ES3021881T3 - Recombinant mopeia virus and vaccine platform - Google Patents

Abstract

Virus Mopeia atenuado recombinante (MOPV) que comprende un segmento S genómico recombinante que codifica una nucleoproteína con actividad exonucleasa atenuada y, opcionalmente, una glucoproteína de arenavirus no MOPV. Uso del MOPV atenuado recombinante para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Virus mopeia recombinante y plataforma de vacuna

Estado de la técnica

El virus Mopeia (MOPV) es un arenavirus del Viejo Mundo, filogenéticamente relacionado de forma cercana con el virus Lassa (LASV). El MOPV se aisló por primera vez en el roedor Mastomys en Mozambique, mientras que el LASV es endémico en África Occidental. A diferencia del LASV, la infección por MOPV nunca se ha observado en humanos y la infección experimental de monos por MOPV es asintomática. El LASV, agente etiológico de la fiebre de Lassa (LF, por sus siglas en inglés), infecta a entre 100.000 y 300.000 personas cada año, causando la muerte de aproximadamente 5.000 de ellas1. El virus está presente de forma natural en los roedores Mastomys y la contaminación humana se produce a través del contacto directo con los roedores o sus deyecciones. Después de un período de incubación relativamente corto, la enfermedad comienza con síntomas similares a los de la gripe como, por ejemplo, fiebre, mialgia y cefalea. En las formas graves, se observan hemorragias y edemas2. En las fases tardías, la muerte de los pacientes ocurre en un contexto de shock hipovolémico, hipotensivo e hipóxico. Entre los que sobreviven, se han informado complicaciones graves como, por ejemplo, mialgia persistente y sordera3. Hasta la fecha, no se dispone de ninguna vacuna autorizada ni de ningún tratamiento eficaz para su uso en terreno. Además, el virus también se exporta en ocasiones a países industrializados4.

Otros arenavirus también son responsables de fiebres hemorrágicas graves, con un cuadro clínico similar: virus Lujo5 (perteneciente al clado de los arenavirus del Viejo Mundo), Junin6, Chapare7, Machupo8, Sabia9, Guanarito10 y Whitewater Arroyo11 (todos pertenecientes al clado del Nuevo Mundo). Con frecuencia se aíslan nuevos arenavirus, ya sea en humanos o en roedores, y el área afectada por estos virus está en expansión, lo cual demuestra el dinamismo de esta familia de virus y la amenaza que representan para la salud pública.

Hasta la fecha, no se dispone de ningún tratamiento para luchar contra estos agentes mortales. La única vacuna disponible aprobada por la FDA es la vacuna Candid#112, una cepa natural atenuada del virus Junin, capaz de proteger a los humanos contra este virus. Por lo tanto, el desarrollo de una estrategia de vacuna dirigida contra las enfermedades inducidas por arenavirus es un desafío importante y representa probablemente el enfoque más valioso para hacer frente a esta amenaza.

La vacunación experimental de primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) con MOPV los protegió contra un desafío experimental con LAS<v>13, arrojando luz sobre el potencial protector de MOPV contra LASV. Sin embargo, la administración de un virus natural de este tipo en humanos no es factible, debido a la falta de conocimiento pleno sobre su seguridad en humanos y, más particularmente, en personas inmunodeprimidas, ancianos y mujeres embarazadas. Además, la administración de un virus vivo natural como vacuna plantea cuestiones éticas y, por diversas razones, no es factible.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de una plataforma de vacuna y vacunas contra arenavirus patógenos, incluido el LASV, para su uso como vacuna y/o terapéutica contra arenavirus responsables de fiebres hemorrágicas y otras afecciones en humanos. La invención descrita y provista en la presente memoria satisface estas y otras necesidades. La invención es como se define en las reivindicaciones.

Objeto de la ivencion

Los inventores han descubierto que la nucleoproteína (NP) del MOPV tiene una función exonucleasa similar a la del LASV. En el LASV, la función exonucleasa desempeña un papel en la patogenicidad porque digiere el ARN de doble cadena (ARNds), el cual es un importante patrón molecular asociado a patógenos (PAMP, por sus siglas en inglés) que se espera que sea reconocido por el sistema inmunitario innato para luchar contra la infección. Dado que la NP del LASV es capaz de digerir estos ARNds, se evita14 su reconocimiento por el sistema inmune y la subsecuente activación de IFN, lo cual conduce a una replicación y diseminación viral incesante. Es sorprendente que la NP del MOPV también presente esta función exonucleasa, ya que el MOPV no es patógeno. Como se describe en los ejemplos, los inventores han generado un MOPV recombinante, en el que la función exonucleasa ha sido anulada (MOPV-ExoN). Los ejemplos caracterizan a este virus por sus propiedades replicativas e inmunogenicidad, e identificaron que este virus es poco replicativo en células inmunitarias, capaz de activar fuertemente células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) y macrófagos (MP, por sus siglas en inglés), y es mucho más inmunogénico que su homólogo de tipo salvaje. Basándose en parte en estos datos, esta invención provee una nueva plataforma de vacuna contra arenavirus patógenos.

Los ejemplos describen la producción de un MOPV recombinante atenuado a modo de ejemplo que comprende una NP con actividad exonucleasa atenuada y opcionalmente una glicoproteína (GP) heteróloga, en particular un precursor de glicoproteína (GPC) heterólogo de un arenavirus patógeno (p. ej.,Lassa).Como se demuestra en los ejemplos, los MOPV recombinantes atenuados presentan varias propiedades deseables que demuestran que los MOPV recombinantes atenuados de la invención son particularmente útiles como agentes para inducir respuestas inmunogénicas en un sujeto contra un arenavirus como, por ejemplo, para inmunizar contra o tratar una infección por arenavirus.

Por consiguiente, esta invención provee un virus Mopeia recombinante atenuado (MOPV) que comprende un ácido nucleico heterólogo y un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína con actividad exonucleasa atenuada, en donde la nucleoproteína difiere de ID SEC n.° 4 en las sustituciones de aminoácidos D390A y G393A y el ácido nucleico heterólogo codifica una glicoproteína de arenavirus no MOPV o un precursor de glicoproteína de arenavirus no MOPV. Los MOPV recombinantes atenuados son útiles, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunogénica contra un arenavirus en un sujeto.

En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido D390 o G393. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393.

En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido D390 o G393, y comprende además al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada entre E392, H430, D467, H529 y D534. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 o G393, y comprende además una sustitución de aminoácido en la posición E392. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 o G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392 y H430. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 o G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430 y D467. En aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 o G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430, D467 y H529. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 o G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430, D467 y D534. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 o G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430, D467, H529 y D534. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada entre E392, H430, d467, H529 y D534. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en la posición E392. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392 y H430. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430 y D467. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430, D467 y H529. En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430, D467 y D534 (designatedMOPV-ExoNM6b). En algunos aspectos de la descripción de un MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390 y G393, y comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392, H430, D467, H529 y D534.

En el MOPV recombinante atenuado según se reivindica, la nucleoproteína comprende las sustituciones de aminoácidos D390A y G393A. En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además al menos una sustitución de aminoácido seleccionada entre E392A, H430A, D467A y D534A. En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además sustituciones de aminoácidos en la posición E392A (designatedMOPV-ExoNM3). En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392A y H430A (designatedMOPV-ExoNM4). En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392A, H430A y D467A (designatedMOPV-ExoNM5). En algunos aspectos de la descripción del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392A, H430A, D467A y H529A (designatedMOPV-ExoNM6a). En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392A, H430A, D467A y D534A (designatedMOPV-ExoNM6b). En algunos aspectos de la descripción del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además sustituciones de aminoácidos en las posiciones E392A, H430A, D467A, H529A y D534A (designatedMOPV-ExoNM7).

En el MOPV recombinante atenuado según se reivindica, el ácido nucleico heterólogo codifica una glicoproteína (GP) de arenavirus no MOPV, en particular un precursor de glicoproteína (GPC) de arenavirus no MOPV. En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, el arenavirus no MOPV es un virusLassa(LASV).

Se describe en la presente memoria que el MOPV recombinante atenuado puede ser poco replicativo en células inmunitarias, activa fuertemente al menos una de las células dendríticas (DC) y macrófagos (MP), y/o es más inmunogénico que el MOPV no modificado. Se describe en algunos aspectos que el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias. Se describe en algunos aspectos que el MOPV recombinante atenuado activa fuertemente al menos una de las células dendríticas (DC) y macrófagos (MP). Se describe en algunos aspectos que el MOPV recombinante atenuado es más inmunogénico que el MOPV no modificado.

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias y activa fuertemente al menos una de las células dendríticas (CD) y macrófagos (MP).

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado activa fuertemente al menos una de las células dendríticas (DC) y macrófagos (MP), y es más inmunogénico que el MOPV no modificado.

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias y es más inmunogénico que el MOPV no modificado.

La invención también provee composiciones inmunogénicas que comprenden al menos uno de los MOPV recombinantes atenuados descritos como una realización en la presente memoria.

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

La descripción también describe métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un arenavirus en un sujeto. En algunos aspectos, el método es un método para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra un arenavirus en un sujeto en riesgo de infección por el arenavirus. Tales métodos pueden comprender la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un arenavirus de la invención como, por ejemplo, en la forma de una composición inmunogénica que comprende un arenavirus de la invención.

En algunos aspectos de la descripción, el método es un método para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica contra un arenavirus en un sujeto infectado con el arenavirus. Tales métodos pueden comprender la administración de una cantidad efectiva de un arenavirus como, por ejemplo, en la forma de una composición inmunogénica que comprende un arenavirus, a un sujeto infectado con el arenavirus. En las reivindicaciones, la invención se refiere a un MOPV recombinante atenuado de la invención para su uso como vacuna para prevenir y/o tratar una infección por arenavirus, o para su uso como vacuna para prevenir y/o tratar una enfermedad inducida por un arenavirus. La invención también provee una célula eucariota que comprende un MOPV recombinante de la invención.

Descripción de las figuras

LasFiguras 1A a 1Cmuestran el diseño racional utilizado en la presente memoria para producir el prototipo de vacuna anti-LASV descrito. (A) ldentificación de residuos críticos en la proteína NP que son importantes para la anulación de la función exonucleasa de la NP de MOPV, localización del dominio DEDDH. ID SEC n.° 6: PNAKTWIDIEGRPED (B) Manipulación genética del segmento corto del MOPV. 1. Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para introducir mutaciones de pérdida de función D390A/G393A (y otras) en el marco de lectura abierta de NP.

