento Fc en ser eliminado para la mitad de la circulación u otros tejidos, una vez presente en el suero del paciente al que se ha administrado. La expresión “Receptor Fcy” o “FcyR” se refiere a los receptores de inmunoglobulinas de tipo IgG, denominados CD64 (FcyRI), CD32 (FcyRII) y CD16 (FcyRIII), en particular cinco receptores expresados (FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIb). Todos son receptores activadores de células efectoras, excepto el FcyRIIb humano, que es un receptor inhibidor de la activación de las células inmunitarias (Muta T et al., Nature, 1994, 368:70-73).
Por “célula efectora” se entiende cualquier célula que porta un receptor Fc, tales como linfocitos, monocitos, neutrófilos, células asesinas naturales (NK), eosinófilos, basófilos, mastocitos, células dendríticas, células de Langerhans y plaquetas.
El término “glicosilación”, en el contexto de la invención, se refiere a la adición, mediante reacción enzimática, de uno o más glúcidos a la secuencia de un fragmento Fc recombinante.
El término “hipersialización”, en el contexto de la invención, se refiere a la adición de uno o más grupos de ácido siálico a la secuencia de un fragmento Fc. La adición de uno o más grupos de ácido siálico se puede realizar mediante una reacción enzimática, una reacción celular o mediante mutagénesis dirigida del Fc que tiene como diana uno o más aminoácidos implicados en la sialilación del Fc.
El término “paciente” se refiere a cualquier sujeto humano o animal, preferiblemente mamífero. En una realización preferida, el paciente es un ser humano, independientemente de su edad o género.
El término “tratamiento” o “tratar” designa una mejora, profilaxis o reversión de una enfermedad o trastorno, o al menos un síntoma discernible del mismo, o una mejora, profilaxis o reversión de al menos un parámetro físico medible asociado con la enfermedad o trastorno que se está tratando, que no es necesariamente discernible en o por el sujeto que se está tratando. El término “tratamiento” o “tratar” incluye además inhibir o retardar la progresión de una enfermedad o trastorno, físicamente, por ejemplo, estabilizando un síntoma discernible, fisiológicamente, por ejemplo, estabilizando un parámetro físico, o ambos.
Composiciones de fragmentos Fc según la invención
Los fragmentos Fc de anticuerpos utilizados en la invención son fragmentos Fc de una inmunoglobulina IgG1, que tiene una afinidad modificada por al menos uno de los receptores Fc (FcR) con respecto a un fragmento Fc parental. Los fragmentos Fc según la invención tienen una afinidad aumentada hacia al menos un receptor Fc, con respecto a un fragmento Fc parental.
La afinidad aumenta, con respecto a la del Fc parental, en una relación al menos igual a 2, preferiblemente mayor que 5, preferiblemente mayor que 10, preferiblemente mayor que 15, preferiblemente mayor que 20, preferiblemente mayor que 25 y preferiblemente mayor que 30. En otras palabras, la afinidad de la región Fc mutada por un FcR es mayor que la del polipéptido parental.
La afinidad de un polipéptido que comprende una región Fc por un FcR se puede evaluar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica anterior. Por ejemplo, un experto en la técnica puede determinar la afinidad (Kd) utilizando resonancia plasmónica de superficie (SPR) que se puede medir mediante el dispositivo Biacore. Alternativamente, un experto en la técnica puede realizar una prueba ELISA adecuada. Una prueba ELISA apropiada permite comparar las fuerzas de unión del Fc parental y del Fc mutado. Se comparan las señales detectadas específicas del Fc mutado y del Fc parental. La afinidad de unión se puede determinar evaluando polipéptidos completos o evaluando regiones Fc aisladas de los mismos.
Según una realización particular de la divulgación, los fragmentos Fc utilizados según la invención tienen una afinidad modificada, ventajosamente aumentada, hacia el receptor FcRn. Este aumento en la unión de FcRn da como resultado una mejora de la retención de sueroin vivoy, en consecuencia, un aumento de la vida media.
Los fragmentos Fc se pueden utilizar solos o en mezcla, por ejemplo varios fragmentos Fc, que tienen diferentes mutaciones se pueden administrar en mezcla o coadministrar.
Los fragmentos Fc de la invención también pueden implementarse en una composición que comprende un solo tipo de fragmento Fc mutado. En otras palabras, la composición incluye entonces moléculas de fragmentos Fc de secuencia idéntica.
En una realización de la divulgación, los fragmentos Fc portan una combinación de mutaciones seleccionada entre 315D/330V/361D/378V/434Y (combinación de mutaciones también denominada “T5A-74”). Por lo tanto, los fragmentos Fc que portan esta combinación de mutación también se denominan “rFc T5A-74), 230S/315D/428L/434Y, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 259I/315D/434Y, 256N/378V/383N/434Y, E294del/T307P/N434Y (combinación de mutaciones también denominada “C6A_66”. Por lo tanto, los fragmentos Fc que portan esta combinación de mutación también se denominan “rFc C6A_66).
