ES3024110T3 - Methods for preservation of cells - Google Patents

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Michael Menze
Jonathan Kopechek
Brett Janis
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Abstract

Se proporcionan aquí sistemas y métodos para la administración de moléculas a las células. El método puede incluir la formación de una solución que comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de moléculas solubles y una o más células, el flujo de la solución a través de un dispositivo microfluídico y su sonicación durante un periodo suficiente para formar poros en una o más células. En particular, estos métodos pueden utilizarse para la preservación de células mediante la administración de un agente de conservación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de preservación de células
Campo técnico
El tema aquí divulgado se relaciona en general con métodos para la administración de moléculas a las células. En particular, ciertas realizaciones de la materia objeto de la presente divulgación se refieren a métodos para la preservación, por ejemplo criopreservación y liofilización, de células que hacen uso de ultrasonidos y sonoporación.
Antecedentes
Los RBC (RBC) desempeñan un papel vital al transportar oxígeno molecular a los tejidos de todo el cuerpo para satisfacer las necesidades metabólicas del cuerpo. Las condiciones o procedimientos que causan una pérdida significativa de RBC funcionales, tales como traumatismos, trastornos sanguíneos, tratamientos contra el cáncer o procedimientos quirúrgicos, pueden provocar privación de oxígeno, insuficiencia orgánica potencialmente mortal y, eventualmente, provocar la muerte. Por lo tanto, muchos pacientes requieren transfusiones de sangre para reemplazar los RBC perdidos y mantener una oxigenación adecuada de los tejidos. Según la Agencia para la Investigación y la Calidad de la Atención Médica, las transfusiones de sangre son el procedimiento médico más común que se realiza en los hospitales de EE. UU., y más de 2,9 millones de pacientes recibieron un total combinado de más de 13,7 millones de unidades de RBC en 2011. Cada año se transfunden aproximadamente 85 millones de unidades de RBC en todo el mundo y el tamaño del mercado mundial de preparación de sangre fue de 44 mil millones de dólares en 2015.
A pesar de la cantidad de RBC que se utilizan cada año, las limitaciones en la preservación de RBC plantean un desafío importante para la medicina transfusional. Los RBC normalmente se almacenan a 4 °C y deben utilizarse dentro de los 42 días. Por lo tanto, se necesitan donaciones de sangre frecuentes para mantener un suministro adecuado de RBC para las transfusiones. En 2011, en Estados Unidos se desecharon más de 370.000 unidades de RBC vencidos y más del 10% de los hospitales estadounidenses encuestados informaron de al menos un día de escasez de sangre al año, con una escasez anual promedio de RBC de 19 días en estos hospitales. En algunos casos especiales, los RBC se pueden congelar en presencia de glicerol durante hasta 10 años, pero el glicerol debe eliminarse completamente mediante múltiples y engorrosos etapas de lavado antes de la transfusión, y la mayoría de los hospitales no tienen la capacidad para realizar este proceso. Además, también se necesitan transfusiones de sangre en lugares donde no se dispone de refrigeración o congelación de RBC, tales como en el campo durante operaciones militares o en centros médicos en ubicaciones remotas. En muchos casos, las ambulancias tampoco están equipadas para transportar RBC. Por lo tanto, un método eficaz para almacenar RBC en estado seco para su conservación a largo plazo a temperatura ambiente sería muy beneficioso y proporcionaría un mayor acceso a los productos sanguíneos.
El artículo "Stabilization of Dry Mammalian Cells: Lessons from Nature" by John H. Crowe et al., Integrative and Comparative Biology, 2005, Volume 45, Issue 5, pages 810-820, revela una liofilización exitosa de plaquetas cargadas con trehalosa. El artículo "Microfluidic electro-sonoporation: a multi-modal cell poration methodology through simultaneous application of electric field and ultrasonic wave" by Whitney Longsine-Parker et al., Lab Chip, 2013,13, pages 2144-2152, divulga un dispositivo de electrosonoporación microfluídica, en el que las células que fluyen a través de un canal microfluídico hecho de un par de microelectrodos se exponen simultáneamente a un campo eléctrico y a una presión acústica generada por un transductor de ultrasonidos colocado en la parte superior del canal. El canal tiene tres entradas, una entrada de célula central y dos entradas de amortiguación laterales.
Sumario de la divulgación
Un aspecto de la divulgación, que no está de acuerdo con la invención reivindicada, proporciona un sistema para la administración de moléculas a células, que comprende un dispositivo microfluídico que comprende un primer canal para alojar una o más microburbujas, un segundo canal para alojar moléculas solubles, el segundo canal en comunicación fluida con e intersectado por el primer canal, y un tercer canal para alojar una solución celular, el tercer canal en comunicación fluida con e intersectado por el segundo canal; y un transductor de ultrasonidos colocado debajo del tercer canal o un transductor interdigital colocado en lados opuestos del tercer canal. En algunas realizaciones, al menos una parte del tercer canal está en una configuración en espiral. En algunas realizaciones, el primer canal, el segundo canal y/o el tercer canal tienen un ancho de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 700 pm y una profundidad de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 400 pm.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para la administración de moléculas a células, que comprende formar una solución que comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de moléculas solubles y una o más células; hacer fluir la solución a través de un dispositivo 4 microfluídico; y sonicar la solución durante un período de tiempo suficiente para formar poros en una o más células. En algunas realizaciones, las moléculas solubles se seleccionan del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, sorbitol, xilitol, mioiositol, fosfato de diglicerol, prolina, ectoína, taurina, hipotaurina y proteínas transgénicas expresadas abundantes en embriogénesis tardía (LEA) del grupo 1, grupo 2 o grupo 3 de la salmueraArtemia franciscana.En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de secado y/o congelación de una o más células. En algunas realizaciones, una o más células son glóbulos rojos.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para la criopreservación de células, que comprende formar una solución que comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de agente de conservación y una o más células; y sonicar la solución durante un período de tiempo suficiente para formar poros en una o más células. Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para la administración de moléculas a células, que comprende pasar un fluido que comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de moléculas solubles y una o más células a través de un microcanal, una célula a la vez, y sonicar las células a medida que pasan a través del microcanal, de modo que las microburbujas formen poros en una o más células a través de los cuales una o más de las moléculas solubles ingresan a una o más células.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1es un diagrama esquemático que muestra un sistema de administración de moléculas de ejemplo de acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación.
La FIG. 2A-Bes un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de dispositivo microfluídico integrado con ultrasonido de acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación.
La FIG. 3es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de diseño microfluídico de acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación.
La FIG. 4es un gráfico que muestra la recuperación de los RBC 24 horas después de la sonoporación, lo que indica una toxicidad mínima con este tratamiento.
La FIG. 5A-Bincluye imágenes microscópicas de RBC secos sin trehalosa (A) y después de cargarlos con trehalosa (B). Las células sanguíneas mantienen su forma después de la rehidratación como se muestra en la imagen confocal (B); no se encontraron células intactas después de la rehidratación sin carga de azúcar (datos no mostrados).