2. Intercambio del gen GPc en el segmento genómico corto de MOPV. 3. Combinación de ambos enfoques dando como resultado MOPV-ExoN GP<lasv>. (C) Estrategia de genética inversa para la obtención de los virus recombinantes mutados. El pPOLI-MOPV-Sag diseñado se transfectó junto con PTM1-LPol, PTM1-NP, pPOLI-MOPV-Lag en células que albergaban polimerasa T7, lo cual llevó a la producción de virus rec-MOPV, MOPV-ExoN, MOPV-ExoN<mejorado>, MOPV-ExoNM6b, MOPV-GP<lasv>, MOPV-ExoN GP<lasv>, MOPV-ExoN<mejorado>-GP<LAsv>y MOPV-ExoNM6b-GPC que expresan otras GPC.

LasFiguras 2A y 2Bmuestran las propiedades replicativas de MOPV-ExoN. (A) Las células Vero E6 fueron infectadas a una MOl de 0,01. Los sobrenadantes celulares se recogieron diariamente durante un máximo de 7 días, y la concentración de virus se determinó mediante ensayo en placa. Los resultados se expresan en log de Unidad Formadora de Foco/ml (log FFU/ml). (B) Las células dendríticas derivadas de monocitos (panel izquierdo) y los macrófagos (panel derecho) fueron infectados con rec-MOPV, nat-MOPV o MOPV-ExoN, a una MOl de 0,1. Los sobrenadantes se recogieron diariamente durante un máximo 4 días y se determinaron los títulos virales. Los datos son representativos de 3 experimentos diferentes, las barras de error representan el error estándar.

LasFiguras 3A y 3Bmuestran las propiedades inmunológicas de MOPV ExoN. Las células dendríticas derivadas de monocitos (panel A) o los macrófagos derivados de monocitos (panel B) fueron infectados a una MOl de 1 con nat-MOPV, rec-MOPV o MOPV-ExoN, o MOCK-infectados. 48 horas después de la infección, las células fueron recolectadas y analizadas por citometría de flujo para determinar la expresión de los marcadores de superficie CD80, CD83, CD40 y CD86 y, en el caso de los macrófagos, la presencia intracelular de Caspasa 3 activada. Los datos se expresan en porcentaje del total de células. Los datos se expresan como la media de 4 experimentos diferentes, y las barras de error representan los errores estándar. (*): P < 0,05; (**): P<0,01; (***): P <0,001.

LasFiguras 4A a 4Bmuestran la activación de la inmunidad innata por MOPV-ExoN. Las células dendríticas derivadas de monocitos (panel A) o los macrófagos derivados de monocitos (panel B) fueron infectados a una MOl de 1 con nat-MOPV, rec-MOPV o MOPV-ExoN, o MOCK-infectados. 24 horas después de la infección, las células fueron recolectadas y el ARN celular se extrajo, se transcribió inversamente utilizando cebadores oligo-dT y se sometió a PCR cuantitativa para IFNalfa1, IFNalfa2, IFNbeta, TNFalfa y CXCL10. Los datos se representan como expresión normalizada respecto al gen de mantenimiento GAPDH y son la media de 4 experimentos independientes, la barra de error representa los errores estándar. (*): p < 0,05.

LaFigura5 muestra el impacto del intercambio de genes gp en la replicación viral. Células Vero E6 infectadas con rec-MOPV, rec-MOPV-GP<LASV>o rec-MOPV-ExoN-GP<LASV>, a una MOl de 0,01. Los sobrenadantes celulares se recogieron 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, y los títulos virales, determinados mediante ensayos de placa, se expresan en log de Unidades Formadoras de Foco/ml (log FFU/ml). Los datos representan la media de dos experimentos concomitantes, en los que cada título se determinó dos veces. Las barras de error representan el error estándar.

LaFigura 6muestra que GPC Lassa no participa en la respuesta de IFN tipo 1 durante la infección. (A) Cinética de los virus LASV-wt, LASV-GPC<mopv>, MOPV-wt y MOPV-GPC<lasv>en células Vero E6 infectadas a una MOl de 0,01. Los títulos virales se determinaron por titulación de sobrenadantes de cultivo en Vero E6 y se expresaron como log de Unidades Formadoras de Foco/ml (FFU/ml). (B) Los macrófagos derivados de monocitos humanos fueron infectados de forma simulada o fueron infectados a una MOl de 1 con LASV-wt, LASV-GPC<mopv>, MOPV-wt y MOPV-GPC<lasv>. El ARN celular total se extrajo utilizando el reactivo RLT (Qiagen). Los niveles de ARNm de IFN-alfa1 (gráfico de la izquierda), IFN-alfa2 (gráfico central) e IFN-beta (gráfico de la derecha) en células infectadas de forma simulada o en células infectadas se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa 24 horas después de la infección. Los resultados informados son los números de copias del ARNm considerado/número de copias del ARNm de GADPH y representan la media ± error estándar de tres experimentos independientes (donantes diferentes). * = P<0,05; ns = no relevante estadísticamente.

LaFigura 7muestra la consolidación de la actividad de ExoN KO. (A) Residuos implicados en la coordinación del catión divalente obligatorio para la actividad ExoN de la nucleoproteína NP y mutantes propuestos; ID SEC n.° 8: D390, E392, G393, H430, D467, H529, D534; ID SEC n.° 9: ExoNM; ID SEC n.° 10: ExoNM3; ID SEC n.° 11: ExoNM4; ID SEC n.° 12: ExoNM5; ID SEC n.° 13: ExoNM6a; ID SEC n.° 14: ExoNM6b; ID SEC n.° 15: ExoNM7. (B) Actividad antagonista de IFN de los mutantes NP en un ensayo de gen reportero. En este ensayo, se evalúa la inducción de un promotor derivado de IFN por el virus Sendai (SeV) en células transfectadas que expresan diferentes mutantes NP. Cinética de los virus mutantes MOPV-wt,<m>O<p>V-E<xo>NM2 y MOPV-ExoNM6b (C) en células Vero E6 infectadas a una MOl de 0,01 y (D) en macrófagos derivados de monocitos humanos infectados a una MOl de 0,5. Los títulos virales se determinaron por titulación de sobrenadantes de cultivo en Vero E6 como se ha descrito anteriormente. (E) Se extrajeron ARN celulares totales de macrófagos infectados de forma simulada o macrófagos infectados y se determinaron los niveles de ARNm de IFN-a1 (gráfico superior), IFN-a2 (gráfico central) e IFN-B (gráfico inferior) mediante RT-PCR cuantitativa 24 horas después de la infección. Los resultados se informan como se muestra en la Figura 6B.

LaFigura 8muestra que los virus basados en Mopeia M6b que albergan GPC de arenavirus afines activan células inmunitarias y son fuertes inductores de la respuesta de IFN tipo 1. (A) Focos infecciosos inducidos en células Vero E6 por los diferentes virus recombinantes basados en MOPV-wt y -ExoNM6b que expresan GPC de virus Lassa (Josiah), Lujo, Machupo (Carvallo), Guanarito (INH95551), Chapare y Sabia y revelados por inmunotinción. (B) Cinética de los virus MOPV-wt, MOPV-ExoNM6b, MOPV-ExoNM6b-GPC<LAsv>y MOPV-ExoNM6b-GPC<MACv>en macrófagos derivados de monocitos humanos infectados a una MOl de 0,05. (C, D) Macrófagos derivados de monocitos humanos infectados de forma simulada o infectados a una MOl de 0,5 con MOPV-wt, MOPV-ExoNM6b, MOPV-ExoNM6b-GPC<LAsv>y MOPV-ExoNM6b-GPC<MACv>. Detección por citometría de flujo de los marcadores de activación de la superficie celular CD40, CD80 y CD86 en macrófagos humanos infectados de forma simulada o infectados 48 horas después de la infección (C). Se extrajeron los ARN celulares totales y se determinaron los niveles de ARNm de IFN-a1 (gráfico de la izquierda), IFN-a2 (gráfico central) e IFN-B (gráfico de la derecha) mediante RT-PCR cuantitativa 24 o 48 horas después de la infección (D). Los resultados se informan como se muestra en la Figura 6B.

LaFigura 9muestra un esquema simplificado del sistema de genética inversa del Mopeia.

Descripción detallada de la invención

A. Arenavirus

Arenavirus es un género de virus que infecta a roedores y, ocasionalmente, a seres humanos. Se conocen al menos ocho arenavirus que causan enfermedad humana. Las enfermedades derivadas de los arenavirus varían en gravedad. La meningitis aséptica, una enfermedad humana grave que provoca una inflamación de las capas que recubren el cerebro y la médula espinal, puede derivarse de la infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV, por sus siglas en inglés). Los síndromes de fiebre hemorrágica pueden derivar de infecciones por virus Guanarito (GTOV), virus Junin (JUNV), virus Lassa (LASV), virus Lujo (LUJV), virus Machupo (MACV), virus Sabia (SABV) o virus Whitewater Arroyo (WWAV). Los arenavirus se dividen en dos grupos: los virus del Viejo Mundo y los del Nuevo Mundo. Las diferencias entre estos grupos se distinguen geográfica y genéticamente.

Los arenavirus son redondos, pleomórficos y envueltos, con un diámetro de 60 a 300 nm. Aunque con frecuencia se los clasifica erróneamente como virus de sentido negativo, en realidad son ambisentido. Esta confusión se debe al hecho de que, mientras que algunas secciones de su genoma se consideran de sentido negativo y codifican genes en sentido inverso, otras secciones codifican genes en sentido opuesto (sentido directo/positivo). Se teoriza que esta compleja estructura de expresión genética es el sistema regulador primitivo de los virus, que le permite al virus controlar qué proteínas se sintetizan y cuándo. El ciclo de vida de los arenavirus se limita al citoplasma celular. Las partículas virales, o viriones, son pleomórficas porque varían en apariencia, pero en muchos casos tienen forma esférica y están cubiertas por espigas de glicoproteínas de superficie.

