ES3019133T3

ES3019133T3 - Hairpin primer design for sequential pcr production of targeted sequencing libraries

Info

Publication number: ES3019133T3
Application number: ES20853637T
Authority: ES
Inventors: Robert Meltzer; Kristina Fontanez; Desiree Schenk
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2025-05-20
Anticipated expiration: 2040-08-20
Also published as: CA3152038A1; EP4017989A1; EP4017989B1; DK4017989T3; EP4017989A4; US20210054369A1; WO2021035056A1

Abstract

La presente divulgación proporciona un método para el diseño de cebadores de horquilla y su amplificación dirigida para la creación de bibliotecas de secuenciación dirigida. En general, estos métodos permiten la construcción simultánea de bibliotecas de secuenciación dirigida para múltiples secuencias de ácidos nucleicos diana dentro de una misma muestra. Los métodos descritos generan una amplificación eficiente y específica de la secuencia diana, a la vez que evitan o reducen significativamente la interacción inespecífica de cebadores multiplex, la amplificación inespecífica de secuencias debida al cebado aleatorio de etiquetas moleculares (como los códigos de barras de los Identificadores Moleculares [MI]) y las interacciones no intencionadas entre cebadores específicos de genes y universales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Diseño de cebadores de horquilla para la producción secuencial por PCR de genotecas de secuenciación dirigidaIntroducción

Con el advenimiento y la adopción de la secuenciación paralela masiva (como la secuenciación de próxima generación), los investigadores interrogan una gran cantidad de información sobre ácidos nucleicos de muestras, como muestras de ADN o ARN. En muchos casos, investigar todo el genoma o grandes porciones de este (secuenciación del exoma) tiene un costo prohibitivo, requiere una secuenciación de gran capacidad y produce grandes cantidades de datos más allá de lo que puede ser necesario para los entornos clínicos. Por lo tanto, la secuenciación dirigida para aplicaciones específicas permite un método enfocado para investigar las regiones de ácido nucleico relevantes de interés. Una aplicación frecuente es la secuenciación dirigida en oncología, que proporciona información mutacional específica de una muestra de biopsia que puede utilizarse para guiar el tratamiento o monitorear la respuesta al tratamiento. Para tales aplicaciones, los ácidos nucleicos se extraen de una muestra, tal como una muestra biológica, y se enriquecen para preparar genotecas de ADN para la secuenciación, en donde una genoteca es un conjunto de moléculas de ADN preparadas a partir de una muestra particular después del proceso de enriquecimiento. Para un enriquecimiento eficiente y rentable, el enriquecimiento de múltiples secuencias genómicas dirigidas se realiza en paralelo (multiplexación). Sin multiplexación, una muestra debe someterse a múltiples pasos de enriquecimiento, lo que puede resultar oneroso con muestras de baja cantidad, sin mencionar el costo multiplicado de los reactivos, el tiempo de procesamiento y la reducción del rendimiento de la muestra.

El documento WO 2019/140298 se refiere a un cebador en bucle, al cebador dividido y al cebador en bucle dividido y a los usos de los mismos.

El documento WO 2018/175399 se refiere a métodos de amplificación de ácidos nucleicos diana mediante el uso de un cebador universal de horquilla y a los usos de los mismos.

El documento WO 2016/138080 se refiere a métodos para la detección, identificación y cuantificación de ácidos nucleicos diana en una muestra utilizando cebadores de códigos de barras de horquilla para incorporar códigos de barras únicos en los ácidos nucleicos diana en un paso de preamplificación por PCR.

La presente descripción proporciona un enfoque para la construcción simultánea de genotecas de secuenciación dirigida para múltiples secuencias genómicas dirigidas dentro de una sola muestra y ventajas relacionadas.

Resumen

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Los métodos y composiciones descritos en la presente memoria proporcionan un método de preparación de genotecas y una composición adecuada para la amplificación nucleica mediante ese método.

El cebador de horquilla puede comprender:

(a) una secuencia cebadora específica de la diana que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una parte de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana;

(b) una secuencia adaptadora;

(c) una secuencia de acoplamiento que comprende una secuencia complementaria a dicha secuencia cebadora específica de la diana;

en donde las secuencias (a) a (c) están dispuestas desde el extremo 3' hasta el extremo 5' de dicho cebador de horquilla. La secuencia cebadora específica de la diana (a) y la secuencia de acoplamiento complementaria (c) son capaces de hibridarse, lo que permite que dicho cebador de horquilla forme una estructura de horquilla secundaria. La secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento, cuando se hibridan, forman la parte de tallo de dicha estructura de horquilla.

En algunos aspectos del cebador de horquilla, la secuencia adaptadora comprende una secuencia cebadora universal. En algunos aspectos del cebador de horquilla, la secuencia de acoplamiento es complementaria a una parte, o a la totalidad, de la secuencia cebadora específica de la diana.

En algunos aspectos, el cebador de horquilla comprende además una secuencia desestabilizadora de horquilla específica del gen ubicada a 5' de la secuencia cebadora específica de la diana, en donde la secuencia desestabilizadora de horquilla específica del gen comprende al menos un nucleótido que no es complementario a la secuencia aguas arriba de la parte de la secuencia de ácido nucleico diana complementaria a la secuencia cebadora específica de la diana.

En algunos aspectos, el cebador de horquilla comprende además una secuencia semialeatoria, denominada en la presente memoria identificador molecular. La secuencia de identificador molecular (MI) se encuentra en 5' de la secuencia desestabilizadora de horquilla específica del gen. En una realización del cebador de horquilla descrito actualmente, la secuencia de MI no contiene tramos largos de GC (bases de guanina y citosina). Esto sirve para evitar o reducir el emparejamiento incorrecto con otras secuencias ricas en GC a la temperatura de apareamiento (que se analiza a continuación). En algunos aspectos, la secuencia de MI es un 9-mero semialeatorio, y en donde las posiciones 1,4 y 7 están restringidas a ATP o TTP. En otros aspectos, la secuencia de MI es más larga y puede estar en el intervalo de aproximadamente 9-15 meros.

En algunos aspectos, el cebador de horquilla comprende además una secuencia desestabilizadora de horquilla adaptadora ubicada en 5' de la secuencia adaptadora, en donde la secuencia desestabilizadora de horquilla del adaptador comprende al menos un nucleótido derivado de la parte específica del gen del cebador de horquilla, en donde dicho nucleótido no es complementario al primer nucleótido del cebador de horquilla que no participa en el tallo de horquilla.

En algunos aspectos, el cebador de horquilla comprende además una secuencia desestabilizadora de tallo ubicada en 5' de la secuencia de acoplamiento, en donde la secuencia desestabilizadora de tallo comprende al menos un nucleótido que no es complementario a la parte 3' de la secuencia cebadora específica de la diana del cebador de horquilla.

En algunos aspectos, la estructura secundaria de horquilla del cebador de horquilla, tal como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores, se desnaturaliza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 55-80 0C. Más específicamente, la estructura secundaria de horquilla del cebador de horquilla, tal como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores, se desnaturaliza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 62-72 0C.

En algunos aspectos, la estructura secundaria de horquilla del cebador de horquilla, tal como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores, se desnaturaliza a una temperatura de 62 0C.

En algunos aspectos, la estructura secundaria de horquilla del cebador de horquilla, tal como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores, se desnaturaliza a una temperatura de 72 0C.

La presente descripción proporciona un método para amplificar el ácido nucleico diana, comprendiendo el método los pasos de:

(a) proporcionar una mezcla de reacción única que comprende:

(i) muestra de ADN;

(ii) el cebador de horquilla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -13;

(iii) un cebador universal que comprende toda, o parte, de la secuencia adaptadora del cebador de horquilla de (ii);

(iv) reactivos de amplificación; y

(iv) una ADN polimerasa;

(b) someter el ADN de la muestra a una amplificación de ADN en donde el cebador de horquilla se aparea con las secuencias diana para permitir la producción de un producto de amplificación específico de la diana; y

(c) someter el producto de amplificación específico de la diana del paso (b) a una amplificación de ADN en donde el cebador universal se aparea con dicho producto de amplificación para permitir la amplificación universal de los productos del paso (b).

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, la muestra de ADN se deriva de una muestra biológica, por ejemplo, ADN genómico

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, la ADN polimerasa se selecciona entre la ADN polimerasa Taq, la polimerasa Phusion, la polimerasa Platinum SuperFi o la polimerasa Q5. Sin embargo, cualquier polimerasa que carezca de actividad de desplazamiento de cadenas es adecuada para los métodos actualmente descritos. En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, la amplificación del ADN del paso (b) va precedida de una incubación desnaturalizante del ADN. En algunos aspectos, la incubación desnaturalizante del ADN se realiza a 98 0C durante dos minutos.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, la amplificación del ADN del paso (b) comprende los pasos de desnaturalizar la muestra de ADN; aparear el cebador de horquilla con el ADN para permitir la formación de un híbrido ADN-cebador; e incubar el híbrido cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un producto de amplificación. En algunos aspectos, la amplificación del ADN del paso (b) se repite al menos dos veces.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (b) se realizan a un intervalo de temperatura de aproximadamente 55-80 0C. En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (b) se realizan a un intervalo de temperatura de aproximadamente 62 a 72 °C. En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (b) se realizan a una temperatura de 62 °C. En otros aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (b) se realizan a una temperatura de 72 °C.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, la amplificación del ADN del paso (c) comprende los pasos de desnaturalizar el ADN que comprende el producto de amplificación del paso (b); aparear el cebador universal con el producto de amplificación para permitir la formación de un híbrido de ADN-cebador; e incubar el híbrido cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un segundo producto de amplificación. En algunos aspectos, la amplificación del ADN del paso (c) se repite al menos veinte veces. En otros aspectos, la amplificación del ADN del paso (c) se repite al menos treinta veces.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación del ADN del paso (c) se realizan a una temperatura inferior a la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b).

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación del ADN del paso (c) es inferior a la temperatura requerida para la desnaturalización de la estructura secundaria de horquilla del cebador de horquilla, lo que evita o reduce la probabilidad del apareamiento del cebador de horquilla con los productos de amplificación del paso (b), muestra de ADN o la secuencia cebadora universal de los cebadores universales.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación del ADN del paso (c) se realizan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 55 62 °C. En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (c) se realizan a una temperatura de 62 °C.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, el método de amplificación del ácido nucleico diana comprende además un paso de amplificación de ADN de transición realizada después del paso (b) y antes del paso (c). En algunos aspectos, el paso de amplificación del ADN de transición comprende los pasos de desnaturalizar el ADN que comprende el producto de amplificación del paso (b); aparear el cebador universal o el cebador de horquilla con dicho producto de amplificación para permitir la formación de un híbrido de cebador de ADN; e incubar el híbrido cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un producto de amplificación. En algunos aspectos, el paso de amplificación del ADN de transición se repite al menos dos veces.

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación del ADN de transición se realizan a una temperatura inferior a la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b), pero superior a la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (c).