En una realización de la divulgación, los fragmentos Fc portan una combinación de mutaciones seleccionada entre:
(i) T260A y 315D/330V/361D/378V/434Y (combinación de mutaciones también denominada “T5A-74”)- el fragmento designado “T5A-74I” es un fragmento Fc que se distingue del fragmento T5A-74 sólo por la adición de la mutación T260A.
O
(ii) E258I y 315D/330V/361D/378V/434Y (combinación de mutaciones también denominada “T5A-74”)- el fragmento designado “T5A-74J” es un fragmento Fc que se distingue del fragmento T5A-74 sólo por la adición de la mutación E258I.
O
(iii) K290Y y 315D/330V/361D/378V/434Y (combinación de mutaciones también denominada “T5A-74”)- el fragmento designado “T5A-74K” es un fragmento Fc que se distingue del fragmento T5A-74 sólo por la adición de la mutación K290Y
O
(iv) E294A y 315D/330V/361D/378V/434Y (combinación de mutaciones también denominada “T5A-74”)- el fragmento designado “T5A-74L” es un fragmento Fc que se distingue del fragmento T5A-74 sólo por la adición de la mutación E294A.
O
(v) Y296W y 315D/330V/361D/378V/434Y (combinación de mutaciones también denominada “T5A-74”)- el fragmento designado “T5A-74M” es un fragmento Fc que se distingue del fragmento T5A-74 sólo por la adición de la mutación Y296W.
Las secuencias de los fragmentos Fc T5A-74, T5A-74I, T5A-74J, T5A-74K, T5A-74L, T5A-74M, se dan en la lista de secuencias adjunta.
T5A-74 (N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y):
SEQ ID N O : 11 DK.THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK.PKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNST YR VV SVL TV LH QD WL DG KE YKC KV SN KA LP VP IEK
T1SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYK
TTPP VL D SDGSFFL Y SKLT V D K S R W QQ G N V F SC S V M H E A L H Y H Y T Q K SLSLSPGK
T5A-74I (T260A/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
SEQ ID N O : 12 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVACVVVDVSHEDPEVKFNWY
VD GV E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L D G K E Y K C K V S N K A L P V P I E K
T5A-74J (E258I/N315D/A330VIN361D/A378VIN434Y)
SEQ ID N O : 13 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPrVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
V D G VE V H N AKTKPREEQ YN STYRVV S VLT V L H Q D W L D G K E Y K C K VSNK ALP VP1EK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74K (K290Y/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
SEQ ID N O : 14 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VD GV EV HN AK TY PRE EQ YN ST YR VV SVL TV LH QD WL DG KE YKC KV SN KA LP VP 1EK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIWEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74L (E294A/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
SEQ ID N O : 15 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTK PRE AQ YN ST YR VV SVL TV LF TQ DW LD GK EYK CK VS NK AL PV PTE KTTSKAKGQPREPQVYTLP PS RD EL TKD QV SL TC LV KG FY PSD TW EW ES NG QP ENN Y KT TP PV LD SD GS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74M (Y296W/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
SEQ ID N O : 16 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY V D G V E V H N A K T K P R E E Q W N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L D G K E Y K C K V S N K A L P V P 1 E KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDTVVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
La divulgación también describe fragmentos Fc mutados que tienen una afinidad aumentada por el receptor FcyRIIIa (CD16a), y comprenden al menos una combinación de 2 mutaciones, comprendiendo dicha combinación:
(i) una mutación seleccionada entre 378V, 326E, 397M, 334N y 396L; y
(ii) al menos una mutación seleccionada entre 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y y 298N,
la numeración es la del índice EU o equivalente en Kabat, y con la condición de que la mutación (i) no ocurra en el mismo aminoácido que la mutación (ii).
La divulgación también describe fragmentos Fc mutados que comprenden al menos una combinación de 3 mutaciones, comprendiendo dicha combinación:
(i) una mutación seleccionada entre 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N y 394P;
y
(ii) al menos 2 mutaciones seleccionadas entre 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 3971, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P y 447N,
la numeración es la del índice EU o equivalente en Kabat, y con la condición de que la mutación (i) no ocurra en el mismo aminoácido que la mutación (ii).
Los fragmentos Fc de la invención portan la combinación de mutaciones K334N/P352S/V397M/A378V (combinación de mutaciones también denominada “A3A-184A”). Los fragmentos Fc que portan esta combinación de mutaciones también se denominan por lo tanto “A3A-184A”.
