ES3023484T3 - Combined solution phase and solid phase dna amplification - Google Patents

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David Allan Davidson
Graham Worsley
Jarrett Killpack
Samuel Reed
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Dnae Diagnostics Ltd
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Abstract

Se describe un método para amplificar y detectar eficazmente ciertas secuencias de ácidos nucleicos de una población. La población seleccionada puede caracterizarse con mayor precisión, por ejemplo, mediante secuenciación. El método combina la amplificación en fase solución y fase sólida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Amplificación de ADN en fase de solución y en fase sólida combinadas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la amplificación específica de secuencia de subpoblaciones de fragmentos de ácido nucleico de una población más amplia de secuencias de ácido nucleico. La invención detecta limpiamente sólo las secuencias objetivo deseadas. Se describe un medio para la amplificación y la detección eficaz dirigida de una secuencia de ácido nucleico particular de una población.
Antecedentes de la invención
La identificación de patógenos en la sangre y otras muestras biológicas es importante para el tratamiento eficaz de numerosas enfermedades, incluida la septicemia. La septicemia mata a cinco personas cada hora en el Reino Unido y el 25 % de todos los supervivientes de septicemia sufren secuelas permanentes que les cambian la vida. La detección e identificación temprana de los agentes causantes de las infecciones bacterianas es esencial para prevenir la aparición de la septicemia y tratarla con éxito. Los métodos actuales de detección e identificación de infecciones transmitidas por la sangre incluyen hemocultivos y el uso de ensayos de susceptibilidad a antibióticos. Estos métodos implican el cultivo de células, lo que resulta costoso, tanto en tiempo como en dinero. A menudo, el choque séptico se produce antes de que se puedan obtener los resultados del cultivo celular.
El uso de los métodos de detección molecular actuales, tales como la PCR, que puede identificar el patógeno a partir de una muestra analizando el ácido nucleico del patógeno, está limitado por un bajo nivel de sensibilidad general. Esto es especialmente un problema cuando se analizan muestras humanas debido a las grandes cantidades de ácidos nucleicos no objetivo (humanos) presentes. Estos ácidos nucleicos no objetivo pueden inhibir la purificación y amplificación posteriores de ácidos nucleicos objetivo (patógenos), lo que lleva a resultados falsos negativos, o dar lecturas falsas positivas para ácidos nucleicos patógenos debido a una amplificación no específica.
Por ejemplo, existen varios genes de resistencia a los antibióticos que tienen múltiples variantes debido a mutaciones puntuales u otros polimorfismos, y donde la presencia de una mutación particular puede resultar en una estrategia terapéutica diferente en comparación con otra mutación. Por lo tanto, es importante que la identificación de estos polimorfismos se realice de manera oportuna y rentable. Las estrategias de identificación actuales que utilizan PCR y otras reacciones de amplificación tienen una capacidad limitada y los laboratorios pueden recurrir a la secuenciación para dilucidar la secuencia interna e identificar los polimorfismos, su implementación requiere mucho tiempo y es costosa.
Por lo tanto, la amplificación selectiva de una población de ácidos nucleicos objetivo con respecto a ácidos nucleicos no objetivo es de gran valor para la industria médica y para la investigación.
Las reacciones de amplificación generalmente se basan en un par de cebadores de amplificación para cada secuencia deseada a amplificar. Aunque se pueden combinar unos pocos pares de cebadores no inmovilizados, la combinación de un gran número de pares de cebadores generalmente no es factible debido a las hibridaciones cruzadas entre cebadores. Por lo tanto, la PCR múltiple generalmente se realiza utilizando cebadores separados en volúmenes de solución separados, lo que requiere una gran cantidad de muestra. Las invenciones actuales describen mejoras en las reacciones de amplificación que permiten la amplificación selectiva de secuencia de una pluralidad de cebadores diferentes dentro de un único volumen de muestra.
También se han divulgado métodos para PCR en emulsión, donde los moldes individuales se diluyen de manera que las burbujas de agua en una emulsión de aceite contengan en promedio menos de una molécula molde por burbuja de agua. Se pueden incluir perlas que tengan un único cebador inmovilizado, estando el segundo cebador en solución. Por lo tanto, la amplificación se realiza utilizando una mezcla de dos cebadores, uno de los cuales está inmovilizado y el otro está en solución. Sin embargo, esto sólo proporciona un único producto de amplificación por volumen de reacción, en contraste con los métodos descritos en el presente documento donde el primer producto de amplificación se amplifica aún más.
El documento WO2007/086935 divulga un aparato y un método para realizar una secuenciación rápida de ADN, tal como secuenciación genómica. El método incluye las etapas de preparar una muestra de ADN para la secuenciación genómica, amplificar el ADN preparado de manera representativa y realizar una reacción de secuenciación múltiple en el ADN amplificado con una sola etapa de hibridación del cebador.
También se conocen métodos de amplificación en los que ambos cebadores están inmovilizados, como por ejemplo la amplificación mediante puentes basada en grupos de Illumina. En tales casos no hay cebadores libres en solución. Junsen Kim et al. "Multiplex real-time PCT using temperature sensitive primer-supplying hydrogel particles and its application for malaria species identification" Incluye una breve descripción general de los métodos conocidos y describe la PCR en tiempo real como un estándar de oro para analizar los genes de diversas enfermedades.
Resumen
La presente invención proporciona una reacción de amplificación bifásica que comprende reacciones de amplificación tanto en fase sólida como en solución (termociclada o isotérmica) que pueden usar una combinación de cebadores inmovilizados y no inmovilizados y moldes de ADN objetivo para generar simultáneamente amplicones de ADN en solución y sobre una superficie. La presencia ausencia de amplicones se puede detectar en un ensayo de punto final después de la amplificación o en tiempo real. Este enfoque bifásico difiere del estado de la técnica, incluida la PCR en emulsión, porque incluye tanto amplificación sólida, es decir, amplificación basada en superficie, como amplificación en fase de solución.
