ES3021463T3

ES3021463T3 - Dll3/cd3 binding proteins for cancer treatment

Info

Publication number: ES3021463T3
Application number: ES19728454T
Authority: ES
Inventors: Susanne Hipp; Paul Adam; Michael Dziegelewski; Rajkumar Ganesan; Philip Nicholas Gorman; Priyanka Gupta; Pankaj Gupta; Justin Scheer; Vladimir H Voynov
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2018-06-09
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2025-05-27
Anticipated expiration: 2039-06-07
Also published as: JP2021526816A; TW202016151A; US20220251236A1; CL2020003105A1; CN119285788A; EP3802598B1; MX2020013348A; CN119499365A; PE20210321A1; HUE071620T2; JP7133043B2; EP3802598A1; MA52742A; HRP20250443T1; PL3802598T3; JOP20200313A1; AU2019280900B2; IL279235A; US20230295337A1; FI3802598T3

Abstract

La presente divulgación se refiere a anticuerpos biespecíficos DLL3-CD3, caracterizados por sus secuencias. La solicitud también se refiere a los usos de los anticuerpos y sus composiciones, en particular con fines terapéuticos en el campo del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a DLL3/CD3 para el tratamiento de cáncer

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se caracteriza mediante las reivindicaciones adjuntas y se refiere a proteínas de unión multiespecíficas que comprenden una primera unidad de unión a antígeno específica para DLL3 y una segunda unidad de unión a antígeno específica para CD3. La invención se refiere, además, a ácidos nucleicos que codifican para dichas proteínas de unión, a métodos para preparar tales proteínas de unión; a células huésped que expresan o son capaces de expresar tales proteínas de unión, a composiciones que comprenden tales proteínas de unión y a usos de tales proteínas de unión o tales composiciones, en particular con fines terapéuticos en el campo de las enfermedades de cáncer.

INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES

DLL3 es una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la familia de ligandos de Notch. DLL3 participa principalmente en la somitogénesis, en la que se localiza predominantemente en el aparato de Golgi y actúa como un inhibidor de la señalización de Notch, en contraste con los demás miembros de la familia DLL: DLL1 y DLL4, que se localizan sobre la superficie celular. Solo en las células de cáncer, donde DLL3 está sobreexpresado, algunas moléculas de DLL3 escapan a la superficie celular (Dylla, Molecular & Cellular Oncology 2016, vol. 3, n.° 2). Se ha identificado DLL3 como una diana específica tumoral mediante la utilización de varios métodos, p. ej., el análisis de cromatografía líquida (CL)/espectrometría de masas (EM) de tejidos tumorales (documento n.° WO 2014/125273), la secuenciación de ARN (documento n.° WO 2017/021349) y el análisis de inmunohistoquímica (Saunders et al., Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ra136; Saunders et al., AACR 2017; documento n.° WO 2013/126746).

Se ha descrito la expresión de DLL3 en tumores neuroendocrinos, tales como el carcinoma neuroendocrino de células grandes (CNCG), el cáncer de pulmón microcítico (CPM), el cáncer vesical microcítico, el cáncer de próstata neuroendocrino, el cáncer neuroendocrino pancreático y el glioblastoma (Saunders et al., Sci Transl Med). 2015 Aug 26;7(302):302ra136; Saunders et al., AACR 2017).

El CPM representa una indicación de necesidad médica extremadamente alta. El CPM representa el 13 % de los diagnósticos de cáncer de pulmón y presenta un peor pronóstico que el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). Entre los tratamientos convencionales para estos cánceres se incluyen principalmente quimioterapia, radioterapia, cirugía o combinaciones de estos; todavía no se dispone de terapias dirigidas. Aunque la tasa de respuesta inicial a la quimioterapia es alta, muchos pacientes recaen rápidamente con una enfermedad resistente a la quimioterapia, para la que no hay opciones de tratamiento disponibles. A pesar de que se han conseguido mejoras en el tratamiento de estos cánceres en los últimos años, las tasas de supervivencia generales para estos tipos de tumores no han cambiado, por lo que existe una necesidad médica insatisfecha de terapias más específicas y potentes.

Los conjugados de fármaco-anticuerpo (CFA) proporcionan un enfoque para una terapia dirigida. Sin embargo, para DLL3, esta estrategia no resulta preferente debido a la baja expresión en la superficie celular de DLL3 y a la alta tasa de resistencia a la quimioterapia. Debido a que la mayoría de pacientes recaen después del tratamiento de quimioterapia y debido a la baja expresión de DLL3 en la superficie celular, utilizar CFA con diana en DLL3 podría tener limitaciones. Además, los enfoques de CFA frecuentemente presentan toxicidades fuera de diana causadas por el fármaco libre como consecuencia de la inestabilidad o degradación del conector.

Se han realizado intentos para combinar el uso de DLL3 como diana con el uso de otras proteínas como dianas. Por ejemplo, el documento n.° WO2017/021349 describe un constructo de anticuerpo biespecífico que combina la unión a DLL3 humano sobre la superficie de una célula diana con la unión a CD3 humano sobre la superficie de las células T. Sin embargo, no se ha demostrado que tales enfoques tengan éxito y hasta la fecha, no se dispone de terapias dirigidas para el CPM y el glioblastoma, ni para los demás tumores que expresan DLL3.

En vista del mal pronóstico para estos pacientes de cáncer, existe una necesidad de identificación de terapias más eficaces, especialmente terapias eficaces que presenten una mejor tolerabilidad. De esta manera, es un objetivo de la invención para proporcionar agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos de tratamiento que proporcionan determinadas ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o métodos actualmente utilizados y/o conocidos de la técnica. Entre dichas ventajas se incluyen eficaciain vivo,propiedades terapéuticas y farmacológicas mejoradas, mayor especificidad, un perfil de seguridad mejorado, menos efectos secundarios, reducción de la inmunogenicidad y otras propiedades ventajosas, tales como una facilidad mejorada de preparación o reducción de costes del producto, mayor estabilidad/semivida más prolongada, necesidad de regímenes de administración menos frecuente, especialmente en comparación con los fármacos candidatos ya conocidos de la técnica.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en un enfoque de acoplamiento a células T biespecíficas que utiliza proteínas de unión multiespecíficas con un brazo de unión a CD3 sobre células T y un brazo de unión a DLL3 sobre la superficie celular de las células tumorales. A través de la unión simultánea a las células T y las células tumorales, los acopladores de las células T fuerzan la formación de una sinapsis citolítica entre las dos células y de esta manera redirigen la actividad de las células T selectivamente hacia las células diana tumorales.

En un aspecto, la invención proporciona una proteína de unión multiespecífica que comprende una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 y una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde dicha primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 se selecciona del grupo que consiste en i) a iii):

i) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y Cd R de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID N<o>:4 (CDR1), SEQ ID N<o>:5 (CDR2) y<s>E<q>ID<n>O:6 (CDR3),

ii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y C<d>R de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de<s>E<q>ID NO:10 (CDR1),<s>E<q>ID NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (CDR3), y

iii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ iD NO:17 (CDR2) y Se Q ID NO:18 (CDR3).

Se describen adicionalmente en la presente memoria proteínas de unión multiespecífica que comprenden una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 y una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde dicha primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 se selecciona del grupo que consiste en iv) a xviii):

iv) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:19 (CDR1), SEQ ID NO:20 (CDR2) y SEQ ID NO:21 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:22 (CDR1), SEQ iD NO:23 (CDR2) y Se Q ID NO:24 (CDR3),

v) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:25 (CDR1), SEQ ID NO:26 (CDR2) y SEQ ID NO:27 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:28 (CDR1), SEQ iD NO:29 (CDR2) y S<e>Q ID NO:30 (CDR3),

vi) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:31 (CDR1), SEQ ID NO:32 (CDR2) y SEQ ID NO:33 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:34 (CDR1), SEQ iD NO:35 (CDR2) y S<e>Q ID NO:36 (CDR3),

vii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:133 (CDR1), SEQ ID NO:134 (CDR2) y SEQ ID NO:135 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:136 (CDR1), SEQ ID NO:137 (CDR2) y SEQ ID NO:138 (CDR3),

viii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:139 (CDR1), SEQ ID NO:140 (CDR2) y SEQ ID NO:141 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:142 (CDR1), SEQ ID NO:143 (CDR2) y SEQ ID NO:144 (CDR3),

ix) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:145 (CDR1), SEQ ID NO:146 (CDR2) y SEQ ID NO:147 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:148 (CDR1), SEQ ID NO:149 (CDR2) y SEQ ID NO:150 (CDR3),

x) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:151 (CDR1), SEQ ID NO:152 (CDR2) y SEQ ID NO:153 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:154 (CDR1), SEQ ID NO:155 (CDR2) y SEQ ID NO:156 (CDR3),

xi) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:157 (CDR1), SEQ ID NO:158 (CDR2) y SEQ ID NO:159 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:160 (CDR1), SEQ ID NO:161 (CDR2) y SEQ ID NO:162 (CDR3),

xii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:163 (CDR1), SEQ ID NO:164 (CDR2) y SEQ ID NO:165 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:166 (CDR1), SEQ ID NO:167 (CDR2) y SEQ ID NO:168 (CDR3),

xiii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:169 (CDR1), SEQ ID NO:170 (CDR2) y SEQ ID NO:171 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:172 (CDR1), SEQ ID NO:173 (CDR2) y SEQ ID NO:174 (CDR3),

xiv) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:175 (CDR1), SEQ ID NO:176 (CDR2) y SEQ ID NO:177 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:178 (CDR1), SEQ ID NO:179 (CDR2) y SEQ ID NO:180 (CDR3),

xv) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:181 (CDR1), SEQ ID NO:182 (CDR2) y SEQ ID NO:183 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:184 (CDR1), SEQ ID NO:185 (CDR2) y SEQ ID NO:186 (CDR3),

xvi) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:187 (CDR1), SEQ ID NO:188 (CDR2) y SEQ ID NO:189 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:190 (CDR1), SEQ ID NO:191 (CDR2) y SEQ ID NO:192 (CDR3),

xvii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:193 (CDR1), SEQ ID NO:194 (CDR2) y SEQ ID NO:195 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:196 (CDR1), SEQ ID NO:197 (CDR2) y SEQ ID NO:198 (CDR3), y

xviii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:199 (CDR1), SEQ ID NO:200 (CDR2) y SEQ ID NO:201 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:202 (CDR1), SEQ ID NO:203 (CDR2) y SEQ ID NO:204 (CDR3).

En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, la primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un primer dominio variable de cadena pesada y se selecciona del grupo que consiste en i) a iii):

i) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:38,

ii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:40, y

iii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:42,

iv) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:43 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:44,

v) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:46,

vi) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:48,

vii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:205 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:206,

viii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:207 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:208,

ix) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:209 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:210,

x) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:211 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:212,

xi) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:213 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:214,

xii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:215 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:216,

xiii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:217 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:218,

xiv) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:219 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:220,

xv) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:221 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:222,

xvi) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:223 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:224,

xvii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:225 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:226, y

xviii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:227 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:228,

En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, la segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 es:

i) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ iD NO:59 (CDR2) y Se Q ID NO:60 (CDR3), o

ii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ iD NO:65 (CDR2) y S<e>Q ID NO:66 (CDR3).

En la presente memoria se describen más detalladamente proteínas de unión multiespecíficas que comprenden una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprenden:

iii) CDR de cadena ligera que comprenden CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:96 (CDR1), SEQ ID NO:97 (CDR2) y SEQ ID NO:98 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:99 (CDR1), SEQ ID<n>O:100 (CDR2) y S<e>Q ID NO:101 (CDR3).

En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, la segunda unidad de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un segundo dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena pesada y es:

i) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:68, o

ii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:70.

En la presente memoria se describen más detalladamente proteínas de unión multispecíficas que comprenden una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprenden:

iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:102 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:103.

En algunas realizaciones de la invención, la primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 comprende de extremo N-terminal a extremo C-terminal: un primer dominio variable de cadena ligera, un primer dominio constante de cadena ligera, un primer conector peptídico, un primer dominio variable de cadena pesada y un primer dominio constante CH1 de cadena pesada; y la segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, un segundo dominio variable de cadena ligera, un segundo dominio constante de cadena ligera, un segundo conector peptídico, un segundo dominio variable de cadena pesada y un segundo dominio constante CH1 de cadena pesada. En algunas realizaciones de la invención, el primer y/o segundo conector peptídico comprende 26 a 42 aminoácidos, preferentemente cualquiera de 30 a 40 aminoácidos, de 34 a 40 aminoácidos, o de 36 a 39 aminoácidos, más preferentemente 38 aminoácidos. En algunas realizaciones de la invención, el primer conector y/o el segundo conector es un conector Gly-Ser, que comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:89, y más preferentemente dicho primer y segundo péptido conector comprenden la misma secuencia.

En algunas realizaciones, la proteína de unión de la invención comprende, además, un primer y un segundo dominio Fc, en donde dicho primer dominio Fc está unido covalentemente a dicha primera unidad de unión a antígeno, y dicho segundo dominio Fc está unido covalentemente a dicha segunda unidad de unión a antígeno.

En algunas realizaciones de la invención,

i) el primer dominio Fc comprende una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y], y el segundo dominio Fc comprende una treonina (T) en la posición 407 [Y407T], o

ii) el primer dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y el segundo dominio Fc comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], un alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V], o

iii) el segundo dominio Fc comprende una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y], y el primer dominio Fc comprende una treonina (T) en la posición 407 [Y407T], o

iv) el segundo dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y el primer dominio Fc comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], un alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V],

preferentemente el primer o el segundo dominio Fc comprende, además, una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F]. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo dominio Fc comprenden, además, una alanina en la posición 234 [L234A] y en la posición 235 [L235A]. En algunas realizaciones, el primer dominio constante de cadena ligera y el segundo dominio constante de cadena ligera comprenden un dominio kappa o lambda humano.

En realizaciones preferentes, la proteína de unión de la invención comprende una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:75, y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:79 o SEQ ID NO:80.

En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico aislada que i) codifica para una primera unión de unión a antígeno y/o una segunda unidad de unión a antígeno de una proteína indicada en la presente memoria, que opcionalmente codifica además un primer y/o un segundo dominio Fc, o ii) codifica una primera y/o una segunda cadena polipeptídica de una proteína indicada en la presente memoria. En aspectos adicionales proporcionados en la presente memoria se describen vectores de expresión que comprenden la molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria, células huésped transfectadas con dichos vectores de expresión, y métodos de preparación de una proteína de la invención.

Tal como se ha detallado anteriormente, en algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria, la proteína de unión multiespecífica comprende una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, donde la primera cadena polipeptídica comprende una primera cadena ligera, un primer conector y una primera cadena pesada, y la segunda cadena polipeptídica comprende una segunda cadena ligera, un segundo conector y una segunda cadena pesada, preferentemente el extremo C-terminal de dicha primera cadena ligera está unida covalentemente al extremo N-terminal de dicha primera cadena pesada a través de dicho primer conector peptídico y el extremo C-terminal de dicha segunda cadena ligera está unido covalentemente al extremo N-terminal de dicha segunda cadena pesada a través de dicho segundo conector peptídico.

En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, la primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada que comprenden secuencias de CDR y/o secuencias VH/VL según se define para las unidades de unión a antígeno de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3 descritas en la presente memoria. Se describen, además, proteínas de unión, en las que la primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR y/o secuencias VH/VL tal como se definen para las unidades de unión a antígeno de DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 o DLL3 n.° 18 descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, la segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada que incluyen secuencias de CDR y/o secuencias VH/VL según se definen para las unidades de unión a antígeno de CD3 n.° 1, CD3 n.° 2 o CD3 n.° 3 descritas en la presente memoria.

Otros aspectos, realizaciones, usos y métodos que implican las proteínas de unión de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención y de las reivindicaciones adjuntas.

La invención proporciona nuevas proteínas de unión que permiten un tratamiento más eficiente de los cánceres que expresan DLL3, tales como el CPM, el glioblastoma o un tumor neuroendocrino que expresa DLL3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Representación esquemática de una proteína de unión biespecífica de la invención

Figura 2: Representación esquemática de la proteína DLL3 de longitud completa y de los constructos de dominio de DLL3 expresados en células HEK293 para el mapeo de dominios de epítopo. Para los constructos de dominio de DLL3, los dominios transmembrana e intracelulares se derivan de EpCAM.

Figura 3A: Mapeo de dominios de epítopo de DLL3 de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo. Proteínas de unión de DLL3/CD3 de ejemplo que reconocen el péptido próximo a membrana, y los dominios EGF4, EGF1 y DSL de DLL3. El eje y representa los recuentos y el eje x representa PE-A (superficie de señal de la ficoeritrina). Figura 3B: Mapeo de dominios de epítopo de DLL3 de seis proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo. Proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que reconocen EGF1, EGF3, EGF4 o EGF6 de DLL3. El eje y representa los recuentos y el eje x representa PE-A (señal de ficoeritrina).

Figura 3C: Mapeo de dominios de epítopo de DLL3 de siete proteínas de unión DLL3/CD3 de ejemplo. Proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que reconocen los dominios DSL o ninguno de los dominios DSL, EGF ni el péptido próximo a membrana de DLL3. El eje y representa los recuentos y el eje x representa PE-A (señal de ficoeritrina).

Figura 4: Unión de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo, a líneas celulares que expresan DLL3 humano y de Cynomolgus (cyno). El eje y representa los recuentos y el eje x representa PE-A (superficie de señal de la ficoeritrina).

Figura 5: Unión de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 a líneas celulares que expresan DLL1 y DLL4 humanos, sin detección de unión a DLL1 ni a DLL4 humanos. El eje y representa los recuentos y el eje x representa PE-A (superficie de señal de la ficoeritrina).

Figura 6A: Unión de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo a líneas celulares de CPM y células T humanas mediante análisis de citometría de flujo.

Figura 6B: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en un péptido que no es ni DSL ni EGF1-6 ni el péptido próximo a membrana) a las células SHP77.

Figura 6 C: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) a las células SHP77.

Figura 6 D: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF1) a las células SHP77.

Figura 6 E: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF3) a las células SHP77.

Figura 6 F: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF4) a las células SHP77.

Figura 6 G: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) a las células SHP77.

Figura 6 H: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio de péptido próximo a membrana) a las células SHP77.

Figura 6 I: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en un péptido que no es ni DSL ni EGF1-6 ni el péptido próximo a membrana) a las células NCI-H82.

Figura 6 J: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) a las células NCI-H82.

Figura 6 K: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF1) a las células NCI-H82.

Figura 6 L: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF3) a las células NCI-H82.

Figura 6 M: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF4) a las células NCI-H82.

Figura 6 N: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) a las células NCI-H82.

Figura 6 O: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio de péptido próximo a membrana) a las células NCI-H82.

Figura 6 P: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en un péptido que no es ni DSL ni EGF1-6 ni el péptido próximo a membrana) a las células T.

Figura 6 Q: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) a las células T. Figura 6 R: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF1) a las células T. Figura 6 S: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF3) a las células T. Figura 6 T: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF4) a las células T. Figura 6 U: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF6) a las células T. Figura 6 V: Unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio de péptido próximo a membrana) a las células T.

Figura 7A: Poder de lisis celular de siete proteínas de unión a DLL3/CD3, que redirigen las PBMC no estimuladas hacia líneas celulares humanas de CPM.

Figura 7B: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en un péptido que no es ni DSL ni EGF1-6 ni el péptido próximo a membrana) que redirigen las células T no estimuladas hacia células SHP77 humanas.

Figura 7 C: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) que redirigen las células T no estimuladas a células SHP77 humanas.

Figura 7 D: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF1) que redirigen las células T no estimuladas a células SHP77 humanas.

Figura 7 E: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF3) que redirigen las células T no estimuladas a células SHP77 humanas.

Figura 7 F: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF4) que redirigen las células T no estimuladas a células SHP77 humanas.

Figura 7 G: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF6) que redirigen las células T no estimuladas a células SHP77 humanas.

Figura 7 H: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el péptido próximo a membrana) que redirigen las células T no estimuladas a células SHP77 humanas.

Figura 7 I: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en un péptido que no es ni DSL ni EGF1-6 ni el péptido próximo a membrana) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 7 J: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio DSL) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 7 K: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF1) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 7 L: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF43) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 7 M: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF4) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 7 N: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el dominio EGF6) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 7 O: Potencia de lisis celular de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (con diana en el péptido próximo a membrana) que redirigen las células T no estimuladas a células NCI-H82 humanas.

Figura 8: Ensayo de internalizaciónin vitrocon dos proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo. Las proteínas de unión a DLL3/CD3 se preincubaron con células SHP77 positivas para DLL3 durante 2 y 4 horas antes de la coincubación durante 48 horas con PBMC humanas.

Figura 9: Farmacocinética de dos proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo. Perfiles farmacocinéticos medios de DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 (cuadrados blancos) y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2 (cuadrados negros) en ratones C57BL/6 macho tras una única dosis intravenosa de 1 mg/kg.

Figura 10: Actividad antitumoral de dos proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo. El eje y representa las medianas de volumen tumoral y el eje x representa el tiempo.

Figura 11: Potencia de lisis celular de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que redirige las PBMC no estimuladas a células SHP77 humanas y RKO-E6.

Figura 12: Potencia de activación de células T en presencia de células SHP77 de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Figura 13: Potencia de degranulación de células T en presencia de células SHP77 de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Figura 14A: Potencia de secreción de interferón gamma por PBMC en presencia de células SHP77 de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Figura 14B: Potencia de secreción de MCP-1 por PBMC en presencia de células SHP77 de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Figura 15: Potencia de proliferación de células T en presencia de células SHP77 de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Figura 16: Potencia de lisis celular de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que redirige células pan-T no estimuladas y células T ingenuas a células SHP77 humanas.

Figura 17: Potencia de lisis celular de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que redirige células T CD4+ y de memoria central CD4+, no estimuladas, a células SHP77 humanas.

Figura 18: Potencia de lisis celular de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que redirige células T CD4+ y efectoras de memoria central CD4+, no estimuladas, a células SHP77 humanas.

Figura 19: Potencia de lisis celular de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que redirige células T CD8+ y efectoras de memoria CD8+CD45RA+, no estimuladas, a células SHP77 humanas.

Figura 20: Potencia de lisis celular de una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo que redirige células T CD8+ y CD8+ de memoria, no estimuladas, a células SHP77 humanas.

Figura 21: Infiltración de células T en tejido tumoral de xenoinjerto SHP77 con una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Figura 22: Unión de tres anticuerpos anti-DLL3 de ejemplo a la proteína DLL3 recombinante en un ensayo ELISA. El eje y representa los recuentos y el eje x representa la concentración de proteína DLL3.

Figura 23: Unión de seis anticuerpos anti-DLL3 de ejemplo a líneas celulares de CMP positivas para DLL3 determinadas mediante citometría de flujo. El eje y representa los recuentos y el eje x representa la concentración de anticuerpo anti-DLL3.

Figura 24: Representación representativa de una muestra de tejido de CMP con cinco anticuerpos anti-DLL3 de ejemplo. Los anticuerpos anti-DLL3 DLL3 n.° 1 y DLL3 n.° 5 mostraron que las células tumorales mostraban una tinción de DLL3 citoplasmática y/o membranosa puntual y/o difusa. Las imágenes se generaron electrónicamente mediante el escáner automatizado LEICA SCN400 con una ampliación de 10x.

Figura 25: tinción representativa de los pellets celulares de líneas celulares de CMP con diferentes niveles de expresión de DLL3. Anticuerpo anti-DLL3 DLL3 n.° 5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

TÉRMINOS Y DEFINICIONES UTILIZADOS

Los aspectos y realizaciones anteriormente descritos y otros resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente memoria, en la que:

A menos que se indique o defina lo contrario, todos los términos utilizados presentan su significado habitual en la técnica, que resultará evidente para el experto en la materia. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándares, tales como el de Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a edición), voIs. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990), y Roittet al.,"Inmunology" (2a edición), Gower Medical Publishing, Londres, New York (1989), así como a los antecedentes generales de la técnica citados en la presente memoria. Además, a menos que se indique lo contrario, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden llevarse cabo, y se han llevado a cabo, de una manera conocidaper se,como resultará evidente para el experto en la materia. Se hace referencia nuevamente a los manuales estándares, a los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente y a referencias adicionales citadas en la misma.

Cuando se utiliza en la presente memoria la expresión "que comprende" y variaciones la misma tales como “comprende” y “comprender”, puede sustituirse por las expresiones "que contiene", "que incluye" o "que presenta”.

El término "secuencia" tal como se utiliza en la presente memoria (por ejemplo, en expresiones como "secuencia de cadena pesada/ligera", "secuencia de anticuerpo", "secuencia de dominio variable", "secuencia de dominio constante" o "secuencia de proteína"), debe entenderse generalmente que incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante como las secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos codificantes de la misma, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada.

Una "unidad de unión a antígeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polipéptido capaz de unirse a su diana o antígeno específico y que comprende los requisitos estructurales mínimos derivados de un anticuerpo (normalmente presentes en un anticuerpo) que permiten la unión a la diana. De esta manera, una unidad de unión a antígeno comprende por lo menos la presencia de tres cadenas ligeras y tres secuencias CDR de cadena pesada, preferentemente por lo menos un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada.

La estructura generalizada de un anticuerpo o inmunoglobulina es bien conocida por el experto en la materia. Estas moléculas son glucoproteínas heterotetraméricas, típicamente de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas, y se hace referencia a ellas habitualmente como "anticuerpos de longitud completa". Cada cadena ligera se une covalentemente a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro para formar un heterodímero, y la molécula heterotetramérica se forma a través de un enlace disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de los heterodímeros. Aunque las cadenas ligera y pesada están unidas por un enlace disulfuro, el número de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía según el isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también presenta puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada presenta en el extremo N-terminal un dominio variable (VH), seguido de tres o cuatro (en el caso de IgE) dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), así como una región bisagra entre CH1 y CH2. Cada cadena ligera presenta dos dominios, un dominio variable N-terminal (VL) y un dominio constante C-terminal (CL). El dominio Vl está asociado de manera no covalente al dominio VH, mientras que el dominio CL normalmente está unido de manera covalente al dominio CH1 a través de un enlace disulfuro. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). Los dominios variables también se denominan en la presente memoria "regiones variables" o Fv y denotan la parte que confiere especificidad a un anticuerpo para el antígeno al llevar el sitio de unión al antígeno.

El "dominio variable de cadena ligera" (o "región variable de cadena ligera") y el "dominio variable de cadena pesada" (o "región variable de cadena pesada") tal como se utilizan en la presente memoria presentan la misma estructura general y cada dominio consiste esencialmente en cuatro regiones de marco (FR, por sus siglas en inglés) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, que se denominan en la técnica y a continuación en la presente memoria "región de marco 1" o "FR1"; "región de marco 2" o "FR2"; "región de marco 3" o "FR3"; y "región de marco 4" o "FR4", respectivamente; dichas regiones de marco están interrumpidas por tres regiones hipervariables, HVR (por sus siglas en inglés) (o CDR), que se denominan en la técnica y a continuación en la presente memoria "región determinante de complementariedad 1" o "CDR1"; "región determinante de complementariedad 2" o "CDR2" y "región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. De esta manera, la estructura general o secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse de la siguiente manera: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Las regiones de marco adoptan una conformación de lámina beta y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina beta. Los CDR en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional en virtud de las regiones de marco y forman junto con las CDR de la otra cadena el sitio de unión a antígeno.

En el contexto de la presente invención, la referencia a las CDR se basa en la definición de CCG, también conocido como IMGT (Lefranc MP, Pommié C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G. “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.”, Dev Comp Immunol. 2003 Jan;27(1):55-77; Giudicelli V, Brochet X, Lefranc MP. “IMGT/V-QUEST: IMGT standardized analysis of the immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) nucleotide sequences“. Cold Spring Harb Protoc.

2011;2011(6):695-715. An alternative definition of CDRs known in the art is based on Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917), junto con Kabat (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller y H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).

La expresión “dominios constantes” o “región constante” tal como se utiliza en la presente solicitud denota la suma de los dominios de un anticuerpo que no son la región variable. Tales dominios y regiones constantes son bien conocidos del estado de la técnica y se describen en, p. ej., Kabat et al., (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicación n.° 91).

La "parte Fc" o "dominio Fc" de un anticuerpo no participa directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, aunque muestra diversas funciones efectoras. Una "parte/dominio Fc de un anticuerpo" es una expresión bien conocida por el experto y se define sobre la base del corte por papaína de los anticuerpos. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases siguientes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Según las regiones constantes de la cadena pesada, las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £,<y>y H respectivamente. Varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej. IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. La parte Fc de un anticuerpo participa en la ADCC (por sus siglas en inglés, citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células) y en la CDC (por sus siglas en inglés, citotoxicidad dependiente del complemento) basada en la activación del complemento, la unión de Clq y la unión de receptores Fc. La activación del complemento (CDC) se inicia mediante la unión del factor del complemento Clq a la parte Fc de la mayoría de las subclases de anticuerpos IgG. Si bien la influencia de un anticuerpo en el sistema del complemento es dependiente de determinadas condiciones, la unión a Clq es causada por sitios de unión definidos en la parte Fc. Dichos sitios de unión son, p. ej., L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según la numeración de la UE (Edelman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. mayo de 1969;63(1):78-85)). Los residuos más cruciales entre estos para mediar en la unión de C1q y el receptor Fc-gamma en IgG1 son L234 y L235 (Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Shields et al (2001) JBC, 276 (9): 6591 6604). Los anticuerpos de las subclases IgG1 e IgG3 generalmente muestran activación del complemento y unión de Clq y C3, mientras que IgG2 e IgG4 no activan el sistema de complemento y no se unen a Clq y C3.

El término “anticuerpo” o “molécula de anticuerpo” (usados indistintamente en la presente memoria) comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), un fragmento de un anticuerpo, en particular un fragmento Fv, Fab, Fab' o F(ab')<2>, un anticuerpo de cadena sencilla, en particular un fragmento variable de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés), un fragmento Fab de cadena sencilla (scFab, por sus siglas en inglés), un inmunofarmacéutico modular pequeño (SMIP, por sus siglas en inglés), un anticuerpo de dominio, un nanocuerpo o un diacuerpo. El anticuerpo puede presentar una función efectora, tal como ADCC o CDC, que generalmente está mediada por la parte Fc (región constante del anticuerpo) del anticuerpo, o puede no presentar función efectora, p. ej. al carecer de una parte Fc o presentar una parte Fc bloqueada o enmascarada, en esencia, una parte Fc que no es, o no es suficientemente, reconocida por las células inmunitarias o los componentes del sistema inmunitario, como el sistema del complemento.

Los anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas en inglés) son anticuerpos monoespecíficos que presentan una secuencia de aminoácidos idéntica. Se pueden producir mediante tecnología de hibridoma a partir de una línea celular hibrida (denominada "hibridoma") que representa un clon de una fusión de una célula B productora de anticuerpos específica con una célula de mieloma (cáncer de células B) (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.). Alternativamente, pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante expresión recombinante en células huésped (Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (mayo de 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells" J Immunol Methods 204 (1): 77-87; ver también posteriormente). Un "anticuerpo recombinante" o "proteína de unión recombinante" es un anticuerpo o proteína de unión que ha sido producido por una célula huésped diseñada mediante recombinación. Opcionalmente se puede aislar o purificar.