La secuencia del fragmento A3A-184A (K334N/P352S/A378V/V397M) se da en el listado de secuencias, como SEQ ID NO: 19:
DK TH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
V D G VE V H N A K TK PR EE Q YNST Y R V V S VLT V L H Q D W L N G K E Y K C K V SNKALP APEEN
TTSKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYK
TT P P M L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
Según otra realización de la divulgación, los fragmentos Fc mutados portan una deleción de un aminoácido en la posición 293 o 294 (DEL293 o DEL294), refiriéndose la numeración de aminoácidos del fragmento Fc a la del índice EU, o el equivalente en Kabat.
Esta única mutación conduce a una glicosilación particular del fragmento, a saber, una hipersialilación, especialmente ventajosa con respecto a la vida media de las glicoproteínas y los procesos inflamatorios.
Según otro aspecto de la invención, se utiliza una composición que comprende una pluralidad de fragmentos Fc que tienen todos sustancialmente la misma secuencia y que, tomados en su conjunto, tienen un perfil de glicosilación particular.
Según un aspecto particular, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen una tasa de fucosilación menor que 65 %, preferiblemente menor que 60 %, preferiblemente menor que 55 %, preferiblemente menor que 50 %, más preferiblemente menor que 45 %, preferiblemente menor que 40 %, preferiblemente menor que 35 %, preferiblemente menor que 30 %, preferiblemente menor que 25 %, preferiblemente menor que 20 %.
Según otro aspecto más, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc, teniendo dichos fragmentos Fc en su sitio de glicosilación (Asn 297) N-glicanos, caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen una estructura de glicano de tipo biantenario, de cadenas cortas, de baja sialilación, que tiene manosas terminales y/o N-acetilglucosaminas terminales no intercaladas.
Según un aspecto más particular, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido mayor que 60 % para las formas G0+G1+G0F+G1F, siendo las formas G0F+G1F menores que 50 %.
Según otro aspecto más particular, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido mayor que 60 % para las formas G0+G1+G0F+G1F, siendo el contenido en fucosa menor que 65 %.
Según otro aspecto aún más particular, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido menor que 40 % para las formas G1F+GOF.
Según un aspecto más particular, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), teniendo dichos N-glicanos de los fragmentos Fc una tasa de fucosilación igual a 0 %. La invención proporciona así una composición que comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en el sitio de glicosilación Asn297, caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc están desprovistos de fucosa.
Además, según un aspecto particular, una composición utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en el sitio de glicosilación Asn297, caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen una tasa de fucosilación comprendida entre 20 % y 55 %. En particular, la invención proporciona una composición que comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en el sitio de glicosilación Asn297, caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen una tasa de fucosilación comprendida entre 20 % y 50 %, entre 25 % y 55 %, entre 25 % y 50 %, entre 20 % y 45 % o entre 25 y 45 %.
Según un aspecto más particular, una composición útil según la invención comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en el sitio de glicosilación Asn297, caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido mayor que 60 %, preferiblemente mayor que 80 %, para las formas G0+G1+G0F+G1F, siendo las formas G0F+G1F menores que 50 %, preferiblemente menores que 40 %, o que 30 %.
Según otro aspecto más particular, los N-glicanos de los fragmentos Fc dentro de la composición tienen un contenido mayor que 60 % para las formas G0+G1+G0F+G1F, siendo el contenido de fucosa menor que 65 %.
Según otro aspecto más particular, los N-glicanos de los fragmentos Fc dentro de la composición tienen un contenido menor que 50 % para las formas G1F+GOF, preferiblemente menor que 40 %, o que 30 %.
Las formas G0, G0F, G1 y G1F se seleccionan de las formas que se indican en la Figura 3.
De manera ventajosa, los N-glicanos de los fragmentos Fc dentro de la composición tienen un contenido promedio de ácido siálico menor que 25 %, 20 %, 15 % o 10 %, preferiblemente 5 %, 4 %, 3 % o 2 %.
Una composición que puede ser utilizada en el contexto de la invención comprende fragmentos Fc que tienen N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), teniendo dichos N-glicanos fragmentos Fc que tienen una estructura de glicano de tipo biantenario, con cadenas cortas, baja sialilación, que tienen manosas terminales y/o N-acetilglucosaminas terminales no intercaladas, teniendo los N-glicanos por ejemplo un contenido mayor que 60 % para las formas G0 G1 G0F G1F, y una baja fucosilación, teniendo los N-glicanos por ejemplo un contenido menor que 50 % de las formas G0F G1F.
En una realización particular, los fragmentos Fc según la invención tienen estructuras de glicano tales como se describen en la solicitud de patente WO01/77181.
Según una realización ventajosa, los fragmentos Fc utilizados en la invención comprenden al menos la secuencia SEQ ID NO: 19, y tienen N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), teniendo dichos N-glicanos fragmentos Fc que tienen una tasa de fucosilación menor que 65 %, preferiblemente menor que 60 %, preferiblemente menor que 55 %, preferiblemente menor que 50 %, más preferiblemente menor que 45 %, preferiblemente menor que 40 %, preferiblemente menor que 35 %, preferiblemente menor que 30 %, preferiblemente menor que 25 %, preferiblemente menor que 20 %.