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación del ADN de transición se realizan a una temperatura en el intervalo entre la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b) y la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (c).

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación del ADN de transición se realizan a una temperatura en el intervalo entre la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b) y la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (c), y en donde la temperatura de los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación del ADN de transición cae gradualmente con cada repetición. En algunos aspectos, la probabilidad de hibridación del cebador de horquilla con los productos de amplificación del paso (b) se reduce con cada repetición. En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación de ADN de transición se realizan en la primera repetición a una temperatura de 72 °C, en una segunda repetición a una temperatura de 70 °C, en una tercera repetición a una temperatura de 68 °C, en una cuarta repetición a una temperatura de 66 °C, en una quinta repetición a una temperatura de 64 °C y en una sexta repetición a una temperatura de 62 0C. El método de amplificación descrito en el presente párrafo también se conoce en la técnica como “ PCR de contacto” .

En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, el cebador universal comprende además una secuencia adaptadora de aplicación. En algunos aspectos, la secuencia adaptadora de la aplicación puede ser una secuencia de indexación, una secuencia de código de barras, una etiqueta para la detección, purificación o cuantificación de los productos de amplificación, o un adaptador de secuenciación para aplicaciones de secuenciación. En algunos aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, el cebador universal para amplificar los productos de amplificación es Universal 500.F, y el cebador universal para amplificar el complemento inverso de los productos de amplificación es Universal 700.R.

En cualquiera de los aspectos del método de amplificación del ácido nucleico diana, los productos de amplificación pueden utilizarse para preparar una genoteca de secuenciación dirigida.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para amplificar una molécula de ácido nucleico diana, que comprende: proporcionar una muestra que comprende la molécula de ácido nucleico diana y un cebador de horquilla para amplificar la molécula de ácido nucleico diana o su complemento inverso, en donde el cebador de horquilla comprende (i) una secuencia cebadora específica de la diana que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una parte de una secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico diana; (ii) una secuencia adaptadora; (iii) una secuencia de acoplamiento que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia cebadora específica de la diana; en donde (i) a (iii) están dispuestos desde un extremo 3' a un extremo 5' del cebador de horquilla; en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento pueden hibridarse, lo que permite de este modo que el cebador de horquilla forme una estructura de horquilla, y en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento, cuando se hibridan, forman una parte de tallo de la estructura de horquilla.

En algunos aspectos, la parte de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico diana se hibrida con la secuencia cebadora específica de la diana del cebador de horquilla.

En algunos aspectos, la muestra comprende además un cebador universal que comprende al menos una parte de la secuencia adaptadora del cebador de horquilla.

En algunos aspectos, la muestra comprende además un reactivo de amplificación. En algunos aspectos, la muestra comprende además una ADN polimerasa.

En algunos aspectos, el método comprende además someter la muestra a una condición de amplificación, en donde el cebador de horquilla se extiende al utilizar la secuencia de ácido nucleico diana como molde para producir un producto de amplificación.

En algunos aspectos, el método comprende además someter la muestra a una condición de amplificación adicional, en donde el cebador universal se aparea con el producto de amplificación para permitir la amplificación universal del producto de amplificación.

En algunos aspectos, la condición de amplificación comprende una temperatura para realizar un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 55-80 0C.

En algunos aspectos, la condición de amplificación comprende una temperatura para realizar un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 62-72 0C.

En algunos aspectos, la temperatura es de aproximadamente 62 0C.

En algunos aspectos, la temperatura es de aproximadamente 72 0C.

En algunos aspectos, la condición de amplificación adicional comprende una temperatura para un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 50-80 0C.

En algunos aspectos, la condición de amplificación adicional comprende una temperatura para un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 60-62 0C.

En algunos aspectos, la temperatura es de 62 0C.

En algunos aspectos, el método comprende además someter la muestra a un paso de amplificación de transición realizada después de la condición de amplificación y antes de la condición de amplificación adicional.

En algunos aspectos, la condición de amplificación de transición comprende desnaturalizar el producto de amplificación; aparear el cebador universal o el cebador de horquilla con el producto de amplificación para permitir la formación de un híbrido entre producto de amplificación y cebador; e incubar el híbrido entre producto de amplificación y cebador para permitir la síntesis de un producto de amplificación adicional.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una gotita que comprende una molécula de ácido nucleico diana y un cebador de horquilla para amplificar la molécula de ácido nucleico diana o su complemento inverso, en donde el cebador de horquilla comprende (i) una secuencia cebadora específica de la diana que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una parte de una secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico diana; (ii) una secuencia adaptadora; (iii) una secuencia de acoplamiento que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia cebadora específica de la diana; en donde (i) a (iii) están dispuestos desde un extremo 3' a un extremo 5' del cebador de horquilla; en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento pueden hibridarse, lo que permite de este modo que el cebador de horquilla forme una estructura de horquilla, y en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento, cuando se hibridan, forman una parte de tallo de la estructura de horquilla.

En algunos aspectos, la gotita es una partícula.

En algunos aspectos, la partícula es una perla.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para amplificar una molécula de ácido nucleico diana en una gotita, que comprende: generar una pluralidad de gotitas, comprendiendo cada gota de la pluralidad un ácido nucleico diana y un cebador de horquilla, en donde el cebador de horquilla comprende (i) una secuencia cebadora específica de la diana que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una parte de una secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico diana; (ii) una secuencia adaptadora; (iii) una secuencia de acoplamiento que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia cebadora específica de la diana; en donde (i) a (iii) están dispuestos desde un extremo 3' a un extremo 5' del cebador de horquilla; en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento pueden hibridarse, lo que permite de este modo que el cebador de horquilla forme una estructura de horquilla, y en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento, cuando se hibridan, forman una parte de tallo de la estructura de horquilla.

En algunos aspectos, la gotita comprende además un cebador universal que comprende al menos una parte de la secuencia adaptadora del cebador de horquilla.

En algunos aspectos, la gotita comprende además un reactivo de amplificación.

En algunos aspectos, la gotita comprende además una ADN polimerasa.

En algunos aspectos, el método comprende además someter la gotita a una condición de amplificación, en donde el cebador de horquilla se extiende al utilizar la secuencia de ácido nucleico diana como molde para producir un producto de amplificación.

En algunos aspectos, el método comprende además someter la gotita a una condición de amplificación adicional, en donde el cebador universal se aparea con el producto de amplificación para permitir la amplificación universal del producto de amplificación.

En algunos aspectos, la condición de amplificación comprende una temperatura para realizar un paso de apareamiento<y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 55-80>0<C. En algunos aspectos, la condición de>amplificación comprende una temperatura para realizar un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 62-72 °C.

En algunos aspectos, la temperatura es de aproximadamente 62 °C.

En algunos aspectos, la temperatura es de aproximadamente 72 °C.

En algunos aspectos, la condición de amplificación adicional comprende una temperatura para un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 50-80 °C.

En algunos aspectos, la condición de amplificación adicional comprende una temperatura para un paso de apareamiento y un paso de síntesis de ADN en un intervalo de aproximadamente 60-62 °C. En algunos aspectos, la<temperatura es de>62<°C.>

En algunos aspectos, el método comprende además someter la gotita a un paso de amplificación de transición realizada después de la condición de amplificación y antes de la condición de amplificación adicional. En algunos aspectos, la condición de amplificación de transición comprende desnaturalizar el producto de amplificación; aparear el cebador universal o el cebador de horquilla con el producto de amplificación para permitir la formación de un híbrido entre producto de amplificación y cebador; e incubar el híbrido entre producto de amplificación y cebador para permitir la síntesis de un producto de amplificación adicional.

En algunos aspectos, la gotita comprende además una partícula. En algunos aspectos, la partícula es una perla. En algunos aspectos, la gotita se genera mediante agitación, agitación en vórtex o mediante un dispositivo microfluídico.

Breve descripción de los dibujos

La invención se puede entender mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

La figura 1 es un esquema de una estructura secundaria de horquilla de una realización de un cebador de horquilla, que representa su secuencia de nucleótidos (“G” representa guanina, “C” representa citosina, “A” representa adenina y “T” representa timina). El apareamiento de bases en la parte de tallo de la estructura de horquilla se muestra esquemáticamente mediante puntos abiertos (guanina-citosina) y sólidos (adenina-timina).

La figura 2 es una ilustración esquemática que representa una realización de las fases de la reacción de amplificación de ciclado térmico (tal como la PCR) al utilizar una realización de la horquilla y los cebadores universales de la presente descripción. Los ácidos nucleicos de muestra se representan como formas bidimensionales alargadas en forma de barra, en donde las secuencias diana se representan como porciones más gruesas de las barras. La muestra de ADN se presenta en un estado desnaturalizado en donde la cadena diana de 5' a 3' (sentido) está marcada como “ Molde(+)” y su complemento inverso (antisentido) está marcado como “ Molde(-)” . Los cebadores de horquilla representados comprenden una secuencia cebadora específica de la diana. En el cebador de horquilla directo, que ceba el Molde(-), la secuencia cebadora específica de la diana se marca como “GS-FWD” , mientras que en el cebador de horquilla inverso, que ceba el Molde (+), la secuencia cebadora específica de la diana se marca como “GS-REV” . La secuencia cebadora específica de la diana se hibrida (pares de bases) con secuencias complementarias (también denominadas en la presente memoria “ regiones” ) de los ácidos nucleicos diana, por ejemplo, la casilla marcada como “GS-FWD” se empareja de bases con una secuencia en el Molde(-). El cebador de horquilla directo representada también contiene un MI (“ MIf” ), un adaptador (“Cebador de sec. I” ) y acoplamiento (“GS-FWDS” ). El cebador de horquilla inverso representado también contiene un MI (“ MIr” ), un adaptador (“ Cebador de sec. 2” ) y acoplamiento (“ GS-REVs” ). Las flechas marcan la dirección de la síntesis de ADN. Los amplicones (también denominados en la presente memoria “ productos de amplificación” ) creados a partir del Molde(+) se marcan con “ GS(+)” , mientras que los amplicones creados con el Molde(-) se marcan con “ GS(-)” . Los cebadores de horquilla también se ilustran en una forma de estructura de horquilla secundaria, en donde la parte de bucle de la horquilla está representada por una línea curva (el bucle comprende las partes MI y adaptadora del cebador de horquilla) que conecta las secuencias cebadoras específicas de la diana y los acoplamientos que se ilustran formando la estructura de tallo de la horquilla mediante el emparejamiento de bases. Los cebadores universales ilustrados contienen adaptadores universales “SP2” o “ SPI” , que representan secuencias adaptadoras universales que comprenden todas, o una parte, de las secuencias adaptadoras de los cebadores de horquilla utilizados en la fase de amplificación específica del gen de la misma reacción de amplificación. Por lo tanto, los cebadores universales pueden hibridarse con GS(+) y GS(-) e impulsar la síntesis de ADN. Se ilustran los cebadores universales que contienen también los adaptadores de aplicaciones “ i7” y “ P7” o “ PS” e “ i5” , que son útiles en aplicaciones posteriores. Los productos de amplificación resultantes ilustrados en la fase de “amplificación universal” incluyen las secuencias diana de interés, los MI, los adaptadores y los adaptadores de aplicación.