Los anticuerpos de longitud completa se pueden tratar con enzimas tales como la papaína o la pepsina para generar fragmentos de anticuerpos útiles. La digestión con papaína se utiliza para producir dos fragmentos de anticuerpos idénticos unidos a antígenos denominados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales presenta un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc". El fragmento Fab contiene además el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')<2>que presenta dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de entrecruzar antígenos.

Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la presencia de residuos adicionales que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo en el extremo C-terminal del dominio CH1. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')<2>son pares de fragmentos Fab' unidos por residuos de cisteína en la región de bisagra. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

El fragmento "Fv" contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno que consiste en un dímero de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan definiendo un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo.

Un fragmento de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" es una variante de Fv de cadena sencilla que comprende los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde los dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. El Fv de cadena sencilla es capaz de reconocer y unirse a un antígeno. El polipéptido scFv puede contener opcionalmente además un conector polipeptídico situado entre los dominios VH y VL con el fin de facilitar la formación de una estructura tridimensional deseada para la unión del antígeno por el scFv (ver, p. ej., Pluckthun, 1994, en: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg y Moore, Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269 a 315).

Un fragmento de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" es una variante de Fab de cadena sencilla que comprende los dominios VL, CL, VH y CH1 de un anticuerpo, en donde los dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. El Fab de cadena sencilla es capaz de reconocer y unirse a un antígeno. El polipéptido scFab puede opcionalmente contener además un conector polipeptídico situado entre los dominios CL y VH (Hust et al. (2007) BMC Biotechnology).

Para la aplicación en el ser humano, con frecuencia resulta deseable reducir la inmunogenicidad de las moléculas terapéuticas, tales como los anticuerpos o las proteínas de unión que comprenden una unidad de unión a antígeno, tal como se describe en la presente memoria, originalmente derivadas de otras especies, como el ratón. Lo anterior se puede llevar a cabo mediante la construcción de anticuerpos/proteínas de unión quiméricos, o mediante un procedimiento denominado "humanización". En el presente contexto, un "anticuerpo quimérico"; o "unidad de unión a antígeno quimérico" se entiende como un anticuerpo o una unidad de unión a antígeno que comprende una parte de secuencia (p. ej., un dominio variable) derivada de una especie (p. ej., el ratón) fusionada a una parte de secuencia (p. ej., los dominios constantes) derivada de una especie diferente (p. ej., el ser humano). En el presente contexto, un “anticuerpo humanizado”, “una proteína de unión humanizada” o “una unidad de unión a antígeno humanizada” es un anticuerpo, una proteína o unidad de unión a antígeno que comprende un dominio variable originalmente derivado de una especie no humana, en donde determinados aminoácidos han sido mutados para que la secuencia general de ese dominio variable sea más similar una secuencia de un dominio variable humano. Los métodos de humanización de anticuerpos son bien conocidos de la técnica (Billetta R, Lobuglio AF). “Chimeric antibodies”. Int Rev Immunol.

1993;10(2-3):165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323).

Un "anticuerpo optimizado" o una "unidad o proteína de unión a antígeno optimizada" es un tipo específico de anticuerpo humanizado o unidad/proteína de unión a antígeno humanizado que incluye una variante de secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina, o fragmento de la misma, que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una o más FR que presentan sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una o más CDR que presentan sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Esta secuencia de aminoácidos no humana, frecuentemente denominada secuencia "de importación", se obtiene normalmente de un dominio de anticuerpo "de importación", particularmente de un dominio variable. En general, un anticuerpo optimizado incluye por lo menos las CDR (o HVL) de un anticuerpo no humano o derivadas de un anticuerpo no humano, insertadas entre las FR de un dominio variable de cadena pesada o ligera humana. Se entenderá que determinados residuos de FR de ratón pueden ser importantes para la función de los anticuerpos optimizados y, por lo tanto, determinados residuos de los dominios variables de cadena pesada y ligera de la secuencia germinal humana se modifican para ser iguales a los de la secuencia correspondiente de ratón. Durante este procedimiento, también se pueden eliminar o modificar aminoácidos no deseados, por ejemplo, para evitar la desamidación, cargas indeseables o lipofilicidad o unión no específica. Un "anticuerpo optimizado", un "fragmento de anticuerpo optimizado" u "optimizado" en ocasiones pueden denominarse "anticuerpo humanizado", "fragmento de anticuerpo humanizado", "humanizado" u "de secuencia optimizada".

Además, se han desarrollado tecnologías para generar anticuerpos o dominios VH/VL basados en secuencias derivadas del genoma humano, por ejemplo, mediante exposición en fagos o el uso de animales transgénicos (WWW. Ablexis.com/technology-alivamab.php; documento n.° WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths y G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.; Brüggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice”. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8). Dichos anticuerpos o unidades de unión a antígeno o dominios VH/VL son "anticuerpos humanos", "unidades de unión a antígeno humanas" o "dominios VH/VL humanos" en el contexto de la presente invención.

La expresión "anticuerpo humano", "unidad de unión a antígeno humano" o "dominio VH/VL humano" tal como se utilizan en la presente memoria, pretenden incluir anticuerpos, unidades de unión a antígeno o dominios VH/VL que presentan regiones variables (y constantes, en su caso) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos, unidades de unión a antígeno, proteínas o dominios VH/VL de la presente tecnología pueden incluir residuos aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", "unidad de unión a antígeno humana" o "dominio VH/VL humano" tal como se utilizan en la presente memoria, no pretenden incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie (de mamífero), tal como el ratón, la rata o el conejo, se han injertado en secuencias de marco humanas. De esta manera, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo humano", "unidad de unión a antígeno humana" o "dominio VH/VL humano" se refiere a un anticuerpo, unidad de unión a antígeno o dominio VH/VL en el que sustancialmente toda parte de la proteína (p. ej., CDR, marco, dominios CL y CH (p. ej., CH1, CH2 y CH3), bisagra, VL y VH) es sustancialmente no inmunogénica en el ser humano, con solo cambios o variaciones de secuencia menores. Estos cambios o variaciones opcionalmente y preferentemente mantienen o reducen la inmunogenicidad en el ser humano u otras especies en comparación con anticuerpos o unidades de unión a antígeno no modificados.

De esta manera, un anticuerpo humano, una unidad de unión a antígeno humana o un dominio VH/VL humano es distinto de, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado. Se señala que un anticuerpo humano, una unidad de unión a antígeno humana o un dominio V<h>/VL humano puede ser producido por un animal no humano o por una célula procariótica o eucariótica que sea capaz de expresar genes de inmunoglobulina humana reorganizados funcionalmente (p. ej., genes de cadena pesada y/o de cadena ligera).

El término "monómero" se refiere a una forma homogénea de un anticuerpo o una proteína multiespecífica tal como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, para un anticuerpo de longitud completa, un monómero significa un anticuerpo monomérico que presenta dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. En el contexto de la presente invención, un "monómero" significa una proteína de la presente invención que presenta una única unidad de unión a antígeno específica para DLL3 y una única unidad de unión a antígeno específica para CD3 tal como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un monómero de una proteína de unión descrita en la presente memoria puede presentar dos cadenas, una primera cadena que comprende un Fab de cadena sencilla con una primera unidad de unión a antígeno y, opcionalmente, un primer dominio Fc, y una segunda cadena que comprende un Fab de cadena sencilla con una segunda unidad de unión a antígeno y, opcionalmente, un segundo dominio Fc.

Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo o a una fracción de unión a antígeno (p. ej., la unidad de unión a antígeno de las proteínas descritas en la presente memoria). El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo o a una fracción de unión de antígeno. En determinadas realizaciones, entre los determinantes epitópicos se incluyen agrupaciones en superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de grupos glucosilo, fosforilo o sulfonilo, y, en determinadas realizaciones, pueden presentar características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros, pero no a los últimos, se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes.

Una molécula/proteína de unión a antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, una unidad de unión a antígeno, o un fragmento de tal molécula/proteína de unión a antígeno) que puede“unir’, “unirsea”,“unir específicamente",o“unirse específicamentea”, que“presenta afinidad para", “es específica para”y/o que“presenta especificidad para"un determinado epítopo, antígeno o proteína (o para por lo menos una parte, fragmento o epítopo del mismo) se dice que está “encontra de"o “dirigido contra”dicho epítopo, antígeno o proteína o es una molécula/proteína“de unión"con respecto a dicho epítopo, antígeno o proteína.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “unión” y “unión específica” se refieren a la unión del anticuerpo o fracción de unión a antígeno (tal como un inmunoglobulina, un anticuerpo, una unidad de unión a antígeno o un fragmento de dicha molécula/proteína de unión a antígeno) a un epítopo del antígeno en un ensayoin vitro,preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón ((Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.", Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6)) con antígeno de tipo salvaje purificado. La afinidad de los anticuerpos también se puede medir utilizando la tecnología de ensayo de exclusión cinética (KinExA) (Darling, R.J., y Brault P-A., “Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions”. ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657).

En general, el término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o epítopos a los que puede unirse una molécula/proteína de unión a antígeno particular (tal como un inmunoglobulina, un anticuerpo, una unidad de unión a antígeno, o un fragmento de dicha molécula/proteína de unión a antígeno). La especificidad de una molécula/proteína de unión a antígeno se puede determinar en función de su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (K<d>), es una medida de la fuerza de unión entre un epítopo y un sitio de unión a antígeno en la molécula/proteína de unión a antígeno: cuanto menor sea el valor de K<d>, mayor será la fuerza de unión entre el epítopo y la molécula/proteína de unión a antígeno (alternativamente, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (K<a>), que es 1/K<d>). Como resultará evidente para el experto en la materia (por ejemplo, sobre la base de la exposición adicional en la presente memoria), la afinidad se puede determinar de una manera conocidaper se,dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula/proteína de unión a antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, una unidad de unión a antígeno o un fragmento de dicha molécula/proteína de unión a antígeno) y el antígeno pertinente. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión a antígeno en la molécula/proteína de unión a antígeno, como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula/proteína de unión a antígeno.

El término "aislado", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a material que está separado de su entorno original o nativo (p. ej., el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que ocurre de manera natural en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por intervención humana de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Estos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o estos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía estar aislados en el sentido de que dicho vector o composición no forma parte del entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico, proteína/polipéptido se considera "(en forma) esencialmente aislada", respecto a su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o medio de cultivo del cual se ha obtenido, una vez separado de por lo menos un componente con el que suele estar asociado en dicha fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o por lo menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, se considera que una molécula de ácido nucleico o proteína/polipéptido está "esencialmente aislada" en el caso de que haya sido purificada por lo menos 2 veces, en particular por lo menos 10 veces, más en particular por lo menos 100 veces, y hasta 1.000 veces o más. Un molécula de ácido nucleico o de proteína/polipéptido que está "en forma esencialmente aislada" es preferentemente esencialmente homogénea, tal como se determina utilizando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o presentan un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para obtener la máxima correspondencia. Para determinar el porcentaje de identidad, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de un primer aminoácido o secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucleico). Seguidamente se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, se considera entonces que las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.° de posiciones idénticas / n.° total de posiciones (p. ej., posiciones superpuestas) x 100). En algunas realizaciones, las dos secuencias que se comparan presentan la misma longitud después de introducir huecos dentro de las secuencias, según corresponda (p. ej., excluyendo la secuencia adicional que se extiende más allá de las secuencias que se están comparando). Por ejemplo, cuando se comparan secuencias de región variable, no se consideran las secuencias del dominio líder y/o constante. Para las comparaciones de secuencia entre dos secuencias, una CDR "correspondiente" se refiere a una CDR en la misma ubicación en ambas secuencias (p. ej., CDR-H1 de cada secuencia).

La determinación del porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferente aunque no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas respecto a un ácido nucleico codificante de una proteína de interés. Las búsquedas de proteínas de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas respecto a una proteína de interés. Para obtener alineaciones con huecos para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST, tal como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, se puede utilizar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterativa que detecte relaciones distantes entre moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo preferente, aunque no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Al utilizar el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Son conocidos de la técnica algoritmos adicionales para el análisis de secuencias, incluyendo ADVANCE y ADAM, descritos en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda. Si ktup=2, se localizan regiones similares en las dos secuencias que se están comparando mediante la observación de pares de residuos alineados; si ktup=1, se examinan aminoácidos alineados individuales. Se puede fijar el parámetro ktup en 2 o 1 para las secuencias de proteínas, o en 1 a 6 para las secuencias de ADN. El valor predeterminado si no se especifica ktup es de 2 para las proteínas y de 6 para el ADN. Alternativamente, la alineación de las secuencias de las proteínas se puede llevar a cabo utilizando el algoritmo CLUSTAL W, descrito por Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.

La expresión "unido covalentemente" tal como se utiliza en la presente memoria significa ya sea un enlace covalente directo entre residuos, o una asociación indirecta donde dos residuos no están directamente unidos pero están unidos covalentemente a una molécula o dominio intermedio, p. ej. un dominio intermedio de una inmunoglobulina.

Los términos "competir" o "competir cruzadamente" se utilizan de manera intercambiable en la presente memoria para referirse a la capacidad de una molécula de anticuerpo para interferir con la unión de una molécula de anticuerpo, p. ej., una molécula de anticuerpo anti-DLL3 de la invención, a una diana, p. ej., DLL3 humano. La interferencia con la unión puede ser directa o indirecta (p. ej., a través de una modulación alostérica de la molécula de anticuerpo o de la diana). El grado en que una molécula de anticuerpo puede interferir con la unión de otra molécula de anticuerpo a la diana, y por lo tanto, la posibilidad de que esté compitiendo, se puede determinar utilizando un ensayo de unión competitiva, por ejemplo, un ensayo FACS, un ELISA o un ensayo BIACORE. En algunas realizaciones, un ensayo de unión competitiva es un ensayo de competencia cuantitativa. En algunas realizaciones, una primera molécula de anticuerpo anti-DLL3 se afirma que compite para la unión a la diana con una segunda molécula de anticuerpo anti-DLL3 en el caso de que la unión de la primera molécula de anticuerpo a la diana se reduzca en 10 % o más, p. ej., 20 % o más, 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 55 % o más, 60 % o más, 65 % o más, 70 % o más, 75 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, 99 % o más en un ensayo de unión competitiva (p. ej., un ensayo de competencia descrito en la presente memoria).

Se debe inferior, sin recitación explícita y a menos que se indique lo contrario, que cuando la presente tecnología se refiere a un polipéptido, proteína, polinucleótido o anticuerpo, se pretende hacer referencia a un equivalente o a un equivalente biológico del mismo comprendido dentro del alcance de la presente tecnología.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "equivalente biológico" se entiende como sinónima de "equivalente" al hacer referencia a una proteína, anticuerpo, polipéptido, polinucleótido o ácido nucleico de referencia, e implica la existencia de una homología mínima a la vez que se mantiene la estructura o funcionalidad deseada. A menos que se indique específicamente en la presente memoria, se contempla que cualquier ácido nucleico, polinucleótido, polipéptido, proteína o anticuerpo mencionado en la presente memoria también incluya equivalentes del mismo. Por ejemplo, un equivalente se refiere a por lo menos aproximadamente 80 % de homología o identidad y alternativamente, por lo menos aproximadamente 85 %, o alternativamente por lo menos aproximadamente 90 %, o alternativamente por lo menos aproximadamente 95 %, o alternativamente 98 % de homología o identidad, y muestra una actividad biológica sustancialmente equivalente a la proteína, polipéptido, anticuerpo o ácido nucleico de referencia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "marcaje detectable" se refiere a una molécula, compuesto o composición que puede producir una señal detectable, es decir, una señal física o química, incluyendo una señal colorimétrica, fluorescente, eléctrica, radiactiva y quimioluminiscente, que puede medirse por métodos visuales o instrumentales, y que indica la presencia y/o cantidad/concentración del marcaje en una muestra.

Puede generarse una “señal detectable” por diversos mecanismos, incluyendo la absorción, emisión y/o dispersión de un fotón (incluyendo fotones de radiofrecuencia, de frecuencia de microondas, de frecuencia de infrarrojos, de frecuencia visible y de frecuencia de ultravioleta) e incluye, aunque sin limitación, señales colorimétricas, fluorescentes, eléctricas, radiactivas y quimioluminiscentes.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "expresión" se refiere al proceso por el que los polinucleótidos se transcriben en ARNm y/o al proceso por el que el ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido se deriva del ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariótica. El nivel de expresión de un gen puede determinarse mediante la medición de la cantidad de ARNm o proteína en una célula o muestra de tejido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "muestra biológica" se refiere a un material de muestra derivado de células vivas o en contacto con ellas. La expresión se refiere a tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "muestra de tejido" se refiere a una muestra celular que preserva la relación espacial entre las células en sección transversal, tal como existían en el sujeto del cual se obtuvo la muestra. Las muestras biológicas también se pueden obtener de biopsias de órganos internos o de cánceres.

La “histoquímica” y la “citoquímica” son técnicas utilizadas para identificar una molécula en el contexto de células intactas al marcar las muestras con un agente que se une específicamente a la molécula de una manera que puede visualizarse al microscopio. La "inmunohistoquímica" y la "inmunocitoquímica" son tipos de histoquímica y citoquímica que utilizan anticuerpos para marcar las moléculas.

PROTEÍNAS DE UNIÓN MULTIESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN.

La presente invención proporciona proteínas de unión multiespecíficas que comprenden por lo menos una unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 (una primera unidad de unión de antígeno) y por lo menos una unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3 (una segunda unidad de unión de antígeno). Dichas proteínas de unión (multiespecíficas) en la presente memoria también se denominan "moléculas de unión (multiespecíficas)" o "proteínas de unión a DLL3/CD3" o "moléculas de unión a DLL3/CD3".

Los inventores han encontrado inesperadamente que las proteínas de unión multiespecíficas de la invención inducen lisis selectiva de líneas celulares de CPM positivas para DLL3 en presencia de células T y ya son activas a bajas proporciones de células efectoras a células diana. Es importante destacar que las proteínas de unión de la invención no causan la activación de las células T, la proliferación de las células T ni la secreción de citoquinas en ausencia de células positivas para DLL3 o de lisis de células negativas para DLL3.

Para evitar dudas, DLL3 tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a DLL3 humano de UniProt Q9NYJ7 y la secuencia de ácido nucleico que codifica esa proteína. CD3, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a complejos de CD3epsilón humano (UniProt P07766) y CD3 gamma (Uniprot: P09693) (complejos CD3ey humanos).

Se espera que el enfoque de utilizar como diana DLL3 mediante el acoplamiento de células T biespecíficas proporcione ventajas sobre un enfoque de ADC, ya que el redireccionamiento de células T no se ve influenciado por la resistencia a la quimioterapia y los niveles bajos de expresión en la superficie celular son menos críticos para este modo de acción. Los acopladores de células T son proteínas de unión multiespecíficas con brazos de unión a CD3 sobre las células T y brazos de unión a un antígeno sobre la superficie celular de las células tumorales. A través de la unión simultánea a las células T y las células tumorales, los acopladores de las células T fuerzan la formación de una sinapsis citolítica entre las dos células y de esta manera redirigen la actividad de las células T selectivamente hacia las células diana tumorales.

En un aspecto, la proteína de unión multiespecífica de la invención comprende una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 y una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde dicha primera unidad de unión se selecciona del grupo que consiste en i) a iii):

i) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:19 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQ ID NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 1),

ii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y Cd R de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de<s>E<q>ID<n>O:10 (CDR1),<s>E<q>ID NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 2), y

iii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQD NO:17 (CDR2) y S<e>Q ID No :18 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 3).

iv) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:19 (CDR1), SEQ ID NO:20 (CDR2) y SEQ ID NO:21 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:22 (CDR1), SEQD NO:23 (CDR2) y S<e>Q ID No :24 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 4),

v) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:25 (CDR1), SEQ ID NO:26 (CDR2) y SEQ ID NO:27 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:28 (CDR1), SEQ iD NO:29 (CDR2) y Se Q ID No :30 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 5),

vi) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:31 (CDR1), SEQ ID NO:32 (CDR2) y SEQ ID NO:33 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:34 (CDR1), SEQD NO:35 (CDR2) y S<e>Q ID N<o>:36 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 6),

vii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:133 (CDR1), SEQ ID NO:134 (CDR2) y SEQ ID NO:135 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:136 (CDR1), SEQ ID NO:137 (CDR2) y SEQ ID N<o>:138 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 7),

viii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:139 (CDR1), SEQ ID NO:140 (CDR2) y SEQ ID NO:141 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:142 (CDR1), SEQ ID NO:143 (CDR2) y SEQ ID N<o>:144 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 8),

ix) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:145 (CDR1), SEQ ID NO:146 (CDR2) y SEQ ID NO:147 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:148 (CDR1), SEQ ID NO:149 (CDR2) y SEQ ID N<o>:150 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 9),

x) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:151 (CDR1), SEQ ID NO:152 (CDR2) y SEQ ID NO:153 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:154 (CDR1), SEQ ID NO:155 (CDR2) y SEQ ID No :156 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 10),

xi) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:157 (CDR1), SEQ ID NO:158 (CDR2) y SEQ ID NO:159 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:160 (CDR1), SEQ ID NO:161 (CDR2) y SEQ ID No :162 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 11),

xii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:163 (CDR1), SEQ ID NO:164 (CDR2) y SEQ ID NO:165 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:166 (CDR1), SEQ ID NO:167 (CDR2) y SEQ ID N<o>:168 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 12),

xiii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:169 (CDR1), SEQ ID NO:170 (CDR2) y SEQ ID NO:171 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:172 (CDR1), SEQ ID NO:173 (CDR2) y SEQ ID No :174 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 13),

xiv) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:175 (CDR1), SEQ ID NO:176 (CDR2) y SEQ ID NO:177 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:178 (CDR1), SEQ ID NO:179 (CDR2) y SEQ ID No :180 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 14),

xv) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:181 (CDR1), SEQ ID NO:182 (CDR2) y SEQ ID NO:183 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:184 (CDR1), SEQ ID NO:185 (CDR2) y SEQ ID No :186 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 15),

xvi) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:187 (CDR1), SEQ ID NO:188 (CDR2) y SEQ ID NO:189 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO:190 (CDR1), SEQ ID NO:191 (CDR2) y SEQ ID N<o>:192 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 16),

xvii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:193 (CDR1), SEQ ID NO:194 (CDR2) y SEQ ID NO:195 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:196 (CDR1), SEQ ID NO:197 (CDR2) y SEQ ID No :198 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 17), y

xviii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:199 (CDR1), SEQ ID NO:200 (CDR2) y SEQ ID NO:201 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de S<e>Q ID NO:202 (CDR1), SEQ ID NO:203 (CDR2) y SEQ ID No :204 (CDR3) (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 18).

Preferentemente, la primera unidad de unión de antígeno de la proteína de unión de la invención es cualquiera de i) a iii) tal como se define en las secuencias CDR anteriormente indicadas.

Para evitar dudas, cada una de las realizaciones específicas enumeradas en la presente memoria también puede considerarse aspectos independientes de la invención.

i) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQD NO:59 (CDR2) y S<e>Q ID N<o>:60 (CDR3) (unidad de unión a antígeno CD3 n.° 1), o

ii) una unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ iD NO:65 (CDR2) y Se Q ID No :66 (CDR3) (unidad de unión a antígeno CD3 n.° 2).

iii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:96 (CDR1), SEQ ID NO:97 (CDR2) y SEQ ID NO:98 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:99 (CDR1), SEQ ID NO:100 (CDR2) y SEQ ID NO:101 (CDR3) (unidad de unión a antígeno CD3 n.° 3).

Las primeras unidades de unión de antígeno i) a xviii) tal como se han indicado anteriormente se denominan DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 y DLL3 n.° 18, respectivamente, y las segundas unidades de unión a antígeno i) a iii) tal como se ha indicado anteriormente se denominan CD3 n.° 1, CD3 n.° 2 y CD3 n.° 3, respectivamente. Se proporciona en la presente memoria una tabla de secuencias que permite identificar fácilmente las secuencias de aminoácidos individuales con unidades de unión a antígeno específicas y proteínas de unión de longitud completa descritas en la presente memoria. Se proporciona un resumen en la Tabla 1 en el Ejemplo 2.

Los términos "primero" y "segundo" con respecto a las unidades de unión a antígeno en general, tal como se usa en la presente memoria, pretenden indicar exclusivamente que estas unidades son dos unidades diferentes (ya que se unen a diferentes antígenos diana). De esta manera, estos términos no debe entenderse que se refieren al orden o secuencia exacta de las unidades dentro de la proteína de unión de la invención.

También se describen en la presente memoria proteínas de unión que comprenden una primera unidad de unión a antígeno seleccionada del grupo que consiste en DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 y DLL3 n.° 18, tal como se definen por las respectivas secuencias de CDR descritas anteriormente, y una segunda unidad de unión a antígeno de CD3 n.° 1, tal como se define mediante las respectivas secuencias de CDR descritas anteriormente. En las realizaciones preferentes, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión a antígeno seleccionada del grupo que consiste en DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3 según se definen mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente y una segunda unidad de unión a antígeno de CD3 n.° 1 según se define mediante las respectivas secuencias CDR indicadas anteriormente.

También se describen en la presente memoria proteínas de unión que comprenden una primera unidad de unión a antígeno seleccionada del grupo que consiste en DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 y DLL3 n.° 18, tal como se definen mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente, y una segunda unidad de unión a antígeno de CD3 n.° 1, tal como se define mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente. En las realizaciones preferentes, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión a antígeno seleccionada del grupo que consiste en DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3 según se definen mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente y una segunda unidad de unión a antígeno de CD3 n.° 2 según se define mediante las respectivas secuencias CDR indicadas anteriormente.

También se describen en la presente memoria proteínas de unión que comprenden una primera unidad de unión a antígeno seleccionada del grupo que consiste en DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 y DLL3 n.° 18, tal como se definen mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente, y una segunda unidad de unión a antígeno de CD3 n.° 3, tal como se define mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente. En la presente memoria se describen también proteínas de unión, que comprenden una primera unidad de unión a antígeno seleccionada del grupo que consiste en DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3 según se definen mediante las respectivas secuencias de CDR indicadas anteriormente y una segunda unidad de unión a antígeno de CD3 n.° 3 según se define mediante las respectivas secuencias CDR indicadas anteriormente.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQD NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:4 (C<d>R1), SEQ ID NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3) y una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), S<e>Q ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:10 (C<d>R1), SEQ ID NO:11 (C<d>R2) y SEQ ID NO:12 (C<d>R3) y una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos S<e>Q ID NO:55 (CDR1),<s>E<q>ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:l7 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3) y una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID N<o>:4 (CD<r>1), SEQ ID NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3) y una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), S<e>Q ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:10 (CDR1), SEQ ID NO:11 (Cd R2) y SEQ ID NO:12 (Cd R3) y una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos Se Q ID NO:61 (CDR1), s Eq ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:l7 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3) y una segunda unidad de unión de antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).

Además de las secuencias de CDR expuestas en la presente memoria, las unidades de unión a antígeno de los proteínas de unión de la invención incluyen secuencias de región de marco (FR) de inmunoglobulina. Estas secuencias preferentemente no son inmunogénicas en el ser humano, y por lo tanto preferentemente son secuencias de FR humanas o humanizadas. Las secuencias de FR humanas o humanizadas adecuadas son conocidas de la técnica. Específicamente, las secuencias de FR preferentes pueden obtenerse de las realizaciones mostradas en la presente memoria, que dan a conocer las unidades completas de unión a antígeno y, de esta manera, las secuencias de CDR, así como las secuencias de FR.

Se describen en la presente memoria proteínas de unión, en las que cada una de la primera y la segunda unidad de unión comprende cada un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada derivados de una molécula de anticuerpo, en donde dichos dominios variables de cadena ligera/pesada definidos por las secuencias de CDR de cualquiera de DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 o DLL3 n.° 18 para la primera unidad de unión a antígeno y dichos dominios variables de cadena ligera/pesada definidos por las secuencias de CDR de cualquiera de CD3 n.° 1, CD3 n.° 2 o CD3 n.° 3 para la segunda unidad de unión a antígeno. En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, el dominio VH y/o VL de las unidades de unión al antígeno de una o más cualesquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17, DLL3 n.° 18, CD3 n.° 1, CD3 n.° 2 o CD3 n.° 3 es un dominio VH y/o VL humano o humanizado.

En realizaciones preferentes de la invención, los dominios variables de cadena ligera/pesada de la primera unidad de unión a antígeno se definen adicionalmente del modo siguiente:

i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:38 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 1), o

ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 2), o

iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 3).

En las proteínas de unión adicionales descritas en la presente memoria, los dominios variables de cadena ligera/pesada de la primera unidad de unión a antígeno se definen de la siguiente manera:

iv) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:43 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 4), o

v) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:45 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 5), o

vi) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:47 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 6), o

vii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:205 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:206 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 7), o

viii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:207 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:208 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 8), o

ix) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:209 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:210 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 9), o

x) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:211 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:212 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 10), o

xi) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:213 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:214 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 11), o

xii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:215 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:216 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 12), o

xiii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:217 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:218 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 13), o

xiv) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:219 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:220 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 14), o

xv) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:221 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:222 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 15), o

xvi) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:223 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:224 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 16), o

xvii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:225 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:226 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 17), o

xviii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:227 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:228 (unidad de unión a antígeno DLL3 n.° 18), o

Preferentemente, la primera unidad de unión de antígeno de la proteína de unión de la invención es cualquiera de i) a iii) según se define mediante las secuencias de VL y VH anteriormente indicadas.

En realizaciones preferentes de la invención, los dominios variables de cadena ligera/pesada de la segunda unidad de unión a antígeno se definen adicionalmente del modo siguiente:

i) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68 (unidad de unión a antígeno CD3 n.° 1), o

ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70 (unidad de unión a antígeno CD3 n.° 2).

iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:102 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103 (unidad de unión a antígeno CD3 n.° 3).

En la presente memoria se describen más detalladamente proteínas de unión que comprenden una combinación de una primera y una segunda unidad de unión a antígeno seleccionadas del grupo que consiste en DLL3 n.° 4/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 5/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 6/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 7/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 8/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 9/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 10/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 11/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 12/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 13/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 14/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 15/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 16/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 17/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 18/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 4/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 5/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 6/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 7/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 8/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 9/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 10/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 11/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 12/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 13/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 14/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 15/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 16/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 17/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 18/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 4/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 5/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 6/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 7/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 8/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 9/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 10/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 11/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 12/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 13/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 14/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 15/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 16/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 17/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 18/CD3 n.° 3, en donde la primera y la segunda unidad de unión a antígeno se definen mediante las secuencias CDR y/o VH y VL de las unidades de unión a antígeno indicadas anteriormente. En realizaciones preferentes, la proteína de unión de la invención comprende una combinación de una primera y una segunda unidad de unión a antígeno seleccionadas del grupo que consiste en DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.°3/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, y DLL3 n.°3/CD3 n.° 2, en donde la primera y la segunda unidad de unión a antígeno se definen mediante las secuencias de CDR y/o VH y VL de las unidades de unión a antígeno indicadas anteriormente.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y (ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:40 y (ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:42 y (ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y (ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:40 y (ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:42 y (ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70.

En algunas realizaciones, la proteína de unión de la invención comprende: i) una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3, tal como se define en las respectivas secuencias de CDR o VH/VL, anteriormente) que comprende un primer dominio variable de cadena ligera unido covalentemente, ya sea directa o indirectamente, a un primer dominio variable de cadena pesada con un primer conector peptídico y/o ii) una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 (p. ej., CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2, tal como se define mediante las respectivas secuencias de CDR o VH/VL, anteriormente) que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera unido covalentemente, ya sea directa o indirectamente, a un segundo dominio variable de cadena pesada con un segundo conector peptídico.