Los arenavirus tienen un genoma de ARN segmentado que consiste en dos ARN ambisentido de cadena simple. El ARN genómico por sí solo no es infeccioso y se requiere maquinaria de replicación viral para iniciar la infección dentro de una célula huésped. El ARN con sentido genómico empaquetado en el virión del arenavirus se denomina ARN de sentido negativo, y primero debe ser copiado a un ARNm de sentido positivo para producir la proteína viral. Los dos segmentos de<a>RN se denominan pequeño (S) y grande (L), y codifican cuatro proteínas virales en una estrategia única de codificación ambisentido. Cada segmento de ARN codifica dos proteínas víricas en orientación opuesta, de modo que el genoma de ARN de sentido negativo sirve de molde para la transcripción de un único ARNm y la copia de sentido positivo del genoma de ARN sirve de molde para un segundo ARNm. Específicamente, el ARN del segmento S codifica la proteína nucleocápside (NP) viral y la glicoproteína (GP), en particular el precursor de la glicoproteína (GPC); y el ARN del segmento L codifica la ARN-polimerasa viral dependiente de ARN (L) y una pequeña proteína que contiene un dominio RING (Z). Las secuencias codificantes separadas de las dos proteínas virales están divididas por una secuencia de ARN de región intergénica que se prevé que se pliegue en una estructura de horquilla estable. La persona con experiencia en la técnica apreciará que las secuencias genómicas de los diversos arenavirus, así como de las proteínas codificadas por estos virus, están a disposición del público. Se pueden encontrar, p. ej., en el sitio web de laVirus Sequence Database(VSD) establecida y mantenida por el Centro de Inmunología y Patología, Instituto Nacional de Salud, Centros para Control y Prevención de Enfermedades de Corea.

En la solicitud, cuando se hace referencia a un virus (ARN), se hace referencia igualmente (e implícitamente) a un clon de dicho virus (ARN) como, por ejemplo, un clon de ARN, ADN o ADNc.

El extremo terminal de cada segmento de ARN contiene una secuencia altamente conservada para el reclutamiento de la maquinaria de replicación viral y el inicio de la transcripción del ARNm viral y la replicación genómica. Las secuencias conservadas de los extremos 5' y 3' del ARN son complementarias y permiten que cada segmento de ARN adopte una estructura de franja de ARN de doble cadena que mantiene los extremos muy próximos y da un aspecto circular a los moldes genómicos purificados de arenavirus visualizados por microscopía electrónica.

La proteína Z forma homo oligómeros y un componente estructural de los viriones. La formación de estos oligómeros es un paso esencial para el ensamblaje y la gemación de las partículas. La unión entre Z y el complejo glicoproteico de la envoltura viral es necesaria para la infectividad del virión. Z también interactúa con las proteínas L y NP. La actividad de polimerasa parece estar modulada por la asociación entre las proteínas L y Z. La interacción entre las proteínas Z y NP es fundamental para el empaquetamiento del genoma. La glicoproteína (GP) se sintetiza como una molécula precursora (precursor de glicoproteína, GPC). Esta sufre una escisión postraduccional en tres partes: las glicoproteínas viriónicas maduras GP1 y GP2, y un péptido señal estable (SSP, por sus siglas en inglés). Estas reacciones son catalizadas por peptidasas señal celulares y la enzima celular Subtilisin Kexin lsozyme-1 (SKI-1)/Proteasa del sitio 1 (S1P).

Los arenavirus pueden dividirse en dos serogrupos, que difieren genéticamente y por su distribución geográfica. Cuando el virus se clasifica como “del Viejo Mundo”, significa que se encontró en el hemisferio oriental, en lugares como, por ejemplo, Europa, Asia y África. Cuando se lo encuentra en el hemisferio occidental, en lugares como, por ejemplo, Argentina, Bolivia, Venezuela, Brasil y Estados Unidos, se lo clasifica como “del Nuevo Mundo”. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) es el único arenavirus que existe en ambas zonas, pero está clasificado como un virus del Viejo Mundo. El complejo del Viejo Mundo incluye el virus Gairo, el virus Gbagroube, el virus lppy, el virus Kodoko, el virus Lassa, el virus Lujo, el virus Luna, el virus Lunk, el virus de la coriomeningitis linfocítica, el virus Merino Walk, el virus Menekre, el virus Mobala, el virus Morogoro, el virus Mopeia, el virus Wenzhou y el virus Tacaribe. El complejo del Nuevo Mundo incluye el virus Amapari, virus Chapare, virus Flexal, virus Guanarito, virus Junin, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Patawa, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabiá, virus Tacaribe, virus Tamiami y virus Whitewater Arroyo.

Un “ácido nucleico heterólogo” es una secuencia de ácido nucleico que se inserta en un segmento genómico de un arenavirus donde no se encuentra de forma natural. Según un aspecto, el ácido nucleico heterólogo tiene generalmente al menos 15 nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, tiene al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 75 o al menos 100 nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo es una secuencia de ácido nucleico del genoma de un primer arenavirus que se inserta en el genoma de un segundo arenavirus. Por ejemplo, el primer arenavirus puede ser un arenavirus patógeno (como, por ejemplo, LASV) y el segundo arenavirus puede ser un arenavirus no patógeno (como, por ejemplo, MOPV). En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína de arenavirus como, por ejemplo, una GP de arenavirus, preferiblemente un GPC de arenavirus. Según la invención y en las reivindicaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica una glicoproteína de arenavirus no MOPV o un precursor de glicoproteína de arenavirus no MOPV.

Como se describe en la presente memoria, se dice que una nucleoproteína tiene “actividad exonucleasa atenuada” cuando la actividad exonucleasa de la nucleoproteína se reduce en al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % en relación con la actividad exonucleasa de una nucleoproteína de referencia en un ensayo de exonucleasain vitro.En algunas realizaciones, se anula la actividad exonucleasa. En algunas realizaciones, la nucleoproteína de referencia es una nucleoproteína natural de un arenavirus como, por ejemplo, la nucleoproteína de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685). Las técnicas para medir dicha actividad exonucleasa son conocidas en la técnica. Tales técnicas se explican ampliamente en la bibliografía. Es preciso ver, por ejemplo, el documento de Qi, X. y otros,Cap binding and immune evasión revealed by Lassa nucleoprotein structure.Nature 468, 779-83 (2010). Es preciso ver también, por ejemplo, el documento de Hastie K.M. y otros,Structure of the Lassa virus nucleoprotein reveals a dsRNA-specific 3' to 5' exonuclease activity essential for immune suppression.Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2396-401 (2011).

B. Sistema de genética inversa para MOPV

Los ejemplos describen un sistema genético inverso que puede ser utilizado para producir MOPV recombinante atenuado. Las personas con experiencia en la técnica apreciarán que, según las enseñanzas de esta descripción, pueden proveerse y utilizarse realizaciones alternativas de sistemas para poner en práctica las realizaciones de esta invención y para producir el MOPV recombinante atenuado y las composiciones descritas.

Los sistemas comprenden normalmente una célula eucariota recombinante que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento L de un MOPV. En algunas realizaciones, se utiliza la secuencia codificante del segmento L de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 y 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento L de un MOPV es una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a nivel nucleotídico a la secuencia codificante del transcrito antigenómico del segmento L de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento L de un MOPV es una secuencia que codifica proteínas Z y L(pol) que son, cada una, de manera independiente al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idénticas a nivel de aminoácidos a las proteínas Z y L(pol) de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2).

La célula eucariota recombinante normalmente comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un MOPV. En algunos aspectos, se utiliza la secuencia codificante del segmento S de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 y 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un MOPV es una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100%idéntica a nivel nucleotídico a la secuencia codificante del transcrito antigenómico del segmento S de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un MOPV es una secuencia que codifica proteínas precursoras de NP y GPC que son, cada una, de manera independiente al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idénticas a nivel de aminoácidos a las proteínas precursoras de GPC y NP (ID SEC n.° 3 & 4, respectivamente) de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2).

En algunos aspectos, la segunda secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia codificante para un transcrito antigenómico de segmento S quimérico de un arenavirus. La segunda secuencia de ácido nucleico puede ser una secuencia codificante del segmento S quimérico que comprende una secuencia codificante para un transcrito antigenómico para una nucleoproteína atenuada de MOPV como se describe en la presente memoria, y una secuencia codificante para un transcrito antigenómico para precursor de glicoproteína (GPC) de un arenavirus que no es MOPV. En algunas realizaciones, el arenavirus que no es MOPV es<l>A<s>V. El LASV puede ser la cepa Josiah (número de acceso J04324).

En algunas realizaciones, se utiliza la secuencia codificante de la nucleoproteína del segmento S de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante de la nucleoproteína del segmento S es una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a nivel nucleotídico a la secuencia codificante de la nucleoproteína de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante de la nucleoproteína del segmento S es una secuencia que codifica una nucleoproteína que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a nivel de aminoácidos a la nucleoproteína de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2).

En la invención, la nucleoproteína codificada difiere de una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (de tipo salvaje) que es ID SEC n.°: 4 por las sustituciones de aminoácidos D390A y G393A. En algunos aspectos, la nucleoproteína codificada difiere además de una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (tipo salvaje) en una, dos, tres, cuatro o cinco posiciones seleccionadas entre E392, H430, D467, H529 y D534. En la invención y en las reivindicaciones, la secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia es la secuencia de nucleoproteína de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685) (ID SEC n.° 4). En algunas realizaciones, según se reivindica, la nucleoproteína codificada difiere de una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (tipo salvaje) por comprender además una, dos, tres, cuatro o cinco de las sustituciones de aminoácidos E392A, H430A, D467A y D534A.

La primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico pueden ser cualquier vector adecuado, incluido un plásmido. Los vectores pueden ser los mismos salvo que comprenden secuencias de codificación diferentes para el segmento L y el segmento S, o pueden ser diferentes. La primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico normalmente comprenden además secuencias reguladoras de la transcripción suficientes para impulsar la expresión de las secuencias codificantes para los segmentos L y S en una célula huésped de interés. En algunas realizaciones, la célula huésped de interés es la célula BHKT7/9. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico están presentes en plásmidos que comprenden secuencias necesarias para impulsar la expresión por la ARN polimerasa l de ratón.

Los sistemas pueden comprender además una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína L(pol) de MOPV. En algunas realizaciones, los sistemas pueden comprender además una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleoproteína de MOPV. En algunas realizaciones, los sistemas pueden comprender además una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína L(pol) de MOPV y una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleoproteína de MOPV. La tercera y/o cuarta secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en cualquier vector adecuado como, por ejemplo, un plásmido. El vector comprenderá normalmente secuencias necesarias para impulsar la expresión de la tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína L(pol) de MOPV y/o la cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleoproteína de MOPV. Las secuencias adecuadas necesarias para impulsar la expresión incluyen un promotor T7.