De manera ventajosa, los fragmentos Fc que tienen una glicosilación modificada a nivel del sitio de glicosilación en la posición 297, en particular una fucosilación baja, tiene una unión aumentada de dicho fragmento a los receptores Fcgamma (FcyR), en particular el receptor FcyRIIIa (CD16a).
Preferiblemente, dichos fragmentos Fc tienen una afinidad por CD16a al menos igual a 2x106 M-1, al menos igual a 2x107 M-1, 2x108 M-1 o 2x109 M-1, tal como se determina mediante análisis de Scatchard o la tecnología BIAcore (Labelfree surface plasmon résonance based technology).
De manera particularmente ventajosa, los fragmentos Fc mutados de la invención se pueden utilizar en combinación con diferentes fragmentos Fc mutados que portan diferentes mutaciones. Por ejemplo, se puede utilizar de manera ventajosa una mezcla de Fc mutados Fc-De1294, Fc mutados T5A-74 (para tener como dianas también FcRn) y Fc mutados mejorados para la unión a FcyRs (tipos A3A-184A).
Producción de fragmentos Fc según la invención
Los fragmentos Fc utilizados en la invención pueden producirse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo por vía de síntesis química o por vía de recombinación.
En una realización preferida, los fragmentos Fc utilizados en la invención se denominan “recombinantes”, a saber, que se obtienen por vía de recombinación.
Cuando los fragmentos Fc según la invención comprenden una mutación de uno o más aminoácidos, la o las mutaciones pueden introducirse opcionalmente mediante técnicas conocidas tales como síntesis génica, mutagénesis dirigida, en particular obtenida mediante PCR con cebadores específicos que introducen las mutaciones deseadas, la mutagénesis aleatoria. Preferentemente, se utiliza mutagénesis aleatoria tal como se describe en la solicitud WO02/038756: se trata de la técnica MutaGen. Esta técnica utiliza una mutasa de ADN humana, seleccionada en particular entre las ADN polimerasas p, n y
i
. Las técnicas recombinantes clásicas implican la recombinación en una célula hospedante, transformada con uno o más vectores que permiten la expresión acompañada o no de la secreción de la secuencia del fragmento Fc en el medio extracelular. El vector normalmente incluye un promotor, señales de inicio y terminación de la traducción, así como regiones de regulación de la transcripción apropiadas. Puede mantenerse de forma estable en la célula hospedante y eventualmente poseer señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes elementos son seleccionados y optimizados por los expertos en la técnica en función del hospedante celular utilizado.
Tales vectores se preparan mediante métodos comúnmente utilizados por los expertos en la técnica, y los clones resultantes pueden introducirse en un hospedante adecuado mediante métodos estándar, tales como lipofección, electroporación, uso de agentes policatiónicos, choque térmico o métodos químicos.
El hospedante celular puede seleccionarse entre sistemas procariotas o eucariotas, por ejemplo células bacterianas, pero también células de levadura o células animales, en particular células de mamíferos. También se pueden utilizar células de insectos o células de plantas.
Los fragmentos Fc utilizados en la invención pueden producirse por cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiados de una célula hospedante que exprese dichos fragmentos Fc; y recuperación de los fragmentos así producidos a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.
Las células de mamífero preferidas para la expresión de fragmentos Fc son la línea de rata YB2/0, la línea vero, la línea de hámster CHO, en particular las líneas Ch O dhfr- y CHO Lec13, CHO-lec10, CHO-lec1, CHOK1SV Potelligent® (Lonza, Suiza), CHOGnTIII (Glycart, Suiza), PER.C6™ (Crucell), HEK293, T1080, EB66, K562, NS0, SP2/0, BHK o COS.
Otro modo de producción es la expresión de fragmentos Fc en organismos transgénicos, por ejemplo en plantas (Ayala M, Gavilondo J, Rodriguez M, Fuentes A, Enríquez G, Pérez L, Cremata J, Pujol M. Production of plantibodies in Nicotiana plants. Methods Mol Biol. 2009;483:103-34.) o en la leche de animales transgénicos tales como el conejo, la cabra, el ratón o el cerdo (Pollock, DP., J.P. Kutzko, E. Birck-Wilson, J.L. Williams, Y. Echelard y H.M. Meade. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. Journal of Immunological Methods. 231: 147-157). Véase también a este respecto el documento WO200748077.
En una realización alternativa, los fragmentos Fc se obtienen mediante tratamiento proteolítico de inmunoglobulinas que están ellas mismas mutadas.