La figura 3 es una imagen de un gel de agarosa que presenta los productos de amplificación del método del ejemplo 1. La amplificación de una parte del gen GAPDH se realizó utilizando solo cebadores de horquilla específicos de la diana. A temperaturas más bajas, la estructura de horquilla de los cebadores de horquilla evita que los cebadores de horquilla inicien una reacción de amplificación. En los primeros cinco carriles después de la escalera, la amplificación tuvo lugar sin la presencia de DMSO, en donde en los carriles posteriores se incluyó DMSO. La presencia de DMSO ayuda a desnaturalizar la estructura de horquilla secundaria, especialmente cuando los pasos de apareamiento/extensión se realizan a 72 0C.

La figura 4 es una imagen de un gel de agarosa que presenta los productos de amplificación del método del ejemplo 2. Las reacciones de amplificación de una parte del gen GAPDH se realizaron en dos sistemas reguladores, el regulador I y el regulador 2. El producto de amplificación se observa a todas las temperaturas utilizadas para los pasos de apareamiento/extensión, excepto a 55 0C, que no es lo suficientemente alta como para desnaturalizar la estructura secundaria de horquilla. La cantidad de producto de amplificación aumenta con un aumento de la temperatura de apareamiento/extensión, lo que indica que las estructuras de horquilla solo se desnaturalizan parcialmente a 59 0C, particularmente en el segundo sistema regulador. A 67 0C y 70 0C, el rendimiento del producto de amplificación ha mejorado con respecto al de la reacción a 59 0C (para ambos tampones). Las horquillas se diseñaron de tal modo que sus temperaturas de fusión fueran de 57 0C (el 50 % de las moléculas desnaturalizadas) y, por lo tanto, estuvieran completamente desnaturalizadas a 67 0C y 70 0C.

La figura 5 es una imagen de un gel de agarosa que presenta los productos de amplificación del método del ejemplo 3, que describe una realización del método para crear genotecas de secuenciación específicas de la GAPD<h>. La amplificación por PCR se realizó sin la presencia de oligonucleótidos universales en la mezcla de reacción y en presencia de un 0 %, un 1 % y un 2 % de DMSO (los tres primeros carriles después de la escalera). Los tres carriles siguientes muestran los productos de amplificación de reacciones de amplificación similares, sin embargo, en estas reacciones también se incluyeron oligos universales en la reacción de amplificación. Cuando solo están presentes los cebadores de horquilla específicos de la diana en la reacción de amplificación, no se detecta ningún producto al finalizar la reacción, lo que indica que los amplicones específicos de la GAPDH se crean, o aumentan considerablemente en cantidad, por la presencia de cebadores universales.

Descripción detallada

La presente descripción proporciona métodos de diseño de cebadores de horquilla y amplificación dirigida de los mismos para la creación de genotecas de secuenciación dirigida. En general, los presentes métodos permiten la construcción simultánea de genotecas de secuenciación dirigida para múltiples secuencias de ácidos nucleicos dirigidas dentro de una sola muestra. Más específicamente, los métodos descritos en la presente memoria generan una amplificación de secuencias eficiente y dirigida, al tiempo que evitan la interacción no específica de cebadores de multiplexado, evitan la amplificación no específica de secuencias debida al cebado aleatorio a partir de secuencias cortas o “etiquetas” moleculares (tales como identificadores moleculares (“ MI” ) o secuencias de códigos de barras) y evitan interacciones no intencionadas entre cebadores específicos de la diana (también denominados en la presente memoria “específicos de un gen” ) y universales durante la amplificación universal por PCR.

Antes de que la presente invención se describa con más detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior y el inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está incluido en la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de forma independiente en los intervalos más pequeños, y también están englobados en la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describen algunos métodos y materiales potenciales y de ejemplo. Cabe señalar que, como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “uno” , “una” , “el” y “ la” incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un cebador” incluye una pluralidad de tales cebadores, “ ácido nucleico diana” incluye una pluralidad de tales dianas, y la referencia a “el ácido nucleico” incluye la referencia a uno o más ácidos nucleicos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, etc.

Cabe señalar, además, que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento que pueda ser opcional. Así pues, esta declaración tiene por objeto servir de base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como “exclusivamente” , “ únicamente” y similares en relación con la enumeración de los elementos de reivindicación, o el uso de una limitación “ negativa” .

Las publicaciones comentadas en la presente memoria se proporcionan exclusivamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que puede ser necesario confirmar de forma independiente.

Cualquier método mencionado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos recitados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible. Por ejemplo, en la presente memoria se describen una variedad de métodos y aplicaciones adicionales, que pueden realizarse en relación con los métodos descritos en la presente memoria en relación con el diseño de cebadores de horquilla para la amplificación de los ácidos nucleicos diana.

Métodos

La presente invención describe métodos para la construcción simultánea (reacción en un tubo) de genotecas de secuenciación dirigida para múltiples secuencias de ácidos nucleicos dirigidos dentro de una única muestra de ácidos nucleicos (tal como una muestra de ADN). La secuenciación dirigida para aplicaciones específicas permite un método enfocado para investigar las regiones relevantes (como las secuencias de ADN) de interés.

Los métodos de preparación de genotecas dirigidas generalmente consisten en dos categorías: captura híbrida y preparación de genotecas basadas en amplificación. Ambos métodos requieren primero la selección de secuencias diana utilizando cebadores selectivos. El primer método utiliza los cebadores específicos (selectivos) (también conocidos como sondas o “cebo” ) para extraer las regiones dirigidas del resto de la muestra. Este último se basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar exponencialmente las regiones dirigidas. Con el enfoque de captura híbrida, las secuencias aisladas también requieren que se adjunten secuencias adaptadoras para su compatibilidad con la secuenciación de próxima generación (secuenciación paralela masiva). Por lo general, esto se realiza mediante ligación o una amplificación separada, lo que añade tiempo de procesamiento adicional a la preparación de la genoteca. Los métodos de captura híbrida generalmente requieren cantidades de muestra más grandes que las genotecas basadas en amplificación con varios pasos más largos para preparar la muestra. Las reacciones de amplificación tienen una duración más corta con menos entrada, pero a medida que la PCR introduce errores, la captura híbrida tiene una ventaja de rendimiento sobre la amplificación para una multiplexación muy alta. Por lo tanto, reducir la preparación de la genoteca a una reacción de amplificación única y fácil de configurar reduce el tiempo de preparación, reduce los pasos para introducir errores y aumenta el rendimiento para los investigadores con varias muestras.

Para la preparación de genotecas dirigidas y basadas en la amplificación, los intentos anteriores de generar genotecas de secuenciación de multiplexado adolecen de varias limitaciones. Por nombrar algunos, para preparar grandes genotecas multiplexadas, se agrupan grandes cantidades de cebadores. Esto a menudo da como resultado poco o ningún producto de amplificación debido a los dímeros cebadores de las interacciones entre cebadores, que pueden desbordar por completo una reacción de amplificación debido a su mayor eficiencia de amplificación (impulsada por la alta concentración de cebadores y su longitud generalmente más corta), y el número de posibles interacciones entre cebadores aumenta significativamente al dirigirse a dianas cada vez mayores (multiplexación). Además, el propio proceso de amplificación introduce errores y, por lo tanto, las tecnologías de secuenciación actuales tienen tasas de error de 1-2 %. El error intrínseco en la metodología de secuenciación se puede superar mediante el uso de identificadores moleculares (MI) que se pueden incorporar en la etapa inicial de la amplificación por PCR para “etiquetar” e identificar las moléculas de la genoteca que corresponden a una molécula original específica de la muestra. Los errores de amplificación y secuenciación se eliminan al colapsar las moléculas de la genoteca con el mismo MI para crear un “consenso” , eliminando los eventos espurios que no están presentes en toda la familia de MI y manteniendo las variantes que están presentes. Estas “ lecturas consensuadas” permiten la detección ultrasensible de secuencias raras, lo que resulta especialmente útil cuando se detectan eventos poco frecuentes, como en la detección del cáncer a partir de ADN libre de células o muestras con bajo contenido tumoral. Sin embargo, las porciones de MI de los oligos son secuencias inherentemente aleatorias, lo que contribuye a un cebado erróneo durante la amplificación. El cebado erróneo se presenta tanto en forma de dímeros cebadores como de amplificación de regiones no dirigidas. El cebado erróneo no solo da como resultado una menor eficiencia de amplificación para las regiones dirigidas, sino también una menor eficiencia de secuenciación, ya que la cantidad de producto dirigido disminuye significativamente.

Basados en los problemas descritos anteriormente, se deben superar varios desafíos técnicos para lograr un enfoque simple de un solo tubo para la construcción de genotecas multiplex ultrasensibles:

1. Evitar, o reducir significativamente, la interacción no específica de los cebadores de multiplexado.

2. Evitar, o reducir significativamente, la amplificación no específica de secuencias y/o dímeros cebadores debido al cebado aleatoria a partir de los códigos de barras MI.

3. Evitar, o reducir significativamente, las interacciones no intencionales entre los cebadores específicos de un gen y los cebadores universales durante la amplificación universal por PCR.

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ muestra” o “ muestra biológica” (estos términos son intercambiables entre sí) abarcan una variedad de tipos de muestras obtenidas de una variedad de fuentes, generalmente los tipos de muestra contienen material biológico. Por ejemplo, el término incluye muestras biológicas obtenidas de un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano, y muestras biológicas obtenidas de un alimento, agua u otra fuente ambiental, etc. La definición abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, así como muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y su descendencia. La definición también incluye muestras que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como mediante el tratamiento con reactivos, la solubilización o el enriquecimiento de ciertos componentes, tales como los polinucleótidos. El término “ muestra” abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, células, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido. La “ muestra” incluye células, por ejemplo, células bacterianas o células eucariotas; fluidos biológicos tales como sangre, líquido cefalorraquídeo, semen, saliva y similares; bilis; médula ósea; piel (por ejemplo, biopsia de piel); y anticuerpos obtenidos de un individuo. Algunos ejemplos no limitantes de una muestra incluyen dianas de biopsia líquida, tales como células circulantes (tumorales, fetales o madre), componentes celulares (por ejemplo, núcleos), ácidos nucleicos libres de células, vesículas extracelulares y antígenos proteicos, que están siendo dirigidos para el desarrollo de diagnósticos no invasivos para una variedad de tipos de cáncer. El término muestra también incluye dianas biológicas indicativas de enfermedades tales como procariotas, hongos y virus.

El término “ muestra de ADN” , como se utiliza en la presente memoria, abarca cualquier ADN derivado, sintetizado o transcrito de forma inversa de una muestra, o contenido en una muestra, e incluye ADN genómico, ADNc, ADN cromosómico microdisecado, ADN cromosómico artificial de levadura (YAC),<a>D<n>cósmido, ADN fágico, ADN cromosómico artificial (PAC) derivado de Pl y ADN cromosómico artificial bacteriano (BAC). En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de la muestra de ADN pueden haber sido manipulados al utilizar cualquier método utilizado tradicionalmente en la técnica, tal como, sin limitación, restricción, ligación o clonación.