La FIG. 6A-Bincluye gráficos que muestran la recuperación de RBC después de la congelación/descongelación (A) o la liofilización/rehidratación (B), lo que indica una recuperación significativamente mayor en muestras con tratamiento de sonoporación.
La FIG. 7A-Bincluye imágenes de microscopía electrónica de barrido de RBC que se rehidrataron después de 6 semanas de almacenamiento en seco a temperatura ambiente. (A) Muestras de RBC rehidratados sin tratamiento ultrasónico y (B) RBC rehidratados después de la carga de trehalosa con ultrasonido. Las escalas gráficas representan 10 pm.
La FIG. 8es un gráfico que muestra el efecto del tiempo y la presión de sonicación en la administración de fluoresceína a los RBC.
La FIG. 9A-Bincluye gráficos que muestran la intensidad de las emisiones de banda ancha durante los primeros 8 segundos de sonicación (A) y después de 8 segundos de sonicación (B).
Descripción detallada
En este documento se exponen los detalles de una o más realizaciones de la materia objeto actualmente divulgada. Las modificaciones a las realizaciones descritas en este documento, y otras realizaciones, serán evidentes para aquellos con conocimientos ordinarios en la materia después de un estudio de la información proporcionada en este documento. La información proporcionada en este documento, y en particular los detalles específicos de las realizaciones ejemplares descritas, se proporciona principalmente para mayor claridad de comprensión y no debe entenderse que de ella se desprenden limitaciones innecesarias. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de este documento, incluyendo las definiciones.
Si bien se cree que los términos utilizados en este documento son bien comprendidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la materia, se establecen ciertas definiciones para facilitar la explicación del tema aquí divulgado.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona experta en la técnica a la que pertenecen las invenciones.
Tal como se usan en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos, son, a menos que se indique de otro modo, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas o la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB (véase, Biochem. (1972) 11(9):1726-1732).
La presente solicitud puede "comprende" (abierta) o "consiste esencialmente en" los componentes de la presente invención así como otros ingredientes o elementos descritos en este documento. Tal como se utiliza en este documento, "que comprende" es un término abierto y significa los elementos recitados, más cualquier otro elemento o elementos que no se recitan. Los términos "que tiene" e "que incluye" también deben interpretarse como abiertos a menos que el contexto sugiera lo contrario.
Según la antigua convención de leyes de patentes, los términos "un", "uno", "una", "el" y "la" hacen referencia a "uno o más" cuando se utilizan en la presente solicitud, incluso en las reivindicaciones. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células, y así sucesivamente.
A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como condiciones de reacción, etc., utilizados en la especificación y las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en esta especificación y reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busquen obtener con la materia objeto actualmente divulgada.
Tal como se utiliza en este documento, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente ocurre o no y que la descripción incluye instancias donde dicho evento o circunstancia ocurre y instancias en las que no. Por ejemplo, una porción opcionalmente variante significa que la porción es variante o no variante.
Las realizaciones de la divulgación proporcionan un sistema y un proceso para administrar moléculas (es decir, un "agente objetivo"), tales como el protector celular trehalosa, a células, tales como RBC o plaquetas, utilizando una combinación de tecnología de ultrasonido y microburbujas. Cualquier tipo de células, por ejemplo células nucleadas, son compatibles con los sistemas y procesos descritos en este documento. Los tipos de células ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células madre que pueden ser útiles para la terapia con células madre, células de insectos, por ejemplo, para la producción de proteínas transgénicas, y líneas celulares para pruebas de fármacos, como HepG2, CHO, HEK, HELA, etc.
Las microburbujas, que generalmente tienen un diámetro de entre ~1 y 3 pm, están aprobadas por la FDA para su uso como agentes de contraste de ultrasonido en ecocardiografía clínica y también están en desarrollo para uso terapéutico. Las microburbujas oscilan en respuesta a ondas de presión ultrasónicas que hacen que las microburbujas se expandan y compriman con cada ciclo de presión positiva y negativa. Esta oscilación de microburbujas ("cavitación") ejerce fuerzas sobre el fluido circundante. Con amplitudes de ultrasonido suficientes, la oscilación se vuelve no lineal y puede inducir fuertes efectos de microflujo o microchorro en el fluido circundante. Cuando esto ocurre cerca de una membrana celular, los microchorros y las ondas de choque producidos por la cavitación de microburbujas pueden formar poros transitorios en la membrana, que generalmente son reparados rápidamente por la célula en menos de un minuto. Las realizaciones de la divulgación utilizan este proceso de formación de poros ("sonoporación") para administrar agentes objetivo directamente a la célula. En algunas realizaciones, se puede utilizar la sonoporación para administrar el azúcar trehalosa, un protector celular, a los RBC para promover la supervivencia celular durante la congelación y el secado.
En algunas realizaciones, las microburbujas comprenden aproximadamente entre el 1 y el 20 % de una solución que contiene el agente y/o las células objetivo.
En algunas realizaciones, las microburbujas están recubiertas de lípidos. Los lípidos ejemplares que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DpPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000) y/o estearato de polietilenglicol-40 (PEG-40). En algunas realizaciones, se utiliza una formulación que comprende DSPC:DSEPC:D<s>PG:PEG-40 en una relación molar de 100:43:1:4,5. En algunas realizaciones, se utiliza una solución lipídica compuesta por una relación molar de 94:4 (DPPC:DSPE-PEG2000).
La trehalosa ha obtenido el estatus de Generalmente Reconocida Como Segura (GRAS) por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE. UU. y se utiliza para la conservación de alimentos en productos como dulces, carnes y alimentos congelados. Es un azúcar no reductor natural que se encuentra en muchas plantas y animales inferiores y que les ayuda a sobrevivir en estados de escasez de agua, tal como la deshidratación o la congelación. Durante la congelación, la trehalosa evita que los cristales de hielo sufran daños.
Durante el secado, el azúcar forma una barrera vitrea alrededor de las membranas celulares que reemplaza al agua. Sin embargo, las células tales como los RBC son generalmente impermeables a la trehalosa y deben manipularse para permitir la administración intracelular de este compuesto. Hasta la fecha, se han probado varias estrategias para cargar trehalosa en los RBC, incluido el estrés osmótico, los cambios rápidos de temperatura o la electroporación, pero estos enfoques no han tenido éxito en la producción de RBC funcionales que sobrevivan a la conservación a largo plazo sin una pérdida significativa de hemoglobina. Sin embargo, ahora se ha descubierto sorprendentemente que se pueden utilizar ultrasonidos y microburbujas para inducir poros transitorios en las membranas celulares y facilitar el transporte activo de moléculas como la trehalosa a las células. Además, se ha determinado que la sonoporación se puede utilizar en un sistema de dispositivo microfluídico para administrar de manera efectiva y constante cantidades suficientes de trehalosa a los<r>B<c>para su conservación a largo plazo en un estado seco, que luego se pueden resuspender en agua estéril u otra solución antes de su uso para transfusión. El sistema microfluídico permite un control preciso y consistente sobre la entrega de moléculas para aumentar la eficiencia de carga y la viabilidad de las células procesadas.