La modificación de la glicosilación de fragmentos Fc se puede obtener mediante técnicas conocidas. Los fragmentos Fc que tienen glicosilación según la invención pueden producirse en particular a partir de la escisión de anticuerpos producidos según la técnica descrita en el documento WO 01/77181, en particular mediante la enzima papaína. Los fragmentos Fc débilmente fucosilados también pueden obtenerse mediante producción en células cultivadas en presencia de kifunensina, tal como se describe por ejemplo en el documento US7700321, o en células para las cuales la vía de producción de GDP-fucosa está inhibida, por ejemplo mediante inhibición de al menos una de las enzimas del ciclo de producción de fucosa (véanse en particular los documentos US 2010291628 o US 20090228994, EP 1 500 698, EP 1792 987 o US 7 846 725). También es posible utilizar ARN (ARNi) interferentes que inhiben la 1,6-fucosiltransferasa como se describe en el documento US 7393 683 o en el documento WO2006133148. También puede tratarse de métodos de preparación en levaduras, como se describe por ejemplo en el documento WO 0200879.
En el caso en el que los fragmentos Fc tengan 100 % de oligosacáridos no fucosilados, es decir cuando los fragmentos Fc estén completamente libres de fucosa, es posible utilizar métodos de preparación conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo los descritos en los documentos EP1176195, US 7214775, US 6994292, US 7425449, US2010223686, WO2007099988, EP 1705 251, no siendo esta lista limitativa. Puede tratarse, por ejemplo, de un método que utiliza una célula hospedante que expresa al menos un ácido nucleico que codifica un fragmento Fc, y cuya glicosilación se modifica mediante la eliminación del gen que codifica la a1,6-fucosiltransferasa o mediante la adición de una mutación de este gen para eliminar la actividad de la a1,6-fucosiltransferasa, y que expresa como tal un fragmento de anticuerpo desprovisto de fucosa.
Aplicaciones terapéuticas
Debido a sus numerosas ventajas, tanto en términos de eficacia, funciones efectoras optimizadas o efectos secundarios reducidos, los fragmentos Fc de la divulgación son útiles para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria.
Según la divulgación, los fragmentos Fc que tienen afinidad alterada por al menos un receptor Fc, en una cantidad terapéuticamente eficaz, se pueden usar para tratar una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria en un paciente.
Una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria según la divulgación significa una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria primaria o secundaria, específica de un órgano, o sistémica, asociada o no con autoanticuerpos patógenos.
Por ejemplo, la enfermedad según la divulgación puede seleccionarse entre Púrpura Trombocitopénica trombótica (PTT), Púrpura Trombótica Idiopática (PTI), rechazo de trasplantes u órganos, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, varios tipos de esclerosis, síndrome de Sjogren primario (o síndrome de Gougerot-Sjogren), polineuropatías autoinmunes como esclerosis múltiple, diabetes tipo I, hepatitis autoinmune, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis gotosa, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, tiroiditis crónica de Hashimoto (hipotiroidismo), enfermedad de Adisson, hepatitis autoinmune, enfermedad de Basedow (hipertiroidismo), colitis ulcerosa, vasculitis como vasculitis sistémica asociada a ANCA (anticuerpos anti-citoplasmo de los neutrofilos) citopenias autoinmunes y otras complicaciones hematológicas en adultos y niños, tales como trombocitopenias autoinmunes agudas o crónicas, anemias hemolíticas autoinmunes, enfermedad hemolítica del recién nacido (HDN), enfermedad por crioaglutininas, la púrpura trombocitopénica trombótica y hemofilia autoinmune adquirida; síndrome de Goodpasture, nefropatías extramembranosas, enfermedades cutáneas ampollosas autoinmunes, miastenia refractaria, crioglobulinemias mixtas, psoriasis, artritis crónica juvenil, miositis inflamatorias, dermatomiositis y enfermedades autoinmunes sistémicas del niño, incluido el síndrome antifosfolípido, enfermedad del tejidos conectivos, los diferentes tipos de esclerosis, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barre, eenfermedad de Kawasaki, MMN (Multifocal Motor Neuropathie), polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PIDC), tiroiditis autoinmune, mellitis, miastenia grave, enfermedad ocular inflamatoria autoinmune, neuromielitis óptica (enfermedad de Devic), esclerodermia, pénfigo, diabetes resistente a la insulina, polimiositis, anemia de Biermer, glomerulonefritis, enfermedad de Wegener, enfermedad de Horton, periartritis nodosa y síndrome de Churg y Strauss, enfermedad de Still, policondritis recidivante, enfermedad de Behget, gammapatía monoclonal, granulomatosis de Wegener, lupus, colitis ulcerosa, artritis psoriásica, sarcoidosis, colitis colagenosa, dermatitis herpetiforme, fiebre mediterránea familiar, glomerulonefritis por IgA, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, oftalmía simpática, síndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter y síndrome uveo-meningo-encefálico.