Se puede amplificar una muestra de ácido nucleico usando uno o más cebadores no inmovilizados. Este ADN generado en fase de solución, así como el molde de ADN objetivo, también puede actuar, o actúa posteriormente, como molde para una reacción adicional en la fase sólida mediante la cual uno o más cebadores inmovilizados interactúan con el molde en fase de solución como parte de la reacción de amplificación del ADN. Al inmovilizar cebadores de diferente secuencia en ubicaciones conocidas y utilizar un sistema de detección capaz de discriminar la ubicación (por ejemplo, utilizando ISFET en chips CMOS IC o sistemas de imágenes ópticas/fluorescencia basados en matrices), la lectura proporciona al sistema poderes de discriminación adicionales.
En el presente documento, proponemos un método novedoso para lograr una amplificación específica de secuencia multiplexada de subpoblaciones de fragmentos de ácido nucleico de una población más amplia de secuencias de ácido nucleico.
Se describe un método que incluye un método para la amplificación y análisis de secuencias de ácidos nucleicos que comprende:
a. tomar un sistema que tiene un volumen de líquido en contacto con un soporte sólido donde el volumen de líquido contiene una muestra de ácido nucleico, dos o más cebadores de amplificación no inmovilizados y reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, y el soporte sólido tiene uno o más cebadores de amplificación inmovilizados;
b. realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico usando los cebadores de amplificación no inmovilizados para producir un primer producto de amplificación de ácido nucleico no inmovilizado;
c. amplificar adicionalmente el primer producto de amplificación de ácido nucleico no inmovilizado usando uno o más cebadores de amplificación inmovilizados para producir un segundo producto de amplificación de ácido nucleico inmovilizado;
d. cualquiera de
i. interrogar una señal localizada generada en la ubicación del segundo producto de amplificación de ácido nucleico inmovilizado en tiempo real o
ii. retirar el volumen de líquido y el primer producto de amplificación no inmovilizado y reemplazarlo con un nuevo volumen de líquido que tiene un cebador que se hibrida con el segundo producto de amplificación de ácido nucleico inmovilizado, y cualquiera de;
1. detectar directamente el cebador hibridado o
2. hacer fluir sobre el segundo producto de amplificación inmovilizado una solución que comprende al menos una especie de nucleótido para extender el cebador hibridado, y
e. detectar la presencia, ausencia o secuencia del segundo producto de amplificación de ácido nucleico.
El método se puede realizar donde los cebadores de amplificación no inmovilizados en el volumen de líquido se liberan de la fase sólida antes de la amplificación. La reacción de amplificación de ácidos nucleicos que utiliza cebadores no inmovilizados puede utilizar uno o más pares de cebadores no inmovilizados. La amplificación de ácidos nucleicos, en cualquier etapa, puede ser isotérmica o realizarse mediante termociclado.
De acuerdo con el método, el cebador hibridado con el segundo producto de amplificación de ácido nucleico se puede marcar de forma fluorescente y se puede lograr una medición posterior de la fluorescencia. Alternativamente, se puede realizar el método donde la detección de los productos amplificados utiliza la detección de los protones liberados a partir de la incorporación de nucleótidos mediante, por ejemplo, un sensor ISFET.
El método se puede realizar de tal manera que el primer y segundo productos de amplificación se obtengan usando cebadores de amplificación que tengan la misma secuencia de ácido nucleico.
El método puede implicar además que los cebadores de amplificación inmovilizados amplifiquen una sección interna del primer producto de amplificación de manera que el segundo producto de amplificación sea más corto que el primer producto de amplificación.
El método puede implicar además la exposición del mismo primer volumen de líquido a dos o más cebadores de amplificación inmovilizados donde cada cebador amplifica una secuencia diferente. Los dos o más cebadores de amplificación inmovilizados pueden diferir en una sola base, detectando así variantes de una sola base en el primer proceso de amplificación nucleica.
Los cebadores inmovilizados del método pueden estar en un microarreglo abierto o en pocillos separados. Los pocillos separados se pueden exponer simultáneamente al mismo volumen de reactivo. Si los pocillos contienen cebadores inmovilizados de diferente secuencia, entonces se pueden generar diferentes amplicones en diferentes pocillos, permitiendo así la amplificación multiplexada dentro de un único volumen de líquido.
Los productos de amplificación pueden detectarse óptica o eléctricamente. Para detectarlos ópticamente, los productos de amplificación deben marcarse con un marcador fluorescente y luego el marcador puede detectarse mediante un régimen óptico.
Ya sea que se detecte una salida óptica o eléctrica, la detección se puede realizar mediante una serie de sensores basados en silicio, como los transistores de efecto de campo (FET). Los FET elegidos pueden ser cualquier chip CMOS adecuado, incluidos, entre otros, los ISFET Los sensores están configurados para integrar señales detectadas temporal o espacialmente o ambas con el fin de identificar la presencia o ausencia, o en algunos casos la cantidad de producto de amplificación presente. A diferencia de algunas implementaciones de arreglos ópticos, no están configurados para generar imágenes de la salida.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Esquema que muestra la amplificación y detección de cebadores anclados localizados únicos (LAPAD)
Figura 2: Esquema que muestra la detección y amplificación de cebadores anclados localizados múltiples (LAPAD)
Figura 3: Esquema que muestra una implementación de escape. Tiene lugar en un sistema abierto que requiere capacidades de flujo en el chip. Durante la reacción de amplificación, el amplicón del producto de la fase de solución aterriza en los cebadores de la fase sólida, que se extienden para crear un bosque de amplicones extendidos en la superficie del chip. Después de la amplificación, el producto de amplificación y los reactivos se eliminan por lavado para dejar el amplicón monocatenario en la superficie del chip. Se cargan el cebador y la enzima de escape en el chip y, después de una breve etapa de hibridación, los cuatro nucleótidos fluyen juntos, creando una explosión de protones en los ISFET con oligos extendidos. Esta explosión de protones es muy clara de ver con un procesamiento mínimo de datos.