En algunas realizaciones de las proteínas de unión de la invención, la primera y/o la segunda unidad de unión a antígeno comprende además un dominio CL y un dominio CH1 como en un dominio Fab ligero/pesado de una molécula de anticuerpo convencional, de modo que dicha primera unidad de unión comprende a) un dominio VL (p. ej., definido por la CDR de cadena ligera (LCCDR) o las secuencias VL de cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o<d>L<l>3 n.° 3,) unida covalentemente (ya sea directa o indirectamente) a un primer dominio CL y b) un dominio VH (p. ej., definido por la CDR de la cadena pesada (HCCDR) o las secuencias V<h>de cualquiera de<d>L<l>3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3,) unida covalentemente (ya sea directa o indirectamente) a un primer dominio CH1 y/o dicha segunda unidad de unión a antígeno comprende a) un dominio VL (p. ej., definido por la LCCDR o las secuencias VL de CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2) unida covalentemente (ya sea directa o indirectamente) a un segundo dominio CL y b) un dominio VH (p. ej., definido por HCCDR o las secuencias VH de CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2) unida covalentemente (ya sea directa o indirectamente) a un segundo dominio CH1.

En el contexto de la presente invención, un dominio CL es el dominio constante de una cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo, una cadena ligera kappa (k) o lambda (A). Un ejemplo de una región constante de una cadena ligera kappa se muestra en SEQ ID NO:87. Un ejemplo de una región constante de una cadena ligera lambda se muestra en SEQ ID NO:88. En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio CL son iguales, p. ej., el primer y el segundo dominio CL son ambos un dominio constante de cadena ligera kappa o el primer y el segundo dominio CL son ambos un dominio constante de cadena ligera lambda. En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio CL son diferentes; p. ej., el primer dominio CL es un dominio constante kappa y el segundo dominio CL es un dominio constante lambda, o viceversa.

En el contexto de la presente invención, un dominio CH1 es el primer dominio constante de una cadena pesada de anticuerpo. Un ejemplo de un dominio constante CH1 se muestra en SEQ ID NO:253.

En realizaciones preferentes de las proteínas de unión de la invención, la primera unidad de unión al antígeno (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3, definida por las secuencias CDR y/o VH/VL tal como se ha indicado anteriormente) de las proteínas de unión de la invención comprende entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal: un primer dominio variable de cadena ligera, un primer dominio CL, un primer conector peptídico, un primer dominio VH y un primer dominio CH1, y/o la segunda unidad de unión (p. ej., CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2 definidas por las secuencias CDR y/o VH/VL tal como se ha indicado anteriormente) de las proteínas de unión de la invención comprende entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal: un segundo dominio variable de cadena ligera, un segundo dominio CL, un segundo conector peptídico, un segundo dominio VH y un segundo dominio CH1. En esta realización, la primera y/o la segunda unidad de unión presentan la estructura de un Fab de cadena sencilla. Para ambos, la primera y/o la segunda unidad de unión al antígeno, al formar un Fab de cadena sencilla, pueden invertirse en orden de tal manera que entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, la unidad de unión a antígeno comprenda: VH-CH1-[conector peptídico]-VL-CL. En algunas realizaciones de la proteína de la invención, cuando la primera y/o segunda unidad de unión a antígeno comprende un Fab o un Fab de cadena sencilla, los dominios constantes pueden ser del mismo tipo (p. ej., ambos dominios CL son cadenas constantes ligeras kappa o lambda) o de diferentes tipos (el primer dominio CL es kappa y el segundo dominio CL es una cadena constante ligera lambda, o viceversa).

En un aspecto, un conector utilizado en una proteína de unión de la presente invención comprende entre 26 y 42 aminoácidos, por ejemplo, entre 30 y 40 aminoácidos. En un aspecto adicional, un conector utilizado en una proteína de la presente invención comprende entre 34 y 40 aminoácidos, por ejemplo, entre 36 y 39 aminoácidos, por ejemplo, 38 aminoácidos. En algunas realizaciones, el conector comprende una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 89, 90, 91, 92, 93, 94 o 95, preferentemente SEQ ID NO: 89.

La secuencia de conector puede ser una secuencia de ocurrencia natural o una secuencia de ocurrencia no natural. En el caso de que se utilice con fines terapéuticos, el conector es preferentemente no inmunogénico en el sujeto al que se administra la proteína de unión de la invención.

Un grupo útil de secuencias de conector son los conectores derivados de la región bisagra de los anticuerpos de cadena pesada, tal como se describe en los documentos n.° WO1996/34103 y n.° WO1994/04678. Otros ejemplos son secuencias de conector polialanina, tal como Ala-Ala-Ala.

Son ejemplos preferentes adicionales de secuencias de enlace los conectores Gly/Ser de diferentes longitudes, tales como los conectores (glyxsery)z, incluyendo, p. ej., (gly4ser)3, (gly4ser)5, (gly4ser)7, (gly3ser)3, (gly3ser)5, (gly3ser)7, (gly3ser2)3, (gly3ser2)5 y (gly3ser2)7, o un conector de cualquiera de SEQ ID NO: 89 a 95

En algunas realizaciones de las proteínas de unión de la invención, el dominio VL de la primera unidad de unión a antígeno (p. ej., definido por la<c>D<r>de cadena ligera (LCCDR) o secuencias VL de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3) se une covalentemente (p. ej., directamente) a través de un primer puente Gly/Ser (p. ej., un conector Gly/Ser de cualquiera de 26 a 42 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos o 36 a 39 aminoácidos, preferentemente 38 aminoácidos) al dominio VH de la primera unidad de unión a antígeno (p. ej., definida por la CDR de cadena pesada (HCCDR) o secuencias VH de DLl3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3); y el dominio VL de la segunda unidad de unión a antígeno (p. ej., definida por la CDR de la cadena ligera (LCCDR) o secuencias VL de CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2) se une covalentemente (p. ej., directamente) a través de un segundo conector Gly/Ser (p. ej., un conector Gly/Ser de cualquiera de 26 a 42 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos o 36 a 39 aminoácidos, preferentemente 38 aminoácidos) al dominio VH de la segunda unidad de unión a antígeno (p. ej., definida por la CDR de cadena pesada (HCCDR) o secuencias VH de CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2). Más preferentemente, el primer y el segundo conector son iguales. Todavía más preferentemente, el primer y el segundo conector comprenden, cada uno, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89.

Se describen adicionalmente en la presente memoria proteínas de unión que comprenden un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno específica para DLL3 y que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:52, SEQ iD NO:53, SEQ ID n O:54, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 y SEQ ID NO:240 y un segundo Fab de cadena sencilla de SEQ ID NO:71 que forma una segunda unidad de unión a antígeno específica para CD3. En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:49 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:71, que forma una segunda unidad de unión a antígeno. En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:50 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:71, que forma una segunda unidad de unión a antígeno. En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:51 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:71, que forma una segunda unidad de unión a antígeno.

Se describen adicionalmente en la presente memoria proteínas de unión que comprenden un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno específica para DLL3 y que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:52, SEQ iD NO:53, SEQ ID n O:54, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 y SEQ ID NO:240 y un segundo Fab de cadena sencilla de SEQ ID NO:72 que forma una segunda unidad de unión a antígeno específica para CD3. En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:49 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:72, que forma una segunda unidad de unión a antígeno. En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:50 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:72, que forma una segunda unidad de unión a antígeno. En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:51 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:72, que forma una segunda unidad de unión a antígeno.

Se describen adicionalmente en la presente memoria proteínas de unión que comprenden un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno específica para DLL3 y que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID n O:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 y SEQ ID NO:240 y un segundo Fab de cadena sencilla de SEQ ID NO:104 que forma una segunda unidad de unión a antígeno específica para CD3. Una proteína de unión descrita en la presente memoria comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:49 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:104, que forma una segunda unidad de unión a antígeno. Otra proteína de unión descrita en la presente memoria comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:50 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:104, que forma una segunda unidad de unión a antígeno. Una proteína de unión adicional descrita en la presente memoria comprende un primer Fab de cadena sencilla que forma una primera unidad de unión a antígeno que comprende la secuencia de SEQ ID NO:51 y un segundo Fab de cadena sencilla que comprende la secuencia de SEQ ID NO:104, que forma una segunda unidad de unión a antígeno.

En algunas realizaciones, la primera unidad de unión al antígeno (p. ej., DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3, tal como se define mediante las secuencias CDR y/o VH/VL indicadas anteriormente) y/o la segunda unidad de unión a antígeno (p. ej., CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2) comprende un dominio VL unido covalentemente (p. ej., directamente) a un dominio CL y un dominio VH unido a un dominio CH1 (es decir, formando conjuntamente un fragmento Fab derivado de un anticuerpo), y dicho dominio CH1 está además unido covalentemente (p. ej., directamente) a un dominio Fc, formando de esta manera un brazo de una molécula de anticuerpo convencional en forma de Y con una cadena ligera y una cadena pesada. En algunas realizaciones, la primera y la segunda unidad de unión a antígeno forman, cada una, un fragmento Fab, es decir, un primer y un segundo fragmento Fab, que están unidos covalentemente (p. ej., directamente) a un primer y un segundo dominio Fc, respectivamente, formando de esta manera una molécula de anticuerpo biespecífico y bivalente heterotetrámerica convencional.

En realizaciones preferentes, la primera unidad de unión al antígeno (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3, tal como se define mediante las secuencias de CDR y/o<v>H/<v>L indicadas anteriormente) y/o la segunda unidad de unión al antígeno (p. ej., CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2) comprenden una Fab de cadena sencilla, es decir, una cadena ligera de anticuerpo (VL-CL) unida covalentemente al dominio VH-CH1 de una cadena pesada a través de un conector peptídico (p. ej., un conector Gly/Ser de cualquiera de 26 a 42 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos, o 36 a 39 aminoácidos, preferentemente 38 aminoácidos, todavía más preferentemente un conector de SEQ ID NO:89). En realizaciones preferentes, la proteína de unión de la invención comprende una primera cadena polipeptídica que comprende un primer Fab de cadena sencilla que se une específicamente a DLL3 (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3, tal como se define en las respectivas secuencias CDR o VH/<v>L, anteriormente; preferentemente la primera unidad de unión a antígeno es DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3) y un primer dominio Fc (esta cadena polipeptídica se denomina también "cadena DLL3" en la presente memoria) y una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo Fab de cadena sencilla que se une específicamente a CD3 (p. ej., CD3 n.° 1 o<c>D3 n.° 2 tal como se define en las respectivas secuencias CDR o VH/VL, anteriormente) y un segundo dominio Fc (esta cadena polipeptídica se denomina también "cadena CD3" en la presente memoria). En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio Fc son iguales. En realizaciones preferentes, los primeros y segundos dominios Fc son diferentes. Las proteínas de unión resultantes de la invención portan un Fc completo y poseen dos sitios de unión independientes, una primera unidad de unión para DLL3 y una segunda unidad de unión para CD3. En algunas realizaciones, la primera unidad de unión de antígeno consiste en una sola cadena polipeptídica (una cadena DLL3). En algunas realizaciones, la segunda unidad de unión de antígeno consiste en una sola cadena polipeptídica (una cadena CD3). En algunas realizaciones, tanto la primera como la segunda unidad de unión a antígeno consisten en una única cadena polipeptídica, respectivamente.

En algunas realizaciones, la primera unidad de unión de antígeno de la proteína de la invención está formada por una primera cadena polipeptídica (una cadena DLL3) y la segunda unidad de unión a antígeno está formada por una segunda cadena polipeptídica (una cadena CD3). De esta manera, en algunas realizaciones, la proteína de unión de la invención comprende dos cadenas polipeptídicas diferentes, en donde cada una comprende una unidad de unión a antígeno con especificidad diferente, las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí, ya sea a través de enlaces disulfuro o potencialmente a través de un conector peptídico. En algunas realizaciones, la proteína de unión de la invención es una proteína heterodimérica biespecífica y bivalente que comprende dos cadenas de polipéptidos, una cadena polipeptídica (una primera cadena polipeptídica o cadena d LL3) que comprende una unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3 (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 o DLL3 n.° 3, definida por las respectivas secuencias CDR y/o VH/VL) y otra cadena polipeptídica (una segunda cadena polipeptídica o cadena CD3) que comprende una unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 (p. ej., CD3 n.° 1 o CD3 n.° 2 ).

En el contexto de la presente invención, un dominio Fc se deriva, por ejemplo, de la cadena pesada de una IgG, por ejemplo, una IgGi,IgG2 o IgG4. Por ejemplo, un dominio Fc de la presente invención es un dominio Fc de una cadena pesada de una IgGi o IgG4 y comprende una región bisagra y dos dominios constantes (C<h>2 y C<h>3). Se muestran ejemplos de dominios Fc (incluyendo una región bisagra) en las SEQ ID NO:81 y 84.

La numeración de los aminoácidos en las cadenas de aminoácidos de una proteína de la presente invención se proporciona en la presente memoria según el sistema de numeración de la UE (Edelman, Cunningham et al. 1969), a menos que se especifique lo contrario. Lo anterior significa que los números de aminoácido indicados en la presente memoria corresponden a las posiciones en una cadena pesada del subtipo correspondiente (p. ej., IgGi o IgG4), de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, a menos que se especifique lo contrario.

En algunas realizaciones, el primer dominio Fc y el segundo dominio Fc en una proteína de la presente invención comprenden, cada uno, uno o más cambios de aminoácido que reducen la formación de homodímeros de la primera o segunda cadena polipeptídica en lugar de heterodímeros de una primera y una segunda cadena polipeptídica. A través de estos cambios, se genera una "protrusión" en uno de los dominios Fc al reemplazar una o más pequeñas cadenas laterales de aminoácidos de la interfaz de una de las cadenas pesadas por cadenas laterales más grandes (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar en la interfaz del otro dominio Fc mediante sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por unas más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros, en particular homodímeros del dominio Fc con la "protrusión" (ver, por ejemplo, Ridgway et al. Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21; Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35). En algunas realizaciones, dichos cambios de aminoácidos son una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y] del primer dominio Fc y una treonina (T) en la posición 407 [Y407T] del segundo dominio Fc. En alguna realizaciones, el primer dominio Fc comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], y el segundo dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], un alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V]. En realizaciones preferentes, el primer dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y el segundo dominio Fc comprende una serina (S) en la posición 366 [T366<s>], un alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V]. Por ejemplo, la posición 366 del dominio Fc según la numeración de la UE, correspondiente a la posición de aminoácido 146 en la secuencia de Fc de la IgG1 humana de SEQ ID NO:81, se cambia de T en la posición 146 en SEQ ID NO:81 a W en la posición 146 en SEQ ID NO:82; y las posiciones 366, 368 y 407 según la numeración de la UE, correspondientes a las posiciones de aminoácido 146, 148 y 187, respectivamente, en SEQ ID NO:81, se cambian de T, L y Y en estas posiciones en SEQ ID NO:81 a S, A y V en estas posiciones en SEQ ID NO:83. En cualquiera de estas realizaciones, los cambios de aminoácidos indicados para el primer dominio Fc pueden localizarse en el segundo dominio Fc y los respectivos cambios de aminoácidos para el segundo dominio Fc pueden localizarse en el primer dominio Fc. En otras palabras, los términos "primer" y "segundo" pueden intercambiarse en estas realizaciones. En algunas realizaciones, dicho dominio Fc es un dominio Fc derivado de la cadena pesada de una IgG1 o IgG4.

En algunas realizaciones, el primer dominio Fc comprende una cisteína (C) en la posición 354 [S354C] además del triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y el segundo dominio Fc comprende una cisteína (C) en la posición 349 [Y349C] además de la serina (S) en la posición 366 [T366S], la alanina (A) en la posición 368 [l368A] y la valina (V) en la posición 407 [Y407V]. En un aspecto, dicho dominio Fc es un dominio Fc derivado de la cadena pesada de una IgG4.

En algunas realizaciones, el primer dominio Fc o el segundo dominio Fc en una proteína de unión de la presente invención que comprende, además, uno o más cambios en los aminoácidos que reducen la unión del dominio Fc a la proteína A. En algunas realizaciones, tales cambios en los aminoácidos son un arginina en la posición 435 [H435R] y un fenilalanina en la posición 436 [Y436F] de uno de los dominios Fc. Ambos cambios se derivan de la secuencia de la IgG3 humana (la IgG3 no se une a la proteína A). Estas dos mutaciones se encuentran en el dominio CH3 y se incorporan en uno de los dominios Fc para reducir la unión a la proteína A (ver, por ejemplo, Jendeberg et al., J Immunol Methods, 1997. 201(1): p. 25-34). Estos dos cambios facilitan la eliminación de homodímeros de cadenas pesadas que comprenden estos cambios durante la purificación de proteínas.

En algunas realizaciones, en una proteína de unión de la presente invención, el dominio Fc, que comprende una treonina (T) en la posición 407 [Y407T], además comprende una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F]. En este caso, la otra cadena pesada comprende una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y], pero no incluye los dos cambios en las posiciones 435 y 436. Alternativamente, en algunas realizaciones, en una proteína de la presente invención, el dominio Fc, que comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], una alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V], comprende, además, una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F]. En este caso, el otro dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], pero no incluye los dos cambios en las posiciones 435 y 436. De esta manera, el dominio Fc que comprende el cambio de aminoácido que resulta en una "cavidad", tal como se ha indicado anteriormente, también comprende los cambios de aminoácidos que reducen la unión a la proteína A. Los homodímeros que comprenden este dominio Fc se eliminan mediante la reducción de la unión a la proteína A. La producción de homodímeros del otro dominio Fc, que comprende la "protrusión", se reduce por la presencia de la "protrusión".

En algunas realizaciones, el dominio Fc de una proteína de la presente invención puede o no comprender mutaciones YTE (M252Y/S254T/T256E, numeración de la UE) (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006)). Se ha demostrado que estas mutaciones mejoran las propiedades farmacocinéticas de los dominios Fc mediante un aumento preferente de la afinidad de unión al receptor FcRn neonatal a pH 6,0.

En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominio Fc de la presente invención derivado de una IgG1 también incluye las mutaciones "KO" (L234A, L235A). En un aspecto adicional, el primer y/o el segundo dominio Fc de la presente invención derivado de una IgG4 también incluye la mutación de Pro en la bisagra (S228P).

En realizaciones preferentes de la invención, la proteína de unión comprende: i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1), o ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1), o iii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°3/CD3 n.° 1). Se describen además en la presente memoria proteínas de unión que comprenden: iv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:76 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°4/CD3 n.° 1), o v) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:77 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°5/CD3 n.° 1), o vi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:78 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°6/CD3 n.° 1), o vii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:241 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°7/CD3 n.° 1), o viii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:242 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°8/CD3 n.° 1), o ix) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:243 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.°9/CD3 n.° 1), o x) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:244 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 10/CD3 n.° 1), o xi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:245 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 11/CD3 n.° 1), o xii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:246 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 12/CD3 n.° 1), o xiii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:247 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 13/CD3 n.° 1), o xiv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:248 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 14/CD3 n.° 1), o xv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:249 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 15/CD3 n.° 1), o xvi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:250 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 16/CD3 n.° 1), o xvii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:251 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 17/CD3 n.° 1), o xviii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:252 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79 (DLL3 n.° 18/CD3 n.° 1). Preferentemente, la primera y segunda cadena polipeptídica se unen a través de uno o más enlaces disulfuro y forman una estructura similar a un anticuerpo (figura 1) similar a una molécula de anticuerpo convencional en forma de Y.

En otra realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:75, y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:79.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79.

En realizaciones preferentes de la invención, la proteína de unión comprende: i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2), o ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2), o iii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2). Se describen adicionalmente en la presente memoria proteínas de unión que comprenden: i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:76 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 4/CD3 n.° 2), o v) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:77 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 5/CD3 n.° 2), o vi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:78 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 6/CD3 n.° 2), o vii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:241 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 7/CD3 n.° 2), o viii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:242 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 8/CD3 n.° 2), o ix) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:243 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 9/CD3 n.° 2), o x) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:244 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 10/CD3 n.° 2), o xi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:245 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 11/CD3 n.° 2), o xii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:246 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 12/CD3 n.° 2), o xiii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:247 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 13/CD3 n.° 2), o xiv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:248 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 14/CD3 n.° 2), o xv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:249 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 15/CD3 n.° 2), o xvi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:250 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 16/CD3 n.° 2), o xvii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:251 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 17/CD3 n.° 2), o xviii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:252 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80 (DLL3 n.° 18/CD3 n.° 2). Preferentemente, la primera y segunda cadena polipeptídica se unen a través de uno o más enlaces disulfuro y forman una estructura similar a un anticuerpo (figura 1) similar a una molécula de anticuerpo convencional en forma de Y.

En otra realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 y Se Q ID NO:75, y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:80.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80.

Se describen además en la presente memoria proteínas de unión que comprenden: i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 1/CD3 n.°3), o ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 2/CD3 n.°3), o iii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°3/CD3 n.°3), o iv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:76 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°4/CD3 n.°3), o v) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:77 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°5/CD3 n.°3), o vi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:78 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°6/CD3 n.°3), o vii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:241 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°7/CD3 n.°3), o viii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:242 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°8/CD3 n.°3), o ix) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:243 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.°9/CD3 n.°3), o x) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:244 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 10/CD3 n.°3), o xi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:245 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 11/CD3 n.°3), o xii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:246 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 12/CD3 n.°3), o xiii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:247 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 13/CD3 n.°3), o xiv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:248 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 14/CD3 n.°3), o xv) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:249 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 15/CD3 n.°3), o xvi) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:250 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 16/CD3 n.°3), o xvii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:251 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 17/CD3 n.°3), o xviii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:252 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105 (DLL3 n.° 18/CD3 n.°3). Preferentemente, la primera y segunda cadena polipeptídica se unen a través de uno o más enlaces disulfuro y forman una estructura similar a un anticuerpo (figura 1) similar a una molécula de anticuerpo convencional en forma de Y.

En otra realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 y Se Q ID NO:75, y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:105.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105.

En una realización preferente, la proteína de unión comprende una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:105.

Para todas las realizaciones anteriores, se entenderá que, al utilizar la expresión "que comprende", también se pretende incluir una realización en la que el dominio o molécula respectiva "consiste en" la secuencia de aminoácidos indicada.

Tal como se ha detallado anteriormente, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona una proteína que comprende una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, en donde la primera cadena comprende una primera cadena ligera unida covalentemente (p. ej., directamente) a un primer conector, que a su vez está unido covalentemente (p. ej., directamente) a una primera cadena pesada, y en donde la segunda cadena que se une específicamente a CD3 comprende una segunda cadena ligera unida covalentemente (p. ej., directamente) a un segundo conector, que a su vez está unido covalentemente (p. ej., directamente) a una segunda cadena pesada.

En algunas realizaciones, desde su extremo N-terminal, la primera cadena polipeptídica comprende una primera región variable de cadena ligera que se une específicamente a DLL3, una primera región constante de cadena ligera, un primer conector, una primera región variable de cadena pesada específica para DLL3 y una primera región constante de cadena pesada. En algunas realizaciones, desde su extremo N-terminal, la segunda cadena polipeptídica comprende una segunda región variable de cadena ligera que se une específicamente a DLL3, una segunda región constante de cadena ligera, un segundo conector, una segunda región variable de cadena pesada específica para DLL3 y una segunda región constante de cadena pesada.

Las proteínas resultantes son portadoras de un Fc completo, que es marginalmente más grande que una IgG y presenta dos sitios de unión independientes (p. ej., cada sitio de unión es monovalente para el antígeno respectivo), un primer sitio de unión para DLL3 y un segundo sitio de unión para CD3. Preferentemente, la primera y la segunda cadena polipeptídica están unidas a través de uno o más enlaces disulfuro. De esta manera, las proteínas de la invención son estructuras similares a anticuerpos, que presentan la estructura en forma de Y de un anticuerpo convencional de longitud completa (ver la figura 1). Este formato biespecífico reduce en gran medida la heterogeneidad después de la expresión y purificación (p. ej., mediante evitación del emparejamiento incorrecto de dominios variables ligeros y pesados con diferentes especificidades de unión), a la vez que se mantienen las propiedades funcionales de las fracciones de unión dentro de una estructura que es menos probable que genere reacciones inmunogénicas no deseadas. Lo anterior también permite una buena expresión de las proteínas heterodiméricas, p. ej. en células de mamífero.

En algunas realizaciones de la proteína de la invención, la primera cadena polipeptídica de unión específica a DLL3 comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un primer dominio variable de cadena pesada, que comprende secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en i) a iii):

i) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQ ID NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3),

ii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:10 (CDR1), SEQ ID NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (CDR3), y

iii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:17 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3).

En proteínas de unión adicionales descritas en la presente memoria, la primera cadena polipeptídica de unión específica a DLL3 comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un primer dominio variable de cadena pesada, que comprenden secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en iv) a xviii):

iv) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:19 (CDR1), SEQ ID NO:20 (CDR2) y SEQ ID NO:21 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:22 (CDR1), SEQ ID NO:23 (CDR2) y SEQ ID NO:24 (CDR3),

v) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:25 (CDR1), SEQ ID NO:26 (CDR2) y SEQ ID NO:27 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:28 (CDR1), SEQ ID NO:29 (CDR2) y SEQ ID NO:30 (CDR3), y

vi) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:31 (CDR1), SEQ ID NO:32 (CDR2) y SEQ ID NO:33 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:34 (CDR1), SEQ ID NO:35 (CDR2) y SEQ ID NO:36 (CDR3),

vii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:133 (CDR1), SEQ ID NO:134 (CDR2) y SEQ ID NO:l35 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:136 (CDR1), SEQ ID NO:137 (CDR2) y SEQ ID NO:138 (CDR3),

viii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:139 (CDR1), SEQ ID NO:140 (CDR2) y SEQ ID NO:l41 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:142 (CDR1), SEQ ID NO:143 (CDR2) y SEQ ID NO:144 (CDR3),

ix) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:145 (CDR1), SEQ ID NO:146 (CDR2) y SEQ ID NO:147 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:148 (CDR1), SEQ ID NO:149 (CDR2) y SEQ ID NO:150 (CDR3),

x) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:151 (CDR1), SEQ ID NO:152 (CDR2) y SEQ ID NO:l53 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:154 (CDR1), SEQ ID NO:155 (CDR2) y SEQ ID NO:156 (CDR3),

xi) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:157 (CDR1), SEQ ID NO:158 (CDR2) y SEQ ID NO:l59 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:160 (CDR1), SEQ ID NO:161 (CDR2) y SEQ ID NO:162 (CDR3),

xii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:163 (CDR1), SEQ ID NO:164 (CDR2) y SEQ ID NO:l65 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:166 (CDR1), SEQ ID NO:167 (CDR2) y SEQ ID NO:168 (CDR3),

xiii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:169 (CDR1), SEQ ID NO:170 (CDR2) y SEQ ID NO:l71 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:172 (CDR1), SEQ ID NO:173 (CDR2) y SEQ ID NO:174 (CDR3),

xiv) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:175 (CDR1), SEQ ID NO:176 (CDR2) y SEQ ID NO:l77 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:178 (CDR1), SEQ ID NO:179 (CDR2) y SEQ ID NO:180 (CDR3),

xv) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:181 (CDR1), SEQ ID NO:182 (CDR2) y SEQ ID NO:l83 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:184 (CDR1), SEQ ID NO:185 (CDR2) y SEQ ID NO:186 (CDR3),

xvi) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:187 (CDR1), SEQ ID NO:188 (CDR2) y SEQ ID NO:l89 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:190 (CDR1), SEQ ID NO:191 (CDR2) y SEQ ID NO:192 (CDR3),

xvii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:193 (CDR1), SEQ ID NO:194 (CDR2) y SEQ ID NO:l95 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:196 (CDR1), SEQ ID NO:197 (CDR2) y SEQ ID NO:198 (CDR3), y

xviii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:199 (CDR1), SEQ ID NO:200 (CDR2) y SEQ ID NO:201 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:202 (CDR1), SEQ ID NO:203 (CDR2) y SEQ ID NO:204 (CDR3).

Los respectivos dominios variables de cadena ligera/pesada definidos por estas secuencias de CDR se denominan DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.°3, DLL3 n.°4, DLL3 n.°5, DLL3 n.°6, DLL3 n.°7, DLL3 n.°8, DLL3 n.°9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 y DLL3 n.° 18, respectivamente. Preferentemente, las secuencias de CDR se seleccionan del grupo que consiste en i) a iii) (DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3) tal como se ha definido anteriormente.

En realizaciones preferentes de la proteína de unión de la invención, dicha segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 comprende un segundo dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena pesada, que comprende secuencias de CDR:

i) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3), o

ii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).

En proteínas de unión adicionales descritas en la presente memoria, la segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 comprende:

iii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:96 (CDR1), SEQ ID NO:97 (CDR2) y SEQ ID NO:98 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:99 (CDR1), SEQ ID NO:100 (CDR2) y SEQ ID NO:101 (CDR3).

Los dominios variables de cadena ligera/pesada respectivos definidos por estas secuencias de CDR se denominan CD3 n.° 1, CD3 n.° 2 y CD3 n.° 3, respectivamente.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende un primer dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos S<e>Q ID NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y un primer dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQD NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3) y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y un segundo dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende un primer dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos S<e>Q ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y un primer dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:10 (CDR1), SEQ iD NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (c Dr 3) y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y un segundo dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende un primer dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y un primer dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:17 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3) y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y un segundo dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende un primer dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos S<e>Q ID NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y un primer dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQ iD NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3) y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y un segundo dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3). En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende un primer dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos S<e>Q ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y un primer dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:10 (CDR1), SEQ iD NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (c Dr 3) y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y un segundo dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende: (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3, que comprende un primer dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y un primer dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQD NO:17 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3) y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera con CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y un segundo dominio variable de cadena pesada con CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).

En realizaciones preferentes de la proteína de la invención, dicha primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 comprende un dominio variable de cadena ligera (un primer dominio variable de cadena ligera) y un dominio variable de cadena pesada (un primer dominio variable de cadena pesada) seleccionados del grupo que consiste en i) a iii):

i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:38 (DLL3 n.° 1), ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:40 (DLL3 n.° 2), y iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:42 (DLL3 n.° 3).

En proteínas de unión adicionales descritas en la presente memoria, la primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un primer dominio variable de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste en iv) a xviii):

iv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:43 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:44 (DLL3 n.° 4), v) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:46 (DLL3 n.° 5), vi) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:48 (DLL3 n.° 6), vii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:205 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:206 (DLL3 n.° 7), viii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:207 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:208 (DLL3 n.° 8), ix) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:209 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:210 (DLL3 n.° 9), x) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:211 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:212 (DLL3 n.° 10), xi) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:213 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:214 (DLL3 n.° 11), xii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:215 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:216 (DLL3 n.° 12), xiii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:217 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:218 (DLL3 n.° 13), xiv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:219 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:220 (DLL3 n.° 14), xv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:221 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:222 (DLL3 n.° 15), xvi) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:223 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:224 (DLL3 n.° 16), xvii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:225 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:226 (DLL3 n.° 17) y xviii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:227 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:228 (DLL3 n.° 18),

Preferentemente, las secuencias de dominio variable de cadena ligera y de dominio variable de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en i) a iii) (DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3) tal como se ha definido anteriormente.