El sistema de genética inversa es útil, por ejemplo, para ensamblar MOPV recombinantes. Normalmente, el MOPV recombinante comprende la NP codificada por el transcrito antigenómico del segmento S presente en el MOPV recombinante, sin embargo, el MOPV recombinante puede producirse de tal manera que la secuencia de NP codificada por el transcrito antigenómico del segmento S presente en el MOPV recombinante sea diferente al menos de parte de la proteína NP presente en el MOPV recombinante. Normalmente, el MOPV recombinante comprende GP, preferiblemente GPC codificados por el transcrito antigenómico del segmento S presente en el MOPV recombinante, sin embargo, en ciertas realizaciones el MOPV recombinante puede producirse de tal manera que la secuencia precursora del GP codificada por el transcrito antigenómico del segmento S presente en el MOPV recombinante sea diferente al menos de algunos de los GPC presentes en el MOPV recombinante.

C. Atenuación del MOPV

La NP de LASV contiene una exonucleasa que evade la respuesta de IFN del huésped al digerir el ARN de doble cadena (ARNds). Los ARNds no están normalmente presentes en células de mamíferos, y como tal, cuando aparecen durante la replicación viral, son reconocidos como PAMP (patrón molecular asociado a patógenos). La digestión de estos intermediarios replicativos permite que el virus escape del sistema de defensa innato. El alineamiento de la NP de MOPV con la NP de LASV mostró que los aminoácidos críticos para esta función se conservaron entre LASV y MOPV, lo cual sugiere que la actividad de exonucleasa (y el posterior escape a la respuesta de IFN) también estaba presente en el virus MOPV. Los inventores confirmaron que la NP de MOPV es capaz de digerir ARNds utilizando un enfoquein vitro.Este resultado es sorprendente porque el MOPV no es patógeno mientras que el LASV lo es.

Se introdujeron mutaciones en la nucleoproteína de MOPV y la nucleoproteína modificada se utilizó para generar un MOPV recombinante atenuado.

De manera ventajosa, el MOPV recombinante atenuado de la solicitud es todavía un virus vivo.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "MOPV recombinante" designa un virus obtenido por genética inversa, es decir, uno que ha sido manipuladoin vitro,p. ej., utilizando técnicas de ADN recombinante para introducir cambios en el genoma viral. En el sentido de la presente solicitud, un MOPV recombinante de tipo salvaje (también denominado “rec-MOPV”) es un virus Mopeia obtenido por genética inversa y que comprende una codificación de secuencia nucleica para la nucleoproteína de referencia (tipo salvaje). En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante es un virus Mopeia en el que se ha introducido al menos una mutación en la nucleoproteína de MOPV y esto resulta en la pérdida parcial o total de la actividad exonucleasa de dicha nucleoproteína.

Una "mutación", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un cambio en la secuencia de ácido nucleico o polipéptido en relación con una secuencia de referencia (que es preferiblemente una secuencia natural normal o de “tipo salvaje”, o de “referencia”), e incluye translocaciones, deleciones, inserciones, y sustituciones/mutaciones puntuales.

Una mutación por "sustitución", como se utiliza con respecto a los aminoácidos, se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por cualquier otro residuo de aminoácido, excepto el residuo de aminoácido sustituido. De manera ventajosa, se utilizan pequeños residuos de aminoácidos para la sustitución con el fin de limitar cualquier efecto sobre la estructura general de la proteína. Por ejemplo, los residuos de alanina se utilizan para sustituir los residuos de aminoácidos cargados y polares y los residuos de serina se utilizan para sustituir los aminoácidos apolares. En algunas realizaciones, dicho "cualquier residuo de aminoácido" es un residuo de alanina. En algunas realizaciones, puede haber al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 sustituciones. El término "conjunto de sustitución de aminoácidos" o "conjunto de sustitución" se refiere a un grupo de sustituciones de aminoácidos. Un conjunto de sustitución puede tener 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más sustituciones de aminoácidos.

Atenuación se entiende en la presente memoria según su significado ordinario en este campo. Más concretamente, el término "atenuado" (en referencia a la expresión "MOPV recombinante atenuado”) se refiere a un virus Mopeia recombinante (ARN) o a un clon (ARN, ADN o ADNc), que comprende una glicoproteína (GP) heteróloga, más particularmente un precursor (GPC), de un arenavirus patógeno (es decir, de un arenavirus no MOPV), y que tiene un fenotipo de patógeno reducido en comparación con el arenavirus patógeno de tipo salvaje (es decir, en comparación con el arenavirus infeccioso y/o virulento), más particularmente en comparación con un virus de tipo salvaje del mismo género, especie, tipo o subtipo (es decir, comparado con un virus infeccioso y/o virulento del mismo género, especie, tipo o subtipo).

Un fenotipo de patógeno reducido abarca una capacidad de infección reducida y/o una capacidad de replicación reducida, y/o un tropismo tisular reducido y/o restringido, y/o un defecto o imperfección en el ensamblaje de las partículas virales, más particularmente, una capacidad de infección reducida.

Un fenotipo de patógeno reducido, más particularmente una capacidad de infección reducida, abarca una infección (viral) que se ve impedida, obstruida o retrasada, especialmente cuando los síntomas que acompañan o siguen a la infección se atenúan, retrasan o alivian o cuando el virus infectante es eliminado del huésped.

Por lo tanto, la solicitud provee un MOPV recombinante atenuado o un clon del mismo que es capaz de replicarse en una medida que es suficiente para inducir una respuesta inmunitaria pero que no es suficiente para inducir una enfermedad.

Específicamente, los datos en los ejemplos demuestran que la sustitución de las posiciones de aminoácidos D390 y G393 de la nucleoproteína de MOPv atenúa la función de la nucleoproteína y que los MOPV recombinantes que comprenden la nucleoproteína con actividad de exonucleasa atenuada también están atenuados. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son D390A y G393A y el MOPV recombinante atenuado se denomina MOPV-ExoN. En la invención, las sustituciones de aminoácidos son al menos D390A y G393A. En algunas realizaciones, el MOPV recombinante atenuado se replica de manera más débil en células Vero y presenta un título continuamente más bajo a lo largo del tiempo en comparación con el MOPV no atenuado. En algunas realizaciones, la replicación del MOPV recombinante atenuado en DC y/o MP se reduce en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 % o más, en comparación con la replicación del MOPV de tipo salvaje recombinante (rec-MOPV) o del MOPV de tipo salvaje (nat-MOPV) en el mismo tipo de célula. Las técnicas para evaluar las propiedades replicativas de un virus son conocidas por la persona con experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Es preciso ver, por ejemplo, el documento de Baize, S. y otros,Lassa virus infection of human dendritic cells and macrophages is productive but fails to actívate cells.J lmmunol. 172(5): 2861-9 (2004). Es preciso ver también, por ejemplo, el documento de Pannetier, D. y otros,Human macrophages, but not dendritic cells, are activated and produce alpha/beta interferons in response to Mopeia virus infection.J Virol. 78(19):10516-24 (2004).

Los ejemplos también demuestran la activación de DC y MP por un prototipo de MOPV recombinante atenuado. Específicamente, los ejemplos demuestran que tanto el MOPV recombinante como el natural exhiben un perfil de fuerte activación en MP, ilustrado por la inducción de CD86, CD80 y, en menor medida, de CD40, pero no inducen DC. Sin embargo, tanto en MP como en DC infectados con MOPV-ExoN, se observó un fuerte nivel de expresión de CD80, CD83 y CD40, indicando que las células fueron activadas por MOPV-ExoN y probablemente propensas a presentar antígenos a los linfocitos. El nivel de CD86 también estaba fuertemente elevado en DC infectadas con MOPV-ExoN, en comparación con las células MOCK-infectadas o infectadas con nat-/rec-MOPV. Este marcador es importante para la coestimulación y maduración de los linfocitos T, indicando entonces que el cebado de los linfocitos debe ser eficiente en respuesta a la infección por MOPV- ExoN. En conjunto, estos resultados obtenidos con un prototipo de MOPV recombinante atenuado demuestran la utilidad de los MOPV recombinantes atenuados de la invención. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el MOPV recombinante atenuado de la invención induce una respuesta inmunitaria en DC. En algunas realizaciones, el MOPV recombinante atenuado de la invención induce una respuesta inmune en MP. En algunas realizaciones, el MOPV recombinante atenuado de la invención induce una respuesta inmunitaria caracterizada por un aumento en la expresión de al menos una molécula seleccionada entre CD80, CD83, CD40 y CD86.

Los ejemplos también demuestran que tanto MP como DC controlaron la replicación de MOPV-ExoN, y que la infección por MOPV-ExoN indujo la apoptosis de MP infectados, como se refleja por un fuerte aumento en el nivel de caspasa 3 en MP infectados con MOPV-ExoN. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se controla la replicación del MOPV recombinante atenuado de la invención en DC y/o MP. En algunas realizaciones, la infección de MP por el MOPV recombinante atenuado de la invención induce la expresión de caspasa 3. En algunas realizaciones, la infección de MP por el MOPV recombinante atenuado de la invención induce la muerte celular de MP.

Los ejemplos también demuestran la inducción de una respuesta inmunitaria innata en DC y MP infectados con un MOPV recombinante atenuado de la invención. Específicamente, los ejemplos muestran que las expresiones de ARNm en células infectadas por rec-MOPV y nat-MOPV son bastante similares, pero que la respuesta innata es más fuerte cuando las DC se infectan con MOPV-ExoN, en comparación con la infección por MOP<v>(rec- o nat-). Este resultado se observó también en MP, dado que los niveles de IFN tipo 1, TNFalfa y CXCL10 fueron más altos en respuesta a MOPV-ExoN que a MOPV de tipo salvaje. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la administración de un MOPV recombinante atenuado de la invención induce una respuesta inmunitaria innata en DC y/o MP. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria innata comprende la expresión de al menos uno de IFN tipo 1, TNFalfa y CXCL10.

Los ejemplos demuestran que la introducción de las sustituciones de aminoácidos D390A y G393A en la nucleoproteína de MOPV produce un MOPV recombinante atenuado que es poco replicativo en células inmunitarias, activa fuertemente al menos uno de entre células dendríticas (DC) y macrófagos (MP), y/o es más inmunogénico que el MOPV no modificado. Al agregar al menos una sustitución adicional de aminoácido en una posición seleccionada entre E392, H430, D467, H529, y D534, puede proveerse un MOPV recombinante atenuado con función ExoN atenuada sin reducción en las propiedades replicativas. Según una realización particular de la invención, la sustitución adicional se selecciona entre E392A, H430A, D467A y D534A.

En la invención, el MOPV recombinante atenuado comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una glicoproteína de arenavirus no MOPV y un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína con actividad exonucleasa atenuada. Los MOPV recombinantes atenuados son útiles, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunogénica

contra un arenavirus en un sujeto.