La Figura 4 muestra un flujo de trabajo de escape y datos del mismo. La primera fila representa la etapa de amplificación del ensayo, que genera un grupo de amplicones extendidos en la superficie del chip. A esto le sigue una etapa de deshibridación, utilizando calor, por ejemplo, para producir un amplicón monocatenario en la superficie del chip sin producto en fase de solución. Después de la hibridación del cebador y la enzima de escape, los cuatro nucleótidos fluyen a través del chip y se genera una señal en aquellos ISFET que se han extendido específicamente.
La Figura 5 muestra datos de ISFET de la muestra que muestran la señal de salida generada después de la PCR para tres moldes objetivo. Los datos mostrados son paraE. coli(un producto de 80 bases, por lo tanto, un escape máximo de 60 bases),E. faecalisy S.marcescensdespués de una amplificación específica del objetivo relevante. Los datos no están modificados y se muestran todos los ISFET
La Figura 6 muestra un chip multiplexado con tres cebadores anclados y un control de molde positivo. PCR con molde Ef, seguida de Escape. El mapa de calor muestra el voltaje de ISFET medido ~15 segundos después del flujo de nucleótidos. Se puede observar que los ISFET coinciden con el patrón de manchas y corresponden tanto a Ef como al control positivo. El trazo de la derecha muestra ejemplos de respuestas de ISFET para cada uno de los grupos de ISFEt
La Figura 7 muestra una implementación de secuenciación. En lugar de agregar los cuatro nucleótidos para el escape, los nucleótidos se agregan secuencialmente. Tiene lugar en un sistema abierto que requiere capacidades de flujo en el chip. Durante la reacción de amplificación, el amplicón del producto de la fase de solución aterriza en los cebadores de la fase sólida, que se extienden para crear un bosque de amplicones extendidos en la superficie del chip. Después de la amplificación, el producto de amplificación y los reactivos se eliminan por lavado para dejar el amplicón monocatenario en la superficie del chip. El cebador de secuenciación y la enzima se cargan en el chip y, después de una corta etapa de hibridación, los cuatro nucleótidos fluyen individualmente, creando una explosión de protones en aquellos ISFET con el producto de amplificación y la base correcta del molde. Se puede lograr una resolución de base única.
La Figura 8 muestra un flujo de trabajo de secuenciación y datos del mismo. La primera fila representa la etapa de amplificación del ensayo, que genera un grupo de amplicones extendidos en la superficie del chip. A esto le sigue una etapa de deshibridación, utilizando calor, por ejemplo, para producir un amplicón monocatenario en la superficie del chip sin producto en la fase de solución. Después de la hibridación del cebador y la enzima de escape, los cuatro nucleótidos fluyen individualmente a través del chip y se genera una señal en aquellos ISFET donde se incorporaron los nucleótidos y que corresponden a donde se generó el producto de amplificación.
La Figura 9 muestra un flujo de trabajo de detección en tiempo real. Puede tener lugar en una plataforma sin flujo de fluido posterior a la amplificación del chip o con un flujo de fluido mínimo. La reacción podría tener lugar en una cámara o cámaras de reacción permanentemente selladas. Durante la reacción de amplificación, el amplicón del producto de la fase de solución aterriza en los oligos de la fase sólida, modificando y extendiendo los oligos específicos. En un sistema sellado con bajo tampón, los protones se generarán cerca de la fase sólida durante la etapa de extensión de cada ciclo de la reacción de amplificación. Empujar la asimetría para producir un exceso significativo de cebador directo en la fase de solución generará efectivamente un "mini escape" de protones en cada ciclo que debería volverse detectable en los ciclos posteriores. Una alternativa a una asimetría en los cebadores al inicio de la reacción de amplificación, podría liberarse o agregarse cebadores adicionales durante la reacción de amplificación, o en puntos de tiempo establecidos. La reacción de amplificación se realizará en un tampón bajo para permitir la detección en tiempo real de la señal de pH.
La Figura 10 muestra datos de detección en tiempo real. Chip manchado con múltiples cebadores anclados en bloques, PCR (asimetría 3:1) con junta de 6 cámaras (3 cámaras selladas fluidamente), escape en estación de flujo con cámara única. La fase de solución muestra una señal de pH en tiempo real que indica que la reacción estaba progresando. Como confirmación de la amplificación, después de la PCR, el chip se sondeó con una etiqueta fluorescente dirigida al extremo distal del amplicón e indica que los cebadores anclados se extendieron durante la reacción de PCR.
La Figura 11 muestra la señal delta promedio de los ISFET para el Ejemplo 1.
La Figura 12 muestra señales delta de todos los ISFET para el objetivo del cebador anclado positivo para el ejemplo 1.
La Figura 13 muestra señales delta de todos los ISFET para el objetivo del cebador anclado negativo para el ejemplo 1.
La Figura 14 muestra señales delta de todos los ISFET para el control de cebador anclado para el ejemplo 1.
La Figura 15 muestra los resultados promedio de la señal de ISFET para los cebadores Positivo, Negativo y de Control para el Ejemplo 1.
La Figura 16 es una imagen de electroforesis en gel que muestra que se generó un amplicón en fase de solución después de la PCR paraSerratia marcescens,para el ejemplo 1.