En algunos aspectos, la muestra comprende ADN de mamífero, ADN vegetal, ADN de levadura, ADN viral y ADN procariótico.

Como se describe más detalladamente en la presente memoria, en diversos aspectos, los métodos en cuestión pueden utilizarse para detectar y amplificar una variedad de componentes a partir de tales muestras biológicas. Los componentes de interés incluyen, pero no se limitan necesariamente a, polinucleótidos (por ejemplo, ADN y/o ARN). En general, los términos “secuencias dirigidas” , “ regiones diana” y “ácido o ácidos nucleicos diana” se utilizan indistintamente en la presente memoria y abarcan cualquier componente de interés que pueda estar presente en una muestra de ADN, tal como, por ejemplo, una región o secuencias específicas del ADN de la muestra

Los términos “cebador(es)” u “oligonucleótido(s)” , como se utilizan en la presente memoria, se refieren a polímeros lineales de monómeros de nucleótidos y pueden utilizarse indistintamente. Los cebadores, u oligonucleótidos, pueden tener cualquiera de una variedad de configuraciones estructurales, por ejemplo, ser monocatenarios, bicatenarios o una combinación de ambas, además de tener estructuras terciarias/secundarias intra o intermoleculares de orden superior, por ejemplo, horquillas, bucles, regiones tricatenarias, etc. Los cebadores de la presente descripción normalmente varían en tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, por ejemplo, de 5 a doscientas unidades monoméricas. En algunos aspectos, los cebadores de la presente descripción normalmente varían en tamaño de cincuenta a cien unidades monoméricas. Siempre que un cebador, u oligonucleótido, esté representado por una secuencia de letras (mayúsculas o minúsculas), tal como “ATGCCTG” , se entenderá que los nucleótidos están en un orden de 5' a 3' de izquierda a derecha y que “A” indica desoxiadenosina, “C” indica desoxicitidina, “ G” indica desoxiguanosina y “T” indica desoxitimidina, “ I” indica desoxiinosina, “ U” indica desoxiuridina, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. A menos que se indique lo contrario, las convenciones de terminología y numeración de átomos seguirán las descritas en Strachan y Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, Nueva York, 1999).

Por consiguiente, los términos “ secuencia de nucleótidos” o “ secuencia” se refieren a una sucesión de letras que indican el orden de los nucleótidos dentro de los polímeros lineales de moléculas de ADN (utilizando GACT) o ARN (GACU). La secuencia de nucleótidos, o ácido nucleico, es generalmente la estructura primaria de la molécula de ADN o ARN.

Diseño de cebadores

La presente invención describe un método de amplificación dirigida y multiplexada para el diseño de cebadores reproducibles. El método de amplificación descrito en la presente memoria emplea dos conjuntos de cebadores, cebadores específicos de la diana y cebadores universales. Los cebadores específicos de la diana (también denominados en la presente memoria “cebadores específicos de genes” o “cebadores de horquilla” ) de la presente invención comprenden tres componentes críticos: una secuencia específica de la diana para hibridar específicamente con las secuencias genéticas de elección, una secuencia adaptadora para permitir la amplificación universal y una secuencia de “ acoplamiento” que comprende una parte, o la totalidad, de la secuencia específica de la diana. Los cebadores universales comprenden una secuencia adaptadora que se une a la secuencia adaptadora del producto de amplificación específico de la diana y también pueden contener nucleótidos adicionales, tales como, pero sin limitarse a, secuencias utilizables para indexar y secuenciar las secuencias de ADN amplificadas (también denominadas en la presente memoria productos de amplificación o amplicones). En algunos aspectos, el método de amplificación descrito en la presente memoria se realiza como una reacción de un solo tubo, en donde todos los componentes de amplificación, incluidos los cebadores de horquilla y los cebadores universales, están presentes en la mezcla de reacción y se utilizan en pasos secuenciales de la reacción de amplificación basados en los parámetros del método, que se analizarán más adelante.

En general, la secuencia nucleotídica del cebador de horquilla, tal como se describe desde el extremo 3' hasta el extremo 5', puede incluir algunos o todos los siguientes elementos de la secuencia de nucleótidos:

a. Secuencia cebadora específica de la diana: una secuencia específica de la región dirigida de los ácidos nucleicos de la muestra diseñada por un experto en la técnica del diseño de cebadores por PCR. La secuencia de nucleótidos específica de la diana permite un apareamiento de bases específico con la secuencia de nucleótidos diana.

b. Desestabilizador de horquilla específico de un gen: una secuencia opcional que comprende al menos un nucleótido que no es complementario a la secuencia aguas arriba de la parte de la secuencia de ácidos nucleicos diana complementaria a la secuencia cebadora específica de la diana para evitar la introducción de bases complementarias del MI durante la amplificación.

c. Identificador molecular (MI) que comprende una secuencia opcional de nucleótidos semialeatorios o aleatorios.

d. Adaptador que comprende una secuencia de nucleótidos que se utiliza para la hibridación con una secuencia cebadora universal con el propósito de amplificación universal (por ejemplo, amplificar todas o la mayoría de las secuencias de nucleótidos que comprenden uno o más loci de una secuencia complementaria a la secuencia cebadora universal).

e. Desestabilizador de horquilla adaptadora: una secuencia opcional que comprende al menos una base nucleotídica derivada de la parte específica del gen del cebador de horquilla y que no es complementaria a la(s) base(s) inmediatamente 5' de las bases que participan en la estructura secundaria de tallo de horquilla de la parte específica del gen del cebador de horquilla. Por lo tanto, se evita que la secuencia adaptadora participe en la estructura de tallo de horquilla.

f. Acoplamiento: una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una parte, o a la totalidad, de la parte de la secuencia cebadora específica de la diana del cebador de horquilla. La secuencia de acoplamiento es capaz de formar la estructura de tallo de horquilla hibridando con la parte de la secuencia cebadora específica del cebador de horquilla.

g. Desestabilizador de tallo: una secuencia opcional que comprende al menos un nucleótido que no es complementario a la parte 3' de la parte de la secuencia cebadora específica de la diana del cebador de horquilla.

En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de cebadores de horquilla, diseñados para atacar y amplificar específicamente una parte del gen GAPDH. La Tabla I representa el cebador de horquilla directo, GAPDH_9mer.F, y el cebador de horquilla inverso, GAPDH_9mer.R. La secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento están subrayadas. Las secuencias desestabilizadoras de horquilla específicas del gen, las secuencias desestabilizadoras de horquilla adaptadora y las secuencias desestabilizadoras de tallo se representan en negrita. Se representan las secuencias de identificador molecular y las secuencias adaptadoras (estas secuencias no están subrayadas ni en negrita). La longitud de la secuencia cebadora específica de la diana y, por consiguiente, la secuencia de acoplamiento, se determina por la cantidad de secuencia requerida para dirigirse específicamente al ácido nucleico de interés y la estabilidad deseada de la estructura de horquilla secundaria. En algunos aspectos, la longitud de la secuencia cebadora específica de la diana está en el intervalo de 5-30 nucleótidos. En otros aspectos, la longitud de la secuencia cebadora específica de la diana está en el intervalo de 10-20 nucleótidos.

En aun otros aspectos, la longitud de la secuencia cebadora específica de la diana es de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos.

En la figura 1 se ilustra un ejemplo de la estructura secundaria de horquilla de un cebador de horquilla. El tallo de horquilla se forma mediante el apareamiento de bases complementarias de la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento, que comprenden secuencias de nucleótidos específicas de la diana. Los pares de bases de adenina-timina están marcados con puntos azules y los pares de bases de guanina-citosina están marcados con puntos rojos. Las secuencias desestabilizadoras de horquilla específicas de genes, A-G en el extremo 5' y G-A en el extremo 3', no forman parte del tallo de horquilla. El bucle en horquilla comprende algunos o todos los demás elementos de secuencia del cebador de horquilla, como el desestabilizador de horquilla específico de un gen, el identificador molecular, el adaptador y/o el desestabilizador de horquilla adaptadora específica del gen.

Haciendo referencia ahora a los cebadores universales, su secuencia de nucleótidos, tal como se describe desde el extremo 3' hasta el extremo 5', puede incluir algunos o todos los siguientes elementos:

a. Adaptador universal: la secuencia adaptadora universal comprende toda, o una parte, de la secuencia adaptadora del cebador o cebadores de horquilla utilizados en la misma reacción de amplificación (por ejemplo, reacción de PCR).

b. Adaptador de aplicaciones que es un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos utilizable para cualquier aplicación aplicable de productos de reacción de amplificación o genoteca genómica. Tales aplicaciones incluyen, pero no se limitan a, la indexación, la codificación de códigos de barras, la secuenciación, la fijación de una etiqueta para la detección, purificación o cuantificación de los productos de amplificación, o la creación de secuencias adicionales para aplicaciones posteriores, como la secuenciación de próxima generación.

En la Tabla 1 se representa un ejemplo de cebadores universales, diseñados para amplificar los productos de amplificación (amplicones) de los cebadores de horquilla de la Tabla 1. La Tabla 1 describe el cebador universal directo, Universal 500.F, y el cebador universal inverso, Universal 700.R. En la realización representada en la Tabla 1, Universal 500.F y Universal 700.R comprenden secuencias cebadoras universales y adaptadores terminales emparejados de Illumina. Los adaptadores de extremo emparejado generalmente permiten aplicaciones basadas en Illumina, como la secuenciación de extremos emparejados.

La Tabla 1, que comprende realizaciones de cebadores universales y de horquilla, se representa a continuación:

En la realización de cebadores de horquilla que se muestra en la Tabla 1, la secuencia de bases nucleotídicas MI está representada por la secuencia de letras, en donde cada letra representa una base nucleotídica en un 9mer semialeatorio. En esta realización, N puede ser cualquier base nucleotídica, sin embargo, las posiciones 1, 4 y 7 (representadas por la letra W) están restringidas a ATP o TTP. En otros aspectos, la secuencia de bases nucleotídicas MI está representada por la secuencia de letras NWNNWNNWN o la secuencia de letras NNWNNWNNW. En estos aspectos, las posiciones 2, 5 y 8 o las posiciones 3, 6 y 9, respectivamente, están restringidas a ATP o TTP. Las bases subrayadas en dicha realización forman la estructura del tallo de horquilla, y las bases intermedias forman el bucle (como se ilustra en la figura 1). Haciendo referencia ahora a la realización de cebadores universales representada en la Tabla 1, las N en cursiva representan una secuencia de bases nucleotídicas de 8 meros, que puede utilizarse, por ejemplo, como código de barras de indexación; sin embargo, esta parte del cebador universal no se limita a

el uso mencionado anteriormente, y puede ser más largo o más corto según el uso previsto. De hecho, en la presente memoria se contemplan cebadores universales con un adaptador universal más corto o una secuencia de códigos de barras de indexación más corta. En la realización mostrada en la Tabla 1, las secuencias adaptadoras de aplicaciones de los cebadores universales son las secuencias de células de flujo PS y P7 que están diseñadas para su secuenciación en un instrumento Illumina.