En realizaciones preferentes de la proteína de la invención, dicha segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 comprende un dominio variable de cadena ligera (un segundo dominio variable de cadena ligera) y un dominio variable de cadena pesada (un segundo dominio variable de cadena pesada) seleccionado de:

i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:68 (CD3 n.° 1), o ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:70 (CD3 n.° 2).

iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:102 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:103 (CD3 n.° 3).

En algunas realizaciones, la proteína de unión descrita en la presente memoria comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica que comprende secuencias CDR y/o VH y VL de los dominios variables de la cadena ligera/pesada seleccionados de la lista que consiste en DLL3 n.° 4/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 5/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 6/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 7/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 8/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 9/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 10/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 11/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 12/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 13/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 14/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 15/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 16/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 17/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 18/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 4/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 5/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 6/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 7/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 8/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 9/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 10/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 11/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 12/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 13/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 14/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 15/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 16/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 17/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 18/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 4/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 5/CD3 n.° 3 y DLL3 n.° 6/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 7/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 8/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 9/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 10/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 11/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 12/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 13/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 14/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 15/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 16/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 17/CD3 n.° 3, DLL3 n.° 18/CD3 n.° 3. En realizaciones preferentes, la proteína de unión de la invención comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica que comprenden secuencias de CDR y/o VH y VL de los dominios variables de cadena ligera/pesada seleccionados de la lista que consiste en DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2 y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a<d>LL3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:38 y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:68.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a d LL3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID n O:39 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:40 y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:68.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a d LL3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID n O:41 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:42 y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:68.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a<d>LL3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID<n>O:37 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:38 y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:70.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a<d>LL3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID<n>O:39 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:40 y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:70.

En una realización preferente, la proteína de unión de la invención comprende (i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a d LL3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID n O:41 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:42 y (ii) una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3, que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:70.

En algunas realizaciones de la invención, el primer y/o el segundo conector peptídico comprenden un conector tal como se ha descrito anteriormente, p. ej., un conector derivado de una región de bisagra, un conector polialanina o un conector Gly/Ser, en donde el conector comprende de 26 a 42 aminoácidos, por ejemplo, cualquiera de 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos, o 36 a 39 aminoácidos, preferentemente 38 aminoácidos.

Se describen en la presente memoria proteínas de unión, en donde la primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, Se Q ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 o SEQ ID NO:240 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:71.

Se describen en la presente memoria proteínas de unión, en donde la primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, Se Q ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 o SEQ ID NO:240 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:72.

Se describen en la presente memoria proteínas de unión, en donde la primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:51, Se Q ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 o SEQ ID NO:240 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:104.

En una realización preferente, la primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:49 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:71.

En una realización preferente, a primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:50 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:71.

En una realización preferente, a primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:51 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:71.

En una realización preferente, a primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQD NO:49 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:72.

En una realización preferente, a primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:50 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:72.

En una realización preferente, a primera cadena polipeptídica específica para DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:51 y la segunda cadena polipeptídica específica para CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:72.

En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, la primera y la segunda cadena polipeptídica comprenden un dominio Fc derivado de la cadena pesada de una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2 o IgG4. Por ejemplo, un dominio Fc de la presente invención es un dominio Fc de una cadena pesada de una IgG1 o IgG4 y comprende una región bisagra y dos dominios constantes (CH2 y CH3). Son ejemplos de dominios Fc de IgG humanas se muestran en SEQ ID NO:81 y 84.

En algunas realizaciones de la proteína de unión de la invención, la cadena pesada comprende uno o más cambios de aminoácidos. Por ejemplo, dichos cambios de aminoácidos son una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y] de la primera cadena pesada y una treonina (T) en la posición 407 [Y407T] de la segunda cadena pesada. En alguna realizaciones, la primera cadena pesada comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S] y la segunda cadena pesada comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], una alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V]. En realizaciones preferentes, la primera cadena pesada comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y la segunda cadena pesada comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], un alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V]. Por ejemplo, la posición 366 del dominio Fc según la numeración de la UE, correspondiente a la posición de aminoácido 146 en la secuencia de Fc de la IgG1 humana de SEQ ID NO:81, se cambia de T en la posición 146 en SEQ ID NO:81 a W en la posición 146 en SEQ ID NO:82; y las posiciones 366, 368 y 407 según la numeración de la UE, correspondientes a las posiciones de aminoácido 146, 148 y 187, respectivamente, en SEQ ID NO:81, se cambian de T, L y Y en estas posiciones en SEQ ID NO:81 a S, A y V en estas posiciones en SEQ ID NO:83. En cualquiera de dichas realizaciones, los cambios de aminoácidos indicados para la primera cadena pesada pueden localizarse en la segunda cadena pesada y los cambios de aminoácidos respectivos para la segunda cadena pesada pueden localizarse en la primera cadena pesada. En otras palabras, los términos “primero” y “segundo” se pueden intercambiar en estas realizaciones. En algunas realizaciones, la cadena pesada se deriva de la cadena pesada de una IgG1 o IgG4.

En algunas realizaciones, la primera cadena pesada o la segunda cadena pesada en una proteína de la presente invención que comprende, además, uno o más cambios en los aminoácidos que reducen la unión de la cadena pesada a la proteína A. En algunas realizaciones, tales cambios en los aminoácidos son una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F] de una de las cadenas pesadas.

En algunas realizaciones, en una proteína de la presente invención, la cadena pesada, que comprende una treonina (T) en la posición 407 [Y407T], además comprende una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F]. En este caso, la otra cadena pesada comprende una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y], pero no incluye los dos cambios en las posiciones 435 y 436. Alternativamente, en algunas realizaciones, en una proteína de la presente invención, la cadena pesada, que comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], una alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V], comprende, además, una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F]. En este caso, la otra cadena pesada comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], pero no incluye los dos cambios en las posiciones 435 y 436. De esta manera, la cadena pesada que comprende el cambio de aminoácido que resulta en una "cavidad", tal como se ha indicado anteriormente, también comprende los cambios de aminoácidos que reducen la unión a la proteína A. Los homodímeros que comprenden estas cadenas pesadas se eliminan mediante la reducción de la unión a la proteína A. La producción de homodímeros de la otra cadena pesada, que comprende la "protrusión", se reduce por la presencia de la "protrusión".

En algunas realizaciones, la cadena pesada de una proteína de la presente invención puede o no comprender mutaciones YTE (M252Y/S254T/T256E, numeración de la UE) (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006)). Se ha demostrado que estas mutaciones mejoran las propiedades farmacocinéticas de la cadena pesada mediante un aumento preferente de la afinidad de unión al receptor FcRn neonatal a pH 6,0.

En algunas realizaciones, la primera y/o la segunda cadena pesada de la presente invención derivada de una IgG1 también incluye las mutaciones "KO" (L234A, L235A). En un aspecto adicional, la primera y/o la segunda cadena pesada de la presente invención derivada de una IgG4 también incluye la mutación de Pro en la bisagra (S228P).

En un aspecto adicional, las proteínas de la invención comprenden una primera unidad de unión a antígeno o cadena polipeptídica específica para DLL3 con una afinidad preferentemente <10 nM, más preferentemente <1 nM, todavía más preferentemente <0,1 nM, e incluso todavía más preferentemente <0,01 nM para DLL3 humano y de mono Cynomolgus. La afinidad se puede medir en un ensayo SPR (BIAcore) utilizando proteína DLL3 recombinante, tal como se describe, p. ej., en los ejemplos u otros métodos que son bien conocidos por el experto en la materia. Las proteínas comprenden una segunda unidad de unión de antígenos o cadena polipeptídica con una afinidad preferentemente <500 nM, más preferentemente <100 nM, todavía más preferentemente <10 nM para el complejo CD3Sy humano y mono Cynomolgus.

En un aspecto adicional, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención no se unen a las células negativas para DLL3 y no reaccionan cruzadamente con los parálogos de DLL3 humanos DLL1 y DLL4, tal como se muestra en el Ejemplo 5.

En un aspecto adicional, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la presente invención comprenden una primera unidad de unión a antígeno o una primera cadena polipeptídica que se une específicamente al péptido próximo a membrana de la proteína DLL3. En un aspecto adicional, las proteínas de la invención muestran una unión débil a las células que expresan la proteína DLL3, p. ej., no se alcanza una saturación de la unión de la proteína a la superficie celular hasta una concentración de 100 nM (ver, p. ej., la figura 6).

En un aspecto adicional, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la presente invención son capaces de mediar en la citotoxicidad contra células tumorales mediante la provisión de condiciones estéricas óptimas para la formación de una sinapsis citolítica entre una célula tumoral que expresa DLL3 y una célula T, con el fin de redirigir la actividad de la célula T selectivamente hacia las células tumorales diana, lo que conduce a la lisis de células tumorales.

Se pueden utilizar diversos métodos para medir la citotoxicidad mediada por las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la presente invención. Por ejemplo, la citotoxicidad se puede medir utilizando el método descrito en el Ejemplo 10. Las células efectoras pueden ser, por ejemplo, células T estimuladas o no estimuladas (humanas o de mono Cynomolgus) o sus subgrupos (p. ej., CD4, CD8), o células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) no estimuladas (humanas o de mono Cynomolgus). Las células diana deberían expresar por lo menos el dominio extracelular de DLL3 (humano o de mono Cynomolgus) y pueden ser células con expresión endógena (natural) de DLL3, tales como las líneas celulares de carcinoma pulmonar microcítico SHP77 y NCI-H82, alternativamente también células recombinantes que expresan ya sea DLL3 de longitud completa o el dominio extracelular de DLL3. La proporción de células efectoras a células diana (E:D) es generalmente de aproximadamente 10:1, aunque puede variar. La actividad citotóxica de las moléculas que se unen a DLL3/CD3 se puede determinar, p. ej., en un ensayo de liberación de LDH tras 48 o 72 horas de incubación. Las modificaciones del tiempo de incubación y de las lecturas utilizadas para la determinación de la citotoxicidad son posibles y son conocidas por el experto en la materia. Los sistemas de lectura de citotoxicidad pueden comprender los ensayos de MTT/MTS, ensayos basados en ATP, ensayos basados en FACS, ensayos de liberación de cromo-51, ensayos de sulforrodamina B (SRB), ensayos colorimétricos (WST), ensayos clonogénicos, tecnología ECIS y ensayos de bioluminiscencia.

La actividad citotóxica mediada por las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la presente invención se mide preferentemente en un ensayo de citotoxicidad celular. La citotoxicidad se representa mediante valores de EC90 medidos en el ensayo de citotoxicidad. El experto en la materia es consciente de que puede esperarse que la EC90 sea más baja al utilizar células T purificadas como células efectoras, en comparación con PBMC; el experto en la materia también sabrá que la EC90 puede ser todavía más baja al utilizar células T estimuladas. Puede esperarse, además, que los valores de EC90 sean más bajos cuando las células diana expresan un alto número de DLL3 sobre la superficie celular en comparación con las células que expresan un número bajo de moléculas de DLL3 sobre la superficie celular. La EC90 de la proteína de unión a DLL3/CD3 es preferentemente <10 nM, más preferentemente <5 nM y todavía más preferentemente <1 nM.

Preferentemente, las proteínas de unión multiespecíficas de la invención no inducen/median en la lisis de células negativas para DLL3. La expresión “no inducen/median en la lisis” de las células negativas para DLL3 significa que una molécula de unión a DLL3/CD3 no induce ni actúa como mediador en la lisis de más de 30 %, preferentemente no más de 20 %, más preferentemente no más de 10 % y especialmente no más de 5 % de las células negativas para DLL3, mientras que la lisis de la línea celular de carcinoma de pulmón positiva para DLL3 se establece en 100 %. Lo anterior generalmente se aplica a concentraciones de la proteína de unión de hasta 1.000 nM.

Preferentemente, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención no son internalizadas por las células diana. La tasa de internalización se puede evaluar, p. ej., tal como se describe en el Ejemplo 11. Preferentemente, la tasa de intemalización (p. ej., medida como una disminución de la citotoxicidad) es <50%después de una preincubación de 4 horas de las proteínas de unión a DLL3/CD3 con las células diana, más preferentemente <40 % y todavía más preferentemente <30 %.

Además, se ha mostrado que las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención son estables con un contenido de monómeros superior a 95 % (p. ej., de por lo menos 98 %, ver el Ejemplo 14), presentan propiedades farmacocinéticas favorables y buena capacidad de fabricación posterior, y se espera además que presenten una buena biodistribución (ver, p. ej., el Ejemplo 12). Las proteínas de la presente invención presentan, además, un perfil de inmunogenicidad favorable (ver el Ejemplo 16) y presentan buena estabilidadin vitroein vivo(ver, p. ej., los Ejemplos 12 y 15). Además, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención (p. ej., DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1,<d>L<l>3 n.° 3/CD3 n.° 2) muestran una eficacia favorable en un modelo de xenoinjerto en ratónin vivohumanizado. Las proteínas de unión a DLL3/CD3 indujeron una fuerte regresión tumoral ya después de la primera dosis de proteínas de unión a DLL3/CD3. Además, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención indujeron la regresión tumoral a dosis muy bajas, de 0,25 mg/kg, administradas una vez a la semana (q7d), corroborando su aplicabilidad terapéutica. En particular, las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención indujeron una proliferación selectiva de células T, la activación de las células T, la degranulación de las células T y la secreción de citoquinas (ver el Ejemplo 18) solo en presencia de células diana positivas para DLL3 y no en presencia de células diana negativas para DLL3, y además aumentaron significativamente la infiltración de las células T en el tejido tumoral (ver el Ejemplo 20). Además, el Ejemplo 19 muestra que las proteínas de unión a DLL3/CD3 actúan de mediadores en la lisis redirigida de células T c D4+ así como de células T CD8+. En particular, las células T ingenuas, así como las células efectoras de memoria CD4+, las células de memoria central CD4+, las células efectoras CD8+CD45RA+ y las células de memoria CD8+ contribuyen a la lisis redirigida de células tumorales que expresan DLL3 por parte de las células T.

En un aspecto adicional, se describen en la presente memoria moléculas de ácido nucleico aisladas codificantes de la primera y/o la segunda unidad de unión de antígeno de una proteína de unión multiespecífica descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico codifican, además, para un primer y/o segundo dominio Fc tal como se describe en la presente memoria, en donde el primer y/o segundo dominio Fc unido al extremo 3' de la molécula de ácido nucleico codifica para la primera y/o segunda unidad de unión a antígeno, respectivamente. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica i) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer Fab de cadena sencilla específico para DLL3 (por ejemplo, cualquiera de DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 y DLL3 n.° 18), y opcionalmente un primer dominio Fc y/o ii) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo Fab de cadena sencilla específico para CD3 (p. ej., cualquiera de CD3 n.° 1, CD3 n.° 2 y CD3 n.° 3) y opcionalmente un segundo dominio Fc.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una primera Fab de cadena sencilla de cualquiera de SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 o SEQ ID NO:240 y/o una segunda Fab de cadena sencilla de SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72 o SEQ ID NO:104. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una primera cadena polipeptídica de cualquiera de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 o SEQ ID NO: 252 y/o una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80 o SEQ ID NO:105.

En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el primer y/o segundo dominio de unión a antígeno (p. ej., un primer y/o segundo Fab de cadena sencilla de la invención). Preferentemente, el vector de expresión comprende, además, una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN, que codifica un primer y/o segundo dominio Fc, unido a la molécula de ácido nucleico, preferentemente la molécula de ADN, que codifica el primer y/o segundo dominio de unión a antígeno (p. ej., primer y/o segundo Fab de cadena sencilla, respectivamente). De esta manera, el vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica que comprende un primer Fab de cadena sencilla unido a un primer dominio Fc y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica que comprende un segundo Fab de cadena sencilla unido a un segundo dominio Fc.

En una realización preferente, el vector de expresión contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la primera y/o la segunda cadena polipeptídica de la invención. En una realización preferente, el vector de expresión comprende la secuencia de nucleótidos codificante de una primera cadena polipeptídica de cualquiera de las SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 o SEQ ID NO: 252 y/o una segunda cadena polipeptídica que comprende SEQ ID NO:79.

En realizaciones preferentes adicionales, el vector de expresión comprende la secuencia de nucleótidos codificante de una primera cadena polipeptídica de cualquiera de las SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 o SEQ ID NO: 252 y/o una segunda cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO:80.

En realizaciones preferentes adicionales, el vector de expresión comprende la secuencia de nucleótidos codificante de una primera cadena polipeptídica de cualquiera de las SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 o SEQ ID NO: 252 y/o una segunda cadena polipeptídica que comprende SEQ ID NO:105.

En una realización específicamente preferente, se pueden utilizar dos vectores de expresión, uno de ellos para la expresión de la primera cadena polipeptídica específica para DLL3, y el otro para la expresión de la segunda cadena polipeptídica específica para CD3, los cuales pueden transfectarse en una célula huésped para la expresión de proteínas recombinantes.

Preferentemente, el vector de expresión será un vector que comprenda dicha o dichas moléculas de ácido nucleico, ligadas operablemente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde dicha secuencia reguladora puede ser una secuencia de promotor, intensificador o terminador, y lo más preferentemente, una secuencia heteróloga de promotor, intensificador o terminador.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped que presenta un vector de expresión codificante de una primera cadena polipeptídica específica para DLL3 de la invención y un vector de expresión que codifica una segunda cadena polipeptídica específica para CD3 de la invención.

Según una realización particularmente preferente, dichas células huésped son células eucarióticas, tales como células de mamífero. En otra realización, dichas células huésped son células bacterianas. Otras células útiles son las células de levadura u otras células fúngicas.

Entre las células de mamífero adecuadas se incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares. Sin embargo, también pueden utilizarse células de anfibios, células de insectos, células vegetales y cualesquiera otra células utilizadas en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas.

ANTICUERPOS ANTI-DLL3

DLL3 se expresa normalmente sobre membranas intracelulares, incluidas las del aparato de Golgi en el cerebro fetal, y desempeña un papel clave en la somitogénesis en el mesodermo paraxial (Geffers et al., J Cell Biol. 2007;178:465; Chapman et al., Hum. Mol. Genet. 2011;20:905-916). La inducción marcada de la expresión de DLL3 en algunos tipos de tumores, incluyendo CPM, carcinoma neuroendocrino de células grandes (CNECG) y glioblastoma, resulta en la localización en la superficie celular: este hecho, junto con la ausencia detectable de DLL3 en la superficie celular en células no malignas, abre una nueva ventana de oportunidad para la terapia específica de células tumorales y para el uso de anticuerpos anti-DLL3 como herramientas diagnósticas y pronósticas.

Varios anticuerpos anti-DLL3 (tales como LS-c167440, Lifespan; AP21739PU-N, Acris; LS-C148700 y LSBio) están disponibles comercialmente. Sin embargo, estos anticuerpos no funcionan bien en inmunohistoquímica (IHQ), FACS y ensayos de ELISA y no consiguen unirse específicamente a la proteína DLL3 expresada sobre las células, particularmente células tumorales. También se ha informado de anticuerpos anti-DLL3 en, p. ej., el documento n.° WO2007111733, y se han propuesto para el uso diagnóstico en pacientes con glioma, aunque no se muestran datos de ensayos de IHQ. De esta manera, el uso de anticuerpos anti-DLL3 como herramientas de diagnóstico fiables para medir con precisión la expresión de DLL3 en pacientes, p. ej., en células/t tejidos tumorales y/o para evaluar la eficacia de las terapias con diana en DLL3, sigue siendo un desafío.

De esta manera, existe la necesidad de identificar anticuerpos anti-DLL3 alternativos, que se puedan utilizar para la detección precisa y específica de la expresión de la proteína DLL3 en diversos ensayos, tales como FACS, ELISA, inmunoprecipitación, transferencia Western, ELISA, radioinmunoensayo, citometría de flujo, IHQ y ensayos inmunométricos en cualquier tipo de muestra biológica y que puedan utilizarse como reactivos diagnósticos fiables.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, se describen en la presente memoria moléculas de anticuerpos anti-DLL3 que comprenden:

i) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQ ID NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3), o

ii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:10 (CDR1), SEQ ID NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (CDR3), o

iii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:17 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3), o

iv) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:19 (CDR1), SEQ ID NO:20 (CDR2) y SEQ ID NO:21 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:22 (CDR1), SEQ ID NO:23 (CDR2) y SEQ ID NO:24 (CDR3), o

v) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:25 (CDR1), SEQ ID NO:26 (CDR2) y SEQ ID NO:27 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:28 (CDR1), SEQ ID NO:29 (CDR2) y SEQ ID NO:30 (CDR3), o

vi) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:31 (CDR1), SEQ ID NO:32 (CDR2) y SEQ ID NO:33 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:34 (CDR1), SEQ ID NO:35 (CDR2) y SEQ ID NO:36 (CDR3), o

vii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:133 (CDR1), SEQ ID NO:134 (CDR2) y SEQ ID NO:135 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:136 (CDR1), SEQ ID NO:137 (CDR2) y SEQ ID NO:138 (CDR3), o

viii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:139 (CDR1), SEQ ID NO:140 (CDR2) y SEQ ID NO:141 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:142 (CDR1), SEQ ID NO:143 (CDR2) y SEQ ID NO:144 (CDR3), o

ix) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:145 (CDR1), SEQ ID NO:146 (CDR2) y SEQ ID NO:147 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:148 (CDR1), SEQ ID NO:149 (CDR2) y SEQ ID NO:150 (CDR3), o

x) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:151 (CDR1), SEQ ID NO:152 (CDR2) y SEQ ID NO:153 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:154 (CDR1), SEQ ID NO:155 (CDR2) y SEQ ID NO:156 (CDR3), o

xi) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:157 (CDR1), SEQ ID NO:158 (CDR2) y SEQ ID NO:159 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:160 (CDR1), SEQ ID NO:161 (CDR2) y SEQ ID NO:162 (CDR3), o

xii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:163 (CDR1), SEQ ID NO:164 (CDR2) y SEQ ID NO:165 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:166 (CDR1), SEQ ID NO:167 (CDR2) y SEQ ID NO:168 (CDR3), o

xiii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:169 (CDR1), SEQ ID NO:170 (CDR2) y SEQ ID NO:171 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:172 (CDR1), SEQ ID NO:173 (CDR2) y SEQ ID NO:174 (CDR3), o

xiv) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:175 (CDR1), SEQ ID NO:176 (CDR2) y SEQ ID NO:177 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:178 (CDR1), SEQ ID NO:179 (CDR2) y SEQ ID NO:180 (CDR3), o

xv) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:181 (CDR1), SEQ ID NO:182 (CDR2) y SEQ ID NO:183 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:184 (CDR1), SEQ ID NO:185 (CDR2) y SEQ ID NO:186 (CDR3), o

xvi) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:187 (CDR1), SEQ ID NO:188 (CDR2) y SEQ ID NO:189 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:190 (CDR1), SEQ ID NO:191 (CDR2) y SEQ ID NO:192 (CDR3), o

xvii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:193 (CDR1), SEQ ID NO:194 (CDR2) y SEQ ID NO:195 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:196 (CDR1), SEQ ID NO:197 (CDR2) y SEQ ID NO:198 (CDR3), o

xviii) CDR de cadena ligera que comprenden CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:199 (CDR1), SEQ ID NO:200 (CDR2) y SEQ ID NO:201 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ iD NO:202 (CDR1), SEQ ID NO:203 (CDR2) y Se Q ID NO:204 (CDR3).

Los anticuerpos i) a xviii) tal como se han descrito anteriormente se denominan DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 o DLL3 n.° 18, respectivamente. Se proporciona en la presente memoria una tabla de secuencias que permite identificar fácilmente las secuencias de aminoácidos individuales con los anticuerpos específicos descritos en la presente memoria.

En realizaciones preferentes, la molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria comprende secuencias de CDR definidas en i) o v) anteriormente, correspondientes a DLL3 n.° 1 o DLL3 n.° 5.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-DLL3 descrito en la presente memoria es una molécula de anticuerpo quimérica, humanizada o humana. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal Fab, F(ab)2, Fv o scFv. . En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria comprende una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena ligera de la molécula del anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria es kappa o lambda.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-DLL3 descrito en la presente memoria presenta un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO:38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228. Preferentemente, la molécula de anticuerpo presenta un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 o 228.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria presenta un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO:37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 y 227. Preferentemente, la molécula de anticuerpo presenta un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 o 227.

Los métodos para calcular las identidades de secuencia de aminoácidos son bien conocidos de la técnica y se comentan en mayor detalle en la presente memoria en el apartado de Definiciones de la especificación.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 presenta: i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:38 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:37 (DLL3 n.° 1), o ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 (DLL3 n.° 2), o iii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:42 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 (DLL3 n.° 3), o iv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:44 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:43 (DLL3 n.° 4), o v) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:46 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45 (DLL3 n.° 5), o vi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:48 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47 (DLL3 n.° 6), o vii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:205 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:206 (DLL3 n.° 7), o viii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:207 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:208 (DLL3 n.° 8), o ix) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:209 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:210 (DLL3 n.° 9), o x) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:211 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:212 (DLL3 n.° 10), o xi) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:213 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:214 (DLL3 n.° 11), o xii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:215 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:216 (DLL3 n.° 12), o xiii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:217 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:218 (DLL3 n.° 13), o xiv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:219 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:220 (DLL3 n.° 14), o xv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:221 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:222 (DLL3 n.° 15), o xvi) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:223 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:224 (DLL3 n.° 16), o xvii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:225 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:226 (DLL3 n.° 17), o xviii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:227 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:228 (DLL3 n.° 18).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-DLL3 descrito en la presente memoria es un anticuerpo monoclonal de ratón. En el contexto de la presente descripción, un anticuerpo monoclonal de ratón incluye un anticuerpo en el que VH y VL se obtienen de la inmunización de ratones con la proteína DLL3 humana, la posterior selección de secuencias de V<h>y VL adecuadas que se unen con una afinidad determinada a DLL3 humano, y a continuación, la unión de esas secuencias de VH y VL a dominios constantes que se derivan de ratón (p. ej., de la IgG2a de ratón) mediante técnicas recombinantes, y que son producidos mediante expresión recombinante en células huésped. Se describen además anticuerpos quiméricos, p. ej., que comprenden regiones variables y constantes de diferentes especies. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria es un anticuerpo quimérico que comprende dominios VH y VL derivados de ratón tal como se ha descrito anteriormente y que, además, comprenden dominios constantes derivados de otra especies, tales como ser humano, conejo, rata, cabra o burro. En algunas realizaciones, el anticuerpo quimérico comprende dominios VH y VL derivados de ratón y después humanizados u optimizados en secuencia tal como se ha definido anteriormente, y además comprende dominios constantes derivados de otra especie. En algunas realizaciones, el anticuerpo quimérico comprende dominios VH y VL derivados de un animal transgénico (p. ej., un ratón) que comprende secuencias de IgG humanas, por lo que comprende secuencias humanas de VH y VL, y además comprende dominios constantes derivados de otra especie. En cualquiera de las realizaciones de anticuerpos quiméricos descritas anteriormente, la región constante de cadena pesada es una región de cadena pesada de ratón, ser humano, conejo, rata, cabra o burro.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria comprende un dominio constante seleccionado del grupo que consiste en los dominios constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE. En una realización preferente, el anticuerpo anti-DLL3 presenta un dominio constante de IgG2a, que comprende preferentemente la secuencia SEQ ID NO:254. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 presenta un dominio constante de cadena ligera que es kappa o lambda; preferentemente, el dominio constante de cadena ligera es un dominio constante de cadena ligera kappa, que preferentemente comprende la secuencia SEQ ID NO:255.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 es capaz de unirse a DLL3 humano y de mono Cynomolgus con una constante de disociación (Kd) preferentemente <10 nM, más preferentemente <1n M, todavía más preferentemente <0,1 nM, y aún todavía más preferentemente <0,01 nM. La afinidad (valor de Kd) se puede medir en un ensayo SPR (BIAcore) utilizando proteína DLL3 recombinante, tal como se describe, p. ej., en los ejemplos u otros métodos que son bien conocidos por el experto en la materia.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 no se une a DLL3 de ratón.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 es capaz de detectar la expresión de DLL3 (p. ej., la expresión de proteínas citoplasmáticas y de superficie) en muestras de tejido (p. ej., muestras de tejido incluidas en parafina/fijadas en formalina), tales como muestras de tejido tumoral o líneas celulares en cultivo. Opcionalmente, las muestras de cultivo celular o tejido incluidas en parafina/fijadas en formalina se tratan adicionalmente con un recuperador de epítopos, tal como la proteinasa K.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos DLL3 n.° 1, DLL2#2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 o DLL3 n.° 18. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria compite cruzadamente para la unión a DLL3 humano con cualquiera de las moléculas de anticuerpo DLL3 n.° 1, DLL2 n.° 2, DLL3 n.° 3, DLL3 n.° 4, DLL3 n.° 5, DLL3 n.° 6, DLL3 n.° 7, DLL3 n.° 8, DLL3 n.° 9, DLL3 n.° 10, DLL3 n.° 11, DLL3 n.° 12, DLL3 n.° 13, DLL3 n.° 14, DLL3 n.° 15, DLL3 n.° 16, DLL3 n.° 17 o DLL3 n.° 18.

En otro aspecto, se describen en la presente memoria moléculas de ácido nucleico aisladas codificantes del dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos codificante del dominio variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO:38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 o 228. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos codificante del dominio variable de cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID NO: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 o 227.

En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos codificante del dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria.

Preferentemente, el vector de expresión comprende, además, una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN, codificante de los dominios constantes de una cadena pesada y/o el dominio constante de una cadena ligera, respectivamente, unida a la molécula de ácido nucleico, preferentemente la molécula de ADN, que codifica el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera, respectivamente.

En una realización específicamente preferente, se pueden utilizar dos vectores de expresión, uno de ellos para la expresión de la cadena pesada, y el otro para la expresión de la cadena ligera, en donde dichos dos vectores de expresión seguidamente pueden transfectarse en una célula huésped para la expresión de proteínas recombinantes.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria una célula huésped que tiene un vector de expresión codificante de una cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria y un vector de expresión codificante de una cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria.

MÉTODOS DE FABRICACIÓN Y PURIFICACIÓN

La invención proporciona además métodos de fabricación de una proteína de unión multiespecífica de la invención, en donde dichos métodos generalmente comprenden las siguientes etapas:

- cultivo de células huésped que comprenden un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una proteína de unión de la invención en condiciones que permiten la formación de la proteína de unión de la invención, y

- recuperación de la proteína de unión expresada por las células huésped a partir del cultivo, y

- opcionalmente purificación y/o modificación y/o formulación de la proteína de unión de la invención.

La invención proporciona, además, métodos de fabricación de un anticuerpo anti-DLL3 de la invención, en donde dichos métodos generalmente comprenden las siguientes etapas:

- cultivo de células huésped que comprenden un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo de la invención bajo condiciones que permiten la formación de la molécula de anticuerpo, y

- recuperación de la molécula de anticuerpo expresada por las células huésped a partir del cultivo, y

- opcionalmente purificación y/o modificación y/o formulación adicional de la molécula de anticuerpo de la invención.