En algunas realizaciones de la materia objeto de la presente divulgación, se proporciona un sistema para la administración de un agente objetivo a células, por ejemplo para la preservación de células, que incluye un dispositivo microfluídico y un transductor de ultrasonidos (FlG. 1). Por ejemplo, realizaciones del sistema son útiles para la criopreservación y/o lioconservación. La criopreservación preserva las células enfriándolas a temperaturas muy bajas (por ejemplo, inferiores a -80 °C), mientras que la lioconservación es una estrategia biomimética basada en la anhidrobiosis para preservar las células a temperatura ambiente en un estado desecado. Este dispositivo se puede utilizar para la sonoporación y la carga de cualquier molécula soluble, por ejemplo, medicamentos, genes, proteínas o marcas celulares (por ejemplo, fluoresceína) en cualquier célula. Con referencia a la Figura 1, en algunas realizaciones, el dispositivo microfluídico se coloca en o cerca de la superficie de un tanque de agua lleno. Se pueden insertar tubos, como el tubo transparente de PVC Tygon (diámetro interno de 1/16 de pulgada, diámetro externo de 1/8 de pulgada) (McMaster-Carr), en los puertos de entrada y salida del dispositivo. El tubo de entrada puede conducir a una válvula de tres vías con un lado de la válvula que conduce a una jeringa llena con la solución de muestra (células, trehalosa y microburbujas) conectada a una bomba de jeringa (por ejemplo, una bomba de jeringa NE-300, Farmingdale, NY, EE. UU.) y el otro lado que conduce a una solución salina tamponada con fosfato (PBS) de lavado, también conectada a una bomba de jeringa. El tubo de salida puede conducir a otra válvula de tres vías que se divide en un contenedor de desechos y recolección.
A medida que la solución que comprende microburbujas, trehalosa y células fluye a través del dispositivo microfluídico, el transductor ultrasónico emite frecuencias ultrasónicas que inducen la oscilación de las microburbujas y provocan la formación de poros en la membrana celular, lo que permite el transporte de trehalosa a través de los poros transitorios hacia las células (FIG. 2A).
Las microburbujas pueden sintetizarse y luego agregarse a las muestras antes de ingresar al dispositivo microfluídico. Alternativamente, las microburbujas pueden sintetizarse directamente dentro del dispositivo microfluídico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se generan microburbujas dentro del dispositivo utilizando el compuesto octafluoropentano (OFP), que está aprobado por la FDA para uso clínico en agentes de contraste de ultrasonido. En algunas realizaciones, las soluciones de OFP y trehalosa se almacenan dentro del propio dispositivo.
En algunas realizaciones, se utilizan gotitas de perfluorocarbono líquido para formar microburbujas. Las gotas de perfluorocarbono se utilizan en fase líquida en lugar de fase gaseosa, normalmente con perfluoropentano (C5F12), que tiene un punto de ebullición bajo (29 °C en masa). Las gotas de líquido suelen tener un diámetro de entre 0,1 y 5 |jm y pueden vaporizarse en microburbujasin situutilizando pulsos de ultrasonido de tan solo 1 a 5 js de duración. Las microburbujas producidas por gotitas vaporizadas se pueden sonificar para inducir una sonoporación similar a las microburbujas descritas anteriormente.
En algunas realizaciones, la solución que comprende células, microburbujas y el agente/molécula objetivo comprende un tampón PBS. En algunas realizaciones, se utiliza un tampón que contiene lactobionato. En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de tampón que contiene lactobionato.
Tabla 1.
En algunas realizaciones, pueden estar presentes menos de todos los componentes enumerados y/o pueden agregarse componentes adicionales. En la Tabla 2 se muestran ejemplos de rangos de concentración que son compatibles con el tampón descrito en este documento.
Tabla 2.
En algunas realizaciones, se proporciona un sistema que comprende una colección de dispositivos microfluídicos con transductores de ultrasonido integrados (FIG. 3). Las células fluyen a través de los dispositivos donde se mezclan con microburbujas y una solución de agente objetivo antes de la sonicación con pulsos de ultrasonido para administrar el agente objetivo a las células.
Con referencia a la Figura 3, el dispositivo microfluídico está compuesto por un primer canal 310 para alojar una o más microburbujas, un segundo canal 320 para alojar un agente objetivo, por ejemplo un agente de conservación, y un tercer canal 330 para alojar una solución celular. En algunas realizaciones, los canales del dispositivo microfluídico están dispuestos de tal manera que el segundo canal 320 está en comunicación fluida con el primer canal 310 y es intersectado por él, y el tercer canal 330 está intersectado por y en comunicación fluida con el segundo canal 320 (y el primer canal 310). En algunas realizaciones, un transductor de ultrasonido se coloca debajo del tercer canal y, en algunas realizaciones, al menos una parte del tercer canal está en una configuración 340 en espiral. Otros diseños son adecuados para el tercer canal 330, tal como por ejemplo uno con forma de serpiente. En algunas realizaciones, se colocan transductores entrelazados (IDT) a cada lado del tercer canal para generar ondas acústicas de superficie en el dispositivo generando fuerzas mecánicas distribuidas periódicamente a través de un efecto piezoeléctrico (FIG.2B). En algunas realizaciones, el primer canal 310, el segundo canal 320 y/o el tercer canal 330 tiene un ancho de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 700 pm y una profundidad de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 400 pm. En algunas realizaciones, el primer canal 310, el segundo canal 320 y/o el tercer canal 330 tienen un ancho de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 500 pm.
Los canales submilimétricos del dispositivo microfluídico permiten una mezcla homogénea de células, la molécula soluble se administra a las células y las microburbujas fluyen a través de ellas mientras se tratan con ultrasonido. La fina capa de células que requiere el tamaño del canal también ayuda a evitar problemas de atenuación causados por las altas concentraciones de microburbujas y células durante el tratamiento con ultrasonido. Esto también aumenta la consistencia de la captación de moléculas, ya que todas las células en línea con el transductor de ultrasonido pueden tratarse simultáneamente y no ser bloqueadas por otras.
Se pueden utilizar varios caudales en el dispositivo microfluídico, tal como por ejemplo aproximadamente 5-40 ml/h. Se pueden utilizar varios métodos conocidos para fabricar el dispositivo microfluídico. En algunas realizaciones, el dispositivo se fabrica utilizando una fotorresistencia como se describe en el Ejemplo 2. Un método alternativo implica el uso de grabado iónico reactivo profundo ("DRIE") con el proceso Bosch para grabar canales directamente en silicio en lugar de utilizar fotorresistencia. El vidrio se puede unir al silicio mediante unión anódica y se perforan agujeros en los dispositivos para los puertos de entrada y salida. Este enfoque requiere más esfuerzo y coste por dispositivo, pero cada uno puede ser más duradero.