La expresión “ secuencia cebadora universal” generalmente se refiere a un sitio de unión al cebador, por ejemplo, una secuencia cebadora que se esperaría que hibridara (par de bases) con, y cebe, uno o más loci de secuencia complementaria, si está presente, en cualquier fragmento de ácido nucleico.

El “ código de barras” o la “ secuencia de código de barras” , como se denominan en la presente memoria, son secuencias de polinucleótidos que son únicas, es decir, distinguibles de otras secuencias de códigos de barras. Las secuencias pueden tener cualquier longitud adecuada que sea suficiente para distinguir la secuencia de códigos de barras de otras secuencias de códigos de barras. Una secuencia de código de barras puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 nucleótidos o más. En algunos aspectos, los códigos de barras están predefinidos y se seleccionan al azar. Los cebadores pueden ser suministrados por cualquier proveedor de síntesis de oligonucleótidos.

Cebadores de horquilla y cebadores universales, y método de amplificación de los mismos

En algunos aspectos, la horquilla y los cebadores universales de la presente invención se utilizan para preparar una genoteca específica de una diana a partir de ácidos nucleicos de muestra al utilizar una reacción basada en la amplificación. En algunos aspectos, la reacción de amplificación es una reacción de un solo tubo (reacción única). En algunos aspectos, la reacción de amplificación se multiplexa (se selecciona más de una diana). La amplificación, como se utiliza en la presente memoria, generalmente se refiere a métodos para crear copias de ácidos nucleicos mediante el uso de ciclado térmico para exponer los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento, y para permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura (por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Como se utiliza en la presente memoria, los ácidos nucleicos de la muestra pueden incluir cualquiera de una amplia variedad de ácidos nucleicos, que incluyen, por ejemplo, ADN y ARN, e incluyen específicamente, por ejemplo, ADN genómico, ADNc, ARNm, Ar N total y ADNc creado a partir de un transcrito de ARNm o ARN total. El ácido nucleico de la muestra puede derivarse, o prepararse, al utilizar métodos conocidos en la técnica, a partir de cualquiera de las muestras, o muestras biológicas, de la presente descripción.

En algunos aspectos, la reacción de amplificación descrita en la presente memoria incluye muestras de ácidos nucleicos, reactivos de amplificación, los cebadores de horquilla de la presente descripción, los cebadores universales de la presente descripción y una polimerasa. El término “ reactivos de amplificación” abarca, sin limitación, los dNTP (mezcla de los nucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP), tampones, detergentes o disolventes, según sea necesario. La polimerasa utilizada en el método de reacción de amplificación descrito en la presente memoria es generalmente una ADN polimerasa, y puede seleccionarse entre, pero no se limita a, ADN polimerasa Taq, polimerasa Phusion o polimerasa Q5.

En algunos aspectos, el método de amplificación incluye ciclos de amplificación iniciales diseñados para la amplificación de dianas específicas, y ciclos de amplificación posteriores diseñados para la amplificación uniforme de los productos de amplificación de dichos ciclos iniciales. Más específicamente, la temperatura de apareamiento o extensión de la secuencia cebadora específica de la diana, la temperatura de apareamiento o extensión del adaptador universal y la temperatura de desnaturalización de la estructura secundaria de horquilla se diseñan de tal modo que el tallo de horquilla quede abierto durante los ciclos iniciales de apareamiento y síntesis de ADN (el término “ síntesis de ADN” también se denomina aquí “extensión” ), pero estará en la estructura de horquilla secundaria en los ciclos de amplificación posteriores, en los que tiene lugar la amplificación universal. En algunos aspectos, la diferencia de temperatura entre los ciclos de amplificación iniciales diseñados específicamente para la amplificación diana y los ciclos de amplificación posteriores diseñados para la amplificación uniforme de los productos de amplificación de dichos ciclos iniciales, está en el intervalo de aproximadamente 0-20 0C. En otros aspectos, la diferencia de temperatura entre los ciclos de amplificación iniciales diseñados específicamente para la amplificación diana y los ciclos de amplificación posteriores diseñados para la amplificación uniforme de los productos de amplificación de dichos ciclos iniciales, está en el intervalo de aproximadamente 5-15 0C. En aun otros aspectos, la diferencia de temperatura entre los ciclos de amplificación iniciales diseñados específicamente para la amplificación diana y los ciclos de amplificación posteriores diseñados para la amplificación uniforme de los productos de amplificación de dichos ciclos iniciales, puede ser de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 0C. La diferencia de temperatura precisa depende de la longitud de la secuencia cebadora específica del gen y de la secuencia adaptadora universal. En algunos aspectos, el cambio de temperatura de apareamiento/extensión descrito anteriormente se producirá durante los ciclos de amplificación de ADN de transición que siguen a los ciclos de amplificación de ADN específicos de la diana y preceden a los ciclos de amplificación de ADN universales.

En la figura 2 se ilustra una realización del presente método de amplificación para la amplificación en un tubo (una reacción) de ácidos nucleicos diana y la creación de genotecas de secuenciación dirigida de los mismos. El ciclado térmico con los cebadores de horquilla específicos de la diana y los cebadores universales comprende los siguientes pasos:

Una amplificación específica de un gen (también denominada en la presente memoria “específica de la diana” ): Se realizan al menos dos ciclos de apareamiento/extensión con una temperatura que es igual o superior a la temperatura de desnaturalización de la estructura de tallo de horquilla de los cebadores de horquilla y dentro del intervalo de apareamiento de la secuencia cebadora específica del gen. Después de dos ciclos, se forman amplicones completos como resultado de la amplificación de las secuencias dirigidas. Cada amplicón contiene las mismas estructuras de horquilla que los cebadores de horquilla que prepararon su síntesis. En algunos aspectos, se realizan ciclos de amplificación adicionales específicos de la diana para mejorar la eficiencia de la amplificación. Por ejemplo, se pueden realizar 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ciclos de amplificación específicos de la diana, según sea necesario.

B. Amplificación de ADN de transición (en la figura 2 marcada como “Transición” ): En algunos aspectos del paso de amplificación del ADN de transición, se realizan al menos dos ciclos de amplificación del ADN a una temperatura (o temperaturas) de apareamiento/extensión más baja que la temperatura de apareamiento/extensión específica del gen utilizada en el paso A, pero más alta que la temperatura de apareamiento/extensión de la amplificación universal utilizada en el paso C. En otros aspectos del paso de amplificación del ADN de transición, se realizan al menos dos ciclos de apareamiento/extensión a una temperatura (o temperaturas) que está en el intervalo entre la temperatura de apareamiento/extensión específica del gen utilizada en el paso A y la temperatura de apareamiento/extensión de la amplificación universal utilizada en el paso C. En cualquiera de los aspectos anteriormente mencionados del paso de amplificación del ADN de transición, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación del ADN de transición puede disminuir gradualmente con cada ciclo de apareamiento/extensión. Durante la fase de transición, las estructuras secundarias de horquilla solo están parcialmente abiertas, lo que permite que la secuencia adaptadora universal de los cebadores universales se una a la secuencia adaptadora de los amplicones producidos en el paso de amplificación específica de la diana descrita en A. Los amplicones producidos durante el paso de transición ya no contendrán las secuencias de acoplamiento derivadas de la amplificación de los cebadores de horquilla. En algunos aspectos, los amplicones producidos en el paso de transición contienen un adaptador de aplicaciones. En la realización ilustrada en la figura 2, los amplicones contienen adaptadores de aplicaciones que son los adaptadores de secuenciación i7, p7 y p5 i5 de Illumina. En algunos aspectos, el paso de amplificación de a Dn de transición comprende de 2-15 ciclos de amplificación de ADN. En otros aspectos, el paso de amplificación de ADN de transición comprende de 2-10 ciclos de amplificación de ADN. En aun otros aspectos, el paso de amplificación del ADN de transición comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ciclos de amplificación del ADN.

C. Amplificación universal: en algunos aspectos del paso de amplificación universal, el apareamiento/extensión se realiza a una temperatura inferior a la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación específica de la diana y los pasos de amplificación del ADN de transición. En algunos aspectos del paso de amplificación universal, el apareamiento/extensión se realiza a una temperatura igual a la temperatura utilizada durante todos o algunos de los ciclos de apareamiento y extensión de la amplificación del ADN de transición. Por lo tanto, las estructuras de horquilla secundarias de los cebadores de horquilla y cualquier amplicón de la amplificación específica de la diana se mantienen generalmente en una forma de estructura secundaria. Las secuencias adaptadoras universales, y opcionalmente las secuencias adaptadoras de cualquier aplicación, de los cebadores universales pueden hibridarse (pares de bases) con secuencias complementarias de los amplicones producidos en la fase de transición del paso B, y propiciar la amplificación universal de dichos amplicones. Los productos de amplificación resultantes (también denominados en la presente memoria “genoteca de secuenciación dirigida” ), tal como se ejemplifica en la figura 2, son secuencias de interés que contienen al menos un MI, una secuencia adaptadora universal y un adaptador de aplicación, y están listos para su procesamiento y análisis.

Como se utiliza en la presente memoria, la amplificación del ADN comprende los pasos de desnaturalizar la muestra de ADN, aparear el cebador de horquilla con el ADN para permitir la formación de un híbrido de cebador de ADN e incubar el híbrido de cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un producto de amplificación. Los pasos de aparear el cebador de horquilla con el ADN para permitir la formación de un híbrido cebador de ADN e incubar el híbrido cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un producto de amplificación se denominan generalmente en la presente memoria “ apareamiento/extensión” . Por lo tanto, un cierto número de ciclos de amplificación de ADN significaría el mismo número de ciclos de apareamiento/extensión, y viceversa.

En algunos aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación específica de la diana permite que aproximadamente el 0-50 % de los cebadores de horquilla retengan su estructura de horquilla secundaria. En otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación específica de la diana permite que aproximadamente el 0-30 % de los cebadores de horquilla retengan su estructura de horquilla secundaria. En aun otros aspectos, el apareamiento o extensión del paso de amplificación específica de la diana permite que aproximadamente el 0-15 % de los cebadores de horquilla retengan su estructura secundaria de horquilla. En aun otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación específica de la diana permite que aproximadamente el 0 %, el 1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 7 %, el 10 %, el 12 % o el 15 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura de horquilla secundaria.

En algunos aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación del ADN de transición permite que aproximadamente el 50-100 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura secundaria de horquilla. En otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación del ADN de transición permite que aproximadamente el 70-100 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura secundaria de horquilla. En aun otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación del ADN de transición permite que aproximadamente el 85-100 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura secundaria de horquilla. En aun otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación del ADN de transición permite que aproximadamente el 100 %, el 99 %, el 98 %, el 97 %, el 96 %, el 95 %, el 93 %, el 90 % o el 85 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura de horquilla secundaria.