Un ácido nucleico descrito en la presente memoria puede ser, p. ej., una molécula de ADN que comprende secuencias codificantes, así como secuencias regulatorias y, opcionalmente, intrones naturales o artificiales, o puede ser una molécula de ADNc. Puede presentar sus codones originales o puede presentar un uso de codones optimizado que ha sido adaptado específicamente para la expresión en la célula huésped u organismo huésped previsto. Según una de las realizaciones descritas en la presente memoria, el ácido nucleico descrito en la presente memoria se encuentra en forma esencialmente aislada, tal como se ha definido anteriormente.

Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria pueden prepararse u obtenerse de una manera conocidaper se(p. ej., mediante síntesis automatizada de ADN y/o tecnología de ADN recombinante), basándose en la información sobre las secuencias de aminoácidos para las proteínas de la invención proporcionada en la presente memoria.

El ácido nucleico descrito en la presente memoria normalmente se incorpora en un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión de la proteína al transfectarla en una célula huésped u otro sistema de expresión adecuado.

Para la preparación de las proteínas de unión de la invención o anticuerpos descritos en la presente memoria, el experto en la materia puede seleccionar de entre una gran variedad de sistemas de expresión bien conocidos de la técnica, p. ej., los proporcionados en la revisión por Kipriyanow y Le Gall, 2004.

Entre los vectores de expresión se incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, episomas derivados del VEB y similares. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula huésped. La secuencia de nucleótidos codificante de la primera unidad de unión a antígeno (p. ej., el Fab de cadena sencilla específico para DLL3 o la cadena completa de DLL3 de la proteína de unión de la invención) y la secuencia de nucleótidos que codifica la segunda unidad de unión a antígeno (p. ej., el Fab de cadena sencilla específico para CD3 o la CD3 de longitud completa de la proteína de unión de la invención) de la proteína de unión a DLL3/CD3 pueden insertarse en vectores separados. En determinadas realizaciones, ambas secuencias de ADN se insertan en el mismo vector de expresión. La secuencia de nucleótidos codificante de la cadena ligera de un anticuerpo de DLL3 y la secuencia de nucleótidos codificante de la cadena pesada de un anticuerpo de DLL3 se pueden insertar en vectores separados. En determinadas realizaciones, ambas secuencias de ADN se insertan en el mismo vector de expresión.

Los vectores convenientes son aquellos codificantes de una secuencia de CH (cadena pesada constante) de inmunoglobulina funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados diseñados para que cualquier unidad de unión a antígeno, tal como una secuencia de Fab de cadena sencilla o cualquier dominio variable de cadena pesada/ligera, pueda insertarse y expresarse fácilmente, tal como se ha descrito anteriormente. Para la cadena pesada de anticuerpo, puede ser, aunque sin limitación, cualquier isotipo de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) u otras inmunoglobulinas, incluyendo variantes alélicas.

El vector de expresión recombinante puede codificar, además, para un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de CD3 o DLL3 de longitud completa a partir de la célula huésped o de la cadena ligera/pesada de un anticuerpo anti-DLL3. El ADN codificante de la cadena de proteína puede clonarse en el vector de tal manera que el péptido de señal esté ligado en el mismo marco que el extremo aminoterminal de la cadena completa madura de ADN. El péptido DE señal puede ser un péptido DE señal de inmunoglobulina o un péptido heterólogo de una proteína no inmunoglobulina. Alternativamente, la secuencia de ADN codificante de las cadenas de longitud completa de la proteína de la invención puede contener ya una secuencia de péptido señal.

Además de la secuencia de ADN codificante de la cadena de DLL3/CD3 o de la cadena pesada/l ligera de un anticuerpo de DLL3, los vectores de expresión recombinante habitualmente llevan secuencias reguladoras, opcionalmente secuencias reguladoras heterólogas, incluyendo promotores, intensificadores, señales de terminación y de poliadenilación y otros elementos de control de la expresión que regulan la expresión de las cadenas de proteína en una célula huésped. Los ejemplos de secuencias de promotor (ejemplificados para la expresión en células de mamífero) son promotores y/o intensificadores derivados del CMV (tal como el promotor/intensificador del virus 40 del simio (SV40) del CMV), adenovirus (p. ej., el promotor mayor tardío del adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamífero fuertes, tales como los promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Son ejemplos de señales de poliadenilación BGH polyA, poliA temprano o tardío del SV40; alternativamente, se pueden utilizar las regiones no traducidas 3' (3' UTR, por sus siglas en inglés) de los genes de inmunoglobulina, etc.

Los vectores de expresión recombinantes también pueden llevar secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (. ej., orígenes de replicación) y genes de marcadores seleccionables. Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena de longitud completa con la primera unidad de unión a antígeno (Fab de cadena sencilla y dominio Fc) o una porción de unión a antígeno de la misma y/o la cadena de longitud completa con la segunda unidad de unión a antígeno (Fab de cadena sencilla y dominio Fc) o una porción de unión a antígeno de la misma, y los vectores que comprenden estas moléculas de ADN pueden introducirse en células huésped, p. ej., células bacterianas o células eucarióticas superiores, p. ej., células de mamífero, de acuerdo con métodos de transfección bien conocidos de la técnica, incluyendo transfección mediada por liposomas, transfección mediada por policatión, fusión de protoplastos, microinyecciones, precipitación con fosfato de calcio, electroporación o transferencia por vectores víricos.

Preferentemente, las moléculas de ADN codificantes del DLL3 y la cadena CD3 de la proteína de la invención están presentes en dos vectores de expresión que se cotransfectan en la célula huésped, preferentemente una célula de mamífero.

Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son bien conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (c Ho , por sus siglas en inglés), NS0, células SP2/0, células HeLa, células de riñón de hámster neonato (BHK, por sus siglas en inglés), células de riñón de mono (COS, por sus siglas en inglés), células de carcinoma humano (p. ej., células Hep G2 y A-549), células 3T3 o los derivados/progenies de cualquiera de dichas líneas celulares. Pueden utilizarse otras células de mamífero, incluyendo, aunque sin limitación, líneas celulares humanas, de ratón, ratas, mono y roedor, u otras células eucarióticas, incluyendo, aunque sin limitación, células de levadura, insectos y plantas, o células procarióticas, tales como bacterias.

Las proteínas de la invención se producen mediante el cultivo de las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de la proteína en las células huésped. Las moléculas de proteína se recuperan preferentemente del medio de cultivo en forma de un polipéptido secretado o se pueden recuperar a partir de los lisados de células huésped si, por ejemplo, se expresan sin una señal de secreción. Es necesario purificar las moléculas de proteína utilizando métodos estándares de purificación de proteínas utilizados para proteínas recombinantes y proteínas de células huésped, de una manera que se obtengan preparaciones sustancialmente homogéneas de la proteína. A título de ejemplo, entre los métodos de purificación del estado de la técnica que resultan útiles para obtener moléculas de proteínas de la invención se incluyen, como primera etapa, la eliminación de las células y/o residuos celulares particulados del medio de cultivo o lisado. A continuación, se purifica la proteína respecto de proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, por ejemplo, mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía Sephadex, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico. Como etapa final en el procedimiento para obtener una preparación de moléculas de proteína, la molécula de proteína purificada puede secarse, por ejemplo, liofilizarse, tal como se describe posteriormente para aplicaciones terapéuticas.

La presente invención se refiere a proteínas de unión que presentan especificidades de unión para por lo menos dos dianas diferentes. En relación con la presente invención, las moléculas de unión se obtienen de anticuerpos. Entre las técnicas para la creación de moléculas de unión se incluyen, aunque sin limitación, la coexpresión recombinante de dos cadenas de inmunoglobulina con diferentes especificidades (ver Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento n.° WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e ingeniería de "botón-en-ojal" (ver, por ejemplo, la patente n.° US 5.731.168; Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35). Las proteínas de unión de la invención también pueden producirse mediante la manipulación de efectos de direccionamiento electrostático para crear moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento n.° WO 2009/089004A1); entrecruzando dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, la patente n.° US 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras de leucinas para producir proteínas biespecíficas (ver, p. ej., Kostelny et al., Inmunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); utilizando la tecnología de "diacuerpos" para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos (ver, p. ej., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)) y utilizando dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv) (ver, p. ej., Gruber et al., Inmunol., 152:5368 (1994)) y preparando anticuerpos triespecíficos tal como se describe en, p. ej., Tutt et al., Inmunol. 147:60 (1991).

Las composiciones (p. ej., las proteínas de unión multiespecíficas y anticuerpos anti-DLL3) y los métodos dados a conocer en la presente memoria comprenden polipéptidos y ácidos nucleicos que presentan las secuencias especificadas, o secuencias sustancialmente idénticas o similares a las mismas, p. ej., secuencias por lo menos 85 %, 90 % o 95 % idénticas o superiores a la secuencia especificada. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, la expresión "sustancialmente idéntico" se utiliza en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son: i) idénticos, o ii) sustituciones conservadoras de residuos aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos, de tal manera que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos pueden presentar un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común presentan por lo menos aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad respecto a una secuencia de referencia, p. ej., una secuencia proporcionada en la presente memoria. En el contexto de la secuencia de nucleótidos, la expresión "sustancialmente idéntico" se utiliza en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico, de manera que la primera y segunda secuencia de nucleótidos codifican un polipéptido que presenta una actividad funcional común, o codifican un dominio polipeptídico estructural común o una actividad polipeptídica funcional común, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que presentan por lo menos aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad respecto a una secuencia de referencia.

Entre las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, las moléculas de ADN codificantes de las secuencias polipeptídicas mostradas en el listado de secuencias. Asimismo, se describen en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de ADN codificantes de las secuencias polipeptídicas mostradas en el listado de secuencias bajo condiciones de unión y lavado de alta astringencia, según se define en el documento n.° WO 2007/042309. Las moléculas preferentes (desde la perspectiva del ARNm) son aquellas que presentan por lo menos 75 % u 80 % (preferentemente por lo menos 85 %, más preferentemente por lo menos 90 % y lo más preferentemente por lo menos 95 %) de homología o identidad de secuencia respecto a una de las moléculas de ADN descritas en la presente memoria. A título de ejemplo, para expresar los anticuerpos en células eucarióticas, las secuencias de ADN mostradas en el listado de secuencias han sido diseñadas para coincidir con el uso de codones en células eucarióticas. Si se desea expresar los anticuerpos enE. coli,estas secuencias pueden cambiarse para coincidir con el uso de codones deE. coli.Las variantes de las moléculas de ADN descritas en la presente memoria pueden construirse de varias maneras diferentes, tal como se describe en, por ejemplo, el documento n.° WO 2007/042309.

Las proteínas de la invención pueden presentar una secuencia N-terminal modificada, p. ej., una eliminación de uno o más aminoácidos N-terminales, o un intercambio de, p. ej., el primer aminoácido N-terminal (p. ej., glutamato a alanina), para optimizar la molécula para que se exprese utilizando determinados sistemas de expresión (tales como vectores específicos o células huésped), o para que se exprese en forma de cuerpos de inclusión o en forma soluble, o para que se secrete al medio o al espacio periplásmico, o para que quede contenida dentro de la célula, o para producir un producto más homogéneo. Los polipéptidos de la invención pueden presentar una secuencia C-terminal modificada, tal como un alanina adicional, y/o intercambios de aminoácidos adicionales en la parte C-terminal o en otras posiciones definidas dentro de cualquiera de las regiones de marco, tal como se explica en, p. ej., los documentos n.° WO2012/175741, n.° WO2011/075861 o n.° WO2013/024059, con el fin de, p. ej., mejorar adicionalmente la estabilidad o reducir la inmunogenicidad de dichos polipéptidos.

Para evitar dudas, se contemplan todas las realizaciones relacionadas con composiciones farmacéuticas, kits, métodos de tratamiento, usos médicos, combinaciones, métodos de administración y dosis, tal como se describe en la presente memoria, para cualquiera de las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente memoria, ya sea solas o en combinación con otros agentes terapéuticos (tal como se especifica con más detalle a continuación).

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS; MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN; DOSIS.

La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades (tal como se especifica en mayor detalle a continuación), en donde dichas composiciones comprenden por lo menos una proteína de unión multiespecífica de la invención. La invención comprende, además, métodos de tratamiento de una enfermedad (tal como se especifica en mayor detalle a continuación) utilizando por lo menos una proteína multiespecífica de la invención o una composición farmacéutica tal como se expone a continuación, y comprende, además, la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de dicha enfermedad utilizando dicha proteína de unión de la invención o composición farmacéutica.

Las proteínas de unión de la invención (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, D<l>L3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) y/o las composiciones que las comprenden pueden administrarse al paciente que lo necesite de cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación farmacéutica o composición específica a utilizar. De esta manera, las proteínas de unión de la invención y/o las composiciones que comprenden las mismas pueden, por ejemplo, administrarse por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), transdérmica, oralmente, sublingualmente (p. ej., en forma de tableta sublingual, espray o gotas bajo la lengua y absorbidas a través de las membranas mucosas en la red capilar bajo la lengua), (intra-)nasalmente (p. ej., en forma de espray nasal y/o como aerosol), tópicamente, mediante un supositorio, mediante inhalación, o de cualquier otra manera adecuada en una cantidad o dosis eficaz. La proteína de unión puede administrarse mediante infusión, bolo o inyección. En realizaciones preferentes, la administración se lleva a cabo mediante infusión intravenosa o inyección subcutánea.

Las proteínas de unión de la invención y/o las composiciones que comprenden las mismas se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que resulte adecuado para tratar y/o aliviar la enfermedad, trastorno o afección que se desea tratar o aliviar. El médico clínico podrá, en general, determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad, el trastorno o la afección a ser tratada o aliviada, la gravedad de la enfermedad, la gravedad de los síntomas de la misma, la proteína de unión específica de la invención que se utilizará, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica a utilizar, la edad, el género, el peso, la dieta, el estado general del paciente y factores similares bien conocidos por el médico clínico. En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más proteínas de unión de la invención, o de una o más composiciones que contienen las mismas, en cantidades o dosis terapéuticamente eficaces.

Generalmente, para el tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos y afecciones mencionados en la presente memoria y dependiendo de la enfermedad, trastorno o afección específica a tratar, la potencia de la proteína de unión específica de la invención que se va a utilizar, la ruta específica de administración y la formulación o composición farmacéutica específica utilizada, las proteínas de unión de la invención se administrarán generalmente en una cantidad entre 0,005 y 20,0 mg por kilogramo de peso corporal y dosis, preferentemente entre 0,05 y 10,0 mg/kg/dosis, ya sea de forma continua (p. ej., mediante infusión) o más preferentemente en forma de dosis únicas (tales como, p. ej., dosis dos veces a la semana, cada semana o cada mes; ver posteriormente), aunque pueden variar significativamente, especialmente dependiendo de los parámetros mencionados anteriormente. De esta manera, en algunos casos puede resultar suficiente usar menos de la dosis mínima indicada anteriormente, mientras que en otros casos puede ser necesario exceder el límite superior. Al administrar grandes cantidades, puede ser recomendable dividirlas en varias dosis más pequeñas a lo largo del día.

Dependiendo de la proteína de unión específica de la invención y sus propiedades farmacocinéticas y otras, puede administrarse diariamente, cada segundo, tercer, cuarto, quinto o sexto día, semanalmente, mensualmente y similares. Un régimen de administración podría incluir un tratamiento semanal a largo plazo. La expresión "a largo plazo" se refiere a un período de por lo menos dos semanas y, preferentemente, de meses o años de duración.

La eficacia de la proteína multiespecífica de la invención, y de las composiciones que comprenden las mismas, puede someterse a ensayo utilizando cualquier ensayoin vitro,ensayo celular, ensayoin vivoy/o modelo animal conocidoper se,o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad específica involucrada. Los ensayos y modelos animales adecuados resultarán evidentes para el experto en la materia, y entre ellos se incluyen, por ejemplo, los ensayos y modelos animales utilizados en el apartado de Ejemplos, posteriormente.

FORMULACIONES

Para el uso farmacéutico, las proteínas de unión de la invención pueden formularse en forma de una preparación farmacéutica que comprende: (i) por lo menos una proteína de unión de la invención (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) y (ii) por lo menos un portador, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable, y (iii) opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacológicamente activos adicionales. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que el material respectivo no muestra efectos biológicos o de otro tipo indeseables cuando se administra a un individuo y no interactúa de manera perjudicial con ninguno de los demás componentes de la composición farmacéutica (tales como, p. ej., el ingrediente farmacéuticamente activo) en la que se encuentran contenidos. Se pueden encontrar ejemplos específicos en manuales estándares, tales como, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, EE. UU. (1990). Por ejemplo, las proteínas de unión de la invención pueden formularse y administrarse de cualquier manera conocidaper separa anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpos y otras proteínas farmacéuticamente activas. De esta manera, según una realización adicional, la invención se refiere a una composición o preparación farmacéutica que contiene por lo menos una proteína de unión de la invención y por lo menos un portador, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente una o más sustancias farmacológicamente activas, en forma de formulaciones liofilizadas o de otro modo secas o soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas.

Las preparaciones farmacéuticas para administración parenteral, tal como inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o infusión intravenosa, pueden ser, por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo y que resultan adecuados, opcionalmente después de un etapa adicional de disolución o dilución, para la infusión o inyección. Entre los portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones se incluyen, aunque sin limitación, agua y soluciones y tampones acuosos estériles farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina fosfatada fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank; aceites hidrosolubles, glicerol; etanol; glicoles, tales como el propilenglicol, así como aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, tales como el aceite de cacahuete y el aceite de soja, así como mezclas adecuadas de los mismos.

Las soluciones de las proteínas de unión de la invención pueden contener, además, un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos, tales como agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, p-hidroxi-benzoatos, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal (sales de metales alcalinos del mismo), ácido etilendiaminotetraacético, y similares. En muchos casos, resultará preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro sódico. Opcionalmente, se pueden utilizar emulsionantes y/o dispersantes. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o mediante el uso de surfactantes. También se pueden añadir otros agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, el monostearato de aluminio y la gelatina. Las soluciones pueden introducirse en viales de inyección, ampollas, frascos de infusión y similares.

En todos los casos, la forma de administración final debe ser estéril, líquida y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado junto con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de la esterilización por filtración. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío y las técnicas de liofilización, que producen unos polvos del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado presente en las soluciones previamente filtradas a esterilidad.

Habitualmente resultarán preferentes las soluciones o suspensiones acuosas. En general, las formulaciones adecuadas para proteínas terapéuticas, tales como las proteínas de unión de la invención, son soluciones de proteínas tamponadas, tales como soluciones que incluyen la proteína a una concentración adecuada (tal como de 0,001 a 400 mg/ml, preferentemente de 0,005 a 200 mg/ml, más preferentemente de 0,01 a 200 mg/ml, más preferentemente de 1,0 a 100 mg/ml, tal como 1,0 mg/ml (administración intravenosa) o 100 mg/ml (administración subcutánea) y un tampón acuoso, tal como:

- solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4,

- otros tampones de fosfato, pH 6,2 a 8,2,

- tampones de acetato, pH 3,2 a 7,5, preferentemente pH 4,8 a 5,5,

- tampones de histidina, pH 5,5 a 7,0,

- tampones de succinato, pH 3,2 a 6,6, y

- tampones de citrato, pH 2,1 a 6,2,

y, opcionalmente, sales (p. ej., NaCl) y/o azúcares (tales como, p. ej., sacarosa y trehalosa) y/o otros polialcoholes (tales como, p. ej., manitol y glicerol) para proporcionar isotonicidad a la solución.

Además, pueden incluirse otros agentes, tales como un detergente, p. ej. Tween-20 o Tween-80 al 0,02 %, en tales soluciones. Las formulaciones para aplicación subcutánea pueden incluir concentraciones significativamente más altas del anticuerpo de la invención, tales como hasta 100 mg/ml o incluso superiores a 100 mg/ml. Sin embargo, resultará evidente para el experto en la materia que los ingredientes y las cantidades de los mismos indicadas anteriormente representan solo una opción preferente. Las alternativas y variaciones de las mismas resultarán inmediatamente evidentes para el experto en la materia, o podrán concebirse fácilmente a partir de la exposición anterior. Las formulaciones indicadas anteriormente pueden proporcionarse opcionalmente en forma de una formulación liofilizada que debe reconstituirse en una solución, p. ej., en agua para inyección (WFI, por sus siglas en inglés).

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, una proteína de unión de la invención puede utilizarse en combinación con un dispositivo útil para la administración de proteínas, tal como una jeringa, una pluma inyectora, una microbomba u otro dispositivo.

MÉTODO DE TRATAMIENTO

Un aspecto adicional descrito en la presente memoria es un método de tratamiento del cáncer, que comprende la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión de la invención.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una proteína de unión de la invención para la utilización en un método de tratamiento del cáncer.

Un aspecto adicional descrito en la presente memoria es el uso de la proteína de unión de la invención para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Para evitar dudas, los aspectos de uso médico de la invención pueden comprender cualquiera de las proteínas de unión específicas de la invención tal como se ha indicado anteriormente (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cáncer" se refiere a todos los tipos de crecimiento canceroso o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos con transformación neoplásica maligna, independientemente del tipo histopatológico o del estadio de invasividad.

Los cánceres de ejemplo cuyo crecimiento puede inhibirse utilizando las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente memoria son cualquier tumor que exprese DLL3, preferentemente CPM, CNECG, glioma, glioblastoma, melanoma u otros tumores neuroendocrinos que expresan DLL3 (p. ej., cáncer de próstata neuroendocrino o cáncer de páncreas neuroendocrino, o cáncer vesicular microcítico).

Los tumores neuroendocrinos (TNE) surgen del sistema endocrino disperso y pueden ocurrir en muchas zonas diferentes del cuerpo. Tradicionalmente, los TNE se han clasificado según su sitio anatómico de origen y suelen ser altamente agresivos. Se encuentran más comúnmente en el tracto gastrointestinal, páncreas o en los pulmones (carcinoma de pulmón microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes), así como en los riñones o en el tracto genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio). Los TNE incluyen determinados tumores del tracto gastrointestinal y de las células de los islotes pancreáticos, determinados tumores del timo y de pulmón, y el carcinoma medular de las células parafoliculares del tiroides.

Los cánceres adicionales cuyo crecimiento puede inhibirse utilizando las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente memoria son tumores pseudoneuroendocrinos pseudo (TpNE) que comparten determinadas características genotípicas, fenotípicas o bioquímicas con los tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente.

En algunas realizaciones, los siguientes cánceres, tumores y otras enfermedades proliferativas pueden tratarse con proteínas de unión multiespecíficas de la invención: cáncer de pulmón; preferentemente CPM, CPNM o CNECG, mama, de cuello uterino, colon, colorrectal, endometrial, de cabeza y cuello, hepático (hepatoblastoma o carcinoma hepatocelular), de ovario, páncreas, próstata, piel; gástrico, de testículo, de tiroides, suprarrenal, renal, vesicular, uterino, esofágico, cáncer urotelial, tumor cerebral, linfoma, sarcoma de Ewing, y otros tumores neuroendocrinos y de células redondas pequeñas azules.

En una realización preferente de la invención, el cáncer es cáncer pulmonar microcítico (CPM) o glioblastoma.

Todos los cánceres, tumores, neoplasias, etc., mencionados anteriormente, que se caracterizan por su ubicación/origen específico en el cuerpo, deben incluir tanto los tumores primarios como los tumores metastásicos derivados de los mismos.

Es posible que el paciente presente más probabilidades de responder al tratamiento con una proteína de unión de la invención (tal como se describe en la presente memoria) si ese paciente presenta un cáncer que se caracteriza por una alta expresión de DLL3. De esta manera, en algunas realizaciones, el cáncer que se tratará con las proteínas de unión de la invención es un cáncer con alta expresión de DLL3, p. ej., la expresión de DLL3 es más alta que la expresión media en células cancerosas de una población de pacientes que sufren del mismo tipo de cáncer que expresa DLL3.

Las proteínas de unión de la invención pueden utilizarse en regímenes terapéuticos en el contexto de tratamientos de primera línea, segunda línea o cualquier tratamiento adicional y tratamiento de mantenimiento.

Las proteínas de unión de la invención pueden utilizarse para la prevención o el tratamiento a corto o largo plazo de las enfermedades mencionadas anteriormente, opcionalmente también en combinación con radioterapia, uno o más agentes terapéuticos adicionales y/o cirugía.

En realizaciones preferentes, la proteína de la invención se utiliza para el tratamiento del cáncer en combinación con un antagonista de PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PDL-1. Preferentemente, el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5, tal como se describe en la presente memoria (tal como se define en las secuencias en la Tabla A, posteriormente) y en el documento n.° WO2017/198741 (). Preferentemente, dicho anticuerpo anti-PDL-1 se selecciona del grupo que consiste en atezolizumab, avelumab y durvalumab. En realizaciones preferentes particulares, la proteína de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, D<l>L3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se utiliza para el tratamiento del cáncer en combinación con PD1-1. En realizaciones preferentes particulares, la proteína de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se utiliza para el tratamiento del cáncer en combinación con PD1-2. En realizaciones preferentes particulares, la proteína de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se utiliza para el tratamiento del cáncer en combinación con PD1-3. En realizaciones preferentes particulares, la proteína de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se utiliza para el tratamiento del cáncer en combinación con PD1-4. En realizaciones preferentes particulares, la proteína de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se utiliza para el tratamiento del cáncer en combinación con PD1-5.

Tabla A: Las secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO de las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos anti-PD1 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5.

De acuerdo con dichas realizaciones preferentes y cualquier otro de los aspectos de la presente invención, los anticuerpos PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5 son moléculas de anticuerpo tal como se da a conocer en el documento n.° WO2017/198741, y se definen mediante las secuencias mostradas en la Tabla A, anteriormente.

De acuerdo con lo anterior, PD1-1 presenta una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:256 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:257;

PD1-2 presenta una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:258 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:259,

PD1-3 presenta una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:260 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:261,

PD1-4 presenta una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:262 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:263, y

PD1-5 presenta una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:264 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:265.

Lo anterior incluye, además, el uso de las proteínas de unión de la invención en diversos métodos de tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente, mediante la administración de una dosis terapéuticamente eficaz a un paciente que lo necesite, así como el uso de estas proteínas de unión para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de dichas enfermedades, así como composiciones farmacéuticas que incluyen dichas proteínas de unión de la invención, así como la preparación y/o fabricación de medicamentos que incluyen dichas proteínas de unión de la invención, y similares.

COMBINACIONES CON OTRAS SUSTANCIAS ACTIVAS O TRATAMIENTOS

Una proteína de unión de la invención puede utilizarse por sí sola o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en particular en combinación con un agente quimioterapéutico como agentes que dañan el ADN, un compuesto terapéuticamente activo que inhibe la angiogénesis, un inhibidor de la vía de transducción de señales, un inhibidor de EGFR, un inmunomodulador, un inhibidor de punto de control inmunitario, un inhibidor de punto de control mitótico o un agente de terapia hormonal.

El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente con la proteína de unión a DLL3/CD3, opcionalmente como un componente de la misma preparación farmacéutica, o antes o después de la administración de la proteína de unión a DLL3/CD3.

Entre las sustancias activas citostáticas y/o citotóxicas que pueden administrarse en combinación con moléculas de unión de la invención se incluyen, aunque sin limitación, hormonas, análogos de hormonas y antihormonas, inhibidores de aromatasa, agonistas y antagonistas de LHRH, inhibidores de factores de crecimiento (factores de crecimiento tales como, por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), el factor de crecimiento epidérmico humano (HER, por ejemplo, HER2, HER3, HER4) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)), los inhibidores son, por ejemplo, anticuerpos (anti-)factores de crecimiento, anticuerpos de receptores de (anti-)factores de crecimiento e inhibidores de tirosina quinasas, tales como por ejemplo cetuximab, gefitinib, afatinib, nintedanib, imatinib, lapatinib, bosutinib y trastuzumab; antimetabolitos (p. ej., antifolatos, tales como metotrexato, raltitrexed, análogos de pirimidina, tales como 5-fluorouracilo (5-FU), gemcitabina, irinotecán, doxorrubicina, TAS-102, capecitabina y gemcitabina, análogos de purinas y adenosina, tales como mercaptopurina, tioguanina, cladribina y pentostatina, citarabina (ara C), fludarabina); antibióticos antitumorales (p. ej., antraciclinas); derivados de platino (p. ej., cisplatino, oxaliplatino y carboplatino); agentes de alquilación (p. ej., estramustina, mecloretamina, melphalan, clorambucil, busulfán, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, temozolomida, nitrosoureas, tales como por ejemplo carmustina y lomustina, y tiotepa); agentes antimitosis (p. ej., alcaloides vinca, tales como por ejemplo vinblastina, vindesina, vinorelbine y vincristina; y taxanos, tales como paclitaxel, docetaxel); inhibidores de angiogénesis, incluyendo bevacizumab, ramucirumab y aflibercept, inhibidores de tubulina; inhibidores de la síntesis de ADN, inhibidores de PARP, inhibidores de topoisomerasa (p. ej., epipodofilotoxinas, tales como por ejemplo etopósido y etopofos, tenipósido, amsacrina, topotecán, irinotecán y mitoxantrona), inhibidores de serina/treonina quinasa (p. ej., inhibidores de PDK1, inhibidores de Raf, inhibidores de A-Raf, inhibidores de B-Raf, inhibidores de C-Raf, inhibidores de mTOR, inhibidores de mTORC1/2, inhibidores de PI3K, inhibidores de PI3Ka, inhibidores duales de mTOR/PI3K, inhibidores de STK33, inhibidores de AKT, inhibidores de PLK1 (tales como volasertib), inhibidores de CDKs, incluyendo inhibidores de CDK9, inhibidores de quinasas deAurora),inhibidores de tirosina quinasas (p. ej., inhibidores de PTK2/FAK), inhibidores de interacciones proteína-proteína, inhibidores de MEK, inhibidores de ERK, inhibidores de FLT3, inhibidores de BRD4, inhibidores de IGF-1R, inhibidores de Bcl-xL, inhibidores de Bcl-2, inhibidores de Bcl-2/Bcl-xL, inhibidores de receptores ErbB, inhibidores de BCR-ABL, inhibidores de ABL, inhibidores de Src, análogos de rapamicina (p. ej., everolimus, temsirolimus, ridaforolimus y sirolimus), inhibidores de la síntesis de andrógenos, inhibidores de receptores de andrógenos, inhibidores de DNMT, inhibidores de HDAC, inhibidores de ANG1/2, inhibidores de CYP17, radiofármacos, agentes inmunoterapéuticos, tales como inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., CTLA4, PD1, PD-L1, LAG3 y moléculas de unión/inmunoglobulinas de TIM3, tales como ipilimumab, nivolumab y pembrolizumab) y diversos agentes quimioterapéuticos, tales como amifostina, anagrelid, clodronato, filgrastim, interferón, interferón alfa, leucovorina, rituximab, procarbazina, levamisole, mesna, mitotano, pamidronato y porfímero; inhibidores del proteasoms (tales como bortezomib); miméticos de Smac y BH3; agentes que restauran la funcionalidad de p53, incluido el antagonista de mdm2-p53; inhibidores de la vía de señalización de Wnt/beta-catenina, y/o inhibidores de la quinasa 9 dependiente de ciclina.