También se hace una lista de otras enfermedades inflamatorias, como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la artritis séptica aguda, la artritis adyuvante, la encefalomielitis alérgica, la rinitis alérgica, la vasculitis alérgica, la alergia, el asma, la aterosclerosis, la inflamación crónica debida a infecciones bacterianas o víricas crónicas, la enfermedad bronconeumopatía obstructiva crónica (EPOC), la cardiopatía coronaria, la encefalitis, las enfermedades inflamatorias intestinal, la osteólisis inflamatoria, la inflamación asociada a reacciones de hipersensibilidad aguda y retardada, la inflamación asociada a tumores, lesiones de nervios periféricos o enfermedades desmielinizantes, inflamación asociada a traumatismos tisulares tales como quemaduras e isquemia, inflamación debida a meningitis, el síndrome de disfunción orgánica múltiple (multiple organ dysfunction syndrome, MODS), la fibrosis pulmonar, sepsis y choque séptico, síndrome de Stevens-Johnson, artritis indiferenciada, y las espondiloartropatías indiferenciadas.
Según la invención, la enfermedad autoinmune es la púrpura trombótica idiopática (PTI).
Uno de los efectos observados es en particular una limitación o reducción de la destrucción de plaquetas observada en la patología PTI y una limitación o reducción de la pérdida de la vaina de mielina de los nervios periféricos en PIDC.
Según la divulgación, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, tal como la enfermedad de injerto contra hospedante. En este caso, los fragmentos Fc según la divulgación portan una mutación que induce hipersialilación, tal como una deleción de un aminoácido en la posición 294 (DEL294) o 293 (DEL293).
Se considera cualquier vía de administración, en particular las vías parenterales, tales como la vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, tópica o por vía mucosal, por ejemplo por inhalación. También son posibles las vías enteral (oral, rectal) e intratecal. Preferentemente, se utiliza la vía intravenosa.
Los fragmentos Fc según la invención se formulan generalmente dentro de composiciones farmacéuticas que comprenden excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en cualquier forma galénica adecuada en función de la vía de administración elegida.
Las composiciones farmacéuticas útiles según la invención comprenden ventajosamente uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Se pueden citar, por ejemplos, disoluciones salinas, fisiológicas, isotónicas, tamponadas, etc., compatibles con el uso farmacéutico y conocidas por los expertos en la técnica. Las composiciones pueden contener uno o más agentes o vehículos elegidos entre dispersantes, solubilizantes, estabilizadores, conservantes, etc. Los agentes o vehículos que se pueden utilizar en formulaciones (líquidas y/o inyectables y/o sólidas) son en particular metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactosa, aceites vegetales, acacia, etc. Las composiciones pueden formularse opcionalmente mediante formas galénicas o dispositivos que aseguran una liberación prolongada y/o retardada. Para este tipo de formulación, se utiliza ventajosamente un agente tal como la celulosa, carbonatos o almidones.
Las dosis administradas pueden variar, entre otro, según el peso y la edad del paciente, así como la gravedad de la enfermedad, según la evaluación del experto en la técnica.
En una realización preferida, la dosis de los fragmentos Fc según la invención está en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, o aproximadamente 20 mg a aproximadamente 100 g por día para un adulto. Preferiblemente, la dosis es de aproximadamente 330 mg/kg a aproximadamente 660 mg/kg por día. Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.
Construcción de vectores de expresión de Fc recombinante (WT y mutados):
La secuencia Fc recombinante (aa 221-447) se clonó en un vector de expresión eucariota genérico derivado de pCEP4 (Invitrogen) para la expresión en células HEK, y el vector optiCHO para la expresión en células YB2/0 utilizando protocolos de PCR estándar.
Todas las mutaciones de interés en el fragmento Fc se insertaron en el vector de expresión mediante PCR superpuesta utilizando dos cebadores que contenían la mutación. Los fragmentos así obtenidos por PCR se combinaron entonces y el fragmento resultante se amplificó por PCR utilizando protocolos estándar. El producto de PCR se purificó en geles de agarosa al 1 % (p/v), se digirió con enzimas de restricción apropiadas y se clonó en el vector de expresión Fc recombinante.
La Figura 7 muestra el mapa del vector pCEP4 utilizado para la expresión de la variante T5A-74 en células HEK, y el mapa del vector OptiCHO utilizado para la expresión de la variante T5A-74 en células YB2/0.
Producción de Fc recombinantes en células HEK
Las células HEK 293 se transfectaron con el vector de expresión de Fc recombinante (WT o mutados) pCEP4 según protocolos estándar (Invitrogen). Las células se cultivaron de manera que produjeran los anticuerpos de manera transitoria. Los anticuerpos producidos han podido ser aislados y purificados según técnicas en uso de la técnica, con vistas a su caracterización. Los porcentajes de producción obtenidos son del orden de 150 a 500 pg/ml. La pureza y calidad de los productos se verificaron mediante SDS-PAGE y SEC.