En algunos aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación universal permite que aproximadamente el 70-100 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura de horquilla secundaria. En otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación universal permite que aproximadamente el 85-100 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura de horquilla secundaria. En aun otros aspectos, la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación universal permite que aproximadamente el 100 %, el 99 %, el 98 %, el 97 %, el 96 %, el 95 %, el 93 %, el 90 % o el 85 % de los cebadores de horquilla conserven su estructura de horquilla secundaria.

En algunos aspectos, la amplificación de ácidos nucleicos diana actualmente descritas y la creación de genotecas de secuenciación dirigida de los mismos se multiplexan, por ejemplo, se dirige a más de una secuencia de ácido nucleico. En los aspectos en donde el método de amplificación de los ácidos nucleicos diana se multiplexa, se diseña un par de cebadores de horquilla (directos e inversos) específicos de la diana, como se ha descrito anteriormente, y se sintetiza para cada diana de interés, en donde cada uno de dichos pares puede comprender secuencias de identificación únicas, tales como secuencias Mis o códigos de barras. En algunos aspectos de la amplificación multiplexada de ADN específico para una diana, las secuencias de los cebadores de horquilla de la reacción se diseñan generalmente de modo que sus estructuras secundarias de horquilla tengan temperaturas de desnaturalización similares. En algunos aspectos de la amplificación multiplexada de ADN específico para una diana, los cebadores universales se diseñan de modo que puedan amplificar todos los amplicones del paso de amplificación específica del gen o, alternativamente, cada par de cebadores universales puede amplificar los amplicones creados por un par específico de cebadores de horquilla.

Métodos de PCR

Una característica de ciertos métodos descritos en la presente memoria es el uso de un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la presencia de ciertos oligonucleótidos y/o genes, por ejemplo, oncogén(es) presente(s) en las células. Los ejemplos de ensayos de interés basados en PCR incluyen, pero no se limitan a, PCR cuantitativa (qPCR), PCR fluorescente cuantitativa (QF-PCR), PCR fluorescente de multiplexado (MF-PCR), PCR digital en gotitas (ddPCR), PCR de células individuales, PCR-R<f>LP/PCR-RFLP en tiempo real, PCR de inicio en caliente, PCR anidada, PCR de polonía in situ, amplificación por círculo rodante in situ (RCA), PCR puente, PCR con picotítulos, PCR en emulsión y PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación de la transcripción, replicación de secuencias autosostenida, amplificación selectiva de las secuencias de polinucleótidos diana, reacción en cadena de la polimerasa (CP-PCR) cebada con secuencias consenso, reacción en cadena de la polimerasa (AP-PCR) cebada arbitrariamente, PCR cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) y amplificación de secuencias basada en ácidos nucleicos (NAB SA).

Se puede usar un ensayo basado en PCR para detectar la presencia de ciertos genes, tales como ciertos oncogenes. En dichos ensayos, uno o más cebadores específicos para cada gen de interés se hacen reaccionar con el genoma de cada célula. Estos cebadores tienen secuencias específicas para el gen en particular, de modo que solo hibridarán e iniciarán la PCR cuando sean complementarios al genoma de la célula. Si el gen de interés está presente y el cebador es compatible, se crean muchas copias del gen. Para determinar si un gen en particular está presente, los productos de PCR pueden detectarse mediante un ensayo que analice el líquido de la gotita monodispersa, por ejemplo, tiñendo la solución con un colorante intercalante, como SybrGreen o bromuro de etidio, hibridando los productos de PCR con un sustrato sólido, tal como una perla (por ejemplo, perlas magnéticas o fluorescentes, tales como las perlas Luminex), o detectándolos mediante una reacción intermolecular, tal como FRET. Estos colorantes, perlas y similares son cada uno un ejemplo de un “componente de detección” , un término que se usa de manera amplia y genérica en la presente memoria para referirse a cualquier componente que se usa para detectar la presencia o ausencia de productos de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, productos de PCR.

Métodos de amplificación y entornos de amplificación de los mismos

Los métodos descritos en la presente memoria pueden realizarse en una variedad de volúmenes de reacción, en donde un volumen para los fines de la presente invención es, en general, un volumen en el que los reactivos se arrastran o se dividen de forma liberable de otro modo. En algunos aspectos, los presentes métodos de amplificación son particularmente adecuados para reacciones de división de agua en aceite de tamaño nanolitro, tales como emulsiones, gotitas generadas microfluídicamente o divisiones instantáneas (PIP) premodeladas. Los pequeños volúmenes de reacción mencionados anteriormente, en combinación con la carga de dianas de ácido nucleico según las estadísticas de Poisson, dan como resultado la presencia de dianas amplificables de O o I en cada reacción en promedio. Además, las reacciones divididas reducen la cantidad de reactivos de muestra y ensayo (tales como dNTP, regulador y polimerasa) requerida para la reacción de amplificación y aumentan la sensibilidad del ensayo en comparación con los ensayos de PCR convencionales.

Los métodos descritos en la presente memoria son compatibles con los métodos conocidos en la técnica para la preparación de divisiones. Tales métodos incluyen una variedad de enfoques tales como, sin limitarse a, agitación, agitación en vórtex, utilización de chips microfluídicos y/o dispositivos asociados, o la introducción de partículas a microescala (a veces denominadas perlas) que moldeen la formación de divisiones uniformes (PIP).

Partículas/perlas y divisiones

Los métodos de la presente descripción se pueden utilizar con cualquier entorno de amplificación adecuado, incluyendo perlas/partículas, divisiones y combinaciones de los mismos.

En particular, las perlas/partículas pueden proporcionar una superficie a la que los reactivos se unen de forma liberable, o un volumen en el que los reactivos se arrastran o se dividen de otro modo de forma liberable. Los ejemplos no limitativos de tales reactivos incluyen, por ejemplo, enzimas, polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, reactivos de etiquetado, por ejemplo, colorantes, fluoróforos, cromóforos, etc., ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos y cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunos casos, las perlas pueden proporcionar una superficie sobre la que sintetizar o unir secuencias de oligonucleótidos. Diversas entidades, incluyendo oligonucleótidos, secuencias de códigos de barras, cebadores, reticulantes y similares, pueden estar asociadas con la superficie exterior de una perla. En el caso de perlas porosas, una entidad puede estar asociada con las superficies exterior e interior de una perla. Las entidades pueden unirse directamente a la superficie de una perla (por ejemplo, mediante un enlace covalente, un enlace iónico, interacciones de van der Waals, etc.), pueden unirse a otras secuencias de oligonucleótidos unidas a la superficie de una perla (por ejemplo, un adaptador o cebadores), pueden difundirse por todo el interior de una perla y/o pueden combinarse con una perla en una división (por ejemplo, una gotita fluídica). En algunos aspectos, los oligonucleótidos (tales como los cebadores) están unidos covalentemente a sitios dentro de la matriz polimérica de la perla y, por lo tanto, están presentes en el interior y el exterior de la perla. En algunos casos, una entidad tal como una célula o un ácido nucleico se encapsula dentro de una perla. Otras entidades, incluidos los reactivos de amplificación (por ejemplo, reactivos de PCR, cebadores) también pueden difundirse por toda la perla o unirse químicamente dentro del interior (por ejemplo, a través de poros, unión covalente a la matriz polimérica) de una perla.

En algunos aspectos, las partículas se utilizan para preparar microambientes de reacción significativamente uniformes (tal como una reacción de amplificación según los métodos descritos actualmente). Las partículas, o perlas, pueden ser porosas o no porosas. La partícula puede incluir microcompartimentos, que pueden contener componentes y/o reactivos adicionales, por ejemplo, componentes y/o reactivos adicionales que pueden liberarse en gotitas monodispersas.

Ejemplo 1: Demostración de horquilla

En una realización del presente método, las temperaturas de fusión (desnaturalización) de la estructura secundaria de horquilla son 4 °C más altas que la temperatura de apareamiento/extensión del paso de amplificación específica del gen. Las secuencias cebadoras específicas de la diana de los cebadores de horquilla están diseñadas para amplificar una parte de 57 libras del gen GAPDH (la secuencia cebadora se describe en la Tabla 1). Las reacciones se preparan al utilizar regulador Ix Phusion GC y polimerasa Phusion, dNTP 0,2 mM, ADN genómico humano I Ong o agua libre de nucleasas, cebadores de horquilla GAPDH 400 nM descritos en la Tabla 1 y DMSO al 3 % o agua libre de nucleasas. Se plantea la hipótesis de que, al facilitar la relajación de la horquilla, la presencia de DMSO daría como resultado una amplificación más eficiente que sin su presencia. El ciclado (ciclo térmico) se realiza con todos los ciclos a la misma temperatura de apareamiento/extensión sin la presencia de cebadores universales: 98 0C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 0C durante 1 minuto y apareamiento/extensión a 50 0C, 56 0C, 62 0C, 68 0C o 72 0C durante 2 minutos. Tras el ciclado, las reacciones se diluyen 1:5 en agua y se cargan en un gel E-GEL EX de agarosa al 2 % (figura 3).

Los cebadores de horquilla están diseñados de modo que las partes de la secuencia cebadora específica de la diana de los cebadores no estén disponibles para la amplificación a temperaturas de apareamiento más bajas, pero la estructura de horquilla se desnaturaliza con un aumento de temperatura. En presencia de DMSO, la estructura de horquilla es más relajada, lo que da como resultado más producto de amplificación que en la reacción sin DMSO. Las estructuras de horquilla de los cebadores de horquilla utilizados en gran medida permanecen sin desnaturalizar a temperaturas inferiores a 72 °C, incluso en presencia de DMSO. A 72 0C, la estructura de horquilla se desnaturaliza y las secuencias cebadoras específicas de la diana pueden amplificar la diana de interés.

Ejemplo 2: Demostración de horquilla

En otra realización del experimento del ejemplo 1, se mantuvo la misma parte de secuencias de cebador específicas de la diana de los cebadores de horquilla; sin embargo, las temperaturas de fusión de la estructura secundaria de horquilla más bajas se diseñaron modificando las secuencias de acoplamiento. La amplificación con los cebadores de horquilla se realizó al utilizar dos tampones diferentes proporcionados por el fabricante de la enzima (polimerasa). El apareamiento/extensión se realiza a 55 0C, 59 0C, 63 0C, 67 0C o 72 0C para todos los ciclos. Aparte de eso, el diseño del experimento es el mismo que el descrito en el Ejemplo 1. Tras completar el ciclado, las reacciones se diluyeron 1:5 en agua y se cargaron en un gel E-GEL EX de agarosa al 2 % (figura 4). Como se ha visto con el conjunto de cebadores específicos de la GAPDH del Ejemplo I, las temperaturas de desnaturalización del acoplamiento en horquilla se pueden adaptar al sistema regulador y, como también se ha visto en el experimento del Ejemplo I, los acoplamientos pueden engancharse completamente (mantener la estructura de tallo) por debajo de temperaturas específicas para impedir la amplificación utilizando los cebadores de horquilla. Como resultado de un menor rendimiento del producto, el regulador 2 contiene una composición diferente para la PCR, lo que hace que los acoplamientos se activen más a 59 0C que el regulador 1. A 67 0C y 70 0C, los acoplamientos están abiertos (desnaturalizados) en ambas reacciones (regulador 1 y regulador 2) para permitir una amplificación similar a ambas temperaturas.