Resultan particularmente preferentes los tratamientos con las moléculas de unión de la invención en combinación con uno o más agentes inmunoterapéuticos, incluidos los agentes anti-PD-1 y anti-PD-LI, y los agentes anti-LAG3: entre los agentes anti-PD1 de ejemplo se incluyen, aunque sin limitación, el anticuerpo anti-PD-1 PDR-001, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab y PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5, tal como se dan a conocer en la presente memoria (Tabla A) y en el documento n.° WO2017/198741. Entre los agentes anti-PDL-1 de ejemplo se incluyen, aunque sin limitación, atezolizumab, avelumab y durvalumab. En realizaciones preferentes, la molécula de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se combina con PD1-1. En realizaciones preferentes, la molécula de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se combina con PD1-2. En realizaciones preferentes, la molécula de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se combina con PD1-3. En realizaciones preferentes, la molécula de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se combina con PD1-4. En realizaciones preferentes, la molécula de unión de la invención (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 y DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) se combina con PD1-5.

En determinadas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser un agente inmunoterapéutico adicional, tal como moduladores de: TIM-1, TIM-3, TIM-4, PD-L2, LAG3, CTLA-4, galectina-9, galectina-1, CD69, CD113, GPR56, CD48, GARP, CAECAM-1, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2B4, CEACAM, CD39, TGFp, IL-10, ligando Fas, ICOS, familia B7 (B7-1, B7-2, B7-H1 (PDL-1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), o B7-H6).

En algunas realizaciones, el agente inmunoterapéutico adicional es un miembro de la familia de moléculas TNF que se une a los miembros de la familia de receptores de TNF cognados, entre los que se incluyen CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-lBBL, CD137, GITR, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TLlA, TRAMP/DR3, EDAR, EDAl, XEDAR, EDA2, TNFRl, linfotoxina-a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, linfotoxina-aip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY y NGFR.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un mimético de SMAC. Los miméticos de SMAC son compuestos que se unen a los inhibidores de proteínas de appoptosis (IPA) y presentan una función inmunomoduladora, actuar como mediador en la inducción de citoquinas sistémicas (p. ej., IL-6, TNFa,etc.)y quimioquinas (p. ej., MCP-1) cuando se administran a animales o seres humanos. En algunas realizaciones, el mimético de<s>M<a>C es: (i)<l>C<l>161, es decir, el compuesto A en el Ejemplo 1 del documento n.° WO 2008/016893 (páginas 28/29; [122]), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (ii) el mimético de SMAC conocido como Debio-1143, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, (iii) el mimético de SMAC conocido como birinapant, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, (iv) el mimético de SMAC conocido como ASTX-660, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o (v) el mimético de SMAC conocido como CUDC-427, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, el agente inmunoterapéutico adicional se selecciona de: (i) antagonistas de citoquinas que inhiben la activación de células T (p. ej., IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF; "citoquinas inmunosupresoras") y/o (ii) agonistas de citoquinas que estimulan la activación de células T y/o citoquinas tales como IL2, para estimular una respuesta inmune, p. ej., para tratar enfermedades proliferativas, tales como el cáncer.

En algunas realizaciones, el agente inmunoterapéutico adicional es un agonista de una proteína que estimula la activación de las células T, tales como CD28, GITRL, OX40L, CD27 y CD28H.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un virus oncolítico, incluyendo, aunque sin limitación, un virus oncolítico derivado del virus vaccinia, adenovirus (AdV), virus del herpes simple (VHS1 o VHS2), reovirus, virus del mixoma (VMIX), poliovirus, virus de la estomatitis vesicular (VEV), virus de Maraba, virus de la varicela, virus del sarampión (VS) o virus de la enfermedad de Newcastle (VEN).

USOS DIAGNÓSTICOS

Las moléculas de anticuerpos anti-DLL3 descritas en la presente memoria resultan útiles en métodos diagnósticos y pronósticos, y pueden utilizarse para marcar, localizar o identificar células o tejidos que expresan DLLE (p. ej., en ensayos de ELISA, ensayos de FACS, inmunohistología o similares) mediante la unión de un pigmento, un fármaco u otra molécula con especificidad de unión para un antígeno diferente. Por ejemplo, se puede conjugar un marcaje detectable con la molécula de anticuerpo anti-DLL3 descrita en la presente memoria o puede utilizarse un reactivo secundario que se une específicamente a la molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria y que se está conjugado con un marcaje detectable (p. ej., un anticuerpo secundario) en dichos métodos diagnósticos. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de DLL3 se unen específicamente a DLL3 expresado en las células, ya sea en el citoplasma y/o en la superficie celular, y se utilizan para localizar y/o identificar dichas células. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de DLL3 proporcionados en la presente memoria se utilizan para identificar células o tejidos que expresan DLL3 (p. ej. células tumorales).

Los anticuerpos descritos en la presente memoria se seleccionan de manera que presentan un alto nivel de especificidad de unión a epítopos y una alta afinidad de unión al polipéptido DLL3. En general, cuanto mayor es la afinidad de unión de un anticuerpo, más estrictas pueden ser las condiciones de lavado aplicadas en un ensayo inmunológico para eliminar material unido no específicamente sin eliminar el polipéptido diana.

De esta manera, en la presente memoria se proporcionan métodos para detectar DLL3 en una muestra biológica. Específicamente, en un aspecto, en la presente memoria se describe un método de detectar DLL3 en una muestra (p. ej., una muestra de tejido o una muestra de tejido tumoral) que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo de la invención, y

(b) detectar el anticuerpo anti-DLL3 unido a DLL3.

Se puede obtener/aislar una muestra biológica a partir de cualquier tejido (incluidas las biopsias), célula o líquido corporal de un sujeto. En una realización preferente, la muestra es una muestra de tejido, preferentemente una muestra de tejido tumoral. En una realización específica, la muestra es una muestra de tejido (tumoral) fijado, preferentemente una muestra de tejido fijada en formalina e incluida en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés), más preferentemente una muestra de tejido tumoral fijada en formalina e incluida en parafina (FFPE).

Las muestras se dividen típicamente en varias porciones y se fijan a un medio para el análisis de microscopía, tal como un portaobjetos de microscopio. En donde la muestra es una muestra de tejido, las varias porciones pueden ser secciones de tejido. En algunas realizaciones, se realizan secciones en serie de muestras de tejido FFPE. En algunas realizaciones, se realizan secciones en serie de una pluralidad de sitios diferentes de un bloque FFPE, lo que se puede hacer para capturar tanto la heterogeneidad intrasección como la heterogeneidad intrabloque. En algunas realizaciones, se realizan secciones en serie de una pluralidad de diferentes muestras de biopsia obtenidas de diferentes ubicaciones en el mismo tumor, lo que se puede llevar a cabo para capturar tanto la heterogeneidad intrasección como la heterogeneidad intratumoral. Normalmente, las muestras de tejido primero en primer lugar pasan por el desparafinado, la recuperación de antígenos (p. ej., con proteinasa K) antes de la detección de antígenos. La muestra de tejido se puede obtener/aislar a partir de una variedad de tejidos (p. ej., de una biopsia), específicamente tejidos obtenidos de tumores, incluyendo, aunque sin limitación, CPM, CNECG, glioma, glioblastoma, melanoma u otros tumores neuroendocrinos (p. ej., cáncer de próstata neuroendocrino o cáncer de páncreas neuroendocrino o cáncer vesicular microcítico).

Los tumores adicionales de ejemplo a partir de los cuales se puede obtener/aislar una muestra (de tejido) se incluyen cáncer de pulmón; preferentemente CPM, CPNM o CNECG, de mama, de cuello uterino, de colon, colorrectal, endometrial, de cabeza y cuello, hepático (hepatoblastoma o carcinoma hepatocelular), de ovario, páncreas, próstata o piel; gástrico, de testículo, de tiroides, suprarrenal, renal, vesicular, uterino, esofágico, cáncer urotelial, tumor cerebral, linfoma, sarcoma de Ewing, y otros neuroendocrinos (incluidos los tumores pseudoendocrinos) y tumores de células pequeñas redondas y azules.

Los métodos de ejemplo de detección de DLL3 en una muestra son inmunocitoquímica (ICQ), inmunohistoquímica (IHQ), transferencia western, citometría de flujo y/o ELISA.

En una realización preferente, DLL3 se detecta mediante IHQ.

En un aspecto específico descrito en la presente memoria, el método para detectar DLL3 en una muestra de tejido comprende:

a) poner en contacto una muestra de tejido (p. ej., un tejido tumoral, tal como CPM, glioblastoma o tumores neuroendocrinos), preferentemente dicha muestra de tejido es una muestra de tejido fijado (p. ej., fijada con formalina e incluida en parafina), con un anticuerpo de la invención (p. ej., DLL3 n.° 1 o DLL3 n.° 5), b) dejar que se formen los complejos de anticuerpo-antígeno en la muestra, y

c) detectar el anticuerpo anti-DLL3 unido a DLL3.

En algunas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria, el anticuerpo anti-DLL3 se detecta mediante una señal detectable; preferentemente, la señal detectable es generada por un marcaje detectable. En una realización preferente del método descrito en la presente memoria, la señal detectable se detecta en un ensayo de IHQ. En algunas realizaciones, la señal detectable se detecta en un ensayo ELISA, mediante citometría de flujo o mediante transferencia western. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para detectar DLL3 presente sobre la superficie celular de una célula (p. ej., una célula tumoral), utilizando, por ejemplo, citometría de flujo. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para detectar la presencia de DLL3 en una muestra de tejido (p. ej., una muestra de tejido tumoral) utilizando ELISA, transferencia western o IHQ.

En algunas realizaciones, el marcaje detectable está conjugado directamente con el anticuerpo anti-DLL3 y, por lo tanto, se deposita sobre la muestra al unirse el anticuerpo anti-DLL3 a DLL3, lo que se conoce generalmente como un método de marcaje directo). Los métodos de marcaje directo frecuentemente son más directamente cuantificables, aunque con frecuencia adolecen de falta de sensibilidad. En otras realizaciones, la deposición del marcaje detectable se lleva a cabo mediante el uso de un reactivo de detección secundaria que se une específicamente a la molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria y que está conjugado con un marcaje detectable (p. ej., un anticuerpo secundario); lo anterior se denomina generalmente "método de marcaje indirecto". En algunas realizaciones, el reactivo de detección secundaria específico puede ser un anticuerpo secundario específico de especie, un anticuerpo antihapteno que se une a un anticuerpo anti-DLL3 conjugado con hapteno, o una proteína que se une a biotina unida a un anticuerpo anti-DLL3 biotinilado).

Entre los ejemplos particulares de marcajes detectables que pueden conjugarse ya sea con el anticuerpo anti-DLL3 de la invención o con un reactivo secundario de detección, se incluyen moléculas y materiales cromogénicos, fluorescentes, fosforescentes, luminiscentes y radiactivos, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como mediante conversión de una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o mediante la producción de un precipitado o incrementar la turbidez de la muestra), haptenos que pueden detectarse a través de interacciones de unión anticuerpo-hapteno utilizando conjugados de anticuerpos marcados detectablemente adicionales, y moléculas o materiales paramagnéticos y magnéticos.

Por ejemplo, el marcaje detectable puede ser un enzima, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), fosfatasa alcalina (FA), fosfatasa ácida, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, p-glucuronidasa y p-lactamasa; un fluoróforo, tal como fluoresceínas, luminóforos, cumarinas, pigmentos BODIPY, resorufinas y rodaminas; nanopartículas, tales como puntos cuánticos (patentes US n.° 6.815.064, n.° 6.682.596 y n.° 6.649.138); quelatos metálicos, tales como los quelatos DOTA y DPTA de iones metálicos radiactivos o paramagnéticos, tales como Gd <3+>; y liposomas, por ejemplo, liposomas que contienen moléculas fluorescentes atrapadas.

En el caso de que el marcaje detectable incluya un enzima, se puede utilizar un sustrato detectable, tal como un cromógeno, un compuesto fluorogénico o un compuesto luminogénico, en combinación con el enzima, para generar una señal detectable. Entre los ejemplos particulares de compuestos cromogénicos se incluyen diaminobencidina (DAB), 4-nitrofenilfosfato (pNPP), Rojo rápido, fosfato de bromoclorindolilo (BCIP, por sus siglas en inglés), nitroazul de tetrazolio (NBT, por sus siglas en inglés), BCIP/NBT, Rojo rápido, AP Naranja, AP Azul, tetrametilbencidina (TMB), sulfonato de 2,2'-azino-di-[3-etilbencotiazolina] (ABTS, por sus siglas en inglés), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-D-galactopiranósido (ONPG), o-fenilendiamina (OPD), 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -galactopiranósido (X-Gal), metilumbeliferil-D-galactopiranósido (MU-Gal), p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucurónido (X-Gluc), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), fucsina, yodonitrotetrazolio (INT), tetrazolio azul y tetrazolio violeta.

En algunos ejemplos, la fracción detectable es un fluoróforo, que pertenece a varias clases químicas comunes, incluyendo cumarinas, fluoresceínas (o derivados y análogos de fluoresceína), rodaminas, resorufinas, luminóforos y cianinas.

En otras realizaciones, la fracción detectable es una molécula detectable mediante microscopía de campo brillante, tal como colorantes que incluyen diaminobencidina (DAB), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple), N,N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonato-indo-dicarbocianina (Cy5) y rodamina-110 (rodamina).

Los haptenos son moléculas pequeñas a las que se unen específicamente los anticuerpos, aunque por sí solas no inducen una respuesta inmune en el animal y deben unirse primero a una molécula transportadora más grande, tal como una proteína, para generar una respuesta inmune. Entre los ejemplos de haptenos se incluyen dinitrofenilo, biotina, digoxina y fluoresceína.

Además, en un aspecto se proporcionan en la presente memoria métodos para diagnosticar o identificar un tumor, tal como un tumor que expresa DLL3 (expresión de DLL3 en el citoplasma y/o en la superficie celular), que comprende detectar DLL3 en una muestra (p. ej., una muestra de tejido tumoral) del sujeto utilizando los anticuerpos anti-DLL3 (p. ej., DLL3 n.° 1 o DLL3 n.° 5) descritos en la presente memoria (p. ej., mediante IHQ en una muestra de tejido tumoral). En un aspecto adicional, se proporcionan en la presente memoria métodos para seleccionar una terapia con diana en DLL3 para un sujeto, que comprenden la detección de DLL3 en una muestra (p. ej., una muestra de tejido tumoral) del sujeto utilizando anticuerpos anti-DLL3 (p. ej., DLL3 n.° 1 o DLL3 n.° 5) descritos en la presente memoria (p. ej., mediante IHQ en una muestra de tejido tumoral). En un aspecto adicional, se proporcionan en la presente memoria métodos para el seguimiento del efecto terapéutico (p. ej., de una terapia con diana en DLLE) en un sujeto, que comprenden la detección de DLL3 en una muestra (p. ej., una muestra de tejido tumoral) del sujeto utilizando anticuerpos anti-DLL3 (p. ej., DLL3 n.° 1 o DLL3 n.° 5) descritos en la presente memoria (p. ej., mediante IHQ en una muestra de tejido tumoral).

Las moléculas de anticuerpos anti-DLL3 descritas en la presente memoria también pueden utilizarse con dianas celulares. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de DLL3 proporcionados en la presente memoria se utilizan para administrar un fármaco o agente citotóxico en una célula diana (p. ej., una célula tumoral que expresa DLL3) mediante la unión de dicho fármaco o agente citotóxico a dicho anticuerpo de DLL3, lo que, por ejemplo, mata dicha célula diana.

KITS

La invención comprende, además, kits que comprenden por lo menos una proteína de unión multiespecífica de la invención (p. ej., cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) y opcionalmente otro u otros componentes seleccionados del grupo que consiste en otros fármacos utilizados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos indicados anteriormente.

En una realización, el kit incluye una composición que contiene una cantidad eficaz de una proteína de unión de la invención en forma de dosis unitaria.

La invención comprende, además, kits que comprenden por lo menos una proteína de unión multiespecífica de la invención y otro u otros componentes seleccionados del grupo que consiste en otros fármacos utilizados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos indicados anteriormente.

En una realización, el kit incluye una composición que contiene una cantidad eficaz de una proteína de unión multiespecífica de la invención en forma de administración unitaria (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1 o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2).

En una realización adicional, el kit incluye tanto una composición que contiene una cantidad eficaz de una proteína de unión multiespecífica de la invención en forma de dosis unitaria (preferentemente cualquiera de DLL3 n.° 1/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 1/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 1, DLL3 n.° 2/CD3 n.° 2, DLL3 n.° 3/CD3 n.° 1, o DLL3 n.° 3/CD3 n.° 2) como una composición que contiene una cantidad eficaz de un antagonista de PD-1 en forma de dosis unitaria, tal como un anticuerpo antiD-1, lo más preferentemente PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, y PD1-5, tal como se describen en la presente memoria (p. ej., en la Tabla A) y en el documento n.° WO2017/198741.

En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente estéril que contiene tal composición; dichos recipientes pueden ser cajas, ampollas, frascos, viales, tubos, bolsas, sobres, paquetes de blísteres u otras formas de contenedor adecuadas conocidas de la técnica. Estos recipientes pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, papel de aluminio o de otros materiales adecuados para contener medicamentos. Además, el kit puede comprender la composición farmacéutica en un primer recipiente con la proteína de unión de la invención en forma liofilizada y un segundo recipiente con un diluyente farmacéuticamente aceptable (p. ej., agua estéril) para inyección. El diluente farmacéuticamente aceptable se puede utilizar para la reconstitución o dilución de la proteína de unión.

Si se desea, se proporciona una proteína de unión multiespecífica de la invención junto con instrucciones para administrar las proteínas de unión multiespecíficas a un sujeto que presenta cáncer. Las instrucciones generalmente incluirán información sobre el uso de la composición para el tratamiento o la prevención de un cáncer. En otras realizaciones, las instrucciones incluyen por lo menos uno de los siguientes: descripción del agente terapéutico, cronograma de dosificación y administración para el tratamiento o prevención del cáncer o síntomas del mismo; precauciones, advertencias, indicaciones, contraindicaciones, información sobre sobredosis, reacciones adversas, farmacología animal, estudios clínicos y/o referencias. Las instrucciones pueden estar directamente imprimidas en el envase (en caso de estar presentes), o en forma de una etiqueta aplicada en el envase, o como una hoja separada, folleto, tarjeta o carpeta suministrada dentro o con el envase.

Tal se expone en la presente memoria, la presente exposición proporciona, además, métodos diagnósticos para determinar la expresión de DLL3 en una muestra biológica. En un aspecto, la presente exposición proporciona kits para llevar a cabo estos métodos, así como instrucciones para llevar a cabo los métodos de la presente exposición, tales como la recogida de tejido y/o la realización de la prueba de detección, y/o el análisis de los resultados.

El kit comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o todavía adicionalmente consiste en, una composición de anticuerpos de DLL3 descrita en la presente memoria (p. ej., anticuerpos monoclonales) e instrucciones de utilización. Los kits resultan útiles para detectar la presencia de polipéptidos DLL3 en una muestra biológica, p. ej., en cualquier líquido corporal o en muestras de biopsia de tejido corporal. En algunas realizaciones, el kit puede comprender: uno o más anticuerpos de DLL3 capaces de unirse a un polipéptido DLL3 en una muestra (p. ej., anticuerpo anti-DLL3 DLL3 n.° 1 o DLL3 n.° 5); medios para detectar el polipéptido DLL3 en la muestra, y opcionalmente medios para comparar la señal/cantidad del polipéptido DLL3 en la muestra con un control. Uno o más de los anticuerpos anti-DLL3 descritos en la presente memoria pueden marcarse. Los componentes del kit (p. ej., reactivos) pueden envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender, además, instrucciones de utilización del kit para detectar los polipéptidos<d>LL3. En determinadas realizaciones, el kit comprende un anticuerpo anti-DLL3 descrito en la presente memoria (un primer anticuerpo) y un segundo anticuerpo diferente que se une ya sea al polipéptido DLL3 o al primer anticuerpo y se conjuga con un marcaje detectable.

El kit puede comprender, además, p. ej., un agente tampón, un conservante o un agente estabilizante de proteínas. El kit puede comprender, además, componentes necesarios para detectar el marcaje detectable, p. ej., un enzima o un sustrato. El kit puede contener, además, una muestra de control o una serie de muestras de control, que pueden someterse a ensayo y compararse con la muestra de ensayo. Cada componente del kit puede estar contenido dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo envase, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados utilizando el kit. Los kits de la presente exposición pueden contener un producto escrito sobre o dentro del recipiente del kit. El producto escrito describe cómo usar los reactivos contenidos en el kit.

Según resulte conveniente, estos componentes sugeridos del kit pueden envasarse del modo habitual para su uso por el experto en la materia. Por ejemplo, dichos componentes sugeridos del kit pueden proporcionarse en solución o en forma de una dispersión líquida o similar.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Diseño y construcción de proteínas de unión a CD3/DLL3.

Los presentes inventores han desarrollado proteínas de unión multiespecíficas de unión a DLL3 y CD3 que inducen la activación de células T, lo que conduce a la lisis de las células tumorales que expresan DLL3. El diseño molecular utilizado presenta un andamiaje de anticuerpo IgG y una estructura similar a IgG. Presenta tecnología de botón-enojal en el Fc para la heterodimerización de los brazos de botón (anti-DLL3) y ojal (anti-CD3). Además, la proteína de unión presenta secuencias peptídicas flexibles entre la cadena ligera y la correspondiente cadena pesada en cada brazo. De esta manera, la proteína de unión comprende dos brazos: uno que se une a CD3 y el otro que se une a DLL3, en donde cada brazo comprende un Fab de cadena sencilla y una región Fc.

Preferentemente, la molécula de unión es biespecífica y bivalente (monovalente para cada una de las dos dianas).

Preparación de dominios de unión que reconocen DLL3 y CD3 utilizando recuperación de genes V de alto rendimiento a partir de hibridomas y células B individuales en cultivo.

Para obtener ligantes anti-DLL3, hibridomas o células B individuales derivadas de ratones de tipo salvaje inmunizados con DLL3 y ratones humanizados AlivaMab (Ablexis, San Francisco, CA, EE. UU.) La plataforma de ratones transgénicos AlivaMab (con loci de inmunoglobulinas humanas) se cultivóin vitro.Se cribaron sobrenadantes para reactividad contra DLL3 humano recombinante, mediante AlphaLISA (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.), y contra células SHP77 (ATCC®, CRL-2195TM) que expresan DLL3 humano, mediante citometría de flujo.

A continuación, los genes de VL y VL de inmunoglobulina (Ig) se amplificaron a partir de clones positivos identificados. Para aislar ARN de hibridomas, se peletizaron aproximadamente 2x106 células de clones individuales y se utilizaron como material de origen. Para células B individuales, se utilizaron de 100 a 500 células expandidas a partir de células B aisladas individualmente como material de origen. El ARN se aisló utilizando RNeasy Plus (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, se sintetizó ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Smarter (Clontech, Mountain View, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para facilitar la síntesis de ADNc, se utilizó oligodT para iniciar la transcripción inversa de todos los ARN mensajeros, seguido de la adición de "caperuzas 5'" con un oligonucleótido Smarter IIA. La amplificación subsiguiente de los fragmentos VH y VL se llevó a cabo utilizando una amplificación por PCR en 2 etapas con cebadores 5' con diana en la caperuza Smarter IIA y cebadores 3' con diana en regiones de consenso en CH1. En resumen, cada reacción de PCR de 50 pl consistía en 20 pM de mezclas de cebadores directos e inversos, 25 pl de premezcla de ADN polimerasa PrimeStar Max (Clontech), 2 pl de ADNc no purificado y 21 pl de H2O bidestilada. El programa de ciclado se inició con 94 °C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos (94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 1 minuto) y terminó con 72 °C durante 7 minutos. La PCR de segunda ronda se llevó a cabo con los cebadores de VL y VH que contenían extensiones complementarias de 15 pb que "se solapaban" en las regiones respectivas en su vector madre pTT5 respectivo (VH y VL). Se llevó a cabo una PCR de segunda ronda con el siguiente programa: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 1 min, 68 °C durante 1 min), y finalización a 72 °C durante 7 min.

Se utilizó el kit de clonación In-Fusion® HD (Clontech, EE. UU.) para la clonación direccional del gen de VL en un vector pTT5 IgK_hu y del gen de VH en un vector pTT5 huIgG1KO. Para facilitar la clonación In-Fusion® HD, los productos de PCR fueron purificados y tratados con el potenciador de clonación antes de la clonación In-Fusion HD. La clonación y la transformación se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Clontech, EE. UU.). Se sometieron a secuenciación de Sanger los ADN de minipreparación a fin de confirmar que se obtenían fragmentos de gen V completo.

Usando esta metodología, se prepararon pares de genes de VH y VL de Ig que codificaban dominios de unión con especificidad para DLL3. Los anticuerpos recombinantes se produjeron mediante transfección transitoria de células CHO-E37 con plásmidos codificantes de las cadenas pesada y ligera correspondientes.

Cribado confirmatorio de anticuerpos recombinantes.

Los sobrenadantes que contenían anticuerpos recombinantes expresados se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la unión a líneas celulares que expresaban DLL3 humano o de Cynomolgus. En resumen, se incubaron células con sobrenadantes recombinantes, se lavaron y los mAb unidos de los sobrenadantes se detectaron con anticuerpo anti-IgG humana-APC (Jackson ImmunoResearch 109-136-098). Se calcularon las proporciones de señalfondo (S/F) mediante división de la mediana de intensidad de fluorescencia (MIF) de la muestra por la del control de isotipo (regiones variables contra una proteína no relacionada y diferentes esqueletos de región constante).

La resonancia del plasmón superficial (SPR) en Biacore 400 se llevó a cabo en sobrenadantes recombinantes. En resumen, las IgG no optimizadas en los sobrenadantes de HTP se capturaron a través de proteína A/G en la superficie del sensor durante 60 segundos a 10 pl/min. Se realizó un seguimiento de la unión de 100 nM de DLL3 humano a las IgG capturadas, durante 180 segundos de asociación a 30 pl/min, seguido de 120 segundos de disociación en el tampón HBS-EP. Se llevó a cabo la regeneración de la superficie de proteína A/G con glicina a pH 2,1 entre cada ciclo de unión. Se utilizaron en este ensayo los siguientes materiales: reactivo de proteína: DLL3 humano expresado recombinantemente. Tampón de migración del sistema: HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y polisorbato P20 al 0,005 % v/v). Reactivo de captura: Proteína A/G G (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), con especificidad para todos los isotipos de IgG humanas.

Se seleccionaron los clones de interés (con Kd<300 pM) para el formato multiespecífico. Se generaron las proteínas de unión multiespecíficas y se evaluaron posteriormente en ensayos de mecanismo y funcionales (tales como unión celular, citotoxicidad y activación de las células T, tal como se describe a continuación).

Humanización de conectores de DLL3 y CD3.

Las secuencias de ligantes de DLL3 tal como han indicado anteriormente, así como ligantes de CD3 descritos en la literatura (Pessano et al., EMBO J. Feb. 1985; 4(2): 337-44; Salmerón A et al., J Immunol. 1991 Nov 1;147(9):3047-52) fueron humanizados y/u optimizados. La optimización/humanización de secuencias de anticuerpos es una metodología para diseñar anticuerpos producidos en especies no humanas (contra un antígeno/epítopo específico) para su uso en terapéuticos que son similares a los anticuerpos producidos en seres humanos, eliminando de esta manera los posibles efectos adversos, tales como la inmunogenicidad, a la vez que se conserva la especificidad. El enfoque de optimización/humanización de secuencias utilizado en la presente memoria fue el descrito por Singh et al, 2015 (Singh S et al., mAbs 2015: 7(4):778-91). En resumen, se identificaron líneas germinales humanas estrechamente coincidentesin silico,y se evaluaron las variantes de optimización/humanización utilizando un método de cribado con fagos. Las secuencias finales de candidatos líderes se seleccionaron en función de la unión, la puntuación en porcentaje humana y Epivax (herramienta predictivain silicopara la potencial inmunogenicidad).

Construcción de proteínas biespecíficas de unión a DLL3 y CD3.

Las regiones variables de los ligandos de DLL3 y CD3 se clonaron en el vector de expresión pTT5 (National Research Council, Canadá), utilizando técnicas comunes de la biología molecular para producir proteínas de unión biespecíficas, con una unidad de unión específica a DLL3 que comprende un Fab de cadena sencilla que se une a DLL3 y una región Fc (dicha unidad de unión también se denomina en la presente memoria "brazo DLL3" o "cadena DLL3") y una unidad de unión específica a CD3 que comprende un Fab de cadena sencilla que se une a CD3 y una región Fc (dicha unidad de unión también se denomina en la presente memoria "brazo CD3" o "cadena CD3"). Las regiones Fc de los brazos DLL3 y CD3 incluyen mutaciones de "botón" u "ojal" (Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35) y las cadenas respectivas se denominan cadenas de botón o de ojal. Para el ensamblaje de ADN de múltiples fragmentos, se utilizaron enfoques de ensamblaje de Gibson y ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi, siguiendo los protocolos de los fabricantes (New England Biolabs, Ipswich, M<a>, EE. UU.). Se secuenciaron minipreparaciones de ADN.

Cada vector de expresión contiene elementos promotores eucarióticos para el gen que codifica la cadena (brazo/cadena DLL3 o CD3), es decir, el gen codificante la secuencia de señal y la cadena ligera y pesada, un casete de expresión para un gen marcador de selección procariótico tal como la ampicilina, y un origen de replicación. Estos plásmidos de ADN se propagaron en colonias y cultivos deE. coliresistentes a ampicilina y se purificaron.

Ejemplo 2: Expresión y purificación de proteínas de unión biespecíficas y bivalentes que se unen a DLL3 y CD3.

Se produjeron moléculas biespecíficas de unión a DLL3 y CD3 mediante transfección transitoria de células CHO-E con los vectores pTT5 que llevan los genes que codifican las cadenas DLL3/CD3. En resumen, las células CHO-E transfectadas cultivadas en suspensión en medio libre de suero se cultivaron en frascos de agitación a 140 rpm, a 37 °C con 5 % de CO2, y se mantuvieron bajo condiciones de crecimiento exponencial. El día de la transfección, las células se transfectaron químicamente con plásmido de cadena de botón y plásmido de cadena de ojal en una proporción másica de 1:3. A continuación, se sembraron a razón de 1 a 2x106 células/ml en 1 litro de medio de expresión de CHO Gibco® FreeStyle™ (LifeTechnologies, NY, EE.UU.). Seguidamente, las células se incubaron bajo agitación orbital durante 10 días con una alimentación única de 200 ml de solución de alimento comercial para permitir la expresión de las proteínas. Los títulos de anticuerpos en los sobrenadantes de cultivo celular se determinaron utilizando un instrumento Octet® (Pall ForteBio, CA, Ee . UU.) y puntas de biosensor de protA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las proteínas de unión a DLL3/CD3 recombinantes se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo en un procedimiento en dos etapas: primero, mediante cromatografía de afinidad con proteína A utilizando una columna MabSelect™ (GE Healthcare); segundo, mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando una columna Poros 50 HS (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE. UU.). El material purificado en dos etapas se almacenó en un tampón final de acetato sódico 50 mM y NaCl 100 mM, pH 5,0. La pureza y el grado de heterogeneidad de las muestras se evaluaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica, espectrometría de masas y ultracentrifugación analítica. Las muestras que se avanzaron para ensayos funcionales comprendían material purificado en dos etapas, con aproximadamente 99 % de contenido de monómero.