Producción de Fc recombinantes en células YB2/0
Las células YB2/0 se transfectaron de manera estable por electroporación con el vector de expresión de Fc recombinante (WT o mutados) optiCHO según protocolos estándar. La producción se realizó en grupos estables o después de la clonación de células YB2/0.
Las etapas de producción por cultivo celular y purificación de los anticuerpos se llevaron a cabo según técnicas en uso de la técnica, con vistas a su caracterización. Los porcentajes de producción obtenidos son del orden de 3 a 30 pg/ml. La pureza y calidad de los productos se verificaron mediante SDS-PAGE y SEC.
Ejemplo 1: Prueba de eficacia (inhibición de la lisis de glóbulos rojos):
Para imitar la situación de lisis de glóbulos rojos que se observa en la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), que involucra a los autoanticuerpos del paciente que padecen PTI, se llevó a cabo una lisis de glóbulos rojos mediada por células efectoras en presencia de un anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D (RhD), y se evaluó la capacidad de diferentes cantidades de inmunoglobulinas polivalentes (IglV) o fragmentos Fc recombinantes, mutados (fragmentos Fc recombinantes que portan las mutaciones según la Tabla 1 a continuación) y no mutados, para inhibir esta lisis, por ejemplo, mediante competición con anti-RhD para la fijación de los receptores Fc a la superficie de las células efectoras.
Tabla 1: Construcciones de variantes de Fc mutados preferidos de la divulgación
La siguiente tabla representa las diferentes variantes de fragmentos Fc mutados que se probaron en los experimentos de prueba de eficacia (inhibición de la lisis de glóbulos rojos) y de prueba de unión a FcRn y CD16aV humanos por resonancia de plasmón de superficie (SPR).
Para ello, a título de células efectoras, se purificaron PBMC (células mononucleares de sangre periférica) a partir de sangre periférica mediante gradiente de Ficoll. Los glóbulos rojos Rh-D+ obtenidos a partir de donantes de sangre sanos Rh-D+ se mezclaron con un anticuerpo monoclonal anti-RhD. Los PBMC se incubaron con glóbulos rojos Rh-D+ opsonizados (relación efector/diana de 2/1).
Para evaluar la capacidad de los candidatos (IgIV y fragmentos Fc recombinantes, mutados como se define en la Tabla 1 y no mutados) para inhibir la citotoxicidad inducida por un anticuerpo anti-RhD por competición y/o saturación de los receptores Fc, se añadieron varias concentraciones de los candidatos (0 a 9,75 pM) a cada pocillo. Después de 16 horas, se estimó cromogénicamente el porcentaje de glóbulos rojos lisados midiendo la cantidad de hemoglobina liberada en los sobrenadantes (medida de densidad óptica o DO). La lisis específica se calcula en porcentaje según la siguiente fórmula:
DO<muestra DO control>0<% l IX ) control JÜC% - DO control>0<% *>100<= % |¡s ¡s>
en la que:
“DO control 100 %” corresponde a la lisis total de hematíes (por ejemplo NhUCl)
“DO control 0 %” corresponde a la lisis observada con una mezcla de reacción sin anticuerpos. Los resultados se expresan en % de lisis específica (véase las Figuras 4 y 5).
Ejemplo 2: Ensayo de unión a FcRn y CD16aV humanos mediante resonancia plasmónica de superficie (SPR) en Biacore X100:
Proteínas utilizadas:
El FcRn humano recombinante ( FcRn a y b2 microglobulina) se produjo en células de baculovirus por la compañía GTP Technology (Labége, Francia) como se describe anteriormente (Popov et al., Mol. Inmunol. 33:521-530 (1996)). El CD16aV humano recombinante está disponible comercialmente (R&D system).
Prueba en FcRn:
Las células FC1 y FC2 de un chip CM5 (Biacore, GE Healthcare) se activaron durante 3 minutos con una mezcla 1/1 de 0,1 M de N-hidroxisuccinimida y 0,1 M de 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida a 30 pl/min. El FcRn recombinante se inmovilizó entonces en la célula FC2 a 32,6 pg/ml en un tampón de acetato de Na 10 mM, pH 5 (inmovilización durante 100 segundos, porcentaje de inmovilización final de 350 RU). Se utilizó una célula FC1 como control negativo, preparada de la misma manera que la FC2 pero en ausencia de FcRn recombinante. Los Fc recombinantes a probar se inyectaron en 6 concentraciones diferentes (300 nM, 150 nM, 75 nM, 30 nM, 15 nM y 0) en tampón de fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, tween20 al 0,05 % pH 6 durante 8 minutos a 10 pl/min en células FC1 y FC2. Las células FC1 y FC2 se regeneraron entre cada concentración de muestra mediante una inyección durante un minuto de tampón fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05 %, pH 7,8. Los datos generados se analizaron con el software BIAevaluation versión 3.1 (Biacore), restando la señal de control obtenida en FC1 de la señal de prueba obtenida en FC2.