Ejemplo 3: Construcción de genotecas Singleplex

Con la adición de MIS, cebadores de secuenciación (tales como cebadores universales) e índices de muestra (tales como códigos de barras), el tamaño final esperado de la genoteca para los productos de amplificación específicos de la GAPDH según el método del ejemplo I es de 725 pares de bases. Las amplificaciones en un tubo se realizan utilizando los cebadores universales y de horquilla descritos en la Tabla 1. Las reacciones de amplificación se preparan únicamente con cebadores de horquilla o con cebadores universales y de horquilla. Para las reacciones con ambos conjuntos de cebadores, las reacciones se preparan con 30 ng de ADN genómico humano o agua libre de nucleasas para controles sin molde (NTC). Las reacciones incluyen los siguientes componentes: Ix regulador de PCR de alta fidelidad de Fluent Biosciences, cebadores GAPDH, cebadores universales, dNTP de 0,2 mM, DMSO, Triton X-100 al 0,5 % y polimerasa de alta fidelidad de Fluent Biosciences. Las condiciones de ciclado son las siguientes: 98 0C durante 2 minutos, 2 ciclos de 98 0C durante 1 minuto y 72 °C durante 6 minutos, un ciclo cada uno de 98 0C durante 1 minuto seguido de 72 0C, 70 0C, 68 0C, 66 0C, 64 0C o 62 0C durante 3 minutos (una disminución de 2 0C para cada ciclo durante seis ciclos) y 30 ciclos de 98 0C durante 30 segundos y 62 0C durante 90 segundos. Tras el ciclado, las reacciones se diluyeron 1:5 en agua y se cargaron en un E-GEL EX de agarosa al 2 % para su visualización mediante electroforesis en gel (figura 5). En general, los 98 0C durante 2 minutos, 2 ciclos de 98 0C durante 1 minuto y 72 0C durante 6 minutos son una realización de la fase específica del gen, un ciclo de 98 0C durante 1 minuto seguido de 72 0C, 70 0C, 68 0C, 66 0C, 64 0C o 62 0C durante 3 minutos (una disminución de 2 0C para cada ciclo durante seis ciclos) es una realización de la fase de transición, y los 30 ciclos de 98 0C para 30 segundos y 62 0C durante 90 segundos es una realización de la fase de amplificación universal.

Las condiciones de ciclado están estructuradas de tal modo que las estructuras de horquilla se desnaturalizan a 72 0C, lo que permite que las porciones específicas del gen se amplifiquen a partir del molde (ADN genómico humano). Los productos (amplicones) de los ciclos de amplificación de fases específicas para genes contienen horquillas; por lo tanto, las horquillas de los amplicones deben estar parcialmente abiertas para que los cebadores universales las ceben (apareando y permitiendo la síntesis de ADN a partir del amplicón completo para crear la genoteca). Para ello, no solo es necesario desnaturalizar parcialmente las estructuras de horquilla durante la fase de transición, sino que también los adaptadores universales deben diseñarse de modo que puedan recocerse (par de bases) en el mismo rango de temperatura. Durante la fase de transición, la temperatura se reduce gradualmente para cerrar completamente las horquillas, evitando que los cebadores universales se unan a los amplicones que incluyen la estructura de horquilla y, por lo tanto, no son la genoteca completamente construida.

Como se mencionó anteriormente, para demostrar la construcción de la genoteca en un solo tubo (enfoque de una reacción), la amplificación por PCR se realizó con y sin la presencia de los cebadores universales en la reacción de amplificación. En los tres primeros carriles después de la escalera (no se incluyen los cebadores universales) de la figura 5, no se observa ningún producto en el gel. Los cebadores específicos de un gen no pueden activarse (aparearse) en ciclos posteriores (de las fases de transición y amplificación universal) debido a la presencia de una estructura secundaria de horquilla, que inhibe la amplificación. Por el contrario, en presencia de cebadores universales (carriles 5-7), se observa en el gel un producto del tamaño de genoteca apropiado (725 pb). Cabe destacar que la adición de DMSO aumenta el rendimiento, principalmente al relajar la estructura secundaria durante los ciclos iniciales específicos del gen y nuevamente en los ciclos de transición cuando los cebadores universales se activan.

Ejemplo 4: Demostración de multiplexado

Para demostrar el presente método con múltiples dianas, se diseñaron seis pares (un par incluye un cebador directo y un cebador inverso, diseñados para amplificar una parte específica de la secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, los cebadores Gapdh_9mer.f y Gapdh_9mer.R, ambos descritos en la Tabla I) de cebadores de horquilla utilizando los requisitos de diseño detallados en la presente descripción para generar seis amplicones específicos. Las reacciones de amplificación de genotecas de un solo tubo se realizaron al utilizar lo siguiente: regulador de PCR de alta fidelidad Ix Fluent Biosciences, cebadores de horquilla (IDT), cebadores universales (IDT), dNTP de 0,2 mM (ThermoFisher, número de catálogo R0192) y polimerasa de alta fidelidad de Fluent Biosciences. Las condiciones de ciclado se realizaron de la siguiente forma: 98 0C durante 2 minutos, 2 ciclos de 98 0C durante 1 minuto y 72 0C durante 6 minutos, un ciclo cada uno de 98 0C durante 1 minuto seguido de 70 0C, 68 0C, 66 0C, 64 0C o 62 0C durante 3 minutos y 36 ciclos de 98 0C durante 30 segundos y 62 0C durante 90 segundos.

En general, 98 0C durante 2 minutos, 2 ciclos de 98 0C durante 1 minuto y 72 0C durante 6 minutos son una realización de la fase específica del gen, un ciclo cada uno de 98 0C durante 1 minuto seguido de 70 0C, 68 0C, 66 0C, 64 0C o 62 0C durante 3 minutos es una realización de la fase de transición, y los 36 ciclos de 98 0C durante 30 segundos y 62 °C durante 90 segundos son una realización de la amplificación universal fase.

Para preparar las genotecas para la secuenciación, los productos de amplificación se purifican mediante una limpieza con perlas magnéticas y las genotecas se cuantifican mediante fluorescencia. Tras la limpieza, las genotecas están listas para la secuenciación. El proceso general requiere solo una amplificación y limpieza por PCR, lo que resulta en un tiempo de proceso de aproximadamente cuatro horas desde el ADN extraído hasta la genoteca secuenciable.

Sin limitar la descripción anterior, a continuación se proporcionan ciertos aspectos no limitativos de la divulgación. Como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada uno de los aspectos numerados individualmente puede utilizarse o combinarse con cualquiera de los aspectos numerados individualmente anteriores o siguientes. Esto tiene la intención de proporcionar soporte para todas estas combinaciones de aspectos y no se limita a las combinaciones de aspectos que se proporcionan explícitamente a continuación:

Los aspectos de la descripción proporcionan un método de preparación de la genoteca. El método incluye dividir una mezcla que comprende un ácido nucleico, un cebador de horquilla y una polimerasa en una pluralidad de divisiones, en donde el cebador de horquilla comprende una estructura de horquilla que inhibe las interacciones no específicas con el cebador de horquilla; aparear, dentro de una de las divisiones, el cebador de horquilla con el ácido nucleico; y realizar una reacción de amplificación para extender el cebador de horquilla apareado con la polimerasa, creando de este modo un amplicón. El método puede incluir además realizar una segunda reacción de amplificación con un cebador universal que incluye una secuencia de acceso complementaria a una parte del amplicón. Preferiblemente, las divisiones son gotitas acuosas rodeadas de aceite dentro de un tubo. La división, la reacción de amplificación y la segunda reacción de amplificación pueden realizarse dentro del tubo y sin lisar o liberar el contenido de las gotitas. En algunos aspectos, la división se logra agitando el tubo en vórtex. La mezcla puede incluir además una pluralidad de perlas que moldeen la formación de las gotitas. En ciertos aspectos, la reacción de amplificación se realiza a una primera temperatura y la segunda reacción de amplificación se realiza a una segunda temperatura inferior a la primera temperatura e inferior a una tercera temperatura a la que la estructura de horquilla se desnaturaliza. En ciertos aspectos, la primera temperatura está en el intervalo de aproximadamente 50-70 grados C y la segunda temperatura está en el intervalo de aproximadamente 55-80 grados C. En algunos aspectos, el cebador universal comprende además una o más de una secuencia de indexación, una secuencia de códigos de barras y un adaptador de secuenciación. El cebador de horquilla puede incluir una secuencia de identificador molecular. En algunos aspectos, la estructura de horquilla inhibe la amplificación no específica de secuencias mediante cebado aleatorio a través de la secuencia de identificador molecular. Las divisiones pueden comprender emulsiones pipeteadas o gotitas generadas microfluídicamente. En algunos aspectos, la mezcla comprende además un cebador universal, comprendiendo el cebador universal una secuencia de identificador molecular y una secuencia de cebado que es complementaria a una parte del amplicón. Preferiblemente, la estructura de horquilla del cebador de horquilla evita el cebado no específico a través de la secuencia de identificador molecular.

Los aspectos proporcionan un cebador de horquilla para amplificar un ácido nucleico diana o un complemento inverso del mismo, comprendiendo el cebador de horquilla: (a) una secuencia cebadora específica de la diana que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una parte de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana; (b) una secuencia adaptadora; (c) una secuencia de acoplamiento que comprende una secuencia complementaria a dicha secuencia cebadora específica de la diana; en donde las secuencias (a) a (c) están dispuestas desde el extremo 3' hasta el extremo 5' de dicho cebador de horquilla;

en donde dicha secuencia cebadora específica de la diana y dicha secuencia de acoplamiento complementaria son capaces de hibridarse, lo que permite que dicho cebador de horquilla forme una estructura de horquilla secundaria; y, en donde la secuencia cebadora específica de la diana y la secuencia de acoplamiento, cuando se hibridan, forman la parte de tallo de dicha estructura de horquilla. La secuencia adaptadoras puede comprender una secuencia cebadora universal. La secuencia de bloqueo puede ser complementaria a una parte, o a la totalidad, de la secuencia cebadora específica de la diana. El cebador de horquilla puede incluir una secuencia desestabilizadora de horquilla específica del gen ubicada en 5' de la secuencia cebadora específica de la diana, en donde la secuencia desestabilizadora de horquilla específica del gen comprende al menos un nucleótido que no es complementario a la secuencia aguas arriba de la parte de la secuencia de ácido nucleico diana complementaria a la secuencia cebadora específica de la diana. El cebador de horquilla puede incluir además una secuencia de identificador molecular (MI) ubicada en 5' de la secuencia desestabilizadora de horquilla específica del gen. La secuencia de MI puede ser un N-mero semialeatorio (N puede ser, por ejemplo, un número entero entre 4 y 20, preferiblemente entre 6 y 12); en donde dicho Nmero comprende opcionalmente tres posiciones de secuencia predeterminadas en las que las bases nucleotídicas están restringidas a ATP o TTP; y, en donde dichas posiciones de secuencia predeterminadas se seleccionan entre las posiciones de secuencia 1, 4 y 7, las posiciones de secuencia 2, 5 y 8, o las posiciones de secuencia 3, 6 y 9.