En el MOPV recombinante atenuado de la invención, la nucleoproteína comprende las sustituciones de aminoácidos

D390A y G393A. En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, la nucleoproteína comprende además

al menos una sustitución de aminoácido seleccionada entre E392A, H430A, d467A y D534A. El MOPV recombinante atenuado que comprende las sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos D390A, G393A, E392A, H430A, D467A, H529A y D534A se denomina MOP-ExoN mejorado.

En el MOPV recombinante atenuado de la invención, el ácido nucleico heterólogo codifica una glicoproteína de arenavirus no MOPV, más preferiblemente un precursor de glicoproteína de arenavirus no MOPV. En algunas realizaciones del MOPV recombinante atenuado, el arenavirus no MOPV es un virusLassa(LASV).

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias, activa fuertemente al menos uno de entre células dendríticas (DC) y macrófagos (MP), y/o es más inmunogénico

que el MOPV no modificado. En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias. En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado activa fuertemente al menos uno de entre células dendríticas (DC) y macrófagos (MP). En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es más inmunogénico que el MOPV no modificado.

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias

y activa fuertemente al menos uno de entre células dendríticas (DC) y macrófagos (MP).

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado activa fuertemente al menos uno de entre

células dendríticas (DC) y macrófagos (MP), y es más inmunogénico que el MOPV no modificado.

En algunos aspectos de la descripción, el MOPV recombinante atenuado es poco replicativo en células inmunitarias

y es más inmunogénico que el MOPV no modificado.

En algunos aspectos, el MOPV recombinante atenuado comprende una secuencia de codificación para un transcrito antigenómico del segmento L de un MOPV. En algunos aspectos, la secuencia de codificación para un transcrito antigenómico del segmento L de un MOPV es una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a nivel nucleotídico a la secuencia codificante del transcrito antigenómico del segmento L de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC

n.° 1 & 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento L de un

MOPV es una secuencia que codifica proteínas Z y L(pol) que son, cada una, de manera independiente al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idénticas a nivel de aminoácido a las proteínas Z y L(pol) de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2).

En algunos aspectos, cualquier proteína Z y L(pol) presente en el MOPV recombinante atenuado es una proteína codificada por la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento L de un MOPV que está presente en el MOPV recombinante atenuado.

En algunos aspectos, el MOPV recombinante atenuado comprende una secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un MOPV. En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un MOPV es una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos

90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a nivel de nucléotido a la secuencia codificante del transcrito antigenómico del segmento S de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC

n.° 1 & 2). En algunos aspectos, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un

MOPV es una secuencia que codifica proteínas precursoras de NP y GP que son, cada una, de manera independiente al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idénticas a

nivel de aminoácido a las proteínas precursoras de NP y GP de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2). En algunos aspectos, cualquier proteína NP y GP presente en el MOPV recombinante atenuado es una proteína codificada por la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de un MOPV que está presente en el MOPV recombinante atenuado.

En algunos aspectos de la descripción, la secuencia codificante para un transcrito antigenómico del segmento S de

un MOPV presente en un MOPV recombinante atenuado de la invención codifica una nucleoproteína que difiere de

una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (tipo salvaje) en las posiciones D390 y G393. En algunos aspectos descriptos, la nucleoproteína codificada difiere además de una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (tipo salvaje) en uno, dos, tres, cuatro, o cinco posiciones seleccionadas entre E392, H430, D467, H529 y D534. En algunos aspectos descriptos, la secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia proviene de una cepa MOPV. En algunos aspectos descriptos, la secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia es la secuencia de nucleoproteína de la cepa AN21366 del MOPV (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2). En la invención, la nucleoproteína codificada difiere de una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (tipo salvaje) que es ID SEC n.°: 4 en las sustituciones de aminoácidos D390A y G393A. En algunas realizaciones de la invención, la nucleoproteína codificada difiere de una secuencia de nucleoproteína de arenavirus de referencia (tipo salvaje) que es ID SEC n.°: 4 por comprender además una, dos, tres, cuatro, o cinco de las sustituciones de aminoácidos E392A, H430A, D467A y D534A.

El MOPV recombinante atenuado comprende también un ácido nucleico heterólogo. En algunas realizaciones, este se inserta en la secuencia codificante del precursor de GP. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se inserta sin eliminar bases presentes en el genoma inicial del MOPV, mientras que en otras realizaciones se eliminan bases presentes en el genoma inicial del MOPV en el sitio de inserción. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo insertado tiene el mismo tamaño que una región correspondiente que se elimina en el sitio de inserción.

En algunas realizaciones, el MOPV recombinante atenuado comprende un segmento S genómico recombinante que codifica una glicoproteína de arenavirus no MOPV. Los ejemplos demuestran la incorporación de una glicoproteína de LASV a un MOPV recombinante atenuado. En tal realización, el MOPV recombinante atenuado puede ser utilizado para inducir una respuesta inmunitaria contra la glicoproteína de LASV, más preferiblemente contra el precursor de la glicoproteína de LASV, lo cual puede ser protector o terapéutico contra la infección por LASV en un huésped. Por consiguiente, en la realización ejemplificada, LASV es el arenavirus objetivo. En otras realizaciones, el arenavirus objetivo es cualquier arenavirus no MOPV. En algunas realizaciones, el arenavirus objetivo se selecciona entre virus Gairo, virus Gbagroube, virus lppy, virus Kodoko, virus Lassa, virus Lujo, virus Luna, virus Lunk, virus de coriomeningitis linfocítica, virus Merino Walk, virus Menekre, virus Mobala, virus Morogoro, virus Wenzhou, virus Tacaribe, virus Amapari, virus Chapare, virus Flexal, virus Guanarito, virus Junin, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Patawa, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabiá, virus Tacaribe, virus Tamiami, y virus Whitewater Arroyo.

Los ejemplos proveen fuerte evidencia de que la introducción de mutaciones que anulan la función exonucleasa de la NP del MOPv resulta en una fuerte atenuación del MOPV. Con el fin de mejorar la protección específica contra un arenavirus objetivo, los inventores diseñaron una vacuna candidata contra LASV, y producen un virus quimérico en el cual la GP de superficie, más preferiblemente el GPC de superficie, de MOPV se reemplaza por la GP, más preferiblemente el GPC de superficie, de LASV. Los ejemplos demuestran que el intercambio de la secuencia codificante de la GP, más preferiblemente del GPC de superficie, en el esqueleto del MOPV no afectó significativamente las propiedades replicativas del MOPV, de manera que el MOPV-GPC<lasv>se replica de manera similar a rec-MOPV. Sin embargo, la replicación de MOPV-ExoN-GPC<lasv>fue hasta cierto punto atenuada en comparación con rec-MOPV, como también se observó para MOPV-ExoN. Esto indica que la atenuación de la capacidad replicativa de MOPV-ExoN-GPC<lasv>se debe al defecto en la función exonucleasa de la NP y no al intercambio de genes gp entre LASV y MOPV. Por lo tanto, este resultado demuestra que la plataforma de MOPV recombinante atenuado provista en la presente memoria es útil para vacunación contra un arenavirus objetivo.

D. Composiciones

La solicitud también describe composiciones. El término “composición” abarca la composición farmacéutica, la composición antiviral, la composición inmunogénica y vacuna, más particularmente la composición antiviral, composición inmunogénica y vacuna. La composición de la solicitud comprende al menos un virus recombinante atenuado de la solicitud como, por ejemplo, al menos un virus vivo y atenuado de la solicitud.

La invención también incluye composiciones inmunogénicas que comprenden un MOPV recombinante atenuado como se describe en la presente memoria. Las composiciones inmunogénicas pueden ser formuladas según procedimientos estándar en la técnica. En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas se administran en combinación con un adyuvante. El adyuvante que se administra en combinación con una composición descripta en la presente memoria puede administrarse antes, concomitantemente con o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término “adyuvante” se refiere a un compuesto que, cuando se administra en conjunto con o como parte de una composición descripta en la presente memoria, aumenta, mejora y/o refuerza la respuesta inmunitaria a un MOPV recombinante atenuado presente en la composición inmunogénica, pero cuando el compuesto se administra solo, no genera una respuesta inmunitaria al MOPV recombinante atenuado. Los adyuvantes pueden mejorar una respuesta inmunitaria por diversos mecanismos que incluyen, p. ej., el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de células B y/o T, la estimulación de macrófagos, y la estimulación de células dendríticas. Cuando una vacuna o una composición inmunogénica de la invención comprende adyuvantes o se administra junto con uno o más adyuvantes, los adyuvantes que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de sales minerales o adyuvantes de gel de sales minerales, adyuvantes particulados, adyuvantes microparticulados, adyuvantes mucosos, y adyuvantes inmunoestimulantes. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (alum) (como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, y sulfato de aluminio), 3-monofosforil lípido A des-O-acilado (MPL) (es preciso ver el documento GB 222021 1), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (es preciso ver la Solicitud Internacional n.° PCT/US2007/064857, publicada como Publicación lnternacional n.° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (es preciso ver la Solicitud lnternacional n.° PCT/US2007/064858, publicada como Publicación lnternacional n.° Wo 2007/109813), y saponinas como, por ejemplo, QS21 (es preciso ver el documento de Kensil y otros, enVaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach(eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Pat. de EE. UU. n.° 5,057,540). En algunas realizaciones, el adyuvante es adyuvante de Freund (complete o incompleto). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (como, por ejemplo, escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios como, por ejemplo, el monofosforil lípido A (es preciso ver el documento de Stoute y otros, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)).

En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas comprenden el MOPV recombinante atenuado solo o, preferiblemente, junto con un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse suspensiones o dispersiones del MOPV recombinante atenuado, especialmente suspensiones o dispersiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, p. ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores, y se preparan de una manera conocidaper se,por ejemplo, mediante procesos convencionales de dispersión y suspensión. Las dispersiones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad. Las suspensiones o dispersiones pueden mantenerse a temperaturas de alrededor de 2-4 °C, o para un almacenamiento más prolongado pueden congelarse y luego descongelarse poco tiempo antes de su uso. Para su inyección, la vacuna o las preparaciones inmunogénicas pueden ser formuladas en soluciones acuosas como, por ejemplo, en amortiguadores fisiológicamente compatibles como, por ejemplo, la solución de Hanks, la solución de Ringer, o un amortiguador salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación como, por ejemplo, agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes.

En ciertas realizaciones, las composiciones descriptas en la presente memoria comprenden además un conservante, p. ej., el timerosal derivado de mercurio. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descriptas en la presente memoria comprenden 0,001 % a 0,01 % de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descriptas en la presente memoria no comprenden un conservante.