En algunas realizaciones, los pulsos de ultrasonido pueden ser generados por cristales piezoeléctricos, que convierten la energía eléctrica en ondas de presión acústica. Estos materiales se utilizan en altavoces de audio y también en transductores de ultrasonido para imágenes médicas (por ejemplo, una sonda de ultrasonido Philips P4-1 en un sistema de ultrasonido Verasonics Vantage 64LE). El espesor del cristal determina la frecuencia fundamental, que es inferior a 20 kHz para equipos de audio y generalmente superior a 1 MHz para aplicaciones de imágenes ecográficas clínicas. La frecuencia de ultrasonido óptima para la sonoporación depende de las propiedades de las microburbujas, pero normalmente está en el rango de 1 a 5 MHz. En algunas realizaciones, se utiliza una frecuencia de aproximadamente 2,5 MHz. En algunas realizaciones, se pueden utilizar frecuencias de hasta 50 MHz para inducir la sonoporación dentro del dispositivo microfluídico. Las frecuencias más altas (>10 MHz) generalmente no se utilizan en imágenes médicas debido al hecho de que la absorción de ultrasonido por el tejido aumenta con la frecuencia, por lo que es difícil obtener imágenes de tejidos más profundos a frecuencias altas. Sin embargo, en el dispositivo microfluídico, la profundidad de penetración no es un problema significativo. Las microburbujas tienen una frecuencia de resonancia basada en su tamaño y propiedades de su capa y, en algunas realizaciones, la frecuencia de ultrasonido para la sonoporación es generalmente la misma que la frecuencia de resonancia de las microburbujas. En la mayoría de los casos, las frecuencias de resonancia de microburbujas están en el rango de 1 a 3 MHz. La amplitud de la presión ultrasónica es otra variable en la sonoporación. Generalmente se utilizan presiones entre 0,1 - 5 MPa, por ejemplo entre 0,5 - 2 MPa. La duración del pulso ultrasónico es un parámetro adicional relevante para la sonoporación. Se pueden utilizar duraciones de pulso de 1 a 1000 ps sin generar un calentamiento significativo. En algunas realizaciones, se utiliza una duración de pulso de aproximadamente 2 ps. En algunas realizaciones, se pueden integrar cristales piezoeléctricos dentro del dispositivo microfluídico para generar ondas ultrasónicas para la sonoporación. En algunas realizaciones, el tiempo total de sonicación (incluidos los pulsos de ultrasonido) es de al menos aproximadamente 1 a 100 segundos, por ejemplo, al menos aproximadamente 8 a 10 segundos. En algunas realizaciones, se emplean ultrasonidos continuos para generar ondas acústicas estacionarias. La fuerza de la radiación acústica hace que las células se muevan hacia nodos específicos en ondas acústicas estacionarias dentro de cada canal, lo que permite una sonoporación constante de cada célula a medida que pasa a través del dispositivo.
En algunas realizaciones, los dispositivos microfluídicos de la materia objeto de la presente divulgación se pueden utilizar como un sistema automatizado independiente que es usado por hospitales y bancos de sangre para procesar RBC para su conservación a largo plazo en un estado congelado o conservado en seco. En la mayoría de los casos, la sangre se recoge en bolsas de recolección especiales y se centrifuga para separar los componentes (es decir, plasma, plaquetas, RBC) entre sí. Después de la separación de los componentes y la reducción opcional de leucocitos para reducir los niveles de glóbulos blancos, los RBC concentrados se almacenan a 4 °C durante hasta 42 días o, en casos excepcionales, los RBC se congelan en presencia de glicerol. Sin embargo, al utilizar los dispositivos de la materia objeto de divulgación, los usuarios pueden colocar una bolsa de RBC empaquetados que se bombearán a través del sistema y se procesarán dentro de la cámara antes de salir a una bolsa de recolección separada que se puede congelar o procesar en seco utilizando protocolos de secado por convección, secado por aspersión o congelación/secado estándar.
Además, en algunas realizaciones de la materia objeto actualmente divulgada se proporcionan métodos para la criopreservación de células. En algunas implementaciones, se proporciona un método para la criopreservación de células que comprende los pasos de formar una solución que incluye una cantidad de microburbujas, una cantidad de un agente de conservación y una o más células; y sonicar la solución durante un período de tiempo suficiente para formar poros en una o más células. En algunas implementaciones, el agente de conservación se selecciona de: carbohidratos, como trehalosa y sacarosa; polioles, tales como sorbitol, xilitol; cilitoles, tales como mioiositol; polioles aniónicos, tales como fosfato de diglicerol; aminoácidos y derivados, tales como prolina, ectoína, taurina e hipotaurina; y proteínas relacionadas con la anhidrobiosis, tales como proteínas transgénicas expresadas con abundancia en la embriogénesis tardía (LEA) de la salmueraArtemia franciscana(grupos 1, 3 y 6). En algunas realizaciones, el agente de conservación se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, sorbitol, xilitol, mioiositol, fosfato de diglicerol, prolina, ectoína, taurina, hipotaurina y proteínas transgénicas expresadas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) de la salmueraArtemia franciscana(grupos 1, 3 y 6).
En algunas realizaciones, para facilitar el almacenamiento y la conservación a largo plazo de una o más células, el método de criopreservación comprende además el paso de secar una o más células, como por ejemplo mediante liofilización. En algunas realizaciones, las células se congelan sin secarlas. En algunas realizaciones, una o más células son glóbulos rojos.
La materia objeto aquí divulgada se ilustra además mediante los siguientes ejemplos específicos pero no limitativos. Algunos de los ejemplos siguientes son proféticos, no obstante los valores numéricos, resultados y/o datos a que se hace referencia y que figuran en los ejemplos. Los siguientes ejemplos también pueden incluir compilaciones de datos que son representativos de datos recopilados en varios momentos durante el curso del desarrollo y la experimentación relacionados con la presente invención.
EJEMPLO 1. Microburbujas
Como se muestra en la Tabla 3, los productos de microburbujas están disponibles comercialmente.
Tabla 3. Productos de microburbujas disponibles comercialmente.
Nombre del Proveedor Est .ad .o d .e aprob . aci .ó ,n Composición de Composición del producto r , la capargasImágenes Aprobado en EE. UU., ^
DEFINITY®médicas de Octafluoropropano Lantheus Europa y partes de Asia.