El cebador de horquilla puede incluir una secuencia desestabilizadora de horquilla adaptadora ubicada en 5' de la secuencia adaptadora, en donde la secuencia desestabilizadora de horquilla del adaptador comprende al menos un nucleótido derivado de la parte específica del gen del cebador de horquilla, en donde dicho nucleótido no es complementario al primer nucleótido del cebador de horquilla que no participa en el tallo de horquilla.

El cebador de horquilla puede incluir opcionalmente una secuencia desestabilizadora de tallo ubicada en 5' de la secuencia de acoplamiento, en donde la secuencia desestabilizadora de tallo comprende al menos un nucleótido que no es complementario a la parte 3' de la secuencia cebadora específica del cebador de horquilla. En algunos aspectos, la estructura de horquilla secundaria se desnaturaliza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 55-80 0C o la estructura de horquilla secundaria se desnaturaliza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 62 72 0C, por ejemplo, la estructura de horquilla secundaria se desnaturaliza a una temperatura de 62 0C. Opcionalmente, la estructura de horquilla secundaria se desnaturaliza a una temperatura de 72 0C.

Los aspectos proporcionan un método para amplificar el ácido nucleico diana, comprendiendo el método: (a) proporcionar una mezcla de reacción única que comprende: (i) una muestra de ADN, (ii) un cebador de horquilla como se ha descrito anteriormente, (iii) un cebador universal que comprende toda, o parte, de la secuencia adaptadora del cebador de horquilla de (ii) (o complemento inverso del mismo), (iii) reactivos de amplificación y (iv) una ADN polimerasa; (b) someter el ADN de la muestra a una amplificación de ADN en donde el cebador de horquilla se aparea con las secuencias diana para permitir la producción de un producto de amplificación específico de la diana; y (c) someter el producto de amplificación específico de la diana del paso (b) a una amplificación de ADN en donde el cebador universal se aparea con dicho producto de amplificación para permitir la amplificación universal de los productos del paso (b). La muestra de ADN puede derivarse de una muestra biológica, por ejemplo, ADN genómico. Preferiblemente, la ADN polimerasa se selecciona de entre la ADN polimerasa Taq, la polimerasa Phusion o la polimerasa Q. Opcionalmente, la amplificación del ADN del paso (b) va precedida de una incubación desnaturalizante del ADN. La incubación desnaturalizante del ADN se puede realizar a 98 0C durante dos minutos. En ciertos aspectos, la amplificación de ADN del paso (b) comprende los pasos de desnaturalización de la muestra de ADN; aparear el cebador de horquilla con el ADN para permitir la formación de un híbrido ADN-cebador; e incubar el híbrido cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un producto de amplificación. La amplificación del ADN del paso (b) puede repetirse al menos dos veces. En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (b) se realizan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 55-80 °C, en el intervalo de aproximadamente 62-72 0C, o a una temperatura de 62 0C. Puede ser que los pasos de apareamiento y síntesis de<a>D<n>de la amplificación de ADN del paso (b) se realicen a una temperatura de 72 0C. Opcionalmente, la amplificación de ADN del paso (c) comprende los pasos de desnaturalización del ADN que comprenden el producto de amplificación del paso (b); aparear el cebador universal con el producto de amplificación para permitir la formación de un híbrido de ADN-cebador; e incubar el híbrido cebador de ADn para permitir que la ADN polimerasa sintetice un segundo producto de amplificación. En algunos aspectos, la amplificación del ADN del paso (c) se repite al menos veinte o incluso treinta veces. En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (c) se realizan a una temperatura inferior a la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b). En ciertos aspectos, la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación del ADN del paso (c) es inferior a la temperatura requerida para la desnaturalización de la estructura secundaria de horquilla del cebador de horquilla, lo que evita o reduce la probabilidad del apareamiento del cebador de horquilla con los productos de amplificación del paso (b), la muestra de ADN o la secuencia cebadora universal de los cebadores universales. En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (c) se realizan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50-80 0C. Opcionalmente, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN de la amplificación de ADN del paso (c) se realizan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 60-62 0C, por ejemplo, a una temperatura de 62 0C.

El método de amplificación del ácido nucleico diana puede comprender además un paso de amplificación del ADN de transición realizado después del paso (b) y antes del paso (c). El paso de amplificación del ADN de transición puede incluir los pasos de desnaturalizar el ADN que comprende el producto de amplificación del paso (b); aparear el cebador universal o el cebador de horquilla con dicho producto de amplificación para permitir la formación de un híbrido de cebador de ADN; e incubar el híbrido cebador de ADN para permitir que la ADN polimerasa sintetice un producto de amplificación. Opcionalmente, el paso de amplificación del ADN de transición se repite al menos dos veces. Opcionalmente, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación de ADN de transición se realizan a una temperatura inferior a la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b), pero superior a la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (c). Opcionalmente, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación de ADN de transición se realizan a una temperatura en el intervalo entre la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b) y la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (c).

En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación de ADN de transición se realizan a una temperatura en el intervalo entre la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (b) y la temperatura utilizada para los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso (c), y en donde la temperatura de los pasos de apareamiento y síntesis de AD<n>del paso de amplificación de ADN de transición cae gradualmente con cada repetición. Preferiblemente, la probabilidad de hibridación del cebador de horquilla con los productos de amplificación del paso (b) se reduce con cada repetición. En algunos aspectos, los pasos de apareamiento y síntesis de ADN del paso de amplificación de ADN de transición se realizan en la primera repetición a una temperatura de 72 0C, en una segunda repetición a una temperatura de 70 0C, en una tercera repetición a una temperatura de 68 0C, en una cuarta repetición a una temperatura de 66 0C, en una quinta repetición a una temperatura de 64 0C y en una sexta repetición a una temperatura de 62 °C. En algunos aspectos, el cebador universal comprende además una secuencia adaptadora de aplicación. La secuencia adaptadora de aplicación puede incluir una secuencia de indexación, una secuencia de código de barras, una etiqueta para la detección, purificación o cuantificación de los productos de amplificación, o un adaptador de secuenciación para aplicaciones de secuenciación. En algunos aspectos, el cebador universal para amplificar los productos de amplificación es Universal 500.F, y el cebador universal para amplificar el complemento inverso de los productos de amplificación es Universal 700.R. Se pueden utilizar productos de amplificación para preparar una genoteca de secuenciación.

Los aspectos de la descripción proporcionan una composición para la amplificación de ácidos nucleicos. La composición incluye una pluralidad de divisiones acuosas. Una de las divisiones comprende: una perla; un cebador de horquilla que comprende una estructura de tallo y bucle que inhibe la hibridación no específica; un ácido nucleico diana; y una polimerasa. Las divisiones pueden comprender gotitas acuosas formadas y contenidas dentro de un tubo.

Las gotitas se pueden formar agitando el tubo en vórtex. La perla puede moldear la formación de una de las gotitas. Preferiblemente, una división comprende además un cebador universal que incluye una secuencia de identificador molecular y una secuencia de cebado que es complementaria a un amplicón creado al extender el cebador de horquilla apareado al ácido nucleico diana. Preferiblemente, la estructura de tallo y bucle del cebador de horquilla evita el cebado no específico a través de la secuencia de identificador molecular.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método de preparación de genotecas, comprendiendo el método:

dividir una mezcla que comprende un ácido nucleico, un cebador de horquilla y una polimerasa en una pluralidad de divisiones, en donde el cebador de horquilla comprende una estructura de horquilla que inhibe las interacciones no específicas con el cebador de horquilla;

aparear, dentro de una de las divisiones, el cebador de horquilla con el ácido nucleico; y realizar una reacción de amplificación para extender el cebador de horquilla apareado con la polimerasa, creando de este modo un amplicón; y

realizar una segunda reacción de amplificación con un cebador universal que incluye una secuencia de acceso complementaria a una parte del amplicón;

en donde la reacción de amplificación se realiza a una primera temperatura y la segunda reacción de amplificación se realiza a una segunda temperatura inferior a la primera temperatura e inferior a una tercera temperatura a la que la estructura de horquilla se desnaturaliza.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las divisiones son gotitas acuosas rodeadas de aceite dentro de un tubo.
3. El método de la reivindicación 2, en donde la división, la reacción de amplificación y la segunda reacción de amplificación se realizan dentro del tubo y sin lisar ni liberar el contenido de las gotitas.
4. El método de la reivindicación 2, en donde la división se logra agitando en vórtex el tubo.
5. El método de la reivindicación 2, en donde la mezcla comprende además una pluralidad de perlas que moldea la formación de las gotitas.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la primera temperatura está en el intervalo de aproximadamente 50-70 grados C y la segunda temperatura está en el intervalo de aproximadamente 55-80 grados C.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador universal comprende además una o más de una secuencia de indexación, una secuencia de códigos de barras y un adaptador de secuenciación.
8. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador de horquilla comprende una secuencia de identificador molecular; y opcionalmente en donde la estructura de horquilla inhibe la amplificación no específica de secuencias mediante cebado aleatorio a través de la secuencia de identificador molecular.
9. El método de la reivindicación 1, en donde las divisiones comprenden emulsiones pipeteadas o gotitas generadas microfluídicamente.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla comprende además un cebador universal, comprendiendo el cebador universal una secuencia de identificador molecular y una secuencia de cebado que es complementaria a una parte del amplicón.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la estructura de horquilla del cebador de horquilla evita el cebado no específico a través de la secuencia de identificador molecular.
12. Una composición adecuada para la amplificación de ácidos nucleicos mediante el método de la reivindicación 1, comprendiendo la composición: una pluralidad de divisiones acuosas, en donde una de las divisiones comprende:

una perla;

un cebador de horquilla que comprende una estructura de tallo y bucle que inhibe la hibridación no específica;

un ácido nucleico diana;

una polimerasa; y

un cebador universal que incluye una secuencia de cebado que es complementaria a un amplicón creado al extender el cebador de horquilla apareado con el ácido nucleico diana, en donde las divisiones comprenden gotitas acuosas formadas por agitación en vórtex; y en donde la perla moldea la formación de una de las gotitas.
13. La composición de la reivindicación 12, en donde el cebador universal incluye además una secuencia de identificador molecular.
14. La composición de la reivindicación 13, en donde la estructura de tallo y bucle del cebador de horquilla evita el cebado no específico a través de la secuencia de identificador molecular.