La Figura 17 muestra una imagen fluorescente de SensoSpot para el Ejemplo 1.
La Figura 18 muestra señales Delta promedio de ISFET para el Ejemplo 2.
La Figura 19 muestra señales Delta para los objetivos de cebadores anclados 1 a 4 positivos para el Ejemplo 2.
La Figura 20 muestra señales delta de todos los ISFET para el cebador negativo anclado para el ejemplo 2.
La Figura 21 muestra señales delta de todos los ISFET para el control de cebador anclado para el ejemplo 2.
La Figura 22 muestra los resultados promedio de la señal de ISFET para positivos, negativos y controles para el ejemplo 2.
La Figura 23 es una imagen de electroforesis en gel para el Ejemplo 2.
La Figura 24 es una imagen fluorescente de SensoSpot para el Ejemplo 2.
Descripción detallada de la invención
Se describe un sistema con la capacidad de generar una lectura de diferentes secuencias a partir del mismo volumen de reacción.
Brevemente, el sistema comprende una reacción de amplificación bifásica en la que se produce una reacción de amplificación en fase de solución (PCR o isotérmica) en presencia de cebadores inmovilizados en la fase sólida que participan además en la producción del producto de reacción de amplificación. La reacción de amplificación en fase de solución (PCR o isotérmica) puede utilizar uno o más cebadores y un molde de ácido nucleico objetivo para generar un producto de amplificación de ácido nucleico en solución y el sistema detecta la señal correspondiente cuando se ha producido suficiente producto. Este producto de amplificación de ácido nucleico generado en fase de solución, así como el molde de ácido nucleico objetivo, también puede actuar, o actúa posteriormente, como molde para una reacción adicional en la fase sólida mediante la cual uno o más cebadores inmovilizados interactúan con el molde en fase de solución como parte de la reacción de amplificación y generar una secuencia de ácido nucleico que posteriormente es detectable por el sistema. Al inmovilizar los cebadores en ubicaciones conocidas y usar un sistema de detección capaz de discriminar la ubicación (por ejemplo, usando ISFET en chips CMOS IC o sistemas de imágenes ópticas de tipo matriz), la lectura permite la amplificación selectiva y la detección de muchos amplicones en el mismo dispositivo.
Se lleva a cabo una reacción de amplificación en fase de solución en presencia de uno o más cebadores adicionales inmovilizados en la fase sólida. Los cebadores inmovilizados pueden ser la misma secuencia que uno o más cebadores en fase de solución o corresponde a secuencias internas del molde de ácido nucleico generado en la fase de solución. El primero permite realizar una segunda llamada a partir de los mismos componentes de reacción, y el segundo, una segunda llamada que añade confirmación y mayor confianza de que se ha generado el producto de reacción de amplificación correcto y/o proporciona más información sobre la secuencia interna del molde objetivo.
El modo de detección descrito en el presente documento puede utilizar la tecnología de CMOS del ISFET, pero también sería aplicable a reacciones de amplificación de ácidos nucleicos y métodos de micromatrices existentes, así como a un sistema personalizado para integrar la detección en tiempo real de reacciones tanto en solución como en fase sólida. El potencial de redundancia del CMOS del ISFET permite una cantidad significativa de réplicas para cada ensayo, así como múltiples genes objetivo para cada objetivo, mejorando así la confianza en el sistema al confiar en múltiples lecturas para cada objetivo. Este diseño también facilita la incorporación de controles positivos y negativos en cada recipiente de reacción, lo que garantiza que se realicen llamadas correctas cuando el control funcione según lo requerido.
A continuación se muestran diversas realizaciones de la reacción de amplificación combinada en solución y fase sólida.
Lecturas de amplificación de ADN
Los cebadores inmovilizados descritos pueden ser iguales o similares a uno o más de los cebadores en fase de solución, y participar en la reacción de amplificación de manera que se genera una señal aumentada a partir de los cebadores inmovilizados en comparación con una amplificación llevada a cabo en ausencia de los cebadores de la solución, agregando así confianza en el resultado pero sin agregar más información a la secuencia que se genera. Por ejemplo, una PCR asimétrica en la fase de solución se puede compensar teniendo el cebador empobrecido en la fase de solución presente en la fase sólida. A medida que avanza la reacción de amplificación, se estimula que el producto en fase de solución que se genera interactúe con la fase sólida, generando amplicones tanto en fase de solución como en fase sólida. Se puede detectar el amplicón inmovilizado. La presencia de esta lectura en múltiples ubicaciones donde está inmovilizado el cebador brinda una mayor confianza de que el material luego amplificado definitivamente está presente en la muestra. La confianza en el resultado aumenta si los cebadores inmovilizados que tienen una secuencia diferente no dan un resultado positivo.
Amplificación de ADN con confirmación interna
Los cebadores inmovilizados descritos pueden corresponder a secuencias internas del molde de ADN generada en la fase de solución, de modo que cualquier señal generada en la fase sólida es una confirmación positiva de que se ha elaborado el producto correcto en la fase de solución. Esta confirmación demuestra que el amplicón en fase de solución no ha sido generado por elementos tales como dímeros de cebador, cebadores no coincidentes u otras reacciones no específicas (por ejemplo, señales generadas al interactuar con el ADN del huésped (humano) cuando el objetivo previsto es un patógeno en la muestra huésped), y ofrece un beneficio significativo sobre las pruebas de confirmación estándar, como el análisis de la curva de fusión y la obtención de imágenes en gel de electroforesis, ya que en la lectura se infiere información de secuencia adicional.
La señal de confirmación interna es análoga a los procedimientos de confirmación de laboratorio estándar, como el análisis de la curva de fusión, la obtención de imágenes en gel de electroforesis, etc.