Las composiciones inmunogénicas pueden comprender desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 1012 unidades formadoras de foco del MOPV recombinante atenuado. Las formas de dosis unitaria para administración parenteral son, por ejemplo, ampollas o viales, p. ej., viales que contienen desde aproximadamente 102 hasta 1012 unidades formadoras de foco o de 104 a 1014 partículas físicas de MOPV recombinante atenuado.

En algunas realizaciones, se administra una composición inmunogénica provista en la presente memoria a un sujeto por las vías, incluidas, entre otras, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, percutánea, intranasal e inhalatoria, y por medio de escarificación (raspado a través de las capas superiores de la piel, p. ej., utilizando una aguja bifurcada). En algunas realizaciones, se utiliza una vía subcutánea o intravenosa. Para la administración intranasal o por inhalación, la preparación para su uso según la presente invención se puede suministrar de manera conveniente en la forma de una presentación de spray aerosol en envases presurizados o un nebulizador, con el empleo de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede determinarse mediante la provisión de una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para su uso en un inhalador o insufladores que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada como, por ejemplo, lactosa o almidón.

Como apreciarán las personas con experiencia en la técnica, la dosificación del MOPV recombinante atenuado depende del tipo de vacunación y del sujeto, y de su edad, peso, condición individual, datos farmacocinéticos individuales, y modo de administración.

E. Uso de MOPV recombinante atenuado

Esta descripción también describe métodos de inducción de una respuesta inmunogénica en un sujeto. Los métodos comprenden la administración al sujeto de MOPV recombinante atenuado, normalmente en la forma de una composición inmunogénica.

En otro aspecto, la descripción también describe el MOPV recombinante atenuado en cuestión para su uso en la inducción de una respuesta inmunogénica en un sujeto. En un aspecto preferido, dicho MOPV recombinante atenuado en cuestión es en la forma de una composición inmunogénica.

El término “respuesta inmunogénica” se entiende según su significado ordinario en el campo, e incluye uno o varios entre producción de anticuerpos, inducción de inmunidad mediada por células, activación de complemento, desarrollo de tolerancia inmunológica, alteración en la producción de citocinas y alteración en la producción de quimiocinas, más particularmente producción de anticuerpos. La producción de anticuerpos abarca la producción de anticuerpos neutralizantes como, por ejemplo, la seroneutralización.

El sujeto es normalmente un mamífero como, por ejemplo, un humano, un primate o un primate no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un ratón, una rata o un conejo. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal doméstico como, por ejemplo, pero no limitado a, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un gato, un perro, un hámster, y un burro.

En algunos aspectos de la descripción, la respuesta inmunogénica comprende una respuesta a la porción de glicoproteína de un MOPV recombinante atenuado de la invención.

El MOPV recombinante atenuado en cuestión o la composición de la solicitud puede utilizarse en la prevención y/o tratamiento y/o paliación de una infección por arenavirus y/o de una enfermedad o trastorno inducido por un arenavirus. Por consiguiente, la invención también se refiere al MOPV recombinante atenuado en cuestión o a la composición para su uso en la prevención y/o tratamiento y/o paliación de una infección por arenavirus y/o de una enfermedad o trastorno inducido por un arenavirus. La invención también se refiere al uso del MOPV recombinante atenuado en cuestión o la composición para producir una vacuna para prevenir y/o tratar y/o paliar, una infección por arenavirus y/o una enfermedad o trastorno inducido por un arenavirus. En algunas realizaciones, el MOPV recombinante atenuado o la composición se utiliza para prevenir una infección por arenavirus y/o una enfermedad o trastorno inducido por un arenavirus. En algunas realizaciones, la respuesta inmunogénica es protectora. Una respuesta protectora es una respuesta que confiere inmunidad al sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se administra al sujeto un MOPV recombinante atenuado, el MOPV recombinante atenuado que comprende una glicoproteína de un arenavirus, preferiblemente un precursor de la misma, o una composición inmunogénica que comprende dicho MOPV recombinante atenuado y después de la administración el sujeto genera una respuesta inmunitaria a la glicoproteína del arenavirus. Si la respuesta inmunitaria confiere al sujeto una inmunidad contra el arenavirus del cual deriva la glicoproteína, entonces la respuesta inmunogénica en el sujeto es protectora. Como apreciará una persona con experiencia en la técnica, una respuesta inmunitaria protectora es una respuesta que reduce el riesgo de que un sujeto se infecte con un arenavirus y/o reduce la gravedad de una infección por un arenavirus. Por consiguiente, las respuestas inmunitarias protectoras incluyen respuestas de grados variables de protección.

Según otra realización, la invención también se refiere al MOPV recombinante atenuado en cuestión de la invención para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto. En una realización preferida, dicho MOPV recombinante atenuado en cuestión es en la forma de una composición inmunogénica de la invención.

En incluso otro aspecto de la descripción, se describe un uso del MOPV recombinante atenuado en cuestión de la invención para producir una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto. En una realización preferida, dicho MOPV recombinante atenuado en cuestión es en la forma de una composición inmunogénica de la invención.

En algunos aspectos, el sujeto está infectado con un arenavirus antes de la administración del MOPV recombinante atenuado de la invención o de una composición que comprende dicho MOPV recombinante atenuado, y la administración de dicho MOPV recombinante atenuado o de dicha composición es terapéutica. En tales aspectos, la administración de dicho MOPV recombinante atenuado o de dicha composición al sujeto infectado con el arenavirus puede tener el efecto de mejorar al menos un síntoma de la infección por arenavirus en el sujeto. En algunas realizaciones, la administración de dicho MOPV recombinante atenuado o de dicha composición al sujeto infectado con el arenavirus puede tener el efecto de reducir el riesgo de muerte del sujeto.

En algunos aspectos, administrar el MOPV recombinante atenuado o una composición del mismo reduce el riesgo de que un sujeto desarrolle una infección por un arenavirus objetivo en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o más, comparado con el riesgo de desarrollar una infección por el arenavirus objetivo en ausencia de administración del MOPV recombinante atenuado o una composición del mismo.

En algunos aspectos, el MOPV recombinante atenuado o una composición del mismo reduce los síntomas en el sujeto de una infección por un arenavirus objetivo en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente

20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o más, comparado con la manifestación de los síntomas de una infección por el arenavirus objetivo en ausencia de administración del MOPV recombinante atenuado o de una composición del mismo.

Otras características y ventajas de la invención aparecen en la continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras cuyas leyendas se representan a continuación.

Ejemplos

Materiales y métodos

Virus

El MOPV, cepa AN21366 (números de acceso JN561684 y JN561685: ID SEC n.° 1 & 2) y el LASV, cepa Josiah (número de acceso J04324) fueron utilizados2021 y pasados no más de 4 veces en células VeroE6. Los sobrenadantes de cultivo celular fueron recolectados 4 días después de la infección y clarificados por centrifugación 5 min a 5000 rpm. Los virus fueron titulados y utilizados como stocks virales para experimentos posteriores. En adelante, este virus se denomina nat-MOPV para distinguirlo del MOPV recombinante de tipo salvaje obtenido por genética inversa (rec-MOPV).

Células

Células BHK T7/9 con expresión estable de la polimerasa T7 fueron utilizadas para rescatar virus recombinantes y fueron mantenidas como se describe en otra parte14. Se utilizaron células VeroE6, cultivadas en Medio de Eagle modificado Glutamax Dulbecco (DMEM - Life Technologies) suplementado con 5 % FCS y 0,5 % de penicilinaestreptomicina, para la amplificación y titulación de stocks virales.

Plásmidos

Se utilizó el plásmido pTM1 para impulsar la expresión de las proteínas LPol y NP bajo el promotor T7. Los plásmidos pTM1 que expresaban MOPV LPol (pTM1-LPol) y MOPV NP (pTMl-NP) se obtuvieron al clonar respectivamente ORF de LPol y NP entre los sitios Ncol y Xhol del plásmido. Para obtener una transcripción completa de ambos segmentos virales, las secuencias L y S en orientación antigenómica del MOPV fueron transcriptas de manera inversa a partir de extractos de ARN viral y el ADNc finalmente clonado en un plásmido que impulsa la correcta transcripción bajo el control de la ARN polimerasa I de ratón. Para lograr tanto una transcripción como una replicación correcta de los segmentos virales, se incluyó una base G extra no codificada al inicio de las secuencias clonadas1422. Todos los plásmidos fueron secuenciados y corregidos mediante mutagénesis dirigida al sitio para coincidir con la secuencia de consenso de la cepa AN21366 del MOPV, excepto por mutaciones introducidas intencionadamente para distinguir entre rec- y nat-MOPV.

El intercambio de ORF GPC en el plásmido pPOLI-MOPV Sag fue generado mediante la introducción de los sitios de restricción BsmBI en sentido descendente y ascendente de los codones Start y Stop de ORF GPC MOPV respectivamente. El ORF GPC de Lassa (Josiah, ID SEC n.° 16), Lujo (NC_012776; iD SEC n.° 17), Machupo (Carvallo, KM198592.1; ID SEC n.° 18), Guanarito (INH95551, AF485258.1; ID SEC n.° 19), Chapare (NC_010562.1; ID SEC n.° 20) o Sabia (NC_006317.1; ID SEC n.° 21) fue luego insertado en el plásmido modificado eliminado del ORF GPC MOPV antes descrito. Para generar un minigenoma basado en pPOLI MOPV Sag, se utilizó una estrategia similar para generar un pPOLI MOPV Sag FF Luc, donde el ORF NP se reemplaza por el ORF Luciferasa de luciérnaga.

Mutagénesis dirigida al sitio

Todas las mutaciones fueron introducidas utilizando la estrategia de mutagénesis dirigida al sitio según las instrucciones del fabricante (Agilent). Los plásmidos fueron luego secuenciados para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas.

Titulación viral

Los sobrenadantes de las células infectadas fueron recolectados y clarificados por centrifugación a 5000 rpm durante 5 min. Se agregaron diluciones seriadas de diez veces de sobrenadantes virales a células VeroE6 subconfluentes. Una hora después de la incubación, las células se cubrieron con una mezcla 1:1 de SVF-DMEM al 5 % y carboximetilcelulosa (CMC), y se incubaron durante 7 días. Luego, las células se fijaron con paraformaldehído (PFA, SIGMA Aldrich, Francia), se permeabilizaron con tritón, y se reveló la presencia del virus con una mezcla de anticuerpos de ratón contra la GP (o el GPC) y las proteínas Np . Los resultados se expresaron en FFU/ml (Unidad Formadora de Foco/ml).