SONOVUE®Bracco Aprobado en América Lípido Hexafluoruro de del Norte, Europa azufreSONAZOID®GE<Aprobado en Japón y>
CoreaLípido PerfluorobutanoOPTISON®GE<Aprobado en EE. UU. y>Albúmina
Europa desnaturalizadaOctafluoropropano
Para estos estudios, se sintetizaron microburbujas recubiertas de lípidos utilizando un proceso sencillo. La capa lipídica se prepara para estabilizar la microburbuja y se utiliza un gas inerte con baja solubilidad en agua (tal como el perfluorocarbono) para promover también la estabilidad de la microburbuja. Para sintetizar microburbujas primero se preparó una solución lipídica. Serían posibles muchas formulaciones diferentes para esta aplicación, pero en este ejemplo se utilizó principalmente una formulación que comprendía DSPC:DSEPC:DSPG:PEG-40 en una relación molar de 100:43:1:4,5. Los lípidos se mezclan en un disolvente orgánico (es decir, cloroformo) que luego se evapora para formar una película lipídica seca. La película lipídica se rehidrata con agua o un tampón tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se sonica con un sonicador de sonda para dispersar los lípidos. Los parámetros exactos de sonicación se pueden variar siempre que la solución lipídica esté completamente dispersa, como lo indica la apariencia de una solución transparente. A continuación, la solución lipídica se coloca en un vial de vidrio de 1,5 ml, se tapa y se sella con un tapón de membrana y una herramienta de engarce. El espacio superior del vial se llena con gas a través de dos agujas (una para la entrada y otra para la ventilación del aire) que se insertan a través del tabique. Después de llenar el espacio de cabeza, el vial se amalgamará utilizando un amalgamador estándar durante 15 a 45 segundos. Esto agita la solución y arrastra burbujas de gas al líquido, donde los lípidos cubren espontáneamente la superficie y estabilizan las microburbujas. Se utilizó gas perfluorobutano (C4F10), pero cualquier gas inerte con baja solubilidad en agua es adecuado. Después de la amalgamación, las microburbujas están listas para su uso. Se pueden almacenr a 4°C hasta un día. Las microburbujas pueden sintetizarse como se describe y luego agregarse a las muestras antes de ingresar al dispositivo microfluídico. Sin embargo, como se describe a continuación, las microburbujas se sintetizaron directamente dentro del dispositivo microfluídico.
EJEMPLO 2. Dispositivo de sonoporación microfluídica
Se desarrolló un dispositivo de sonoporación microfluídica para mejorar la consistencia y precisión de la carga de trehalosa en glóbulos rojos. Este dispositivo se puede utilizar para la sonoporación y la carga de cualquier molécula soluble en cualquier célula. En estudios anteriores, se agregó una solución que contenía trehalosa (200-400 mM), microburbujas y glóbulos blancos a un tubo cónico de 15 ml (volumen total de muestra de 0,5 ml), se colocó en un tanque de agua y se aplicaron pulsos de ultrasonido durante 70 segundos para inducir la sonoporación y la administración de trehalosa. Sin embargo, en esta configuración las microburbujas y las células se distribuyen por toda la muestra y no interactúan de manera consistente. El dispositivo de sonoporación microfluídica permite una interacción más consistente de microburbujas y células en ubicaciones precisas. Un ejemplo del diseño del dispositivo se muestra en laFIG. 3.En este diseño, un canal 310 que contiene gas perfluorocarbono se interseca con un canal 320 que contiene solución de trehalosa. El gas pasa a través de un orificio de 10 pm antes de ingresar a la solución de trehalosa, donde se deshará en pequeñas burbujas a un ritmo constante. Tenga en cuenta que no se necesita ningún surfactante (lípido) en este diseño, porque las microburbujas serán sonificadas por ultrasonido en cuestión de segundos antes de que se disuelvan. La solución de microburbujas/trehalosa se intersecta con el canal 330 que contiene la solución celular, que ingresa a un canal 340 con patrón en espiral. La fuerza centrífuga generada a medida que la solución pasa a través del patrón en espiral empujará las células y las microburbujas hacia la pared exterior para que estén cerca cuando se aplique el ultrasonido, mejorando así la eficiencia de la sonoporación. La FIG. 3 muestra canales de flujo entrante 342 y canales de flujo saliente 344. Son posibles otros diseños, tal como por ejemplo una forma de serpiente. El transductor de ultrasonidos, o cristal piezoeléctrico, se coloca directamente debajo del patrón en espiral. En este ejemplo, cada canal tiene 100 pm de ancho y 50 pm de profundidad, aunque estas dimensiones se pueden ajustar hasta un tamaño mínimo de 20-30 pm (las células pueden quedar atrapadas si las dimensiones son menores de 20 pm).
Existen múltiples opciones para la fabricación de los dispositivos. En el presente ejemplo, la fabricación comienza con la creación de una fotomáscara del diseño del dispositivo. Se recubre una oblea de silicio con un espesor de 50 pm con fotorresistencia (SU8-2050), se alinea la fotomáscara sobre la oblea con un alineador de máscara y se expone la oblea a luz ultravioleta para reticular la fotorresistencia en las secciones expuestas. Después de procesarla con una solución reveladora, la oblea está lista para usarse como molde. Se vierte polidimetilsiloxano (PDMS) sobre el molde de oblea y se hornea a 60 °C durante 2 horas para curar. Se retira el PDMS del molde de oblea y se corta cada dispositivo del resto del PDMS curado. Se perforan agujeros con una perforadora de 2,5 mm para crear los puertos de entrada/salida. Los dispositivos se colocan en un horno de plasma durante 1 minuto y se adhieren inmediatamente a portaobjetos de vidrio. Se colocan tubos de plástico en los orificios y se conectan a jeringas, que se presionan automáticamente en una bomba de jeringa al caudal deseado.
EJEMPLO 3. Criopreservación de glóbulos rojos
Se han realizado experimentosin vitropara validar los métodos y sistemas descritos en este documento. Brevemente, se colocó una solución de 0,5 mL que contenía RBC de cerdo o humanos, 200 mM de trehalosa y microburbujas en un tubo cónico y se sonicó con una sonda de ultrasonido clínico de 2,5 MHz durante 70 segundos (Philips 4-1 en un sistema de imágenes por ultrasonido Verasonics Vantage 64LE). Se obtuvo una alta recuperación de células (>95 %) 24 horas después de la sonicación (FIG. 4), lo que indica que este tratamiento causa una toxicidad mínima. Después de la sonicación, las muestras se secaron (FIG. 5A-B), se congelaron a -80 °C o se liofilizaron durante 1 semana. Tras la descongelación o rehidratación, se contó el porcentaje de RBC estructuralmente intactos (FIG. 6A-B). Se lograron tasas de recuperación celular de hasta el 85 % después de la congelación/descongelación, en comparación con menos del 40 % sin sonoporación. Se lograron tasas de recuperación celular de hasta el 12 % después de la liofilización/rehidratación, en comparación con el 0 % sin sonoporación. Aunque la recuperación aún es baja, se creyó que este era un resultado significativo dado que no se recuperó ni un solo RBC de las muestras liofilizadas que no habían sido tratadas con sonoporación. Además, las técnicas mejoradas de liofilización pueden aumentar la recuperación, ya que los experimentos iniciales dieron como resultado una recuperación de menos del 8 % (datos no mostrados), pero incluso con pequeños cambios en la composición del medio celular y los parámetros de liofilización, la tasa de recuperación aumentó por encima del 12 %, mientras que la tasa de recuperación de las células congeladas fue superior al 85 %. El dispositivo de sonoporación microfluídica puede mejorar aún más las tasas de recuperación al permitir una administración constante y precisa de trehalosa a cada célula. Este dispositivo también es eficaz en el procesamiento de RBC para su conservación a largo plazo en estado congelado o liofilizado.
EJEMPLO 4. Administración de moléculas a las células
Procedimientos
Fuente y condiciones de almacenamiento de RBC humanos.Los RBC se adquirieron de Innovation Research (Omaha, NE, EE. UU.) y se almacenaron en solución CPD-AS 1 a 4 °C durante hasta 42 días.