El uso de cebadores inmovilizados correspondientes a secuencias internas en el molde objetivo permite dar más especificidad al sistema mediante el cual la combinación de reacción en fase de solución y reacción en fase sólida identifica más información de secuencia que una reacción en fase de solución por sí sola, mejorando así la confianza en el resultado comparado con la fase de solución sola.
Amplificación de ADN con información interna de secuencia
Además de la etapa de confirmación ya identificada, también está disponible la posibilidad de permitir que estén presentes múltiples cebadores inmovilizados correspondientes a diferentes áreas del producto amplificado en fase de solución, de modo que uno o más puedan usarse para proporcionar información interna además de simplemente confirmando que se ha elaborado el producto correcto en la fase de solución.
Esto puede tomar una forma simple de múltiples cebadores internos del producto amplificado, cada uno de los cuales agrega confianza en el resultado inferido al proporcionar más de una alineación de secuencia, o en una versión más avanzada se puede usar para identificar variaciones internas dentro de un gen objetivo correspondiente a mutaciones puntuales y otros polimorfismos. Por ejemplo, existen varios genes de resistencia a los antibióticos que tienen múltiples variantes debido a mutaciones puntuales u otros polimorfismos, y donde la presencia de una mutación particular puede resultar en una estrategia terapéutica diferente en comparación con otra mutación. Por lo tanto, es importante que la identificación de estos polimorfismos se realice de manera oportuna y rentable. Las estrategias de identificación actuales que utilizan PCR y otras reacciones de amplificación tienen una capacidad limitada y los laboratorios pueden recurrir a la secuenciación para dilucidar la secuencia interna e identificar los polimorfismos; esto requiere mucho tiempo y es costoso de implementar y, a menudo, no se hace.
En esta realización, se puede usar un único par de cebadores en la fase de solución para amplificar todas las variantes del gen, y se pueden usar uno o más cebadores inmovilizados correspondientes a las mutaciones puntuales o polimorfismos en la fase sólida para identificar uno o más de las variantes. Una combinación de cada uno de los cebadores internos inmovilizados proporciona al usuario información valiosa sobre la secuencia general del gen amplificado y puede hacer que las decisiones clínicas se tomen más fácilmente y más rápidamente.
Escape (incluidos escapes múltiples)
Las reacciones de amplificación generalmente se realizan en tampones de alta fuerza iónica. Para los sistemas de secuenciación que miden la liberación de protones de los nucleótidos incorporados, los productos de amplificación pueden detectarse si el tampón de amplificación se reemplaza por un tampón con una capacidad de tamponamiento baja. Alternativamente, los productos de amplificación pueden detectarse usando cebadores marcados con fluorescencia o mediante el uso de nucleótidos marcados con fluorescencia.
El escape se lleva a cabo en un sistema abierto que requiere capacidades de flujo en el chip. Durante la reacción de amplificación, el amplicón del producto de la fase de solución aterriza en los cebadores de la fase sólida, que se extienden para crear un bosque de amplicones extendidos en la superficie del chip. Después de la amplificación, el producto de amplificación y los reactivos se eliminan por lavado para dejar el amplicón monocatenario en la superficie del chip. Se cargan el cebador y la enzima de escape en el chip y, después de una etapa de hibridación, los cuatro nucleótidos fluyen juntos, creando una explosión de protones en aquellos ISFET con oligos extendidos. Esta explosión de protones es muy clara de ver con un procesamiento mínimo de datos.
Para realizar una detección electrónica/de protones, al final de la etapa de amplificación descrita anteriormente con reacciones tanto en fase de solución como en fase sólida, los componentes de la fase de solución se eliminan del cartucho y se reemplazan con una solución con baja capacidad de tamponamiento. A esto le siguen cebadores y enzimas, ya sea en secuencia o combinados, seguidos de un flujo de nucleótidos, que dará como resultado una liberación de protones a medida que se incorporan los nucleótidos y una señal correspondiente en la plataforma de detección, por ejemplo, un cambio de mV en los ISFET pertinentes. Los cebadores utilizados para el escape pueden corresponder a cualquier ubicación dentro del molde amplificado, incluidas secuencias genéricas agregadas durante reacciones de amplificación anteriores. El uso de cebadores específicos de amplicones internos al producto amplificado en solución ofrece una mayor confianza en el resultado al confirmar que se ha elaborado el material correcto en la fase sólida, pero puede aumentar la complejidad del sistema al tener un múltiplex más alto. Si se han agregado secuencias genéricas en reacciones de amplificación anteriores, sería posible limitar la escala del múltiplex en fase de solución mejorando así la eficiencia de la reacción; sin embargo, esto puede limitar la confianza de la lectura debido a la posibilidad de que las secuencias genéricas fallen.
Al conocer la ubicación de un cebador inmovilizado particular, se puede determinar la identificación del objetivo cuando los protones que se generan durante la reacción de escape dan como resultado una señal en el sensor ISFET particular donde está inmovilizado el cebador específico. En esta realización son posibles múltiples réplicas para cada objetivo de ensayo, con la escala del múltiplex limitada por la separación espacial, el número de pocillos y sensores por dispositivo y los desafíos bioinformáticos.
El sistema puede hacer uso de una única reacción de escape o de múltiples reacciones de escape, con o sin una etapa de deshibridación entre cada proceso. Se pueden utilizar escapes adicionales para interrogar las señales anteriores de modo que se pueda aumentar la confianza en la secuencia interna. Por ejemplo, si se usaron secuencias genéricas en reacciones de amplificación anteriores, un primer escape podría usar la secuencia genérica para identificar qué ensayos han generado señales, y un escape posterior podría usar cebadores específicos correspondientes a esos ensayos en particular para confirmar que se ha utilizado el producto correcto.