Prueba en CD16aV:
Las células FC1 y FC2 de un chip CM5 (Biacore, GE Healthcare) se prepararon con el kit His Capture de GE Healthcare referencia 28-9950-56, de manera a inmovilizar el anticuerpo anti-Histidina a 50 pg/ml (caudal de 5 pl/min, activación en EDC/NHS durante 7 min, inmovilización durante 7 minutos, porcentaje de inmovilización final de 12000 RU en FC1 y FC2). El CD16aV humano recombinante se inmovilizó en células FC2 (1 pg/ml en HBS-EP+, Biacore, GE Healthcare) durante 60 segundos a 5 pl/min. Los Fc recombinantes a probar se inyectaron en células FC1 y FC2 a 5 concentraciones diferentes (1000nM, 500nM, 250nM, 125nM y 25nM) en tampón HBS-EP+ en condición SCK (Single Cycle Kinetics), con un contacto de 60 segundos, una disociación de 300 segundos y un caudal de 30 pl/min sin regeneración entre cada concentración. La regeneración final, entre cada Fc recombinante, se realizó en tampón glicina 10 mM pH 1,5 durante 60 segundos a 30 pl/min en las células FC1 y FC2. Los datos generados se analizaron con el software BIAevaluation versión 3.1 (Biacore), restando la señal de control obtenida en FC1 de la señal de prueba obtenida en FC2.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Laboratoire Fran^ais du Fractionnement et des Biotechnologies
<120> Uso de fragmentos Fc mutados en inmunoterapia
<130> B2057PC
<160> 21
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG1 G1m1,17
<400> 1
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG2
<400> 2
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 3
<211> 222
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG3
<400> 3
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45
Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140
Lys Gly Phe Pro Ser Asp Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220
<210> 4
<211> 222
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG4
<400> 4
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220
<210> 5
<211> 222
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG1 G1m3
<400> 5
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220
<210> 6
<211> 232
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG1 G1m1,17
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 7
<211> 228
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG2
<400> 7
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 8
<211> 279
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG3
<400> 8
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 180 185 190 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205
Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275
<210> 9
<211> 229
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG4
<400> 9
Glu Ser Lys Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fc de IgG1 G1m3
<400> 10
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 11
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado T5A-74
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado T5A-74I
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Ala Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 13
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado T5A-74J
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 14
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado T5A-74K
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Tyr Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado T5A-74L
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 16
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado T5A-74M
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Trp Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 17
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado ZAC2-85
<400> 17
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Ala Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado ZAC3-172
<400> 18
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Tyr Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 19
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado A3A-184A
<400> 19
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110
Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 20
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado A3A-105D
<400> 20
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Asp
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Glu Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento Fc mutado J3B-118A
<400> 21
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Thr Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende fragmentos Fc de anticuerpos, para su uso en el tratamiento de la púrpura trombótica idiopática, siendo dichos fragmentos Fc fragmentos Fc aislados que tienen una afinidad mejorada de una relación al menos igual a 2 para el receptor FcRyIII (CD16a), con respecto a un fragmento Fc parental de IgG1 de tipo salvaje de secuencia SEQ ID NO: 1, y que comprende al menos la secuencia SEQ ID NO: 19.
2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que los fragmentos Fc consisten en la secuencia SEQ ID NO: 19.
3. Una composición que comprende fragmentos Fc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que los fragmentos Fc se obtienen ppor vía recombinante.
4. Composición que comprende fragmentos Fc para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen una tasa de fucosilación menor que 65 %, preferiblemente menor que 60 %, preferiblemente menor que 55 %, preferiblemente menor que 50 %, más preferiblemente menor que 45 %, preferiblemente menor que 40 %, preferiblemente menor que 35 %, preferiblemente menor que 30 %, preferiblemente menor que 25 %, preferiblemente menor que 20 %.
5. Composición que comprende fragmentos Fc para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, teniendo dichos fragmentos Fc, N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen una estructura de glicano de tipo biantenario, de cadenas cortas, de baja sialilación, que tiene manosas terminales y/o N-acetilglucosaminas terminales no intercaladas.
6. Composición que comprende fragmentos Fc para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido mayor que 60 % para las formas G0+G1+G0F+G1F, siendo las formas G0F+G1F menor que 50 %.
7. Composición que comprende fragmentos Fc para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 5, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido mayor que 60 % para las formas G0+G1+G0F+G1F, siendo el contenido en fucosa menor que 65 %.
8. Composición que comprende fragmentos Fc para su uso según la reivindicación 6 o 7, teniendo dichos fragmentos Fc N-glicanos en su sitio de glicosilación (Asn 297), caracterizada por que dichos N-glicanos de los fragmentos Fc tienen un contenido menor que 40 % para las formas G1F+G0F.
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