Experimentos de rescate

Se sembraron 4 x 106 células BHK-T7/9 en frascos de 75 cm2. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con pPOLI MOPV SAg y pPOLI MOPV Lag utilizando reactivo Fugene 6 (Promega, Francia). La transfección se llevó a cabo durante 6 horas a 37 °C. Luego, las células se lavaron y se dejaron durante 5 días en DMEM al 2,5 % de SVF. Los sobrenadantes de células BHK-T7/9 constituyen el stock de siembra. A continuación, se amplificó el virus del stock de siembra en células VeroE6. El primer paso del stock de siembra en VeroE6 constituye el stock viral “paso 1”. Después de la titulación, el virus “paso 1” se utilizó para infectar células VeroE6 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001 o 0,01. La infección se llevó a cabo durante 3 o 4 días, antes de la recolección del sobrenadante. Este segundo paso titulado en células VeroE6 provee los stocks virales utilizados para todos los otros experimentos. En todos los stocks virales, la ausencia de contaminación por micoplasma se determinó usando el kit de detección Mycoplasma (Lonza, Suiza). Se extrajeron los ARN virales de los stocks utilizando QiAmp (QIAGEN) y se amplificaron mediante RT-PCR de un paso (Titan, Roche Applied Biosciences). Los productos de PCR se secuenciaron mediante secuenciación Sanger (GATC, Konstanz, Alemania).

Generación de células dendríticas y macrófagos derivados de monocitos

Las muestras de sangre se obtuvieron del Etablissement Frangais du Sang (EFS). Las células mononucleares se purificaron mediante centrifugación de gradiente de densidad Ficoll (GE Healthcare). Se recogió plasma autólogo y se descomplementó durante 30 min a 56 °C. Los monocitos se separaron de los leucocitos de sangre periférica mediante centrifugación en un colchón de Percoll 50 % (GE Healthcare) en PBS. Los PBL restantes se retiraron de la fracción de monocitos con dynabeads anti-CD3, anti-CD19 y anti-CD56 (Life Technologies) o con el Kit de Aislamiento de Monocitos II, humano (Miltenyi Biotec). Los macrófagos (MP) se obtuvieron mediante incubación de monocitos durante 4 a 6 días en RPMI, 10 % SVF, 10 % plasma autólogo suplementado con 100ng/ml de M-CSF (Factor Estimulante de Colonias de Macrófagos, Miltenyi Biotec). Las células dendríticas (DC) se diferenciaron durante 6 días en RPMI 10 % SVF suplementado con 1.000 U/mL de GM-CSF (Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos Macrófagos) y 500 U/mL de IL-4 (ambos de Peprotech). En ambos tipos de células (DC y MP), se agregaron citoquinas cada 2 días y se reemplazó un tercio del medio de cultivo.

Citometría de flujo

Las moléculas de superficie se tiñeron utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con colorante fluorescente contra CD83, CD80, CD86, CD40 (BD Biosciences) durante 30 min a 4 °C. La tinción intracelular de Caspasa 3 se llevó a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Caspasa 3 conjugado con ficoeritrina (BD Biosciences) durante 20 min, después de la permeabilización Cytofix/Cytoperm (Beckton Dickinson). Finalmente, las células se lavaron y se resuspendieron en PBS 1 % PFA, antes del análisis mediante Citometría de Flujo usando un citómetro Gallios (Beckman Coulter). Los datos se analizaron utilizando software Kaluza (Beckman Coulter).

RT, síntesis de ADNc y qPCR

El ARN se aisló de células infectadas utilizando Mini Kit RNeasy (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. Luego se llevó a cabo la transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) de los ARN totales, utilizando cebadores oligo dT y kit de transcriptasa inversa Superscript III según las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Para la amplificación y clonación del ADNc, se utilizaron la polimerasa de ADN KOD (EMD Millipore) y cebadores específicos de genes.

Para experimentos RT-qPCR, los ADNc se amplificaron utilizando el kit de mezcla maestra de expresión génica y una mezcla cebador/sonda desarrollada y optimizada para cada gen (Applied Biosystems Thermo Scientific), excepto por los IFN tipo 1 desarrollados internamente23. Los ensayos qPCR se realizaron en LightCycler 480 (Roche Applied Biosciences). Para todos los genes, la expresión se estandarizó respecto al gen GAPDH, y se expresó como inducción de pliegue en comparación con GAPDH.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando software SigmaPlot (Systat Software lnc, California) o GraphPad Prism 6. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la pruebapost hocHolm-Sidak.

Ejemplo 1: configuración de un sistema de genética inversa para MOPV

El sistema de genética inversa para MOPV aquí desarrollado fue similar al utilizado previamente para LASV14 Los segmentos cortos y largos de MOPV en sentido antigenómico se clonaron en un plásmido que impulsa la transcripción a través de la ARN polimerasa I de ratón. Estos plásmidos se transfectaron, junto con pTM1-NP y pTM1-LPol, en células BHKT7/9. La expresión de segmentos de longitud genómica y de las proteínas virales Lpol y NP permitió reconstituir las RNP (ribonucleoproteínas) de unidad de transcripción y replicación viral a partir de la cual ocurre la expresión de los cuatro genes virales, conduciendo finalmente al ensamblaje y la gemación de MOPV recombinante (rec-MOPV).

Ejemplo 2: anulación de la actividad exonucleasa en la NP de MOPV

El trabajo previo14-16 ha mostrado que la NP de LASV es capaz de eludir la respuesta de IFN gracias a su función exonucleasa, la cual es capaz de digerir ARN de doble cadena (ARNds). En efecto, los ARNds no están normalmente presentes en células de mamíferos y, como tal, cuando aparecen durante la replicación viral, son reconocidos como PAMP (patrón molecular asociado a patógenos). La digestión de estos intermediarios replicativos permite que el virus escape del sistema de defensa innata. Curiosamente, esta función exonucleasa es asumida por un dominio DEDDH. El alineamiento de la NP de MOPV con la NP de LASV mostró que los aminoácidos críticos para esta función se conservaron entre LASV y MOPV, lo cual sugiere que la actividad de exonucleasa (y el posterior escape a la respuesta de IFN) también estaba presente en el virus MOPV. Hemos confirmado que la NP de MOPV es capaz de digerir ARNds utilizando un enfoquein vitroy de bloquear la respuesta de IFN a ARNds en las células (datos no mostrados). Además, las mutaciones del dominio DDEDH (D390, E392, D530, D534 y H430) anulan la actividad antagonista de IFN de la NP de MOPV sin reducir su capacidad de soportar la transcripción/replicación viral. Por consiguiente, por analogía con LASV, hemos diseñado un virus MOPV-ExoN mediante la introducción de las mutaciones D390A y G393A para anular la función exonucleasa de MOPV en el virus vivo (Figura 1). Las mutaciones se introdujeron en el pPOLI-MOPV -Sag, y este plásmido modificado se utilizó como se describió previamente para generar un virus MOPV-ExoN. Ambos virus recombinantes se pasaron dos veces en células Vero E6, y se verificaron las secuencias virales. Las únicas mutaciones recuperadas fueron aquellas introducidas intencionadamente, ya sea para anular la función exonucleasa de MOPV, o para distinguir entre MOPV natural y recombinante (mutaciones silenciosas).

Tanto el rec-MOPV (virus de tipo salvaje obtenido mediante el sistema de genética inversa) como el MOPV-ExoN (rec-MOPV en el cual NP D390 y NP G393 se sustituyeron por Alanina) se caracterizaron por sus propiedades replicativas en células Vero E6, y se compararon con el virus nat-MOPV aislado naturalmente (Figura 2A). En ambos casos, los virus se replicaron de manera similar, alcanzando un pico replicativo a las 72 horas después de la infección, y disminuyendo después ligeramente. Nat-MOPV y rec-MOPV tienen un patrón de replicación similar. Por el contrario, MOPV-ExoN se replica más débilmente, como lo refleja su continuo título más bajo a lo largo del tiempo, aunque este virus alcanza también un pico a los 3 días después de la infección.

De manera similar, se midió la replicación de estos tres virus en DC (Figura 2B, panel de la izquierda) y MP (Figura 2B, panel de la derecha). Como se esperaba, el MOPV recombinante y el natural presentaron un comportamiento similar, con un pico a los 3 días después de la infección de DC, y en menor medida, a los 2 días después de la infección de MP. La replicación de MOPV-ExoN estuvo totalmente anulada en ambas células. Estos resultados indican que las células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) controlan fuertemente la replicación de nuestro prototipo de vacuna, excluyendo así la posibilidad de una replicación masiva y duradera de este agente después de la inoculación.

Ejemplo 3: caracterización de células dendríticas y macrófagos después de la infección por MOPV- ExoNCon el fin de evaluar el potencial vacunal del prototipo MOPV-ExoN, hemos analizado su capacidad de activar DC y MP. Con este fin, las DC y los MP derivados de monocitos fueron infectados con MOCK, o bien infectados con nat-MOPV, rec-MOPV o MOPV-ExoN, a una MOI de 1 durante 48 horas. El perfil de expresión de CD80, CD83, CD40 y CD86 fue bastante similar cuando las células fueron infectadas con virus rec-MOPV o nat-MOPV (Figuras 3A y B). En comparación con las células infectadas con MOCK, tanto rec-MOPV como nat-MOPV mostraron un perfil de fuerte activación en MP, ilustrado por la inducción de CD86, CD80 y, en menor medida, de CD40. Esta activación no se observó en DC. Sin embargo, tanto en MP como en DC infectados con MOPV-ExoN, se observó un fuerte nivel de expresión de CD80, CD83 y CD40, indicando que las células fueron activadas por MOPV-ExoN, y probablemente propensas a presentar antígenos a los linfocitos. Curiosamente, el nivel de CD86 también aumentó fuertemente en las DC infectadas con MOPV-ExoN, en comparación con las células infectadas con MOCK o infectadas con nat-/rec-MOPV. Este marcador es importante para la coestimulación y maduración de los linfocitos T, indicando así que el cebado de los linfocitos debe ser eficiente en respuesta a la infección con MOPV-ExoN.

Una característica importante para un candidato a vacuna viva es la capacidad de las células de eliminar este agente. En nuestro caso, tanto los MP como las DC controlaron la replicación de MOPV-ExoN y, más aún, la infección por MOPV-ExoN indujo la apoptosis de los MP infectados, como lo refleja el fuerte aumento en el nivel de Caspasa 3 en los MP infectados con MOPV-ExoN. Esta es una característica importante, ya que se sabe que algunos arenavirus como, por ejemplo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), inducen infecciones persistentes en las células24.