Se pueden analizar múltiples secuencias objetivo en paralelo ya que se pueden inmovilizar cebadores de diferentes secuencias en diferentes ubicaciones del soporte sólido.
Información de secuencia (una o varias bases a la vez)
Al final de la etapa de amplificación descrita anteriormente, los componentes de la fase de solución se pueden eliminar del cartucho y reemplazarlos con una solución con bajo tampón, como ocurre con el flujo de trabajo de escape. A esto le siguen cebadores y enzimas, ya sea en secuencia o combinados, seguidos de un flujo de nucleótidos individuales o una combinación de 2 o más nucleótidos, lo que dará como resultado una liberación de protones cuando los nucleótidos complementarios correctos fluyan a través del chip y se incorporen. Este flujo de trabajo proporciona la información más rica de todas las realizaciones, ya que proporciona información de secuencia en lugar de depender únicamente de la alineación de los cebadores con su molde correspondiente. Este flujo de trabajo no solo confirma que se ha realizado la alineación correcta y que se ha elaborado el producto correcto en la fase sólida, sino que también indica la secuencia interna, ya sea por inferencia o por identificación directa. En el presente documento se pueden usar enfoques similares a los que se han analizado en la realización de escape, siendo posibles múltiples ejecuciones para proporcionar más información, así como un flujo de trabajo que combina el escape con este enfoque de usar uno o más nucleótidos.
Detección en tiempo real
El proceso de amplificación se puede detectar en tiempo real midiendo la extensión de los cebadores inmovilizados. La reacción podría tener lugar en una cámara o cámaras de reacción permanentemente selladas. Durante la reacción de amplificación, el amplicón del producto de la fase de solución aterriza en los oligos de la fase sólida, modificando y extendiendo los oligos específicos. En un sistema sellado con bajo tamponamiento, los protones se generarán cerca de la fase sólida durante la etapa de extensión de cada ciclo de la reacción de amplificación, y estos podrán detectarse.
La amplificación puede ser asimétrica, donde los dos cebadores en solución están presentes en diferentes concentraciones, dando lugar a productos de amplificación que son en gran medida monocatenarios debido a la falta de un cebador complementario que se extienda contra ellos. Empujar la asimetría para producir un exceso significativo de cebador directo en la fase de solución generará efectivamente un "mini escape" de protones en cada ciclo que debería volverse detectable en los ciclos posteriores. Una alternativa a una asimetría en los cebadores al inicio de la reacción de amplificación, podría liberarse o agregarse cebadores adicionales durante la reacción de amplificación, o en puntos de tiempo establecidos. La reacción de amplificación se realizará en un tampón bajo para permitir la detección en tiempo real de la señal de pH.
El ácido nucleico fuente puede ser un polinucleótido genómico. El material de origen puede ser eucariota, procariota o arqueal. Se pueden proporcionar uno o más materiales de origen. El ácido nucleico fuente puede representar un fragmento de un genoma; por ejemplo, un único cromosoma o un único locus genómico (por ejemplo, para la secuenciación rápida de polimorfismos alélicos). En ejemplos particulares, la amplificación puede ser específica para material patógeno dentro de una muestra. Por ejemplo, la amplificación puede seleccionar ácidos nucleicos bacterianos o virales presentes en una muestra humana. Los moldes pueden ser ADN, ARN o copias de ADNc de los mismos.
El material biológico puede amplificarse en solución antes de sufrir las reacciones de amplificación reivindicadas. Por lo tanto, es posible que el material ya haya pasado por una etapa de amplificación basada en secuencia antes de que se realice la invención. Alternativamente, la muestra puede procesarse para unir una secuencia universal común a uno o ambos extremos de todas las cadenas en la muestra. La secuencia universal se puede utilizar como una secuencia universal para hibridar con un cebador común, que puede ser de origen no natural.
La invención descrita en el presente documento puede permitir cuatro o más niveles de especificidad de amplificación. Se puede realizar una primera amplificación en solución. Puede realizarse una segunda amplificación utilizando los cebadores no inmovilizados. Se puede llevar a cabo una tercera amplificación utilizando cebadores inmovilizados de secuencia diferente a los segundos cebadores de amplificación. La presencia del amplicón se puede detectar utilizando un cebador específico del amplicón generado por los cebadores inmovilizados. Por lo tanto, se pueden utilizar cuatro niveles de especificidad de amplificación, asegurando que el amplicón final sólo se detecte si la secuencia original está absolutamente presente en la muestra. De este modo se pueden eliminar los resultados falsos positivos de la detección de secuencias estrechamente relacionadas pero no deseadas.
La inmovilización de ácidos nucleicos en superficies es convencional. Se puede utilizar cualquier método de inmovilización covalente o no covalente. La inmovilización es idealmente estable ante múltiples ciclos de termociclado a una temperatura que provoca la separación de las cadenas de ácido nucleico. Los métodos particulares de inmovilización incluyen el entrecruzamiento inducido por UV o la inmovilización mediante la formación de enlaces amida o enlaces fosforotioato.
Ejemplos
Se han recopilado datos experimentales para la amplificación y detección de cebadores anclados localizados únicos (LAPAD) deSerratia marcescens(proveedor: NCTC, número de catálogo 27137) en una única región objetivo y detección y amplificación de cebadores anclados localizados múltiples (LAPAD) deSchizosaccharomyces pombe(proveedor: ATCC, número de catálogo: 26189) en múltiples regiones objetivo.
Las representaciones esquemáticas tanto de LAPAD única como múltiple se muestran como la Figura 1 y la Figura 2.