Métodos de síntesis de microburbujas.Se sintetizaron microburbujas para uso ultrasónico. Las microburbujas estaban compuestas por un núcleo de perfluorocarbono gaseoso rodeado por una capa lipídica. Los fosfolípidos se obtuvieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE. UU.). La solución lipídica de microburbujas estaba compuesta por una relación molar de 96:4 (DPPC:DSPE-PEG2000). Los lípidos se disolvieron en cloroformo y el disolvente se evaporó bajo argón. La película lipídica seca se rehidrató en PBS a una concentración de 5 mg/mL. Para producir microburbujas, la solución lipídica preparada se diluyó 4 veces en PBS en un vial de vidrio transparente de 11 mm y se selló con un septo objetivo de 10 mm y tapones de 11 mm, todos de VWR (Radnor, PA, Ee . UU.). El aire restante en el vial se reemplazó con decafluorobutano (Fluoromed, Round Rock, TX, EE. UU.) a través de una aguja hipodérmica (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) y una segunda aguja para ventilar. Luego, el vial se mezcló mediante un amalgamador de alta velocidad durante 30 s a 4350 CPM (Pelican).
Diseño/fabricación de dispositivos microfluídicos.Fabricación de mascarilla/oblea:
Oblea de silicio prefabricada de 3 pulgadas de diámetro
Materiales fotorresistentes (SU8-3035, SU8-2050)
Acetato de éter monometílico de propilenglicol - desarrollo de máscara
Isopropanol - lavar la oblea
Para crear el dispositivo PDMS, se combinó y mezcló bien una mezcla 10:1 de base y agente de curado (SYLGARD® 184 Silicone Elastomer Kit, Down Corning Corporation, Midland, MI). La mezcla se desecó durante 1 hora para eliminar las burbujas de aire y se vertió sobre la oblea de silicio en una placa de Petri. Luego la oblea cubierta se horneó durante 2 horas a 60°C. Una vez curado, el dispositivo se cortó a medida utilizando una navaja de afeitar y se crearon orificios de entrada/salida utilizando una herramienta de muestreo de 2,5 mm (WellTech Rapid-Core). Luego, la pieza de PDMS se unió mediante plasma a un lado de vidrio (100 V durante 60 s, 500 mbar de O2) utilizando un incinerador de plasma Axic HF-8. Para prepararlo para la prueba, el dispositivo se sostuvo con abrazaderas y soportes de anillo en la superficie de un tanque de agua lleno de 20 galones (FIG. 1). Se insertó un segmento de tubo transparente de PVC Tygon (diámetro interno de 1/16 de pulgada, diámetro externo de 1/8 de pulgada) (McMaster-Carr) en los puertos de entrada y salida del dispositivo. El tubo de entrada conduce a la válvula de 3 vías. Un lado de la válvula conduce a una jeringa llena con la solución de prueba, conectada a una bomba de jeringa NE-300 (Farmingdale, NY, EE. UU.). El otro lado conducía a una solución de PBS de lavado, también conectada a una bomba de jeringa. El tubo de salida conduce a otra válvula de tres vías que se divide en un vial cónico de desechos y recolección.
Configuración y métodos de ultrasonido.Se colocó un transductor de ultrasonido P4-1 (Ultra Solutions, EE. UU.) en el agua, debajo del dispositivo, con la lente acústica orientada hacia la superficie del agua. El ultrasonido se utilizó en modo Flash con presiones que oscilaban entre 0 y 1,8 MPa de presión negativa máxima. El foco está a 40 mm de la lente acústica.
Ensayo de fluoresceína.La solución de sangre madre se diluyó 40 veces en solución de fluoresceína (VWR) y PBS. Luego, la mezcla se pipeteó en alícuotas de 1 ml y se aspiró con una jeringa (VWR) con el uso de una aguja hipodérmica. Las cantidades adecuadas de microburbujas se agregaron poco antes de procesar las muestras en el dispositivo. La alícuota de 1 ml se hizo fluir a través del dispositivo con la configuración de ultrasonido y la velocidad de flujo adecuadas (10-40 ml/h) y se recogió en un vial cónico al final. La colección se lavó 3 veces con 1 ml de PBS y se agregó un volumen final de 200 pL de PBS después del lavado. Las muestras se mantuvieron en hielo o en un refrigerador a 4 °C hasta que se pudo realizar el análisis de citometría de flujo.
Ensayo de trehalosa.La solución de sangre madre se diluyó 40 veces en PBS con trehalosa disuelta a una concentración de 171 mg/mL. Se pipeteó en alícuotas de 1 mL y se aspiró con una jeringa con el uso de una aguja hipodérmica. La cantidad adecuada de microburbujas se añadió poco antes de ejecutar la muestra en el dispositivo. La alícuota de 1 mL se hizo fluir a través del dispositivo con la configuración de ultrasonido y la velocidad de flujo adecuadas y se recogió en un vial cónico al final. La colección se lavó 3 veces con 1 mL de PBS y se agregó un volumen final de 100 pL de Triton X-100 al 0,1 % después del lavado. Las muestras se incubaron durante un mínimo de 30 minutos, se agitaron y se utilizó un kit de ensayo de trehalosa para analizar los resultados. (Megazyme, Bray, Condado de Wicklow, Irlanda)
Experimento de congelación/descongelación.La solución de sangre madre se diluyó 40 veces en PBS con trehalosa disuelta a una concentración de 171 mg/mL. Se pipeteó en alícuotas de 1 mL y se aspiró con una jeringa con el uso de una aguja hipodérmica. La cantidad adecuada de microburbujas se añadió poco antes de ejecutar la muestra en el dispositivo. La alícuota de 1 mL se hizo fluir a través del dispositivo con la configuración de ultrasonido y la velocidad de flujo adecuadas y se recogió en un vial cónico al final. La colección no se lavó, sino que se mezcló mediante pipeteo y 0,5 mL de la muestra se colocaron en un criovial y se congelaron a - 80 °C con la ayuda de una caja COOLCELL® de Biocision. (San Rafael, CA, EE. UU.) Después de un mínimo de 24 horas a -80 °C, las muestras se sacaron del congelador y se descongelaron. Aproximadamente el 40 % de la muestra se utilizó para un ensayo de citometría de flujo/calceína-AM y el 60 % restante para un ensayo de hemoglobina.Métodos de citometría de flujo.La citometría de flujo se realizó en un analizador MACSQUANT®10 (un citómetro de flujo de Miltenyi Biotec) durante 10000 eventos. Se analizaron los datos usando el software FlowJo®. La puerta se creó mediante dispersión frontal y lateral de una muestra de control en la escala logarítmica y se copió en las muestras restantes. La fluorescencia media de FITC se calculó a partir de las células seleccionadas y también se copió en las muestras restantes. Luego estos datos se transfirieron a MICROSOFT® Excel, se promediaron y se graficaron.
Ensayo de trehalosa.Completado según lo descrito en el kit de ensayo de trehalosa de Megazyme (Bray, Co., Wicklow, Irlanda).