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO: de secuencias de CDR, VH, VL, scFab y brazo DLL3 y brazo CD3 de las proteínas/constructos de anticuerpos descritos en la presente memoria:

(continuación)

*La secuencia subrayada indica la región de la bisagra.

Ejemplo 3: Producción de proteínas recombinantes.

• DLL3-His humana

Se generó una línea celular para producir DLL3-His humano utilizando células HEK-293 (Thermo Fisher), el sistema de lentivirus Lenti-X (Clontech) y un plásmido codificante de DLL3-His humano (n.° de acceso de DLL3 humano Q9NYJ7 huDLL3-His: SEQ ID NO:106). Para la expresión, las células se cultivaron y expandieron a 37 °C, 5 % de CO2 y agitación a 140 rpm. El día 0 de expresión, se peletizaron las células y se resuspendieron en medio Expi 293. El día 3 de la expresión, se recogió el sobrenadante de la cultivo acondicionado, mediante centrifugación de las células durante 40 minutos a 4.700 rpm. Se añadieron inhibidores de proteasa a la biomasa antes de la purificación. Se confirmó la expresión mediante transferencia Western. Se ajustó el sobrenadante de cultivo acondicionado con TCEP 0,5 mM, CHApS al 0,02 % e imidazol 10 mM. La purificación se llevó a cabo en una columna HisTrap Ni excel y el tampón A: MES 50 mM, NaCl 50 mM, TCEP 0,5 mM, CHAPS al 0,02 %, pH 6,5. La proteína de interés se eluyó en el tampón A suplementado con imidazol 0,5 M, pH 8,5, utilizando un gradiente de elución de imidazol 20 mM hasta imidazol 500 mM. Las fracciones agrupadas se dializaron en el tampón: MES 50 mM, NaCl 50 mM, TCEP 1 mM, CHAPS al 0,02 %, arginina 0,2 M, glicerol al 3 %, pH 6,5. El material purificado se cualificó mediante espectrometría de masas y ultracentrifugación analítica.

• DLL3-His de Cynomolgus

Se generó una línea celular para producir DLL3-His humano utilizando células HEK-293 (Thermo Fisher), el sistema de lentivirus Lenti-X (Clontech) y un plásmido codificante de DLL3-His de Cynomolgus (n.° de acceso de DLL3 Cyno: XM_005589196.1 (RefSeq); Cyno DLL3-His: SEQ ID NO:107). Para la expresión, las células se cultivaron y expandieron a 37 °C, 5 % de CO2 y agitación a 140 rpm. El día 0 de la expresión, se peletizaron las células y se resuspendieron en medio Expi 293. El día 3 de la expresión, se recogió el sobrenadante de la cultivo acondicionado, mediante centrifugación de las células durante 40 minutos a 4.700 rpm. Se añadieron inhibidores de proteasa a la biomasa antes de la purificación. Se confirmó la expresión mediante transferencia Western. Se ajustó el sobrenadante de cultivo acondicionado con TCEP 0,5 mM, CHAPS al 0,02 % e imidazol 10 mM. La purificación se llevó a cabo en una columna HisTrap Ni excel y el tampón A: MES 50 mM, NaCl 50 mM, TCEP 0,5 mM, CHAPS al 0,02 %, pH 6,5. La proteína de interés se eluyó en el tampón A suplementado con imidazol 0,5 M, pH 8,5, utilizando un gradiente de elución de imidazol 20 mM hasta imidazol 500 mM. Las fracciones agrupadas se dializaron en el tampón: MES 50 mM, NaCl 50 mM, TCEP 1 mM, CHAPS al 0,02 %, arginina 0,2 M, glicerol al 3 %, pH 6,5. El material purificado se cualificó mediante espectrometría de masas y ultracentrifugación analítica.

• CD3 E+G humano HuFc-6xHis (E+G indica subunidades ey)

Se generó una línea celular para producir CD3 E+G HuFc-6xHis humano utilizando células HEK-293 (Thermo Fisher), el sistema lentivírico Lenti-X (Clontech) y un plásmido que codifica CD3 E+G HuFc-6xHis humano (CD3E humano número de acceso: P07766; CD3E+G-HuFc-His humano: SEQ ID NO:108). Para la expresión, las células se cultivaron y expandieron en medio Freestyle 293, a 37 °C, en un ambiente humidificado con 8 % de CO2, y bajo agitación a 135 rpm. El sobrenadante de cultivo acondicionado se recogió el día 6 mediante centrifugación durante 30 minutos a 9.300xg. Se llevó a cabo el seguimiento de la expresión mediante SDS-PAGE y transferencia western. El sobrenadante de cultivo acondicionado se ajustó con sacarosa 0,2 M, glicerol al 5 %, CHAPS al 0,01 % e imidazol 10 mM. A continuación, se ajustó el pH a 7,2. La purificación se llevó a cabo en un procedimiento de dos etapas: purificación por afinidad utilizando resina de Ni/NTA (incubación durante la noche a 4 °C y elución con imidazol 250 mM), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 en tampón de destino de PBS con sacarosa 0,2 M, glicerol al 5 %, CHAPS al 0,01 %, TCEP 1 mM, pH 7,2. El material agrupado se concentró utilizando un dispositivo de centrifugación Viva cell 100 con una membrana PES de 10K MWCO antes del análisis final y almacenamiento. El material purificado se cualificó mediante espectrometría de masas y ultracentrifugación analítica.

• CD3 E+G de Cynomolgus HuFc-6xHis (E+G indica subunidades ey)

Se generó una línea celular para producir CD3 E+G HuFc-6xHis de Cynomolgus utilizando células HEK-293 (Thermo Fisher), el sistema lentivírico Lenti-X (Clontech) y un plásmido que codificaba CD3 E+G HuFc-6xHis Cynomolgus (CD3E de Cynomolgus número de acceso: Q95LI5 <, cyno CD3 E+G huFc-His: SEQ ID NO:109). Para la expresión, las células se cultivaron y expandieron en medio Freestyle 293, a 37 °C, en un ambiente humidificado con 8 % de CO2, y bajo agitación a 135 rpm. El sobrenadante de cultivo acondicionado se recogió el día 6 mediante centrifugación durante 30 minutos a 9.300xg. Se llevó a cabo el seguimiento de la expresión mediante SDS-PAGE y transferencia western. El sobrenadante de cultivo acondicionado se ajustó con sacarosa 0,2 M, glicerol al 5 %, CHAPS al 0,01 % e imidazol 10 mM. A continuación, se ajustó el pH a 7,2. La purificación se llevó a cabo en un procedimiento de dos etapas: purificación por afinidad utilizando resina de Ni/NTA (incubación durante la noche a 4 °C y elución con imidazol 250 mM), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 en tampón de destino de PBS con sacarosa 0,2 M, glicerol al 5 %, CHAPS al 0,01 %, TCEP 1 mM, pH 7,2. El material agrupado se concentró utilizando un dispositivo de centrifugación Viva cell 100 con una membrana PES de 10K MWCO antes del análisis final y almacenamiento. El material purificado se cualificó mediante espectrometría de masas y ultracentrifugación analítica.

Ejemplo 4A: Determinación basada en SPR de afinidades a las subunidades recombinantes zy de DLL3 y CD3, y reactividad cruzada entre especies.

La afinidad de unión de los constructos biespecíficos de DLL3/CD3 purificados para las proteínas de fusión Fc de DLL3-ECD recombinante humano y de Cynomolgus, y subunidades CD3 £ y se determinó mediante resonancia del plasmón superficial (SPR), utilizando un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad). El tampón de migración y todas las diluciones (excepto en donde se indique) se llevaron a cabo en PBS-T-EDTA. El chip de sensor GLM (Bio-Rad) se normalizó y preacondicionó siguiendo las recomendaciones del fabricante. El chip sensor se activó con una mezcla igual de EDC/s-NHS en la dirección horizontal durante 300 segundos a un caudal de 30 pl/min y se inmovilizó con proteína A/G (20 pg/ml en acetato 10 mM, pH 4,5) en la dirección horizontal durante 300 segundos a un caudal de 30 pl/min, lo que resultó en aproximadamente 5.000 UR de proteína A/G en la superficie. El chip sensor se desactivó con HCl de etanolamina 1 M en la dirección horizontal durante 300 segundos a un caudal de 30 pl/min. El chip sensor se estabilizó con 18 segundos de ácido fosfórico al 0,85 % a un caudal de 100 pl/min, 3 veces horizontalmente y 3 veces verticalmente.

Para la determinación cinética de la unión a DLL3, las moléculas biespecíficas se capturaron individualmente en la superficie de proteína A/G verticalmente durante 250 segundos a un caudal de 25 pl/min. La línea base se estabilizó mediante la inyección de PBS-T-EDTA durante 60 segundos a un caudal de 40 pl/min horizontalmente. El analito (DLL3_hu o DLL3_cy) se inyectó horizontalmente sobre el anticuerpo capturado durante 600 segundos a un caudal de 40 pl/min y una disociación de 2.700 segundos. Las concentraciones del analito eran de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM y 1,25 nM. La superficie se regeneró mediante inyección de una solución de ácido fosfórico al 0,85 % durante 18 segundos a un caudal de 100 pl/min, horizontalmente y una vez verticalmente.

Para la determinación cinética de la unión a CD3, CD3£Y_hu-Fc y CD3£Y_cy-Fc (disueltos en acetato a pH 4,5) se inmovilizaron directamente sobre la superficie del sensor a través de acoplamiento de aminas durante 140 segundos a un caudal de 30 pl/min verticalmente. La línea base se estabilizó mediante la inyección de PBS-T-EDTA durante 60 segundos a un caudal de 40 pl/min horizontalmente. El analito (la molécula biespecífica) se inyectó horizontalmente sobre el constructo capturado CD3<ey>-F<c>durante 600 segundos a un caudal de 40 pl/min y una disociación durante 600 segundos. Las concentraciones del analito eran de 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, 31,3 nM y 15,6 nM o 2 pM, 1 pM, 0,5 pM, 0,25 pM y 0,125 pM. La superficie se regeneró mediante inyección de una solución de ácido fosfórico al 0,85 % durante 18 segundos a un caudal de 100 pl/min, horizontalmente y una vez verticalmente.

Se restaron el punto de interacción (interacciones con la superficie del sensor) y el blanco (PBS-T-EDTA) de los datos en bruto. Los sensogramas se ajustaron a un modelo cinético 1:1 para proporcionar las constantes de tasa (ka, kd), así como el valor de afinidad (Kd) para DLL3_hu y DLL3_cy, y se ajustaron globalmente al equilibrio para proporcionar el valor de afinidad (K<d>) para CD3£Y_hu y CD3£Y_cy.

Las proteínas de unión a DLL3/CD3 descritas en la presente memoria mostraron afinidades para DLL3 en el intervalo de pM. Las afinidades a la subunidad CD3 £ y estaban en el intervalo bajo de nM. La brecha interespecífica entre ser humano y mono Cynomolgus es equilibrada. Las afinidades de tres proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena CD3 de SEQ ID No :79, SEQ ID NO:80 o SEQ ID NO:105, respectivamente) se muestran en la Tabla 2A.

Tabla 2A: Afinidades (Kd) de las proteínas de unión a DLL3/CD3 para DLL3 humano y de mono Cynomolgus y la subunidad CD3 Sy según lo determinado mediante análisis de SPR, y brechas interspecíficas.

La afinidad de unión de los constructos biespecíficos DLL3/CD3 purificados para DLL3-ECD humano recombinante y la proteína de fusión de Fc de las subunidades CD3 Sy humanas se determinó mediante resonancia del plasmón superficial (SPR), utilizando un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad). El método era similar al del Ejemplo 4A, con algunas diferencias tal como se detalla posteriormente.

Para la determinación cinética de la unión a DLL3, las moléculas anti-DLL3/CD3 se capturaron individualmente en la superficie de proteína A/G verticalmente durante 200 segundos a un caudal de 30 pl/min. La línea base se estabilizó mediante la inyección de PBS-T-EDTA durante 60 segundos a un caudal de 30 pl/min horizontalmente. El analito (DLL3_hu) se inyectó horizontalmente sobre el anticuerpo capturado durante 300 segundos a un caudal de 30 pl/min y una disociación de 1.800 segundos. Las concentraciones del analito eran de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM y 1,25 nM. La superficie se regeneró mediante inyección de una solución de ácido fosfórico al 0,85 % durante 18 segundos a un caudal de 100 pl/min, horizontalmente y una vez verticalmente.

Para la determinación cinética de la unión a CD3, CD3E_hu-Fc_CD3G_hu-Fc (disueltos en acetato a pH 4,5) se inmovilizaron directamente sobre la superficie del sensor a través de acoplamiento de aminas durante 360 segundos a un caudal de 30 pl/min verticalmente. La línea base se estabilizó mediante la inyección de PBS-T-EDTA durante 60 segundos a un caudal de 30 pl/min horizontalmente. El analito (todas las moléculas anti-DLL3/CD3) se inyectó horizontalmente sobre el anticuerpo capturado durante 600 segundos a un caudal de 30 pl/min y una disociación de 1.800 segundos. Las concentraciones del analito eran de 250 nM, 83,3 nM, 27,8 nM, 9,3 nM y 3,1 nM. La superficie se regeneró mediante inyección de una solución de ácido fosfórico al 0,85 % durante 18 segundos a un caudal de 100 pl/min, horizontalmente y una vez verticalmente.

Las afinidades de las proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252 y una cadena CD3 de SEQ ID NO:79, una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena CD3 de SEQ ID NO:80, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena DLL3 de SEQ ID n O:75 y una cadena CD3 de SEQ ID n O:105) se muestran en 2B.

Tabla 2B: Afinidades (Kd) de las proteínas de unión a DLL3/CD3 a la DLL3 humana y a la subunidad CD3 Sy determinadas mediante análisis SPR

(continuación)

Ejemplo 5: Generación de células HEK293 que expresan el dominio extracelular y sus subdominios en la superficie celular.

Para la generación de células HEK293 estables que expresaban DLL3 humano de longitud completa (Uniprot: Q9NYJ7), DLL3 de Cynomolgus (UPI0003AB95BD), DLL1 humano (Q00548) y DLL4 humano (Q9NR61), respectivamente, la secuencia de codificación respectiva se clonó en pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) y se insertó una etiqueta FLAG entre la secuencia de señal y el dominio extracelular. La expresión sobre la superficie celular se verificó mediante la utilización de un anticuerpo anti-FLAG (clon M2, Sigma) seguido de un anticuerpo monoclonal anti-IgG1 de ratón (Acris).

El dominio extracelular de DLL3 consistía en diferentes subdominios:

Péptido señal de DLL3_hu: aa 1 a 26

Dominio extracelular (ECD) N-terminal de DLL3_hu: aa 27 a 175

DLL3_hu DSL: aa 176 a 215

DLL3_hu EGF1: aa 216 a 249

DLL3_hu EGF2: aa 274 a 310

DLL3_hu EGF3: aa 312 a 351

DLL3_hu EGF4: aa 353 a 389

DLL3_hu EGF5: aa 391 a 427

DLL3_hu EGF6: aa 429 a 465

Péptido próximo a membrana: aa 466 a 492

Los siguientes subdominios de DLL3 se expresaron sobre la superficie celular de las células HEK293:

• DLL3_hu EGF1+2: Uniprot Q9NYJ7 aa 216 a 310

• DLL3_hu EGF 2+3: Uniprot Q9NYJ7 aa 274 a 351

• DLL3_hu EGF3+4: Uniprot Q9NYJ7 aa 312 a 389

• DLL3_hu EGF4+5: Uniprot Q9NYJ7 aa 353 a 427

• DLL3_hu EGF5+6: Uniprot Q9NYJ7 aa 391 a 465

• DLL3_hu EGF6+péptido próximo a membrana: Uniprot. Q9NYJ7 aa 429 a 492

Para la generación de células HEK293 que expresan subdominios etiquetados con 6-His-myc de DLL3 humano, las secuencias codificantes respectivas se clonaron en pcDNA 3.1 (Thermo Fisher Scientific). Los constructos contenían una secuencia líder de IgG Vk de ratón N-terminal, seguida de una etiqueta de 6-histidinas-myc y el respectivo dominio DLL3 humano. Para asegurar la localización en la superficie celular de los dominios DLL3 humanos, todas las construcciones fueron seguidas con un conector Ser/Gly, el dominio transmembrana (aa266 a 288) y el dominio intracelular (aa 289 a 314) de EpCAM humano (P16422). La expresión de los subdominios se verificó utilizando anticuerpos IgG2a monoclonales de ratón contra diversos dominios, tal como se describe en el documento n.° WO 2013126746. El anticuerpo monoclonal unido se detectó con un F(ab)'2 de cabra anti-IgG de ratón-RPE (Jackson Immuno Research). Las muestras se midieron mediante citometría de flujo. La expresión de DLL1 y DLL4 humanos se confirmó mediante análisis de FACS utilizando anticuerpos anti-DLL1 (R&D Systems, MAB1818) y anti-DLL4 (R&D Systems, MAB1506) seguida de anticuerpos secundarios antirratón o antirrata etiquetados con PE (ver la figura 5, panel derecho).

Tabla 3: Secuencias de diversos subdominios de DLL3 expresados sobre células HEK293

(continuación)

Ejemplo 6: Mapeo de dominios de epítopo de proteínas de unión a DLL3/CD3.

Los dominios de epítopo se determinaron mediante la unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 a líneas celulares recombinantes que expresaban subdominios de DLL3 (ver la figura 2). La generación de estas líneas celulares se describe en el Ejemplo 5.

Las proteínas de unión a DLL3/CD3 se produjeron mediante la transfección transitoria de células CHO-E con vectores pTT5 portadores de los genes codificantes de las cadenas, tal como se describe en el Ejemplo 2.

Las células que expresaban subdominios de DLL3 se tiñeron con proteínas de unión a DLL3/CD3 purificadas en dos etapas a 1,6 nM en tampón de FACS (PBS/BSA al 0,5 %/azida sódica al 0,05 %). Las moléculas unidas se detectaron con un anticuerpo secundario antihumano conjugado con PE (Sigma-Aldrich, n.° P8047). Como control negativo, las células se incubaron con solo anticuerpo secundario. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo. La figura 3A-C muestra ligantes de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de<s>E<q>ID NO:80), de unión a diferentes regiones de DLL3. Las secuencias de los dominios de epítopo se enumeran en el Ejemplo 5, Tabla 3.

Ejemplo 7: Reactividad cruzada entre especies.

La reactividad cruzada entre especies se determinó mediante la unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 a las células NCI-H82 (HTB-175TM) y SHP77 (ATCC®, CRL-2195TM), dos líneas celulares de CPM, así como a una línea celular recombinante que expresa DLL3 de Cynomolgus (generación de la línea celular descrita en el Ejemplo 5).

Las proteínas de unión a DLL3/CD3 se produjeron mediante la transfección transitoria de células CHO-E con vectores pTT5 portadores de los genes codificantes de las cadenas, tal como se describe en el Ejemplo 2. Las células que expresaban DLL3 humana o de Cynomolgus se tiñeron con 1,6 nM de proteínas de unión a DLL3/CD3 purificadas en dos etapas, con concentraciones crecientes en el tampón de FACS (PBS/BSA al 0,5 %/azida sódica al 0,05 %). Las moléculas unidas se detectaron con un anticuerpo secundario antihumano conjugado con PE (Sigma-Aldrich, n.° P8047). Como control negativo, las células se incubaron con solo anticuerpo secundario. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo. La figura 4 muestra la unión a células humanas y de Cynomolgus que expresan DLL3 de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73 y una cadena de CD3 de Se Q ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:74 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID N<o>:80, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:76 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:77 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79 o una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:78 y una cadena de CD3 de SEQ ID No :79).

Ejemplo 8: Confirmación de la ausencia de unión a DLL1 y DLL4 humanos.

La ausencia de reactividad cruzada con DLL1 y DLL4 humanos se determinó mediante la unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 a células recombinantes que expresaban DLL1 o DLL4 humanos (la generación de líneas celulares se describe en el Ejemplo 5).

Las células que expresaban DLL1 y DLL4 se tiñeron con 1,6 nM de proteínas de unión a DLL3/CD3 purificadas en dos etapas, con concentraciones crecientes en el tampón de FACS (PBS/BSA al 0,5 %/azida sódica al 0,05 %). Las moléculas unidas se detectaron con un anticuerpo secundario antihumano conjugado con PE (Sigma-Aldrich, n.° P8047). Como control negativo, las células se incubaron con solo anticuerpo secundario. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo. La expresión de DLL1 y DLL4 humanos se confirmó mediante análisis de FACS utilizando anticuerpos anti-DLL1 (R&D Systems, MAB1818) y anti-DLL4 (R&D Systems, MAB1506) seguida de anticuerpos secundarios antirratón o antirrata etiquetados con PE. La figura 5 muestra la unión de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:74 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID<n>O:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:76 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:77 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79 o una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:78 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79) a células expresantes de DL11 y DLL4 humanos.

Ejemplo 9: Unión de proteínas de unión a de DLL3/CD3 a líneas celulares de CPM y células T.

Se sometió a ensayo la unión de proteínas de unión a DLL3/CD3 a líneas celulares de CPM humanas mediante citometría de flujo de NCI-H82 (HTB-175TM) y SHP77 (ATCC®, CRL-2195TM). Las proteínas de unión a DLL3/CD3 se produjeron tal como se describe en el Ejemplo 2.

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparaciones enriquecidas en linfocitos (en inglés, "buffy coats"), un subproducto de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Todas las capas leucocitarias se obtuvieron después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y con la aprobación del comité ético cantonal en Austria, y las PBMC se prepararon el mismo día de la recogida. Por lo tanto, se aislaron células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (35 minutos sin freno a 1.400 rpm) y lavados extensos con PBS. Los eritrocitos restantes se eliminaron mediante incubación durante 3 minutos en un tampón de lisis ACK (Thermo Fisher Scientific, A1049201), seguido de un lavado en PBS, antes de suspenderlos en un medio de ensayo que contenía RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco n.° 61870-010), suero humano AB al 5 % (Gemini, GemCell n.° de cat. 100-512, LOTE n.° H56500I) MEM-NEAA al 1 % (Gibco n.° 11140-035), HEPES 10 mM (Affymetrix n.° 7365-49-9), beta-mercaptoetanol 10 pM (Gibco n.° 21985-023) y piruvato sódico (Gibco n.° 11360-039).

Las células T se aislaron mediante selección negativa utilizando el kit II de aislamiento de células pan-T (Miltenyi Biotec n.° 130-091-156). En resumen, las células se resuspendieron en 40 pl de tampón PBS/BSA al 0,5 % (Gibco ref. n.° 041-94553 M)/EDTA 2 mM (Invitrogen ref. n.° 15575-038) por cada 10 millones de células y se incubaron con 10 pl de cóctel de anticuerpos biotinilados por cada 10 millones de células durante 5 minutos a 4 °C. Posteriormente, se añadieron 30 |jl de tampón y 20 |jl de MicroBeds anti-biotina por cada 10 millones de células y se incubaron durante 10 minutos a 4 °C. Seguidamente, la mezcla se introdujo en una columna preenjuagada 25LS (Miltenyi Biotec n.° 130 042-401) en el campo magnético de un separador m Ac S adecuado (Miltenyi Biotec). El eluido se recogió y lavó en medio de ensayo.

Las células (células T o células de CPM humanas) se tiñeron con concentraciones crecientes de proteínas de unión a DLL3/CD3 purificadas en dos etapas en tampón de FACS (PBS/BSA al 0,5 %/azida sódica al 0,05 %). Las moléculas unidas se detectaron con un anticuerpo secundario antihumano conjugado con PE (Sigma-Aldrich, n.° P8047). Las proteínas de unión a DLL3/CD3 con diana en los dominios DSL (D<l>L3 n.° 6), EGF1 (DLL3 n.° 5) o EGF4 (DLL n.° 4) muestran una unión más fuerte a líneas celulares de CPM que expresan DLL3, en comparación con las proteínas de unión a DLL3/CD3 con diana en el péptido próximo a membrana (DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3). La unión a las células SHP77, NCI-H82 y células T de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80) contra diferentes dominios de epítopo se muestra en la figura 6A-V.

Ejemplo 10A: Potencia de redireccionamiento de PBMC no estimuladas contra líneas celulares de CMP humanas.

La potencia de las PBMC no estimuladas contra líneas celulares de CPM se determinó utilizando la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) como medida de la lisis celular. En este ensayo, las líneas celulares de CPM positivas para DLL3, SHP77 y NCI-H82, se cocultivaron con PBMC humanas como células efectoras y concentraciones crecientes de proteínas de unión a DLL3/CD3 durante 72 horas en una proporción de células efectoras a células diana de 10:1. Las proteínas de unión a DLL3/CD3 (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80) se produjeron mediante transfección transitoria de células CHO-E con los vectores pTT5 que contenían los genes codificantes de cadena, tal como se describe en el Ejemplo 2.

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparaciones enriquecidas en linfocitos, un subproducto de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Todas las capas leucocitarias se obtuvieron después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y con la aprobación del comité ético cantonal en Austria, y las PBMC se prepararon el mismo día de la recogida. Por lo tanto, se aislaron células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (35 minutos sin freno a 1.400 rpm) y lavados extensos con PBS. Los eritrocitos restantes se eliminaron mediante incubación durante 3 minutos en un tampón de lisis ACK (Thermo Fisher Scientific, A1049201), seguido de un lavado en PBS, antes de suspenderlos en un medio de ensayo que contenía RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco n.° 61870-010), suero humano AB al 5 % (Gemini, GemCell n.° de cat. 100-512, LOTE n.° H56500I) MEM-NEAA al 1 % (Gibco n.° 11140-035), HEPES 10 mM (Affymetrix n.° 7365-49-9), betamercaptoetanol 10 pM (Gibco n.° 21985-023) y piruvato sódico (Gibco n.° 11360-039).

Posteriormente, las células diana: SHP77 y NCI-H82, y las PBMC en una proporción de 1:10 se incubaron con proteínas de unión a DLL3/CD3 a concentraciones de entre 0,0001 nM y 100 nM durante 72 horas.

Se determinó la actividad citotóxica utilizando el kit de detección de citotoxicidadPLUS (Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, este método se basa en el uso de la liberación de LDH de células muertas o con la membrana plasmática dañada. El sobrenadante de cultivo celular se incuba con la mezcla de reacción del kit durante 30 minutos y la formación de formazán, como resultado de la actividad de la LDH, se mide en un espectrofotómetro a 500 nm como sustituto de la lisis celular. El porcentaje de citotoxicidad respecto al control de lisis máxima se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

v a lo r m e d id o — fo n d o

C ito to x ic id a d (re sp e c to a l c o n tro l) = i-----------;------------------------ ;--------lis is m a x im a — lis is m ín im a

Fondo: células diana Células efectoras

Lisis máxima: células diana Triton X-100 al 5 %

Lisis mínima: células diana

Utilizando el software GraphPad Prism 5, se representó el porcentaje de citotoxicidad respecto al control de lisis máxima frente a las concentraciones correspondientes de la proteína de unión a DLL3/CD3. Las curvas de respuesta a dosis se analizaron con el modelo de ecuación logística de cuatro parámetros para la evaluación de la curva de respuesta a dosis sigmoidal y se calcularon los valores de EC90 (los valores de EC90 se muestran en la Tabla 4A).

La figura Figura 7A muestra un ejemplo de potencia de lisis celular de siete proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, o SEQ ID NO:78, y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de S<e>Q ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80) uniendo a diferentes dominios de epítopo.

Tabla 4A: valores de EC90 [nM] de proteínas de unión a DLL3/CD3 según medición en ensayo de citotoxicidad de 72 horas con PBMC no estimulados como células efectoras y líneas celulares de CPM, NCI-H82 y SHP77 como células diana.

Ejemplo 10B: Potencia de redireccionamiento de células T no estimuladas contra líneas celulares de CMP humanas.

Las células T se aislaron tal como se describe en el Ejemplo 9. Seguidamente, se utilizaron las células T purificadas como células efectoras en un ensayo de citotoxicidad con células SHP77 y NCI-H82 como células diana, tal como se ha descrito en el Ejemplo 10A. Se muestran las curvas de respuesta a dosis en las figuras 7B-H (células SHP77) y figuras 7I-O (células NCI-H82). Los valores EC90 calculados se muestran en la Tabla 4B.

La figura 7B-O muestra ejemplos de potencia de lisis celular de 19 proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 y SEQ ID NO:252).

Tabla 4B: Valores de EC90 [nM] de proteínas de unión a DLL3/CD3 según medición en un ensayo de citotoxicidad de 72 horas con células T purificadas como células efectoras y líneas celulares de CPM y NCI-H82 como células diana.

Ejemplo 11: Ensayo de intemalización in vitro.

Se midieron los cambios en la potencia de las proteínas de unión a DLL3/CD3 después de la preincubación con células SHP77 positivas para DLL3 como células diana. Si la proteína de unión a DLL3/CD3 se internaliza, la concentración efectiva debería disminuir por ello y, por lo tanto, reducirse la potencia aparente.

Las proteínas de unión a DLL3/CD3 se produjeron tal como se describe en el Ejemplo 2. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 10.

Se sembraron células diana SHP77 y se incubaron con proteínas de unión a DLL3/CD3 a concentraciones de entre 0,0001 y 100 nM durante 2 y 4 horas antes de añadir las PBMC no estimuladas durante 48 horas. La proporción de células efectoras a células diana era de 10:1. Se determinó la actividad citotóxica utilizando el kit de detección de citotoxicidadPLUS (Roche) tal como se describe en el Ejemplo 10.

La figura 8 no muestra ninguna diferencia en potencia y eficacia de las células en lisis de dos proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y proteína de unión a DLL3/CD3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80). Se observó potencia y eficacia en comparación con muestras no preincubadas (0 h). Los resultados sugieren que no se produce una internalización significativa con las proteínas de unión a DLL3/CD3.

Ejemplo 12: Estudio farmacocinético (FC) en ratones.

Se evaluó la FC de las proteínas de unión a DLL3/CD3 en ratones C57BL/6 tras una dosis única de 1 mg/kg por vía intravenosa. Se determinaron las concentraciones séricas de proteínas de unión a DLL3/CD3 utilizando un ensayo de captura de DLL3/detección de CD3.

En resumen, ratones C57BL/6 macho recibieron una única dosis intravenosa (i.v.) de 1 mg/kg (n=3 por molécula). Se recogieron muestras de sangre antes de la dosis y a 0,15, 2, 8, 24, 72, 96, 168, 240 y 336 horas después de la dosis. Se midieron los niveles de fármacos en suero con un ensayo de unión de ligandos basado en MSD, utilizando DLL3 biotinilado como reactivo de captura y CD3 etiquetado con sulfo como reactivo de detección. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos (FC) a partir de los perfiles de curso temporal de la concentración en suero utilizando un análisis no compartimental. Se evaluaron los siguientes parámetros farmacocinéticos: AUCtlast (superficie bajo la curva de concentración en suero en función del tiempo entre tiempo cero y el último tiempo cuantificable), AUCinf (superficie bajo la curva de concentración en suero extrapolada a infinito),<c>L (aclaramiento sistémico), Vss (volumen de distribución de estado estacionario) y t-i/2 (semivida terminal).

En la figura 9 se resumen los perfiles temporales de medias (DE) de concentración sérica de las proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteína de unión a DLL3/CD3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y proteína de unión a DLL3/CD3 que comprende una cadena de DLL3 de s Eq ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80). Las medias (DE) de parámetros FC para estas proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Medias (DE) de parámetros FC de proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo en ratones C57BL/6 macho tras una sola dosis intravenosa de 1 mg/kg.