Ejemplo 1: Am plificación y detección de cebadores anclados localizados únicos (LAPAD)
Amplificación y detección deSerratia marcescensen una única región objetivo. La región objetivo que está en el extremo 3' del ADN molde amplificado se hibridó con sobre el objetivo del cebador anclado complementario. Durante el proceso de amplificación, este cebador objetivo anclado se extendió y en la siguiente etapa se detectó la misma región objetivo durante la extensión. Las secuencias de cebadores/oligonucleótidos utilizadas se muestran en la Tabla 1. 'aa
Tabla 1: Secuencias de Oligonucleótidos
Ejemplo 2: Am plificación y detección de cebadores anclados localizados múltiples (LAPAD) Amplificación y detección deSchizosaccharomyces pombeen múltiples regiones objetivo. La región objetivo 1, que está después de unas pocas bases de nucleótidos del extremo 3' del ADN molde amplificado, se híbrida con el cebador anclado objetivo 1 complementario. Región objetivo 2 que después de algunas bases de la región objetivo 1 y hacia el extremo 5' del ADN molde amplificado se hibridó con el cebador anclado objetivo 2 complementario. La región objetivo 3, que está después de unas pocas bases de la región objetivo 2 y hacia el extremo 5' del ADN molde amplificado, se hibrida con el cebador anclado objetivo 3 complementario. Región objetivo 4 que después de algunas bases de la región objetivo 3 y hacia el extremo 5' del ADN molde amplificado se hibridó con el cebador anclado objetivo 4 complementario. Durante el proceso de amplificación, estos 4 cebadores anclados objetivo con los moldes de ADN hibridados se extendieron y luego, en la siguiente etapa, se detectaron las mismas regiones objetivo durante la extensión. Las secuencias de cebadores/oligonucleótidos utilizadas se muestran en la Tabla 1.
Método experimental
La plataforma del chip incorporó '004' chips CMOS de Ta2O5 que consisten en los ISFET y encerrados en pocillos SU-8 se anclaron con cebadores utilizando una química de superficie de entrecruzamiento basada en UV. Se montó un colector sobre la superficie del chip para incluir fluidos para que se produjera la reacción en la superficie del chip.
Se realizó una PCR para generar ADN para la detección; la receta del reactivo de PCR, volumen final de 50 pl, se muestra en la Tabla 2. Las condiciones de termociclado utilizadas se muestran en la Tabla 3.
Tabla 2: Receta del reactivo de PCR
Tabla 3: Condiciones de termociclado
Después de la PCR, los chips se lavaron con tampón de lavado (solución salina-citrato de sodio 0.06x, Tween20 al 0.06%), seguido de deshibridación química del ADN con NaOH 20 mM durante 5 minutos y luego se lavaron nuevamente con tampón de lavado.
Se añadió luego la mezcla del cebador de escape (la secuencia se muestra en la Tabla 1) a la superficie del chip. Se añadieron 3.33 pM de cebador marcado fluorescentemente (Cy3) al tampón de hibridación (acetato de magnesio 5 mM, cloruro de sodio 150 mM, Tris 20 mM, pH 7.5, Tween 20 al 0.01%).
Luego se calentaron los chips con la mezcla de cebador de escape a 95 °C durante 2 minutos, seguido de 58 °C durante 5 minutos y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se lavaron los chips con tampón de carga de enzimas (Thermopol® 1x, Tween 20 al 0.06%).
Luego se añadió una mezcla de enzimas a la superficie del chip; esta mezcla de enzimas se creó añadiendo 25 unidades/pl de ADN polimerasa del fragmento grande de Bst personalizado al tampón de carga de enzimas. Luego los chips se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos.
La incorporación de trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) se logró mediante el uso de un sistema de flujo personalizado que permite que los dNTP fluyan sobre la superficie del chip. Se añadieron 12.5 pM de cada uno de trifosfato de desoxiadenosina, trifosfato de desoxitimidina, trifosfato de desoxiguanosina y trifosfato de desoxicitidina al tampón de RMD no carbonatado (cloruro de magnesio 10 mM, cloruro de sodio 25 mM, Tergitol al 0.025%). El pH de la mezcla de dNTP se ajustó a pH 8 y se mantuvo manteniendo el fluido bajo nitrógeno gaseoso.
Detección del sensor ISFET
Los datos de salida de voltaje del sensor ISFET sin procesar y el mapa de detección del cebador anclado se procesaron juntos mediante un proceso de análisis de datos personalizado (proceso Galaxy Runoff v1.3.15). Se detectaron las alturas de los picos de la señal de voltaje de los ISFET y las alturas de los picos de la señal de voltaje del ISFET del cebador anclado se restaron de las del blanco de ISFET posterior adyacente. Esto se hace para eliminar el ruido del sistema, incluido el ruido del flujo de fluido, que puede enmascarar la detección. Esta salida de voltaje del sensor ISFET delta de todos los sensores de cebadores anclados específicos se promedió para determinar la detección de señal.
Análisis de electroforesis en gel E
Se utilizaron geles E preparados (geles de agarosa al 2% de 48 pocillos teñidos con bromuro de etidio) para el análisis cualitativo de la PCR en fase de solución. Las muestras se recogieron después de la PCR de la superficie del chip y se añadió 1 pL de la muestra al colorante de carga del gel E 1x antes de cargarlo en los pocillos del gel E. También se cargó una escala de medida para comparar el tamaño del amplicón. El gel se operó durante 10 minutos sobre la base del gel E, que proporciona un campo eléctrico para que el amplicón de ADN migre según su tamaño.
Imágenes de fluorescencia Sensospot
Después del proceso, los chips se escanearon en el escáner de fluorescencia de SensoSpot bajo una luz verde para iluminar el cebador de escape Cy3 que se habría hibridado con el amplicón generado en el chip. En función de la intensidad de la fluorescencia, la amplificación en el chip se puede determinar cualitativamente.