Ensayo de BCA.Completado como se describe en BCA Protein Assay Kit II de BioVision Inc. (Milpitas, CA, EE. UU.).
Ensayo de calceína-AM.La calceína-AM (1 mg/mL en DMSO) se diluyó 1:10 en PBS 1X. La solución diluida se añadió a 200 pL de glóbulos rojos procesados. La concentración final de calceína-AM fue de 5 pM. Las muestras se incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37 °C y se colocaron en hielo hasta que estuvieron listas para la citometría de flujo. La citometría de flujo se realizó en un analizador MACSQUANT® 10 (un citómetro de flujo de Miltenyi Biotec) durante 10 000 eventos. Se analizaron los datos usando el software FlowJo®. Se procesaron muestras de control (RBC diluidos 20X sin calceína-AM) para analizar las muestras. Las células de control fueron seleccionadas en función de la dispersión frontal y lateral. Luego se ajustó el histograma de fluorescencia de calceína de modo que cualquier célula con un nivel de fluorescencia más alto indicara viabilidad. Luego se graficaron estos porcentajes.
Ensayo de hemoglobina.En una placa de 96 pocillos, se crearon pocillos en blanco y de calibración agregando agua en un pocillo y una proporción de 4:1 de agua: calibrador en otro pocillo. Las muestras se mezclaron en una proporción 4:1 de reactivo:muestra de sangre en pocillos separados. Las muestras se leyeron a una longitud de onda de 400 nm en un lector de placas al menos 5 minutos después de la mezcla.
Análisis estadístico.Las comparaciones estadísticas entre los grupos experimentales y de control se determinaron mediante una prueba t de Student, con significancia estadística definida como p < 0,05 (dos colas). Las barras representan la media ± desviaciones estándar.
Resultados
La FIG.7A-Bmuestra imágenes SEM de RBC que se rehidrataron después de 6 semanas de almacenamiento en seco a temperatura ambiente.
Se encontró que el aumento de los tiempos de sonicación disminuyó la eficiencia de administración de fluoresceína mientras que una presión de 1,2 MPa tuvo una mayor eficiencia de administración de fluoresceína que una presión de 3,6 MPa (FIG. 8).
Se añadieron microburbujas a soluciones de eritrocitos y se sonicaron (2,5 MHz, 4 ciclos) a diversas presiones y duraciones. La fluorescencia se cuantificó con citometría de flujo. La amplitud de las emisiones de banda ancha en los primeros 8 segundos de sonicación no se correlacionó con la administración (r2= 0,23), mientras que después de 8 segundos la amplitud de las emisiones de banda ancha se asoció con una mayor administración a los eritrocitos (r2 = 0,97) (FIG.9A-B). Estos resultados sugieren que el momento de la actividad de cavitación, más que la amplitud sola, puede ser un factor importante en la administración de compuestos a los eritrocitos mediada por ultrasonidos.
Referencias
1. Pfuntner, A., et al., Most Frequent Procedures Performed in U.S. Hospitals, 2011. HCUP Statistical Brief #165. October 2013. Agency for Healthcare Research and Quality, Rockville, MD. hcupus. ahrq.gov/reports/statbriefs/sb165.pdf
2. Whitaker, B.I., 2011 National Blood Collection and Utilization Survey. 2011.
3. Janssen, S.J., et al., Allogeneic blood transfusions and postoperative infections after lumbar spine surgery. Spine J, 2015. 15(5): p. 901-9.
4. Blood Preparation Market size worth over USD 64 billion by 2024: Global Market Insights Inc. Oct 11 2016; Available from: globenewswire.com/news-release/2016/10/11/878475/0/en/Blood-Preparation-Marketsize-worthover-USD-64-billion-by-2024-Global-Market-Insights-Inc.html.
5. Bailey, T.L., et al., Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells. Cryobiology, 2015. 71(3): p. 472-80.
6. Li, S., et al., Late embryogenesis abundant proteins protect human hepatoma cells during acute desiccation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(51): p. 20859-64.
7. Solocinski, J., et al., Effect of trehalose as an additive to dimethyl sulfoxide solutions on ice formation, cellular viability, and metabolism. Cryobiology, 2017.
8. Stokich, B., et al., Cryopreservation of hepatocyte (HepG2) cell monolayers: impact of trehalose. Cryobiology, 2014. 69(2): p. 281-90.
9. Zhou, X., et al., Loading trehalose into red blood cells by electroporation and its application in freeze-drying. Cryo Letters, 2010. 31(2): p. 147-56.
10. Satpathy, G.R., et al., Loading red blood cells with trehalose: a step towards biostabilization. Cryobiology, 2004.
49(2): p. 123-36.
11. Slonim, R.W., C.; Garbarino, E., The Market for Blood. Journal of Economic Perspectives, 2014. 28(2): p. 177 196.
12. Whitaker, B.I., et al., 2009 National Blood Collection and Utilization Survey2009.
13. Global Blood Processing Devices and Consumables Market, By Product Type (Devices, Consumables), and By Geography - Trends, Size, and Forecast from 2016 to 2024. January 2017; Available from: coherentmarketinsights.com/market-insight/blood-processing-devices-and-consumables-market-83.
14. Scoffin, K. Instant blood. Dec 92012; Available from: soci.org/chemistry-and-industry/cnidata/2012/9/instantblood.
15. HHS funds development of freeze-dried platelets for disaster response. Sep 20 2013; Available from: phe.gov/Preparedness/mcm/Pages/platelets-1309.aspx.
16. Fitzpatrick, G.M., et al., Thrombosomes: a platelet-derived hemostatic agent for control of noncompressible hemorrhage. Transfusion, 2013. 53 Suppl 1: p. 100S-106S.
17. Fitzpatrick, M., 080 Freeze-dried platelets: Advancing towards clinical use. Cryobiology, 2013. 67(3): p. 420.
18. Moradi, S., et al., Artificial Blood Substitutes: First Steps on the Long Route to Clinical Utility. Clin Med Insights Blood Disord, 2016. 9: p. 33-41.
19. Chen, J.Y, et al., A review of blood substitutes: examining the history, clinical trial results, and ethics of hemoglobin-based oxygen carriers. Clinics (Sao Paulo), 2009. 64(8): p. 803-13.
20. Kim, H.O., In-vitro stem cell derived red blood cells for transfusion: are we there yet? Yonsei Med J, 2014. 55(2): p. 304-9.
21. Kanias, T and J.P. Acker, Trehalose loading into red blood cells is accompanied with hemoglobin oxidation and membrane lipid peroxidation. Cryobiology, 2009. 58(2): p. 232-9.
22. Straat, M., et al., Accelerated clearance of human red blood cells in a rat transfusion model. Intensive Care Med Exp, 2015. 3(1): p. 27.
23. U.S. Patent No, 5,242,792, filed 1991-02-25, by U.S. Navy, and entitled "Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides"
24. International Patent Application Publication No. WO 1995/033488, filed 1995-06-02, by Quadrant Holdings, Cambridge Limited, and entitled "Method of preventing aggregation of various substances upon rehydration or thawing and compositions obtained thereby."