Ejemplo 13: Estudio de eficacia de xenoinjertación en vivo.

Se llevaron a cabo estudios de eficacia utilizando un modelo de xenoinjerto en ratón de células T humanas. En detalle, las células de cáncer pulmonar microcítico SHP77 humano (2x107 células) se inyectaron subcutáneamente (s.c.) en el flanco dorsal derecho de ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac hembra sometidas a niveles subletales de radiación (2 Gy, día -1) (Día 1). En paralelo, se expandieronin vitrocélulas T positivas para CD3 humanas (aisladas de un donante sano de sangre humana).

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 10.

Las células T se aislaron mediante selección negativa utilizando el kit II de aislamiento de células pan-T (Miltenyi Biotec n.° 130-091-156). En resumen, las células se resuspendieron en 40 pl de tampón PBS/BSA al 0,5 % (Gibco ref. n.° 041-94553 M)/EDTA 2 mM (Invitrogen ref. n.° 15575-038) por cada 10 millones de células y se incubaron con 10 pl de cóctel de anticuerpos biotinilados-biotina por cada 10 millones de células durante 5 minutos a 4 °C. Posteriormente, se añadieron 30 pl de tampón y 20 pl de MicroBeds anti-biotina por cada 10 millones de células y se incubaron durante 10 minutos a 4 °C. Seguidamente, la mezcla se introdujo en una columna preenjuagada 25LS (Miltenyi Biotec n.° 130 042-401) en el campo magnético de un separador m Ac S adecuado (Miltenyi Biotec). El eluido se recogió y lavó en medio de ensayo.

Seguidamente, se expandieron las células T utilizando el kit de activación/expansión de células T humanas (Miltenyi Biotec n.° de cat. 130-091-441, Lote n.° 5170720843) durante 20 días. En resumen, las partículas antibiotina MACSiBead™ se cargaron con biotina CD2-, CD3-, CD28 y se transfirieron a las células T purificadas en una proporción de 2 células por partícula y se incubaron en presencia de 20 unidades de IL-2 recombinante (R&D n.° 202-IL-050/CF) a una densidad de 0,5-1x106 células/ml durante 20 días. Las células se suplementaron con 20 unidades de IL-2 fresca cada tres días. Tres días antes de la inyección en los animales, se reestimularon las células T con partículas antibiotina MACSiBead™ cargadas con biotina CD2, CD3 y CD28 en una proporción de 1 microesfera por cada cuatro células durante tres días adicionales. Finalmente, se retiraron las microesferas con un separador MACSiMAG (Miltenyi Biotec) y se lavaron las células T en PBMC.

El día 14, los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento según el volumen del tumor y se inyectaron 2x107 células T humanas por vía intraperitoneal (i.p.). El tratamiento se inició el día 17 y se administró proteína de unión a DLL3/CD3 (proteína de unión a DLL3/CD3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, y proteína de unión a DLL3/CD3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80) o tampón portador (NaOAc 50 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0) en un régimen de administración q7d mediante inyecciones intravenosas (i.v.) de bolo en la vena lateral de la cola. Se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral mediante mediciones externas con calibrador y se calcularon los volúmenes tumorales utilizando una fórmula estándar semielipsoidal. Se evaluó la injertación de células T humanas en el bazo mediante tinción inmunohistoquímica (IHQ) para CD3 humano al final del estudio. Solo aquellos animales que mostraban injertación de células T humanas al final del estudio fueron incluidos en el análisis estadístico. Los animales que cumplían con los criterios de sacrificio fueron eutanizados anticipadamente durante el estudio por razones éticas. El tratamiento de ratones portadores de tumores con proteínas de unión a DLL3/CD3 una vez a la semana por vía intravenosa a 0,25 mg/kg indujo una regresión tumoral significativa (figura 10).

Ejemplo 14: Contenido de monómero en porcentaje de proteínas de unión a DLL3/CD3.

Se determinó el porcentaje de monómero de las proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQD NO:105) mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (aSEC, por sus siglas en inglés) (mostrado en la Tabla 6). Se llevó a cabo la aSEC en un sistema UPLC Acquity de Waters (Milford, MA, EE. UU.) utilizando una columna Protein BEH SEC de 200Á, 1,7 pm, 4,6x150 mm (n.° de cat. 186005225). Las condiciones de la migración fueron las siguientes: Fase móvil: fosfato sódico 50 mM, arginina 200 mM y azida sódica al 0,05 %; Caudal: 0,5 ml/min; Tiempo de migración: 5 minutos; cantidad de carga de muestra: 10 pg; Detección de picos: A280 nm; Método de procesamiento automatizado de cromatogramas.

Tabla 6: Porcentaje de monómero después de la primera y segunda etapa de purificación

Ejemplo 15A: Termoestabilidad.

Se determinó la termoestabilidad mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) y los resultados de las primeras transiciones de fusión (Tm1) de las proteínas de unión a DLL3/CD3 se muestran en la Tabla 7. Las curvas de fusión de DSC proporcionan información sobre la estabilidad térmica de una proteína en solución respecto a un control de tampón. Se llevó a cabo un seguimiento del desplegamiento térmico y la agregación de una solución de proteínas de 1 mg/ml en citrato 20 mM, NaCl 115 mM, pH 6, entre 20 °C y 110 °C a una velocidad de barrido de 60 °C/h mediante un DSC capilar automatizado.

Tabla 7A:

Ejemplo 15B: Termoestabilidad.

Se determinó la termoestabilidad mediante análisis de desplazamiento térmico (TSA, por sus siglas en inglés) y los resultados de las primeras transiciones de fusión (Tm1) de las proteínas de unión a DLL3/CD3 (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:105) se muestran en la Tabla 7B. Se adquirió el perfil de intensidad de fluorescencia en función de la temperatura utilizando un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems, Waltham, MA) con SYPRO Orange (Invitrogen, Carlsbad, CA) como el fluoróforo extrínseco. La muestra se diluyó a 0,4 mg/ml en histidina 10 mM, pH 6,0 con cloruro sódico 40 mM y azida sódica al 0,02 %. La curva de fusión se generó con una rampa térmica de 25 °C a 95 °C a una tasa de 2 °C/min, con datos recogidos aproximadamente cada 0,4 °C a través del conjunto de filtros 'ROX' (Exc.: 580 ±10 nm, Em.: 623 ±14 nm). Los datos se analizaron utilizando el software Protein Thermal Shift versión 1.3 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

Tabla 7B:

Ejemplo 16: Puntuaciones de inmunogenicidad predichos in silico mediante Epivax.

La inmunogenicidad de las secuencias se evaluóin silicocon un algoritmo matemático. Específicamente, las puntuaciones ajustadas según Treg de EpiMatrix (EpiVax Inc., Providence RI) como medida de las puntuaciones de inmunogenicidad se determinaron para las proteínas de unión a DLL3/CD3 (proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de Se Q ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:80, y una proteína de unión a<d>LL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:105) y se compararon con las puntuaciones de diversas secuencias de Fc. Estas puntuaciones tienen en consideración los epítopos de células T y los epítopos de Treg. Cuanto menor es la puntuación de inmunogenicidad, menos probable es que una secuencia sea inmunogénica. En general, una puntuación negativa se considera de bajo riesgo de inmunogenicidad, mientras que una puntuación altamente positiva se considera una indicación de potencial inmunogenicidad. Tal como se muestra en las tablas a continuación, las proteínas de unión a DLL3/CD3 descritas en la presente memoria presentan puntuaciones de inmunogenicidad muy bajos, lo que indica que el riesgo de ser inmunogénicas es bajo para estas proteínas de unión.

Tabla 8: Puntuaciones de Epivax ajustadas de proteínas de unión a DLL3/CD3

Tabla 9: Puntuaciones ajustadas de Epivax de los dominios Fc

Ejemplo 17A: Unión no específica a superficie.

La especificidad de las proteínas de unión a DLL3/CD3 de la invención fue probada además en un ensayo basado en SPR utilizando proteínas altamente cargadas. Se desarrolló un ensayo de unión no específico utilizando tecnología de biosensores para determinar si las proteínas de unión tienen una unión significativa a proteínas cargadas no relacionadas. En este ensayo, se pasaron proteínas de unión a DLL3/CD3 sobre dos superficies de SPR, una recubierta con una proteína cargada negativamente (Inhibidor de Tripsina) y otra recubierta con una proteína cargada positivamente (lisozima). Cuando una proteína muestra una unión no específica significativa a estas superficies, es probable que la causa de la unión sea la presencia de parches de superficie cargados positivamente o negativamente en el candidato. La unión no específica de proteínas puede traducirse en una mala farmacocinética (PK) y biodistribución, y también puede presentar impactos en la fabricabilidada posteriori.

El experimento se realizó en un Biacore T200. La dilución, la preparación de superficies y los experimentos de unión se realizaron a 25 °C en un tampón HBS-EP 1X preparado a partir de HBS-EP 10X. El caudal para el protocolo de inmovilización y el experimento de unión fue de 5 p/min.

Para preparar la superficie para el experimento de unión no específica, la lisozima de clara de huevo de pollo y el inhibidor de tripsina de soja deGlycine maxse acoplaron manualmente a un chip serie S CM5 con una densidad superficial de 3000-5000 unidades relativas (UR) utilizando el kit de acoplamiento de aminas siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las muestras se prepararon en un tampón HBS-EP 1X 1 pM. Las muestras se inyectaron sobre superficies activadas con una asociación de 10 minutos y una disociación de 10 minutos. Los datos fueron recopilados utilizando el software de control Biacore T200 versión 2.0.1 y analizados con el software de evaluación Biacore T200 versión 3.0.

Las proteínas de unión a DLL3/CD3 no se unieron a estas superficies altamente cargadas. La Tabla 10A muestra la ausencia de unión a las dos proteínas altamente cargadas, inhibidor de tripsina y lisozima, con dos proteínas de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Tabla 10A:

Ejemplo 17B: Unión no específica a superficie.

La especificidad de las proteínas de unión a DLL3/CD3 (las proteínas de unión a DLL3/CD3 que comprenden una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251 o SEQ ID NO:252, y una cadena de CD3 de SEQ ID NO:79, una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena CD3 de SEQ ID NO:80, y una proteína de unión a DLL3 que comprende una cadena de DLL3 de SEQ ID NO:75 y una cadena de CD3 de SEQ ID n O:105) se probó además en un ensayo basado en SPR utilizando proteínas altamente cargadas, tal como se describe en el Ejemplo 17a, con una asociación de 10 minutos y una disociación de 15 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 10B.

Tabla 10B: Los números bajos de UR indican que no hay una unión significativa a proteínas cargadas no relacionadas.

Ejemplo 18: Inducción de lisis, activación de células T, degranulación de células T, proliferación de células T y secreción de citoquinas en presencia de células tumorales positivas y negativas para DLL3.

Las PBMC se purificaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 9. Para determinar la activación de células T, la degranulación de las células T y la secreción de citoquinas, se diseñó un ensayo de citotoxicidad con PBMC y células SHP77 positivas para DLL3 o células RKO-E6 negativas para DLL3 como células diana, tal como se ha descrito en el Ejemplo 10B. La potencia de lisis celular mediante redireccionamiento de células T a células SHP77 o RKO-E6 humanas se determinó tal como se ha descrito en el Ejemplo 10A. Para determinar la activación de las células T y la degranulación de las células T, las células se centrifugaron y se tiñeron con anticuerpos contra CD4 (BD n.° 550630), CD8 (BD n.° 557834), CD25 (BD n.° 340907); posteriormente, las células se permeabilizaron utilizando la solución de fijación/permeabilización (BD n.° 554714) y se tiñeron con anticuerpos contra perforina (BioLegend n.° 308120) y granzima B (BD n.° 560221) y se midieron mediante citometría de flujo. Los niveles de citoquinas en los sobrenadantes se determinaron mediante los ensayos U-PLEX Biomarker Group 1 (hu) (MSD, n.° K15067L-2, Kit).

Para determinar la proliferación de células T, se marcaron las PBMC con Cell Trace™ CFSE 5 pM (Invitrogen, C34554) y las células T se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3 (BioLegend n.° de cat: 317336. A continuación, las PBMC marcadas se incubaron con células SHP77 o RKO-E6 en una proporción de 10:1 y concentraciones crecientes de una proteína de unión a DLL3/CD3 durante 6 días.

Las figuras 11 a 15 muestran la inducción de la lisis redirigida por células T a células SHP77 o RKO-E6 (figura 11) y la inducción de la activación de células T dependiente de la dosis (figura 12), degranulación de células T (figura 13), secreción de citoquinas (figura 14A: interferón gamma; 14B: MCP-1), y la proliferación de células T (figura 15) en presencia de células SHP77 o RO-E6 y una proteína de unión a DLL3/CD3.

Ejemplo 19: Redirección de subconjuntos de células T a células SHP77

Se aislaron las PBMC tal como se describe en el Ejemplo 10a. Seguidamente, se aislaron los subconjuntos de células T utilizando los siguientes reactivos y protocolos:

Tabla 11: Reactivos y protocolos para el aislamiento de subconjuntos de células T

Las figuras 16 a 20 muestran la potencia de redireccionamiento de las células pan-T (figura 16), células T ingenuas (figura 16), células T CD4+ (figuras 17, 18), células T efectoras de memoria<c>D4+ (figura 18), células T de memoria central c D4+ (figura 17), células T CD8+ (figuras 19 y 20), células T efectoras CD8+ CD45RA+ (figura 19), células T de memoria CD8+ (figura 20) contra células SHP77 humanas de una proteína de unión a DLL3/CD3.

Ejemplo 20: Infiltración de células T en tejido tumoral de xenoinjerto de SHP77 con una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo.

Los tejidos tumorales restantes de los ratones en el estudio descrito en el Ejemplo 13 se prepararon, fijaron con formalina e incluyeron en parafina. Seguidamente, se prepararon secciones de tejido y se tiñeron para la expresión de CD3 en las células T (2GV6 Ventana). En la figura 21 se muestra la infiltración de células T en tejido tumoral del xenoinjerto de SHP77 con una proteína de unión a DLL3/CD3 de ejemplo. Las puntuaciones en la Tabla 12 se utilizaron para cuantificar la expresión de CD3 en los tejidos tumorales de xenoinjerto.

Tabla 12: Puntuaciones para la cuantificación de células T positivas para CD3 infiltrantes

Ejemplo 21: Producción de anticuerpos anti-DLL3

Con el fin de obtener ligantes anti-DLL3, se cultivaron in vitro hibridomas o células B individuales derivadas de ratones de tipo salvaje inmunizados con DLL3 y ratones humanizados AlivaMab (Ablexis, San Francisco, CA, EE. UU.). Se cultivó in vitro la plataforma de ratones transgénicos AlivaMab con loci de inmunoglobulinas humanas. Los sobrenadantes se cribaron para reactividad contra DLL3 humano recombinante, mediante AlphaLISA (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.), y contra células SHP-77 (ATCC®, CRL-2195TM) que expresaban DLL3 humano, mediante citometría de flujo.

A continuación, se amplificaron los genes de VH y VL de inmunoglobulina (Ig) a partir de los clones positivos identificados. Para aislar el ARN de los hibridomas, se peletizaron aproximadamente 2x106 células de clones individuales y se utilizaron como material de origen. Para las células B individuales, se utilizaron de 100 a 500 células expandidas a partir de células B aisladas individualmente como material de origen. El ARN se aisló utilizando RNeasy Plus (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, se sintetizó ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Smarter (Clontech, Mountain View, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para facilitar la síntesis del ADNc, se utilizó oligodT para iniciar la transcripción inversa de todos los ARN mensajeros, seguido de la adición de caperuza en el extremo 5' de un oligonucleótido Smarter IIA. A continuación se llevó a cabo la amplificación de los fragmentos VH y VL utilizando una amplificación por PCR en 2 etapas con cebadores 5' con diana en la caperuza Smarter IIA y cebadores 3' con diana en regiones de consenso en CH1. En resumen, cada reacción de PCR de 50 pl consistía en mezclas de cebadores directo e inverso a una concentración de 20 pM, 25 pl de premezcla de a Dn polimerasa PrimeStar Max (Clontech), 2 pl de ADNc no purificado y 21 pl de H2O bidestilada. El programa de ciclado se inició con 94 °C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos (94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 1 minuto, 68 °C durante 1 minuto), y finalizando con 72 °C durante 7 minutos. La PCR de segunda ronda se llevó a cabo con los cebadores de segunda ronda de VL y VH que contenían extensiones complementarias de 15 pares de bases (pb) que "se superponían" a las regiones respectivas en su vector madre pTT5 respectivo (VH y VL). Se llevó a cabo una PCR de segunda ronda siguiendo el siguiente programa: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 1 min, 68 °C durante 1 min), y terminó con 72 °C durante 7 min.

Se utilizó el kit de clonación In-Fusion® HD (Clontech, EE. UU.) para la clonación direccional del gen de VL dentro del vector pTT5 huIgK y del gen de VH dentro del vector pTT5 huIgG1KO. Para facilitar la clonación In-Fusion® HD, los productos de PCR se purificaron y trataron con potenciador de clonación antes de la clonación In-Fusion HD. La clonación y la transformación se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Clontech, EE. UU.). Los ADN de minipreparación se sometieron a secuenciación de Sanger para confirmar que se habían obtenido fragmentos de gen V completo.

Usando esta metodología, se prepararon pares de genes de VH y VL de Ig que codificaban dominios de unión con especificidad para DLL3. Los anticuerpos recombinantes se produjeron mediante la transfección transitoria de células CHO-E37 con los plásmidos que codificaban las cadenas pesada y ligera correspondientes.

Cribado de confirmación de anticuerpos recombinantes.

Se sometieron a ensayo los sobrenadantes que contenían anticuerpos recombinantes expresados mediante citometría de flujo para la unión a líneas celulares que expresaban DLL3 humano. En resumen, se incubaron las células con sobrenadantes recombinantes, se lavaron y los mAb unidos de los sobrenadantes se detectaron con anti-IgG humana-APC (Jackson ImmunoResearch 109-136-098). Las proporciones de señal-fondo (S/F) se calcularon mediante división de la mediana de intensidad de fluorescencia (MIF) de la muestra por la del control de isotipo.

Se llevó a cabo una resonancia del plasmón superficial (SPR) en Biacore 400 de los sobrenadantes recombinantes. En resumen, las IgG no optimizadas en los sobrenadantes de HTP se capturaron a través de la proteína A/G sobre la superficie del sensor durante 60 segundos a 10 pl/min. Se llevó a cabo un seguimiento de la unión de DLL3 humano 100 nM a las IgG capturadas, durante 180 segundos de asociación a 30 pl/min, seguido de 120 segundos de disociación en el tampón HBS-EP. La regeneración de la superficie de la proteína A/G se realizó con glicina a pH 2,1 entre cada ciclo de unión. En este ensayo se utilizaron los siguientes materiales: reactivo de proteína: DLL3 humano expresado recombinantemente. Tampón de migración del sistema: HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y polisorbato P20 al 0,005 % v/v). Reactivo de captura: proteína A/G, con especificidad para todos los isótopos de IgG humana.

Se seleccionaron los clones de interés (con Kd<300pM) y se evaluaron adicionalmente en diversos ensayos de detección tal como se describe a continuación.

Ejemplo 22: Unión de anticuerpos anti-DLL3 a la proteína DLL3 humana recombinante.

La unión de anticuerpos se llevó a cabo en un ensayo ELISA. En resumen, se recubrió con los anticuerpos anti-DLL3 a una concentración de 2 pg/ml a 4 °C durante toda la noche. Después de un lavado, las placas se bloquearon con un tampón de bloqueo (Gibco, Gibco n.° 043-90309A) durante una hora a temperatura ambiente, seguido de un lavado y una incubación con proteína DLL3 recombinante a concentraciones crecientes. Para la detección, la proteína DLL3 unida se incubó con un anticuerpo policlonal anti-DLL3 (R&D Systems, AB4315) seguido de un anticuerpo anticabra etiquetado con SULFO-TAG (R32AG-1) durante una hora. El anticuerpo unido se cuantificó utilizando un tampón de lectura (MSD) en un sistema de imagen Sector 6000 (MSD). La figura 22 muestra la unión a tres anticuerpos anti-DLL3 de ejemplo a una proteína recombinante. El anticuerpo anti-DLL3 con diana en el dominio peptídico próximo a la membrana (DLL3 n.° 3) mostraba una unión más fuerte a la proteína DLL3 recombinante, en comparación con los anticuerpos anti-DLL3 con diana en el dominio EGF4 (DLL3 n.° 4) o en el dominio EGF1 (DLL3 n.° 5).

Ejemplo 23: Unión de anticuerpos anti-DLL3 a líneas celulares de CPM.

Se tiñeron células (células T o células de CPM humanas) con concentraciones crecientes de anticuerpo anti-DLL3 en un tampón FACS (PBS/BSA al 0,5 %/azida sódica al 0,05 %). Las moléculas unidas se detectaron con anticuerpo secundario antirratón conjugado con PE (Jackson Immuno Research, 115-116-072) mediante análisis de FACS. Los anticuerpos anti-DLL3 con diana en los dominios DSL (DLL3 n.° 6), EGF1 (DLL3 n.° 5) o EGF4 (DLL3 n.° 4) mostraban una unión más fuerte a las líneas celulares de CPM que expresaban DLL3, en comparación con los anticuerpos anti-DLL3 con diana en el péptido C-terminal (DLL3 n.° 1, DLL3 n.° 2 y DLL3 n.° 3), tal como se muestra en la figura 23.

Ejemplo 24: (IHQ)

Se sometieron a ensayo anticuerpos anti-DLL3 en una muestra de CPM positiva para ARNm de DLL3 a una concentración de 20 pg/ml utilizando una plataforma Ventana Discovery ultra (Ventana Medical Systems, Inc, Arizona) y siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se llevó a cabo la IHQ en tejido fijado en formalina e incluido en parafina en secciones (4 pm) con tinción de los anticuerpos anti-DLL3. Se llevó a cabo un ensayo IHQ en la plataforma Ventana Discovery Ultra utilizando RUO Discovery. La tinción de anticuerpos anti-DLL3 se optimizó utilizando proteinasa K para la recuperación de epítopos durante 12 minutos. El anticuerpo anti-DLL3 se incubó durante 60 minutos, seguido del sistema de detección antimurino HQ y anti HQ HRP, ambos durante 12 minutos. Se sometieron a ensayo controles negativos (anticuerpos IgG) para cada sección de tejido, tratados de manera idéntica a los portaobjetos de ensayo.

Como control positivo se utilizó la línea celular de CPM humana SHP77. Se captaron imágenes digitales de secciones de tejido completo utilizando un escáner histológico Leica SCN400 (Leica Microsystems, Milton Keynes, Reino Unido).

El análisis de inmunohistoquímica de una muestra humana de CPM con anticuerpos anti-DLL3 de ejemplo se muestra en la figura 24.

Ejemplo 25: Determinación de los niveles de expresión en líneas celulares de CPM.

La expresión en la superficie celular de los anticuerpos anti-DLL3 se cuantificó utilizando QIFIKIT (K0078; Dako). En resumen, las líneas celulares de CPM (SHP77, NCI-H82 y NCI-H2286) se marcaron con el anticuerpo anti-DLL3 (DL309, documento n.° WO 2011/093097) o con un anticuerpo irrelevante (control de isotipo) a una concentración de 5 pg/ml en un vial separado. Posteriormente, las células y las perlas proporcionadas en el kit se marcaron en paralelo con anticuerpos secundarios antimurinos conjugados con fluoresceína. Las muestras se midieron en un fluorocitómetro BD CantolI y, seguidamente se correlacionó el nivel de fluorescencia con el número de anticuerpos anti-DLL3 unidos a las células y a las microesferas. La Tabla 12 muestra las moléculas DLL3 expresadas sobre la superficie celular de tres líneas celulares de cáncer pulmonar microcítico (CPM).

Tabla 13: Moléculas de DLL3 expresadas sobre la superficie celular de líneas celulares de CPM

Ejemplo 26: Determinación de la sensibilidad del protocolo de IHQ en bloques de líneas celulares de CPM.

Para evaluar la sensibilidad del protocolo de IHQ, las líneas celulares de CPM (SHP77, NCI-H82 y NCI-H2286) se procesaron como tejidos en hospitales y se fijaron en formalina y posteriormente se incluyeron en parafina.

Las líneas celulares de CPM se cultivaron de acuerdo con las instrucciones de la ATCC. Las células se desprendieron de la placa mediante raspado y se fijaron en formalina, y posteriormente se añadieron a Histogel solubilizado (Thermo Fisher Scientific, HG-4000-012) e incubaban durante la noche a 4 °C, seguido de un procedimiento estándar de inclusión en parafina realizado en un laboratorio de patología rutinario. En resumen, el bloque celular se incubó en etanol y isopropanol antes incorporarlo en parafina (roti-Plast, n.° 6642.5). Se realizaron secciones de los bloques de pellet celular y se tiñeron siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 24. Los resultados mostrados en la figura 25 muestran que un protocolo de IHQ con el anticuerpo anti-DLL3 d LL3 n.° 5 es capaz de detectar células con una expresión de DLL3 muy baja.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Proteína que comprende una primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 y una segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde dicha primera unidad de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3 se selecciona del grupo que consiste en i) a iii):

i) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 (CDR1), SEQ ID NO:2 (CDR2) y SEQ ID NO:3 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQ ID NO:5 (CDR2) y SEQ ID NO:6 (CDR3),

ii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7 (CDR1), SEQ ID NO:8 (CDR2) y SEQ ID NO:9 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:10 (CDR1), SEQ ID NO:11 (CDR2) y SEQ ID NO:12 (CDR3), y

iii) una unidad de unión de antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:17 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3),

y en donde dicha segunda unidad de unión de antígenos que se une específicamente a CD3 comprende:

i) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3), o ii) CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:61 (CDR1), SEQ ID NO:62 (CDR2) y SEQ ID NO:63 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:64 (CDR1), SEQ ID NO:65 (CDR2) y SEQ ID NO:66 (CDR3).
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha primera unidad de unión a antígeno comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2) y SEQ ID NO:15 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:16 (CDR1), SEQ ID NO:17 (CDR2) y SEQ ID NO:18 (CDR3) y una segunda unidad de unión a antígeno que comprende CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:55 (CDR1), SEQ ID NO:56 (CDR2) y SEQ ID NO:57 (CDR3) y CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2) y SEQ ID NO:60 (CDR3).
3. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha primera unidad de unión a antígeno comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un primer dominio variable de cadena pesada y se selecciona del grupo que consiste en i) a iii):

i) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:38,

ii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:40, y

iii) una unidad de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:42.
4. Proteína según la reivindicación 1 o 3, en la que dicha segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende:

i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:68, ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:69 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:70.
5. Proteína según la reivindicación 4, en la que dicha primera unidad de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:42, y dicha segunda unidad de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:67 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:68.
6. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que:

i) dicha primera unidad de unión de antígeno que se une específicamente a DLL3 comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, un primer dominio variable de cadena ligera, un primer dominio constante de cadena ligera, un primer conector peptídico, un primer dominio variable de cadena pesada y un primer dominio constante CH1 de cadena pesada, y

ii) dicha segunda unidad de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, un segundo dominio variable de cadena ligera, un segundo dominio constante de cadena ligera, un segundo conector peptídico, un segundo dominio variable de cadena pesada y un segundo dominio constante CH1 de cadena pesada.
7. Proteína según la reivindicación 6, en la que dicho primer y/o segundo conector peptídico comprende 26 a 42 aminoácidos, preferentemente cualquiera de 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos, o 36 a 39 aminoácidos, más preferentemente 38 aminoácidos.
8. Proteína según la reivindicación 6 o 7, en la que dicho primer conector peptídico y/o segundo conector peptídico es un conector Gly-Ser, que comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:89, más preferentemente dicho primer y segundo conector peptídico comprenden la misma secuencia.
9. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende, además, un primer y un segundo dominio Fc, en la que dicho primer dominio Fc está unido covalentemente a dicha primera unidad de unión a antígeno, y dicho segundo dominio Fc está unido covalentemente a dicha segunda unidad de unión a antígeno.
10. Proteína según la reivindicación 9, en la que:

i) dicho primer dominio Fc comprende una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y], y dicho segundo dominio Fc comprende una treonina (T) en la posición 407 [Y407T], o

ii) dicho primer dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y dicho segundo dominio Fc comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], una alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V], o

iii) dicho segundo dominio Fc comprende una tirosina (Y) en la posición 366 [T366Y], y dicho primer dominio Fc comprende una treonina (T) en la posición 407 [Y407T], o

iv) dicho segundo dominio Fc comprende un triptófano (W) en la posición 366 [T366W], y dicho primer dominio Fc comprende una serina (S) en la posición 366 [T366S], una alanina (A) en la posición 368 [L368A] y una valina (V) en la posición 407 [Y407V],

preferentemente en la que dicho primer o dicho segundo dominio Fc comprende, además, una arginina en la posición 435 [H435R] y una fenilalanina en la posición 436 [Y436F].
11. Proteína según la reivindicación 10, en la que dicho primer y/o dicho segundo dominio Fc comprende, además, una alanina en la posición 234 [L234A] y en la posición 235 [L235A].
12. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en la que el primer dominio constante de cadena ligera y el segundo dominio constante de cadena ligera comprenden un dominio kappa o lambda humano.
13. Proteína que comprende:

(i) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79, o

(ii) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79, o

(iii) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79, o

(iv) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 y que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:73 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 y que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80, o

(v) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:74 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80, o

(vi) una primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y una segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:80.
14. Proteína según la reivindicación 13, en la que la primera cadena polipeptídica que se une específicamente a DLL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:75 y la segunda cadena polipeptídica que se une específicamente a CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:79.
15. Célula huésped transfectada con dos vectores de expresión, un vector de expresión que codifica una primera cadena polipeptídica de cualquiera de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 o S<e>Q ID NO:75 y otro vector de expresión que codifica una segunda cadena polipeptídica de SEQ ID NO:79 o SEQ ID NO:80.
16. Método de fabricación de una proteína según la reivindicación 13, que comprende:

i) cultivar la célula huésped según la reivindicación 15 bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína según la reivindicación 13, y

ii) recuperar la proteína, y opcionalmente

iii) purificar y/o modificar y/o formular adicionalmente la proteína.
17. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la utilización en medicina.
18. Composición farmacéutica que comprende la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un portador farmacéuticamente aceptable.
19. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la utilización en un método de tratamiento del cáncer.
Proteína para la utilización según la reivindicación 19, en la que el cáncer es un tumor que expresa DLL3, preferentemente en la que el cáncer es cáncer pulmonar microcítico (CPM), glioblastoma o un tumor neuroendocrino que expresa DLL3.
21. Proteína para la utilización según la reivindicación 19 o 20, en la que dicha proteína se utiliza en combinación con un agente quimioterapéutico, un compuesto terapéuticamente activo que inhibe la angiogénesis, un inhibidor de la ruta de transducción de señales, un inhibidor de EGFR, un inmunomodulador, un inhibidor de punto de control inmunitario o un agente de terapia hormonal.
22. Proteína para la utilización según la reivindicación 21, en la que dicha proteína se utiliza en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario, preferentemente un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1.
23. Proteína para la utilización según la reivindicación 22, en la que el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5.