Resultados
La detección para ambos ensayos se estableció cuantitativamente mediante la salida de voltaje del sensor ISFET delta. La amplificación por PCR en fase de solución se evaluó cualitativamente mediante análisis de gel E y amplificación de la superficie del chip mediante imágenes fluorescentes Sensospot.
Ejemplo 1: Am plificación y detección del cebador anclado localizado único (LAPAD)
Objetivo:Serratia marcescens
Identificación del chip: NM-248-0214
Las secuencias de cebadores anclados para el Ejemplo 1 se pueden ver en la Tabla 4.
Tabla 4: Secuencias de cebadores anclados para el Ejemplo 1
La señal delta promedio de los ISFET se puede ver en la Figura 11.
Las señales delta de todos los ISFET para el Cebador Anclado objetivo Positivo se pueden ver en la Figura 12. Las señales delta de todos los ISFET para el Cebador Anclado objetivo Negativo se pueden ver en la Figura 13
Las señales delta de todos los ISFET para el control del Cebador Anclado se pueden ver en la Figura 14. Los resultados promedio de la señal ISFET para los cebadores Positivo, Negativo y de Control se pueden ver en la Figura 15. Se detectó una señal ISFET promedio de 36.2 dmV para el Cebador Anclado Positivo NH2_iSp18_SmR, que fue incluso mayor que la señal ISFET promedio de 23.4 dmV para el Cebador Anclado de Control NH2_ddl_5' T15.
El amplicón en fase de solución se generó después de la PCR paraSerratia marcescenscomo se ve en la imagen de electroforesis en gel (Figura 16). Junto con el cebador Anclado de Control, el amplicón en chip generado también se puede ver para el cebador Anclado Positivo NH2-iSp18_SmR en la imagen fluorescente de SensoSpot (Figura 17).
Se demostró la amplificación y detección deSerratia marcescensen una única región objetivo. Se detectó una señal de voltaje ISFET delta significativa que era incluso mayor que la del Cebador Anclado de Control. Ejemplo 2: Am plificación y detección de cebadores anclados localizados múltiples (LAPAD) Objetivo:Schizosaccharomyces pombe
Identificación del chip: NM-248-0172
Las secuencias de cebadores anclados para el Ejemplo 2 se pueden ver en la Tabla 5.
Tabla 5: Secuencias de cebadores anclados para el Ejemplo 2.
La señal delta promedio de los ISFET para el ejemplo 2 se puede ver en la Figura 18.
Las señales delta de todos los ISFET para el Cebador Anclado objetivos 1 a 4 positivos se pueden ver en la Figura 19.
Las señales delta de todos los ISFET para el Cebador Anclado Negativo se pueden ver en la Figura 20. Las señales delta de todos los ISFET para el Control del Cebador Anclado se pueden ver en la Figura 21. Los resultados promedio de la señal ISFET para los cebadores Positivo, Negativo y de Control se pueden ver en la Figura 22. Se detectó una señal ISFET de 1.5 a 4.4 dmV para los cuatro cebadores Anclados Positivos. Esto es mucho más bajo que las intensidades de señal anteriores y la señal ISFET promedio del Cebador Anclado de Control que era de 34.6 dmV.
El amplicón en fase de solución se generó después de la PCR paraSchizosaccharomyces pombecomo se ve en la imagen de electroforesis en gel (Figura 23). El amplicón en el chip generado no se puede ver para los cebadores Anclados Positivos en la imagen fluorescente de SensoSpot (Figura 24). Sin embargo, se puede ver el cebador Anclado de Control.
Se demostró la amplificación y detección deSchizosaccharomyces pombeen múltiples regiones objetivo.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la amplificación y análisis de secuencias de ácidos nucleicos, comprendiendo el método: a. tomar un sistema que tiene un volumen de líquido que contiene una muestra de ácido nucleico, dos o más cebadores de amplificación no inmovilizados y reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, y uno o más cebadores de amplificación inmovilizados; en el que los cebadores de amplificación no inmovilizados exceden a los cebadores de amplificación inmovilizados;
b. realizar una reacción de amplificación asimétrica de ácidos nucleicos utilizando los cebadores de amplificación no inmovilizados para producir un primer producto de amplificación de ácidos nucleicos no inmovilizados;
c. amplificar adicionalmente el primer producto de amplificación de ácidos nucleicos no inmovilizados utilizando el uno o más cebadores de amplificación inmovilizados para producir un segundo producto de amplificación de ácidos nucleicos inmovilizado;
d. interrogar en tiempo real una señal localizada generada en la ubicación del segundo producto de amplificación de ácidos nucleicos inmovilizado; y
e. detectar la presencia, ausencia o secuencia del segundo producto de amplificación de ácidos nucleicos.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la relación de cebadores de amplificación no inmovilizados respecto a los cebadores de amplificación inmovilizados es de 3:1.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se libera o añade un cebador adicional durante la reacción de amplificación o en momentos determinados.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los cebadores de amplificación no inmovilizados del volumen de líquido se liberan de la fase sólida antes de la amplificación.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los productos amplificados se detectan ópticamente.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección de los productos amplificados implica sondas indicadoras fluorescentes y la posterior medición de la fluorescencia.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los cebadores de amplificación inmovilizados amplifican una sección interna del primer producto de amplificación, de modo que el segundo producto de amplificación es más corto que el primer producto de amplificación.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer volumen de líquido se expone a dos o más cebadores de amplificación inmovilizados, donde cada cebador amplifica una secuencia diferente.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que los dos o más cebadores de amplificación inmovilizados difieren en una sola base, detectando así variantes de una sola base en los primeros productos de amplificación nucleicos.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método se lleva a cabo en un sistema de imágenes ópticas de tipo matriz que comprende una superficie con la que entra en contacto el volumen de líquido.
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