25. International Patent Application Publication No. WO 1999/060849, filed 1999-05-26, by Lifecell Corporation, and entitled "Cryopreservation of human red blood cells."
26. International Patent Application Publication No. WO 2001/058431, filed 2000-08-09, by Gendel Limited, and entitled "Method for loading a red blood cell with an agent."
27. International Patent Application Publication No. WO 2004/011616, filed 2003-07-28, by General Hospital Corp., and entitled "Systems and methods for cell preservation."
28. U.S. Patent Application Publication No. US 2006/0188867, filed 2006-01-27, by Canadian Blood Services, and entitled "Method of cryopreserving cells and tissues by liposomal delivery of sugars to enhance post-thaw viability." 29. International Patent Application Publication No. WO 2007/028984, filed 2006-09-07, by University of Dundee, and entitled "Apparatus and method for sonoporation."
30. U.S. Patent Application Publication No. US 2011/0027861, filed 2010-06-04, by Hememics Biotechnologies, and entitled "Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same."
31. U.S. Patent Application Publication No. US 2014/0073027, filed 2012-06-20, by University of St. Andrews, and entitled "Microfluidic photoporation."
32. International Patent Application Publication No. WO 2015/047502, filed 2014-06-27, by Duke University, and entitled "Systems, apparatus, and methods for droplet-based microfluidics cell poration."
Se entenderá que varios detalles de la materia objeto actualmente divulgada pueden modificarse sin alejarse del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones. Además, la descripción anterior es sólo a modo de ilustración y no de limitación.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para la administración de moléculas a las células, que comprende: formar una solución que comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de moléculas solubles y una o más células; hacer fluir la solución a través de un dispositivo microfluídico que comprende un primer canal (310) para alojar una o más microburbujas, un segundo canal (320) para alojar moléculas solubles, el segundo canal en comunicación fluida con e intersectado por el primer canal; y un tercer canal (330) para alojar una solución celular, el tercer canal en comunicación fluida con e intersectado por el segundo canal, y sonicar la solución durante un período de tiempo suficiente para formar poros en una o más células.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde las moléculas solubles se seleccionan del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, sorbitol, xilitol, mioiositol, fosfato de diglicerol, prolina, ectoína, taurina, hipotaurina y proteínas transgénicas expresadas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) del grupo 1, grupo 2 o grupo 3 de la salmueraArtemia franciscana.
  3. 3. Un método para la conservación de células, que comprende: formar una solución que comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de agente conservante y una o más células; hacer fluir la solución a través de un dispositivo microfluídico que comprende un primer canal para alojar una o más microburbujas, un segundo canal para alojar un agente conservante, el segundo canal en comunicación fluida con el primer canal e intersecado por él; y un tercer canal para alojar una solución celular, el tercer canal en comunicación fluida con el segundo canal e intersectado por él, y sonicar la solución durante un período de tiempo suficiente para formar poros en una o más células que permitan la entrada del agente conservante en una o más células.
  4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde el agente de conservación se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, sorbitol, xilitol, mioiositol, fosfato de diglicerol, prolina, ectoína, taurina, hipotaurina y proteínas transgénicas expresadas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) del grupo 1, grupo 2 o grupo 3 de la salmuera Artemia franciscana.
  5. 5. El método de la reivindicación 1 en donde la solución comprende una cantidad de microburbujas, una cantidad de moléculas solubles y una o más células se pasan a través del tercer microcanal, una célula a la vez; y en donde la sonicación sonica las células a medida que pasan a través del microcanal de tal manera que las microburbujas forman poros en una o más células a través de los cuales una o más de las moléculas solubles ingresan a una o más células.
  6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde las moléculas solubles se seleccionan del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, sorbitol, xilitol, mioiositol, fosfato de diglicerol, prolina, ectoína, taurina, hipotaurina y proteínas transgénicas expresadas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) del grupo 1, grupo 2 o grupo 3 de la salmuera Artemia franciscana.
  7. 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de secado y/o congelación de una o más células.
  8. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una o más células son glóbulos rojos.
  9. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde que dichas microburbujas tienen un diámetro de aproximadamente 1-3 pm.
  10. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas microburbujas están recubiertas de lípidos.
  11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde los lípidos de dichas microburbujas se eligen entre 1,2-diestearoilsn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000) y/o estearato de polietilenglicol-40 (PEG40<).>
  12. 12. El método de la reivindicación 11, en donde dichos lípidos comprenden una formulación DSPC:DSEPC:DSPG:PEG-40 en una relación molar de 100:43:1:4,5.
    ��
    FIG. 2A
    FIG. 2B
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116056759A (zh) * 2020-08-24 2023-05-02 叶秩光 超声波搭配微气泡辅助的气球导管系统及其血管扩张方法
WO2022187313A1 (en) * 2021-03-02 2022-09-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Analysis of cell or particle properties using acoustofluidics and machine learning

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242792A (en) 1991-02-25 1993-09-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides
DE69530196T2 (de) 1994-06-02 2003-11-20 Elan Drug Delivery Ltd Methode zum verhindern der aggregation von proteinen/peptiden bei rehydratation oder auftauen
ES2257050T3 (es) 1998-05-26 2006-07-16 Lifecell Corporation Conservacion por el frio de hematies humanos.
GB0002856D0 (en) 2000-02-08 2000-03-29 Gendel Limited Ultrasound sensitisation
AU2003268033A1 (en) * 2002-07-26 2004-02-16 The General Hospital Corporation Systems and methods for cell preservation
CA2595638A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Canadian Blood Services A method of cryopreserving cells and tissues by liposomal delivery of sugars to enhance post-thaw viability
GB0518273D0 (en) 2005-09-08 2005-10-19 Univ Dundee Apparatus and method for sonoporation
US20090081785A1 (en) 2007-09-24 2009-03-26 Hememics Biotechnologies, Inc. Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same
CN101381705B (zh) * 2008-10-21 2011-05-04 上海理工大学 一种海藻糖载入红细胞内的方法
WO2011017524A1 (en) * 2009-08-05 2011-02-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Microfluidic-based generation of functionalized microbubbles for ultrasound imaging and therapy
WO2011025893A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems, methods, and devices for production of gas-filled microbubbles
US20130129635A1 (en) * 2010-05-24 2013-05-23 Wilson Sonsini Goodrch & Rosati Polymerized shell lipid microbubbles and uses thereof
GB201110454D0 (en) * 2011-06-21 2011-08-03 College The Microfluidic photoporation
CN104684546A (zh) * 2012-06-07 2015-06-03 哈佛大学校长及研究员协会 用于药物靶向的纳米疗法
WO2015047502A2 (en) 2013-06-27 2015-04-02 Duke University Systems, apparatus, and methods for droplet-based microfluidics cell poration
WO2016010861A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for improved performance of fluidic and microfluidic systems
AU2016289530B2 (en) * 2015-07-09 2021-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of materials to anucleate cells
EP3184624A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-28 Diagenode S.A. Frequency optimized devices and methods for microfluidic sonication
GB201601053D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Isis Innovation Method and apparatus for generating bubbles

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