También hemos buscado la inducción de una respuesta inmunitaria innata en DC y MP infectados con nat- o rec-MOPV o con MOPV-ExoN (Figura 4). Las expresiones de ARNm observadas en las células infectadas con recMOPV y en las infectadas con nat-MOPV fueron bastante similares. Curiosamente, la respuesta innata fue más fuerte cuando las DC fueron infectadas con MOPV-ExoN, en comparación con la infección con MOPV (rec- o nat-). Aunque fue más moderado, este resultado también se observó en MP, ya que los niveles de IFN tipo 1, TNFalfa y CXCL10 fueron más altos en respuesta a MOPV-ExoN que a MOPV de tipo salvaje.

En conjunto, estos resultados relativos a la activación de APC en respuesta al virus MOPV-ExoN arrojan luz sobre las propiedades de este virus atenuado para ser un valioso prototipo de vacuna: en efecto, este virus es capaz de inducir fuertemente la respuesta inmunitaria innata y probablemente la adaptativa, y, por otra parte, su replicación permanece bajo control en estas células. Más aún, la inducción de la apoptosis de los MP infectados con MOPV-ExoN es coherente con una ausencia de persistencia en las células infectadas.

Ejemplo 4: producción y caracterización preliminar de MOPV-ExoN-GP<lasv>

Se demostró previamente que Nat-MOPV es una vacuna eficaz contra LASV. Sin embargo, su seguridad es difícil de demostrar y se han descripto algunas lesiones menores después de la infección por MOPV en ratones y primates no humanos25. Aquí, proveemos evidencias fuertes de que la introducción de mutaciones que anulan la función exonucleasa de la NP de MOPV resulta en una fuerte atenuación de MOPV. Con el fin de mejorar la protección específica contra LASV, hemos pensado en diseñar nuestro candidato a vacuna, y en producir un virus quimérico en el cual la GP de superficie de MOPV se ha reemplazado por la de LASV. Para hacer esto, hemos manipulado el plásmido pPOLI_Sag_MOPV para reemplazar el ORFgpMOPV por el ORFgpLASV, en pPOLI_Sag_MOPV y pPOLI_Sag_MOPV_ExoN, ambos de tipo salvaje. MOPV-GP<lasv>y MOPV-ExoN-GP<lasv>quiméricos fueron rescatados, titulados y amplificados.

Las propiedades replicativas de estos virus se analizaron mediante la infección de células VeroE6 a una MOI de 0,01 y la recolección de los sobrenadantes diariamente durante 4 días. Se determinaron los títulos virales para cada momento, y se los comparó con los obtenidos para rec-MOPV (Figura 5).

El intercambio del gen gp en el esqueleto de MOPV no afectó significativamente las propiedades replicativas de MOPV, ya que MOPV-GP<lasv>se replica de manera similar a rec-MOPV. Sin embargo, la replicación de MOPV-E<xo>N-GP<lasv>estuvo en cierta medida atenuada en comparación con rec-MOPV, como también se observó para MOPV-ExoN. Por consiguiente, la atenuación de la capacidad replicativa de MOPV-ExoN-GP<lasv>se debe más bien al defecto en la función exonucleasa de la NP que al intercambio de genes gp entre LASV y MOPV. En efecto, la actividad exonucleasa de la NP de los arenavirus puede tener un rol importante en la conservación de la integridad del genoma, y la desactivación de esta función puede implicar sustancialmente la capacidad replicativa de los arenavirus, incluso en células Vero E6, las cuales son deficientes para la respuesta de IFN tipo 1. Todos los virus que hemos generado en este estudio son capaces de replicarse y de producirse a buenos títulos infecciosos en células Vero E6, lo cual es un parámetro importante en las especificaciones requeridas de un prototipo de vacuna.

Ejemplo 5: el intercambio de GPC no afecta las propiedades inmunogénicas de los virus recombinantesCon el fin de evaluar si el intercambio del GPC de MOPV por el GPC de LASV puede afectar la respuesta inmunitaria de las células presentadoras de antígeno (APC), hemos generado virus MOPV y LASV recombinantes que expresan respectivamente el GPC de LASV o MOPV.

Como se muestra en la Figura 6A, estos virus presentaron una cinética de crecimiento similar en las células VeroE6, con el LASV-GPC<mopv>replicándose a títulos más bajos a las 24 horas después de la infección pero a títulos similares a todos los otros virus a las 48 horas después de la infección y hasta el final de la cinética de replicación. Luego hemos infectado macrófagos humanos primarios con estos virus a una MOI de 1 y hemos analizado sus respuestas de IFN tipo 1 a las 24 horas mediante RT-qPCR. Como se muestra en la Figura 6B, el intercambio de la proteína GPC no tuvo ningún efecto sobre la capacidad de los virus recombinantes de inducir la expresión de IFN tipo 1 en macrófagos. Además, MOPV-wt y MOPV- GPC<lasv>fueron ligeramente más inmunogénicos que LASV-wt y LASV-GPC<mopv>, confirmando los resultados previamente observados y sugiriendo que la atenuación de MOPV no depende de la proteína GPC.

Ejemplo 6: consolidación de la actividad ExoN KO

Para evitar cualquier posible reversión de dos mutaciones introducidas en el gen np para anular la actividad ExoN, hemos pensado en mutar más residuos en el sitio ExoN. Al menos 7 residuos han estado implicados en la función del dominio ExoN: D390, E392, G393, H430, D467, H529 y D534. Además de las dos mutaciones previamente descriptas, D390A y G393A (ExoN), hemos mutado proximalmente todos los residuos del dominio ExoN, generando así 6 mutantes adicionales (Figura 7A). Hemos comprobado primero el efecto de estas mutaciones en la actividad ExoN en un ensayo de gen reportero. En este ensayo, células transfectadas con un plásmido que codifica una luciferasa impulsada por promotor IRF-3 y un plásmido que codifica formas de tipo salvaje (wt, por sus siglas en inglés) o mutantes de la NP fueron infectadas con SeV, un fuerte inductor de las respuestas de IRF-3 e IFN. La Figura 7B demuestra que NP-wt puede bloquear la inducción de la expresión de luciferasa en respuesta a SeV. Por el contrario, todos los mutantes del dominio ExoN estuvieron afectados en su capacidad de reducir la inducción de la expresión del gen reportero.

Luego hemos introducido las mutaciones correspondientes en plásmidos de genética inversa con el fin de generar virus recombinantes que alberguen estas mutaciones. Todos los virus pudieron ser rescatados excepto por MOPV-ExoNM6a y ExoNM7. Para evitar la más mínima posibilidad de observar cualquier reversión de las mutaciones de NP, se eligió el MOPV-ExoNM6b, que contiene 6 mutaciones, como nuestra plataforma de vacuna. Hemos demostrado que la replicación de MOPV-ExoNM6b en células VeroE6 fue similar a la replicación de MOPV-ExoN (Figura 7C), confirmando que mutaciones adicionales en el dominio ExoN no tuvieron ningún efecto adicional sobre la capacidad de la NP de soportar la transcripción/replicación viral. Por el contrario, la replicación de MOPV-ExoNM6b se anuló en macrófagos inmunocompetentes en comparación con MOPV-wt, como se observa con MOPV-ExoN (Figura 7D). En macrófagos infectados, MOPV-ExoN y MOPV-ExoNM6b mutantes también indujeron ligeramente más IFN tipo 1 que MOPV-wt (Figura 7E). En conjunto, estos resultados apoyan la elección de MOPV-ExoNM6b como una plataforma de vacuna.

Ejemplo 7: caracterización y propiedades inmunogénicas de los candidatos a vacuna basada en MOPVDespués de elegir el MOPV-ExoNM6b como una plataforma de vacuna, hemos reemplazado la proteína GPC de MOPV por la proteína GPC de otros arenavirus patogénicos: virus Lassa y Lujo del Viejo Mundo; Machupo, Guanarito, Chapare y Sabia del Nuevo Mundo. Todos los virus recombinantes fueron rescatados y replicados en células VeroE6 (Figura 8A).

Como prueba de principio, hemos caracterizado la replicación y las propiedades inmunogénicas de dos candidatos a vacuna, a saber MOPV-ExoNM6b-GPC<LASV>y MOPV-ExoNM6b-GPC<MACV>, en macrófagos inmunocompetentes. Como se esperaba, mientras que MOPV-wt pudo replicarse en macrófagos, MOPV-ExoNM6b-GPC<LASV>y MOPV-ExoNM6b-GPC<MACV>no pudieron replicarse eficientemente en estas células como el MOPV-ExoNM6b parental (Figura 8B), sugiriendo un control por la respuesta inmunitaria. Hemos analizado la expresión de moléculas de activación en la superficie de macrófagos infectados utilizando citometría de flujo y hemos mostrado que todos los virus estaban induciendo una regulación al alza de CD40, CD80 y CD86 en comparación con macrófagos no infectados, con una inducción de CD40 y CD86 más alta para los virus ExoNM6b en comparación con MOP-wt (Figura 8C). Según estos resultados, todos los virus indujeron altos niveles de expresión de genes de IFN tipo 1 (Figura 8D).

Referencias

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un virus Mopeia (MOPV) recombinante atenuado que comprende un ácido nucleico heterólogo y un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína con actividad exonucleasa atenuada, en donde la nucleoproteína difiere de ID SEC n.° 4 por las sustituciones de aminoácidos D390A y G393A y el ácido nucleico heterólogo codifica una glicoproteína de arenavirus no MOPV o un precursor de glicoproteína de arenavirus no MOPV.

2. El MOPV recombinante atenuado según la reivindicación 1, en donde la nucleoproteína comprende además la sustitución de aminoácido E392A, o las sustituciones de aminoácidos E392A y H430A, o las sustituciones de aminoácidos E392A, H430A y D467A, o las sustituciones de aminoácidos E392A, H430A, D467A y D534A.

3. El MOPV recombinante atenuado según la reivindicación 2, en donde la nucleoproteína comprende además sustitución de aminoácidos en las posiciones E392A, H430A, D467A y D534A.

4. El MOPV recombinante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el arenavirus no MOPV es un virus Lassa (LASV).

5. El MOPV recombinante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la glicoproteína de arenavirus no MOPV se inserta en la secuencia codificante del precursor de glicoproteína de MOPV.

6. El MOPV recombinante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde la secuencia codificante del precursor de glicoproteína de LASV reemplaza a la secuencia codificante del precursor de glicoproteína de MOPV.

7. Una composición inmunogénica que comprende un MOPV recombinante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. El MOPV recombinante atenuado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición de la reivindicación 7 para su uso como una vacuna para prevenir y/o tratar una infección por arenavirus.

9. Una célula eucariota que comprende el MOPV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.